BRPI0721103A2 - Lipase, método de determinação do desempenho da digestão in vitro de uma lipase em comparação com uma lipase de referência, uso de uma lipase ou de uma mistura de lipases, composição farmacêutica, e, método para o tratamento de doença - Google Patents

Lipase, método de determinação do desempenho da digestão in vitro de uma lipase em comparação com uma lipase de referência, uso de uma lipase ou de uma mistura de lipases, composição farmacêutica, e, método para o tratamento de doença Download PDF

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BRPI0721103A2
BRPI0721103A2 BRPI0721103-1A BRPI0721103A BRPI0721103A2 BR PI0721103 A2 BRPI0721103 A2 BR PI0721103A2 BR PI0721103 A BRPI0721103 A BR PI0721103A BR PI0721103 A2 BRPI0721103 A2 BR PI0721103A2
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BR
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lipase
seq
protease
amylase
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BRPI0721103-1A
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Allan Svendsen
Debbie Yaver
Nina Lundin
Michael Lamsa
Peter Colin Gregory
Michael Skjoet
Lars Lehmann Hylling Christensen
Signe Eskildsen Larsen
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Novozymes As
Novozymes Inc
Solvay Pharm Gmbh
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Description

I “LIPASE, MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DO DESEMPENHO DA DIGESTÃO IN VITRO DE UMA LIPASE EM COMPARAÇÃO COM UMA LIPASE DE REFERÊNCIA, USO DE UMA LIPASE OU DE UMA MISTURA DE LIPASES, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODO 5 PARA O TRATAMENTO DE DOENÇA”
Referência a uma listagem de seqüências
Esse pedido contém uma Listagem de Seqüências em uma forma legível por um computador. A forma legível por computador é aqui incorporada por referência.
Campo Técnico
A presente invenção se refere a uma lipase para uso como um medicamento, cuja lipase (a) tem pelo menos 50% de identidade com a seqüência de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; (b) tem atividade lipase; e a qual (c) em comparação com a seqüência dos aminoácidos 1 -269 da SEQ 15 ID NO: 2 compreende as substituições N33Q, T231R e N233R, assim como pelo menos uma substituição adicional selecionada dentre as seguintes El*,D,N; Q4H,P,R; D5E; N8L,Q; Q9H; FIOL; Nl 1C,D,H,L,P,Q,R,S; G23E N26A,H,I; D27I,N,Q,R,S,V; P29T; A30T,V; T37K,M G3 8 A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T, W, Y; N39H,S; E43K; K46M; A49T 20 L52I,R; E56K,Q,R,S; D57G,N; V60E,S; G61R; V63R; A68V; L69I; N71I,S N73Q,Y; I76T; R84E; I86F,L; E87A,H,K,R; I90L,V G91 A,C,E,F,K,L,M,N,S,T,V, W,Y; L93*,F; N94*,K,Q,R,S; F95* D96*,E,G,N,R,S,W,Y; L97M,Q; K98I,T; E99D; N101Q; D102E,G,Y R108M; G109A; D111A,E,N,S; G112A; Tl 141; S115L 25 W117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; D122E,N; Q126L; V128A; D130H H135D; P136H; Y138F; V141E,L; A150V; V154F,I,L; A155V; G156R G161 A,E; Nl 62G,S,T; Gl 63 A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V, W,Y D167E; V168M; V176A,D,F,G,H,I,K,M,N,Q,T,W; Gl77A; R179T; L185M G190C,D; N200Q,S; R205I; L206F; E210D,R,V,Y; S216P; E219D; G225P Τ226Ν; L227F,G; P229R; E239D; G240L; D242E; T244S; G246A; Q249R; N251Q,S; D254A,G,I,K,L,M,N,R,Q,S,Y; I255A,F;
P256A,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y; e L269F,H.
A invenção também se refere às composições farmacêuticas compreendendo essas lipases, assim como algumas dessas lipases como tais.
A invenção ainda se refere aos métodos de determinação, e opcionalmente comparando o desempenho da digestão in vitro das lipases.
As lipases da invenção podem ser usadas em combinação com uma protease e/ou uma amilase. Exemplos de indicações médicas são: Tratamento de distúrbios digestivos, insuficiência exócrina pancreática (PEI), pancreatite, fibrose cística, diabetes tipo I e/ou diabetes tipo II.
A lipase da SEQ ID NO: 2 é uma lipase do tipo selvagem derivada de Humicola lanuginosa DSM 4109 (sinônimo: Thermomyces lanuginosus).
Técnica anterior
A Patente Americana No. 5.614.189 (EP 600868 BI) descreve o uso, dentre outras coisas, de uma lipase derivada de Humieola lanuginosa na terapia de substituição da enzima pancreática, por exemplo, no tratamento de pacientes sofrendo de fibrose cística. Essa lipase é de Humieola lanuginosa DSM 4109 e tem a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2.
WO 92/05249, WO 92/19726, WO 94/25577, WO 95/09909, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 99/42566, WO 00/32758, WO 00/60063, WO 01/83559, WO 01/83559, WO 2002/055679, WO 2002/062973, WO 2002/062973, WO 2004/099400 e WO 2004/111216 descrevem uma série de variantes da SEQ ID NO: 2, porém não o seu uso farmacêutico.
WO 2006/136159 descreve o uso farmacêutico da lipase com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 1, assim como uma variante N33Q sua.
Existe uma necessidade na técnica por lipases melhoradas para uso farmacêutico.
Sumário da invenção 5 A presente invenção fornece lipases melhoradas para uso
farmacêutico. Preferivelmente, as enzimas para uso de acordo com a invenção têm uma eficácia melhorada in vivo e/ou in vitro; uma atividade melhorada; uma estabilidade melhorada; são estáveis contra a degradação por proteases; são estáveis na presença de sais biliares; e/ou têm potencial alergênico 10 reduzido. Mais preferivelmente, as lipases da invenção têm um desempenho de digestão melhorado in vitro, em comparação com uma lipase de referência com a seqüência SEQ ID NO: 2 com as seguintes substituições: N33Q + T231R + N233R.
A presente invenção se refere a uma lipase para uso como um 15 medicamento, cuja lipase (a) tem pelo menos 50% de identidade com a seqüência de aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; (b) tem atividade lipase; e que (c), em comparação com a seqüência de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2, compreende substituições N33Q, T231R e N233R, assim como pelo menos uma substituição adicional selecionada dentre as seguintes: 20 E1*,D,N; Q4H,P,R; D5E; N8L,Q; Q9H; FIOL; Nl 1C,D,H,L,P,Q,R,S; G23E; N26A,H,I; D27I,N,Q,R,S,V; P29T; A30T,V; T37K,M; G3 8A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T, W,Y; N39H,S; E43K; K46M; A49T; L52I,R; E56K,Q,R,S; D57G,N; V60E,S; G61R; V63R; A68V; L69I; N71I,S; N73Q,Y; I76T; R84E; I86F,L; E87A,H,K,R; I90L,V; 25 G91 A,C,E,F,K,L,M,N,S,T,V, W,Y; L93*,F; N94*,K,Q,R,S; F95*; D96*,E,G,N,R,S,W,Y; L97M,Q; Κ98Ι/Γ; E99D; N101Q; D102E,G,Y; R108M; G109 A; D111A,E,N,S; G112A; Tl 141; S115L; Wll7C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; D122E,N; Q126L; V128A; D130H; H135D; P136H; Y138F; V141E,L; A150V; V154F,I,L; A155V; G156R; G161A,E; N162G,S,T; G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y D167E; V168M; V176A,D,F,G,H,I,K,M,N,Q,T,W; G177A; R179T; L185M G190C,D; N200Q,S; R205I; L206F; E210D,R,V,Y; S216P; E219D; G225P T226N; L227F,G; P229R; E239D; G240L; D242E; T244S; G246A; Q249R N251Q,S; D254A,G,I,K,L,M,N,R,Q,S,Y; I255A,F
P256A,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y; e L269F,H.
A invenção ainda se refere ao uso de tais lipases para a produção de um medicamento para o tratamento de distúrbios digestivos. PEI, pancreatite, fibrose cística, diabetes tipo I e/ou diabetes tipo II esses usos 10 opcionalmente ainda compreendendo o uso de uma protease e/ou de uma amilase; assim como a tais lipases para uso no tratamento dessas condições, opcionalmente em combinação com uma protease e/ou com uma amilase.
A invenção ainda se refere a uma composição farmacêutica compreendendo tais lipases, juntamente com pelo menos um material adjuvante farmaceuticamente aceitável, opcionalmente incluindo uma protease e/ou uma amilase.
A invenção também se refere a um método para o tratamento de distúrbios digestivos, PEI, pancreatite (aguda e/ou crônica), fibrose cística, diabetes tipo I e/ou diabetes tipo II, através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de tais lipases, opcionalmente juntamente com uma protease e/ou uma amilase.
Finalmente, a invenção se refere aos métodos para determinar, e opcionalmente comparar os desempenhos da digestão da lipase in vitro; assim como a certas lipases como tais, por exemplo:
Uma lipase a qual (a) tem pelo menos 50% de identidade com
a seqüência de aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; (b) tem atividade lipase; e que (c), em comparação com a seqüência de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 compreende uma substituição em pelo menos uma posição selecionada dentre as seguintes: 9, 30, 38, 39, 63, 112, 114, 115, 117, 122, 128, 130, 136, 154, 155, 156, 161, 163, 168, 185, 190, 239 e 246; e
Uma lipase a qual (a) tem pelo menos 50% de identidade com a seqüência de aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; (b) tem atividade lipase; e a qual
(cl) em comparação com a seqüência de aminoácidos 1 a 269
da SEQ ID NO: 2 compreende pelo menos uma substituição selecionada dentre as seguintes: ElN; Q4H; N8L,Q; Q9H; Nl 1C,D,H,L,P,S; G23E; D27I P29T; A30T,V; T37K,M; G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; N39H,S D57N; G61R; V63R; N71I,S; N73Q,Y; I76T; I86F,L; E87H 10 G91 F,K,L,M,V,Y; N94Q; F95*; D96*; N101Q; Dl 11E; G112A; Tl 141 S115L; Wll7C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; D122E,N; Q126L; V128A D130H, H135D, P136H; V141E,L; V154F,I,L; A155V; G156R; G161A,E N162G,S; G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; V168M; L185M: G190C,D; R205I; G240L; G246A; N251Q,S; e L269F,H; ou a qual,
(c2) em comparação com a seqüência de aminoácidos 1 a 269
da SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos um dos seguintes aminoácidos na posição indicada: IN; 4H; 8L,Q; 9H; 11C,D,H,L,P,S; 23E; 271; 29T; 30T,V 37K,M; 38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; 39H,S; 57N; 6IR; 63R; 7II,S 73Q,Y; 76T; 86F,L; 87H; 91F,K,L,M,V,Y; 94Q; 95*; 96*; 101Q; IllE 20 112 A; 1141; 115L; 117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; 122E,N; 126L; 128A 13 0H, 135D, 136H; 141E,L; 154F,I,L; 155V; 156R; 161A,E; 162G,S 163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; 168M; 185M; 190C,D; 2051 240L; 246A; 251Q,S; e 269F,H.
Descrição detalhada da invenção Lipases
Uma lipase é um polipeptídeo com atividade lipase. No que se segue, a lipase para uso nas composições, métodos e usos da invenção é referida como a lipase da invenção. A lipase da invenção pode ser um éster carboxílico hidrolase EC 3.1.1.-, a qual inclui atividades tais como EC 2.1.1.3 triacilglicerol lipase, EC 3.1.1.4 fosfolipase Α2, EC 3.1.1.5 lisofosfolipase, EC 3.1.1.26 galactolipase, EC 3.1.1.32 fosfolipase Al, EC 3.1.1.73 feruloil esterase. Em uma modalidade particular, a lipase é uma EC 3.1.1.3 triacilglicerol lipase. Em outra modalidade particular, a lipase tem atividade EC 3.1.1.4 fosfolipase A2, isto é, catalisa a reação: fosfatidilcolina + H(2)0 = 1-acilglicerofosfocolina + um carboxilato (remove o ácido graxo ligado na posição 2). Ainda em outra modalidade particular, a lipase tem atividade EC 3.1.1.32 fosfolipase Al, isto é, catalisa a reação: fosfatidilcolina + H(2)0 = 2- acilglicerofosfocolina + um carboxilato.
O número EC se refere à nomenclatura de enzimas 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, São Diego, Califórnia, incluindo os suplementos 1-5 publicados em Eur. J. Biochem., 1994, 223: 1-5; Eur. J. Biochem., 1995, 232: 1-6; Eur. J. Biochem., 1996, 237: 1-5; Eur. J. Biochem., 1997, 250: 1-6; e em Eur. J. Biochem., 1999, 264: 610-650; respectivamente. A nomenclatura é regularmente suplementada e atualizada; ver, por exemplo, na World Wide Web em www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.
A lipase da invenção pode ser uma variante de uma lipase
originária.
Variante
O termo variante é aqui definido como uma lipase compreendendo uma ou mais alterações, tais como substituições, inserções, anulações e/ou truncamentos de um ou mais resíduos de aminoácidos específicos em uma ou mais posições específicas no polipeptídeo, com comparação com uma lipase originária.
Lipase originária
O termo lipase originária se refere ao polipeptídeo com o qual uma variante é comparada e alinhada. Um exemplo particular de uma lipase originária é a lipase para a qual modificações, por exemplo, substituição(ões), inserção(ões), anulação(ões) e/ou truncamento(s) são feitos para produzir as variantes de lipase da presente invenção. A original pode ser uma lipase de ocorrência natural (tipo selvagem), ou ela pode ser uma variante sua, preparada por quaisquer meios adequados. Uma original pode também ser uma variante alélica a qual é um polipeptídeo codificado por qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo local cromossomal.
Em uma modalidade particular, a lipase originária é uma lipase fungica com uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 50% de identidade com a seqüência de aminoácidos 1 a 269 da lipase de T. Ianuginosus mostrada na SEQ ID NO: 2. A lipase originária pode ser uma lipase de levedura tal como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Piehia, Saccharomyees, Schizosaceharomyees, or Yarrowia; ou, mais preferivelmente, uma lipase de fungo filamentoso tal como uma lipase de Aeremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humieola, Magnaporthe, Mueor, Myeeliophthora, Neoeallimastix, Neurospora, Paedlomyees, Penieillium, Piromyees, Schizophyllum, Talaromyees, Thermoaseus, Thielavia, Tolypoeladium, ou Triehoderma - ou uma variante de qualquer uma delas. Uma lipase originária preferida é uma lipase de ascomicete, preferivelmente derivada de uma cepa de Humieola, Talaromyees ou Thermomyees, por exemplo, uma cepa de Humieola fuseoatra, Humieola grisea, Humieola insolens, Humieola lutea, Humieola nigreseens, Humieola sp., Humieola lanuginosa (Thermomyees lanoginosus), Thermomyees ibadanensis, Thermomyees verrueosus, Talaromyees thermophilus, Talaromyees emersonii, ou Talaromyees byssoehlamydoides, ou variantes de qualquer um desses. Em uma modalidade particular, a lipase originária é (i) a lipase de Humieola lanuginosa com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2, ou (ii) uma variante sua.
Nomenclatura das lipases variantes
Na presente invenção, uma numeração específica das posições dos resíduos de aminoácidos nas variantes de lipase é empregada. Através do alinhamento das seqüências de aminoácidos das lipases conhecidas, é possível designar uma numeração da posição de aminoácidos a qualquer resíduo de aminoácidos em qualquer enzima lipase.
5 Com o uso do sistema de numeração originário da seqüência
de aminoácidos da lipase revelada na SEQ ID NO: 2, alinhada com a seqüência de aminoácidos de outra lipase usando o procedimento de alinhamento aqui descrito, é possível indicar a posição de cada resíduo de aminoácido em qualquer outra lipase. Concordantemente, para qualquer lipase 10 da invenção a qual seja comparada com a seqüência de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2, cada posição e/ou substituição corresponde a uma posição dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2.
Ao descrever as várias variantes de lipase da presente invenção, a nomenclatura descrita abaixo é adaptada por facilidade de referência. Em todos os casos, a letra individual IUPAC ou abreviação do aminoácido com três letras é empregada.
Para uma substituição de aminoácidos, a nomenclatura a seguir é usada. Aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Concordantemente, a substituição de asparagina com isoleucina na posição 26 20 é designada como N26I. Várias mutações são separadas pela adição dos símbolos (+), por exemplo, N33Q+E210D+T231R+N233R representa mutações nas posições 33, 210, 231 e 233 substituindo asparagina (N) com glutamina (Q), ácido glutâmico (E) com ácido aspártico (D), treonina (T) com arginina (R) e asparagina (N) com arginina (R), respectivamente.
Para uma anulação de aminoácido, a nomenclatura a seguir é
usada: aminoácido original, posição, *. Concordantemente, a anulação do ácido glutâmico (E) na posição 1 é designada como “El*”. Várias anulações são separadas por marcas de adição (“+”), por exemplo, a anulação de leucina (L), asparagina (N), fenilalanina (F) e ácido aspártico (D) nas posições 93, 94, 95 e 96, respectivamente, é designada como “Lp3*+N94*+F95*+D96*”. Concordantemente, para os atuais propósitos, uma anulação pode de fato ser considerada como um exemplo de uma substituição, a saber, uma substituição do aminoácido original com nada. A variante a seguir da lipase dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 pode, deste modo, ser dita como incluindo 11 substituições no total: 7 substituições em outro aminoácido, e 4 substituições em nada, isto é, 4 anulações: D27R+N3 3 Q+G91A+L93 * +N94 * +F9 5 * +D96 * +D111A+T231R+N233R+P2 56T.
Consequentemente, quando um aminoácido específico pode ser substituído com dois ou mais aminoácidos diferentes ou anulado, isto é indicado como uma substituição, onde os substituintes incluindo a anulação são separados por vírgulas. Por exemplo, a designação “E1*,D,N” significa que glutamina na posição 1 na lipase originária (El) pode ser substituída por nada (isto é, anulada) (*), substituída com ácido aspártico (D) ou substituída com asparagina (N).
Cálculo de identidade e alinhamento
Esta seção se aplica às lipases, amilases e proteases da presente invenção (as enzimas da invenção).
A relação entre as duas seqüências de aminoácidos é descrita pelo parâmetro “identidade”.
Para os propósitos da presente invenção, o alinhamento de duas seqüências de aminoácidos é determinado pelo uso do programa Needle para o pacote EMBOSS (HTTP://emboss.org) versão 2.8.0. O programa Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito em Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453. A matriz de substituição usada é BLOSUM62, a penalidade de abertura de intervalo é 10, e a penalidade de extensão de intervalo é 0,5.
O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácidos da presente invenção (“seqüência de invenção”, por exemplo, variante LVA023 com a seqüência de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 com as seguintes quatro substituições: N33Q+E210D+T231R+N233R) e uma seqüência de aminoácidos diferente (“seqüência estrangeira”, por exemplo, aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2) é calculado como a quantidade de emparelhamentos exatos em um alinhamento das duas seqüências, dividido pelo comprimento da “seqüência da invenção” ou o comprimento da “seqüência estrangeira”, a que for mais curta. O resultado é expresso em identidade porcentual.
Um emparelhamento exato ocorre quando a “seqüência da invenção” e a “seqüência estrangeira” têm resíduos de aminoácidos idênticos nas mesmas posições da sobreposição (no exemplo de alinhamento abaixo isto é representado por “|”). O comprimento de uma seqüência é a quantidade de resíduos de aminoácidos na seqüência (por exemplo, o comprimento da SEQ ID NO: 2 é 269).
No exemplo de alinhamento puramente hipotético abaixo, a sobreposição é a seqüência de aminoácidos “HTWGER-NL” da Seqüência 1; ou a seqüência de aminoácidos “HGWGEDANL” da Seqüência 2. no exemplo um intervalo é indicado por um
Exemplo de alinhamento hipotético:
Seqüência 1: ACMSHTWGER-NL
Seqüência 2: HGWGEDANLAMNPS
Concordantemente, a porcentagem de identidade da Seqüência
1 em relação à Seqüência 2 é 6/12 = 0,5, correspondendo a 50%.
Em uma modalidade particular, a porcentagem de identidade de uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo com ou em relação aos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 é determinada i) pelo alinhamento das duas seqüências de aminoácidos usando o programa Needle, com a matriz de substituição BLOSUM62, uma penalidade de abertura de intervalo de 10 e uma penalidade de extensão de intervalo de 0,5; ii) contagem da quantidade exata de emparelhamentos no alinhamento; iii) divisão da quantidade de emparelhamentos exatos pelo comprimento da mais curta das duas seqüências de aminoácidos, e iv) conversão do resultado da divisão de iii) em porcentagem.
Em uma modalidade preferida, a lipase da invenção é pelo menos 51% idêntica à lipase com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2. Em modalidades preferidas adicionais, ela é pelo menos 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% ou pelo menos 60% idêntica à lipase com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2. Em modalidades preferidas adicionais, a porcentagem de identidade é de pelo menos 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% ou pelo menos 70%. Em outras modalidades preferidas, a porcentagem de identidade é de pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% ou pelo menos 80%. Em modalidades preferidas adicionais, a porcentagem de identidade é de pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou de pelo menos 90%. Em modalidades adicionais mais preferidas, a porcentagem de identidade é de pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou de pelo menos 99%.
Em outra modalidade preferida, a lipase originária é pelo menos 51% idêntica à lipase com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2. Em modalidades preferidas adicionais, ela é pelo menos 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% idêntica à lipase com aminoácidos
1 a 269 da SEQ ID NO: 2.
Propriedades melhoradas
A presente invenção fornece lipases melhoradas para uso farmacêutico. Preferivelmente, as enzimas para uso de acordo com a invenção têm uma eficácia melhorada in vivo e/ou in vitro: uma atividade melhorada; uma estabilidade melhorada; são estáveis contra a degradação pelas proteases; são estáveis na presença de sais biliares; e/ou têm capacidade alergênica reduzida.
As lipases da invenção são preferivelmente purificadas, mais
preferivelmente até a homogeneidade, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 5 de WO 2006/136159. Preparações de lipase purificadas podem ser analisadas por SDS-PAGE, e a lipase pode ser identificada como a principal banda proteica em 30-40 KDa. Por varredura densiométrica de géis SDS- 10 PAGE marcados com Coomassie, essa banda preferivelmente constitui de 90 a 97% do espectro proteico. O densiômetro é, por exemplo, um densiômetro GS-800 calibrado da BIO-RAD.
A lipase da invenção tem um desempenho de digestão melhorado em comparação com uma lipase de referência, preferivelmente um desempenho de digestão melhorado in vitro.
O desempenho de digestão é preferivelmente determinado usando (I) um modelo de digestão, (II) pela determinação da estabilidade em pH 3 na presença de pepsina, e/ou (III) pela determinação da atividade em pH 5 na presença dos sais biliares.
Para cada um dos métodos (I), (II) e (III), os quais são
adicionalmente discutidos abaixo, a variante da lipase N33Q+T231R+N233R da SEQ ID NO: 2 é um exemplo preferido de uma lipase de referência (revelada em WO 2006/136159). Outros exemplos de lipases de referência são: A lipase da SEQ ID NO: 1 (N33Q+T231R da SEQ ID NO: 2) e a lipase 25 da SEQ ID NO: 2. Ainda outro exemplo de uma lipase de referência é a média da lipase dos aminoácidos +1 a +269 da SEQ ID NO: Iea variante N33Q sua.
O modelo de digestão (I) representa um novo método de determinação do desempenho de digestão, o qual compreende os seguintes passos:
a) seleção de uma lipase de referência;
b) mistura de 100 partes por volume de uma dieta com 20 partes por volume de pepsina e 30 partes por volume da lipase da lipase de
referência, respectivamente;
c) adição de i) 0 ou ii) 10 partes por volume de tampão (MES 0,8 M, acetato de sódio 0,8 M, imidazol 0,8 M, pH 7,0), em que o passo i) pode ser referido como um passo gástrico de pH 3, e o passo ii) pode ser referido como um passo gástrico de pH 5;
d) incubação por 1 hora a 37°C com agitação;
e) adição de 20 partes por volume de sais biliares, assim como i) 25 ou ii) 15 partes por volume de tampão (MES 0,8 M, acetato de sódio 0,8 M, imidazol 0,8 M, pH 7,0), em que o passo i) corresponde a um passo gástrico de pH 3, e o passo ii) corresponde a um passo gástrico de pH 5;
f) incubação por 2 horas a 37°C com agitação;
g) adição de 50 partes por volume de Triton-XlOO 10% em ácido fosfórico 1 M;
h) determinação da quantidade de ácidos graxos livres;
i) ajuste das curvas de dose resposta à equação:
FFA = FFAmax * [E]/([E] + K)
onde FFA é a quantidade de ácidos graxos livre liberados, FFAmax é a quantidade máxima de ácidos graxos livres que as lipases podem liberar da dieta, [E] é a concentração de lipase e K é a concentração de lipase que libera metade da FFAmax; e j) cálculo do fator de melhoramento (IF) que está a seguir:
IF = K(ref)/K(lipase), onde K(ref) é a concentração da lipase de referência que libera metade da FFAmax e K(Iipase) é a concentração de lipase que libera metade da FFAmax. O desempenho da digestão também pode ser determinado pelo novo teste de estabilidade da pepsina em pH 3, referido como (II) acima, cujo método compreende os passos a seguir:
i) selecionar uma lipase de referência;
ii) misturar 5 partes por volume da lipase da lipase de
referência, respectivamente, com 5 partes por volume de
a) um diluente contendo Triton-XlOO 0,01% e NaCl 10 mM,
ou
b) uma solução de tratamento de pepsina contendo 105 ug/mL de pepsina, CaCl2 4 mM, Triton-XlOO 0,01% e citrato 50 mM, pH 3,0,
em que a) é referido como uma amostra não-tratada, e b) é referido como uma amostra tratada com pepsina;
iii) incubar as amostras do passo ii) por 3 horas a 20°C;
iv) adicionar a cada amostra do passo iii) 55 partes por volume de substrato contendo PNP-palmitato I mM, Triton-XlOO 1,2%, CaCl2 4
mM,. TRIS 100 mM, pH 8,0, juntamente com
a) 5 partes por volume de solução de tratamento de pepsina, ou
b) 5 partes por volume de diluente
em que a) se refere à amostra não-tratada, e b) à amostra tratada com pepsina;
v) seguir à degradação do substrato com a leitura de OD40S das amostras de iv) em intervalos;
vi) coletar dados de v) que são englobados na faixa linear e calcular a atividade da lipase para a amostra tratada com pepsina e a amostra
não-tratada, respectivamente, em mOD (mili OD) por hora;
vii) calcular a % da atividade de lipase residual (%RA) pela divisão da atividade da lipase da amostra tratada com pepsina com aquela da amostra não-tratada tal como resultam do passo vi), e multiplicar o resultado por 100; e, caso seja desejável, viii) comparar a % de RA da lipase com aquela da lipase de referência.
O desempenho da digestão pode também ser determinado pelo novo testa da atividade dos sais biliares em pH 5, referido como (III) acima, cujo método compreende os passos a seguir:
i) selecionar uma lipase de referência;
ii) misturar 10 partes por volume da lipase ou da lipase de referência, respectivamente, com 23 partes por volume de a) água, ou b) sais biliares 20 mM, em que a) é refere-se à amostra não-tratada, e b) refere-se à amostra de sais biliares;
iii) adicionar, a cada amostra de ii), 200 partes por volume de substrato contendo PNP oleato 1 mM em succinato 25 mM, CaCl2 2 mM, Triton-XlOO 1,2%, pH 5,0, e misturar;
iv) imediatamente após o passo iii), remover, de cada amostra, 60 partes por volume da mistura resultante e transferir quatro vezes 15 partes por seu volume em quatro compartimentos separados;
v) adicionar, depois de 1, 2, 3 e 4 horas, 60 partes por volume de TRIS 100 mM, pH 8,0, ao compartimento respectivo dos quatro compartimentos de iv), Ier imediatamente em OD 405 e, com base na faixa linear das leituras de 1, 2, 3 e 4 horas, calcular a atividade em Mod/HORA;
vi) dividir, para a lipase, assim como para a lipase de referência, a atividade, obtida no passo v), da amostra dos sais biliares pela atividade da amostra não-tratada, conforme também obtida no passo v), para obter as proporções de estabilidade dos sais biliares da lipase e da lipase de referência, respectivamente; e
vii) dividir a proporção da estabilidade dos sais biliares da lipase pela proporção da estabilidade dos sais biliares da lipase de referência, cuja proporção resultante pode ser definida como o fator de melhoramento da lipase. Foi verificado que os métodos (I), (II) e (III) surpreendentemente identificam as lipases melhoradas, das quais uma alta proporção também pode ser fornecida in vivo.
Método (!)
O modelo de digestão (referido como (I) acima) mimetiza a digestão nos animais monogástricos (tais como, por exemplo, seres suínos e humanos) sofrendo de insuficiência exócrina pancreática.
Triton X-IOO (C14H22O(C2H4O)n) (No. CAS 9002-93-1) é um tensoativo não-iônico o qual tem um grupo óxido de polietileno hidrofílico (em média, ele tem 9,5 unidades de óxido de etileno, isto é, n = 9-10) e um grupo lipofílico ou hidrofóbico. O grupo de hidrocarboneto é um grupo 4- (1,1,3,3 -tetrametilbutil)-fenil.
O termo “partes por volume” designa preferivelmente microlitro, o qual pode ser abreviado como ul, uL, μΐ ou μι.
Em modalidades particulares do modelo de digestão in vitro,
(a) a concentração de pepsina é de 700 mg/mL; (b) a lipase e/ou a lipase de referência são analisadas em 4 diferentes concentrações, cada uma preferivelmente em duplicata; e/ou (c) as reações ocorrem em poços de uma placa de microtitulação.
Em modalidades particulares adicionais do modelo de digestão in vitro, (d) a concentração dos sais biliares é de 50 g/L; (e) o pH resultante depois da adição dos sais biliares e do tampão no passo e) está na faixa de 5,7 a 6,0; e/ou (f) Triton-XIOO, quando adicionado no passo g), serve para interromper a reação.
Em ainda outras modalidades particulares do modelo de digestão in vitro, (g) a quantidade de ácidos graxos livres é determinada após a diluição apropriada, tal como 125 a 250 vezes, preferivelmente em Triton- XIOO 1%, e preferivelmente determinada usando um kit NEFA C da Wako Chemicals, o qual é descrito no Exemplo 3): (h) a curva dose-resposta no passo i) refere-se à curva mostrando a resposta, a saber, a quantidade de ácidos graxos livres, em função da dose de lipase; e/ou (i) assumindo que FFAmax é idêntico às lipases, isto é, para a lipase de referência e a(s) lipase(s) em questão.
Em modalidades particulares adicionais do modelo de digestão in vitro, (j) a Titulação de Sítio Ativo (AST, Exemplo 6) é usada para determinar a concentração de lipase/ e/ou (k) A2so é usado para determinar a concentração de lipase, preferivelmente usando o coeficiente de extinção 1,24 A280Ang.
Uma lipase melhorada é definida como uma lipase a qual tem um fator de melhoramento acima de 1,00. Em modalidades particulares, (i) o fator de melhoramento é o fator de melhoramento médio, (ii) o fator de melhoramento é o fator de melhoramento médio menos o desvio padrão; e/ou (iii) o fator de melhoramento é maior do que 1,0, ou maior do que 1. O desvio médio ou padrão leva a variação experimental em consideração e pode ser calculado conforme é conhecido na técnica, por exemplo, Desvio padrão = (soma(IF-Média(IF))/(n-l))A0,5, onde IF é o fator de melhoramento, Média(IF) é a média dos fatores de melhoramento calculados e n é a quantidade de fatores de melhoramento calculados. O V invertido significa exponencial.
A dieta do modelo de digestão in vitro contém preferivelmente entre 250 e 400 g de gordura/Kg, mais preferivelmente entre 300 e 350 g de gordura/Kg, mais preferivelmente entre 313 e 340 g de gordura/Kg. O conteúdo de carboidratos e proteína não é relevante, porém ele preferivelmente reflete as necessidades e recomendações de dieta usuais e típicas, por exemplo, um conteúdo de carboidratos de 250 a 500 g/Kg, e um conteúdo de proteínas entre IOe 200 g/Kg. A dieta pode ser selecionada, por exemplo, da Dieta I (340 g de gordura/Kg, 450 g de carboidrato/Kg, 20 g de proteína/Kg) ou a Dieta II (313 g de gordura/Kg, 358 g de carboidrato/Kg e 146 g de proteína/Kg). A Dieta I contém 247,2 partes em peso de leite de vaca (1,5% de gordura), 29,9 partes em peso de óleo de oliva, 87 partes em peso de Calshake (comercialmente disponível da Fresenius LKabi e com um conteúdo de energia de 2077 Kg/J, um conteúdo de proteína de 4,3 g de proteína de leite/100 g e um conteúdo de gordura de 24,4 g de gordura/100 g) e 9,9 partes em peso de g de Methocel (grau alimentício, E5 Premium LV FG (E464); Dow). Os ingredientes são misturados, por exemplo, usando um UltraTurrex (YellowLine DI 25 básico) por 2 minutos. Opcionalmente, a dieta é tratada com 0,5 ug/mL de protease SAVINASE 16,0 LEX (comercialmente disponível da Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca) em pH 8,0 por 4 horas a 50°C para reduzir a viscosidade. A protease é subsequentemente inativada pela redução do pH até 3 e incubando a 70°C por 30 min, ou 5 O0C por 60 min. O termo “partes em peso” se refere preferivelmente a gramas (g).
A Dieta (II) preferivelmente consiste de 73 g/Kg (peso úmido) de farinha de aves (Altromin), 73 g/Kg de farinha de ervilha, 73 g/Kg de caseína (precipitada sob condições ácidas, da Altromin), 290 g/Kg de farinha de trigo, 290 g/Kg de amido de batata, 125 g/Kg de toicinho, 76 g/Kg de vitaminas, minerais e elementos traço, e 375 g/Kg de creme de leite (33% de gordura).
Método (II)
As seguintes são modalidades particulares do método de determinação do desempenho de digestão pela medição da estabilidade em pH 3 na presença de pepsina, cujo método é referido como em (II) acima:
a) As lipases usadas no passo (ii) são sobrenadantes de cultura, preferivelmente preparados como a seguir: colônias de levedura individuais, tais como colônias de Saccharomyces cerevisiae JG 169 (ver, por exemplo, a Patente Americana No. 7.217.433), capaz de expressar a lipase são tomadas em 1 parte por volume (por exemplo, 1 mL) de um meio adequado) (por exemplo, o meio de cultura de semeadura do Exemplo 8), e crescidas de um dia para o outro a 3O0C e 250 rpm. A expressão da lipase é conseguida pela inoculação de 0,020 partes por volume (por exemplo, 20 uL) da cultura de semeadura resultante em 1 parte por volume de um meio adequado (por exemplo, o meio otimizado do Exemplo 8) e pelo cultivo a 3O0C e 250 rpm por 4 a 6 dias. O cultivo pode ser efetuado, por exemplo, em placas de microtitulação, por exemplo, em placas com 24 poços, ou em frascos de agitação. As amostras de lipase podem ser diluídas adequadamente, por exemplo, por 25 vezes, em diluente;
(b) as 3 horas de incubação do passo iii) podem ser em temperatura ambiente;
(c) a leitura do OD405 do passo v) pode, por exemplo, ocorrer 6 vezes; e, por exemplo, já em 20 minutos depois da adição do substrato e contanto que em 18 horas depois da adição do substrato;
(d) no passo vi), a atividade da lipase é calculada para a amostra tratada com pepsina e a amostra não-tratada, respectivamente, em mOD (mili OD) por hora, e dados de v) são coletados que se enquadram na faixa linear;
(e) no passo vii), o cálculo da % de atividade lipase residual (%RA) pela divisão da taxa do passo vi) da lipase tratada com pepsina pela taxa da condição não-tratada e multiplicando o resultado por 100; e/ou
(f) no passo v), a OD 540 também é lida e usada para corrigir a OD de fundo pela subtração da leitura de OD540 da leitura de OD405.
Método (III)
As seguintes são modalidades particulares do método de determinação do desempenho de digestão pela medição da atividade em pH 5 na presença dos sais biliares (referidas como (III) acima):
a) as lipases usadas no passo ii) são purificadas; (b) as lipases são apropriadamente diluídas, tipicamente entre 25 vezes e 200 vezes em diluente (tal como Triton-XIOO 0,01%, NaCl 10 mM), por exemplo, até aproximadamente 8 microgramas/mL; (c) a concentração das amostras de lipase purificada é determinada a partir da absorbância a 280 nm usando o 5 coeficiente de extinção de 1,24 A28o/mg; (d) ODs entre cerca de 0,100 e 0,475 estão na faixa linear; e/ou (e) os sais biliares são Sigma B-8756 compostos em água destilada até 20 mM.
Em outra modalidade particular (f) no passo vi), uma proporção da atividade na presença de sais biliares em pH 5,0 é expressa 10 como uma porcentagem pelo cálculo da média de todos os dados lineares obtidos no passo v) corrigido pelo tempo e diluição para a atividade dos “sais biliares” dividido pela média de todos os dados lineares corrigidos pelo tempo e diluição para a atividade dos “sais não-biliares”.
(A) Em uma primeira modalidade, a lipase da invenção é selecionada dentre lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
N33Q+E87K+T231R+N233R;
N33Q+N94K+T231R+N233R;
N33Q+D96Y+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R;
N26I+N33Q+T231R+N233R;
A30T+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+G91A+T231R+N233R;
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R; P29T+N33Q+T231R+N233R; N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+G91E+T231R+N233R; e N33Q+N94K+T231R+N233R.
Em uma segunda modalidade particular, a lipase da invenção é
selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
N3 3 Q+K98I+T231R+N23 3R;
A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R;
N3 3 Q+G91V+T231R+N23 3R;
N33Q+G91A+T231R+N233R;
N3 3 Q+G91V+L97M+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R;
P29T+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N3 3 Q+G91E+T231R+N233R; e
N33Q+N94K+T231R+N233R.
Em uma terceira modalidade particular, a lipase da invenção é
selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2: N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N3 3 Q+G91A+T231R+N23 3R;
N3 3 Q+G91V+L97M+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R; Ν3 3 Q+G91Ε+Τ231R+N23 3 R; e
N33Q+N94K+T231R+N233R.
Em uma quarta modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
N3 3 Q+G91V+T231R+N23 3 R;
N33Q+G91A+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R; e
N3 3 Q+G91E+T231R+N23 3R.
Todas as variantes da lipase dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 com as substituições listadas acima (cada uma das quatro modalidades particulares) têm um desempenho de digestão in vitro melhorado, isto é, um fator de melhoramento (IF) de pelo menos 1,50 (ou
1,5), 2,00 (ou 2,0), 2,50 (ou 2,5), 3,00 (ou 3,0), 3,50 (ou 3,5), ou de pelo menos 4,00 (ou 4,0), preferivelmente de pelo menos 5,00 (ou 5,0), 6,00 (ou 10 6,0), 7,00 (ou 7,0), 8,00 (ou 8,0), 9,00 (ou 9,0), 10,00 (ou 10,0) ou de pelo menos 11,00 (ou 11,0). Uma etapa gástrica de pH 3 é preferivelmente usada. Uma dieta preferida é a dieta II. A Titulação de Sítio Ativo (AST, Exemplo 6) e/ou A28o pode ser usado para determinar a concentração de lipase, preferivelmente usando o coeficiente de extinção de 1,24 A28(/mg.
(B) Em outra primeira modalidade particular, a lipase da
invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R;
D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R;
Q9H+N3 3 Q+D102E+T231R+N23 3 R;
N33Q+D111E+T231R+N233R;
N33Q+D122E+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; N33Q+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91 A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T;
NI 1R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+N39H+T231R+N233R;
N33Q+P229R+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; D27R+N 3 3 Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T;
D27R+N 3 3 Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T; D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+N200S+T231R+N233R;
N33Q+N39S+T231R+N233R;
N33Q+E210R+T231R+N233R;
N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R;
N33Q+T231R+N233R+D254R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+D96R+T231R+N233R;
D27N+N33Q+T231R+N233R;
D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+L227F+T231R+N233R;
N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R;
N33Q+G225P+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+D96G+T231R+N233R;
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+D254G;
N3 3 Q+D13 0H+T231R+N23 3R;
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+E239D;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N3 3 Q+E210V+T231R+N23 3R+D254S;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N23 3R+D254G; N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+Gl 63Κ+Τ231R+N233R+D254S;
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R;
Q4R+D2 7R+N 33Q+G91T+N 94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N3 3 Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G177A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+G246A;
D27N+N33Q+G91 T+Gl 63K+T231R+N233R+D254S; D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R; e N3 3 Q+G91T+E219D+T231R+N23 3 R.
