CH627495A5 - Verfahren zur herstellung von moenomycin. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Moenomycin durch mikrobiologische Fermentation von Moenomycin-bildenden Streptomyceten in Gegenwart von Fetten, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Fermentationsmedium ein Tensid der Formel 1

R-0-(CH2-CH2-0-)„H (1),

worin R einen gesättigten oder einfach ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit 8 bis 18 C-Atomen, der jeweils auch eine Hydroxygruppe tragen kann, und n eine ganze Zahl zwischen 18 und 30 bedeuten, zusetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Moenomycin-bildende Streptomyceten Strepto-myces ghanaensis ATCC14672, Streptomyces bambergiensis ATCC13879, Streptomyces ederensis ATCC 15304 oder Streptomyces geysiriensis ATCC 15303 oder ihre Mutanten oder Revertanten verwendet.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Tensid der Formel 1 ein solches verwendet, dessen Molekulargewicht zwischen 1000 und 1500, dessen Trübungspunkt zwischen 73 und 79, dessen Hydroxylzahl zwischen 39 und 78 und dessen hydrophil-lipophiler Balancewert zwischen 16 und 18 liegt.

Nach DBP1 210514 ist ein Verfahren zur Herstellung von Moenomycin durch mikrobiologische Fermentation von Moe-nomycin-bildenden Streptomyceten bekannt, wobei man als zusätzliche Kohlenstoffquelle Fette verwendet.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Moenomycin durch mikrobiologische Fermentation von Moenomycin-bildenden Streptomyceten auf üblichem biologischen Wege und in Gegenwart von Fetten gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man dem Fermentationsmedium ein nicht-ionogenes Tensid der allgemeinen Formel (1 )

R-0-(CH2-CH2-0-)nH (1)

worin R einen gesättigten oder einfach ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit 8 bis 18 C-Atomen, der jeweils auch eine Hydroxygruppe tragen kann, und n eine ganze Zahl zwischen 18 und 30 bedeutet, zusetzt.

Die Kohlenwasserstoffreste R sind bevorzugt geradkettig; sie können jedoch, insbesondere bei Resten synthetischer Herkunft, bis zu etwa 20% verzweigte Anteile enthalten. Insbesondere sind KW-Reste mit 10 bis 14 C-Atomen bevorzugt.

In der allgemeinen Formel (1) bedeutet R insbesondere Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Hexadecyl, Heptadecyl, Octadecyl sowie Octenyl, Nonenyl, Decenyl, Undecenyl, Dodecenyl, Tridecenyl, Tetrade-cenyl, Pentadecenyl, Hexadecenyl, Heptadecenyl und Octade-cenyl. Ferner Hydroxy-Octyl, Hydroxy-Nonyl, Hydroxy-Decyl, Hydroxy-Undecyl, Hydroxy-Dodecyl, Hydroxy-Tridecyl, Hydroxy-Tetradecyl, Hydroxy-Pentadecyl, Hydroxy-Heptade-cyl sowie Hydroxy-Octadecyl. Die Hydroxy-Gruppe kann bei allen vorstehend genannten Resten am ersten, zweiten, dritten, usw. bis vorletzten C-Atom stehen: C1-C7 bei dem Octylrest, Ci-Cs bei dem Nonylrest, Ci-G» bei dem Decylrest, C1-C10 bei dem Undecylrest, C1-C11 bei dem Dodecylrest, C1-C12 bei dem Tridecylrest, Ci-Cu bei dem Tetradecylrest, C1-C14 bei dem Pentadecylrest, C1-C15 bei dem Hexadecylrest, Ci-Cie bei dem Heptadecylrest, Ci-Cn bei dem Octadecylrest.

Bezüglich der Stellung der Hydroxygruppe im Molekül sind diejenigen Verbindungen bevorzugt, die praktisch am leichtesten zugänglich sind, wie zum Beispiel 12-Hydroxy-A -9,10-Octadecensäure oder 12-Hydroxy-A -6,7-Octadecensäure oder 12-Hydroxy-A -9,10-Tetradecensäure oder 12-Hydroxy-A -5,6-T etradecensäure.

