Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums, das nachstehend mit SL 3364 bezeichnet wird.
Erfindungsgemäss gelangt man zu dem neuen Antibioticum SL 3364, indem man einen neuen Stamm der Pilzspecies Sepedonium chrysospermum auf oder in einem Nährmedium züchtet und das Antibioticum aus der Fermentationsbrühe und dem Mycel, z. B. auf an sich bekannte Weise wie mittels Extraktion oder Adsorption, isoliert und reinigt.
Der neue, erfindungsgemäss verwendete Stamm S 3364 von Sepedonium chrysospermum wurde aus einer in England gefundenen Erdprobe isoliert und eine Probe davon beim United States Departement of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, III. USA, unter der Nummer NRRL 3489 deponiert.
Der neue Stam der Pilzspecies Sepedonium chrysospermum wächst auf einem Glucose-Malzextrakt- He feextrakt-Pepton-Agar bei 18-270 und bildet filziges, weisses bis beiges Luftmycel. Die Rückseite der Kolonie zeigt eine rotbraune Verfärbung des Substrats. Ältere Kolonien bilden ein helles, klares Exsudat. Die Lufthyphen sind unregelmässig verzweigt, septiert, 3,0-5,5 im Durchmesser, blass orange gefärbt und in einer dünnen Schicht auf der Oberfläche des Agars ausgebreitet.
Die Konidiophoren sind nicht scharf von den vegetativen Hyphen unterschieden, sie sind einfach oder geteilt, hyalin, meist septiert, unter dem Septum verdickt und haben einen Durchmesser von 4,0 4,5,u. Zwei Sporentypen werden gebildet: (i) dünnwandige ellipsoide oder birnenförmige Konidien, locker an den Enden langer Verzweigungen gruppiert, 9,0-11,0 x 4,5-6,0Ec, hyalin, (ii) dickwandige Chlamydosporen-ähnliche Konidien, kugelförmig, deutlich warzig, mit grossen Öltropfen, 11,5-16,O Durchmesser, hell cadmiumfarbig, einzeln an Seitenverzweigungen.
Der neue Stamm NRRL 3489 der Pilzspecies Sepedonium chrysospermum entspricht in seiner Morphologie und Physiologie den Beschreibungen, wie sie von J.C. Gilman in: A Manual of Soil Fungi, p. 301, The Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA (1957) und von G.L. Barron in: The Genera of Hyphomycetes from Soil, pp. 278-279, The Willlams & Wilkins Co. Baltimore, USA (1968) gegeben wurden.
Der neue Stamm der Pilzspecies Sepedonium chrysospermum lässt sich auf vielerlei Nährböden, die die üblichen Nährstoffe enthalten, züchten. So verwendet ein solcher Stamm die für kohlenstoffheterotrophe Organismen üblicherweise benutzten Nährstoffe, beispielsweise Glucose, Stärke, Dextrin, Lactose, Rohrzucker usw.
als Kohlenstoffquelle, organische und anorganische, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Trypton, Hefe- oder Fleischextrakte, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Aminosäuren usw. als Stickstoffquelle, sowie die ütbli- chen Mineralsalze und Spurenelemente.
Das neue Antibioticum kann man in der Weise herstellen, dass ein flüssiges Nährmedium mit einer Mycelsuspension des neuen Stammes von Sepedonium chrysospermum beimpft und die Kultur bei 18 inkubiert wird. Die Züchtung kann unter aeroben Bedingungen in einer Oberflächenkultur oder submers unter Schütteln oder in Fermentern mit Begasung durdh Luft oder Sauerstoff unter Rühren erfolgen. Sobald nach etwa 8 Tagen eine maximale Menge an Antibioticum produziert worden ist, wird filtriert und das Antibioti cum durch extraktive oder adsoprtive Arbeitsmethoden auf an sich bekannte Weise aus der mycelfreien Kulturlösung und dem zuvor mechanisch zuerstörten Mycel gewonnen.
Eine Methode, die sich als vorzugsweise geeignet erwiesen hat, besteht in der mechanischen Zerstörung des von der Kulturbrühe abgetrennten Mycels, der Extraktion einer das Antibioticum aus dem Mycel enthaltenden wässerigen Lösung mit Chlorform und de Extraktion der mycelfreien Kultuilösung mit Essigester, jedoch können auch andere organische Lösungsmittel, wie z. B. Benzol, Chloroform, Butylacetat oder Methy lenchlorid, verwendet werden.
Das neue Antibioticum kann aus den Extrakten chromatographisch isoliert werden.
