CS207457B2 - Method of preparation of the mixture of the antibioticum a-35512 - Google Patents

Description

(54) Způsob přípravy směsi antibiotik A-35512

Směs antibiotik A-35512, zahrnující mikrobiálně aktivní příbuzné faktory А, В, С, E, F, G a H, se připravuje submerzní aerobní fermentací nového mikroorganismu Streptomyces candidus NRRL 8156. Jednotlivé A-35512 faktory se oddělí a izolují chromatografií. Mírnou kyselou hydrolýzou A-35512 faktoru В se odštěpí několik cukrů a získá se aglykon A-35512 faktoru B. A-35512 antibiotika jsou antibakteriální látky a jako činidla podporující růst a zvyšující využitelnost potravy u ipřežvýkavců a drůbeže. Kromě toho A-35512 faktor В je použitelný při léčení paradentosy a uhrů.

Antibiotika A 35512 jsou blízce příbuzná glykopeptidická antibiotika. Antibiotikum A-35512 faktor в, nejúplněji charakterizovaný člen komplexu antibiotik A-35512, se jeví jako nový člen skupiny peptidy obsahujících antibiotik, která zahrnují vancomycin (U. S. A. patent č. 3 067 099), A-4696 А, В a C (U. S. A. patent č. 3 952 095), avoparcin (U. S. A. patent č. 3 855 410), ristomycln A (Lomakina, N., 7th International Symposium of Chemistry of National Products, Riga, Latvia, str. 625, 1970) a ristocetin A (U. S. A. patent č. 2 990 329). Antibiotika A-35512 se odlišují od známých antibiotik například v jiné pohyblivosti v různých chromatografic2 kých systémech a v obsahu aminokyselin a cukrů.

I když mnohé antibiotícky účinné látky jsou dnes známé, požadavky na nová lepší antibiotika stále pokračují. Jedním problémem v současné terapii antibiotik je fakt, že se antibiotika liší v účinnosti proti různým patogenním organismům. Jiný problém spočívá ve faktu, že organismus kmenů si stále vyvíjí resistenci na současně používaná antibiotika. Ještě další problém vyvstává z faktu, že jednotliví pacienti často mají různé reakce na specifická antibiotika, a to vzhledem na přecitlivělost a/nebo na toxické účinky. Vzhledem k tomuto problému v současné terapii spočívá jeden rys podle vynálezu v tom, že se připravují nová antibiotika, která jsou použitelná proti nemocem způsobeným mikroorganismy.

Další rys vynálezu spočívá ve zvýšení využití potravy u přežvýkavců a drůbeže. Vzhledem k tomu, že požadavky na množství potravy se zvyšují, má zvýšení využitelnosti velký význam. Diethylstilbestrol a ostatní estrogeny zvyšují využitelnost potravy u drůbeže a živočichů. Existuje všek nebezpečí, spočívající v tom, že může dojít ke konzumaci těchto přísad v mase. Je tedy velká ekonomická potřeba nových cest pro využití účinnosti limitovaných přísad do potravy po207437

A-35512 faktor A užívané .při produkci masa přežvýkavců a drůbeže. Směs antibiotik A-35512, jejich faktory a jejich deriváty jsou přínosem v tomto směru.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy směsi antibiotik A-35512 sestávající z faktorů А, В, С, E, F, G a H, a jejího rozdělení na jednotlivé faktory a následující .přípravy aglykonu faktoru B, který se vyznačuje tím, že se kultivuje Streptomyces candidus NRRL 8156 v živném médiu obsahujícím asimilovatelné zdroje sacharidů, dusíku a anorganických ;solí, při teplotě mezi 20 a 40 °C za submerzních aerobních fermentačních podmínek, popřípadě se z živného média izoluje směs antibiotik A-35512, popřípadě se ze směsi antibiotik A-35512 Izolují antibioticiké A-35512 faktory А, В, С, E, F, G a H a popřípadě se z antibiotika A-35512 faktoru В připraví aglykon A-35512 faktoru B.

Počet a poměr jednotlivých faktorů vznikajících současně v této směsi antibiotik je různý a. závisí na použitých fermentačních podmínkách. Antibiotické sloučeniny připravené podle vynálezu jsou zde označeny jako A-35512 antibiotika. Faktor В je hlavním faktorem v této směsi A-35512. A-35512 faktory přítomné ve směsi A-35512 se izolují jako jednotlivé složky ze směsi ve formě hydrochloridů. Každý individuální faktor se může převést na volnou bázi (prostou iontů chloru), například chromatografií na slabě bazické iontoměničové pryskyřici. Kroimě volné báze a odpovídajícího hydrochloridu jsou též použitelné ostatní farmaceuticky vhodné soli A-35512 faktorů. V diskusích o použitelnosti se výraz „A-35512 sloučenina“ používá pro jednoduchost pro označení sloučenin vybraných ze skupiny sestávající z A-35512 faktorů А, В, С, E a H a jejich farmaceuticky vhodných solí.

Infračervená absorpční spektra (v .tabletách KBr) následujících A-35512 faktorů jsou uvedena na přiložených obrázcích.

Obr. 1 — dihydrochlorid A-35512 faktoru A. Obr. 2 — dihydrochlorid A-35512 faktoru B. Obr. 3 — hydrochlorid A-35512 faktoru H.

Obr. 4 — dihydrochlorid A-35512 faktoru C. Obr. 5 — hydrochlorid A-35512 faktoru E.

Infračervené absorpční spektrum aglykonu A-35512 faktoru В (v nujolu) je uvedeno na obr. 6.

Faktory A-35512 podle vynálezu jsou blízce příbuzné sloučeniny.

Sedm antibiotických faktorů bylo izolováno při fermentací jako směs antibiotik A-35512. Jednotlivé faktory se oddělí vzájemně a faktory А, В, С, E a H se izolují jako individuální sloučeniny způsobem popisaným dále. Směs A-35512 je rozpustná ve vodě, zejména je rozpustná v alkoholech, jako je methanol a ethanol, ale je nerozpustná v ostatních organických rozpouštědlech, jako je benzen, chloroform, aceton, diethylether, ethylacetát, toluen, hexan, acetonltríl a díoxan.

A-35512 faktor A je bílá, amorfní bazická sloučenina. A-35512 faktor A má následující procentní elementární složení:

uhlík 54,29 %, vodík 5,19 %, dusík 5,58 %, kyslík 33,76 %, chlor 1,69 %.

Dihydrochlorid A-35512 faktoru A je bílá, amorfní, hygroskopická sloučenina. Dihydrochlorid A-35512 faktoru A má následující průměrné procentní složení:

uhlík	51,03	%,
vodík	5,10	0/0,
dusík	4,75	%,
kyslík	34,20	%,
chlor	4,80	%.

Infračervené absorpční spektrum dihydro- , chloridu A-35512 faktoru A v KBr tabletách je uvedeno na obr. 1. Nejdůležitější absorpční maxima mají následující frekvence (cm'¹): 3405 (silný), 3300 (inflex), 2950 (slabý), 1750 (slabý), 1670 (silný), 1625 (inflex), 1602 (silný), 1520 (silný), 1470 (slabý), 1440 (slabý), 1405 (slabý), 1345 (inflex), 1312 (střední), 1225 (střední), 1180 (slabý), 1130 (slabý), 1080 (silný) a 1020 (inflex).

Ultrafialová (UV) absorpční spektra dihydrochloridu A-35512 faktoru A ukazují v kyselém a neutrálním methanolu absorpční maximum při 282 nm (ε 11700) a v bazickém methanolu absorpční maximum při 292 nm. (ε 14 000), vypočteno na použití molekulární hmotnosti 2000. Ultrafialová spektra dihydrochloridu A-35512 faktoru A také ukazují na koncovou absorpci při 225 nm.

13c nukleár .magnetické-rezonanční spektrum dihydrochloridu A-35512 faktoru A v D2O má následující charakteristiky: f

Či.	PPM	Výška (%)
3	175,3	0,8
4	173,0	2,1
5	172,1	2,0
6	171,4	1,5
7	170,9	2,7
8	170,5	. 2,3
9	169,5	1,6
10	159,0	1,3
11	157,9	2,3
12	156,2	2,6
13	155,6	2,3
14	155,3	2,4
15	154,4	1,1
16	136,3	1,4
17	136,0	1,0
18	135,1	1,4
19	133,5	1,2
20	129,6	1,6

20'7 457 s

0.	PPM	Výška (%)
21	129,1	1,7
22	128,7	1,8
23	127,5	1,0
24	126,0	1,4
25	124,3	2,8
26	122,1	1,6
27	109,9	1,3
28	107,4	1,6
29	101,7	0,9
30	77,6	3,8
31	76,3	4,6
32	75,5	2,6
33	74,8	2,5
34	74,5	2,4
35	73,4	3,7
36	72,8	6,0
37	72,0	4,4
38	70,9	7,0
39	69,6	2,8
40	67,4	90,9 *
41	65,4	1,7
42	61,7	3,1
43	56,7	1,7
44	55,5	1,3
45	54,7	0,8
46	24,6	0,9
47	19,1	1,7
48	17,9	2,0
49	17,2	1,9
50	16,7	3,2
51	16,2	3,0

* dioxanový standard

Dihydrochlorid . A-35512 faktoru A má následující specifickou rotaci:

fajo²⁵ -100 (c 1, HžO),

Mm²⁵-400 (c 1, HžO).

Elektrometrická titrace dihydrochloridu A-35512 faktoru A v 66% vodném dimethylformamidu ukazuje .na přítomnost čtyř titrovatelných skupin s pKa hodnotami přibližně 7,35, 9,09, 10,49 a 12,44 (původní pH 6,2).

Přibližná molekulární hmotnost dihydrochloridu A-35512 faktoru A stanovená titrací je asi 2106.

D^'hydro^l^lorid A-35512 .faktoru A je rozpustný ve vodě, částečně rozpustný v alkoholech, jako je methanol a· ethanol, ale je obecně nerozpustný v jiných organických rozpouštědlech, jako je benzen, chloroform, aceton, diethylether, ethylácetát, toluen,· hexan, acetomiril a dioxan.

Dihydrochlorid A-35512 faktoru A je stabilní 7'2 hodin ve vodných roztocích s pH od asi 3 do 10.

Analýza aminokyselin kysele hydrolyzovaného^: dihydrochloridu A-35512 faktoru A ukazuje, že A-35512 faktor A obsahuje alespoň pět zbytků aminokyselin, z nichž jedna je glycin.

A-35512 faktor B

A-35512 faktor B je bílá, amorfní bazická sloučenina. Přibližný empirický vzorec pro A-35512 faktor B je

097-99^()1-^51^8-904(^48^ .

A-35512 faktor B má následující průměrné procentní složení:

uhlík 53,97 %, vodík 4,75 %, dusík 5,-25 %, kyslík 34,29 ·%, · chlor 1,59 %.

Toto elementární složení je v souhlase s preferovaným empirickým vzorcem

C98H104N9O47CI , (vypočteno: C 53,60, H 4,75, N · 5,74, O 34,30, Cl 1,61). Alternativní preferovaný empirický vzorec je

C98H103N8O47C1 , (vypočteno: C 54,00, H 4,75, N 5,15, O 34,50, Cl 1,60).

Ultrafialová absorpční spektra A-35512 faktoru B vykazují v kyselém· a neutrálním methanolu absorpční maximum při 282 nm (ε 15 000) a v alkalickém methanolu absorpční maximum- při 292 nm. (ε 16 000), vypočteno · na použití molekulární hmotnosti 2000. UV spektra A-35512 faktoru B mají koncovou absorpci při 225 nm.

A-35512 faktor B má následující specifické rotace:

Md2⁵ -123° (c = 1, HžO), [Wj365²⁵ —446° (c = 1, HžO).

