CN101743308A - 用于药物用途的脂肪酶变体 - Google Patents

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Abstract

与包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的细毛嗜热霉(疏棉状腐质霉)脂肪酶相关的脂肪酶的药物用途，所述脂肪酶任选地与蛋白酶和/或淀粉酶组合。医学适应症的实例是：治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全(PEI)、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。本发明的脂肪酶具有，例如，改进的体外消化性能，在中性范围pH下改进的活性，在低pH下改进的稳定性，针对蛋白酶降解是稳定的，和/或在胃蛋白酶和胆汁盐存在下是稳定的。本发明还涉及测定脂肪酶体外消化性能的方法，以及细毛嗜热霉的脂肪酶的某些新变体。

Description

用于药物用途的脂肪酶变体
对序列表的涉及
本申请还有计算机可读形式的序列表。将所述计算机可读形式通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用作药物的脂肪酶，所述脂肪酶(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列具有至少50％同一性；(b)具有脂肪酶活性；并且其(c)如与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列相比，包含取代N33Q、T231R和N233R，以及选自下列的至少一个额外的取代：E1*，D，N；Q4H，P，R；D5E；N8L，Q；Q9H；F10L；N11C，D，H，L，P，Q，R，S；G23E；N26A，H，I；D27I，N，Q，R，S，V；P29T；A30T，V；T37K，M；G38A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；N39H，S；E43K；K46M；A49T；L52I，R；E56K，Q，R，S；D57G，N；V60E，S；G61R；V63R；A68V；L69I；N71I，S；N73Q，Y；I76T；R84E；I86F，L；E87A，H，K，R；I90L，V；G91A，C，E，F，K，L，M，N，S，T，V，W，Y；L93*，F；N94*，K，Q，R，S；F95*；D96*，E，G，N，R，S，W，Y；L97M，Q；K98I，T；E99D；N101Q；D 102E，G，Y；R108M；G109A；D111A，E，N，S；G112A；T114I；S115L；W117C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y；D122E，N；Q126L；V128A；D130H；H135D；P136H；Y138F；V141E，L；A150V；V154F，I，L；A155V；G156R；G161A，E；N162G，S，T；G163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；D167E；V168M；V176A，D，F，G，H，I，K，M，N，Q，T，W；G177A；R179T；L185M；G190C，D；N200Q，S；R205I；L206F；E210D，R，V，Y；S216P；E219D；G225P；T226N；L227F，G；P229R；E239D；G240L；D242E；T244S；G246A；Q249R；N251Q，S；D254A，G，I，K，L，M，N，R，Q，S，Y；I255A，F；P256A，F，G，H，I，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y；和L269F，H。
本发明还涉及包含这些脂肪酶的药物组合物，同样也涉及这些脂肪酶中的一些。
本发明还涉及测定，和任选地比较，多种脂肪酶在体外的消化性能的方法。
本发明的脂肪酶可以与蛋白酶和/或淀粉酶组合使用。医学适应症的实例是：治疗消化性病症(digestive disorder)、胰腺外分泌机能不全(pancreaticexocrine insufficiency)(PEI)、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。
SEQ ID NO：2的脂肪酶是源自疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)DSM4109(同物异名：细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus))的野生型脂肪酶。
背景技术
美国专利No.5,614,189(EP 600868 B1)描述了，但不限于(i.a.)，使用源自疏棉状腐质霉的脂肪酶在胰酶替代疗法中的用途，例如在对患有囊性纤维化的患者的治疗中。这种脂肪酶来自疏棉状腐质霉DSM 4109并且具有SEQID NO：2的氨基酸1-269的氨基酸序列。
WO 92/05249、WO 92/19726、WO 94/25577、WO 95/09909、WO95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 99/42566、WO 00/32758、WO00/60063、WO 01/83559、WO 01/83559、WO 2002/055679、WO 2002/062973、WO 2002/062973、WO 2004/099400和WO 2004/111216描述了SEQ ID NO：2的多种变体，但是未描述它们的药物用途。
WO 2006/136159描述了具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的脂肪酶的药物用途，以及它的变体N33Q。
本领域存在对用于药物用途的改进的脂肪酶的需求。
发明内容
本发明提供用于药物用途的改进的脂肪酶。优选地，用于根据本发明的用途的酶在体内和/或体外具有改进的效能(efficacy)；改进的活性；改进的稳定性；针对蛋白酶的降解是稳定的；在胆汁盐存在下是稳定的；和/或具有降低的变应原性。更优选地，如与参照脂肪酶相比本发明的脂肪酶具有改进的体外消化性能，所述参照脂肪酶具有SEQ ID NO：2和以下取代：N33Q+T231R+N233R。
本发明涉及用作药物的脂肪酶，所述脂肪酶(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列具有至少50％同一性；(b)具有脂肪酶活性；并且其(c)如与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列相比，包含取代N33Q、T231R和N233R，以及选自下列的至少一个额外的取代：E1*，D，N；Q4H，P，R；D5E；N8L，Q；Q9H；F10L；N11C，D，H，L，P，Q，R，S；G23E；N26A，H，I；D27I，N，Q，R，S，V；P29T；A30T，V；T37K，M；G38A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；N39H，S；E43K；K46M；A49T；L52I，R；E56K，Q，R，S；D57G，N；V60E，S；G61R；V63R；A68V；L69I；N71I，S；N73Q，Y；I76T；R84E；I86F，L；E87A，H，K，R；I90L，V；G91A，C，E，F，K，L，M，N，S，T，V，W，Y；L93*，F；N94*，K，Q，R，S  ；F95*；D96*，E，G，N，R，S，W，Y；L97M，Q；K98I，T；E99D；N101Q；D102E，G，Y；R108M；G109A；D111A，E，N，S；G112A；T114I；S115L；W117C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y；D122E，N；Q126L；V128A；D130H；H135D；P136H；Y138F；V141E，L；A150V；V154F，I，L；A155V；G156R；G161A，E；N162G，S，T；G163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；D167E；V168M；V176A，D，F，G，H，I，K，M，N，Q，T，W；G177A；R179T；L185M；G190C，D；N200Q，S；R205I；L206F；E210D，R，V，Y；S216P；E219D；G225P；T226N；L227F，G；P229R；E239D；G240L；D242E；T244S；G246A；Q249R；N251Q，S；D254A，G，I，K，L，M，N，R，Q，S，Y；I255A，F；P256A，F，G，H，I，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y；和L269F，H。
本发明进一步涉及使用这样的脂肪酶用于制备药物的用途，所述药物用于治疗消化性病症、PEI、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病，这些用途任选地还包括使用蛋白酶和/或淀粉酶；以及在对这些状况的治疗中使用的这样的脂肪酶，任选地与蛋白酶和/或淀粉酶组合。
本发明还涉及药物组合物，其包含这样的脂肪酶，加上至少一种可药用的辅助材料，任选地包括蛋白酶和/或淀粉酶。
本发明还涉及用于治疗消化性病症、PEI、胰腺炎(急性和/或慢性的)、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法，其通过施用治疗有效量的这样的脂肪酶，任选地与蛋白酶和/或淀粉酶一起施用。
最后，本发明涉及用于测定，和任选地比较，脂肪酶体外消化性能的方法；以及某些脂肪酶本身，例如：
脂肪酶，其(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少50％同一性；(b)具有脂肪酶活性；并且其，(c)如与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列相比，包含在选自下列的至少一个位置的取代：9、30、38、39、63、112、114、115、117、122、128、130、136、154、155、156、161、163、168、185、190、239和246；和
脂肪酶，其(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列具有至少50％同一性；(b)具有脂肪酶活性；并且其
(c1)如与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列相比，包含选自下列的至少一个取代：E1N；Q4H；N8L，Q；Q9H；N11C，D，H，L，P，S；G23E；D27I；P29T；A30T，V；T37K，M；G38A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，Y；N39H，S；D57N；G61R；V63R；N71I，S；N73Q，Y；I76T；I86F，L；E87H；G91F，K，L，M，V，Y；N94Q；F95*；D96*；N101Q；D111E；G112A；T114I；S115L；W117C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y；D122E，N；Q126L；V128A，D130H，H135D，P136H；V141E，L；V154F，I，L；A155V；G156R；G161A，E；N162G，S；G163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；V168M；L185M；G190C，D；R205I；G240L；G246A；N251Q，S；和L269F，H；或其，
(c2)如与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列相比，包含以下在指定位置的氨基酸中的至少一个：1N；4H；8L，Q；9H；11C，D，H，L，P，S；23E；27I；29T；30T，V；37K，M；38A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；39H，S；57N；61R；63R；71I，S；73Q，Y；76T；86F，L；87H；91F，K，L，M，V，Y；94Q；95*；96*；101Q；111E；112A；114I；115L；117C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y；122E，N；126L；128A，130H，135D，136H；141E，L；154F，I，L；155V；156R；161A，E；162G，S；163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；168M；185M；190C，D；205I；240L；246A；251Q，S；和269F，H。
发明详述
脂肪酶
脂肪酶是具有脂肪酶活性的多肽。在下文中，将本发明的组合物、方法和用途中使用的脂肪酶称作本发明的脂肪酶。本发明的脂肪酶可以是羧酸酯水解酶EC 3.1.1.-，其包括活性如EC 3.1.1.3三酰甘油脂肪酶、EC 3.1.1.4磷脂酶A2、EC 3.1.1.5溶血磷脂酶、EC 3.1.1.26半乳糖酯酶(galactolipase)、EC3.1.1.32磷脂酶A1、EC 3.1.1.73阿魏酸酯酶。在具体实施方案中，脂肪酶是EC 3.1.1.3三酰甘油脂肪酶。在另一具体的实施方案中，脂肪酶具有EC3.1.1.4磷脂酶A2活性，即，催化反应：磷脂酰胆碱+H(2)O＝1-酰基甘油磷酸胆碱(1-acylglycerophosphocholine)+羧酸(去除2-位附接的脂肪酸)。在更进一步的具体实施方案中，脂肪酶具有EC 3.1.1.32磷脂酶A1活性，即，催化反应：磷脂酰胆碱+H(2)O＝2-酰基甘油磷酸胆碱+羧酸。
EC号引用NC-IUBMB，Academic Press，San Diego，California的EnzymeNomenclature 1992，包括分别在Eur.J.Biochem.，1994，223：1-5；Eur.J.Biochem.，1995，232：1-6；Eur.J.Biochem.，1996，237：1-5；Eur.J.Biochem.，1997，250：1-6；和Eur.J.Biochem.，1999，264：610-650中出版的增补1-5。命名法经常性地补充和更新；参见，例如，在www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html的万维网(World Wide Web)。
本发明的脂肪酶可以是亲本脂肪酶的变体。
变体
术语变体在本文定义为如与亲本脂肪酶相比，在多肽中的一个或多个特定位置包含一个或多个变化，例如取代、插入、缺失和/或截短一个或多个特定氨基酸残基的脂肪酶。
亲本脂肪酶
术语亲本脂肪酶是指变体与其进行比较和比对的多肽。亲本脂肪酶的具体实例是对其进行修饰以生成本发明的脂肪酶变体的脂肪酶，所述修饰例如，取代、插入、缺失和/或截短。亲本可以是天然存在的(野生型)脂肪酶，或者它可以是通过任何合适手段制备的天然存在的(野生型)脂肪酶的变体。亲本也可以是等位变体(allelic variant)，其是由占据相同染色体基因座的基因的两种或两种以上可选形式中的任一所编码的多肽。
在具体实施方案中，亲本脂肪酶是真菌脂肪酶，其具有与SEQ ID NO：2中所示细毛嗜热霉脂肪酶的氨基酸1-269的序列具有至少50％同一性的氨基酸序列。亲本脂肪酶可以是酵母脂肪酶，例如，念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或，更优选地，丝状真菌脂肪酶，例如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、网孢菌属(Filobasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃弧菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)脂肪酶，或这些中任一的变体。优选的亲本脂肪酶是子囊菌类(ascomycete)脂肪酶，优选源自腐质霉属、篮状菌属或嗜热霉属(Thermomyces)的菌株，例如，源自棕黑腐质霉(Humicola fuscoatra)、灰腐质霉(Humicolagrisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、藤黄腐质霉(Humicola lutea)、黑腐质霉(Humicola nigrescens)、腐质霉属菌种(Humicola sp.)、疏棉状腐质霉(细毛嗜热霉)、Thermomyces ibadanensis、Thermomyces verrucosus、嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)或Talaromyces byssochlamydoides的菌株，或任何这些的变体。在具体实施方案中，亲本脂肪酶是(i)具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的疏棉状腐质霉脂肪酶，或(ii)它的变体。
脂肪酶变体的命名法
在本发明中，采用了一种脂肪酶变体中氨基酸残基位置的具体编号方式。通过比对已知脂肪酶的氨基酸序列，能够为任何脂肪酶中的任何氨基酸残基指定氨基酸位置号。
使用源自SEQ ID NO：2中公开的脂肪酶的氨基酸序列的编号系统，与另一脂肪酶的氨基酸序列使用本文公开的比对方法比对，可以指明任何其它脂肪酶中的每个氨基酸残基的位置。因此，对于与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列相比的本发明的任何脂肪酶，每个位置和/或取代对应于SEQ IDNO：2的氨基酸1-269的位置。
在对本发明的多种脂肪酶变体的描述中，为了便于参考采用下文描述的命名法。在所有情况下，使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸，位置，取代氨基酸。因此，在位置26用异亮氨酸取代天冬酰胺指定为N26I。多重突变用加号(+)分开，例如，N33Q+E210D+T231R+N233R代表在位置33、210、231和233分别用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，用精氨酸(R)取代苏氨酸(T)，和用精氨酸(R)取代天冬酰胺(N)。
对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸，位置，*。因此，将位置1谷氨酸(E)的缺失指定为“E1*”。多重缺失用加号(“+”)分开，例如，将在位置93、94、95和96分别缺失亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)、苯丙氨酸(F)和天冬氨酸(D)指定为″L93*+N94*+F95*+D96*″。
因此，就本文而言，事实上可以将缺失认作取代的特例(example)，即用没有氨基酸取代原始氨基酸。因此SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶的以下变体可以说包括总共11个取代：7个取代成另一种氨基酸，且4个取代成没有氨基酸，即，4个缺失：D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T。
因此，当用特定氨基酸可以用两种或更多种不同的氨基酸取代或被缺失时，将这称为取代，其中用逗号分隔包括缺失在内的可选的取代者。例如，指定为″E1*，D，N″是指亲本脂肪酶中的位置1(E1)可以用没有氨基酸(即，缺失)(*)取代，用天冬氨酸(D)取代，或用天冬酰胺取代(N)。
比对和同一性计算
这节适用于本发明的脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶(本发明的酶)。
两个氨基酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列的比对是通过来自EMBOSS程序包(http://emboss.org)版本2.8.0的Needle程序测定的。Needle程序执行Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453描述的全局比对算法。使用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口产生罚分(gap opening penalty)是10，且缺口延伸罚分(gap extension penalty)是0.5。
将本发明的氨基酸序列(“发明序列”；例如具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列及以下四个取代的变体LVA023：N33Q+E210D+T231R+N233R)和不同氨基酸序列(“外来序列”；例如SEQ ID NO：2的氨基酸1-269)之间的同一性程度作为两个序列的比对中的精确匹配数除以“发明序列”的长度或“外来序列”的长度中最短者来计算。结果表示为百分比同一性。
当“发明序列”和“外来序列”在重叠(在下文的比对实例中，将这用“|”表示)的相同位置中具有相同的氨基酸残基时，发生精确匹配。序列的长度是序列中的氨基酸残基数(例如SEQ ID NO：2的长度是269)。
在以下纯假设性的比对实例中，重叠是序列1的氨基酸序列“HTWGER-NL”；或序列2的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在所述实例中，缺口用“-”指出。
假设性比对实例：
序列1：ACMSHTWGER-NL
           | |||  ||
序列2：    HGWGEDANLAMNPS
因此，序列1与序列2的同一性百分比是6/12＝0.5，相当于50％。
在具体实施方案中，多肽的氨基酸序列与或相对于SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的同一性百分比如下测定：i)使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵、缺口产生罚分为10且缺口延伸罚分为0.5比对两个氨基酸序列；ii)计数比对中的精确匹配数；iii)用精确匹配数除以两个氨基酸序列中最短者的长度，和iv)将iii)的除法的结果转化成百分比。
在优选的实施方案中，本发明的脂肪酶与具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶是至少51％相同的。在另外的优选实施方案中，本发明的脂肪酶与具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶是至少52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或至少60％相同的。在另外的优选实施方案中，同一性的百分比是至少61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或至少70％。在进一步优选的实施方案中，同一性的百分比是至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或至少80％。在另外的优选实施方案中，同一性的百分比是至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或至少90％。在另外的更优选的实施方案中，同一性的百分比是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
在另一优选的实施方案中，亲本脂肪酶与具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶至少51％相同。在另外的优选实施方案中，亲本脂肪酶与具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶是至少52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同的。
改进的性质
本发明提供改进的脂肪酶用于药物用途。优选地，用于根据本发明的用途的酶具有改进的体内和/或体外效能；改进的活性；改进的稳定性；针对蛋白酶的降解是稳定的；在胆汁盐存在下是稳定的；和/或具有降低的变应原性。
本发明的脂肪酶优选是纯化的，更优选纯化至均质(homogeneity)，例如，如WO 2006/136159的实施例5中所述。纯化的脂肪酶制备物可以通过SDS-PAGE分析，并且脂肪酶可以作为30-40kDa处的主要蛋白质条带来鉴定。通过对考马斯染色的SDS-PAGE凝胶的密度计扫描，这种条带优选构成蛋白质谱的90-97％。光密度计是例如BIO-RAD的GS-800校准光密度计。
本发明的脂肪酶如与参照脂肪酶相比具有改进的消化性能，优选具有改进的体外消化性能。
消化性能优选如下测定，使用(I)消化模型，(II)通过在胃蛋白酶存在下在pH 3测定稳定性，和/或(III)通过在胆汁盐存在下在pH 5测定活性。
对于在下文进一步讨论的方法(I)、(II)和(III)中的每一种，SEQ ID NO：2的脂肪酶变体N33Q+T231R+N233R是参照脂肪酶的优选实例(WO2006/136159中公开的)。参照脂肪酶的其它实例是：SEQ ID NO：1的脂肪酶(SEQ ID NO：2的N33Q+T231R)，和SEQ ID NO：2的脂肪酶。参照脂肪酶的更进一步的实例是SEQ ID NO：1的氨基酸+1至+269的脂肪酶及其变体N33Q的均值(average)。
消化模型(I)代表一种测定消化性能的新方法，其包括以下步骤：
a)选择参照脂肪酶；
b)混合100体积份的饮食和20体积份的胃蛋白酶和分别为30体积份的脂肪酶或参照脂肪酶；
c)加入i)0或ii)10体积份的缓冲液(0.8M MES，0.8M乙酸钠，0.8M咪唑，pH 7.0)，其中步骤i)可以称作pH 3的胃步骤(gastric step)，而步骤ii)可以称作pH 5的胃步骤；
d)在37℃伴随振荡温育1小时；
e)加入20体积份的胆汁盐，以及i)25或ii)15体积份的缓冲液(0.8MMES，0.8M乙酸钠，0.8M咪唑，pH 7.0)，其中步骤i)对应于pH 3的胃步骤，而步骤ii)对应于pH 5的胃步骤；
f)在37℃伴随搅拌温育2小时；
g)加入50体积份的1M磷酸中的10％Triton-X100；
h)测定游离脂肪酸的量；
i)将剂量响应曲线拟合成方程式：
FFA＝FFAmax*[E]/([E]+K)
其中FFA是释放的游离脂肪酸的量，FFAmax是脂肪酶能够从所述饮食中释放的游离脂肪酸的最大量，[E]是脂肪酶浓度，且K是释放一半FFAmax的脂肪酶浓度；和
j)如下计算改进因子(improvement factor)(IF)：
IF＝K(参照)/K(脂肪酶)，
其中K(参照)是释放一半FFAmax的参照脂肪酶的浓度，而K(脂肪酶)是释放一半FFAmax的所述脂肪酶浓度。
消化性能还可以通过上文(II)所涉及的新型胃蛋白酶稳定性测试在pH 3测定，所述方法包括以下步骤：
i)选择参照脂肪酶；
ii)将5体积份的所述脂肪酶或参照脂肪酶分别与5体积份的下列项混合：
a)含有0.01％Triton-X100和10mM NaCl的稀释剂，或
b)胃蛋白酶处理溶液，含有150ug/mL胃蛋白酶，4mM CaCl2，0.01％Triton-X100，和50mM柠檬酸盐，pH 3.0，
其中a)称为未处理样品，且b)称为经胃蛋白酶处理的样品；
iii)在20℃将步骤ii)的样品温育3小时；
iv)向步骤iii)的每个样品加入55体积份的底物，所述底物含有1mMPNP-棕榈酸盐(PNP-palmitate)，1.2％Triton-X100，4mM CaCl2，100mM TRIS，pH 8.0，以及
a)5体积份的胃蛋白酶处理溶液，或
b)5体积份的稀释剂
其中a)涉及未处理的样品，且b)涉及经胃蛋白酶处理的样品；
v)通过不时地(at intervals)读取iv)的样品的OD405来追踪底物的降解；
vi)从v)收集落入线性范围的数据并且分别计算经胃蛋白酶处理的样品和未处理的样品的脂肪酶活性，以mOD(毫OD)每小时为单位；
vii)通过如下计算％残余脂肪酶活性(％RA)：按照从步骤vi)获得的，用经胃蛋白酶处理的样品的脂肪酶活性除以未处理的样品的脂肪酶活性，再将结果乘以100；并且，如果期望，
viii)将所述脂肪酶的％RA与参照脂肪酶的％RA进行比较。
消化性能也可以通过上文称作(III)的新型胆汁盐活性测试在pH 5测定，所述方法包括以下步骤：
i)选择参照脂肪酶；
ii)将10体积份的脂肪酶或参照酶分别与23体积份的a)水，或b)20mM胆汁盐混合，其中a)称作未处理的样品，且b)称作胆汁盐样品；
iii)向ii)的每个样品加入200体积份的底物，所述底物含有25mM琥珀酸盐，2mM CaCl2，1.2％ Triton-X100，pH 5.0中的1mM PNP-油酸盐(PNP-Oleate)，并混合；
iv)步骤iii)之后立即从每个样品取出60体积份的所得混合物，并且将它以4个15体积份转移至四个单独的区室；
v)在1、2、3和4小时之后，向iv)的四个区室的各区室分别加入60体积份的100mM TRIS，pH 8.0，立即读取OD405，并且，基于1，2，3和4小时读数的线性范围，以mOD/小时计算活性；
vi)对于所述脂肪酶以及参照脂肪酶，用步骤v)中获得的胆汁盐样品的活性除以同样在步骤v)中获得的未处理样品的活性，以分别得到所述脂肪酶和参照脂肪酶的胆汁盐稳定性比；和
vii)用所述脂肪酶的胆汁盐稳定性比除以参照脂肪酶的胆汁盐稳定性比，所得比例可以定义为所述脂肪酶的改进因子。
已经发现方法(I)、(II)和(III)令人惊讶地鉴定了改进的脂肪酶，其中的大部分在体内也可能是改进的。
方法(I)
消化模型(上文称作(I))模仿患有胰腺外分泌机能不全的单胃动物(诸如，例如，猪和人)中的消化。
Triton X-100(C14H22O(C2H4O)n)(CAS No.9002-93-1)是非离子表面活性剂，其具有亲水的聚环氧乙烷基团(其平均具有9.5个环氧乙烷单元，即，n＝9-10)和烃类亲脂或疏水基团。烃基是4-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基。
术语“体积份”优选是指微升，其可以缩写为ul、uL、μl或μL。
在体外消化模型的具体实施方案中，(a)胃蛋白酶浓度是700mg/ml；(b)所述脂肪酶和/或参照脂肪酶以4种不同的浓度进行分析，每种优选一式两份；和/或(c)反应在微量滴定板的孔中进行。
在体外消化模型的另外的具体实施方案中，(d)胆汁盐的浓度是50g/l；(e)在步骤e)中加入胆汁盐和缓冲液之后所得的pH在5.7-6.0的范围内；和/或(f)当在步骤g)中添加时，Triton-X100提供用于终止反应。
在体外消化模型的更进一步的具体实施方案中，(g)游离脂肪酸的量是在适当稀释之后测定的，例如稀释125-250倍，优选在1％Triton-X100中，并且优选使用Wako Chemicals的NEFA C试剂盒测定，其在实施例3)中描述；(h)步骤i)中的剂量响应曲线是指表示响应的曲线，即游离脂肪酸的量作为脂肪酶剂量的函数；和/或(i)假设脂肪酶的FFAmax相同，即，参照脂肪酶和所述的脂肪酶的FFAmax相同。
在体外消化模型的另外的具体实施方案中，(j)使用活性位点滴定(AST，实施例6)测定脂肪酶浓度；和/或(k)使用A280测定脂肪酶浓度，优选使用消光系数1.24A280/mg。
改进的脂肪酶定义为具有1.00以上的改进因子的脂肪酶。在具体实施方案中，(i)改进因子是平均改进因子；(ii)改进因子是平均改进因子减去标准差；和/或(iii)改进因子在1.0以上，或在1以上。平均值和标准差将实验偏差(experimental variation)考虑在内，并且可以如本领域已知的来计算，例如标准差＝(Sum(IF-Avg(IF))/(n-1))^0.5，其中IF是改进因子，Avg(IF)是计算的改进因子的平均值，且n是计算的改进因子的个数。倒写的v是指指数。
体外消化模型的饮食优选含有250-400g脂肪/kg，更优选300-350g脂肪/kg，最优选313-340g脂肪/kg。碳水化合物和蛋白质的含量不是关键，但是优选该含量可反映常规和典型的饮食需求和建议，例如250-500g/kg的碳水化合物含量，和10-200g/kg的蛋白质含量。所述饮食可以选自，例如，饮食I(340g脂肪/kg，450g碳水化合物/kg，20g蛋白质/kg)，或饮食II(313g脂肪/kg，358g碳水化合物/kg，和146g蛋白质/kg)。
饮食I含有247.2重量份的牛乳(1.5％脂肪)，29.9重量份的橄榄油，87重量份的Calshake(可从Fresenius Kabi以商业方法获得，并且具有2077kJ/g的含能量(energy content)，4.3g乳蛋白/100g的蛋白质含量，和24.4g脂肪/100g的脂肪含量)，和9.9重量份的g Methocel(食用级，E5 Premium LV FG(E464)；Dow)。将成分混合，例如使用UltraTurrex(YellowLine DI 25基础型)混合2分钟。任选地，将饮食在50℃用0.5ug/ml的SAVINASE 16.0LEX蛋白酶(可从Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark以商业方法获得)在pH 8.0处理4小时以降低粘性。然后通过降低pH至3并且在70℃温育30分钟，或在50℃温育60分钟来使所述蛋白酶失活。术语“重量份”优选是指克(g)。
饮食II含有，优选其组成为，73g/kg(湿重)禽类餐食(poultry meal)(Altromin)，73g/kg豌豆粉(pea meal)，73g/kg酪蛋白(在酸性条件下沉淀，来自Altromin)，290g/kg小麦面粉，290g/kg马铃薯淀粉，125g/kg猪油，76g/kg维生素、矿物质和痕量元素，以及375g/kg牛奶油(cow′s cream)(33％脂肪)。
方法(II)
以下是通过测量在胃蛋白酶存在下于pH 3的稳定性来测定消化性能的方法的具体实施方案，所述方法在上文称作(II)：
(a)步骤ii)中使用的脂肪酶是培养物上清液，优选如下制备：将能够表达所述脂肪酶的酵母单菌落，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)JG169(参见例如，美国专利No.7,217,433)的菌落，挑取至1体积份(例如1mL)的合适培养基(例如实施例8的种子培养基)中，并且在30℃和250rpm过夜培养。通过将0.020体积份(例如20uL)的所得种子培养物接种至1体积份的合适培养基(例如实施例8的优化培养基)中并且在30℃和250rpm培养4-6天来实现脂肪酶的表达。培养可以在例如微量滴定板，例如，24孔平板中，或在摇瓶中进行。可以将脂肪酶样品在稀释剂中适当地稀释，例如稀释25倍；
(b)步骤iii)的3小时温育可以是在室温；
(c)步骤v)的OD405读数可以例如进行6次；并且例如早在底物添加之后15分钟和在底物添加18个小时之后进行；
(d)在步骤vi)中，以mOD(毫OD)每小时分别计算经胃蛋白酶处理的样品和未处理的样品的脂肪酶活性，并且收集落入线性范围的来自v)的数据；
(e)在步骤vii)中，通过用步骤vi)的经胃蛋白酶处理的脂肪酶的比例除以未处理条件的比例，并将结果乘以100来计算％残余脂肪酶活性(％RA)；和/或
(f)在步骤v)中，还读取OD 540并且通过从OD405读数中减去OD540读数来用于校正背景OD。
方法(III)
以下是通过测量在胆汁盐存在下于pH 5的活性来测定消化性能的方法(上文称作(III))的具体实施方案：
(a)将步骤ii)中使用的脂肪酶纯化；(b)将脂肪酶使当地稀释，通常在稀释剂中稀释25倍到200倍(例如0.01％ Triton-X100，10mM NaCl)，例如稀释至大约8微克/mL；(c)使用消光系数1.24A280/mg从280nm的吸光度测定纯化的脂肪酶样品的浓度；(d)约0.100-0.475的OD在线性范围中；和/或(e)胆汁盐是Sigma B-8756，在蒸馏水中制成20mM。
在步骤vi)中的进一步具体实施方案(f)中，将在pH 5.0在胆汁盐存在下的活性的比例表示为百分比，通过计算按时间和“胆汁盐”活性的稀释度校正的步骤v)中获得的所有线性数据的平均值，除以按时间和“无胆汁盐”活性的稀释度校正的全部线性数据的平均值。
(A)在第一具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+E87K+T231R+N233R；
N33Q+N94K+T231R+N233R；
N33Q+D96Y+T231R+N233R；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R；
N26I+N33Q+T231R+N233R；
A30T+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G91V+T231R+N233R；
N33Q+G91A+T231R+N233R；
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R；
P29T+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G91V+T231R+N233R；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+G91E+T231R+N233R；和
N33Q+N94K+T231R+N233R。
在第二具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+K98I+T231R+N233R；
A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+G91V+T231R+N233R；
N33Q+G91A+T231R+N233R；
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R；
P29T+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G91V+T231R+N233R；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+G91E+T231R+N233R；和
N33Q+N94K+T231R+N233R。
在第三具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+G91V+T231R+N233R；
N33Q+G91A+T231R+N233R；
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R；
N33Q+G91E+T231R+N233R；和
N33Q+N94K+T231R+N233R。
在第四具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+G91V+T231R+N233R；
N33Q+G91A+T231R+N233R；
N33Q+K98I+T231R+N233R；和
N33Q+G91E+T231R+N233R。
具有上文所列取代(四种具体实施方案中的每种)的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶的变体全部具有改进的体外消化性能，即，改进因子(IF)为至少1.50(或1.5)，2.00(或2.0)，2.50(或2.5)，3.00(或3.0)，3.50(或3.5)，或至少4.00(或4.0)，优选为至少5.00(或5.0)，6.00(或6.0)，7.00(或7.0)，8.00(或8.0)，9.00(或9.0)，10.00(或10.0)，或至少11.00(或11.0)。优选使用pH 3的胃步骤。优选的饮食是饮食II。活性位点滴定(AST，实施例6)和/或A280可以用于测定脂肪酶浓度，优选使用消光系数1.24A280/mg。
(B)在另一第一具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R；
D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R；
Q9H+N33Q+D 102E+T231R+N233R；
N33Q+D111E+T231R+N233R；
N33Q+D122E+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T；
N11R+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+N39H+T231R+N233R；
N33Q+P229R+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T；
D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T；
N33Q+N200S+T231R+N233R；
N33Q+N39S+T231R+N233R；
N33Q+E210R+T231R+N233R；
N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R；
N33Q+T231R+N233R+D254R；
N33Q+N94R+T231R+N233R；
N33Q+D96R+T231R+N233R；
D27N+N33Q+T231R+N233R；
D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R；
N33Q+L227F+T231R+N233R；
N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R；
N33Q+G225P+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254S；
N33Q+D96G+T231R+N233R；
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R+D254G；
N33Q+D130H+T231R+N233R；
N33Q+E87A+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+E239D；
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G；
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R；
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D 111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G177A+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+G246A；
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R；和
N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R。
在另一第二具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T；
N33Q+N39S+T231R+N233R；
N33Q+N94R+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254S；
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S；
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T；和
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S。
在另一第三具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S；
