Verfahren zur Herstellung von Erythromycin B Er,ythromyein ist ein Antibiotikum mit breiter antibakterieller Wirksamkeit, das sich als wirksames therapeutisches Mittel für die Behandlung solcher Krankheiten erwiesen hat, die durch Mikroorganismen verursaclit werden; es wird durch Züchtung des '-Nlikro- organismus Streptomyces erythreus auf künst- liehem Nährboden hergestellt.
Der Mikroorga nismus und die für die Herstellung von Ery- thromycin geeigneten Nährmedien und Gär verfahren sind im amerikanischen Patent Nr. 2<B>653 899</B> ausführlich beschrieben worden.
Es wurde nun gefunden, dass sieh zusam men mit Erythromyein noch ein weiteres, neues Antibiotikum herstellen lässt. Das neue Antibiotikum wurde von seinen Entdeckern als Erythromyeln B bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ilerstellung von Erythromy- ein B, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Erythromycin B erzeugenden Stamm von Streptomyees erythreus, vorzugs weise unter submersen aeroben Bedingungen, in einem Nährmedium züchtet, das assimilier- bare Kohlenhydrate, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält,
dass man dann das Myeel aus dem Nährmedium entfernt, alle entstandenen antibiotisch wirksamen Stoffe ausdem Medium isoliert, zweckmässig mittels mit Wasser nicht mischbaren polaren Lösungs mitteln und anschliessender Entfernung des Lösungsmittels und das Erythromycin B vom mitentstandenen Erythromycin abtrennt.
Ery- thromycin B lässt sich von Erythromycin zum Beispiel durch Verfahren abtrennen, bei denen die verschiedenen Lösliehkeiten oder die unterschiedlichen Adsorptionseigenschal- ten der beiden Stoffe ausgenutzt werden, z. B. dureli Adsorption und anschliessende selektive Auswaschung oder durch Gegenstromvertei- lung unter Verwendung mehrerer miteinander nicht mischbarer Lösungsmittel in einer Ex traktionsanlage mit einer Vielzahl von Röh ren.
Die neue stickstoffhaltige Base Erythro- mycin B besitzt folgende Eigenschaften: Bei Titration in einer Lösung von DimethyMorm- amid in Wasser im Verhältnis 2:<B>1</B> ein pK'o, -von etwa<B>8,5;</B> nach den Titrationsdaten ein Molekulargewicht von etwa<B>736;
</B> und in Chloroformlösung mit einer Konzentration von etwa<B>6,0</B> Gewichtsvolumenprozent fol gende unterscheidbaren Absorptionsmaxima in einem lii.frarot-Absorptionsspektrum im Be reich zwischen 2,4 und 12,0 u:<B>2,80;</B> 3,34; <B>5,80; 5,90;</B> 6,84; 7,24;<B>7,50; 7,79;</B> 8,04; 8,54-, <B>8,98;</B> 9,14; 9,48;<B>9,86;</B> 10,24;<B>10,56;</B> 10,96,'; 11,22; 11,54 und 11,94.
Erythromycin B besitzt einige dem Ery- t'hromyein ähnliche Eigenschaften, weist<B>je-</B> doch in seiner chemischen Struktur bestimmte deutliche Unterschiede auf, die sich durch Vergleich der Infrarot-Absorptionsspektren von Chloroformlösungen. der beiden Stoffe leicht zeigen lassen (siehe Fig.1 der Zeich nung). Ausserdem zeichnet sich Erythromycin B durch eine grössere Stabilität in stark sau ren Lösungen aus.
Der für das erfindungsgemässe Verfahreh benutzte Aetinomycet gehört nach der Klas- #sifizierung in Bergeys Manual of Determina- tive Baeteriology <B>(6.</B> Ausgabe, Seite<B>938)</B> zur Gattung Streptomyces der Ordnung Aetino- mycetales. Seinen morphologischen Eigen schaften nach scheint der Organismus mit einem von Waksman [Soil Seience <B>8,
</B> 71-214 <B>(1919) ]</B> unter dein Namen Aetinomyces <B>181 </B> beschriebenen Actinomycet, der später von ihm mit Streptomyces erythreus bezeichnet wurde, nahe verwandt zu sein. Die Eigen schaften der Kulturen des -#on 'Waksman be schriebenen und des neuen isolierten Organis mus nach vorliegender Erfindung weisen einige Unterschiede auf. Das neue isolierte Lebewesen<B>,</B> nach vorliegender Erfindung wurde vorläufig als ein Stamm von Strepto- myces erythreus klassifiziert.
Eine der Kul- turensann-nlung des Northern Regional Re- search Laborätory überlassene Kultur des Organismus erhielt dort die Kulturennummer NRRL <B>2338.</B>
Die vorliegende Erfindung wird unter be2 sonderer Bezugnahme auf den obenerwähn- ten Stamm NRRL <B>2338</B> beschrieben.
Es kön- neu jedoch auch andere Erythromycin B er zeugende Stämme von Streptomyces eryth- reus verwendet werden, z.B. solche, die sieh durch bekannte Isolier- lind Stammodifizier- verfahren, z.B. durch Auswahl gezüchteter Organismen sowie Einwirkung von Modifizie- rungsmitteln, wie Röntgenstrahlen, UV-Liellt und dhen-dschen Mitteln, z.
B. Stickstofflost, auf die Organismen, leicht herstellen und iso lieren lassen. Weitere Erythromycin B erzeu gende Stämme sind zum Beispiel die Strepto- myces erythreus-Stämme NRRL <B>2359, 2360</B> und<B>2361.</B>
Als Nährmedium lassen sich verschiedene Medien der angegebenen Art verwenden, da der Organismus in der Lage ist, von verschie- denen Energiequellen zu leben. Bestimmte Nährmedien werden jedoch aus wirtschaft lichen Gründen zur Erzielung höchster Aus beuten und im Hinblick auf die Isolierung der Antibiotika bevorzugt. Bevorzugte Kohlen hydrate sind zum Beispiel Stärke und Glu- kose. Andere C-Quellen sind Rohrzucker, Dex- trin, Melasse.
Zu den bevorzugten Quellen für Stickstoff gehören Maisquellwasser, grobes oder feines Sojabohnenmehl und in Schlempe enthaltene lösliche Stoffe; andere geeignete N-Quellen sind Casein, Aminosäuremischun- gen, Peptone (sowohl von Fleisch wie auch von Soja herrührend). Ebenso können anor ganische Quellen für Stickstoff, wie z. B. Ni trate oder Ammoniumsalze, verwendet werden.
Als anorganische Salze kann man die übli chen Natrium-, Kalium-, Caleium-, Phosphat-, Chlorid-, Suliationen abgebenden Salze ver wenden.
Wie es auch für das Wachstum anderer Mikroorganismen erforderlich ist, werden auch zür Züchtung des erfindungsgemäss eingesetz ten Aetinomyeeten dem Nährmedium vorteil haft die wichtigsten Spurenelemente zugesetzt. Derartige Spurenelemente sind aber gewöhn lich schon als Verunreinigungen in den an dern zugegebenen Bestandteilen des Mediums enthalten.
Zur Erzielung gü4stigsten Wachstums und höchster Entwicklung des Streptomyces eryth- reus, Stamm NRRL <B>2338,</B> wird das Nähr medium vor der Impfung mit dem Organis mus zweckmässig auf einen pH-Wert zwischen <B>6,0</B> und<B>7,5,</B> vorzugsweise etwa<B>6,5,</B> eingestellt.