Elektrometrická titra-ce A-35512 faktoru B v 66% vodném dimethylformamidu ukazuje na přítomnost čtyř titrovatelnýc-h skupin s pKa 7,15, 8,81, 10,20, 12,00 a s možnou ' přítomností jiné skupiny s pKa větším než 13,50.

Molekulární hmotnost A-35512 faktoru B stanovená titrací je asi 2143.

Dihydrochlorid A-35512 faktoru B je bílá krystalická sloučenina (z 50% vodného methanolu). I když · dihydrochlorid A-35512 faktoru B je hygroskopická sloučenina a nevykazuje .odlišný bod tání, termogram ukazuje, že zráta hmotnosti započíná při . 25 °C a 7,4 % ztrát je při 121 °C, při 135 °C dochází k dalším: ztrátám a vede k rozkladu.

Dihydrochlorid A-35512 faktoru B má následující procentní elementární složení:

uhlík	52,57 O/0)
vodík	4,80 %,
dusík	5,66 %,
kyslík	32,86 %,
chlor	4,51 %.

Toto elementární složení je zejména v souhlase s jiným alternativním empirickým vzorcem

C98H103N9O.17CI. 2 HC1 (vypočteno·: C 51,93, H 4,65, N 5,57, O 33,20, Cl 4,65).

UV spektra dihydrochloridu A-35512 faktoru B ukazují v kyselém a neutrálním methanolu absorpční maximum při 282 nm (ε = 12 000 a v alkalickém methanolu absorpční maximum při 292 (ε = 14 000), vypočteno za použití .molekulární hmotnosti 2000. UV spektra, dihydrochloridu A-35512 faktoru B ' také* ukazují koncovou absorpci při 225 nm.

Dihydrochlorid A-35512 faktoru B má následující specifické rotace:

(a]t>25 —128° (c - 1, HžO), [a)].3652⁵ —475 (c = 1, HžO).

Elektrometrické titrace dihydrochloridu A-35512 faktoru B v 66% vodném dimethylformamidu ukazují na přítomnost čtyř titrovatelných skupin s pKa přibližně 7,15, - 8,87, 10,30, a 12,10 a na možnou přítomnost jiné skupiny s pKa větším než 13,1.

Přibližná molekulární hmotnost dihydrochloridu A-35512 faktoru B stanovená titrací je asi 2027.

13c nukleárně magnetické rezonanční spektrum dihydrochloridu A-35512 faktoru B v DžO má následující charakteristiky:

č. PPM Výška (%)

2	173,0	4,1
3	171,9	3,7
4	171,6	3,3
5	171,0	5,8
6	170,8	5,0
7	169,6	3,6
8	159,0	4,1
9	157,9	4,4
10	157,5	3,7
11	156,6	4,8
12	155,6	6,1
13	155,3	4,2
14	154,9	3,3
15	154,3	4,2
16	151,7	3,3
17	144,3	3,1
18	136,7	3,5
19	136,2	4,9
20	135,4	4,0
21	135,2	4,4
22	133,6	4,2
23	133,3	4,1
24	129,8	1,7
25	129,3	3,0
26	128,8	-2,6
27	127,6	1,5
28	126,1	3,9
29	124,2	5,6
30	122,4	1,4
31	122,0	4,4
32	120,7	3,3

C.	PPM	Výška (%)
33	116,5	2,7
34	109,5	0,8
35	108,2	1,1
36	107,7	2,7
37	104,5	1,7
38	101,8	2,9
39	100,9	1,6
40	98,2	1,0
41	76,9	1,2
42	76,1	1,8
43	74,1	2,0
44	73,5	2,7
45	72,7	2,4
46	72,3	4,0
47	71,0	7,1
48	70,3	2,5
49	69,7	2,5
50	67,4	74,7*
51	64,6	1,2
52	62,0	1,5
53	58,0	1,3
54	56,8	1,7
55	55,4	3,9
56	54,3	2,5
57	24,5	2,0
58	17,9	3,0
59	17,2	2,0
60	16,3	2,5

“dioxanový standard

Dihydrochlorid A-35512 faktoru B krystalovaný ze směsi .methanolu a vody má následující charakteristiky práškového difrakčního obrazce X-paprsků (Cu⁺⁺ radiace 1,5405 λ, niklový filtr, d= meziplanární prostory v angstromech):

d relativní intenzita

17,15	100
12,90	80
10,85	70
9,25	70
8,87	60
8,22	50
7,86	50
6,93	40
6,20	40
5,62	40
5,04	05
4,02	02
3,54	02

Infračervené absorpční spektrum dihydrochloridu A-35512 faktoru B v KBr tabletách je uvedeno na obr. 2. Nejvýznamnější absorpční maxima jsou při frekvencích [cm-1): 3420 (silný), 3300 (inflex), 2950 [slabý), 1752 (slabý), 1675 (silný), 1630 (inflex), 1605 (silný), 1520 (silný), 1470 (slabý), 1440 (slabý), 1410 (slabý), 1345 (inflex), 1312 [střední), 12225 (střední), 1180 (slabý), 1135 (slabý), 1080 (silný a 1020 (slabý).

Analýza aminokyselin kysele hydrolyzovaného díhydrochloridu A-35512 faktoru B ukazuje, že A-35512 faktor B obsahuje alespoň pět zbytků aminokyselin, z nichž jedna je glycín. Čtyři zbylé zbytky aminokyselin v A-35512 faktoru B jsou komplexní a zdají se stejné s kyselinami nalezenými u A-35512 faktoru A.

Struktura jednoho ze zbytků aminokyselin se zdá být

Analýzy těchto produktů hydrolýzy kyselin ukazují, že dihydrochlorid A-35512 faktoru B obsahuje následující cukry: glukosu, fukosu, amnnosu, rhamnosu a 3-amino-2(3(6-trideoxy-3-C-me.thyl-L-xylohexqpyranosu. Mírná kyselá hydrolýza díhydrochloridu A-35.512 faktoru B odštěpuje glukosu, fukosu, mannosu, a rhamnosu a získává se charakteristický aglykon.

Dihydrochlorid A-35512 faktoru B má alespoň jednu hydroxyskupinu schopnou esterifikace.

Dihydrochlorid A-35512 faktoru B je rozpustný ve vodě, je částečně rozpustný v alkoholech, jako· je methanol a ethanol, a je nerozpustný v jiných méně polárních organických rozpouštědlech, jako je benzen, chloroform, aceton, diethylether, ethylacetát, toluen, hexan, . acetoniiril a dioxan.

Dihydrochlorid A-35512 faktoru B je stabilní 7'2 hodin ve vodných roztocích pH od 3 do 10.

A -35512 faktor C

A-35512 faktor C je bílá, amorfní bazická sloučenina.

A-35512 faktor C má následující přibližné procentní složení:

uhlík 55,90 · “/o, vodík 5Д1 %, dusík 5,88 %, kyslík 32,33 %, chlor 1,90 °/o.

Elementární složení je v souhlase s výhodným empirickým vzorcem

C8,H00N8O38C1 .

A-35512 faktor C má přibližnou molekulární hmotnost 1862.

Dihydrochlorid A-35512 faktoru C je bílá amorfní sloučenina. Dihydrochlorid A-35512 faktoru C má následující procentní elementární složení:

uhlík 55/76 'θ/o, vodík 5,(07 %, dusík 5,(^íL “/o, kyslík 30,29 %, chlor 4,88 %.

Empirický vzorec díhydrochloridu A-35512 faktoru C je v rozmezí

C83 - 85H99 _ioiNj037_39CI3 .

Elementární složení je zvláště v souhlase s . jiným empirickým vzorcem

C84H07NuO38C1.2 HC1 (vypočteno· C 52,2 %, H 5,1 %, N 5,8 %, 0 31,5 o/o, Cl 5,4 . %).

Infračervené absorpční spektrum' dihydrochloridu A-35512 faktoru C v KBr tabletách je uvedeno .na obr. 4 připojeného výkresu. Nejvýznamnější absorpční maxima jsou v následujících frekvencích (cm^-1): 3370. (široký), 3280 ('inflex), 3040 (inflex), 2080 (inflex), 2020 (slabý), 1740 (slabý), 1658 (silný), 1620 (slabý), .1589 (střední), 1503 (siný), 1460 (slabý), 1428 (střední), 1385 (slabý), 1330 (slabý), .1205 (střední), 1210 (siný), 1162 (střední), 1120 (slabý), 1060 (siný) a 1005 (střední).

Ultrafialová absorpční spektra dihydrochloridu A-35512 faktoru C ukazují v kyselém a neutrálním methanolu absorpční maximum- při .282 nm (ε 14,600·) a v bazickém methanolu absorpční maximum při 202 nm (ε 16,400), vypočteno za použití .molekulární hmotnosti 2000.

C13 nukleární magnetické resonanční spektrum díhydrochloridu A-35512 . faktoru C v DaO vykazuje následující charakteristiky:

c.	PPM	Výška (%)
1	172,0	2,5
2	172,2	2,0
3		2,2
4	171,0	3,0
5	560(6	2,0
6	158,6	1,8
7	157,8	3,0
8	156,5	2,1
0	156,1	2,8
10	155,6	4,2
11	154,6	3,0
12	151,1	1,5
13	143,3	1,4
14	136,0	3,2
15	135,4	2,7
16	133,2	3,7
17	128,7	2,3
18	126,5	3,1
10	124,6	2,1
20	120,3	2,7
21	121,5	2,2

c.	PPM	Výška (%)
22	120,1	1,2
23	118,0	1,7
24	116,5	1,2
25	107,8	2,7
26	104,5	1,9
27	101,7	1,9
28	94,5	1,0
29	75,9	3,0
30	74,3	2,0
31	73,4	2,3
32	72,1	3,5
33	70,9	4,3
34	68,7	2,9 71,7*
35	67,4
36	64,3	1,3
37	62,2	1,6
38	56,1	1,4
39	55,2	3,5
40	54,2	2,1
41	24,3	1,9
42	17,9	2,2
43	17,1	2,0
44	16,2	2,0

* dioxanový standard

Dihydrochlorid A-35512 faktoru C má následující specifické rotace:

[a] o²⁵ = -161° (c = 1,05, H2O], [a:]365²⁵ = —6 14° (C = 1,05, H2O).

Elektrometrické titrace dihydrochloridu A-35512 faktoru C v 66o/_o vodném dimethylformamidu ukazují na přítomnost tří titrovatelných skupin s pKa hodnotami přibližně 7,30, 8,92 a 10,99 a na možnou přítomnost dvou nebo více skupin s pKa hodnotami většími než 11,5.

Přibližná molekulární hmotnost dihydrochloridu A-35512 faktoru C stanovená titrací je asi 1982.

Analýza aminokyselin kysele hydrolyzovaného dihydrochloridu A-35512 faktoru C ukazuje, že obsahuje alespoň pět zbytků aminokyselin, z nichž jedna je glycin. Čtyři zbylé zbytky aminokyselin dosud nebyly identifikovány.

Dihydrochlorid A-35512 faktoru C je rozpustný ve vodě, dimethylsulfoxidu a vodném dimethylformamidu, částečně rozpustný v alkoholech, jako je methanol a ethanol, a je nerozpustný v jiných méně polárních organických rozpouštědlech, jako je benzen, chloroform, aceton, diethylether, ethylacetát, toluen, hexan, acetonitril a dioxan.

Dihydrochlorid A-35512 faktoru C je stabilní ve vodných roztocích pH asi od 3 asi do 10 po dobu 146 hodin.

A-35512 faktor E

A-35512 faktor E je bílá, amorfní bazická sloučenina. A-35512 faktor E má následující přibližné procentní elementární složení:

uhlík 54,84 %, vodík 4,73 °/o, dusík 5,26 %, kyslík 32,67 %, chlor 1,72 °/o.