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；和
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R。
在另一第四具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R。
具有上文所列取代(四种另外的具体实施方案中的每种)的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶的变体全部具有改进的体外消化性能，即，改进因子(IF)，优选平均IF减去标准差，为1.00以上，或为至少1.50(或1.5)，2.00(或2.0)，2.50(或2.5)，3.00(或3.0)，3.50(或3.5)，或至少4.00(或4.0)，优选为至少5.00(或5.0)，6.00(或6.0)，7.00(或7.0)，8.00(或8.0)，9.00(或9.0)，10.00(或10.0)，或至少11.00(或11.0)。优选使用pH 3的胃步骤。优选的饮食是饮食I。优选使用活性位点滴定(AST，实施例6)测定脂肪酶浓度。
(C)在更进一步的第一具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+E219D+T231R+N233R；
N33Q+W117L+T231R+N233R；
D27Q+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G91T+T231R+N233R；
D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
Q4R+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96W+T231R+N233R；和
N33Q+G91N+T231R+N233R。
在更进一步的第二具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ IDNO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+E219D+T231R+N233R；
D27Q+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G91T+T231R+N233R；和
D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T。
在更进一步的第三具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ IDNO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+E219D+T231R+N233R；和
N33Q+G91T+T231R+N233R。
具有上文所列取代(三种更进一步的具体实施方案中的每种)的SEQ IDNO：2的氨基酸1-269的脂肪酶的变体全部具有改进的体外消化性能，即，改进因子(IF)，优选平均IF减去标准差，为1.00以上，或为至少1.50(或1.5)，2.00(或2.0)，2.50(或2.5)，3.00(或3.0)，3.50(或3.5)，或至少4.00(或4.0)，优选为至少5.00(或5.0)，6.00(或6.0)，7.00(或7.0)，8.00(或8.0)，9.00(或9.0)，10.00(或10.0)，或至少11.00(或11.0)。优选使用pH 3的胃步骤。优选的饮食是饮食II。优选使用活性位点滴定(AST，实施例6)测定脂肪酶浓度。
(D)在第一具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+D167E+T231R+N233R；
N33Q+E87A+T231R+N233R；
N33Q+E210V+T231R+N233R；
N33Q+E56K+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254G；
N33Q+D96S+T231R+N233R；
N33Q+D122N+T231R+N233R；
N26A+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+N162T+T231R+N233R；
N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+G240L；
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R；
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R；
N33Q+G163R+T231R+N233R；
N33Q+G163N+T231R+N233R；
N33Q+G163C+T231R+N233R；
N33Q+G163Q+T231R+N233R；
N33Q+G163E+T231R+N233R；
N33Q+G163H+T231R+N233R；
N33Q+G163I+T231R+N233R；
N33Q+G91K+T231R+N233R；
N33Q+G91M+T231R+N233R；
N33Q+G91F+T231R+N233R；
N33Q+G91S+T231R+N233R；
N33Q+G91W+T231R+N233R；
N33Q+G91Y+T231R+N233R；
N33Q+G163Y+T231R+N233R；
N33Q+G163V+T231R+N233R；
N33Q+G91C+T231R+N233R；
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R；
N33Q+G91M+G161E+T231R+N233R；
N33Q+V128A+T231R+N233R；
N33Q+V128A+T231R+N233R；
N33Q+G163E+T231R+N233R；
N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R；
N33Q+G38A+T231R+N233R；
N33Q+G163A+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R；
N33Q+G163M+T231R+N233R；
N33Q+G91V+T231R+N233R；
N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T；
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R；
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R+P256T；
N33Q+T231R+N233R+D242E；
N33Q+E87R+T231R+N233R；
N33Q+E56R+T231R+N233R；
N33Q+N162G+T231R+N233R；
N33Q+G91L+T231R+N233R；
N33Q+E87H+T231R+N233R；
N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S；
N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G163A+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254A；
N33Q+T231R+N233R+D254N；
N33Q+T231R+N233R+D254L；
N33Q+T231R+N233R+D254K；
N33Q+T231R+N233R+D254M；
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S；
N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R+P256N；
N33Q+T231R+N233R+P256G；
N33Q+T231R+N233R+P256H；
N33Q+T231R+N233R+P256M；
N33Q+T231R+N233R+P256W；
N33Q+T231R+N233R+P256Y；
N33Q+T231R+N233R+P256F；
N33Q+T231R+N233R+P256V；
N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R；
N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R；
N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R；
N33Q+V176N+T231R+N233R；
N33Q+V176D+T231R+N233R；
N33Q+W117F+T231R+N233R；
N33Q+V176I+T231R+N233R；
N33Q+D111N+T231R+N233R；
N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R；
N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R；
N33Q+G91M+G163P+T231R+N233R；
N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R；
N33Q+W117D+T231R+N233R；
N33Q+W117H+T231R+N233R；
N33Q+W117C+T231R+N233R；
N33Q+W117C+T231R+N233R；
N33Q+W117K+T231R+N233R；
N33Q+W117V+T231R+N233R；
N11S+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+W117E+V176K+T231R+N233R；
N33Q+W117G+T231R+N233R；
N33Q+W117P+T231R+N233R；
N33Q+W117S+T231R+N233R；
N33Q+W117T+T231R+N233R；
N33Q+W117I+T231R+N233R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+V176M+T231R+N233R；
N33Q+V176H+T231R+N233R；
N33Q+V176A+T231R+N233R；
D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+W117Y+T231R+N233R；
N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R；
D27R+N33Q+P136H+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S；
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G161A+T231R+N233R；
N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R；
N33Q+N101Q+T231R+N233R；
N33Q+N94Q+T231R+N233R；
N11Q+N33Q+T231R+N233R；
N8Q+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+N251Q；
N33Q+N200Q+T231R+N233R；
N33Q+G177A+T231R+N233R；
N33Q+N73Q+T231R+N233R；
N33Q+I86L+T231R+N233R；
N33Q+K98I+G163K+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+K98I+G163K+N200Q+T231R+N233R+N251S；
N33Q+G38S+G163K+T231R+N233R；
N33Q G38Y T231R N233R；
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G38N+N73Q+T231R+N233R；
N33Q+G38D+R84E+T231R+N233R；
N33Q+G38Q+T231R+N233R；
N33Q+G38I+T231R+N233R；
N33Q+G38K+T231R+N233R；
N33Q+G38F+T231R+N233R；
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S；
N33Q+G38L+T231R+N233R；
N33Q+G38P+T231R+N233R；
N33Q+G38T+T231R+N233R；
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R+P256A；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A；
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R；
N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A；
E1N N33Q T231R N233R；
N33Q G38H T231R N233R；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
D27R+N33Q+W117I+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+T231R+N233R+D254Q；
N11R+N33Q+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176W+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G163D+T231R+N233R；
N33Q+G163D+T231R+N233R；
N33Q+G163P+T231R+N233R；
E1D+N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R；
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+W117S+T231R+N233R；
N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I；
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+G163T+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+N233R；
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D242E+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L；
N33Q+G38A+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+D254I；
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S；
N33Q+E56Q+G156R+V176W+T231R+N233R；
E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A；
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+I90L+G91T+N94S+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L；
N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254Y+I255F；
N33Q+L93F+D102Y+T231R+N233R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N11S+N33Q+T231R+N233R；
N11R+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R；
N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+P256F；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G156R+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91K+D96S+G163T+T231R+N233R+Q249R；
N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+G23E+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I；
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R；
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
E1*+N11R+N33Q+G38A+G91N+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S；
E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G 163P+V176F+L227F+T231R+N233R；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I；
N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176I+T231R+N233R；
N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S；
N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F+L269F；
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F；
N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L；
N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；和
N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S。
在第二具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+E87A+T231R+N233R；
N33Q+E210V+T231R+N233R；
N33Q+E56K+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254G；
N33Q+D96S+T231R+N233R；
N33Q+N162T+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+G240L；
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G163N+T231R+N233R；
N33Q+G163Q+T231R+N233R；
N33Q+G163E+T231R+N233R；
N33Q+G91M+T231R+N233R；
N33Q+G91F+T231R+N233R；
N33Q+G163Y+T231R+N233R；
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R；
N33Q+V128A+T231R+N233R；
N33Q+G38A+T231R+N233R；
N33Q+G163M+T231R+N233R；
N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T；
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R；
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R+P256T；
N33Q+T231R+N233R+D242E；
N33Q+E87R+T231R+N233R；
N33Q+E56R+T231R+N233R；
N33Q+N162G+T231R+N233R；
N33Q+G91L+T231R+N233R；
N33Q+E87H+T231R+N233R；
N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S；
N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254L；
N33Q+T231R+N233R+D254K；
N33Q+T231R+N233R+D254M；
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R+P256N；
N33Q+T231R+N233R+P256G；
N33Q+T231R+N233R+P256M；
N33Q+T231R+N233R+P256W；
N33Q+W117F+T231R+N233R；
N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R；
N33Q+W117C+T231R+N233R；
N33Q+W117C+T231R+N233R；
N33Q+W117K+T231R+N233R；
N11S+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+W117G+T231R+N233R；
N33Q+W117P+T231R+N233R；
N33Q+W117S+T231R+N233R；
N33Q+W117T+T231R+N233R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S；
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R；
N33Q+N101Q+T231R+N233R；
N33Q+N94Q+T231R+N233R；
N11Q+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G177A+T231R+N233R；
N33Q+N73Q+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+G38I+T231R+N233R；
N33Q+G38F+T231R+N233R；
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S；
N33Q+G38T+T231R+N233R；
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A；
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R；
N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A；
N33Q G38H T231R N233R；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R；
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+W117S+T231R+N233R；
N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I；
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+N233R；
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D242E+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I；
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S；
E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A；
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N11R+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R；
N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F；
N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I；
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R；
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S；
E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I；
N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S；
N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R；
N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L；
N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；和
N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S。
在第三具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+E87A+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254G；
N33Q+T231R+N233R+G240L；
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R；
N33Q+G163M+T231R+N233R；
N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T；
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S；
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R+D242E；
N33Q+E87R+T231R+N233R；
N33Q+E56R+T231R+N233R；
N33Q+N162G+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254L；
N33Q+T231R+N233R+D254K；
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R+P256N；
N33Q+T231R+N233R+P256M；
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R；
N33Q+G177A+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+G38F+T231R+N233R；
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S；
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A；
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R；
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R；
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D242E+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L；
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F；
N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R；
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q；
N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S；
N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R；
N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；和
N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S。
在第四具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S；
N33Q+E87R+T231R+N233R；
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A；
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L；
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S；
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R；
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S；和
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T。
在第五具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R；和
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S。
具有上文所列取代(五种具体实施方案中的每种)的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶的变体全部具有改进的体外消化性能，即，改进因子(IF)，优选平均IF减去标准差，为1.00以上，或为至少1.50(或1.5)，2.00(或2.0)，2.50(或2.5)，3.00(或3.0)，3.50(或3.5)，或至少4.00(或4.0)，优选为至少5.00(或5.0)，6.00(或6.0)，7.00(或7.0)，8.00(或8.0)，9.00(或9.0)，10.00(或10.0)，或至少11.00(或11.0)。优选使用pH 5的胃步骤。优选的饮食是饮食I。优选使用活性位点滴定(AST，实施例6)测定脂肪酶浓度。
(E)在第一具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T；
N33Q+E210D+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R；
N33Q+D111A+T231R+N233R；
N33Q+G91T+T231R+N233R；
D27Q+N33Q+T231R+N233R；
Q9H+N33Q+D 102E+T231R+N233R；
N33Q+E56Q+T231R+N233R；
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T；
N33Q+N39S+T231R+N233R；
N33Q+N94R+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R；
K98I+T231R+N233R+N251S；
N33Q+G163P+T231R+N233R；
N33Q+G163D+T231R+N233R；
N33Q+G163T+T231R+N233R；
N33Q+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R；
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+T231R+N233R+P256A；
N33Q+T231R+N233R+P256S；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+S115L+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S；
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L；和
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
在第二具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T；
N33Q+E210D+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R；
N33Q+D111A+T231R+N233R；
N33Q+G91T+T231R+N233R；
N33Q+N94R+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；N33Q+G163P+T231R+N233R；
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S；和
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
在第三具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+T231R+N233R；
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；和
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S。
具有上文所列取代(三种具体实施方案中的每种)的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶的变体全部具有改进的体外消化性能，即，改进因子(IF)，优选平均IF减去标准差，为1.00以上，或为至少1.50(或1.5)，2.00(或2.0)，2.50(或2.5)，3.00(或3.0)，3.50(或3.5)，或至少4.00(或4.0)，优选为至少5.00(或5.0)，6.00(或6.0)，7.00(或7.0)，8.00(或8.0)，9.00(或9.0)，10.00(或10.0)，或至少11.00(或11.0)。优选使用pH 3的胃步骤。优选的饮食是饮食I。优选使用活性位点滴定(AST，实施例6)测定脂肪酶浓度。
(F)在第一具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T；
N33Q+E210D+T231R+N233R；
N33Q+D111A+T231R+N233R；
N33Q+G91T+T231R+N233R；
D27Q+N33Q+T231R+N233R；
Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R；
N33Q+E56Q+T231R+N233R；
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
N33Q+N94R+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R；
K98I+T231R+N233R+N251S；
N33Q+G163P+T231R+N233R；
N33Q+G163D+T231R+N233R；
N33Q+G163T+T231R+N233R；
N33Q+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R；
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+T231R+N233R+D254Q；
N33Q+T231R+N233R+D254I；
N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+T231R+N233R+P256A；
N33Q+T231R+N233R+P256L；
N33Q+T231R+N233R+P256S；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+S115L+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+G161A+T231R+N233R；
N33Q G38M T231R N233R；
N33Q G38F T231R N233R；
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L；和
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
在第二具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T；
N33Q+E210D+T231R+N233R；
N33Q+D111A+T231R+N233R；
N33Q+G91T+T231R+N233R；
D27Q+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+E56Q+T231R+N233R；
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G；
N33Q+G91T+G 163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G163P+T231R+N233R；
N33Q+G163D+T231R+N233R；
N33Q+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254Q；
N33Q+T231R+N233R+D254I；
N33Q+T231R+N233R+P256S；
N33Q+S115L+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
N33Q G38M T231R N233R；
N33Q G38F T231R N233R；
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L；和
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
在第三具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+E210D+T231R+N233R；
N33Q+G91T+T231R+N233R；
D27Q+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
N33Q G38M T231R N233R；
N33Q G38F T231R N233R；
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S；
具有上文所列取代(三种具体实施方案中的每种)的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶的变体全部具有改进的体外消化性能，即，改进因子(IF)，优选平均IF减去标准差，为1.00以上，或为至少1.50(或1.5)，2.00(或2.0)，2.50(或2.5)，3.00(或3.0)，3.50(或3.5)，或至少4.00(或4.0)，优选为至少5.00(或5.0)，6.00(或6.0)，7.00(或7.0)，8.00(或8.0)，9.00(或9.0)，10.00(或10.0)，或至少11.00(或11.0)。优选使用pH 5的胃步骤。优选的饮食是饮食I。优选使用A280测定脂肪酶浓度，优选使用消光系数1.24A280/mg。
本发明的脂肪酶相对于参照可以具有至少1.2、1.4、1.6、1.8或至少2.0的胆汁盐成比例改进(bile salt ratio improvement)。更优选地，本发明的脂肪酶相对于参照可以具有至少2.2、2.5、2.8或至少3.0的胆汁盐成比例改进。甚至更优选地，本发明的脂肪酶相对于参照可以具有至少3.2、3.4、3.6、3.8或至少4.0的胆汁盐成比例改进。这些比例也可以表示为，例如，3X，3倍，或300％，全部对应于3.0的比例，并且对于其它比例反之亦然。
在具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T；
D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S；
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R；
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R；
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D 111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A；
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A；
D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111A+T114I+V168M+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R；
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+T231R+N233R+P256T+L269H；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A
D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R；
D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S；和
N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
在更优选的实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T；
D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S；
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R；
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R；
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A；
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A；
