Verfahren zur Herstellung von 1,4-Dien-3-ketonen der Steroidreihe 1,4-Dien-3-ketone der Steroidreihe haben in der letzten Zeit wegen ihrer therapeutischen Wirkung besonderes Interesse gefunden. So zeigen das 1-De- hydro-cortison (41#4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20- trion) und das 1-Dehydro-hydrocortison (41.4-Pregna- dien - 11ss,17a,21 - triol - 3,20 - dion)
gegenüber den bisher bekannten Nebennierenrindenhormonen er höhte Wirksamkeit und bessere Verträglichkeit (Science, 121, 176 [1955]).
Die Herstellung der genannten Verbindungen auf chemischem Wege ist wegen der Empfindlich keit der Dioxyacetonseitenkette schwierig. Bessere Möglichkeiten bietet die biochemische Dehydrierung von geeigneten Steroiden mit Mikroorganismen. So berichteten Vischer u.
Wettstein (Experientia IX, 371 [1953]), dass Schimmelpilze der Gattung Fusarien @14-3-Ketone der Pregnanreihe im Ring A zu 1,4- Dienen dehydrieren, wobei gleichzeitig die Seiten kette abgespalten wird, wenn am C-Atom neben der Seitenkette ein H-Atom steht.
In einer späteren Ar beit (Vischer, Meystre, Wettstein, Helv. 38, 835 [1955]) konnten die Autoren zeigen, dass Fusarien bei 17a Oxy-substituierten 44-3-Ketonen der Pregnan- reihe im Ring A dehydrierend wirken, ohne die Sei tenkette abzuspalten. Auch andere Pilze, die zur Gattung Calonectria, Ophiobolus und Alternaria ge hören, konnten diese Dehydrierung vollziehen, wobei kein Abbau der Seitenkette stattfindet.
Die Autoren beschreiben eine Reihe von so hergestellten 1,4-Dien- 3-ketosteroiden, geben aber für ihre Versuche keine Ausbeuten an. Auch von andern Autoren wurde beschrieben, dass durch Schimmelpilze 44-3-Ketone zu 1,4-Dien- ketonen dehydriert werden, wobei aber gleichzeitig die Seitenkette abgespalten oder der Ring D in einen Lactonring übergeführt wird (Peterson, Eppstein, Meister, Murray, Leigh, Weintraub, Reinecke,
Jour nal Amer. Chem. Soc. 75, 5768 [1953]; Fried, Thoma, Klingsberg, Journ. Amer. Chem. Soc. 75, 5764 [1953]). über die Ausbeuten finden sich in den genannten Arbeiten keine Angaben.
Es wurde gefunden, dass man in guter Ausbeute zu 1,4-Dien-3-ketonen der Steroidreihe dadurch ge langen kann, dass man 44-3-Ketone dieser Reihe unter aeroben Bedingungen der Einwirkung von Bakterien aus der Gruppe der grampositiven aeroben Sporenbildner, insbesondere eines Bacillus Subtilis- Stammes, unterwirft.
Wenn man derartige Bakterien unter submersen Bedingungen, unter Schütteln oder Einleiten von Luft züchtet und nach einer Vorwachszeit von 24 Stunden bis einigen Tagen eine Lösung eines 44-3 Ketosteroids in einem mit Wasser mischbaren Lö sungsmittel zusetzt und weiter einige Stunden bis einige Tage bebrütet, so findet eine Dehydrierung des Ringes A statt, und man erhält 1,4-Dien-3-keto- steroide, ohne dass ein Seitenkettenabbau oder eine andere Veränderung des Moleküls stattfindet.
So lässt sich z. B. Reichsteins Substanz S (44 Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion) in 41.4-Pregnadien- 17a!,21-diol-3,20-dion und ebenso Cortison (I) in 41,4_pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion (II) über führen:
EMI0002.0001
Andere Steroide, die ebenfalls mit Bakterien aus der Gruppe der grampositiven aeroben Sporenbildner zu 1,4-Dien-3-ketonen dehydriert werden können, sind z.
B. Hydrocortison, 11-epi-Hydrocortison, Cor- tison, Cortexon, 17a-Oxy-cortexon, Corticosteron, 11-Dehydro-corticosteron, Aldosteron, Progesteron oder Androsten-dion. Anstelle der genannten Steroide können auch Derivate, z. B. Ester; der Dehydrierung unterworfen werden.
Zur Aufarbeitung wird die Fermentationslösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmit tel extrahiert, z. B. mit Methylenchlorid, Äthylen chlorid, Chloroform, Äther, Essigester, Butylacetat oder Butanol. Aus der Lösung kann das Dienketon direkt kristallisiert oder durch chromatographische Adsorption isoliert werden.
Zur Prüfung des Verlaufs der Fermentierung, der Aufarbeitung und der Reinheit der Endprodukte eignet sich besonders die Papierchromatographie. Zur Charakterisierung kann die Ultraviolettabsorp- tion und besonders das Infrarotspektrum dienen. 41,4_3-Keto-steroide zeigen besonders im Bereich von 6,15 lt und 6,22,u charakteristische IR-Absorp- tionsbanden.
