CH637159A5 - Preparation of an antibiotic mixture - Google Patents

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CH637159A5
CH637159A5 CH627277A CH627277A CH637159A5 CH 637159 A5 CH637159 A5 CH 637159A5 CH 627277 A CH627277 A CH 627277A CH 627277 A CH627277 A CH 627277A CH 637159 A5 CH637159 A5 CH 637159A5
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antibiotic
factor
mixture
dihydrochloride
medium
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CH627277A
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Karl Heinz Michel
Calvin Eugene Higgens
Manuel Debono
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Lilly Co Eli
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07G—COMPOUNDS OF UNKNOWN CONSTITUTION
    • C07G11/00—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients

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Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikumgemisches A-35512 mit den Faktoren A, B, C, E, F, G und H, des Antibiotikums A-35512 Faktor A, des Antibiotikums A-35512 Faktor B, des Antibiotikums A-35512 Faktor C, des Antibiotikums A-35512 Faktor E, des Antibiotikums A-35512 Faktor F, des Antibiotikums A-35512 Faktor G und des Antibiotikums A-35512 Faktor H sowie des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismus Streptomyces Candidus NRRL 8156 in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, submers unter aeroben Fermentationsbedingungen züchtet, bis eine wesentliche Menge des Antibiotikums gebildet ist.
Es besteht die Möglichkeit, im erfindungsgemässen Verfahren eine Mutante des genannten Mikroorganismus Streptomyces Candidus NRRL 8156 einzusetzen.
Die Faktoren A, B, C, E, F, G und H sind mikrobiologisch wirksam, und sie können chromatographisch voneinander getrennt und isoliert werden. Durch schwache saure Hydrolyse von A-35512 Faktor B erhält man z.B. unter Entfernung mehrerer Zucker A-35512 Faktor B Aglykon. Das Antibiotikumgemisch A-35512 stellt ein antibakterielles und wachstumsförderndes Mittel dar, mit dem sich die Futterverwertung bei Wiederkäuern und Geflügel erhöhen lässt. Das Antibiotikum A-35512 Faktor B eignet sich ferner auch zur Behandlung von Zahnkaries und Akne.
Bei dem antibiotischen Gemisch A-35512 handelt es sich um ein Gemisch aus eng verwandten antibiotisch wirksamen Glycopeptiden. Das Antibiotikum A-35512 Faktor B, das das am besten charakterisierte Glied aus dem Antibiotikumkomplex A-35512 darstellt, scheint ein neuer Vertreter aus der Gruppe der peptidhaltigen Antibiotika zu sein, zu denen auch Vancomycin (US-PS 3 067 099), A-4696 Faktor A, Faktor B und Faktor C (US-PS 3 952 095), Avoparcin (US-PS 3 855 410), Ristomycin A (N. Lomakina, 7. Internationales Symposium für Chemie Nationaler Produkte, Riga, Latvia, Seite 625,1970) und Ristocetin A (US-PS 2 990 329) gehören. Das Antibiotikumgemisch A-35512 unterscheidet sich von den bekannten Antibiotika beispielsweise in der Laufgeschwindigkeit in verschiedenen chromatographischen Systemen sowie im Aminosäure-und Zuckergehalt.
3
637 159
Es gibt zwar bereits eine Reihe antibakteriell wirksamer Mittel, doch braucht man immer noch weitere neue und verbesserte Antibiotika. Ein Problem der häufigen Therapie mit Antibiotika ist die Tatsache, dass sich die Antibiotika in ihrer Wirksamkeit gegenüber pathogenen Organismen unterscheiden. Ein anderes Problem ist darin zu sehen, dass sich kontinuierlich Organismenstämme entwickeln, die gegen die heute verwendeten Antibiotika resistent sind. Ein weiteres Problem liegt in der Tatsache, dass einzelne Patienten aufgrund einer Überempfindlichkeit und/oder toxischer Effekte auf bestimmte Antibiotika oft stark reagieren. Aufgrund dieser Probleme bei der heutigen Therapie ist Ziel der Erfindung die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung neuer Antibiotika, die sich gegen durch Mikroorganismen hervorgerufene Erkrankungen einsetzen lassen.
Die erfindungsgemäss erhaltenen Antibiotika können in Mitteln verwendet werden, mit denen sich die Futterverwertung bei Wiederkäuern und Geflügel verbessern lässt, da die Notwendigkeit zur Erhöhung der Futterverwertung immer wichtiger wird. Eine derartige Erhöhung der Futterverwertung bei einer Reihe von Tieren sowie bei Geflügel lässt sich beispielsweise bereits mit Diäthylstilböstrol und anderen Östrogenen erreichen. Diese Futterzusätze haben jedoch den Nachteil, dass sie in dem zum Verzehr bestimmten Fleisch zurückbleiben. Man sucht daher nach anderen und neuen Wegen zur Erhöhung der Futterverwertung, um so die begrenzten Futtermengen bei der Mästung von Wiederkäuern und Geflügel besser auszunutzen. Das Antibiotikumgemisch A-35512 mit seinen Einzelfaktoren und deren Derivaten stellt in dieser Richtung einen Schritt nach vorne dar.
Die Erfindung ist also auf das weiter oben beschriebene Verfahren zur Herstellung des Antibiotikumgemisches A-35512 mit den Faktoren A, B, C, E, F, G und H, des Antibiotikums A-35512 Faktor A, des Antibiotikums A-35512 Faktor
B, des Antibiotikums A-35512 Faktor C, des Antibiotikums A-35512 Faktor E, des Antibiotikums A-35512 Faktor F, des Antibiotikums A-35512 Faktor G und des Antibiotikums A-35512 Faktor H sowie des Aglykonderivats des Faktors B gerichtet.
Man kann das Antibiotikumgemisch A-35512 aus dem Kulturmedium abtrennen, aus dem Antibiotikumgemisch A-35512 die Antibiotika A-35512 Faktoren A, B, C, E, F, G und H isolieren und aus dem Antibiotikum A-35512 Faktor B das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon herstellen.
Zahl und Verhältnis der bei diesem Antibiotikumgemisch gleichzeitig gebildeten Einzelfaktoren schwanken in Abhängigkeit von den angewandten Fermentationsbedingungen. Die erfindungsgemäss erhaltenen antibiotisch wirksamen Substanzen werden willkürlich als Antibiotika A-35512 bezeichnet. Der Faktor B ist der überwiegende Faktor in dem Antibiotikumgemisch A-35512. Die verschiedenen Faktoren von A-35512 kommen in dem Gemisch A-35512 vor und lassen sich aus diesem Gemisch einzeln in Form ihrer Hydrochloridsalze gewinnen. Jeder Einzelfaktor kann in seine freie Base (nämlich die ionische chlorfreie Form) überführt werden, indem man ihn beispielsweise über ein schwach saures Ionenaustauscherharz chromatographiert. Ausser den Formen der freien Base und der Hydrochloridsalze eignen sich auch andere pharmazeutisch unbedenkliche Salze der einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-35512. Der Kürze halber wird bei der Diskussion über die Verwendbarkeit des vorliegenden Antibiotikums einfach die Angabe Verbindung A-35512 verwendet, um auf diese Weise eine Verbindung aus der Gruppe A-35512 Faktoren A, B,
C, E und H und ihrer pharmazeutisch unbedenklichen Salze zu bezeichnen.
Aus der Zeichnung gehen die Infrarotabsorptionsspektren (die mit KBr-Presslingen erhalten wurden) der folgenden Faktoren des Antibiotikums A-35512 hervor:
Figur 1 - A-35512 Faktor A Dihydrochlorid Figur 2 - A-35512 Faktor B Dihydrochlorid Figur 3 - A-35512 Faktor H Hydrochlorid Figur 4 - A-35512 Faktor C Dihydrochlorid 5 Figur 5 - A-35512 Faktor E Hydrochlorid
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon (gemessen in Nujol-Mull) ist in Fig. 6 dargestellt.
Die erfindungsgemäss erhaltenen A-35512 Faktoren sind io engverwandte Verbindungen. Bis zu sieben antibiotisch wirksame Faktoren lassen sich bei dem bei der Züchtung erhaltenen Antibiotikumgemisch A-35512 isolieren. Die Einzelfaktoren können voneinander getrennt werden, und die Faktoren A, B, C, E und H werden bevorzugt in der im folgenden beschriebe-15 nen Weise als Einzelverbindungen isoliert. Das Antibiotikumgemisch A-35512 ist in Wasser löslich, löst sich in Alkoholen, wie Methanol oder Äthanol, teilweise und ist in anderen organischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Chloroform, Aceton, Di-äthyläther, Äthylacetat, Toluol, Hexan, Acetonitril oder Dioxan 20 vollständig unlöslich.
Antibiotikum A-35512 Faktor A
Das Antibiotikum A-35512 Faktor A ist eine weisse amorphe basische Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor A 25 hat etwa eine Elementarzusammensetzung von 54,29% Kohlenstoff, 5,19% Wasserstoff, 5,58% Stickstoff, 33,76% Sauerstoff und 1,69% Chlor.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid ist eine weisse amorphe hygroskopische Verbindung. Das Antibio-30 tikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid hat eine mittlere Elementarzusammensetzung von 51,03% Kohlenstoff, 5,10% Wasserstoff, 4,75% Stickstoff, 34,20% Sauerstoff und 4,80% Chlor.
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor A Dihydrochlorid in Form eines KBr-Press-35 lings geht aus Figur 1 der Zeichnung hervor und weist signifikante Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm-1) auf : 3405 (stark), 3300 (Schulter), 2950 (schwach), 1750 (schwach), 1670 (stark), 1625 (Schulter), 1602 (stark), 1520 (stark), 1470 (schwach), 1440 (schwach), 1405 (schwach), 1345 40 (Schulter), 1312 (mittel), 1225 (mittel), 1180 (schwach), 1130 (schwach), 1080 (stark) und 1020 (Schulter).
Die Ultraviolettabsorptionsspektren des Antibiotikums A-35512 Faktor A Dihydrochlorid zeigen in saurem und neutralem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (epsi-45 Ion = 11 700) und in basischem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 292 nm (epsilon = 14 000), und zwar berechnet aufgrund eines Molekulargewichts von 2000. Die Ultraviolettspektren des Antibiotikums A-35512 Faktor A Dihydrochlorid zeigen ferner auch bei 225 nm eine Endabsorption.
so Ein 13C magnetisches Kernresonanzspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor A Dihydrochlorid in D2O hat folgende Charakteristiken:
65
Nr.
ppm
Höhe (%)
3
175,3
0,8
4
173,0
2,1
5
172,1
2,0
6
171,4
1,5
7
170,9
2,7
8
170,5
2,3
9
169,5
1,6
10
159,0
1,3
11
157,9
2,3
12
156,2
2,6
13
155,6
2,3
637 159
4
Nr.
ppm
Höhe (%)
14
155,3
2,4
15
154,4
1,1
16
136,3
1,4
17
136,0
1,0
18
135,1
1,4
19
133,5
1,2
20
129,6
1,6
21
129,1
1,7
22
128,7
1,8
23
127,5
1,0
24
126,0
1,4
25
124,3
2,8
26
122,1
1,6
27
109,9
1,3
28
107,4
1,6
29
101,7
0,9
30
77,6
3,8
31
76,3
4,6
32
75,5
2,6
33
74,8
2,5
34
74,5
2,4
35
73,4
3,7
36
72,8
6,0
37
72,0
4,4
38
70,9
7,0
39
69,6
2,8
40
67,4
90,9*
41
65,4
1,7
42
61,7
3,1
43
56,7
1,7
44
55,5
1,3
45
54,7
0,8
46
24,6
0,9
47
19,1
1,7
48
17,9
2,0
49
17,2
1,9
50
16,7
3,2
51
16,2
3,0
* Dioxan als Standard
Das Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid besitzt folgende spezifische Drehwerte:
[alpha]o = —100 (c = l.mO)
[alpha]365 = -400 (c = 1, H2O).
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor A Dihydrochlorid in 66prozentigem wässrigem Dime-thylformamid weist auf die Anwesenheit von vier titrierbaren Gruppen mit pKa-Werten von etwa 7,35,9,09,10,49 und 12,44 (Anfangs-pH-Wert 6,2) hin.
Das durch Titration bestimmte scheinbare Molekulargewicht des Antibiotikums A-35512 Faktor A Dihydrochlorid beträgt etwa 2106.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid ist in Wasser löslich, in Alkoholen, wie Methanol oder Äthanol, teilweise löslich und in anderen organischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthyläther, Äthylacetat,
Toluol, Hexan, Acetonitril oder Dioxan im allgemeinen unlöslich.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid ist in wässrigen Lösungen mit pH-Werten von etwa 3 bis etwa 10 über eine Zeitspanne von 72 Stunden stabil.
Eine Aminosäureanalyse des säurehydrolysierten Antibiotikums A-35512 Faktor A Dihydrochlorid ergibt, dass das Antibiotikum A-35512 Faktor A wenigstens 5 Aminosäurereste enthält, von denen einer Glycin ist.
Antibiotikum A-35512 Faktor B
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B ist eine weisse amorphe basische Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor B hat eine etwaige empirische Formel von Cgv.çgHioi-iosNg.gC^e-5 48C1. Das Antibiotikum A-35512 Faktor B weist eine mittlere Elementarzusammensetzung von 53,97% Kohlenstoff, 4,75% Wasserstoff, 5,25% Stickstoff, 34,29% Sauerstoff und 1,59% Chlor auf.
