Verfahren zur Herstellung von Erythromycin B Er,ythromyein ist ein Antibiotikum mit breiter antibakterieller Wirksamkeit, das sich als wirksames therapeutisches Mittel für die Behandlung solcher Krankheiten erwiesen hat, die durch Mikroorganismen verursaclit werden; es wird durch Züchtung des '-Nlikro- organismus Streptomyces erythreus auf künst- liehem Nährboden hergestellt.
Der Mikroorga nismus und die für die Herstellung von Ery- thromycin geeigneten Nährmedien und Gär verfahren sind im amerikanischen Patent Nr. 2<B>653 899</B> ausführlich beschrieben worden.
Es wurde nun gefunden, dass sieh zusam men mit Erythromyein noch ein weiteres, neues Antibiotikum herstellen lässt. Das neue Antibiotikum wurde von seinen Entdeckern als Erythromyeln B bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ilerstellung von Erythromy- ein B, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Erythromycin B erzeugenden Stamm von Streptomyees erythreus, vorzugs weise unter submersen aeroben Bedingungen, in einem Nährmedium züchtet, das assimilier- bare Kohlenhydrate, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält,
dass man dann das Myeel aus dem Nährmedium entfernt, alle entstandenen antibiotisch wirksamen Stoffe ausdem Medium isoliert, zweckmässig mittels mit Wasser nicht mischbaren polaren Lösungs mitteln und anschliessender Entfernung des Lösungsmittels und das Erythromycin B vom mitentstandenen Erythromycin abtrennt.
Ery- thromycin B lässt sich von Erythromycin zum Beispiel durch Verfahren abtrennen, bei denen die verschiedenen Lösliehkeiten oder die unterschiedlichen Adsorptionseigenschal- ten der beiden Stoffe ausgenutzt werden, z. B. dureli Adsorption und anschliessende selektive Auswaschung oder durch Gegenstromvertei- lung unter Verwendung mehrerer miteinander nicht mischbarer Lösungsmittel in einer Ex traktionsanlage mit einer Vielzahl von Röh ren.
Die neue stickstoffhaltige Base Erythro- mycin B besitzt folgende Eigenschaften: Bei Titration in einer Lösung von DimethyMorm- amid in Wasser im Verhältnis 2:<B>1</B> ein pK'o, -von etwa<B>8,5;</B> nach den Titrationsdaten ein Molekulargewicht von etwa<B>736;
</B> und in Chloroformlösung mit einer Konzentration von etwa<B>6,0</B> Gewichtsvolumenprozent fol gende unterscheidbaren Absorptionsmaxima in einem lii.frarot-Absorptionsspektrum im Be reich zwischen 2,4 und 12,0 u:<B>2,80;</B> 3,34; <B>5,80; 5,90;</B> 6,84; 7,24;<B>7,50; 7,79;</B> 8,04; 8,54-, <B>8,98;</B> 9,14; 9,48;<B>9,86;</B> 10,24;<B>10,56;</B> 10,96,'; 11,22; 11,54 und 11,94.
Erythromycin B besitzt einige dem Ery- t'hromyein ähnliche Eigenschaften, weist<B>je-</B> doch in seiner chemischen Struktur bestimmte deutliche Unterschiede auf, die sich durch Vergleich der Infrarot-Absorptionsspektren von Chloroformlösungen. der beiden Stoffe leicht zeigen lassen (siehe Fig.1 der Zeich nung). Ausserdem zeichnet sich Erythromycin B durch eine grössere Stabilität in stark sau ren Lösungen aus.
Der für das erfindungsgemässe Verfahreh benutzte Aetinomycet gehört nach der Klas- #sifizierung in Bergeys Manual of Determina- tive Baeteriology <B>(6.</B> Ausgabe, Seite<B>938)</B> zur Gattung Streptomyces der Ordnung Aetino- mycetales. Seinen morphologischen Eigen schaften nach scheint der Organismus mit einem von Waksman [Soil Seience <B>8,
</B> 71-214 <B>(1919) ]</B> unter dein Namen Aetinomyces <B>181 </B> beschriebenen Actinomycet, der später von ihm mit Streptomyces erythreus bezeichnet wurde, nahe verwandt zu sein. Die Eigen schaften der Kulturen des -#on 'Waksman be schriebenen und des neuen isolierten Organis mus nach vorliegender Erfindung weisen einige Unterschiede auf. Das neue isolierte Lebewesen<B>,</B> nach vorliegender Erfindung wurde vorläufig als ein Stamm von Strepto- myces erythreus klassifiziert.