<I>Beispiel 1</I> Ein Fermentierungskolben von 5 Liter Inhalt, der mit Rührer, Lufteinleitungsrohr und einem Zu gabestutzen mit Kapsenberg-Verschluss versehen ist, wird mit 3 Liter einer Nährlösung gefüllt, die im Liter 50g Dextrose, 20 g Pepton und 5 g Cornsteep liquor enthält.
Ausserdem werden 60 cm-' einer Lösung zu gesetzt, die 10 g Ca(N03)2, 10 g KCl, 5 g KH2P04, 10 g MgS04 - 7H20, 1 g FeS04 und 3 g MnS04 im Liter enthält. Nach dem Sterilisieren wird der Kolben, mit einer Abschwemmung eines aus der Luft isolier ten grampositiven sporenbildenden Stäbchens aus der B-subtilis-Gruppe, Stamm 547, beimpft.
Das An wachsen wird innerhalb 48 Stunden bei 28 unter Rühren (200 U/Min.) und Einleiten von Luft (250 I/Stunde) durchgeführt. Nach dieser Zeit gibt man 1 g Reichsteins Substanz S, in 100 em3 Aceton gelöst, unter sterilen Bedingungen zur Kulturlösung zu und inkubiert bei 37 und 100 Liter Luft/Min. 48 Stunden.
Zur Aufarbeitung wird der gesamte Kolben inhalt durch Einengen im Vakuum auf ein Volumen zwischen 200 bis 500 cm'. gebracht. Dann sechsmal mit 200 cm3 Methylenchlorid extrahiert, über Na triumsulfat getrocknet und auf ein kleines Volumen eingeengt. Ein aliquoter Anteil wird papierchromato- graphisch nach der Methode von Zaffaroni und Mit arbeiter (Science, 111, 6 [1950]) unter Verwendung von Schleicher & Schüll-Papier Nr. 2043 b M ge trennt.
Nach dem Festlegen der Zonen durch UV- Kontakt-Photographie bei 240 my werden die Zonen mit salzsaurem Methanol extrahiert und die Lösun gen im Beckman-Spektrophotometer bei 240 m;cc quantitativ ausgemessen.
Dabei ergeben sich folgende Ausbeuten: d1A-Dien 40% Substanz S 50'% (zurückgewonnen) Da die Rohlösung schlecht kristallisiert, wird sie zur Trockne eingeengt, der Rückstand in wenig Me- thylenchlorid/Äthanol (97 :
3 v/v) gelöst und die Lö sung an einer Säule aus 50g Silikagel chromatogra- phiert. Die Säule wird aus 50 g Silikagel , das mit 50 cm-' 969/oigem Äthanol imprägniert, dann in Me- thylenchlorid : Äthanol (97 : 3 v/v) suspendiert und in das Chromatographierrohr gebracht wurde, her gestellt.
Nach dem Einbringen des Extraktes in die Säule wird mit Methylenchlorid : Äthanol (97 : 3 v/v) eluiert, und es werden Fraktionen von je 50 cm:, aufgefangen. Die Fraktionen 2-5 ergeben 250 mg nicht umgesetzte Substanz S. Aus den Fraktionen 6-10 erhält man 350 mg 1-Dehydro-Substanz S (Z1 1,4 - Pregnadien - 17a, 21 - diol - 3,20 - dion), die nach dem Umkristallisieren aus Aceton bei 228 bis 230 (u. Z.) schmilzt. Die optische Drehung beträgt [a]2 = -E-80 3 (c = 0,521 in Äthanol).
Das IR-Spektrum zeigt die für 41,4_3-Keto- steroide typischen Banden, speziell die für die beiden Doppelbindungen bei 6,15 und 5,23 <I>Beispiel 2</I> Es wird gemäss Beispiel 1 verfahren, aber unter Verwendung einer Nährlösung von 2,8 Liter Lei tungswasser und 200 em3 Nährlösung wie in Bei spiel 1 und Zusatz von 0,8 g Substanz S in 80 cm3 Aceton. Die Inkubationszeit beträgt 3 Tage.
Gemes sene Ausbeute:
EMI0002.0112
d1,4-Dien <SEP> = <SEP> 600/0
<tb> Substanz <SEP> S <SEP> = <SEP> 40 <SEP> 0/0 Aus dem Methylenchloridextrakt kristallisieren nach dem Einengen auf ein kleines Volumen 300 mg Dien-Keton aus, das wie oben aus Aceton umkristal lisiert werden kann.
<I>Beispiel 3</I> Es wird gemäss Beispiel 1 verfahren, aber unter Verwendung einer Abschwemmung eines aus der Luft isolierten grampositiven schleimig wachsenden Sporenbildners, Stamm 582. Gemessene Ausbeute:
EMI0003.0006
41A-Dien <SEP> 600/0
<tb> Substanz <SEP> S <SEP> = <SEP> 40 <SEP> 0/0
<tb> In <SEP> Kristallform <SEP> isoliert: <SEP> 300 <SEP> mg <SEP> Dien. <I>Beispiel 4</I> Es wird gemäss Beispiel 1 verfahren, aber unter Verwendung von 0,80 g Cortison, das in 80 cm3 Aceton gelöst ist. Die Inkubationszeit beträgt 5 Tage.