Das neue Antibioticum SL 3364 kann wie folgl charakterisiert werden: Orangefarbene Kristalle; C = 69,6 o/o; H = 5,7 O/o; 0 = 24,2 ovo Schmelzpunkt 169-171 0C Spezifische Drehung: = x 388C (c = 0,06 in Chloroform) D UV.-Spektrum (Methylenchlorid): R max.=
243 nm (log e' = 1,48), 308,5 nm (log e' = 1,61)
380 nm (log ±' = 2,10) (Fig. 1) IR.-Spektrum (Methylenchlorid): u.a. Banden bei 1740, 1717, 1630, 1603 cm-1 (Fig. 2)
Das neue Antibioticum zeichnet sich durch interessante pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden.
Das neue Antibioticum besitzt eine hohe fungistatische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Erregern von Pilzinfektionen. Besonders hervorzuheben ist die gute in vitro Aktivität gegen Trichophyton mentagrophytes (Mindesthemmkonzen- tration 10 y/ml) Trichophyton tonsurans (Mindesthemmkonzentration 10 yiml) Trichophyton rubrum (Mindes themmkonzentration 10 ylml) Epidermophyton floccosum (Mindesthemmkonztration 3 y/ml) Microsporum canis (MindesthemmJkonzentration 10 y/ml) Microsporum audouinii (Mindesthemmkonzentration 3 riml).
Überdies besitzt das neue Antibioticum eine ausgeprägte cytostatische Wirkung, wie sie in virtro an einem aus einem Maustumor herrührenden Zellstamm (P-815 Mastocytom) gezeigt werden konnte. So zeigt das neue Antibioticum in vitro eine 500/obige Hemmung der Zellvermehrung bei einem Gehalt von 1,5 mg/l.
Weiterhin zeigt das neue Antibioticum eine deutliche Verminderung der Gerinnungszeit nach i.p. Injktion.
Im allgemeinen hat sich für grosse Säugetiere eine Einzeldosis von 50-1000 mg als vorteilhaft erwiesen, die vorzugsweise täglich zu verabreichen ist. Für die orale Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform 50-1000 mg der Wirksubstanz, ver mischt mit einem flüssigen oder festen Träger. Für die topicale Anwendung können Pulver od. Sprays od.
Salben od. Tinkturen, die 0,1 bis 2 O/o der Wirksubstanz enthalten, verwendet werden.
In dem nachfolgenden Beispiel, welches die Aus führung des Verfahrens erläutert, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Die
Schmelzpunkt sind auf dem Kofler-Block bestimmt.
Beispiel
In einem Fermenter werden 10 Liter eine Näherlösung, die pro Liter 40g Cerelose
5 g Trypton 3g NUN03 lg K2HPO4
500mg KCl
500 mg MgSO4.7HoO
10 mg FeSO4 entmineralisiertes Wasser enthält, mit einer Mycelsuspension des Stammes S 3364 von Sependonium chrysospermum beimpft und unter Belüftung (1 L Luft/Min./L Näherlösung) und unter Rühren (150 U./Min.) 8 Tage bei 18 inkubiert. Die Kulturbrühe wird über eine Celite-Vorschwemmschicht filtriert und das Antibioticum aus dem Filtrat mit Essigester extrahiert. Das Mycel wird mit Methanol im Ultra-Turrax aufgeschlossen, abfiltriert und mit Methanol/Wasser (9 : 1) gewaschen.
Das Methanol destilliert man ab und extrahiert die wässerige Phase mit Chloroform. Die so erhaltenen Rohextrakte werden an mit Salzsäure gewaschenem und getrocknetem Kieselgel Merck (0,05-0,2 mm) chromatographiert. Das neue Antibioticum SL 3364 eluiert man mit Chloroform/Methanol (99 : 1) und kristallisiert mehrmals aus Methanol um. Man erhält das neue Antibioticum in Form orangefarbener Kristalle vom Schmelzpunkt 169-1710.
Die zur Beimpfung verwendete Mycelsuspension wird in zwei Stufen hergestellt. Zuerst züchtet man eine Kultur des urpsürnglich isolierten Stammes 8 Tage bei 27 auf einem Agarmedium der folgenden Zusatz mensetzung:
20 g Cerelose
20 g Fadenagar
2 g Malzextrakt
2 g Hefe-Extrakt
2g Pepton 2g KH2PO4
2 g MgSO4 - 7 HsO und entmineralisiertes Wasser ad 1 L.
Diese Kultur wird in der zweiten Stufe 7 Tage bei 27 in dem vorstehend aufgeführten Fermentermedium unter Schütteln inkubiert und sodann die daraus hergestellte Mycelsuspension, wie im Beispiel beschrieben, verwendet.