Eine der Kul- turensann-nlung des Northern Regional Re- search Laborätory überlassene Kultur des Organismus erhielt dort die Kulturennummer NRRL <B>2338.</B>
Die vorliegende Erfindung wird unter be2 sonderer Bezugnahme auf den obenerwähn- ten Stamm NRRL <B>2338</B> beschrieben.
Es kön- neu jedoch auch andere Erythromycin B er zeugende Stämme von Streptomyces eryth- reus verwendet werden, z.B. solche, die sieh durch bekannte Isolier- lind Stammodifizier- verfahren, z.B. durch Auswahl gezüchteter Organismen sowie Einwirkung von Modifizie- rungsmitteln, wie Röntgenstrahlen, UV-Liellt und dhen-dschen Mitteln, z.
B. Stickstofflost, auf die Organismen, leicht herstellen und iso lieren lassen. Weitere Erythromycin B erzeu gende Stämme sind zum Beispiel die Strepto- myces erythreus-Stämme NRRL <B>2359, 2360</B> und<B>2361.</B>
Als Nährmedium lassen sich verschiedene Medien der angegebenen Art verwenden, da der Organismus in der Lage ist, von verschie- denen Energiequellen zu leben. Bestimmte Nährmedien werden jedoch aus wirtschaft lichen Gründen zur Erzielung höchster Aus beuten und im Hinblick auf die Isolierung der Antibiotika bevorzugt. Bevorzugte Kohlen hydrate sind zum Beispiel Stärke und Glu- kose. Andere C-Quellen sind Rohrzucker, Dex- trin, Melasse.
Zu den bevorzugten Quellen für Stickstoff gehören Maisquellwasser, grobes oder feines Sojabohnenmehl und in Schlempe enthaltene lösliche Stoffe; andere geeignete N-Quellen sind Casein, Aminosäuremischun- gen, Peptone (sowohl von Fleisch wie auch von Soja herrührend). Ebenso können anor ganische Quellen für Stickstoff, wie z. B. Ni trate oder Ammoniumsalze, verwendet werden.
Als anorganische Salze kann man die übli chen Natrium-, Kalium-, Caleium-, Phosphat-, Chlorid-, Suliationen abgebenden Salze ver wenden.
Wie es auch für das Wachstum anderer Mikroorganismen erforderlich ist, werden auch zür Züchtung des erfindungsgemäss eingesetz ten Aetinomyeeten dem Nährmedium vorteil haft die wichtigsten Spurenelemente zugesetzt. Derartige Spurenelemente sind aber gewöhn lich schon als Verunreinigungen in den an dern zugegebenen Bestandteilen des Mediums enthalten.
Zur Erzielung gü4stigsten Wachstums und höchster Entwicklung des Streptomyces eryth- reus, Stamm NRRL <B>2338,</B> wird das Nähr medium vor der Impfung mit dem Organis mus zweckmässig auf einen pH-Wert zwischen <B>6,0</B> und<B>7,5,</B> vorzugsweise etwa<B>6,5,</B> eingestellt.
Man hat beobachtet, dass das Medium wäh rend der Wachstumszeit des Organismus und der Herstellung der Antibiotika allmählich alkalisch wird und eine Alkalinität von etwa pH <B>7,2</B> bis etwa<B>8,5</B> oder mehr erreichen kann, wobei der endgÜltige pH-Wert mindestens teil weise vom Anlangs-pH-'#Vert des Mediums, den im Medium anwesenden Puffersubstanzen und der Waehstumszeit des Organismus ab hängt.
Wie bei der Erzeugung grösserer Mengen anderer Antibiotika bevorzugt man es auch für die Gewinnung grosser Mengen Erythro- inyeln B, die Kulturen unter submersen aero- ben Bedingungen zu züchten. Zur Herstellung begrenzter Mengen dieser Stoffe kann man Schüttelkolben verwenden oder Oberflächen kulturen in Flaschen züchten.
Bei Züchtung von Submerskulturen in grossen Behältern ist es bekanntlich vorteilhaft, zum Impfen die vegetative Form des Organismus zu verwen den, um die Bildung des Antibiotikums zu beschleunigen und dadurch die Anlage mög lichst gut auszunutzen. Deslialb ist es zweek- mässig, zuerst einen vegetativen Impfstoff des Organismus herzustellen, indem man eine ver hältnismässig kleine Menge Nährmedium mit der Sporenform des Organismus impft und nach Bildung des frischen aktiven Impfstof fes diesen aseptisch in die grossen Behälter einführt.