Man hat beobachtet, dass das Medium wäh rend der Wachstumszeit des Organismus und der Herstellung der Antibiotika allmählich alkalisch wird und eine Alkalinität von etwa pH <B>7,2</B> bis etwa<B>8,5</B> oder mehr erreichen kann, wobei der endgÜltige pH-Wert mindestens teil weise vom Anlangs-pH-'#Vert des Mediums, den im Medium anwesenden Puffersubstanzen und der Waehstumszeit des Organismus ab hängt.
Wie bei der Erzeugung grösserer Mengen anderer Antibiotika bevorzugt man es auch für die Gewinnung grosser Mengen Erythro- inyeln B, die Kulturen unter submersen aero- ben Bedingungen zu züchten. Zur Herstellung begrenzter Mengen dieser Stoffe kann man Schüttelkolben verwenden oder Oberflächen kulturen in Flaschen züchten.
Bei Züchtung von Submerskulturen in grossen Behältern ist es bekanntlich vorteilhaft, zum Impfen die vegetative Form des Organismus zu verwen den, um die Bildung des Antibiotikums zu beschleunigen und dadurch die Anlage mög lichst gut auszunutzen. Deslialb ist es zweek- mässig, zuerst einen vegetativen Impfstoff des Organismus herzustellen, indem man eine ver hältnismässig kleine Menge Nährmedium mit der Sporenform des Organismus impft und nach Bildung des frischen aktiven Impfstof fes diesen aseptisch in die grossen Behälter einführt.
Das Nährmedium, in dem der vege tative Impfstoff hergestellt wird, kann das gleiche wie das für die Herstellung des Anti biotikums verwendete oder ein anderes sein.
Streptomyces erythreus, Stamm NRRL <B>2338,</B> lässt sich gut bei Temperaturen zwischen etwa<B>25</B> und<B>370 C</B> züchten. Die höchsten Aus beuten des Antibiotikums erhält man, wenn man das Nährmedium auf etwa 26-3011 <B>C</B> hält.
Bei der Herstellung von Antibiotika unter submersen aeroben Bedingungen ist es üblich, sterile Luft durch das Nährmedium zu blasen. Vorzugsweise beträgt das Volumen der für die Bildung von Erythromycin und Erythro- inye,in B eingeleiteten Luft über<B>0,1</B> Raumteil Luft in der Minute<B>je</B> Ratunteil des Nähr mediums. Das Wachstum und die Bildung des Antibiotikums sind noch besser, wenn minde stens 0,4 Raumteile Luft auf<B>1</B> Raumteil des Kulturmediums durchgeleitet werden.
Die Entstehungsgeschwindigkeit und die Konzentration der antibiotisclien Wirkstoffe im Nährmedium lässt sich während der Wachs tumszeit des Mikroorganismus leicht verfolgen, wenn man Proben des Mediums auf ihre anti biotische Wirksamkeit gegenüber Organismen prüft, von denen man weiss, dass sie auf'das Antibiotikum reagieren, z.
B. von Staphylo- coccus aureus und Myobacterium tubereulosis. Für diese Untersuchungen empfiehlt es sich, derart vorzugehen, dass man Proben der Kul tur fortschreitend immer mehr verdünnt, be stimmte Mengen der so verdünnten Proben einem geschmolzenen Nähragar zusetzt, dann diesen Agar in einer Petrischale erstarren lässt, mit einer frischen Kultur des<B>S.</B> aureus oder M.
tubdreulosis impft und diejenige stärkste Verdünnung des Nährmediums der Kultur feststellt, bei der das Wachstum des Organismus auf dem Agar-Nährboden noch gänzlich gehemmt wird.
Die Bildung der Antibiotika kann auch mittels turbidimetrischer Prüfung kontrolliert werden, wie sie auch, bei der Herstellung an derer Antibiotika durchgeführt wird.
Die Anwesenheit von Erythromyein B und Erythromycin lässt sich durch ehromatogra- phische Verfahren bestimmen. So löst man etwa 0,2 bis<B>0,5 y</B> der zu untersuchenden Probe in einer kleinen Menge eines Lösungsmittels, z. B. in Alkohol, bringt einen Tropfen der konzentrierten Lösung auf ein Ende eines Streifens Filterpapier, trocknet den entstehen den Fleck und entwickelt ihn nach dem übli chen papierehromatographischen Verfahren.
Zu den Lösungsmitteln, die zur Entwick lung des, Papierstreif ens, das heisst zum Aus- einanderziehen der Adsorptionszonen dienen können, gehören:<B>1 : 99</B> (V/V) Ammonium- hydroxydlösung; destilliertes, mit Methyliso- butylketon gesättigtes Wasser;
destilliertes, mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser mit Zusatz von 2 11/o (V/V) Piperidin; <B>0,1</B> mole kulare, mit Methylisobutylketon gesättigte Bo- ratpullerlösung mit einem pH-Wert von<B>9,9;</B> <B>0,15</B> n mit, Methylisobutylketon gesättigte Na tronlauge;<B>0,1</B> molekulare saure Kaliumphos- phat-Pufferlösung mit<B>3</B> Volumenprozent Äthanol.
Die Entwicklungsdauer ist etwa 4 bis<B>5</B> Stunden oder so lange, bis die Lösungs- mittelfront das Ende des. Streifens erreicht. Nach der Entwicklung stellt man die Lage der antibiotischen Substanz auf dem Streifen mit einem Bioautogramm fest.
Hierbei legt man den entwickelten Filterpapierstreifen auf die Oberfläche eines etwa<B>3</B> mm dicken, in einer grossen Glasschale befindlichen Agar- Nährbodens, den man durch Impfen eines war- men sterilen Agar-Nährmediums mit Baeillus subtilis hergestellt hat. Das Antibiotikum dringt vom Papier aus in das Agarmedium ein.
Nach<B>10</B> Minuten wird der Papierstreifen entfernt, die Schale gekippt und die Lage des Filterpapierstreifens sowie der Lösungsmittel- front, und die Stelle, an der die Versuchs lösung aufgetragen wurde, direkt aussen auf der Unterseite der Glassehale vermerkt. Das Agar-Medium wird über Nacht bei etwa<B>371 C</B> in umgekehrter Lage bebrütet. Das Auftreten klarer Zonen im Medium, das heisst von Strei fen, die frei von bakteriellem Wachstum sind, zeigt die Lage der antibiotischen Substanz entsprechend deren Verteilung auf dem Fil terpapier an.
Durch Messen der vom Anti biotikum und vom Lösungsmittel zurückgeleg ten Wege bestimmt man den Ri--Wert, das heisst das Verhältnis der Wanderungsgeschwin digkeit des Antibiotiktims zu der des Lösungs mittels. Es wurde gefunden, dass sieh Erythro- mycin B bei diesem Versuch weniger schnell bewegt als Erythromyein. Bei Anwesenheit einer Mischung von Erythromycin B und Erythromycin erscheinen im Bioautogramm zwei klare Zonen;
ist jedoch nur eine Zone frei von Bakterienwachstum, so kann man durch Vergleich der Lage dieser Zone mit der Lage einer -unter genau denselben Bedin gungen mit reinem Erythromycin B oder Erythromycin erhaltenen Zone feststellen, welches der beiden Antibiotika vorhanden ist.