D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111A+T114I+V168M+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R；
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S；和
N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
在最优选的实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T；
D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S；
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R；
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R；和N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S。
具有上文所列取代(三种具体实施方案中的每种)的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶的变体全部具有改进的体外消化性能，即，在胃蛋白酶存在下于pH 3的改进的稳定性，更具体而言在75ug/mL胃蛋白酶存在下于pH 3.0和20℃(或室温)温育3小时之后，于pH 8.0和20℃(或室温)对PNP-棕榈酸盐测定的改进的残余活性，优选如通过实施例8的方法测定的改进的％残余活性(％RA)。在具体的实施方案中，％RA是至少30、至少50、至少70、至少80或至少90％。改进比例可以定义为所述的脂肪酶的％RA与参照脂肪酶的％RA的比例。这种改进比例优选为至少1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或至少4.5。改进比例可以从表10中的结果计算，通过用所述的脂肪酶的％RA除以参照脂肪酶(例如，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的脂肪酶，或另一参照脂肪酶，如果期望)的％RA。
本发明的脂肪酶相对于参照可以具有至少1.2、1.4、1.6、1.8或至少2.0的胆汁盐成比例改进。更优选地，本发明的脂肪酶相对于参照可以具有至少2.2、2.5、2.8或至少3.0的胆汁盐成比例改进。甚至更优选地，本发明的脂肪酶相对于参照可以具有至少3.2、3.4、3.6、3.8或至少4.0的胆汁盐成比例改进。这些比例也可以表示为，例如，3X，3倍，或300％，全部对应于3.0的比例，并且对于其它比例反之亦然。
在具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+D254K+P256A；
L52I+V60E+T114I+V168M+E210D；
D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；和
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T。
更优选地，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；和
N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A。
甚至更优选地，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；和
N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A。
在最优选的实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T。
具有上文所列取代(四种具体实施方案中的每种)的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶的变体全部具有改进的体外消化性能，即，在2mM胆汁盐存在下于pH 5.0对PNP-油酸盐的改进的活性，更具体而言如通过实施例9中的方法测定的改进的胆汁盐比例。
在进一步的具体实施方案中，本发明的脂肪酶选自如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比具有以下取代，优选取代的集合的脂肪酶：
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；和
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S。
最优选的脂肪酶如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比包含以下取代，优选取代的集合：
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S。
在具体实施方案中，本发明的脂肪酶在低pH具有改进的活性。在讨论活性的背景下，低pH是指范围在4-7的pH，例如pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0。优选的低pH是pH 6.0。在优选的实施方案中，在pH 6.0的活性如下测定：i)在37℃；ii)使用三亚油精(trilinolein)底物，优选浓度为8mM；iii)在酶和底物的温育过程中存在胆汁盐，优选浓度为10mM；iv)使用100mM咪唑，100mM乙酸盐，100mM丙二酸，pH 6.0作为测定缓冲液；v)在酶和底物的温育过程中存在CaCl2，优选浓度为1mM；和/或vi)纯化的脂肪酶的量相当于0.01mg EP/mL(EP＝酶蛋白，基于A280))。在另外的优选实施方案中，vii)在测定之前将酶在5mM NaH2PO4pH 7.0中稀释(例如，为了获得适当浓度用于测定的目的)；iix)将酶和底物温育30分钟；ix)将酶和底物在微量滴定板(MTP)中温育，并且优选以700rpm振荡；x)用终止溶液来终止酶反应，优选(2.2％Triton-X100，0.22M磷酸)，更优选包括胃蛋白酶(70mg/l)；xi)作为酶反应的结果生成的游离脂肪酸通过酶显色测试(例如NefaC)来测定；和/或xii)在pH 6.0的活性的改进相对于在相同条件下的参照脂肪酶的活性或相对于变体LV2934来表示，所述参照脂肪酶例如具有SEQ ID NO：1或2(优选2)的氨基酸1-269的脂肪酶。关于所述测试方法的更多细节，请参见实施例3。在pH 6.0具有改进的活性的脂肪酶变体(相对于具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶)的具体实例是：LVA049、LVA349、LVA023、LVA099、SEQ ID NO：1、LVA061、LV2934、LV1330、LVA043、LVA041、LVA012、LV1857和LV1855(它们的结构参见表1)。LVA049、LVA349、LVA023和LVA099脂肪酶变体是特别优选的(与SEQ ID NO：1脂肪酶相比也是改进的)。LVA049和LVA349脂肪酶变体是甚至更优选的。最优选的脂肪酶，从pH活性的角度出发，是LVA049脂肪酶变体。
在另一具体实施方案中，本发明的脂肪酶在低pH具有改进的稳定性。在讨论稳定性的背景下，低pH是指范围在2-6的pH，例如，pH 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0。优选的低pH是3.0。纯化的脂肪酶的稳定性是通过将所述酶在期望的pH(例如，3.0)在37℃温育1、15、45和120分钟来测定的，其后在pH 8和室温(RT)对对硝基苯基辛酸酯(p-Nitrophenyl caprylate)测量残余脂肪酶活性。在优选的实施方案中，i)用于稳定性预温育(pre-incubation)的缓冲液(稳定性缓冲液)是200mM咪唑，200mM乙酸盐，200mM丙二酸，调节至理想的pH(例如，3.0)；ii)首先将酶在20mM NaH2PO4pH7.0，0.01％Triton-X100中稀释成每毫升0.4或0.8mg酶蛋白的工作溶液，优选基于A280，iii)预温育过程中的酶浓度是每毫升0.05或0.1mg酶蛋白，并且对于这种稀释，缓冲液优选是酶稀释缓冲液：20mM乙酸盐pH 6，0.01％Triton-X100；iv)预温育在微量滴定板(MTP)中，伴随振荡，优选以700rpm；v)对于后续的残余活性(RA)测定，将取自(withdraw from)预温育步骤的含酶等分试样在以下残余活性缓冲液(RA缓冲液)中稀释至少20倍：200mM Tris(三羟甲基氨基甲烷(tris-hydroxymethyl aminomethan)，2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇(2-amino-2-hydroxymethyl-1，3-propandiol)，pH 8，0.4％Triton-X100，1mM CaCl2；vi)残余活性是在pH 8.0和RT对对硝基苯基辛酸酯测量的，并且通过动力学(速度(velocity)；速率(rate))方法在405nm测量5分钟；vii)％残余活性如下计算：用针对每份取样(withdraw)(1、15、45、120分钟；或1、60、120分钟)的每种pH的速率减去无酶对照的速率，如果能够与胆汁盐或胃蛋白酶一起应用(参见下文的iix)和ix))，再用这种校正的速率除以每个pH内的最高值，并乘以100。任选地，将酶iix)在胆汁盐存在下，优选浓度为10mM，和/或ix)在胃蛋白酶(70mg/l)存在下预温育。关于这种测试方法的更多细节，请参见实施例4。
在进一步的具体实施方案中，在缓冲液中于pH 3.0温育120分钟之后，本发明的脂肪酶具有的％残余活性，如上文和实施例4中所述测定的，是至少60、65、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90或92。
在进一步的具体实施方案中，在缓冲液中于pH 3.0温育60分钟之后，本发明的脂肪酶具有的％残余活性，如上文和实施例4中所述测定的，是至少82、83、84、85、86、87、88或至少89。
在更进一步的具体实施方案中，在胃蛋白酶存在下于pH 3.0温育45分钟之后，本发明的脂肪酶具有的％残余活性，如上文和实施例4中所述测定的，是至少35、40、45、50、55、60、65、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92或94。
在更进一步的具体实施方案中，在胃蛋白酶存在下于pH 3.0温育60分钟之后，本发明的脂肪酶具有的％残余活性，如上文和实施例4中所述测定的，是至少20、30、40、50、60、70、80、82、84、86、88或至少89。
在更进一步的具体实施方案中，在胃蛋白酶存在下于pH 3.0温育120分钟之后，本发明的脂肪酶具有的％残余活性，如上文和实施例4中所述测定的，是至少2、4、6、8、10、20、30、40、50、60、70或至少71。
在更进一步的具体实施方案中，在胆汁盐存在下于pH 3.0温育15分钟之后，本发明的脂肪酶具有的％残余活性，如上文和实施例4中所述测定的，是至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50。
在pH 3.0的稳定性改进的脂肪酶变体的具体实例(相对于具有SEQ IDNO：2的氨基酸1-269的序列的脂肪酶)是：LV2934、LVA043、LVA049、LV1855、LV1865、LV1874、LV1889、LV1857、LVA012、LVA023、LVA041、LVA061和LVA099。特别优选的在胃蛋白酶存在下于pH 3.0具有改进的稳定性的脂肪酶如下：LVA043、LV1855、LV1865、LV1874、LV1889、LV1857、LVA012和LVA099。在胃蛋白酶存在下于pH 3.0具有改进的稳定性的脂肪酶的其它实例如下：LVA147、LVA315、LVA317、LVA319和LVA714。这些如与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：1和LV2934的脂肪酶中的任一相比都是改进的。另一特别优选的在胆汁盐存在下于pH 3.0具有改进的稳定性的脂肪酶变体是LVA349。关于这些脂肪酶变体的结构，参见表1和实施例4。
在另一具体实施方案中，其对于较不纯的脂肪酶制备物可能尤其有用，例如用于筛选目的，pH 3.0的稳定性如下测量：首先将酶在75ug/mL胃蛋白酶存在下于pH 3.0和室温预温育3小时，然后在随时间监控活性的速率测定法中测量脂肪酶活性。在优选的实施方案中，i)用于参与活性测定法的底物是4-硝基苯酚棕榈酸盐(4-nitrophenol palmitate)，优选1mM PNP-棕榈酸盐，1.2％Triton-X100，4mM CaCl2，100mM TRIS，pH 8.0；ii)对于残余活性测定法，在加入底物之后15分钟读取OD405读数，并且直到加入底物之后18个小时；iii)OD405读数表示为mOD(毫OD)/小时；iv)收集落入线性范围的数据，并且将每个经胃蛋白酶处理的样品的残余脂肪酶活性与相应的未处理样品的残余脂肪酶活性比较；v)％残余活性(％RA)通过用处理的情况的速率除以未处理的情况的速率并且将结果乘以100来计算。更多多细节参见实施例8。如与具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列的脂肪酶相比，以下变体在胃蛋白酶存在下于pH 3.0具有改进的稳定性：具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的脂肪酶、LVAR0002b、LVAR0003、LVAR0011a、LVAR0013、LVAR0014、LVAR0015、LVAR0016、LVAR0017、LVAR0045、LVAR0046、LVAR0047、LVAR0048、LVAR0050、LVAR0051、LVAR0052、LVAR0053、LVAR0054、LVAR0055、LVAR0056、LVAR0057、LVAR0058、LVAR0059、LVAR0061、LVAR0062、LVAR0063、LVAR0064、LVAR0065、LVAR0066、LVAR0067、LVAR0068、LVAR0069、LVAR0070、LVAR0071、LVAR0072、LVAR0101、LVAR0102和LVAR0106。优选的变体是：LVAR0011a、LVAR0013、LVAR0017、LVAR0046、LVAR0052、LVAR0055、LVAR0061、LVAR0063、LVAR0068、LVAR0070、LVAR0071、LVAR0072、LVAR0014、LVAR0015、LVAR0057、LVAR0101、LVAR0102和LVAR0106。特别优选的脂肪酶变体是：LVAR0014、LVAR0015、LVAR0057、LVAR0101、LVAR0102和LVAR0106。这些变体的结构示于表6和9。
在另一具体实施方案中，本发明的脂肪酶在胃蛋白酶存在下是稳定的，例如在70mg/ml胃蛋白酶存在下，优选在期望的pH(例如pH 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0)和37℃持续15、45、60和/或120分钟。关于更多细节，参见上节提到的实施例4。
在更进一步的具体实施方案中，本发明的脂肪酶在胆汁盐存在下是稳定的，例如，在10mM胆汁盐存在下，优选在期望的pH(例如pH 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0)和37℃持续15、45和/或120分钟。关于更多细节，参见上节提到的实施例4。
在更进一步的具体实施方案中，本发明的脂肪酶如与参照脂肪酶相比具有改进的磷脂酶活性，所述参照脂肪酶例如具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列的脂肪酶，或具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的序列的脂肪酶磷脂酶活性可以如下测定：i)将纯化的酶在酶稀释缓冲液(20mM乙酸钠，0.01％w/w Triton-X100，pH 5.0)中稀释至5mgEP/ml，例如基于A280；ii)测定对于1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)的活性，优选在40℃并且进行20分钟；iii)通过MALDI-TOF MS测定并定量释放的游离脂肪酸，优选在与50％ MeOH，0.1％TFA(基质)中的20mg/mL 2，5-二氢-苯甲酸混合之后；iii)使用MS峰的相对信号强度(每个峰下的面积)来计算磷脂酶A1和A2活性之间的分布。
如与参照脂肪酶相比，在水解之后剩余的未消化磷脂的％方面改进的脂肪酶具有改进的磷脂酶活性，所述参照脂肪酶例如具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶，或具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的脂肪酶。
如与SEQ ID NO：2相比具有改进的磷脂酶活性的脂肪酶变体的具体实例如下：LV1889、LVA023、LV1330、LV1855、LV1865、LV1874、LV1889、LVA043、LVA049、LV1857和LV1232。优选的脂肪酶是LV1232和LV1889。
在更进一步的具体实施方案中，本发明的脂肪酶如与具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶、具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的脂肪酶相比，和/或如与LV2934(SEQ ID NO：1的去糖基化变体N33Q)相比，在体外消化模型中具有改进的性能。体外模型使用实验部分描述的饮食I或饮食II。简言之，将100ul的饮食与20ul胃蛋白酶(700mg/ml)和30ul脂肪酶(4种浓度，一式两份)在微量滴定板的孔中混合，将所述平板在37℃伴随振荡(750rpm)温育1小时，其后加入25ul缓冲液(0.8M MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES(2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid)))，0.8M乙酸钠，0.8M咪唑，pH 7.0)和20ul胆汁盐(100mM)，结果使pH为5.7-6.0。然后将所述平板在37℃伴有搅拌温育2小时，其后通过加入1M磷酸中的50ul 10％Triton-X100来终止反应。在1％Triton-X100中稀释125-250倍之后，使用比色试剂盒测定了游离脂肪酸的量，所述试剂盒例如NEFA C试剂盒，如实施例3中所述。
体外性能改进的脂肪酶的实例是：LVAR0003、LVAR0045、LVAR0046、LVAR0047、LVAR0050、LVAR0051、LVAR0052、LVAR0053、LVAR0054、LVAR0056、LVAR0057、LVAR0061、LVAR0062、LVAR0063、LVAR0064、LVAR0065、LVAR0067、LVAR0069和LVAR0072。其它实例是：LVAR0074、LVAR0076、LVAR0077、LVAR0078、LVAR0079、LVAR0080、LVAR0086、LVAR0088、LVAR0091、LVAR0094、LVAR0095、LVAR0096、LVAR0099、LVAR0101、LVAR0102、LVAR0103、LVAR0104、LVAR0106和LVAR0108。优选的实例是：LVAR0003、LVAR0013、LVAR0032、LVAR0050、LVAR0058和LVAR0069。更优选的是：LVAR0063、LVAR0067、LVAR0069、LVAR0079、LVAR0080、LVAR0094、LVAR0095、LVAR0096、LVAR0099、LVAR0101、LVAR0102、LVAR0103、LVAR0104、LVAR0106和LVAR0108。最优选的是：LVAR0094、LVAR0099、LVAR0095和LVAR0106。
在更进一步的具体实施方案中，本发明的脂肪酶具有改进的体内性能。体内性能可以在脂肪酶筛选测试中在诱导了胰腺外分泌机能不全(PEI)的雌性
Figure G2007800516386D00601
迷你猪(Ellegaard)中进行估计，如实施例10中所述，和/或在完整体内消化性试验中估计，如实施例11中所述。相对于具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶、具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的脂肪酶和/或作为具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的脂肪酶的去糖基化变体N33Q的LV2934，所述性能可以是改进的。关于这种测试的更多细节，请参见实施例10。
本发明的脂肪酶优选包含以下取代中的至少一种：N26I、D27Q、D27R、D27Y、P29T、A30T、A30V、T32I、N33Q、N33T、N33Y、P42L、E43D、E43K、E43M、E43V、A49T、L69I、E87K、E99D、E99K、E99P、E99S、E99T、G163K、S216P、L227G、T231R、N233R、D234K、E239V。
本发明的脂肪酶优选包含以下取代中的至少一种：N26I、D27Q、D27R、D27Y、P29T、A30T、A30V、T32I、N33Q、N33T、N33Y、P42L、E43D、E43K、E43M、E43V、A49T、E56C、E56S、D57A、D57G、D57N、V60L、L69I、E87K、G91A、G91E、G91N、G91R、G91S、G91T、G91V、G91W、L93F、N94K、N94R、N94S、D96E、D96G、D96L、D96N、D96S、D96V、D96W、D96Y、L97M、L97Q、K98I、E99D、E99K、E99P、E99S、E99T、D111A、D111S、T114I、L147S、G163K、E210D、S216P、L227G、T231R、N233R、D234K、E239V、Q249R、N251S、D254N、P256T、G263Q、L264A、I265T、G266D、T267A和/或L269N。
在具体实施方案中，本发明的脂肪酶不是：(i)具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的脂肪酶；(ii)(i)的脂肪酶的变体N33Q；(iii)SEQ ID NO：1的氨基酸-5-269(-5至+269)、-4-269(-4至+269)、-3-269(-3至+269)、-2-269(-2至+269)、-1-269(-1至+269)和2-269；(iv)任一(iii)的序列的变体N33Q；实施方案(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)中的任何一个，其具有氨基末端甲硫氨酸残基；(v)实施方案(i)、(ii)、(iii)、(iv)和/或(v)中的任何一个任何一个，其具有聚组氨酸簇(polyhistidine tract)；(vi)实施方案(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)和/或(vi)中的任何一个，其具有至少一个如WO 2006/136159第五页第4-18行中限定的保守取代；(vii)前述实施方案中任何一个的片段，如WO 2006/136159第六页第4-14行所限定；(iix)变体的特定混合物，如WO 2006/136159第六页第34行至第七页第11行所限定；和/或不是(ix)WO 2006/136159中具体公开的用于药物用途的脂肪酶。
特别优选的本发明的脂肪酶是：LV1232、LV1855、LV1857、LV1865、LV1874和LV1889。
其它特别优选的本发明的脂肪酶是以下脂肪酶，其是亲本脂肪酶的变体，并且包含(T231R+N233R)和额外的以下取代中的至少一个：N26I、D27Q、D27R、D27Y、A30V、T32I、N33Y、P42L、E43K、E43M、E43V、A49T、E56A、E56C、E56K、E56R、E56S、D57A、D57G、D57N、E87K、G91E、G91N、G91R、G91V、G91W、L93F、N94K、N94R、D96G、D96L、D96N、D96S、D96V、D96W、D96Y、L97M、L97Q、K98I、E99K、E99P、E99S、E99T、D111A、D111S、T114I、L147S、G163K、S216P、L227G、D234K、E239V、Q249R、D254N、G263Q、L264A、I265T、G266D和/或L269N。
脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶
以下脂肪酶也包括在本发明的范围内：本文要求保护的和公开的任一脂肪酶，其还包含任一以下N-末端延伸：SPIRR、PIRR、IRR、RR和R，分别对应于SEQ ID NO：2的氨基酸-5至-1，SEQ ID NO：2的-4至-1，SEQ ID NO：2的-3至-1，SEQ ID NO：2的-2至-1和SEQ ID NO：2的-1。本文还具体包括任意这些N-末端形式的任何混合物。
在具体实施方案中，本发明的脂肪酶的比活性(specific activity)是具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶的比活性的至少50％。在另外的具体实施方案中，变体脂肪酶的比活性是具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶的比活性的至少60、70、75、80、85、90或至少95％。比活性可以使用本文实施例1的任何脂肪酶测定法来测量，但是优选使用实施例1的LU测定法以LU/mg酶蛋白为单位测量，并且测定酶含量，例如如实施例2中所述(A280和GPMAW)，或使用氨基酸分析。在氨基酸中，对脂肪酶样品的肽键进行酸水解，其后对释放的氨基酸进行分离并定量，例如按照制造商的说明书在Biochrom 20 Plus氨基酸分析仪上进行，该分析仪可从Bie &Berntsen A/S，Sandbaekvej 5-7，DK-2610 Roedovre，Denmark以商业方法获得。每种单独氨基酸的量通过与茚三酮反应来测定。
在更进一步的具体实施方案中，将本发明的脂肪酶与另外的脂肪酶组合使用。另外的脂肪酶的实例是哺乳动物脂肪酶，和微生物脂肪酶。优选的哺乳动物脂肪酶是胰腺提取物，例如来自猪或牛(ox)，如胰酶制剂(pancreatin)。胰酶制剂可以以未包覆(未加工)产品的形式使用，或者以配方产品(formulated products)的形式(包有肠溶衣的(enteric coated)(提供对胃酸的抗性)，或非功能性包覆的(包覆的，但不提供对胃酸的抗性))使用。胰酶制剂可能包含更进一步的酶活性组分，如胰蛋白酶和/或胰淀粉酶。微生物脂肪酶可以是，例如，基于或源自细菌或真菌脂肪酶。细菌脂肪酶可以源自，例如，芽孢杆菌属(Bacillus)或假单胞菌属(Pseudomonas)，真菌脂肪酶可以源自，例如，根霉属(Rhizopus)、念珠菌属或腐质霉属的菌株，如德氏根霉(Rhizopusdelemar)、爪哇根霉(Rhizopus javanicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)或疏棉状腐质霉的菌株，具体是产品Lipase D2TM或Lipase D Amano 2000TM(脂肪酶，EC 3.1.1.3)，其可从Amano Pharmaceuticals，Japan以商业方法获得。
本发明的脂肪酶还可与蛋白酶组合使用，有或没有(with or without)如下所述的淀粉酶。术语“蛋白酶”在本文中定义为水解肽键的酶。它包括任何属于EC 3.4酶组的酶(包括其十三个亚类的每一个，将这些酶在下文称作“属于EC 3.4.-.-组”)。
蛋白酶的实例是哺乳动物蛋白酶，和微生物蛋白酶。优选的哺乳动物蛋白酶是胰腺提取物，例如来自猪或牛，如胰酶制剂。胰酶制剂可以以未包覆(未加工)产品的形式使用，或者以配方产品的形式(包有肠溶衣的，或非功能性包覆)使用。胰酶制剂潜在地包含更进一步的酶活性组分，如胰脂肪酶、BSSL(Bile Salt Stimulated Lipase；胆汁盐刺激的脂肪酶)，和/或胰淀粉酶。
微生物蛋白酶可以是，例如，基于或源自细菌或真菌菌株。蛋白酶可以特别源自曲霉属的菌株，如米曲霉(Aspergillus oryzae)或蜂蜜曲霉(Aspergillusmelleus)的菌株，具体是产品Prozyme 6TM(中性、碱性蛋白酶EC 3.4.21.63)，可从Amano Pharmaceuticals，Japan以商业方法获得。细菌蛋白酶的实例是来自芽孢杆菌属和拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)的蛋白酶，如具有SEQ ID NO：3的氨基酸1-274的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)蛋白酶，具有SEQ ID NO：4的氨基酸1-188的氨基酸序列的拟诺卡氏菌属菌种(Nocardiopsis sp.)蛋白酶，或具有SEQ ID NO：5的氨基酸1-188的氨基酸序列的达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种(Nocardiopsis dassonviellei subsp.Dassonvillei)蛋白酶。SEQ ID NO：3的氨基酸1-274的蛋白酶可以例如，如WO 2006/136160中所述来制备。SEQ ID NO：4-5的氨基酸1-188的蛋白酶可以例如如WO 2001/58276或WO 2004/111224中所述来制备。
在优选实施方案中，本发明的蛋白酶与具有或包含下述之一的蛋白酶是至少70％相同的：(i)SEQ ID NO：3的氨基酸1-274，(ii)SEQ ID NO：4的氨基酸1-188，和/或(iii)SEQ ID NO：5的氨基酸1-188。在(i)、(ii)或(iii)中任一的其它优选实施方案中，同一性程度是至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。在(i)、(ii)或(iii)中任一的可选实施方案中，同一性程度是至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％或至少69％。
本发明的脂肪酶，含有或不含有如上所述的蛋白酶，还可与淀粉酶组合使用。
在本文的上下文中，淀粉酶是催化淀粉和其它直链与支链寡糖和多糖的内部水解(endo-hydrolysis)的酶。淀粉的直链淀粉部分富含1，4-α-糖苷键，而支链淀粉部分更支链化，不仅包含1，4-α-糖苷键，也包含1，6-α-糖苷键。在具体实施方案中，淀粉酶是属于EC 3.2.1.1组的酶。
在具体实施方案中，淀粉酶是哺乳动物淀粉酶或微生物淀粉酶。哺乳动物淀粉酶的实例是胰腺提取物，例如来自猪或牛，如胰酶制剂。胰酶制剂可以以未包覆(未加工)产品的形式使用，或者以配方产品的形式(包有肠溶衣的，或非功能性包覆)使用。胰酶制剂潜在地还包含进一步的酶活性组分，如胰蛋白酶和/或胰脂肪酶。微生物淀粉酶可以是，例如，基于或源自微生物或真菌菌株，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、曲霉属或根霉属。
淀粉酶可以具体源自曲霉属的菌株，如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉或蜂蜜曲霉的菌株，例如源自米曲霉的产品Amylase A1TM，其可从AmanoPharmaceuticals，Japan以商业方法获得；或源自蜂蜜曲霉的Amylase ECTM，其可从Extract-Chemie，Germany以商业方法获得。
优选的淀粉酶是(i)包含SEQ ID NO：6的氨基酸1-481(例如其氨基酸1-481、1-484或1-486)、SEQ ID NO：7的氨基酸1-481，和/或SEQ ID NO：8的氨基酸1-483的淀粉酶。在优选的实施方案中，淀粉酶是所具有或包含的氨基酸序列与以下之一是至少70％相同的淀粉酶：(i)SEQ ID NO：6的氨基酸1-481，(ii)SEQ ID NO：7的氨基酸1-481，和/或(iii)SEQ ID NO：8的氨基酸1-483。SEQ ID NO：6-8的淀粉酶可以例如，如同时待审的WO 2006/136161中所述制备。在(i)、(ii)或(iii)中任一的其它优选实施方案中，同一性程度是至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。在(i)、(ii)或(iii)中任一的可选实施方案中，同一性程度是至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％或至少69％。
通常，脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶(下文的“酶”，即本发明的酶)可以是天然或野生型酶(获得自动物，具体而言是哺乳动物，例如人或猪的酶；自植物，或自微生物)，也可以是其任何显示期望的酶活性的突变体、变体、片段等，以及合成酶，如改组、杂交或嵌合酶，和共有酶。
在特定的实施方案中，酶是低变应原性变体，将其设计成当曝露于动物包括人时产生(invoke)降低的免疫应答。术语免疫应答可以理解为由曝露于酶的动物的免疫系统产生的任何反应。免疫应答的一种类型是变应性应答，其导致曝露的动物中IgE的水平增加。低变应原性变体可以使用本领域已知的技术制备。例如可将酶与聚合物基团屏蔽部分(polymer moieties shieldingportion)或者免疫应答中涉及的酶的表位结合。与聚合物的结合可涉及聚合物对酶的体外化学偶联，例如，如WO 96/17929、WO 98/30682、WO 98/35026和/或WO 99/00489所述。所述结合可以另外或可选地涉及聚合物对酶的体内偶联。这种结合可以用下述方法实现：编码酶的核苷酸序列的基因工程，在酶中插入编码额外糖基化位点的共有序列和在能够将酶糖基化的宿主中表达酶，参见例如WO 00/26354。提供低变应原性变体的另一种方法是：编码酶的核苷酸序列的基因工程，以引起酶的自寡聚，致使所述酶单体可屏蔽其它酶单体的表位，并且由此降低寡聚体的变应原性。这些产品和它们的制备在例如WO 96/16177中有所描述。免疫应答涉及的表位可以由各种方法鉴定，如WO 00/26230和WO 01/83559中所述的噬菌体展示方法，或EP 561907中所述的随机方法。一旦将表位鉴定，可通过已知的基因操作技术，如定点诱变(参见例如WO 00/26230、WO 00/26354和/或WO 00/22103)改变它的氨基酸序列以产生改变的酶的免疫性质，和/或可在足够接近表位处进行聚合物的结合，以使聚合物屏蔽所述表位。
在具体的实施方案中，酶是(i)在pH 2-8稳定，优选也在pH 3-7稳定，更优选在pH 4-6稳定；(ii)在pH 4-9，优选4-8有活性；(iii)对胃蛋白酶和其它消化蛋白酶(如胰蛋白酶(pancreas protease)，即主要为胰蛋白酶(trypsin)和胰凝乳蛋白酶)的降解稳定；和/或(iv)在胆汁盐存在时稳定和/或有活性。
术语“与......组合”是指根据本发明将脂肪酶、蛋白酶和/壶哦淀粉酶组合使用。组合使用可以是同时的、重叠的或顺序的，这三个术语通常按照医师的处方来解释。
术语“同时的”是指酶同时有活性的情况，例如当它们作为一种或多种单独的药物产品同时施用时，或如果将它们在同一种药物组合物中施用。
术语“顺序的”是指这样的情况，其中一种和/或两种酶先作用，而第二种和/或第三种酶随后作用。顺序的作用能够这样获得：将所述酶作为单独的药物制剂施用，中间有需要的间歇；或者作为一种药物组合物施用，其中对所述酶进行不同的配制(进行区分)，例如为了获得不同的释放时间，提供改进的产品稳定性，或为了最优化酶剂量。
术语“重叠的”指这样的情况，其中酶活性时期既不完全是同时的，也不完全是顺序的，即存在特定的时期，其中两种酶或全部酶都有活性。
术语“一(a)”，例如当用于本发明的蛋白酶、脂肪酶和/或淀粉酶的上下文中时，指至少一种。在具体实施方案中，“一”表示“一种或多种”或“至少一种”，其也表示一种、两种、三种、四种、五种等。
本发明的酶的活性可以使用任何合适的测定法来测量。通常可使测定pH和测定温度适用于所述的酶。测定pH值的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。测定温度的实例是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95℃。优选的pH值和温度在生理范围内，例如4、5、6、7或8的pH值，和30、35、37或40℃的温度。
合适的酶测定法的实例包括在实验部分中。其它实例是用于蛋白酶和淀粉酶活性的FIP或Ph.Eur.测定法。这些测定法例如分别在同时待审的(co-pending)申请WO 2006/136160和WO 2006/136161中描述。
药物
在本上下文中，术语“药物”是指化合物或化合物的混合物，其治疗、防止和/或减轻疾病的症状，优选治疗和/或减轻疾病的症状。药物可以由医师开出处方，或者可以是非处方(over-the-counter)产品。
药物组合物
本发明的酶的分离、纯化和浓缩可以通过常规方法进行。例如，它们可以通过常规程序从发酵培养液中回收，所述常规程序包括但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，并用本领域已知的各种方法进一步纯化，所述方法包括但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编辑，VCH Publishers，New York，1989)。
例如，SEQ ID NO：2的脂肪酶的变体例如SEQ ID NO：1的脂肪酶可以，例如，基于美国专利No.5,869,438(其中SEQ ID NO：1是编码本文的SEQ IDNO：2的脂肪酶的DNA序列)制备，即通过下述方法：在合适的宿主细胞中重组表达DNA序列，所述DNA序列是该美国专利的SEQ ID NO：1的修饰体，修饰反映了本文的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间的氨基酸差异。这些修饰能够通过定点诱变实现，如本领域所知。
在具体的实施方案中，将每个酶的浓缩固体或液体制备物单独制备。这些浓缩物也可以，至少部分地，单独进行配制，如下所详细解释的。
在另外的具体实施方案中，将酶以固体浓缩物形式并入本发明的药物组合物中。酶能够通过本领域已知的各种方法形成固态。例如，固态可以是结晶，其中酶分子以高度有序的形式排列；或是沉淀物，其中酶分子排列形式有序性较低，或是无序形式。
结晶可以例如在接近酶的pI的pH并在低电导率实现，所述电导率例如10mS/cm或更低，如EP 691982所述。在具体的实施方案中，根据本发明使用的脂肪酶是结晶脂肪酶，其可以如EP 600868 B1的实施例1所述制备。脂肪酶晶体此外还可以如WO 2006/044529所述的交联。
多种沉淀方法是本领域已知的，包括用盐沉淀，如硫酸铵，和/或硫酸钠；用有机溶剂沉淀，如乙醇，和/或异丙醇；或用聚合物沉淀，如PEG(聚乙二醇)。或者，酶能够用本领域已知的各种方法通过去除溶剂(通常为水)而从溶液沉淀，所述方法例如冻干、蒸发(例如在减压下)，和/或喷雾干燥。
在进一步具体的实施方案中，酶的固体浓缩物具有的活性酶蛋白含量为固体浓缩物中总蛋白含量的至少50％(w/w)。在更进一步具体的实施方案中，活性酶蛋白的含量，相对于固体浓缩物的总蛋白含量是至少55、60、65、70、75、80、85、90或至少95％(w/w)。蛋白含量能够如本领域已知的进行测量，例如通过密度计扫描考马斯染色的SDS-PAGE凝胶，例如使用BIO-RAD的GS-800校准的光密度计；通过使用商业试剂盒，如Protein Assay ESL，定购号1767003，其可从Roche以商业方法获得；或基于WO 01/58276的实施例8中所述的方法。
优选地，如用密度计扫描考马斯染色的SDS-PAGE凝胶测量，酶蛋白(例如，脂肪酶酶蛋白)组成根据本发明使用的固体酶浓缩物的蛋白谱的至少50％，更优选至少55、60、65、70、75、80、85、90、92、94、95、96或至少97％。这样的酶可以称为“分离的”、“纯化的”或“纯化并分离的”酶或多肽。对于如WO 2006/136159的实施例5中解释的在曲霉属中表达并且包含多种N-末端形式的混合物的脂肪酶，SDS-PAGE凝胶上的相关条带位于与34-40kDa的分子量对应的位置。对于SEQ ID NO：1的非糖基化变体例如N33Q(LV2934)，相关条带位于大约30kDa的位置。
本发明的药物组合物包含酶，所述酶优选为浓缩酶制备物的形式，更优选为固体浓缩物，加上至少一种可药用的辅助或补充(subsidiary)材料，如(i)至少一种载体和/或赋型剂；或(ii)至少一种载体、赋型剂、稀释剂和/或佐剂。均可药用的任选的其它组分的非限定性实例是崩散剂(disintegrator)、润滑剂、缓冲剂、增湿剂、防腐剂、增香剂(flavouring agent)、溶剂、增溶剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、推进剂和媒介物(vehicle)。
通常，根据所述医学适应症等，可以针对本领域已知的所有施用方式设计本发明的组合物，优选包括肠内施用(通过消化道)。因此，组合物可以为固体、半固体、液体或气体形式，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒(granule)、微球(microsphere)、软膏、乳膏(cream)、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、洗剂(lotion)和气溶胶。医务工作者将了解选择最合适的施用途径，并理所应当地避免潜在的危险或其它不利的施用途径。
下述方法和辅助材料因此仅也作为示例性而绝非用以限制。
对于固体口服制备物，所述酶能够单独使用或与合适的添加剂组合使用，以制成小丸(pellet)、微丸(micropellet)、片剂、微片剂、粉剂、颗粒或胶囊，例如，与常规载体组合使用，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与赋型剂或粘合剂组合使用，如结晶状或微晶状纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶(acacia)、玉米淀粉或明胶；与崩散剂组合使用，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂组合使用，如巴西棕榈蜡，白蜡，虫胶，无水胶态硅石(waterless colloid silica)，从1500到20000的聚乙二醇(PEG，也称作术语聚乙二醇(macrogol))，具体而言是PEG 4000、PEG 6000、PEG8000，聚维酮(povidone)，滑石，monolein或硬脂酸镁；并且如果需要，与稀释剂、佐剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯(E218)、着色剂如二氧化钛(E171)，和增香剂如蔗糖、糖精、橙油、柠檬油和香兰素(vanillin)组合使用。口服制备物是用作治疗PEI的医学适应症的优选制备物的实例。
还可以将所述酶非常常规地配制成液体口服制备物，通过将它们溶解、悬浮或乳化在水溶剂如水中，或非水溶剂中，如植物性或其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯、丙二醇、聚乙二醇如PEG 4000，或低级醇，如直链或分支的C1-C4醇，例如2-丙醇；并且如果需要，与常规补充材料或添加剂组合使用，如增溶剂、佐剂、稀释剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
此外，所述酶通常能够通过与各种基底(bases)例如乳化基底(emulsifyingbase)或水溶性基底(water-soluble base)混合制成栓剂用于直肠施用。所述栓剂可包括在体温融化而在室温固化的运载体(vehicle)如可可脂、碳蜡和聚乙二醇。