Das Nährmedium, in dem der vege tative Impfstoff hergestellt wird, kann das gleiche wie das für die Herstellung des Anti biotikums verwendete oder ein anderes sein.
Streptomyces erythreus, Stamm NRRL <B>2338,</B> lässt sich gut bei Temperaturen zwischen etwa<B>25</B> und<B>370 C</B> züchten. Die höchsten Aus beuten des Antibiotikums erhält man, wenn man das Nährmedium auf etwa 26-3011 <B>C</B> hält.
Bei der Herstellung von Antibiotika unter submersen aeroben Bedingungen ist es üblich, sterile Luft durch das Nährmedium zu blasen. Vorzugsweise beträgt das Volumen der für die Bildung von Erythromycin und Erythro- inye,in B eingeleiteten Luft über<B>0,1</B> Raumteil Luft in der Minute<B>je</B> Ratunteil des Nähr mediums. Das Wachstum und die Bildung des Antibiotikums sind noch besser, wenn minde stens 0,4 Raumteile Luft auf<B>1</B> Raumteil des Kulturmediums durchgeleitet werden.
Die Entstehungsgeschwindigkeit und die Konzentration der antibiotisclien Wirkstoffe im Nährmedium lässt sich während der Wachs tumszeit des Mikroorganismus leicht verfolgen, wenn man Proben des Mediums auf ihre anti biotische Wirksamkeit gegenüber Organismen prüft, von denen man weiss, dass sie auf'das Antibiotikum reagieren, z.
B. von Staphylo- coccus aureus und Myobacterium tubereulosis. Für diese Untersuchungen empfiehlt es sich, derart vorzugehen, dass man Proben der Kul tur fortschreitend immer mehr verdünnt, be stimmte Mengen der so verdünnten Proben einem geschmolzenen Nähragar zusetzt, dann diesen Agar in einer Petrischale erstarren lässt, mit einer frischen Kultur des<B>S.</B> aureus oder M.
tubdreulosis impft und diejenige stärkste Verdünnung des Nährmediums der Kultur feststellt, bei der das Wachstum des Organismus auf dem Agar-Nährboden noch gänzlich gehemmt wird.
Die Bildung der Antibiotika kann auch mittels turbidimetrischer Prüfung kontrolliert werden, wie sie auch, bei der Herstellung an derer Antibiotika durchgeführt wird.
Die Anwesenheit von Erythromyein B und Erythromycin lässt sich durch ehromatogra- phische Verfahren bestimmen. So löst man etwa 0,2 bis<B>0,5 y</B> der zu untersuchenden Probe in einer kleinen Menge eines Lösungsmittels, z. B. in Alkohol, bringt einen Tropfen der konzentrierten Lösung auf ein Ende eines Streifens Filterpapier, trocknet den entstehen den Fleck und entwickelt ihn nach dem übli chen papierehromatographischen Verfahren.
Zu den Lösungsmitteln, die zur Entwick lung des, Papierstreif ens, das heisst zum Aus- einanderziehen der Adsorptionszonen dienen können, gehören:<B>1 : 99</B> (V/V) Ammonium- hydroxydlösung; destilliertes, mit Methyliso- butylketon gesättigtes Wasser;
destilliertes, mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser mit Zusatz von 2 11/o (V/V) Piperidin; <B>0,1</B> mole kulare, mit Methylisobutylketon gesättigte Bo- ratpullerlösung mit einem pH-Wert von<B>9,9;</B> <B>0,15</B> n mit, Methylisobutylketon gesättigte Na tronlauge;<B>0,1</B> molekulare saure Kaliumphos- phat-Pufferlösung mit<B>3</B> Volumenprozent Äthanol.
Die Entwicklungsdauer ist etwa 4 bis<B>5</B> Stunden oder so lange, bis die Lösungs- mittelfront das Ende des. Streifens erreicht. Nach der Entwicklung stellt man die Lage der antibiotischen Substanz auf dem Streifen mit einem Bioautogramm fest.
Hierbei legt man den entwickelten Filterpapierstreifen auf die Oberfläche eines etwa<B>3</B> mm dicken, in einer grossen Glasschale befindlichen Agar- Nährbodens, den man durch Impfen eines war- men sterilen Agar-Nährmediums mit Baeillus subtilis hergestellt hat. Das Antibiotikum dringt vom Papier aus in das Agarmedium ein.