Erhalten werden 500 mg 1-Dehydro-cortison (41,4- Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion) vom Schmelz punkt 232-233 (u. Z.).
Das IR-Spektrum zeigt u. a. die für 1,4-Dien- ketone typischen Banden bei 6,15 und 6,23 ,u. <I>Beispiel 5</I> Ein Fermentierungskolben wie in Beispiel 1 wird mit 3 1 einer Nährlösung gefüllt, die 2,8 1 Leitungs wasser, 4,5 g Comsteep-liquor, 5,8 g KH2P04 und 9,2g Na,HP04 enthält.
Nach dem Sterilisieren wird der Kolben mit einer Abschwemmung der Kultur eines aus der Luft isolierten grampositiven sporen- bildenden Stäbchens aus der B-subtilis-Gruppe be- impft. Unter Rühren (200 U./Min.) und Einleiten von Luft (100 1/Stunde) lässt man bei 28 etwa 24 Stunden vorwachsen. Dann gibt man 1 g Cortison, in 100 cm3 Aceton gelöst,
unter sterilen Bedingun gen zur Kulturlösung zu und inkubiert etwa 48 Stunden bei 3111 unter Einleiten von Luft (100 1 pro Stunde).
Die Aufarbeitung erfolgt, wie in Beispiel 1, durch Extraktion mit Methylenchlorid. Aus der Methylen- chloridlösung erhält man durch Einengen das 1-De- hydro-cortison.
<I>Beispiel 6</I> Eine wie in Beispiel 1 hergestellte Nährlösung wird mit einer Abschwemmung einer B. subtilis- Kultur beimpft. Dann setzt man eine Lösung von 1 g Cortison in 100 cm3 Aceton zu und bebrütet den Ansatz bei 31 etwa 3 Tage lang (Luft 100 1 pro Stunde).
Nach Aufarbeitung wie in Beispiel 5 erhält man 1-Dehydro-cortison.
<I>Beispiel 7</I> Es wird gemäss Beispiel 5 verfahren unter An wendung von 0,8 g Hydrocortison in 100 cm3 Aceton und einer Bebrütungszeit von etwa 48 Stunden. Nach Extraktion der Kulturlösung wie in Bei spiel 5 und Einengen der Methylenchloridlösung kristallisiert das 1-Dehydro-hydrocortison aus (41.4- Pregnadien-l lss,17 ,21-triol-3,20-dion).
Es schmilzt bei 240-241 NIL) - + l02 (Dioxan). Das IR-Spektrum zeigt u. a. die für 1,4- Dienketone typischen Banden bei 6,16 und 6,23 ,u. <I>Beispiel 8</I> Es wird gemäss Beispiel 6 verfahren unter An wendung von 1,0g Hydrocortison in 100 cm3 Aceton und einer Bebrütungszeit von etwa 3i/2 Tagen. Nach der Aufarbeitung wie in Beispiel 7 erhält man 1-Dehydro-hyd'rocortison.
<I>Beispiel 9</I> Es wird gemäss Beispiel 1 verfahren, aber unter Verwendung von 3 1 Nährboden mit 6 g Hefe extrakt, 4,5 g Comsteep liquor, 5,8g KH2P04 und 9,2g Na2HP04. Nach dem Sterilisieren wird der Fermentierungskolben mit einer Abschwemmung des in Beispiel 3 verwendeten Stamm 582 beimpft. Das Anwachsen wird innerhalb 24-36 Stunden bei 30 unter Rühren (220 U./Min.) und Einleiten von Luft (l00 durchgeführt.
Nach dieser Zeit gibt man 1 g Cortison in 100 cm3 Aceton gelöst, unter sterilen Bedingungen zur Kulturlösung zu und inkubiert bei obigen Bedingungen fünfmal 24 Stun den. Man erhält 701/o, 1-Dehydro-cortison.
<I>Beispiel 10</I> Es wird gemäss Beispiel 9 verfahren, aber unter Verwendung von 3 1 Nährboden mit 30 g Hefe extrakt, 5,8 g KH2P04 und 9,2 g Na2HPO4. Das Steroid (1 g Cortison in 100 cm3 Aceton gelöst) wird sofort nach dem Impfen des Fermentes mit den Bakterien, Stamm 582, zugegeben. Die Inkuba tionszeit betrug 6 Tage, die Inkubationstemperatur 35 C. Man erhält 72% 1-Dehydro-cortison.
<I>Beispiel 11</I> Es wird gemäss Beispiel 9 verfahren, aber unter Verwendung von 3 1 Nährboden mit 6 g Sojamehl, 4,5 g Cornsteep liquor, 5,8g KH.P04 und 9,2 g Na2HP04 und 1 g Hydrocortison, gelöst in 100 cm3 Aceton. Die Inkubationszeit betrug 5 Tage. Gemes sene Ausbeute:
EMI0003.0098
1-Dehydro-hydrocortison <SEP> 41% Hydrocortison <SEP> 44%