DE3248167C2 - - Google Patents
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- C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
- C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
Die Erfindung betrifft Gemische aus Trehalose-2,2′3,4-
tetraestern und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Trehaloselipide sind bekanntlich Glycolipide, die
als Disaccharidanteil Trehalose enthalten und grenzflächenaktiv
wirksam sind. Die Trehaloselipide
können durch Mikroorganismen hergestellt werden, wie
beispielsweise aus der DE-PS 28 05 823 bekannt
ist. Danach werden in einem Bioreaktor eine Nährstofflösung
in Wasser und n-Alkane der Kettenlänge
von C₈ bis C₂₄ oder Rohöl vermischt und dieses Gemisch
mit einem Mikroorganismus beimpft. Die Züchtung
wird unter einer Belüftungsrate von 0,5 bis 1,0 V/V/m
und einer Umdrehungszahl von 400 bis 1200 cm-1 bei
einer Temperatur von 30°C bis 50°C durchgeführt,
wobei der pH-Wert der Flüssigkultur durch Zusatz
von Ammoniaklösung auf 6,8 bis 7,0 gehalten wird.
Die Züchtung wird durch einen Temperaturschock,
d. h. kurzfristiges Erhitzen der Flüssigkultur mit
einer Temperatur um 60°C, beendet. Aus der Kultursuspension
wird die Zellmasse abgetrennt. Die hierbei
hinterbleibende wäßrige Phase kann dann direkt
einer technischen Verwendung zugeführt oder in
an sich bekannter Weise auf Glykolipide aufgearbeitet
werden, beispielsweise durch Extraktion mit einem
geeigneten Lösungsmittel, das aus dem abgetrennten
Extrakt abgedampft wird.
Nach diesem bekannten Verfahren werden Trehalose-
6,6′-diester der allgemeinen Formeln
und
erhalten, wenn als Mikroorganismen Nocardia rhodochrous
bzw. Mycobacterium phlei eingesetzt worden
sind. Die Ausbeuten an Trehalose-6,6′-diestern liegen
bei diesem Verfahren zwischen 600 und 700 mg/l der
aus der Flüssigkultur isolierten wäßrigen Phase.
Diese Trehaloselipide sind bisher allein als
nichtionogene, grenzflächenaktive Substanzen angesehen
worden, deren in C₆-Positionen liegende CH₂OH-
Gruppen durch je eine Fettsäure verestert sind, so
daß die Trehaloselipide zutreffend auch als Trehalose-
6,6′-diester bezeichnet werden.
Diese bekannten Trehalose-6,6′-diester können durch
die allgemeine Formel
dargestellt werden,
worin R₁ für H oder R₂ steht und R₂ folgende Reste bedeuten kann:
mit m = 8 bis 10 und n = 18 bis 21 oder
mit m = 20 bis 22 und n = 14 bis 17.
Diese Verbindungen sind Diester der Trehalose,
die als nichtionogene grenzflächenaktive Substanzen
wirksam sind.
In einer Veröffentlichung von S. G. Batrakov et al
in "Chemistry and Physics of Lipids" 29 (1981),
Seiten 241 bis 266, wird über neue Typen von
Trehaloselipiden berichtet, die aus der Zellmasse
des Paraffin oxidierenden Bakteriums Mycobacterium
paraffinicum isoliert werden können. Neben den
bekannten Fettsäureestern der Trehalose, wie
6,6′-Di-O-mycolyl-αα-D-trehalose, 6-O-Mycolyl-α,
α-D-trehalose und 6,6′-Di-O-acyl (C₁₂-C₁₆)-α,α-D-
trehalose, sind aus der Zellmasse noch die Verbindungen
6-O-Mycolyl-6′-O-acyl (C₁₂-C₁₆)-a,α-D-trehalose
und 2-O-Octanoyl-3,2′-Di-O-decanoyl-6-0-succinoyl-
α,α-D-trehalose isoliert und identifiziert worden.
Bei der Fermentation von Torulopsis bombicola entstehen
nach J.F.T. Spencer et al in "Canadian Journal
of Chemistry" 39 (1961), Seite 846, Sophorolipide
der allgemeinen Formel:
in der R¹ und R² = H oder eine
R³ = H oder eine -CH₃-Gruppe und R⁴ ein gesättigter
oder ungesättigter Kohlenwasserstoffrest mit C₁₁
bis C₁₆ sind. Diese Sophorolipide werden in der
dargestellten Lactonbindung und in der damit im
Gleichgewicht stehenden freien Säure erhalten,
die sich durch die hydrolytische Aufspaltung der
Lactonbindung daraus bildet. Diese Sophorolipide
sind demnach zum Teil Diacetylester.
