DE2435260B2

DE2435260B2 - Verfahren zur herstellung von moenomycin

Info

Publication number: DE2435260B2
Application number: DE19742435260
Authority: DE
Inventors: Jürgen Dr. 6238 Hofheim; Mracek Miroslav 6000 Frankfurt; Sukatsch Dieter Dr. 6230 Frankfurt; Nesemann Georg Dr. 6239 Lorsbach Dietrich
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1974-07-23
Filing date: 1974-07-23
Publication date: 1976-08-12
Also published as: FI752090A; ES439464A1; JPS5811999B2; JPS5135497A; IL47728A; GB1514219A; CH627495A5; IT1041781B; IL47728A0; CA1054543A; BG27915A3; DK139820C; FR2279846A1; DD119436A5; ATA566275A; PL94627B1; DK332075A; NL7508629A; LU73030A1; DE2435260A1

Description

R-O-(CH₂-CH₂-O—)„H (1)

worin R einen gesättigten oder einfach ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit 8 bis 18 C-Atomen, der jeweils auch eine Hydroxygruppe tragen kann, und η eine ganze Zahl zwischen 18 und 30 bedeutet, zusetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als moenomycinbildende Streptomyceten Streptomyces ghanaensis ATCC 14 672, Streptomyces bambergiensis ATCC 13 879, Streptomyces ederensis ATCC 15 304 oder Streptomyces geysiriensis ATCC 15 303 sowie ihre Mutanten und Revertanten verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Tensid der allgemeinen Formel (1) ein solches verwendet wird, dessen Molekulargewicht zwischen 1000 und 1500, dessen Trübungspunkt zwischen 73 und 79, dessen Hydroxylzahl zwischen 39 und 78 und dessen hydrophil-lipophiler Balancewert zwischen 16 und 18 liegt.

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Nach DT-PS 12 10 514 ist ein Verfahren zur Her-•tellung von Moenomycin durch mikrobiologische fermentation von moenomycinbildenden Streptomy- *eten bekannt, wobei man als zusätzliche Kohlenstoff- <juelle Fette verwendet.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Moenomycin durch mikrobiologische Fermentation Von moenomycinbildenden Streptomyceten auf üblichem biologischen Wege und in Gegenwart von Fetten gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Iran dem Fermentationsmedium ein nichtionogenes Tensid der allgemeinen Formel (1)

R-O -(CH₂-CH₂-O -)„H (1)

Die Kohlenwasserstoffreste R sind bevorzugt geradkettig; sie können jedoch, insbesondere bei Resten synthetischer Herkunft, bis zu etwa 20% verzweigte Anteile enthalten. Insbesondere sind KW-Reste mit bis 14 C-Atomen bevorzugt.

In der allgemeinen Formel (1) bedeutet R insbesondere Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Hexadecyl, Heptadecyl, Octadecyl sowii Octeny!, Nonenyl, Decenyl, Undecenyl, Dodecenyl, Tridecenyl, Tetradecenyl, Pentadecenyl, Hexadecenyl, Heptadecenyl und Octadecenyl. Ferner Hydroxy-octyl, Hydroxy-nonyl, Hydroxy-decyl, Hydroxy-undecyl, Hydroxy-dodecyl, Hydroxy-tridecyl, Hydroxy-tetradecyl, Hydroxy-pentadecyl, Hydroxyheptadecyl sowie Hydroxy-octadecyl. Die Hydroxy-Gruppe kann bei allen vorstehend genannten Resten am ersten, zweiten, dritten usw. bis vorletzten C-Atom stehen: C₁ bis C₇ bei dem Octylrest, C₁ bis C_s bei dem Nonylrest, C₁ bis C₉ bei dem Decylrest, C₁ bis C₁₀ bei dem Undecylrest, C₁ bis C₁₁ bei dem Dodecylrest, C₁ bis C₁₂ bei dem Tridecylrest, C₁ bis C₁₃ bei dem Tetradecylrest, C₁ bis C₁₄ bei dem Pentadecylrest. C₁ bis C₁₅ bei dem Hexadecylrest, C₁ bis C₁₆ bei dem Heptadecylrest, C₁ bis C₁₇ bei dem Octadecylrest.