Die obige Elementarzusammensetzung stimmt besonders mit der bevorzugten empirischen Formel C98H104N9O47CI 10 (berechnet:C = 53,60;H = 4,75;N5,74;O = 34,30;Cl = 1,61) überein. Eine andere bevorzugte empirische Formel ist C98H103N8O47CI (berechnet: C = 54,00; H = 4,75 ;N = 5,15; O = 34,50;C1= 1,60).
Die Ultraviolettabsorptionsspektren des Antibiotikums 15 A-35512 Faktor B zeigen in saurem und neutralem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (epsilon = 15 000) und in basischem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 292 nm (epsilon = 16 000), berechnet auf einem Molekulargewicht von 2000. Die Ultraviolettspektren des Antibiotikums A-35512 Fak-20 tor B zeigen ferner auch eine Endabsorption bei 225 nm.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B verfügt über folgende spezifische Drehwerte:
[alphatè5 = -123° (c = 1, H2O).
[alphallös = —446° (c = 1, H2O).
25 Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor B in 66 prozentigem wässrigem Dimethylformamid weist auf die Anwesenheit von vier titrierbaren Gruppen mit pKa-Werten von etwa 7,15,8,81,10,20 und 12,00 sowie auf die mögliche Gegenwart einer weiteren Gruppe mit einem pKa-30 Wert von über 13,50 hin.
Das durch Titration bestimmte scheinbare Molekulargewicht des Antibiotikums A-35512 Faktor B beträgt etwa 2143.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid ist eine weisse kristalline Verbindung (aus 50prozentigem wässri-35 gern Methanol). Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid ist zwar hygroskopisch und hat keinen sauber ausgeprägten Schmelzpunkt, ein entsprechendes Thermogramm hiervon zeigt jedoch einen bei 25 °C beginnenden Gewichtsverlust, mit einem 7,4prozentigen Gewichtsverlust bei 121 °C und 40 einem unter Zersetzung verlaufenden weiteren Gewichtsverlust bei 135 °C.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid hat eine mittlere Elementarzusammensetzung von 52,57% Kohlenstoff, 4,80% Wasserstoff, 5,66% Stickstoff, 32,86% Sauerstoff 45 und 4,51% Chlor. Die obige Elementarzusammensetzung . stimmt genau überein mit einer anderen möglichen empirischen Formel C98H103N9O47CI • 2HC1 (berechnet : C = 51,93 ; H = 4,65 ; N = 5,57 ; O = 33,20 ; Cl = 4,65).
Die Ultraviolettspektren des Antibiotikums A-35512 Faktor so B Dihydrochlorid zeigen in saurem und neutralem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (epsilon = 12 000) und in basischem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 292 nm (epsilon = 14 000), berechnet unter Verwendung eines Molekulargewichts von 2000. Das Ultraviolettspektrum des Antibioti-55 kums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid zeigt ferner auch bei 225 nm eine Endabsorption.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid besitzt folgende spezifische Drehwerte:
[alphajo5 = -128 (c = 1, H2O)
60 [alpha]H5 = -475° (c = 1, H2O).
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid in 66prozentigem wässrigem Dimethylformamid weist auf die Anwesenheit von vier titrierbaren Gruppen mit pKa-Werten von etwa 7,15, 8,87,10,30 und 12,10 65 sowie auf die mögliche Gegenwart einer weiteren Gruppe mit einem pKa-Wert von über 13,1 hin.
Das durch Titration bestimmte scheinbare Molekulargewicht des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid beträgt etwa 2027.
5
637 159
Das 13C magnetische Kernresonanzspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid in D2O weist folgende Charakteristiken auf :
Das aus Methanol-Wasser umkristallisierte Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid besitzt folgendes charakteristisches Pulver-Röntgenbeugungsdiagramm (Cu + + Strahlung lambda 1,5405, Nickelfilter, d = Interplanarabstand in Angstrom) :
Nr.
ppm
Höhe (%)
2
173,0
4,1
3
171,9
3,7
4
171,6
3,3
5
171,0
5,8
6
170,8
5,0
7
169,6
3,6
8
159,0
4,1
9
157,9
4,4
10
157,5
3,7
11
156,6
4,8
12
155,6
6,1
13
155,3
4,2
14
154,9
3,3
15
154,3
4,2
16
151,7
3,3
17
144,3
3,1
18
136,7
3,5
19
136,2
4,9
20
135,4
4,0
21
135,2
4,4
22
133,6
4,2
23
133,3
4,1
24
129,8
1,7
25
129,3
3,0
26
128,8
2,6
27
127,6
1,5
28
126,1
3,9
29
124,2
5,6
30
122,4
1,4
31
122,0
4,4
32
120,7
3,3
33
116,5
2,7
34
109,5
0,8
35
108,2
1,1
36
107,7
2,7
37
104,5
1,7
38
101,8
2,9
39
100,9
1,6
40
98,2
1,0
41
76,9
1,2
42
76,1
1,8
43
74,1
2,0
44
73,5
2,7
45
72,7
2,4
46
72,3
4,0
47
71,0
7,1
48
70,3
2,5
49
69,7
2,5
50
67,4
74,7*
51
64,6
1,2
52
62,0
1,5
53
58,0
1,3
54
56,8
1,7
55
55,4
3,9
56
54,3
2,5
57
24,5
2,0
58
17,9
3,0
59
17,2
2,0
60
16,3
2,5
d
Relative Intensität
17,15
100
12,90
80
10,85
70
9,25
70
8,87
60
8,22
50
7,86
50
6,93
40
6,20
40
5,62
40
5,04
05
4,02
02
3,54
02
25 Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid in Form von KBr-Presslin-gen geht aus Fig. 2 der Zeichnung hervor. Die signifikantesten Absorptionsmaxima treten bei folgenden Frequenzen (cm-1) auf : 3420 (stark), 3300 (Schulter), 2950 (schwach), 1752 30 (schwach), 1675 (stark), 1630 (Schulter), 1605 (stark), 1520 (stark), 1470 (schwach), 1440 (schwach), 1410 (schwach), 1345 (Schulter), 1312 (mittel), 1225 (mittel), 1180 (mittel), 1135 (schwach), 1080 (stark) und 1020 (schwach).
Die Aminosäureanalyse des säurehydrolysierten A-35512 35 Faktor B Dihydrochlorids ergibt, dass das Antibiotikum A-35512 Faktor B wenigstens 5 Aminosäurereste enthält, von denen einer Glycin ist. Die vier restlichen Aminosäurereste im Antibiotikum A-35512 Faktor B sind komplex und scheinen mit denen, wie sie auch im Antibiotikum A-35512 Faktor A zu 40 finden sind, identisch zu sein. Die Struktur eines dieser Aminosäurereste dürfte folgende sein :
HOOG Mte i r
^OO
L I
f/^COOH
* Dioxan als Standard
55 Eine Analyse seiner säurehydrolysierten Produkte ergibt, dass das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid folgende Zucker erhält: Glucose, Fructose, Mannose, Rhamnose und 3-Amino-2,3,6-trideoxy-3-C-methyl-L-xylohexopyranose.
Durch milde saure Hydrolyse des Antibiotikums A-35512 Fak-60 tor B Dihydrochlorid werden die Glucose-, Fructose-, Mannose-und Rhamnosegruppen entfernt, und es entsteht ein charakteristisches Aglykonderivat.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid verfügt über wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe. 65 Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid ist in Wasser löslich, löst sich teilweise in Alkoholen, wie Methanol oder Äthanol, und ist in anderen weniger polaren organischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthyl-
637 159
6
äther, Äthylacetat, Toluol, Hexan, Acetonitril oder Dioxan, unlöslich.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid ist in wässrigen Lösungen mit pH-Werten von etwa 3 bis etwa 10 bis zu 72 Stunden stabil.
Antibiotikum A-35512 Faktor C
Das Antibiotikum A-35512 Faktor C ist eine weisse amorphe basische Verbindung.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor C hat eine mittlere Elementarzusammensetzung von 53,93% Kohlenstoff, 5,15% Wasserstoff, 5,80% Stickstoff, 32,35% Sauerstoff und 1,90% Chlor.
Die obige Elementarzusammensetzung stimmt mit der bevorzugten empirischen Formel C84H99N8O38CI überein. Das Antibiotikum A-35512 Faktor C hat ein Molekulargewicht von etwa 1862.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid ist eine weisse amorphe Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid hat eine mittlere Elementarzusammensetzung von 51,76% Kohlenstoff, 5,07% Wasserstoff, 5,61% Stickstoff, 30,29% Sauerstoff und 4,88% Chlor.
Die empirische Formel für das Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid entspricht etwa Cgß.gsHsv.ioiNsOsv.sgCb.
Die Elementarzusammensetzung stimmt genau überein mit einer anderen bevorzugten empirischen Formel Cs4H97N8038C1.2HCl (berechnet: C = 52,2%; H = 5,1%;N = 5,8%; O = 31,5%; Cl = 5,4%).
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor C Dihydrochlorid in Form von KBr-Presslin-gen geht aus Figur 4 der Zeichnung hervor. Die signifikantesten Absorptionsmaxima treten bei folgenden Frequenzen (cm-1) auf: 3370 (stark), 3280 (Schulter); 3040 (Schulter), 2980 (Schulter), 2920 (schwach), 1740 (schwach), 1658 (stark), 1620 (schwach), 1589 (mittel), 1503 (stark), 1460 (schwach), 1428 (mittel), 1385 (schwach), 1330 (schwach), 1295 (mittel), 1210 (stark), 1162 (mittel), 1120 (schwach), 1060 (stark) und 1005 (mittel).
Die Ultraviolettabsorptionsspektren des Antibiotikums A-35512 Faktor C Dihydrochlorid zeigen in saurem und neutralem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (epsilon = 14 600) und in basischem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 292 nm (epsilon = 16 400), berechnet unter Verwendung eines Molekulargewichts von 2000.
Das l3C magnetische Kernresonanzspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor C Dihydrochlorid in D2O hat folgende Charakteristiken:
Nr.
ppm
Höhe (°/o)
18
126,5
3,1
19
124,6
2,1
5 20
129,3
2,7
21
121,5
2,2
22
120,1
1,2
23
118,0
1,7
24
116,5
1,2
10 25
107,8
2,7
26
104,5
1,9
27
101,7
1,9
28
94,5
1,0
29
75,9
3,0
15 30
74,3
2,0
31
73,4
2,3
32
72,1
3,5
33
70,9
4,3
34
68,7
2,9
20.35
67,4
71,7*
36
64,3
1,3
37
62,2
1,6
38
56,1
1,4
39
55,2
3,5
25 40
54,2
2,1
41
24,3
1,9
42
17,9
2,2
43
17,1
2,0
44
16,2
2,0
30
* Dioxan als Standard
Nr.
ppm
Höhe (%)
1
172,9
2,5
2
172,2
2,0
3
171,5
2,2
4
171,0
3,9
5
169,6
2,0
6
158,6
1,8
7
157,8
3,0
8
156,5
2,1
9
156,1
2,8
10
155,6
4,2
11
154,6
3,9
12
151,1
1,5
13
143,3
1,4
14
136,0
3,2
15
135,4
2,7
16
133,2
3,7
17
128,7
2,3
Das Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid besitzt 35 folgende spezifische Dreh werte:
[alpha]o5 = -161° (c = 1,05, H2O)
[alpha]||5 = -614° (c = 1,05, H2O).
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512 40 Faktor C Dihydrochlorid in 66prozentigem wässrigem Dime-thylformamid weist auf die Gegenwart von drei titrierbaren Gruppen mit pKa-Werten von etwa 7,30,8,92 und 10,99 sowie die mögliche Gegenwart zweier oder mehrerer Gruppen mit pKa-Werten von über 11,5 hin.
45 Das durch Titration bestimmte scheinbare Molekulargewicht des Antibiotikums A-35512 Faktor C Dihydrochlorid beträgt etwa 1982.
Die Aminosäureanalyse des säurehydrolysierten Antibiotikums A-35512 Faktor C Dihydrochlorid ergibt, dass dieses 50 wenigstens 5 Aminosäurereste enthält, von denen einer Glycin zu sein scheint. Die vier anderen Aminosäurereste sind bisher nicht identifiziert worden.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid ist in Wasser, Dimethylsulfoxid und wässrigem Dimethylformamid 55 löslich, löst sich teilweise in Alkoholen, wie Methanol oder Äthanol, und ist in weniger polaren organischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthyläther, Äthylacetat, Toluol, Hexan, Acetonitril oder Dioxan, unlöslich.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid ist in 60 wässrigen Lösungen mit pH-Werten von etwa 3 bis etwa 10 bis zu 146 Stunden stabil.
Antibiotikum A-35512 Faktor E
Das Antibiotikum A-35512 Faktor E ist eine weisse amor-65 phe basische Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor E hat eine Elementarzusammensetzung von etwa 54,84% Kohlenstoff, 4,73% Wasserstoff, 5,26% Stickstoff, 32,67% Sauerstoff und 1,72% Chlor.
7
637 159
Das Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid ist eine weisse amorphe Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid hat eine Elementarzusammensetzung von etwa 52,67% Kohlenstoff, 4,59% Wasserstoff, 5,55% Stickstoff, 33,51% Sauerstoff und 3,62% Chlor. 5
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor E Hydrochlorid in Form von KBr-Presslingen geht aus Fig. 5 der Zeichnung hervor. Die signifikantesten Absorptionsmaxima treten bei folgenden Frequenzen (cm-1) auf : 3360 (stark), 3220 (Schulter), 2900 (schwach), 1725 io
(schwach), 1650 (stark), 1580 (mittel), 1498 (stark), 1450 (schwach), 1419 (schwach), 1295 (mittel), 1205 (mittel), 1172 (mittel), 1110 (schwach), 1060 (stark) und 1000 (schwach).
