Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums, das nachstehend mit SL 3364 bezeichnet wird.
Erfindungsgemäss gelangt man zu dem neuen Antibioticum SL 3364, indem man einen neuen Stamm der Pilzspecies Sepedonium chrysospermum auf oder in einem Nährmedium züchtet und das Antibioticum aus der Fermentationsbrühe und dem Mycel, z. B. auf an sich bekannte Weise wie mittels Extraktion oder Adsorption, isoliert und reinigt.
Der neue, erfindungsgemäss verwendete Stamm S 3364 von Sepedonium chrysospermum wurde aus einer in England gefundenen Erdprobe isoliert und eine Probe davon beim United States Departement of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, III. USA, unter der Nummer NRRL 3489 deponiert.
Der neue Stam der Pilzspecies Sepedonium chrysospermum wächst auf einem Glucose-Malzextrakt- He feextrakt-Pepton-Agar bei 18-270 und bildet filziges, weisses bis beiges Luftmycel. Die Rückseite der Kolonie zeigt eine rotbraune Verfärbung des Substrats. Ältere Kolonien bilden ein helles, klares Exsudat. Die Lufthyphen sind unregelmässig verzweigt, septiert, 3,0-5,5 im Durchmesser, blass orange gefärbt und in einer dünnen Schicht auf der Oberfläche des Agars ausgebreitet.
Die Konidiophoren sind nicht scharf von den vegetativen Hyphen unterschieden, sie sind einfach oder geteilt, hyalin, meist septiert, unter dem Septum verdickt und haben einen Durchmesser von 4,0 4,5,u. Zwei Sporentypen werden gebildet: (i) dünnwandige ellipsoide oder birnenförmige Konidien, locker an den Enden langer Verzweigungen gruppiert, 9,0-11,0 x 4,5-6,0Ec, hyalin, (ii) dickwandige Chlamydosporen-ähnliche Konidien, kugelförmig, deutlich warzig, mit grossen Öltropfen, 11,5-16,O Durchmesser, hell cadmiumfarbig, einzeln an Seitenverzweigungen.
Der neue Stamm NRRL 3489 der Pilzspecies Sepedonium chrysospermum entspricht in seiner Morphologie und Physiologie den Beschreibungen, wie sie von J.C. Gilman in: A Manual of Soil Fungi, p. 301, The Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA (1957) und von G.L. Barron in: The Genera of Hyphomycetes from Soil, pp. 278-279, The Willlams & Wilkins Co. Baltimore, USA (1968) gegeben wurden.
Der neue Stamm der Pilzspecies Sepedonium chrysospermum lässt sich auf vielerlei Nährböden, die die üblichen Nährstoffe enthalten, züchten. So verwendet ein solcher Stamm die für kohlenstoffheterotrophe Organismen üblicherweise benutzten Nährstoffe, beispielsweise Glucose, Stärke, Dextrin, Lactose, Rohrzucker usw.
als Kohlenstoffquelle, organische und anorganische, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Trypton, Hefe- oder Fleischextrakte, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Aminosäuren usw. als Stickstoffquelle, sowie die ütbli- chen Mineralsalze und Spurenelemente.
Das neue Antibioticum kann man in der Weise herstellen, dass ein flüssiges Nährmedium mit einer Mycelsuspension des neuen Stammes von Sepedonium chrysospermum beimpft und die Kultur bei 18 inkubiert wird. Die Züchtung kann unter aeroben Bedingungen in einer Oberflächenkultur oder submers unter Schütteln oder in Fermentern mit Begasung durdh Luft oder Sauerstoff unter Rühren erfolgen. Sobald nach etwa 8 Tagen eine maximale Menge an Antibioticum produziert worden ist, wird filtriert und das Antibioti cum durch extraktive oder adsoprtive Arbeitsmethoden auf an sich bekannte Weise aus der mycelfreien Kulturlösung und dem zuvor mechanisch zuerstörten Mycel gewonnen.