Als einfach ungesättigte Kohlenwasserstoffreste kommen für R in Betracht A -4,5-Decenyl, A -9,10-Decenyl, A -4,5-Dode-cenyl, A -5,6-Tetradecenyl, A -9,10-Tetradecenyl, A -9,10-Hexa-decenyl, A -6,7-Octadecenyl, A -9,10-0ctadecenyl und A -11,12-Octadecenyl; bei allen vorstehend genannten ungesättigten Kohlenwasserstoffresten kann zusätzlich eine Hydroxylgruppe an jedem der C-Atome stehen, die keine Doppelbindung tragen. Dabei können alle genannten ungesättigten Kohlenwasserstoffreste sowohl in eis- als auch in trans-Konfiguration vorkommen. Bevorzugt sind dabei diejenigen Konfigurationen, welche natürlich vorkommen. Das gilt auch für die Positionen der Doppelbindungen.

Besonders bevorzugt unter den Tensiden der allgemeinen Formel (1) sind solche, deren Molekulargewicht zwischen 1000 und 1500 liegt, deren Trübungspunkt (lg Substanz in 100 ml 10%iger Kochsalzlösung) zwischen 73 und 79 liegt, deren Hydroxyzahl zwischen 39 und 78 und deren hydrophil-lipophi-ler Balance-Wert zwischen 16 und 18 liegen.

Unter den besonders bevorzugten Tensiden der Formel I haben sich solche hervorragend bewährt, in welchen einerseits n die Zahl 25 bedeutet und R ein Gemisch aus 6-9% Octyl, 5-7% Decyl, 48-54% Dodecyl, 18-20% Tetradecyl, 7-9% Hexadecyl und 8-10% Octadecyl bedeuten, in welchen andererseits n die Zahl 18,20 oder 22 und R Dodecyl bedeuten.

Die genannten Tenside werden durch Oxalkylierung, insbesondere Oxäthylierung, entsprechender Fettalkohole in alkalischem Medium mit unterschiedlichen Mengen Äthylenoxid hergestellt.

Die Fermentation der Streptomyceten wird in der Regel unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Medium durchgeführt, das neben anorganischen Salzen als Kohlenstoffquelle Stärke, Glucose, Rohrzucker oder Melasse und zusätzlich ein tierisches, pflanzliches oder synthetisches Fett sowie als Stickstoffquelle Sojaschrot oder -mehl, Cornsteepliquor, Hefeextrakt, Baumwollsamen- oder -keimlingsmehl, Nitrate oder Ammoniumsalze enthält sowie ein Tensid der Formel (1).

Die Fermentation wird bis zur Erreichung einer maximalen antibiotischen Aktivität durchgeführt. Diese kann durch Messen der Konzentration des gelösten Stickstoffs im Fermentationsmedium oder der gebildeten Trockengewichtsmasse bestimmt werden.

Nach Erreichen der maximalen antibiotischen Aktivität wird die Fermentation unterbrochen. Zur Isolierung des Antibiotikums wird entweder die gesamte Kultur homogenisiert und anschliessend extrahiert oder das Mycel wird durch Zentri-fugieren von der Kulturlösung abgetrennt und diese beiden Bestandteile jeweils für sich extrahiert. Als Extraktionsmittel kommen vorzugsweise mit Wasser mischbare oder teilweise mischbare Lösungsmittel in Betracht, z. B. Methanol, Äthynol, Propanol, Butanol, Äthylenglycolmonomethyläther, Aceton oder Dioxan.

Aus den so gewonnenen Extrakten wird das rohe Antibiotikum zweckmässig durch Abdampfen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck gewonnen. Der Rückstand wird zur weiteren Reinigung mit heissen, polaren, organischen Lösungsmitteln, z. B. Methanol, extrahiert und das Antibiotikum aus dem unter vermindertem Druck eingeengten Extrakt durch Fällung mit einem mässig polaren organischen Lösungsmittel wie Di-äthyläther, Diisopropyläther oder Äthylacetat, ausgefällt.