Die Ultraviolettspektren des Antibiotikums A-35512 Faktor E Hydrochlorid weisen folgende Absorptionsmaxima auf : In 15 neutralem Methanol bei 270 nm (Schulter) und 359 nm (epsilon = 16 216), in saurem Methanol bei 286 nm (epsilon = 18 018) und 310 nm (Schulter), in basischem Methanol bei 270 nm (Schulter), 300 nm (epsilon = 16 216) und 354 nm (epsilon = 17 568), berechnet unter Verwendung eines Molekulargewichts 20 von 2000.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid hat folgenden spezifischen Dreh wert:
[alpha]o5 = -108,3 (c = 1, H2O).
(mittel), 1118 (schwach), 1135 (schwach), 1080 (stark) und 1020 (Schulter).
Die Ultraviolettabsorptionsspektren des Antibiotikums A-35512 Faktor H Hydrochlorid ergeben in saurem und neutralem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (epsilon = 12 500) und in basischem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 292 nm (epsilon = 14000), berechnet unter Verwendung eines Molekulargewichts von 2000. Die Ultraviolettspektren des Antibiotikums A-35512 Faktor H Hydrochlorid zeigen bei 225 nm ferner auch eine Endabsorption.
Das l3C magnetische Kernresonanzspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor H Hydrochlorid in D2O weist folgende Charakteristiken auf :
25
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor E Hydrochlorid in 66prozentigem wässrigem Dimethyl-formamid weist auf die Gegenwart von drei titrierbaren Gruppen mit pKa-Werten von etwa 6,30,9,09 und 11,62 sowie die mögliche Gegenwart von ein oder zwei Gruppen mit pKa-Wer-ten von etwa 12,5 oder darüber (bei einem Anfangs-pH-Wert von 5,45) hin.
Das durch Titration bestimmte scheinbare Molekulargewicht des Antibiotikums A-35512 Faktor E Hydrochlorid beträgt etwa 2018.
Die Aminosäureanalyse des säurehydrolysierten Antibiotikums A-35512 Faktor E Hydrochlorid ergibt, dass das Antibiotikum A-35512 Faktor E sechs bis jetzt noch nicht identifizierte Aminosäurereste enthält.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid ist in Wasser löslich, in Alkoholen, wie Methanol oder Äthanol, teilweise löslich, in den meisten organischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthyläther, Äthylacetat,
Toluol, Hexan, Acetonitril oder Dioxan, jedoch unlöslich.
Antibiotikum A-35512 Faktor H
Das Antibiotikum A-35512 Faktor H ist eine weisse amorphe basische Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor H hat eine Elementarzusammensetzung von etwa 53,76% Kohlenstoff, 5,32% Wasserstoff, 5,53% Stickstoff, 33,48% Sauerstoff und 1,59% Chlor.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor H verfügt über die empirische Formel C85_87Hio3-io7Ns038_4oClJ wobei die bevorzugte empirische Formel CsöHkmNsOjsCI sein dürfte, und hat ein Molekulargewicht von etwa 1908.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydrochlorid ist eine weisse amorphe hydroskopische Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydrochlorid hat eine Elementarzusammensetzung von etwa 53,10% Kohlenstoff, 5,37% Wasserstoff, 5,35% Stickstoff, 30,12% Sauerstoff und 3,78%
Chlor.
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor H Hydrochlorid in Form von KBr-Presslingen geht aus Fig. 3 der Zeichnung hervor. Die signifikantesten Absorptionsmaxima treten bei folgenden Frequenzen (cm-1) auf : 3410 (stark), 3240 (Schulter), 2940 (schwach), 1670 (stark), 1630 (Schulter), 1605 (stark), 1520 (stark), 1470 (schwach), 1442 (schwach), 1400 (schwach), 1345 (Schulter), 1310 (mittel), 1225
30
35
40
45
50
55
60
65
Nr.
ppm
Höhe (%)
2
177,2
2,7
3
171,6
5,2
4
170,9
5,8
5
169,6
4,7
6
158,9
3,1
7
157,6
4,3
8
156,6
3,8
9
155,6
4,1
10
155,4
3,8
11
154,3
2,4
12
151,3
1,6
13
137,7
2,0
14
136,7
2,2
15
136,0
4,0
16
135,3
1,9
17
133,5
5,0
18
129,4
3,7
19
127,3
1,3
20
126,1
3,2
21
124,2
6,9
22
122,6
4,1
23
107,6
2,7
24
101,8
1,8
25
76,2
2,8
26
73,5
4,4
27
72,3
7,4
28
71,0
12,2
29
69,7
4,6
30
67,4
73,1*
31
61,6
3,5
32
56,8
1,8
33
55,4
2,8
34
55,0
1,5
35
24,5
2,6
36
17,9
4,6
37
17,2
2,6
38
16,3
3,6
* Dioxan als Standard
Das Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydrochlorid hat folgenden spezifischen Dreh wert:
[alpha]o = -123,5° (c = 1, H2O).
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor H Hydrochlorid in 66prozentigem wässrigem Dimethyl-formamid weist auf die Gegenwart von fünf titrierbaren Gruppen mit pKa-Werten von etwa 5,0,7,46,9,80,11,43 und 13,02 (Anfangs-pH-Wert 5,93) hin.
637 159
8
Das durch Titration bestimmte scheinbare Molekulargewicht des Antibiotikums A-35512 Faktor H Hydrochlorid beträgt etwa 1660.
Die Aminosäureanalyse des säurehydrolysierten Antibiotikums A-35512 Faktor H Hydrochlorid ergibt, dass das Antibiotikum A-35512 Faktor H wenigstens 5 Aminosäurereste enthält, von denen einer Glycin ist. Die anderen vier Aminosäurereste im Antibiotikum A-35512 Faktor H scheinen mit denjenigen identisch zu sein, wie man sie auch bei dem Antibiotikum A-35512 Faktoren A und B findet.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydrochlorid ist in Wasser löslich, löst sich in Alkoholen, wie Methanol oder Äthanol, nur teilweise, ist jedoch in den meisten organischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthyl-äther, Äthylacetat, Toluol, Hexan, Acetonitril oder Dioxan, unlöslich. J,
Das Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydrochlorid ist-in wässrigen Lösungen mit pH-Werten von etwa 3 bis etwa lß bis zu 72 Stunden stabil.
Die Auftrennung des Antibiotikumgemisches À-35512 in die Einzelfaktoren A, B, C, E und H und die weniger häufigen Faktoren F und G erfolgt papierchromatographisch unter Verwendung eines Lösungsmittelsystemsaus 1-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser (15:10:3:12). Eine bevorzugte Detek-tionsmethode besteht in einer Bioautographie unter Verwendung von Sarcina lutea. Die ungefähren RrWerte der einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-35512 in diesem System gehen aus folgenderTabelle I hervor.
Tabelle I
Säulengrösse:
3,175x 152,4 mm
Packung:
Polyamid (ZIPAX, DuPont)
Lösungsmittel:
KH2P04(327 g)/HzO (1800 ml)
Strömungsgeschwindigkeit :
0,5 ml/min
Kartengeschwindigkeit :
5,1 cm/Std.
Druck:
105 kg/cm2
Tabelle III
A-35512 Faktor
Verweilzeit (Minuten)
A
9,375
B
13,125
C
26,25
E
5,625
F
7,5
G
7,5
H
7,5
A-35512 Faktor
Rf-Wert
Faktor A-2HC1
0,21
Faktor B-2HC1
0,34
Faktor C-2HC1
0,46
Faktor E-HCl
0,64
Faktor F
0,81
Faktor G
0,93
Faktor H-HCl
0,15
In verschiedenen Systemen hat das Antibiotikum A-35512 Faktor H ein chromatographisches Profil, das demjenigen des Antibiotikums AM374 (US-PS 3 700 768) sehr ähnlich ist. Das Antibiotikum A-355.12 Faktor H lässt sich von dem Antibiotikum AM374 in wenigstens zwei papierchromatographischen Systemen unterscheiden. Die RrWerte für das Antibiotikum A-35512 Faktor H • 2HC1 und AM374 in diesen beiden Systemen gehen aus der folgenden Tabelle II hervor:
Tabelle II
Rf-Wert
Lösungsmittelsystem
A-35512 H
AM374
CH3OH :0,1 n HCl (3:1 )
0,47
0,58
l-Propanol:NH40H:H20 (6:3:1)
0,11
0,20
Mehrere Faktoren des Antibiotikumgemisches A-35512 lassen sich auch durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung von Polyamid (ZIPAX, DuPont) als stationärer Phase und einer 1,33-molaren wässrigen einbasi- Nr. sehen Kaliumphosphatlösung als mobiler Phase sowie durch Ultraviolettdetektion (250 nm) voneinander trennen. Aus der \ folgenden Tabelle III gehen die Retentionszeiten für die Fakto- 65 2 ren des Antibiotikums A-35512 bei einer typischen Auftren- 3 nung durch Hochleistungsflüssigchromatographie unter Ein- 4 satz folgender Bedingungen hervor: 5
20 Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid ist eine weisse amorphe Verbindung mit einer Elementarzusammensetzung von etwa 54,29% Kohlenstoff, 4,34% Wasserstoff, 7,40% Stickstoff; 5,02% Chlor und 28,95% Sauerstoff 25 (durch Differenzbildung).
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid in Nujol-Mull geht aus Fig. 6 der Zeichnung hervor. Die signifikantesten Absorptionsmaxima treten bei folgenden Frequenzen (cm-1) auf : 3440 30 (Schulter), 3340 (Schulter), 3215 (stark), 2950 (Schulter), 2910 (stark), 2840 (stark), 2640 (Schulter), 1735 (schwach), 1655 (stark), 1590 (mittel), 1500 (stark), 1460 (stark), 1378 (mittel), 1365 (Schulter), 1298 (mittel), 1215 (mittel), 1155 (mittel), 1120 (Schulter), 1105 (schwach), 1060 (schwach), 1040 (schwach), 35 1008 (mittel), 925 (schwach), 875 (schwach), 765 (Schulter) und 718 (schwach).
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid in 66prozentigem wässrigem Dimethylformamid weist auf die Gegenwart von drei titrierba-40 ren Gruppen mit pKa-Werten von etwa 7,5,9,25 und 11,0 sowie die mögliche Gegenwart zweier weiterer Gruppen mit pKa-Werten von über 11,0 hin.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid hat ein durch Titration bestimmtes Molekulargewicht von etwa 45 1282.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid hat folgende spezifische Drehwerte :
[alpha]o = -178° (c = 5, CHsOH)
50
[alphaÜs = -716,8° (c = 5, CH3OH).
Die Ultraviolettabsorptionsspektren des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid zeigen in saurem und 55 neutralem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (E'um = 102,62) und in basischem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 302 nm (E'^m = 182,09).
Das 13C magnetische Kernresonanzspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon in DMSO-dó bei 90 °C hat fol-6ogende Charakteristiken:
ppm
Höhe (%)
187,8
172.0 170,7
170.1 169,6
37,2 40,9 45,2 46,9 47,7
9
637 159
Nr.
ppm
Höhe (°/o)
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid
enthält wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe.
6
168,4
57,6
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid
7
166,7
52,5
ist in Wasser und Methanol löslich, in weniger polaren
8
157,4
49,9
s Lösungsmitteln, wie Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthyl-
9
156,6
45,5
äther, Äthylacetat, Toluol, Hexan, Acetonitril oder Dioxan,
10
155,7
55,8
jedoch unlöslich.
11
155,6
71,5
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid
12
155,4
56,7
hat bei einer Cellulosedünnschichtchromatographie (Alumi-
13
154,5
50,5
io niumträger) unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus
14
149,3
43,0
1-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser (15:10:3:12) einen
15
138,8
38,8
RrWert von etwa 0,80. Die Detektion erfolgt vorzugsweise
16
136,9
54,3
durch Bioautographie unter Verwendung von Sarcina lutea.
17
136,3
40,2
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid
18
135,2
31,7
15 ergibt bei einer Silicageldünnschichtchromatographie unter
19
134,7
28,4
Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Methanol, Chlo
20
133,8
40,9
roform und konzentriertem Ammoniumhydroxid (3:2:1) einen
21
128,2
102,9
RrWert von etwa 0,26.
22
126,2
77,2
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon (freie Base)
23
123,0
57,5
20 ist eine weisse amorphe Verbindung mit einer mittleren Ele
24
121,3
38,1
mentarzusammensetzung von etwa 52,65% Kohlenstoff, 4,57%
25
117,7
44,4
Wasserstoff, 6,91% Stickstoff, 2,94% Chlor, 27,04% Sauerstoff
26
117,0
31,5
und 4,70% Asche.
27
108,6
31,0
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums
28
106,7
47,9
25 A-35512 Faktor B Aglykon (freie Base) in Form von KBr-Press-
29
105,7
81,2
lingen weist signifikante Absorptionsmaxima bei folgenden
30
103,2
26,5
Frequenzen (cm-1) auf : 3360 (stark), 3260 (Schulter), 2940
31
93,6
33,4
(Schulter), 1735 (Schulter), 1660 (stark), 1598 (mittel), 1510
32
74,9
39,8
(stark), 1440 (mittel), 1295 (schwach), 1215 (mittel), 1165 (mit-
33
71,8
33,9
3o tel), 1122 (schwach), 1070 (schwach), 1018 (stark), 940
34
68,9
40,2
(schwach) und 920 (schwach).