使用脂质体作为递送运载体是另一种通常可能感兴趣的方法。脂质体与靶位点的细胞融合，并且细胞内递送腔室(lumen)的内容物。将脂质体保持与细胞接触一段足够融合的时间，使用各种方法以保持接触，例如分离、结合剂等。在本发明的一个方面，将脂质体设计成雾化的用于肺部施用。可将脂质体与介导膜融合的纯化蛋白质或肽一起制备，如仙台病毒或流感病毒等。脂质可以是已知的脂质体形成脂质的任何有用组合，包括阳离子或两性离子的脂质，例如磷脂酰胆碱。剩余的脂质通常将是中性或酸性脂质，例如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。为制备脂质体，可以使用Kato等，1991，J.Biol.Chem.266：3361所述的方法。
可以提供用于口服或直肠施用的单位剂型如糖浆、酏剂、粉剂和悬浮剂，其中每剂量单位，例如，一茶匙、一大汤匙、胶囊、片剂或栓剂，包含预先定量的酶。相似地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可将酶包含在作为无菌水、生理盐水或其它可药用载体的溶液的组合物中。
术语“单位剂型”用于本文是指适合作为人和动物受试者单元剂量(unitary dosage)的物理上的离散单位(physically discrete unit)，每单位含有预先定量的酶，所预定的量足以产生期望效果。
在具体实施方案中，本发明的药物组合物用于肠内施用，优选口服施用。
在进一步的具体实施方案中，口服组合物是(i)包含酶晶体的液体组合物；(ii)(高度)纯化酶的沉淀(sendiment)的液体悬浮剂；(iii)包含固体或溶解形式的酶的凝胶；(iv)固定化酶或吸附于颗粒上的酶等的液体悬浮剂；或(v)以含酶粉剂、小丸、颗粒或微球形式存在的固体组合物，如果需要，以片剂、胶囊等形式存在的固体组合物，可任选地将所述固体组合物包覆，例如用酸稳定性的包覆物。
在组合物的另一个具体的实施方案中，对酶进行区分(compartmentalize)，即彼此分离，例如通过分离包覆的方法。
在组合物的更进一步的具体实施方案中，将蛋白酶与组合物的其它酶组分分隔，所述其它酶组分如脂肪酶和/或淀粉酶。
酶的剂量将变化很大，依赖于将施用的特定的酶、施用频率、施用方式、症状的严重性和受试者对副作用的易感性等。某些特定的酶可能比其它的酶更有效。
本发明的酶的固体口服制备物的实例包含：(i)本发明的脂肪酶；(ii)与选自下组的蛋白酶具有至少70％同一性的蛋白酶：a)具有SEQ ID NO：3的氨基酸1-274的蛋白酶，b)具有SEQ ID NO：4的氨基酸1-188的蛋白酶，和c)具有SEQ ID NO：5的氨基酸1-188的蛋白酶；和/或(iii)与选自下组的淀粉酶具有至少70％同一性的淀粉酶：a)具有SEQ ID NO：6的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQ ID NO：7的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQ ID NO：8的氨基酸1-483的淀粉酶；其中优选地，(i)、(ii)和(iii)的酶的预期每日临床剂量如下(全部以mg酶蛋白每kg体重(bw)表示)：对于(i)的脂肪酶：0.01-1000、0.05-500、0.1-250或0.5-100mg/kg bw；对于(ii)的淀粉酶：0.001-250、0.005-100、0.01-50或0.05-10mg/kg bw；对于(iii)的蛋白酶：0.005-500、0.01-250、0.05-100或0.1-50mg/kg bw。
本发明的酶的固体口服制备物的优选实例包含：(i)本发明的脂肪酶，和(ii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸1-481的淀粉酶，和/或(iii)包含，优选具有，SEQ ID NO：3的氨基酸1-274的蛋白酶。
(i)、(ii)和(iii)的酶的预期每日临床剂量的实例如下(全部以mg酶蛋白每kg体重(bw)表示)：对于(i)的脂肪酶：0.1-250、0.5-100或1-50mg/kg bw；对于(ii)的淀粉酶：0.01-50、0.05-10或0.1-5mg/kg bw；对于(iii)的蛋白酶：0.05-100、0.1-50或0.5-25mg/kg bw。
为了口服施用时更好的稳定性，可对酰胺(肽)键以及氨基和羧基末端进行修饰。例如，可将羧基末端酰胺化。
本发明的药物组合物的具体实施方案，其适合于治疗消化性病症、PEI、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病，和/或II型糖尿病，可通过将本发明的酶并入小丸中来制备。所述小丸通常可包含10-90％(w/w，相对于所得小丸的干重)生理上可以接受的有机聚合物，10-90％(w/w，相对于所得小丸的干重)的纤维素或纤维素衍生物，和80-20％(w/w，相对于所得小丸的干重)的酶，在每种情况下，使有机聚合物、纤维素或纤维素衍生物和酶的总量满足100％。
生理上可以接受的有机聚合物可选自下组：聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇3000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、羟丙基甲基纤维素、聚氧乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯的共聚物和所述有机聚合物的混合物。聚乙二醇4000优选作为生理上可以接受的有机聚合物。
纤维素或纤维素衍生物可以例如选自：纤维素、乙酸纤维素、纤维素脂肪酸酯、硝酸纤维素、纤维素醚、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、甲基乙基纤维素和甲基羟丙基纤维素。纤维素，特别是微晶纤维素优选作为纤维素或纤维素衍生物。
所得小丸可以用合适的肠溶衣包覆，用其它非功能性包覆物包覆或不进行这种包覆直接使用。此外，所得的小丸可以填充到胶囊如硬明胶胶囊或不含明胶的胶囊中，所述胶囊的大小适合于上文详细描述的病症或疾病的治疗。在本发明的实施方案中，产生自不同酶类型，特别是产生自脂肪酶、蛋白酶和/或淀粉酶的小丸，可以填充到所述胶囊中。当用不同酶类型填充胶囊时，通过向胶囊添加指定量的脂肪酶、蛋白酶和/或淀粉酶中的任一种，可使单一酶类型(即脂肪酶、蛋白酶或淀粉酶)的定量适合于某种适应症组或某种患者亚组的特定需要，即可产生其中脂肪酶∶蛋白酶∶淀粉酶的特定比例不同的胶囊。
本发明的脂肪酶的优选药物组合物在WO 2005/092370中描述，特别是包含本文提到的优选exhibient的制剂。在特别优选的实施方案中，药物组合物包含单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇(PEG)C6-C22脂肪族羧酸的单酯和二酯的聚乙二醇甘油酯(macrogolglyceride)混合物，并且也可能包含小部分的甘油和游离聚乙二醇。
包含于聚乙二醇甘油酯混合物中的聚乙二醇(PEG)优选是平均每分子具有6个到最多40个环氧乙烷单元的PEG，或优选是具有分子量在200-2000的PEG。
本发明的另一个方面提供本发明的酶的药物组合物，其包含由表面活性剂、共表面活性剂(co-surfactant)和亲脂相组成的体系，所述体系具有大于或等于10的LVB(亲水-亲脂平衡，Hydrophilic-Lipophilic Balance)值，和高于或等于30℃的熔点。在优选实施方案中，所述体系具有10-16的LVB值，优选12-15，和在30-600℃的熔点，优选在40-500℃。具体而言，通过LVB值和熔点表征的体系是单、二和三酰基甘油酯与聚乙二醇(PEG)和脂肪族羧酸的单和二酯的混合物，所述脂肪族羧酸具有8-20个，优选8-18个碳原子，而聚乙二醇优选每分子具有约6至约32个环氧乙烷单元，并且所述体系任选地包含游离甘油和/或游离聚乙二醇。这种体系的LVB值优选通过PEG的链长来调节。这种体系的熔点通过脂肪酸的链长、PEG的链长和脂肪酸链的饱和度来调节，并且因此由制备聚乙二醇甘油酯混合物的起始油(starting oil)来调节。
“C8-C18脂肪族羧酸”指混合物，其中将辛酸(C8)、癸酸(C10)、月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)和硬脂酸(C18)以重要而可变的比例包含在内，如果这些酸是饱和的，还包括相应的不饱和C8-C18羧酸。这些脂肪酸的比例可根据起始油而变化。
这样的单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇(PEG)与脂肪族羧酸的单和二酯的混合物，其中所述脂肪族羧酸带有8至18个碳原子，所述混合物可以例如通过聚乙二醇和起始油的反应获得，其中聚乙二醇的分子量在200-1500，并且所述起始油由带有脂肪酸的甘油三酸酯混合物组成，所述脂肪酸选自包含以下脂肪酸的组：辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚麻酸，单独存在或作为混合物。任选地，这种反应的产物也可包含小比例的甘油和游离聚乙二醇。
这些混合物可以商业方法获得，例如以商品名
Figure G2007800516386D00721
本发明的一个有优势的实施方案提供商品名为
Figure G2007800516386D00722
的产品，具体而言“
Figure G2007800516386D00723
50/13”和/或“
Figure G2007800516386D00724
44/14”，其代表适合用于根据本发明的药物制备物中的混合物。
Figure G2007800516386D00725
50/13是混合物，包含单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇的单和二酯，分别带有40％至50％的棕榈酸(C16)和48％至58％的硬脂酸(C18)，组成结合脂肪酸(bound fatty acid)的主要部分。在每种情况下，辛酸(C8)和癸酸(C10)的比例低于3％，并且在每种情况下月桂酸(C12)和肉豆蔻酸(C14)的比例低于5％。
Figure G2007800516386D00726
44/14是混合物，包含单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇的单和二酯，各比例如下：棕榈酸(C16)是4-25％，硬脂酸(C18)5-35％，辛酸(C8)少于15％，癸酸(C10)少于12％，月桂酸(C12)30-50％和肉豆蔻酸(C14)5-25％。
Figure G2007800516386D00727
44/14能够例如通过使用棕榈仁油和聚乙二醇1500的醇解/酯化反应来制备。
本发明的优选实施方案提供本发明的酶的药物组合物，其包含的体系含有单、二和三酰基甘油酯和C8-C18脂肪族羧酸的聚乙二醇单和二酯的混合物，并且还可能含有小比例的甘油和游离聚乙二醇，所述体系具有在40℃-55℃的熔点和在12-15的LVB值。更优选地，所述体系具有在44℃-50℃的熔点和在13-14的LVB值。或者，所述体系具有大约44℃的熔点和14的LVB，或所述系统具有大约50℃的熔点和13的LVB值。
处理方法
根据本发明使用的脂肪酶，任选地与蛋白酶和/或淀粉酶(本发明的酶)组合，在对动物中各种疾病或病症的治疗处理和/或预防处理中是有用的。术语“动物”包括所有动物，并且特别是人类。动物的实例是非反刍动物和反刍动物，如绵羊、山羊和牛，例如肉牛(beef cattle)和奶牛。在具体实施方案中，动物是非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如马、猪(包括但不限于，小猪、饲育猪(growing pigs)和母猪(sow))；家禽，如火鸡、鸭和小鸡(chickens)(包括但不限于雏鸡(broiler chick)、蛋鸡(layer))；牛犊(young calves)；宠物如猫和狗；和鱼(包括但不限于鲑鱼(salmon)、鳟鱼(trout)、罗非鱼(tilapia)、鲶鱼(catfish)和鲤鱼(carp))；和甲壳类动物(包括但不限于河虾(shrimp)和对虾(prawn))。在具体实施方案中，动物是哺乳动物，更具体为人类。
例如，所述酶对于消化性病症如消化不良或胃弱(dyspepsia)等的治疗是有用的，所述消化性病症经常由消化酶的产生不足和/或向胃肠道中的分泌不足引起，所述消化酶通常分泌自胃和胰腺。
此外，酶对PEI的治疗特别有用。PEI能够使用
Figure G2007800516386D00731
测试(JOP.JPancreas(Online)2002；3(5)：116-125)等验证，并且它可能由以下疾病和症状导致，如胰腺癌、胰腺和/或胃的外科手术，例如胰腺的全部或部分切除术、胃切除术、后胃肠分流术(post gastrointestinal bypass surgery)(例如Billroth II式胃肠造口吻合术)；慢性胰腺炎；施-戴综合征(Shwachman Diamond Syndrome)；胰腺或总胆管的管梗阻(例如由于肿瘤)；和/或囊性纤维化(遗传性疾病，其中浓粘液阻断胰管)。所述酶也可以是对急性胰腺炎的治疗有用的。
所述酶对消化性病症的作用可以如EP 0600868中概括描述的测定，其中实施例2描述用于测量在胃条件下的脂肪酶稳定性的体外消化性测试(digestibility test)，而实施例3描述用于测定在胆汁盐存在下的脂肪酶活性的体外消化性测试。可以针对蛋白酶和淀粉酶建立相应的测试。WO 02/060474也公开了合适的测试，例如(1)用于测量猪的测试饲料中脂质消化的体外测试，和(2)用胰腺分泌不足(pancreas insufficient)的猪进行的体内试验，其中测量脂肪、蛋白质和淀粉的消化性。
作为另一个实例，酶对治疗I型和/或II型糖尿病(Diabetes mellitus)是有用的，特别是对糖尿病治疗中对经常伴随这种疾病的消化性病症的辅助治疗，目的为减少晚期并发症。
可以通过一种或多种WO 00/54799所述的方法来确定酶对糖尿病的效果，例如通过控制糖基化血红蛋白的水平，血糖水平，低血糖发作(hypoglycaemic attack)，脂溶性维生素如维生素A、D和E的状态，胰岛素的必需每日剂量，体重指标，和高血糖期。
本文描述并且要求保护的发明不限于本文公开的特定实施方案的范围，因为这些实施方案旨在说明本发明的几个方面。任何相当的实施方案应包含于本发明的范围内。事实上，除了本文所示和所述之外对本发明的各种修饰，根据前文的描述，对本领域的技术人员是显而易见的。这些修饰也应包含于所附权利要求的范围内。在发生冲突的情况下，按照包括定义在内的本发明内容为准。
具体实施方案
本发明还涉及脂肪酶，优选用作药物，所述脂肪酶，如与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列相比，包含权利要求1-2和5-9中任一项的取代，例如取代N33Q、T231R和N233R，以及至少一个选自下列的额外的取代：E1*，D，N；Q4H，P，R；D5E；N8L，Q；Q9H；F10L；N11C，D，H，L，P，Q，R，S；G23E；N26A，H，I；D27I，N，Q，R，S，V；P29T；A30T，V；T37K，M；G38A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；N39H，S；E43K；K46M；A49T；L52I，R；E56K，Q，R，S；D57G，N；V60E，S；G61R；V63R；A68V；L69I；N71I，S；N73Q，Y；I76T；R84E；I86F，L；E87A，H，K，R；I90L，V；G91A，C，E，F，K，L，M，N，S，T，V，W，Y；L93*，F；N94*，K，Q，R，S；F95*；D96*，E，G，N，R，S，W，Y；L97M，Q；K98I，T；E99D；N101Q；D102E，G，Y；R108M；G109A；D111A，E，N，S；G112A；T114I；S115L；W117C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y；D122E，N；Q126L；V128A；D130H；H135D；P136H；Y138F；V141E，L；A150V；V154F，I，L；A155V；G156R；G161A，E；N162G，S，T；G163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；D167E；V168M；V176A，D，F，G，H，I，K，M，N，Q，T，W；G177A；R179T；L185M；G190C，D；N200Q，S；R205I；L206F；E210D，R，V，Y；S216P；E219D；G225P；T226N；L227F，G；P229R；E239D；G240L；D242E；T244S；G246A；Q249R；N251Q，S；D254A，G，I，K，L，M，N，R，Q，S，Y；I255A，F；P256A，F，G，H，I，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y；和L269F，H；所述脂肪酶进一步地：
(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列具有至少50％同一性；
(b)由如下多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低(优选低、中、中-高、高或最优选非常高)严紧性条件下与以下杂交：(i)通过提述并入本文的美国专利No.5,869,438的SEQ ID NO：1的编码序列(编码本文的SEQ ID NO：2的脂肪酶的DNA序列)，或(ii)(i)的全长互补链；和/或
(c)是额外地包含对SEQ ID NO：1的成熟多肽的一个或多个(例如，几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入(优选是保守性的)的变体。
非常低至非常高严紧性条件定义为在42℃，在5×SSPE、0.3％ SDS、200μg/ml已剪切和变性的鲑精DNA，对于非常低和低严紧性25％甲酰胺，对于中和中-高严紧性35％甲酰胺，或对于高和非常高严紧性50％甲酰胺中，根据标准的Southern印迹方法进行最佳12-24小时的预杂交和杂交。将载体材料最终用2×SSC，0.2％ SDS，优选在45℃(非常低严紧性)，更优选在50℃(低严紧性)，更优选在55℃(中严紧性)，更优选在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选在65℃(高严紧性)，并且最优选在70℃(非常高严紧性)洗涤三次，每次15分钟。
保守性质的氨基酸改变不显著影响蛋白质的折叠和/或活性，并且包括小的缺失，通常为1至约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至约20-25残基的小接头肽；或者通过改变净电荷或其它功能而有利于纯化的小延伸，例如聚组氨酸簇、抗原表位或结合域。
本发明还涉及亲本脂肪酶的变体，优选用作药物，所述变体在一个或多个位置包含变化，所述位置对应于亲本酶中的一个或多个位置，其中：
(a)所述变化独立地是
(i)在紧邻所述位置的上游的氨基酸插入，
(ii)占据所述位置的氨基酸的缺失，和/或
(iii)对占据所述位置的氨基酸的取代；
(b)所述变化选自权利要求1-2和5-9中任一项的变化；
(c)所述变体具有脂肪酶活性；并且
(d)每个位置对应于具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。
在具体实施方案中，所述变体，和/或所述亲本与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列具有至少50％同一性。
变体中变化的总数优选是22、21、20、19、18、17或16。更优选变化的总数是15，甚至更优选14，甚至更优选13，甚至更优选12，甚至更优选11，甚至更优选10，甚至更优选9，甚至更优选8，甚至更优选7，甚至更优选6，甚至更优选5，甚至更优选4，甚至更优选3，甚至更优选2，且最优选1。
变体可以通过改组编码一种或多种同源亲本脂肪酶的一种或多种多核苷酸来产生。术语“改组”是指两个或多个同源核苷酸序列之间的核苷酸序列重组，产生重组的核苷酸序列(即，已经经过改组循环的核苷酸序列)，其与起始核苷酸序列相比具有多个交换的核苷酸。
SEQ ID NO：2的脂肪酶的以下变体是权利要求6和9的脂肪酶的实例：
LVA012
＝LVA013  D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T；
LVA023    N33Q+E210D+T231R+N233R；
LVA041    N33Q+D111A+T231R+N233R；
LVA043    N33Q+G91T+T231R+N233R；
LVA055    N33Q+E219D+T231R+N233R；
LVA060    N33Q+W 117L+T231R+N233R；
LVA061    D27Q+N33Q+T231R+N233R；
LVA063    N33Q+G91T+T231R+N233R；
LVA089    D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T；
LVA094    D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T；
LVA099    D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
LVA103    Q4R+N33Q+T231R+N233R；
LVA113    N33Q+T231R+N233R+Q249R；
LVA120    N33Q+D96W+T231R+N233R；
LVA129    D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R；
LVA130    D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R；
LVA139    Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R；
LVA140    N33Q+D111E+T231R+N233R；
LVA143    N33Q+D122E+T231R+N233R；
LVA147    D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
LVA162    N33Q+D167E+T231R+N233R；
LVA179    N33Q+G91N+T231R+N233R；
LVA180    N33Q+T231R+N233R+P256T；
LVA182
D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T；
LVA185    N11R+N33Q+T231R+N233R；
LVA198    N33Q+N39H+T231R+N233R；
LVA202    N33Q+P229R+T231R+N233R；
LVA206    D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+
     P256T；
LVA208    N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R；
LVA210    D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
     P256T；
LVA211    D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T；
LVA214    N33Q+E87A+T231R+N233R；
LVA216    N33Q+E56Q+T231R+N233R；
LVA217    N33Q+E210V+T231R+N233R；
LVA218    N33Q+E56K+T231R+N233R；
LVA220    N33Q+T231R+N233R+D254G；
LVA221    N33Q+D96S+T231R+N233R；
LVA222    N33Q+D122N+T231R+N233R；
LVA228    N26A+N33Q+T231R+N233R；
LVA229    N33Q+N162T+T231R+N233R；
LVA230    N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R；
LVA231    N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
LVA234    N33Q+T231R+N233R+G240L；
LVA238    D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T；
LVA241    D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T；
LVA243    N33Q+N200S+T231R+N233R；
LVA245    N33Q+N39S+T231R+N233R；
LVA247    N33Q+E210R+T231R+N233R；
LVA248    N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R；
LVA249    N33Q+T231R+N233R+D254R；
LVA250    N33Q+N94R+T231R+N233R；
LVA252    N33Q+D96R+T231R+N233R；
LVA254    D27N+N33Q+T231R+N233R；
LVA256    D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R；
LVA257    N33Q+L227F+T231R+N233R；
LVA272    N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R；
LVA273    N33Q+G225P+T231R+N233R；
LVA275    N33Q+T231R+N233R+D254S；
LVA277    N33Q+D96G+T231R+N233R；
LVA279    N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S；
LVA280    N33Q+T231R+N233R+D254G；
LVA281    N33Q+D130H+T231R+N233R；
LVA284    N33Q+E87A+T231R+N233R；
LVA287    N33Q+T231R+N233R+E239D；
LVA307    N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G；
LVA308    N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
LVA310    N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
LVA315    N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G；
LVA317    N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA319    N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA325    Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
          P256T；
LVA327    N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R；
LVA330    Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+
          N233R+P256T；
LVA331    Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
          P256T；
LVA333    N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T；
LVA334    N33Q+G177A+T231R+N233R；
LVA338    N33Q+T231R+N233R+G246A；
LVA341    D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA345    D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R；
LVA347    N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R；
LVA349    K98I+T231R+N233R+N251S；
LVA353    N33Q+G163R+T231R+N233R；
LVA355    N33Q+G163N+T231R+N233R；
LVA357    N33Q+G163C+T231R+N233R；
LVA359    N33Q+G163Q+T231R+N233R；
LVA360
＝LVA415  N33Q+G163E+T231R+N233R；
LVA362    N33Q+G163H+T231R+N233R；
LVA364    N33Q+G163I+T231R+N233R；
LVA368    N33Q+G163P+T231R+N233R；
LVA370    N33Q+G163D+T231R+N233R；
LVA371    N33Q+G91K+T231R+N233R；
LVA373    N33Q+G91M+T231R+N233R；
LVA375    N33Q+G91F+T231R+N233R；
LVA379    N33Q+G91S+T231R+N233R；
LVA381    N33Q+G91W+T231R+N233R；
LVA383    N33Q+G91Y+T231R+N233R；
LVA387    N33Q+G163T+T231R+N233R；
LVA389    N33Q+G163W+T231R+N233R；
LVA391    N33Q+G163Y+T231R+N233R；
LVA393    N33Q+G163V+T231R+N233R；
LVA399    N33Q+G91C+T231R+N233R；
LVA411    N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R；
LVA412    N33Q+G91M+G161E+T231R+N233R；
LVA413
＝LVA414  N33Q+V128A+T231R+N233R；
LVA416    N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R；
LVA417    N33Q+G38A+T231R+N233R；
LVA420    N33Q+G163A+T231R+N233R；
LVA421    N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R；
LVA437    N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R；
LVA438    N33Q+G163M+T231R+N233R；
LVA440    N33Q+G91V+T231R+N233R；
LVA442    N33Q+D 111A+T231R+N233R+Q249R；
LVA444    N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S；
LVA449    D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA450    D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T；
LVA451    N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S；
LVA453    N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R；
LVA454    N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S；
LVA456    N33Q+T231R+N233R+P256T；
LVA458    N33Q+T231R+N233R+D242E；
LVA460    N33Q+E87R+T231R+N233R；
LVA461    N33Q+E56R+T231R+N233R；
LVA463    N33Q+N162G+T231R+N233R；
LVA464    N33Q+G91L+T231R+N233R；
LVA468    N33Q+E87H+T231R+N233R；
LVA470    N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R；
LVA471    N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S；
LVA472    N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S；
LVA473    D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA474    N33Q+G163A+T231R+N233R；
LVA480    D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA482    N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R；
LVA483    N33Q+T231R+N233R+D254A；
LVA484    N33Q+T231R+N233R+D254N；
LVA486    N33Q+T231R+N233R+D254Q；
LVA488    N33Q+T231R+N233R+D254I；
LVA490    N33Q+T231R+N233R+D254L；
LVA492    N33Q+T231R+N233R+D254K；
LVA494    N33Q+T231R+N233R+D254M；
LVA503    N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R；
LVA505    D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R；
LVA506    N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R；
LVA507    D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R；
LVA509    D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R；
LVA512    N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
LVA513    D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R；
LVA516    N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R；
LVA518    D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R；
LVA519    D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
LVA520    N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
LVA523    D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
          P256T；
LVA526    D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+
          N233R+P256T；
LVA527    D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+
          N233R+D254S+P256T；
LVA530    D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
          P256T；
LVA532    D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+
          P256T；
LVA535    D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+
          P256T；
LVA540    D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+L227G+T231R+N233R+
          D254S+P256T；
LVA542    D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+
          P256T；
LVA547    N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S；
LVA548    N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S；
LVA553    N33Q+T231R+N233R+P256A；
LVA555    N33Q+T231R+N233R+P256N；
LVA561    N33Q+T231R+N233R+P256G；
LVA562    N33Q+T231R+N233R+P256H；
LVA564    N33Q+T231R+N233R+P256L；
LVA565    N33Q+T231R+N233R+P256M；
LVA566    N33Q+T231R+N233R+P256S；
LVA567    N33Q+T231R+N233R+P256W；
LVA569    N33Q+T231R+N233R+P256Y；
LVA576    N33Q+T231R+N233R+P256F；
LVA578    N33Q+T231R+N233R+P256V；
LVA580    N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R；
LVA581    N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R；
LVA582    N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R；
LVA583    N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R；
LVA586    N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R；
LVA602    N33Q+V176N+T231R+N233R；
LVA604    N33Q+V176D+T231R+N233R；
LVA614    N33Q+W117F+T231R+N233R；
LVA620    N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
LVA622    N33Q+V176I+T231R+N233R；
LVA623    N33Q+D111N+T231R+N233R；
LVA627    N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R；
LVA629    N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R；
LVA631    D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R；
LVA632     N33Q+G91M+G163P+T231R+N233R；
LVA634     N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R；
LVA639     N33Q+W117D+T231R+N233R；
LVA640     N33Q+W 117H+T231R+N233R；
LVA649
＝LVA650   N33Q+W117C+T231R+N233R；
LVA651     N33Q+W117K+T231R+N233R；
LVA653     N33Q+W117V+T231R+N233R；
LVA656     N11S+N33Q+T231R+N233R；
LVA658     N33Q+W117E+V176K+T231R+N233R；
LVA659     N33Q+W117G+T231R+N233R；
LVA664     N33Q+W117P+T231R+N233R；
LVA665     N33Q+W117S+T231R+N233R；
LVA666     N33Q+W117T+T231R+N233R；
LVA667     N33Q+W 117I+T231R+N233R；
LVA670     D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
LVA672     N33Q+S115L+T231R+N233R；
LVA675     N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA696     N33Q+V176M+T231R+N233R；
LVA697     N33Q+V176H+T231R+N233R；
LVA700     N33Q+V 176A+T231R+N233R；
LVA702     D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R；
LVA705     N33Q+W117Y+T231R+N233R；
LVA707     N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R；
LVA713     D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
LVA714
＝LVAR714 D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+
          D254S；
LVA715    D27R+N33Q+P136H+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
LVA718    N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S；
LVA721    N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
LVA722    N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