Em outra segunda modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R; D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T; N33Q+N39S+T231R+N233R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S; N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G; N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T; e D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S.
Em outra terceira modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2: N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; e
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R.
Em outra quarta modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
NE3 3 Q+G91T+94 S +D111A+V176I+T231R+N233R.
Todas as variantes da lipase dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 com as substituições listadas acima (cada uma das quatro outras modalidades particulares) têm um desempenho de digestão in vitro melhorado, isto é, um fator de melhoramento (IF), preferivelmente IF médio menos desvio padrão, maior do que 1,00, ou de pelo menos 1,50 (ou 1,5),
2.00 (ou 2,0), 2,50 (ou 2,5), 3,00 (ou 3,0), 3,50 (ou 3,5), ou de pelo menos
4.00 (ou 4,0), preferivelmente de pelo menos 5,00 (ou 5,0), 6,00 (ou 6,0), 7,00 (ou 7,0), 8,00 (ou 8,0), 9,00 (ou 9,0), 10,00 (ou 10,0) ou de pelo menos 11,00 (ou 11,0). Uma etapa gástrica de pH 3 é preferivelmente usada. Uma dieta
preferida é a dieta I. A Titulação de Sítio Ativo (AST, Exemplo 6) é preferivelmente usada para determinar a concentração de lipase.
(C) Em ainda outra primeira modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ
ID NO: 2:
N33Q+E219D+T231R+N233R;
N33Q+W117L+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R; N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N23 3R+P25 6Τ; Q4R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96W+T231R+N233R; e N33Q+G91N+T231R+N233R.
Em ainda outra segunda modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ
ID NO: 2:
N33Q+E219D+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R; e
D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T.
Em ainda outra terceira modalidade particular, a lipase da
invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
N33Q+E219D+T231R+N233R; e N33Q+G91T+T231R+N233R.
Todas as variantes da lipase dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 com as substituições listadas acima (cada uma das três modalidades particulares adicionais) têm um desempenho de digestão in vitro melhorado, isto é, um fator de melhoramento (IF), preferivelmente IF médio menos desvio padrão, maior do que 1,00, ou de pelo menos 1,50 (ou 1,5), 2,00 (ou
2.0), 2,50 (ou 2,5), 3,00 (ou 3,0), 3,50 (ou 3,5), ou de pelo menos 4,00 (ou 4,0), preferivelmente de pelo menos 5,00 (ou 5,0), 6,00 (ou 6,0), 7,00 (ou
7.0), 8,00 (ou 8,0), 9,00 (ou 9,0), 10,00 (ou 10,0) ou de pelo menos 11,00 (ou
11.0). Uma etapa gástrica de pH 3 é preferivelmente usada. Uma dieta preferida é a dieta II. A Titulação de Sítio Ativo (AST, Exemplo 6) é preferivelmente usada para determinar a concentração de lipase.
(D) Em uma primeira modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ
ID NO: 2:
N33Q+D167E+T231R+N233R;
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N33Q+E210V+T231R+N233R;
N3 3 Q+E56K+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254G;
N33Q+D96S+T231R+N233R;
N33Q+D122N+T231R+N233R;
N26A+N33Q+T231R+N233R;
N3 3 Q+N162T+T231R+N23 3R;
N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+G240L;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
Nll R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R;
Q4R+D27R+N3 3 Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T;
N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R;
N33Q+G163R+T231R+N233R;
N3 3 Q+G163N+T231R+N23 3R;
N33Q+G163C+T231R+N233R;
N33Q+G163Q+T231R+N233R;
N33Q+G163E+T231R+N233R;
N33Q+G163H+T231R+N233R;
N33Q+G163I+T231R+N233R;
N33Q+G91K+T231R+N233R;
N33Q+G91M+T231R+N233R;
N33Q+G91F+T231R+N233R; N33Q+G91S+T231R+N233R;
N33Q+G91W+T231R+N233R;
N33Q+G91Y+T231R+N233R;
Ν3 3 Q+G163 Y+T231R+N23 3 R;
N33Q+G163V+T231R+N233R;
N33Q+G91C+T231R+N233R;
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R;
N3 3 Q+G91M+G161E+T231R+N23 3 R;
N33Q+V128 A+T231R+N233R;
N33Q+V128A+T231R+N233R;
N33Q+G163E+T231R+N233R;
N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R;
N33Q+G38A+T231R+N233R;
N33Q+G163 A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R; N33Q+G163M+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T; N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N3 3 Q+G91T+N 94R+D111A+W117L+T231R+N233R;
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256T;
N33Q+T231R+N233R+D242E;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+N162G+T231R+N233R;
N33Q+G91L+T231R+N233R;
N33Q+E87H+T231R+N233R;
N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163A+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254A;
N33Q+T231R+N233R+D254N;
N33Q+T231R+N233R+D254L;
N33Q+T231R+N233R+D254K;
N33Q+T231R+N233R+D254M;
D27V+N33 Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N23 3 R+Q249R; N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R;
Ν3 3 Q+E219D+L227G+T231R+N23 3 R+Q249R; D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+W117L+L227G+T231R+N23 3 R+Q249R;
D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27Q+N3 3 Q+E219D+L227G+T231R+N23 3 R+Q249R;
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N23 3R+P256T; D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D2 54S+P256T;
D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N3 3 Q+G91N+N94R+D111S+A15 5 V+S216P+L227G+T231R+N23 3 R+D254S+ Ρ256Τ;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+D111 A+Wl 17L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256N;
N33Q+T231R+N233R+P256G;
N33Q+T231R+N233R+P256H;
N33Q+T231R+N233R+P256M;
N33Q+T231R+N233R+P256W; N33Q+T231R+N233R+P256Y;
N33Q+T231R+N233R+P256F;
N33Q+T231R+N233R+P256V;
N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R;
Ν3 3 Q+G91M+G163 D+T231R+N23 3R;
Ν33 Q+G91K+G163 W+T231R+N23 3R;
N3 3 Q+G91T+G163 W+T231R+N23 3 R; N33Q+V176N+T231R+N233R;
N33Q+V176D+T231R+N233R;
N33Q+W117F+T231R+N233R;
N33Q+V176I+T231R+N233R;
N33Q+D111N+T231R+N233R;
N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R;
N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R;
D27R+N3 3Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R; N3 3 Q+G91M+G163P+T231R+N233R; N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R;
N33Q+W117D+T231R+N233R;
N33Q+W117H+T231R+N233R;
N33Q+W117C+T231R+N233R;
N33Q+W117C+T231R+N233R;
N33Q+W117K+T231R+N233R;
N33Q+W117V+T231R+N233R;
Nl 1S+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+W117E+V176K+T231R+N233R;
N33Q+W117G+T231R+N233R;
N33Q+W117P+T231R+N233R;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33Q+W117T+T231R+N233R;
N33Q+W117I+T231R+N233R; D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+V176M+T231R+N233R;
N33Q+V176H+T231R+N233R; N33Q+V176Α+Τ231R+N233R; D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+W117Y+T231R+N233R;
N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R; D27R+N33Q+P136H+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
NI 1R+N33Q+T231R+N233R+T244S;
Ν3 3 Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S; N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G161A+T231R+N233R;
N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R;
N33Q+N101Q+T231R+N233R;
N33Q+N94Q+T231R+N233R;
NI 1Q+N33Q+T231R+N233R;
N8Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+N251Q;
N33Q+N200Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R;
N33Q+N73Q+T231R+N233R;
N33Q+I86L+T231R+N233R;
N33Q+K98I+G163K+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163 A+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R; N33Q+K98I+G163K+N200Q+T231R+N233R+N251S; N33Q+G38S+G163K+T231R+N233R;
N33Q G38Y T231RN233R;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; D2 7R+N 33Q+G91T+N 94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; N33Q+G38N+N73Q+T231R+N233R;
N33Q+G38D+R84E+T231R+N233R;
N33Q+G38Q+T231R+N233R;
N33Q+G38I+T231R+N233R;
N33Q+G38K+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R; Ν33 Q+G3 8H+N200Q+T231R+N23 3R+N251S;
N33Q+G38L+T231R+N233R;
N33Q+G38P+T231R+N233R;
N33Q+G38T+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G91 T+Wl 17I+G163K+T231R+N233R+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; NI 1R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111 A+Gl 63A+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R+P256A; N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A;
E1NN33Q T231RN233R;
N33Q G38H T231RN233R;
N11R+N3 3 Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N23 3 R+D254S; N33Q+K98I+T231R+N233R;
D27R+N33Q+W117I+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
Nll R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33 Q+G3 8 A+G163 A+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+T231R+N233R+D254Q;
Nl 1R+N33Q+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+G 163K+V176W+T231R+N233R+D254S; N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
E1D+N3 3 Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N23 3 R+D254S;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N3 3 Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T;
D27R+N3 3 Q+T3 7K+N711+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N23 3 R+ Ρ256Τ;
D27R+N33 Q+E43K+K46M+I90 V+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+S216P+L227G+T231 R+N233R+P256T;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33 Q+G61R+V63R+G15 6R+V176 W+T231R+N23 3R+P2561;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G156R+V176 W+T231R+N23 3R+Q249R;
N3 3 Q+G91T+N94S+D111A+G163T+V176W+T231R+N23 3R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+N233R;
Nll R+D27R+N 3 3 Q+E5 6Q+D5 7N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+
T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T;
NI 1R+D27R+N3 3 Q+E5 6Q+D5 7N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+ D242E+D254S+P256T;
D27R+N 3 3 Q+G3 8 A+E5 6Q+D5 7N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T;
Q4R+D27Q+N 3 3 Q+G91T+N94S+E99D+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256L;
N33Q+G38A+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+D254I;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
Nl 1R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E56Q+G91 T+Gl 63K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G3 8 A+G91 T+G 112A+G163 A+T231R+N23 3R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+G 163K+T231R+N233R+D254I;
N11R+N 33Q+G91T+G163 K+V176T+T231R+N23 3 R+D254S; N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91 T+Gl 63K+V176D+T231R+N233R+D254S; N33Q+E56Q+G156R+V176W+T231R+N233R;
E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111 A+Wl 17L+V176W+T231R+N233R; N33Q+G163 K+G177 A+T231R+N233 R+G246A;
N11R+N3 3 Q+E56Q+G91 T+Gl 63K+T231R+N23 3R+D254S;
Nl 1R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N3 3 Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+ Q249R+D254S+P256T;
D2 7R+N 3 3 Q+E5 6Q+D 5 7N+G91N+N 94R+D111S+S216P+E219D+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T;
Nl 1R+N33Q+I90L+G91T+N94S+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+G 163K+V176I+T231R+N23 3R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+N3 3 Q+G91 T+G 163 A+V176T+T231R+N23 3 R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+G 163L+V176T+T231R+N233R+D254S; N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+G 163P+V176I+T231R+N23 3R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N; D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+ N233R+Q249R+D254S+P256T;
Q4R+D2 7 Q+N 3 3 Q+G91T+N 94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256L;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256L;
N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254Y+I255F;
N33Q+L93F+D102Y+T231R+N233R;
D2 7R+N 3 3 Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
NI 1S+N33Q+T231R+N233R;
NI 1 R+N 3 3 Q+T231R+N23 3R; N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R;
N8L+N11R+N33Q+G91 T+Gl 63K+T231R+N23 3R+D254S; E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R; NI 1R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F;
N11R+N33Q+G91 T+G 163K+T231R+N23 3R+P256F;
NI 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F;
NI 1R+N33Q+G38A+G91T+G156R+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S;
N3 3 Q+G91K+D96S+G163T+T231R+N23 3 R+Q249R;
NI 1R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
Nll R+N33Q+G91 K+Gl 63K+T231R+N233R+D254S;
Nll R+G23 E+N 3 3 Q+G91T+G163 K+T2 31R+N23 3 R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+T37K+G91 T+Gl 63K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+G 163 A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N3 3 Q+T3 7M+G91 T+G 163 P+V176T+T231R+N23 3R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I; N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R;
Nl 1R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+L227G+ T231R+N233R+D254S+P256T;
NI 1 R+N 3 3 Q+G3 8 A+G91 T+Gl 63 P+V 176G+T231R+N233R+D254S; N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38 A+G91 T+Gl 63T+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G3 8 A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
E1 *+N 11R+N33Q+G38 A+G91N+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S; E1N+N11 R+N 3 3 Q+G3 8 A+G91 T+G 163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+F1OL+N11R+N3 3 Q+G3 8 A+G91T+G163 P+V 176F+T231R+N23 3 R;
E1N+N33Q+G38A+G91 T+G 163P+V176F+T231R+N233R+D254S; E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33 Q+G3 8 A+G91 T+G 163 P+V 176F+L227F+T231R+N23 3R;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R; E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S; E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q; Ε1Ν+Ν11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S; N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+T231R+N233R; N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176I+T231R+N233R;
Nl 1R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; NI 1R+N33Q+G3 8 A+G91T+S115L+G163K+T231R+N23 3R+D254S+P256T;
E1N+N11 R+N 3 3 Q+G91T+G163 A+T231R+N23 3 R+G246A+D254S;
Nl 1R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+ P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F+L269F;
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F;
Nl 1C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
NI 1H+N33Q+G91 T+Gl 63K+T231R+N233R+D254S;
N11D+N33Q+G91 T+G 163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N 3 3 Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; Nl 1P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227 G+
T231R+N233R+P256L;
N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S; e Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S.
Em uma segunda modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N3 3 Q+E21OV+T231R+N23 3 R;
N33Q+E56K+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+D254G;
N33Q+D96S+T231R+N233R;
N33Q+N162T+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+G240L;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S; N33Q+G163N+T231R+N233R;
N33Q+G163Q+T231R+N233R;
Ν3 3 Q+G163 E+T231R+N23 3 R;
N33Q+G91M+T231R+N233R;
N33Q+G91F+T231R+N233R;
N3 3 Q+G 163 Y+T231R+N23 3 R;
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R;
N33Q+V128A+T231R+N233R;
N33Q+G38A+T231R+N233R;
N33Q+G163M+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T; N3 3 Q+G91T+N 94R+T2 31R+N23 3R+D254S;
N33Q+G91T+N94R+D111 A+Wl 17L+T231R+N233R;
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256T;
N33Q+T231R+N233R+D242E;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+N162G+T231R+N233R;
N33Q+G91L+T231R+N233R;
N33Q+E87H+T231R+N233R;
N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254L;
N33Q+T231R+N233R+D254K; N33Q+T231R+N233R+D254M;
D27V+N33 Q+V60S+G91T+D96 W+T231R+N23 3R+Q249R; N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R;
Ν33 Q+E219D+L227G+T231R+N23 3 R+Q249R; D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
Ν3 3 Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N23 3 R+Q249R;
D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256N;
N33Q+T231R+N233R+P256G;
N33Q+T231R+N233R+P256M;
N33Q+T231R+N233R+P256W;
N33Q+W117F+T231R+N233R;
N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
N33Q+W117C+T231R+N233R;
N33Q+W117C+T231R+N233R;
N33Q+W117K+T231R+N233R;
NI 1S+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+W117G+T231R+N233R;
N33Q+W117P+T231R+N233R;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33Q+W117Τ+Τ231R+N233R; D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11 R+N 3 3 Q+T231R+N23 3R+T244S;
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S; N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G3 8I+G177A+T231R+N23 3R;
N33Q+N101Q+T231R+N233R; N33Q+N94Q+T231R+N233R;
NI 1Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R;
N33Q+N73Q+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+G38I+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N25IS;
N33Q+G38T+T231R+N233R;
NI 1R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G91 T+Wl 17I+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N3 3Q+G38A+G91T+D96E+D111 A+Gl 63 A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A;
N33Q G38H T231RN233R;
N11R+N3 3 Q+G91 T+Gl 63K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38 A+G91 T+G 163K+T231R+N233R+D254S; N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+G91T+N94R+D111 A+Wl 17L+V176W+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N +N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T;
D27R+N3 3 Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231 R+
N233R+P256T;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N3 3 Q+D96N+G156R+V176 W+T231R+N23 3R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+N233R; NI 1R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+ D242E+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T;
NI 1R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N11R+D2 7R+N 3 3 Q+G91T+D96E+D111 A+Gl 63Κ+Τ231R+N233R+D254S+P256T; Nll R+N 3 3 Q+G3 8 A+G91T+G112 A+G163 A+T2 31R+N23 3R+D254S;
N11R+N33 Q+G91 T+G 163K+E210D+T231R+N23 3 R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S; E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R; N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A;
Nl 1R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+ Q249R+D254S+P256T;
D27R+N3 3 Q+E56Q+D5 7N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S;
Nll R+N33Q+G91 T+Gl 63K+Y176Q+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+Gl 63L+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N3 3 Q+G91 T+G 163 L+Y176T+T231R+N23 3 R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
Nll R+N33Q+G91 T+Gl 63P+V176I+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N; D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+ N233R+Q249R+D254S+P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256L;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256L;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
NI 1R+N33Q+T231R+N233R; N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R;
N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F;
NI 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F;
Nll R+N33Q+G91 T+Gl 63Ν+Τ231R+N233R+D254S;
Nll R+N33Q+G91 T+Gl 63T+T231R+N233R+D254S; N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nll R+N33Q+L52R+G91 T+Gl 63K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+Gl 63 A+V176I+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I;
N3 3 Q+G3 8 S+G15 6R+G163K+V176 W+T231R+N23 3R;
NI 1R+D27R+N33 Q+E56Q+D5 7N+G91N+N94R+D111 S+G 163K+S216P+L227G+ T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G3 8 A+G91 T+Gl 63 Q+V176G+T231R+N233R+D254S;
Nll R+N33Q+G38 A+G91 T+Gl 63T+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G3 8 A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S; E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+F1OL+N11R+N3 3 Q+G3 8 A+G91 T+G 163 P+V 176F+T231R+N23 3R; E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S; E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33 Q+G3 8 A+G91 T+G 163P+V176F+L227F+T231R+N23 3R;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G3 8 A+G91 T+G 163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S; E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q; Ε1Ν+Ν11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S; N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
NI 1R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; NI 1R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S;
NI 1R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+ P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N11C+N33Q+G91 T+Gl 63K+T231R+N233R+D254S;
N11L+N33Q+G91 T+Gl 63K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; Nl 1P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227 G+T231R+N233R+P256L;
Nl 1R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S; e Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S.
Em uma terceira modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254G;
N33Q+T231R+N233R+G240L;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R;
N33Q+G163M+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T; N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+D242E;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+N162G+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254L;
N33Q+T231R+N233R+D254K;
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R; N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D111Α+Τ231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256N;
N33Q+T231R+N233R+P256M;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R; D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S; N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
Ν3 3 Q+G3 8I+G177 Α+Τ231R+N23 3R;
N33Q+G177Α+Τ231R+N233R;
D27R+N 3 3 Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S;
NI 1R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N 3 3 Q+G3 8 A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; NI 1R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S; D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S; N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T; D27R+N3 3 Q+E43 Κ+Κ46Μ+Ι90 V+G91N+N 94R+D111Α+Τ114I+S216P+L227G+T231 R+N233R+P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R;
NI 1R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T;
D2 7R+N 3 3 Q+E5 6 Q+D 5 7N+G91 N+N 94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+ D242E+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T;
Nll R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N11R+D2 7R+N 3 3 Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; Nll R+N3 3 Q+G3 8 A+G91 T+G 112 A+G163 A+T231 R+N233 R+D254S;
Nll R+N 3 3 Q+G91 T+G 163 K+T231R+N233R+D2541;
N11R+N33Q+G3 8 A+G91 T+G 163K+V176D+T231R+N23 3R+D254S; N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+ Q249R+D254S+P256T;
N11 R+N 33Q+G91T+G163 K+V17 6Q+T2 31R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+Gl 63L+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+Gl 63P+V176I+T231R+N233R+D254S;
Nll R+N 3 3 Q+G91T+G163L+T231R+N23 3R+D254S+P256N;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256L;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256L;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nll R+N 3 3 Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F;
N11R+N33Q+G91 T+Gl 63K+T231R+N233R+D254S+P256F;
NI 1R+N33Q+G91 T+Gl 63T+T231R+N233R+D254S;
Nll R+N 3 3 Q+G91T+G163W+T231R+N23 3 R+D254S;
Nll R+N33Q+G91 K+Gl 63K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+A68 V+G91 T+G 163K+T231R+N233R+D254S; N11R+N3 3 Q+T3 7M+G91 T+G 163 P+V176T+T231R+N23 3 R+D254S; N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R;
N11R+D27R+N3 3 Q+E5 6Q+D5 7N+G91N+N94R+D111 S+G 163K+S216P+L227G+ T231R+N233R+D254S+P256T;
N11 R+N 3 3 Q+G3 8 A+G91 T+G 163T+V176G+T231R+N23 3R+D254S;
El N+N 11R+N33Q+G3 8 A+G91 T+G 163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+F1OL+N11R+N3 3 Q+G3 8 A+G91 T+G 163 P+V 176F+T231R+N23 3R;
E1N+N33Q+G38A+G91 T+Gl 63P+V176F+T231R+N233R+D254S;
E1 N+N 11 R+N3 3 Q+G3 8 A+G91T+D111A+G163 P+V 176F+T231R+N23 3 R; E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S; E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q; Nll R+N3 3 Q+G3 8 A+G91 T+D 102G+S115L+G163K+T231R+N23 3R+D254S+P256T; Nl 1R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
E1N+N11R+N33Q+G91 T+G 163 A+T231R+N23 3R+G246A+D254S;
NI 1R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+ P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
Nll C+N33Q+G91 T+Gl 63K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; Nl 1P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S; e N11R+N3 3 Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N23 3 R+D254S.
Em uma quarta modalidade particular, a lipase da invenção é
selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2: N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R; N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G38A+G91 T+G 112A+G163A+T231R+N233R+D254S;
Q4R+D27 Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256L;
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S; e
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T.
Em uma quinta modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
N11R+N33Q+G91 T+G 163 W+T231R+N23 3R+D254S;
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R; e
Nl 1L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S.
Todas as variantes da lipase dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 com as substituições listadas acima (cada uma das cinco modalidades particulares) têm um desempenho de digestão in vitro melhorado, isto é, um fator de melhoramento (IF), preferivelmente IF médio menos desvio padrão, maior do que 1,00, ou de pelo menos 1,50 (ou 1,5),
2,00 (ou 2,0), 2,50 (ou 2,5), 3,00 (ou 3,0), 3,50 (ou 3,5), ou de pelo menos 10 4,00 (ou 4,0), preferivelmente de pelo menos 5,00 (ou 5,0), 6,00 (ou 6,0), 7,00 (ou 7,0), 8,00 (ou 8,0), 9,00 (ou 9,0), 10,00 (ou 10,0) ou de pelo menos 11,00 (ou 11,0). Uma etapa gástrica de pH 5 é preferivelmente usada. Uma dieta preferida é a dieta II. A Titulação de Sítio Ativo (AST, Exemplo 6) é preferivelmente usada para determinar a concentração de lipase. (E) Em uma primeira modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
Q9H+N3 3 Q+D102E+T231R+N23 3R;
N33Q+E56Q+T231R+N233R;
N3 3 Q+I90L+G163 L+T231R+N23 3R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T; N33Q+N39S+T231R+N233R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N3 3 Q+G91 T+G 163 K+T231R+N233 R+D254G; N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27N+N33Q+G91 T+Gl 63K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R;
K98I+T231R+N233R+N251S;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163T+T231R+N233R;
N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+T231R+N233R+P256A;
N33Q+T231R+N233R+P256S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S; N33Q+S115L+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91A+N 94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N3 3 Q+G91T+K9 8I+T114I+G163 K+T2 31R+N23 3R+D25 4S; N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L; e N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L.
Em uma segunda modalidade particular, a lipase da invenção é
selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2: D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
N3 3 Q+N94R+T231R+N23 3R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S; N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S; ed N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L.
Em uma terceira modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; e N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S.
Todas as variantes da lipase dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 com as substituições listadas acima (cada uma das três modalidades particulares) têm um desempenho de digestão in vitro melhorado, isto é, um fator de melhoramento (IF), preferivelmente IF médio menos desvio padrão, maior do que 1,00, ou de pelo menos 1,50 (ou 1,5), 2,00 (ou 2,0), 2,50 (ou 5 2,5), 3,00 (ou 3,0), 3,50 (ou 3,5), ou de pelo menos 4,00 (ou 4,0), preferivelmente de pelo menos 5,00 (ou 5,0), 6,00 (ou 6,0), 7,00 (ou 7,0), 8,00 (ou 8,0), 9,00 (ou 9,0), 10,00 (ou 10,0) ou de pelo menos 11,00 (ou 11,0). Uma etapa gástrica de pH 3 é preferivelmente usada. Uma dieta preferida é a dieta I. A Titulação de Sítio Ativo (AST, Exemplo 6) é preferivelmente usada 10 para determinar a concentração de lipase.
(F) Em uma primeira modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
D2 7R+N 3 3 Q+G91A+D96E+L9 7Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R;
N33Q+E56Q+T231R+N233R;
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11 R+N 33Q+G91T+G163 K+T231R+N23 3 R+D254S;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R;
K98I+T231R+N23 3 R+N251S; N33Q+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
Ν3 3 Q+G 163 T+T231R+N23 3R;
N3 3 Q+G 163 W+T231R+N23 3R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+T231R+N233R+D254Q;
N33Q+T231R+N233R+D254I;
N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+T231R+N233R+P256A;
N33Q+T231R+N233R+P256L;
N33Q+T231R+N233R+P256S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+S115L+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R; D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S; N33Q+G161A+T231R+N233R;
N33Q G38M T231RN233R;
N33Q G38F T231RN233R;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N3 3 Q+G91A+N 94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S; N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S; N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L; e N3 3 Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N23 3 R+D254S+P256L.
Em uma segunda modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
D27R+N33 Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R; N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+E56Q+T231R+N233R;
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254Q;
N33Q+T231R+N233R+D254I;
N33Q+T231R+N233R+P256S;
N33Q+S115L+T231R+N233R;
N33Q+G3 8A+G91 T+G 163K+T231R+N23 3R+D254S;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q G38M T23 IR N233R;
N33Q G38F T231RN233R;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S; N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L; e N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L.
Em uma terceira modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+I90L+G163L+T231R+N23 3R; D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q G38M T231RN233R;
N33Q G38F T23IR N233R; N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;
Todas as variantes da lipase dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ
ID NO: 2 com as substituições listadas acima (cada uma das três modalidades
particulares) têm um desempenho de digestão in vitro melhorado, isto é, um
fator de melhoramento (IF), preferivelmente IF médio menos desvio padrão,
maior do que 1,00, ou de pelo menos 1,50 (ou 1,5), 2,00 (ou 2,0), 2,50 (ou
2,5), 3,00 (ou 3,0), 3,50 (ou 3,5), ou de pelo menos 4,00 (ou 4,0),
preferivelmente de pelo menos 5,00 (ou 5,0), 6,00 (ou 6,0), 7,00 (ou 7,0), 8,00
(ou 8,0), 9,00 (ou 9,0), 10,00 (ou 10,0) ou de pelo menos 11,00 (ou 11,0).
Uma etapa gástrica de pH 5 é preferivelmente usada. Uma dieta preferida é a
dieta I. A2so é preferivelmente usado para determinar a concentração de lipase,
preferivelmente usando o coeficiente de extinção de 1,24 A28o/mg.
As lipases da invenção podem ter uma proporção de sais
biliares melhorados VS referência de pelo menos 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 ou de pelo
menos 2,0. Mais preferivelmente, as lipases da invenção podem ter uma
proporção de sais biliares melhorados VS referência de pelo menos 2,2, 2,5,
2,8 ou de pelo menos 3,0. Ainda mais preferivelmente, as lipases da invenção
podem ter uma proporção de sais biliares melhorados VS referência de pelo
menos 3,2, 3,4, 3,6, 3,8 ou de pelo menos 4,0. Essas proporções podem ser
referidas como, por exemplo, 3X, 3-vezes, ou 300%, todos correspondendo a
uma proporção de 3,0 - e vice-versa para outras proporções.
Em uma modalidade particular, a lipase da invenção é
selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2: D27R+N3 3 Q+E43 K+K46M+I90 V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R
+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+L227G+T231 R+N233R+P256T;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
D27I+N3 3Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163 K+E210D+T231R+N23 3R+P256T; N33Q+G91T+D96E+K98T+T114Ι+Τ231R+N233R+G163 S;
Ν33 Q+G3 8W+G91Τ+Τ114I+G163 Κ+Ε210 V+T231R+N233R; Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T;
Ν33 Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163 Κ+Ε210D+T231R+N23 3R; D27R+N33Q+T37K+N711+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R +Ρ256Τ;
Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A; N33Q+G91 Τ+Τ 114I+G163Κ+Ε210D+T231R+N233R+D254G+P256A; D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+V168M+E210D+S216P+L227 G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T;
D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111 A+Gl90D+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T;
N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T;
D27N+N33Q+G91 T+Tl 14I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R; D27R+N33Q+T37K+N711+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R +P256T;
D27R+N3 3 Q+G91T+T114I+G163 W+E210D+T231R+N23 3R; D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+T231R+N233R+ P256T+L269H;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111 A+V 154I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N3 3 Q+G91 T+T 114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A
D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T;
N33Q+G91 T+Tl 14I+G163K+E210D+T231R+N233R; D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ;
D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111Α+Υ138F+G163R+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T;
Ν3 3 Q+G91Α+Ν 94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R; N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S; e N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L.
Em uma modalidade mais preferida, a lipase da invenção é
selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+L227G+T231R
+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231 R+N233R+P256T;
N33Q+G3 8W+G91 T+T 114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T; D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
N33 Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N23 3 R+G163 S;
N3 3 Q+G3 8W+G91T+T114I+G163 K+E210 V+T231R+N233R; Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T;
N3 3Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R;
D27R+N33Q+T37K+N711+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R +P256T;
Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A; N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A; D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V168M+E210D+S216P+L227 G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T;
D27R+A3 OV+N 3 3 Q+G91N+N94R+G109 A+D111A+G190D+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+G91 N+N94R+K981+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T;
N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T;
D27N+N33Q+G91 T+T 114I+G163 S+E210D+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R; D27R+N33Q+T37K+N711+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R +P256T;
D27R+N3 3 Q+G91 T+T 114I+G163 W+E210D+T231R+N233R; D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231 R+N233R+D254S; e N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L.
Em uma modalidade mais preferida, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+L227G+T231R +N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231 R+N233R+P256T;
N33Q+G38W+G91 T+T 114I+G163K+E210D+T231R+N23 3R+P256T;
D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N23 3R+P256T;
N3 3 Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N23 3R+G163 S;
N33Q+G38 W+G91 T+Tl 14I+G163K+E210V+T231R+N233R;
Q4P+D2 7R+N 3 3 Q+G91 N+N 94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R; e N3 3 Q+G91T+K98I+T114I+G163 K+T231R+N23 3R+D254S.
Todas as variantes das lipases dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 com as substituições acima listadas (cada uma das três modalidades) têm um desempenho de digestão in vitro melhorado, isto é, uma estabilidade melhorada em pH 3 na presença de pepsina, mais particularmente uma atividade residual melhorada em PNP-palmitato em pH 8,0 e 20°C (ou temperatura ambiente) depois da incubação por 3 horas em pH 3,0 e 20°C (ou temperatura ambiente) na presença de 75 ug/mL de pepsina, preferivelmente uma % de atividade residual melhorada (% de RA) conforme determinado pelo método do Exemplo 8. Em modalidades particulares, a % de RA é de 5 pelo menos 30, de pelo menos 50, de pelo menos 70, de pelo menos 80 ou de pelo menos 90%. Uma proporção de melhoramento pode ser pode ser definida como a proporção de % de RA da lipase em questão em relação à % de RA da lipase de referência. Essa proporção de melhoramento é preferivelmente de pelo menos 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 ou de pelo menos 4,5. A proporção 10 de melhoramento pode ser calculada a partir dos resultados na Tabela 10 pela divisão da % de RA da lipase em questão com a % de RA da lipase de referência (por exemplo, a lipase da SEQ ID NO: 2, ou SEQ ID NO: 1, ou outra lipase de referência, conforme desejável).
As lipases da invenção podem ter uma proporção de sais biliares melhorados VS referência de pelo menos 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 ou de pelo menos 2,0. Mais preferivelmente, as lipases da invenção podem ter uma proporção de sais biliares melhorados VS referência de pelo menos 2,2, 2,5,
2,8 ou de pelo menos 3,0. Ainda mais preferivelmente, as lipases da invenção podem ter uma proporção de sais biliares melhorados VS referência de pelo menos 3,2, 3,4, 3,6, 3,8 ou de pelo menos 4,0. Essas proporções podem ser referidas como, por exemplo, 3X, 3-vezes, ou 300%, todos correspondendo a uma proporção de 3,0 - e vice-versa para outras proporções.
Em uma modalidade particular, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
D2 7 V+N 3 3 Q+G91A+N 94R+D111A+G163 K+L227F+T2 31R+N23 3 R+Q249R+D254S;
N3 3 Q+G91A+N 94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T;
D27R+N3 3 Q+E43 K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231 R+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+L227G+T231 R+N233R+P256T;
N3 3 Q+G91T+T114I+E210 V+D254K+P256A;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163 S+E210 V+D254K+P256A;
L52I+V60E+T114I+V168M+E210D;
D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T;
D27R+N33Q+I76T+G91 N+N94R+RIO8M+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T; e
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+L227G+T231 R+N233R+P256T.
Mais preferivelmente, a lipase da invenção é selecionada
dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente grupos de
substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91A+N94K+D111 A+Gl 63K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91 N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+L227G+T231 R+N233R+P256T; e
N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A.
Ainda mais preferivelmente, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R; G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+
T231R+N23 3R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T; e
N33Q+G91 T+Tl 14I+E210V+D254K+P256A.
Em uma modalidade mais preferida, a lipase da invenção é selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2: G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216p+L 227G+T231R+N233R+P256T.
Todas as variantes das lipases dos aminoácidos 1 a 269 da 5 SEQ ID NO: 2 com as substituições acima listadas (cada uma das quatro modalidades) têm um desempenho de digestão in vitro melhorado, isto é, uma atividade melhorada em PNP-oleato em pH 5,0 na presença de sais biliares 2 mM, mais particularmente uma proporção de sais biliares melhorados, conforme determinado pelo método no Exemplo 9.
Em outra modalidade particular, a lipase da invenção é
selecionada dentre as lipases com as seguintes substituições, preferivelmente
grupos de substituições, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
N33Q+G91 T+G 163K+T231R+N23 3R+D254G;
N3 3 Q+G91 T+G 163K+T231R+N23 3 R+D254S; e
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S.
Uma lipase mais preferida compreende as seguintes substituições, preferivelmente grupos de substituições em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2:
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S.
Em uma modalidade particular, a lipase da invenção tem uma atividade melhorada em pH baixo. Em um contexto de atividade, pH baixo significa um pH na faixa de 4 a 7, por exemplo, de pH 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 ou 7,0. Um pH baixo preferido é pH 6,0. Em modalidades preferidas, a atividade em pH 6,0 é determinada: i) a 37°C; ii) com o substrato de trilinoleína, preferivelmente em uma concentração de 8 mM; iii) com sais biliares presentes durante a incubação da enzima e substrato, preferivelmente 5 em uma concentração de 10 mM; iv) usando um tampão de ensaio imidazol 100 mM, acetato 100 mM, ácido malônico 100 mM, pH 6,0; v) com CaCl2 estando presente durante a incubação de enzima e substrato, preferivelmente em uma concentração de 1 mM; e/ou vi) com uma quantidade de lipase purificada correspondendo a 0,01 mg de EP/mL (EP = enzima-proteína, 10 baseando-se em A280). Em modalidades preferidas adicionais, vii) a enzima é diluída antes do ensaio (por exemplo, para obter uma concentração apropriada para fins de ensaio) em NaH2PO4 5 mM, pH 7,0; iix) enzima e substrato são incubados por 30 minutos; ix) enzima e substrato são incubados em placas de microtitulação (MTP), e preferivelmente agitados a 700 rpm; x) a reação 15 enzimática é interrompida com uma solução de parada, preferivelmente (Triton-XIOO 2,2%, ácido fosfórico 0,22M), mais preferivelmente incluindo pepsina (70 mg/L); xi) os ácidos graxos livres gerados como resultado da reação enzimática são determinados por um teste de cor enzimático, tal como Nefac; e/ou xii) a melhoria na atividade em pH 6,0 é indicada em relação à 20 atividade sob as mesmas condições de uma lipase de referência, tal como a lipase com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 1 ou 2, preferivelmente 2, ou em relação à variante LV2934. Para maiores detalhes em relação ao método de teste, ver o Exemplo 3. Exemplos particulares das variantes de lipase de uma atividade melhorada em pH 6,0 são (em relação à lipase com 25 aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2): LVA049, LVA349, LVA023, LVA099, SEQ ID NO: 1, LVA061, LV2934, LV1330, LVA043, LVA041, LVA012, LVl857 e LVl855 (ver Tabela 1 para as suas estruturas). As variantes de lipase LVA049, LVA349, LVA023, LVA099 são particularmente preferidas (melhoradas também em comparação com a lipase da SEQ ID NO: I). As variantes de lipase LVA049 e LVA349 são ainda mais preferidas. Uma lipase mais preferida, sob um ponto de vista de atividade de pH, é a variante da lipase LVA049.
Em outra modalidade particular, a lipase da invenção tem uma 5 estabilidade melhorada em pH baixo. Em um contexto de estabilidade, pH baixo significa um pH na faixa de 2 a 6, por exemplo, de pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5,
4,0, 4,5, 5,0, 5,5 ou 6,0. Um pH baixo preferido é pH 3,0. A estabilidade de uma enzima lipase purificada é determinada pela incubação da enzima a 37°C no pH desejado (por exemplo, 3,0) por 1, 15, 45 e 120 minutos, depois do que 10 cada atividade lipase residual é medida em caprilato de p-nitrofenila em pH 8 e temperatura ambiente (RT). Em modalidades preferidas, i) o tampão usado para a estabilidade pré-incubação (tampão de estabilidade) é de imidazol 200 mM, acetato 200 mM, ácido malônico 200 mM, ajustado até o pH desejado (por exemplo, 3,0); as enzimas são primeiramente diluídas em NaH2PO4 20 15 mM, pH 7,0, Triton-XlOO 0,01% para soluções de trabalho de 0,4 ou 0,8 mg de enzima-proteína por mL, preferivelmente baseando-se em A280, iii) a concentração enzimática durante a pré-incubação é de 0,05 ou 0,1 mg de enzima-proteína por mL, e para essa diluição o tampão é preferivelmente tampão de diluição enzimático: acetato 20 mM pH 6, Triton X-100 0,01%; iv) 20 a pré-incubação é em placas de microtitulação (MTP) com agitação, preferivelmente com 700 rpm; v) para a determinação subsequente de atividade residual (RA), as alíquotas contendo enzimas removidas da etapa de pré-incubação são diluídas pelo menos 20 vezes no tampão de atividade residual a seguir (tampão RA): Tris(tris-hidroximetilaminometano, 2-amino- 25 2-hidroximetil-l,3-propanodiol, pH 8,0, Triton X-100 0,4%, CaCl2 1 mM 200 mM; vi) a atividade residual é medida em caprilato de p-nitrofenila em pH 8,0 e RT e é medida através da cinética (velocidade;taxa) a 405 nm por 5 minutos; vii) a % de atividade residual é calculada como se segue: A taxa dentro de cada pH para cada retirada (1, 15, 45, 120 minutos; ou 1, 60, 120 minutos) é subtraída da taxa para ausência de controle enzimático, caso aplicável com sais biliares ou pepsina (ver iix) e ix) abaixo), e essa taxa corrigida é a seguir dividida pelo valor mais alto dentro de cada pH e multiplicada por 100. Opcionalmente, as enzimas são pré-incubadas iix) na presença de sais biliares, preferivelmente em uma concentração de 10 mM, e/ou xi) na presença de pepsina (70 mg/L). Para maiores detalhes em relação a este método de teste, ver Exemplo 4.
Em outras modalidades particulares, a lipase da invenção tem uma % de atividade residual, determinada conforme descrito acima e no Exemplo 4, de pelo menos 60, 65, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, ou 92 depois de 120 minutos de incubação em pH 3,0 em tampão.
Em outras modalidades particulares, a lipase da invenção tem uma % de atividade residual, determinada conforme descrito acima e no Exemplo 4, de pelo menos 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 ou pelo menos 89 depois de 60 minutos de incubação em pH 3,0 em tampão.
Em ainda outras modalidades particulares, a lipase da invenção tem uma % de atividade residual, determinada conforme descrito acima e no Exemplo 4, de pelo menos 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, ou 94 depois de 45 minutos de incubação em pH 3,0 na presença de pepsina.