Bezüglich der Stellung der Hydroxygruppe im Molekül sind diejenigen Verbindungen bevorzugt, die praktisch am leichtesten zugänglich sind, wie z. B. n-Hydroxy-.iWJO-octadecensäure oder 12-HydroxyzJ-6,7-octadecensäure oder 12-Hydroxy-J-9,10-tetradecensäure oder 12-Hydroxy-.:l-5,6-tetradecensäure.

Als einfach ungesättigte Kohlenwasserstoffreste kommen für R in Betracht zJ-4,5-Decenyl, ,1-9,10-Decenyl, J-4,5-Dodecenyl, <d-5,6-Telradecenyl, .1-9,10-Tetradecenyl, /1-9,10-Hexadecenyl, J-6,7-Octadecenyl, J-9,10-Octadecenyl und <d-ll,12-Octadecenyl; bei allen vorstehend genannten ungesättigten Kohlenwasserstoffresten kann zusätzlich eine Hydroxylgruppe art jedem der C-Atome stehen, die keine Doppelbindung tragen. Dabei können alle genannten ungesättigten Kohlenwasserstoffreste sowohl in eis- als auch in trans-Konfigurationen vorkommen. Bevorzugt sind dabei diejenigen Konfigurationen, welche natürlich vorkommen. Das gilt auch für die Positionen der Doppelbindungen.

Besonders bevorzugt unter den Tensiden der allgemeinen Formel (1) sind solche, deren Molekulargewicht zwischen 1000 und 1500 liegt, deren Trübungspunkt (Ig Substanz in 100 ml 10%iger Kochsalzlösung) zwischen 73 und 79 liegt, deren Hydroxylzahl zwischen 39 und 78 und deren hydrophil-lipophiler Balancewert zwischen 16 und 18 liegt.

Die Fermentation der Streptomyceten wird unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Medium durchgeführt, das neben anorganischen Salzen als Kohlenstoffquelle Stärke, Glucose, Rohrzucker oder Melasse und zusätzlich ein tierisches, pflanzliches oder synthetisches Fett sowie als Stickstoffquelle Sojaschrot oder -mehl, Cornsteepliquor, Hefeextrakt, Baumwollsamen- oder -keimlingsmehi, Nitrate oder Ammoniumsalze enthält sowie ein Tensid der Formel (1).

Die Fermentation wird bis zur Erreichung einer maximalen antibiotischen Aktivität durchgeführt. Diese kann durch Messen der Konzentration des gelösten Stickstoffs im Fermentationsmedium oder der gebildeten Trockengewichtsmasse bestimmt werden.

Nach Erreichen der maximalen antibiotischen Aktivität wird die Fermentation unterbrochen. Zur Isolierung des Antibiotikums wird entweder die gesamte Kultur homogenisiert und anschließend extrahiert, oder das Mycel wird durch Zentrifugieren von der Kulturlösung abgetrennt und diese beiden Bestandteile jeweils für sich extrahiert. Als Extraktionsmittel kommen vorzugsweise mit Wasser mischbare oder teilweise mischbare Lösungsmittel in Betracht, z. B.

Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Äthylenglycolmonomethyläther. Aceton oder Dioxan.

Aus den so gewonnenen Extrakten wird das rohe Antibiotikum zweckmäßig durch Abdampfen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck gewonnen. Der Rückstand wird zur weiteren Reinigung mit heißen, polaren, organischen Lösungsmitteln, z. B. Methanol, extrahiert und das Antibiotikum aus dem unter vermindertem Druck eingeengten Extrakt durch Fällung mit einem mäßig polaren organischen Lösungsmiitel, wie Diäthyläther, Diisopropyläther oder Äthylacetat, ausgefällt.