Unter günstigen Bedingungen beträgt der Ri- Wert von Erythromycin B etwa drei Viertel desjenigen von Erythromycin. - Fig. 2 der Zeichnung zeigt ein mit einem Papierehromatogramm hergestelltes Bioauto- gramm, auf dein gleichzeitig Erythromycin B,
Erytliromycin und eine Mischung aus an nähernd gleichen Mengen Erythromycin und Erythromvein B chromatographiert -wurden. Für die Entwicklung, das heisst die Zonen trennung, benutzte man hierbei als Löstings- mittel eine <B>1</B> %ige wässrige Lösung vo Ü kon- zentriertem Anunoni-Lunhydroxyd,
die mit Me- thylisohlitylketon gesättigt war. Die sc'hwar- zen Flächen bedeuten Zonen, in denen keiner lei bakterielles Wachstum auftrat. Im allgemeinen ist die gesamte antibio tische Wirksamkeit bei subinersen aeroben .Kulturen innerhalb von etwa<B>2-5</B> Tagen nach Impfung des Nährinediums am grössten, bei Oberflächen- oder Schüttelkulturen erst innerhalb von etwa<B>5-10</B> Tagen.
Gewöhnlich entstehen im Nährmedium an nähernd gleiche Mengen Erythromycin und Erythromycin B; dieses Verhältnis hängt<B>je-</B> doch von der Dauer der Fermentationszeit ab. E:-ärzere Wachstumszeiten, etwa von<B>1</B> oder 2 Tagen, begünstigen die überwiegende Bildung von Erythromyein B. Eine Verlängerung der Ferinentationszeit führt zu -einer relativen Verminderung der Erythromycin-B-Menge im Vergleich zu der des Erythromycins und kann sogar einen absoluten Rückgang der Menge des im Nährmedium anfänglich vorhandenen Erythromycins B verursachen.
Der Grund Tür diese relative oder absolute Abnahme ist nicht bekannt.
Die in der Kultur des S.-erythreus-Stam- mes NRRL <B>2338</B> entstehenden Antibiotika las sen sich durch Extraktions- oder Adsorptions- verfahren aus dem Nährinediuni isolieren. Hierbei werden die erstgenannten Verfahren deshalb bevorzugt, weil sie schneller und bil liger sind. Für die Extraktion der Antibiotika aus dem Nährmedium der Kultur werden mit Wasser nicht mischbare, polare organische Lösungsmittel bevorzugt, z.
B. Fettsäurealkyl- ester, wie Äthyl- und Amylaeetat; chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform und Di- chloräthylen; Alkohole mit geringer Wasser löslichkeit, wie Butanol und Amylalkohol; Ketone mit geringer Wasserlöslichkeit, wie Methylamylketon;
Lind andere Verbindungen, wie Äthyläther und Dibutyläther. Vorzugs weise wird die filtrierte Nährbrühe vor der Extraktion auf einei# pil-Wert von etwa<B>9,5</B> oder höher eingestellt.
Das Erythromycin B lässt sich leicht von, dem Erythromycin unter Ausnutzung der unterschiedlichen Löslichkeit und Adsorp- tionseigenschaften der beiden Verbindungen abtrennen.
So wird zum Beispiel Erythro- mycin B auf Cellulose stärker als Erythro- i mycin adsorbiert. Deshalb erscheint bei Ad- sorption einer Mischung von Erythromyein und Erythromycin B aus deren gemeinsamer Lösung auf einer Säule aus Cellulose und Aus waschung dieser Säule mit einem geeigneten Lösungsmittel das, Erythromyein bereits im, ersten Waschwasser,
während Erythromycin B auf der Säule bleibt und erst bei längerem Auswaschen gewonnen wird. Man kann die beiden Verbindungen auch durch selektive Extraktionsverfahren in einer Gegenstrom anlage trennen.- <I>Beispiel<B>1</B></I> Eine Sporen enthaltende Kultur von Streptomyees erythreus, Stamm NRRL <B>2338,</B> wird hergestellt, indem man den Organismus auf einem Agar-Schrägnährboden folgender Zusammensetzung Achtet:
Dextrin <B>15 g</B> Trypton <B>5 g</B> Agar 20<B>g</B> Betain 0,5 <B>g</B> Gelöste Mineralmischung* 2 ems Wasser zur Auffüllung auf<B>1</B> Liter *Diese Mineralmischung enthält folgende Bestandteile:
K2HP04 100,0 <B><I>g</I></B> NaC1 100,0 <B>g</B> M9S04 100,0 <B><I>g</I></B> FeS04'7 H20 2,0<B>g</B> ZnS04-7 11,0 1,0- <B><I>g</I></B> CUS04.5 H20<B>0,5 g</B> MnC12'4 H,0 0,5 <B>g</B> C0C12 <B>* 6</B> H20 <B>0,1 g</B> CaC12 40,0<B>g</B> Wasser zur Auffüllung auf<B>1</B> Liter.
Der Schrägnährboden wird<B>10</B> Tage lang bei<B>330 C</B> bebrütet. Man gewinnt die Sporen in Form einer wässrigen Suspension, indem man den Schrägnährboden mit einer kleinen Menge sterilen destillierten Wassers bedeckt und die Sporen vorsichtig von der Oberfläche des Nährbodens abschabt.
Etwa<B>1</B> cm,% der auf diese Weise erhaltenen Sporensuspension verwendet man zur Imp fung des folgenden sterilisierten Nährmediums unter sterilen Bedingungen: Caseinhydrolysat <B>1 g</B> < N-Z-Amin <B>A ,</B> von Sbeffield Farms erhalten) Blacksträp -Melasse 2<B>g</B> K21-I-PO4 0,15 <B>g</B> Wasser<B>100</B> CM3 Das geimpfte Nährmedium -wird etwa<B>72</B> Stunden lang bei etwa 2811 <B>C</B> bebrütet, bis gute vegetative Entwicklung zu beobachten ist.
Etwa<B>5</B> ems des die vegetative Form des Organismus enthaltenden Nährmediums be nutzt man zur Impfung eines<B>250</B> em3 lassen den Erlenmeyerkolbens, der etwa<B>75</B> em3 eines sterilisierten Gärmediums folgender Zusam mensetzung enthält:
Rohrzucker 45<B>g</B> Sojabohnenmehl 20<B>g</B> Aus kondensierter Melasse- schlempe gewonnene lös- liehe Stoffe 2<B>g</B> Natriumchlorid <B>5 g</B> Caleiumearbonat 2<B>g</B> Cobal.tochloridhexahydrat 0,
001 <B>g</B> Wasser zur Auffüllung auf<B>1</B> Liter Der Kolben mit dem geimpften Nähr medium wird in einen auf etwa<B>280 0</B> gehal tenen Brutraum gestellt und sechs Tage lang auf einer sich drehenden Schüttelvorriehtung mit einem Schüttelhub von etwa<B>5</B> cm und einer Geschwindigkeit von 240 Umdrehungen in der Minute geschüttelt. Von Zeit zu Zeit werden Proben des Nährmediums auf die Ge samtmenge der darin enthaltenen autibioti- sehen Wirkstoffe untersucht. Erreicht deren Menge einen Wert von etwa<B>250-300</B> j/eins der Brühe, so filtriert man diese zur Entfer nung des Mycels.
Etwa 11/9 Liter der filtrierten Kulturbrühe werden mit Natronlauge auf einen pH-Wert von<B>9,5</B> gebracht lind mit<B>0,75</B> Liter Amyl- aeetat ausgezogen. Der Ainylacetatextrakt, in dem praktisch alle in der ursprünglielien Gär brühe vorhandenen autibiotischen Wirkstoffe enthalten sind, wird duteli Vakuumeindamp- fung auf ein Volumen von etwa<B>10</B> eins ein geengt.