Em ainda outras modalidades particulares, a lipase da invenção tem uma % de atividade residual, determinada conforme descrito acima e no Exemplo 4, de pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 82, 84, 86, 88 ou de pelo menos 89 depois de 60 minutos de incubação em pH 3,0 na presença de pepsina.
Em ainda outras modalidades particulares, a lipase da invenção tem uma % de atividade residual, determinada conforme descrito acima e no Exemplo 4, de pelo menos 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ou pelo menos 71 depois de 120 minutos de incubação em pH 3,0 na presença de pepsina. Em ainda outras modalidades particulares, a lipase da invenção tem uma % de atividade residual, determinada conforme descrito acima e no Exemplo 4, de pelo menos 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, ou 50 depois de 15 minutos de incubação em pH 5 3,0 na presença de sais biliares.
Exemplos particulares de variantes de lipase de uma estabilidade melhorada em pH 3,0 são (em relação à lipase com a seqüência de aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2): LV2934, LVA043, LVA049, LV1855, LVl 865, LV1874, LV1889, LV1857, LVA012, LVA023, LVA041, 10 LVA061 e LVA099. Lipases particularmente preferidas com estabilidade melhorada em pH 3,0 na presença de pepsina são as seguintes: LVA043, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LV1857, LVA012 e LVA099. Outros exemplos de lipases com estabilidade melhorada em pH 3,0 na presença de pepsina são as seguintes: LVA147, LVA315, LVA317, LVA319 e LVA714. 15 Estas são melhoradas em comparação com qualquer uma das lipases da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1 e LV2934. Outra variante de lipase particularmente preferida a qual tem uma estabilidade melhorada em pH 3,0 na presença de sais biliares é a LVA349. Ver Tabela 1 e Exemplo 4 para a estrutura dessas variantes de lipase.
Em outra modalidade particular, a qual pode ser
particularmente útil para preparações de lipase menos purificadas, por exemplo, com propósitos de varredura, a estabilidade em pH 3,0 é medida como se segue: primeiro a enzima é pré-incubada por 3 horas em pH 3,0 e temperatura ambiente na presença de 75 ug/mL de pepsina, e a seguir a 25 atividade da lipase residual é medida em um ensaio de proporção monitorando a atividade no decorrer do tempo. Em modalidades preferidas, i) o substrato para o ensaio de atividade residual é palmitato de 4-nitrofenol, preferivelmente PNP-palmitato I mM, Triton-XlOO 1,2%, CaCl2 4 mM, TRIS 100 mM, pH 8,0; ii) para o ensaio de atividade residual, as leituras de OD40S são efetuadas de 15 minutos depois da adição de substrato e até 18 horas depois da adição de substrato; iii) as leituras de OD40S são expressas como mOD (mili OD) por hora; iv) os dados que se enquadram dentro da faixa linear são coletados e a atividade lipase residual de cada amostra tratada com 5 pepsina em comparação com a atividade lipase residual da amostra não- tratada correspondente; v) % da atividade residual (%RA) é calculada dividindo-se a taxa da condição tratada pela taxa de condição não-tratada e multiplicando-se o resultado por 100. Ver o Exemplo 8 para maiores detalhes. As seguintes variantes têm uma estabilidade melhorada em pH 3,0 na 10 presença de pepsina, em comparação com a lipase com a seqüência de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2. A lipase com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 1, LVAR0002b, LVAR0003, LVAROOHa, LVAROO13, LVAROO14, LVAROO15, LVAR0016, LVAR0017, LVAR0045, LVAR0046, LVAR0047, LVAR0048, LVAR0050, LVAR0051, LVAR0052, LVAR0053, 15 LVAR0054, LVAR0055, LVAR0056, LVAR0057, LVAR0058, LVAR0059, LVAR0061, LVAR0062, LVAR0063, LVAR0064, LVAR0065, LVAR0066, LVAR0067, LVAR0068, LVAR0069, LVAR0070, LVAR0071, LVAR0072, LVAR0101, LVARO102 e LVARO106. Variantes preferidas são: LVAROOHa, LVAR0013, LVAR0017, LVAR0046, LVAR0052, 20 LVAR0055, LVAR0061, LVAR0063, LVAR0068, LVAR0070, LVAR0071, LVAR0072, LVAR0014, LVAR0015, LVAR0057, LVAR0101, LVARO102 e LVAR0106. Variantes de lipase particularmente preferidas são: LVAR0014, LVAR0015, LVAR0057, LVAR0101, LVAR0102 e LVAR0106. As estruturas dessas variantes estão mostradas nas Tabelas 6 e 9.
Em outra modalidade particulares, a lipase da invenção é
estável na presença de pepsina, por exemplo, na presença de 70 mg/mL de pepsina, preferivelmente para 15, 45, 60 e/ou 120 minutos em um pH desejado (por exemplo, pH 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0) e 37°C. Para maiores detalhes, ver a seção acima se referindo ao Exemplo 4. Ainda em uma modalidade particular adicional, a lipase da invenção é estável na presença de sais biliares, por exemplo, na presença de sais biliares 10 mM, preferivelmente por 15, 45 e/ou 120 minutos em um pH desejado (por exemplo, pH 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0) e 37°C. Para maiores detalhes, ver a seção acima se referindo ao Exemplo 4.
Ainda em uma modalidade particular adicional, a lipase da invenção tem uma atividade fosfolipase melhorada em comparação com uma lipase de referência, tal como a lipase com a seqüência de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2, ou a lipase com a seqüência de aminoácidos 1 a 269 da 10 SEQ ID NO: I. A atividade fosfolipase pode ser determinada como a seguir: i) a enzima purificada é diluída em tampão de diluição de enzima (Acetato de sódio 20 mM, Triton-XlOO 0,01%, pH 5,0) até 5 mg de EP/mL, por exemplo, baseando-se em A2so; ü)a atividade da l-miristoil-2-palmitoil-sn-glicero-3- fosfocolina é determinada, preferivelmente a 40°C e por 20 minutos; iii) os 15 ácidos graxos livres liberados são determinados e quantificados por MALDI- TOF MS, preferivelmente depois da mistura com 20 mg/mL, ácido 2,5- diidrobenzóico em MeOH 50%, TFA 0,1% (matriz); iii) as intensidades de sinal relativas (área sob cada pico) dos picos de MS são usadas para o cálculo da distribuição entre a atividade da fosfolipase Ale A2.
Lipases com uma % de fosfolipídeo não-digerido melhorada
remanescente depois da hidrólise em comparação com uma lipase de referência, tal como a lipase com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO:2, ou a lipase com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 1, têm uma atividade fosfolipase melhorada.
Exemplos particulares das variantes da lipase com atividade
fosfolipase melhorada em comparação com a SEQ ID NO: 2 são os seguintes: LVl889, LVA023, LV1330, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LVA043, LVA049, LVl 857 e LV1232. Lipases preferidas são as LC1232 e a LVl 889.
Ainda em outra modalidade particular, a lipase da invenção tem um desempenho melhorado em um modelo de digestão in vitro em comparação com a lipase com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2, a lipase com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 1 e/ou em comparação com LV2934 (a variante desglicosilada N33Q da SEQ ID NO: I). O modelo in 5 vitro faz uso da Dieta I ou da Dieta II, as quais estão descritas na parte Experimental. Resumidamente, 100 uL de dieta são misturados com 20 uL de pepsina (700 mg/mL) e 30 uL de lipase (duplicata de 4 concentrações) no poço de uma placa de microtitulação, a qual é incubada por 1 hora a 37°C com agitação (750 ppm) antes da adição de 25 ul de tampão (MES 0,8 M 10 (ácido 2-[N-morfolino]etanossulfônico), acetato de sódio 0,8 M, imidazol 0,8 M, pH 7,0) e 20 uL de sais biliares (100 mM) resultando em um pH de 5,7 a
6,0. A placa é, a seguir, incubada 2 horas a 37°C com agitação antes da interrupção da reação pela adição de 50 uL de Triton-XlOO 10% em ácido fosfórico 1 M. Depois da diluição 125 a 250 vezes em Triton-XlOO 1%, a quantidade de ácidos graxos livres é determinada usando um kit colorimétrico, tal como o kit NEFA C, conforme descrito no Exemplo 3.
Exemplos de lipases com um desempenho melhorado in vitro são: LVAR0003, LVAR0045, LVAR0046, LVAR0047, LVAR0050, LVAR0051, LVAR0052, LVAR0053, LVAR0054, LVAR0056, LVAR0057, 20 LVAR0061, LVAR0062, LVAR0063, LVAR0064, LVAR0065, LVAR0067, LVAR0069 e LVAR0072. Outros exemplos são: LVAR0074, LVAR0076, LVAR0077, LVAR0078, LVAR0079, LVAR0080, LVAR0086, LVAR0088, LVAR0091, LVAR0094, LVAR0095, LVAR0096, LVAR0099, LVARO101, LVARO102, LVARO103, LVAR0104, LVARO106, e LVARO108. Exemplos 25 preferidos são: LVAR0003, LVAR0013, LVAR0032, LVAR0050, LVAR0058, e LVAR0069. Mais preferidos são: LVAR0063, LVAR0067, LVAR0069, LVAR0079, LVAR0080, LVAR0094, LVAR0095, LVAR0096, LVAR0099, LVAR0101, LVARO102, LVARO103, LVARO104, LVARO106, e LVARO108. Mais preferidos são LVAR0094, LVAR0099, LVAR0095 e LVARO106.
Ainda em outra modalidade particular, a lipase da invenção tem um desempenho melhorado in vivo. O desempenho in vivo pode ser estimado em um teste de varredura de lipase em porquinhos Gõttingen fêmeas 5 (Ellegaard) com Insuficiência Exócrina Pancreática induzida (PEI), conforme descrito no Exemplo 10, e/ou em um teste de digestibilidade in vivo completo conforme descrito no Exemplo 11. O desempenho pode ser melhorado em relação à lipase com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2, a lipase com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 1, e/ou LV2934 sendo a variante N33Q 10 desglicosilada da lipase com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: I. Para maiores detalhes desse teste, ver o Exemplo 10.
A lipase da invenção preferivelmente compreende pelo menos uma das seguintes substituições: N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, L69I, E87K, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, G163K, S216P, L227G, T231R, N233R, D234K, E239V.
A lipase da invenção preferivelmente compreende pelo menos uma das seguintes substituições: N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, 20 E56C, E56S, D57A, D57G, D57N, V60L, L69I, E87K, G91A, G91E, G91N, G91R, G91 S, G91T, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, N94S, D96E, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M, L97Q, K98I, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, Dl 11 A, Dl 11S, Tl 141, L147S, G163K, E210D, S216P, L227G, T231R, N233R, D234K, E239V, Q249R, N251S, 25 D254N, P256T, G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A e/ou L269N.
Em uma modalidade particular, a lipase da invenção não é: (i) a lipase com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 1: (ii) variante N33Q da lipase de (i): (iii) aminoácidos -5- 269 (-5 a +269), -4-269 (-4 a +269), -3-269 (-3 a +269), -2-269 (-2 a + 269), -1-269 (-1 a +269) e 2-269 da SEQ ID NO: 1; (iv) variante N33Q de qualquer uma das seqüências de (iii); qualquer uma das modalidades (i), (ii), (iii) e/ou (iv) co um resíduo de metionina aminoterminal, (v) qualquer uma das modalidades (i), (ii), (iii), (iv) e/ou (v) com uma região de poliistidina; (vi) qualquer uma das modalidades (i), (ii), 5 (iii), (iv), (v) e/ou (vi) com pelo menos uma substituição conservativa conforme definido na p. 5, linhas 4-18 de WO 2006/136159; (vii) um fragmento de qualquer uma das modalidades anteriores, conforme definido na página 6, linhas 4 a 14 da WO 2006/136159; (iix) uma mistura específica das variantes, conforme definido na p. 6, linha 34 à página 7, linha 11 de WO 10 2006/136156; e/ou não (ix) uma lipase especificamente revelada para uso farmacêutico em WO 2006/136159.
Lipases particularmente preferidas da invenção são: LV1232, LV1855, LVl857, LV1865, LV1874 e LV1889.
Outras lipases particularmente preferidas da invenção são as 15 lipase as seguir, as quais são variantes de uma lipase originária, e compreendem (T231R+N233R), e além disso, pelo menos uma das seguintes substituições: N26I, D27Q, D27R, D27Y, A30V, T32I, N33Y, P42L, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56C, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, E87K, G91E, G91N, G91R, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, D96G, 20 D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M. L97Q, K98I, E99K, E99P, E99S, E99T, Dl 11 A, Dl 11S, Tl 141, L147S, G163K, S216P, L227G, D234K, E239V, Q249R, D254N, G263Q, L264A, I265T, G266D e/ou L269N.
Lipase, protease, amilase
As seguintes lipases também são incluídas dentro do escopo da 25 presente invenção: qualquer uma das lipases reivindicadas e aqui reveladas, compreendendo além disso qualquer uma das seguintes extensões N- terminais: SPIRR, PIRR, IRR, RR e R, correspondendo aos aminoácidos -5 a -I da SEQ ID NO: 2, -4 a -I da SEQ ID NO: 2, -3 a -I da SEQ ID NO: 2, -2 a -I da SEQ ID NO: 2, e -I da SEQ ID NO: 2, respectivamente. Também qualquer mistura de qualquer uma dessas versões N-terminais é especificamente aqui incluída.
Em uma modalidade particular, a atividade específica da lipase da invenção é pelo menos 50% da atividade específica da lipase com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2. Em modalidades particulares adicionais, a atividade específica da variante lipase é de pelo menos 60, 70, 75, 80, 85, 90 ou pelo menos 95% da atividade específica da lipase com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2. A atividade específica pode ser medida usando qualquer um dos ensaios de lipase do Exemplo 1 aqui, porém é preferivelmente medida em LU/mg de enzima-proteína usando o ensaio LU do Exemplo 1, e determinando o conteúdo de enzima-proteína, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 2 (A28o e GPMAW), ou usando análise de aminoácidos. Em uma análise de aminoácidos, as ligações peptídicas da amostra de lipase são submetidas à hidrólise ácida, seguido pela separação e quantificação dos aminoácidos liberados, por exemplo, em um analisador de aminoácidos Biochrom 20 Plus, comercialmente disponível da Bie & Bemtsen A/S, Sandbaekvej 5-7, DK-2610 Roedovre, Dinamarca, de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade de cada aminoácido individual é determinada pela reação com ninidrina.
Ainda em outras modalidades particulares, a lipase da invenção é usada em combinação com uma lipase adicional. Exemplos de lipases adicionais são lipases de mamíferos, e lipases microbianas. Uma lipase de mamífero preferida é o extrato de pâncreas, por exemplo, de porco ou de boi, tal como pancreatina. A pancreatina pode ser usada na forma de um produto não-revestido (bruto) ou na forma de um produto formulado (revestimento entérico (para proporcionar resistência contra o suco gástrico), ou não-funcionalmente revestido (revestido, porém não para proporcionar resistência contra o suco gástrico)). A pancreatina ainda compreende potencialmente outros constituintes ativos enzimáticos, como a protease pancreática e/ou a amilase pancreática. A lipase microbiana pode ser, por exemplo, à base de ou derivada de uma lipase fungica ou bacteriana. Lipases bacterianas podem ser derivadas, por exemplo, de Bacillus ou de Pseudomonas, lipases fungicas podem ser derivadas, por exemplo, de cepas 5 de Rhizopus, Candida ou Humicola, tal como Rhizopus delemar, Rhizopus javanicus, Rhizopus oryzae, or Humicola lanuginosa, particularmente qualquer um dos produtos Lipase D2™ ou Lipase D Amano 2000™ (lipase, EC 3.1.1.3), as quais são comercialmente disponíveis de Amano Pharmaceuticals, Japão.
A lipase da invenção pode ser usada em combinação com uma
protease, com ou sem uma amilase conforme descrito abaixo. O termo “protease” é aqui definido como uma enzima que hidrolisa ligações peptídicas. Ele inclui uma enzima pertencendo ao grupo de enzimas EC 3.4 (incluindo cada uma das suas treze subclasses, essas enzimas sendo a seguir chamadas como “pertencendo ao grupo EC 3.4.-.-“).
Exemplos de proteases são proteases de mamíferos, e proteases microbianas. Uma protease de mamífero preferida é extrato pancreático, por exemplo, de porco ou boi, tal como pancreatina. A pancreatina pode ser usada na forma de um produto não-revestido (bruto), ou 20 na forma de um produto formulado (revestimento entérico, ou revestimento não-funcional). A pancreatina compreende potencialmente ainda outros constituintes ativos enzimáticos, como a lipase pancreática, BSSL (Lipase Estimulada por Sais Biliares), e/ou amilase pancreática.
A protease microbiana pode ser, por exemplo, à base de ou 25 derivada de cepas bacterianas ou fungicas. A protease pode particularmente ser derivada de uma cepa de Âspergillus, tal como Aspergillus oryzae ou Aspergillus melleus, particularmente o produto Prozyme 6™ (protease neutra, alcalina EC 3.4.21.63), a qual é comercialmente disponível de Amano Pharmaceuticals, Japão. Exemplos de proteases bacterianas são proteases de Bacillus e Nocardiopsis, tal como a protease de Bacillus licheniformis com a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 3, a protease de Nocardiopsis sp. com a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 4, ou a protease de Nocardiopsis 5 dassonviellei, subespécie dassonvillei com a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 5. A protease dos aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 3 pode, por exemplo, ser preparada conforme descrito em WO 2006/136160. As proteases dos aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 4 e 5 podem, por exemplo,ser preparadas conforme descrito em WO 2001/58276, 10 ou em WO 2004/111224.
Em uma modalidade preferida, a protease da invenção é pelo menos 70% idêntica a uma protease com, ou compreendendo, qualquer um (i) dos aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 3, (ii) aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 4, e/ou (iii) aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 5. Em modalidades 15 preferidas adicionais de (i), (ii) ou (iii), os graus de identidade são de pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99%. Em modalidades alternativas de (i), (ii) ou de (iii), os graus de identidade são de pelo menos cerca de 50%, 51%, 20 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68% ou de pelo menos 69%.
A lipase da invenção, com ou sem uma protease conforme descrito acima, também pode ser usadas em combinação com uma amilase.
No presente contexto, uma amilase é uma enzima que catalisa 25 a endoidrólise do amido e outros oligo e polissacarídeos lineares e ramificados. A parte amilose do amido é rica em ligações 1,4-alfa- glicosídicas, enquanto que a parte de amilopectina é mais ramificada, contendo não somente ligações 1,4-alfa como também 1,6-alfa-glicosídicas. Em uma modalidade particular, a amilase é uma enzima pertencendo ao grupo EC 3.2.1.1.
Em modalidades particulares, a amilase é uma amilase de mamífero ou uma amilase microbiana. Um exemplo de uma amilase de mamífero é o extrato pancreático, por exemplo, e porco ou boi, tal como 5 pancreatina. A pancreatina pode ser usada na forma de um produto não- revestido (bruto), ou na forma de um produto formulado (revestimento entérico, ou revestimento não-funcional). A pancreatina compreende potencialmente ainda outros constituintes ativos enzimáticos, como a protease pancreática e/ou a lipase pancreática. A amilase microbiana pode, por 10 exemplo, ser à base de ou derivada de cepas bacterianas ou fungicas, tais como Bacillus, Pseudomonas, Aspergillus ou Rhizopus.
A amilase pode ser particularmente derivada de uma cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus niger, Aspergillus oryzae ou Aspergillus melleus, por exemplo, qualquer um dos produtos Amulase Al™ derivados de 15 Aspergillus oryzae o qual é comercialmente disponível de Amano Pharmaceuticals, Japão, ou Amylase EC™ derivada de Aspergillus melleus o qual é comercialmente disponível de Extract-Chemie, Alemanha.
Amilases preferidas são (i) uma amilase compreendendo os aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 6 (tais como os aminoácidos 1 a 481, 1 a 20 484 ou 1 a 486 seus), aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 7, e/ou os aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade preferida, a amilase é uma amilase com, ou compreendendo uma seqüência de aminoácidos sendo pelo menos 70% idêntica a qualquer um (i) dos aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 6, (ii) dos aminoácidos 1 a 481 da SEQ 25 ID NO: 7, e/ou (iii) dos aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 8. As amilases das SEQ ID Nos: 6 a 8 podem, por exemplo, ser preparadas conforme descrito em WO 2006/136161 co-pendente. Em modalidades preferidas adicionais ou de (i), (ii) ou (iii), os gruas de identidade são de pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99%. Em modalidades alternativas de (i), (ii) ou de (iii), os graus de identidade são de pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68% ou 5 de pelo menos 69%.
Geralmente, as enzimas lipase, protease e amilase (de agora em diante “as enzimas”, a saber, as enzimas da invenção) podem ser enzimas naturais ou do tipo selvagem (obtidas de animais, particularmente mamíferos, por exemplo, enzimas humanas ou de porco; de vegetais, ou de 10 microrganismos), porém também quaisquer mutantes, variantes, fragmentos, etc. seus exibindo a atividade enzimática desejada, assim como enzimas sintéticas, tais como enzimas misturadas, híbridas ou quiméricas, e enzimas de consenso.
Em uma modalidade específica, a(s) enzima(s) são variantes 15 pouco alergênicas, projetadas para invocar uma resposta imunológica reduzida quando expostas a animais, inclusive o homem. O termo resposta imunológica é para ser entendido como qualquer reação pelo sistema imune de um animal exposto à(s) enzima(s). Um tipo de resposta imunológica é uma resposta alérgica levando a níveis aumentados de IgE no animal exposto. 20 Variantes pouco alergênicas podem ser preparadas usando habilidades conhecidas na técnica. Por exemplo, a(s) enzima(s) pode(m) ser conjugada(s) com porções de polímero protegendo porções ou epítopos da(s) enzima(s) envolvida(s) em uma resposta imunológica. A conjugação com os polímeros pode envolver acoplamento químico in vitro do polímero com a(s) enzima(s), 25 por exemplo, conforme descrito em WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026 e/ou WO 99/00489. A conjugação pode, além disso ou alternativamente a isto, envolver o acoplamento in vivo dos polímeros com a(s) enzima(s). Tal conjugação pode ser conseguida pela engenharia genética da seqüência de nucleotídeos codificando a(s) enzima(s), inserindo sítios de glicosilação adicionais codificando seqüências de consenso na(s) enzima(s) e expressando a(s) enzima(s) em um hospedeiro capaz de glicosilar a(s) enzima(s), ver, por exemplo, WO 00/26354. Outra forma de fornecer variantes pouco alergênicas é a engenharia genética da seqüência de nucleotídeos codificando a(s) enzima(s) de modo a fazer com que as enzimas se auto-oligomerizem, fazendo com que os monômeros da enzima possam proteger os epítopos de outros monômeros de enzima e, deste modo, reduzindo a antigenicidade dos oligômeros. Tais produtos e suas preparações são descritas, por exemplo, em WO 96/16177. Os epítopos envolvidos em uma resposta imunológica podem ser identificados por vários métodos, tais como o método de exibição de fago descrito em WO 00/26230 e em WO 01/83559, ou a abordagem aleatória descrita em EP 561907. Uma vez que um epítopo tenha sido identificado, sua seqüência de aminoácidos pode ser alterada para produzir propriedades imunológicas alteradas da(s) enzima(s) por técnicas de manipulação genética conhecidas, tais como mutagênese direcionada a sítio (ver, por exemplo, WO 00/26230, WO 00/26354 e/ou WO 00/22103) e/ou a conjugação de um polímero pode ser feita com proximidade suficiente ao epítopo para o polímero proteger o epítopo.
Em modalidades particulares, a(s) enzima(s) é/são (i) estável(is) em ph 2 - 8, preferivelmente também em pH 3-7, mais preferivelmente em pH 4-6; (ii) ativas em pH 4 a 9, preferivelmente 4 a 8; (iii) estáveis contra degradação por pepsina e outras proteases digestivas (tais como proteases pancreáticas, isto é, principalmente tripsina e quimiotripsina); e/ou (iv) estáveis e/ou ativas na presença dos sais biliares.
O termo “em combinação com” se refere ao uso combinado de acordo com a invenção da lipase, protease e/ou amilase. O uso combinado pode ser simultâneo, de sobreposição ou seqüencial, esses três termos sendo geralmente interpretados à luz da prescrição feita pelo clínico.
O termo “simultâneo” se refere às circunstâncias sob as quais as enzimas são ativas ao mesmo tempo, por exemplo, quando elas são administradas ao mesmo tempo como um ou mais produtos farmacêuticos separados, ou se elas fossem administradas em uma e na mesma composição farmacêutica.
O termo “seqüencial” se refere a tais exemplos onde uma e/ou duas das enzimas estão agindo primeiro, e a segunda e/ou terceira enzima subsequentemente. Uma ação seqüencial pode ser obtida pela administração das enzimas em questão como formulações farmacêuticas separadas com intervalos desejados, ou como uma composição farmacêutica na qual as enzimas em questão são diferentemente formuladas (compartimentalizadas), por exemplo, com um panorama para obter um diferente tempo de liberação, proporcionando uma estabilidade de produto melhorada, ou para otimizar a dosagem da enzima.
O termo “sobreposição” se refere a tais exemplos onde os períodos de atividade enzimática não são nem completamente simultâneos e nem completamente seqüenciais, a saber, existe um certo período no qual as enzimas possuem ambas ou toda a atividade.
O termo “um”, por exemplo, quando usado no contexto da protease, lipase e/ou amilase da invenção, significa pelo menos uma. Em modalidades particulares, “um” significa “um ou mais” ou “pelo menos um”, o que novamente significa um, dois, três, quatro, cinco etc.
A atividade da(s) enzima(s) da invenção pode ser medida usando qualquer ensaio adequado. Geralmente, um pH de ensaio e uma temperatura de ensaio podem ser adaptados à enzima em questão. Exemplos e valores de pH de ensaio são pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Exemplos de temperaturas de ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 ou 95°C. Valores de pH e temperaturas preferidos estão em uma faixa fisiológica, tais como valores de pH de 4, 5, 6, 7 ou 8, e temperaturas de 30, 35, 37 ou 40°C. Exemplos de ensaios enzimáticos adequados são incluídos na parte experimental. Outros exemplos são os ensaios FIP ou da Farmacopéia Européia para atividade da protease e da amilase. Esses ensaios são, por exemplo, descritos nos pedidos co-pendentes WO 2006/136160 e WO 2006/136161, respectivamente.
Medicamento
No presente contexto, o termo “medicamento” significa um composto, ou mistura de compostos, que trata, previne e/ou alivia os sintomas da doença preferivelmente trata e/ou alivia os sintomas da doença. O medicamento pode ser prescrito por um clínico, ou ele pode ser um produto vendido sem receita médica.
Composições farmacêuticas
O isolamento, purificação e concentração da(s) enzima(s) da invenção pode ser executado por meios convencionais. Por exemplo, eles podem ser recuperados de um caldo fermentativo por procedimentos convencionais incluindo, porém sem se limitar, a centrifugação, filtração, extração, atomização. evaporação ou precipitação, e adicionalmente purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, porém sem se limitar, à cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, chromatofocusing e de exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C., Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989).
Por exemplo, uma variante da lipase da SEQ ID NO: 2, tal como a lipase da SEQ ID NO: 1, pode, por exemplo, ser preparada com base na Patente Americana No. 5.869.438 (na qual a SEQ ID NO: 1 é uma seqüência de DNA codificando a lipase da SEQ ID NO: 2 aqui), a saber, pela expressão recombinante em uma célula hospedeira adequada de uma seqüência de DNA, a qual é uma modificação da SEQ ID NO: 1 da patente americana, a modificação refletindo as diferenças de aminoácidos entre as SEQ ID NO: 1 e 2 aqui. Tais modificações podem ser feitas por mutagênese direcionada a sítio, conforme é conhecido na técnica.
Em uma modalidade particular, as preparações líquidas ou sólidas concentradas de cada uma da(s) enzima(s) são preparadas separadamente. Esses concentrados também podem, pelo menos em parte, ser formulados separadamente, conforme explicado em maiores detalhes abaixo.
Em uma outra modalidade particular, a(s) enzima(s) são incorporadas nas composições farmacêuticas da invenção na forma de concentrados sólidos. A(s) enzima(s) podem ser levadas ao estado sólido por vários métodos, conforme é conhecido na técnica. Por exemplo, o estado sólido pode ser ou cristalino, onde as moléculas enzimáticas estão dispostas em uma forma altamente ordenada, ou um precipitado, onde as moléculas enzimáticas estão dispostas em uma forma menos ordenadas, ou desordenadas.
A cristalização pode, por exemplo, ser efetuada em um pH próximo do PI da(s) enzima(s) e em baixa condutividade, por exemplo, de 10 mS/cm ou menos, conforme descrito na EP 691982. Em uma modalidade particular, a lipase para uso de acordo com a invenção é uma lipase cristalina, a qual pode ser preparada conforme descrito no Exemplo I da EP 600868 B1. Os cristais de lipase podem ainda ser reticulados conforme descrito em WO 2006/044529.
Vários métodos de precipitação são conhecidos na técnica, incluindo precipitação com sais, tais como sulfato de amônio e/ou sulfato de sódio; com solventes orgânicos, tais como etanol e/ou isopropanol; ou com polímeros, tais como PEG (polietilenoglicol). Em uma alternativa, a(s) enzima(s) pode(m) ser precipitada(s) a partir de uma solução pela remoção do solvente (tipicamente água) por vários métodos conhecidos na técnica, por exemplo, liofllização, evaporação (por exemplo, em pressão reduzida) e/ou atomização.
Em uma outra modalidade particular, o concentrado sólido da(s) enzima(s) tem um conteúdo de proteína de enzima ativa de pelo menos 50% (p/p) por referência ao conteúdo de proteína total do concentrado sólido. Em ainda outras modalidades particulares, o conteúdo de proteína enzimática ativa, em relação ao conteúdo de proteína total do concentrado sólido, é de pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou de pelo menos 95% (p/p). O conteúdo de proteína pode ser medido conforme é conhecido na técnica, por exemplo, por varredura densitométrica de géis SDS-PAGE marcados com Coomassie, por exemplo, usando um densiômetro calibrado GS-800 da BIO- RAD; pelo uso de um kit comercial, tal como Ensaio de Proteína ESL, No. de ordem 1767003, o qual é comercialmente disponível da Roche; ou com base no método descrito no Exemplo 8 de WO 01/58276.
Preferivelmente, a proteína enzimática (por exemplo, proteína da enzima lipase) constitui pelo menos 50% mais preferivelmente pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96 ou pelo menos 97% do espectro de proteína do concentrado de enzima sólida para uso de acordo com a invenção, conforme medido por varredura densiométrica de um gel SDS- PAGE marcado com Coomassie. Tais enzimas podem ser designadas como enzimas ou polipeptídeos “isolados”, “purificados” ou “purificados e isolados”. Para a lipase expressa em Aspergillus e compreendendo uma mistura de várias formas N-terminais, conforme explicado no Exemplo 5 de WO 2006/136159, a banda relevante em um gel SDS-PAGE é localizada correspondendo a um peso molecular de 34 a 40 KDa. Para uma variante não- glicosilada, tal como N33Q da SEQ ID NO: 1 (LV2934), a banda relevante está localizada em aproximadamente 30 KDa.
Uma composição farmacêutica da invenção compreende a(s) enzima(s), preferivelmente na forma de preparações enzimáticas concentradas, mais preferivelmente concentrados sólidos, em combinação com pelo menos um adjuvante farmaceuticamente aceitável, ou adjuvante, material tal como (i) pelo menos um veículo e/ou excipiente; ou (ii) pelo menos um veículo, excipiente, diluente e/ou adjuvante. Exemplos não- limitativos de, opcional, outros ingredientes, todos farmaceuticamente aceitáveis, são desintegrantes, lubrificantes, agentes tamponantes, agentes umidificantes, conservantes, agentes flavorizantes, solventes, agentes solubilizantes, agentes suspensores, emulsificantes, estabilizantes, propelentes e veículos.
Geralmente, dependendo entre outras coisas da indicação médica em questão, a composição da invenção pode ser designada para todas as formas de administração conhecidas na técnica, preferivelmente incluindo administração enteral (através do canal alimentar). Deste modo, a composição pode estar na forma sólida, semi-sólida, líquida ou gasosa, tais como comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, microesferas, unguentos, cremes, espumas, soluções, supositórios, injeções, inalantes, géis, loções e aerossóis. O médico clínico geral saber[a selecionar a via mais adequada de administração e, é claro, evitar vias de administração potencialmente perigosas ou, de outro modo, desvantajosas.
Os seguintes métodos e materiais adjuvantes são, consequentemente, também meramente exemplares e de modo algum limitativos.
Para preparações orais sólidas, a(s) enzima(s) pode(m) ser usada(s) sozinha(s) ou em combinação com aditivos apropriados para fazer pelotas, micropelotas, comprimidos, microcomprimidos, pós, grânulos ou cápsulas, por exemplo, com veículos convencionais, tais como lactose, manitol, amido de milho ou amido de batata; com excipientes ou ligantes, tais como celulose cristalina ou microcristalina, derivados de celulose, acácia, amido de milho ou gelatinas; com desintegrantes, tais como amido de milho, amido de batata ou carboximetilcelulose sódica; com lubrificantes, tais como cera de carnaúba, cera branca, laca, sílica coloidal anidra, polietilenoglicol (PEGs, também conhecidos com o termo macrogol) de 1500 a 20000, particularmente PEG 4000, PEG 6000, PEG 8000, povidona, talco, monoleína ou estearato de magnésio; e, caso desejado, com diluentes, adjuvantes, agentes tamponantes, agentes umidificantes, conservantes, tais como metilparaidroxibenzoato (E218), agentes corantes tais como dióxido de titânio (El71) e agentes flavorizantes, tais como sacarose, sacarina, óleo de laranja, óleo de limão e vanilina. Preparações orais são exemplos de preparações preferidas para o tratamento da indicação médica de PEI.
A(s) enzima(s) também podem, muito geralmente, ser formuladas em preparações orais líquidas, por dissolução, suspensão ou emulsificação delas em um solvente aquoso, tal como água, ou em solventes não-aquosos, tais como óleos vegetais ou outros similares, glicerídeos do ácido alifático sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores, propilenoglicol, polietilenoglicol, tal como PEG 4000, ou álcoois inferiores tais como álcoois C1-C4 lineares ou ramificados, por exemplo, 2-propanol; e, caso desejado, com materiais subsidiários convencionais ou aditivos, tais como solubilizantes, adjuvantes, diluentes, agentes isotônicos, agentes suspensores, agentes emulsificantes, estabilizantes e conservantes.
Além disso, a(s) enzima(s) podem ser geralmente feitas em supositórios para administração retal pela mistura com uma variedade de bases, tais como bases emulsificantes ou bases solúveis em água. O supositório pode incluir veículos, tais como manteiga de cacau, carbowax e polietilenoglicóis, os quais fundem na temperatura corporal, no entanto são solidificados em temperatura ambiente.
O uso de lipossomas como um veículo de distribuição é outro método de possível interesse geral. Os lipossomas se fundem com as células do sítio alvo e distribuem os conteúdos do lúmen intracelularmente. Os lipossomas são mantidos em contato com as células por tempo suficiente para se fundirem, usando várias formas para manter contato, tais como isolamento, agentes de ligação e semelhantes. Em um aspecto da invenção, os lipossomas são projetados para serem distribuídos por aerossol para administração pulmonar. Os lipossomas podem ser preparados com proteínas ou peptídeos purificados que medeiam a fusão das membranas, tal como o vírus Sendai ou o vírus influenza, etc. Os lipídeos podem ser qualquer combinação útil de lipídeos formadores de lipossoma conhecidos, incluindo lipídeos catiônicos ou zwitteriônicos, tais como fosfatidilcolina. O lipídeo remanescente será normalmente lipídeos neutros ou ácidos, tais como colesterol, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol e semelhantes. Para preparar os lipossomas, o procedimento descrito por Kato et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:3361 pode ser usado.
Formas de dosagem unitárias para administração oral ou retal, tais como xaropes, elixires, pós e suspensões podem ser fornecidas em que cada unidade de dosagem, por exemplo, colher de chá cheia, colher de sopa cheia, cápsula, comprimido ou supositório, contém uma quantidade predeterminada da(s) enzima(s). Semelhantemente, formas de dosagem unitárias para administração por injeção ou intravenosa podem compreender a(s) enzima(s) em uma composição como uma solução em água estéril, salina normal ou outro veículo farmaceuticamente aceitável.
O termo “forma de dosagem unitária”, conforme aqui utilizado, se refere às unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos humanos e animais, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de enzima(s) em uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado.
Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica da invenção é para administração enteral, preferivelmente oral.
Em outras modalidades particulares, a composição oral é (i) uma composição líquida contendo cristais da(s) enzima(s); (ii) uma suspensão líquida de sedimentos de enzima(s) (altamente) purificadas; (iii) um gel contendo a(s) enzima(s) na forma sólida ou solubilizada; (iv) uma suspensão líquida de enzima(s) imobilizada(s) ou de enzimas adsorvidas em partículas e semelhantes; ou (v) uma composição sólida na forma de pó, pelotas, grânulos ou microesferas contendo enzima(s), caso desejado na forma de comprimidos, cápsulas ou semelhantes, que são opcionalmente revestidos, por exemplo, com um revestimento estável a ácido.
Em outra modalidade particular da invenção, a(s) enzima(s) é/são compartimentalizadas, a saber, separadas umas das outras, por exemplo, através de revestimentos separados.
Em ainda uma outra modalidade particular da invenção, a protease é separada de outros componentes enzimáticos da composição, tais como a lipase e/ou a amilase.
A dosagem da(s) enzima(s) irá variar amplamente, dependendo da(s) enzima(s) específica(s) a ser(em) administrada(s), da frequência de administração, do modo de administração, da gravidade dos sintomas e da suscetibilidade do indivíduo aos efeitos colaterais, e semelhantes. Algumas das enzimas específicas podem ser mais potentes do que outras.
Exemplos de preparações orais sólidas da(s) enzima(s) da invenção compreendem: (i) uma lipase da invenção; (ii) uma protease com pelo menos 70% de identidade com uma protease selecionada do grupo consistindo de a) uma protease com os aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 3, b) uma protease com os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 4, e c) uma protease com os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 5, e/ou (iii) uma amilase com pelo menos 70% de identidade com uma amilase selecionada do grupo consistindo de a) uma amilase com os aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 6, b) uma amilase com os aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 7 e c) uma amilase com os aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 8; em que preferivelmente as dosagens clínicas diariamente antecipadas das enzimas de (i), (ii) e (iii) são como se segue (todas em mg de proteína enzimática por Kg de peso corporal (bw)): Para a lipase de (i): 0,01-1000, 0,05-500, 0,1-250, ou 0,5-100 mg/kg bw; para a amilase de (ii): 0,001-250, 0,005-100, 0,01-50, or 5 0,05-10 mg/kg bw; par a protease de (iii): 0,005-500, 0,01-250, 0,05-100, ou 0,1-50 mg/kg bw.
Um exemplo preferido de preparações orais sólidas da(s) enzima(s) da invenção compreende: (i) uma lipase da invenção, e (ii) uma amilase compreendendo os aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 6, e/ou (iii) uma protease compreendendo, preferivelmente com os aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 3.
Exemplos de dosagens clínicas diárias antecipadas das enzimas de (i), (ii) e (iii) são as que se seguem (todos em g de proteína enzimática por Kg de peso corporal (bw)): para a lipase de (i): 0,1-250, 0,5- 100 ou 1-50 mg/kg bw; para a amilase de (ii): 0,01-50, 0,05-10 ou 0,1-5 mg/kg bw; para a protease de (iii): 0,05-100, 0,1-50 ou 0,5-25 mg/kg bw.
As ligações amida (peptídicas), assim como os amino e carbóxi terminais, podem ser modificados para uma maior estabilidade na administração oral. Por exemplo, o carbóxi terminal pode ser amidado.
Modalidades particulares das composições farmacêuticas da
invenção, adequadas para o tratamento de distúrbios digestivos, PEI, pancreatite, fibrose cística, diabetes tipo I e/ou diabetes tipo II, podem ser preparadas pela incorporação da(s) enzima(s) da invenção em pelotas. As pelotas podem geralmente compreender de 10 a 90% (p/p, em relação ao peso 25 seco das pelotas resultantes) de um polímero orgânico fisiologicamente aceitável, de 10 a 90% (p/p, em relação ao peso seco das pelotas resultantes) de celulose ou de um derivado de celulose, e de 80 a 20% (p/p, em relação ao peso seco das pelotas resultantes) da(s) enzima(s), a quantidade total de polímero orgânico, celulose ou derivado de celulose e enzima(s) compondo 100% em cada caso. O polímero orgânico fisiologicamente aceitável pode ser selecionado do grupo consistindo de polietilenoglicol 1500, polietilenoglicol 2000, polietilenoglicol 3000, polietilenoglicol 4000, polietilenoglicol 6000, polietilenoglicol 8000, polietilenoglicol 10000, polietilenoglicol 20000, hidroxipropilmetilcelulose, polioxietileno, copolímeros de polioxietileno- polioxipropileno e misturas dos referidos polímeros orgânicos. Polietilenoglicol 4000 é preferido como polímero orgânico fisiologicamente aceitável.