LVA723    N33Q+G161A+T231R+N233R；
LVA731    N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R；
LVA732    N33Q+N101Q+T231R+N233R；
LVA733    N33Q+N94Q+T231R+N233R；
LVA734    N33Q+G161A+T231R+N233R；
LVA736    N11Q+N33Q+T231R+N233R；
LVA738    N8Q+N33Q+T231R+N233R；
LVA740    N33Q+T231R+N233R+N251Q；
LVA743    N33Q+N200Q+T231R+N233R；
LVA744    N33Q+G177A+T231R+N233R；
LVA746    N33Q+N73Q+T231R+N233R；
LVA749    N33Q+I86L+T231R+N233R；
LVA753    N33Q+K98I+G163K+T231R+N233R；
LVA754    D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA755    D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA770    D27R+N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R；
LVA771    N33Q+K98I+G163K+N200Q+T231R+N233R+N251S；
LVA772    N33Q+G38S+G163K+T231R+N233R；
LVA773    D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA774    N33Q G38Y T231R N233R；
LVA777    D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
LVA778    D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
LVA782    N33Q+G38N+N73Q+T231R+N233R；
LVA783    N33Q+G38D+R84E+T231R+N233R；
LVA784    N33Q+G38Q+T231R+N233R；
LVA786    N33Q+G38I+T231R+N233R；
LVA788    N33Q+G38K+T231R+N233R；
LVA792    N33Q+G38F+T231R+N233R；
LVA799    N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S；
LVA800    N33Q+G38L+T231R+N233R；
LVA801    N33Q+G38M+T231R+N233R；
LVA803    N33Q+G38F+T231R+N233R；
LVA804    N33Q+G38P+T231R+N233R；
LVA805    N33Q+G38T+T231R+N233R；
LVA806    N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA808    D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D 111A+G 163K+T231R+N233R+D254S+
          P256T；
LVA809    N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA811    D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+
          P256T；
LVA813    D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
LVA814    N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R+P256A；
LVA816    N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A；
LVA817    N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R；
LVA818    N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A；
LVA819    E1N+N33Q+T231R+N233R；
LVA821    N33Q G38H T231R N233R；
LVA829    N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S；
LVA830    N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
LVA831    N33Q+K98I+T231R+N233R；
LVA834    D27R+N33Q+W117I+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
LVA835    N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA839    N33Q+G163W+T231R+N233R；
LVA841    N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R；
LVA842    D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA844    N33Q+T231R+N233R+D254Q；
LVA846    N11R+N33Q+G91T+S115L+G 163K+T231R+N233R+D254S；
LVA847    N11R+N33Q+G91T+G163K+V176W+T231R+N233R+D254S；
LVA848
＝LVA849  N33Q+G163D+T231R+N233R；
LVA850    N33Q+G163P+T231R+N233R；
LVA853    E1D+N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S；
LVA857    N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R；
LVA860    Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D 111A+L206F+S216P+L227G+T231R+
          N233R+P256T；
LVA862
  D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+
        N233R+P256T；
LVA863  D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
        L227G+T231R+N233R+P256T；
LVA865  N33Q+W117S+T231R+N233R；
LVA866  N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I；
LVA869  N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R；
LVA871  N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R；
LVA873  N33Q+G91T+N94S+D111A+G163T+V176W+T231R+N233R；
LVA875  N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+N233R；
LVA877  N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+
        L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA878  D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+
        T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA880  N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+
        T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA882  D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+
        N233R+D242E+D254S+P256T；
LVA883  D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+
        T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA888  Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+E210D+S216P+L227G+
        T231R+N233R+P256L；
LVA890  N33Q+G38A+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S；
LVA892  N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+D254I；
LVA896  N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
LVA897  N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R+D254S；
LVA899    N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
LVA904    N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+
          P256T；
LVA906    N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S；
LVA907    N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S；
LVA913    N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I；
LVA915    N11R+N33Q+G91T+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S；
LVA917    N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；
LVA919    N11R+N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R+D254S；
LVA921    N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S；
LVA925    N33Q+E56Q+G156R+V176W+T231R+N233R；
LVA927    E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R；
LVA928    N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A；
LVA929    N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA930    N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA933    D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+
          N233R+Q249R+D254S+P256T；
LVA934    D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D+L227G+
          T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA941    N11R+N33Q+I90L+G91T+N94S+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA942    N11R+N33Q+G91T+G 163K+V 176I+T231R+N233R+D254S；
LVA943    N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
LVA944    N11R+N33Q+G91T+G 163A+V 176T+T231R+N233R+D254S；
LVA945    N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S；
LVA946    N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S；
LVA947    N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S；
LVA948    N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；
LVA949    N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S；
LVA950    N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N；
LVA952    D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+
          T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T；
LVA953    Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+
          L227G+T231R+N233R+P256L；
LVA954    Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+
          L227G+T231R+N233R+P256L；
LVA959    N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254Y+I255F；
LVA961    N33Q+L93F+D102Y+T231R+N233R；
LVA962    D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
LVA964    N11S+N33Q+T231R+N233R；
LVA966    N11R+N33Q+T231R+N233R；
LVA968    N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA969    N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R；
LVA970    N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA972    E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
LVA973    N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
LVA976    N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F；
LVA977    N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+P256F；
LVA978    N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F；
LVA979    N11R+N33Q+G38A+G91T+G156R+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S；
LVA980    N33Q+G91K+D96S+G163T+T231R+N233R+Q249R；
LVA981    N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S；
LVA983    N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S；
LVA984    N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S；
LVA985    N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA987    N11R+G23E+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA988    N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA989    N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA990    N11R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA991    N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA993    N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA994    N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S；
LVA995    N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S；
LVA997    N11R+N33Q+G91I+G163L+T231R+N233R+D254S；
LVA998    N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I；
LVA999    N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R；
LVA1000   N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+
          L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA1002   N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
LVA1003   N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+D254S；
LVA1004   N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S；
LVA1005   N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
LVA1006   E1*+N11R+N33Q+G38A+G91N+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+
          D254S；
LVA1007   E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
LVA1008   E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
LVA1009   E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S；
LVA1010   E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R；
LVA1011   E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R；
LVA1012   E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R；
LVA1013   E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S；
LVA1014   E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+
          P256Q；
LVA1015   E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+
          D254S；
LVA1017   N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I；
LVA1018   N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+T231R+N233R；
LVA1019   N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176I+T231R+N233R；
LVA1021   N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+
          P256T；
LVA1023   N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
LVA1027   E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S；
LVA1028   N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+
          D254S+P256T；
LVA1029    N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R；
LVA1031    N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F+
           L269F；
LVA1032    N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F；
LVA1033    N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA1034    N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA1035    N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA1036    N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA1037    N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA1038    D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+
           P256T；
LVA1040    N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVA1041
      Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+
          L227G+T231R+N233R+P256L；
LVA1044  N11R+N33Q+E56Q+G 163K+T231R+N233R+D254S；
LVA1045  N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S；
LVA1046  N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；
LVA1048  N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S；
LVAR0074 N33Q+E87K+T231R+N233R；
LVAR0076 N33Q+N94K+T231R+N233R；
LVAR0077 N33Q+D96Y+T231R+N233R；
LVAR0079 N33Q+K98I+T231R+N233R；
LVAR0080 A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R；
LVAR0086 N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R；
LVAR0088 N26I+N33Q+T231R+N233R；
LVAR0091 A30T+N33Q+T231R+N233R；
LVAR0094 N33Q+G91V+T231R+N233R；
LVAR0095 N33Q+G91A+T231R+N233R；
LVAR0096 N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R；
LVAR0099 N33Q+K98I+T231R+N233R；
LVAR0101    N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R；
LVAR0102    P29T+N33Q+T231R+N233R；
LVAR0103    N33Q+G91V+T231R+N233R；
LVAR0104    N33Q+K98I+T231R+N233R；
LVAR0106    N33Q+G91E+T231R+N233R；
LVAR0108    N33Q+N94K+T231R+N233R；
LVAR204     D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+
            N233R+P256T；
LVAR205
       D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+
          N233R+P256T；
LVAR207   D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
          P256T；
LVAR208   D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+
          N233R+P256T；
LVAR209   D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111A+T114I+V168M+E210D+
          S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
LVAR214   Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D 111A+R205I+L206F+S216P+L227G+
          T231R+N233R+P256T；
LVAR215   Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+
          N233R+P256T；
LVAR216   D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+N233R+
          P256T；
LVAR218   D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+
          N233R+P256T；
LVAR219   D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
          P256T；
LVAR220   D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+T231R+
          N233R+P256T+L269H；
LVAR223   D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+
          N233R+P256T；
LVAR225    D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R
LVAR226    G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+
           L227G+T231R+N233R+P256T；
LVAR230    D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
           L227G+T231R+N233R+P256T；
LVAR231    D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+
           T231R+N233R+P256T；
LVAR234    D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+
           T231R+N233R+P256T；
LVAR235    N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+
           T231R+N233R+P256T；
LVAR277    N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+
           P256A；
LVAR280    N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S；
LVAR281    N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R；
LVAR282    N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A；
LVAR283    D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R；
LVAR284    D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T；
LVAR285    N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R；
LVAR286    N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R；
LVAR287    N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T；
LVAR288    D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+
           P256T；
LVAR290    N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A；
LVAR828
＝LVA828   N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
LVAR861    G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+
           L227G+T231R+N233R+P256T；
LVAR863    D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
           L227G+T231R+N233R+P256T；
LVAR955    N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S；
LVAR956     N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L；
LVA957      N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L；
LVAR1042    G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+
            L227G+T231R+N233R+P256T；和
LVAR1043    D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
            L227G+T231R+N233R+P256T。
以下是本发明的其它具体实施方案(SEQ ID NO：1的脂肪酶是SEQ IDNO：2的氨基酸1-269的脂肪酶的变体(T231R+N233R))：
1.一种用作药物的脂肪酶，其中所述脂肪酶是亲本脂肪酶的变体，所述变体(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少50％同一性；并且(b)具有脂肪酶活性；并且(c)包含至少一个选自以下取代的取代：N26I、D27Q、D27R、D27Y、P29T、A30T、A30V、T32I、N33Q、N33T、N33Y、P42L、E43D、E43K、E43M、E43V、A49T、E56A、E56C、E56K、E56R、E56S、D57A、D57G、D57N、V60L、L69I、E87K、G91A、G91E、G91N、G91R、G91S、G91T、G91V、G91W、L93F、N94K、N94R、N94S、D96E、D96G、D96L、D96N、D96S、D96V、D96W、D96Y、L97M、L97Q、K98I、E99D、E99K、E99P、E99S、E99T、D111A、D111S、T114I、L147S、G163K、E210D、S216P、L227G、T231R、N233R、D234K、E239V、Q249R、N251S、D254N、P256T、G263Q、L264A、I265T、G266D、T267A和L269N，其中每个位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的位置；并且(d)条件是所述变体不是(i)具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的脂肪酶，也不是(ii)(i)的脂肪酶的变体N33Q。
2.一种用作药物的脂肪酶，其中所述脂肪酶是亲本脂肪酶的变体，所述变体(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少50％同一性；并且(b)具有脂肪酶活性；并且(c)包含取代T231R和N233R，且还包含至少一个选自以下取代的取代：N26I、D27Q、D27R、D27Y、P29T、A30T、A30V、T32I、N33Q、N33T、N33Y、P42L、E43D、E43K、E43M、E43V、A49T、E56A、E56C、E56K、E56R、E56S、D57A、D57G、D57N、V60L、L69I、E87K、G91A、G91E、G91N、G91R、G91S、G91T、G91V、G91W、L93F、N94K、N94R、N94S、D96E、D96G、D96L、D96N、D96S、D96V、D96W、D96Y、L97M、L97Q、K98I、E99D、E99K、E99P、E99S、E99T、D111A、D111S、T114I、L147S、G163K、E210D、S216P、L227G、D234K、E239V、Q249R、N251S、D254N、P256T、G263Q、L264A、I265T、G266D、T267A和L269N，其中每个位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的位置；并且(d)条件是所述脂肪酶不是SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的变体N33Q。
3.一种用作药物的脂肪酶，其中所述脂肪酶是亲本脂肪酶的变体，所述变体(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少50％同一性；并且(b)具有脂肪酶活性；并且(c)在位置30、42、114和/或163中的至少一个中包含至少一个取代，其中每个位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的位置。
4.一种用作药物的脂肪酶，其中所述脂肪酶是亲本脂肪酶的变体，所述变体(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少50％同一性；并且(b)具有脂肪酶活性；并且(c)包含至少一个选自以下取代的取代：A30T、A30V、P42L、T114I和G163K，其中每个位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的位置。
5.一种用作药物的脂肪酶，其中所述脂肪酶是亲本脂肪酶的变体，所述变体(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少50％同一性；并且(b)具有脂肪酶活性；并且(c)选自以下变体：
LVA012：  D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T，
LVA023：  N33Q+E210D+T231R+N233R，
LVA041：  N33Q+D111A+T231R+N233R，
LVA043：  N33Q+G91T+T231R+N233R，
LVA049：  N33Q+G163K+T231R+N233R，
LVA061：  D27Q+N33Q+T231R+N233R，
LVA099：  D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T，
LVA349：  K98I+T231R+N233R+N251S，
LV1232：  G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N，
LV1330：  N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R，
LV1855：  D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T，
LV1857：  D27R+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T，
LV1865：  D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T，
LV1874：  D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T，
LV1889：  D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T，
LVAR0002b T32I+G91V+T231R+N233R，
LVAR0003：K98I+T231R+N233R，
LVAR0011a   G91A+T231R+N233R，
LVAR0013：  G91V+T231R+N233R，
LVAR0014    N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R，
LVAR0015    P42L+D57N+G91E+T231R+N233R，
LVAR0016    K98I+T231R+N233R，
LVAR0017    V60L+G91V+T231R+N233R，
LVAR0032：  D57G+L93F+T231R+N233R，
LVAR0045：  A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R，
LVAR0046：  E99T+T114I+D254N+T231R+N233R，
LVAR0047：  D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R，
LVAR0048    E43K+E56S+E87K+T231R+N233R，
LVAR0050：  E56S++E87K+D96L+E99D+T231R+N233R，
LVAR0051：  E56A+D57A+T114I+T231R+N233R，
LVAR0052：  G91E+T231R+N233R，
LVAR0053：  E56K+D96G+D111A+T231R+N233R，
LVAR0054：  E87K+D111S+T231R+N233R，
LVAR0055    E43V+G91R+T231R+N233R，
LVAR0056：  E56S+E87K+T231R+N233R，
LVAR0057：  E87K+G91E+T231R+N233R，
LVAR0058：  D27Y+E87K+T231R+N233R，
LVAR0059    E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R，
LVAR0061：  E56K+E87K+D111A+T231R+N233R，
LVAR0062：  E87K+E99P+T231R+N233R，
LVAR0063：  E87K+D96L+E99P+T231R+N233R，
LVAR0064：  E56C+E87K+T231R+N233R，
LVAR0065：  E56R+E87K+D96L+T231R+N233R，
LVAR0066    E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R，
LVAR0067：  E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R，
LVAR0068    E87K+L147S+T231R+N233R，
LVAR0069：  D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R，
LVAR0070    E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R，
LVAR0071    E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R，