Hydrochlorid A-35512 faktoru E je bílá, amorfní sloučenina. Hydrochlorid A-35512 faktoru E má následující přlibližné procentní elementární složení:

uhlík 52,67 %, vodík 4,59 %, dusík 5,55 %, kyslík 33,51 %, chlor 3,62 %.

Infračervené absorpční spektrum hydrochloridu A-35512 faktoru E v KBr tabletách je uvedeno na obr. 5 připojených výkresů. Nejvýznačnější absorpční maxima jsou při následujících frekvencích (cm'¹): 33'60 (silný), 3220 (inflex), 2900 (slabý), 1725 (slabý), 1650 (silný), 1580 (střední), 1498 (silný), 1450 (slabý), 1419 (slabý), 1295 (střední), 1205 (střední), 1172 (střední), 1110 (slabý), 1060 (silný) a 1000 (slabý).

Ultrafialová absorpční spektra hydrochloridu A-35512 faktoru E vykazují následující absorpční maxima: v neutrálním methanolu 270 nm (inflex) a 359 nm (ε = 16216); v kyselém methanolu, 286 nm (ε = 18018) a 310 nm (inflex) v bazickém methanolu 270 nm (inflex), 300 nm (ε = 16216) a 354 nm (ε = 17568), vypočteno za použití molekulární hmotnosti 2000.

Hydrochlorid A-35512 faktoru E má následující specifické rotace:

[a]_D ²⁵ = —108,3 (c = 1 H2O).

Elektrometrické titrace hydrochloridu A-35512 faktoru E ve vodném 680/0 dimethlformamidu ukazuje na přítomnost tří titrovatelných skupin s pKa hodnotami přibližně 6,30, 9,09 a 11,6'2 a s možnou přítomností jedné nebo dvou skupin s pKa hodnotami asi

12,5 nebo většími (původní pH 5,45).

Přibližná molekulární hmotnost hydrochloridu A-35512 faktru E stanovená titrací je přibližně 2018.

Analýza aminokyselin hydrochloridu A-35512 faktoru E ukazuje, že A-35512 faktor E obsahuje šest dosud neidentifikovaných zbytků aminokyselin.

Hydrochlorid A-35512 faktoru E je rozpustný ve vodě, částečně rozpustný v alkoholech, jako je methanol a ethanol, ale je nerozpustný v převážné části organických rozpouštědel, jako je benzen, chloroform, aceton, diethylether, ethylacetát, toluen, hexan, acetonitril a dioxan.

A-35512 faktor H

A-35512 faktor H je bílá, amorfní bazická sloučenina. A-35512 faktor H má následující přibližné elementární složení:

uhlík 53,76 vodík 5,32 %, dusík 5,53 %, kyslík 33,48 %, chlor 1,59 °/o.

A-35512 faktor H má empirický vzorec v rozmezí

Cs5 - 87H103 _ 107N8O38 _ 40CI a výhodný pokusný empirický vzorec

СвбНш№ОзэС1 a přibližnou molekulární hmotnost 1908.

Hydrochlorid A-35512 faktoru H je bílá, amorfní hygroskopická sloučenina. Hydrochlorid A-35512 faktoru H má následující průměrné procentní elementární složení:

uhlík 53,10 %, vodík 5,37°/o, dusík 5,35%, kyslík 30,120/0, chlor 3,78°/o.

Infračervené absorpční spektrum hydrochloridu A-35512 faktoru H v KBr tabletách je uvedeno na obr. 3 připojených výkresů. Nejvýznamnější absorpční maximum mají následující frekvence (cm“¹): 3410 (silný), 3240 (inflex), 2940 (slabý), 1670 (silný), 1630 (inflex), 1605 (isilný),, 1520 (silný), 1470 (slabý), 1442 (slabý), 1400 (slabý), 1345 (inflex), 1310 (střední), 1225 (střední), 1180 (slabý), 1135 (slabý), 1080 (silný) a 1020 (inflex).

Ultrafialová absorpční spektra hydrochloridu A-35512 faktoru H v kyselém a neutrálním methanolu vykazují absorpční maximum při 282 nm (ε = 13 500) a v bazickém methanolu absorpční maximum při 292 nm (ε 14000), vypočteno na molekulární hmotnost 2000. Ultrafialové spektrum hydrochloridu A-35512 faktoru H také vykazuje koncovou absorpci při 225 nm.

C13	nukleární magnetické rezonanční
spektrum hydrochloridu A-35512 faktoru H
v DzO , 1	má následující	charakteristiky:
c.	PPM	Výška (%)
2	177,2	2,7
3	171,6	5,2
4	170,9	5,8
5	169,6	4,7
6	158,9	3,1
7	157,6	4,3
8	156,6	3,8
9	155,6	4,1
10	155,4	3,8
11	154,3	2,4
12	151,3	1,6
13	137,7	2,0
14	136,7	2,2
15	136,0	4,0

C.	PPM	-Výška (%]
16	135,3	1,9
17	133,5	5,0
18	129,4	3,7
19	127,3	1,3
20	126,1	3,2
21	124,2	6,9
22	122,6	4,1
23	107,6	2,7
24	101,8	1,8
25	76,2	2,8
26	73,5	4,4
27	72,3	7,4
28	71,0	12,2
29	69,7	4,6
30	67,4	73,1*
31	61,6	3,5
32	56,8	1,8
33	55,4	2,8
34	55,0	1,5
35	24,5	2,6
36	17,9	4,6
37	17,2	2,6
38	16,3	3,6

* dioxanový standard.

Hydrochlorid A-35512 faktoru H má následující specifické rotace:

[_a]_D25 = -123,5° (c = 1, H2O).

Elektrometrická titrace hydrochloridu A-35512 faktoru H v 66o/₀ vodném dimethylformamidu ukazuje na přítomnost pěti titrovatelných skupin s pKa hodnotami .přibližně 5,0, 7,46, 9,80, 11,43 a 13,02 (původní pH 5,93).

Přibližná molekulární hmotnost hydrochloridu A-35512 faktoru H je stanovena titrací přibližně 1660,

Analýza aminokyselin kysele hydrolyzovaného hydrochloridu A-35512 faktoru H obsahuje alespoň pět zbytků aminokyselin, z nichž jeden je glycin. Čtyři zbylé zbytky aminokyselin v A-35512 faktoru H jsou identické se sloučeninami nalezenými v A-35512 faktorech A a B.

Hydrochlorid A-35512 faktoru H je rozpustný ve vodě, částečně rozpustný v alkoholech, jako je methanol a ethanol, ale je nerozpustný v převážné části organických rozpouštědel, jako je benzen, chloroform, aceton, diethylether, ethylacetát, toluen, hexan, acetonitril a dioxan.

Hydrochlorid A-35512 faktoru H je stabilní 72 hodin ve vodných roztocích pH od 3 do 10.

A-35512 faktory А, В, С, E a H a minoritní faktory F a G ses výhodou oddělují chromatografií na papíře za použití směsi rozpouštědel 1-butanol: pyridin : kyselina octová : voda (15:10:3:12). Bioautografie za použití Sarcina llitea je výhodnou detekční metodou. Přibližné Rf hodnoty A-35512 faktorů v tomto systému jsou uvedeny v tabulce I.

TABULKA I

35512	faktor	Rf hodnota
faktor	A . 2 HCl	0,21
faktor	B . 2 HC1	0,34
faktor	C . 2 HCl	0,46
faktor	E . HCl	0,64
faktor	F	0,81
faktor	G	0,93
faktor	H . HCl	0,15

V různých systémech má A-35512 faktor H chromatografický profil velmi obdobný profilu antibiotika AM 374 (USA patent -čís. 3 700 768). Antibiotikum A-35512- faktor H se může odlišit od antibiotika AM 374 alespoň ve dvou chromatografických -systémech na papíře. Hodnoty Rf ' A-35512 faktoru H . . 2 HC1 a AM 374 v těchto dvou systémech jsou uvedeny v tabulce II.

TABULKA II

Rf hodnota Systém rozpouštědel A-35512 H AM 374

CH3OH : 0,1 N HCl (3 : 1) 0,47 05^8'

1-propanol : NHaOH : H2O (6:3:1) 0,11 0,20

Několik A-35512 faktorů se může oddělit vysokotlakou kapalnou chromatografií za -použitípolyamidu (Z1PAX, Dupont) jako- .stacionární fáze a 1,33 molárního- vodného- monobazického- roztoku fosforečnanu draselné ho jako mobilní fáze za použití detekce UV světlem (250 nm). V tabulce III jsou uvedeny retenční časy pro A-35512 faktory při dělení na vysokotlaké chromatografií za použití následujících podmínek:

velikost kolony: 1/8“ - x 6‘, náplň: polyamid (Z1PAX, DuPont), rozpouštědlo: KH2PO4 (327 g)/H2O (1800 ml), průtok: 0,5 -ml/min, rychlost: 2“/h, tlak: 1500 P. S. I.

TABULKA III

A-35512 - faktor retenční -čas (minuty)

A B C E F

G H

9,375

13,125

26,25

5,625

7,5

7,5

7,5

Agiykon A-35512 faktoru B

uhlík	54,29 %,
vodík	4,34 %,
dusík	7,40 %,
chlor	5,02 %,
kyslík	28,95 % (diferencí]

Infračervené absorpční -spektrum hydrochloridu aglykonu A-35512 faktoru B v nujolu je uvedeno- na obr. 6 připojených výkresů. Nejvýznamnější -absorpční pásy jsou u následujících frekvencí (cm~1): 3440 (inflex), 3340 (inflex), 3215 (silný), 2950 (inflex), 2910- (silný), 2840 (silný), 2640 (inflex), 1735 (slabý), 1655 (silný), 1590 (střední), 1500 (silný), 1460 (silný), 1378 (střední), 1365 (inflex), 1298 (střední), 1215 (střední), 1155 (střední), 1120 (inflex), 1105 (slabý), - 1060 (slabý), 1040 (slabý), 1008 .(střední), 925 (slabý), 875 (slabý), 765 (inflex) - a 718 -(slabý).

Elektrometrická titrace hydrochloridu aglykonu A-35512 faktoru B - v 66% - vodném dimethylformamidu ukazuje na přítomnost tří titrovatelných skupin s pKa. asi 7,5, 9,25 a· 11,0 a na možnou přítomnost -dvou dalších skupin s pKa hodnotami většími než 11,0.

Hydrochlorid aglykonu A-35512 faktoru B má molekulární hmotnost kolem 1282, stanoveno· titrací.

Hydrochlorid aglykonu A-35512 faktoru B má následující -specifické rotace:

(ar_D25 —178° (c = 5, CH3OH), [¢¢136525- 7 16,8° (c = 5, CH3OH).

Ultrafialová absorpční spektra hydrochloridu aglykonu A-35512 faktoru B vykazují v kyselém a neutrálním - methanolu absorpční maximum při 282 nm (Eld 102,62) a v bazickém 'methanolu absorpční maximum při 302 nm (E J d 182,09).

¹³C nukleárně magnetické resonanční -spektrum aglykonu A-35512 faktoru B v DMSO-d6 při 90 °C má následující charakteristiky:

PPM Výška ( - %)

C.