A celulose ou derivado de celulose pode, por exemplo, ser selecionado de celulose, acetato de celulose, éster de ácido graxo de celulose, nitratos de celulose, éter de celulose, carboximetilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, metilcelulose, metiletilcelulose e metilidroxiproilcelulose. Celulose, particularmente celulose microcristalina, é preferida como celulose ou derivado de celulose.
As pelotas resultantes podem ser revestidas com um revestimento entérico adequado, outros revestimentos não-funcionais ou serem usados diretamente sem tal revestimento. Além disso, as pelotas resultantes podem ser preenchidas em cápsulas como cápsulas de gelatina dura ou cápsulas sem gelatina de um tamanho adequado para a terapia de um distúrbio ou doença conforme descrito em maiores detalhes acima. Em uma modalidade da invenção, as pelotas produzidas a partir de diferentes tipos enzimáticos, particularmente de lipase, protease e/ou amilase, podem ser preenchidos nas referidas cápsulas. Embora o enchimento das cápsulas com os diferentes tipos enzimáticos, a dosagem dos tipos enzimáticos individuais (a saber, lipase, protease ou amilase) pode ser adaptada às necessidades específicas de um certo grupo de indicação ou de um certo subgrupo de pacientes pela adição de uma quantidade especificada de qualquer um dentre lipase, protease e/ou amilase às cápsulas, isto é, cápsulas podem ser produzidas, as quais variam nas suas proporções específicas de lipase:protease:amilase.
Composições farmacêuticas preferidas da lipase da invenção são descritas em WO 2005/092370, particularmente em formulações compreendendo os excipientes preferidos ali mencionados. Em uma modalidade particularmente preferida, a composição farmacêutica compreende uma mistura de macrogoglicerídeo de mono-, di- e triacilglicerídeos e polietilenoglicol (PEG), mono e diésteres de ácidos carboxílicos C6-C22 alifáticos, e também possivelmente pequenas proporções de glicerol e de polietilenoglicol livre.
O polietilenoglicol (PEG) contido nas misturas macrogoglicerídicas é preferivelmente PEG, o qual tem em média de 6 até no máximo 40 unidades de óxido de etileno por molécula ou um peso molecular entre 200 e 2000.
Um aspecto adicional da invenção proporciona à composição farmacêutica da invenção da(s) enzima(s) da invenção compreender um sistema consistindo de tensoativo, co-tensoativo e fase lipofílica, o sistema com um valor LVB (balanço hidrofílico-lipofílico) maior do que ou igual a 10 e um ponto de fiisão maior do que ou igual a 3O0C. Em uma modalidade preferida, o sistema tem um valor LVB de 10 a 16, preferivelmente de 12 a
15, e tem um ponto de fusão entre 30 e 600°C, preferivelmente entre 40 e 500°C. Particularmente, o sistema caracterizado pelo valor LVB e ponto de fusão é uma mistura de mono, di e triacilglicerídeos e de mono e diésteres de polietilenoglicol (PEG) com ácidos carboxílicos alifáticos com 8 a 20, preferivelmente 8 a 18 átomos de carbono, por meio do que o polietilenoglicol tem preferivelmente de cerca de 6 até cerca de 32 unidades de óxido de etileno por molécula, e o sistema contém opcionalmente glicerina livre e/ou polietilenoglicol livre. O valor LVB de tal sistema é preferivelmente regulado pelo comprimento da cadeia do PEG. O ponto de fusão de tal sistema é regulado pelo comprimento da cadeia dos ácidos graxos, o comprimento da cadeia do PEG e o grau de saturação das cadeias de ácido graxo, e deste modo o óleo de partida para a preparação da mistura macrogoglicerídica.
5 “Ácidos carboxílicos C8-C18 alifáticos” designa misturas nas
quais o ácido caprílico (C8), ácido cáprico (CIO), ácido láurico (Cl2), ácido mirístico (Cl4), ácido palmítico (Cl6) e ácido esteárico (Cl8) estão contidos em uma proporção significativa e variável,se esses ácidos forem saturados, e os correspondentes ácidos carboxílicos C8-C18 insaturados. As proporções desses ácidos graxos podem variar de acordo com os óleos de partida.
Tal mistura de mono, di e triacilgliceróis e mono e diésteres de poletilenoglicol (PEG) com ácidos carboxílicos alifáticos com 8 a 18 átomos de carbono pode, por exemplo, ser obtida por uma reação entre um polietilenoglicol com um peso molecular entre 200 e 1500 e um óleo de 15 partida, o óleo de partida consistindo de uma mistura triglicerídica com ácidos graxos os quais são selecionados do grupo contendo ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico e ácido linolênico, individualmente ou como uma mistura. Opcionalmente, o produto de tal reação também pode conter pequenas 20 proporções de glicerina e de polietilenoglicol livre.
Tais misturas são comercialmente disponíveis, por exemplo, sob o nome comercial Gelucire®. Uma modalidade vantajosa da invenção estabelece que, dos produtos conhecidos sob o nome comercial Gelucire®, particularmente “Gelucire® 50/13” e/ou “Gelucire® 44/14” representam 25 misturas adequadas para uso em preparações farmacêuticas de acordo com a invenção.
Gelucire® 50/13 é uma mistura com mono, di e triglicerídeos e mono e diésteres de poletilenoglicol, com ácido palmítico (Cl6) e ácido esteárico (Cl8) de 40% a 50% e 48% a 58%, respectivamente, compondo a maior proporção dos ácidos graxos ligados. A proporção de ácido caprílico (c8) e de ácido cáprico (ClO) é menor do que 3% em cada caso, e a proporção de ácido láurico (Cl2) e de ácido mirístico (Cl4) em cada caso é menor do que 5%.
5 Gelucire® 44/14 é uma mistura com mono, di e
triacilglicerídeos e mono e diésteres de polietilenoglicol, as respectivas proporções de ácido palmítico (Cl6) sendo de 4 a 25%, ácido esteárico (Cl8) de 5 a 35%, ácido caprílico (c8) menor do que 15%, ácido cáprico (ClO) menor do que 12%, ácido láurico (Cl2) de 30 a 50% e ácido mirístico (Cl4) 10 de 5 a 25%. Gelucire® 44/14 pode, por exemplo, ser preparado por uma reação de alcoólise/esterificação usando óleo de semente de palma e polietilenoglicol 1500.
Uma modalidade preferida da presente invenção fornece uma composição farmacêutica das enzima(s) da invenção, a qual compreende um 15 sistema contendo uma mistura de mono, di e triacilglicerídeos e polietilenoglicol mono e diésteres de ácidos carboxílicos C8-C18 alifáticos e também possivelmente pequenas proporções de glicerina e polietilenoglicol livre, o sistema com um ponto de fusão entre 40°C e 55°C e um valor LVB na faixa entre 12 e 15. Mais preferivelmente, o sistema tem um ponto de fusão 20 entre 44°C e 50°C e um valor de LVB na faixa de 13 a 14. Alternativamente, o sistema tem um ponto de fusão de aproximadamente 44°C e um valor LVB de 14, ou o sistema tem um ponto de fusão em tomo de 50°C e um valor LVB de 13.
Métodos de tratamento A lipase para uso de acordo com a invenção, opcionalmente
em combinação com uma protease, e/ou uma amilase (a enzima(s) da invenção) é útil no tratamento terapêutico e/ou profilático de várias doenças ou distúrbios em animais. O termo “animal” inclui todos os animais, e particularmente seres humanos. Exemplos de animais são não-ruminantes e ruminantes, tais como ovelhas, cabras e gado, por exemplo, gado de corte e vaca. Em uma modalidade particular, o animal é um animal não-ruminante. Animais não-ruminantes incluem animais monogástricos, por exemplo, cavalo, porco (incluindo, porém sem se limitar, a leitões, porcos em crescimento e porcas); aves tais como perus, patos e galinhas (incluindo, porém sem se limitar, a galinhas de grelha, galinhas poedeiras); vacas jovens; animais de estimação, tais como gatos e cachorros; e peixes (incluindo, porém sem se limitar, a salmão, truta, tilápia, peixe-gato e carpas; e crustáceos (incluindo porém sem se limitar a camarões e pitus). Em uma modalidade particular, o animal é um mamífero, mais particularmente um ser humano.
Por exemplo, a(s) enzima(s) é/são útil(eis) no tratamento de distúrbios digestivos como má-digestão ou dispepsia que são geralmente causadas por uma produção e/ou secreção deficiente no trato gastrintestinal de enzimas digestivas normalmente secretadas do estômago, e do pâncreas.
Além disso, a(s) enzima(s) são particularmente úteis no tratamento de PEI. PEI pode ser verificado usando, inter alia, o teste de Borgstrõm (JOP. J Pancreas (Online), 2002; 3(5): 116-125), e isto pode ser causado por doenças e condições tais como câncer pancreático, cirurgia pancreática e/ou gástrica, por exemplo, resseção total ou parcial do pâncreas, gastrectomia, cirurgia de revascularização pós-gastrintestinal (por exemplo, gastroenterostomia de Billroth II); pancreatite crônica; síndrome de Shwachman diamante; obstrução do dueto do pâncreas ou dueto biliar comum (por exemplo, do neoplasma); e/ou fibrose cística (uma doença hereditária na qual um muco espesso bloqueia os duetos do pâncreas). A(s) enzima(s) pode(m) também ser útil/úteis no tratamento de pancreatite aguda.
O efeito da(s) enzima(s) nos distúrbios digestivos pode ser medido conforme é geralmente descrito em EP 0600868, no qual o Exemplo 2 descreve um teste de digestibilidade in vitro para medir a estabilidade da lipase sob condições gástricas, e o Exemplo 3 um teste de digestibilidade in vitro para a atividade da lipase na presença de sais biliares. Os testes correspondentes podem ser estabelecidos para a protease e a amilase. Também WO 02/060474 descreve testes adequados, por exemplo (1) um teste in vitro para medir a digestão lipídica em uma ração de teste suína, e (2) um 5 teste in vivo cm pâncreas insuficiente de suíno no qual a digestibilidade da gordura, proteína e amido é medida.
Como outro exemplo, a(s) enzima(s) é/são útil/úteis no tratamento de diabetes mellitus tipo I e/ou tipo II, particularmente para o tratamento adjuvante em uma terapia de diabetes de distúrbios digestivos geralmente acompanhando esta doença, em vista de reduzir complicações posteriores.
O efeito na diabetes mellitus da(s) enzima(s) pode ser determinado por um ou mais dos métodos descritos em WO 00/54799, por exemplo, pelo controle do nível de hemoglobina glicosilada, pelo nível de 15 glicose sanguínea, por ataques hipoglicêmicos, o status de vitaminas lipossolúveis como as vitaminas A, D e E, a dosagem diária necessária de insulina, o índice de massa corporal e períodos hiperglicêmicos.
A invenção descrita e aqui reivindicada não está limitada no escopo pelas modalidades específicas aqui reveladas, uma vez que essas 20 modalidades são tencionadas como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer modalidades equivalentes são tencionadas a estarem dentro do escopo dessa invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas aqui mostradas e descritas serão aparentes para as pessoas versadas na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações 25 também são tencionadas para caírem dentro do escopo das reivindicações anexadas. Em caso de conflito, a presente descoberta incluindo definições irá prevalecer.
Modalidades particulares
A invenção também se refere a uma lipase, preferivelmente ao uso como medicamento, cuja lipase, em comparação com a seqüência do aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2, compreende as substituições de qualquer uma das reivindicações 1-2 e 5-9, tais como as substituições N33Q, T231R e N233R, assim como pelo menos uma substituição adicional 5 selecionada a partir das seguintes:
E1*,D,N; Q4H,P,R; D5E; N8L,Q; Q9H; FlOL; Nl 1C,D,H,L,P,Q,R,S; G23E N26A,H,I; D27I,N,Q,R,S,V; P29T; A30T,V; T37K,M G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; N39H,S; E43K; K46M; A49T L52I,R; E56K,Q,R,S; D57G,N; V60E,S; G61R; V63R; A68V; L69I; N71I,S N73Q,Y; I76T; R84E; I86F,L; E87A,H,K,R; I90L,V G91 A,C,E,F,K,L,M,N,S,T,V, W,Y; L93*,F; N94*,K,Q,R,S; F95* D96* ,E,G,N,R,S,W,Y; L97M,Q; K98I,T; E99D; N101Q; D102E,G,Y R108M; G109 A; D111A,E,N,S; G112A; Tl 141; S115L Wll7C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; D122E,N; Q126L; V128A; D130H H135D; P136H; Y138F; V141E,L; A150V; V154F,I,L; A155V; G156R G161A,E; N162G,S,T; G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y D167E; V168M; V176A,D,F,G,H,I,K,M,N,Q,T,W; G177A; R179T; L185M G190C,D; N200Q,S; R205I; L206F; E210D,R,V,Y; S216P; E219D; G225P T226N; L227F,G; P229R; E239D; G240L; D242E; T244S; G246A; Q249R N251Q,S; D254A,G,I,K,L,M,N,R,Q,S,Y; 1255A,F
P256A,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y; e L269F,H; referida lipase além disso:
(a) tendo pelo menos 50% de identidade com a seqüência dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2;
(b) sendo codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito baixas (preferivelmente baixas, médias,
média-altas, altas ou mais preferivelmente muito altas) com (i) a seqüência codificadora da SEQ ID NO: 1 da Patente Americana No. 5.869.438, a qual é por meio disso incorporada por referência (uma seqüência de DNA codificando a lipase da SEQ ID NO: 2 aqui), ou (ii) uma fita complementar de comprimento total de (i); e/ou
(c) sendo uma variante compreendendo além disso uma substituição, anulação e/ou inserção de um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, preferivelmente de 5 natureza conservativa.
Condições de estringência de muito baixas a muito altas são definidas com pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS
0,3%, DNA de esperma de salmão desnaturado e cortado 200 microg/mL, e ou formamida 25% para estringências muito baixas e baixas, formamida 35% 10 para estringências médias e médio-elevadas, ou formamida 50% para estringências elevadas e muito elevadas, após os procedimentos de Southern blotting padrões, idealmente por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS 0,2%, preferivelmente a 45°C (estringência muito baixa), mais preferivelmente a 15 50°C (baixa estringência), mais preferivelmente a 55°C (estringência média), mais preferivelmente a 60°C (estringência médio-alta), ainda mais preferivelmente a 65°C (alta estringência), e mais preferivelmente a 70°C (estringência muito alta).
Alterações de aminoácidos de uma natureza conservativa não 20 afetam significativamente a dobragem e/ou atividade da proteína, e incluem pequenas anulações, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensão amino ou carboxiterminais pequenas, tal como um resíduo de metionina aminoterminal; um pequeno ligante peptídico de até cerca de 20 a 25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação pela alteração da 25 carga líquida ou outra função, tal como uma região de poliistidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.
A invenção ainda se refere a uma variante de uma lipase originária, preferivelmente para uso como um medicamento, cuja variante compreende uma alteração em uma ou mais posições, as referidas posições correspondendo a uma ou mais posições na enzima de origem, em que:
(a) a(s) alteração(ões) são independentemente
(i) uma inserção de um aminoácido imediatamente à jusante da
posição,
5
(ii) uma anulação do aminoácido o qual ocupa a posição, e/ou
(iii) uma substituição do aminoácido a qual ocupa a posição;
(b) as alterações são selecionadas das alterações de qualquer
uma das reivindicações 1 - 2 e 5 - 9;
10
(c) a variante tem atividade lipase; e
(d) cada posição corresponde a uma posição da seqüência de
aminoácidos da enzima, com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
Em uma modalidade particular, a variante, e/ou a original tem
pelo menos 50% de identidade com a seqüência de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2.
de vinte e dois, vinte e um, vinte, dezenove, dezoito, dezessete ou dezesseis. Mais preferivelmente, a quantidade total das alterações é quinze, ainda mais preferivelmente catorze, ainda mais preferivelmente treze, ainda mais preferivelmente doze, ainda mais preferivelmente onze, ainda mais
preferivelmente dez, ainda mais preferivelmente nove, ainda mais preferivelmente oito, ainda mais preferivelmente sete, ainda mais preferivelmente seis, ainda mais preferivelmente cinco, ainda mais preferivelmente quatro, ainda mais preferivelmente três, ainda mais preferivelmente duas e mais preferivelmente uma.
Uma variante pode ser produzida pela mistura de um ou mais
polinucleotídeos codificando uma ou mais lipases originais homólogas. O termo “mistura” significa recombinação de sequência(s) de nucleotídeo(s) entre duas ou mais seqüências de nucleotídeos homólogas, resultando em seqüências de nucleotídeos recombinadas (isto é, seqüências de nucleotídeos
15
A quantidade total de alterações na variante preferivelmente é submetidas a um ciclo de mistura) com uma quantidade de nucleotídeos trocada, em comparação com a seqüência de nucleotídeos inicial.
As seguintes variantes da lipase da SEQ ID NO: 2 são exemplos de lipases de acordo com a reivindicação 6 e 9:
LVAO12
=LVAO 13 D27R+N3 3Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T; LVA023 N33Q+E210D+T231R+N233R;
LVA041 N33Q+D111A+T231R+N233R;
LVA043 N33Q+G91T+T231R+N233R;
LVA055 N33Q+E219D+T231R+N233R;
LVA060 N33Q+W117L+T231R+N233R;
LVA061 D27Q+N33Q+T231R+N233R;
LVA063 N33Q+G91T+T231R+N233R;
LVA089 D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P +T231R+N233R+P256T;
LVA094 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T;
LVA099 D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R +P256T;
LVAl 03 Q4R+N 3 3 Q+T231R+N23 3 R;
LVAl 13 N33Q+T231R+N233R+Q249R;
LVA120 N33Q+D96W+T231R+N233R;
LVA129 D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R;
LVA130 D2 7V+N33 Q+V60S+T231R+N23 3 R+Q249R;
LVA139 Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R;
LVA140 N33Q+D111E+T231R+N233R;
LVA143 N33Q+D122E+T231R+N233R;
LVA147 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T;
LVA162 N33Q+D167E+T231R+N233R; LVA179 LVA180 LVAl 82
LVAl 85 LVAl 98 LVA202 LVA206
LVA208
LVA210
LVA211
LVA214
LVA216
LVA217
LVA218
LVA220
LVA221
LVA222
LVA228
LVA229
LVA230
LVA231
LVA234
LVA238
LVA241
LVA243
Ν33 Q+G91Ν+Τ231R+N23 3 R;
N33Q+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R
+P256T;
N11R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+N39H+T231R+N233R;
N33Q+P229R+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R +N233R+ P256T;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+ P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R +P256T;
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N33Q+E56Q+T231R+N233R;
N33Q+E210V+T231R+N233R;
N33Q+E56K+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254G;
N33Q+D96S+T231R+N233R;
N33Q+D122N+T231R+N233R;
N26A+N3 3 Q+T231R+N23 3 R;
N33Q+N162T+T231R+N233R;
N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R; N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+G240L;
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T; D27R+N33Q+G91A+N94S+D111Λ+Τ231R+N233 R+P256T; N33Q+N200S+T231R+N233R; LVA245
LVA247
LVA248
LVA249
LVA250
LVA252
LVA254
LVA256
LVA257
LVA272
LVA273
LVA275
LVA277
LVA279
LVA280
LVA281
LVA284
LVA287
LVA307
LVA308
LVA310
LVA315
LVA317
LVA319
LVA325
LVA327
LVA330
N33Q+N39S+T231R+N233R;
N33Q+E210R+T231R+N233R;
N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R;
N33Q+T231R+N233R+D254R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+D96R+T231R+N233R;
D27N+N33Q+T231R+N233R;
D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+L227F+T231R+N233R;
N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R;
N33Q+G225P+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+D96G+T231R+N233R;
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+D254G;
N33Q+D130H+T231R+N233R;
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+E239D;
N33Q+D111Α+Τ231R+N233R+D254G;
Ν33 Q+E21OV+Τ231R+N23 3R+D254S;
Nll R+N 3 3 Q+E210 V+T231R+N23 3R+D254S; N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163 K+T231R+N23 3R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+Gl 63K+T231R+N233R+D254S; Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+P256T;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R; Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T; LVA331
LVA333
LVA334
LVA338
LVA341
LVA345
LVA347
LVA349
LVA353
LVA355
LVA357
LVA359
LVA360
=LVA415
LVA362
LVA364
LVA368
LVA370
LVA371
LVA373
LVA375
LVA379
LVA381
LVA383
LVA387
LVA389
LVA391
LVA393
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+P256T;
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G177A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+G246A; D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27Q+N3 3 Q+G91T+G163 K+E219D+T231R+N233R;
N3 3 Q+G91T+E219D+T231R+N23 3R;
K98I+T231R+N233R+N251S;
N33Q+G163R+T231R+N233R;
N33Q+G163N+T231R+N233R;
N33Q+G163C+T231R+N233R;
N33Q+G163Q+T231R+N233R;
N33Q+G163E+T231R+N233R;
N33Q+G163H+T231R+N233R;
N33Q+G163I+T231R+N233R;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G91K+T231R+N233R;
N33Q+G91M+T231R+N233R;
N33Q+G91F+T231R+N233R;
N33Q+G91S+T231R+N233R;
N33Q+G91W+T231R+N233R;
N33Q+G91Y+T231R+N233R;
N33Q+G163T+T231R+N233R;
N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G163Y+T231R+N233R;
N33Q+G163V+T231R+N233R; LVA399
LVA411
LVA412
LVA413
=LVA414
LVA416
LVA417
LVA420
LVA421
LVA437
LVA438
LVA440
LVA442
LVA444
LVA449
LVA450
LVA451
LVA453
LVA454
LVA456
LVA458
LVA460
LVA461
LVA463
LVA464
LVA468
LVA470
N33Q+G91C+T231R+N233R;
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G161E+T231R+N23 3R;
N33Q+V128A+T231R+N233R; N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R;
N3 3 Q+G3 8 A+T231R+N23 3 R;
N33Q+G163 A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
N33Q+G163M+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N23 3 R+Q249R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S +P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G +P256T;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94R+D111 A+Wl 17L+T231R+N233R;
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S; N33Q+T231R+N233R+P256T;
N33Q+T231R+N233R+D242E;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
N33Q+E56R+T231R+N233R;
N3 3 Q+N162G+T231R+N23 3 R;
N33Q+G91L+T231R+N233R;
N33Q+E87H+T231R+N233R;
N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R; LVA471
LVA472
LVA473
LVA474
LVA480
LVA482
LVA483
LVA484
LVA486
LVA488
LVA490
LVA492
LVA494
LVA503
LVA505
LVA506
LVA507
LVA509
LVA512
LVA513
LVA516
LVA518
LVA519
LVA520
LVA523
LVA526
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S +Ρ256Τ;
N33Q+G163A+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254A;
N33Q+T231R+N233R+D254N;
N33Q+T231R+N233R+D254Q;
N33Q+T231R+N233R+D254I;
N33Q+T231R+N233R+D254L;
N33Q+T231R+N233R+D254K;
N33Q+T231R+N233R+D254M;
N33Q+S216P+L227G+T231R+N23 3 R+Q249R; D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R; N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R; D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R;
D27R+N3 3 Q+L227G+T231R+N23 3 R+Q249R;
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R; D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R; D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
Ν3 3 Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N23 3 R+Q249R; D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T; LVA527
LVA530
LVA532
LVA535
LVA540
LVA542
LVA547
LVA548
LVA553
LVA555
LVA561
LVA562
LVA564
LVA565
LVA566
LVA567
LVA569
LVA576
LVA578
LVA580
LVA581
LVA582
LVA583
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+ T231R+ N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91 N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R +D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155 V+S216P+L227G+T231R +N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R +D254S+P256T;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S; N33Q+T231R+N233R+P256A;
N33Q+T231R+N233R+P256N;
N33Q+T231R+N233R+P256G;
N33Q+T231R+N233R+P256H;
N33Q+T231R+N233R+P256L;
N33Q+T231R+N233R+P256M;
N33Q+T231R+N233R+P256S;
N33Q+T231R+N233R+P256W;
N33Q+T231R+N233R+P256Y;
N33Q+T231R+N233R+P256F;
N33Q+T231R+N233R+P256V;
N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R;
N3 3 Q+G91M+G163 D+T231R+N23 3 R; N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R; LVA586 N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R;
LVA602 N33Q+V176N+T231R+N233R;
LVA604 N33Q+V176D+T231R+N233R;
LVA614 N33Q+W117F+T231R+N233R;
LVA620 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
LVA622 N33Q+V176I+T231R+N233R;
LYA623 N33Q+D111N+T231R+N233R;
LVA627 N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R;
LVA629 N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R;
LVA631 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
LVA632 Ν3 3 Q+G91M+G163P+T231R+N23 3 R;
LV A634 N33Q+G91T+G163 A+T231R+N23 3R;
LVA639 N33Q+W117D+T231R+N233R;
LVA640 N33Q+W117H+T231R+N233R;
LVA649
=LVA650 N33Q+W117C+T231R+N233R;
LVA651 N33Q+W117K+T231R+N233R;
LVA653 N33Q+W117V+T231R+N233R;
LVA656 Nl 1S+N33Q+T231R+N233R;
LVA658 N33Q+W117E+V176K+T231R+N233R;
LVA659 N33Q+W117G+T231R+N233R;
LVA664 N33Q+W117P+T231R+N233R;
LVA665 N33Q+W117S+T231R+N233R;
LVA666 N33Q+W117T+T231R+N233R;
LVA667 N33Q+W117I+T231R+N233R;
LVA670 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
LVA672 N33Q+S115L+T231R+N233R;
LVA675 N3 3 Q+G3 8 A+G91 T+G 163 K+T231R+N23 3 R+D254S;
LVA696 N33Q+V176M+T231R+N233R; LVA697 N33Q+V176H+T231R+N233R; LVA700 N33Q+V176A+T231R+N233R; LVA702 D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R; LVA705 N33Q+W117Y+T231R+N233R; LVA707 N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R; LVA713 D27V+N33Q+G91A+N94R+D111 A+Gl 63K+L227F+T231R+N233R LVA714 +Q249R; =LVAR714 D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R LVA715 +Q249R+D254S; D27R+N33Q+P136H+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S; LVA718 Nl 1R+N33Q+T231R+N233R+T244S; LVA721 N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S; LVA722 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N23 3R+D254S; LVA723 N33Q+G161A+T231R+N233R; LVA731 N3 3 Q+G3 8I+G177 A+T231R+N23 3 R; LVA732 N33Q+N101Q+T231R+N233R; LVA733 N33Q+N94Q+T231R+N233R; LVA734 N33Q+G161A+T231R+N233R; LVA736 Nl 1Q+N33Q+T231R+N233R; LVA738 N8Q+N33Q+T231R+N233R; LVA740 N33Q+T231R+N233R+N251Q; LVA743 N33Q+N200Q+T231R+N233R; LVA744 N33Q+G177A+T231R+N233R; LVA746 N33Q+N73Q+T231R+N233R; LVA749 N33Q+I86L+T231R+N233R; LVA753 N3 3 Q+K98I+G163K+T231R+N233R; LVA754 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S +Ρ256Τ; LVA755
LVA770
LVA771
LVA772
LVA773
LVA774
LVA777
LVA778
LVA782
LVA783
LVA784
LVA786
LVA788
LVA792
LVA799
LVA800
LVA801
LVA803
LVA804
LVA805
LVA806
LVA808
LVA809 LVA811
D27R+N3 3 Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S +Ρ256Τ;
D27R+N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R; N33Q+K98I+G163K+N200Q+T231R+N233R+N251S; N33Q+G38S+G163K+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111Α+Τ231R+N233R+D254S +Ρ256Τ;
N33Q G38Y T231RN233R;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R +Ρ256Τ;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R +Ρ256Τ;
N33Q+G38N+N73Q+T231R+N233R;
Ν33 Q+G3 8D+R84E+T231R+N23 3 R;
N33Q+G38Q+T231R+N233R;
N33Q+G38I+T231R+N233R;
Ν3 3 Q+G3 8Κ+Τ231R+N23 3 R;
Ν33 Q+G3 8F+T231R+N23 3 R;
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S; N33Q+G38L+T231R+N233R;
N33Q+G38M+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G38P+T231R+N233R;
N33Q+G38T+T231R+N233R;
NI 1R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R +D254S+P256T;
NI 1R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R +D254S+P256T;
LVA813 D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
LV Α814 Ν33 Q+W117I+V176Q+T231R+N233R+P256A;
LV A816 N33 Q+G3 8 A+G163 A+T231R+N233R+P256A;
L V A817 N33 Q+W 117I+V176Q+T231R+N23 3R;
LVA818 N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A;
LVA819 E1N+N33Q+T231R+N233R;
LVA821 N33Q G38H T231RN233R;
LVA829 N3 3 Q+G91A+N 94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R +D254S;
LV A830 N11R+N33Q+G91 T+G 163K+V176Q+T231R+N23 3R+D254S;
LVA831 N33Q+K98I+T231R+N233R;
LVA834 D27R+N33Q+W117I+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
LVA835 Nl 1R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA839 N33Q+G163W+T231R+N233R;
LVA841 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
LVA842 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S +P256T;
LVA844 N33Q+T231R+N233R+D254Q;
LVA846 Nl 1R+N33Q+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA847 Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+V176W+T231R+N233R+D254S;
LVA848
=LVA849 N33Q+G163D+T231R+N233R;
LVA850 N33Q+G163P+T231R+N233R;
LVA853 E1D+N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S;
L V A8 5 7 N33 Q+G91T+N94R+D111 A+W 117L+V176 W+T231R+N23 3 R;
LVA860 Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T;
LVA862 D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G LVA863
LVA865
LVA866
LVA869
LVA871
LVA873
LVA875
LVA877
LVA878
LVA880
LVA882
LVA883
LVA888
LVA890
LVA892
LVA896
LVA897
LVA899
LVA904
LVA906
+Τ231R+N233R+P256T;
D27R+N3 3 Q+E43 K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91T+N94S+D111 A+Gl 63T+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+N233R;
Nl 1R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T +S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+ L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
Nl 1R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P +L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N3 3 Q+E5 6Q+D5 7N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G +T231R+N233R+D242E+D254S+P256T;
D27R+N3 3 Q+G3 8 A+E5 6Q+D5 7N+G91N+N94R+D111S+S216P +L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+E210D+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256L;
N33Q+G38A+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+D254I;
Nl 1R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
Nl 1R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E56Q+G91 T+Gl 63K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R +D254S+P256T;
NI 1R+N 3 3 Q+G3 8 A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S; LVA907
LVA913
LVA915
LVA917
LVA919
LVA921
LVA925
LVA927
LVA928
LVA929
LVA930
LVA933
LVA934
LVA941
LVA942
LVA943
LVA944
LVA945
LVA946
LVA947
LVA948
LVA949
LVA950
LVA952
LVA953
NI 1R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I;
NI 1R+N33Q+G91T+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S; N33Q+E56Q+G156R+V176W+T231R+N233R;
E1D+N3 3 Q+G3 8 A+G91T+N94R+D111 A+W 117L+V176 W+T231R +N233R;
N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A;
NI 1R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N23 3R+D254S; D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G +T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
D27R+N3 3 Q+E56Q+D5 7N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D +L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N3 3 Q+I90L+G91T+N94S+D96E+G163K+T231R+N23 3R+D254S; NI 1R+N33Q+G91 T+Gl 63K+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N3 3 Q+G91 T+G 163 K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S;
Nll R+N33Q+G91 T+Gl 63L+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N3 3 Q+G91 T+G 163 L+T231R+N23 3R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
Nll R+N33Q+G91 T+Gl 63P+V176I+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N; D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P +L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
Q4R+D27Q+N33 Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V LVA954
LVA959
LVA961
LVA962
LVA964
LVA966
LVA968
LVA969
LVA970
LVA972
LVA973
LVA976
LVA977
LVA978
LVA979
LVA980
LVA981
LVA983
LVA984
LVA985
LVA987
LVA988
LVA989
LVA990
LVA991
LVA993
+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256L; N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254Y+I255F; N33Q+L93F+D102Y+T231R+N233R;
D27R+N3 3 Q+L227G+T231R+N23 3 R+Q249R+D254S;
NI 1S+N33Q+T231R+N233R;
Nl 1R+N33Q+T231R+N233R; N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R;
N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33 Q+G3 8 A+G91 T+G 163 P+V176F+T231R+N23 3 R;
N11R+N33Q+G3 8 A+G91 T+G 163 P+V 176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+Gl 63K+T231R+N233R+D254A+P256F;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+P256F;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F;
N11R+N33Q+G38 A+G91 T+Gl 56R+G163K+V176T+T231R+N233R +D254S;
N33Q+G91K+D96S+G163T+T231R+N233R+Q249R;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+G23E+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+V141 E+Gl 63K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nll R+N33Q+T37K+G91 T+Gl 63K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; LVA994 LVA995 LVA997 LVA998 LVA999 LVA1000
LVAl 002 LVA1003 LVA1004 LVA1005
LVA1006
LVAl 007 LVAl 008 LVA1009 LVA1010 LVAl Ol I LVA1012
LVA1013
LVA1014
LVA1015
LVAlOl 7 LVA1018
Nll R+N33Q+G91 T+Gl 63 A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+T37M+G91 T+Gl 63P+V176T+T231R+N233R+D254S;
Nll R+N33Q+G91 T+Gl 63L+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I; N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R;
NI 1R+D27R+N3 3 Q+E5 6Q+D5 7N+G91N+N94R+D111S+G163K +S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N3 3 Q+G3 8 A+G91 T+Gl 63 P+V 176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G3 8 A+G91 T+G 163Q+V176G+T231R+N233R+D254S;
NI 1R+N33Q+G38 A+G91 T+Gl 63T+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33 Q+G3 8 A+G91T+N94R+G163 P+V 176G+T231R+N23 3 R +D254S;
E1 *+N 11R+N33Q+G38 A+G91N+N94R+G163P+V176G+T231R+ N233R+D254S;
E1 N+N 11R+N3 3 Q+G3 8 A+G91 T+G 163 P+V176F+T231R+N23 3R;
E1N+F1OL+N11R+N33Q+G3 8 A+G91 T+G 163P+V176F+T231R+N233R; E1N+N3 3 Q+G3 8 A+G91 T+G 163 P+V176F+T231R+N23 3 R+D254S; E1N+N33Q+G3 8A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G3 8 A+G91 T+G 163P+V176F+L227F+T231R+N233R;
E1 N+N 11R+N3 3 Q+G3 8 A+G91 T+D 111 A+G 163 P+V 176F+T231R +N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91 T+Gl 63P+V176F+L227F+T231R+N233R +D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S
+I255A+P256Q;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R +N233R+D254S;
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+T231R+N233R; LVA1019 LVA1021
LVA1023
LVAl 027 LVAl 028
LVA1029 LVA1031
LVAl 032
LVA1033 LVAl 034 LVAl 035 LVA1036 LVA1037 LVA103 8
LVA1040 LVA1041
LVA1044 LVAl 045 LVA1046 LVAl 048 LVAR0074 LVAR0076
Ν3 3 Q+G91T+N94S+D111 A+G 156R+G163 T+V176I+T231R+N23 3 R;
N11R+N33Q+G38A+G91 T+D 102G+S115L+G163K+T231R+N233R +D254S+P256T;
NI 1R+N33Q+G38 A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S +P256T;
El N+N 11R+N33Q+G91 T+G 163 A+T231R+N233R+G246A+D254S;
Nl 1R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R +N233R+D254S+P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y
+I255F+L269F;
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y
+I255F;
NI 1C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R +D254S+P256T;
N11P+N3 3 Q+G91 T+G 163K+T231R+N23 3 R+D254S;
Q4R+D27N+N3 3 Q+G3 8A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V +S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
Nl 1R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S;
Nl 1R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+Gl 63P+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91 T+Gl 63K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S; N3 3 Q+E8 7K+T231R+N23 3 R;
N33Q+N94K+T231R+N233R; LVAR0077 LVAR0079 LVAR0080 LVAROO 8 6 LVAR0088 LVAR0091 LVAR0094 LVAR0095 LVAR0096 LVAR0099 LVAROl 01 LVARO102 LVARO103 LVARO104 LVARO106 LVARO108 LVAR204
LVAR205
LVAR207
LVAR208
LVAR209
LVAR214
LVAR215
N33Q+D96Y+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
Α3 OV+N 3 3 Q+K98I+T231R+N23 3 R;
N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R;
N26I+N33Q+T231R+N233R;
A30T+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+G91A+T231R+N233R;
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R;
P29T+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+G91E+T231R+N233R;
Ν3 3 Q+N94K+T231R+N23 3 R;
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G +Τ231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G +Τ231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+P256T;
D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+V168M +E210D+S216P+L227G+T231R+N23 3R+P256T;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P +L227G+T231R+N233R+P256T;
Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G LVAR216
LVAR218
LVAR219
LVAR220
LVAR223
LVAR225
LVAR226
LVAR230
LVAR231
LVAR234
LVAR235
LVAR277
LVAR280
LVAR281
LVAR282
LVAR283
LVAR284
+Τ231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R +N233R+P256T;
D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91 N+N94R+K981+D111A+S216P+L227G+T23 IR +N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G +T231R+N233R+P256T+L269H;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+R179T+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E +S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91 N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+A3 OV+N3 3 Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P +L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P +L227G+T231R+N23 3R+P256T;
N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P +L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R +D254K+P256A;
N3 3 Q+G91T+D96E+K9 8T+T114I+T231R+N23 3 R+G163 S; N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R;
N3 3 Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A; D27R+N33Q+G91 T+Tl 14I+G163 W+E210D+T231R+N233R; D27N+N33Q+G91 T+Tl 14I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T; LVAR285
LVAR286
LVAR287
LVAR288
LVAR290
LVAR828
=LVA828
LVAR861
N3 3 Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N23 3 R;
N3 3 Q+G3 8 W+G91T+T114I+G163 K+E21OV+T231R+N23 3 R;
N3 3 Q+G3 8 W+G91 T+T 114I+G163K+E210D+T231R+N23 3 R+P256T; D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R +N233R+P256T;
N33Q+G91 T+Tl 14I+E210V+T231R+N23 3R+D254K+P256A;
10
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R +Q249R; G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+ 216P+ L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR863 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR955 N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVAR956 N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L;
LVA957 N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L;
LVARl042 G23E+D27R+N33Q+L52R+G91 N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E +S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T; e LVARl 043 D27R+N 3 3 Q+E43 K+K46M+I90V+G91 N+N 94R+D111A+T114I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T.
As seguintes são modalidades particulares adicionais da invenção (a lipase da SEQ ID NO: 1 é uma variante (T231R+N233R) da lipase dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2):
1. Uma lipase para uso como medicamento, em que a lipase é uma variante de uma lipase originária, cuja variante (a) tem pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; e (b) tem atividade lipase; e (c) compreende pelo menos uma substituição selecionada dentre as seguintes substituições: N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56C, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, V60L, L69I, E87K, G91A, G91 E, G91 N, G91 R, G91S, G91T, G91V, G91W, L93F, Ν94Κ, N94R, N94S, D96E, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W. D96Y, L97M, L97Q, Κ98Ι, E99D, Ε99Κ, Ε99Ρ, E99S, Ε99Τ, Dl 11Α, Dl 11S, Tl 141, L147S, G163K, E210D, S216P, L227G, T231R, N233R, D234K, 5 E239V, Q249R, N251S, D254N, Ρ256Τ, G263Q, L264A, Ι265Τ, G266D, Τ267Α e L269N, em que cada posição corresponde a uma posição dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; e (d) com a condição de que a variante não é (i) a lipase com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 1, e não (ii) é a variante N33Q da lipase de (i).
2. Uma lipase para uso como medicamento, em que a lipase é
uma variante de uma lipase originária, cuja variante (a) tem pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; e (b) tem atividade lipase; e (c) compreende as substituições T231R e N233R e além disso pelo menos uma substituição selecionada dentre as seguintes substituições: N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56C, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, V60L, L69I, E87K, G91A, G91E, G91N, G91R, G91S, G91T, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, N94S, D96E, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M, L97Q, K98I, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, D111A, DlHS, Tl 141, L147S, G163K, E210D, S216P, L227G, D234K, E239V, Q249R, N251S, D254N, P256T, G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A e L269N, em que cada posição corresponde a uma posição dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; e (d) com a condição de que a lipase não é uma variante N33Q dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 1.