LVAR0072：  D96V+D111A+T231R+N233R，
LVAR0074：  N33Q+E87K+T231R+N233R，
LVAR0076：  N33Q+N94K+T231R+N233R，
LVAR0077：  N33Q+D96Y+T231R+N233R，
LVAR0078：  N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R，
LVAR0079：  N33Q+K98I+T231R+N233R，
LVAR0080：  A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R，
LVAR0086：  N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R，
LVAR0088：  N26I+N33Q+T231R+N233R，
LVAR0091：  A30T+N33Q+T231R+N233R，
LVAR0094：  N33Q+G91V+T231R+N233R，
LVAR0095：  N33Q+G91A+T231R+N233R，
LVAR0096：  N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R，
LVAR0099：  N33Q+K98I+T231R+N233R，
LVAR0101：  N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R，
LVAR0102：  P29T+N33Q+T231R+N233R，
LVAR0103：  N33Q+G91V+T231R+N233R，
LVAR0104：  N33Q+K98I+T231R+N233R，
LVAR0106：  N33Q+G91E+T231R+N233R，和
LVAR0108：  N33Q+N94K+T231R+N233R，
其中每个位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的位置。
6.一种是亲本脂肪酶的变体的脂肪酶，所述变体(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少50％同一性；并且(b)具有脂肪酶活性；并且(c)在位置30、42、114和/或163中的至少一个中包含至少一个取代，其中每个位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的位置。
7.一种是亲本脂肪酶的变体的脂肪酶，所述变体(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少50％同一性；并且(b)具有脂肪酶活性；并且(c)包含以下取代中的至少一个：D27Y、P29T、A30T、A30V、T32I、N33T、N33Y、P42L、D57A、D57N、G91V、T114I、G163K、N251S，其中每个位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的位置。
8.一种是亲本脂肪酶的变体的脂肪酶，所述变体(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少50％同一性；并且(b)具有脂肪酶活性；并且(c)选自以下变体：
LVA012：    D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T，
LVA023：    N33Q+E210D+T231R+N233R，
LVA041：    N33Q+D111A+T231R+N233R，
LVA043：    N33Q+G91T+T231R+N233R，
LVA049：    N33Q+G163K+T231R+N233R，
LVA061：    D27Q+N33Q+T231R+N233R，
LVA099：    D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T，
LVA349：    K98I+T231R+N233R+N251S，
LV1232：    G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N，
LV1330：    N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R，
LV1855：    D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T，
LV1857：    D27R+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T，
LV1865：    D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T，
LV1874：    D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T，
LV1889：    D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T，
LVAR0002b   T32I+G91V+T231R+N233R，
LVAR0003：  K98I+T231R+N233R，
LVAR0011a   G91A+T231R+N233R，
LVAR0013：  G91V+T231R+N233R，
LVAR0014    N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R，
LVAR0015    P42L+D57N+G91E+T231R+N233R，
LVAR0016    K98I+T231R+N233R，
LVAR0017    V60L+G91V+T231R+N233R，
LVAR0032：  D57G+L93F+T231R+N233R，
LVAR0045：  A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R，
LVAR0046：  E99T+T114I+D254N+T231R+N233R，
LVAR0047：  D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R，
LVAR0048    E43K+E56S+E87K+T231R+N233R，
LVAR0050：  E56S++E87K+D96L+E99D+T231R+N233R，
LVAR0051：  E56A+D57A+T114I+T231R+N233R，
LVAR0052：  G91E+T231R+N233R，
LVAR0053：  E56K+D96G+D111A+T231R+N233R，
LVAR0054：  E87K+D111S+T231R+N233R，
LVAR0055    E43V+G91R+T231R+N233R，
LVAR0056：  E56S+E87K+T231R+N233R，
LVAR0057：  E87K+G91E+T231R+N233R，
LVAR0058：  D27Y+E87K+T231R+N233R，
LVAR0059    E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R，
LVAR0061：  E56K+E87K+D111A+T231R+N233R，
LVAR0062：  E87K+E99P+T231R+N233R，
LVAR0063：  E87K+D96L+E99P+T231R+N233R，
LVAR0064：  E56C+E87K+T231R+N233R，
LVAR0065：  E56R+E87K+D96L+T231R+N233R，
LVAR0066    E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R，
LVAR0067：  E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R，
LVAR0068    E87K+L147S+T231R+N233R，
LVAR0069：  D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R，
LVAR0070    E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R，
LVAR0071    E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R，
LVAR0072：  D96V+D111A+T231R+N233R，
LVAR0074：  N33Q+E87K+T231R+N233R，
LVAR0076：  N33Q+N94K+T231R+N233R，
LVAR0077：  N33Q+D96Y+T231R+N233R，
LVAR0078：  N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R，
LVAR0079：  N33Q+K98I+T231R+N233R，
LVAR0080：  A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R，
LVAR0086：  N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R，
LVAR0088：  N26I+N33Q+T231R+N233R，
LVAR0091：  A30T+N33Q+T231R+N233R，
LVAR0094：N33Q+G91V+T231R+N233R，
LVAR0095：N33Q+G91A+T231R+N233R，
LVAR0096：N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R，
LVAR0099：N33Q+K98I+T231R+N233R，
LVAR0101：N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R，
LVAR0102：P29T+N33Q+T231R+N233R，
LVAR0103：N33Q+G91V+T231R+N233R，
LVAR0104：N33Q+K98I+T231R+N233R，
LVAR0106：N33Q+G91E+T231R+N233R，和
LVAR0108：N33Q+N94K+T231R+N233R，
其中每个位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的位置。
9.实施方案1-8中任一项的脂肪酶，与蛋白酶或淀粉酶组合，用作药物。
10.实施方案1-8中任一项的脂肪酶，与蛋白酶和淀粉酶组合，用作药物。
11.根据实施方案9或10与蛋白酶和/或淀粉酶组合的脂肪酶，其中(i)所述蛋白酶与选自下组的蛋白酶具有至少70％同一性：a)具有SEQ ID NO：3的氨基酸1-274的蛋白酶，b)具有SEQ ID NO：4的氨基酸1-188的蛋白酶，和c)具有SEQ ID NO：5的氨基酸1-188的蛋白酶；(ii)所述淀粉酶与选自下组的淀粉酶具有至少70％同一性：a)具有SEQ ID NO：6的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQ ID NO：7的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQ ID NO：8的氨基酸1-483的淀粉酶。
12.使用如实施方案1-8中任一项所限定的脂肪酶或脂肪酶的混合物用于制备药物的用途，所述药物用于消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的治疗。
13.实施方案12的用途，进一步包含使用蛋白酶或淀粉酶。
14.实施方案12的用途，进一步包含使用蛋白酶和淀粉酶。
15.实施方案13或14的用途，其中所述蛋白酶和/或淀粉酶如实施方案11中所限定。
16.一种如实施方案1-8任一项中限定的脂肪酶，用于消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的治疗中。
17.实施方案16的脂肪酶，与蛋白酶或淀粉酶组合。
18.实施方案16的脂肪酶，与蛋白酶和淀粉酶组合。
19.实施方案16或17的脂肪酶，其中所述蛋白酶和/或淀粉酶如实施方案11中所限定。
20.一种药物组合物，其包含实施方案1-8任一项中限定的脂肪酶或脂肪酶的混合物，连同至少一种可药用的辅助材料。
21.实施方案20的组合物，进一步包含蛋白酶或淀粉酶。
22.实施方案20的组合物，进一步包含蛋白酶和淀粉酶。
23.实施方案21或22的组合物，其中所述蛋白酶和/或淀粉酶如实施方案11中所限定。
24.一种用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法，通过施用治疗有效量的如实施方案1-8任一项中限定的脂肪酶或脂肪酶的混合物。
25.实施方案24的方法，进一步包括施用治疗有效量的蛋白酶或淀粉酶。
26.实施方案24的方法，进一步包括施用治疗有效量的蛋白酶和淀粉酶。
27.实施方案25或26的方法，其中所述蛋白酶和/或淀粉酶如实施方案11中所限定。
本文引用了各种文献，将所述文献的公开通过提述以其完整形式并入本文。
实施例
使用的化学品是至少试剂级的商品。去离子水来自Milli-Q系统(QPAK1，Millipore，目录号CPMQ004R1)。
实施例1：酶测定法
用于猪胰酶制剂(pancreatin)中脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性的测定法已经由FIP(Fédération Internationale Pharmaceutique)以及欧洲药典(EuropeanPharmacopoeia)和美国药典(United States Pharmacopoeia)公布。所述测定法在例如：关于药用酶标准化的Fédération Internationale Pharmaceutique，ScientificSection：International Commission中有所描述。a)“Pharmaceutical Enzymes，”Editors：R.Ruyssen and A.Lauwers，E.Story Scientia，Ghent，Belgium(1978)，b)欧洲药典。也参见Deemester等在Lauwers A，ScharpéS(编)：PharmaceuticalEnzymes，New York，Marcel Dekker，1997，第343-385页中。适当的酶标准品可以从下述单位获得：International Commission on Pharmaceutical Enzymes，Centre for Standards，Harelbekestraat 72，B-9000 Ghent。
脂肪酶FIP测定法以及其它用于脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的合适测定法如下所述。
脂肪酶FIP测定法
为了测量胰酶制剂的脂肪分解活性，使用欧洲药典5.1中公布的方法。除非另作说明，为了测定微生物脂肪酶的脂肪分解活性，使用FIP公布的用于米根霉脂肪酶的测定法。
脂肪酶pNP测定法
底物：对-硝基-苯基(pNP)戊酸盐(para-Nitro-Phenyl Valerate)
测定pH：7.7
测定温度：40℃
反应时间：25分钟
带有黄色的消化产物在405nm有特征吸收。用分光光度法测定它的量。脂肪酶活性可以相对于活性已知的酶标准品来测定。可以将活性表示为Lipolase单位(LU)。1LU(Lipolase单位)是在上述标准条件下，每分钟释放1mmol可滴定的丁酸的酶量。1KLU＝1000LU。更详细的测定法描述，AF95/6-GB(针对三丁酸甘油酯(tributyrin)底物的脂肪酶/酯酶-恒定-pH方法(Lipase/Esterase-pH-STAT Method)(LU))，以及LU标准品，可向Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark请求获得。
脂肪酶LU测定法
在这种测定法中，脂肪酶催化的对0.16M三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯，Merck 1.01958.000)在pH 7.00和30℃(+/-1℃)的降解，通过用0.025M脱气的(de-gassed)、不含CO2的氢氧化钠(Sodium hydroxide titrisol，Merck 9956)对释放的丁酸进行恒定-pH滴定(pH-stat titration)来跟踪。将滴定剂的消耗作为时间的函数记录。
将底物用0.6％w/v阿拉伯树胶乳化剂乳化(20.0g阿拉伯树胶、89.5gNaCl、2.05g KH2PO4、加水至1.5l，放置直至完全溶解，加入2700ml甘油，调节pH至4.5。将90ml三丁酸甘油酯与300ml阿拉伯树胶乳化剂和1410ml脱矿质水(demineralised water)混合，并且使用例如Silverson乳化剂L4RT于7000rpm均质化3分钟，然后调节至pH 4.75)。脂肪酶样品首先在0.1M甘氨酸缓冲液(glycin buffer)pH 10.8中稀释，然后在脱矿质水中稀释，使活性水平为1.5-4.0LU/ml。将15ml乳化的底物溶液倒入滴定容器。加入1.0ml样品溶液，并且在滴定过程中将pH保持在7.0。测量为了维持恒定的pH每分钟加入的滴定剂的量。活性计算基于滴定曲线线性范围的平均斜率。可以使用已知活性的标准品作为校验水平(level check)。
1LU(脂肪酶单位)是在上述给定测定条件下，每分钟释放1微摩尔可滴定的丁酸的酶量。1kLU(千脂肪酶单位)＝1000LU。
更详细的测定法描述，EB-SM-0095.02，可向Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark请求获得。
脂肪酶恒定pH测定法
测定法基于在0.65mM胆汁盐存在下从橄榄油乳剂中由脂肪酶催化释放脂肪酸。将底物用作为乳化剂的阿拉伯树胶乳化(将175g橄榄油用630ml阿拉伯树胶溶液(4000ml水中的474.6g阿拉伯树胶、64g氯化钙)在搅拌器中乳化15分钟；冷却至室温后，使用4M NaOH将pH调节至pH 6.8-7.0)。
为了测定，将19ml乳剂和10ml胆汁盐溶液(将492mg胆汁盐溶于水中，并补充至500ml)在反应容器中混合并加热至36.9℃至37.5℃。通过加入1.0ml酶溶液开始反应。通过加入0.1M氢氧化钠自动将释放的酸滴定于pH 7.0，共进行5分钟。从第一分钟和第五分钟之间滴定曲线的斜率计算活性。为了校准，在三种不同活性水平测量标准品。
蛋白酶Suc-AAPF-pNA测定法
底物：Suc-AAPF-pNA(Sigma S-7388)。
测定缓冲液：100mM琥珀酸、100mM HEPES(Sigma H-3375)、100mMCHES(Sigma C-2885)、100mM CABS(Sigma C-5580)、1mM CaCl2、150mMKCl、0.01％Triton X-100(非离子表面活性剂，具有分子式：C14H22O(C2H4O)n其中每分子环氧乙烷单元的平均数为大约9或10，CAS #：9002-93-1)，用HCl或NaOH调节至pH 9.0。
测定温度：25℃。
将300μl稀释的蛋白酶样品与1.5ml试验缓冲液混合，通过加入1.5mlpNA底物(50mg溶于1.0ml DMSO中，并用0.01％ Triton X-100进一步稀释45x)开始活性反应，并且，在混合后，用分光光度计监测A405的增加，作为对蛋白酶活性的测量。在活性测量之前将蛋白酶样品稀释，以确保所有活性测量结果都落在测定法的剂量-反应曲线的线性范围中。
蛋白酶AU测定法
变性的血红蛋白(0.65％(w/w)于含尿素的6.7mM KH2PO4/NaOH缓冲液pH 7.50中)在25℃用蛋白酶降解10分钟，再用三氯乙酸(TCA)将未降解的血红蛋白沉淀，并过滤去除。用Folin & Ciocalteu的苯酚试剂(1体积Folin-Ciocalteu Phenol Reagent Merck 9001.0500加至2体积脱矿质水)测定滤液中TCA可溶性的血红蛋白降解产物，所述苯酚试剂与几种氨基酸一起得到蓝色(在750nm测定)。活性单位(AU)参照标准品来测量和定义。变性的血红蛋白底物可以如下制备：将1154g尿素(Harnstoff，Merck 8487)溶于1000ml脱矿质水中，加入240.3g NaOH，然后慢慢加入63.45g血红蛋白(Merck4300)，然后加入315.6g KH2PO4，加脱矿质水至3260g。将pH调节至7.63。更多细节和合适的Alcalase标准品可向Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark(测定号：EB-SM-0349.01)请求获得。
淀粉酶
底物：Phadebas片剂(Pharmacia Diagnostics；交联、不溶、蓝色的淀粉聚合物，将其与牛血清白蛋白和缓冲物质混合，并制成片剂)
测定温度：37℃
测定pH：4.3(或7.0，如果需要)
反应时间：20分钟
在悬浮于水中后，用α-淀粉酶水解淀粉，得到可溶的蓝色片段。所得蓝色溶液于620nm测得的吸光度是α-淀粉酶活性的函数。α-淀粉酶活性可以相对于活性已知的标准品来测定，例如按照真菌α-淀粉酶单位(FAU)表示。1FAU是在标准测定条件每小时分解5.26g淀粉(Merck，Amylum solubile Erg.B.6，批号9947275)的酶量。更详细的测定法描述，APTSMYQI-3207，和FAU标准品，可向Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark请求获得。
实施例2：具有改进的磷脂酶活性的脂肪酶变体
将编码下表1中所示的脂肪酶变体的DNA转化入米曲霉菌株ToC1512(在WO 2005/070962中描述)，其中使用美国专利No.5,869,438的实施例22中所述的方法，只是使用PyrG选择(在WO 2004/069872中描述)代替AMDS选择。从琼脂斜面取得米曲霉宿主的孢子并且用于接种10ml YPM(10g酵母提取物，Difco+20g蛋白胨，Difco，加水至1L，将其高压灭菌；加入除菌过滤的麦芽糖至2％(w/w))。将接种的试管在New Brunswick Scientific Innova 2300摇床中以180rpm于30℃温育3天。通过用Mira-Cloth(Calbiochem)过滤培养物，再用0.45um(微米)滤器进行除菌过滤，收获了上清液。如美国专利No.5,869,438的实施例23中所概括描述的来纯化所述脂肪酶变体。
表1.脂肪酶变体I
Figure G2007800516386D01041
Figure G2007800516386D01051
以下脂肪酶用于比较并且也如上所述制备：
来自疏棉状腐质霉DSM 1800的野生型脂肪酶具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列并且在例如美国专利No.5,614,189中将其描述用于药物用途，并且它的具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的(T231R+N233R)变体在WO2006/136159中描述用于药物用途。
将以下脂肪酶充当阳性对照(磷脂酶活性阳性)：
变体LV1232，如与SEQ ID NO：2相比具有以下取代：G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N。
如下文中所述测试这些脂肪酶的磷脂酶活性。
酶：
将酶样品在酶稀释缓冲液(20mM乙酸钠，0.01％w/w Triton-X100，pH5.0)中稀释至5mg/mL(每ml中酶蛋白(EP)的mg数)。酶浓度基于A280和计算的摩尔吸光系数测定(程序GPMAW(Lighthouse Data，Odense，Denmark；http://welcome.to/gpmaw；也可参见Gill和von Hippel，1989，Calculation ofprotein extinction coefficients from amino acid sequence data，Anal.Biochem.182：319-326)。
底物：
底物1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(下文中为“磷脂酰胆碱”)可从Avanti Polar Lipids Inc.，700 Industrial Park Drive，Alabaster，AL 35007，US，目录号850445以商业方法获得，其溶液如下制备：
1将7.5mg磷脂酰胆碱溶于750uL(微升)去离子水
2在室温搅拌1小时
3加入37.5uL 0.32M CaCl2
4搅拌1-2分钟
5加入375uL 16mM脱氧胆酸钠
6加入750uL去离子水
7在室温搅拌30分钟
酶反应：
1将100uL底物转移至2mL的Eppendorf管
2加入5uL酶，如上所述稀释至5mg/mL
3在Eppendorf热混合器(thermomixer)中于40℃、1000rpm温育20分钟
4将10uL反应混合物转移至新的Eppendorf管并且加入990uL 50％甲醇(MeOH)，0.1％(w/w)三氟乙酸(TFA)
5通过MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption/IonizationTime-Of-Flight mass spectrometry)进行分析，分析之前与这种基质混合：50％MeOH，0.1％TFA中的20mg/mL 2，5-二氢苯甲酸
将底物对照包括在内，其中加入5uL酶稀释缓冲液代替步骤2中的酶。在步骤5中对于每种样品进行四次独立的测定。使用的MALDI-TOF MS设备是具有外部校准的、具有反射模式的阳性电离的Voyager DE PRO仪器(Calmix 2，Applied Biosystems)。
通过选择具有不同长度的酯键合的酸的基于甘油的底物，通过测量消化后甘油主链的质量可以辨别酶特异性(攻击1-位或2-位)。各种可能的消化后甘油主链的质量是：
706Da磷脂酰胆碱
496Da  A1水解(磷脂酰胆碱去掉(minus)位置1的肉豆蔻酰(C14))
468Da  A2水解(磷脂酰胆碱去掉位置2的棕榈酰(C16))
258Da  A1和A2水解(未降解的磷脂酰胆碱去掉C14和C16)
结果：
将代表706、496、468和258Da分子量的MS峰的相对信号强度(每个峰下的面积)用作计算磷脂酶A1和A2活性(PLA1-和PLA2-)之间分布的基础。
来自两个不同实验(I和II)的结果示于下文表2和3。
通常，A1/A2相对于A2/A1在10-15％以上的信号强度可以表明是真实的双重活性或不纯的样品。
表2：实验I：脂肪酶变体的磷脂酶活性
Figure G2007800516386D01071
表3：实验II：脂肪酶变体的磷脂酶活性
Figure G2007800516386D01072
结论：
测试的所有脂肪酶在某种程度上具有磷脂酶活性，主要作为PLA1活性。阳性对照，LV1232，在两项实验中显示了高磷脂酶活性。
当在相同的实验(实验I)中进行测试时，SEQ ID NOS：1和2的现有技术磷脂酶在磷脂酶活性方面显示了几乎相同的性能，在水解之后分别剩余了大约44％和42％的未消化磷脂。
预期以下磷脂酶变体如与SEQ ID NO：2相比具有改进的磷脂酶活性：LV1232、LV1889和LVA023(实验I)，及LV1232、LV1330、LV1855、LV1865、LV1874、LV1889、LVA043、LVA049和LV1857(实验II)。在两项实验中变体LV1232和LV1889特别显示出大大改进的磷脂酶活性。
实施例3：在pH6具有改进的活性的脂肪酶变体
测试了上文表1中所示的多种纯化的脂肪酶变体在10mM胆汁盐存在下于pH6的活性。如实施例1中，将SEQ ID NO：2和1的脂肪酶包括用于比较。
化学品和试剂：
测定缓冲液pH 6：100mM咪唑，100mM乙酸盐，100mM丙二酸，pH 6.0
酶稀释缓冲液：5mM NaH2PO4pH 7.0
7mM CaCl2(Merck，1.02382.0500)
胆汁盐(80mM)：脂肪酶活化性胆汁盐混合物，来自SolvayPharmaceuticals，批号176.01-PA-7374
三亚油精(甘油三亚油酸酯(glyceryl trilinoleate)，Sigma T9517)
胃蛋白酶：(Merck VL 317492437，目录号1.0792.0001)
终止溶液：10％Triton-X100，1M磷酸。
底物：
底物工作乳剂的制备如下：
1.混合2.188mL胆汁盐(80mM)与6.68mL去离子水。
2.加入0.133mL三亚油精(甘油三亚油酸酯，Sigma T9517)。
3.用Ultraturex混合器(黄线DI 25基础型(yellow line DI 25basic))在室温混合1分钟。
如此得到含19.44mM胆汁盐和15.56mM三亚油精的底物的工作乳剂。
酶：
将酶样品在5mM NaH2PO4pH 7.0中稀释至0.07mg/mL(每ml中酶蛋白的mg数)。酶浓度基于A280。将酶在5mM NaH2PO4中稀释两倍(总共制备六个稀释物和无酶/缓冲液对照)。这些稀释物在孔中给出以下酶的终浓度：0.01mg/ml、0.05、0.025、0.0125、0.0625、0.03125和0.015625mg/ml。
测定步骤：
1.在微量滴定板(MTP)中将35ul(微升)测定缓冲液与25ul 7mM CaCl2混合。加入90ul底物工作乳剂。在37℃，700rpm预温育20分钟。
2.加入25ul各种酶稀释液，并且在37℃，700rpm(终体积175ul)温育30分钟。MTP孔中的胆汁盐和三亚油精的终浓度分别为10mM和8mM。
3.加入50ul终止溶液(10％Triton-X100，1M磷酸)和25ul胃蛋白酶(700mg/l)。在室温温育10分钟。加入胃蛋白酶，其是一种蛋白酶，从而避免在后续步骤(游离脂肪酸(FFA)的测定)中pH升高时脂肪酶蛋白再活化。
4.立即将样品在1％Triton-X100中稀释10倍用于通过NefaC(Wako，Nefa C ACS-ACOD法酶显色测试，代码：999-75406)检测FFA。
通过NefaC试剂盒(Nefa C ACS-ACOD法酶显色测试，代码：999-75406)检测游离脂肪酸：
1.制备溶液A：将R1a瓶用10ml的R1瓶(来自NefaC试剂盒)溶解
制备溶液B：将R2a瓶用20ml的R2瓶(来自NefaC试剂盒)溶解
2.将Cal1 Nefa C标准品油酸(28.2mg/dl-1mmol/L)稀释于1％Triton-X100以获得NefaC标准品的以下浓度：1mM、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125和0.015625mM。
3.将25ul标准品/脂肪酶样品与50ul溶液A混合。在室温，700rpm温育15分钟。
4.加入100ul溶液B，在室温，700rpm温育15分钟。
结果：
从Nefa C标准曲线测定以mM为单位的FFA浓度。将脂肪酶活性结果拟合成Michealis-Menten样拟合：
A＝A0+Amax*[E]/([E]+K)
测定V0(mmol FFA/g酶蛋白/分钟)，并且测定相对于SEQ ID NO：1的脂肪酶的V0的比例。在每个MTP上将SEQ ID NO：1的脂肪酶和变体LV2934(SEQ ID NO：1的非糖基化变体)包括作为对照。
将相对于SEQ ID NO：1标准化的结果示于以下的表4中。
表4：在pH 6对三亚油酸酯的脂肪酶活性
结论：
基于以上结果考虑，除了LV1889、LV1874和LV1865，测试的全部变体如与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比，使用含10mM胆汁盐的三亚油酸酯底物在pH 6具有更高的活性。
LVA049、LVA349、LVA023和LVA099脂肪酶变体在这个方面似乎远优于用于比较的SEQ ID NO：2的脂肪酶，事实上优于SEQ ID NO：1脂肪酶。特别对于LVA049和LVA349脂肪酶变体，更特别对于LVA049脂肪酶变体而言是如此。
实施例4：在pH3具有改进的稳定性的脂肪酶变体
测试了上文表1所列的多种脂肪酶变体在pH范围2-8中的pH稳定性。如先前的实施例中，将SEQ ID NO：2和1的脂肪酶包括用于比较。还测试了SEQ IDNO：2的脂肪酶的以下变体：
LVA147：D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T
LVA315：N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G
LVA317：N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S
LVA319：N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S
LVA714：D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+
        D254S
将每种酶在两个浓度(0.05和1.0mg酶蛋白/ml)以一式两份进行测试。此外，在含或不含胆汁盐10mM，及含和不含胃蛋白酶(70mg/l)条件下测试酶。
简言之，将酶在期望的pH于37℃温育1、15、45和120分钟(或1、60和120分钟)，其后在pH 8和室温(RT)针对p-硝基苯基辛酸酯测量残余脂肪酶活性。
化学品/试剂：
酶稀释缓冲液：20mM乙酸盐pH 6，0.01％Triton-X100
稳定性缓冲液：200mM咪唑，200mM乙酸盐，200mM丙二酸，调节至pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0。
残余活性缓冲液(RA缓冲液)：200mM Tris(三羟甲基氨基甲烷，2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇，CAS号：77-86-1)pH 8，0.4％Triton-X100，1mM CaCl2
pNP辛酸盐：Sigma N-0752
胃蛋白酶(700mg/l)：Merck，VL 317492437(1.0792.0001)
胆汁盐(80mM)：脂肪酶活化性胆汁盐混合物，来自SolvayPharmaceuticals(批号176.01-PA-7374)
酶：
将酶在20mM NaH2PO4pH 7.0，0.01％Triton-X100中稀释成0.4或0.8mg酶蛋白每毫升(基于A280)的工作溶液。
稳定性测定法：
1)向微量滴定板(MTP)的每个孔中加入50ul稳定缓冲液，20ul 0.1％Triton-X100，25ul胆汁盐(80mM)或20ul胃蛋白酶(700mg/l)或去离子水。向每孔加入去离子水至终体积为175ul。将全部样品制成一式两份。在700rpm于37℃预热20分钟。
2)加入25ul酶(终浓度0.05或0.1mg酶蛋白每毫升)。对于每个pH，包括含胃蛋白酶和胆汁盐的无酶对照，即向这些孔加入25ul 20mM NaH2PO4pH7.0，0.01％Triton-X100。在37℃700rpm温育1、15、45和120分钟。
3)取20ul的等分试样并且用180ul残余活性缓冲液pH 8.0稀释样品，将样品保持在冰上。
4)稀释样品(最低稀释20x以使pH增加至8)。在稀释20x、40x、80x、160x和320x的1分钟样品pH 8上得到初始残余活性(RA)以确定在测定中获得线性所需的稀释度。
5)如下文所述用pNP辛酸盐底物在pH 8.0测量RA。
底物：
底物储液通过混合14.2ul p-硝基苯基辛酸酯(Sigma N-0752)和1ml 2-丙醇来制备。将这种储液在残余活性缓冲液pH 8.0中稀释50x得到工作溶液，将150ul所述工作溶液加入每个孔。
测定残余活性(RA)的步骤：
1)在新的MTP中将20ul稀释的样品和150ul底物工作溶液混合。
2)在405nm测量动力学5分钟(从混合开始(mix first time)，每12秒读数一次，室温)。
结果：
％残余活性如下计算：用每种取样样品(1、15、45、120分钟)每个pH内的比例减去含胆汁盐或胃蛋白酶的无酶对照的比例。然后用这种校正的比例除以每个pH内的最大值，再乘以100。
下文的表5显示了与SEQ ID NO：2相比得到改进的那些变体在pH 3的稳定性(在缓冲液中，分别在胃蛋白酶存在下，或在胆汁盐存在下)。仅显示了在pH 3得到的稳定性，因为在此pH观察到了最显著的差异。
Figure G2007800516386D01151
Figure G2007800516386D01161
Figure G2007800516386D01171
结论：
以下脂肪酶变体与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比在pH 3具有改进的稳定性：LV2934、LVA043、LVA049、LV1855、LV1865、LV1874、LV1889、LV1857、LVA012、LVA023、LVA041、LVA061、LVA099、LVA147和LVA714。
以下脂肪酶变体与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比在pH 3有胃蛋白酶的条件下具有改进的活性：LVA043、LV1855、LV1865、LV1874、LV1889、LV1857、LVA012、LVA099、LVA315、LVA317、LVA319和LVA714。
以下蛋白酶与SEQ ID NO：2的脂肪酶相比在pH 3有胆汁盐的条件下具有改进的活性：LVA349。
实施例5：脂肪酶变体的微量纯化(micro-purification)
下文表6中显示的额外的脂肪酶变体直到并且包括对发酵上清液的除菌过滤是如实施例2中所述制备的。
表6：脂肪酶变体II
Figure G2007800516386D01181
将除菌过滤的含脂肪酶的培养物上清液使用以下方案微量纯化：向过滤板(Unifilter 800，25um(微米)熔化吹制聚丙烯滤器(melt blownpolypropylene filter)，Whatman)的孔加入大约50ul(微升)XpressLine ProA层析介质(可从Upfront Chromatography A/S，Lersoe Parkalle 42，DK-2100Copenhagen，Denmark以商业方法获得)。将层析介质通过加入200ul 1M乙酸钠pH 5.0来平衡。在搅拌10分钟之后，通过真空去除平衡缓冲液(Uni-Vac 3，Whatman)。重复平衡步骤。然后将100ul结合缓冲液(1M乙酸钠，pH 5.0)和400ul培养物上清液加入并且与层析介质混合30分钟。通过真空去除未结合的材料。重复结合步骤。将结合了脂肪酶的层析介质用缓冲能力递减的200ul洗涤缓冲液(100/50/10mM乙酸钠，pH 5.0)洗涤3次。在每个洗涤步骤中，加入缓冲液，将平板摇动10分钟，再通过真空去除洗涤缓冲液。最后，将结合的脂肪酶通过加入两次100ul 100mM Tris，0.02％ Brij 35(聚氧乙烯(23)月桂醚)，pH 9.0来洗脱。对于每个洗脱步骤，将平板摇动15分钟，然后通过真空将洗脱的脂肪酶收集在微量滴定板中。
实施例6：测定脂肪酶变体的浓度
活性位点滴定
通过如下文中描述的爆发活性位点滴定(burst active site titration)测定了经过纯化的脂肪酶变体的浓度(按照常规如实施例2中概括描述的进行纯化，和/或如实施例6中描述的进行微量纯化)。
按照需要，将纯化的脂肪酶在0.01％Triton-X100稀释，以获得5uM(对应于150ug酶蛋白/ml)以下的浓度。将100ul纯化的脂肪酶与大约100ul溶解在1M Tris，4mM SDS(十二烷基硫酸钠)，pH 9.0中的40uM试卤灵(乙基试卤灵庚基磷酸酯(ethyl resorufinyl heptylphosphonate)，一种脂肪酶抑制剂)在黑色微量滴定板的孔中混合。试卤灵的精确浓度不重要，只是如与5uM脂肪酶相比必需过量添加试卤灵。混合之后即可测量来自释放的试卤灵的荧光的动态(kinetics)，酶分钟测量一次，持续1-3小时(直到爆发终止)(在515nm激发，在590nm发射，在来自BMG LabTechnologies GmbH的POLARstar荧光强度测量仪上测量)。
将测得的荧光值拟合成方程式：
F＝F0+爆发*(1-exp(-(t+dt)*ln(2)/T1/2)+斜率*(t+dt)
其中F是测得的荧光，F0是来自抑制剂和脂肪酶的荧光背景，t是从第一次荧光测量起的时间，dt是从将脂肪酶与抑制剂混合到第一次荧光测量的时间，爆发是荧光爆发，T1/2是指数爆发的半衰期，且斜率是荧光线性变化的斜率，例如，由于脂肪酶-乙基庚基磷酸络合物的水解和/或试卤灵的漂白。将活性磷脂酶浓度按照计算的爆发和试卤灵标准曲线的斜率(0-4uM；包括在微量滴定板上)之间的比例来测定。
从A 280 测定浓度
还从280nm的吸光度估计了纯化的脂肪酶变体的浓度，使用消光系数1.24A280/mg。
实施例7：脂肪酶变体的体外测试
如下所述在体外消化模型中测试了纯化的脂肪酶变体。
在所述体外消化模型中使用两种饮食(分别为饮食I和饮食II)中的任一种。饮食I的组成是34％(w/w)脂肪，45％(w/w)碳水化合物，2％(w/w)蛋白质(其余为水、盐等)。饮食II的组成是：脂肪313，蛋白质146，和淀粉358(无氮提取物，NfE，可以计算成432)，均为g/kg干重。
饮食I通过将247.2g牛乳(1.5％脂肪)、29.9g橄榄油、87g Calshake(可从Fresenius Kabi以商业方法获得，并且具有2077kJ/g含能量，蛋白质含量为4.3g乳蛋白/100g，且脂肪含量为24.4g脂肪/100g)和9.9g Methocel(食用级，E5 Premium LV FG(E464)；Dow)使用UltraTurrex(YellowLine DI 25基础型)混合2分钟来制备。为了降低粘度，将所述饮食用0.5ug/ml的SAVINASE 16.0 LEX蛋白酶(可从Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880Bagsvaerd，Denmark以商业方法获得)在pH 8.0在50℃处理4小时。然后通过将pH降低至3并且在70℃温育30分钟或在50℃温育60分钟使所述蛋白酶失活。
饮食II由73g/kg(湿重)禽类餐食(Altromin)、73g/kg豌豆粉、73g/kg酪蛋白(在酸性条件下沉淀，来自Altromin)、290g/kg小麦面粉、290g/kg马铃薯淀粉、125g/kg猪油、76g/kg维生素、矿物质和痕量元素、375g/kg牛奶油(33％脂肪)组成。
将100ul饮食与20ul胃蛋白酶(Merck VL 317492437，目录号1.0792.0001，700mg/ml)和30ul脂肪酶(4个浓度，一式两份)在微量滴定板的孔中混合。如果胃步骤将在pH 5进行，那么加入10ul缓冲液(0.8M MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)，0.8M乙酸钠，0.8M咪唑，pH 7.0)，而如果胃步骤使用pH 3，那么不加入缓冲液。将微量滴定板在37℃伴随振荡(Eppendorf热混合器，750rpm)温育1小时，然后加入15ul(如果胃步骤使用pH 5)，或25ul(如果胃步骤使用pH 3)缓冲液(0.8M MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)，0.8M乙酸钠，0.8M咪唑，pH 7.0)和20ul胆汁盐(50g/l，对应于100mM，使用500g/mol的平均分子量)；脂肪酶活化性胆汁盐混合物，来自SolvayPharmaceuticals(批号176.01-PA-7374))使pH为5.7-6.0。然后将平板在37℃伴随摇动温育2小时，然后通过加入1M磷酸中50ul的10％Triton-X100来终止反应。在1％Triton-X100中稀释125-250倍之后，使用来自WakoChemicals的NEFA C试剂盒，如实施例3中所述，测定了游离脂肪酸的量。
将剂量相应曲线拟合成方程式：
FFA＝FFAmax*[E]/([E]+K).