Als moenomycinbildende Streptomyceten werden

Streptomyces ghanaensis ATCC 14 672,
Streptomyces bambergiensis ATCC 13 879,
Streptomyces ederensis ATCC 15 304 und
Streptomyces geysiriensis ATCC 15 303

Nach Animpfen wird die Vorkultur bei 28 bis 30^cC 2 Tage lang mit einer Frequenz von 300 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.

Das Fermentationsmedium der Hauptkultur hat folgende Zusammensetzung:

3,0% Sojaöl,
3,0% Sojamehl,
3,0% Maisstärke,
1,0% Saccharose,
0,3 % Ammonsulfat,
0,4% Calciumcarbonat,
2,0% Hefe,
Wasser ad. 30 ml.

sowie ihre Mutanten und Revertanten verwendet.

Als tierische Fette kommen zweckmäßig Tierkörperfette wie Schweineschmalz oder Hammeltalg oder künstlich hergestellte Fraktionen solcher Fette mit definiertem Kohlenstoffgehalt in Betracht. Als pflanzliche Fette werden zweckmäßig fette öle wie Olivenöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl, Cocosöl, Ricinusöl verwendet. Ferner kommen synthetische Fette wie öl- »äuretriglycerid oder Stearinsäuretripiycerid in Betracht. Sämtliche Fette werden in Konzentrationen rwischen 0,1 und 16 Gewichtsprozent, vorzugsweise 2 und 5 Gewichtsprozent, verwendet.

Die außerordentlich fördernde Wirkung des erfindungsgemäßen Zusatzes eines Tensids der allgemeinen Formel (1) auf die Bildung von Moenomycin aus Streptomyces-Arten ist überraschend. Zwar ist die Itimulierende Wirkung von z. B. Polyoxyäthylen-Derivaten von Sorbitananhvdriden, die teilweise mit Fettsäure verestert sind (Tween®-Typen) oder von Zuckerfettsäureestern auf die Enzymproduktion gewisser Mikroorganismen bekannt (E. T. R e e s e et al., Applied Microbiology, 1969, 242 bis 245) sowie auf die Bildung von Riboflavin aus Ashbya gossypii (C. G. S m i t h et al., Biochim. Biophys. Acta 47 J1961,] 344 bis 349). Diese oberflächenaktiven Verbindungen haben jedoch keine positive Wirkung auf die Bildung von Moenomycin. Auf der anderen Seite haben sie die Moenomycinbildung fördernden Verbindungen der allgemeinen Formel (1) keine positive Wirkung auf z. B. die Bildung von Streptomycin.

Beispiele

Streptomyces ghanaensis ATCC 14 672 wird in einem 300-ml-Erlenmeyer-Kolben auf 30 ml eines sterilen Nährmediums folgender Zusammensetzung überimpft:

4,0% Glucose,

3,0% Sojamehl,

0,3% Schlempe, trocken,

0,25% Kochsalz,

0,25 % Calciumcarbonat,

Wasser ad. 30 ml.

Der Zusatz eines der in nachstehender Tabelle 1 aufgeführten Tenside zum Fermentatiorismedium erfolgt in Form einer lOgewichtsprozentigen wäßrigen Lösung mit doppelt destilliertem Wasser. Die Lösung wird anschließend 10 Minuten lang bei 123 bis 127' C sterilisiert.

Nun wird das obengenannte Fermentationsmedium mit 1,5 ml der Tensidlösung von 37⁰C versetzt. Dann werden 5 ml der Vorkultur zugegeben.

Diese Hauptkultur wird bei 28 bis 30¹C 120 Stunden lang mit 260 bis 300 Umdrehungen pro Minute

35 geschüttelt. Anschließend wird das Ganze mit 60 ml Methanol 2 Minuten lang im Vibromischer geschüttelt und anschließend durch einen Faltenfilter filtriert. In einem aliquoten Teil des Filtrats wird der Moenomycin-Gehalt durch seine Einwirkung auf eine standardisierte Kultur von Staphylococcus aureus turbidimetrisch im Vergleich zur Wirkung einer Moenomycin-Lösung bekannten Gehalts bestimmt.

