TW200829698A

TW200829698A - Lipase variants for pharmaceutical use

Info

Publication number: TW200829698A
Application number: TW096148377A
Authority: TW
Inventors: Allan Svendsen; Michael Skjoet; Debbie Yaver; Lars Lehmann Hylling Christensen; Signe Eskildsen Larsen; Nina Lundin; Michael Lamsa; Peter Colin Gregory
Original assignee: Novozymes As; Novozymes Inc; Solvay Pharm Gmbh
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2007-12-18
Publication date: 2008-07-16
Also published as: EP2455461B1; IL198893A0; EP2455459B1; US20150209414A1; US8273348B2; WO2008079685A2; CN105112386A; US20120308543A1; WO2008079685A3; CN101743308B; CA3081308A1; MX2009006597A; JP5406040B2; US20100034797A1; BRPI0721103A2; AR064494A1; CA2670643C; EP2455462A3; EP2455459A2; EP2455462A2

Description

200829698 九、發明說明：對序列表之參照本申请案含有電腦可讀形式之序列表。該電腦可讀形式係以引用方式那入本文中。【發明所屬之技術領域】本發明係關於用作為醫藥品的脂肪酶，該脂肪酶（a ) 與SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269之序列具有至少5〇%的 ( 相同性；（b )具有脂肪酶活性；且其（c )與SEQ ID NO : 2之胺基酸1—269之序列相比，包含取代N33Q、T231R、與 N233R，以及至少一個選自以下者的附加的取代：ei*，D，N ; Q4H，P，R ; D5E ; N8L，Q ; Q9H ; F10L ; N11C，D，H，L，P，Q，R，S ; G23E; N26A，H，I; D27I，N，Q，R，S，V; P29T; A30T，V; T37K，M ; G3 8A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y; N3 9H，S; E43K; K46M ; A49T; L52I，R; E56K，Q，R，S; D57G，N; V60E，S; G61R; V63R ; A68V ； L69I ； N71I，S ; N73Q，Y ; I76T ; R84E ; I86F，L ; I E87A，H，K，R ; I90L，V ; G91A，C，E，F，K，L，M，N，S，T，V，W，Y ; L93*，F ; N94*，K，Q，R，S ; F95* ; D96*，E，G，N，R，S，W，Y ; L97M，Q; K98I，T; E99D; N101Q; D102E，G，Y; R108M; G109A ; D111A，E，N，S ； G112A ； T114I ； S115L ； W117C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y ; D122E，N ; Q126L ; V12 8A； D13 0H； H135D； P13 6H； Y13 8F； V141E?L ； A150V ； V154F，I，L ; A155V ; G156R ; G161A，E ; N162G，S，T ; G163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y ； D167E ； 7 200829698