1	187,8	37,2
2	172,0	40,9
3	170,7	45,2
4	170,1·	46,9
5	169,6	47,7
6	168,4	57,6
7	166,7	52,5
8	157,4	49,9
9	156,6	45,5
10	155,7	55,8
11	155,6	71,5
12	155,4	56,7
13	154,5	50,5
14	149,3	43,0
15	138,8	38,8
16	136,9	54,3
17	136,3	40,2
18	135,2	31,7
19	134,7	28,4
20	133,8	40,9
21	128,2	102,9

Hydrochlorid aglykonu A-35512 faktoru B je bílá amorfní sloučenina přibližného následujícího elementárního složení:

PPM Výška (θ/ο)

22	126,2	77,2
23	123,0	57,5
24	121,3	38,1
25	117,7	44,4
26	117,0	31,5
27	108,6	31,0
28	106,7	47,9
29	105,7	81,2
30	103,2	26,5
31	93,6	33,4
32	74,9	39,8
33	71,8	33,9
34	68,9 63,2	40,2 43,1
35
36	60,4	33,6
37	57,1	57,8
38	55,2	33,1
39	53,2	30,1
40	51,8	36,0
41	40,7	43,4
42	39,9	60,9
43	39,1	43,9
44	23,8	55,7
45	17,1	47,8
46	0,0	43,7

* DMSO-de ¹³C NMR spektrum prokazuje, že aglykon A-35512 faktoru В má zachovanou 3-amino-2,3,6-.1г1пеоху-3-С-те1Ьу1-Ь-ху1оЬехоругаnosovou část molekuly (jeden cukr je přítomen v A-35512 faktoru B).

Analýza aminokyselin dále kysele hydrogenovaného aglykonu A-35512 faktoru В ukazuje, že obsahuje glycin a alespoň tři komplexní zbytiky aminokyselin. Struiktuira jednoho· z těchto zbytků aminokyselin je

Hydrochlorid aglykonu A-35512 faktoru В má alespoň 1 hydroxyskupinu schopnou esterifikace a je rozpustný ve vodě a v methanolu a je nerozpustný v méně polárních organických rozpouštědlech, jako· je benzen, chloroform, aceton, diethylether, ethylacetát, toluen, hexan, acetonitril a dioxan.

Hydrochlorid aglykonu A-35512 faktoru В má přibližnou hodnotu Rf při chromatografií na tenké vrstvě celulózy (hliníková fólie) použitím směsi 1-butanol—·pyridin—kyselina octová—vocla (15:10:3:12). Bioautografie za použití Sarcina lutea je výhodná detekční metoda.

Hydrochlorid aglykonu A-35512 faktoru В má přibližnou Rf hodnotu 0,26 při ch-romatografii na tenké vrstvě silikagelu na celulóze při použití směsi methanol: chloroform : : konc. NHiOH (3:2:1).

Aglykon A-35512 faktoru В (volná báze) je bílá amorfní sloučenina o následujícím přibližném procentním elementárním složení (průměr):

uhlík	52,65 o/o,
vodík	4,57 %,
dusík	6,91 o/o,
chlor	2,94 o/Oi
kyslík	27,04 “/o,
popel	4,70 o/o.

Infračervené absorpční spektrum» aglykonu A-35512 faktoru В (volná báze) v KBr tabletách vykazuje význačné absorpční pásy při následujících frekvencích: (cm^-1): 3360 (silný), 32'60 (inflex), 2940 (inflex), 1735 (inflex), 1660 (silný), 1598 (střední), 1510 (silný), 1440 (střední), 1295 (slabý), 1215 (střední), 1165 (střední), 1122 (slabý), 1070 (slabý), 1018 (silný), 940 (slabý) a 920 (slabý).

Elektrométrická titrace aglykonu A-35512 fajktoru В (volná báze) v 66% vodném dimethylformamidu ukazuje na přítomnost pěti titrovatelných skupin s pKa hodnotami asi 6,2, 8,2, 10,1, 11,4, 12,4 a s možnou přítomností jedné nebo dvou dalších skupin s pKa hodnotami většími než 12,5.

Aglykon A-35512 faktoru В (volná báze) má následující specifickou rotaci:

[a]_D ²⁵ = —64,5° (c = 3, DMSO).

Ultrafialová abiscrpčiní spektra aglyikoinu A-35512 faktoru В (volná báze) vykazuje v neutrálním a kyselém methanolu absorpční maximum při 282 nm (Ε 1 cl 43,65) a v bazickém methanolu absorpční maximum při 301 nm(E } nn 67,46).

Aglykon A-35512 faktoru В (volná báze) má stejné přibližné Rf hodnoty popsané dříve pro hydrochlorid aglykonu A-35512 faktoru B.

Kromě volné báze a hydrochloridu tvoří jednotlivé individuální A-35512 faktory a aglykon A-35512 faktoru В i jiné farmaceuticky vhodné soli A-35512 faktorů А, В, С, E, H a aglykonu faktoru B, které jsou rovněž částí vynálezu. ,,Farmaceuticky vhodné“ soli jsou soli, u kterých toxicita sloučenin jako takových к teplokrevným živočichům se nezvyšuje relativně oproti volným bázím. Příklady a vhodné soli A-35512 faktorů А, В, C, E a H a aglykonu A-35512 faktoru В zahrnují ty soli, které vznikají standardní reakcí s anorganickými a organickými kyselinami, jako je například kyselina sírová, fosforečná, octová, jantarová, citrónová, mléčná, maleinová, fumarová, palmitová, cholová, pamoová, muková, D-glutamová, d-kafrová, glutarová, glykolová, ftalová, vinná, laurová, stearová, salicylová, methansulfonová, benzensulfonová, sorbová, pikrová, benzoová, cinnamová apod;

Nová antibiotika podle vynálezu se připravují kultivací kmenu Streptomyces candidus NRRL 8156, produkujícího· A-35512 za submerzních aerobních podmínek ve vhodném živném médiu tak dlouho, až vznikne dostatečná antibiotická aktivita. Antibiotika se izolují použitím různých izolačních a čisticích procedur, používaných běžně při přípravě antibiotik fermentačním způsobem.

Nové organismy používané pro· přípravu a^t-lbiotlik A-35512 byly izolovány ze vzorku půdy sebraného na Eniwetok Atoll. Tento organismus byl klasifikován jako· nový kmen Streptomyces candidus (Krassilnikov) Waksman, popsaný v práci E. B. Shirling a D. Gottlieb v „Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces. II. Species Descriptions from Second Study“, Intern. J. Systematic Baoteriol. 18 (4): 297—392 (1968), a· S. A. Waksman, „The Actinomycetes. Vol. 2, Clasdfication, Identification, and Descriiptions of Genera and Species“), Williams and Wilkins Co,, Baltimore, 1961.

Tato klasifikace je založena na metodách doporučených v International Streptomyces Project [E. B. Shirling a D. Gottlieb, „Methods for Characterization of Streptomyces Species“, Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 16: 313—340 (1966)] a na určitých doplňujících testech. Názvy barev byly přiřazeny podle ISCC-NBS metody (K. L. Kelly a D. B. Judd, „The ISCC-NBS Method of Determining Colors and Dictionary of Color Names“, U. S. Department of Commerce Cir. 553, Washington, D. C., 1955). Čísla v závarkách se vztahují na Tresner a Backus color series (H. D. Tresner a S. J. Backus, „Systém of Color Wheels for Streptomy.cete Taxonomy“, Appl. Microbiol. 11: 335—338 (1963)] a barevné označení je podtržené: Údaje o· barvách podle Maerza a Paula (A. Maerz a M. . R. Paul, „Dictionary of Color“, McGraw-IHll, New York, N. Y. 1950) jsou uvedeny v závorkách. Kultury byly pěstovány při 30 °C 14 dnů, pokud není uvedeno jinak.

Charakterizace kmenu produkujícího A-35512 antibiotika

Morfologie

Produkují se dlouhé, vlnité sporofory. Spory, které se vyskytují v řetězcích po· ,10 až 50, jsou válcovité a měří od 0,7 do· 1,05 μ x 1,4 až 3,5 μ. Na některých médiích vznikají struktury typu sclerotia. Někdy jsou pozorovány hyfy tvaru košťat nebo chomáčkovité hyfy. Povrch spor byl pozorován elektronovým mikroskopem a bylo nalezeno, že je hladký.

Kulturní charakteristiky na různých .médiích:

.........._...........

Médium charakteristiky

ISP č. 2 (extrakt z kvasnic, extrakt ze sladu agar):

růst hojný, rub šedivožlutý [11J5], hojné vzdušné mycelium a sporulace, blíé (w) a; žádný rozpustný pigment.

ISP č. 3 (ovesná mouka, agar): růst mírný, rub světle žlutozelený [10B1], pěkné vzdušné mycelium a· sporulace, bílé (w) 13ba, žádný rozpustný pigment, tělíska typu sclerotia byly pozorovány.

ISP č. 4 (anorganické soli — škrob agar): růst dobrý, rub jantarově bílý · [10C1], dobré vzdušné mycelium a sporulace, žlutošedivý (GY) 2dc, mírně hnědý rozpustný pigment, pozorovány tělíska typu sclerotií.

ISP č. 5 (glycerol asparagin agar): .

růst dobrý, rub světle žlutozelený [10B2], dobré vzdušné mycelium a sporulace, bílé (w) a, žádný rozpustný pigment, mycelium je chomáčkovité.

Emersonův agar:

růst dobrý, rub světle olivový [14L6], žádné vzdušné mycelium nebo sporulace, světle hnědý rozpustný pigment.

Bennettův modifikovaný agar: růst hojný, rub mírně žlutý [11J6], hojné vzdušné mycelium a sporulace, bílé (w) a, žádný rozpustný pigment.

Czapek roztok, agar: růst dobrý, rub světle žlutozelený [10B1], dobré vzdušné mycelium· a sporulace, bílé · (w) b, žádný rozpustný pigment, · mycelium je chomáčkovité.

Tomatová pasta, ovesná kaše, agar: růst · hojný, rub šedožlutý, [1115], hojné vzdušné mycelium a sporulace, bílé (w) a, mycelium se stáčí nahoru od povrchu agaru, žádný rozpustný pigment.

Živný agar:

růst pěkný až dobrý, rub světle žlutozelený (18D2), dobré vzdušné mycelium a sporulace, bílé (w) a, světle hnědý rozpustný pigment.

Glukosa asparagin agar: růst dobrý, rub světle žlutozelený [17E1], dobré vzdušné mycelium a sporulace, bílé (w) 13ba, žádný rozpustný pigment.

Trypton, extrakt z kvasnic, agar:

růst pěkný, rub bílý [10A1], pěkné vzdušné mycelium a sporulace, bílé (w) b, žádný rozpustný pigment.

Tyrosin agar:

růst dobrý, rub bílý [10B2], dobré vzdušné mycelium a sporulace, bílé (w) a, hnědý rozpustný pigment, byla pozorována tělíska podobná sclerotia.

Glycerol-glycin agar:

růst dobrý, rub bílý [10B2], dobré vzdušné mycelium a sporulace, bílý (w) b, slabě hnědý rozpustný pigment.

Maleát vápenatý agar:

růst dobrý, rub bílý [10B1], dobré vzdušné mycelium a sporulace, bílé (w), a, žádný rozpustný pigment, médium se vyčeří kolem očka.

Organismus byl studován na vybrané fyziologické vlastnosti za standardních podmínek. Byly nalezeny následující vlastnosti a charakteristiky:

Pozorované vlastnosti charakteristiky

Působení na mléko:

koagulace s vyčeřením za 14 dní.

Redukce dusičnanů: pozitivní.

Produkce melaminového pigmentu na: šikmé půdě pepton, železo, agar:

negativní.

Tyrosinový agar, šikmá půda:

slabě pozitivní (pigment po 7 dnech).

Ttypton, extrakt z kvasnic, méidum: negativní.

Zkapalnění želatiny:

úplné za 14 dní.

Požadavky na teplotu:

až 30 °C, dobrý růst a sporulace.

(ISP č. 2, médium extrakt z kvasnic, extrakt že sladu, šikmá půda):

°C, slabý růst, žádné vzdušné mycelium ani spory, 40 °C slabý vegetativní růst, pouze 45 °C žádný růst.