Als Moenomycin-bildendes Streptomyceten werden vorzugsweise Streptomyces ghanaensis ATC14 672, Streptomyces bambergiensis ATCC 13 879, Streptomyces ederensis ATC 15 304 und Streptomyces geysiriensis ATCC 15 303 sowie ihre

2

5

10

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30

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Mutanten und Revertanten verwendet.

Als tierische Fette kommen zweckmässig Tierkörperfette wie Schweineschmalz oder Hammeltalg oder künstlich hergestellte Fraktionen solcher Fette mit definiertem Kohlenstoffgehalt in Betracht. Als pflanzliche Fette werden zweckmässig fette öle wie Olivenöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl, Cocosöl, Ricinusöl verwendet. Ferner kommen synthetische Fette wie Ölsäuretriglycerid oder Stearinsäuretriglycerid in Betracht. Sämtliche Fette werden in der Regel in Konzentrationen zwischen 0,1 und 16 Gewichtsprozent, vorzugsweise 2 und 5 Gewichtsprozent, verwendet.

Die ausserordentlich fördernde Wirkung des erfindungsge-mässen Zusetzens eines Tensids der allgemeinen Formel (1) auf die Bildung von Moenomycin aus Streptomyces-Arten ist überraschend. Zwar ist die stimulierende Wirkung von z. B. Poly-oxyäthylen-Derivaten von Sorbitananhydriden, die teilweise mit Fettsäure verestert sind (Tween (I)-Typen) oder von Zuckerfettsäureestern auf die Enzymproduktion gewisser Mikroorganismen bekannt (E.T. Reese et al., Applied Microbiology, 1969, 242-245) sowie auf die Bildung von Riboflavin aus Ashbya gos-sypii (GG. Smith et al., Biochim. Biophys. Acta 47 (1961) 344-349). Diese oberflächenaktiven Verbindungen haben jedoch keine positive Wirkung auf die Bildung von Moenomycin. Auf der anderen Seite haben die die Moenomycinbildung fördernden Verbindungen der allgemeinen Formel (1) keine positive Wirkung auf z. B. die Bildung von Streptomycin.

Beispiele

Streptomyces ghanaensis ATTC14 672 wird in einem 300-ml-Erlenmeyer-Kolben auf 30 ml eines sterilen Nährmediums folgender Zusammensetzung überimpft:

4,00% Glucose 3,00% Sojamehl 0,30% Schlempe, trocken 0,25% Kochsalz 0,25% Calciumcarbonat Wasser ad 30 ml

Nach Animpfen wird die Vorkultur bei 28 bis 30 °C zwei Tage lang mit einer Frequenz von 300 Umdrehungen/Minute geschüttelt.

Das Fermentationsmedium der Hauptkultur hat folgende Zusammensetzung:

3,0% Sojaöl 3,0% Sojamehl 3,0% Maisstärke l,0%Saccarose 0,3% Ammonsulfat 0,4% Calciumcarbonat 2,0% Hefe Wasser ad 30 ml

Der Zusatz eines der in nachstehender Tabelle 1 aufgeführten Tenside zum Fermentationsmedium erfolgt in Form einer 10 gewichtsprozentigen wässrigen Lösung mit doppelt destilliertem Wasser. Die Lösung wird anschliessend 10 Minuten lang bei 123 bis 127 °C sterilisiert.

Nun wird das oben genannte Fermentationsmedium mit 1,5 ml derTensidlösung von 37 °C versetzt. Dann werden 5 ml der Vorkultur zugegeben.

Diese Hauptkultur wird bei 28 bis 30 °C 120 Stunden lang mit 260 bis 300 Umdrehungen/Minute geschüttelt.