3. Uma lipase para uso como um medicamento, em que a lipase é uma variante de uma lipase originária, cuja variante (a) tem pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2, e
(b) tem atividade lipase; e (c) compreende pelo menos uma substituição em pelo menos uma das posições 30, 42, 114 e/ou 163, em que cada posição corresponde a uma posição dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2.
4. Uma lipase para uso como um medicamento, em que a lipase é uma variante de uma lipase originária, cuja variante (a) tem pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2, e
(b) tem atividade lipase; e (c) compreende pelo menos uma substituição selecionada das seguintes substituições: A30T, A30V, P42L, Tl 141 e G163K, em que cada posição corresponde a uma posição dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2.
5. Lipase para uso como um medicamento, em que a lipase é
uma variante de uma lipase originária, cuja variante (a) tem pelo menos 50%
de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; e (b) tem
atividade lipase; e (c) é selecionada das seguintes variantes:
LVAO12: D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T,
LVA023: N33Q+E210D+T231R+N233R,
LVA041: N33Q+D111A+T231R+N233R,
LVA043: N33Q+G91T+T231R+N233R,
LVA049: N33Q+G163K+T231R+N233R,
LVA061: D27Q+N33Q+T231R+N233R,
LVA099: D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T,
LVA349: K98I+T231R+N233R+N251S,
LV1232: G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N,
LV1330: N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R,
LV185 5: D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1857: D27R+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T,
LVl 865: D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1874: D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1889: D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T,
LVAR0002b T32I+G91V+T231R+N233R,
LVAR0003: K98I+T231R+N233R,
LVAR00 Ila G91A+T231R+N233R,
LVAR0013: G91V+T231R+N233R,
LVAR0014 N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R,
LVAR0015 P42L+D57N+G91E+T231R+N233R, LVAROO16 Κ98Ι+Τ231R+N233R, LVAROO17 V 60L+G91V+T231R+N233R, LVAR0032 : D57G+L93F+T231R+N233R, LVAR0045 : Α49Τ+Ε5 6R+E8 7Κ+Ε99 S+T231R+N233R, LVAR0046 : Ε99Τ+Τ114I+D254N+T231R+N233R, LVAR0047 : D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R, LVAR0048 Ε43 Κ+Ε5 6 S+E8 7Κ+Τ231R+N233R, LVAR0050 Ε5 6 S++E8 7K+D96L+E99D+T231R+N23 3R, LVAR0051 E56A+D57A+T114Ι+Τ231R+N233R, LVAR0052 G91Ε+Τ231R+N233R, LVAROO 5 3 E56K+D96G+D111Α+Τ231R+N233R, LVAR0054 E87K+D111S+T231R+N233R, LVAR0055 E43V+G91R+T231R+N233R, LVAR005 6 E56S+E87K+T231R+N233R, LVAR0057 E87K+G91Ε+Τ231R+N233R, LVAR0058 D27Y+E87K+T231R+N233R, LVAR0059 Ε43 Μ+Ε8 7K+D96L+E99P+T231R+N233R, LVAR0061 E56K+E87K+D111Α+Τ231R+N233R, LVAR0062 Ε87Κ+Ε99Ρ+Τ231R+N233R, LVAR0063 E87K+D96L+E99P+T231R+N233R, LVAR0064 E56C+E87K+T231R+N233R, LVAR0065 E56R+E87K+D96L+T231R+N233R, LVAR0066 E43D+E56A+D57A+E87K+D111Α+Τ231R+N233R, LVAR0067 Ε5 6K+E87K+D96L+E99P+T231R+N23 3 R, LVAR0068 E87K+L147S+T231R+N233R, LVAR0069 D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N23 3 R, LVAROO 70 E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R, LVAR0071 E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R, LVAR0072 D96V+D111Α+Τ231R+N233R, LVAR0074 N33Q+E87K+T231R+N233R, LVAR0076 N33Q+N94K+T231R+N233R, LVAR0077 N33Q+D96Y+T231R+N233R, LVAR0078 Ν3 3 T+E43V+E5 6K+D96G+T231R+N23 3R, LVAR0079 N33Q+K98I+T231R+N233R, LVAROO 80 Α3 0 V+N 3 3 Q+K981+Τ231R+N233R, LVAR0086 Ν3 3 Q+E87K+D96E+T231R+N233R, LVAR0088 N26I+N33Q+T231R+N233R, LVAR0091 A30T+N33Q+T231R+N233R, LVAR0094 N33Q+G91V+T231R+N233R, LVAR0095 N33Q+G91A+T231R+N233R, LVAR0096 N3 3 Q+G91V+L97M+T231R+N23 3R, LVAR0099 N33Q+K98I+T231R+N233R, LV AROlOl N3 3 Q+L69I+G91E+T231R+N233R, LVARO102 P29T+N33Q+T231R+N233R, LVARO103 N33Q+G91V+T231R+N233R, LVARO104 N33Q+K98I+T231R+N233R, LVARO106 N33Q+G91E+T231R+N233R, e LVARO108 N33Q+N94K+T231R+N233R, em que cada posição corresponde a uma posição dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2.
6. Uma lipase sendo uma variante da lipase originária, cuja variante (a) tem pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269
da SEQ ID NO: 2; e (b) tem atividade lipase; e (c) compreende pelo menos uma substituição em pelo menos uma das posições 30, 42, 114 e/ou 163, em que cada posição corresponde a uma posição de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2.
7. Uma lipase sendo uma variante de uma lipase originária, cuja variante (a) tem pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a
269 da SEQ ID NO: 2; e (b) tem atividade lipase; e (c) compreende pelo menos uma das seguintes substituições: D27Y, P29T, A30V, T32I, N33T, N33Y, P42L, D57A, D57N, G91V, Tl 141, G163K, N251S, em que cada posição corresponde a uma posição de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2.
8. Uma lipase sendo uma variante da lipase originária, cuja variante (a) tem pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; e (b) tem atividade lipase; e (c) é selecionada das seguintes variantes:
LVA012: D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T,
LVA023: N33Q+E210D+T231R+N233R, LVA041: N33Q+D111Α+Τ231R+N233R,
LVA043: N33Q+G91T+T231R+N233R,
LVA049: N33Q+G163K+T231R+N233R,
LVA 061: D27Q+N33Q+T231R+N233R,
LVA099: D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T,
LVA349: K98I+T231R+N233R+N251S,
LV1232: G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N,
LV1330: N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R,
LVl 855: D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1857: D2 7R+G91N+N 94R+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1865: D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T,
LVl 874: D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T,
LVl 889: D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T,
LVAR0002b T32I+G91V+T231R+N233R,
LVAR0003: K98I+T231R+N233R,
LVAROOlla G91A+T231R+N233R,
LVAR0013: G91V+T231R+N233R,
LVAROO14 N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R,
LVAROO15 P42L+D57N+G91E+T231R+N233R,
LVAROO16 K98I+T231R+N233R,
LVAROO17 V60L+G91V+T231R+N233R,
LVAR0032: D57G+L93F+T231R+N233R,
LVAR0045: A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R,
LVAR0046: E99T+T114I+D254N+T231R+N233R,
LVAR0047: D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0048 E43K+E56S+E87K+T231R+N233R,
LVAR0050: E56S++E87K+D96L+E99D+T231R+N233R,
LVAROO 51: E56A+D57A+T114I+T231R+N233R,
LVAR0052: G91E+T231R+N233R,
LVAR0053: E56K+D96G+D111A+T231R+N233R,
LVAR0054: E87K+D111S+T231R+N233R,
LVAR0055 E43V+G91R+T231R+N233R,
LVAR0056: E56S+E87K+T231R+N233R,
LVAR0057: E87K+G91E+T231R+N233R,
LVAR0058: D27Y+E87K+T231R+N233R,
LVAR0059 E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0061: E56K+E87K+D111A+T231R+N233R, LVAR0062: E87K+E99P+T231R+N233R, LVAR0063: E87K+D96L+E99P+T231R+N233R, LVAR0064: E56C+E87K+T231R+N233R, LVAR0065: E5 6R+E8 7K+D96L+T231R+N233R, LVAR0066 E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R, LVAR0067: E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R, LVAR0068 E87K+L147S+T231R+N233R, LVAR0069: D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R, LVAR0070 E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R, LVAR0071 E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R, LVAROO 72: D96V+D111A+T231R+N233R, LVAR0074: N33Q+E87K+T231R+N233R, LVAR0076: N33Q+N94K+T231R+N233R, LVAROO 77: N33Q+D96Y+T231R+N233R, LVAR0078: N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R, LVAR0079: N33Q+K98I+T231R+N233R, LVAR0080: A3 OV+N 3 3 Q+K98I+T2 31R+N233R, LVAR0086: N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R, LVAR0088: N26I+N33Q+T231R+N233R, LVAR0091: A30T+N33Q+T231R+N233R, LVAR0094: N33Q+G91V+T231R+N233R, LVAR0095: N33Q+G91A+T231R+N233R, LVAR0096: N33 Q+G91V+L97M+T231R+N23 3 R, LVAR0099: N33Q+K98I+T231R+N233R, LVAR0101: N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R, LVARO102: P29T+N33Q+T231R+N233R, LVARO103: N33Q+G91V+T231R+N23 3 R, LVARO104: N33Q+K98I+T231R+N233R, LVARO106: N33Q+G91E+T231R+N233R, e LVARO108: N33Q+N94K+T231R+N233R, em que cada posição corresponde a uma posição dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2.
9. A lipase, de qualquer uma das modalidades 1 a 8, em combinação com uma protease ou uma amilase, para uso como medicamento.
10. A lipase, de qualquer uma das modalidades 1 a 8, em
combinação com uma protease e uma amilase, para uso como medicamento. 11. Lipase, em combinação com uma protease e/ou uma amilase de acordo com a modalidade 9 ou 10, em que (i) a protease tem pelo menos 70% de identidade com uma protease selecionada do grupo consistindo de a) uma protease com os aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 3, b) uma
protease com os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 4, e c) uma protease com os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 5; (ii) a amilase tem pelo menos 70% de identidade com uma amilase selecionada do grupo consistindo de a) uma amilase com os aminoácidos 1 a 48 I da SEQ ID NO: 6, b) uma amilase com os aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 7, e c) uma amilase com os
aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 8.
12. O uso de uma lipase ou de uma mistura de lipases, conforme definido em qualquer uma das modalidades 1 a 8 para a produção de um medicamento para o tratamento de distúrbios congestivos, insuficiência exócrina pancreática, pancreatite, fibrose cística, diabetes tipo I e/ou diabetes
tipo II.
13. O uso da modalidade 12, compreendendo ainda o uso de uma protease ou de uma amilase.
14. O uso da modalidade 12, compreendendo ainda o uso de uma protease e de uma amilase.
15. O uso da modalidade 13 ou 14, em que a protease e/ou
amilase são definidas na modalidade 11.
16. Uma lipase, conforme definido em qualquer uma das modalidades 1 a 8 para uso no tratamento de distúrbios digestivos, insuficiência exócrina pancreática, pancreatite, fibrose cística, diabetes tipo I
e/ou diabetes tipo II.
17. A lipase da modalidade 16, em combinação com uma protease ou com uma amilase.
18. A lipase da modalidade 16, em combinação com uma protease e com uma amilase. 19. A lipase da modalidade 16 ou 17, em que a protease e/ou a amilase são conforme definido na reivindicação 11.
20. Uma composição farmacêutica compreendendo uma lipase ou uma mistura de lipases, conforme definido em qualquer uma das
modalidades 1 a 8, juntamente com pelo menos um material adjuvante farmaceuticamente aceitável.
21. A composição da modalidade 20, compreendendo ainda uma protease ou uma amilase.
22. A composição da modalidade 20, compreendendo ainda uma protease e uma amilase.
23. A composição da modalidade 21 ou 22, em que a protease e/ou amilase são definidas como na modalidade 11.
24. Um método para o tratamento de distúrbios digestivos, insuficiência exócrina pancreática, pancreatite, fibrose cística, diabetes tipo I
e/ou diabetes tipo II, pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma lipase ou de uma mistura de lipases, conforme definido em qualquer uma das modalidades 1 a 8.
25. O método da modalidade 24, compreendendo ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma protease ou
de uma amilase.
26. O método da modalidade 24, compreendendo ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma protease e de uma amilase.
27. O método da modalidade 25 ou 26, em que a protease e/ou a amilase são conforme definidas na modalidade 11.
Várias referências são aqui citadas, as descobertas das quais sendo incorporadas por referência nas suas totalidades.
Exemplos
As substâncias químicas usadas foram produtos comerciais pelo menos de grau reagente. Água deionizada é do sistema Milli-Q (QPAK1, Millipore, no. de catálogo CPMQ004R1).
Exemplo 1. Ensaios enzimáticos
Ensaios para atividade lipase, protease e amilase de pancreatina suína foram publicados pela FIP (Fédération Intematinale Pharmaceutique), assim como pela Farmacopéia Européia e pela Farmacopéia Americana. 1 unidade FIP = 1 unidade Farmacopéia Européia (Farmacopéia Européia). Os ensaios estão descritos, por exemplo, em Fédération Internationale Pharmaceutique, Seção Científica: International Commission for the standardisation of pharmaceutical enzymes, a) "Pharmaceutical Enzymes," Editores: R. Ruyssen e A. Lauwers, E. Story Scientia, Ghent, Bélgica (1978), b) European Pharmacopoeia. Ver também Deemester et al em Lauwers A, Scharpé S (eds): Pharmaceutical Enzymes, Nova Iorque, Marcel Dekker, 1997, p. 343-385. Padrões enzimáticos apropriados podem ser procurados da: Comissão Internacional de Enzimas Farmacêuticas (International Commission on Pharmaceutical Enzymes), Núcleo de Padrões, Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent.
O ensaio FIP de lipase, assim como outros ensaios adequados para lipase, protease e amilase, está descrito abaixo.
Ensaio de lipase FIP
Para medir a atividade lipolítica da pancreatina, o método publicado na Farmacopéia Européia 5.1 foi usado. A não ser que seja estabelecido de outra forma, par a determinação da atividade lipolítica das lipases microbianas, o ensaio para a lipase de Rhizopus oryzae, publicado pela FIP, foi usado.
Ensaio da pNP lipase
Substrato: valerato de para-nitrofenila (pNP). pH do Ensaio: 7,7.
Temperatura do ensaio: 40°C. Tempo reacional: 25 min.
O produto digerido com cor amarela teve uma absorbância característica a 405 nm. Essa quantidade é determinada por espectrofotometria. A atividade lipase pode ser determinada em relação a um 5 padrão enzimático de atividade conhecida. A atividade pode ser expressa em unidades de lipolase (LU). Uma LU (unidade lipolase) é a quantidade de enzima que libera 1 mmol de ácido butírico titulável por minuto sob as condições padrões acima. I KLU = 1000 LU. Uma descrição de ensaio mais detalhada, AF95/6-GB (método lipase/esterase -pH-STAT em um substrato 10 de tributirina (LU)), assim como o substrato LU, está disponível sob solicitação à Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca.
Ensaio da LU lipase
Nesse ensaio, a degradação catalisada por lipase de tributirina 0,16 M (tributirato de glicerol, Merck 1.01958.000) em pH 7,00 e 30°C (+/- 10C) é seguida pela titulação pH-stat do ácido butírico liberado com hidróxido de sódio sem CO2 desgaseificado 0,025 M (titrisol de hidróxido de sódio, Merck 9956). O consumo de titulante é registrado como em função do tempo.
O substrato é emulsificado com um emulsificante de goma 20 arábica 0,6% p/v (20,0 g de goma arábica, 89,5 g de NaCl 2,05 g de KH2PO4, adicionar água até 1,5 L, deixar em repouso até a dissolução completa, adicionar 2700 mL de glicerol, ajustar o pH até 4,5. 90 mL de tributirina são misturados com 300 mL de emulsificante de goma arábica e 1410 m de água desmineralizada e homogeneizada por 3 minutos usando, por exemplo, um 25 emulsificante Silverson L4RT a 7000 rpm e, a seguir, o pH foi ajustado para 4,75). Amostras de lipase foram primeiramente diluídas em tampão glicina 0,1 M pH 10,8, depois em água desmineralizada, objetivando um nível de atividade de 1,5 a 4,0 LU/mL. 15 mL da solução de substrato emulsificado foram vertidos no frasco de titulação. 1,0 mL de solução de amostra é adicionado, e o pH é mantido a 7,0 durante a titulação. A quantidade de titulante adicionado por minuto para manter o pH constante é medida. O cálculo de atividade é baseado na inclinação média da faixa linear da curva de titulação. Um padrão de atividade conhecida pode ser usado como verificador do nível.
I LU (unidade lipase) é a quantidade de enzima que libera 1 micromol de ácido butírico titulável por minuto sob as condições de ensaio dadas acima. I KLU (unidade quilolipase) = 1000 LU.
Uma descrição do ensaio mais detalhada, EB-SM-0095.02, está disponível sob solicitação à Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca.
Ensaio pH stat de lipase
Esse ensaio se baseia na liberação catalisada por lipase dos ácidos graxos de uma emulsão de óleo de oliva na presença de 0,65 mM de sais biliares. O substrato é emulsificado com goma arábica como emulsificante (175 g de óleo de oliva emulsificados com 630 mL de solução de goma arábica (474,6 g de goma arábica, 64 g de cloreto de cálcio em 4000 mL de água) por 15 minutos em um misturador; depois de esfriar até a temperatura ambiente, o pH é ajustado para pH 6,8 - 7,0 usando NaOH 4 M).
Para a determinação, 19 mL da emulsão e 10 mL de solução de sais biliares (492 mg de sais biliares são dissolvidos em água e completados até 500 mL) são misturados no frasco reacional e aquecidos até 36,9°C até 37,5°C. A reação é iniciada pela adição de 1,0 mL de solução de enzimas. O ácido liberado é titulado automaticamente em pH 7,0 pela adição de hidróxido de sódio 0,1 M por 5 min. A atividade é calculada a partir da inclinação da curva de titulação entre o I0 e o 5o minuto. Para calibração, um padrão é medido em três níveis diferentes de atividade.
Ensaio Suc-AAPF-pN protease Substrato: Suc-AAPF-pNA (Sigma S-7388). Tampão de ensaio: ácido succínico 100 mM, HEPES 100 mM (sigma H-3375), CHES 100 mM (Sigma C-2885), CABS 100 mM (Sigma C- 5580), CaCl2 1 mM, KCl 150 mM, Triton-XlOO 0,01% (um tensoativo não- iônico com a fórmula molecular: Cj4H22O(C2H4O)n, onde o número médio de unidades de óxido de etileno por molécula é de cerca de 9 ou 10, # CAS: 9002-93-1) ajustado para pH 9,0 com HCl ou NaOH.
Temperatura de ensaio: 25°C.
300 microlitros de amostra de protease diluída foram misturados com 1,5 mL do tampão de ensaio e a atividade da reação foi iniciada pela adição de 1,5 mL de substrato pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 mL de DMSO e depois diluído 45x com Triton X-100 0,01%) e, depois da mistura, o aumento em A405 foi monitorado por um espectrofotômetro como medição da atividade da protease. As amostras de protease foram diluídas antes da medição da atividade para assegurar que todas as medições de atividade estavam dentro da parte linear da curva dose-resposta para o ensaio. Ensaio de AU protease
Hemoglobina desnaturada (0,65% (p/p) em KH2PO4 6,7 mM contendo uréia/tampão NaOH, pH 7,50) é degradada a 25°C por 10 minutos pela protease e hemoglobina não-degradada é precipitada com ácido tricloroacético (TCA) e removida por filtração. Os produtos de degradação de hemoglobina solúveis em TCA no filtrado são determinados com o reagente de fenol Folin & Ciocalteu (1 volume do reagente de fenol Folin-Ciocalteu MErck 9001.0500 para 2 volumes de água desmineralizada), o que produz uma cor azul com vários aminoácidos (sendo medida a 750 nm). A unidade de atividade (AU) é medida e definida com referência a um padrão. O substrato de hemoglobina desnaturada pode ser preparado como a seguir: 1154 g de uréia (Hamstoff, MErck 8487) são dissolvidos em 1000 mL de água desmineralizada, 240,3 g de NaOH são adicionados e, a seguir, lentamente, 63,45 g de hemoglobina (Merck 4300) são adicionados, seguido por 315,6 g de KH2PO4, e água desmineralizada até 3260 g. O pH é ajustado para 7,63. Maiores detalhes e um padrão de alcalase adequado são disponibilizados mediante solicitação da Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca (no. do ensaio EB-SM-0349.01).
Amilase
Substrato: comprimidos Phadebas (Pharmacia Diagnostics; polímero de amido de cor azul, insolúvel, reticulado, o qual é misturado com albumina de soro bovino e uma substância tampão, e produzido em comprimidos).
Temperatura do ensaio: 37°C.
pH do ensaio: 4,3 (ou 7,0, caso desejado).
Tempo reacional: 20 min.
Depois da suspensão em água, o amido é hidrolisado pela alfa- amilase, produzindo fragmentos azuis solúveis. A absorbância da solução azul resultante, medida a 620 nm, é uma função da atividade da alfa-amilase. A atividade da alfa-amilase pode ser determinada em relação a um padrão de atividade conhecida, por exemplo, expressa em unidades de alfa-amilase fúngicas (FAU). Uma FAU é a quantidade de enzima que quebra 5,26 g de amido (Merck, Amylum solubile Erg. B. 6, Lote 9947275) por hora nas condições de ensaio padrões. Uma descrição mais detalhada, APTSMYQ 1- 3207, e um padrão FAU, estão disponíveis sob solicitação da Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca.
Exemplo 2: Variantes de lipase com atividade fosfolipase melhorada
DNA codificando as variantes de lipase mostrado na Tabela 1 abaixo foi transformado na cepa Aspergillus oryzae ToCl512 (descrita em WO 2005/070962), usando o método descrito no Exemplo 22 da Patente Americana No. 5.869.438, exceto que a seleção de PyrG foi usada (descrito em WO 2004/069872) ao invés da seleção de AMDS. Os esporos do hospedeiro Aspergillus oryzae foram tomados de um agar inclinado e usados para inoculação de YPM 10 mL (10 g de extrato de levedura, Difco + 20 g de peptona, Difco, água até 1 L, são autoclavados; adicionar maltose filtrada estéril até 2% (p/p)). Os tubos inoculados foram incubados a 3 0°C por três dias em um agitador New Brunswick Scientific Innova 2300 a 180 rpm. Os 5 sobrenadantes foram coletados pela filtragem e culturas com Mira-Cloth (Calbiochem) depois da filtração estéril com filtros de 0,45 um (micrômetros). As variantes da lipase foram purificadas conforme descrito de modo geral no Exemplo 23 da Patente Americana No. 5.869.438.
Tabela 1: Variantes de lipase I
Designação Substituições como comparado à SEQ ID NO: 2 da variante LVA012 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T LVA023 N33Q+E210D+T231R+N233R LVA041 N33Q+D111A+T231R+N233R LVA043 N33Q+G91T+T231R+N233R LVA049 N33Q+G163K+T231R+N233R LVA061 D27Q+N33Q+T231R+N233R LVA099 D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVA103 Q4R+N33Q+T231R+N233R LVA120 N33Q+D96W+T231R+N233R LVA349 K98I+T231R+N233R+N251S LV1330 N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R LV1855 D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T LV1857 D27R+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T LV1865 D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T LV1874 D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T LV1889 D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T LV2934 N33Q+T231R+N233R As lipases a seguir foram usadas para comparação e também
foram preparadas conforme descrito acima:
A lipase do tipo selvagem e Humicola lanuginosa DSM 1800 com a seqüência dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 e descrita para uso farmacêutico, por exemplo, na Patente Americana No. 5.614.189), e a sua variante (T231R+N233R) com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 1, descrita para uso farmacêutico em WO 2006/136159.
A lipase a seguir serve como um controle positivo (positivo para a atividade da fosfolipase):
Variante LV1232 com as seguintes substituições em comparação com a SEQ ID NO: 2: G91A + D96W + E99K + G263Q + L264A + I265T + G266D + T267A + L269N.
Essas lipases foram testadas para a atividade da fosfolipase conforme descrito a seguir.
Enzimas:
As amostras enzimáticas foram diluídas em tampão de diluição de enzima (acetato de sódio 20 mM, Triton-XlOO 0,01%, pH 5,0) até 5 mg/mL )mg de proteína enzimática (EP) por mL). As concentrações enzimáticas foram determinadas com base em A2so e o coeficiente de 10 absorção molar calculado (programa GPMAW (Lighthouse Data, Odense, Dinamarca; http://welcome.to/gpmaw; ver também Gill e von Hippel, 1989, Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data, Anal. Biochem. 182: 319-326).
Substrato:
Uma solução do substrato l-miristoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-
fosfocolina (a seguir “fosfatidilcolina”), a qual é comercialmente disponível de Avanti Polar Lipids Inc., 700 Industrial Park Drive, Alabaster, AL 35007, EUA, no. do catálogo. 850445), foi preparada como a seguir:
1. 37,5 mg de fosfatidilcolina são dissolvidos em 750 uL (microlitros) de água deionizada.
2. Agitar por 1 h em temperatura ambiente.
3. Adicionar 37,5 uL de CaCl2 0,32 M.
4. Agitar por 1-2 minutos.
5. Adicionar 375 uL de desoxicolato de sódio 16 mM.
6. Adicionar 750 uL de água deionizada.
7. Agitar por 30 minutos em temperatura ambiente.
Reação enzimática:
1. Transferir 100 uL de substrato para tubos eppendorf de 2
mL. 2. Adicionar 5 uL de enzima, diluída para 5 mg/mL conforme
descrito acima.
3. Incubar por 20 minutos a 40°C, 1000 rpm em um termoagitador eppendorf.
4. Transferir 10 uL de mistura reacional para um novo tubo
eppendorf e adicionar 990 uL de metanol 50% (MeOH), ácido trifluoracético
0,1% (p/p) (TFA).
5. Isto foi analisado por MALDI-TOF MS (Espectrometria de massa por tempo de vôo por dessorção-ionização de laser em matriz), depois de misturar com essa matriz: ácido 2,5-diidrobenzóico 20 mg/mL em MeOH 50%, TFA 0,1%.
Um controle de substrato foi incluído, no qual 5 uL de tampão de diluição de enzima foram adicionados ao invés da enzima no passo 2. Quatro determinações independentes foram feitas para cada amostra no passo 15 5. O aparelho MALDI-TOF usado foi um instrumento Voyager DE PRO com ionização positiva no modo refletor com calibração externa (Calmix 2, Applied Biosystems).
Pela escolha de um substrato A base de glicerol com ácidos ligados a éster de diferentes comprimentos, é possível distinguir entre especificidades enzimáticas (ataque na posição 1 ou na posição 2) pela medição da massa da estrutura de glicerol digerida. As massas das várias estruturas de glicerol digeridas possíveis são:
706 Da Fosfatidilcolina
496 Da Hidrólise Al (fosfatidilcolina menos miristoil (Cl4)
na posição 1)
468 Da Hidrólise A2 (fosfatidilcolina menos palmitoil (Cl6) na posição 2)
258 Da Hidrólise de Al e A2 (fosfatidilcolina não- degradada menos C14 e C16) Resultados:
As intensidades de sinal relativas (área sob cada pico) dos picos MS representando as massas moleculares de 706, 496, 468 e 258 Da são usadas como base para o cálculo da distribuição entre a atividade da fosfolipase Al e A2 (PLA-1 e PLA-2).
Os resultados, a partir de dois experimentos diferentes (I e II) são mostrados nas Tabelas 2 e 3 abaixo.
Geralmente, uma intensidade de sinal acima de 10 a 15% de A1/A2 em relação a A2/A1 pode indicar ou verdadeira atividade dupla ou uma amostra impura.
Tabela 2: Experimento I: Atividade da fosfolipase das variantes de lipase
Enzima testada Distribuiçã( de atividade % fosfolipídeo não digerido PLA-I % PLA-2 % deixado após hidrólise SEQ ID NO: 1 72 28 44 SEQ ID NO: 2 78 22 42 LVAO12 66 34 65 LVA023 78 22 40 LVA041 79 21 55 LVA061 73 27 46 LVA099 71 29 45 LVA103 69 31 68 LVA349 80 20 46 LVA120 75 25 47 LV1889 63 37 26 LV2934 60 40 62 LV1232 68 32 1,4 Controle de imento II: ativ idade da fosfoli 82 substrato Dase das variantes de lipase "abela 3: Exper Enzima testada Distribuição de atividade % fosfolipídeo não digerido PLA-I % PLA-2 % deixado após hidrólise SEQ ID NO: 1 73 27 82 LV1330 86 15 54 LV1855 84 16 58 LV1865 78 22 65 LVl 874 84 17 56 LV1889 89 11 4,6 LVA043 82 18 51 LVA049 82 18 50 LV1857 86 14 42 LV1232 91 9,3 1,3 Controle de 100 substrato Conclusão: Todas as lipases testadas têm atividade fosfolipase até certo grau, primariamente como atividade PLAI. O controle positivo, LV1232, apresentou uma alta atividade para a fosfolipase em ambos os experimentos.
As lipases da técnica anterior das SEQ ID Nos: 1 e 2 mostraram o mesmo desempenho em relação à atividade da fosfolipase quando testadas no mesmo experimento (Experimento I), deixando aproximadamente 44% e 42%, respectivamente, de fosfolipídeo não-digerido depois da hidrólise.
r
E contemplado que as seguintes variantes da lipase têm uma atividade da fosfolipase melhorada em comparação com a SEQ ID NO: 2: LV1232, LVl889 e LVA023 (Experimento I), e LV1232, LV1330, LV1855, LVl 865, LVl874, LV1889, LVA043, LVA049 e LV1857 (Experimento II). A variante LV1232 e a LV1889 em particular apresentam uma atividade para a fosfolipase muito melhorada em ambos os experimentos.
Exemplo 3: Variantes da lipase com atividade melhorada em pH 6
Uma variedade de variantes de lipases purificadas mostradas na Tabela 1 acima foram testadas para a atividade em pH 6 na presença de sais biliares 10 mM. Como no Exemplo 1, as lipases das SEQ ID Nos: 2 e 1 foram incluídas por comparação.
Substâncias químicas e reagentes:
Tampão de ensaio pH 6: imidazol 100 mM, acetato 100 mM, ácido malônico 100 mM, pH 6,0.
Tampão de diluição de enzima: NaH2PO4 5 mM, pH 7,0.
CaCl2 7 mM (Merck, 1.02382.0500).
Sais biliares (80 mM): mistura de sais biliares ativadora da lipase de Solvay Pharmaceuticals, lote 176.01-PA-7374.
Trilinoleína (trilinoleato de glicerila, Sigma T9517).
Pepsina: (Merck VL 317492437, No. do catálogo 1.0792.0001).
Solução de parada: Triton X-100 10%, ácido fosfórico 1 M.
Substrato:
Emulsão de trabalho de substrato foi preparada como a seguir: 1. Misturar 2,188 mL de sais biliares (80 mM) com 6,68 mL
de água deionizada.
2. Adicionar 0,133 mL de trilinoleína (trilinoleato de glicerila,
Sigma T9517).
3. Misturar 1 minuto com misturador ultraturex (YellowLine DI 25 básico) em temperatura ambiente.
Isto fornece uma emulsão de trabalho de substrato com 19,44 mM de sais biliares e 15,56 mM de trilinoleína.
Enzimas:
As amostras de enzima foram diluídas em NaH2PO4 5 mM pH 15 7,0 a 0,07 mg/mL (mg de proteína enzimática por mL). As concentrações enzimáticas foram baseadas em A280. As enzimas foram diluídas duas vezes em NaH2PO4 5 mM (seis diluições feitas no total e sem enzima/controle de tampão). Essas diluições produziram as seguintes concentrações finais de enzima nos poços: 0,01 mg/mL, 0,05, 0,025, 0,0125, 0,0625, 0,03125 e 20 0,015625 mg/mL.
Procedimento do ensaio:
1. Misturar em microplacas de titulação (MTP) 35 uL de tampão de ensaio com 25 uL de CaCl2 7 mM. Adicionar 90 uL de emulsão de trabalho de substrato. Pré-incubar por 20 min a 37°C, 700 rpm.
2. Adicionar 25 uL das respectivas diluições de enzimas, e
incubar 30 min a 37°C, 700 rpm (volume final de 175 uL). A concentração final dos sais biliares e trilinoleína é de 10 mM e 8 mM, respectivamente, no poço MTP.
3. Adicionar 50 uL de solução de parada (Triton-XIOO 10%, ácido fosfórico 1 M) e 25 uL de pepsina (700 mg/L), incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. A pepsina, a qual é uma protease, é adicionada para evitar a reativação da proteína lipase quando o pH é aumentado no procedimento subsequente (a determinação dos ácidos graxos livres (FFA)).
4. Amostras diluídas imediatamente 10 vezes em Triton-XlOO
1% para detecção de FFA por NefaC (Wako, Nefa C Método ACS-ACOD de teste de coloração enzimática No. do código: 999-75406).
Detecção dos ácidos graxos livres pelo kit NefaC Nefa C Método ACS-ACOD de teste de coloração enzimática No. do código: 999- 75406):
I. Fazer a solução A: Garrafa Rla é dissolvida com 10 mL da garrafa Rl (do kit NefaC).
Fazer a solução B: Garrafa R2a é dissolvida com 20 mL da garrafa R2 (do kit NefaC).
2. Padrão de ácido oleico Call Nefa C (28,2 mg/dL — 1
mmol/L) é diluído em Triton-XlOO 1% para obter as concentrações a seguir para o padrão nefaC: 1 mM, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125 e 0,015625 mM.
3. 25 uL de padrão/amostra lipase são misturados com 50 uL de solução A. Incubados por 15 min em temperatura ambiente, 700 rpm.
4. Adicionar 100 uL de solução B, incubação por 15 min em temperatura ambiente, 700 rpm.
Resultados:
A concentração de FFA em mM é determinada a partir da curva padrão Nefa C. Os resultados da atividade lipase são ajustados para se ajustar ao tipo Michaelis-Menten:
A=A0+Amax* [E]/([E]+K)
VO é determinado (mmol de FFA/g de enzima/min), e a proporção para o VO para a lipase da SEQ ID NO: 1 é determinada. A lipase da SEQ ID NO: Iea variante LV2934 (uma variante não-glicosilada da SEQ ID NO: 1) foram incluídas em cada MTP como controles.
Os resultados, normalizados para a SEQ ID NO: 1, estão mostrados na Tabela 4 abaixo.
Tabela 4: Atividade lipase em pH 6 em trilinoleato
Enzima testada VO relativo (mmol FFA/g enzima/min) SEQ ID NO: 2 0,35 LVA049 1,45 LVA349 1,10 LVA023 1,06 LVA099 1,02 SEQ ID NO: I (I) 1,00 SEQ ID NO: I (II) 1,00 SEQ ID NO: I (III) 1,00 LVA061 0,90 LV2934-I 0,80 LV2934-II 0,77 LV2934-III 0,73 LV1330 0,79 LVA043 0,75 LVA041 0,72 LVAO12 0,64 LVl 857 0,47 LVl 855 0,36 LVl 889 0,34 LVl 874 0,33 LV1865 0,23 Conclusão: Com base nos resultados acima é contemplado que, exceto para LVl 889, LVl 874 e LVl865, todas as variantes testadas têm uma atividade maior em pH 6 usando substrato trilinoleato com sais biliares 10 mM, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2.
As variantes de lipase LVA049, LVA349, LVA023 e LVA099
parecem muito melhores do que a lipase comparativa da SEQ ID NO: 2 sob esse aspecto, e fato melhores do que a lipase da SEQ ID NO: 1. Istoé muito particular para as variantes da lipase LVA049 e LVA349, mais particularmente para a variante da lipase LVA049.
Exemplo 4: Variantes da lipase com estabilidade melhorada em pH 3 Um número de variantes de lipase listadas na Tabela 1 acima
foram testados para a estabilidade ao pH na faixa de pH de 2 a 8. Como nos
Exemplos anteriores, as lipases da SEQ ID NO: 2 e 1 foram incluídas por
comparação. As seguintes variantes da lipase da SEQ ID NO: 2 também
foram testadas:
LVA147 LVA315 LVA317 LVA319 LVA714
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S Nll R+N 3 3 Q+G91T+G163 K+T231R+N233R+D254S
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111 A+Gl 63K+L227F+T231R+N233R+Q249R+ D254S
Cada enzima foi testada em duplicata, em duas concentrações (0,05 e 1,0 mg de proteína enzimática/mL). Além disso as enzimas foram testadas com e sem sais biliares 10 mM, e com e sem pepsina (70 mg/L).
Em resumo, as enzimas foram incubadas a 37°C no pH desejado por 1, 15, 45 e 120 minutos (ou por 1, 60 e 120 minutos), depois do que a atividade da lipase residual foi medida em caprilato de p-nitrofenila em pH 8 e temperatura ambiente (RT).
Substâncias químicas/reagentes:
Tampão de diluição de enzima: acetato 20 mM, pH 6, Triton-
XlOO 0,01%.
Tampão de estabilidade: imidazol 200 mM, acetato 200 mM, ácido malônico 200 mM, ajustado para pH 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 e 8,0.
Tampão de atividade residual (tampão RA): Tris (tris- hidroximetilaminometan, 2-amino-2-hidroximetil-l,3-propanodiol) 200 mM, número CAS: 77-86-1) pH 8, Triton-X 100 0,4%, CaCl2 1 mM.
pNP-caprilato (C8): Sigma N-0752
Pepsina (700 mg/L): Merck, VL 317492437 (1.0792.0001)
Sais biliares (80 mM): Mistura de sais biliares ativadora de lipase de Solvay Pharmaceuticals (lote 176.01-PA-7374).
Enzimas:
As enzimas foram diluídas em NaH2P04 20 mM, pH 7,0, Triton-XlOO 0,01% para as soluções de trabalho de 0,4 ou 0,8 mg de proteína enzimática por mL, baseando-se em A28O- Ensaio de estabilidade:
I) A cada poço de uma placa de microtitulação (MTP) 5 adicionar 50 uL de tampão de estabilidade, 20 uL de Triton-XlOO 0,1%, 25 uL de sais biliares (80 mM) ou 20 ul de pepsina (700 mg/L) ou água deionizada. Adicionar água deionizada até um volume final de 175 uL por poço. Todas as amostras foram feitas em duplicata. Pré-aquecer a 37°C por 20 min, 700 rpm.
2) Adicionar 25 uL de enzima (concentração final de 0,05 ou
0,1 mg de proteína enzimática por mL). Para cada pH, nenhum controle de enzima com pepsina e sais biliares estão incluídos, isto é, 25 uL de NaH2PC^ 20 mM, Triton-XlOO 0,01% são adicionados a esses poços. Incubar a 37°C 700 rpm por 1, 15, 45 e 120 min.
3) Retirar alíquotas de 20 uL e diluir a amostra com 180 uL de
tampão de atividade residual pH 8,0, manter as amostras em gelo.
4) Diluir a amostra (diluição mínima de 20x para aumentar o pH até 8). Fazer a atividade residual inicial (RA) em amostras de 1 min pH 8, 20x, 40x, 80x,. 160x e 320x para determinar a diluição necessária para obter
linearidade no ensaio.
5) Medir RA com substrato pNP-caprilato em pH 8,0 conforme descrito abaixo.
Substrato:
Solução estoque de substrato é preparada pela mistura de 14,2
uL de caprilato de p-nitrofenila (sigma N-0752) com 1 mL de 2-propanol. Essa solução estoque é diluída 50x em tampão de atividade residual pH 8,0, produzindo uma solução de trabalho da qual 150 uL são adicionados em cada poço.
Procedimento para determinar a atividade residual (RA): 1) Misturar em MTP novos 20 uL de amostra diluída e 150 uL de solução de trabalho de substrato.
2) Medir a cinética a 405 nm por 5 min (misturar a primeira vez, Ier a cada 12 seg, em temperatura ambiente).
Resultados:
A atividade % residual é calculada como se segue: A taxa dentro de cada pH para cada retirada (1, 15, 45, 120 minutos) é subtraída a taxa para sem controle enzimático com sais biliares ou pepsina. Essa taxa corrigida é a seguir dividida pelo valor mais alto dentro de cada pH e multiplicado por 100.