Eine Methode, die sich als vorzugsweise geeignet erwiesen hat, besteht in der mechanischen Zerstörung des von der Kulturbrühe abgetrennten Mycels, der Extraktion einer das Antibioticum aus dem Mycel enthaltenden wässerigen Lösung mit Chlorform und de Extraktion der mycelfreien Kultuilösung mit Essigester, jedoch können auch andere organische Lösungsmittel, wie z. B. Benzol, Chloroform, Butylacetat oder Methy lenchlorid, verwendet werden.
Das neue Antibioticum kann aus den Extrakten chromatographisch isoliert werden.
Das neue Antibioticum SL 3364 kann wie folgl charakterisiert werden: Orangefarbene Kristalle; C = 69,6 o/o; H = 5,7 O/o; 0 = 24,2 ovo Schmelzpunkt 169-171 0C Spezifische Drehung: = x 388C (c = 0,06 in Chloroform) D UV.-Spektrum (Methylenchlorid): R max.=
243 nm (log e' = 1,48), 308,5 nm (log e' = 1,61)
380 nm (log ±' = 2,10) (Fig. 1) IR.-Spektrum (Methylenchlorid): u.a. Banden bei 1740, 1717, 1630, 1603 cm-1 (Fig. 2)
Das neue Antibioticum zeichnet sich durch interessante pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden.
Das neue Antibioticum besitzt eine hohe fungistatische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Erregern von Pilzinfektionen. Besonders hervorzuheben ist die gute in vitro Aktivität gegen Trichophyton mentagrophytes (Mindesthemmkonzen- tration 10 y/ml) Trichophyton tonsurans (Mindesthemmkonzentration 10 yiml) Trichophyton rubrum (Mindes themmkonzentration 10 ylml) Epidermophyton floccosum (Mindesthemmkonztration 3 y/ml) Microsporum canis (MindesthemmJkonzentration 10 y/ml) Microsporum audouinii (Mindesthemmkonzentration 3 riml).
Überdies besitzt das neue Antibioticum eine ausgeprägte cytostatische Wirkung, wie sie in virtro an einem aus einem Maustumor herrührenden Zellstamm (P-815 Mastocytom) gezeigt werden konnte. So zeigt das neue Antibioticum in vitro eine 500/obige Hemmung der Zellvermehrung bei einem Gehalt von 1,5 mg/l.
Weiterhin zeigt das neue Antibioticum eine deutliche Verminderung der Gerinnungszeit nach i.p. Injktion.
Im allgemeinen hat sich für grosse Säugetiere eine Einzeldosis von 50-1000 mg als vorteilhaft erwiesen, die vorzugsweise täglich zu verabreichen ist. Für die orale Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform 50-1000 mg der Wirksubstanz, ver mischt mit einem flüssigen oder festen Träger. Für die topicale Anwendung können Pulver od. Sprays od.
Salben od. Tinkturen, die 0,1 bis 2 O/o der Wirksubstanz enthalten, verwendet werden.
In dem nachfolgenden Beispiel, welches die Aus führung des Verfahrens erläutert, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Die
Schmelzpunkt sind auf dem Kofler-Block bestimmt.
Beispiel
In einem Fermenter werden 10 Liter eine Näherlösung, die pro Liter 40g Cerelose
5 g Trypton 3g NUN03 lg K2HPO4
500mg KCl
500 mg MgSO4.7HoO
10 mg FeSO4 entmineralisiertes Wasser enthält, mit einer Mycelsuspension des Stammes S 3364 von Sependonium chrysospermum beimpft und unter Belüftung (1 L Luft/Min./L Näherlösung) und unter Rühren (150 U./Min.) 8 Tage bei 18 inkubiert. Die Kulturbrühe wird über eine Celite-Vorschwemmschicht filtriert und das Antibioticum aus dem Filtrat mit Essigester extrahiert. Das Mycel wird mit Methanol im Ultra-Turrax aufgeschlossen, abfiltriert und mit Methanol/Wasser (9 : 1) gewaschen.
Das Methanol destilliert man ab und extrahiert die wässerige Phase mit Chloroform. Die so erhaltenen Rohextrakte werden an mit Salzsäure gewaschenem und getrocknetem Kieselgel Merck (0,05-0,2 mm) chromatographiert. Das neue Antibioticum SL 3364 eluiert man mit Chloroform/Methanol (99 : 1) und kristallisiert mehrmals aus Methanol um. Man erhält das neue Antibioticum in Form orangefarbener Kristalle vom Schmelzpunkt 169-1710.