Nach<B>10</B> Minuten wird der Papierstreifen entfernt, die Schale gekippt und die Lage des Filterpapierstreifens sowie der Lösungsmittel- front, und die Stelle, an der die Versuchs lösung aufgetragen wurde, direkt aussen auf der Unterseite der Glassehale vermerkt. Das Agar-Medium wird über Nacht bei etwa<B>371 C</B> in umgekehrter Lage bebrütet. Das Auftreten klarer Zonen im Medium, das heisst von Strei fen, die frei von bakteriellem Wachstum sind, zeigt die Lage der antibiotischen Substanz entsprechend deren Verteilung auf dem Fil terpapier an.
Durch Messen der vom Anti biotikum und vom Lösungsmittel zurückgeleg ten Wege bestimmt man den Ri--Wert, das heisst das Verhältnis der Wanderungsgeschwin digkeit des Antibiotiktims zu der des Lösungs mittels. Es wurde gefunden, dass sieh Erythro- mycin B bei diesem Versuch weniger schnell bewegt als Erythromyein. Bei Anwesenheit einer Mischung von Erythromycin B und Erythromycin erscheinen im Bioautogramm zwei klare Zonen;
ist jedoch nur eine Zone frei von Bakterienwachstum, so kann man durch Vergleich der Lage dieser Zone mit der Lage einer -unter genau denselben Bedin gungen mit reinem Erythromycin B oder Erythromycin erhaltenen Zone feststellen, welches der beiden Antibiotika vorhanden ist.
Unter günstigen Bedingungen beträgt der Ri- Wert von Erythromycin B etwa drei Viertel desjenigen von Erythromycin. - Fig. 2 der Zeichnung zeigt ein mit einem Papierehromatogramm hergestelltes Bioauto- gramm, auf dein gleichzeitig Erythromycin B,
Erytliromycin und eine Mischung aus an nähernd gleichen Mengen Erythromycin und Erythromvein B chromatographiert -wurden. Für die Entwicklung, das heisst die Zonen trennung, benutzte man hierbei als Löstings- mittel eine <B>1</B> %ige wässrige Lösung vo Ü kon- zentriertem Anunoni-Lunhydroxyd,
die mit Me- thylisohlitylketon gesättigt war. Die sc'hwar- zen Flächen bedeuten Zonen, in denen keiner lei bakterielles Wachstum auftrat. Im allgemeinen ist die gesamte antibio tische Wirksamkeit bei subinersen aeroben .Kulturen innerhalb von etwa<B>2-5</B> Tagen nach Impfung des Nährinediums am grössten, bei Oberflächen- oder Schüttelkulturen erst innerhalb von etwa<B>5-10</B> Tagen.
Gewöhnlich entstehen im Nährmedium an nähernd gleiche Mengen Erythromycin und Erythromycin B; dieses Verhältnis hängt<B>je-</B> doch von der Dauer der Fermentationszeit ab. E:-ärzere Wachstumszeiten, etwa von<B>1</B> oder 2 Tagen, begünstigen die überwiegende Bildung von Erythromyein B. Eine Verlängerung der Ferinentationszeit führt zu -einer relativen Verminderung der Erythromycin-B-Menge im Vergleich zu der des Erythromycins und kann sogar einen absoluten Rückgang der Menge des im Nährmedium anfänglich vorhandenen Erythromycins B verursachen.
Der Grund Tür diese relative oder absolute Abnahme ist nicht bekannt.
Die in der Kultur des S.-erythreus-Stam- mes NRRL <B>2338</B> entstehenden Antibiotika las sen sich durch Extraktions- oder Adsorptions- verfahren aus dem Nährinediuni isolieren. Hierbei werden die erstgenannten Verfahren deshalb bevorzugt, weil sie schneller und bil liger sind. Für die Extraktion der Antibiotika aus dem Nährmedium der Kultur werden mit Wasser nicht mischbare, polare organische Lösungsmittel bevorzugt, z.
B. Fettsäurealkyl- ester, wie Äthyl- und Amylaeetat; chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform und Di- chloräthylen; Alkohole mit geringer Wasser löslichkeit, wie Butanol und Amylalkohol; Ketone mit geringer Wasserlöslichkeit, wie Methylamylketon;
Lind andere Verbindungen, wie Äthyläther und Dibutyläther. Vorzugs weise wird die filtrierte Nährbrühe vor der Extraktion auf einei# pil-Wert von etwa<B>9,5</B> oder höher eingestellt.