A Tabela 5 abaixo mostra a estabilidade em pH 3 para aquelas variantes que são melhoradas em comparação com a SEQ ID NO: 2 (em tampão, na presença de pepsina ou na presença de sais biliares, respectivamente). Somente os resultados de estabilidade em pH 3 são mostrados, uma vez que as diferenças mais acentuadas foram observadas neste pH. Tabela 5: Atividade residual da variante da lipase depois de pré-incubacão em pH 3 Lipase Tempo Tampão Pepsina Sais biliares Lipase Tempo Tampão Pepsina Sais biliares Desv. Desv. Padrão. Padrão. SEQ ID NO: 2 1 min 100,0 100,0 100,0 LVA049 1 min 100,0 desv. 2,6 9,6 1,1 desv. padrão 4,9 padrão min 82,6 2,1 5,2 15 min 92,0 desv. 1,2 0,7 4,6 desv. padrão 5,3 padrão 45 min 80,9 1,6 2,0 45 min 85,4 desv. 2,9 0,8 1,7 desv. padrão 5,8 padrão 120 min 59,0 -1,2 -0,2 120 min 74,6 desv. 4,9 1,2 0,3 desv. padrão 7,1 padrão SEQ ID NO: 1 1 min 100,0 100,0 100,0 1 min 100,0 100,0 desv. 3,1 2,2 6,5 desv. padrão 0,7 2,4 padrão min 72,2 1,1 39,2 15 min 92,1 90,4 desv. 0,5 0,1 0,2 LV1855 desv. padrão 1,3 0,6 padrão 45 min 62,2 0,1 20,5 45 min 90,6 67,5 desv. 0,3 0,0 3,1 desv. padrão 0,0 3,2 padrão 120 min 59,2 0,0 10,5 120 min 88.4 31.5 desv. 1,3 0,0 1,4 desv. padrão 3.1 2.2 padrão 1 min 100,0 LV1865 1 min 100.0 100.0 100.0 desv. 2,5 desv. padrão 3,8 0,4 0,7 padrão 15 min 84,9 15 min 92,5 85,0 50,2 LY2934 desv. 0,5 desv. padrão 0,4 0,9 1,3 padrão 45 min 73,9 45 min 92,8 66,5 36,4 desv. 0,4 desv. padrão 0,1 1,1 0,4 padrão 120 min 62,6 120 min 92,7 30,3 14,6 desv. 1,1 desv. padrão 0,7 0,5 1,3 padrão LVA043 1 min 100,0 100,0 LV1874 1 min 100,0 100,0 desv. 3,4 1,5 desv. padrão 7,0 3,8 padrão min 91,2 51,0 15 min 84,9 72,3 desv. 2,7 9,6 desv. padrão 1,4 5,1 padrão 45 min 91,7 34,3 45 min 89,7 60,5 desv. 3,4 6,1 desv. padrão 2,6 1,9 padrão 120 min 83,4 25,1 120 min 87,9 23,6 desv. 3,1 5,1 desv. padrão 1,7 1,9 padrão LVl 889 1 min 100,0 100,0 LVA041 1 min 100,0 136 desv. 5,2 3,1 padrão min 97,4 68,2 desv. 6,0 6,2 padrão 45 min 92,8 36,0 desv. 9,4 5,4 padrão 120 min 88,0 7,8 desv. 5,7 2,8 padrão LVl 857 1 min 100,0 100,0 desv. 4,0 5,3 padrão min 95,8 80,3 desv. 0,7 2,2 padrão 45 min 94,5 54,2 desv. 1,8 2,4 padrão 120 min 72,4 17,8 desv. 3,2 1,1 padrão desv. padrão 3,0 min 85,3 desv. padrão 2,9 45 min 80,1 desv. padrão 3,7 120 min 69,6 desv. padrão 5,9 LVA061 1 min 100,0 desv. padrão 3,1 min 87,8 desv. padrão 2,9 45 min 83,0 desv. padrão 7,0 120 min 77,6 desv. padrão 7,2 1,37 Lipase Desvio Tampão Pepsina Sais Biliares Lipase Desvio Tampão Pepsina Sais Biliares Padrão Padrão de de Tempo Tempo LVAO12 1 min 100.0 100.0 LVA099 1 min 100.0 100.0 desv. 6.0 1.4 desv. padrão 4.0 2.8 padrão min 98.3 83.1 15 min 93.3 93.8 desv. 6.4 1.0 desv. padrão 3.7 1.4 padrão 45 min 88.2 54.8 45 min 89.9 95.2 desv. 4.6 1.3 desv. padrão 3.4 1.2 padrão 120 min 78.4 20.1 120 min 74.7 94.0 desv. 5.5 1.7 desv. padrão 9.0 2.4 padrão LVA023 1 min 100.0 LVA349 1 min 100.0 desv. 3.1 desv. padrão 8.2 padrão min 94.7 15 min 44.2 desv. 5.2 desv. padrão 12.2 padrão 45 min 88.8 45 min 24.2 desv. 5.5 desv. padrão 13.3 padrão 120 min 83.7 120 min 31.2 desv. 7.2 desv. padrão 18.3 padrão LVA147 1 min 100.0 LVA714 1 min 100.0 100.0 desv. 2.2 desv. padrão 2.9 0.9 padrão 60 min 20.1 60 min 89.1 70.9 desv. 1.4 desv. padrão 0.5 3.3 padrão 120 min 4.7 120 min 84.7 54.4 desv. 0.4 desv. padrão 0.5 3.6 padrão LVA319 1 min 100.0 desv. 6.3 padrão min 68.4 desv. 8.2 padrão 45 min 28.5 desv. 11.2 padrão 120 min 6.3 desv. 4.8 padrão LVA315 1 min 100.0 LVA317 1 min 100.0 desv. 4.8 desv. padrão 3.2 padrão min 27.2 15 min 63.5 desv. 9.1 desv. padrão 6.1 padrão 45 min 5.3 45 min 27.5 desv. 5.0 desv. padrão 9.5 padrão 120 min 0.9 120 min 3.6 desv. 1.0 desv. padrão 2.5 padrão Conclusão:
As seguintes variantes de lipase têm uma estabilidade melhorada em pH 3, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2: LV2934, LVA043, LVA049, LVl855, LVl865, LVl874, LVl889, LVl857, LVAO12, LVA023, LVA041, LVA061, LVA099, LVA147 e LVA714.
As seguintes variantes de lipase têm uma estabilidade melhorada em pH 3 com pepsina, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2: LVA043, LV1855, LV1865, LV1874. LV1889, LV1857, LVA012, LVA099, LVA315, LVA317, LVA319 e LVA714.
As seguintes variantes de lipase têm uma estabilidade
melhorada em pH 3 com sais biliares, em comparação com a lipase da SEQ ID NO: 2: LVA349.
Exemplo 5: Micropurificação das variantes de lipase
Variantes de lipase adicionais mostradas na Tabela 6 abaixo foram preparadas conforme descrito no Exemplo 2, até e incluindo a filtração estéril do sobrenadante da fermentação.
Tabela 6: Variantes de lipase II
Designação Substituições como comparado à SEQ ID NO: 2 da variante LVAR0003 K98I+T231R+N233R LVARO013 G91V+T231R+N233R LVAR0032 D57G+L93F+T231R+N233R LVAR0045 A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R LVAR0046 E99T+T114I+D254N+T231R+N233R LVAR0047 D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R LVAR0050 E56S+E87K+D96L+E99D+T231R+N233R LVAR0051 E56A+D57A+T114I+T231R+N233R LVAR0052 G91E+T231R+N233R LVAR0053 E56K+D96G+D111A+T231R+N233R LVAR0054 E87K+D111S+T231R+N233R LVAR0056 E56S+E87K+T231R+N233R LVAR0057 E87K+G91E+T231R+N233R LVAR0058 D27Y+E87K+T231R+N233R LVAR0061 E56K+E87K+D111A+T231R+N233R LVAR0062 E87K+E99P+T231R+N233R LVAR0063 E87K+D96L+E99P+T231R+N233R LVAR0064 E56C+E87K+T231R+N233R LVAR0065 E56R+E87K+D96L+T231R+N233R LVAR0067 E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R LVAR0069 D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R LVAR0072 D96V+D111A+T231R+N233R LVAR0074 N33Q+E87K+T231R+N233R LVAR0076 N33Q+N94K+T231R+N233R LVAR0077 N33Q+D96Y+T231R+N233R LVAR0078 N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R LVAR0079 N33Q+K98I+T231R+N233R LVAR0080 A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R LVAR0086 N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R LVAR0088 N26I+N33Q+T231R+N233R LVAR0091 A30T+N33Q+T231R+N233R LVAR0094 N33Q+G91V+T231R+N233R LVAR0095 N33Q+G91A+T231R+N233R LVAR0096 N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R LVAR0099 N33Q+K98I+T231R+N233R LVAR0101 N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R LVARO102 P29T+N33Q+T231R+N233R LVARO103 N33Q+G91V+T231R+N233R LVAR0104 N33Q+K98I+T231R+N233R LVAR0106 N33Q+G91E+T231R+N233R LVAR0108 N33Q+N94K+T231R+N233R Os sobrenadantes da cultura contendo lipase filtrada estéril foram micropurificados usando o protocolo a seguir:
Aos poços de uma placa de filtração (Unifilter 800, 25 um (micrômetros), filtro de polipropileno fiado por sopro em fusão, Whatman) 5 aproximadamente 50 uL (microlitros) de meio cromatográfico XpressLine ProA foram adicionados (comercialmente disponíveis de Upfront Chromatography A/S, Lersoe Parkalle 42, DK-2100 Copenhagen, Dinamarca). O meio cromatográfico foi equilibrado pela adição de 200 uL de acetato de sódio 1 M, pH 5,0. Depois de 10 min de agitação o tampão de 10 equilíbrio foi removido por vácuo (Uni-Vac 3, Whatman). O passo de equilíbrio foi repetido. A seguir, 100 uL de tampão de ligação (acetato de sódio 1 M, pH 5,0) e 400 uL de sobrenadante de cultura foram adicionados e misturados com o meio cromatográfico por 30 min. O material não-ligado foi removido por vácuo. O passo de ligação foi repetido. O meio cromatográfico 15 com lipase ligada foi lavado 3 vezes com 200 uL de tampão de lavagem com capacidade tamponante reduzida (acetato de sódio 100/50/10 mM, pH 5,0). Em cada passo de lavagem o tampão foi adicionado, a placa foi agitada por 10 min e o tampão de lavagem foi removida em vácuo. Finalmente, a lipase ligada foi eluída pela adição com duas vezes de 100 uL de Tris 100 mM, Brij 35 (polioxietilen(23)lauriléter) 0,02%, pH 9,0. Para cada passo de eluição, a placa foi agitada 15 min antes da lipase eluída ser coletada em uma placa de microtitulação por vácuo.
Exemplo 6. Determinação da concentração de variantes de lipase
Titulação do sítio ativo
A concentração das variantes de lipase as quais foram purificadas (convencionalmente purificadas conforme geralmente descrito no Exemplo 2, e/ou micropurificadas conforme descrito no Exemplo 6) foram determinadas por titulação do sítio ativo burst conforme descrito a seguir.
A lipase purificada foi diluída em Triton-XlOO 0,01%, caso necessário, para atingir uma concentração menor do que 5 uM (correspondendo a 150 ug de proteína enzimática/mL). 100 uL de lipase purificada foram misturados com aproximadamente 100 uL de resorufina 40 uM (heptilfosfonato de etilresorufinila; um inibidor da lipase) dissolvido em Tris 1 M, SDS 4 mM (dodecilsulfato de sódio), pH 9,0 no poço de uma placa de microtitulação preta. A concentração precisa da resorufina não é importante, ela somente tem que ser adicionada em excessos em comparação com 5 uM de lipase. Imediatamente após a mistura, a cinética da fluorescência a partir de resorufina liberada foi medida a cada minuto por 1-3 horas (até as explosões terminarem) (excitação a 515 nm, emissão a 590 nm, medidos em um instrumento medidor de intensidade de fluorescência da BMG LabTechnologies GmbH).
Os valores de fluorescência medidos são ajustados à equação: F=F0+Z?«rs/*(l-exp(-(t+dt)*ln(2)/Tl/2)+inclinação*(t+dt) onde F é a fluorescência medida, FO é o fimdo de fluorescência do inibidor e lipase, t é o tempo a partir da primeira medição de fluorescência, dt é o tempo da mistura da lipase com inibidor até a primeira medição de fluorescência, Burst é a explosão de fluorescência, T1/2 é a metade do tempo para o burst exponencial, e inclinação é a inclinação para a mudança linear na fluorescência, por exemplo, devido à hidrólise do complexo lipase- heptilfosfonato de etila e/ou alvejamento da resorufina.
A concentração da lipase ativa foi determinada como a proporção entre o burst calculado e a inclinação de uma curva padrão de resorufina (0 a 4 uM; incluído na placa de microtitulação).
Determinação da concentração de A?sn
A concentração das variantes de lipase purificadas também foi estimada a partir da absorbância a 280 nm usando o coeficiente de extinção de 1,24 A28o/mg.
Exemplo 7: Teste in vitro das variantes de lipase
As variantes da lipase purificada foram testadas em um modelo de digestão in vitro conforme descrito abaixo.
Qualquer uma das duas dietas (Dieta I e Dieta II, respectivamente) foi usada no modelo in vitro. A composição da Dieta I é de 34% (p/p) de gordura, 45%» (p/p) de carboidrato, 2% (p/p) de proteína (o restante de água, sais, etc.). A composição da Dieta II é: gordura 313, proteína 146 e amido 538 (extrato sem nitrogênio, NfE, pode ser calculado como 432), todos em g/Kg de peso seco.
A Dieta I foi preparada pela mistura de 247,2 g de leite de vaca (1,5% de gordura), 29,9 g de óleo de oliva, 87 g de Calshake (comercialmente disponível da Fresenius Kabi e com um conteúdo de energia de 2077 Kg/J, um conteúdo de proteína de 4,3 g de proteína de leite/l00 g e um conteúdo de gordura de 24,4 g de gordura/l00 g) e 9,9 g de Methocel (grau alimentício, E5 Premium LV FG (E464); Dow) usando um UltraTurrex (YellowLine DI 25 básico) por 2 minutos. Para reduzir a viscosidade, a dieta foi tratada com 0,5 ug/mL da SA VINASE 16.0 LEX protease (comercialmente disponível da Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca) em pH 8,0 por 4 horas a 50°C. A protease foi a seguir inativada pela redução do pH até 3 e incubando a 7O0C por 30 min, ou 5 O0C por 60 min.
A Dieta (II) consiste de 73 g/Kg (peso úmido) de farinha de aves (Altromin), 73 g/Kg de farinha de ervilha, 73 g/Kg de caseína 5 (precipitada sob condições ácidas, da Altromin), 290 g/Kg de farinha de trigo, 290 g/Kg de amido de batata, 125 g/Kg de toicinho, 76 g/Kg de vitaminas, minerais e elementos traço, e 375 g/Kg de creme de leite (33% de gordura).
100 uL da dieta são misturados com 20 uL de pepsina (Merck VL 317492437, No. de catálogo 1.0792.0001, 700 mg/mL) e 30 uL de lipase (duplicata de 4 concentrações) no poço de uma placa de microtitulação. Se o passo gástrico tiver que ser executado em pH 5, 10 uL de tampão (MES 0,8 M (ácido 2-[N-morfolino]etanossulfônico), acetato de sódio 0,8 M, imidazol 0,8 M, pH 7,0) foram adicionados, enquanto que nenhum tampão foi adicionado se o pH 3 foi usado para o passo gástrico. A placa de microtitulação fio incubada por 1 hora a 37°C com agitação (Termomisturador Ependorf, 750 rpm), antes da adição de 15 uL (se pH 5 é usado no passo gástrico), ou 25 uL (se pH 3 é usado no passo gástrico) de tampão (MES 0,8 M (ácido 2-[N- morfolino]etanossulfônico), acetato de sódio 0,8 M, imidazol 0,8 M, pH 7,0) e 20 uL de sais biliares (50 g/L, correspondendo a 100 mM, usando um peso molecular médio de 500 g/mol): Lipase ativando a mistura de sais biliares de Solvay Pharmaceuticals (lote 176.Ol-PA-7374)) resultando em um pH de 5,7 a 6,0. A placa foi, a seguir, incubada 2 horas a 37°C com agitação antes da interrupção da reação pela adição de 50 uL de Triton-XlOO 10% em ácido fosfórico 1 M. Depois de diluir 125 a 250 vezes em Triton-XlOO 1%, a quantidade de ácidos graxos livres foi determinada usando um kit NEFA C da Wako Chemicals, conforme descrito no Exemplo 3.
As curvas de dose resposta são ajustadas à equação:
FFA = FFAmax* [E]/([E]+K) onde FFA é a quantidade de ácidos graxos livres liberada, FFAmax é a quantidade máxima de ácidos graxos livres que as lipases podem liberar da dieta, [E] é a concentração de lipase e K é a concentração de lipase que libera metade da FFAmax. Assumindo que FFAmax é idêntica para as lipases, um fator de melhoramento (IF) é definido como:
IF = K(ref)/K(lipase) onde K(ref) é a concentração de uma lipase de referência que libera metade de FFAmax e K(Iipase) é a concentração de variante de lipase que libera metade da FFAmax.
Para as variantes listadas nas Tabelas 7a e 8a abaixo, usamos como uma lipase de referência a média da lipase da SEQ ID NO: 1 e sua variante desglicosilada N33Q (LV2934 na Tabela 1), isto é, K(ref) = 1/2 x (K(SEQ ID NO: 1) + K(LV2934)).
Todas as variantes da lipase listadas nas Tabelas 7a e 8a abaixo têm um fator de melhoramento acima de 1,0. Isto significa que uma quantidade menor dessas lipases é necessária para obter um efeito similar ao comparado com a lipase de referência. O fator de melhoramento de qualquer variante da lipase em relação, por exemplo, à SEQ ID No: 2 pode ser calculado como o fator de melhoramento da variante da lipase em questão em relação à lipase de referência dividido pelo fator de melhoramento (constante) da SEQ ID NO: 2 em relação à lipase de referência, a qual está indicada na Tabela 7a abaixo. Quando, por exemplo, a Titulação do Sítio Ativo (AST, Exemplo 6) é usada para determinar a concentração de lipase, e se o fator de melhoramento para a variante em questão tiver que ser calculado em relação à lipase da SEQ ID NO: 2, deve-se dividir o IF médio da variante em questão pelo IF médio da SEQ ID NO: 2, o qual é 0,88, preferivelmente 0,9.
Para as variantes de lipase adicionais listadas nas Tabelas 7b, 8b, 8c e 8d abaixo, a variante desglicosilada N33Q da SEQ ID NO: 1 (LV2934 na Tabela 1) foi usada como lipase de referência. Cada uma dessas lipases tem um fator de melhoramento acima de 1,00 (fator de melhoramento médio menos o desvio padrão). Para a seleção das lipases melhoradas, os valores de IF e os desvios padrões foram usados com duas casas decimais. Esses dados foram subsequentemente arredondados para uma cada casa decimal.
Tabela 7a: Variantes da lipase com um desempenho melhorado in vitro
(micropuri ficada)
_Fator de melhora (IF)
Enzima testada AST A280 Dieta I (pH 3 na etapa gástrica) SEQ ID NO: 2 0,9+/-0,1 0,9+/- 0,2 LVAR0003 l,9+/-0,4 2,4, 2,1+/-0,4 LVAR0045 4,1 - LVAR0046 5,5 - LVAR0047 4,3 - LVAR0050 4,1 - LVAROO 51 1,8 - LVAR0052 3,2 - LVAR0053 3,5 - LVAR0054 3,8 - LVAR0056 2,2+/-0,6 - LVAR0057 3,0 - LVAR0061 2,3 - LVAR0062 2,4 - LVAR0063 6,6 - LVAR0064 2,0+/-0,0 - LVAR0065 4,6 - LVAR0067 8,0 - LVAR0069 7,3 - LVAR0072 2,5 - Dieta II
(pH 3 na etapa gástrica)
LVAR0074 3,3 2,2 LVAR0076 5,0 3,2 LVAR0077 4,5 2,5 LVAR0078 2,9 1,5 LVAR0079 6,7 7,7 LVAR0080 7,1 5,9 LVAR0086 4,3 2,7 LVAR0088 1,8 3,1 LVAR0091 5,2 4,3 LVAR0094 11,0 10,5 LVAR0095 9,3 11,5 LVAR0096 8,3 6,6 LVAR0099 11,1 11,8 LVAR0101 8,1 8,2 LVARO102 6,0 4,1 LVARO103 7,5 4,3 LVARO104 7,9 5,9 LVARO106 10,0 9,7 LVARO108 6,1 6,5 - média não-determinada
Tabela 7b: Variantes da lipase adicionais com um desempenho melhorado in
vitro
Lipase Substituições como comparado à SEQ ID NO: 2 IF (AST) Dieta I pH 3 na etapa gástrica LVA129 D27V+N33 Q+V 60S+D96 W+T231R+N23 3R+Q249R 5,7+/-2,0 LVA130 D2 7 V+N 3 3 Q+V 60S+T231R+N233 R+Q249R 1,5+/-0,4 LVA139 Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R 2,4+/-1,2 LVA140 N33Q+D111E+T231R+N233R l,8+/-0,3 LVA143 N33Q+D122E+T231R+N233R l,8+/-0,5 LVA147 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+ 5,6+/-3,4 T231R+N233R+P256T LVA180 N3 3 Q+T231 R+N233R+P25 6T 2,3+/-0,7 LVA182 D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D11IA+ l,2+/-0,0 T231R+N233R+P256T LVA185 Nl 1R+N33Q+T231R+N233R l,9+/-0,7 LVA198 N33Q+N39H+T231R+N233R l,4+/-0,3 LVA202 N3 3 Q+P229R+T231 R+N23 3 R l,5+/-0,5 LVA206 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+ 2,9+/-0,8 L227G+T231R+N233R+P256T LVA208 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R 4,6+/-2 LVA210 D2 7R+N3 3 Q+G91A+D96E+L9 7 Q+D111A+S216P+L227G+ l,3+/-0,3 T231R+N233R+P256T LVA211 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231 R+N 4,3+/-1,2 233R+P256T LVA238 D2 7R+N 3 3 Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+ 3,8 D254G+P256T LVA241 D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T 1,8 LVA243 N33Q+N200S+T231R+N233R l,9+/-0,3 LVA245 N33Q+N39S+T231R+N233R 3,6+/-0,0 LVA247 N33Q+E210R+T231R+N23 3 R 3,3+/-0,6 LVA248 N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R 2,4+/-0,9 LVA249 N3 3 Q+T231 R+N233 R+D254R 3,1+/-0,4 LVA250 N33Q+N94R+T231R+N233R 4,0+/-0,l LVA252 N33Q+D96R+T231R+N233R 2,3+/-0,l LVA254 D27N+N33Q+T231R+N233R 1,5+/-0,1 LVA256 D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R 2,6+/-1,2 LVA257 N33Q+L227F+T231R+N233R 2,3+/-0,7 LVA272 N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R 2,3+/-0,2 LVA273 N3 3 Q+G225P+T231R+N23 3 R l,9+/-0,2 LVA275 N33Q+T231R+N233R+D254S 6,2+/-1,5 LVA277 N33Q+D96G+T231R+N233R 1,8+/-0,1 LVA279 N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S 6,1+/-0,6 LVA280 N33Q+T231R+N233R+D254G 2,1+/-0,1 LVA281 N33Q+D130H+T231R+N233R l,2+/-0,0 LVA284 N33Q+E87A+T231R+N233R 2,1+/-0,1 LVA287 N33Q+T231R+N23 3 R+E23 9D 1,2 LVA307 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G 2,2 LVA308 N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S 5,9 LVA310 N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S 7,6 LVA315 N3 3 Q+G91T+G163 K+T231 R+N233R+D254G 3,4 LVA317 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 5,5 LVA319 N11 R+N 3 3 Q+G91 T+G 163 K+T231R+N233 R+D254S 6,6 LVA325 Q4R+D27R+N 3 3 Q+G91T+N 94S+D111A+S216P+L227G+ 1,2 T231R+N233R+P256T LVA327 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R 9,2 LVA330 Q4R+D27R+N3 3 Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+ 1,1 L227G+T231R+N233R+P256T LVA331 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+ 1,2 T231R+N233R+P256T LVA333 N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T 3,5 LVA334 N33Q+G177A+T231R+N233R 1,0 LVA338 N33Q+T231R+N233R+G246A 1,1 LVA341 D2 7N+N 3 3 Q+G91T+G163 K+T231 R+N233 R+D254S 4,2 LVA345 D2 7 Q+N 33Q+G91T+G163K+E219D+T231 R+N233 R 2,3 LVA347 N33 Q+G91T+E219D+T231R+N23 3 R 1,2 Dieta II
(pH 3 na etapa gástrica)
LVA055 N33Q+E219D+T231R+N233R 5,1 LVA060 N33Q+W117L+T231R+N233R 2,4 LVA061 D27Q+N33Q+T231R+N233R 2,6 LVA063 N33Q+G91T+T231R+N233R 5,1 LVA089 D27S+N3 3 Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+ 2,2 N233R+P256T LVA094 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T 1,0 LVA099 D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+ 2,5 N233R+P256T LVA103 Q4R+N 3 3 Q+T231R+N233R 1,3 LVAl 13 N33Q+T231R+N233R+Q249R 1,3 LVA120 N33Q+D96W+T231R+N233R 1,1 LVA179 N33 Q+G91N+T231R+N233R l,7+/-0,6 Tabela 8A: Variantes da lipase com desempenho melhorado in vitro
Fator de melhora (IF)_
Enzima testada AST A280 Dieta I (pH 3 na etapa gástrica) LVAR0003 5,2+/-0,3 4,6+/-0,2 LVAR0013 5,5+/-0,7 4,8+/-0,6 LVAR0032 3,7+/-1,4 3,3+/-l,0 LVAR0050 3,9+/-0,4 1,5+/-0,1 LVAR0058 3,6+/-0,4 2,7+/-0,4 LVAR0069 5,0+/-0,8 l,4+/-0,2 Tabela 8b: Variantes de lipase adicionais com desempenho melhorado in vitro
Lipase | Substituições como comparado à SEQ ID NO: 2_IIF (AST)
Dieta I
(pH 5 na etapa gástrica)
LVA162 N33Q+D167E+T231R+N233R 1.4+/-0.2 LVA214 N33Q+E87A+T231R+N233R 2,7+/-0,4 LVA217 N33Q+E210V+T231R+N233R 2,8+/-0,9 LVA218 N33Q+E56K+T231R+N233R 2,4+/-0,5 LVA220 N33Q+T231R+N233R+D254G 2,0+/-0,2 LVA221 N33Q+D96S+T231R+N233R 2,1+/-0,4 LVA222 N33Q+D122N+T231R+N233R 1,6+/-0,2 LVA228 N26A+N33Q+T231R+N233R 1,2+/-0.2 LVA229 N33Q+N162T+T231R+N233R 3.5+/-1,9 LVA230 N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R 1,6+/-0,3 LVA234 N33Q+T231R+N233R+G240L 2,8+/-0,2 LVA308 N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S 2.9+/-0.1 LVA310 N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S 3.0+/-0.4 LVA327 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R 2.0+/-0.6 LVA330 Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+ 1,1+/-0,0 L227G+T231R+N233R+P256T LVA347 N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R 1,7+/-0,3 LVA353 N33Q+G163R+T231R+N233R 1,5+/-0,1 LVA355 N33Q+G163N+T231R+N233R 2,2+/-0,4 LVA357 N33Q+G163C+T231R+N233R 1,6+/-0,3 LVA359 N33Q+G163Q+T231R+N233R 1,6+/-0.0 LVA360 N33Q+G163E+T231R+N233R 1,7+/-0,1 LVA362 N33Q+G163H+T231R+N233R 1,3+/-0,1 LVA364 N33Q+G163I+T231R+N233R 1,5+/-0.4 LVA371 N33Q+G91K+T231R+N233R 2,1+/-0,9 LVA373 N33Q+G91M+T231R+N233R 2,0+/-0,4 LVA375 N33Q+G91F+T231R+N233R 1,9+/-0.1 LVA379 N33Q+G91S+T231R+N233R 1,4+/-0.1 LVA381 N33Q+G91W+T231R+N233R 1,5+/-0,2 LVA383 N33Q+G91Y+T231R+N233R 1,6+/-0,3 LVA391 N33Q+G163Y+T231R+N233R 1,9+/-0.1 LVA393 N33Q+G163V+T231R+N233R 1,6+/-0,5 LVA399 N33Q+G91C+T231R+N233R 1,2+/-0,0 LVA411 N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R 2,2+/-0,0 LVA412 N33Q+G91M+G161E+T231R+N233R 2,6+/-0,2 LVA413 N33Q+V128A+T231R+N233R 1,6+/-0,1 LVA414 N33Q+V128A+T231R+N233R 1,4+/-0.0 LVA415 N33Q+G163E+T231R+N233R 1,9+/-0,5 LVA416 N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R 1,4+/-0,3 LVA417 N33Q+G38A+T231R+N233R 1,6+/-0,1 LVA420 N33Q+G163A+T231R+N233R 1,2+/-0.0 LVA421 N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R 1,2+/-0,1 LVA438 N33Q+G163M+T231R+N233R 2,4+/-0,2 LVA440 N33Q+G91V+T231R+N233R 1,5+/-0,2 LVA442 N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R 2,6+/-0,4 LVA450 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ 2,7+/-0,1 D254G+P256T LVA451 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S 3,2+/-0,1 LVA453 N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R 2.0+/-0.5 LVA454 N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S 2,3+/-0,3 LVA456 N33Q+T231R+N233R+P256T 1,7+/-0.1 LVA458 N33Q+T231R+N233R+D242E 2.7+/-0.0 LVA460 N33Q+E87R+T231R+N233R 3.8+/-0.1 LVA461 N33Q+E56R+T231R+N233R 2,4+/-0,2 LVA463 N33Q+N162G+T231R+N233R 2,3+/-0,2 LVA464 N33Q+G91L+T231R+N233R 1.7+/-0.1 LVA468 N33Q+E87H+T231R+N233R 2,1+/-0,2 LVA470 N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R 2,9+/-1,2 LVA471 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S 4,2+/-2,7 LVA472 N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S 2,0+/-0,1 LVA474 N33Q+G163Α+Τ231R+N233R 2.5+/-1.1 LVA480 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111Α+Τ231R+N233R+ 1.7+/-0.6 D254S+P256T LVA482 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R 1.9+/-0.0 LVA483 N33Q+T231R+N233R+D254A 1,5+/-0,1 LVA484 N33Q+T231R+N233R+D254N 1,1+/-0,0 LVA490 N33Q+T231R+N233R+D254L 2.4+/-0,1 LVA492 N33Q+T231R+N233R+D254K 3,1+/-0,2 LVA494 N33Q+T231R+N233R+D254M 1,8+/-0.2 LVA505 D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R 4,5+/-0,6 LVA506 N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R 2.6+/-0.1 LVA507 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R 1,5+/-0.2 LVA509 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R 1,4+/-0,1 LVA512 N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R 3.9+/-0.3 LVA513 D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R 1.3+/-0.0 LVA516 N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R 1.5+/-0.1 LVA518 D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R 1,2+/-0.2 LVA519 D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R 2,5+/-0,2 LVA520 N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R 3,6+/-0,0 LVA523 D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+ 2,0+/-0,2 Τ231R+N233R+P256T LVA526 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+ 2,2+/-0,4 L227G+T231R+N233R+P256T LVA527 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216Ρ+ 1.9+/-0.7 L227G+T231R+N233R+D254S+P256T LVA530 D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+ 1,5+/-0,4 Τ231R+N233R+P256T LVA532 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+ 1,8+/-0,1 Τ231R+N233R+D254S+P256T LVA535 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+ 1,8+/-0.0 Τ231R+N233R+D254S+P256T LVA540 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+ 1.6+/-0.3 L227G+T231R+N233R+D254S+P256T LVA542 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+ 1,7+/-0.2 Τ231R+N233R+D254S+P256T LVA547 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S 2,1+/-0,1 LVA548 N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S 1,7+/-0.4 LVA555 N33Q+T231R+N233R+P256N 2,1+/-0,1 LVA561 N33Q+T231R+N233R+P256G 1,6+/-0.0 LVA562 N33Q+T231R+N233R+P256H 1,2+/-0,1 LVA565 N33Q+T231R+N233R+P256M 3.0+/-0.3 LVA567 N33Q+T231R+N233R+P256W 2,2+/-0,4 LVA569 N33Q+T231R+N233R+P256Y 1,7+/-0.4 LVA576 N33Q+T231R+N233R+P256F 2,0+/-1,0 LVA578 N33Q+T231R+N233R+P256V 1,9+/-0.5 LVA580 N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R 1,4+/-0.3 LVA581 N33Q+G91M+G163Τ+Τ231R+N233R 1,1+1-0,Q LVA582 N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R 1,1+1-0 J LVA583 N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R 1,3+/-0.2 LVA586 N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R 1,3+/-0.3 LVA602 N33Q+V176Ν+Τ231R+N233R 1J+1-0 J LVA604 N33Q+V176D+T231R+N233R 1,2+1-0,2 LVA614 N33Q+W117F+T231R+N233R 1.6+/-0.1 LVA622 N33Q+V176Ι+Τ231R+N233R 1.3+/-0.0 LVA623 N33Q+D111Ν+Τ231R+N233R 1,1+/-0,0 LVA627 N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R 1.9+/-0.3 LVA629 N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R 1,4+/-0,1 LVA631 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+ 2.4+/-0.4 T231R+N233R LVA632 N33Q+G91M+G163P+T231R+N233R 1.5+/-0.1 LVA634 N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R 1,3+/-0,1 LVA639 N33Q+W117D+T231R+N233R 1,4+/-0.2 LVA640 N33Q+W117Η+Τ231R+N233R 1.3+/-0.1 LVA649 N33Q+W117C+T231R+N233R 1.6+/-0.1 LVA650 N33Q+W117C+T231R+N233R 1.7+/-0.1 LVA651 N33Q+W117Κ+Τ231R+N233R 1.7+/-0.1 LVA653 N33Q+W117V+T231R+N233R 1.2+/-0.1 LVA656 N11S+N33Q+T231R+N233R 2,0+/-0,4 LVA658 N33Q+W117E+V176Κ+Τ231R+N233R 2,2+1-0,B LVA659 N33Q+W117G+T231R+N233R 1,8+/-0.3 LVA664 N33Q+W117Ρ+Τ231R+N233R 2.3+/-0.7 LVA665 N33Q+W117S+T231R+N233R 1,1+1-0,λ LVA666 N33Q+W117Τ+Τ231R+N233R 1.8+/-0.1 LVA667 N33Q+W117I+T231R+N233R 1,3+/-0,1 LVA670 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S 4,1+/-0,8 LVA696 N33Q+V176Μ+Τ231R+N233R 1,3+/-0,2 LVA697 N33Q+V176Η+Τ231R+N233R 1,2+1-0,2 LVA700 N33Q+V176Α+Τ231R+N233R 1,2+/-0.0 LVA702 D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R 1.3+/-0.3 LVA705 N33Q+W117Y+T231R+N233R 1,1+/-0,1 LVA707 N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R 1,4+/-0.3 LVA715 D27R+N33Q+P136H+L227G+T231R+N233R+Q249R+ 1,3+/-0.2 D254S LVA718 N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S 2.0+/-0.5 LVA721 N33Q+G91T+D96N+D111A+V176Ι+Τ231R+N233R+D254S 3.0+/-0.3 LVA722 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S 2,3+/-0,2 LVA723 N33Q+G161A+T231R+N233R 1,5+/-0.2 LVA731 N33Q+G38I+G177Α+Τ231R+N233R 2,9+/-0,6 LVA732 N33Q+N101Q+T231R+N233R 2,5+/-0,6 LVA733 N33Q+N94Q+T231R+N233R 2.0+/-0,1 LVA736 N11Q+N33Q+T231R+N233R 2,0+1-0,2 LVA738 N8Q+N33Q+T231R+N233R 1,6+/-0.2 LVA740 N33Q+T231R+N233R+N251Q 1,3+/-0,1 LVA743 N33Q+N200Q+T231R+N233R 1,4+/-0.0 LVA744 N33Q+G177Α+Τ231R+N233R 2.3+/-0.3 LVA746 N33Q+N73Q+T231R+N233R 1.8+/-0.2 LVA749 N33Q+I86L+T231R+N233R 1,6+/-0.4 LVA753 N33Q+K98I+G163K+T231R+N233R 1,5+/-0.3 LVA754 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+ 2.0+/-0.4 N233R+D254S+P256T LVA755 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+ 3.9+/-0.3 N233R+D254S+P256T LVA770 D27R+N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R 1.6+/-0.2 LVA771 N33Q+K98I+G163K+N200Q+T231R+N233R+N251S 1,7+/-0.5 LVA772 N33Q+G38S+G163K+T231R+N233R 1,7+/-0.6 LVA774 N33Q G38Y T231R N233R 1,3+/-0.2 LVA777 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ 1,4+/-0.2 N233R+P256T LVA778 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ 1.3+/-0.0 N233R+P256T LVA782 N33Q+G38N+N73Q+T231R+N233R 1,9+/-0.9 LVA783 N33Q+G38D+R84E+T231R+N233R 1,8+/-0.6 LVA784 N33Q+G38Q+T231R+N233R 1.8+/-0.5 LVA786 N33Q+G38I+T231R+N233R 2.2+/-0.3 LVA788 N33Q+G38K+T231R+N233R 1,4+/-0,1 LVA792 N33Q+G38F+T231R+N233R 2.4+/-0.2 LVA799 N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S 2,2+/-0,2 LVA800 N33Q+G38L+T231R+N233R 1,8+/-0.3 LVA804 N33Q+G38P+T231R+N233R 1.5+/-0.3 LVA805 N33Q+G38T+T231R+N233R 1,9+/-0,1 LVA806 N11R+N33Q+G91T+W117I+G163Κ+Τ231R+N233R+D254S 2,6+/-0,4 LVA808 D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+ 3.7+/-0.2 N233R+D254S+P256T LVA809 N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S 2,6+/-0,2 LVA811 D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+ 2,2+1-0,3 N233R+D254S+P256T LVA813 D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+ 2.6+/-0.4 D254S LVA814 N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R+P256A 1,8+/-0.5 LVA816 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A 3,1+/-0,1 LVA817 N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R 2,8+/-0,8 LVA818 N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A 2.3+/-0.8 LVA819 Ε1Ν N33Q T231R N233R 2,3+/-1,2 LVA821 N33Q G38H T231RN233R 2,0+1-0,4 LVA830 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+ 1,8+/-0.3 D254S LVA831 N33Q+K98I+T231R+N233R 1,2+1-0,λ LVA834 D27R+N33Q+W117I+V176Q+L227G+T231R+N233R+ 1,4+/-0.0 Q249R+D254S LVA835 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Κ+Τ231R+N233R+D254S 1,9+/-0,4 LVA839 N33Q+G163W+T231R+N233R 1.9+/-0.3 LVA841 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R 1.9+/-0.2 LVA842 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111Α+Τ231R+N233R+ 2.5+/-0.9 D254S+P256T LVA844 N33Q+T231R+N233R+D254Q 1.5+/-0.2 LVA846 N11R+N33Q+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S 1,5+/-0.2 LVA847 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176W+T231R+N233R+ 1,4+/-0.3 D254S LVA848 N33Q+G163D+T231R+N233R 1.3+/-0.1 LVA849 N33Q+G163D+T231R+N233R 1,2+/-0,2 LVA850 N33Q+G163Ρ+Τ231R+N233R 1.2+/-0.2 LVA853 E1D+N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R+ 1,2+/-0,0 D254S LVA857 N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+ 3.8+/-0.7 N233R LVA860 Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+ 2.6+/-0.4 L227G+T231R+N233R+P256T LVA862 D27R+N33Q+T37K+N711+G91N+N94R+K98I+D111A+ 1,7+/-0.5 S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVA863 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+ 2,1+/-0,1 T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVA865 N33Q+W117S+T231R+N233R 2,0+/-0,2 LVA866 N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I 2,1+/-0,4 LVA869 N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R 2,6+/-0,3 LVA871 N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R 1,6+/-0.3 LVA873 N33Q+G91T+N94S+D111A+G163T+V176W+T231R+ 1,4+/-0.3 N233R LVA875 N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+ 1,6+/-0,1 N233R LVA877 N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+ 1,6+/-0.2 G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T LVA878 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163Τ+ 1,2+/-0,1 S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T LVA880 N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+ 2,7+/-0,3 S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T LVA882 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216Ρ+ 2.6+/-0.1 L227G+T231R+N233R+D242E+D254S+P256T LVA883 D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+ 3.4+/-1.1 S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T LVA888 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+E210D+ 1,2+1-0,2 S216P+L227G+T231R+N233R+P256L LVA890 N33Q+G38A+G91 T+G 163Α+Τ231R+N233R+D254S 1,6+/-0.5 LVA892 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+D254I 1.2+/-0.2 LVA896 N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R 4.0+/-0.4 LVA897 N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R+D254S 1.9+/-0.5 LVA899 Ν11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+ 1,3+1-0,2 N233R+D254S LVA904 N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+ 4.5+/-1.6 N233R+D254S+P256T LVA906 N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163Α+Τ231R+ 3.6+/-0.4 N233R+D254S LVA907 N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+ 2,2+1-0,3 D254S LVA913 N11R+N33Q+G91T+G163Κ+Τ231R+N233R+D254I 3.5+/-0.9 LVA915 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Τ+Τ231R+N233R+D254S 1,8+/-0.5 LVA917 N11R+N33Q+G91T+G163Ρ+Τ231R+N233R+D254S 2.0+/-0,1 LVA919 N11R+N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R+D254S 1,4+/-0.2 LVA921 N11R+N33Q+G38A+G91 T+G 163K+V176D+T231R+ 3.9+/-1,8 N233R+D254S LVA925 N33Q+E56Q+G156R+V176W+T231R+N233R 1,4+/-0.2 LVA927 E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+ 1.8+/-0.2 Τ231R+N233R LVA928 N33Q+G163K+G177Α+Τ231R+N233R+G246A 3.4+/-0.7 LVA929 N11R+N33Q+E56Q+G91 T+G 163K+T231R+N233R+D254S 2,1+/-0,2 LVA930 N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S 2,0+/-0,2 LVA933 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+ 2,7+1-0,7 L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T LVA934 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+ 2,0+1-0,2 E219D+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T LVA941 N11R+N33Q+I90L+G91T+N94S+D96E+G163K+T231R+ 1,5+1-0,2 N233R+D254S LVA942 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S 1.9+/-0.1 LVA943 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+ 2,1+/-0,0 D254S LVA944 N11R+N33Q+G91 T+G 163A+V176T+T231R+N233R+D254S 1.7+/-0.1 LVA945 N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S 2,0+/-0,0 LVA946 N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S 2,2+1-0,Q LVA947 N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S 1,8+1-0,2 LVA948 N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S 1,5+/-0,1 LVA949 N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S 2,4+/-0,4 LVA950 N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N 2,6+/-0,6 LVA952 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+ 1.9+/-0.0 S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T LVA953 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+ 2,7+/-0,4 E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L LVA954 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+ 3,4+/-0,4 E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L LVA959 N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254Y+I255F 1,4+/-0.2 LVA961 N33Q+L93F+D102Y+T231R+N233R 1,5+/-0,1 LVA962 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S 1,6+/-0,1 LVA964 N11S+N33Q+T231R+N233R 4,0+/-2,7 LVA966 N11R+N33Q+T231R+N233R 2.6+/-1,0 LVA968 N33Q+G38A+G91 T+G 163K+T231R+N233R+D254S 2,7+1-0,7 LVA969 N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R 2,1+/-0,3 LVA970 N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 3,7+/-1,8 LVA972 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R 1,8+/-0.4 LVA973 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+ 2,1+/-0,4 N233R+D254S LVA976 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F 3,3+/-0,7 LVA977 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+P256F 1,6+/-0.3 LVA978 N11R+N33Q+G91 T+G 163K+T231R+N233R+D254S+P256F 3,0+/-0,6 LVA979 N11R+N33Q+G38A+G91 T+G 156R+G163K+V176T+ 1,6+/-0.2 T231R+N233R+D254S LVA980 N33Q+G91K+D96S+G163T+T231R+N233R+Q249R 2.7+/-1.4 LVA981 N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S 1,9+/-0.3 LVA983 N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S 3,4+/-0,6 LVA984 N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S 5.9+/-1,7 LVA985 N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S 2,2+1-0,2 LVA987 N11R+G23E+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 1,4+/-0.0 LVA988 N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S 2,0+/-0,4 LVA989 N11R+N33Q+L52R+G91 T+G 163K+T231R+N233R+D254S 4,2+/-1,2 LVA990 N11R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S 1,8+1-0,7 LVA991 N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 3,1+/-0,7 LVA993 N11R+N33Q+A68V+G91T+G163Κ+Τ231R+N233R+D254S 3,0+/-0,5 LVA994 N11R+N33Q+G91T+G163A+V176Ι+Τ231R+N233R+D254S 3.4+/-1,9 LVA995 N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176Τ+T231R+ 2,8+/-0,2 N233R+D254S LVA997 N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S 2,7+/-0,8 LVA998 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I 2,2+/-0,7 LVA999 N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R 6,4+/-0,2 LVA10OO N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+ 2,8+/-0,8 G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T LVA1002 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R 1,4+/-0.2 +D254S LVA1003 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+ 2,6+/-0,7 N233R+D254S LVA1004 N11R+N33Q+G38A+G91 T+G 163T+V176G+T231R+ 3,2+/-0,8 N233R+D254S L VA1005 N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+ 2,3+/-0,4 N233R+D254S LVA1006 E1*+N11R+N33Q+G38A+G91N+N94R+G163P+V176G+ 1,4+/-0.1 T231R+N233R+D254S LVA1007 E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+ 2,3+/-0,3 N233R LVA1008 E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+ 2,5+/-0,1 T231R+N233R LVA1009 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+ 2,7+1-0,2 D254S LVA1010 E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+ 1,9+/-0,3 N233R LVA1011 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+ 2,1+/-0,3 N233R LVA1012 E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+ 2,4+/-0,3 T231R+N233R LVA1013 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+ 3,4+/-1,2 N233R+D254S LVA1014 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+ 2,2+1-0,2 D254S+I255A+P256Q LVA1015 E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+ 1,9+/-0,1 T231R+N233R+D254S LVA1017 N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I 2,4+/-0,3 LVA1018 N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+ 1,9+/-0,6 T231R+N233R LVA1019 N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176I+ 1,3+/-0,3 T231R+N233R LVA1021 N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+ 2,5+/-0,3 T231R+N233R+D254S+P256T LVA102 3 N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+ 2,3+/-0,1 D254S+P256T LVA1027 E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+ 3,1+/-0,1 D254S LVA1028 N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+ 3,7 +/-1,4 T231R+N233R+D254S+P256T LVA1029 N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R 3,4+/-0,0 LVA1031 N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+ 1,4+/-0,1 D254Y+I255F+L269F L VA1032 N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+ 1,5+1-0,2 D254Y+I255F LVA1033 N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 2.5+/-0.1 LVA1034 N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 4,3+/-0,0 LVA1035 N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 2.2+/-0.0 L VA1036 N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 4,1+/-1,2 LVA1037 N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S 3.4+/-0.0 LVA1038 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+ 5,6+/-1,8 N233R+D254S+P256T LVA1040 N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 3,0+/-1,0 L VA1041 Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+ 2,5+/-0,9 V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L LVA1044 N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S 2,9+/-0,5 LVA1045 N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S 2,0+/-0,1 LVA1046 N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S 2.8+/-0,1 LVA1048 N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+ 2.5+/-0.3 N233R+D254S Tabela_8ç: Variantes da lipase adicionais com desempenho melhorado in vitro