Výsledky testů využití uhlíku byly provedeny s organismem NRRL 8156 a jsou uvedeny níže. Symboly použité pro označení růstu jsou:

4- = dobrý růst, pozitivní využití (-H) = špatný až pěkný růst ( —) = slabý růst, pravděpodobně nevyužívání — = žádný růst, žádné využití.

Zdroje uhlíku žádný (negativní kontrola)( —)

D-glukosa (pozitivní kontrola)4L-arabinosa(—) sacharosa( —) i-inositol+

D-mannitol+

D-frukto'sa4rhamnosa( —) raff inosa(—)

D-xylosa(4-)

Určité charakteristiky kmene S. candidus NRRL 8156, produkujícího A-35512, jsou odlišné od charakteristik organismů popsaných Shirlingem a Gottliebem [Elwood B. Shirling a David Gottlieb „Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces

III. Additional Species Descriptions from First and Second Studies“, Intern. J. Systematic Bacteriol. 18 (2), 69 — 189 (1968)] a Waksman [S. A. Waksman, „The Actinomycetes. Classification, Identification and Description of Genera and Species“, Vol. 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md., 1961]. Tyto diference jsou shrnuty v tabulce IV.

TABULKA IV

Využití uhlíku

NRRL 8156

L-arabinosa rhamnosa i-inositol

Publikovaný popis +

+

Zkapalnění želatiny Působení na mleto úplné za 14 dní koagulace, vyčeření za 14 dnů pomalé žádná koagulace, dobrá peptonizace.

24

Kultura Streptomyces candidus, použitá pro produkci antibiotik A-35512, byla uložena a je dostupná ve sbírce kultur Northern Regional R-asearch Center, U. S. Department of Agrisulture, Agricul-tural R-esearch Service, Peoria, Illinois, 61604, odkud je dostupná . pod obecným číslem NRRL 8156.

Tak jako· v případě jiných - organismů charakteristiky kultury Streptomyces- candidus NRRL 8156 produkující A-35512 jsou schopné variací. Například umělé varianty a mutanty NRRL 8156 kmene -se mohou získat působením, různých známých mutagenů, jako- jsou ultrafialové světlo, X-paprsky, vysokofrekvenční vlny, radioaktivní záření a různé chemické sloučeniny. Veškeré přírodní a umělé varianty a .mutanty, které přísluší Streptomyces candidus a produkují A-35512 antibiotika, se mohou použít při postupu podle vynálezu.

Živné médium použité pro růst Streptomyces candidus 8156 může být kterékoli z řady médií. Pro ekonomickou produkci, optimální výtěžek a snadnou izolaci produktu jsou však výhodná určitá živná média.

Tak například výhodný zdroj sacharidů při fermentaci ve velkém je -sacharosa, i když glukosa, tapioca dextrin, fruktosa, manitol, maltosa, laktosa apod. se mohou také použít. Výhodným zdrojem. dusíku je rozpustný pepton masa, i - když sójová - mouka, mletá vepřová krev, aminokyseliny, jako je kyselina glutamová -apod., se mohou také použít. U živných anorganických solí, které se mohou přidávat do živného- média, se běžně přidávají -rozpustné soli poskytující ionty zinku, sodíku, hořčíku, vápníku, amonný ion., chloridový, uhličitanový, - sulfátový, nitrátový anod.

Základní stopové prvky nutné pro růst a vývoj organismu mají být také přítomny v živném médiu. Tyto stopové prvky se běžné vyskytují jako nečistoty v jiných složkách média v množství, které je -dostatečné pro růstové požadavky organismu.

Může být také nutné přidání malého- množství (např. 0,2 ml/1) protipěnicího činidla, jako je polypropylenglykol, a - to- zejména při -výrobě ve velkém, kde pěnění -může způsobit značné problémy.

Pro výrobu· dostatečných množství antibiotik A-35512 je výhodná submerzní aerobní fermentace v tancích. Malá množství antibiotik A-35512 se mohou získat z třepané kultury v baňkách. Vzhledem k prodlužování doby vznikající očkováním velkých tanků -sporami organismu je výhodné použít vegetativní očko. Vegetativní očko se připravuje naočkováním malého objemu živnéhomédia sporami nebo částí mycelia organismu a získá se tak čerstvá, aktivní rostoucí kultura -organismu. Vegetativní očko se pak přenese do- velkého- tanku.

Organismus produkující A-35512 se může pěstovat -při teplotě -mezi 20° a asi 40- °C.

Optimální -produkce je mezi teplotou 30 až °C.

Jak je běžné při aerobním submerzním postupu, zavádí se sterilní vzduch do živného média. Pro účinný růst organismu je -objem - vzduchu použitý při výrobě v tancích s výhodou větší než 0,1 objemu vzduchu na objem- živného média za minutu (obj/obj/ /min). Pro účinnou produkci A-35512 antibiotik je objem použitého vzduchu při -produkci v tanku asi 0,25 obj/obj/min.

Produkce A-35512 -antibiotik se -může během fermentace sledovat testováním vzorků živného- média nebo extraktů -pevného podílu mycelia na - antibiotickou účinnost proti organismům, o kterých je známo, že jsou citlivé vůči těmto - antibiotikům.. Organismus použitelný pro testování těchto antibiotik je Bacillus subtilis ATCC 6633. Biotest se s výhodou - provádí papírovými terčíky na agarových -deskách, -obsahujících médium s omezenými živinami.

Po provedení fermentace za submerznfch aerobních -podmínek -se A-35512 antibiotika mohou izolovat z fermentačního média metodami používanými při fermentacích. Antibiotický účinek produkovaný během fermentace organismem- produkujícím A-35512 se obecně vyskytuje -ve filtrovaném živném médiu. Maximální izolace -antibiotik A-35512 se dosáhne původním odfiltrováním hmoty mycelia. Filtrované médium se pak může čistit různými způsoby a získá se směs A-35512 antibiotik. Výhodné techniky zahrnují adsorpci filtrovaného média na koloně polyamidu a eluci kolony vodou a vodnou směsí alkoholu. Elu ováné frakce vykazující antibiotícký účinek se mohou spojit a získá se A-35512 směs. Alternativně použitím- této techniky se eluované frakce mohou spojit na základě chování při chromatografií na tenké vrstvě - a získá se tak A-35512 faktor B a obohacená směs jiných faktorů A-35512.

Další čištění jednotlivých individuálních A-35512 faktorů zahrnuje další adsorpci a extrakci. Adsorbenty jako je -kysličník hlinitý, -silikagel a iontoměničové pryskyřice se mohou s -výhodou použít pro tento účel.

A-35512 faktory - se vyskytují ve fermentačním méidu jako- hydrochloridy. Výhodným izolačním- postupem - na polyamidu - se získá A-35512 faktor B -a zbylé podíly směsi A-35512 jako hydrochloridy. Každý individuální faktor se pak může -převést na volné báze (prosté iontů chloru) vhodným postupem, jako je například chromatografie na slabě bazické iontoměničové pryskyřici.

Alternativně -se pevné podíly živné půdy včetně média a mycelia mohou použít bez extrakce nebo separace, ale s výhodou po •odstranění veškeré vody, jako zdroj pro- A-35512 antibiotika. Například po· produkci A-35512 antibiotické aktivity se živné médium může vysušit - lyofilizaci a přimísit pak přímo do- krmné směsi.

Aglykon A-35512 faktoru B se připraví mírnou kyselou hydrolýzou A-35512 faktoru B. A-35512 faktor B je nejsnadněji dostupný ve formě dihydrochloridu. Dihydro207457

2S chlorid A-35512 faktoru B je tedy výhodným výchozím materiálem pro přípravu aglykonu A-35512 faktoru B. Rovněž tak se vsak mohou použít A-35512 faktor B nebo jiné soli A-35512 faktoru B s kyselinou. Kyselá hydrolýza se provádí běžně známými postupy. I když se může kterákoli z kyselin pro tento' účel použít, kyselina chlorovodíková je výhodnou kyselinou pro· přípravu aglykonu A-35512 faktoru B. Je-stliže se použije chlorovodíková kyselina, pak se aglykon A-35512 faktoru B izoluje ve formě hydrochloridu. Hydrolýza se s výhodou provádí ve vodě za varu po dobu od jedné asi do dvou hodin. Delší reakční doby ve dou k degradaci aglykonu a získají se méně aktivní a později inaktivní produkty. Optimální reakční doba pro specifické reakční podmínky se může stanovit testováním bioaktivity alikvotních podílů reakce.

Směs A-35512 antibiotik, A-35512 antibiotické faktory A, B, C, E a H a .aglykon A-35512 faktoru B inhibují růst určitých patogenních organismů, zejména gram-pozitivních bakterií. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) u různých A-35512 faktorů A, B, C a H inhibuje vybrané bakterie, jak bylo· stanoveno standardními zřeďovacími testy, které jsou zahrnuty v tabulce V.

TABULKA V

Testovaný organismus A-35512 faktor A-2 HC1

Staphylococcus aureus 30556,25

Staphylococcus aureus 307425,0

Streptococcus faecalis6,25

Důležitý aspekt vynálezu spočívá v tom, že antibiotika A-35512 inhibují růst organismů, které jsou rezistentní vůči jiným· antibiotikům.. V tabulce VI jsou shrnuty účinky stanovené standardní metodou terčíků na

MIC (mcg/ml)

A-35512 faktor B . 2 HC1	A-35512 faktor C . 2 HC1	A-35512 faktor H-HC1
3,12	.•6,25	25,0
6,25	6,25	25,0
3,12	3,12	12,5

deskách pro· A-35512 faktory A, B, C, E a H (30 mcg/terčík] proti různým organismům. Aktivita je měřena v mm průměru .pozorované zóny inhibice.

TABULKA VI

Testovaný organismus Průměr zóny (mm.)

	A-35512 faktor A . 2 HC1	A-35512 faktor B . 2 HC1	A-35512 faktor C . 2 HC1	A-35512 faktor E . HC1	A-35512 faktor H . HC1
	Staphylococcus aureus 3055 (na penicilín G citlivý)	13,4	18,4	0	14,4	11,9
	Staphylococcus aureus 3074 (rezistentní na penicilín G)	13,2	16,8	0	14,5	11,6
*	Staphylocuccus aureus 3130 (rezistentní na meehicШn)	14,4	18,4	0	15,4	12,6
Streptococcus pyogenes (skupina A)	17,0	19,6	10,5	17,0	16,0
	Streptococcus sp. 9960 (skupina D)	15,5	19,4	0	16,4	13,8
	Diplococcus pneumoniae	—	—	11,0	20,0	—

Park I

Tabulka VII udává další zředovací testy na agaru pro dihydrochlorid A-35512 faktoru В a jsou uvedeny minimální inhibiční koncentrace (MIC) na skupinu A Streptococci a Diplococcus pneumonia.

TABULKA VII

Testovaný organismusMIC (mcg/ml) A-35512 faktor В

Streptococcus pyogenes C2031

Streptococcus pyogenes 103891

Streptococcus pyogenes 123448

Streptococcus pyogenes 129611

Streptococcus pyogenes 663-720,5

Streptococcus pyogenes 664-720,5

Streptococcus pyogenes 665-721

Streptococcus pyogenes 132340,5

Streptococcus pyogenes 190350,5

Streptococcus pyogenes M65170,5

Streptococcus pyogenes D277811

Diplococcus pneumoniae

Park I2

Diplococcus pneumoniae typ 142

Tabulka VIII uvádí další agarové ředicí testy pro dihydrochlorid A-35512 faktoru В proti několika skupinám D Streptococci.