Das Erythromycin B lässt sich leicht von, dem Erythromycin unter Ausnutzung der unterschiedlichen Löslichkeit und Adsorp- tionseigenschaften der beiden Verbindungen abtrennen.
So wird zum Beispiel Erythro- mycin B auf Cellulose stärker als Erythro- i mycin adsorbiert. Deshalb erscheint bei Ad- sorption einer Mischung von Erythromyein und Erythromycin B aus deren gemeinsamer Lösung auf einer Säule aus Cellulose und Aus waschung dieser Säule mit einem geeigneten Lösungsmittel das, Erythromyein bereits im, ersten Waschwasser,
während Erythromycin B auf der Säule bleibt und erst bei längerem Auswaschen gewonnen wird. Man kann die beiden Verbindungen auch durch selektive Extraktionsverfahren in einer Gegenstrom anlage trennen.- <I>Beispiel<B>1</B></I> Eine Sporen enthaltende Kultur von Streptomyees erythreus, Stamm NRRL <B>2338,</B> wird hergestellt, indem man den Organismus auf einem Agar-Schrägnährboden folgender Zusammensetzung Achtet:
Dextrin <B>15 g</B> Trypton <B>5 g</B> Agar 20<B>g</B> Betain 0,5 <B>g</B> Gelöste Mineralmischung* 2 ems Wasser zur Auffüllung auf<B>1</B> Liter *Diese Mineralmischung enthält folgende Bestandteile:
K2HP04 100,0 <B><I>g</I></B> NaC1 100,0 <B>g</B> M9S04 100,0 <B><I>g</I></B> FeS04'7 H20 2,0<B>g</B> ZnS04-7 11,0 1,0- <B><I>g</I></B> CUS04.5 H20<B>0,5 g</B> MnC12'4 H,0 0,5 <B>g</B> C0C12 <B>* 6</B> H20 <B>0,1 g</B> CaC12 40,0<B>g</B> Wasser zur Auffüllung auf<B>1</B> Liter.
Der Schrägnährboden wird<B>10</B> Tage lang bei<B>330 C</B> bebrütet. Man gewinnt die Sporen in Form einer wässrigen Suspension, indem man den Schrägnährboden mit einer kleinen Menge sterilen destillierten Wassers bedeckt und die Sporen vorsichtig von der Oberfläche des Nährbodens abschabt.
Etwa<B>1</B> cm,% der auf diese Weise erhaltenen Sporensuspension verwendet man zur Imp fung des folgenden sterilisierten Nährmediums unter sterilen Bedingungen: Caseinhydrolysat <B>1 g</B> < N-Z-Amin <B>A ,</B> von Sbeffield Farms erhalten) Blacksträp -Melasse 2<B>g</B> K21-I-PO4 0,15 <B>g</B> Wasser<B>100</B> CM3 Das geimpfte Nährmedium -wird etwa<B>72</B> Stunden lang bei etwa 2811 <B>C</B> bebrütet, bis gute vegetative Entwicklung zu beobachten ist.
Etwa<B>5</B> ems des die vegetative Form des Organismus enthaltenden Nährmediums be nutzt man zur Impfung eines<B>250</B> em3 lassen den Erlenmeyerkolbens, der etwa<B>75</B> em3 eines sterilisierten Gärmediums folgender Zusam mensetzung enthält:
Rohrzucker 45<B>g</B> Sojabohnenmehl 20<B>g</B> Aus kondensierter Melasse- schlempe gewonnene lös- liehe Stoffe 2<B>g</B> Natriumchlorid <B>5 g</B> Caleiumearbonat 2<B>g</B> Cobal.tochloridhexahydrat 0,
001 <B>g</B> Wasser zur Auffüllung auf<B>1</B> Liter Der Kolben mit dem geimpften Nähr medium wird in einen auf etwa<B>280 0</B> gehal tenen Brutraum gestellt und sechs Tage lang auf einer sich drehenden Schüttelvorriehtung mit einem Schüttelhub von etwa<B>5</B> cm und einer Geschwindigkeit von 240 Umdrehungen in der Minute geschüttelt. Von Zeit zu Zeit werden Proben des Nährmediums auf die Ge samtmenge der darin enthaltenen autibioti- sehen Wirkstoffe untersucht. Erreicht deren Menge einen Wert von etwa<B>250-300</B> j/eins der Brühe, so filtriert man diese zur Entfer nung des Mycels.