Nach der DE-OS 29 05 252 kann ein Glycolipidmethylester
mit Grenzflächenaktivität und wachsähnlichen
Eigenschaften erhalten werden, wenn ein durch Fermentation
von Torulopsis bombicola erhaltenes und
hydratisiertes Sophorolipid mit bestimmten Ätheralkoholen
vermischt und aus diesem Gemisch das
Wasser abdestilliert wird, worauf das wasserfreie
System aus Sophorolipid und Ätheralkohol durch
Umsetzung mit Methanol in Gegenwart einer starken
Säure einer Methanolyse und Methylierungsreaktion
unterzogen wird. Dadurch werden die beiden Acetylreste
abgespalten und die Säuregruppe mit Methanol
verestert. Dieser Ester weist im Sophoroseteil
seines Moleküls keine Esterbindungen mehr auf,
sondern nur noch eine mit einem niederen Alkohol
veresterte Carbonsäuregruppe der den Lipidanteil
des Moleküls bildenden Fettsäure. Da die Hydroxylgruppen
des Sophoroseteils dieses Esters frei sind,
weist dieser Ester als nichtionogenes Tensid eine
hohe Grenzflächenaktivität auf, die durch Austausch
des esterartig gebundenen alkoholischen Methylrests
gegen andere Alkohole mit längerer Kohlenstoffkette
im Molekül im Wege der Umesterung verändert
werden kann.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Gemische
aus neuen Trehalose-2,2′,3,4-tetraestern und ein
Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen, wobei
hohe Ausbeuten an den Trehalose-2,2′-3,4-tetraestern
erhalten werden.
Diese Aufgabe wird gelöst mit Gemischen aus
Trehalose-2,2′3,4-tetraestern
der allgemeinen Formel:
mit den Bedeutungen:
und
R₃ Wasserstoff oder Alkyl
x = 4 bis 22
y = 1 bis 4
z = 4 bis 22
y = 1 bis 4
z = 4 bis 22
mit der Maßgabe, daß mindestens ein Rest
R₁ ein Dicarbonsäurerest ist,
und einem Verfahren zur Herstellung der Gemische mit
den Merkmalen des Anspruchs 2.
Diese Trehalose-2,2′,3,4-tetraester sind anionische
grenzflächenaktive Substanzen, die gegenüber den
nichtionogenen, grenzflächenaktiven Trehalose-6,6′-di-
und 6-monoester eine höhere Grenzflächen-Aktivität
besitzen.
Zur Herstellung dieser Trehalose-2,2′3,4-tetraester hat sich
ein Verfahren bewährt, das von der Züchtung von
Trehaloseestern produzierenden und Alkane verwertenden
Mikroorganismen in einem Kohlenwasserstoff enthaltenden,
wäßrigen Medium mit bestimmten pH-Wert
bei einer Temperatur von unter 50°C und anschließender
Isolierung der Trehaloseester aus der Kultursuspension
ausgeht. Erfindungsgemäß werden die
Mikroorganismen aerob bei einem pH-Wert von 3 bis
8 und einer Temperatur von 15 bis 50°C unter Limitierung
der Wachstumsgeschwindigkeit gezüchtet.
Die Produktion der gewünschten Trehalose-2,2′-3,4-
tetraester kann dadurch erreicht werden, daß in
die Kultursuspension im Verlauf der logarithmischen
Wachstumsphase Kohlenwasserstoffe, nämlich
Kerosin oder ein Gemisch aus etwa 89 Vol.% Kohlenwasserstoffen
mit 14 C-Atomen und etwa 9 Vol.% Kohlenwasserstoffen
mit 15 C-Atomen (nachstehend als n-Paraffin S bezeichnet)
in mehreren das Wachstum
des Mikroorganismus nicht beeinträchtigenden Teilmengen
in zeitlichem Abstand nacheinander eingerührt
wird.
Das Kerosin enthält
vorteilhaft etwa 85 Vol.% gesättigte und etwa 15
Vol.% aromatische Kohlenwasserstoffe.