Lipase | Substituições como comparado à SEQ IP NO: 2_| IF (A280)
Dieta I
(pH 3 na etapa gástrica)
LVA012 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ 2,5+/-0,4 P256T LVA023 N33Q+E210D+T231R+N233R 1,9+/-0,2 LVA027 N33Q+T231R+N233R 1,8+/-0.2 LVA041 N33Q+D111A+T231R+N233R 2,0+/-0,3 LVA043 N33Q+G91T+T231R+N233R 3,1 LVA061 D27Q+N33Q+T231R+N233R 1,7+/-0.4 L VA139 Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R 2.3+/-1,0 LVA216 N33Q+E56Q+T231R+N233R 1,3+/-0,1 LVA231 N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R 1,3+/-0,2 LVA238 D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+ 1,3+/-0.3 D254G+P256T LVA245 N33Q+N39S+T231R+N233R 1,7+/-0,7 LVA250 N33Q+N94R+T231R+N233R 3,3+/-1,8 LVA275 N33Q+T231R+N233R+D254S 4,3+/-2,7 LVA315 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G 1,4+/-0.2 LVA317 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 1,8+/-0.4 LVA319 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 2,2+/-0,3 LVA341 D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 2,3+/-0,1 LVA348 N33Q+T231R+N233R 1,4+/-0.2 LVA349 K98I+T231R+N233R+N251S 1,4+/-0.2 LVA368 N33Q+G163P+T231R+N233R 1,7+/-0,1 LVA370 N33Q+G163D+T231R+N233R 1,3+/-0,1 LVA387 N33Q+G163T+T231R+N233R 1,1+/-0,1 LVA389 N33Q+G163W+T231R+N233R 1,3+/-0,0 LVA437 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R 1,4+/-0.0 LVA444 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S 1,2+/-0.0 LVA473 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ 1,2+/-0.2 D254S+P256T LVA553 N33Q+T231R+N233R+P256A 1,2+/-0.0 LVA566 N33Q+T231R+N233R+P256S 1,2+/-0,1 LVA620 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S 1,2+/-0,1 LVA672 N33Q+S115L+T231R+N233R 1,1 +/-O1O LVA675 N33Q+G38A+G91 T+G 163K+T231R+N233R+D254S 1,6+/-0.2 LVA714 D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+ 1,1+/-0,0 N233R+Q249R+D254S LVA773 D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+ 1,3+/-0,1 D254S+P256T LVA828 N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+ 1.6+/-0.3 N233R+Q249R LVA829 N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+ 1,7+/-0.0 N233R+Q249R+D254S LVA955 N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S 3.3+/-1,0 LVA956 N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L 1,8+/-0.4 LVA957 N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L 2.3+/-0.5 Tabela 8d: Variantes da lipase adicional com desempenho melhorado in vitro Substituições como comparado à SEQ ID NO: 2_[ IF (A280)
Lipase
Dieta I (pH 5 na etapa gástrica)
LVA012 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ 2.1+/-0.5 P256T LVA013 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ 1.6+/-0.0 P256T LVA023 N33Q+E210D+T231R+N233R 3.2+/-1.1 LVA041 N33Q+D111A+T231R+N233R 2.2+/-0.6 LVA043 N33Q+G91T+T231R+N233R 3.9+/-1.1 LVA061 D27Q+N33Q+T231R+N233R 2.4+/-0.8 LVA139 Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R 1.5+/-0.3 LVA208 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R 1.4+/-0.1 LVA216 N33Q+E56Q+T231R+N233R 1.9+/-0.2 LVA231 N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R 2.0+/-0.0 LVA250 N33Q+N94R+T231R+N233R 1.9+/-0.5 LVA275 N33Q+T231R+N233R+D254S 1.8+/-0.5 LVA315 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G 1.9+/-0.3 LVA317 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 2.1+/-0.4 LVA319 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 2.3+/-0.8 LVA341 D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 2.4+/-0.1 LVA348 N33Q+T231R+N233R 1.6+/-0.3 LVA349 K98I+T231R+N233R+N251S 1.7+/-0.5 LVA368 N33Q+G163P+T231R+N233R 1.7+/-0.1 LVA370 N33Q+G163D+T231R+N233R 2.0+/-0.4 LVA387 N33Q+G163T+T231R+N233R 1.4+/-0.0 LVA389 N33Q+G163W+T231R+N233R 1.5+/-0.0 LVA437 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R 1.9+/-0.3 LVA444 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S 1.2+/-0.2 LVA449 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ 1.4+/-0.1 D254S+P256T LVA473 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ 1.4+/-0.4 D254S+P256T LVA486 N33Q+T231R+N233R+D254Q 1.9+/-0.1 LVA488 N33Q+T231R+N233R+D254I 1.6+/-0.1 LVA503 N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R 1.3+/-0.1 LVA553 N33Q+T231R+N233R+P256A 1.1+/-0.1 LVA564 N33Q+T231R+N233R+P256L 1.2+/-0.1 LVA566 N33Q+T231R+N233R+P256S 1.7+/-0.2 LVA620 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S 1.5+/-0.2 LVA672 N33Q+S115L+T231R+N233R 1.7+/-0.1 LVA675 N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 2.2+/-0.4 LVA713 D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+ 2.7+/-0.2 N233R+Q249R LVA714 D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+ 1.2+/-0.0 N233R+Q249R+D254S LVA734 N33Q+G161A+T231R+N233R 1.3+/-0.1 LVA801 N33Q G38M T231R N233R 3.3+/-0.9 LVA803 N33Q G38F T231RN233R 3.2+/-0.4 LVA828 N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+ 2.0+/-0.9 N233R+Q249R LVA829 N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+ 2.8+/-1.5 N233R+Q249R+D254S LVA955 N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S 4.2+/-1.7 LVA956 N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L 2.6+/-0.8 LVA957 N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L 2.1+/-0.3 Exemplo 8: Variantes da lipase com estabilidade melhorada em pH 3 na
presença de pepsina
As variantes da Tabela 6 no Exemplo 5 foram varridas quanto à estabilidade em pH 3 na presença de pepsina, juntamente com as variantes 5 da Tabela 9 abaixo.
As variantes foram selecionadas de duas bibliotecas de levedura aleatoriamente modificadas dos aminoácidos 21 a 100 da SEQ ID NO: 1 e de uma biblioteca de leveduras alvejada da SEQ ID NO: 1 com as seguintes alterações almejadas: D27X, E43X, E56X, D57DA, D62DA, 10 E87EK, D96DL, E99X, Dll IX, D234X Q249QR, D254DN, de uma biblioteca de levedura almejada da SEQ ID NO: 1 com G91T e G163K com as seguintes alterações almejadas: NI IR, D27RQNV, G38X, D96EW, K98X, Tl 141, K163WA, E210VD, R231I, D254SGQIK e P256TA, de uma biblioteca aleatoriamente modificada de SEQ ID NO: 1 com G91T e G163K, 15 de uma biblioteca aleatoriamente modificada da SEQ ID NO: 1 com D27R, G91 N, N94R, Dl 11 A, S216P, L227G e P256T ou foram variantes sítio direcionadas geradas a partir da SEQ ID NO: I. A levedura é a Saccharomyces eerevisiae JG 169 (MATa; ura3-52; Ieu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-113; prd::HIS3; prbl:: LEU2; cir+). Tabela 9: Variantes da lipase III
Designação Substituições como comparado à SEQ ID NO: 2 da variante LVAR0002b T32I+G91V+T231R+N233R LVAROOlla G91A+T231R+N233R LVAROO14 N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R LVAROO15 P42L+D57N+G91E+T231R+N233R LVAROO16 K98I+T231R+N233R LVAROO17 V60L+G91V+T231R+N233R LVAR0048 E43K+E56S+E87K+T231R+N233R LVAR0055 E43V+G91R+T231R+N233R LVAR0059 E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R LVAR0066 E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R LVAR0068 E87K+L147S+T231R+N233R LVAR0070 E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R LVAR0071 E43 K+E5 6A+E87K+D234K+T231R+N23 3R LVAR230 D27R+N 3 3 Q+E43 K+K46M+I90 V+G91N+N 94R+D111A+T1141+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVAR226 G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVAR287 N3 3 Q+G3 8 W+G91T+T1141+G163 K+E210D+T231R+N233R+P25 6T LVAR288 D27I+N3 3Q+G91T+D96E+K98T+T1141+G 163 K+E210D+T231R+ N233R+P256T LVAR280 N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S LVAR286 N3 3 Q+G3 8 W+G91 T+T 1141+G 163 K+E210 V+T231R+N23 3R LVAR214 Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T LVAR281 N33 Q+G91T+D96E+K98T+T1141+G 163 K+E210D+T231R+N23 3 R LVAR205 D2 7R+N 3 3 Q+T3 7K+N 711+G91N+N 94R+K9 8I+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T LVAR215 Q4H+D27R+N3 3 Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T LVAR277 N33 Q+G91T+D96E+K98T+T1141+G 163 S+E210 V+T231R+N23 3 R+ D254K+P256A LVAR282 N33Q+G91 T+Tl 141+G 163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A LVAR209 D2 7R+N 3 3 Q+L5 21+V60E+G91N+N 94R+D111A+T114I+V168M+ E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVAR223 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T LVAR231 D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T LVAR204 D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T LVAR235 N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T LVAR284 D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T LVAR225 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R LVAR205 D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T LVAR283 D27R+N33Q+G91 T+Tl 14I+G163 W+E210D+T231R+N233R LVAR219 D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T LVAR220 D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+ T231R+N233R+P256T+L269H LVAR216 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T LVAR290 N3 3 Q+G91T+T114I+E210 V+T231R+N233R+D254K+P256A LVAR218 D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T LVAR285 N33Q+G91 T+Tl 141+G 163K+E210D+T231R+N233 R LVAR208 D27R+N3 3Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T LVAR207 D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T23 IR+ N233R+P256T LVAR234 D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T LVAR828 N3 3 Q+G91A+N 94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R LVAR955 N33Q+G91T+K98I+T1141+G 163 K+T231R+N23 3 R+D254S LVAR956 N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L Princípio
O processo de varredura mede a atividade lipase residual depois de um tratamento de 3 horas em pH 3,0 e temperatura ambiente na presença de 75 ug/mL de pepsina. A atividade lipase residual é medida em uma atividade de monitoramento de taxa de ensaio no decorrer do tempo para permitir uma atividade muito elevada e que lipases com atividade muito baixa sejam detectadas durante o evento de varredura.
Nas varreduras primárias das variantes, uma diluição suficientemente grande é efetuada na amostra de caldo para minimizar os efeitos no meio ou dos componentes de fermentação nas condições de teste. Variantes que fazem isso passam da fase primária e sofrem mais testes na varredura de acompanhamento pela adição de mais diluições e replicatas das amostras de teste.
Materiais e Métodos Meio de varredura primário:
1,7 g de nitrogênio levedura base (YNB) com sulfato de amônio (Bio 101, # Cat 4027-532), 0,8 g de mistura de suplemento complemento-uracil (CSM-ura) w/40 mg de adenina (ADE) (Bio 101, # Cat 4512-722), 5 g de ácidos Casamino (BD, #Cat223050), 100 mL de glicose 50%, 50 mL de K2HPO4 0,5 M (fosfato de potássio dibásico), 1 mL de CuS04.5H20 100 mM (JD Baker, #Catl 843-01), 1 mL de ampicilina 100 mg/mL em um volume total ajustado para I L com água deionizada. O meio foi esterilizado por filtração e armazenado a 4°C.
Meio otimizado:
6,7 g de YNB com sulfato de amônio (Bio 101, # Cat 4027- 5 532), 5,9 g de ácido succínico (Sigma S-9512), 0,8 g de CSM-ura w/40 mg de ADE (Bio 101, # Cat 4512-722), 20 g de galactose (Sigma, #Cat G-0625), 10 g de glicose, I mL de CuSO4.5H20 100 mM e 1 mL de ampicilina 100 mg/mL. O pH foi ajustado para 6,6 com NaOH e o volume foi ajustado para 1 L com água deionizada. O meio foi esterilizado por filtração e armazenado a 10 4°C.
Meio de cultura de semeadura:
Misturar os seguintes ingredientes: 6,7 g de YNB com sulfato de amônio (Bio 101, # Cat 4027-532), 5 g de ácidos Casamino (BD, #Cat 223050), 100 mL de ácido succínico 0,5 M (Sigma S-9512), 855 mL de H2O deionizada. Autoclavar a mistura. Adicionar 2 mL de cloranfenicol 10 mg/mL e 40 mL de glicose 50%. Armazenar a 4°C.
Soluções estoque para fazer tratamento com pepsina e o substrato:
1. Triton-XlOO 10% (p/v)
2. TRIS 1 M, pH 8,0
3. CaCl2*2H20 10% (680 mM)
4. Ácido cítrico 100 mM, pH 3,0
5. Pepsina de porco 5 mg/mL (Sigma P-6887, 3280 U/mg de sólido, 3370 U/mg de proteína) combinada com ácido cítrico 100 mM, Triton- XlOO 0,01%
6. Palmitato de 4-nitrofenol (PNP) 50 mM combinado em
Triton-XlOO 10%
Substrato para ensaio de atividade de lipase
PNP-palmitato I mM, Triton-XlOO 1,2%, CaCl2 4 mM, TRIS 100 mM, pH 8,0 Solução de tratamento de pepsina: Pepsina 150 ug/mL, CaCl2 4 mM, Triton-XlOO 0,01%, citrato
50 mM, pH 3,0 Diluente:
Triton-XlOO 0,01%, NaCl 10 mM
Enzimas:
Amostras de caldo de variante da lipase para varreduras primárias foram derivadas de clones individuais tomados de placas de Agar em Meio de Varredura Primário em placas com 96 poços.
Crescimento de culturas:
Três receitas de meios foram usadas para crescer as variantes de lipase. Uma vez que o nível de expressão ao nível de varredura primário não é crítico, o Meio de Varredura Primário foi usado para um estágio de varredura inicial. Variantes de lipases individuais expressando colônias de leveduras foram tomadas em 180 uL de Meio de Varredura Primário em placas de 96 poços e crescidas a 30°C e 250 rpm por 4 a 6 dias para as amostras de varredura primária.
Para a varredura secundária, 20 uL de cultura da placa de varredura primária foram transferidos em 1 mL de meio de cultura de semeadura em placas de 24 poços e crescidas de um dia para o outro a 3O0C e 250 rpm. A expressão da lipase foi conseguida pela inoculação de 20 uL da cultura de semeadura em 1 m de meio otimizado em placas de 24 poços a 30°C e 250 rpm por 4 a 6 dias.
Para qualquer varredura subsequente, colônias de levedura individuais foram tomadas em 1 mL de meio de cultura de semeadura em placas de 24 poços e crescidas de um dia para o outro a 30°C e 250 rpm. A expressão da lipase foi conseguida pela inoculação de 20 uL da cultura de semeadura em 1 mL de meio otimizado em placas de 24 poços a 30°C e 250 rpm por 4 a 6 dias. O meio otimizado foi usado para crescer em uma placa de 24 poços e um frasco de agitação para maximizar o nível de expressão de proteína.
Procedimento de varredura:
Em varreduras primárias, as amostras foram diluídas 25 vezes em diluente, a seguir 5 uL foram adicionados em placas de 384 poços contendo 5 uL ou de diluente ou de solução de tratamento de pepsina.
Depois de 3 horas em temperatura ambiente, o substrato foi adicionado a cada amostra como se segue:
As amostras tratadas com pepsina foram misturadas com 55 uL de substrato + 5 uL de diluente, as amostras não-tratadas foram misturadas com 55 uL de substrato + 5 uL de solução de tratamento com pepsina. (o pH da pepsina é 3,0 e sem compensar a alteração no pH, o ensaio de atividade será efetuado em dois valores de pH diferentes, de modo que isto normaliza o pH do ensaio sem ter um efeito na estabilidade da lipase (pela adição desta no final quando o pH do substrato é suficiente para elevar o pH global para 8,0, onde a pepsina não é ativa). As leituras de OD40S foram feitas 6 vezes por placa de 384 poços; exatamente 15 minutos depois da adição de substrato e até 18 horas depois da adição do substrato e foram expressas como mOD (miliOD) por hora. Os dados que se enquadram na faixa linear foram coletados e a atividade lipase residual de cada amostra tratada com pepsina foi comparada com a atividade lipase residual da amostra não-tratada correspondente. Isto é reportado abaixo como % de atividade residual (%RA); calculado dividindo-se a taxa da condição tratada pela taxa da condição não- tratada e multiplicando o resultado por 100.
A automação pode ser realizada usando um sistema compreendido de uma estação de trabalho Biomek FX a qual funciona para mover placas e realizar etapas de pipetagem, um leitor de placas DXT 880 para registrar dados das placas de ensaio, um carrossel e um sistema de correia transportadora para transportar as placas para e da estação de trabalho. Esse procedimento aceita amostras nos formatos de placas de 96 poços, efetua diluições no mesmo formato, e a seguir usa placas de 384 poços para os passos de tratamento e ensaio.
Resultados:
As atividades residuais relativas para cada variante de lipase
conforme medido depois da varredura secundária estão mostradas na Tabela 10 abaixo. Cada uma dessas variantes tem um RA melhorado (estabilidade em pH 3 na presença de pepsina) em comparação com a lipase dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2.
Tabela 10: Atividade da lipase residual depois da incubação em pH 3 na
presença de pepsina
Enzima testada Atividade residual (RA), % SEQ ID NO: 2 2.3 SEQ ID NO: 1 9.7 LVAR0002b 37 LVAR0003 37 LVAROOHa 58 LVAR0013 56 LVAR0014 80 LVAR0015 70 LVAR0016 37 LVAR0017 62 LVAR0045 33 LVAR0046 61 LVAR0047 45 LVAR0048 39 LVAR0050 45 LVAR0051 40 LVAR0052 58 LVAR0053 44 LVAR0054 30 LVAR0055 66 LVAR0056 37 LVAR0057 71 LVAR0058 42 LVAR0059 36 LVAR0061 63 LVAR0062 31 LVAR0063 59 LVAR0064 33 LVAR0065 40 LVAR0066 34 LVAR0067 32 LVAR0068 57 LVAR0069 45 LVAR0070 52 LVAR0071 60 LVAR0072 52 LVAR0101 95 LVAR0102 76 LVAR0106 86 LVAR230 91 LVAR226 100 LVAR287 96 LVAR288 94 LVAR280 93 LVAR286 91 LVAR214 90 LVAR281 90 LVAR205 89 LVAR215 88 LVAR277 87 LVAR282 87 LVAR209 86 LVAR223 85 LVAR231 84 LVAR204 84 LVAR235 83 LVAR284 83 LVAR225 81 LVAR205 80 LVAR283 80 LVAR219 80 LVAR220 79 LVAR216 79 LVAR290 78 LVAR218 78 LVAR285 78 LVAR208 77 LVAR207 76 LVAR234 75 LVAR828 75 LVAR955 96 LVAR956 85 Exemplo 9: Variantes da lipase com atividade melhorada na presença de sais biliares
Para identificar as variantes da lipase com atividade melhorada na presença de sais biliares o ensaio a seguir foi desenvolvido. O ensaio mede a atividade da lipase na presença de sais biliares 2 mM em comparação com as condições sem os sais biliares. O teste é estabelecido de modo que a atividade da lipase seja medida em uma atividade de monitoramento da taxa do ensaio no decorrer do tempo para permitir que atividades muito altas e atividades muito baixas da lipase sejam detectadas. Esse ensaio é automatizado para controlar precisamente o momento da adição dos reagentes e ajustes do pH das reações do pH 5,0, onde a lipase reage com o substrato em 5 baixo pH, até H 8,0, um pH que permite que o grupo PNOP liberado seja lido em OD 405. As placas são lidas imediatamente depois de realizado o ajuste do pH.
Soluções estoque para o ensaio de tratamento de substrato e
sais biliares:
10
destilada.
XlOO 10%.
Substrato para o ensaio da atividade da lipase:
PNP-oleato I mM, Triton-XlOO 1,2%, CaCl2 2 mM, succinato 25 mM, pH 5,0.
Diluente:
Triton-XlOO 0,01%, NaCl 10 mM.
Enzimas:
Amostras de lipase purificadas são diluídas em diluente até aproximadamente 8 microgramas/mL para o método automatizado. A concentração de amostras de lipase purificadas foi determinada a partir da absorbância a 280 nm usando o coeficiente de extinção 1,24 A280/mg. Procedimento de Varredura do Ensaio de Sais Biliares em base Líquida:
1.Triton-X 100 10% (p/v).
2. TRIS 100 mM, pH 8,0.
3. Succinato 100 mM, pH 5,0.
4. CaCl2*2H20 10% (680 mM).
5. Sais biliares 20 mM (Sigma B-8756) completados em água
6. Oleato de 4-nitrofenol (PNP) 50 mM completado em Triton-
Amostras de enzima são diluídas 25 vezes e 200 vezes em diluente, a seguir 10 microlitros são adicionados ou a 23 microlitros de água ou a 23 microlitros de sais biliares 20 mM em placas reacionais de 96 poços. Depois disso, 200 microlitros do substrato (oleato de PNP 1 mM em succinato
25 mM, CaCl2 2 mM,. Triton-XlOO 1,2%, pH 5,0) foram adicionados e misturados. Imediatamente após a mistura, 60 microlitros foram removidos e microlitros foram pipetados em quatro placas de 384 poços separadas onde os 4 quadrantes (4 x 96) são usados para ajustar as condições de sais biliares “+” e para cada uma das duas diluições das amostras de lipase. As placas de 384 poços são usadas para estabelecer 4 pontos de tempo (de modo que cada placa tenha as 2 diluições da lipase, cada uma de sais biliares “+” e “-“). Depois de 1, 2, 3 e 4 horas 60 microlitros de TRIS 100 mM, pH 8,0 foram adicionados à placa apropriada e ao quadrante e esta foi lida (OD 405 e OD 540) imediatamente. ODs entre ~ 0,1 e 0,475 são a faixa linear usada para esse ensaio. Uma proporção da atividade na presença dos sais biliares em pH 5,0 é expressa como uma porcentagem pelo cálculo da média de todos os dados lineares corrigidos para tempo e diluição para a atividade dos “sais biliares” dividido pela média de todos os dados lineares corrigidos para o tempo e diluição para a atividade dos “sais não-biliares”. A proporção da atividade versus a referência (variante N33Q da SEQ ID NO: 1) é calculada pela relação das variantes de sais biliares mais e menos pela relação dos sais biliares mais e menos de referência e é reportada como uma melhoria de vezes (por exemplo, 3 x significa 300%).
Tabela 11.
Variante Proporção de Substituições como comparado à SEQ ID NO: 2 sais biliares melhorados x de referência LVAR714 3X D2 7 V+N 3 3 Q+G91A+N 94R+D111A+G163K+L227F+ T231R+N233R+Q249R+D254S LVAR828 3X N3 3 Q+G91A+N94K+D111A+G163 K+L227F+T231R+ N233R+Q249R LVAR1042 4X G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T1141+ V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVAR1043 3X D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D11IA+ T114I+S216P+L227G+T231R+N23 3 R+P256T LVAR861 3X G23 E+D2 7R+N 3 3 Q+L5 2R+G91N+N94R+D111A+T1141+ V141E+S216P+L227G+T231 R+N233R+P256T LVAR863 2.5X D27R+N3 3 Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D11IA+ Tl 14I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVAR290 3X N33Q+G91 T+T 114I+E210V+D254K+P256A LVAR277 2X N33Q+G91T+D96E+K98T+T1141+G 163 S+E210V+D254K + P256A LVAR209 2X L52I+V60E+T114I+V168M+E210D LVAR234 2X D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R + S216P+L227G+T231R+N23 3 R+P25 6T LVAR208 2X D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P + L227G+T231R+N233R+P256T LVAR230 2X D2 7R+N3 3 Q+E43 K+K46M+I90V+G91 N+N94R+D11IA+ Tl 14I+S216P+L227G+T231R+N23 3 R+P256T Exemplo 10: Teste de digestibilidade in vivo (teste de varredura)
Variantes da lipase de Humicola lanuginosa purificada selecionada da invenção foram estudadas em um teste de varredura de lipase em porquinhos Gõttingen fêmeas (Ellegaard) com Insuficiência Exócrina Pancreática (PEI) induzida. As seqüências de aminoácidos das variantes são encontradas nas Tabelas 1, 7 e 8. A eficácia foi comparada com aquela da variante N33Q da lipase com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 1 (variante LV2934; lipase de referência da Tabela 12). A Insuficiência Exócrina Pancreática (PEI) foi induzida nos porquinhos por ligação do dueto pancreático, e eles também foram ajustados com a cânula reentrante íleo- cecal, tudo sob anestesia com isoflurano e em um peso de cerca de 25 Kg, conforme descrito por Tabeling et al. (Tabeling et al. (1999): " Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duet-ligated pigs and the effects of enzyme substitution", J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82: 251-263) e em Gregory et al. (Gregory et al. (1999): "Growth and digestion in pancreatic duet ligated pigs, Effect of enzyme supplementation" in "Biology of the Pancreas in Growing Animais" (Pierzynowski & Zabielski eds), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp 381-393). Um período de pelo menos 4 semanas foi concedido para recuperação da cirurgia, antes dos estudos serem iniciados. Antes do estudo iniciar, o status PEI de cada porco foi confirmado pelo teste de quimiotripsina em fezes (comercialmente disponível da lmmundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim, Alemanha, com o No. de catálogo K 6990).
Ensaio
O teste de varredura para a atividade da lipase foi efetuado em dois grupos de 3 ou 4 porquinhos PEI. Durante os estudos, os porcos foram alocados em gaiolas de metabolismo modificadas e foi lhes dado livre acesso a água e foram alimentados duas vezes por dia.
Teste da farinha
247,2 g de leite; 1 x 87 g de sache Calshake da Fresenius Kabi (2077KJ/100 g); 29,9 g de óleo de oliva; 9,88 g de Methocel (Methocel E5, da Colorcon GmbH); e 0,368 g de óxido crômico. Calshake contém 24,4% de gordura, 3,3% de lactose, 64,9% de carboidratos (49% de açúcar) 4,3% de proteína.
O leite e o óxido crômico foram homogeneizados com um homogeneizador Ultraturax (9500 rpm, ca. 1 min) depois do que o óleo foi misturado e novamente homogeneizado por 1 -2 minutos. A seguir o Calshake foi misturado (agitado com o misturador por 1-2 min) e finalmente o Methocel foi lentamente adicionado durante a mistura com o Ultraturax, e o alimento como um todo foi a seguir homogeneizado por aproximadamente 3 minutos.
Desempenho
Par avaliar a eficácia da lipase, os porcos foram alimentados com uma refeição de teste única (contendo 51,6 g de gordura) na qual diferentes quantidades de uma lipase de referência ou quantidades semelhantes de variantes da lipase foram misturadas imediatamente antes da alimentação.
A lipase de referência LV2934 foi dosada a 0,124, 1,24, 4,96 ou 18,61 mg de proteína enzimática/farinha (correspondendo a 500, 5000, 20000 e 75000 FIP U lipase/farinha, respectivamente), e as variantes da lipase da invenção foram também dosadas de acordo com a mg de proteína enzimática (1,24, 4,96 e 18,61 mg/refeição) para comparar a eficácia in vivo com LV2934. Os estudos foram efetuados de acordo com o planejamento de Quadrado Latino.
O quimo do íleo foi coletado durante 8 horas depois do primeiro aparecimento do marcador da refeição no íleo (quimo verde) e amostras de duas horas foram congeladas a -20°C. Pelo menos um dia de lavagem foi concedido entre as determinações separadas. Uma farinha líquida com baixo teor de gordura foi dada na tarde antes de cada teste para reduzir a possibilidade de interferência dos conteúdos da farinha das refeições não relacionadas com o teste.
Análise
As amostras de quimo do íleo congeladas foram liofilizadas, trituradas e analisadas para matéria seca (DM) e gordura (Naumann & Bassler 1993; Die chemische Untersuchung von Futtermitteln, 3a edição, VDLUFA- Verlag, Darmstadt (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten). DM foi estimado em peso depois da liofilização seguido por 8h de incubação a 103°C; o conteúdo e gordura bruto da amostra seca foi determinado por hidrólise ácida e extração com éter de petróleo usando a técnica de bolsa de filtração em um extrator ANKOMXT15 (o qual é disponível da Ankom Technology, Macedon, NY, EUA; capaz de efetuar 15 extrações de uma vez); Cr2O3 foi oxidado a cromato e o conteúdo de cromo foi calculado conforme descrito por Petry e Rapp em Zeitung fiir Tierphysiologie (1970), vol. 27, p. 181-189 (Petry & Rapp, 1970, Z. Tierphysiol. 27: 181-189) através da extinção a 365 nm (espectrofotômetro).
Os valores de digestibilidade (coeficiente de absorção de gordura; CFA) foram estimados pelo método do marcador de acordo com a fórmula:
„ [% de Cr,0, na ração] · [% de qordura no quimo do ileo]
CFA (%) = 100--^------------·100
[% de Cr2O3 no quimo do ileo]«[% de gordura na ração]
Resultados e conclusão:
Os resultados de CFA estão mostrados na Tabela 12. A dosagem de lipase é indicada em miligramas de proteína enzimática por farinha (mg/farinha).
Tabela 12: Efeito das variantes da lipase da invenção em CFA (coeficiente de
absorção de gordura)
Variante de 0 0,124 1,24 4,96 18,61 Lipase (mg/farinha)** (mg/farinha)** (mg/farinha)*** (mg/farinha) ** AA * Nenhuma 14,56 +/- lipase 5,94 Animais de 85,8 +/- 3,2 controle (não PEI) Lipase de 17,53 35,41 +/- 5,41* 54,69 +/- 1,52** 65,48 +/- referência(LV2 +/-4,95*** 5,88* 934)**** LVA129 30,02 58,47 75,47 LVA147 41,44 54,84 74,00 LVA238 37,74 57,33 72,05 LVA315 37,03 64,87 80,91 LVA317 43,7 68,57 81,14 LVA319 27,07 63,72 73,43 83,82 LVA368 34,21 51,45 75,50 * Desvio padrão calculado a partir de 6 testes independentes e incluindo a testagem de LVA027 e LVA348.
** Desvio padrão calculado a partir de 2 testes independentes (LVA027 e LVA348).
*** Desvio padrão calculado a partir de 4 testes independentes.
**** Correspondendo às seguintes quantidades de FIP U de lipase de referência LV2934: 500, 5000, 20000 e 75000 unidades FIP determinadas pelo teste FIP pancreático, respectivamente.
Variantes de lipase adicionais incluindo LVl330, LVl 855, LVl 865, LVl 874, LV1889, LVA043, LVA049, LVA012, LVA023, LVA099, LVA041, LVA061, LVA103, LV1857, LV1232 e LVA473 são estudadas no mesmo teste de varredura.
Todas as variantes da lipase testadas foram ativas in vivo e causaram ume melhoria dose-dependente em CFA. As variantes de lipase LVA129, LVA147, LVA238, LVA315, LVA317, LVA319 e LVA368 foram todas consideravelmente melhoradas em comparação com a lipase de referência.
Exemplo 11: Teste de digestibilidade in vivo total
A variante de lipase purificada LVA319 foi testada em um estudo e digestibilidade total em um grupo de 6 porquinhos Gõttingen fêmeas (Ellegaard). A eficácia foi comparada com aquela da lipase da SEQ ID NO: 1 testada em porquinhos PEI alimentados com a mesma dieta. A Insuficiência Exócrina Pancreática (PEI) foi induzida nos porquinhos pela ligação do dueto pancreático, e eles também foram ajustados com uma cânula reentrante íleo- cecal, tudo sob anestesia com isoflurano e em um peso de cerca de 25 Kg, conforme descrito por Tabeling et al. (Tabeling et al. (1999): "Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duet-ligated pigs and the effects of enzyme substitution", J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82: 251-263) e em Gregory et al. (Gregory et al. (1999): "Growth and digestion in pancreatic duet ligated pigs, Effect of enzyme supplementation" in "Biology of the Pancreas in Growing Animais" (Pierzynowski & Zabielski eds), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp 381-393). Um período de pelo menos 4 semanas foi concedido para recuperação da cirurgia, antes dos estudos serem iniciados. Antes do estudo iniciar, o status PEI de cada porco foi confirmado pelo teste de quimiotripsina em fezes (comercialmente disponível da Immundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim, Alemanha, com o No. de catálogo K 6990).
Ensaio
Durante o estudo, os porcos foram alimentados duas vezes ao dia (08:00, 20:00 h) com 300 g de uma dieta “tipo humana” com alto teor de 25 gordura contendo: 200 g de dupla dieta triturada (da Altromin), mais 25 g de óleo de oliva, 75 g de creme e 0,625 g de Cr2O3 misturados co 1 litro de água (ver Tabela 13). A farinha de teste continha 31% de gordura, 15% de proteína, 36% de amido assim como vitaminas, minerais e elementos traço conforme as necessidades nutricionais dos porcos.
30 Tabela 13: Composição da dieta “tipo humana” experimental
Componentes da dieta Conteúdo (g/Kg de peso úmido) Farinha de aves 73 Farinha de ervilha 73 Caseína (precipitada sob condições 73 ácidas) Farinha de trigo 290 Amido de batata 290 Toicinho 125 Vitaminas, minerais, elementos traço 76 Até 200 g da mistura acima foram adicionados: Creme (32% de gordura) 75 g Oleo de oliva 25 g Oxido crômico 0,625 g Agua 1000 mL O creme e o óleo de oliva, seguido por água de torneira e finalmente das diferentes quantidades/diferentes suplementos enzimáticos foram misturados na ração seca pré-pesada (incluindo o marcador de óxido crômico) imediatamente antes dos porcos serem alimentados.
Desempenho
Para avaliar a eficácia da lipase, os porcos foram alimentados com duas vezes 300 g da farinha de teste/dia, no qual diferentes quantidades de uma ou outra das duas lipases foram misturadas imediatamente antes da 10 alimentação. A quantidade de cada lipase administrada é mostrada entre parênteses na Tabela 15, a saber, as atividades na lipase FIP U microbiana/farinha (unidades de FIP lipase, ver Exemplo I). Cada dosagem de enzima foi alimentada por 14 dias: os porcos foram coletados nos 5 dias seguintes, pesados e armazenados a -20°C até o momento da análise.