其中FFA是释放的游离脂肪酸的量，FFAmax是脂肪酶能够从所述饮食中释放的游离脂肪酸的最大量，[E]是脂肪酶浓度，且K是释放一半FFAmax的脂肪酶浓度。假设FFAmax对于脂肪酶是一样的，将改进因子(IF)定义为：
IF＝K(参照)/K(脂肪酶)
其中K(参照)是释放一半FFAmax的参照脂肪酶的浓度，而K(脂肪酶)是释放一半FFAmax的脂肪酶变体浓度。
对于下文表7a和8a中列出的变体，作为参照，我们使用了SEQ ID NO：1的脂肪酶及其去糖基化变体N33Q(表1中的LV2934)的平均值，即，K(参照)＝1/2x(K(SEQ ID NO：1)+K(LV2934))。
下文表7a和8a所列的脂肪酶变体全部具有大于1.0的改进因子。这意味着如与参照脂肪酶相比，为了获得相似效果所需的这些脂肪酶的量较低。任何脂肪酶变体相对于例如SEQ ID NO：2的改进因子可以按照所述的脂肪酶变体相对于参照脂肪酶的改进因子除以SEQ ID NO：2相对于所述参照脂肪酶的(常量)改进因子来计算，其示于下文的表7a。当例如使用活性位点滴定(AST，实施例6)来测定脂肪酶浓度时，并且如果所述的变体的改进因子是相对于SEQ ID NO：2的脂肪酶计算的时，用所述的变体的平均IF除以SEQ ID NO：2的平均IF，后者为0.88，优选0.9。
对于下文表7b、8b、8c和8d中所列的其它脂肪酶变体，使用SEQ ID NO：1的去糖基化变体N33Q(表1的LV2934)作为参照脂肪酶。这些脂肪酶中的每一个都具有大于1.00的改进因子(平均改进因子减去标准差)。为了选择改进的脂肪酶，使用小数点后有两位的IF值和标准差。然后将这些数字圆整到小数点后一位。
表7a：具有改进的体外性能的脂肪酶变体(微量纯化的)
Figure G2007800516386D01231
Figure G2007800516386D01241
-是指“未测定”
表7b：具有改进的体外性能的其它脂肪酶变体
Figure G2007800516386D01242
Figure G2007800516386D01251
表8a：具有改进的体外性能的脂肪酶变体(纯化的)
表8b：具有改进的体外性能的其它脂肪酶变体
Figure G2007800516386D01272
Figure G2007800516386D01281
Figure G2007800516386D01291
Figure G2007800516386D01311
Figure G2007800516386D01321
Figure G2007800516386D01331
Figure G2007800516386D01341
Figure G2007800516386D01361
Figure G2007800516386D01371
表8c：具有改进的体外性能的其它脂肪酶变体
Figure G2007800516386D01382
Figure G2007800516386D01391
饮食I
(胃步骤中为pH 3)
Figure G2007800516386D01392
Figure G2007800516386D01401
表8d：具有改进的体外性能的其它脂肪酶变体
Figure G2007800516386D01402
Figure G2007800516386D01411
Figure G2007800516386D01421
实施例8：在胃蛋白酶存在下在pH 3具有改进的稳定性的脂肪酶变体
筛选了实施例5中表6的变体在胃蛋白酶存在下在pH 3的稳定性，以及下文表9的变体。
所述变体选自以下文库：SEQ ID NO：1的氨基酸21-100的两个随机诱变的酵母文库和一个靶向以下变化的SEQ ID NO：1的靶向酵母文库：D27X、E43X、E56X、D57DA、D62DA、E87EK、D96DL、E99X、D111X、D234XQ249QR、D254DN；一个靶向以下变化的含G91T和G163K的SEQ ID NO：1的靶向酵母文库：N11R、D27RQNV、G38X、D96EW、K98X、T114I、K163WA、E210VD、R231I、D254SGQIK和P256TA；一个含G91T和G163K的SEQ IDNO：1的随机诱变文库；一个含D27R、G91N、N94R、D111A、S216P、L227G和P256T的SEQ ID NO：1的随机诱变文库；或者所述变体是从SEQ ID NO：1生成的定点变体。酵母是酿酒酵母JG169(MATα；ura3-52；leu 2-3，112；his3-D200；pep 4-113；prd::HIS3；prb1::LEU2；cir+)。
表9：脂肪酶变体III
Figure G2007800516386D01422
原理
筛选过程测量的是在75ug/mL胃蛋白酶存在下在pH 3.0和室温处理3小时之后的残余脂肪酶活性。在速率测定法中测量残余脂肪酶活性，所述测定法监测随时间变化的活性，以允许在筛选事件中检测到非常高活性和非常低活性的脂肪酶。
在最初的变体筛选中，对培养液样品进行足够大的稀释以最小化培养基或发酵成分对测试条件的影响。通过加入测试样品的更多稀释和重复，使通过初步阶段的变体在后续筛选中历经更多测试。
材料和方法
初步筛选培养基：
1.7g含硫酸铵的酵母氮基底(yeast nitrogen base)(YNB)(Bio 101，目录号4027-532)，0.8g完全补充混合物-尿嘧啶(Complete SupplementMixture-Uracil)(CSM-ura)w/40mg腺嘌呤(ADE)(Bio 101，目录号4512-722)，5g酪蛋白氨基酸(BD，目录号223050)，100ml 50％葡萄糖，50ml 0.5MK2HPO4(磷酸氢二钾)，1ml 100mM CuSO4-5H2O(JD Baker，目录号1843-01)，1ml 100mg/mL氨苄青霉素，用去离子水将总体积调整为1升。将所述培养基过滤除菌并且储存在4℃。
优化培养基：
6.7g含硫酸铵的YNB(Bio 101，目录号4027-532)，5.9g琥珀酸(SigmaS-9512)，0.8g CSM-ura w/40mg ADE(Bio 101，目录号4512-722)，20g半乳糖(Sigma，目录号G-0625)，10g葡萄糖，1ml 100mM CuSO4-5H2O和1ml100mg/mL氨苄青霉素。用NaOH将pH调节至6.6，并且用去离子水将体积调整为1升。将所述培养基过滤除菌并且储存在4℃。
种子培养基：
混合以下成分：6.7g含硫酸铵的YNB(Bio 101，目录号4027-532)，5g酪蛋白氨基酸(BD，目录号223050)，100ml 0.5M琥珀酸(Sigma S-9512)，855ml去离子水。高压灭菌所述混合物。加入2ml 10mg/mL氯霉素和40ml50％葡萄糖。储存在4℃。
用于制备底物和经胃蛋白酶处理的储液：
1.10％Triton-X100(w/v)
2.1M TRIS，pH 8.0
3.10％(680mM)CaCl2*2H2O
4.100mM柠檬酸，pH 3.0
5.5mg/mL猪的胃蛋白酶(Sigma P-6887，3280U/mg固体，3370U/mg蛋白质)，制备在100mM柠檬酸，0.01％Triton-X100中
6.50mM 4-硝基酚(PNP)棕榈酸盐，制备在10％Triton-X100中
用于脂肪酶活性测定的底物：
1mM PNP-棕榈酸盐，1.2％Triton-X100，4mM CaCl2，100mM TRIS，pH8.0
胃蛋白酶处理溶液：
150ug/mL胃蛋白酶，4mM CaCl2，0.01％Triton-X100，50mM柠檬酸盐，pH 3.0
稀释剂：
0.01％Triton-X100，10mM NaCl
酶：
用于初步筛选的脂肪酶变体的培养液样品源自从琼脂平板将单克隆挑取至96孔板中的初步筛选培养基中。
培养物的生长：
使用三种培养基配方来培养脂肪酶变体。因为在初步筛选水平的表达水平不是关键，使用初步筛选培养基用于较早期的筛选阶段。将表达单一脂肪酶变体的酵母菌落挑取至96孔板中的180uL初步筛选培养基中并且在30℃和250rpm培养4-6天进行样品的初步筛选。
对于第二轮筛选，将来自初步筛选平板的20uL培养物转移至24孔板中的1mL种子培养基中，并且在30℃和250rpm过夜培养。脂肪酶的表达通过将20uL种子培养物接种到24孔板中的1mL优化培养基中在30℃和250rpm中培养4-6天来实现。
对于任何后续的筛选，将单酵母菌落挑取至24孔板中的1mL种子培养基中，并且在30℃和250rpm过夜培养。脂肪酶的表达通过将20uL种子培养物接种至24孔板中的1mL优化培养基中在30℃和250rpm中培养4-6天来实现。使用优化的培养基用于在24孔板和摇瓶中的培养来最大化蛋白表达水平。
筛选步骤：
在初步筛选中，将样品在稀释剂中稀释25倍，然后将5uL加入含有5uL稀释剂或胃蛋白酶处理溶液的384孔板中。
在室温3小时之后，如下将底物加入每个样品：将经胃蛋白酶处理的样品与55uL底物+5uL稀释剂混合，将未经处理的样品与55uL底物+5uL胃蛋白酶处理溶液混合。胃蛋白酶pH是3.0，如果不补偿pH的变化，活性测定将在两个不同的pH值进行，所以这种做法将测定pH标准化而对脂肪酶稳定性没有影响(在结束时加入胃蛋白酶，结束时底物的pH足以使整体pH提高至8.0，在该pH胃蛋白酶没有活性)。读取384孔板的OD405读数6次；最早在加入底物之后15分钟，直到加入底物之后18小时，并且将该读书表示为mOD(毫OD)/小时。收集落入线性范围的数据并且将每种经胃蛋白酶处理的样品的残余脂肪酶活性与相应的未经处理的样品的残余脂肪酶活性比较。将这种结果作为％残余活性(％RA)在下文报告；通过用处理条件的比例处以未处理条件的比例并且将结果乘以100。
可以使用由下列组成的系统来完成自动操作：功能为移动平板和进行移液步骤的Biomek FX工作站，记录测定平板的数据的DXT 880平板度数器，将平板转移到工作站或从工作站转移平板的转盘和传送带系统。这种过程接受96孔平板形式的样品，以相同的形式进行稀释，然后使用384孔平板进行处理和测定步骤。
结果：
在第二轮筛选之后测量的每种脂肪酶变体的相对残余活性示于下表10。这些变体中的每种与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶相比具有改进的RA(在胃蛋白酶存在下于pH 3的稳定性)。
表10：在胃蛋白酶存在下与pH 3温育之后的残余脂肪酶活性
Figure G2007800516386D01471
Figure G2007800516386D01481
实施例9：在胆汁盐存在下具有改进的活性的脂肪酶变体
为了鉴定在胆汁盐存在下具有改进的活性的脂肪酶变体，开发了以下测定法。所述测定法测量与不含胆汁盐的条件相比在2mM胆汁盐存在下的脂肪酶活性。测试的设定使脂肪酶活性在速率测定中进行测量，所述速率测定监测随时间变化的活性以允许检测到非常高活性和非常低活性的脂肪酶。这种测定被自动化以精确控制加入试剂的时机并且将反应的pH从pH 5.0(其中脂肪酶与底物在低pH反应)调节至pH 8.0(允许在OD 405对释放的PNP基团进行读数的pH)。在pH调节进行之后立即对平板进行读数。
用于测定底物和胆汁盐处理的储液：
1.10％Triton-X100(w/v)
2.100mM TRIS，pH 8.0
3.100mM琥珀酸盐，pH 5.0
4.10％(680mM)CaCl2*2H2O
5.在蒸馏水中配制的20mM胆汁盐(Sigma B-8756)
6.在10％Triton-X100中配制的50mM 4-硝基酚(PNP)油酸盐
用于脂肪酶活性测定的底物：
1mM PNP-油酸盐，1.2％Triton-X100，2mM CaCl2，25mM琥珀酸盐，pH 5.0
稀释剂：
0.01％Triton-X100，10mM NaCl
酶：
将纯化的脂肪酶样品在稀释剂中稀释至大约8微克/mL用于自动化方法。纯化的脂肪酶样品的浓度是使用消光系数1.24 A280/mg从280nm的吸光度测定的。
基于液体的胆汁盐测定法筛选步骤：
将酶样品在稀释剂中稀释25倍和200倍，然后将100微升加入96孔板反应平板中的23微升水中或23微升20mM胆汁盐中。在此之后，将200微升底物(25mM琥珀酸盐，2mM CaCl2，1.2％Triton-X100，pH 5.0中的1mMPNP油酸盐)加入并混合。混合之后，立即取出60微升，并且用移液器移入四个单独的384孔平板，每个15微升，在所述平板中使用4个象限(4x96)为2种稀释度的脂肪酶样品的每一种设置“+”和“-”胆汁盐条件。使用四个384孔平板设置4个时间点(由此每个平板具有脂肪酶的2种稀释，各有“+”和“-”胆汁盐)。在1、2、3和4小时之后，将60微升的100mM TRIS，pH 8.0加入适当的平板和象限，并且立即读数(OD 405和OD 540)。～0.1-0.475的OD是本测定所使用的线性范围。通过计算“胆汁盐”活性根据时间和稀释度校正的全部线性数据的平均值除以“无胆汁盐”活性根据时间和稀释度校正的全部线性数据的平均值的结果，将在pH 5.0在胆汁盐存在下的活性比表示为百分比。相对于参照(SEQ ID NO：1的变体N33Q)的活性比通过用变体+/-胆汁盐的比例处以参照+/-胆汁盐的比例来计算并且作为倍数改进来报告(例如，3X是指300％)。
表11.
Figure G2007800516386D01511
Figure G2007800516386D01521
实施例10：体内消化性试验(筛选测试)
在诱导了胰腺外分泌机能不全(PEI)的雌性
Figure G2007800516386D01522
迷你猪(Ellegaard)中的脂肪酶筛选测试中研究了选择的本发明纯化的疏棉状腐质霉脂肪酶变体。所述变体的氨基酸序列可参见表1、7和8。将效力于具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的脂肪酶的变体N33Q(变体LV2934；表12的参照脂肪酶)的效力比较。通过结扎胰管诱发迷你猪的胰腺外分泌机能不全(PEI)，并且配以回盲折返插管(ileo-caecal re-entrant cannula)，上述全部在异氟烷(isofluorane)麻醉下进行，并且体重为约25kg，如Tabeling等(Tabeling等(1999)：“Studies on nutrient digestibilities(pre-caecal and total)in pancreaticduct-ligated pigs and the efeccts of enzyme substitution”，J.Anim.Physiol.A.Anim.Nutr.82：251-263)和Gregory等(Gregory等(1999)：“Growth anddigestion in pancreatic duct ligated pigs，Effect of enzyme supplementation”in“Biology of the Pancreas in Growing Animals”(Pierzynowski & Zabielski编辑)，Elsevier Science BV，Amsterdam，第381-393页)中所述。在研究开始之前，允许用至少4周的时间从外科手术中恢复。在研究开始前，通过粪便胰凝乳蛋白酶测试(可从Immundiagnostik AG，Wiesenstrasse 4，D-64625 Bensheim，Germany以商业方法获得，目录号为K 6990)确定每头猪的PEI状态。
测定法
对脂肪酶活性的筛选测试在两组每组3或4头PEI迷你猪中进行。在研究过程中，将猪圈养在改进的代谢笼中，允许自由饮水并且每日喂食两餐。
测试餐
247.2g奶；1x87g来自Fresenius Kabi的袋装Calshake(sachet Calshake)(2077KJ/100g)；29.9g橄榄油；9.88g Methocel(Methocel E5，来自ColorconGmbH)；和0.368g三氧化二铬。Calshake含有24.4％脂肪，3.3％乳糖，64.9％碳水化合物(49％糖)，4.3％蛋白质。
将奶和三氧化二铬用Ultraturax均质仪均质化(9500rpm，约1分钟)，其后将油混入并再次均质化1-2分钟。然后将Calshake混入(用搅拌器搅拌1-2分钟)并且最后慢慢加入Methocel同时用Ultraturax混合，然后再将全部的餐食均质化大约3分钟。
性能
为了评估脂肪酶效力，给猪喂养单次测试餐(含51.6g脂肪)，在喂食之前向所述测试参中即刻混入不同量的参照脂肪酶或类似量的脂肪酶变体。
参照脂肪酶LV2934的投喂剂量为0.124、1.24、4.96或18.61mg酶蛋白/餐(分别对应于500、5000、20000和75000FIP U脂肪酶/餐)，且本发明的脂肪酶变体的投喂剂量也是按照mg酶蛋白(1.24、4.96和18.61mg/餐)，从而与LV2934比较体内效力。所述研究按照拉丁方设计来进行。
在回肠中首次出现餐食标记(绿色食糜)之后总共收集8小时的回肠食糜，并且将两小时样品冷冻在-20℃。在单独的测定之间允许至少一天的清洗。在每次测试之前在晚间给予低脂、液态餐以降低来自非测试餐的餐食内容物产生干扰的可能性。
分析
将冷冻的回肠食糜样品冷冻干燥、研磨并且分析干物质(DM)和脂肪(Naumann & Bassler 1993；Die chemische Untersuchung von Futtermitteln，第3版，VDLUFA-Verlag，Darmstadt(VDLUFA＝Verband DeutscherLandwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten)。DM通过冷冻干燥然后在103℃进行8小时温育之后称重来估测；干燥样品的粗脂肪含量通过酸水解和石油醚提取来测定，所述提取使用ANKOMXT15提取器中的滤袋技术(其可从Ankom Technology，Macedon，NY，US以商业方法获得；能够同时进行15个提取)；Cr2O3被氧化成铬酸盐，并且如Petry和Rapp在Zeitungfür Tierphysiologie(1970)，第27卷，第181-189页(Petry & Rapp，1970，Z.Tierphysiol.27：181-189)中所述藉由365nm处(分光光度计)的消光(extinction)计算铬含量。
根据下述公式，用标记方法评估消化性值(脂肪吸收系数；CFA)：
Figure G2007800516386D01541
结果和结论
CFA结果示于表12。脂肪酶剂量以每餐中酶蛋白的毫克数(mg/餐)表示。
表12：本发明的脂肪酶对CFA(脂肪吸收系数)的作用
Figure G2007800516386D01542
*标准差从6个独立的测试计算并且包括对LVA027和LVA348的测试
**标准差从2个独立的测试(LVA027和LVA348)计算
***标准差从4个独立的测试计算
****分别对应于参照脂肪酶LV2934的以下FIP U量：通过胰FIP测试测定的500、5000、20000和75000FIP单位
在相同的筛选测试中研究了包括LV1330、LV1855、LV1865、LV1874、LV1889、LVA043、LVA049、LVA012、LVA023、LVA099、LVA041、LVA061、LVA103、LV1857、LV1232和LVA473在内的额外的脂肪酶变体。
测试的全部脂肪酶变体在体内是活性的并且引起了CFA的剂量依赖性的改进。脂肪酶变体LVA129、LVA147、LVA238、LVA315、LVA317、LVA319和LVA368与参照脂肪酶相比均有可观的改进。
实施例11：完全体内消化性试验
在一组6只雌性
Figure G2007800516386D01551
迷你猪(Ellegaard)中进行的完全体内消化性试验中测试了纯化的脂肪酶变体LVA319。将效力与在用相同饮食喂食的PEI迷你猪中测试的SEQ ID NO：1的脂肪酶的效力进行了比较。通过结扎胰管诱发迷你猪的胰腺外分泌机能不全(PEI)，并且配以回盲折返插管，上述全部在异氟烷麻醉下进行，并且体重为约25kg，如Tabeling等(Tabeling等(1999)：“Studies on nutrient digestibilities(pre-caecal and total)in pancreatic duct-ligatedpigs and the effects of enzyme substitution”，J.Anim.Physiol.A.Anim.Nutr.82：251-263)和Gregory等(Gregory等(1999)：“Growth and digestion in pancreaticduct ligated pigs，Effect of enzyme supplementation”in“Biology of the Pancreasin Growing Animals”(Pierzynowski & Zabielski编)，Elsevier Science BV，Amsterdam，第381-393页)中所述。在研究开始之前，允许用至少4周的时间从外科手术中恢复。在研究开始前，通过粪便胰凝乳蛋白酶测试(可从Immundiagnostik AG，Wiesenstrasse 4，D-64625 Bensheim，Germany以商业方法获得，目录号为K 6990)确定每头猪的PEI状态。
测定法
在研究过程中，猪在猪圈中，采用12∶12小时的明-暗循环(light-darkcycle)，而且允许自由饮水，并每日喂食两餐。
测试餐
研究过程中，每日两次(08.00，20.00时)给猪喂食300g的高脂“类人用”饮食(“human-like”diet)，该饮食含有：200g双重研磨的饮食(double-milleddiet)(来自Altromin)，加上25g橄榄油，75g奶油和0.625g Cr2O3，与1升水混合(参见表13)。所述测试餐含有31％脂肪，15％蛋白质，36％淀粉以及按照猪的营养需求的维生素，矿物质和痕量元素。
表13：实验用“类人用”饮食的组成
Figure G2007800516386D01561
在给猪喂食之前不久，将奶油和橄榄油，然后是自来水，最后是不同量/不同酶补充物混入预先称重的干燥口粮(dry ration)(包括三氧化二铬标记)中。
性能
为了评估脂肪酶的效力，每天给猪喂食两餐300g测试餐，在喂食之前向所述测试餐中即刻混入不同量的两种脂肪酶中的一种或另一种。施用的每种脂肪酶的量示于表14的括号中，即以微生物FIP U脂肪酶/餐(脂肪酶FIP单位，参见实施例1)为单位的活性显示。每种酶剂量喂食14天：给猪喂食高脂饮食加上每种新的酶剂量9天，其后在接下来的5天中收集全部粪便，称重，并在分析之前储存在-20℃。
分析
将每头猪的冷冻粪便冷冻干燥、再次称重并研磨。然后将5天中每一天的研磨样品的等分试样(根据每日粪便的产生)集中并且混合在一起；即，对于每头猪每种酶剂量得到一个集中样品。从每份集中样品中测定干物质和粗脂肪的含量(Naumann & Bassler 1993；Die chemische Untersuchung vonFuttermitteln，第3版，VDLUFA-Verlag，Darmstadt(VDLUFA＝VerbandDeutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten))。在冻干后于103℃温育8小时之后，按重量估计干物质；通过酸水解和石油醚提取测定干燥样品的粗脂肪含量，所述提取使用ANKOMXT15提取器中的滤袋技术；将Cr2O3氧化成铬酸盐，如Petry和Rapp在Zeitung für Tierphysiologie(1970)，第27卷，第181-189页.(Petry & Rapp 1970；Z.Tierphysiol.27；181-189)中所述，在365nm处(分光光度计)经由消光计算铬含量。
根据下述公式，用标记方法评估消化性值(脂肪吸收系数；CFA)：
Figure G2007800516386D01571
结果和结论
从表14的结果清楚地看出脂肪酶变体LVA319的表现比SEQ ID NO：1的参照脂肪酶好得多。
本发明的脂肪酶引起了脂肪消化性上非常强的且为剂量依赖性的改进，在测试的最低剂量已经显示出高效的改进。
表14：酶补充对CFA(脂肪吸收的系数)的影响
Figure G2007800516386D01572
实施例12：药物组合物
小丸(pellet)
制备纯化的脂肪酶变体LVA129(实施例10中进行体内测试的)的液态脂肪酶浓缩物。将所述液态浓缩物通过常规方法干燥，并且测量所述干燥粉末的脂肪酶蛋白含量，所述含量应该优选在50％以上。然后，将500g干燥的脂肪酶粉末与200g微晶纤维素和300g聚乙二醇4000(MacrogolTM 4000)在商业上可获得的混合器中干式预混在一起。加入足量的通常使用的润湿剂并且将获得的湿物质在室温完全混合。然后将均质化的物质在商业上可获得的挤压机中挤压以形成圆柱状小丸，所述挤压机装有冲孔模(piercing die)，该冲孔模的孔径为0.8mm。将产生的挤压物用商业上可获得的制粒机(spheronizer)，通过加入必要量的通常使用的润湿剂滚圆成球形小丸。在商业上可获得的真空干燥器中，将小丸于大约40℃的产物温度干燥。然后使用机械筛选机，用0.7和1.4mm筛网分离干燥的小丸。收集≥0.7mm和≤1.4mm的筛选级分，并且将每份200mg小丸的部分填入大小为2的胶囊中。
通过应用实施例1中描述的恒定pH测试法来测试所得小丸的脂肪分解活性。
按照Pharm.Eur.2.9.1.(Section“Disintegration of tablets and capsules”)(测试溶液：0.1M丙二酸，pH 6.0-500mL，37℃)测试所得小丸的崩散性。

Claims (32)

1.一种用作药物的脂肪酶，所述脂肪酶
(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列具有至少50％同一性；
(b)具有脂肪酶活性；并且其
(c)如与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列相比，包含取代N33Q、T231R和N233R，以及至少一个选自下列的额外的取代：
E1*，D，N；Q4H，P，R；D5E；N8L，Q；Q9H；F10L；N11C，D，H，L，P，Q，R，S；G23E；N26A，H，I；D27I，N，Q，R，S，V；P29T；A30T，V；T37K，M；G38A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；N39H，S；E43K；K46M；A49T；L52I，R；E56K，Q，R，S；D57G，N；V60E，S；G61R；V63R；A68V；L69I；N71I，S；N73Q，Y；I76T；R84E；I86F，L；E87A，H，K，R；I90L，V；G91A，C，E，F，K，L，M，N，S，T，V，W，Y；L93*，F；N94*，K，Q，R，S；F95*；D96*，E，G，N，R，S，W，Y；L97M，Q；K98I，T；E99D；N101Q；D102E，G，Y；R108M；G109A；D111A，E，N，S；G112A；T114I；S115L；W117C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y；D122E，N；Q126L；V128A；D130H；H135D；P136H；Y138F；V141E，L；A150V；V154F，I，L；A155V；G156R；G161A，E；N162G，S，T；G163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；D167E；V168M；V176A，D，F，G，H，I，K，M，N，Q，T，W；G177A；R179T；L185M；G190C，D；N200Q，S；R205I；L206F；E210D，R，V，Y；S216P；E219D；G225P；T226N；L227F，G；P229R；E239D；G240L；D242E；T244S；G246A；Q249R；N251Q，S；D254A，G，I，K，L，M，N，R，Q，S，Y；I255A，F；P256A，F，G，H，I，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y；和L269F，H。
2.权利要求1的脂肪酶，其与参照脂肪酶相比具有改进的体外消化性能，所述参照脂肪酶具有SEQ ID NO：2的序列和以下取代：N33Q+T231R+N233R。
3.一种与参照脂肪酶相比测定脂肪酶的体外消化性能的方法，所述方法包括以下步骤：
a)选择参照脂肪酶；
b)混合100体积份的饮食和20体积份的胃蛋白酶和分别为30体积份的脂肪酶或参照脂肪酶；
c)加入i)0或ii)10体积份的缓冲液(0.8M MES，0.8M乙酸钠，0.8M咪唑，pH 7.0)，其中步骤i)可以称作pH 3的胃步骤，而步骤ii)可以称作pH5的胃步骤；
d)在37℃伴随振荡温育1小时；
e)加入20体积份的胆汁盐，以及i)25或ii)15体积份的缓冲液(0.8MMES，0.8M乙酸钠，0.8M咪唑，pH 7.0)，其中步骤i)对应于pH 3的胃步骤，而步骤ii)对应于pH 5的胃步骤；
f)在37℃伴随搅拌温育2小时；
g)加入50体积份的1M磷酸中的10％ Triton-X100；
h)测定游离脂肪酸的量；
i)将剂量响应曲线拟合成方程式：
FFA＝FFAmax*[E]/([E]+K)
其中FFA是释放的游离脂肪酸的量，FFAmax是脂肪酶能够从所述饮食中释放的游离脂肪酸的最大量，[E]是脂肪酶浓度，且K是释放一半FFAmax的脂肪酶浓度；和
j)如下计算改进因子(IF)：
IF＝K(参照)/K(脂肪酶)，
其中K(参照)是释放一半FFAmax的参照脂肪酶的浓度，而K(脂肪酶)是释放一半FFAmax的所述脂肪酶浓度。
4.一种与参照脂肪酶相比测定脂肪酶的体外消化性能的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在胃蛋白酶存在下于pH 3测定稳定性，通过：
i)选择参照脂肪酶；
ii)将5体积份的所述脂肪酶或参照脂肪酶分别与5体积份的下列项混合：
a)含有0.01％Triton-X100和10mM NaCl的稀释剂，或
b)胃蛋白酶处理溶液，其含有150ug/mL胃蛋白酶，4mM CaCl2，0.01％Triton-X100，和50mM柠檬酸盐，pH 3.0，
其中a)称为未处理样品，且b)称为经胃蛋白酶处理的样品；
iii)在20℃将步骤ii)的样品温育3小时；
iv)向步骤iii)的每个样品加入55体积份的底物，所述底物含有1mMPNP-棕榈酸盐(PNP-palmitate)，1.2％Triton-X100，4mM CaCl2，100mM TRIS，pH 8.0，以及
a)5体积份的胃蛋白酶处理溶液，或
b)5体积份的稀释剂
其中a)涉及未处理的样品，且b)涉及经胃蛋白酶处理的样品；
v)通过不时地读取iv)的样品的OD405来追踪底物的降解；
vi)从v)收集落入线性范围的数据并且分别计算经胃蛋白酶处理的样品和未处理的样品的脂肪酶活性，以mOD(毫OD)每小时为单位；
vii)通过如下计算％残余脂肪酶活性(％RA)：按照从步骤vi)获得的，用经胃蛋白酶处理的样品的脂肪酶活性除以未处理的样品的脂肪酶活性，再将结果乘以100；并且，如果期望，
viii)将所述脂肪酶的％RA与参照脂肪酶的％RA进行比较；
和/或
b)在胆汁盐存在下于pH 5测定活性，通过：
i)选择参照脂肪酶；
ii)将10体积份的脂肪酶或参照酶分别与23体积份的a)水，或b)20mM胆汁盐混合，其中a)称作未处理的样品，且b)称作胆汁盐样品；
iii)向ii)的每个样品加入200体积份的底物，所述底物含有25mM琥珀酸盐，2mM CaCl2，1.2％Triton-X100，pH 5.0中的1mM PNP-油酸盐，并混合；
iv)步骤iii)之后立即从每个样品取出60体积份的所得混合物，并且将它以4个15体积份转移至四个单独的区室；
v)在1、2、3和4小时之后，向iv)的四个区室的各区室分别加入60体积份的100mM TRIS，pH 8.0，立即读取OD405，并且，基于1，2，3和4小时读数的线性范围，以mOD/小时计算活性；
vi)对于所述脂肪酶以及参照脂肪酶，用步骤v)中获得的胆汁盐样品的活性除以同样在步骤v)中获得的未处理样品的活性，以分别得到所述脂肪酶和参照脂肪酶的胆汁盐稳定性比；和
vii)用所述脂肪酶的胆汁盐稳定性比除以参照脂肪酶的胆汁盐稳定性比，所得比例可以定义为所述脂肪酶的改进因子。
5.权利要求2的脂肪酶，其中所述体外消化性能是使用权利要求3或4的方法测定的。
6.权利要求1-2和5中任一项的脂肪酶，所述脂肪酶包含选自下列的一组取代：
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T；
N33Q+E210D+T231R+N233R；
N33Q+D111A+T231R+N233R；
N33Q+G91T+T231R+N233R；
N33Q+E219D+T231R+N233R；
N33Q+W117L+T231R+N233R；
D27Q+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G91T+T231R+N233R；
D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
Q4R+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96W+T231R+N233R；
D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R；
D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R；
Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R；
N33Q+D111E+T231R+N233R；
N33Q+D122E+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+D167E+T231R+N233R；
N33Q+G91N+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T；
N11R+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+N39H+T231R+N233R；
N33Q+P229R+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T；
N33Q+E87A+T231R+N233R；
N33Q+E56Q+T231R+N233R；
N33Q+E210V+T231R+N233R；
N33Q+E56K+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254G；
N33Q+D96S+T231R+N233R；
N33Q+D122N+T231R+N233R；
N26A+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+N162T+T231R+N233R；
N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R；
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+G240L；
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T；
D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T；
N33Q+N200S+T231R+N233R；
N33Q+N39S+T231R+N233R；
N33Q+E210R+T231R+N233R；
N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R；
N33Q+T231R+N233R+D254R；
N33Q+N94R+T231R+N233R；
N33Q+D96R+T231R+N233R；
D27N+N33Q+T231R+N233R；
D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R；
N33Q+L227F+T231R+N233R；
N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R；
N33Q+G225P+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254S；
N33Q+D96G+T231R+N233R；
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R+D254G；
N33Q+D130H+T231R+N233R；
N33Q+E87A+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+E239D；
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G；
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R；
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G177A+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+G246A；
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R；
N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R；
K98I+T231R+N233R+N251S；
N33Q+G163R+T231R+N233R；
N33Q+G163N+T231R+N233R；
N33Q+G163C+T231R+N233R；
N33Q+G163Q+T231R+N233R；
N33Q+G163E+T231R+N233R；
N33Q+G163H+T231R+N233R；
N33Q+G163I+T231R+N233R；
N33Q+G163P+T231R+N233R；
N33Q+G163D+T231R+N233R；
N33Q+G91K+T231R+N233R；
N33Q+G91M+T231R+N233R；
N33Q+G91F+T231R+N233R；
N33Q+G91S+T231R+N233R；
N33Q+G91W+T231R+N233R；
N33Q+G91Y+T231R+N233R；
N33Q+G163T+T231R+N233R；
N33Q+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G163Y+T231R+N233R；
N33Q+G163V+T231R+N233R；
N33Q+G91C+T231R+N233R；
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R；
N33Q+G91M+G161E+T231R+N233R；
N33Q+V128A+T231R+N233R；
N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R；
N33Q+G38A+T231R+N233R；
N33Q+G163A+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R；
N33Q+G163M+T231R+N233R；
N33Q+G91V+T231R+N233R；
N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T；
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R；
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R+P256T；
N33Q+T231R+N233R+D242E；
N33Q+E87R+T231R+N233R；
N33Q+E56R+T231R+N233R；
N33Q+N162G+T231R+N233R；
N33Q+G91L+T231R+N233R；
N33Q+E87H+T231R+N233R；
N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S；
N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+G163A+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254A；
N33Q+T231R+N233R+D254N；
N33Q+T231R+N233R+D254Q；
N33Q+T231R+N233R+D254I；
N33Q+T231R+N233R+D254L；
N33Q+T231R+N233R+D254K；
N33Q+T231R+N233R+D254M；
N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+W 117L+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+
N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+
P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+
P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+L227G+T231R+N233R+
D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+
P256T；
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S；
N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R+P256A；
N33Q+T231R+N233R+P256N；
N33Q+T231R+N233R+P256G；
N33Q+T231R+N233R+P256H；
N33Q+T231R+N233R+P256L；
N33Q+T231R+N233R+P256M；
N33Q+T231R+N233R+P256S；
N33Q+T231R+N233R+P256W；
N33Q+T231R+N233R+P256Y；
N33Q+T231R+N233R+P256F；
N33Q+T231R+N233R+P256V；
N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R；
N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R；
N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R；
N33Q+V176N+T231R+N233R；
N33Q+V176D+T231R+N233R；
N33Q+W117F+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+V176I+T231R+N233R；
N33Q+D111N+T231R+N233R；
N33Q+D 111N+G225P+T231R+N233R；
N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R；
N33Q+G91M+G163P+T231R+N233R；
N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R；
N33Q+W117D+T231R+N233R；
N33Q+W117H+T231R+N233R；
N33Q+W117C+T231R+N233R；
N33Q+W117K+T231R+N233R；
N33Q+W117V+T231R+N233R；
N11S+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+W117E+V176K+T231R+N233R；
N33Q+W117G+T231R+N233R；
N33Q+W117P+T231R+N233R；
N33Q+W117S+T231R+N233R；
N33Q+W117T+T231R+N233R；
N33Q+W117I+T231R+N233R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+S115L+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+V176M+T231R+N233R；
N33Q+V176H+T231R+N233R；
N33Q+V176A+T231R+N233R；
D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+W117Y+T231R+N233R；
N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R；
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+
D254S；
D27R+N33Q+P136H+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S；
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G161A+T231R+N233R；
N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R；
N33Q+N101Q+T231R+N233R；
N33Q+N94Q+T231R+N233R；
N33Q+G161A+T231R+N233R；
N11Q+N33Q+T231R+N233R；
N8Q+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+N251Q；
N33Q+N200Q+T231R+N233R；
N33Q+G177A+T231R+N233R；
N33Q+N73Q+T231R+N233R；
N33Q+I86L+T231R+N233R；
N33Q+K98I+G163K+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+K98I+G163K+N200Q+T231R+N233R+N251S；
N33Q+G38S+G163K+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q G38Y T231R N233R；
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G38N+N73Q+T231R+N233R；
N33Q+G38D+R84E+T231R+N233R；
N33Q+G38Q+T231R+N233R；
N33Q+G38I+T231R+N233R；
N33Q+G38K+T231R+N233R；
N33Q+G38F+T231R+N233R；
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S；
N33Q+G38L+T231R+N233R；
N33Q+G38M+T231R+N233R；
N33Q+G38F+T231R+N233R；
N33Q+G38P+T231R+N233R；
N33Q+G38T+T231R+N233R；
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+
P256T；
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+
P256T；
D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R+P256A；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A；
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R；
N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A；
E1N+N33Q+T231R+N233R；
N33Q G38H T231R N233R；
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
D27R+N33Q+W117I+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+T231R+N233R+D254Q；
N11R+N33Q+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176W+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G163D+T231R+N233R；
N33Q+G163P+T231R+N233R；
E1D+N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R；
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+W117S+T231R+N233R；
N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I；
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+G163T+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+N233R；
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+
L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+
T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+
T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+
N233R+D242E+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+
T231R+N233R+D254S+P256T；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+E210D+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256L；
N33Q+G38A+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+D254I；