Die übrigen in der Tabelle zusammengefaßten Ergebnisse wurden durch Variation der Streptomyces-Stämme, des Fettzusatzes und des Tensidzusatzes unter sonst gleichen Bedingungen erhalten.

Die in der Tabelle angegebenen Tenside haben die folgenden Kenndaten, wobei bedeutet: Molekulargewicht MG, Trübungspunkt TB, Hydroxylzahl HZ und hydrophil-lipophiler Balancewert HLB.

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	Gemisch A	η	MG	TB	HZ	HLB
60	Gemisch A	2(i	1070	77	53	16,2
	Gemisch B Dodecyl	2fi	1290	78	44	16,8
65	Dodecyl	2.Ί 20	1260 1000	77 79	43 56	17,5 16,5
	30	1430	78	39	17,5

	24	Fett	35 260	6	Y	Moenomycin-
				η	Ausbeute
	Sojaöl	KW-Stoffrest R		100%
5	Sojaöl		—
Fermentation mit Streptomyces
		Gemisch A aus
Str. bambergiensis		7% C₈		161%
Str. bambergiensis		6% Qo	20
		51% Q₁
		19% C₁₄
	Sojaöl	8% C₁₁		180%
	Sojaöl	9% Q₈	25
		Gemisch A
		Gemisch B aus
Str. bambergiensis		13% C,		155%
Str. bambergiensis		32% C₁.	25
		20% C₁₁ 10% C₁₁
		14% Q₃
	Cocosöl	10% Q₄		165%
	Glycenntrioleat	3% C₁₅	30	200%
	Glycerinirioleat	Dodecyl	20	190%
	Glycenntrioleat	Gemisch A	30	202%
Str. bambergiensis	Ricinusöl	Dodecyl	20	205%
Str. bambergiensis	Sojaöl	Dodecyl	25	100%
Str. bambergiensis	Sojaöl	Gemisch A	—	158%
Str. bambergiensis	Cocosöl	—	20	160%
Str. bambergiensis	Glycenntrioleat	Gemisch A	30	158%
Str. ghanaensis	Glycerintrioleat	Dodecyl	20	173%
Str. ghanaensis	Glycenntrioleat	Gemisch A	30	158%
Str. ghanaensis	Ricinusöl	Dodecyl	20	150%
Str. ghanaensis	Sojaöl	Dodecyl	25	100%
Str. ghanaensis	Sojaöl	Gemisch A	—	155%
Str. ghanaensij	Cocosöl	—	20	150%
Str. ghanaensis	Glycerintrioleat	Gemisch A	30	160%
Str. geysiriensis	Glycerin tr. jleat	Dodecyl	20	155%
Str. geysiriensis	Glycorintrioleat	Gemisch A	30	160%
Str. geysiriensis	Ricinusöl	Dodecyl	20	145%
Str. geysiriensis	Sojaöl	Dodecyl	25	100%
Str. geysiriensis	Sojaöl	Gemisch A		152%
Str. geysiriensb	Cocosöl		20	140%
Str. geysiriensis	Glycerintrioleat	Gemisch A	30	145%
Str. ederensis	Glycerintrioleat	Dodecyl	20	150%
Str. ederensis	Glycerintrioleat	Gemisch A	30	155%
Str. ederensis	Ricinusöl	Dodecyl	20	140%
Str. ederensis	Dodecyl	25
Str. ederensis	Gemisch A
Str. ederensis
Str. ederensis

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Moenomycin durch mikrobiologische Fermentation von moenomycinbildenden Streptomyceten auf üblichem biologischen Wege und in Gegenwart von Fetten, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Fermentationsmedium ein Tensid der allge- m meinen Formel (1)