Der konzentrierten Amylacetatlösung setzt man<B>0,5 g</B> gereinigte Cellulosefasern zu und trocknet die Misehung über Nacht im Va- ku-Lun. Die trockene, feinpulverige Cellulose, auf der alle antibiotischen Wirkstoffe der Brühe absorbiert sind, wird auf die Oberseite einer etwa<B>3,2</B> X<B>38</B> cm messenden ehromato- graphischen Adsorptionssäule gelegt,
die etwa <B>161 g</B> trockene gereinigte Celluloselasern (im Handel -unter derMarkenbezeichnung Solka - Flocken zu haben) enthält. Es wird mit 0,1- prozentiger, -wässriger, mit Methylisobutyl- keton gesättigter Ammoniumhydroxydlösung ehromatographiert. Das Eluat wird in Frak tionen gesammelt,
die auf ihre antibiotische Wirksamkeit gegen<B>S.</B> aureus als Prüforga- nismus untersucht werden. Die Anwesenheit von Erythroinyein und/oder Erythromycin, B wird unter Verwendung des gleichen Lösungs- mittelsystems wie oben durch ehromatogra- phisc'he Analyse mit Filterpapier bestimmt.
Dabei zeigt sich, dass die ersten 120 em3 der Auswaschflüssigkeit nur Erythromycin, die zweiten 120 eins jedoch eine Mischung aus Erythromycin und Erythromycin B enthal ten. Die folgenden aktiven Eluatfraktionen enthalten nur Erythromycin B; diese werden vereinigt und mit Chloroform ausgezogen.
Der Chloroformauszug wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, und der nur aus Ery- throinycin B bestehende Rückstand wird mit Hexan gewaschen und in<B>25</B> ein3 Äther auf genommen. Die ätherische Lösung wird fil triert und im Vakuum zur Trockne einge dampft. Den Rückstand löst man in einer möglichst kleinen Menge warmen Acetons und lässt abkühlen, wobei sich Kristalle des Ery- thromycins B abscheiden.
Dieses kristalline Antibiotikum enthält (ebenso wie das Ery- thromycin) eine bestimmte Menge gebundenes Lösungsmittel. Entfernt man dieses Lösungs mittel, so hat dies den Verlust der kristallinen Eigenschaften des Antibiotikums zur Folge.
<B>. -</B><I>Beispiel<B>-0</B></I> Man stellt ein sterilisiertes Nährmedium her, das folgende Bestandteile enthält: Dextrose 15 <B>g</B> Sojabohnenmehl 15 <B>g</B> Maisieststoffe, ( cornsteep solids ) <B>5,0 g</B> Caleiumearbonat 2,0<B>g</B> Natriumehlorid <B>5,0 g</B> Wasser zur Auffüllung auf<B>1</B> Liter Das Nährmedium wird mit einer Sporen- suspension geimpft, die man herstellt, indem man Streptomyces erythreus, Stamm NRRL <B>2338,
</B> nach dem in Beispiel<B>1</B> beschriebenen Verfahren auf einem Agar-Schrägnälirboden züchtet und die Sporen zusammen mit einer kleinen Menge sterilen destillierten Wassers abschabt. Das in einer 2-Liter-Flasche befind- liehe geimpfte Nährinedium wird etwa<B>26</B> Stunden lang bei etwa 280<B>C</B> unter Schütteln der Flasche in einer sieh hin und her bewe genden Schüttelvorrichtung mit einem Aus schlag von<B>5</B> ein und einer Geschwindigkeit von 114 vollständigen Ausschlägen in der Mi- nutA bebrütet.
Das erhaltene vegetative Mycel wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und in etwa<B>1</B> Liter ste rilem destilliertem Wasser erneut suspendiert. Der auf diese Weise hergestellte Impfstoff wird zur Impfung eines 40 Liter fassenden Gürgefässes verwendet, das etwa 20 Liter einer sterilisierten Gärbrühe von folgender Zusam mensetzung enthält:
Glykokoll <B>150 g</B> Rohrzucker<B>1370<I>g</I></B> dl-a-Alanin <B>17,8<I>g</I></B> Primäres Natriumphosphat <B>100 g</B> Natriunichlorid 100 <B>g</B> Magnesiumsulfat 10 <B>g</B> Ferrosullat-heptahydrat 0,4<B><I>g</I></B> Zinksuliat-heptahydrat 0,2<B>g</B> Magnesiumchlorid-tetrahydrat <B>0,032 g</B> Cobaltochlorid-hexahydrat 0,2<B>g</B> Wasser zur Auffüllung auf 20 Liter Die Mischung aus anorganischen Salzen,
Glykokoll und dl-a-Alanin -wird zusammen sterilisiert und der pH-Wert der Brühe nach aer Sterilisation auf etwa<B>7,5</B> eingestellt. Der Rohrzucker wird getrennt sterilisiert und der sterilisierten Brühe aseptisch zugesetzt.
Nach Abkühlung der sterilisierten Brühe setzt man den nach dem oben beschriebenen Verfahren vegetativ hergestellten Impfstoff aseptisch zu. Der Organismus wird in der Brühe etwa vier Tage lang bei einer Tem peratur von etwa<B>280 C</B> gezüchtet. Während der Wachstumszeit wird die Brühe gerührt und sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa<B>0,5</B> Raumteilen auf<B>1</B> Raumteil Brühe in der Minute hindurchgeblasen.
Mikrobiolo gische Versuche mit<B>S.</B> aureus als Versuchs organismus zeigen, dass der Gesamtgehalt an antibiotischen Wirkstoffen in der Brühe zu letzt etwa<B>250</B> y/ems beträgt, wovon etwa <B>50</B> % aus Erythromycin B bestehen, wie sich durch Papierehromatographie und Bioauto- gramm beweisen lässt. Die Brühe wird zur Entfernung des Mycels filtriert,
und aus dem klaren Filtrat lässt sieh nunmehr Erythromy- ein B gewinnen.
11/2 Liter der so erhaltenen filtrierten Erythromyein und Eryth r*omycin B enthalten den Nährbrühe werden mit wässriger Natron lauge auf einen pH7Wert von<B>9,5</B> eingestellt und mit etwa<B>0,75</B> Liter Amylacetat ausgezo gen. Der Amylacetat-Extrakt wird im Va kuum zur Trockne eingedampft. Der Ver- dampfungsrückstand wird in etwa<B>250</B> ems Chloroform aufgenommen, filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Nun wird ein Lösungsmittelsystem hergestellt, indem man 20 Teile Methylisobutylketon, 20 Teile einer<B>0,1</B> molekularen Phosphatpufferlösung mit einem pu-Wert von<B>6,5</B> und<B>1</B> Teil Ace ton miteinander mischt. Lässt man diese Mischung stehen, so bildet sieh ein Zwei- schichtensystem, das man in eine ganz aus Glas bestehende, 200 cm.3 fassende 60röhrige Craig-Gegenstroin-Extraktionsanlage gibt.
Der Verdampfungsrüekstand des Chloroformex- traktes wird in<B>10</B> em3 der obern Phase gelöst und in die erste Röhre der Extraktionsanlage gegeben. Nun wird in üblicher Weise im Ge genstrom extrahiert. Die Fraktionen werden wieder papierehromatographisch und mikro- biologisch unter Verwendung von<B>S.</B> aure-Lis als Versuchsorganismus analysiert. Dabei zeigt sieh, dass die Fraktionen Nr. 27-40 nur Ery- t,hromycin B enthalten.