Als Züchtungsbasis wird hierzu eine wäßrige Nährsalzlösung
eingesetzt, die in der Zusammensetzung auf
den Nährstoffbedarf des zu züchtenden und Trehaloseester
produzierenden Mikroorganismus abgestellt
ist. Dieser Nährstofflösung werden nach Sterilisation
die sterilen und assimilierbaren Kohlenwasserstoffe,
insbesondere n-Paraffin S, zugesetzt. Nach Einstellung
des pH-Wertes der Flüssigkultur auf einen
Wert zwischen 3 und 8 mit der wäßrigen Lösung einer
alkalisch wirkenden Verbindung, z. B. Ammoniaklösung,
wird diese Kulturlösung mit einer Submerskultur
des Trehaloseester produzierenden Mikroorganismus
beimpft. Unter Konstanthaltung des anfänglich eingestellten
pH-Wertes wird die auf einer Temperatur
von 15 bis 50°C gehaltene Kultursuspension bei
einer Umdrehungszahl von etwa 1500 cm-1 mit auf
40 Vol-% Sauerstoff angereicherter Luft mit einer
Belüftungsrate von 0,5 V/V/m begast. Im Verlauf
der logarithmischen Wachstumsphase können im
zeitlichen Abstand nacheinander mehrere Teilmengen
der Kohlenwasserstoffe
in die Kultursuspension eingerührt
werden. Bei Verwendung von Kerosin als Substrat
und Lösungsmittel hat es sich bewährt, nach einer
anfänglichen Kultivierungszeit von etwa 14 Stunden
der Kultursuspension 10 g/l, nach weiteren 11 Stunden
16 g/l, nach weiteren 5 Stunden 18 g/l und nach
weiteren 10 Stunden 10 g/l Kerosin zuzusetzen.
Durch diese Teilmengen an Kerosin wird das Wachstum
der Mikroorganismen nicht gehemmt. Das Kerosin
steigert aber offenbar die Permeabilität der lipophilen
Zellwandungen und löst die an der Zellwand
haftenden Trehaloseester ab, wodurch der Mikroorganismus
offensichtlich zur Produktion weiterer
Mengen an Trehaloseestern angeregt wird.
Analog kann als Substrat und organisches Lösungsmittel
auch n-Paraffin S nach dem Verfahren der Erfindung
eingesetzt werden. Hierbei hat es sich bewährt,
die erste Teilmenge von 20 g/l Kultursuspension
nach einer anfänglichen Kultivierungszeit von etwa
17 Stunden in die Kultursuspension einzurühren.
Die weiteren Teilmengen von 12 g/l werden nach
weiteren 32 Stunden und von 12 g/l nach weiteren
10 Stunden in die Kultursuspension eingerührt.
Nach dieser Alternative des Verfahrens der Erfindung
werden Ausbeuten an Trehaloseestern von über 2000
mg/l erhalten.
Nach einer anderen Möglichkeit der Limitierung
bei dem Verfahren der Erfindung wird in die Kultursuspension
in Abhängigkeit von dem Wachstum des
Trehaloseester produzierenden Mikroorganismus
ein Komplexbildner für mehrwertige anorganische
Kationen, vorzugsweise Ethylendiamintetraessigsäure,
in Mengen eingerührt, die das Wachstum des Mikroorganismus
einschränken, aber nicht beenden. Es hat
sich bewährt, die Zugabe der Ethylendiamintetraessigsäure,
vorzugsweise als Di-natriumsalz, mit
der Zugabe der den pH-Wert der Kultursuspension
regelnden wäßrigen Lösung einer alkalisch wirkenden
Verbindung, wie beispielsweise Ammoniak, dergestalt
zu koppeln, daß die Ethylendiamintetraessigsäure in
diese wäßrige Lösung in entsprechender Menge inkorporiert
wird. Vorzugsweise werden in der verwendeten
10 Vol-% Ammoniak enthaltenden Lösung mindestens
46 bis 47 g/l Ethylendiamintetraessigsäure bzw.
eine entsprechende Menge des Di-natriumsalzes dieser
Säure gelöst. Auf diese Weise werden der Kultursuspension
im Verlauf der Züchtung etwa 3,75 g/l des
Di-natriumsalzes der Ethylendiamintetraessigsäure
zugesetzt. Die Ausbeuten an Trehaloseestern liegen
bei dieser Alternative des Verfahrens der Erfindung
bei etwa 3250 mg/l Kultursuspension.
Als Standardregel kann hier gelten, daß pro Mol
der in der Kultursuspension gelöst vorliegenden
zweiwertigen Kationen und pro Mol der dreiwertigen
Kationen zumindest ein Mol Ethylendiamintetraessigsäure
eingesetzt wird. Durch die Zugabe der Ethylendiamintetraessigsäure
werden im Verlauf der Züchtung
zunehmend die in der Kultursuspension gelöst vorliegenden
mehrwertigen Kationen komplexiert und
stehen dadurch als Nährstoff für den Mikroorganismus
nur in limitierten Konzentrationen zur Verfügung.