Etwa 11/9 Liter der filtrierten Kulturbrühe werden mit Natronlauge auf einen pH-Wert von<B>9,5</B> gebracht lind mit<B>0,75</B> Liter Amyl- aeetat ausgezogen. Der Ainylacetatextrakt, in dem praktisch alle in der ursprünglielien Gär brühe vorhandenen autibiotischen Wirkstoffe enthalten sind, wird duteli Vakuumeindamp- fung auf ein Volumen von etwa<B>10</B> eins ein geengt.
Der konzentrierten Amylacetatlösung setzt man<B>0,5 g</B> gereinigte Cellulosefasern zu und trocknet die Misehung über Nacht im Va- ku-Lun. Die trockene, feinpulverige Cellulose, auf der alle antibiotischen Wirkstoffe der Brühe absorbiert sind, wird auf die Oberseite einer etwa<B>3,2</B> X<B>38</B> cm messenden ehromato- graphischen Adsorptionssäule gelegt,
die etwa <B>161 g</B> trockene gereinigte Celluloselasern (im Handel -unter derMarkenbezeichnung Solka - Flocken zu haben) enthält. Es wird mit 0,1- prozentiger, -wässriger, mit Methylisobutyl- keton gesättigter Ammoniumhydroxydlösung ehromatographiert. Das Eluat wird in Frak tionen gesammelt,
die auf ihre antibiotische Wirksamkeit gegen<B>S.</B> aureus als Prüforga- nismus untersucht werden. Die Anwesenheit von Erythroinyein und/oder Erythromycin, B wird unter Verwendung des gleichen Lösungs- mittelsystems wie oben durch ehromatogra- phisc'he Analyse mit Filterpapier bestimmt.
Dabei zeigt sich, dass die ersten 120 em3 der Auswaschflüssigkeit nur Erythromycin, die zweiten 120 eins jedoch eine Mischung aus Erythromycin und Erythromycin B enthal ten. Die folgenden aktiven Eluatfraktionen enthalten nur Erythromycin B; diese werden vereinigt und mit Chloroform ausgezogen.
Der Chloroformauszug wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, und der nur aus Ery- throinycin B bestehende Rückstand wird mit Hexan gewaschen und in<B>25</B> ein3 Äther auf genommen. Die ätherische Lösung wird fil triert und im Vakuum zur Trockne einge dampft. Den Rückstand löst man in einer möglichst kleinen Menge warmen Acetons und lässt abkühlen, wobei sich Kristalle des Ery- thromycins B abscheiden.
Dieses kristalline Antibiotikum enthält (ebenso wie das Ery- thromycin) eine bestimmte Menge gebundenes Lösungsmittel. Entfernt man dieses Lösungs mittel, so hat dies den Verlust der kristallinen Eigenschaften des Antibiotikums zur Folge.
<B>. -</B><I>Beispiel<B>-0</B></I> Man stellt ein sterilisiertes Nährmedium her, das folgende Bestandteile enthält: Dextrose 15 <B>g</B> Sojabohnenmehl 15 <B>g</B> Maisieststoffe, ( cornsteep solids ) <B>5,0 g</B> Caleiumearbonat 2,0<B>g</B> Natriumehlorid <B>5,0 g</B> Wasser zur Auffüllung auf<B>1</B> Liter Das Nährmedium wird mit einer Sporen- suspension geimpft, die man herstellt, indem man Streptomyces erythreus, Stamm NRRL <B>2338,
</B> nach dem in Beispiel<B>1</B> beschriebenen Verfahren auf einem Agar-Schrägnälirboden züchtet und die Sporen zusammen mit einer kleinen Menge sterilen destillierten Wassers abschabt. Das in einer 2-Liter-Flasche befind- liehe geimpfte Nährinedium wird etwa<B>26</B> Stunden lang bei etwa 280<B>C</B> unter Schütteln der Flasche in einer sieh hin und her bewe genden Schüttelvorrichtung mit einem Aus schlag von<B>5</B> ein und einer Geschwindigkeit von 114 vollständigen Ausschlägen in der Mi- nutA bebrütet.