V168M ; V176A，D，F，G，H，I，K，M，N，Q，T，W ; G177A ; R179T ; L185M , G190C，D，N200Q，S ; R205I ; L206F ; E210D，R，V，Y

S216P ； E219D , G225P ； T226N ； L227F,G ； P229R ； E239D

G240L，D242E ; T244S ; G246A ; Q249R ; N251Q，S D254A，G，I5K，L，M，N，R，Q，S5Y ; 1255A F P256A,F，G,H，I，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y ;與 L269F,H。本發明亦關於包含此等脂肪酶的醫藥組成物，以及關於一些此等脂肪酶本身。本發明進一步關於測定（且視需要比較）脂肪酶之試管内消化表現的方法。本發明之脂肪酶可結合蛋白酶及/或殿粉酶使用。醫學適應症之貝例為·消化性失调症、騰臟外分泌不足（pancreaUc exocrine insufficiency，PEI )、胰臟炎、囊腫性纖維化、第 I型糖尿病、及/或第II型糖尿病之治療。 c SEQ ID NO ·· 2之脂肪酶係衍生自絨毛腐質黴菌 (Humicola lanuginosa) DSM 4109 (同物異名：疏綿狀嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanuginosus )) 的野生型脂肪酶。【先前技術】 US 專利案 No· 5,614，189 ( EP 600868 B1 )敘述，i.a.，衍生自絨毛腐質黴菌的脂肪酶於胰臟酵素補充治療法（例如於治療患有囊腫性纖維化的患者）之用途。此脂肪酶係來自絨毛腐質黴菌DSM 4109且具有SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269之胺基酸序列。 8 200829698 WO 92/05249、WO 92/19726、WO 94/25577、WO 95/09909、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 99/42566、WO 00/32758、WO 00/60063、WO 01/83559、WO 0 1/83559、WO 2002/055679、WO 2002/062973、WO 2002/062973、WO 2004/099400、與 WO 2004/1 11216 敘述了一些SEQ ID NO : 2之變體，但未敘述其等之醫藥用途。 WO 2006/136159敘述了具有SEQ ID NO ·· 1之胺基酸 1-269之脂肪酶、以及其變體N33Q之醫藥用途。在技術領域中有對於用於醫藥用途之改善的脂肪酶之需要。【發明内容】發明簡述本發明提供用於醫藥用途的改善的脂肪酶。較佳地，用於根據本發明使用的酵素具有改善的活體内及/或試管内功效；改善的活性；改善的穩定性；對藉由蛋白酶的降解係穩定的；在膽鹽存在下係穩定的；及/或具有減小的致過敏性。更佳地，本發明的脂肪酶（相較於具有有以下取代的SEQ ID NO : 2之序列的參考脂肪酶）具有改善的試管内消化表現：N33Q + T231R+N233R。本發明係關於一種用作為醫藥品的脂肪酶，其中該脂肪酶（a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269之序列具有至少50%的相同性；（b )具有脂肪酶活性；且其（c )與SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269之序列相比，包含取代N33Q、 9 200829698 T231R、與N23 3R，以及至少一個選自以下者的附加的取代： E1*，D，N ; Q4H，P，R ; D5E ; N8L，Q ; Q9H ; F10L ; N11C，D，H，L，P，Q，R，S ; G23E ; N26A，H，I ; D27I，N，Q，R，S，V ; P29T ； A30T，V ； T37K，M ； G3 8A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y; N3 9H，S; E43K; K46M ; A49T; L52I，R; E56K，Q，R，S; D57G，N; V60E，S; G61R; V63R ; A68V ; L69I ; N71I，S ; N73Q，Y ; I76T ; R84E ; I86F，L ; E87A，H，K，R ; I90L，V ; G91A，C，E，F，K，L，M，N，S，T，V，W，Y ; L93*，F ; N94*，K，Q，R，S ; F95* ; D96*，E，G，N，R，S，W，Y ; L97M，Q; K98I，T; E99D; N101Q; D102E，G，Y; R108M; G109A ; D111A，E，N，S ； G112A ； T114I ； S115L ； W117C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y ; D122E，N ; Q126L ; V128A ; D13 0H ; H135D ; P136H ; Y138F ; V141E，L ; A150V ; V154F，I，L ; A155V ; G156R ; G161A，E ; N162G，S，T ; G163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y ； D167E ； V168M ; V176A，D，F，G，H，I，K，M，N，Q，T，W ; G177A ; R179T ; L185M ; G190C，D ; N200Q，S ; R205I ; L206F ; E210D，R，V，Y ; S216P ； E219D ； G225P ； T226N ； L227F,G ； P229R ； E239D ； G240L ； D242E ； T244S ； G246A ； Q249R ； N251Q?S ； D254A，G，I，K，L，M，N，R，Q，S，Y ； 1255 A，F ； P256A，F，G，H，I，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y;以及 L269F，H。