Eine weitere Möglichkeit der Steigerung der Ausbeute
an Trehaloseestern besteht erfindungsgemäß
in einer Limitierung der Stickstoffquelle in der
Kultursuspension, die durch entsprechende Voreinwaage
erreicht und dadurch aufrechterhalten wird,
daß der pH-Wert der Kultursuspension durch Zugabe
einer stickstoffreien alkalischen Verbindung, wie
beispielsweise einer Alkalihydroxidlösung, auf dem
vorbestimmten Wert gehalten wird. Hierdurch wird
der Stickstoffgehalt der Kultursuspension auf die
Menge limitiert, die in der ursprünglich eingesetzten
Nährsalzlösung in Form einer Ammoniumverbindung
gelöst ist. Die Ausbeuten an Trehaloseestern liegen
bei dieser Alternative des Verfahrens der Erfindung
bei etwa 5000 mg/l Kultursuspension.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Limitierungsmaßnahmen
kann auch die Temperatur der
Kultursuspension nach Beendigung der logarithmischen
Wachstumsphase um 15°C angehoben oder abgesenkt
werden. Bei beispielsweise gleichzeitiger Stickstofflimitierung
werden nach dieser Variante des
Verfahrens der Erfindung über 7800 mg Trehaloseestern
pro l Kultursuspension erhalten.
Eine weitere Steigerung der Ausbeute an Trehaloseestern
kann erfindungsgemäß dadurch erreicht werden,
daß der Nährsalzlösung nach deren Sterilisation
zusätzlich mindestens 0,01 bis 0,02 g/l d-N,N′-Bis
(l-hydroximethylpropyl)-ethylendiamin-dihydrochlorid
(Ethambutol) zugesetzt werden. Unter gleichzeitiger
Anwendung der Stickstofflimitierung und der Temperaturabsenkung
während der Züchtung steigt die Ausbeute
an Trehaloseestern nach dieser Variante des Verfahrens
der Erfindung auf über 10 000 mg/l Kultursuspension.
Die Isolierung der nach den verschiedenen Varianten
des Verfahrens der Erfindung gebildeten Trehaloseester-
Gemische aus der Kulturlösung erfolgt nach an sich bekannter
Arbeitsweise. So kann die Kulturlösung
erschöpfend mit einem Gemisch aus Methylenchlorid/
Methanol im Volumenverhältnis 2 : 1 extrahiert
werden. Die erhaltenen Extrakte werden dann im
Vakuum zum Rohextrakt konzentriert, aus dem der
nicht umgesetzte Kohlenwasserstoff abgetrennt wird,
der dann erneut gemäß dem Verfahren der Erfindung
eingesetzt werden kann. Es bleibt ein Gemisch aus
Trehaloseestern zurück, das je nach Verfahrensvariante
zu 10 bis 40 Gew-% aus nichtionogenen Trehalosemono-
bzw. -diestern und zu 60 bis 90 Gew-% aus
anionischen Trehalose-2,2′,3,4-Tetraestern besteht
und in seiner Menge 0,75 bis 10,5 g/l Kultursuspension
beträgt.
Die Trennung dieses Gemisches in seine Komponenten
kann mittels an sich bekannter Maßnahmen durchgeführt
werden, wie sie beispielsweise in Beispiel 10 angegeben
sind.
Als Trehaloselipide produzierende Mikroorganismen
können für das Verfahren der Erfindung
Rhodococcus erythropolis DSM 43 215 sowie Arthrobacter
spec. DSM 2567 und Corynebacterium spec. DSM 2568
eingesetzt werden.
Mit den Maßnahmen der Erfindung sind die Möglichkeiten
gegeben, die Ausbeute an Trehaloseestern in
biotechnologischen Herstellungsverfahren entscheidend
zu erhöhen und gleichzeitig die bisher noch nicht
bekannten anionischen, grenzflächenaktiven Trehalose-
2,2′,3,4-tetraester zu erzeugen, wobei die Kettenlänge
der Säurereste dieser Ester in Abhängigkeit von dem
Substrat variiert. Durch Auswahl geeigneter Varianten
des Verfahrens der Erfindung ist es ferner
möglich, das Verhältnis der erfindungsgemäß erzeugten
Trehaloseester zu ändern und damit auch die grenzflächenaktive
Wirkung dieser Produkte zu beeinflussen,
da die neuen anionischen Trehalose-2,2′,3,4-tetraester
im Vergleich mit nichtionogenen Mono- bzw.