Anschliessend wird das Ganze mit 60 ml Methanol 2 Minuten lang im Vibromischer geschüttelt und anschliessend durch einen Faltenfilter filtriert. In einem aliquoten Teil des Filtrats wird der Moenomycin-Gehalt durch seine Einwirkung auf eine standardisierte Kultur von Staphylococcus aureus turbidime-trisch im Vergleich zur Wirkung einer Moenomycin-Lösung bekannten Gehalts bestimmt.

Die übrigen in der Tabelle zusammengefassten Ergebnisse wurden durch Variation der Streptomyces-Stämme, des Fettzusatzes und des Tensidzusatzes unter sonst gleichen Bedingungen erhalten.

Die in der Tabelle angegebenen Tenside haben die folgenden Kenndaten, wobei bedeuten Molekulargewicht MG, Trübungspunkt TB, Hydroxylzahl HZ und hydrophil-iipophiler Balance-Wert HLB:

n

MG

TB

HZ

HLB

Gemisch A

20:

1070

77

53

16,2

Gemisch A

25:

1290

78

44

16,8

Gemisch B

25:

1260

77

43

17,5

Dodecyl

20:

1000

79

56

16,5

Dodecyl

30:

1430

78

39

17,5

Tabelle

Fermentation mit Fett KW-Stoff- n Monomycin-

Streptomyces rest R Ausbeute

Str.bambergiensis Sojaöl

-

-

100%

Str.bambergiensis Sojaöl

Gemisch A

aus

7%Cs

6%Cio

51%Cn

20

161%

19%Cu

8% Ci6

9% Ci8

Str.bambergiensis Sojaöl

Gemisch A 25

180%

Str.bambergiensis Sojaöl

Gemisch B

aus

13%G>

32% C.o

20% Cu

25

155%

10%Cl2

14%Ci3

10%Cl4

3%C.S

Str.bambergiensis Cocosöl

Dodecyl

30

165%

Str.bambergiensis Glycerin-

Gemisch A

20

200%

trioleat

Str.bambergiensis Glycerin-

Dodecyl

30

190%

trioleat

Str.bambergiensis Glycerin-

Dodecyl

20

202%

trioleat

Str.bambergiensis Ricinusöl

Gemisch A

25

205%

Str.ghanaensis Sojaöl

-

-

100%

Str.ghanaensis Sojaöl

Gemisch A

20

158%

Str.ghanaensis Cocosöl

Dodecyl

30

160%

Str.ghanaensis Glycerin-

Gemisch A

20

158%

trioleat

Str.ghanaensis Glycerin-

Dodecyl

30

173%

trioleat

Str.ghanaensis Glycerin-

Dodecyl

20

158%

trioleat

Str.ghanaensis Ricinusöl

Gemisch A

25

150%

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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4

l-'crmcnlation mit

Felt

KW-Stoff- n

Monomyein-

Sircpiomyccs

rest R

Ausbeute

Str.geysiriensis

Sojaöl

„

100%

Str.geysiriensis

Sojaöl

Gemisch A 20

155%

Str.geysiriensis

Cocosöl

Dodecyl 30

150%

Str.geysiriensis

Glycerin-

Gemisch A 20

160%

trioleat

Str.geysiriensis

Glycerin-

Dodecyl 30

155%

trioleat

Str.geysiriensis

Glycerin-

Dodecyl 20

160%

trioleat

Str.geysiriensis

Ricinusöl

Gemisch A 25

145%

Str.ederensis

Sojaöl

_ _

100%

Str.ederensis

Sojaöl

Gemisch A 20

152%

Str.ederensis

Cocosöl

Dodecyl 30

140%

Str.ederensis

Glycerin-

Gemisch A 20

145%

trioleat

Str.ederensis

Glycerin-

Dodecyl 30

150%

trioleat

Str.ederensis

Glycerin-

Dodecyl 20

155%

trioleat

Str.ederensis

Ricinusöl

Gemisch A 25

140%

G