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+
P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S；
N33Q+E56Q+G156R+V176W+T231R+N233R；
E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A；
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+
N233R+Q249R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D+L227G+
T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+I90L+G91T+N94S+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+
T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256L；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D 111A+V176I+E210V+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256L；
N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254Y+I255F；
N33Q+L93F+D102Y+T231R+N233R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N11S+N33Q+T231R+N233R；
N11R+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R；
N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+P256F；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G156R+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91K+D96S+G163T+T231R+N233R+Q249R；
N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+G23E+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I；
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R；
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+
L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
E1*+N11R+N33Q+G38A+G91N+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+
D254S；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S；
E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+
P256Q；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+
D254S；
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I；
N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176I+T231R+N233R；
N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+
P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S；
N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+
D254S+P256T；
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F+
L269F；
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F；
N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+
P256T；
N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+
S216P+L227G+T231R+N233R+P256L；
N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S；
N33Q+E87K+T231R+N233R；
N33Q+N94K+T231R+N233R；
N33Q+D96Y+T231R+N233R；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R；
N26I+N33Q+T231R+N233R；
A30T+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G91V+T231R+N233R；
N33Q+G91A+T231R+N233R；
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R；
P29T+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G91V+T231R+N233R；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+G91E+T231R+N233R；
N33Q+N94K+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111A+T114I+V168M+E210D+
S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T；
Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+T231R+
N233R+P256T+L269H；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T；
N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+
P256A；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R；
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A；
D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R；
D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R；
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R；
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T；
D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+
P256T；
N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A；
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L；
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L；
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T；和
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T。
7.一种脂肪酶，其
(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列具有至少50％同一性；
(b)具有脂肪酶活性；并且其
(c)如与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列相比，在至少一个选自下列的位置包含取代：9、30、38、39、63、112、114、115、117、122、128、130、136、154、155、156、161、163、168、185、190、239和246。
8.一种脂肪酶，其
(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列具有至少50％同一性；
(b)具有脂肪酶活性；并且其，
(c)如与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列相比，包含至少一个选自下列的取代：E1N；Q4H；N8L，Q；Q9H；N11C，D，H，L，P，S；G23E；D27I；P29T；A30T，V；T37K，M；G38A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；N39H，S；D57N；G61R；V63R；N71I，S；N73Q，Y；I76T；I86F，L；E87H；G91F，K，L，M，V，Y；N94Q；F95*；D96*；N101Q；D111E；G112A；T114I；S115L；W117C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y；D122E，N；Q126L；V128A，D130H，H135D，P136H；V141E，L；V154F，I，L；A155V；G156R；G161A，E；N162G，S；G163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；V 168M；L185M；G190C，D；R205I；G240L；G246A；N251Q，S；和L269F，H。
9.一种脂肪酶，其
(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列具有至少50％同一性；并且
(b)具有脂肪酶活性；并且其，
(c)如与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列相比，包含选自下列的一组取代：
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T；
N33Q+E210D+T231R+N233R；
N33Q+D111A+T231R+N233R；
N33Q+G91T+T231R+N233R；
N33Q+E219D+T231R+N233R；
N33Q+W117L+T231R+N233R；
D27Q+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G91T+T231R+N233R；
D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D2111A+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91T+N94S+D 111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
Q4R+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96W+T231R+N233R；
D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R；
D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R；
Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R；
N33Q+D111E+T231R+N233R；
N33Q+D122E+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+D167E+T231R+N233R；
N33Q+G91N+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+
P256T；
N11R+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+N39H+T231R+N233R；
N33Q+P229R+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T；
N33Q+E87A+T231R+N233R；
N33Q+E56Q+T231R+N233R；
N33Q+E210V+T231R+N233R；
N33Q+E56K+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254G；
N33Q+D96S+T231R+N233R；
N33Q+D122N+T231R+N233R；
N26A+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+N162T+T231R+N233R；
N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R；
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+G240L；
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T；
D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T；
N33Q+N200S+T231R+N233R；
N33Q+N39S+T231R+N233R；
N33Q+E210R+T231R+N233R；
N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R；
N33Q+T231R+N233R+D254R；
N33Q+N94R+T231R+N233R；
N33Q+D96R+T231R+N233R；
D27N+N33Q+T231R+N233R；
D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R；
N33Q+L227F+T231R+N233R；
N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R；
N33Q+G225P+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254S；
N33Q+D96G+T231R+N233R；
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R+D254G；
N33Q+D130H+T231R+N233R；
N33Q+E87A+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+E239D；
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G；
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G；
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R；
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G177A+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+G246A；
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R；
N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R；
K98I+T231R+N233R+N251S；
N33Q+G163R+T231R+N233R；
N33Q+G163N+T231R+N233R；
N33Q+G163C+T231R+N233R；
N33Q+G163Q+T231R+N233R；
N33Q+G163E+T231R+N233R；
N33Q+G163H+T231R+N233R；
N33Q+G163I+T231R+N233R；
N33Q+G163P+T231R+N233R；
N33Q+G163D+T231R+N233R；
N33Q+G91K+T231R+N233R；
N33Q+G91M+T231R+N233R；
N33Q+G91F+T231R+N233R；
N33Q+G91S+T231R+N233R；
N33Q+G91W+T231R+N233R；
N33Q+G91Y+T231R+N233R；
N33Q+G163T+T231R+N233R；
N33Q+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G163Y+T231R+N233R；
N33Q+G163V+T231R+N233R；
N33Q+G91C+T231R+N233R；
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R；
N33Q+G91M+G161E+T231R+N233R；
N33Q+V128A+T231R+N233R；
N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R；
N33Q+G38A+T231R+N233R；
N33Q+G163A+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R；
N33Q+G163M+T231R+N233R；
N33Q+G91V+T231R+N233R；
N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T；
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R；
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R+P256T；
N33Q+T231R+N233R+D242E；
N33Q+E87R+T231R+N233R；
N33Q+E56R+T231R+N233R；
N33Q+N162G+T231R+N233R；
N33Q+G91L+T231R+N233R；
N33Q+E87H+T231R+N233R；
N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S；
N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+G163A+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+D254A；
N33Q+T231R+N233R+D254N；
N33Q+T231R+N233R+D254Q；
N33Q+T231R+N233R+D254I；
N33Q+T231R+N233R+D254L；
N33Q+T231R+N233R+D254K；
N33Q+T231R+N233R+D254M；
N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R；
D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+
N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+
P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+
P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+L227G+T231R+N233R+
D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+
P256T；
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S；
N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S；
N33Q+T231R+N233R+P256A；
N33Q+T231R+N233R+P256N；
N33Q+T231R+N233R+P256G；
N33Q+T231R+N233R+P256H；
N33Q+T231R+N233R+P256L；
N33Q+T231R+N233R+P256M；
N33Q+T231R+N233R+P256S；
N33Q+T231R+N233R+P256W；
N33Q+T231R+N233R+P256Y；
N33Q+T231R+N233R+P256F；
N33Q+T231R+N233R+P256V；
N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R；
N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R；
N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R；
N33Q+V176N+T231R+N233R；
N33Q+V176D+T231R+N233R；
N33Q+W117F+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+V176I+T231R+N233R；
N33Q+D111N+T231R+N233R；
N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R；
N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R；
N33Q+G91M+G163P+T231R+N233R；
N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R；
N33Q+W117D+T231R+N233R；
N33Q+W117H+T231R+N233R；
N33Q+W117C+T231R+N233R；
N33Q+W117K+T231R+N233R；
N33Q+W117V+T231R+N233R；
N11S+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+W117E+V176K+T231R+N233R；
N33Q+W117G+T231R+N233R；
N33Q+W117P+T231R+N233R；
N33Q+W117S+T231R+N233R；
N33Q+W117T+T231R+N233R；
N33Q+W117I+T231R+N233R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+S 115L+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+V176M+T231R+N233R；
N33Q+V176H+T231R+N233R；
N33Q+V176A+T231R+N233R；
D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+W117Y+T231R+N233R；
N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R；
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+
D254S；
D27R+N33Q+P136H+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S；
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G161A+T231R+N233R；
N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R；
N33Q+N101Q+T231R+N233R；
N33Q+N94Q+T231R+N233R；
N33Q+G161A+T231R+N233R；
N11Q+N33Q+T231R+N233R；
N8Q+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+T231R+N233R+N251Q；
N33Q+N200Q+T231R+N233R；
N33Q+G177A+T231R+N233R；
N33Q+N73Q+T231R+N233R；
N33Q+I86L+T231R+N233R；
N33Q+K98I+G163K+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+K98I+G163K+N200Q+T231R+N233R+N251S；
N33Q+G38S+G163K+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q G38Y T231R N233R；
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G38N+N73Q+T231R+N233R；
N33Q+G38D+R84E+T231R+N233R；
N33Q+G38Q+T231R+N233R；
N33Q+G38I+T231R+N233R；
N33Q+G38K+T231R+N233R；
N33Q+G38F+T231R+N233R；
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S；
N33Q+G38L+T231R+N233R；
N33Q+G38M+T231R+N233R；
N33Q+G38F+T231R+N233R；
N33Q+G38P+T231R+N233R；
N33Q+G38T+T231R+N233R；
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+
P256T；
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+
P256T；
D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R+P256A；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A；
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R；
N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A；
E1N+N33Q+T231R+N233R；
N33Q G38H T231R N233R；
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
D27R+N33Q+W117I+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G163W+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T；
N33Q+T231R+N233R+D254Q；
N11R+N33Q+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176W+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G163D+T231R+N233R；
N33Q+G163P+T231R+N233R；
E1D+N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R；
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D 111A+L206F+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+W117S+T231R+N233R；
N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I；
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+G163T+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+N233R；
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+
L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+
T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+
T231R+N233R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+
N233R+D242E+D254S+P256T；
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+
T231R+N233R+D254S+P256T；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+E210D+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256L；
N33Q+G38A+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+D254I；
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R；
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+
P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S；
N33Q+E56Q+G156R+V176W+T231R+N233R；
E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A；
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+
N233R+Q249R+D254S+P256T；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D+L227G+
T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+I90L+G91T+N94S+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N；
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+
T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256L；
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256L；
N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254Y+I255F；
N33Q+L93F+D102Y+T231R+N233R；
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S；
N11S+N33Q+T231R+N233R；
N11R+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R；
N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+P256F；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G156R+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91K+D96S+G163T+T231R+N233R+Q249R；
N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+G23E+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I；
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R；
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+
L227G+T231R+N233R+D254S+P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S；
E1*+N11R+N33Q+G38A+G91N+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+
D254S；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S；
E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S；
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+
P256Q；
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+
D254S；
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I；
N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+T231R+N233R；
N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176I+T231R+N233R；
N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+
P256T；
N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T；
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S；
N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+
D254S+P256T；
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R；
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F+
L269F；
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F；
N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S；
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+
P256T；
N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S；
Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+
S216P+L227G+T231R+N233R+P256L；
N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S；
N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S；
N33Q+E87K+T231R+N233R；
N33Q+N94K+T231R+N233R；
N33Q+D96Y+T231R+N233R；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R；
N26I+N33Q+T231R+N233R；
A30T+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G91V+T231R+N233R；
N33Q+G91A+T231R+N233R；
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R；
P29T+N33Q+T231R+N233R；
N33Q+G91V+T231R+N233R；
N33Q+K98I+T231R+N233R；
N33Q+G91E+T231R+N233R；
N33Q+N94K+T231R+N233R；
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111A+T114I+V168M+E210D+
S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T；
Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+T231R+
N233R+P256T+L269H；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T；
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T；
N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+
P256A；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S；
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R；
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A；
D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R；
D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R；
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R；
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T；
D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+
P256T；
N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A；
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R；
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T；
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S；
N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L；
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L；
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T；和
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T。
10.权利要求1-2和5-6中任一项的脂肪酶，与蛋白酶或淀粉酶组合，用作药物。
11.权利要求1-2和5-6中任一项的脂肪酶，与蛋白酶和淀粉酶组合，用作药物。
12.根据权利要求10或11与蛋白酶和/或淀粉酶组合的脂肪酶，其中
(i)所述蛋白酶与选自下组的蛋白酶具有至少70％同一性
a)具有SEQ ID NO：3的氨基酸1-274的序列的蛋白酶，
b)具有SEQ ID NO：4的氨基酸1-188的序列的蛋白酶，和
c)具有SEQ ID NO：5的氨基酸1-188的序列的蛋白酶；
(ii)所述淀粉酶与选自下组的淀粉酶具有至少70％同一性
a)具有SEQ ID NO：6的氨基酸1-481的序列的淀粉酶，
b)具有SEQ ID NO：7的氨基酸1-481的序列的淀粉酶，和
c)具有SEQ ID NO：8的氨基酸1-483的序列的淀粉酶。
13.使用如权利要求1-2和5-6任一项中限定的脂肪酶或脂肪酶的混合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。
14.权利要求13的用途，还包括使用蛋白酶或淀粉酶。
15.权利要求13的用途，还包括使用蛋白酶和淀粉酶。
16.权利要求14或15的用途，其中所述蛋白酶和/或淀粉酶如实施例12中所限定。
17.一种如权利要求1-2和5-6中任一项所限定的脂肪酶，其用于消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的治疗。
18.权利要求17的脂肪酶，其与蛋白酶或淀粉酶组合。
19.权利要求17的脂肪酶，其与蛋白酶和淀粉酶组合。
20.权利要求18或19的脂肪酶，其中所述蛋白酶和/或淀粉酶如权利要求12中所限定。
21.一种药物组合物，其包含如权利要求1-2和5-6的任一项中限定的脂肪酶或脂肪酶的混合物，以及至少一种可药用的辅助材料。
22.权利要求21的组合物，还包含蛋白酶或淀粉酶。
23.权利要求21的组合物，还包含蛋白酶和淀粉酶。
24.权利要求22或23的组合物，其中所述蛋白酶和/或淀粉酶如权利要求12中所限定。
25.一种用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法，通过施用治疗有效量的如权利要求1-2和5-6任一项中限定的脂肪酶或脂肪酶混合物。
26.权利要求25的方法，还包括施用治疗有效量的蛋白酶或淀粉酶。
27.权利要求25的方法，还包括施用治疗有效量的蛋白酶和淀粉酶。
28.权利要求26或27的方法，其中所述蛋白酶和/或淀粉酶如权利要求12中所限定。
29.一种用作药物的脂肪酶，其中所述脂肪酶是亲本脂肪酶的变体，所述变体
(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少50％同一性；并且
(b)具有脂肪酶活性；并且
(c)包含至少一个选自下列取代的取代：N26I、D27Q、D27R、D27Y、P29T、A30T、A30V、T32I、N33Q、N33T、N33Y、P42L、E43D、E43K、E43M、E43V、A49T、E56A、E56C、E56K、E56R、E56S、D57A、D57G、D57N、V60L、L69I、E87K、G91A、G91E、G91N、G91R、G91S、G91T、G91V、G91W、L93F、N94K、N94R、N94S、D96E、D96G、D96L、D96N、D96S、D96V、D96W、D96Y、L97M、L97Q、K98I、E99D、E99K、E99P、E99S、E99T、D111A、D111S、T114I、L147S、G163K、E210D、S216P、L227G、T231R、N233R、D234K、E239V、Q249R、N251S、D254N、P256T、G263Q、L264A、I265T、G266D、T267A和L269N，其中每个位置对应于SEQID NO；2的氨基酸1-269的位置；并且
(d)条件是所述变体不是
(i)具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的脂肪酶，也不是
(ii)(i)的脂肪酶的变体N33Q。
30.一种用作药物的脂肪酶，其中所述脂肪酶是亲本脂肪酶的变体，所述变体
(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少50％同一性；并且
(b)具有脂肪酶活性；并且
(c)在位置30、42、114和/或163中的至少一个中包含至少一个取代，其中每个位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的位置。
31.一种用作药物的脂肪酶，其中所述脂肪酶是亲本脂肪酶的变体，所述变体
(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少50％同一性；并且
(b)具有脂肪酶活性；并且
(c)包含至少一个选自下列取代的取代：A30T、A30V、P42L、T114I和G163K，其中每个位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的位置。
32.一种用作药物的脂肪酶，其中所述脂肪酶是亲本脂肪酶的变体，所述变体
(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少50％同一性；并且
(b)具有脂肪酶活性；并且
(c)选自以下变体：
LV1232      G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+
            L269N；
LV1330      N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R；
LV1855      D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T；
LV1857      D27R+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T；
LV1865      D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T；
LV1874      D27R+G91S+D 111A+S216P+L227G+P256T；
LV1889      D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T；
LVA049      N33Q+G163K+T231R+N233R；
LVAR0002b   T32I+G91V+T231R+N233R；
LVAR0003    K98I+T231R+N233R；
LVAR0011a   G91A+T231R+N233R；
LVAR0013    G91V+T231R+N233R；
LVAR0014    N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R；
LVAR0015    P42L+D57N+G91E+T231R+N233R；
LVAR0016    K98I+T231R+N233R；
LVAR0017    V60L+G91V+T231R+N233R；
LVAR0032    D57G+L93F+T231R+N233R；
LVAR0045    A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R；
LVAR0046    E99T+T114I+D254N+T231R+N233R；
LVAR0047    D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R；
LVAR0048    E43K+E56S+E87K+T231R+N233R；
LVAR0050    E56S+E87K+D96L+E99D+T231R+N233R；
LVAR0051    E56A+D57A+T114I+T231R+N233R；
LVAR0052    G91E+T231R+N233R；
LVAR0053    E56K+D96G+D111A+T231R+N233R；
LVAR0054    E87K+D111S+T231R+N233R；
LVAR0055    E43V+G91R+T231R+N233R；
LVAR0056    E56S+E87K+T231R+N233R；
LVAR0057    E87K+G91E+T231R+N233R；
LVAR0058    D27Y+E87K+T231R+N233R；
LVAR0059    E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R；
LVAR0061    E56K+E87K+D111A+T231R+N233R；
LVAR0062    E87K+E99P+T231R+N233R；
LVAR0063    E87K+D96L+E99P+T231R+N233R；
LVAR0064    E56C+E87K+T231R+N233R；
LVAR0065    E56R+E87K+D96L+T231R+N233R；
LVAR0066    E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R；
LVAR0067    E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R；
LVAR0068    E87K+L147S+T231R+N233R；
LVAR0069    D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R；
LVAR0070    E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R；
LVAR0071    E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R；
LVAR0072    D96V+D111A+T231R+N233R；和
LVAR0078    N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R。
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