Diese Fraktionen wer den vereinigt und im Vakuum bis auf<B>130</B> ems eingedampft. Diese Rückstandslösung wird auf<B>10</B> % Natriumehloridgehalt aufgefüllt, mit verdünnter Natronlauge auf den pH-Wert <B>9,8</B> eingestellt und zweimal mit<B>je 75</B> em3 Chloro form ausgezogen. Die vereinigten Chloroform- extrakte werden über wasserfreiem Natrium sulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Den Verdampfungsrückstand löst man bei 470<B>C</B> in möglichst wenig Aceton auf, lässt langsam abkühlen und gewinnt kri stallines Erythromycin B aus der Lösung.
Das auf diese Weise gewonnene Erythro- mycin B schmolz bei<B>190</B> bis<B>1910 C</B> auf der Kofler-Heizbank. Die Elementaranalyse einer drei Stunden lang bei 6011 <B>C</B> im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrockneten Probe ergab folgende Werte: 61,541/o C; 9,45% H;
2,0% N und (als Differenzwert) 28,01 1/o 0.
Die elektrometrische Titration in 66%iger wässriger Dimethyliormamidlös-Luig zeigte die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe mit einem PK'a von<B>8,5</B> an.
Das nach den Titrationsdaten ermittelte Molekulargewicht beträgt etwa<B>736.</B>
Das UV-Absorptionsspektrum des in abso lutem Methanol gelösten Erythromycins B zeigte ein Maximum bei<B>286</B> mu, ein Minimum bei<B>259</B> niu und E"", <B>= 59.</B>
Eine mikrobiologisehe Prüfung mit<B>S.</B> au- reus als Versuchsorganismus zeigt, dass ein Milligramin Erythromyein B die. gleiche anti biotische Wirksamkeit wie etwa<B>750 y</B> Ery- thromycin hat.
Das Infrar-ot-Absorptionsspektrum einer 60/Gi,gen Lösung von Erythromycin B in Chloroform, auf Gewichts-Volumen-Grund- lage, hat zwischen 2,4 und 12 u folgende un terscheidbare Absorptionsmaxima:<B>2,50;</B> 3,34; <B>5,80;</B> 6,84; 7,24;<B>7,50;</B> 8,04; 8,54;<B>8,98;</B> 9,14; 9,48;<B>9,86;</B> 10,24;<B>10,56; 10,96;</B> 11,22; 11,54 und 11,94. In Fig. <B>1</B> der Zeichnung wird diese Infrarot-Absorptionskurve durch die ausgezo gene Linie dargestellt.
Stellt. man gleichzeitig Chromatogramme von Erythrömycin B und Erythromycin un ter Verwendung von ammoniakalischem, mit Methylisobutylketon gesättigtem destilliertem Wasser als Entwieklungs-Lösungsmittel auf Filterpapierstreifen her, so ist das Verhältnis der Geseliwindigkeiten, mit denen sich die bei den Antibiotika bewegen, folgendes:
EMI0008.0009
Erythromycin B ist in saurer Lösung viel beständiger als Erythromycin. Wenn man wässrige Lösungen mit<B>je</B> etwa<B>38</B> Einheiten Erythronlycin B -Lind Erythromycin im ein2 auf verschiedene- p]I-Werte einstellt und<B>j</B> edes- mal eine Stunde lang bei etwa<B>250</B> C stellen lässt,
zeigendie Lösmigen von Erythromycin B eine viel grössere Beständigkeit gegenüber Säuren.
Die Säureanlagerungssalze von Erythro- mycin B lassen sich herstellen, indem man eine wässrige Lösung der Erythromycin-B-Base mit einer äquivalenten Menge einer Säure behan delt und die Lösung im Vakuum zur Trockne eindampft. Man kann auch die Lösung der Erythromycin-B-Base in einem organischen Lösungsmittel mit einer Säure oder deren Lö sung behandeln; das Erythromycinsalz fällt dann direkt aus der Lösung aus.
Bei der Her stellung von Säureanlagerungssalzen starker Säuren ist darauf zu achten, dass nicht wÄh- rend der Anlagerung der Säure an das Anti- biotik-Lun örtlich zu hohe Konzentrationen der Säure auftreten, da sieh ein Teil des Erythro- mycins B zersetzen kann, wenn der pH-Wert geraume Zeit unter etwa 2 sinkt.
Geeignete Erythromycin-B-Salze sind das Hydrochlorid, SuHat, Citrat, Mandelat, Succinat, Oleat, Palmitat, Myristat, Stearat, Oxalat, Thio- cyanat und G,1-ticoheptonat. Weitere ähnliche Salze lassen sich nach den obenerwähnten Verfahren leicht herstellen. Für therapeu tische Zwecke sollten die verhältnismässig un giftigen Salze ausgewählt werden.
Das Hydro- chlorid des Erythromyeins B zum Beispiel wird hergestellt, indem man eine Lösung von Erythromycin B in Äthanol mit einer äqui valenten Menge wässriger Salzsäure behandelt und die Lösung unter Abscheidung des festen Salzes im Vakuum zur Trockne- eindampft. Das Salz wird durch Umkristallisation aus einer Mischung von Äthanol und Aceton ge reinigt.
Das Erythromycin B und seine Salze sind wirksame Antibiotika, die unter Berücksichti gung des erhöhten Molekulargewichtes der Salze etwa dieselbe breite antibakterielle Wirk samkeit -wie Erythromycin besitzen.
Process for producing erythromycin B Er, ythromyein is an antibiotic having broad antibacterial activity, which has been shown to be an effective therapeutic agent for the treatment of such diseases caused by microorganisms; it is produced by cultivating the '-Nmicroorganism Streptomyces erythreus on artificial borrowed nutrient medium.
The microorganism and the nutrient media and fermentation processes suitable for the production of erythromycin have been described in detail in the American patent no. 2 653 899.
It has now been found that, together with erythromyein, another new antibiotic can be produced. The new antibiotic was named erythromyella B by its discoverers.
The present invention relates to a method for the production of erythromycin B, which is characterized in that an erythromycin B producing strain of Streptomyees erythreus is cultivated, preferably under submerged aerobic conditions, in a nutrient medium, the assimilable carbohydrates, a nitrogen source and contains inorganic salts,
that one then removes the myeel from the nutrient medium, isolates all antibiotic active substances from the medium, expediently means using water-immiscible polar solvents and then removing the solvent and separating the erythromycin B from the erythromycin that has also formed.
Erythromycin B can be separated from erythromycin, for example, by methods in which the different solubilities or the different adsorption properties of the two substances are used, e.g. B. dureli adsorption and subsequent selective leaching or countercurrent distribution using several immiscible solvents in an extraction system with a large number of tubes.
The new nitrogenous base erythromycin B has the following properties: When titrated in a solution of dimethymormamide in water in the ratio 2: 1, a pK'o, -of about 8.5; According to the titration data, a molecular weight of about 736;
</B> and in chloroform solution with a concentration of about <B> 6.0 </B> weight volume percent following distinguishable absorption maxima in a li.frarot absorption spectrum in the range between 2.4 and 12.0 u: <B> 2.80; 3.34; <B> 5.80; 5.90; 6.84; 7.24; <B> 7.50; 7.79; 8.04; 8.54, 8.98; 9.14; 9.48; <B> 9.86; </B> 10.24; <B> 10.56; </B> 10.96, '; 11.22; 11.54 and 11.94.
