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d'-4-3-Ketosteroide haben in der letzten Zeit wegen ihrer therapeutischen
Wirkung besonderes Interesse gefunden. So zeigen das 1-Dehydrocortison (d'-4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion)unddas
1-Dehydrohydrocortison (d'''- Pregnadien - 11(3,17a,21- triol-3,20-dion) gegenüber
den bisher bekannten Nebennierenrindenhormonen erhöhte Wirksamkeit und bessere Verträglichkeit
(Science, 121, 176 [1955]).
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Die Herstellung der genannten Verbindungen auf chemischem Wege ist
wegen der Empfindlichkeit der Dioxyacetonseitenkette schwierig. Bessere Möglichkeiten
bietet die biochemische Dehydrierung von geeigneten Steroiden mit Mikroorganismen.
So berichteten V i s c h e r und W e t t s t e i n (Experientia, IX, 371 [1953]j,
daß Schimmelpilze der Gattung Fusarien j4-3-Ketone der Pregnadienreihe im Ring A
zu 1,4-Dienen dehydrieren, wobei gleichzeitig die Seitenkette abgespalten wird,
wenn am C -Atom 17 neben der Seitenkette ein H -Atom steht. In einer späterenArbeit(Vischer,Meystre,Wettstein,
Helv. Chim. Acta, 38, 835 [1955] konnten die Autoren zeigen, daß Fusarien bei 17a-hydroxylierten
A'-3-Ketonen der Pregnanreihe im Ring A dehydrierend wirken, ohne die Seitenkette
abzuspalten. Auch andere Pilze, die zur Gattung Calonectria, Ophiobolus und Alternaria
gehören, konnten diese Dehydrierung vollziehen, wobei kein Abbau der Seitenkette
stattfindet. Die Autoren beschreiben eine Reihe von so hergestellten d'4-3-Ketosteroiden,
geben aber für ihre Versuche keine Ausbeuten an.
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Auch von anderen Autoren wurde beschrieben, daß durch Schimmelpilze
L14-3-Ketone zu A'4-3-Ketonen -dehydriert werden, wobei aber gleichzeitig die Seitenkette
abgespalten oder der Ringt) in einen Lactonring übergeführt wird (P e t e r s o
n, E p p -stein, Meister, Murray, Leigh, Weint r a u b; R e i n e c k e, Journal
Am. Chem. Soc., 75, 5768 [1953]; Fried, Thoma, Klingsberg, J. Am. Chem. Soc., 75,
5764 [1953]). über die Ausbeuten finden sich in den genannten Arbeiten keine Angaben.
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Es wurde nun gefunden, daß man in guter Ausbeute zu d'& 3-Ketosteroiden
durch mikrobiologische Dehydrierung von . 14-3-Ketosteroiden unter aeroben und submersen
Bedingungen gelangen kann, indem man das z1''-3-Ketosteroid der Einwirkung eines
Bazillus aus der Gruppe der grampositiven aeroben Sporenbildner (vgl. Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology, 6. Auflage, 1948, S. 706, Abschnitt IA), insbesondere
der Einwirkung eines Stammes von Bacillus subtilis unterwirft.
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Wenn man derartige Bazillen unter submersen Bedingungen, unter Schütteln
oder Einleiten von Luft züchtet und nach einer Vorwachszeit von 24 Stunden bis einigen
Tagen eine Lösung eines < 14-3-Ketosteroids in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel
zusetzt und weiter einige Stunden bis einige Tage bebrütet, so findet eine Dehydrierung
des Ringes A statt, und man erhält ,f4-3-Ketosteroide, ohne daß ein Seitenkettenabbau
oder eine andere Veränderung des Moleküls stattfindet.
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So läßt sich z. B. Reichstein's Substanz S (: I4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion)
zu etwa 60% in .l'-4- Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion und ebenso Cortison (I) in
A'4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion (1I) überführen-
Andere Steroide, die ebenfalls mit Bazillen aus der Gruppe der grampositiven aeroben
Sporenbildner zu .-1'4-3-Ketonen dehydriert werden können, sind z. B. Hydrocortison,
I 1-epi-Hydrocortison, Cortison, Cortexon, 17a-Oxy-cortexon, Corticosteron, 11-Dehydro-corticosteron;
-Aldosteron, Progesteron oder 4-Androsten-3,17-dion. An Stelle der. genannten Steroide
können auch Derivate, z..8. Ester, der De-.. hydrierung unterworfen werden.