本發明進一步係關於如此脂肪酶用於製造用於治療消化性失調症、PEI、胰臟炎、囊腫性纖維化、第I型糖尿病、及/或第II型糖尿病的醫藥品之用途，此等用途視需要進一 10 200829698 步包含使用蛋白酶、及/或殿粉酶；以及詩如此脂肪酶於治療此等症狀（視需要結合蛋白酶及/或澱粉酶）的用途。、本發明進-步關於包含如此脂肪酶、結合至少—種醫藥上可接受的輔助性物質、視需要包含蛋白酶及/或澱粉：的醫藥組成物。本發明亦關於用於治療消化性失調症、pEI、胰臟炎（急性及/或慢性）、囊腫性纖維化、第j型糖尿病、及/或第: ，㈣尿病的方法，其藉由投藥治療有效量的如此脂肪酶， ( 視需要結合蛋白酶及/或澱粉酶。最後，本發明係關於用於決定（以及視需要比較）脂肪酶試管内消化表現的方法；以及關於某些脂肪酶本身，例如：一種脂肪酶，其（a)與SEQIDN〇: 2之胺基酸卜269 之序列具有至少50%的相同性；（b )具有脂肪酶活性；且其（c)與SEQ ID NO : 2之胺基酸U69之序列相比，於至少一個選自以下者的位置包含取代：9、3〇、38、39、63、 I 112、114、115、117、122、128、130、136、154、155、156、 161、163、168、185、190、239、與 246;以及一種脂肪酶，其（a)與SEq ID NO : 2之胺基酸U69 之序列具有至少5〇%的相同性；（b )具有脂肪酶活性；且其 (cl )與SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269之序列相比，包含至少一個選自以下者的取代：E1N ; Q4H ; N8L，Q ; Q9H ; N11C，D，H，L，P，S ; G23E ; D27I ; P29T ; A30T，V ; T37K,M ; n 200829698 - G3 8A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y; N39H，S; D5 7N; G61R ; V63R ; N71I，S ; N73Q，Y ; I76T ; I86F，L ; E87H ; G91F，K，L，M，V，Y ; N94Q ; F95* ; D96* ; N101Q ; D111E ; G112A; T114I; S115L; W117C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y ; D122E，N; Q12 6L; V12 8A，D130H，H13 5D，P136H; V141E，L ; V154F，I，L ； A155V ; G156R ; G161A，E ; N162G，S ; G163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y ； V168M ； L185M ; G190C，D ; R205I ; G240L ; G246A ; N251Q，S ;與 \ L269F，H ;或其 (c2)與SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269之序列相比，於所指定的位置包含至少一個以下的胺基酸·· IN; 4H; 8L，Q ; 9H ; 11C，D，H，L，P，S ; 23E ; 271 ; 29T ; 30T，V ; 37K，M ; 38A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y; 39H，S; 57N; 61R; 63R ; 71I，S ; 73Q，Y ; 76T ; 86F，L ; 87H ; 91F，K，L，M，V，Y ; 94Q ; 95* ； 96* ； l〇lQ ； 111E ； 112A ； 1141 ； 115L ； 117C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y; 122E，N; 126L; 128A，130H， ( 135D，136H; 141E，L; 154F，I，L; 155V; 156R; 161A，E; 162G，S ; 163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y; 168M; 185M; 190C，D ; 2051 ; 240L ; 246A ; 251Q，S ;與 269F，H。【實施方式】發明詳述脂肪氣脂肪酶係一種具有脂肪酶活性的多肽。於以下，用於 12 200829698 本發明之紐成物、方法、與用途的脂肪酶係稱為本發明的脂肪酶。本發明的脂肪酶可為羧酸酯水解酶Ec 3· 1;1_，其包括例如EC 3·1·1·3三醯甘油脂脂肪酶、Ec 311·4磷脂酉母Α2、EC 3.1.1.5溶血磷脂酶、EC 3丄126半乳糖脂肪酶、 EC 3.1.1.32 磷脂酶 A1、Ec 311·73 阿魏醯基（醋酶活性。在一個特殊的具體態樣中，脂肪酶係Ec 3.113 二醯甘油脂脂肪酶。在另一個特殊的具體態樣中，脂肪酶具有EC 3 ·1 · 1.4磷脂酶A2活性，即催化以下反應··磷脂醯膽鹼+ Ηβ = 1-醯基甘油磷膽鹼+羧酸酯（移出接附至2_ 位置的月曰肪酸）。在又一個特殊的具體態樣中，脂肪酶具有EC 3.1.1.32磷脂酶A1活性，即催化以下反應：磷脂醯膽驗+ % 0 = 2 - 基甘油鱗膽驗+魏酸g旨。 EC編號指來自以下者的酵素命名1992 ( Enzyme Nomenclature 1 992 )： NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California，包含增刊 1-5，分別地於 Eur· j. Bi〇chem· 1994, 223, 1-5 ; Eur· J. Biochem. 1995, 232, 1·6 ; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5 ; Eur· J· Biochem. 1997, 250, 1-6 ;以及 Eur. J.