Das erhaltene vegetative Mycel wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und in etwa<B>1</B> Liter ste rilem destilliertem Wasser erneut suspendiert. Der auf diese Weise hergestellte Impfstoff wird zur Impfung eines 40 Liter fassenden Gürgefässes verwendet, das etwa 20 Liter einer sterilisierten Gärbrühe von folgender Zusam mensetzung enthält:
Glykokoll <B>150 g</B> Rohrzucker<B>1370<I>g</I></B> dl-a-Alanin <B>17,8<I>g</I></B> Primäres Natriumphosphat <B>100 g</B> Natriunichlorid 100 <B>g</B> Magnesiumsulfat 10 <B>g</B> Ferrosullat-heptahydrat 0,4<B><I>g</I></B> Zinksuliat-heptahydrat 0,2<B>g</B> Magnesiumchlorid-tetrahydrat <B>0,032 g</B> Cobaltochlorid-hexahydrat 0,2<B>g</B> Wasser zur Auffüllung auf 20 Liter Die Mischung aus anorganischen Salzen,
Glykokoll und dl-a-Alanin -wird zusammen sterilisiert und der pH-Wert der Brühe nach aer Sterilisation auf etwa<B>7,5</B> eingestellt. Der Rohrzucker wird getrennt sterilisiert und der sterilisierten Brühe aseptisch zugesetzt.
Nach Abkühlung der sterilisierten Brühe setzt man den nach dem oben beschriebenen Verfahren vegetativ hergestellten Impfstoff aseptisch zu. Der Organismus wird in der Brühe etwa vier Tage lang bei einer Tem peratur von etwa<B>280 C</B> gezüchtet. Während der Wachstumszeit wird die Brühe gerührt und sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa<B>0,5</B> Raumteilen auf<B>1</B> Raumteil Brühe in der Minute hindurchgeblasen.
Mikrobiolo gische Versuche mit<B>S.</B> aureus als Versuchs organismus zeigen, dass der Gesamtgehalt an antibiotischen Wirkstoffen in der Brühe zu letzt etwa<B>250</B> y/ems beträgt, wovon etwa <B>50</B> % aus Erythromycin B bestehen, wie sich durch Papierehromatographie und Bioauto- gramm beweisen lässt. Die Brühe wird zur Entfernung des Mycels filtriert,
und aus dem klaren Filtrat lässt sieh nunmehr Erythromy- ein B gewinnen.
11/2 Liter der so erhaltenen filtrierten Erythromyein und Eryth r*omycin B enthalten den Nährbrühe werden mit wässriger Natron lauge auf einen pH7Wert von<B>9,5</B> eingestellt und mit etwa<B>0,75</B> Liter Amylacetat ausgezo gen. Der Amylacetat-Extrakt wird im Va kuum zur Trockne eingedampft. Der Ver- dampfungsrückstand wird in etwa<B>250</B> ems Chloroform aufgenommen, filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Nun wird ein Lösungsmittelsystem hergestellt, indem man 20 Teile Methylisobutylketon, 20 Teile einer<B>0,1</B> molekularen Phosphatpufferlösung mit einem pu-Wert von<B>6,5</B> und<B>1</B> Teil Ace ton miteinander mischt. Lässt man diese Mischung stehen, so bildet sieh ein Zwei- schichtensystem, das man in eine ganz aus Glas bestehende, 200 cm.3 fassende 60röhrige Craig-Gegenstroin-Extraktionsanlage gibt.
Der Verdampfungsrüekstand des Chloroformex- traktes wird in<B>10</B> em3 der obern Phase gelöst und in die erste Röhre der Extraktionsanlage gegeben. Nun wird in üblicher Weise im Ge genstrom extrahiert. Die Fraktionen werden wieder papierehromatographisch und mikro- biologisch unter Verwendung von<B>S.</B> aure-Lis als Versuchsorganismus analysiert. Dabei zeigt sieh, dass die Fraktionen Nr. 27-40 nur Ery- t,hromycin B enthalten.
Diese Fraktionen wer den vereinigt und im Vakuum bis auf<B>130</B> ems eingedampft. Diese Rückstandslösung wird auf<B>10</B> % Natriumehloridgehalt aufgefüllt, mit verdünnter Natronlauge auf den pH-Wert <B>9,8</B> eingestellt und zweimal mit<B>je 75</B> em3 Chloro form ausgezogen. Die vereinigten Chloroform- extrakte werden über wasserfreiem Natrium sulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Den Verdampfungsrückstand löst man bei 470<B>C</B> in möglichst wenig Aceton auf, lässt langsam abkühlen und gewinnt kri stallines Erythromycin B aus der Lösung.
Das auf diese Weise gewonnene Erythro- mycin B schmolz bei<B>190</B> bis<B>1910 C</B> auf der Kofler-Heizbank. Die Elementaranalyse einer drei Stunden lang bei 6011 <B>C</B> im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrockneten Probe ergab folgende Werte: 61,541/o C; 9,45% H;
2,0% N und (als Differenzwert) 28,01 1/o 0.