Diestern eine höhere Hydrophilität haben. Die grenzflächenaktive
Wirkung der erfindungsgemäßen Produkte
kann durch chemische Derivatisierung, wie beispielsweise
Veresterung, weiter beeinflußt werden. Aus
den erfindungsgemäßen Produkten kann durch Verseifung
der Esterbindung auch Trehalose gewonnen werden.
Ein 100-l-Bioreaktor, ausgerüstet mit einem Intensor-
System, wird mit 50 l Nährsalzlösung (Zusammensetzung:
500 g Hefeextrakt, 62 g Zitronensäure × 1 H₂O, 100 g
(NH₄)₂SO₄, 25 g KH₂PO₄, 25 g Na₂HPO₄ × 2 H₂O, 50 g
85%ige H₃PO₄, 2,5 g CaCl₂ × 2 H₂O, 1 g FeCl₃ × 6 H₂O,
10 g FeSO₄ × 7 H₂O, 55 g MgSO₄ × 7 H₂O und 50 l Leitungswasser)
versetzt, bei pH 3.0 und einer Temperatur
von 121°C 30 min sterilisiert, nach Abkühlung
auf eine Temperatur von 30°C mit 2200 g sterilem
Paraffin S (89% C-14, 9% C-15) versetzt, der
pH-Wert mit 5%iger NH₄OH-Lösung auf 5,8 eingestellt
und mit 5000 ml einer 24 Std. alten Submerskultur
von Rhodoccus erythopolis DSM 43 215 beimpft.
Während der Züchtung wird die Submerskultur
automatisch mit einer pH-Regulierstation durch
Titration mit 5-volumenprozentiger Ammoniak-Lösung
bei pH 5,8 konstant gehalten und bei einer Temperatur
von 30°C, einer Umdrehungszahl von 1500 cm-1
und einer Belüftungsrate von 0,5 V/V/m mit 40 Vol-%-
sauerstoffangereicherter Luft begast. Nach einer
Kultivierungszeit von 14 Std. werden 500 g, nach
25 Std. 800 g, nach 30 Std. 900 g und nach 40 Std.
500 g Kerosin (Zusammensetzung: 85 Vol-% gesättigte
Kohlenwasserstoffe, 15 Vol-% Aromate) zugesetzt.
Die Züchtung ist nach 50 Std. beendet, danach wird
die erhaltene Submerskultur (enthaltend 1150 g
Zelltrockenmasse) in bekannter Weise erschöpfend
mit Methylenchlorid/Methanol (2 : 1 Vol./Vol.)
extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte
werden im Vakuum konzentriert. Der Rückstand (2700 g)
wird in 10 l Chloroform aufgenommen, mit 5000 g
Kieselgel 60 versetzt und die erhaltene Suspension
abfiltriert. Das Filtrat enthält nach Konzentrierung
im Vakuum 2650 g Kohlenwasserstoff, der recyclisiert
wird. Die am Kieselgel adsorbierten Glykolipide
werden erschöpfend mit CH₃OH extrahiert und
die vereinigten CH₃OH-Extrakte im Vakuum eingeengt.
Der Rückstand enthält 20,2 g Trehalose-6,6′-di-
und 6-monoester = 40%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid,
und 18,6 g Trehalose-2,2′,3,4-tetraester
= 60%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid.
Rhodococcus erythropolis DSM 43 215 wird, wie in
Beispiel 1, gezüchtet, jedoch werden anstelle von
Kerosin nach einer Kultivierungszeit von 17 Std.
1000 g, nach 49 Std. 600 g und nach 59 Std. 600 g
n-Paraffin S (Zusammensetzung: 89% C-14, 9% C-15)
zugesetzt. Die Züchtung ist nach 64 Std. beendet.
Die Extraktion wird wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Der erhaltene organische Rohextrakt enthält neben
n-Paraffin S (450 g), das recyclisiert wird, 31,65 g
Trehalose-6,6′-di- und 6-monoester = 20%, bezogen
auf Gesamttrehaloselipid, und 77,86 g Trehalose-
2,2′,3,4-tetraester = 80%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid.