Biochem· 1999, 264, 610-650刊登。該命名係定期地補充與更新；參見例如網際網路位址 http : //www.chem. qmw· ac ·ιι1<:/4ιιΐ3ΐηΐ3/6ηζγιη6/ίη<ΐ6χ·1ι1:ιη1 〇本發明的脂肪酶可為親本脂肪酶之變體。變體術語變體於本文係定義為一種（相較於親本脂肪酶）在多肽中的一或多個特殊位置包含一或多個改變（例如取 13 200829698 代插入、刪除、及/或戴斷_或多個特殊胺基酸殘基）的脂肪酶。親本脂術語親本脂肪酶意指變體與其比較與校準之多肽。一個親本脂肪酶之特殊實例為其被修改（例如取代、插入、刪除、及/或截斷）以製造本發明之脂肪酶變體的脂肪酶。親本可為天然存在的（野生形）脂肪酶，或其可為其變體，而該變體係藉由任何適合的手段製備。親本亦可為對偶基因k體，其係由佔據相同染色體基因座的基因之二或多種供遥擇的形式中的任一種所編碼的多肽。在一個特殊的具體態樣中，親本脂肪酶係真菌的脂肪酶，其具有與於SEQ IDN〇: 2所示的疏綿狀嗜熱絲孢菌的脂肪酶之胺基酸^69之序列有至少5〇%的相同性的胺基酸序列。親本脂肪酶可為酵母菌脂肪酶，例如念珠菌 (Candida)、克魯維酵母菌（Kluyveromyces)、畢赤酵母囷（Pichia )、釀母囷（Saccharomyces )、裂殖酵母菌 (Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母菌（Yarr〇wia)多肽；或，更佳地，為絲狀真菌的脂肪酶，例如枝頂孢菌 (Acremoniimi )、麴菌（Aspergillus )、短梗黴菌 (Aureobasidium)、隱球菌（Cryptococcus)、線黑粉酵母菌（Filobasidium )、梭黴菌（Fusarium )、腐質黴菌 (Humicola) 、Magnaporthe、白黴菌（Mucor)、毀絲黴菌 (Myceliophthora)、Neocallimastix、紅黴菌（Neurospora)、擬青黴菌（Paecilomyces )、青黴菌（Peniciiiium )、瘤胃 14 200829698 菌（Piromyces)、裂序習菌（Schizophyllum)、Talaromyces、嗜熱子囊菌（Thermoascus )、梭孢殼菌（Thielavia )、、彎頸黴菌（Tolypocladium )、或木黴菌（Trichoderma )脂肪酶一或任何此等之變體。一種較佳的親本脂肪酶係子囊菌 (ascomycete )脂肪酶，較佳地係衍生自腐質黴菌、 Talaromyces或嗜熱真菌（Thermomyces )之品係，例如係衍生自才示黑腐質撤囷（Humicola fuscoatra )、灰腐質黴菌 (Humicola grisea)、特異腐質黴（Humic〇la ins〇lens)、 Humicola lutea、黑腐質黴菌（Humic〇la nigrescens)、腐質霉屬物種（Humicola sp·)、絨毛腐質黴菌（Therm〇myces lanoginosus ) 、Thermomyces ibadanensis、疣狀頂孢黴 (Thermomyces verrucosus )、嗜熱踝節菌（丁山⑺町⑽ thennophUus)、埃默森籃狀菌（Talar〇mycesemers〇nii)、或Talaromyces byssochlamydoides之品係—或任何此等的變體。在一個特殊的具體態樣中，親本脂肪酶係（i)具有seq idn〇:2之胺基酸i至269的絨毛腐質徽菌脂肪酶，或⑻ 其變體。脂肪酶轡體之命名於本發明中，係利用在脂肪酶啤又體中的胺基酸殘基位置之特殊編號。藉由校準已知脂肪阿 < 版基酸序列，將胺基酸位置編號指派給任何脂肪酶酵你1A匕认京中的任何胺基酸殘基係可能的。使用源自於SEQ ID NO : 2中姐- 调不的脂肪酶之脸美g參痒列的編號系統，使用本文所述的 ⑽之基I序半方法與另一個脂肪酶 15 200829698 之胺基酸序列校準，指出於任何其他脂肪酶中的每個胺基酸殘基之位置係可能的。因此，對於任何與SEQ ID N〇 : 2 之胺基酸1 -269之序列比較的本發明之脂肪酶，每個位置及 /或取代對應於SEQ ID NO : 2之胺基酸之位置。於描述各種本發明之脂肪酶變體中，修改以下所述的命名以易於參考。在所有的實例中，係利用被接受的mpAc 單字母或三字母胺基酸縮寫。對於胺基酸取代，係使用以下的命名：原始胺基酸，位置，取代的胺基酸。因此，於位置26以異白胺酸取代天冬醯胺酸係標示為N26I。多重突變係以加號（+)分開，例如 N3 3Q + E2 10D + T23 1R+N23 3R 代表於位置 33、210、231、與233突變，分別地以麵醯胺酸（q )取代天冬醯胺酸（N )、以天冬胺酸（D )取代麩胺酸（E )、以精胺酸（r )取代經丁胺酸（T)、以及以精胺酸（R)取代天冬醯胺酸（1^)。對於胺基酸刪除，係使用以下的命名：原始胺基酸，位置，*。因此，於位置1删除麩胺酸（E )係標示為r El *」。多重刪除係以加號（“ + ”）分開，例如於位置93、94、95、與96分別地刪除白胺酸（l)、天冬醯胺酸（N)、苯丙胺酸（F )、與天冬胺酸（D )係標示為「L93*+N94*+F95*+D96*」。因此，爲了本發明的目的，删除事實上可被視為取代之貫例’即以無物取代原始胺基酸。以下的SEQ ID NO ·· 2之胺基酸1-269之脂肪酶之變體可因此稱為包括總共η個取代： 7個取代成另一種胺基酸，而四個4取代成無物，即4個刪除： 16 200829698 D27R+N33Q + G91 A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T23 1R +N233R+P256T。因此’當特定胺基酸可以二或多種不同的胺基酸取代或刪除時’此可表明為取代，其中包含刪除的供選擇的取代基係以逗點分開。例如，指名「E丨*，D，N」意指在親本脂肪酶（E 1 )中於位置！的麩醯胺酸可以無物取代（即刪除） (* )、以天冬胺酸（D )取代、或以天冬醯胺酸（N )取代。校準與相同性計笪此部分可應用至本發明之脂肪酶、澱粉酶、與蛋白酶 (本發明之酵素）。二胺基酸序列間的相關性係以參數「相同性」敘述。為了本發明的目的，兩胺基酸序列之校準係藉由使用來自 EMBOSS 套裝（http : //emboss.org) 2.8.0 版之 Needle 程式測定。Needle程式執行總體校準演算法，其敘述於 Needleman，S.B·與 Wunsch C D (197〇) j M〇i Bi〇i ⑽， 3 45 3所使用的取代矩陣係BLOSUM62，空隙開放罰分 (gap opening penalty )係i 〇，而空隙拓展罰分（extasi⑽ penalty)係〇·5。一本發明的胺基酸序列（「發明序列」；例如具有有以下四取代的SEq ID Ν〇 : 2之胺基酸之序列的變體 LVA023 : N33Q+E210D + T231R+N233R)與一不同的胺基酸序列（「外來序列」；例如SEQIDN〇: 2之胺基酸卜⑽）間的相同性程度，係以在兩序列之校準中完全吻合之數目，除以「發明序列的長度啖「外夾庠厌^外木序列」的長度（使用長 17 200829698 • 度最短者）計算。結果係以百分比相同性表現。當「發明序列」與「外來序列」在重疊的相同位置具有相同的胺基酸殘基時，則發生完全吻合（在以下校準實例中此係以「丨」表示）。序列的長度係在該序列中胺基酸殘基的數目（例如序列識別號：2的長度係269 )。在以下之（純假設性）校準實例中，重疊係序列1的胺基酸序列「HTWGER-NL」；或序列2的胺基酸序列「HGWGEDANL」。在該實例中，空隙係以「_」象徵。 (假設性校準實例：