35
63,2
43,1
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512
36
60,4
33,6
Faktor B Aglykon (freie Base) in 66prozentigem wässrigem
37
57,1
57,8
Dimethylformamid weist auf die Gegenwart von fünf titrierba-
38
55,2
33,1
35 ren Gruppen mit pKa-Werten von etwa 6,2, 8,2, 10,1, 11,4 und
39
53,2
30,1
12,4 und die mögliche Gegenwart einer oder zweier weiterer
40
51,8
36,0
Gruppen mit pKa-Werten von über 12,5 hin.
41
40,7
43,4*
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon (freie Base)
42
39,9
60,9*
hat folgenden spezifischen Drehwert:
43
39,1
43,9*
40 [alphaß5 = -64,5° (c = 3, DMSO).
44
23,8
55,7
Die Ultraviolettabsorptionsspektren des Antibiotikums
45
17,1
47,8
A-35512 Faktor B Aglykon (freie Base) zeigen in neutralem und
46
0,0
43,7
saurem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (E'^n,
= 43,65) und in basischem Methanol ein Absorptionsmaximum
*DMSO-dó
45 bei 301 nm (E10/2m = 67,46).
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon (freie Base) Das UC magnetische Kernresonanzspektrum zeigt, dass hat die gleichen ungefähren RrWerte, wie sie vorher für das auch im Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon der 3-Amino- Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid beschrieben worden sind.
so Neben der freien Base und dem Hydrochlorid der einzelnen Faktoren des Antibiotikumgemisches A-35512 sowie des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon können auch andere pharmazeutisch unbedenkliche Säureadditionssalze des Antibiotikums A-35512 mit den Faktoren A, B, C, E und H sowie 55 des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon hergestellt werden. Unter pharmazeutisch unbedenklichen Salzen werden dabei Salze verstanden, die gegenüber der Nichtsalzform der Verbindungen insgesamt keine Erhöhung der Toxizität gegenüber Warmblütern ergeben. Typische und geeignete Salze 60 des Antibiotikums A-35512 mit den Faktoren A, B, C, E und H sowie des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon sind diejenigen, wie sie durch übliche Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren entstehen, beispielsweise mit Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Citronen-65säure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamoarsäure, Mutinsäure, D-Glutaminsäure, d-Camphersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansul-
2,3,6-trideoxy-3-C-methyl-L-xylohexopyranoserest (nämlich einer der Zucker, die auch beim Antibiotikum A-35512 Faktor B vorhanden sind) enthalten ist.
Die Aminosäureanalyse des weiter säurehydrolysierten Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid zeigt, dass das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon Glycin und wenigstens drei komplexe Aminosäurereste enthält. Die Struktur eines dieser Aminosäurereste dürfte folgende sein :
HOOG RHz i r
YY
1 X
H H COOH
2
637 159
10
15
20
fonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure oder Zimtsäure.
Die neuen Antibiotika werden erfindungsgemäss hergestellt, indem man einen das Antibiotikum A-35512 bildenden Stamm von Streptomyces Candidus NRRL 8156 submers unter aeroben 5 Bedingungen solange in dem weiter oben definierten Kulturmedium züchtet, bis eine wesentliche antibiotische Aktivität gebildet ist. Die Gewinnung der dabei erhaltenen Antibiotika kann unter Einsatz von in der Fermentationstechnik bekannten verschiedenen Isolierungs- und Reinigungsverfahren erfol- io gen.
Der zur Herstellung der Antibiotika A-35512 geeignete neue Mikroorganismus wurde aus einer auf dem Eniwetok-Atoll gesammelten Bodenprobe isoliert. Dieser Mikroorganismus lässt sich als neuer Stamm von Streptomyces Candidus (Kressilnikov) Waksman nach E.B. Shirling und D. Gottlieb in «Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces» klassifizieren.
Diese Klassifizierung beruht auf Methoden, wie sie vom International Streptomyces Project [E.B. Shirling und D. Gottlieb, «Methods for Characterizätion of Streptomyces Species», Intern. Bull Systematic Bacteriol. 16:313-340 (1966)] empfohlen werden, zusammen mit bestimmten ergänzenden Untersuchungen. Die Farbnamen werden nach der ISCC-NBS-Methode (K.L. Kelly und D.B. Judd, «The ISCC-NBS Method of Determining Colors and a Dictionary of Color Names», U.S. Department of Commerce Cir. 553, Washington, D.C., 1955) bezeichnet. Die in Parenthesen befindlichen Zahlen beziehen sich auf die Farbreihen von Tresner und Backus [H.D. Tresner und S.J. Backus, «System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy», Appi. Microbiol. 11:335-338 (1963)], wobei die Bezeichnungen der Farbstreifen unterstrichen sind. In Klammern sind die Farbblöcke nach Maerz und Paul (A. Maerz und M.R. Paul, «Dictionary of Color», McGraw-Hill, New York, N. Y„ 1950) angegeben. Sofern nichts anderes gesagt ist, lässt man die Kulturen jeweils 14Tage bei 30 °C wachsen.
Charakterisierung des A-35512 produzierenden Mikroorganismus
Morphologie
Es werden lange gewellte Sporophoren gebildet. Die Sporen, die in 10- bis 50er Ketten auftreten, sind zylindrisch und haben Abmessungen von 0,7 bis 1,05 jx x 1,4 bis 3,5 (x. Auf mehreren Medien entstehen sklerotiumartige Strukturen. Gelegentlich lassen sich auch besenförmige oder büschelartige Hyphen feststellen. Die Sporenoberfläche ist einer elektronenmikrosko- 45 pischen Untersuchung zufolge glatt.
Medium
Charakteristiken
Glycerin-Asparagin-Agar (ISP Nr. 5)
Emerson-Agar modifizierter Bennet-Agar
Czapek-Lösung-Agar
30
35
40
T omatenpaste-Haf ermehl-Agar
Züchtungsverhalten auf verschiedenen Medien
Medium
Charakteristiken
50
Nährstoff-Agar
Glucose-Asparagin-Agar
T rypton-Hefeextrakt-Agar
Tyrosin-Agar
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar(ISPNr. 2)
Hafermehl-Agar (ISP Nr. 3)
Anorganische
Salze-Stärke-Agar (ISP Nr. 4)
Starkes Wachstum, Unterseite gräulichgelb (11J5), reichlich Luftmyzel und Sporulation, weiss (w) a, kein lösliches ( Pigment;
mittleres Wachstum,
Unterseite fahlgelbgrün [10B1], leidlich Luftmyzel und Sporulation, weiss (w) 13ba,
kein lösliches Pigment, es lassen sich sklerotiumartige Körper feststellen;
gutes Wachstum, Unterseite bernsteinfarben weiss [10C1], gutes Luftmyzel und gute Sporulation, gelblichgrau (GY)
55
Glycerin-Glycin-Agar
60
Calcium-Malat-Agar
65
2dc, leicht braunes lösliches Pigment, es lassen sich sklerotiumartige Körper feststellen;
gutes Wachstum, Unterseite fahlgelbgrün [10B2], gutes Luftmyzel und gute Sporulation, weiss (w) a, kein lösliches Pigment, das Myzel scheint büschelartig zu sein; gutes Wachstum, Unterseite helloliv [14L6], kein Luftmyzel und keine Sporulation, hellbraunes lösliches Pigment; reichliches Wachstum, Unterseite mässig gelb [11J6], reichliches Luftmyzel und reichliche Sporulation, weiss (w) a, kein lösliches Pigment; gutes Wachstum, Unterseite fahlgelbgrün [10B1], gutes Luftmyzel und gute Sporulation, weiss (w) b, kein lösliches Pigment, das Myzel erscheint büschelartig; reichliches Wachstum, Unterseite gräulich gelb [1115], reichliches Luftmyzel und reichliche Sporulation, weiss (w) a, das Myzel rollt sich von der Agaroberfläche ab, kein lösliches Pigment;
leidliches bis gutes Wachstum, Unterseite fahlgelbgrün [18D2], gutes Luftmyzel und gute Sporulation, weiss (w) a, hellbraunes lösliches Pigment; gutes Wachstum, Unterseite fahlgelbgrün [17E1], gutes Luftmyzel und gute Sporulation, weiss (w) 13ba, kein lösliches Pigment; leidliches Wachstum, Unterseite weiss [10A1],
leidlich Luftmyzel und Sporulation, weiss (w) b, kein lösliches Pigment;
gutes Wachstum, Unterseite weiss [10B2], gutes Luftmyzel und gute Sporulation, weiss (w)
a, braunes lösliches Pigment, es lassen sich sklerotiumartige Pigmente feststellen;
gutes Wachstum, Unterseite weiss [10B2], gutes Luftmyzel und gute Sporulation, weiss (w)
b, hellbraunes lösliches Pigment;
gutes Wachstum, Unterseite weiss [10B1], gutes Luftmycel und gute Sporulation, weiss (w) a, kein lösliches Pigment, das Medium klärt sich um die Zone des Inokulums herum auf.
11
637 159
Der Mikroorganismus wird ferner auch unter Verwendung von Standardverfahren bezüglich ausgewählter physiologischer Eigenschaften untersucht. Hierbei ergibt sich folgendes:
Eigenschaften
Charakteristiken
Wirkung auf Milch
Nitratreduktion Melaninbildung auf : Pepton-Eisen-Schrägagar T y rosin-Schrägagar
T rypton-Hefeextrakt-Brühe Gelatineverflüssigung
Temperaturanforderungen
Hefeextrakt-Malzextrakt-Schräg agar (ISP Medium Nr. 2):
Koagulation unter einer gewissen Aufklärung nach 14
Tagen;
positiv;
negativ;
schwach positiv (Pigment nach 7 Tagen)
negativ ;
nach 14 Tagen vollständig beendet;
26-30 °C, gutes Wachstum und gute Sporulation ; 37 °C - spärliches Wachstum, kein Luftmyzel und keine Sporen;
40 °C - nur leichtes vegetatives Wachstum ;
45 °C - kein Wachstum
Die bei entsprechenden Untersuchungen über die Kohlenstoffverwertung des Mikroorganismus NRRL 8156 erhaltenen Ergebnisse gehen aus folgender Aufstellung hervor:
Bewertung:
+ = gutes Wachstum, positive Verwertung ( + ) = schwaches bis leidliches Wachstum (-) = geringes Wachstum, möglicherweise keine Verwertung - = kein Wachstum, keine Verwertung
Kohlenstoffquelle :
Keine (negative Kontrolle) D-Glucose (positive Kontrolle) L-Arabinose Saccharose iso-Inosit D-Mannit D-Fructose Rhamnose Raffinose D-Xylose
(-) +
(-)
(") +
+ +
(~) (-) (+)
NRRL8156
Veröffentlichte Beschreibung iso-Inosit
+
—
Gelatineverflüssigung vollständig langsam
nach 14 Tagen
Wirkung auf Milch
Koagulation;
keine
gewisse Auf
Koagulation ;
klärung nach gute
14 Tagen
Peptinisierung
Bestimmte Eigenschaften des A-35512 bildenden Stammes S. Candidus NRRL 8156 unterscheiden sich von den Eigenschaften des von Shirling und Gottlieb beschriebenen Mikroorganismus [Elwood, B. Shirling und David Gottlieb, «Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces III. Additio nal Species Descriptions from First and Second Studies»,
Intern. J. Systematic Bacteriol. 18(2), 69-189 (1968)] und von Waksman [S.A. Waksman, «The Actinomycetes. Classification, Identification and Descriptions of Genera and Species», Vol. 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md., 1961]. Diese Unterschiede gehen aus folgender Tabelle IV hervor:
Tabelle IV
NRRL 8156
Veröffentlichte Beschreibung
Kohlenstoffverwertung
L-Arabinose
Rhamnose
+ +
Eine Kultur des das Antibiotikum A-35512 produzierenden Mikroorganismus Streptomyces Candidus ist in der ständigen 15 Sammlung des Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peo-ria, Illinois, 61604, hinterlegt worden und von dort unter der Hinterlegungsnummer NRRL 8156 frei beziehbar.
Wie bei anderen Organismen unterliegen die Eigenschaften 20 der die Antibiotikum A-35512 produzierenden Kultur, nämlich des Streptomyces Candidus NRRL 8156, einer Variation. Beispielsweise kann man durch Behandlung mit verschiedenen bekannten mutagenen Mitteln, wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radioaktiver Strahlung oder 25 Chemikalien, künstliche Varianten und Mutanten des Stammes NRRL 8156 bilden. Alle natürlichen und künstlichen Varianten sowie Mutanten, die zu Streptomyces Candidus gehören und die Antibiotika A-35512 produzieren, können erfindungsgemäss verwendet werden.
30 Zur Züchtung des Mikroorganismus Streptomyces Candidus NRRL 8156 kann man irgendeines der vielen Kulturmedien verwenden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, einer optimalen Ausbeute bezüglich des Antibiotikums und einer leichten Isolierung des Produkts werden jedoch gewisse 35 Kulturmedien bevorzugt. So ist beispielsweise die für die Fermentation in grossem Massstab vorzugsweise angewandte Koh-lenhydratquelle Saccharose, obgleich man stattdessen auch Glucose, Tapiocadextrin, Fructose, Mannit, Maltose, Lactose oder dergleichen verwenden kann. Eine bevorzugte Stickstoff-40 quelle ist Fleischpepton, man kann jedoch auch mit Sojabohnenmehl, Schweineblutmehl, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, oder dergleichen arbeiten. Als anorganische Nährsalze können den Kulturmedien übliche lösliche Salze zugegeben werden, die Zink-, Natrium-, Magnesium-, Calcium-, Ammo-45 nium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat- oder Nitrationen liefern.