Die zur Beimpfung verwendete Mycelsuspension wird in zwei Stufen hergestellt. Zuerst züchtet man eine Kultur des urpsürnglich isolierten Stammes 8 Tage bei 27 auf einem Agarmedium der folgenden Zusatz mensetzung:
20 g Cerelose
20 g Fadenagar
2 g Malzextrakt
2 g Hefe-Extrakt
2g Pepton 2g KH2PO4
2 g MgSO4 - 7 HsO und entmineralisiertes Wasser ad 1 L.
Diese Kultur wird in der zweiten Stufe 7 Tage bei 27 in dem vorstehend aufgeführten Fermentermedium unter Schütteln inkubiert und sodann die daraus hergestellte Mycelsuspension, wie im Beispiel beschrieben, verwendet.
Process for the manufacture of a new antibiotic
The present invention relates to a process for the production of a new antibiotic, which is referred to as SL 3364 below.
According to the invention, the new antibiotic SL 3364 is obtained by cultivating a new strain of the fungal species Sepedonium chrysospermum on or in a nutrient medium and removing the antibiotic from the fermentation broth and the mycelium, e.g. B. in a manner known per se such as by means of extraction or adsorption, isolated and purified.
The new strain S 3364 of Sepedonium chrysospermum used according to the invention was isolated from a soil sample found in England and a sample thereof was obtained from the United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, III. USA, deposited under number NRRL 3489.
The new strain of the fungal species Sepedonium chrysospermum grows on a glucose-malt extract-He feextrakt-peptone agar at 18-270 and forms felty, white to beige aerial mycelium. The reverse side of the colony shows a reddish brown discoloration of the substrate. Older colonies will produce a light, clear exudate. The aerial hyphae are irregularly branched, septate, 3.0-5.5 in diameter, colored pale orange and spread out in a thin layer on the surface of the agar.
The conidiophores are not sharply distinguished from the vegetative hyphae, they are simple or divided, hyaline, mostly septate, thickened under the septum and have a diameter of 4.0 4.5 u. Two types of spores are formed: (i) thin-walled ellipsoidal or pear-shaped conidia, loosely grouped at the ends of long branches, 9.0-11.0 x 4.5-6.0Ec, hyaline, (ii) thick-walled chlamydosporic-like conidia, spherical , clearly warty, with large oil droplets, 11.5-16.0 in diameter, light cadmium-colored, isolated on side branches.
The new strain NRRL 3489 of the mushroom species Sepedonium chrysospermum corresponds in its morphology and physiology to the descriptions as given by J.C. Gilman in: A Manual of Soil Fungi, p. 301, The Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA (1957) and by G.L. Barron in: The Genera of Hyphomycetes from Soil, pp. 278-279, The Willlams & Wilkins Co. Baltimore, USA (1968).
The new strain of the fungal species Sepedonium chrysospermum can be grown on a variety of nutrient media that contain the usual nutrients. Such a strain uses the nutrients commonly used for carbon-heterotrophic organisms, for example glucose, starch, dextrin, lactose, cane sugar, etc.
as a carbon source, organic and inorganic, nitrogen-containing compounds such as tryptone, yeast or meat extracts, ammonium chloride, ammonium nitrate, amino acids, etc. as a nitrogen source, as well as the usual mineral salts and trace elements.
The new antibiotic can be produced in such a way that a liquid nutrient medium is inoculated with a mycelium suspension of the new strain of Sepedonium chrysospermum and the culture is incubated at 18. The cultivation can take place under aerobic conditions in a surface culture or submerged with shaking or in fermenters with gassing with air or oxygen with stirring. As soon as a maximum amount of antibiotic has been produced after about 8 days, it is filtered and the antibiotics are obtained from the mycelium-free culture solution and the previously mechanically destroyed mycelium by extractive or adsorptive working methods in a manner known per se.