TABULKA VIII

Testovaný organismus MIC (mcg/ml) A-35512 faktor В

Streptococcus sp. D2822

Streptococcus sp. 99012

Streptococcus sp. 99134

Streptococcus sp. 99334

Streptococcus sp. 99604

Streptococcus sp. 12253F4

Streptococcus sp. Shrigley4

Streptococcus sp. Mitis4

Streptococcus sp. 2382

Streptococcus sp. SS9924

Tabulka IX udává další ředicí testy na agaru pro dihydrochlorid A-35512 faktoru В proti jiným gram-pozitivním organismům,

TABULKA IX

Testovaný organismusMIC (mcg/ml) A-35512 faktor В

Staphylococcus aureus 3123*4

Staphylococcus auresu H43**4

Staphylococcus aureus 3124**4

Staphylococcus aureus 3126**2

Staphylococcus auresu 3127**4

Testovaný organismus

MIC (mcg/ml) A-35512 faktor В

Staphylococcus auresu H57**2

Staphylococcus auresu 3074**4

Staphylococcus aureus 3130***4

Staphylococcus aureus 3131***'*4

Staphylococcus aureus 3133***2

Staphylococcus aureus 3136***2

Staphylococcus aureus 3125***4

Staphylococcus epidermis

3064**2

Staphylococcus epidermis

3078*2

Bacillus subtilis ATCC 66332

Sarcina lutea PCI-1001-FDA1 * na penicilín G citlivý ** na penicilín G rezistentní *** penicilín G rezistentní, methicillin rezistentní **** penicilín G rezistentní, methicillin rezistentní, clindamycin rezistentní.

Antibiotika A 35512 také inhibují růst určitých anaerobních bakterií. Tabulka X shrnuje aktivitu dihydrochloridu A-35512 faktoru В proti různým· anaerobním bakteriím za použití standardního ředicího testu.

TABULKA X

Testovaný organismus	MIC (mcg/ml) A-35512 faktor В
Actinomyces israelii	0,5
Clostridium perfringens	2,0
Clostridium septicum	4,0
Eubacterium aerofaciens	2,0
Peptococcus asaccharolyticus	1,0
Peptococcus prevoti	2,0
Peptostreptococcus anaerobius	1,0
Peptostreptococcus intermedius	4,0
Propionibacterium acnes	0,5
Bacteroides fragilis ssip. fra-	64,0
gilis 111
Fusobacterium necrophorum	8,0

Dihydrochlorid A-35512 faktoru В vykazuje in vivo antimikrobiální účinek proti experimentálním bakteriálním infekcím. Jestliže se dvě podkožní dávky A-35512 faktoru В aplikují myším s objasněnou infekcí, pak se účinek měří jako EDso [účinná dávka v mg/kg chránící 50 o/_o testovaných živočichů (viz Warre-n Wick aj., J. Bacteriol. 81 233 až 235 (1961)]. EDso hodnoty pozorované pro dihydrochlorid A-35512 faktor В jsou uvedeny v tabulce XI.

TABULKA XI

Testovaný organismus

Streptococcus pyogenes C203

Diplococcus pneumoniae Park I

Staphylococcus aureus 3055

Dihydrochlorid A-35512 faktoru В také chrání morčata, která byla infikována Clostridium chauvoei (způsobující onemocnění Black Leg u skotu). Tyto testy byly provedeny podle U, S. D. A. Suipplemental Assay Method for Potency Testing Clostridium

ED50

Změna infekce

1,75 260 x LDso (ip)

4,3 60,8 x LDso (ip)

6,9 206 x LDso (ip) chauvoeí-containing Products (SAM 200, U. S. Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Veterinary Servise Laboratories, Ames Iowa 50010, Apríl 7, 1975, under 9 C. F. R. 113.91). Výsledky testů jsou uvedeny v tabulce XII.

TABULKA XII

Ošetření

Mrtvý/celkem

Procento ochrany

A-35512 faktor B, 10 mg/kg*

A-35512 faktor В, 1 mg/kg* kontrola * Intramuskulární aplikace.

0/10

3/10

10/10

100

0

TABULKA XIV

Účinek aglykonu A-35512 faktoru B, měřený běžným difúzním testem za použití terčíků (6 mm v průměru, ponořené do roztoků obsahujících 1 mg testované sloučeniny na ml roztoku a umístěné na agarové desky naočkované testovaným organismem), je shrnut v tabulce XIII.

TABULKA XIII

Testovaný organismus

Stahpylococcus aureus

Bacillus subtilis Sarcina lutea

Bacillus subtilis*

Zóna inhibice (mm) A-35512 faktor В aglykon (volná báze) * agar s omezenými živinami.

Tabulka XIV shrnuje minimální inhibiční koncentrace (MIC), při použití hydrochloridu aglykonu A-35512 В je aktivní na vybrané kmeny Staphylococcus aureus, stanoveno standardními zřeďovacími testy na agaru.

Testovaný organismus	MIC (mcg/ml)
Slaphyl-ococcus aureus 3055*	0,5
Staphylococcus aureus H290*	0,5
Staphylococcus aureuis V92*	0,5
Staphylococcus aureus V104*	0,25
Staphylococcus aureus 3074* *	0,25
Staphylococcus aureus H43**	0,5
Staphylococcus aureus V57**	0,5
Staiphylococcus aureus H356**	1,0
Staphylococcus aureus 3130***	0,5
Staphylococcus aureus 3131****	0,5

* na penicilin-G citlivý ** na penicilin-G resistentní *** na penicilin-G resistentní, na methicillin resistentní **** na penicilin-G resistentní, na methicillin resistentní, na clindamycln resistentní

Tabulka XV udává další ředicí testy na agaru pro hydrochlorid aglykonu A-35512 faktoru В proti několika Streptococcus skupiny D.

TABULKA XV

testovaný organismus	MIC (mcg/ml)
Streptococcus sp. Shrigley	1,0
Streptococcus sp. Mitis	1,0
Streptococcus sp. 12253F	1,0
Streptococcus sp. SS992	1,0
Streptococcus sp. 9933	1,0
Streptococcus sp. 9913	1,0
Streptococcus sp. 282	1,0
Streptococcus sp. 238	1,0

Aglykon A-35512 faktoru B vykazuje in vivo antibakteriální účinek proti experimentálním infekcím. Jestliže se dvě podkožní dávky hydrochloridu aglykonu A-35512 faktoru B aplikují · myším· se známou infekcí, pak pozorovaný účinek je měřen jako EDso hodnot. EDso hodnoty stanovené pro hydrochlorid aglykonu A-35512 faktoru B jsou uvedeny v tabulce XVI.

TABULKA XVI

testovaný organismus	EDso	změna infekce
Streptococcus pyogenes C203	5,8	2570 x LDso (lip)
Streptococcus pneumoniae	7,0	374 x LDso (iip)
Staphylococcus aureus 3055	1,04	370 x LDso (íip)

Antibiotika A-35512 jsou relativně netoxická. Například LDo dihydrochloridu A-35512 faktoru A při podkožní aplikaci vyhladovělým samicím myší Cox a Harlar ICR je větší než 8000 mg/kg. LDso dihydrochloridu · A-35512 faktoru B · u myší při íntraperitoneální injekci · je přibližně 1356 mg/,kg a při · intravenosní aplikaci je > 1000 < 1250 mg/kg. Jak dihydrochlorid A-35512 faktoru C a hydrochlorid A-35512 faktoru E mají akutní toxicitu při intraperitoneální aplikaci myším vyšší · než 300 mg/kg.

Jiná důležitá vlastnost A-35512 směsi a sloučenin je schopnost zlepšení využití potravy u živočichů. Tato schopnost byla prokázána u přežvýkavců, které mají vyvinutý přežvýkavý žaludek.

Je známo, že účinnost využití sacharidů u přežvýkavců se zvyšuje ' ošetřením·, při kterém se. stimuluje flora · přežvýkavého· žalud- « ku živočichů tak, aby .produkovaly . propionátové sloučeniny spíše než acetátové nebo butyrátové .sloučeniny (například úplnější diskuse viz C.hurch aj. v „Digestive Physiology and Nutrition· of Ruminants“, Vol. 2, 1971, str. 622· a 625 j.

Účinnost využití potravy je možno· demonstrovat testy in vivo· u dobytka s vývodem z žaludku, metodou popsanou Arthus P. Raunem v USA patentu č. · 3 794 732 (viz zejména příklad 8): Tabulka XVII shrnuje výsledky· těchto testů používající dihydrochlorid A-35512 faktoru B, které jsou uvedeny v molárních procentech koncentrace kyseliny propionové, v žaludku přežvýkavců a hodnota je průměrem pěti analýz během 21 dnů testovaného období.

ošetření	počet živočichů	TABULKA XVII	i
průměr · mol. % propionové kyseliny	zvýšení molárních % oproti kontrole
kontrola	5	19,3	—
A-35512 faktor B 50 g/t	5	26,0	6,7

Směs A-35512 · sloučenin a sloučeniny A-35512 jsou, účinné pro zvýšení propionátů a tak se zvyšuje využití potravy při aplikaci · přežvýkavců · orálně v množství od 0,15 do asi 10,0 mg/kg/den. Nejlepší výsledky byly dosaženy při použití množství asi od 1,0 asi do 2,0 mg/kg/den. Výhodná metoda aplikace směsi nebo sloučenin A-35512 je smíšení s potravou živočichů, avšak tyto sloučeniny se mohou také podávat například · ve formě tablet, dražé· nebo· kapslí. Úprav těchto· různých dávkových forem· lze dosáhnout · při použití · metod dobře známých ve veterinární farmaceutické praxi. Každá individuální ’ dávková jednotka obsahuje množství A-35512 směsi nebo sloučeniny, přímo· vztažené na denní dávku zvířete, které se má ošetřit.

Směs A-35512 nebo sloučeniny A-35512 jsou také použitelné jako· činidla podporující růst u živočichů. Při testování u kuřat brojlerů se dihydrochlorid A-35512 faktoru B přidá k potravě v množství 20 g na tunu, které zvyšuje přírůstek hmotnosti a využitelnosti potravy. Tabulka XVIII shrnuje · výsledky těchto testů, při · kterých byly dvakrát opakovány testy používající čtyři skupiny po osmi ptácích.

ošetření	TABULKA XVIII	% zlepšení proti kontrole
konc. (g/tuna)	váha % zlepšení přírůstek (g) proti kontrole	využití potravy
kontrola	—	380 —	1,850	—
A-35512
faktor B	20	394 3,68	1,776	4,00

Tabulka XIX shrnuje výsledky těchto· testů, ve kterých se použije 12 opakovaných pokusů po 80 ptácích.

TABULKA XIX
ošetření	k.onc. (g/tuna)	váha přírůstek (g)	% zlepšení proti kontrole	využití potravy	% zlepšení proti kontrole
kontrola A-35512	—	1898	—	2,250	—
faktor B	20	1956*	3,06	2,177*	.2,81

*P á 0,05

Směs A-35512 a · sloučeniny A-35512 jsou účinné při zlepšování růstu u drůbeže, jestliže se s· potravou aplikuje množství od 1 asi do 1θ0 g směsi sloučenin A-35512 na tunu potravy.

Vynález je blíže objasněn v následujících (příkladech.

Příklad 1

A. Fermentace A-35512 v třepané baňce

Lyofilrsovaná tableta Streptomyces candidus NRRL 8156 se rozpustí v 1 až 2 ml sterilované vody. Tento roztok se použije pro· naočkování, šikmého aga-ru Bacte' extraktu z kvasnic a sladu (ISP č. 2, Difco Laboratories, Detroit, Michigan).