Die für das Wachstum und die Entwicklung des Mikroorganismus erforderlichen Spurenelemente sollen im Kulturmedium ebenfalls vorhanden sein. Diese Spurenelemente treten normalerweise als Verunreinigungen der anderen Bestandteile so des Mediums in solchen Mengen auf, wie sie zum Wachsen des Mikroorganismus erforderlich sind.
Hat man es bei der grosstechnischen Fermentation mit dem - Problem eines Schäumens der Fermentationsmedien zu tun,
dann muss man diese bevorzugt mit geringen Mengen (nämlich 55 mit 0,2 ml pro Liter) eines Antischäummittels, wie Propylengly-kol, versetzen.
Für die Bildung wesentlicher Mengen der Antibiotika A-35512 wird eine submerse aerobe Fermentation in Tanks oder Behältern bevorzugt. Geringe Mengen der Antibiotika 60 A-35512 lassen sich auch durch Schüttelflaschenkultur herstellen. Wegen der Zeitverzögerung, die bei der Antibiotikabildung auftritt, wenn man grosse Tanks oder Behälter mit den Sporen des Mikroorganismus animpft, wird vorzugsweise mit einem vegetativen Inokulum gearbeitet. Das vegetative Inokulum 65 kann hergestellt werden, indem man ein kleines Volumen des Kulturmediums mit der Sporenform oder mit Myzelbruchstük-ken des Mikroorganismus animpft, wodurch man eine frische aktiv wachsende Kultur des Organismus erhält. Die vegetative
637 159
12
Impfkultur überträgt man dann gewöhnlich in einen grösseren Behälter.
Der die Antibiotika A-35512 produzierende Mikroorganismus kann bei Temperaturen zwischen etwa 20 und 40 °C gezüchtet werden. Eine optimale Bildung der Antibiotika 5 A-35512 scheint bei Temperaturen von etwa 30 bis 34 °C zu erfolgen.
Wie bei submersen aeroben Züchtungsverfahren üblich,
bläst man auch vorliegend bevorzugt durch das Kulturmedium Luft. Zur Erzielung eines effizienten Wachstums des Mikro- io Organismus sollte das bei einer Tankproduktion eingesetzte Luftvolumen vorzugsweise mehr als 0,1 Volumina Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute (V/V/M) aufmachen. Für eine ausreichende Produktion der Antibiotika A-35512 arbeitet man im allgemeinen bei einer Tankproduktion mit einem Luft-15 volumen von etwa 0,25 V/V/M.
Die Bildung der Antibiotika A-35512 lässt sich während der Fermentation verfolgen, indem an entsprechende Proben der Kulturbrühe oder von Extrakten der Myzelfeststoffe in bezug auf ihre antibiotische Wirksamkeit gegenüber Mikro- 20
Organismen untersucht, deren Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika bekannt ist. Ein hierzu besonders geeigneter Nachweisorganismus ist Bacillus subtilis ATCC 6633. Dieser Biover-such wird vorzugsweise auf Papierscheiben oder Agarplatten durchgeführt, die ein ernährungstechnisch begrenztes Medium 25 enthalten.
Die unter entsprechenden submersen aeroben Fermentationsbedingungen hergestellten Antibiotika A-35512 lassen sich nach ihrer Bildung aus dem Fermentationsmedium durch in der Fermentationstechnik übliche Methoden gewinnen. Die während der Fermentation des A-35512 produzierenden Mikroorganismus entstandene antibiotische Aktivität tritt im allgemeinen in der filtrierten Kulturbrühe auf. Eine maximale Gewinnung der Antibiotika A-35512 ergibt sich daher, wenn man von der Kulturbrühe zuerst die Myzelmasse abfiltriert. Die auf diese Weise erhaltene filtrierte Brühe lässt sich dann nach irgendeiner Technik reinigen, wodurch man das antibiotisch wirksame Gemisch A-35512 erhält. Eine bevorzugte Methode zur Gewinnung dieser Antibiotika besteht in einer Adsorption der filtrierten Brühe auf einer Polyamidsäule und 40 einer Elution der Säule mit Wasser und wässrigen Alkoholgemischen. Die dabei eluierten antibiotisch wirksamen Fraktionen lassen sich unter Bildung des Antibiotikagemisches A-35512 vereinigen. Wahlweise kann man die eluierten Fraktionen unter Anwendung dieser Technik auch auf Basis ihres 45 Verhaltens bei der Dünnschichtchromatographie vereinigen, wodurch man gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor B und angereicherte Gemische der anderen A-35512 Faktoren erhält.
Die weitere Reinigung der einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-35512 besteht im allgemeinen in zusätzlichen 50 Adsorptions- und Extraktionsverfahren. Mit Vorteil verwendet
30
35
man hierzu adsorptive Materialien, wie Aluminiumoxid, Silica-gel, Ionenaustauscherharze oder dergleichen. Die Faktoren des Antibiotikums A-35512 kommen in der Fermentationsbrühe als Hydrochloride vor. Das bevorzugte Auftrennverfahren unter Verwendung von Polyamid ergibt das Antibiotikum A-35512 Faktor B und als Rest das Gemisch der anderen Faktoren des Antibiotikums A-35512 in Form der Hydrochloride. Jeder einzelne Faktor lässt sich in bekannter Weise, beispielsweise chromatographisch, über ein schwach basisches Ionenaustauscherharz in seine freie Base (ionische chlorfreie Verbindung) überführen.
Wahlweise kann man die Kulturfeststoffe unter Einschluss der Bestandteile des Mediums und des Myzels auch ohne Extraktion oder Abtrennung, jedoch vorzugsweise nach Entfernung des Wassers, als Quelle für die Antibiotikum A-35512 verwenden. So kann man das Kulturmedium beispielsweise nach Bildung des antibiotisch wirksamen A-35512 durch Lyophyli-sieren trocknen und das dabei erhaltene Material dann direkt in ein Futtervorgemisch einmischen.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon wird vorzugsweise durch milde saure Hydrolyse des Antibiotikums A-35512 Faktor B hergestellt. Das Antibiotikum A-35512 Faktor B ist am leichtesten in Form seines Dihydrochlorids zugänglich. Als Ausgangsmaterial zur Herstellung des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon verwendet man daher vorzugsweise das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid. Man kann hierzu jedoch auch das Antibiotikum A-35512 Faktor B oder andere Säureadditionssalze des Antibiotikums A-35512 Faktor B einsetzen. Die saure Hydrolyse kann in üblicher Weise vorgenommen werden. Man kann hierzu zwar mit irgendeiner Säure arbeiten, verwendet zur Bildung des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon vorzugsweise jedoch Chlorwasserstoffsäure. Bei Einsatz von Chlorwasserstoffsäure erhält man das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon als Hydrochloridsalz. Die Hydrolyse wird vorzugsweise in Wasser unter Rückflusssieden über eine Zeitspanne von etwa 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Längere Umsetzungszeiten führen zu einem Abbau des Agly-kons unter Bildung weniger aktiver und später sogar inaktiver Produkte. Die für die jeweiligen Reaktionsbedingungen optimalen Umsetzungszeiten lassen sich ohne weiteres bestimmen, indem man entsprechende Teilmengen des jeweiligen Reaktionsgemisches bezüglich ihrer Biowirksamkeit untersucht.
Das Antibiotikumgemisch A-35512, die Faktoren A, B, C, E und H des Antibiotikums A-35512 und das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon hemmen das Wachstum bestimmter pathogener Mikroorganismen, insbesondere grampositiver Bakterien. Die Minimalinhibierungskonzentrationen (MIC-Werte), bei denen die Faktoren A, B, C und H des Antibiotikums A-35512 ausgewählte Bakterien hemmen, werden durch übliche Agar-Verdünnungsversuche ermittelt, und die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle V hervor.
Tabelle V
MIC (mcg/ml)
A-35512
A-35512 A-35512
A-35512
Testorganismus
Faktor A -2HC1
Faktor B • 2HC1 Faktor C • 2HC1
Faktor H-HCl
Staphylococcus aureus 3055
6,25
3,12 6,25
25,0
Staphylococcus aureus 3074
25,0
6,25 6,25
25,0
Streptococcus faecalis
6,25
3,12 3,12
12,5
Besonders interessant und wichtig ist die Tatsache, dass die Antibiotika A-35512 auch das Wachstum von Mikroorganismen hemmen, die gegenüber anderen Antibiotika resistent sind. Aus der folgenden Tabelle VI geht die beim Standard-Scheiben-Platten-Versuch erhaltene Wirksamkeit der Faktoren
A, B, C, E und H des Antibiotikums A-35512 (bei 30 Mikro-65 gramm pro Scheibe) gegenüber typischen Mikroorganismen hervor. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden ausgedrückt als der Durchmesser (mm) der beobachteten Inhibie-rungszonen.
13
Tabelle VI
637 159
Zonendurchmesser (mm)
A-35512 A-35512 A-35512 A-35512 A-35512
Testorganismus FaktorA-2HCl FaktorB-2HCl FaktorC-2HCl FaktorE-HCl FaktorH-HCl
Staphylococcus aureus 3055
13,4
18,4
0
14,4
11,9
(penicillin-g-suszeptibel)
Staphylococcus aureus 3074
13,2
16,8
0
14,5
11,6
(penicillin-G-resistent)
Staphylococcus aureus 3130
14,4
18,4
0
15,4
12,6
(methicillinresistent)
Streptococcus pyogenes
17,0
19,6
10,5
17,0
16,0
(Gruppe A)
Streptococcus sp. 9960
15,5
19,4
0
16,4
13,8
(Gruppe D)
Diplococcus pneumoniae
-
-
11,0
20,0
-
Park I
Weitere Ergebnisse aus Agar-Verdünnungsversuchen gehen aus der folgenden Tabelle VII für das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid hervor, und darin sind die Minimal-inhibierungskonzentrationen (MIC-Werte) gegenüber mehreren Mikroorganismen aus der Gruppe A der Streptokokken sowie gegenüber Diplococcus pneumonia angeführt.
Tabelle VII
25
MIC (mcg/ml)
Testorganismus
A-35512 Faktor B
Streptococcus pyogenes C203
1
Streptococcus pyogenes 10389
1
Streptococcus pyogenes 12344
8
Streptococcus pyogenes 12961
1
Streptococcus pyogenes 663-72
0,5
Streptococcus pyogenes 664-72
0,5
Streptococcus pyogenes 665-72
1
Streptococcus pyogenes 13234
0,5
Streptococcus pyogenes 19035
0,5
Streptococcus pyogenes M6517
0,5
Streptococcus pyogenes D27781
1
Diplococcus pneumoniae Park I
2
Diplococcus pneumoniae Typ 14
2
- Aus der folgenden Tabelle VIII gehen weitere bei der Untersuchung des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid in Agar-Verdünnungsversuchen erhaltene Ergebnisse gegenüber mehreren Organismen aus der Gruppe D der Streptokokken hervor.
45
50
55
Tabelle VIII
Testorganismus
MIC (mcg/ml) A-35512 Faktor B
Streptococcus sp. D282 Streptococcus sp. 9901 Streptococcus sp. 9913 Streptococcus sp. 9933 Streptococcus sp. 9960 Streptococcus sp. 12253F Streptococcus sp. Shrigley Streptococcus sp. Mitis
2 2 4 4 4 4 4 4
MIC (mcg/ml)
Testorganismus
A-35512 Faktor B
Streptococcus sp. 238
2
Streptococcus sp. SS992
4
30
Andere bei Agar-Verdünnungsversuchen unter Verwendung des Mikroorganismus A-35512 Faktor B Dihydrochlorid erhaltene Ergebnisse gegenüber anderen grampositiven Organismen können der folgenden Tabelle IX entnommen werden.
Tabelle IX
Testorganismus
MIC (mcg/ml) A-35512 Faktor B
40
Staphylococcus aureus 3123* Staphylococcus aureus H43** Staphylococcus aureus 3124** Staphylococcus aureus 3126** Staphylococcus aureus 3127** Staphylococcus aureus H57** Staphylococcus aureus 3074** Staphylococcus aureus 3130*** Staphylococcus aureus 3131 **** Staphylococcus aureus 3133*** Staphylococcus aureus 3136*** Staphylococcus aureus 3125*** Staphylococcus epidermis 3064** Staphylococcus epidermis 3078* Bacillus subtilis ATCC 6633 Sarcina lutea PCI-1001-FDA
4 4 4 2 4 2 4 4 4 2 2 4 2 2 2 1
60
* penicillin-G-suszeptibel penicilin-G ** -resistent
*** penicillin-G-resistent; methicillinresistent **** penicillin-G-resistent; methicillinresistent; clindamycinresistent i Die Antibiotika A-35512 hemmen ferner auch das Wachstum bestimmter anaerober Bakterien. Die Wirksamkeit des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid gegenüber verschiedenen anaeroben Bakterien, ermittelt nach dem Stan-
637 159
14
dard-Agar-Verdünnungsversuch, geht aus der folgenden Tabelle X hervor.
Tabelle X
Testorganismus
MIC (mcg/ml) A-35512 Faktor B
such (hierzu werden 6 mm grosse Bauschen in Lösungen getaucht, die pro Milliliter Lösung 1 Milligramm Wirkstoff enthalten, und dann auf mit den jeweils zu untersuchenden Organismen beimpfte Agarplatten gegeben) geht aus der folgenden Tabelle XIII hervor.