A method which has proven to be particularly suitable consists in the mechanical destruction of the mycelium separated from the culture broth, the extraction of an aqueous solution containing the antibiotic from the mycelium with chlorine form and the extraction of the mycelium-free culture solution with ethyl acetate, but other organic Solvents such as B. benzene, chloroform, butyl acetate or Methy lenchlorid can be used.
The new antibiotic can be isolated from the extracts by chromatography.
The new antibiotic SL 3364 can be characterized as follows: orange-colored crystals; C = 69.6 o / o; H = 5.7 O / o; 0 = 24.2 ovo Melting point 169-171 0C Specific rotation: = x 388C (c = 0.06 in chloroform) D UV. Spectrum (methylene chloride): R max. =
243 nm (log e '= 1.48), 308.5 nm (log e' = 1.61)
380 nm (log ± '= 2.10) (Fig. 1) IR spectrum (methylene chloride): i.a. Bands at 1740, 1717, 1630, 1603 cm-1 (Fig. 2)
The new antibiotic is characterized by interesting pharmacological properties and can therefore be used as a remedy.
The new antibiotic has a high fungistatic effectiveness against various pathogens of fungal infections. Particularly noteworthy is the good in vitro activity against Trichophyton mentagrophytes (minimum inhibitory concentration 10 y / ml) Trichophyton tonsurans (minimum inhibitory concentration 10 ylm) Trichophyton rubrum (minimum theme concentration 10 ylml) Epidermophyton floccosum (minimum inhibitory concentration 3 y / ml) Microsporum canis concentration / ml) Microsporum audouinii (minimum inhibitory concentration 3 riml).
In addition, the new antibiotic has a pronounced cytostatic effect, as could be demonstrated in virtro on a cell strain derived from a mouse tumor (P-815 mastocytoma). Thus, the new antibiotic shows in vitro an inhibition of cell proliferation above 500% at a level of 1.5 mg / l.
Furthermore, the new antibiotic shows a clear reduction in the clotting time after i.p. Injection.
In general, a single dose of 50-1000 mg has proven advantageous for large mammals, which is preferably to be administered daily. For oral administration, a suitable form of administration contains 50-1000 mg of the active substance, mixed with a liquid or solid carrier. For topical use, powders or sprays or sprays can be used.
Ointments or tinctures that contain 0.1 to 2 O / o of the active substance are used.
In the following example, which explains the implementation of the method but is not intended to restrict the scope of the invention in any way, all temperatures are given in degrees Celsius. The
Melting points are determined on the Kofler block.
example
In a fermenter 10 liters of a closer solution, 40g of cerelose per liter
5 g tryptone 3g NUN03 lg K2HPO4
500mg KCl
500 mg MgSO4.7HoO
10 mg FeSO4 contains demineralized water, inoculated with a mycelium suspension of strain S 3364 of Sependonium chrysospermum and incubated for 8 days at 18 with aeration (1 L air / min. / L closer solution) and with stirring (150 rpm). The culture broth is filtered through a Celite precoat and the antibiotic is extracted from the filtrate with ethyl acetate. The mycelium is disrupted with methanol in an Ultra-Turrax, filtered off and washed with methanol / water (9: 1).
The methanol is distilled off and the aqueous phase is extracted with chloroform. The crude extracts obtained in this way are chromatographed on Merck silica gel (0.05-0.2 mm) washed with hydrochloric acid and dried. The new antibiotic SL 3364 is eluted with chloroform / methanol (99: 1) and recrystallized several times from methanol. The new antibiotic is obtained in the form of orange crystals with a melting point of 169-1710.
The mycelium suspension used for inoculation is produced in two stages. First, a culture of the originally isolated strain is grown for 8 days at 27 on an agar medium with the following additional composition:
20 g cerelose
20 g of thread agar
2 g of malt extract
2 g yeast extract
2g peptone 2g KH2PO4
2 g MgSO4 - 7 HsO and demineralized water ad 1 L.
In the second stage, this culture is incubated for 7 days at 27 in the above-mentioned fermenter medium with shaking and then the mycelium suspension prepared therefrom, as described in the example, is used.