Erythromycin B has some properties similar to erythromycin, but <B> however </B> it has certain clear differences in its chemical structure, which can be seen by comparing the infrared absorption spectra of chloroform solutions. the two substances can be easily shown (see Fig. 1 of the drawing). Erythromycin B is also characterized by greater stability in strongly acidic solutions.
The aetinomycete used for the method according to the invention belongs to the genus Streptomyces of the order Aetino according to the classification in Bergey's Manual of Determinative Baeteriology (6th edition, page 938) - mycetales. According to its morphological properties, the organism appears to have one of Waksman's [Soil Seience <B> 8,
</B> 71-214 <B> (1919)] </B> to be closely related to the actinomycete described under your name Aetinomyces <B> 181 </B>, which he later referred to as Streptomyces erythreus. The properties of the cultures of the - # on 'Waksman described and of the new isolated organism according to the present invention show some differences. The new isolated living being <B>, </B> according to the present invention has been provisionally classified as a strain of Streptomyces erythreus.
A culture of the organism left to the culture of the Northern Regional Research Laboratory was given the culture number NRRL <B> 2338. </B>
The present invention is described with particular reference to the above-mentioned strain NRRL 2338.
However, it is now also possible to use other erythromycin B-producing strains of Streptomyces erythreus, e.g. those which can be seen by known isolation and stem modification methods, e.g. through the selection of cultivated organisms as well as the action of modifying agents such as X-rays, UV lights and other means, e.g.
B. nitrogen mustard, on the organisms, easily produce and let iso lieren. Further erythromycin-producing strains are, for example, the Streptomyces erythreus strains NRRL 2359, 2360 and 2361
Various media of the specified type can be used as the nutrient medium, since the organism is able to live from various energy sources. However, certain nutrient media are preferred for economic reasons in order to achieve the highest possible yield and with a view to isolating the antibiotics. Preferred carbohydrates are, for example, starch and glucose. Other carbon sources are cane sugar, dextrin, molasses.
Preferred sources of nitrogen include corn steep liquor, coarse or fine soybean meal, and solubles in stillage; other suitable N sources are casein, amino acid mixtures, peptones (derived from both meat and soy). Likewise, inorganic sources of nitrogen, such as. B. Ni occurred or ammonium salts, can be used.
The usual salts which donate sodium, potassium, calcium, phosphate, chloride, and sulfate ions can be used as inorganic salts.
As is also necessary for the growth of other microorganisms, the most important trace elements are advantageously added to the nutrient medium for the cultivation of the aetinomyeete used according to the invention. Such trace elements are usually already contained as impurities in the other ingredients of the medium.
In order to achieve the most favorable growth and maximum development of Streptomyces erythreus, strain NRRL <B> 2338, </B>, the nutrient medium is expediently brought to a pH between <B> 6.0 </ before inoculation with the organism. B> and <B> 7.5, </B> preferably set about <B> 6.5, </B>.
It has been observed that the medium gradually becomes alkaline during the growth period of the organism and the production of the antibiotics and has an alkalinity of about pH 7.2 to about 8.5 or can achieve more, whereby the final pH value depends at least in part on the initial pH value of the medium, the buffer substances present in the medium and the growth time of the organism.
As with the production of large quantities of other antibiotics, it is preferred to grow the cultures under submerged, aerobic conditions for the production of large quantities of erythroynyls B. Shake flasks or surface cultures in flasks can be used to produce limited quantities of these substances.
When cultivating submerged cultures in large containers, it is known to be advantageous to use the vegetative form of the organism for inoculation in order to accelerate the formation of the antibiotic and thereby to use the system as well as possible. Deslialb it is appropriate to first produce a vegetative vaccine of the organism by inoculating a relatively small amount of nutrient medium with the spore shape of the organism and after the formation of the fresh active vaccine this aseptically introduced into the large container.
The nutrient medium in which the vegetative vaccine is made can be the same as or different from that used to make the antibiotic.
Streptomyces erythreus, strain NRRL <B> 2338 </B> can be grown well at temperatures between about <B> 25 </B> and <B> 370 C </B>. The highest yields of the antibiotic are obtained when the nutrient medium is kept at around 26-3011 <B> C </B>.
When producing antibiotics under submerged aerobic conditions, it is common practice to blow sterile air through the nutrient medium. The volume of the air introduced into B for the formation of erythromycin and erythroinye is preferably over <B> 0.1 </B> part of the volume of air per minute for each part of the nutrient medium. The growth and formation of the antibiotic are even better if at least 0.4 parts of air are passed through to <B> 1 </B> part of the space of the culture medium.
The rate of emergence and the concentration of the antibiotic active ingredients in the nutrient medium can be easily followed during the growth period of the microorganism if samples of the medium are tested for their antibiotic effectiveness against organisms that are known to react to the antibiotic, e.g.
B. from Staphylococcus aureus and Myobacterium tubereulosis. For these investigations it is advisable to proceed in such a way that samples of the culture are progressively diluted more and more, certain amounts of the samples diluted in this way are added to a molten nutrient agar, then this agar is allowed to solidify in a Petri dish with a fresh culture of the <B> S. </B> aureus or M.
tubdreulosis inoculates and determines the strongest dilution of the culture medium at which the growth of the organism on the agar medium is completely inhibited.
The formation of antibiotics can also be checked by means of turbidimetric testing, as is also carried out in the manufacture of other antibiotics.
The presence of erythromyein B and erythromycin can be determined by Ehromatographic methods. For example, about 0.2 to 0.5 y of the sample to be examined is dissolved in a small amount of a solvent, e.g. B. in alcohol, puts a drop of the concentrated solution on one end of a strip of filter paper, dries the resulting stain and develops it according to the usual paper-chromatographic process.
The solvents which can be used to develop the paper strip, that is, to pull the adsorption zones apart, include: 1:99 (V / V) ammonium hydroxide solution; distilled water saturated with methyl isobutyl ketone;
distilled water saturated with methyl isobutyl ketone with the addition of 2 11 / o (V / V) piperidine; <B> 0.1 </B> Molecular Borratpuller solution saturated with methyl isobutyl ketone with a pH of <B> 9.9; </B> <B> 0.15 </B> n with methyl isobutyl ketone Saturated sodium hydroxide solution; <B> 0.1 </B> molecular acidic potassium phosphate buffer solution with <B> 3 </B> volume percent ethanol.
The development time is about 4 to <B> 5 </B> hours or so long until the solvent front reaches the end of the strip. After the development, the position of the antibiotic substance on the strip is determined with a bioautograph.
Here, the developed filter paper strip is placed on the surface of an approximately 3 mm thick agar culture medium in a large glass dish, which has been produced by inoculating a warm sterile agar culture medium with Baeillus subtilis. The antibiotic penetrates the agar medium from the paper.
After <B> 10 </B> minutes, the paper strip is removed, the dish tilted and the position of the filter paper strip and the solvent front, and the point where the test solution was applied, is noted directly outside on the underside of the glass dish. The agar medium is incubated overnight at about 371 C in the reverse position. The appearance of clear zones in the medium, that is to say of streaks that are free of bacterial growth, shows the position of the antibiotic substance according to its distribution on the filter paper.
By measuring the distances covered by the antibiotic and the solvent, the Ri value is determined, that is, the ratio of the migration speed of the antibiotic to that of the solvent. It was found that erythro- mycin B moved less rapidly than erythromyein in this experiment. If a mixture of erythromycin B and erythromycin is present, two clear zones appear in the bioautogram;
However, if only one zone is free from bacterial growth, one can determine which of the two antibiotics is present by comparing the location of this zone with the location of a zone obtained under exactly the same conditions with pure erythromycin B or erythromycin.