Tabelle XIII
Actinomyces israelii
0,5
Clostridium perfringens
2,0
Clostridium septicum
4,0
Eubacterium aerofaciens
2,0
Peptococcus asaccharolyticus
1,0
Peptococcus prevoti
2,0
Peptostreptococcus anaerobius
1,0
Peptostreptococcus intermedius
4,0
Propionibacterium acnes
0,5
Bacteroides fragilis ssp. fragilis 111
64,0
Fusobacterium necrophorum
8,0
Testorganismus
Inhibierungszone (mm)
A-35512 Faktor B Aglykon (freie Base)
Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Sarcina lutea Bacillus subtilis*
19
13
14 22
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid hat sich in vivo auch gegenüber experimentell hervorgerufenen Bakterieninfektionen als antimikrobiell wirksam erwiesen. Für diese Untersuchungen verabreicht man entsprechend infizierten Mäusen subkutan zwei Dosen des Antibiotikums A-35512 Faktor B und bestimmt die hierdurch bedingte Wirksamkeit durch Messen der sogenannten EDso-Werte [wirksame Dosis in mg/kg zum Schutz von 50% der untersuchten Tiere, J. Bacte-riol. 81,233-235 ( 1961 )]. Die dabei für das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid erhaltenen EDso-Werte gehen aus der folgenden Tabelle XI hervor.
* mit ernährungstechnisch begrenztem Agar
Aus der folgenden Tabelle XIV gehen Versuchswerte über die Minimalinhibierungskonzentrationen (MIC-Werte) hervor, mit denen das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid gegenüber bestimmten Stämmen von Staphylococcus aureus wirksam ist. Diese Werte sind durch Standard-Agar-Verdünnungsversuche ermittelt worden.
Tabelle XIV
30
Tabelle XI
Testorganismus
ED50
Infektion
Streptococcus pyogenes C 203
1,75
260xLD5o(ip)
Diplococcus pneumoniae Park I
4,3
60,8xLDso(ip)
Staphylococcus aureus 3055
6,9
206xLDso(ip)
40
Testorganismus
MIC (mgc/ml)
Staphylococcus aureus 3055+
0,5
Staphylococcus aureus H290+
0,5
Staphylococcus aureus V92+
0,5
Staphyloccocus aureus V104+
0,25
Staphyloccocus aureus 3074++
0,25
Staphylococcus aureus H43++
0,5
Staphylococcus aureus V57++
0,5
Staphylococcus aureus H356++
1,0
Staphylococcus aureus 3130+++
0,5
Staphylococcus aureus 3131++++
0,5
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid ergibt ferner auch bei Meerschweinchen einen Schutz, die man mit dem anaeroben Clostridium chauvoei (der Ursache für Klauenseuche bei Rindern) infiziert hat. Diese Untersuchungen wer- 45 den nach der abgewandelten U.S.D.A.-Methode zur Ermittlung der Stärke von Clostridium chauvoei enthaltenden Produkten durchgeführt (SAM 200, U.S. Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Veterinary Services Laboratories, Ames, Iowa 50010,7. April 1975, unter 9 C.F.R. 50 113.91 ). Die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle XII hervor.
+ penicillin-G-suszeptibel
++ penicillin-G-resistent
+++ penicillin-G-resistent; methicillinresistent
++++ penicillin-G-resistent; methicillinresistent, clindamycinresistent
Weitere bei Agar-Verdünnungsversuchen unter Verwendung des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid gegenüber der Gruppe D der Streptokokken erhaltene Versuche gehen aus der folgenden Tabelle XV hervor.
Tabelle XV
'Testorganismus
MIC (mg/ml)
Tabelle XII
Infektion
Prozentualer
Behandlung tot/total
Schutz
A-35512 Faktor B
0/10
100
10 mg/kg*
A-35512 Faktor B
3/10
70
1 mg/kg*
Infektionskontrolle
10/10
0
55
Streptococcus sp. Shrigley
1,0
Streptococcus sp. Mitis
1,0
Streptococcus sp. 12253F
1,0
Streptococcus sp. SS992
1,0
Streptococcus sp. 9933
1,0
Streptococcus sp. 9913
1,0
Streptococcus sp. 282
1,0
Streptococcus sp. 238
1,0
: intramuskuläre Verabreichung
Die Wirksamkeit des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon bei einem herkömmlichen Scheiben-VerdünnungsverDas Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon erweist sich 65 auch in vivo als gegenüber experimentell hervorgerufenen Bakterieninfektionen antibakteriell wirksam. Hierzu verabreicht man Mäusen mit den entsprechenden Infektionen subkutan zwei Dosen des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykonhy-
15
637 159
drochlorid und bestimmt die dabei beobachtete Wirksamkeit kum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid erhaltenen ED50-durch die sogenannten ED50-Werte. Die dabei für das Antibioti- Werte gehen aus der folgenden Tabelle XVI hervor.
Testorganismus
Streptococcus pyogenes C203 Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus 3055
Tabelle XVI
ED50 Infektion
5,8 2570x LDso(ip)
7,0 374xLDso(ip)
1,04 370xLDäo(ip)
Die Antibiotika A-35512 sind verhältnismässig nicht toxisch. So liegt beipielsweise der LDo-Wert für das Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid bei subkutaner Verabreichung an ausgehungerte weibliche Cox- und Harlan-ICR-Mäuse bei unter 8000 mg/kg.Der LDso-Wert für das Antibioti- 20 kum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid an der Maus beträgt nach intraperitonealer Verabreichnung etwa 1356 mg/kg und nach intravenöser Verabreichnung über 1000 und unter 1250 mg/kg. Sowohl das Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid als auch das Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydro- 25 chlorid verfügen nach intraperitonealer Verabreichungen an Mäuse über eine akute Toxizität von über 300 mg/kg.
Eine weitere wichtige Eigenschaft des Antibiotikumgemisches A-35512 und der entsprechenden Verbindungen ist ihre Fähigkeit zur Verbesserung der Futterverwertung bei Tieren. 30 Diese Fähigkeit zeigt sich anhand von Wiederkäuern mit entwickelter Pansenfunktion.
Die Wirksamkeit der Kohlehydratutilisation bei Wiederkäuern lässt sich bekanntlich durch Behandlungen èrhôhen, die die Pansenflora der Tiere eher zur Bildung von Propionat- 35 Verbindungen anregen als zur Bildung von Acetat- oder Bityrat-verbindungen. (Church et al. in «Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants», Band 2,1971, Seiten 622 und 625).
Die Wirksamkeit für die Futterverwertung lässt sich durch in-vivo-Versuche anhand entsprechender Rinder mit einer ao Magenfistula nach dem in US-PS 3 794 732 beschriebenen Verfahren (insbesondere Beispiel 8) bestimmen. Aus der folgenden Tabelle XVII gehen die bei derartigen Untersuchungen unter Verwendung des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid erhaltenen Ergebnisse hervor, die die prozentualen Pro- 45 pionsäurekonzentrationen im Rumen aus einem Mittel aus 5 Analysen während einer 21 tägigen Versuchsdauer darstellen.
50
Tabelle XVII
Behandlung Anzahl der Tiere Mittlere
Molprozentuale
molprozen
Zunahme
tuale Menge gegenüber der
Propionsäure
Kontrolle
Kontrolle 5
19,3
A-35512 Faktor5
26,0
6,7
B 50g/Tonne
Mit dem Antibiotikumgemisch A-35512 und den entsprechenden Verbindungen ergeben sich propionaterhöhende und somit futterverwertungsverbessernde Wirkungen, wenn man diesen Säugetieren z.B. oral in Mengen von etwa 0,15 bis 10,0 mg/kg und Tag verabreicht. Die günstigsten Ergebnisse erhält man bei Verabreichungsmengen von etwa 1,0 bis 2,0 mg/kg und Tag. Eine bevorzugte Methode zur Verabfolgung des Antibiotikumgemisches A-35512 oder der entsprechenden Verbindung erfolgt durch Vermischen mit dem Tierfutter. Die vorliegenden Wirkstoffe lassen sich jedoch auch in anderer Weise verabreichen, beispielsweise in Form von Tabletten, Tränken, Bolen oder Kapseln. Die Formulierung dieser verschiedenen Dosierungsformen lässt sich in der Tierarzneikunde übliche weise erreichen. Jede einzelne Dosierungseinheit sollte dabei eine der jeweils geeigneten Tagesdosis für das zu behandelnde Tier direkt entsprechende Menge an Antibiotikum A-35512 oder einer entsprechenden Verbindung hiervon enthalten.
Das Antibiotikumgemisch A-35512 und die entsprechenden Verbindungen eignen sich ferner auch als wachstumsfördernde Mittel bei Tieren. Die entsprechenden Untersuchungen unter Verwendung von Brathühnchen ergeben z.B. bei einem Zusatz von 20 g Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid pro Tonne Futter eine Gewichtszunahme und verbesserte Futterverwertung. Die bei entsprechenden Untersuchungen mit Tierbatterien mit jeweils 4 Gruppen aus jeweils 8 Tieren unter jeweiliger Wiederholung der einzelnen Versuche erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle XVIII hervor.
Tabelle XVIII
Behandlung
Konz. (g/Tonne)
Gewichtszunahme (g)
Prozentuale Verbesserung gegenüber der Kontrolle
Futterverwertung
Prozentuale Verbesserung gegenüber der Kontrolle
Kontrolle
380
1,850
A-35512
20
394
3,68
1,776
4,00
Faktor B
Aus der folgenden Tabelle XIX gehen die bei Versuchen der von 12 Gruppen aus jeweils 80 Tieren erhaltenen Ergebnisse obigen Art in Bodengehegeuntersuchungen unter Verwendung hervor.
637 159
* p ^ 0,05
16
Tabelle XIX
Behandlung
Konz. (g/Tonne)
Gewichtszunahme (g)
Prozentuale Verbesserung gegenüber der Kontrolle
Futterverwertung
Prozentuale Verbesserung gegenüber der Kontrolle
Kontrolle
1898
2,250
A-35512
20
1956*
3,06
2,177*
2,81
Faktor B
Das Antibiotikumgemisch A-35512 und die entsprechenden Verbindungen wirken bei Geflügel insbesondere dann wachs- i tumsfördernd, wenn man sie dem Futter der Tiere in Mengen von etwa 1 bis 100 g pro Tonne Futter zusetzt.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1
A. Schüttelflaschenfermentation des Antibiotikums A-35512
Man löst ein lyophilisiertes Plätzchen von Streptomyces Candidus NRRL 8156 in 1 bis 2 ml sterilem Wasser. Mit dieser Lösung beimpft man dann einen Bacto-Hefe-Malz-Extrakt-Schrägagar (ISP Nr. 2, Difco Laboratories, Detroit, Michigan).
Der inokulierte Schrägagar wird dann etwa 7 Tage bei einer Temperatur von 30 °C bebrütet. Die reife Schrägagarkultur gewinnt man unter Verwendung von Wasser (2 ml) und durch Abkratzen mit einer sterilen Pipette zur Lockerung der Sporen. Eine bestimmte Menge dieser Wassersuspension der Sporen (0,1 ml) verwendet man zur Beimpfung eines anderen Schräg-agars von ISP Nr. 2. Der hiermit beimpfte Schrägagar wird etwa 7 Tage bei 30 °C inkubiert. Die Gewinnung der reifen Schrägagarkultur erfolgt unter Verwendung von Wasser (5 ml) und durch Abkratzen mit einer sterilen Pipette zum Lockern der Sporen. Mit 2,5 ml der dabei erhaltenen Sporensuspension beimpft man dann 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung:
Bestandteile
Menge (g/1)
ZnCk KH2PO4
L-Glutaminsäure
DL-Citrullin
CaCCb
Deionisiertes Wasser
0,03 0,1
1,0
0,1 5,0 q.s. 1 Liter
Bestandteile
Menge
Trypticase Sojabrühe
30 g
(Baltimore-Biological
Laboratories, Cockeys-
ville, Md.)
Wasser (deionisiert)
q.s. 1 Liter
Das inokulierte vegetative Medium bebrütet man anschliessend in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben bei einer Temperatur von 30 °C über eine Zeitspanne von 48 Stunden auf einem Rotationsschüttler, der unter einem Bogendurchmesser von etwa 5 cm bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute betrieben wird.
Mit dem auf diese Weise erhaltenen inkubierten vegetativen Medium (0,5 ml) beimpft man dann 50 ml eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung:
Das in obiger Weise hergestellte inokulierte Produktionsme-25 dium bebrütet man in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben bei einer Temperatur von 32 °C 8 bis 10 Tage auf einem Rotationsschüttler, der bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute unter einem Bogendurchmesser von etwa 5 cm rotiert.
30
B. Tankfermentation zur Gewinnung des Antibiotikums A-35512
Zur Bildung eines grösseren Volumens der Impf kultur verwendet man 20 ml des oben beschriebenen inkubierten Medi-35 ums zum Animpfen von 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium der ersten Stufe besitzt. Dieses angeimpfte vegetative Medium der zweiten Stufe inkubiert man 24 Stunden bei einer Temperatur von 32 °C in einem 21 fassenden Kolben auf 40 einem Rotationsschüttler, der sich unter einem Bogendurchmesser von etwa 5 cm mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute bewegt.
Das auf diese Weise hergestellte inkubierte vegetative Medium der zweiten Stufe (800 ml) verwendet man zur Beimp-45 fung von 1001 sterilem Produktionsmedium. Das inokulierte Produktionsmedium lässt man in einem 1651 fassenden Fermentationstank etwa 8 bis 10 Tage bei 32 °C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird durch Einleiten steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,25 V/V/M belüftet und mit her-30 kömmlichen Rührern bei einer Geschwindigkeit von 200 Umdrehungen pro Minute gerührt.