序歹，J 1 : ACMSHTWGER-NL

序歹丨J 2: HGWGEDANLAMNPS 因此，序列1對序列2之相同性之百分比係6/12 = 〇 5，對應至50%。在一個特殊的具體態樣中，多肽之胺基酸序列與（或對）SEQ ID NO: 2之胺基酸1-269之相同性之百分比係藉由以下決定：i)使用Needle程式，利用BL〇SUM62取代

矩陣，1〇的空隙開放罰分，與〇·5的空隙拓展罰分校準兩個胺基酸序列；ii )計算校準中精確吻合的數目；丨丨丨）將精確吻合的數目除以兩胺基酸序列之最短者之長度，並N / 將iii)之除之結果轉換成百分比。在一個較佳的具體態樣中，本發明的脂肪酶係至+ 相同於具t SEQIDN〇:2之胺基酸卜⑽的脂肪酶。在。更佳的具體態樣中，其係至少52〇/〇、53% ι/0 3 5%、5 60/〇、 18 200829698 -Λ 57°/〇、58%、59%、或至少 60%相同於具有 SEQ ID NO : 2 、之胺基酸1 -269的脂肪酶。在更佳的具體態樣中，相同性百分比係至少 61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69%、或至少70%。在又更佳的具體態樣中，相同性之百分 t匕 4系至少 71〇/〇、 72〇/〇、730/〇、740/〇、75〇/〇、76〇/〇、77〇/〇、78〇/〇、 79%、或至少80%。在更佳的具體態樣中，相同性之百分比係至少 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、或至少90%。在額外更佳的具體態樣中，相同性之百分比 f 係至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少99%。在另一個較佳的具體態樣中，親本脂肪酶係至少5 1% 相同於具有SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269的脂肪酶。在更佳的具體態樣中，其係至少52%、53%、54°/。、55%、56%、 57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、660/〇、 67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、 77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、 I 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、或至少 99%相同於具有SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269的脂肪酶。改善的特十生本發明提供改善的用於醫藥用途的脂肪酶。較佳地，用於根據本發明使用的酵素具有改善的活體内及/或試管内功效；改善的活性；改善的穩定性；對藉由蛋白酶的降解係穩定的；在膽鹽存在下係穩定的；及/或具有減小的致過 19 200829698 敏性。本發明之脂肪酶較佳地係經純化的，更佳地係純化至同貝，例如如於W〇2〇〇6/136159 t貝例5中所敘述。經纯化^日肪酶製劑可藉由SDS_PAGE分析，且脂_可= ^ 〇 4G kDa的主要蛋白f條帶而確認。藉由密度計掃描考馬 4 U〇〇massie) ·染色的 SDS_PAGE;疑膠成蛋白質譜之90-97%。穷产訃A Γ办丨上、平又彳土地構 u W/。益度彳為（例如）來自bi〇_rad GS-800校正過的密度計。