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Zur Aufarbeitung wird die Fermentationslösung mit einem mit Wasser
nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, z. B. mit Methylenehlorid, Athylenchlorid,
Chloroform, Xther, Essigester, Butyiacetat oder Butanol. Aus der Lösung kann das
Dienketon direkt kristallisiert oder durch chromatographische Adsorption isoliert
werden.
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Zur Prüfung des Verlaufs der Fermentierung, der Aufarbeitung und der
Reinheit der Endprodukte eignet sich besonders die Papierchromatographie. Zur Charakterisierung
kann die Ultraviolett-Absorption und besonders das Infrarotspektrum dienen. 1'4-3-Ketosteroide
zeigen besonders im Bereich von 6,15 und 6,22 E.. charakteristische IR-Absorptionsbanden.
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Beispiel 1 Ein Fermentierungskolben von 51 Inhalt, der mit Rührer,
Lufteinleitungsrohr und einem Zugabestutzen mit Kapsenberg-Verschluß versehen ist,
wird mit 31 einer Nährlösung gefüllt, die im Liter 50 g Dextrose, 20 g Pepfon und
5 g Cornsteep liquor enthält. Außerdem werden 60 ccm einer Lösung zugesetzt, die
10 g Ca(N03)2, 10 g KCI, 5 g KH2P04, 10 g MgS04 71120, 1 g FeS04 und 3 g
MnS04 im Liter enthält. Nach dem Sterilisieren wird der Kolben mit einer Abschwemmung
eines aus der Luft isolierten grampositiven sporenbildenden Stäbchens aus der B.
subtilis-Gruppe »Stamm 547« beimpft. Das Anwachen wird innerhalb 48 Stunden bei
28°C unter Rühren (200 Umdr./Min.) und Einleiten von Luft (2501 /Stunde) durchgeführt.
Nach dieser Zeit gibt man 1 g Reichsteins Substanz S, in 100 ccm Acet@_i
gelöst, unter
sterilen Bedingungen zur Kulturlösung zu und inkubiert
bei 37°C und 1001 Luft/Min. 48 Stunden.
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Zur Aufarbeitung wird der gesamte Kolbeninhalt durch Einengen im Vakuum
aufein Volumen zwischen 200 bis 500 ccm gebracht, dann 6mal mit 200 ccm Methylenchlorid
extrabiert, über Natriumsulfat getrocknet und auf ein kleines Volumen. eingeengt.
Ein aliquoter Anteil wird papierchromatographisch nach der Methode von Z a f f a
r o n i und Mitarbeiter (Scienoe, 111, 6 [1950]) unter Verwendung von Schleicher
& Schüll-Papier Nr. 2043 b M getrennt. Nach dem Festlegen der Zonen durch UV-Kontakt-Photographie
bei 240 ml. werden die Zonen mit salzsaurem Methanol extrahiert und die Lösungen
im Beckmann-Spektrophotometer bei 240 ml quantitativ ausgemessen. Dabei ergeben
sich folgende Ausbeuten: 1,4-Dien 40%,r Substanz S 50°/a (zurückgewonnen).
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Da die Rohlösung schlecht kristallisiert, wird sie zur Trockene
eingeengt, der Rückstand in wenig Methylenchlorid-Athanol (97: 3 v/v) gelöst
und die Lösung an einer Säule aus 50 g Silicagel chromatographiert. Die Säule wird
aus 50 g Silicagel, das mit 50 ccm W%igemAthanol imprägniert, dann in Methylenchlorid-Athanol
(97:3 y7"v) suspendiert und in das Chromatographierrohr gebracht wurde, hergestellt.
Nach dem Einbringen. des Extraktes in die Säule wird mit Methylenchlorid- Athanol
(97: 3 v/v) eluiert, und es werden Fraktionen von je 50 ccm aufgefangen. Die Fraktionen
2 his 5 ergeben 250 mg nicht umgesetzte Substanz S. Aus den Fraktionen 6 bis 10
erhält man 350 mg Kristalle von .-fl-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion, die nach
dem Umkristallisieren aus Aceton bei 228 bis 230C (Zersetzung) schmelzen. Die optische
Drehung beträgt: [a]ö _ + 80 ± 3° (c = 0,521 in Athanol).