Naočkovaná šikmá půda se , inkubuje asi sedm dní při 30 °C. Vzrostlá šikmá kultura se převrství vodou (2 ml) a sterilní pipetou se seškrabou spory. Část (0,1 ml) tét-o· vodné suspense spor se použije pro naočkování jiné šikmé agarové· půdy s ISP č. 2. Tato naočkovaná šikmá půda se inkubuje asi sedm dní při 30 °C. Dorostlá šikmá půda se převrství vodou (5 ml) a sterilní pipetou se seškrábou spory. Část (2,5 ml) vzniklé suspense spor se použije pro naočkování 50 ml vegetativního média následujícího složení.

složky množství

Trypticase sójové médium (Bartimore Btologcal Laboratories, Cockeyswille Md.) 30 g voda (deionisovaná) doplnit do 1 litru

Naočkované vegetativní médium· se inkubuje v 250 ml Erlenmeyerově baňce při 30°

Celsia po· dobu 48 hodin na rotační třepačce s posunem 5 cm a 250 otáčkami · za miTakto naočkované vegi^^.a^ivní médium (0,5 ml) se použije pro naočkování 50 ml produkčního média následujícího· složení:

Složka	Množství (8/1)
Tapioca dextrin	25,0
glukosa	10,0
NH4NO3	2,5
KC1	1,5
MgS04	1,1
FeCii. 4HaO	0,03
Zndž	0,03
KH2PO4	0,1
L-glutamová kyselina	1,0
DL-cítrullin	0,1
CaCO3	5,0
deionisovaná voda	do 1 litru

Naočkované produkční médium se inkubuje v 250 · ml Erlenmeyerově baňce 8—10 ' dnů při teplotě 32 °C na třepačce s posunem · 5 cm a 250 otáčkami za minutu.

B. Fermentace A-35512 v tanku

Pro přípravu většího' objemu očka se 20 mililitrů naočkovaného vegetativního média připraveného postupem popsaným výše použije pro· naočkování 400 ml druhého stupně média pro vegetativní -růst, které má stejné složení jako vegetativní médium. Tento· druhý stupeň média se inkubuje 24 hodin v dvoulitrové baňce při 32 °C na třepačce s posunem 5 cm a 250 otáčkami za minutu.

Inkubované· vegetativní médium druhého stupně (800 ml), .připravené tímto· způsobem, se použije pro· naočkování 100- litrů sterilního produkčního média. Naočkované produkční médium se fermentuje v 1651iti’ovém fermentačním tanku po· dobu 8 až 10 dnů při teplotě 32 °C. Fermentační médium se· provzdušňuje sterilním vzduchem rych nutu.

lostí 0,25 obj./obj./min a míchá se běžným míchadlem rychlostí 200 ot/min.

Příklad 2

Inkubované vegetativní médium, připravené postupem popsaným v příkladu 1 sekce A, se může alternativně skladovat pro pozdější použití tak, že se udržuje v plynné fázi kapalného· dusíku, podle ná^dét^ujícího· postupu.

V malé (13 · x 100 mm.) sterilní zkumavce se šroubovacím· uzávěrem se umístí 2 ml suspensního· činidla následujícího složení:

Složka Množství glycerol 20 % laktosa 10 °/o voda (deionisovaná) 70 %

K tomuto· suspensnímu činidlu se přidají 2 ml vegetativního média inkubovaného· 48 hodin, připraveného postupem popsaným výše. Smíšený roztok se zmrazí a udržuje v plynné fázi v nádržce s kapalným dusíkem.

Takto skladované vegetativní médium se roztaví pro· použití v třepané fermentaci nebo· pro fermentaci v tanku tak, že se zkumavka umístí do· vodní lázně teploty 43 °C. Část roztátého roztoku (1 · ml) ze · zkumavky se použije pro naočkování 50 ml vegetativního média stejného· složení, jako· bylo· popsáno v příkladu 1, sekci A. Naočkované vegetativní médium se použije způsobem popsaným· v příkladu 1 buď po fermentaci v třepaných baňkách, nebo pro· přípravu většího očka pro fermentační tank.

Příklad 3

Fermentace se provádí postupem· podle příkladu 1, ale za použití produkčního média pro· třepané baňky nebo fermentaci v tanku, následujícího· složení:

složka

Tapioca dextrin melasa rozpustný pepton z masa

MgSOr. 7H₂O

CaCO3 voda množství · (g/1)

75,0

40,0

15,0

0,5

2,0 do 1 litru psané v příkladu 1 se filtruje použitím filtrační pomocné látky (Hyflo supercel, diatomická hlinka, Johns-Manville Products Corp.), přičemž pH média je 6,8 — 7,2. Čirý filtrát získaný tímto způsobem ee prolije kolonou obsahující 10 ml polymerního· adsorbentu (Amiberlit XAD-4 Rohn · a Haas Co.) na 100 ml filtrátu média, rychlostí 150 ml za minutu. Frakce získané tímto· způsobem· se testují na biologickou aktivitu proti Sarcina luitea standardní metodou za použití terčíků. Biologicky inaktivní eluáty se vylejí. Kolona se promyje vodou (1/8 celkového objemu) rychlostí 150 ml/minutu. Inaktivní voda se vylaje.

Kolona se pak eluuje 50% vodným · methanolem (600 litrů) rychlostí 200 ml za minutu. Eluáty obsahují směs antibiotik A-35512 se zahustí ve vakuu na objem· 15 litrů,· obsahující po 200 mg směsi antibiotik A-35512 na litr.

Příklad 5

Isolace faktorů ze směsi - antibiotik A-35512

Směs antibiotik A-35512 (asi 3000 g rozpuštěné v 15 litrech methanolu), získaná postupem podle příkladu · 4, se chromatografuj'e na koloně polyamidu · (Woelm, 100 litrů). Kolona se eluuje deionisovanou vodou průtokem asi 80 až 120 ml za · minutu. .

Frakce se sledují chromatografií na tenké vrstvě celulosy · nebo papírovou chromatografií ve směsi n-butanol/pyridin/kyseli-na octová/voda (15:10:3:12) a bioautografií za použití Sarcina lutea.

Prvních 100 litrů eluátu se vylije.

Rychlost · promývání · se pak změní na asi 160 — 200· · ml · za., minutu a jímají se dvanáctilttrové · frakce. · Tímto způsobem· se jímá dvacet frakcí.

Pak se eluční rozpouštědlo změní na gradient voda-met'hanol použitím následujícího postupu:

Zás<^'hi^‘^ik 360 litrů · methanolu se sifonovým přepadem · se . spojí se · zásobníkem obsahujícím · 120 litrů vody. V zásobníku obsahujícím vodu se roztok míchá a použije se pro eluci kolony.

Dvace^tym frakcí · (po 24 litrech) se jímá tímto způsobem rychlostí 200 — 3Ú0 ml/ /min.

Na základě bioautografických výsledků se skupiny frakcí spojí a odpaří k suchu ve vakuu. Získá se tak dihydrochlorid A-35512 faktoru B a následující obohacené směsi faktorů:

i

Příklad 4

Isolace směsi antibiotik A-35512

Celé fermentační médium (1136 litrů) po207457 frakce objem [litry] faktor hmotnost

1 — 10	120	A + H	192 g
11 — 24	216	B	269 g
25 — 31	168	B + C	590 g
32 — 44	312	C, E, F, G	224 g
Příklad 6		Příklad 8
Cištěm A-35512 faktoru B		Čištění A-35512 faktoru A

Částečně vyčištěný dihydrochlorid A-35512 faktoru B (400 g), získaný způsobem podle příkladu 5, se rozpustí v · 1,2 1 50% vodného· methanolu a chromatografuje se pa koloně kysličníku .hlinitého, připravené následujícím' způsobem:

Kyselý kysličník hlinitý (10 kg, M. Woelm) se míchá v 50% vodně methanolické směsi. Po stání směsi se supernatant dekantuje a vylije. Kysličník hlinitý se znovu míchá v 50o/0 vodném methanolu a pak naplní do kolony o průměru 13,5 cm. Kolona kysličníku hlinitého se promývá 50*% vodným methanolem, až se získá čirý eluát.

Kolona se eluuje 50'% vodným methanolem· rychlostí 8 — , 10' . ml/min a jímají se frakce 240 — 300 ml. Frakce se sledují bioautografií na tenké vrstvě, jak je popsána v příkladu 5.

Na základě těchto. dat se frakce spojí a získá se vyčištěný dihydrochlorid A-35512 faktoru B.

frakce . hmotnost — 21 9,6g — 29 72,0g — 37 117,0g

Každý .podíl se krystaluje ze zahuštěného 50¹% vodně methanolického roztoku při 49° Celsia. Takto· vyčištěný dihydřochlorid A-35512 faktoru B obsahuje asi 4,6 % chloru. Roztok dihydrochloridu A-35512 faktoru B v 66% dimethylformamidu má pH asi 6,5.

Příklad 7

Příprava A-35512 faktoru B prostého iontů chloru

Čištěný dihydřochlorid A-35512 faktoru B (1 g], získaný postupem. popsaným v příkladu 6 a· rozpuštěný ve vodě (40 ml), se prolije ioníoměničovou kolonou 2,5 x 18 cm (Bio-Rad AG 3—4x v OH cyklu) rychlostí 0,5 1/min. a kolona se eluuje deionisovanou vodou. První eluát (5 ml) se vylije. Následující eluát (50· ml) se odpaří ve vakuu k suchu a získá se 0,76 g A-35512 faktoru B, prostého· iontů chloru, ve formě bílého· prášku, který obsahuje asi 1,59 % chloru. Roztok tohoto A-35512 faktoru B prostého· atomů chloru v 60% vodném dimethylformamidu má pH 9,13.

Částečně vyčištěný dihydřochlorid A-35512 faktoru A (1 g), získaný · postupem popsaným v příkladu 5 (frakce 1 — 10], se rozpustí v 50% vodném methanolu (5 ml). , Tento roztok se chromatografuje na koloně kysličníku hlinitého· rozměrů 3 x 16 cm · (M. Woelm), připraveného postupem podle příkladu 5. Kolona se eluuje 50% vodným· methanolem rychlostí 0,5 ml/min. Jímají se frakce · o objemu · 5 ml. Veškeré frakce se analysují chromatografií na tenké vrstvě bioautografií, způsobem popsaným v příkladu 5. Na základě těchto testů se -frakce 7 až 15 spojí, zahustí za sníženého tlaku na malý objem a lyofilisací se získá 0,3 g dihydrochloridu A-35512 faktoru A (4,71 % chloru).

Příklad 9

Příprava A-35512 faktoru A prostého iontů chloru

Dihydrochlorid A-35512 faktoru A (200 mg), připravený · postupem podle příkladu 8, se rozpustí ve vodě (10 ml). Tento· roztok se prolije iontoměničovou kolonou (l,5x xlOcm) (Bio-Rad AG 3—4x v OH cyklu) rychlostí 0,5 ml/min, elucí deionisovanou vodou. Původní eluát (10 ml) se vylije. Následující eluát (20 ml) se zahustí na malý objem za sníženého· tlaku, načež se lyooilisuje za vzniku 115 mg A-35512 faktoru A, prostého· iontů chloru.

Příklad 10

Čištění A-35512 faktoru C .......... ..........................

Částečně vyčištěný dihydřochlorid A-35512 faktoru C (15 g), získaný postupem popsaným v příkladu 5 (frakce 25 — 31), se rozpustí v dei-on.isované vodě (40 ml). Tento· roztok se nanese na 4 x 115 cm- kolonu s polyamidem, použitím MN < 0,07 mm, Brinkman Instruments lne., připravené a promývané přes noc vodou. Kolona se eluuje deionisovanou vodou rychlostí asi 3 ml za minutu. První eluát (250 ml) se vylije a pak se jímají frakce po 24 ml.