本發明的脂肪酶相較於參考脂肪酶具有改善的消化表現，較佳地具有改善的試管内消化表現。消化表現較佳地係使用以下者決定：⑴消化模型、 (II) 藉由測定於pH 3在胃蛋白酶存在下的穩定性、及/或 (III) 藉由測定於pH 5在膽鹽存在下的活性。對方法⑴、⑻、與（叫之每一者，其等於以下進一步討論’ SEQ ID N〇 : 2之脂肪酶變體 N33Q + T231R+N233R係參考脂肪酶之較佳的實例（揭示於 WO2006/136159)。其他參考脂肪酶之實例為：seqidn〇 : 1 之脂肪酶（SEQ ID NO·· 2 之 N33Q+T23 1R)，與 SEQ m n〇 · 2之脂肪酶。一個參考脂肪酶之又進一步的實例係seq id NO: 1之胺基酸+1至+269與其變體N33Q之脂肪酶之平均。消化模型（I )代表一種新穎的測定消化表現之方法，其包含以下的步驟·· a) 挑選參考脂肪酶； b) 分別地，將100份每體積的飲食與2〇份每體積的 20 200829698 —‘胃蛋白酶以及3〇份每體積的脂肪酶或參考脂肪酶混合； c)加入i) 0或ii) H)份每體積的緩衝液（〇 8MMES、〇.讀醋酸鈉、〇·8Μ味β坐，pH 7.0)，其中步驟丨）可稱為pH 3的胃的步驟，而步驟ϋ )可稱為pH 5的胃的步驟； d )伴隨搖動於37°C培養1小時；

e) 加入20份每體積的膽鹽，以及丨）25或丨丨）15份每體積的緩衝液（0·8Μ MES、0·8Μ醋酸鈉、〇·8Μ咪唑，pH 7.0) ’其中步驟i)對應於pH 3的胃的步驟，而步驟η ) \ 對應於pH 5的胃的步驟； f) 伴隨攪動於37°C培養2小時； g) 加入50份每體積的於1M磷酸中的1〇% Trit〇n_ X100 ； h) 測定自由脂肪酸之量f 1 )將劑量反應曲線擬合至以下方程式·· FFA = FFAmax * [E] / ( [E] + K) /、中FFA係所釋放的自由脂肪酸之量，pFAniax係脂肪 i 酶可自飲食釋放的自由脂肪酸之最大量，[E]係脂肪酶濃度，且K係釋放FFAmax的一半的脂肪酶濃度；且 j )計算改善係數（IF )如下： IF = K ( ref) / K (脂肪酶），其中K(ref)係釋放FFAmax的一半的參考脂肪酶之濃度且κ (脂肪酶）係釋放FFAmax的一半的脂肪酶濃度。消化表現亦可藉由以上稱為（II )的於ρΗ3的新穎胃蛋白酉母穩定性試驗而測定，而該方法包含以下的步驟： 21 200829698 i)挑選參考脂肪酶； ii )分別地，將5份每體積的脂肪酶或參考脂肪酶與5 份每體積的以下者混合 a)含有 0.01°/。Triton-XlOO 與 10mM NaCl 的稀釋劑，或 b )含有 150ug/mL 胃蛋白酶、4mM CaCl2、0.01% Trit〇n-Xl〇〇、與5〇mM擰檬酸鹽，pH 3_0的胃蛋白酶處理溶液，其中a)稱為未經處理的樣本，而b)稱為經胃蛋白酶處理的樣本； ⑴）於20°C培養步驟Π)之樣本3小時；

iv )加入每個步驟“丨）之樣本55份每體積的含有imM PNP-才示櫚酸酉旨、i 2%Trit〇n_xl〇〇、4mM caCl2、100mM TRIS， ρΗ8·0的受質，以及 a) 5份每體積的胃蛋白酶_處理溶液，或 b ) 5份每體積的稀釋劑其中a)稱為未經處理的樣本，而稱為經胃蛋白酶處理的樣本； v )卩牛解X質後於間隔讀取iv )之樣本之oh” ； ^ V1 )自ν )收集落入線性範圍的數據並（分別地）爲經月蛋白酶處理的樣本與未經處理的樣本以m〇D (毫〇D )每小日守计异脂肪酶活性； ^ )藉由將來自步驟vi )的經胃蛋白酶處理的樣本之酶舌ϋ除以未經處理的樣本之脂肪酶活性計算％殘餘脂 22 200829698 肪酶活性（％RA)，並將結果乘以10G;且（若需要） iix)比較脂肪酶與參考脂肪酶之％RA。肖表見亦可藉由以上稱為（III)的於pH 5的新穎膽鹽活性試,驗而測$，該$法包含以下的步驟： i)挑選參考脂肪酶； U )刀別地，將1 0份每體積的脂肪酶或參考脂肪酶與23 伤母體積的a)水、或b) 2〇 mM膽鹽混合，未經處理的樣本，而b)稱為膽鹽樣本；