Ein 100-l-Bioreaktor, ausgerüstet mit einem Intensor-
System, wird mit 50 l Nährsalzlösung (Zusammensetzung:
50 g Hefeextrakt, 121 g Zitronensäure × 1 H₂O, 23,5 g
(NH₄)₂SO₄, 184 g KH₂PO₄, 71,5 g Na₂HPO₄ × 2 H₂O,
50 g 85%ige H₃PO₄, 21,5 g CaCl₂ × 2 H₂O, 12,5 g
FeCl₃ × 6 H₂O, 76,5 g MgSO₄ × 7 H₂O, 2 g KCl und
50 l Leitungswasser) versetzt, bei pH 3,0 und einer
Temperatur von 121°C 30 min sterilisiert, nach
Abkühlung auf eine Temperatur von 30°C mit 4900 g
sterilem n-Paraffin S (89% C-14, 9% C-15) versetzt,
der pH-Wert mit 5%iger NH₄OH-Lösung auf pH 5,8
eingestellt und mit 5000 ml einer 24 Std. alten
Submerskultur von Rhodococcus eryhtropolis DSM
43 215 beimpft. Während der Züchtung wird die
Submerskultur automatisch mit einer pH-Regulierstation
durch Titration mit 10-Vol.%-iger Ammoniaklösung,
die 46,74 g Ethylendiamintetraessigsäure
pro Liter enthält, bei pH 5,8 konstant gehalten
und bei einer Temperatur von 30°C, einer Umdrehungszahl
von 2000 cm-1 und einer Belüftungsrate von 1,5
V/V/m mit Luft begast bei einem konstanten Reaktordruck
von 2 bar. Insgesamt werden 187 g Ethylendiamintetraessigsäure
zugesetzt. Die Züchtung ist nach 130
Std. beendet. Die Extraktion wird wie in Beispiel
1 durchgeführt. Der erhaltene Rohextrakt enthält
neben 3200 g n-Paraffin S, das recyclisiert wird,
84,85 g Trehalose-6,6′-di- und 6-monoester = 40%,
bezogen auf Gesamttrehaloselipid, und 78,28 g
Trehalose-2,2′,3,4-tetraester = 60%, bezogen
auf Gesamttrehaloselipid.
Ein 100-l-Bioreaktor, ausgerüstet mit einem Intensor-
System, wird mit 50 l Nährsalzlösung (Zusammensetzung:
50 g Hefeextrakt, 62 g Zitronensäure × 1 H₂O, 235,5 g
(NH₄)₂SO₄, 25 g KH₂PO₄, 25 g Na₂HPO₄ × 2 H₂O, 50 g
85%ige H₃PO₄, 2,5 g CaCl₂ × 2 H₂O, 1 g FeCl₃ ×
6 H₂O, 10 g FeSO₄ × 7 H₂O, 55 g MgSO₄ × 7 H₂O und
50 l Leitungswasser) versetzt, bei pH 3,0 und bei
einer Temperatur von 121°C 30 min sterilisiert,
nach Abkühlung auf eine Temperatur von 30°C mit
4900 g n-Paraffin S (89% C-14, 9% C-15) versetzt,
der pH-Wert mit 10%iger NaOH-Lösung auf pH 5,8
eingestellt und mit 3000 ml einer 24 Std. alten
Submerskultur von Rhodococcus erythropolis DSM
43 215 beimpft. Während der Züchtung wird die
Submerskultur automatisch mit einer pH-Regulierstation
durch Titration mit einer 10%igen NaOH-Lösung
bei pH 5,8 konstant gehalten und bei einer
Temperatur von 30°C, einer Umdrehungszahl von 2000
cm-1 und einer Belüftungsrate von 1,5 V/V/m mit
Luft begast bei einem konstanten Reaktordruck von
2 bar. Die Züchtung ist nach 140 Std. beendet.
Die Extraktion wird wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Der erhaltene organische Rohextrakt enthält neben
3300 g n-Paraffin S, das recyclisiert werden kann,
37,9 g Trehalosee-6,6′-di- und 6-monoester = 10%,
bezogen auf Gesamttrehaloselipid, und 209,6 g
Trehalose-2,2′,3,4-tetraester = 90%, bezogen auf
Gesamttrehaloselipid.