Under favorable conditions, the Ri value of erythromycin B is about three quarters of that of erythromycin. - Fig. 2 of the drawing shows a bioautogram produced with a paper chromatogram, on which at the same time erythromycin B,
Erytliromycin and a mixture of approximately equal amounts of erythromycin and erythromycin B -were chromatographed. For the development, i.e. the zone separation, a <B> 1 </B>% aqueous solution of concentrated Anunoni-Lunhydroxyd was used as a solvent,
which was saturated with methyl isotyl ketone. The black areas mean zones in which no bacterial growth occurred. In general, the total antibiotic effectiveness is greatest in sub-mineral aerobic cultures within about <B> 2-5 </B> days after inoculation of the nutrient medium, in surface or shaking cultures only within about <B> 5-10 < / B> days.
Usually, approximately equal amounts of erythromycin and erythromycin B are formed in the nutrient medium; however, this ratio depends on the duration of the fermentation time. E: Marser growth times, for example of 1 or 2 days, favor the predominant formation of erythromyein B. An increase in the fermentation time leads to a relative reduction in the amount of erythromycin B compared to that of erythromycin and can even cause an absolute decrease in the amount of erythromycin B initially present in the nutrient medium.
The reason for this relative or absolute decrease is unknown.
The antibiotics produced in the culture of the S. erythreus strain NRRL 2338 can be isolated from the nutrient medium by extraction or adsorption processes. The first-mentioned methods are preferred here because they are faster and cheaper. For the extraction of the antibiotics from the nutrient medium of the culture, water-immiscible, polar organic solvents are preferred, e.g.
B. fatty acid alkyl esters, such as ethyl acetate and amyl acetate; chlorinated hydrocarbons such as chloroform and dichloroethylene; Alcohols with poor water solubility such as butanol and amyl alcohol; Ketones with poor water solubility such as methyl amyl ketone;
And other compounds such as ethyl ether and dibutyl ether. The filtered nutrient broth is preferably adjusted to an i # pil value of about 9.5 or higher before extraction.
The erythromycin B can easily be separated from the erythromycin using the different solubility and adsorption properties of the two compounds.
For example, erythromycin B is more strongly adsorbed on cellulose than erythromycin. Therefore, when a mixture of erythromyein and erythromycin B is adsorbed from their common solution on a column of cellulose and this column is washed with a suitable solvent, erythromyein appears in the first wash water.
while erythromycin B remains on the column and is only obtained after a longer washout. The two compounds can also be separated by selective extraction processes in a countercurrent system.- <I> Example<B>1</B> </I> A spore-containing culture of Streptomyees erythreus, strain NRRL <B> 2338, </ B > is produced by observing the organism on an agar inclined culture medium with the following composition:
Dextrin <B> 15 g </B> Tryptone <B> 5 g </B> Agar 20 <B> g </B> Betaine 0.5 <B> g </B> Dissolved mineral mixture * 2 ems water to fill up to <B> 1 </B> liter * This mineral mixture contains the following ingredients:
K2HP04 100.0 <B><I>g</I> </B> NaC1 100.0 <B> g </B> M9S04 100.0 <B><I>g</I> </B> FeS04'7 H20 2.0 <B> g </B> ZnS04-7 11.0 1.0- <B><I>g</I> </B> CUS04.5 H20 <B> 0.5 g </B> MnC12'4 H, 0 0.5 <B> g </B> C0C12 <B> * 6 </B> H20 <B> 0.1 g </B> CaC12 40.0 <B > g </B> water to make up <B> 1 </B> liters.
The inclined nutrient medium is incubated for <B> 10 </B> days at <B> 330 C </B>. The spores are obtained in the form of an aqueous suspension by covering the inclined nutrient medium with a small amount of sterile distilled water and carefully scraping the spores from the surface of the nutrient medium.
About <B> 1 </B> cm,% of the spore suspension obtained in this way is used to inoculate the following sterilized nutrient medium under sterile conditions: Casein hydrolyzate <B> 1 g </B> <NZ-Amin <B> A, </B> obtained from Sbeffield Farms) Blacksträp -Molasse 2 <B> g </B> K21-I-PO4 0.15 <B> g </B> Water <B> 100 </B> CM3 The inoculated nutrient medium - is incubated for about <B> 72 </B> hours at about 2811 <B> C </B> until good vegetative development can be observed.
About <B> 5 </B> ems of the nutrient medium containing the vegetative form of the organism are used to inoculate a <B> 250 </B> em3 leave the Erlenmeyer flask, which is about <B> 75 </B> em3 sterilized Fermentation medium contains the following composition:
Cane sugar 45 <B> g </B> Soybean meal 20 <B> g </B> Soluble substances obtained from condensed molasses pulp 2 <B> g </B> Sodium chloride <B> 5 g </B> Caleium carbonate 2 <B> g </B> Cobal.tochloride hexahydrate 0,
001 <B> g </B> water to make up <B> 1 </B> liters The flask with the inoculated nutrient medium is placed in an incubation chamber kept at around <B> 280 0 </B> and for six days long on a rotating shaking device with a shaking stroke of about <B> 5 </B> cm and a speed of 240 revolutions per minute. From time to time samples of the nutrient medium are examined for the total amount of the autibiotic active ingredients contained therein. If their amount reaches a value of about <B> 250-300 </B> j / one of the broth, this is filtered to remove the mycelium.
About 11/9 liters of the filtered culture broth are brought to a pH value of 9.5 with sodium hydroxide solution and extracted with 0.75 liters of amyl acetate. The ainylacetate extract, which contains practically all of the autibiotic active ingredients present in the original fermentation broth, is reduced by vacuum evaporation to a volume of around <B> 10 </B> one.
<B> 0.5 g </B> cleaned cellulose fibers are added to the concentrated amyl acetate solution and the mixture is dried overnight in the Vacu-Lun. The dry, finely powdered cellulose, on which all the antibiotic active ingredients of the broth are absorbed, is placed on top of an etomatographic adsorption column measuring about 3.2 X 38 cm.
which contains about <B> 161 g </B> dry, purified cellulose fibers (commercially available under the brand name Solka - flakes). It is chromatographed with 0.1 percent aqueous ammonium hydroxide solution saturated with methyl isobutyl ketone. The eluate is collected in fractions,
which are examined for their antibiotic effectiveness against <B> S. </B> aureus as a test organism. The presence of erythroinyein and / or erythromycin, B is determined by using the same solvent system as above by eromatographic analysis with filter paper.
It can be seen that the first 120 em3 of the wash-out liquid only contain erythromycin, the second 120 ones contain a mixture of erythromycin and erythromycin B. The following active eluate fractions contain only erythromycin B; these are combined and extracted with chloroform.
The chloroform extract is evaporated to dryness in vacuo, and the residue, consisting only of erythroinycin B, is washed with hexane and taken up in 25% ether. The ethereal solution is filtered and evaporated to dryness in vacuo. The residue is dissolved in the smallest possible amount of warm acetone and allowed to cool, whereupon crystals of the erythromycin B separate out.
This crystalline antibiotic contains (like erythromycin) a certain amount of bound solvent. If this solvent is removed, this results in the loss of the crystalline properties of the antibiotic.