Hi)至每個Π)之樣本，加入200份每體積的含有於25 mM琥珀酸鹽中的！福pNp油酸酯、2祕caw、u Trit〇n-X100, pH5.〇的受質，並混合； iv)自每個樣本，於步驟iH)後立即移出6〇份每體積的所得混合物並轉移四次15份每體積的其等至四個分開的隔間；

)在1 2 3、與4小時後，將60份每體積的100 mM TRIS ’ pH 8.0加至iv)之四個隔間之個別的隔間，立刻讀取〇D 4G5，亚基於！、2、3、與4小時的讀值之線性範圍，以mOD/小時計算活性； vi) Μ脂肪酶以及參考脂肪酶，將膽鹽樣本之活性（獲自步驟ν))除以未經處理的樣本的活性（亦獲自步驟ν)/ 以（分別地）達到脂肪酶與參考脂肪酶之膽鹽敎性比率，· 叫將脂肪酶之膽鹽較性比率除以參考脂肪酶之膽鹽穩定性比率，其所得比率可定義為脂肪酶之改善係數。 23 200829698 令人驚言牙地，方法（、雜h 4、，（1) 、（11)與（ΙΠ )已被發現可鏗疋改善的脂肪酶，复八τ很大邛为亦為活體内改善的。方法（η ’肖化核型（以上稱為⑴）模仿在患有胰臟外分泌不足的單胃動物（例如豬與人類）中的消化。

Trit〇nX-1〇〇(C^〇(C2H40)n)(CAS No. 9002-93-1 ) 係一種非離子性介面活性為 *曰> 闽/ 生^ ’其具有親水性聚環氧乙烷基團（平均其具有9.5個環氣- 斤乳乙坑早凡，即n = 9-10)以及碳氫親脂性或疏脂性基團。硝气土图石反虱基團係4_ ( 1，1，3,3-四甲基丁基）-苯基基團。術語「份每體積的」較佳地係指微升，其可簡寫為U卜 uL、μΐ、或 jaL。在試管内消化模型之特殊的具體態樣中，u)胃蛋白酶濃度係700 mg/ml; (b)脂肪酶及/或參考脂肪酶係於* 種不同的濃度分析，較佳地每個皆：重複；及/或⑺反應微滴定盤的槽孔中發生。在額外的試管内消化模型之特殊具體態樣中，（d)膽鹽之濃度係、50 g/1; (〇加入膽鹽與步驟e)中的緩衝液後的所得PH係於5.7至6.〇的範圍；及/或⑴Trit〇n_xi〇〇當於步驟g )加入時係用以停止反應。在又進一步特殊的試管内消化模型之具體態樣中，（& ) 自由脂肪酸之量係於適當的稀釋（例如125_25〇倍，較佳地於1。/。Tm〇n-X100)之後測定，且較佳地係使用來自|认〇 ChemicaU的NEFA C套組測定，其係於實施例3敘述）； 24 200829698 ⑴於㈣υ巾㈣量反應曲線指顯示呈脂肪酶劑量之凸數的反應（即自由脂肪酸之量）的曲線；及，或（i)假設 FFAmax對脂肪酶（即對所討論的參相肪酶與脂肪酶）係相同的。在額外的試管内消化模型之特殊具體態樣中，（』）係使用活性位置滴定（Active She Titrati〇n，ast，實施例6 ) 以測定脂肪酶濃度；及/或⑴係使用A28G以測定脂肪酶濃度，較佳地係使用A280/mg之消光係數。改善的脂肪酶係定義為具有高於1.00的改善係數的脂肪酶。在特殊的具體態樣中，（i)改善係數係平均改善係數，（u )改善係數係平均改善係數減掉標準差丨及/或（) 改善係數係兩於i ·〇’或高於i。平均與標準差考慮到實驗變動且可以如技術領域中已知而計算，例如標準差=(Sum (IF-Avg(IF) ) /(η _ η ) Λ〇 5，其中 IF 係改善係數， Avg ( IF )係所計算改善係數之平均且n係所計算改善係數之數目。上下顛倒的V意指exp。试官内消化模型之飲食較佳地含有介於250與4〇〇 g脂肪/kg之間，更佳地為介於3〇〇與35〇 g脂肪/kg之間，最佳地介於313與340 g脂肪/kg之間。碳水化合物與蛋白質的含里較無關’但較佳地其反映通常的與典型的飲食需要以及建議’例如250-500 g/kg的碳水化合物含量，與介於1〇與200 g/kg間的蛋白質含量。飲食可選自（例如）飲食I( Diet 1，340 §脂肪/1^、450 §碳水化合物/1<:§、2(^蛋白質/]^)、或飲食II ( Diet II，3 13 g脂肪/kg、358 g碳水化合物/kg、 25 200829698 與146 g蛋白質/kg)。飲食I含有247.2份每重量的牛奶（1.5%脂肪）、29.9 份每重量的撖彳覽油、87份每重量的Cal shake (商業上可購自Fresenius Kabi且具有2077kJ/g的能量含量、4.3 g牛奶蛋白質/100g的蛋白質含量、與24·4 g脂肪/100g的脂肪含 ϊ )、與 9.9 份每重量的 Methocel ( Food Grade，E5 Premium LV FG( E464 ); Dow)。將組成部分混合（例如使用uitraTmrex (YellowLine DI 25 basic ) ) 2分鐘。視需要地，飲食係以 0.5ug/ml的SAVINASE 16.0 LEX蛋白酶（商業上可購自