Rhodococcus erythropolis DSM 43 215 wird wie in
Beispiel 4 gezüchtet, jedoch wird die Züchtungstemperatur
von 30°C nach 45 Std. Reaktionszeit innerhalb
20 min auf eine Temperatur von 21°C gesenkt und
weitere 85 Std. bei dieser Temperatur die Submerskultur
geführt. Die Extraktion wird wie in Beispiel 1
durchgeführt. Der erhaltene organische Rohextrakt
enthält neben 3500 g n-Paraffin S, das recyclisiert
werden kann, 59,8 g Trehalose-6,6′-di- und 6-monoester
= 10%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid,
und 330,9 g Trehalose-2,2′,3,4-tetraester = 90%,
bezogen auf Gesamttrehaloselipid.
Rhodococcus erythropolis DSM 43 215 wird wie in
Beispiel 4 gezüchtet, jedoch wird nach Sterilisation
der Nährsalzlösung aseptisch 0,75 g Ethambutol
(d-N,N′-Bis(1-hydroxymethyl-propyl)-ethylendiamindihydrochlorid)
zugesetzt und die Züchtungstemperatur
von 30°C nach 70 Std. Reaktionszeit innerhalb 20 min
auf eine Temperatur von 21°C gesenkt und weitere
115 Std. bei dieser Temperatur geführt. Die nach
Beispiel 1 durchgeführte Extraktion ergibt einen
organischen Rohextrakt, der neben 3400 g n-Paraffin
S, das recyclisiert werden kann, 215,2 g Tetrahalose-
6,6′-di- und 6-monoester = 30%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid,
und 308,8 g Trehalose-2,2′,3,4-
tetraester = 70%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid
enthält.
Arthrobacter spec. DSM 2567 wird bei 100 cm-1 und 30°C
in sieben 500 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen,
die jeweils 100 ml eines Vorkulturmediums (Zusammensetzung:
30 g Saccharose, 10 g Fleischextrakt,
10 g Pepton, 3 g NaCl und 1 l destilliertes Wasser;
pH 7 vor der Sterilisation) enthalten, angezüchtet.
Nach 72 Std. Inkubation wird diese Kultursuspension
in einen mit einem Blattrührer ausgerüsteten 10 l
Bioreaktor übertragen, der mit 7 l folgender Nährlösung
für 30 min bei einer Temperatur von 121°C
sterilistiert worden ist: 11,5 g Maisquellwasser,
16,9 g Zitronensäure × 1 H₂O, 35 g (NH₄)₂SO₄, 25,8 g
KH₂PO₄, 10 g Na₂HPO₄ × 2 H₂O, 7 g 85%ige H₃PO₄,
10,7 g MgSO₄ × 7 H₂O, 0,28 g KCl, 3 g CaCl₂ × 2 H₂O,
1,75 g FeCl₃ × 6 H₂O und 7 l deionisiertes Wasser;
pH 3,0. Nach Abkühlen auf eine Temperatur von 30°C
ist dieses Medium vor der Beimpfung mit 540 g sterilem
n-Paraffin S (89% C-14, 9% C-15) versetzt und
der pH-Wert mit 10%-iger NaOH-Lösung auf pH 6,2
eingestellt worden.
Während der Kultivierung wird die Submerskultur
automatisch mit einer pH-Regulierstation durch
Titration mit einer 10%-igen NaOH-Lösung bei pH 6,2
konstant gehalten und bei einer Temperatur von
30°C, einer Rührgeschwindigkeit von 350 cm-1 und
einer Belüftungsrate von 0,8 V/V/m mit Luft begast.
Nach 144 Std. wird die Kultursuspension zweimal
mit 14 l des Lösungsmittelgemisches Ch₂Cl₂/CH₃OH
= 2 : 1 extrahiert und nach Einengen der organischen
Phase 595 g Rückstand erhalten. Dieser Rohextrakt
wird in 2 l CHCl₃ gelöst und anschließend mit 1 kg
Kieselgel 60 30 min lang verrührt. Danach wird
filtriert und das verbleibende Kieselgel zweimal
mit 2 l CHCl₃ nachgespült. Nach Vereinigung der
CHCl₃-Lösungen und Evakuieren des Lösungsmittels
unter Vakuum resultieren 27 g n-Paraffin S, die
recyclisiert werden können. Das Kieselgel wird
zweimal mit 2 l CH₃OH gerührt, und nach Filtration
werden die vereinigten organischen Extrakte
eingeengt. Der Rückstand enthält 8,3 g Trehalose-
6,6′-di- und 6-monoester = 10%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid,
sowie 74,8 g Trehalose-2,2′,3,4-
tetraester = 90%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid.