Frakce se sledují bioautografií chromatogramů na tenké vrstvě. Chromatografická deska s celuiosou (na hliníkové podložce

E. Merck W. Germany) za použití směsi sek.: pyridin : kyselina octová : voda (10:

:10:3:8) a za použití Bacillus subtills jako et^^ísníiho organismu. Na základě výsledků chromatografie na tenké vrstvě se frakce 1 až 33 spojí, zahustí ve vakuu na 150 ml a lyo-filisují se.

Další dvě dávky částečně vyčištěného· dihydroc.hloridu A-35512 faktoru C se chromatografuje za stejných podmínek. Pokaždé se frakce · 1 až 33 spojí, zahustí ve vakuu na 150 ml a lyofilisují se. Tri lyofil^^s^ované _ vzorky ze tří kolon se spojí a získá se

12,3 g částečně vyčištěného dihydrochloridu. faktoru C.

Dihydrochlorid A-35512 faktoru C se 'dále čistí chromatografií na jiné koloně polyamidu, postupem popsaným· výše, jímají se však frakce objemu 15 ml rychlostí 1 ml za minutu. Eluáty z kolony se znovu sledují bioautografií na tenké vrstvě. Frakce 36 až 58 se spojí, zahustí ve vakuu na objem. 150 ml a lyofilisací se získá 5,3 g dále vyčištěného dihydrochloridu ' A-35512 faktoru C.

Konečné čištění dihydrochloridu A-35512 faktoru C se provádí chromatografií na koloně 5 x 41 cm kyselého kysličníku hlinitého (Woelm). Kolona se naplní a promyje se 50% vodným methanolem. Jakmile promývací eluát je čirý, nanese se A-35512 faktor C na kolonu (5,3 g, rozpuštěný v 30 ml 5O0/0 vodného· methanolu). Kolona se eluuje 50% vodným· methanolem rychlostí 1 ml za minutu. Jímají se frakce o· objemu 12 ml a eluáty se sledují chromatografií na tenké vrstvě a bioautografií, jak je popsáno výše. Frakce 22 až 74 se spojí, zahustí .ve vakuu na objem 250 ml a lyofilisací se získá 3,86 gramu dihydrochloridu A-35512 faktoru C.

Příklad 11

Příprava A-35512 faktoru C prostého iontů chloru

Dihydrochlorid A-35512 faktoru C (200 •miligramů), připravený postupem popsaným v příkladu 10, se chromatografuje na slabě basické iontoměničové pryskyřici, použitím postupu uvedeného v příkladu 9, a získá se 156 mg A-35512 faktoru C prostého chloru. Tento· · A-35512 faktor C prostý chloru obsahuje a.si 1,90 % chloru.

Příklad 1 2

Čištění A-35512 faktoru E

Částečně vyčištěný hydrochlorid A-35512 faktoru E (8,1 g), získaný postupem podle příkladu 5 (frakce 32 — 44), se rozpustí v deionisované vodě (40 ml). Tento· roztok se nanese na 5 x 110 cm polyamidovou kolonu (MN < 0,07 · mm, Brinkman Instruments, lne.), připravenou a promývanou vodou přes noc. Kolona se pak eluuje deionisovanou vodou rychlostí 20 ml za 15 minut a jímají se frakce o objemu 20 ml. Po 118. frakci se eluční rozpouštědlo· změní na 50% vodný · methanol. Frakce se sledují chromatografií na tenké vrstvě a bioautografií, jak je popsáno v příkladu 10.

Frakce 148 až 195 obsahují A-35512 faktor E. Tyto· frakce se spojí, zahustí za sníženého tlaku na objem· 150 ml a lyofilisací se · získá 2,7 g hydrochloridu A-35512 faktoru E.

Část tohoto částečně vyčištěného hydrochloridu A-35512 faktoru E (615 mg) se rozpustí v 50·% vodném methanolu (5 ml) · a nanese se na kolonu 1,5 x 50 cm· kyselého kysličníku hlinitého, která se připraví a promývá 50% vodným methanolem· až do čirého eluátu. Kolona se pak eluuje 50% vodným methanolem rychlostí 1 ml za minutu a jímají se frakce o objemu 10 · ml. Znovu se frakce sledují chromatografií na tenké vrstvě a lyofilisují. Frakce 5 až 8 se spojí a zahustí za sníženého tlaku na objem asi 10 ml. Deionísovaná voda (asi 50 ml) se pak přidá a vzniklý roztok se lyofilisuje a získá se 480 mg hydrochloridu A-35512 faktoru E. ,

Příklad 13

Příprava A-35512 faktoru E prostého iontů chloru

Hydrochlorid A-35512 faktoru E (200· mg), připravený postupem popsaným v příkladu 12, se chromatografuje na slabě basické iontoměničové pryskyřici použitím· postupu uvedeného· v příkladu 9 a získá se 170 mg A-35512 faktoru E prostého iontů chloru. Tento A-35512 faktor E prostý lontů chloru obsahuje asi 1,72 % chloru.

Příklad 14

Čištění A-35512 faktoru . H

Částečně vyčištěný hydrochlorid A-35512 faktoru H (30 g), získaný postupem popsaným v příkladu 5 (frakce 1—10), se rozpustí v minimálním · množství roztoku m.ethanol : voda (7:3). Vzniklý roztok se adsorbuje na koloně · kyselého· kysličníku hlinitého (3 x 60 cm, Woelm, naplněné v methanolu a eluované methanolem až do čirého eluátu). Kolona se pak eluuje methanolem rychlostí · čtyř ml/min. Frakce se jímají o objemu 24 ml. Eluční · rozpouštědlo se změní při frakci 59 na směs methano!: : voda (1:1).

Frakce se sledují ·c.hromatogгafii na tenké vrstvě za použití směsi chloroform : methanol : hydroxid amonný (2:3:1) a bioautografií s Ba-ciUus subtilis při alkalickém pH.

Frakce 51 až 118 se spojí a odpaří ve vakuu a získá se 6,4 g vyčištěného hydrochloridu A-35512 faktoru H.

příklad 15

Příprava A-35512 faktoru H prostého iontů chloru

Hydrochlorid.A-35512 faktoru H (200 mg), připravený postupem podle příkladu 14, se chromatografuje na slabě basické iontoměničové pryskyřici použitím postupu uvedeného v příkladu 9. Získá se 143 mg A-35512 faktoru H prostého iontů chloru. Tento A-35512 faktor H prostý iontů chloru obsahuje přibližně 1,59 % chloru.

Příklad 16

Příprava aglykonu A-35512 faktoru B

Dihydrochlorid A-35512 faktoru B (5,0 g), získaný postupem podle příkladu 6, se rozpustí ve vodě (200 ml). Tento· roztok se okyselí 4N kyselinou chlorovodíkovou (14 mililitrů). Vzniklý roztok se zahřívá dvě hodiny k varu. Roztok se pak ochladí a odpaří ve vakuu asi na 3/4 původního objemu. Kyselina chlorovodíková (6N) se pak přikape k tomuto roztoku až do úplného· vysrážení. Vzniklá sraženina se odfiltruje a vysušením se získá 3,56 g surového· hydrochloridu aglykonu A-35512 faktoru B.

Filtrát se zahustí a analysuje. Filtrát obsahuje glukosu, fukosu, mannosu a rhamnosu.

Surový aglykon A-35512 faktoru B se čistí chromatografií na kysele promytém kysličníku hlinitém (Woelm, aktivita I) použitím· směsi voda : methanol (1:9). Eluáty z kolony se sledují chromatografií na tenké vrstvě celulosy. Frakce obsahující aglykon A-35512 faktoru B se spojí a odpařením· ve vakuu se získá 398 mg částečně vyčiště ného produktu. Srovnání chromatografických výsledků za použití detekce ninhydrinem prokazují, že v produktu jsou stále přítomny neaktivní nečistoty.

Část tohoto částečně vyčištěného aglykonu A-35512 faktoru B (100 mg), se dále čistí chromatografií na polyamidu (4 g, Machery, Nagel & Co. NM-SC-6, distribuce Brinkmann Instruments Co., < 0,07 mm), elucí vodou. Dělení na této koloně se také sleduje chromatografií na tenké vrstvě celulosy, jak je popsáno· výše. Eluované frakce obsahující .aglykon A-35512 faktoru B se spojí a lyofilisací se získá 64 mg vyčištěného hydrochloridu aglykonu A-35512 faktoru B. Celkový výtěžek 5,08 °/o z výchozího faktoru A-35512 faktoru B.

Píklad 17

Příprava volné báze aglykonu A-35512 faktoru B

Hydrochlorid aglykonu A-35512 faktoru B (90 mg), získaný postupem podle příkladu 16, se rozpustí v 30 ml směsi methanolu a vody (1:1). Tento roztok se neutralizuje iontoměničovou pryskyřicí [3,5 ml, Bio-Rad AG-3-4X (OH-)). Vzniklý roztok se míchá 15 minut při teplotě místnosti. Pryskyřice se pak odfiltruje. Filtrát se zahustí ve vakuu při teplotě pod 60 °C asi na jednu polovinu objemu, načež · se lyofilisací získá 68 mg volné báze aglykonu A-35512 faktoru B.

Claims (10)

1. PREDMĚT

   1. Způsob přípravy směsi antibiotik A-35512, sestávající z faktorů A, B, C, E, F, G H, a jejího rozdělení na jednotlivé faktory a následující přípravy aglykonu faktoru B, vyznačený tím, že se kultivuje Streptomyces candidus NRRL 8156 v živném· médiu obsahujícím asimilovatelné zdroje sacharidů, dusíku a anorganických solí, při teplotě mezi 20 až 40 °C za submersních aerobních fermentačních podmínek, popřípadě se ze živného média isoluje směs antibiotik A-35512, popřípadě se ze směsi antibiotik A-35512 isolují antibiotické A-35512 faktory A, B, C, E, F, G, H a popřípadě se z antibiotika A-35512 faktoru B připraví aglykon A-35512 faktoru · B.
2. 2. Způsob podle bodu 1 pro přípravu směsi antibiotik A-35512, vyznačený tím, že se isoluje směs antibiotik A-35512 ze živného média filtrací.
3. 3. Způsob podle bodu 1 pro přípravu A-35512 faktoru A vyznačený tím·, že se A-35512 faktor A isoluje ze směsi antibiotik A-35512 chromatografickým dělením.
4. 4. Způsob podle bodu 1 pro přípravu A

   -35512 faktoru B vyznačený tím, že se A-35512 faktor B Isoluje ze směsi antibiotik A-35512 chromatografickým dělením.
5. 5. Způsob podle bodu 1 pro přípravu A-35512 faktoru C vyznačený tím, že se A-35512 faktor C isoluje ze směsi antibiotik A-35512 chromatografickýim· dělením.
6. 6. Způsob podle bodu 1 pro· přípravu A-35512 faktoru E vyznačený tím, že se A-35512 faktor E isoluje ze směsi antibioňtik A-35512 chromatografickým dělením.
7. 7. Způsob podle bodu 1 pro přípravu A-35512 faktoru F vyznačený tím, že se A-35512 faktor F isoluje ze směsi antibiotik A-35512 chromatografickým· dělením na papíře.
8. 8. Způsob podle bodu 1 pro přípravu A-35512 faktoru G vyznačený tím, že se A-35512 faktor G isoluje ze směsí antibiotik A-35512 chromatografickým dělením na papíře.
9. 9. Způsob podle bodu 1 pro přípravu A-35512 · faktoru H vyznačený tím, že se A-35512 faktor H Isoluje ze směsi antibiotik A-35512 chromatografickým dělením.
10. 10. Způsob podle bodu 1 pro přípravu aglykonu faktoru В vyznačený tím, že se z

    A-35512 faktoru В připraiví aglykon faktoru В kyselou hydrolýzou za mírných podmínek.