Análise
As fezes congeladas de cada porco foram liofílizadas, novamente pesadas e moídas. Alíquotas de cada uma das amostras trituradas de 5 dias (de acordo com a produção diária fecal) foram a seguir reunidas e misturadas juntas; isto é, fornecendo uma amostra reunida para cada porco para cada dose de enzimas. De cada amostra reunida o conteúdo de matéria seca e gordura bruta foram determinados Naumann & Bassler 1993; Die chemische Untersuchung von Futtermitteln, 3a Edição, VDLUFA-Verlag, Darmstadt (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten). A matéria seca foi estimada em 5 peso depois de liofilizada, seguido por 8 h de incubação a 103°C; o conteúdo de gordura bruto da amostra seca foi determinado por hidrólise ácida e extração com éter de petróleo usando uma técnica da bolsa de filtro em um
YrTl C f
extrator ANKOM ; Cr2O3 foi oxidado a cromato e o conteúdo de cromo foi calculado conforme descrito por Petry e Rapp em Zeitung fur Tierphysiologie, 1970, vol. 27, p. 181-189. (Petry & Rapp 1970; Z. Tierphysiol. 27; 181-189) através da extinção a 365 nm (espectrofotômetro).
Os valores da digestibilidade (coeficiente de absorção de gordura; CF A) foram estimados pelo método marcador de acordo com a fórmula:
[% de Cr,0, na ração] · [% de gordura nas fezes]
CFA (%) = 100 - --^----------·100
[% de Cr2O3 nas fezes]«[% de gordura na ração]
Resultados e conclusão
A partir dos resultados na Tabela 14, fica aparente que a variante da lipase LVA319 em um desempenho muito melhoro do que a lipase de referência da SEQ ID NO: 1.
A lipase da invenção causou uma melhoria muito grande e dose-dependente na digestibilidade de gorduras, já indicando uma melhora altamente eficiente na dose mais baixa testada.
Tabela 14: Influência da suplementação da enzima em CFA (Coeficiente de Absorção de Gordura)
Suplemento 0 Baixo Médio Alto enzimático Sem suplemento 21,7 ±4,5 Lipase de referência 46,3 ± 4,9 59,2 ± 7,0 75,6 ± 4,7 (SEQ ID NO: 1) (40101 FIP U) (155743 FIP U) (1168069 FIP U) Variante da lipase 59,2 ±4,4 (9538 72,0 ±4,3 (38150 81,4 ± 1,3 LVA319 FIP U) FIP U) (114450 FIP U) Exemplo 12: Composições farmacêuticas
Pelotas Um concentrado de lipase líquida da variante da lipase purificada LVA129 (testada in vivo no Exemplo 10) é preparado. O concentrado líquido é seco por meios convencionais, e o conteúdo de proteína da lipase do pó seco foi medido e deve preferivelmente estar acima de 50%. A seguir, 500 g de pó de lipase seco são pré-misturados seco em combinação com 200 g de celulose microcristalina e 300 g de polietilenoglicol 4000 (MAcrogol™ 4000) em um misturador comercialmente disponível. Uma quantidade suficiente de um agente umidificador comumente usado é adicionado e a massa úmida resultante é totalmente misturada em temperatura ambiente. A massa homogeneizada é, a seguir, extrusada em uma extrusora comercialmente disponível ajustada com um molde perfurante com um diâmetro de orifício de 0,8 mm para formar pelotas cilíndricas. O extrusado produzido é arredondado até pelotas esféricas com um esferonizador comercialmente disponível pela adição da quantidade necessária de um agente umidificante comumente usado. As pelotas são secas em uma temperatura de produto de aproximadamente 40°C em um secador a vácuo comercialmente disponível. As pelotas secas são, a seguir, separadas pelo uso de uma máquina de peneiração mecânica com telas de 0,7 e 1,4 mm. As frações peneiradas >
0,7 mm e < 1,4 mm são coletadas e preenchidas em porções de pelotas de 200 mg cada, em cápsulas de tamanho 2.
As pelotas resultantes são testadas quanto à atividade lipolítica pela aplicação do ensaio pH-Stat de lipase descrito no Exemplo 1.
As pelotas resultantes são testadas para desintegração de acordo com a Farmacopéia Européia 2.9.1 (Seção “Desintegração de comprimidos e cápsulas (“Disintegration of tablets and capsules”) (solução de teste: ácido malônico 0,1 M, pH 6,0 - 500 mL, 37°C). I LISTAGEM DE SEOUENCIAS
<110> Solvay Pharmaceuticals GmbH
Novozymes North America, Novozymes A/S Svendsen, Allan Skjoet, Michael Christensen , Lars HC Larsen, Signe E.
Lundin, Nina Lamsa, Michael Gregory, Peter C.
Yaver, Debbie <120> VARIANTEes de lipase para <130> 11143.204-W0 <160> 8
<170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 274 <212> PRT
<213> Humicola lanuginosa <220>
<221> VARIANTE <222> (1)..(274)
<220>
<221> mat_peptide <222> (6)..(274)
<4 00> 1
Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser -5 -1 1 Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala 15 Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr 30 35 Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe 45 50 Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu 60 65 Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser 80 Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu 95 Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser 110 115 Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala 125 130 Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu 140 145 Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly 160 Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg 175 Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg 190 195 Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe 205 210 Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu 220 225 Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala 240 Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu 255 Inc.
uso farmacêutico
Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn 5 10 Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp 25 Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu 40 Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly 55 Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu 70 75 Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly 85 90 Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys 100 105 Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr 120 Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg 135 Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala 150 155 Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr 165 170 Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val 180 185 Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val 200 Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu 215 Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile 230 235 Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn 245 250 Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr 260 265 Cys Leu <210> 2 <211> 269 <212> PRT
<213> Humicola Ianuginosa <220>
<221> mat_peptide <222> (1)..(269)
<4 00> 2
Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn 1 5 Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys 20 Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala 35 40 Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu 50 55 Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr 65 70 Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn 85 Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys 100 Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val 115 120 Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro 130 135 His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala 145 150 Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val 165 Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe 180 Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn 195 200 Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser 210 215 Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg 225 230 Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn 245 Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu 260 <210> 3 <211> 274 <212> PRT
<213> Bacillus Iicheniformis <220>
<221> mat_peptide <222> (1) . . (274)
<400> 3
Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile 1 5 Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala 20 Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro 35 40 Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr 50 55 Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala 65 70 Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser 85 Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr 10 15 Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr 30 Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp 45 Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr 60 Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe 75 80 Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp 90 95 Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly 105 110 Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val 125 Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly 140 Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg 155 160 Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val 170 175 Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr 185 190 Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro 205 Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser 220 Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly 235 240 Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ile 250 Thr Cys Leu 255 265 Gly Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val 10 15 Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 30 Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala 45 Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly 60 Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val 75 80 Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn 90 95 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp 100 105 110 Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala 115 120 125 Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg 130 135 140 Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn 145 150 155 160 Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val 165 170 175 Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly 180 185 190 Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr 195 200 205 Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro 210 215 220 His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu 225 230 235 240 Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu 245 250 255 Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln 260 265 270 <210> 4 <211> 188 <212> PRT
<213> Nocardiopsis sp. <220>
<221> mat_peptide <222> (1)..(188)
<4 00> 4
Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile 85 90 95 Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val 115 120 125 Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr 180 185
<210> 5 <211> 188 <212> PRT
<213> Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei <22 0>
<221> mat_peptide <222> (1)..(188) <400> 5
Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Thr Gly Thr Phe Gln Asn Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Gly Gly Tyr Gln Ser Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala 85 90 95 Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val 115 120 125 Tyr Ser Leu Thr Arg Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Ser Val Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly Val Arg Ile Arg Thr 180 185
<210> 6 <211> 513 <212> PRT
<213> Bacillus stearothermophilus <220>
<221> VARIANTE <222> (1)..(513)
<220>
<221> mat_peptide <222> (1)7.(513)
<400> 6 Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu 1 5 10 15 Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn 20 25 30 Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys 35 40 45 Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp 50 55 60 Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr 65 70 75 80 Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met 85 90 95 Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly 100 105 110 Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln 115 120 125 Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe 130 135 140 Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His 145 150 155 160 Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro Glu 195 200 205 Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr Thr 210 215 220 Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser 225 230 235 240 Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys Pro 245 250 255 Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Leu His 260 265 270 Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asp Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Ala Pro 275 280 285 Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala Phe Asp 290 295 300 Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Thr Leu 305 310 315 320 Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala Leu 325 330 335 Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr 355 360 365 Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile Asp Pro 370 375 380 Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr 385 390 395 400 Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Gly Thr Glu 405 410 415 Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val Phe Tyr 435 440 445 Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Asp Gly 450 455 460 Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val Pro 465 470 475 480 Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr Arg Pro 485 490 495 Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val Ala Trp 500 505 510 Pro
<210> 7 <211> 481 <212> PRT
<213> Bacillus Iicheniformis <220>
<221> VARIANTE
<222> (1)..(481) <4 00> 7
Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp 1 5 10 15 Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp 20 25 30 Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser 35 40 45 Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu 50 55 60 Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu 65 70 75 80 Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr 85 90 95 Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp 100 105 110 Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser 115 120 125 Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp 130 135 Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys 145 150 Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys 165 Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val 180 Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp 195 200 Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp 210 215 Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys 225 230 Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu 245 Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp 260 Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser 275 280 Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln 290 295 Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser 305 310 Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln 325 Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu 340 Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe 355 360 Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro 370 375 Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr 385 390 Phe Asp His His Asp Ile Val Gly 405 Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala 420 Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg 435 440 Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu 450 455 Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly 465 470 Arg <210> 8
<211> 483
<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<220>
<221> VARIANTE <222> (1)..(483)
<400> 8
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr 1 5 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp 20 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser 35 40 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val 50 55 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys 65 70 Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg 140 Trp Tyr Trp Tyr His Phe Asp Gly 155 160 Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln 170 175 Ser Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Asp 185 190 Tyr Asp His Pro Asp Val Val Ala 205 Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp 220 His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg 235 240 Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr 250 255 Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu 265 270 Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr 285 Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys 300 Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr 315 320 Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr 330 335 Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg 345 350 Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys 365 Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro 380 Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr 395 400 Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser 410 415 Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 425 430 Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His 445 Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly 460 Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln 475 480 Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 10 15 Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 30 Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 45 Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 60 Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala 85 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val 100 Ala Thr Glu Met Val Lys Ala Val 115 120 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr 130 135 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His 145 150 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp 165 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Gly 180 Phe Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met 195 200 Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg 210 215 Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg 225 230 Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile 245 Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu 260 Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr 275 280 Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr 290 295 Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn 305 310 Met His Ala Val Thr Phe Val Asp 325 Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu 340 Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly 355 360 Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly 370 375 Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln 385 390 Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile 405 Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu 420 Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val 435 440 Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Lys 450 455 Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val 465 Asn Lys 470 Val Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 90 95 Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 105 110 Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 125 Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 140 Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 155 160 Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 170 175 Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 185 190 Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His 205 Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn 220 Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys 235 240 Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly 250 255 Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala 265 270 Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp 285 Asn Ala Ser Lys Ser Gly Gly Asn 300 Gly Thr Val Val Gln Lys His Pro 315 320 Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu 330 335 Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 345 350 Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp 365 Val Pro Ala Met Lys Ser Lys Ile 380 Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg Gln Asn 395 400 Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn 410 415 Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Ala 425 430 Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val 445 Ala Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala 460 Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp 475 480

Claims (32)

1. Lipase, caracterizada pelo fato de ser para uso como medicamento, cuja lipase (a) tem pelo menos 50% de identidade com a seqüência de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; (b) tem atividade lipase; e a qual (c) em comparação com a seqüência dos aminoácidos 1-269 da SEQ ID NO: 2 compreende as substituições N33Q, T231R e N233R, assim como pelo menos uma substituição adicional selecionada dentre as seguintes E1*,D,N; Q4H,P,R; D5E; N8L,Q; Q9H; Fl0L; Nl 1C,D,H,L,P,Q,R,S; G23E N26A,H,I; D27I,N,Q,R,S,V; P29T; A30T,V; T37K,M G3 8 A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T, W, Y; N39H,S; E43K; K46M; A49T L52I,R; E56K,Q,R,S; D57G,N; V60E,S; G61R; V63R; A68V; L69I; N71I,S N73Q,Y; I76T; R84E; I86F,L; E87A,H,K,R; I90L,V G91 A,C,E,F,K,L,M,N,S,T,V, W,Y; L93*,F; N94*,K,Q,R,S; F95* D96*,E,G,N,R,S,W,Y; L97M,Q; K98I,T; E99D; N101Q; D102E,G,Y R108M; G109A; D111A,E,N,S; G112A; Tl 141; S115L Wll 7C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; D122E,N; Q126L; V128A; D130H H135D; P136H; Y138F; V141E,L; A150V; V154F,I,L; A155V; G156R G161A,E; N162G,S,T; G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y D167E; V168M; V176A,D,F,G,H,I,K,M,N,Q,T,W; G177A; R179T; L185M G190C,D; N200Q,S; R205I; L206F; E210D,R,V,Y; S216P; E219D; G225P T226N; L227F,G; P229R; E239D; G240L; D242E; T244S; G246A; Q249R N251Q,S; D254A,G,I,K,L,M,N,R,Q,S,Y; I255A,F P256A,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y; e L269F,H.
2. Lipase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ter um desempenho de digestão melhorado in vitro em comparação com uma lipase de referência com a seqüência da SEQ ID NO: 2 com as seguintes substituições: N33Q+T231R+N233R.
3. Método de determinação do desempenho da digestão in vitro de uma lipase em comparação com uma lipase de referência, caracterizado pelo fato de compreender os seguintes passos: a) seleção de uma lipase de referência; b) mistura de 100 partes por volume de uma dieta com 20 partes por volume de pepsina e 30 partes por volume da lipase da lipase de referência, respectivamente; c) adição de i) 0 ou ii) 10 partes por volume de tampão (MES 0,8 M, acetato de sódio 0,8 M, imidazol 0,8 M, pH 7,0), em que o passo i) pode ser referido como um passo gástrico de pH 3, e o passo ii) pode ser referido como um passo gástrico de pH 5; d) incubação por 1 hora a 37°C com agitação; e) adição de 20 partes por volume de sais biliares, assim como i) 25 ou ii) 15 partes por volume de tampão (MES 0,8 M, acetato de sódio 0,8 M, imidazol 0,8 M, pH 7,0), em que o passo i) corresponde a um passo gástrico de pH 3, e o passo ii) corresponde a um passo gástrico de pH 5; f) incubação por 2 horas a 37°C com agitação; g) adição de 50 partes por volume de Triton-XlOO 10% em ácido fosfórico 1 M; h) determinação da quantidade de ácidos graxos livres; i) ajuste das curvas de dose resposta à equação: FFA = FFAmax * [E]/([E] + K) onde FFA é a quantidade de ácidos graxos livres liberados, FFAmax é a quantidade máxima de ácidos graxos livres que as lipases podem liberar da dieta, [E] é a concentração de lipase e K é a concentração de lipase que libera metade da FFAmax; e j) cálculo do fator de melhoramento (IF) que está a seguir: IF = K(ref)/K(lipase), onde K(ref) é a concentração da lipase de referência que libera metade da FFAmax e K(Iipase) é a concentração de lipase que libera metade da FFAmax.
4. Método de determinação do desempenho de digestão in vitro de uma lipase em comparação com uma lipase de referência, caracterizado fato de compreender os seguintes passos: a) determinar a estabilidade em pH 3 na presença de pepsina, através: i) da seleção de uma lipase de referência; ii) da mistura de 5 partes em volume da lipase ou da lipase de referência, respectivamente, com 5 partes por volume de a) um diluente contendo Triton-XlOO 0,01% e NaCl 10 mM, ou b) uma solução de tratamento com pepsina contendo 150 ug/mL de pepsina, CaC12 4 mM, Triton-XlOO 0,01% e Citrato 50 mM, pH 3,0, em que a) se refere a uma amostra não-tratada, e b) se refere a uma amostra tratada com pepsina; iii) incubar as amostras do passo ii) por 3 horas a 20°C; iv) adicionar a cada amostra do passo iii) 55 partes por volume de substrato contendo PNP-palmitato I mM, Triton-XlOO 1,2%, CaC12 4 mM, TRIS 100 mM, pH 8,0, juntamente com a) 5 partes por volume de solução de tratamento com pepsina, ou b) 5 partes por volume de diluente em que a) se refere à amostra não-tratada, e b) à amostra tratada com pepsina; v) acompanhar a degradação do substrato com a leitura da OD405 das amostras de iv) em intervalos; vi) coletar dados de v) que estejam na faixa linear e o cálculo da atividade da lipase para a amostra tratada com pepsina e a amostra não- tratada, respectivamente, em mOD (miliOD) por hora; vii) calcular a % da atividade de lipase residual (%RA) pela divisão da atividade da lipase da amostra tratada com pepsina com aquela da amostra não-tratada tal como resultam do passo vi), e multiplicar o resultado por 100; e, caso seja desejável, viii) comparar a % de RA da lipase com aquela da lipase de referência; e/ou b) determinar a atividade em pH 5 na presença de sais biliares, por: i) selecionar uma lipase de referência; ii) misturar 10 partes por volume da lipase ou da lipase de referência, respectivamente, com 23 partes por volume de a) água, ou b) sais biliares 20 mM, em que a) refere-se à amostra não-tratada, e b) refere-se à amostra de sais biliares; iii) adicionar, a cada amostra de ii), 200 partes por volume de substrato contendo PNP oleato 1 mM em succinato 25 mM, CaC12 2 mM, Triton-XlOO 1,2%, pH 5,0, e misturar; iv) imediatamente após o passo iii), remover, de cada amostra, 60 partes por volume da mistura resultante e transferir quatro vezes 15 partes por seu volume em quatro compartimentos separados; v) adicionar, depois de 1, 2, 3 e 4 horas, 60 partes por volume de TRIS 100 mM, pH 8,0, ao compartimento respectivo dos quatro compartimentos de iv), Ier imediatamente em OD 405 e, com base na faixa linear das leituras de 1, 2, 3 e 4 horas, calcular a atividade em mOD/hora; vi) dividir para a lipase, assim como para a lipase de referência, a atividade, obtida no passo v), da amostra dos sais biliares pela atividade da amostra não-tratada, conforme também obtido no passo v), para obter as proporções de estabilidade dos sais biliares da lipase e da lipase de referência, respectivamente; e vii) dividir a proporção da estabilidade dos sais biliares da lipase pela proporção da estabilidade dos sais biliares da lipase de referência, 5 cuja proporção resultante pode ser definida como o fator de melhoramento da lipase.
5. Lipase de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o desempenho de digestão in vitro é determinado usando o método como definido na reivindicação 3 ou 4.
6. Lipase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2 e 5, caracterizada pelo fato de compreender um grupo de substituições selecionadas das seguintes: D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T; N33Q+E210D+T231R+N233R; N33Q+D111A+T231R+N233R; N33Q+G91T+T231R+N233R; N33Q+E219D+T231R+N233R; N33Q+W117L+T231R+N233R; D27Q+N33Q+T231R+N233R; N33Q+G91T+T231R+N233R; D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; Q4R+N33Q+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+Q249R; N33Q+D96W+T231R+N233R; D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R; D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R; Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R; N33Q+D111E+T231R+N233R; N33Q+D122E+T231R+N233R; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; N33Q+D167E+T231R+N233R; N33Q+G91N+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G91 A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T; N11R+N33Q+T231R+N233R; N33Q+N39H+T231R+N233R; N33Q+P229R+T231R+N233R; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T; N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R; D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T; D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T; N33Q+E87A+T231R+N233R; N33Q+E56Q+T231R+N233R; N33Q+E210V+T231R+N233R; N33Q+E56K+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+D254G; N33Q+D96S+T231R+N233R; N33Q+D122N+T231R+N233R; N26A+N33Q+T231R+N233R; N33Q+N162T+T231R+N233R; N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R; N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+G240L; D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T; D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T; N33Q+N200S+T231R+N233R; N33Q+N39S+T231R+N233R; N33Q+E210R+T231R+N233R; N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R; N33Q+T231R+N233R+D254R; N33Q+N94R+T231R+N233R; N33Q+D96R+T231R+N233R; D27N+N33Q+T231R+N233R; D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R; N33Q+L227F+T231R+N233R; N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R; N33Q+G225P+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+D254S; N33Q+D96G+T231R+N233R; N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S; N33Q+T231R+N233R+D254G; N33Q+D130Η+Τ231R+N233R; N33Q+E87A+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+E239D; N33Q+D111Α+Τ231R+N233R+D254G; N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S; N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S; N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G; N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R; Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T; N33Q+G177Α+Τ231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+G246A; D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R; N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R; Κ98Ι+Τ231R+N233R+N251S; N33Q+G163R+T231R+N233R; N33Q+G163Ν+Τ231R+N233R; N33Q+G163C+T231R+N233R; N33Q+G163Q+T231R+N233R; N33Q+G163E+T231R+N233R; N33Q+G163H+T231R+N233R; N33Q+G163Ι+Τ231R+N233R; N33Q+G163P+T231R+N233R; N33Q+G163D+T231R+N233R; N33Q+G91Κ+Τ231R+N233R; N33Q+G91Μ+Τ231R+N233R; N33Q+G91F+T231R+N233R; N33Q+G91S+T231R+N233R; N33Q+G91W+T231R+N233R; N33Q+G91Y+T231R+N233R; N33Q+G163Τ+Τ231R+N233R; N33Q+G163W+T231R+N233R; N33Q+G163Υ+Τ231R+N233R; N33Q+G163V+T231R+N233R; N33Q+G91C+T231R+N233R; N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R; N33Q+G91M+G161Ε+Τ231R+N233R; N33Q+V128Α+Τ231R+N233R; N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R; N33Q+G38A+T231R+N233R; N33Q+G163A+T231R+N233R; N33Q+G91T+N94S+D111Α+Τ231R+N233R; N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R; N33Q+G163M+T231R+N233R; N33Q+G91V+T231R+N233R; N33Q+D111Α+Τ231R+N233R+Q249R; N33Q+D111Α+Τ231R+N233R+D254S; D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111Α+Τ231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111Α+Τ231R+N233R+D254G+P256T; N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S; N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R; N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S; N33Q+T231R+N233R+P256T; N33Q+T231R+N233R+D242E; N33Q+E87R+T231R+N233R; N33Q+E56R+T231R+N233R; N33Q+N162G+T231R+N233R; N33Q+G91L+T231R+N233R; N33Q+E87H+T231R+N233R; N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R; N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S; N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111Α+Τ231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+G163A+T231R+N233R; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+D254A; N33Q+T231R+N233R+D254N; N33Q+T231R+N233R+D254Q; N33Q+T231R+N233R+D254I; N33Q+T231R+N233R+D254L; N33Q+T231R+N233R+D254K; N33Q+T231R+N233R+D254M; N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R; D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R; N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R; D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R; D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R; N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R; D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R; N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R; D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R; D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R; N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R; D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+L227G+T231R+N233R+ D254S+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+ Ρ256Τ; N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S; N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S; N33Q+T231R+N233R+P256A; N33Q+T231R+N233R+P256N; N33Q+T231R+N233R+P256G; N33Q+T231R+N233R+P256H; N33Q+T231R+N233R+P256L; N33Q+T231R+N233R+P256M; N33Q+T231R+N233R+P256S; N33Q+T231R+N233R+P256W; N33Q+T231R+N233R+P256Y; N33Q+T231R+N233R+P256F; N33Q+T231R+N233R+P256V; N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R; N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R; N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R; N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R; N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R; N33Q+V176N+T231R+N233R; N33Q+V176D+T231R+N233R; N33Q+W117F+T231R+N233R; N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S; N33Q+V176I+T231R+N233R; N33Q+D111N+T231R+N233R; N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R; N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R; D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R; N33Q+G91M+G163P+T231R+N233R; N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R; 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Ν11L+N33Q+G91T+G163Κ+Τ231R+N233R+D254S; Ν11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; Ν11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; Ν11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+ Ρ256Τ; Ν11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256L; Ν11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S; N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S; Ν11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S; Ν11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S; N33Q+E87K+T231R+N233R; N33Q+N94K+T231R+N233R; N33Q+D96Y+T231R+N233R; N33Q+K98I+T231R+N233R; A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R; N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R; N26I+N33Q+T231R+N233R; A30T+N33Q+T231R+N233R; N33Q+G91V+T231R+N233R; N33Q+G91Α+Τ231R+N233R; N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R; N33Q+K98I+T231R+N233R; N33Q+L69I+G91Ε+Τ231R+N233R; P29T+N33Q+T231R+N233R; N33Q+G91V+T231R+N233R; N33Q+K98I+T231R+N233R; N33Q+G91Ε+Τ231R+N233R; N33Q+N94K+T231R+N233R; D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+T37K+N711+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+V168M+E210D+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+ Τ231R+N233R+P256T; Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+T231R+ N233R+P256T+L269H; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+R179T+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+V141E+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T; D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+ Τ231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111Α+Υ138F+G163R+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T; N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T; N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+ Ρ256Α; N33Q+G91T+D96E+K98T+T114Ι+Τ231R+N233R+G163S; N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R; N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A; D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R; D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T; N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R; N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R; N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T; D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+ Ρ256Τ; N33Q+G91T+Tl 14Ι+Ε210V+T231R+N233R+D254K+P256A; N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R; G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+V141E+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T; N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S; N33Q+G91T+K98I+G163Κ+Τ231R+N233R+D254S+P256L; N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L; G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+V141E+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T; and D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T.
7. Lipase, caracterizada pelo fato de que (a) tem pelo menos 50% de identidade com a seqüência de aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; (b) tem atividade lipase; e que (c) em comparação com a seqüência de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2, compreende uma substituição em pelo menos uma posição selecionada dentre as seguintes: 9, 30, 38, 39, 63, 112, 114, 115, 117, 122, 128, 130, 136, 154, 155, 156, 161, 163, 168, 185, 190, 239 e 246.
8. Lipase, caracterizada pelo fato de que (a) tem pelo menos 50% de identidade com a seqüência de aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; (b) tem atividade lipase; e a qual (c) em comparação com a seqüência de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição selecionada dentre as seguintes: EIN; Q4H; N8L,Q; Q9H; Nl 1C,D,H,L,P,S; G23E; D27I P29T; A30T,V; T37K,M; G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; N39H,S D57N; G61R; V63R; N71I,S; N73Q,Y; I76T; I86F,L; E87H G91 F,K,L,M,V,Y; N94Q; F95*; D96*; N101Q; Dl 11E; G112A; Tl 141 S115L; Wll7C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; D122E,N; Q126L; V128A 20 D130H, H135D, P136H; V141E,L; V154F,I,L; A155V; G156R; G161A,E N162G,S; G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; V168M; L185M G190C,D; R205I; G240L; G246A; N251Q,S; e L269F,H.
9. Lipase, caracterizada pelo fato de que (a) tem pelo menos 50% de identidade com a seqüência dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; e (b) tem atividade lipase; e a qual, (c) em comparação com a seqüência dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2, compreende um grupo de substituições selecionadas dentre as seguintes: D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T; N33Q+E210D+T231R+N233R; N33Q+D111A+T231R+N233R; N33Q+G91T+T231R+N233R; N33Q+E219D+T231R+N233R; N33Q+W117L+T231R+N233R; D27Q+N33Q+T231R+N233R; N33Q+G91T+T231R+N233R; D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; Q4R+N33Q+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+Q249R; N33Q+D96W+T231R+N233R; D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R; D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R; Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R; N33Q+D111E+T231R+N233R; N33Q+D122E+T231R+N233R; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; N33Q+D167E+T231R+N233R; N33Q+G91N+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T; N11R+N33Q+T231R+N233R; N33Q+N39H+T231R+N233R; N33Q+P229R+T231R+N233R; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T; N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R; D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T; D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T; N33Q+E87A+T231R+N233R; N33Q+E56Q+T231R+N233R; N33Q+E210V+T231R+N233R; N33Q+E56K+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+D254G; N33Q+D96S+T231R+N233R; N33Q+D122Ν+Τ231R+N233R; N26A+N33Q+T231R+N233R; N33Q+N162T+T231R+N233R; N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R; N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+G240L; D27R+N33Q+G91A+D96E+D111Α+Τ231R+N233R+D254G+P256T; D27R+N33Q+G91A+N94S+D111Α+Τ231R+N233R+P256T; N33Q+N200S+T231R+N233R; N33Q+N39S+T231R+N233R; N33Q+E210R+T231R+N233R; N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R; N33Q+T231R+N233R+D254R; N33Q+N94R+T231R+N233R; N33Q+D96R+T231R+N233R; D27N+N33Q+T231R+N233R; D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R; N33Q+L227F+T231R+N233R; N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R; N33Q+G225P+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+D254S; N33Q+D96G+T231R+N233R; N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S; N33Q+T231R+N233R+D254G; N33Q+D130Η+Τ231R+N233R; N33Q+E87A+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+E239D; N33Q+D111Α+Τ231R+N233R+D254G; N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S; N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S; N33Q+G91 T+G 163K+T231R+N233R+D254G; N33Q+G91T+G163Κ+Τ231R+N233R+D254S; N11R+N33Q+G91T+G163Κ+Τ231R+N233R+D254S; Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R; Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; N33Q+G91T+N94S+D111Α+Τ231R+N233R+P256T; N33Q+G177A+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+G246A; D27N+N33Q+G91T+G163Κ+Τ231R+N233R+D254S; D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R; N33Q+G91Τ+Ε219D+T231R+N233R; Κ98Ι+Τ231R+N233R+N251S; N33Q+G163R+T231R+N233R; N33Q+G163N+T231R+N233R; N33Q+G163C+T231R+N233R; N33Q+G163Q+T231R+N233R; N33Q+G163E+T231R+N233R; N33Q+G163H+T231R+N233R; N33Q+G163I+T231R+N233R; N33Q+G163P+T231R+N233R; N33Q+G163D+T231R+N233R; N33Q+G91Κ+Τ231R+N233R; N33Q+G91Μ+Τ231R+N233R; N33Q+G91F+T231R+N233R; N33Q+G91S+T231R+N233R; N33Q+G91W+T231R+N233R; N33Q+G91Υ+Τ231R+N233R; N33Q+G163T+T231R+N233R; N33Q+G163W+T231R+N233R; N33Q+G163Y+T231R+N233R; N33Q+G163V+T231R+N233R; N33Q+G91C+T231R+N233R; N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R; N33Q+G91M+G161Ε+Τ231R+N233R; N33Q+V128Α+Τ231R+N233R; N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R; N33Q+G38A+T231R+N233R; N33Q+G163A+T231R+N233R; N33Q+G91T+N94S+D111Α+Τ231R+N233R; N33Q+G38A+G163Α+Τ231R+N233R; N33Q+G163M+T231R+N233R; N33Q+G91V+T231R+N233R; N33Q+D111Α+Τ231R+N233R+Q249R; N33Q+D111Α+Τ231R+N233R+D254S; D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111Α+Τ231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111Α+Τ231R+N233R+D254G+P256T; N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S; N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R; N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S; N33Q+T231R+N233R+P256T; N33Q+T231R+N233R+D242E; N33Q+E87R+T231R+N233R; N33Q+E56R+T231R+N233R; N33Q+N162G+T231R+N233R; N33Q+G91L+T231R+N233R; N33Q+E87H+T231R+N233R; N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R; N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S; N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111Α+Τ231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+G163A+T231R+N233R; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111Α+Τ231R+N233R+D254S+P256T; N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R; N33Q+T231R+N233R+D254A; N33Q+T231R+N233R+D254N; N33Q+T231R+N233R+D254Q; N33Q+T231R+N233R+D254I; N33Q+T231R+N233R+D254L; N33Q+T231R+N233R+D254K; N33Q+T231R+N233R+D254M; N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R; D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R; N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R; D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R; D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R; N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R; D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R; N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R; D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R; D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R; N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R; D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+L227G+T231R+N233R+ D254S+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+ Ρ256Τ; N33Q+D111Α+Τ231R+N233R+D254S; N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S; N33Q+T231R+N233R+P256A; N33Q+T231R+N233R+P256N; N33Q+T231R+N233R+P256G; N33Q+T231R+N233R+P256H; N33Q+T231R+N233R+P256L; N33Q+T231R+N233R+P256M; N33Q+T231R+N233R+P256S; N33Q+T231R+N233R+P256W; N33Q+T231R+N233R+P256Y; N33Q+T231R+N233R+P256F; N33Q+T231R+N233R+P256V; N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R; N33Q+G91M+G163Τ+Τ231R+N233R; N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R; N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R; N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R; N33Q+V176Ν+Τ231R+N233R; N33Q+V176D+T231R+N233R; N33Q+W117F+T231R+N233R; N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S; N33Q+V176Ι+Τ231R+N233R; 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N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R; N33Q+I86F+L93F+D102Υ+Ε210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F+ L269F; N33Q+I86F+L93F+D102Υ+Ε210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F; N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; N11L+N33Q+G91T+G163Κ+Τ231R+N233R+D254S; N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+ P256T; N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256L; N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S; N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S; N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S; N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S; N33Q+E87K+T231R+N233R; N33Q+N94K+T231R+N233R; N33Q+D96Y+T231R+N233R; N33Q+K98I+T231R+N233R; A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R; N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R; N26I+N33Q+T231R+N233R; A30T+N33Q+T231R+N233R; N33Q+G91V+T231R+N233R; N33Q+G91A+T231R+N233R; N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R; 32 N33Q+K98I+T231R+N233R; N33Q+L69I+G91Ε+Τ231R+N233R; P29T+N33Q+T231R+N233R; N33Q+G91V+T231R+N233R; N33Q+K98I+T231R+N233R; N33Q+G91Ε+Τ231R+N233R; N33Q+N94K+T231R+N233R; D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111Α+Ν162S+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+T37K+N711+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+V168M+E210D+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+ Τ231R+N233R+P256T; Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ Ρ256Τ; D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+T231R+ N233R+P256T+L269H; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+R179T+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T; D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+V141E+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T; D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+ 33 Τ231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+ Τ231R+N233R+P256T; N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+ Τ231R+N233R+P256T; N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+ Ρ256Α; N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S; N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R; N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A; D27R+N33Q+G91Τ+Τ114I+G163W+E210D+T231R+N233R; D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T; N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R; N33Q+G38W+G91T+T114I+G163Κ+Ε210V+T231R+N233R; N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T; D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+ Ρ256Τ; N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A; N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R; G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+V141E+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T; N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S; N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L; N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L; G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111Α+Τ114I+V141E+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T; and D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T.
10. Lipase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2 e 5-6, caracterizada pelo fato de, em combinação com uma protease ou uma amilase, ser usada como medicamento.
11. Lipase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2 e 5-6, caracterizada pelo fato de, em combinação com uma protease e uma amilase, ser usada como medicamento.
12. Lipase em combinação com uma protease e/ou uma amilase de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que (i) a protease tem pelo menos 70% de identidade com uma protease selecionada do grupo consistindo de a) uma protease com a seqüência dos aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 3, b) uma protease com a seqüência dos aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 4, e c) uma protease com a seqüência dos aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 5; (ii) a amilase tem pelo menos 70% de identidade com uma amilase selecionada do grupo consistindo de a) uma amilase com a seqüência de aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 6, b) uma amilase com a seqüência de aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 7, e c) uma amilase com a seqüência de aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 8.
13. Uso de uma lipase ou de uma mistura de lipases, como definida em qualquer uma das reivindicações 1-2 e 5-6, caracterizado pelo fato de ser para a produção de um medicamento para o tratamento de distúrbios digestivos, insuficiência exócrina pancreática, pancreatite, fibrose cística, diabetes tipo I e/ou diabetes tipo II.
14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender o uso de uma protease ou de uma amilase.
15. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender o uso de uma protease e de uma amilase.
16. Uso de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a protease e/ou amilase são conforme definidas na reivindicação 12.
17. Lipase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2 e 5-6, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de distúrbios digestivos, insuficiência exócrina pancreática, pancreatite, fibrose cística, diabetes tipo I e/ou diabetes tipo II.
18. Lipase de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de ser em combinação com uma protease ou uma amilase.
19. Lipase de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de ser em combinação com uma protease e uma amilase.
20. Lipase de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que a protease e/ou amilase são como definidas na reivindicação 12.
21. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender uma lipase ou uma mistura de lipases, como definida em qualquer uma das reivindicações 1-2 e 5-6, juntamente com pelo menos um material adjuvante farmaceuticamente aceitável.
22. Composição de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de compreender ainda uma protease ou uma amilase.
23. Composição de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de compreender ainda uma protease e uma amilase.
24. Composição de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada pelo fato de que a protease e/ou amilase são como definida na reivindicação 12.
25. Método para o tratamento de doença, dita doença sendo distúrbios digestivos, insuficiência exócrina pancreática, pancreatite, fibrose cística, diabetes tipo I e/ou diabetes tipo II, caracterizado pelo fato de ser pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma lipase ou mistura de lipases como definida em qualquer uma das reivindicações 1-2 e 5-6.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de compreender ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma protease ou de uma amilase.
27. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de compreender ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma protease e de uma amilase.
28. Método de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que a protease e/ou amilase são como definida na reivindicação 12.
29. Lipase, caracterizada pelo fato de ser para uso como medicamento, em que a lipase é uma variante de uma lipase originária, cuja variante (a) tem pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; e (b) tem atividade lipase; e (c) compreende pelo menos uma substituição selecionada dentre as seguintes substituições: N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56C, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, V60L, L69I, E87K, G91A, G91E, G91N, G91 R, G91S, G91T, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, N94S, D96E, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M. L97Q, K98I, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, Dl 11 A, Dl 11S, Tl 141, L147S, G163K, E210D, S216P, L227G, T231 R, N233R, D234K, E239V, Q249R, N251S, D254N, P256T, G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A e L269N, em que cada posição corresponde a uma posição dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; e (d) com a condição de que a variante não é (i) a lipase com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 1, e não (ii) a variante N33Q da lipase de (i).
30. Lipase, caracterizada pelo fato de ser para uso como medicamento, em que a lipase é uma variante de uma lipase originária, cuja variante (a) tem pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; e (b) tem atividade lipase; e (c) compreende pelo menos uma substituição em pelo menos uma das posições 30, 42, 114 e/ou 163, em que cada posição corresponde a uma posição dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2.
31. Lipase, caracterizada pelo fato de ser para uso como medicamento, em que a lipase é uma variante de uma lipase originária, cuja variante (a) tem pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; e (b) tem atividade lipase; e (c) compreende pelo menos uma substituição selecionada dentre as seguintes substituições: A30T, A30V, P42L, Tl 141 e G163K, em que cada posição corresponde a uma posição dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2.
32. Lipase, caracterizada pelo fato de ser para uso como medicamento, em que a lipase é uma variante de uma lipase originária, cuja variante (a) tem pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2; e (b) tem atividade lipase; e (c) é selecionada dentre as seguintes variantes: LV1232 G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N; LV1330 N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R; LVl 855 D2 7R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T; LVl 857 D27R+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T; LV1865 D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T; LV1874 D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T; LV1889 D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P25 6T; LVA049 N33Q+G163K+T231R+N233R; LVAR0002b T32I+G91V+T231R+N233R; LVAR0003 K98I+T231R+N233R; LVAROO 11a G91A+T231R+N233 R; LVAROO13 G91V+T231R+N233 R; LVAROO 14 N33 Y+G91W+N94K+T231R+N233R; LVAROO 15 P42L+D5 7N+G91E+T231R+N233R; LVAROO 16 K98I+T231R+N233R; LVAROO 17 V60L+G91V+T231R+N233R; LVAR0032 D57G+L93F+T231R+N233R; LVAR0045 A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R; LVAR0046 E99T+T114I+D254N+T231R+N233R; LVAR0047 D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R; LVAR0048 E43K+E56S+E87K+T231R+N233R; LVAR0050 E56S+E87K+D96L+E99D+T231R+N233R; LVAR0051 E56A+D57A+T114I+T231R+N233R; LVAR0052 G91E+T231R+N233R; LVAR0053 E56K+D96G+D111A+T231R+N233R; LVAR0054 E87K+D111S+T231R+N233R; LVAR0055 E43V+G91R+T231R+N233R; LVAR0056 E56S+E87K+T231R+N233R; LVAR0057 E87K+G91E+T231R+N233R; LVAR0058 D27Y+E87K+T231R+N233R; LVAR0059 E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R; LVAR0061 E56K+E87K+D111A+T231R+N233R; LVAR0062 E87K+E99P+T231R+N233R; LVAR0063 E87K+D96L+E99P+T231R+N233R; LVAR0064 E56C+E87K+T231R+N233R; LVAR0065 E56R+E87K+D96L+T231R+N233R; LVAR0066 E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R; LVAR0067 E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R; LVAR0068 E87K+L147S+T231R+N233R; LVAR0069 D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R; LVAR0070 E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R; LVAR0071 E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R; LVAR0072 D96V+D111A+T231R+N233R; and LVAR0078 N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R.
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Free format text: REFERENTE AO NAO RECOLHIMENTO DAS 5A E 6A ANUIDADES.

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Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2602 DE 17-11-2020 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.