Beispiel 2
Das nach Beispiel 1, Abschnitt A, hergestellte inkubierte 55 vegetative Medium lässt sich gegebenenfalls auch bis zu einer späteren Verwendung aufheben, indem man es in folgender Weise in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff hält.
In ein kleines (13 x100 mm messendes) sterilisiertes Röhrchen mit Schraubverschluss gibt man 2 ml einer Suspension fol-. 60 gender Zusammensetzung:
Bestandteile
Menge (g/1)
Tapioca-Dextrin
Glucose
NH4NO3
KCl
MgSCh
FeCh.4H20
25,0 10,0 2,5 - 1,5 1,1 0,03
Bestandteile
Menge
Glycerin
20%
Lactose
10%
Wasser (deionisiert)
70%
17
637 159
Die auf diese Weise erhaltene Suspension versetzt man dann mit 2 ml eines in obigerWeise hergestellten und über eine Zeitspanne von 48 Stunden inkubierten vegetativen Mediums. Nach entsprechendem Vermischen friert man die Lösung ein und hebt sie in der Gasphase eines Tanks mit flüssigem Stickstoff auf.
Zur Verwendung des auf diese Weise gelagerten vegetativen Mediums für eine Schüttelflaschen- oder Tankfermentation gibt man das in obiger Weise bearbeitete Röhrchen zum Auftauen in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 43 °C. Mit einem Teil der dabei erhaltenen aufgetauten Lösung ( 1 ml) beimpft man dann 50 ml eines vegetativen Mediums der gleichen Zusammensetzung, wie sie in Beispiel 1, Abschnitt A, beschrieben ist. Das inokulierte vegetative Medium verwendet man wie in Beispiel 1 beschrieben entweder zur Schüttelfla-schenfermentation oder zur Bildung einer grösseren Menge an Inokulum für eine Tankfermentation.
Beispiel 3
Das in Beispiel 1 beschriebene Fermentationsverfahren wird unter Verwendung eines Schüttelflaschen-/Tankproduk-tionsmediums folgender Zusammensetzung wiederholt:
Bestandteile Menge (g/1)
Tapioca-Dextrin 75,0
Melasse 40,0
lösliches Fleischpepton 15,0
MgSCWHzO 0,5
CaCCb 2,0
Wasser q.s. 1 Liter
Beispiel 4
Abtrennung des Antibiotikumgemisches A-35512
Die in Beispiel 1 beschriebene gesamte Fermentationsbrühe (9461) filtriert man unter Verwendung einer Diatomeenerde-Filterhilfe (Hyflo Super-cel, Johns-Manville Products Corp.) beim jeweiligen pH-Wert der Brühe (pH 6,8 bis 7,2). Das dabei erhaltene klare Filtrat schickt man dann mit einer Geschwindigkeit von 150 ml pro Minute durch eine Säule, die 10 ml poly-meres Adsorbens (Amberlite XAD-4, Rohm und Haas Co.) pro 100 ml Brühenfiltrat enthält. Die hierbei anfallenden Fraktionen werden unter Einsatz des herkömmlichen Scheibenversuchs gegenüber Sarcina lutea bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeit überwacht. Der biologisch unwirksame Abstrom wird verworfen. Die Säule wäscht man mit Wasser (Vs des Brühenvolumens) mit einer Geschwindigkeit von 150 ml pro Minute. Das inaktive Waschwasser wird ebenfalls verworfen.
Im Anschluss daran eluiert man die Säule unter Verwendung einer 50prozentigen wäßrigen Methanollösung (6001) mit einer Geschwindigkeit von 200 ml pro Minute. Sodann konzentriert man das dabei erhaltene Eluat, das das Antibiotikumgemisch A-35512 enthält, unter Vakuum auf ein Volumen von 151, wodurch sich etwa 200 g Antibiotikum A-35512 pro 1 ergeben.
Beispiel 5
Isolierung der Faktoren des Antibiotikumgemisches A-35512
Das nach Beispiel 4 erhaltene Antibiotikumgemisch A-35512 (etwa 3000 g, gelöst in 15 1 Methanol) Chromatographien man über eine Polyamidsäule (Woelm, 100 Liter). Die Säule wird mit deionisiertem Wasser und einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 80 bis 120 ml pro Minute eluiert.
Die Überwachung der einzelnen Fraktionen erfolgt durch Cellulosedünnschichtchromatographie oder Papierchromato-. graphie unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser(15:10:3:12) sowie durch Bioautographie mit Sarcina lutea.
Die ersten 100 1 Eluat werden verworfen. Sodann erhöht man die Strömungsgeschwindigkeit auf etwa 160 bis 200 ml pro Minute und sammelt Fraktionen von jeweils 12 1. Auf diese Weise werden insgesamt 12 Fraktionen gesammelt.
An diesem Punkt ändert man das zum Eluieren verwendete Lösungsmittel in folgender Weise in einen Gradienten aus Wasser und Methanol:
Ein Behälter mit 360 1 Methanol wird in einen Behälter mit 1201 Wasser gehoben. Die im Wasserbehälter befindliche Mischlösung wird gerührt und dann auf die Säule aufgegeben.
Es werden 24 Fraktionen (jeweils 241) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 200 bis 300 ml pro Minute gesammelt.
Auf Basis der bei einer Bioautographie erhaltenen Ergebnisse fasst man Gruppen entsprechender Fraktionen zusammen und dampft diese dann unter Vakuum zurTrockne ein, wodurch man das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid und die folgenden angereicherten Gemische von Faktoren erhält:
Fraktionen
Volumen (Liter)
Faktoren
Gewicht
1-10
120
A+H
192g
11-24
216
B
269 g
25-31
168
B+C
590 g
32-44
312
C,E,F,G
224 g
Beispiel 6
Reinigung des Antibiotikums B-35512 Faktor B
Das nach Beispiel 5 erhaltene teilweise gereinigte Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid (400 g) löst man in 1,2 1 50prozentigem wässrigem Methanol und Chromatographien die dabei erhaltene Lösung dann in folgender Weise über einer mit Aluminiumoxid gefüllten Säule:
Man rührt saures Aluminiumoxid ( 10 kg, M. Woelm) in eine 50prozentige wässrige Methanollösung. Sodann lässt man das Gemisch stehen, dekantiert die überstehende Lösung und verwirft sie. Das dabei erhaltene Aluminiumoxid verrührt man dann mit 50prozentigem wässrigem Methanol und bepackt damit eine Säule mit einem Durchmesser von 13,5 cm. Im Anschluss daran wäscht man die mit Aluminiumoxid gefüllte Säule solange mit 50prozentigem wässrigem Methanol, bis der Säulenabstrom klar ist.
Die mit obigem Absorbens gefüllte Säule eluiert man unter Verwendung von 50prozentigem wässrigem Methanol bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 8 bis 10 ml pro Minute unter Auffangen von Fraktionen mit einem Volumen von etwa 240 bis 300 ml. Die einzelnen Fraktionen werden wie in Beispiel 5 beschrieben durch Dünnschichtbioautographie überwacht. Auf Basis der dabei erhaltenen Werte erhält man durch Vereinigen folgender Fraktionen gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid:
Fraktionen
Gewicht
17-21
9,6 g
22-29
72,0 g
30-37
117,0g
Jede dieser Fraktionen kristallisiert man aus einer konzentrierten 50prozentigen wässrigen Methanollösung bei einer Temperatur von 4 °C. Das auf diese Weise erhaltene gereinigte Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid enthält etwa 4,6% Chlor. Eine Lösung des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid in 66prozentigem wässrigem Dimethylforma-mid hat einen pH-Wert von etwa 6,5.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
637 159
18
Beispiel 7
Herstellung von an ionischem Chlor freien Antibiotikum A-35512 Faktor B
Man löst wie in Beispiel 6 hergestelltes gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid (1 g) in Wasser (40 ml) und schickt diese Lösung unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute durch eine mit einem Ionenaustauscher gefüllte 2,5x 18 cm messende Säule (Bio-Rad AG3-4X, in der OH~ Form), die man mit deionisjertem Wasser eluiert. Das erste Eluat (5 ml) wird verworfen. Das sich daran anschliessende Eluat (50 ml) dampft man unter Vakuum zur Trockne ein, wodurch man 0,76 g eines an ionischem Chlor freien Antibiotikums A-35512 Faktor B in Form eines weissen Pulvers erhält, das etwa 1,59% Chlor enthält. Eine Lösung dieses an ionischem Chlor freien Antibiotikums A-35512 Faktor B in 66prozentigem wässrigem Dimethylformamid hat einen pH-Wert von 9,13.
Beispiel 8
Reinigung des Antibiotikums A-35512 Faktor A
Nach Beispiel 5 (Fraktionen 1 bis 10) erhaltenes teilweise gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid (1 g) löst man in 50prozentigem wässrigen Methanol (5 ml). Die so erhaltene Lösung chromatographiert man dann über eine mit saurem Aluminiumoxid (M. Woelm) gefüllte und 3 x 16 cm messende Säule, die wie in Beispiel 5 beschrieben zugerichtet wird. Die Eluierung der Säule erfolgt mit 50prozentigem wässrigem Methanol unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute. Es werden jeweils Fraktionen mit einem Volumen von 5 ml gesammelt. Alle Fraktionen analysiert man durch Dünnschichtbioautographie nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren. Auf Basis dieser Untersuchungen vereinigt man die Fraktionen 7 bis 15, konzentriert das Ganze unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen und lyophilisiert das dabei erhaltene Material anschliessend unter Bildung von 0,3 g Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid (Chlorgehalt = 4,71%).
Beispiel 9
Herstellung von an ionischem Chlor freien Antibiotikum A-35512 Faktor A
Man löst ein nach Beispiel 8 hergestelltes Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid (200 mg) in Wasser (10 ml) und schickt die so erhaltene Lösung dann unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute durch eine mit Ionenaustauscherharz gefüllte und 1,5 x 10 cm messende Säule (Bio-Rad AG3-4X, in der OH- Form), wobei man mit deionisiertem Wasser eluiert. Das am Anfang kommende Eluat (10 ml) wird verworfen. Das sich daran anschliessende Eluat (20 ml) konzentriert man unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen und lyophilisiert das Ganze dann unter Bildung von 115 mg an ionischem Chlor freiem Antibiotikum A-35512 Faktor A.
Beispiel 10
Reinigung des Antibiotikums A-35512 Faktor C
Man löst ein nach Beispiel 5 (Fraktionen 25 bis 31) erhaltenes teilweise gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid (15 g) in deionisiertem Wasser (40 ml). Die auf diese Weise erhaltene Lösung gibt man dann auf eine mit Polyamid gefüllte und 4x 115 cm messende Säule (MN, mit einer Korn-grösse von unter 0,07 mm von Brinkman Instruments, Inc.), die man in Wasser hergestellt und damit über Nacht gewaschen hat. Die Säule wird unter Verwendung von deionisiertem Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 3 ml pro Minute eluiert. Das erste Eluat (250 ml) wird verworfen. Im Anschluss daran sammelt man Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 24 ml.
Die einzelnen Fraktionen werden durch dünnschichtchro-matographische Bioautographie überwacht. Hierzu arbeitet man mit Cellulosedünnschichtchromatographierplatten (auf Aluminiumfolien, E. Merck, Deutschland), unter Verwendung 5 eines Lösungsmittelsystems aus sec.-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser ( 10:10:3:8) und Einsatz von Bacillus subtilis als Detektionsorganismus. Auf Basis der bei der Dünnschichtchromatographie erhaltenen Ergebnisse vereinigt man die Fraktionen 1 bis 33, konzentriert sie unter Vakuum auf ein io Volumen von 150 ml und lyophilisiert sie anschliessend.
Unter Anwendung der gleichen Bedingungen chromatographiert man zwei weitere Mengen von teilweise gereinigtem Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid. Auch hier vereinigt man wiederum die Fraktionen 1 bis 33, konzentriert 15 sie anschliessend unter Vakuum auf ein Volumen von 150 ml und lyophilisiert das Ganze abschliessend. Die drei dabei aus den drei Säulen erhaltenen lyophilisierten Proben werden vereinigt, wodurch man 12,3 g teilweise gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid erhält.
20 Zur weiteren chromatographischen Reinigung gibt man das so erhaltene Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid in der oben beschriebenen Weise auf eine andere polyamidgefüllte Säule auf, wobei man jedoch hier Fraktionen mit einem Volumen von 15 ml bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 25 ml pro Minute auffängt. Die einzelnen Fraktionen werden ebenfalls wiederum durch dünnschichtchromatographische Bioautographie überwacht. Die Fraktionen 36 bis 58 werden vereinigt, unter Vakuum auf ein Volumen von 150 ml eingeengt und abschliessend lyophilisiert, wodurch man 5,3 g weiter gerei-30 nigtes Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid erhält. Zur Endreinigung chromatographiert man das Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid unter Verwendung einer mit saurem Aluminiumoxid (Woelm) gefüllten und 5x41 cm messenden Säule. Die Säule wird nach entsprechendem 35 Bepacken mit 50prozentigem wässrigem Methanol gewaschen. Nach Klarwerden des zum Waschen verwendeten Methanols gibt man auf die Säule das Antibiotikum A-35512 Faktor C auf (und zwar 5,3 g in Form einer Lösung in 30 ml 50prozentigem wässrigem Methanol). Anschliessend eluiert man die Säule mit 40 50prozentigem wässrigem Methanol unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml pro Minute. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 12 ml gesammelt und wie oben beschrieben durch dünnschichtchromatographische Bioautographie überwacht. Die Fraktionen 22 bis 74 werden vereinigt, 45 unter Vakuum auf ein Volumen von 250 ml eingeengt und nachfolgend lyophilisiert, wodurch man 3,86 g Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid erhält.