Die elektrometrische Titration in 66%iger wässriger Dimethyliormamidlös-Luig zeigte die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe mit einem PK'a von<B>8,5</B> an.
Das nach den Titrationsdaten ermittelte Molekulargewicht beträgt etwa<B>736.</B>
Das UV-Absorptionsspektrum des in abso lutem Methanol gelösten Erythromycins B zeigte ein Maximum bei<B>286</B> mu, ein Minimum bei<B>259</B> niu und E"", <B>= 59.</B>
Eine mikrobiologisehe Prüfung mit<B>S.</B> au- reus als Versuchsorganismus zeigt, dass ein Milligramin Erythromyein B die. gleiche anti biotische Wirksamkeit wie etwa<B>750 y</B> Ery- thromycin hat.
Das Infrar-ot-Absorptionsspektrum einer 60/Gi,gen Lösung von Erythromycin B in Chloroform, auf Gewichts-Volumen-Grund- lage, hat zwischen 2,4 und 12 u folgende un terscheidbare Absorptionsmaxima:<B>2,50;</B> 3,34; <B>5,80;</B> 6,84; 7,24;<B>7,50;</B> 8,04; 8,54;<B>8,98;</B> 9,14; 9,48;<B>9,86;</B> 10,24;<B>10,56; 10,96;</B> 11,22; 11,54 und 11,94. In Fig. <B>1</B> der Zeichnung wird diese Infrarot-Absorptionskurve durch die ausgezo gene Linie dargestellt.
Stellt. man gleichzeitig Chromatogramme von Erythrömycin B und Erythromycin un ter Verwendung von ammoniakalischem, mit Methylisobutylketon gesättigtem destilliertem Wasser als Entwieklungs-Lösungsmittel auf Filterpapierstreifen her, so ist das Verhältnis der Geseliwindigkeiten, mit denen sich die bei den Antibiotika bewegen, folgendes:
EMI0008.0009
Erythromycin B ist in saurer Lösung viel beständiger als Erythromycin. Wenn man wässrige Lösungen mit<B>je</B> etwa<B>38</B> Einheiten Erythronlycin B -Lind Erythromycin im ein2 auf verschiedene- p]I-Werte einstellt und<B>j</B> edes- mal eine Stunde lang bei etwa<B>250</B> C stellen lässt,
zeigendie Lösmigen von Erythromycin B eine viel grössere Beständigkeit gegenüber Säuren.
Die Säureanlagerungssalze von Erythro- mycin B lassen sich herstellen, indem man eine wässrige Lösung der Erythromycin-B-Base mit einer äquivalenten Menge einer Säure behan delt und die Lösung im Vakuum zur Trockne eindampft. Man kann auch die Lösung der Erythromycin-B-Base in einem organischen Lösungsmittel mit einer Säure oder deren Lö sung behandeln; das Erythromycinsalz fällt dann direkt aus der Lösung aus.
Bei der Her stellung von Säureanlagerungssalzen starker Säuren ist darauf zu achten, dass nicht wÄh- rend der Anlagerung der Säure an das Anti- biotik-Lun örtlich zu hohe Konzentrationen der Säure auftreten, da sieh ein Teil des Erythro- mycins B zersetzen kann, wenn der pH-Wert geraume Zeit unter etwa 2 sinkt.
Geeignete Erythromycin-B-Salze sind das Hydrochlorid, SuHat, Citrat, Mandelat, Succinat, Oleat, Palmitat, Myristat, Stearat, Oxalat, Thio- cyanat und G,1-ticoheptonat. Weitere ähnliche Salze lassen sich nach den obenerwähnten Verfahren leicht herstellen. Für therapeu tische Zwecke sollten die verhältnismässig un giftigen Salze ausgewählt werden.
Das Hydro- chlorid des Erythromyeins B zum Beispiel wird hergestellt, indem man eine Lösung von Erythromycin B in Äthanol mit einer äqui valenten Menge wässriger Salzsäure behandelt und die Lösung unter Abscheidung des festen Salzes im Vakuum zur Trockne- eindampft. Das Salz wird durch Umkristallisation aus einer Mischung von Äthanol und Aceton ge reinigt.
Das Erythromycin B und seine Salze sind wirksame Antibiotika, die unter Berücksichti gung des erhöhten Molekulargewichtes der Salze etwa dieselbe breite antibakterielle Wirk samkeit -wie Erythromycin besitzen.