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Das IR-Spektrum zeigt die für _h"`-3-Ketosteroide typischen Banden,
speziell die fier die beiden Doppelbindungen bei 6,15 und 6.23,u. Beispiel 2 Es
wird gemäß Beispiel l verfahren,, aber unter Verwendung einer Nährlösung von 2,81
Leitungswasser und 200 ccm Nährlösung wie im Beispiel 1 und Zusatz von 0,8 g Substanz
S in 80 ccm Aceton. Die Inkubationszeit beträgt 3 Tage. Gemessene Ausbeute: 1,4-Dien
60°/Q, Substanz S 4eä (zurückgewonnen).
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Ausdem Methylenchloridextrakt kristallisieren nach dem Einengen auf
ein kleines Volumen 300 g Dienketon aus, das wie oben aus Aceton umkristallisiert
werden kann. Beispiel 3 Es wird gemäß Beispiel l verfahren, aber unter Verwendung
einer Abschwemmung eines aus der Luft isolierten grampositiven schleimig wachsenden
Sporenbildners »Stamm 582«. Gemessene Ausbeute: 1,4-Dien 60%, Substanz S 40°a (zurückgewonnen).
In Kristallform isoliert: 300 mg Dien. Beispiel 4 Es wird gemäß Beispiell
verfahren, aber unter Verwendung von 0,80g Cortison, das in 80 ccm Aceton gelöst
ist. Die Inkubationszeit beträgt 5 Tage. Erhalten werden 500 mg 1-Dehydra-cortison
(_ 114-Pregnadien-17t421-diol-3,11,20-trion) vom Schmelzpunkt 232 bis 233°C (Zersetzung).
Däs IR-Spektrum zeigt unter anderem die für 1,4-Dien-ketone typischen Banden bei
6,15 und 6,23 I.
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Nach längerem Stehenlassen kristallisiert aus der Mutterlauge eine
weitere Substanz aus. Nach dem Umkristallisieren aus Aceton und Essigester erhält
man 150 g eines Kristallisats vom Fp. = 188 bis 190°C; [a] ä5 = + 140° (Aceton).
Beispiel s Ein Fermentierungskolben wie im Beispiel 1 wird mit 31 einer Nährlösung
gefüllt, die 2,81 Leitungswasser, 4,5 g Cornsteepliquor, 5,8 g KH2P04 und 9,2 g
Na2HP04 enthält. Nach dem Sterilisieren wird der Kolben mit einer Abschwemmung der
Kultur eines aus der Luft isolierten grampositiven sporenbildenden Stäbchens aus
der B. subtilis-Gruppe »Stamm 547« beimpft. Unter Rühren (20nUmdr./Min.) und Einleiten
von Luft (1001/Stunde) läßt man bei 28°C etwa 24 Stunden vorwaschen. Dann gibt man
1 g Cortison, in 100 ccm Aceton gelöst, unter sterilen Bedingungen zur Kulturlösung
zu und inkubiert etwa 48 Stunden bei 31°C unter Einleiten von Luft (1001/Stunde).
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Die Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel 1 durch Extraktion mit Methylenchlorid.
Aus der Methylenchloridlösung erhält man durch Einengen das 1-Dehydrocortison. Beispiel
6 Eine wie im Beispie15 hergestellte Nährlösung wird mit einer Abschwemmung einer
B.subtilis-(»Stamm 547«)-Kultur beimpft. Dann setzt man eine Lösung von 1 g Cortison
in 100 ccm Aceton zu und bebrütet den Ansatz bei 31°C etwa 3 Tage lang (Luft 100
I/Stunde).
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Nach Aufarbeitung wie im Beispiel 5 erhält man 1-Dehydrocortison.
Beispiel ? Es wird gemäß Beispie15 verfahren unter Anwendung von 0,8 g Hydrocortison
in 100 ccm. Aceton und einer Bebrütungszeit von etwa 48 Stunden.
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Nach Extraktion der Kulturlösung wie im Beispie15 und Einengen der
Methylenchloridlösung kristallisiert das 1-Dehydro-hydrocortison aus.
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. Es schmilzt bei 240 bis 241'C; [a]" = 102° (Dioxan). Das IR-Spektrum
zeigt unter anderem die für 1,4-Dienketone typischen Banden bei 6,15 und 6,23 #t.
Beispiel 8 Es wird gemäß Beispie16 verfahren unter Anwendung von 1,0 g Hydrocortison
in 100 ccm Aceton und einer Bebrütungszeit von etwa 31/z Tagen. Nach der Aufarbeitung
wie im Beispiel 7 erhält man 1-Dehydro-hydrocortison. .