Beispiel 11
so Herstellung von an ionischem Chlor freien Antibiotikum A-35512 Faktor C
Das wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellte Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid (200 mg) chromatographiert man über ein schwach basisches Ionenaustauscherharz 55 nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren, wodurch man 156 mg an ionischem Chlor freies Antibiotikum A-35512 Faktor C erhält. Dieses an ionischem Chlor freie Antibiotikum A-35512 Faktor C enthält etwa 1,90% Chlor.
60 Beispiel 12 Reinigung des Antibiotikums A-35512 Faktor E
Man löst nach Beispiel 5 (Fraktionen 32 bis 44) erhaltenes teilweise gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid (8,1 g) in deionisiertem Wasser (40 ml). Die auf diese 65 Weise erhaltene Lösung gibt man dann auf eine mit Polyamid (MN, <0,07 mm, Brinkman Instruments, Inc.) gefüllte und 5x110 cm messende Säule auf, wobei man dieses Material in Wasser herstellt und mit Wasser über Nacht wäscht. Anschlies-
19
637 159
send eluiert man die Säule mit deionisiertem Wasser bei einer Beispiel 15
Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml pro 15 Minuten, wobei Herstellung von an ionischem Chlor freiem Antibiotikum man Fraktionen mit einem Volumen von 20 ml auffängt. Bei A-35512 Faktor H
der Fraktion 118 ändert man das zum Eluieren verwendete Man chromatographiert ein nach Beispiel 14 hergestelltes
Lösungsmittel in 50prozentiges wässriges Methanol. Die einzel- 5 Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydrochlorid (200 mg) über nen Fraktionen überwacht man durch dünnschichtchromato- ein schwach basisches Ionenaustauscherharz nach dem in Beigraphische Bioautographie wie in Beispiel 10 beschrieben. spiel 9 beschriebenen Verfahren, wodurch man 143 mg an ioni-
Die Fraktionen 148 bis 195 enthalten das Antibiotikum schem Chlor freies Antibiotikum A-35512 Faktor H erhält.
A-35512 Faktor E. Diese Fraktionen werden vereinigt, unter Dieses an ionischem Chlor freie Antibiotikum A-35512 Faktor verringertem Druck auf ein Volumen von 150 ml eingeengt und io H enthält etwa 1,59% Chlor.
anschliessend lyophilisiert, wodurch man 2,7 g Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid erhält. Beispiel 16
Eine Teilmenge des in obigerWeise hergestellten teilweise Herstellung von Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon gereinigten Antibiotikums A-35512 Faktor E Hydrochlorid Man löst nach Beispiel 6 hergestelltes Antibiotikum
(615 mg) löst man in 50prozentigem wässrigem Methanol (5 15 A-35512 Faktor B Dihydrochlorid (5,0 g) in Wasser (200 ml), ml) und gibt die so erhaltene Lösung dann auf eine 1,5 x 50 cm Die auf diese Weise erhaltene Lösung säuert man dann m it 4 messende Säule auf, die mit saurem Aluminiumoxid (Woelm) normaler Chlorwasserstoffsäure (14 ml) an, worauf man diese gefüllt ist, das man in 50prozentigem wässrigem Methanol Lösung 2 Stunden auf Rückflusstemperatur erhitzt. Sodann zubereitet und damit so lange wäscht, bis der Abstrom klar ist. kühlt man die Lösung ab und dampft sie unter Vakuum auf Anschliessend eluiert man die Säule mit 50prozentigem wässri- 20 etwa drei Viertel ihres ursprünglichen Volumens ein. Die so gern Methanol unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml erhaltene Lösung versetzt man hierauf solange tropfenweise pro Minute, wobei man Fraktionen mit einem Volumen von mit Chlorwasserstoffsäure (6 normal), bis die Ausfällung been-jeweils 10 ml auffängt. Die einzelnen Fraktionen werden eben- det ist. Der dabei erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und falls wieder durch dünnschichtchromatograhische Bioautogra- getrocknet, wodurch man zu 3,56 g rohem Antibiotikum phie überwacht. Die Fraktionen 5 bis 8 werden vereinigt und 25 A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid gelangt.
unter verringertem Druck auf ein Volumen von etwa 10 ml ein- Das oben erhaltene Filtrat wird eingeengt und analysiert. Es geengt. Nach Zusatz von deionisiertem Wasser (etwa 50 ml) lyo- enthält Glucose, Fructose, Mannose und Rhamnose.
philisiert man die dabei erhaltene Lösung, wodurch man zu 480 Das in obiger Weise hergestellte rohe Antibiotikum mg Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid gelangt. A-35512 Faktor B Aglykon reinigt man chromatographisch
30 über mit Säure gewaschenes Aluminiumoxid (Woelm, Sorte I) Beispiel 13 unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser
Herstellung von an ionischem Chlor freiem Antibiotikum Und Methanol ( 1:9). Die Elution der Säule überwacht man
A-35512 Faktor E durch Cellulosedünnschichtchromatographie. Die das Antibio-
Das wie in Beispiel 12 beschrieben hergestellte Antibioti- tikum A-35512 Faktor B Aglykon enthaltenden Fraktionen kum A-35512 Faktor E Hydrochlorid (200 mg) chromatogra- 35 werden vereinigt und unter Vakuum eingedampft, wodurch phiert man nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren man zu 398 mg teilweise gereinigtem Produkt gelangt. Ein Verüber ein schwach basisches Ionenaustauscherharz, wodurch gleich dieser dünnschichtchromatographischen Ergebnisse man 170 mg an ionischem Chlor freies Antibiotikum A-35512 unter Besprühen mit Ninhydrin zur Detektion bestätigt, dass Faktor E erhält. Dieses an ionischem Chlor freie Antibiotikum immer noch nicht bioaktive Verunreinigungen vorhanden sind. A-35512 Faktor E enthält etwa 1,72% Chlor. 40 Eine Teilmenge dieses teilweise gereinigten Antibiotikums
A-35512 Faktor B Aglykon (100 mg) reinigt man daher chroma-Beispiel 14 tographisch über Polyamid (4 g, Machery, Nagel & Co. MN-
Reinigung des Antibiotikums A-35512, Faktor H SC-6, Lieferant Brinkman Instruments Co. ; <0,07 mm) weiter,
Man löst wie in Beispiel 5 (Fraktionen 1 bis 10) hergestelltes wobei man mit Wasser eluiert. Auch diese Säule überwacht teilweise gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydro- 45 man wiederum in der bereits oben beschriebenen Weise durch chlorid (30 g) in einer minimalen Menge eines Gemisches aus Cellulosedünnschichtchromatographie. Die das Antibiotikum Methanol und Wasser (7:3). Die auf diese Weise erhaltene A-35512 Faktor B Aglykon enthaltenden Fraktionen werden
Lösung adsorbiert man hierauf an eine mit saurem Aluminium- vereinigt und dann lyophilisiert, wodurch man zu 64 mg gerei-oxid gefüllte Säule (3 x 60 cm, Woelm, in Methanol gepackt nigtem Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid und mit Methanol bis zum Klarwerden des Abstroms eluiert). 50 gelangt. (Gesamtausbeute auf das als Ausgangsmaterial ver-Anschliessend eluiert man die Säule mit Methanol unter einer wendete Antibiotikum A-35512 Faktor B bezogen = 5,08%). Strömungsgeschwindigkeit von 4 ml pro Minute. Man fängt Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 24 ml auf. Bei der Beispiel 17
Fraktion 59 verändert man das zum Eluieren verwendete Herstellung der freien Base des Antibiotikums A-35512 Faktor
Lösungsmittel in ein Gemisch aus Methanol und Wasser (1:1). 55 B Aglykon
Die einzelnen Fraktionen überwacht man durch Dünn- Man löst wie in Beispiel 16 hergestelltes Antibiotikum
Schichtchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmit- A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid (90 mg) in 30 ml eines telsystems aus Chloroform, Methanol und Ammoniumhydro- Gemisches aus Methanol und Wasser (1:1). Die so erhaltene xid (2:3:1 ) sowie durch Bioautographie mit Bacillus subtilis bei Lösung neutralisiert man dann mit einem Ionenaustauscheralkalischem pH-Wert. 60 harz [3,5 ml, Bio-Rad AG-3-4X (OH-)]. Anschliessend rührt
Die Fraktionen 51 bis 118 werden vereinigt und unter man die Lösung 15 Minuten bei Raumtemperatur, worauf man
Vakuum eingedampft, wodurch man 6,4 g gereinigtes Antibioti- das Harz abfiltriert. Sodann engt man das Filtrat unter Vakuum kum A-35512 Faktor H Hydrochlorid erhält. und Einhalten einer Temperatur von weniger als 60 °C auf etwa die Hälfte seines Volumens ein und lyophilisiert das Ganze 65 nachfolgend, wodurch man zu 68 mg der freien Base des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon gelangt.
G 2 Blatt Zeichnungen

Claims (10)

637 159
1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikumgemisches A-35512 mit den Faktoren A, B, C, E, F, G und H, des Antibiotikums A-35512 Faktor A, des Antibiotikums A-35512 Faktor
B, des Antibiotikums A-35512 Faktor C, des Antibiotikums 5 A-35512 Faktor E, des Antibiotikums A-35512 Faktor F, des Antibiotikums A-35512 Faktor G und des Antibiotikums A-35512 Faktor H sowie des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismus Streptomyces Candidus NRRL 8156 in einem Nährme- io dium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, submers unter aeroben Fermentationsbedingungen züchtet, bis eine wesentliche Menge des Antibiotikums gebildet ist und die erhaltenen Antibiotikafaktoren gegebenenfalls in pharmazeutisch annehmbare Säure-15 additionssalze überführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Antibiotikumgemisches A-35512, dadurch gekennzeichnet, dass man a) den Mikroorganismus Streptomyces Candidus NRRL 8156 in einem Nährmedium züchtet und 20
b) das Antibiotikumgemisch A-35512 aus dem Kulturmedium abtrennt.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Antibiotikums A-35512 Faktor A, dadurch gekennzeichnet, dass man a) den Mikroorganismus Streptomyces Candidus NRRL 25 8156 in einem Nährmedium züchtet,
b) das Antibiotikumgemisch A-35512 aus dem Kulturmedium abtrennt und c) aus dem Antibiotikumgemisch A-35512 das Antibiotikum A-35512 Faktor A isoliert. 30
4. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Antibiotikums A-35512 Faktor B, dadurch gekennzeichnet, dass man a) den Mikroorganismus Streptomyces Candidus NRRL 8156 in einem Nährmedium züchtet,
b) das Antibiotikumgemisch A-35512 aus dem Kulturme- 35 dium abtrennt und c) aus dem Antibiotikumgemisch A-35512 das Antibiotikum A-35512 Faktor B isoliert.
5. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Antibiotikums A-35512 Faktor C, dadurch gekennzeichnet, dass man 40
a) den Mikroorganismus Streptomyces Candidus NRRL 8156 in einem Nährmedium züchtet,
b) das Antibiotikumgemisch A-35512 aus dem Kulturmedium abtrennt und c) aus dem Antibiotikumgemisch A-35512 das Antibioti- 45 kum A-35512 Faktor C isoliert.
6. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Antibiotikums A-35512 Faktor E, dadurch gekennzeichnet, dass man a) den Mikroorganismus Streptomyces Candidus NRRL
8156 in einem Nährmedium züchtet, 50
b) das Antibiotikumgemisch A-35512 aus dem Kulturmedium abtrennt und c) aus dem Antibiotikumgemisch A-35512 das Antibiotikum A-35512 Faktor E isoliert.
7. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Antibio- 55 tikums A-35512 Faktor F, dadurch gekennzeichnet, dass man a) den Mikroorganismus Streptomyces Candidus NRRL 8156 in einem Nährmedium züchtet,
b) das Antibiotikumgemisch A-35512 aus dem Kulturmedium abtrennt und 60
c) aus dem Antibiotikumgemisch A-35512 das Antibiotikum A-35512 Faktor F isoliert.
8. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Antibiotikums A-35512 Faktor G, dadurch gekennzeichnet, dass man a) den Mikroorganismus Streptomyces Candidus NRRL 65 8156 in einem Nährmedium züchtet,
b) das Antibiotikumgemisch A-35512 aus dem Kulturmedium abtrennt und c) aus dem Antibiotikumgemisch A-35512 das Antibiotikum A-35512 Faktor G isoliert.
9. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Antibiotikums A-35512 Faktor H, dadurch gekennzeichnet, dass man a) den Mikroorganismus Streptomyces Candidus NRRL 8156 in einem Nährmedium züchtet,
b) das Antibiotikumgemisch A-35512 aus dem Kulturmedium abtrennt und c) aus dem Antibiotikumgemisch A-35512 das Antibiotikum A-35512 Faktor H isoliert.
10. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon, dadurch gekennzeichnet, dass man a) den Mikroorganismus Streptomyces Candidus NRRL 8156 in einem Nährmedium züchtet,
b) das Antibiotikumgemisch A-35512 aus dem Kulturmedium abtrennt,
c) aus dem Antibiotikumgemisch A-35512 das Antibiotikum A-35512 Faktor B isoliert und d) aus dem Antibiotikum A-35512 Faktor B das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon herstellt.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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GR75473B (de) * 1981-04-20 1984-07-23 Lilly Co Eli
GB2137087B (en) * 1983-03-18 1987-02-18 American Cyanamid Co Improving milk production
GB8608798D0 (en) * 1986-04-11 1986-05-14 Lepetit Spa Recovery of glycopeptide antibiotics from aqueous solutions
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