<b>. - </B> <I> Example <B> -0 </B> </I> A sterilized nutrient medium is produced which contains the following components: Dextrose 15 <B> g </B> Soybean meal 15 <B> g </B> Cornsteep solids <B> 5.0 g </B> Caleium carbonate 2.0 <B> g </B> Sodium chloride <B> 5.0 g </B> water to make up < B> 1 </B> liter The nutrient medium is inoculated with a spore suspension which is produced by adding Streptomyces erythreus, strain NRRL <B> 2338,
</B> according to the method described in example <B> 1 </B> on an agar inclined soil and scraped off the spores together with a small amount of sterile distilled water. The inoculated nutrient medium, located in a 2 liter bottle, is mixed in a reciprocating shaking device for about 26 hours at about 280 C while shaking the bottle a deflection of <B> 5 </B> and a speed of 114 complete deflections in the MinutA.
The vegetative mycelium obtained is separated off by centrifugation, washed with water and resuspended in about 1 liter of sterile distilled water. The vaccine produced in this way is used to inoculate a 40 liter Gürgefäß, which contains about 20 liters of a sterilized fermentation broth with the following composition:
Glycocolla <B> 150 g </B> Cane sugar <B> 1370 <I> g </I> </B> dl-a-alanine <B>17,8<I>g</I> </B> Primary sodium phosphate <B> 100 g </B> Sodium dichloride 100 <B> g </B> Magnesium sulfate 10 <B> g </B> Ferrosullate heptahydrate 0.4 <B> <I> g </I> </ B> Zinc sulate heptahydrate 0.2 <B> g </B> Magnesium chloride tetrahydrate <B> 0.032 g </B> Cobalt chloride hexahydrate 0.2 <B> g </B> Water to make up to 20 liters The mixture from inorganic salts,
Glycocolla and dl-a-alanine are sterilized together and the pH of the broth is adjusted to about 7.5 after sterilization. The cane sugar is sterilized separately and aseptically added to the sterilized broth.
After the sterilized broth has cooled down, the vaccine produced vegetatively by the process described above is added aseptically. The organism is grown in the broth for about four days at a temperature of about <B> 280 C </B>. During the growth period, the broth is stirred and sterile air is blown through it at a rate of about <B> 0.5 </B> parts by volume to <B> 1 </B> parts of the broth per minute.
Microbiological tests with <B> S. </B> aureus as the test organism show that the total content of antibiotic active ingredients in the broth is about <B> 250 </B> y / ems, of which about <B> 50 </B>% consist of erythromycin B, as can be proven by paper chromatography and bioautograph. The broth is filtered to remove the mycelium,
and erythromy- a B can now be obtained from the clear filtrate.
11/2 liters of the filtered erythromyein and erythrocyin B obtained in this way contain the nutrient broth are adjusted to a pH of 9.5 with aqueous sodium hydroxide solution and about 0.75 > Liters of amyl acetate drawn out. The amyl acetate extract is evaporated to dryness in a vacuum. The evaporation residue is taken up in about 250 ems chloroform, filtered and evaporated to dryness in vacuo.
A solvent system is now produced by adding 20 parts of methyl isobutyl ketone, 20 parts of a <B> 0.1 </B> molecular phosphate buffer solution with a pu value of <B> 6.5 </B> and <B> 1 </ B> Part Ace ton mixes together. If this mixture is left to stand, a two-layer system is formed, which is put into a 200 cm.3 60-tube Craig counter-current extraction system made entirely of glass.
The evaporation residue of the chloroform extract is dissolved in <B> 10 </B> em3 of the upper phase and placed in the first tube of the extraction system. Extraction is then carried out in the usual way in countercurrent. The fractions are again analyzed by paper chromatography and microbiologically using <B> S. </B> aure-Lis as the test organism. It can be seen that fractions no. 27-40 contain only eryt, hromycin B.
These fractions are combined and evaporated down to <B> 130 </B> ems in a vacuum. This residue solution is made up to <B> 10 </B>% sodium chloride content, adjusted to the pH value <B> 9.8 </B> with dilute sodium hydroxide solution and twice with <B> 75 </B> em3 chloroform moved out. The combined chloroform extracts are dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo.
The evaporation residue is dissolved in as little acetone as possible at 470 C, allowed to cool slowly and crystalline erythromycin B is obtained from the solution.
The erythromycin B obtained in this way melted at <B> 190 </B> to <B> 1910 C </B> on the Kofler heating bench. The elemental analysis of a sample dried for three hours at 6011 C in vacuo over phosphorus pentoxide gave the following values: 61.541 / o C; 9.45% H;
2.0% N and (as a difference value) 28.01 1 / o 0.
The electrometric titration in 66% aqueous Dimethyliormamidlös-Luig indicated the presence of a titratable group with a PK'a of <B> 8.5 </B>.
The molecular weight determined on the basis of the titration data is approximately <B> 736 </B>
The UV absorption spectrum of the erythromycin B dissolved in absolute methanol showed a maximum at <B> 286 </B> mu, a minimum at <B> 259 </B> niu and E "", <B> = 59. < / B>
A microbiological test with <B> S. </B> aureus as the test organism shows that a milligramin erythromyein B die. has the same anti-biotic effectiveness as <B> 750 y </B> erythromycin.
The infrared absorption spectrum of a 60 / g solution of erythromycin B in chloroform, on a weight-volume basis, has the following distinguishable absorption maxima between 2.4 and 12 u: <B> 2.50; </ B> 3.34; 5.80; 6.84; 7.24; 7.50; 8.04; 8.54; 8.98; 9.14; 9.48; 9.86; 10.24; 10.56; 10.96; 11.22; 11.54 and 11.94. In Fig. 1 of the drawing, this infrared absorption curve is represented by the solid line.
Provides. If you simultaneously produce chromatograms of erythromycin B and erythromycin using ammoniacal, distilled water saturated with methyl isobutyl ketone as a developing solvent on filter paper strips, the ratio of the velocities with which the antibiotics move is as follows:
EMI0008.0009
Erythromycin B is much more stable than erythromycin in acidic solution. If you adjust aqueous solutions with <B> each </B> about <B> 38 </B> units of erythronlycine B -and erythromycin in ein2 to different- p] I values and <B> j </B> edes- let stand at about <B> 250 </B> C for an hour,
the solutions of erythromycin B show a much greater resistance to acids.
The acid addition salts of erythromycin B can be prepared by treating an aqueous solution of the erythromycin B base with an equivalent amount of an acid and evaporating the solution to dryness in vacuo. You can also treat the solution of the erythromycin B base in an organic solvent with an acid or its solution; the erythromycin salt then precipitates directly from the solution.
When preparing acid addition salts of strong acids, care must be taken that during the addition of the acid to the antibiotic Lun, too high concentrations of the acid occur locally, since some of the erythro- mycine B can decompose if the pH value drops below about 2 for a long time.
Suitable erythromycin B salts are the hydrochloride, suhat, citrate, mandelate, succinate, oleate, palmitate, myristate, stearate, oxalate, thiocyanate and G, 1-ticoheptonate. Other similar salts can be easily prepared by the above-mentioned methods. The relatively nontoxic salts should be selected for therapeutic purposes.
The hydrochloride of erythromycin B, for example, is produced by treating a solution of erythromycin B in ethanol with an equivalent amount of aqueous hydrochloric acid and evaporating the solution to dryness in vacuo with the solid salt separating out. The salt is purified by recrystallization from a mixture of ethanol and acetone.
Erythromycin B and its salts are effective antibiotics which, taking into account the increased molecular weight of the salts, have about the same broad antibacterial effectiveness as erythromycin.