Die Züchtung von Corynebacterium spec. DSM 2568 erfolgt
bei 100 cm-1 und pH 6,5 in insgesamt zehn 500 ml-
Erlenmeyerkolben mit Schikanen, die jeweils 100 ml
Kultursuspension enthalten (Zusammensetzung 0,2 g
Na₂HPO₄ × 2 H₂O, 0,05 g FeSO₄ × 7 H₂O, 0,3 g Maisquellwasser,
0,2 g KH₂PO₄, 0,5 g (NH₄)₂SO₄, 0,002 g
MnSO₄ × 1 H₂O, 0,1 g MgSO₄ × 7 H₂O, 0,01 g CaCl₂ ×
2 H₂O, 0,001 g ZnSO₄ × 7 H₂O und 100 ml destilliertes
Wasser), die 20 min bei einer Temperatur von 121°C
sterilisiert und nach Abkühlung auf eine Temperatur
von 30°C mit 10 g sterilem n-Paraffin S (89% C-14,
9% C-15) versetzt werden. Jede 100 ml Kultur wird
dabei mit 2 ml einer 72 Std. alten Vorkultur (Medium:
wie in Beispiel 7 beschrieben) von Corynebacterium
spec. DSM 2568 beimpft.
Während der Kultivierung wird der pH-Wert der Submerskultur
täglich einmal mit steriler 1 N NaOH-Lösung
auf pH 6,5 korrigiert. Eine nach 12 Tagen Inkubation
erfolgte Extraktion der vereinigten Reaktionsansätze
mit zweimal 2 l des Lösungsmittelgemisches
CH₂Cl₂/CH₃OH = 2 : 1 führt nach Verdampfen
der Lösungsmittel zu 70 g Rückstand, der an einer
mit Kieselgel 60 gefüllten Glassäule (d i = 4,5 cm,
40 cm hoch gepackt) chromatographiert wird. Mit
CHCl₃ als Eluierungsmittel werden 65 g n-Paraffin S
erhalten, die recyclisiert werden können. Aus der
Eluierung mit CHCl₃/CH₃OH-Gemischen im Volumenverhältnis
5 : 1 bis 1 : 2 gehen 0,3 g Trehalose-6,6′-
di- und 6-monoester = 10%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid,
sowie 2,6 g Trehalose-2,2′,3,4-tetraester
= 90%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid, hervor.
Das Gemisch aus Trehalose-2,2′,3,4-tetraestern
weist die folgenden ¹H-NMR spektroskopischen Daten
auf (nachgereicht):
Die Kennzeichnung des Trehalose-2,2′3,4-tetraestergemischs
über IR-Spektroskopie ergibt folgende Daten (nachgereicht):
Claims (3)
1. Gemische aus Trehalose-2,2′,3,4-tetraestern der allgemeinen
Formel
mit den Bedeutungen:
und
R₃ Wasserstoff oder Alkyl
x = 4 bis 22
y = 1 bis 4
z = 4 bis 22mit der Maßgabe, daß mindestens ein Rest R₁ ein Dicarbonsäurerest ist.
y = 1 bis 4
z = 4 bis 22mit der Maßgabe, daß mindestens ein Rest R₁ ein Dicarbonsäurerest ist.
2. Verfahren zur Herstellung der Gemische aus Trehalose-
2,2′,3,4-tetraestern nach Anspruch 1 durch Züchtung von
Trehaloselipiden produzierenden und n-Alkan verwertenden
Mikroorganismen in einem Kohlenwasserstoffe
enthaltenden, wäßrigen Nährmedium mit einem bestimmten
pH-Wert bei einer Temperatur von unter
50°C und anschließender Isolierung der Trehaloseester
aus der Kultursuspension, dadurch gekennzeichnet,
daß die Mikroorganismen aerob bei
einem pH-Wert von 3 bis 8 und einer Temperatur
von 15 bis 50°C unter Limitierung der Wachstumsgeschwindigkeit
gezüchtet werden und daß als Mikroorganismen
Rhodococcus erythropolis DSM 43215, Arthrobacter
spec. DSM 2567 oder Corynebacterium spec. DSM 2568,
eingesetzt werden und daß man als Kohlenwasserstoff
Kerosin oder ein Gemisch aus etwa 89 Vol.% Kohlenwasserstoffen
mit 14 C-Atomen und etwa 9 Vol.% Kohlenwasserstoffen
mit 15 C-Atomen einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß der pH-Wert der Kultursuspension durch Zugabe
der wäßrigen Lösung einer stickstofffreien alkalischen
Verbindung auf dem vorbestimmten Wert gehalten wird.
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