Novozymes A/S，Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd，丹麥）在50°C於pH 8·0處理4小時以減小黏性。隨後將蛋白酶藉由減小pH至3並於7〇。〇培養3〇分鐘，或於5〇γ培養6〇分鐘以失活化。術語「份每重量」較佳地稱為克（g )。飲食II含有（較佳地為由以下者構成）73 g/kg (濕重）家禽膳食（Altromin ) 、73 g/kg豌豆膳食、73 g/kg酪蛋白 (於酸性條件下沈澱，來自Altr〇min)、29〇g/kg小麥麵粉、 290 g/kg馬鈐薯澱粉、125 g/kg豬油、76 g/kg維生素、石芒物質與微量元素、與375 g/kg牛奶油（33〇/〇脂肪）。只方法（II) 以下為藉由在胃蛋白酶的存在下於pH 3測量穩定性的測定消化表現之方法之特殊具體態樣，該方法以 (II) : % 為 (a)用於步驟ii)的脂肪酶為培養物上清液，較係如下製備··將能夠表現脂肪酶的單一酵母菌菌落（^ 26 200829698 啤酒釀母菌JG169之菌落（參見例如us專利案⑽· 7,217,433))挑人i份每體積（例如imL)的適合培養基㈠列如實施心之種子培養基⑷心此咖制^))， JL於30 C與25G rpm生長過夜。脂肪酶之表現係藉由接種 ⑽〇份每_ (例如2G uL)的所得種子培養物㈠^ Culture) 1丨份每體積的適合培養基（例如實施例8之最佳化培養基（Optimized Medium))並於3〇。€與25〇卬瓜培育心6天而達成。培育可於例如微較盤（例如μ槽孔盤）或於搖動燒瓶中進行。脂肪酶樣本可適當地於㈣劑中稀釋（例如25倍）； (b )步驟hi )之培養之3小時可於室溫； (〇步驟Ο之ODm之讀取可例如發生6次.且例如早至受質加入後15分鐘並長達受質加入後18個小時；

U)於步驟vi)，係（分別地）為經胃蛋白酶二樣本與未經處理的樣本以m〇D (毫〇D _ V4异脂肽祿活性，並收集落入線性範圍的來自V)的數據； … (e )於步驟vii )，藉由將來自步驟V 田 ^ „ 、、工月蛋白酶处的知肪酶之比率除以未經處理條件之比率並將結果a 以100而計算％殘餘脂肪酶活性（％RA) ，、、口乘 ^ ( f)於步驟v)，亦讀取〇D 54〇並使用其藉由自頃數減去ODMO讀數而校正背景QD。 13405 ^ΧΙΠ)_ 以下者係藉由在膽鹽存在下於ρΗ 5測量活忸表見之方法之特殊具體態樣（以上稱為（III)): 27 200829698 (a)用於步驟ii)的脂肪酶係經純化的；（b)於稀釋劑（例如 0.01% Triton-X100、10mM NaCl )將脂肪酶適當地稀釋，典型地從介於25倍至200倍，例如至大約8 pg/mL ; (c )經純化脂肪酶樣本之濃度係使用消光係數1.24 A28C/mg 自於280 nm的吸收測定；（d)介於約0.100與0.475的OD 係於線性範圍内；及/或（e)膽鹽係Sigma B-8756，其於蒸德水中組成至20 mM。在步驟vi)的進一步特殊具體態樣（f)，於pH 5.0在膽鹽存在下的活性之比率係以百分比表現，其藉由計算對「膽鹽」活性對時間與稀釋校正的於步驟v)獲得的所有線性數據之平均除以對「非膽鹽」活性對時間與稀釋校正的所有線性數據之平均。 (A)在第一個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N33Q+E87K+T231R+N233R ； N33Q+N94K+T231R+N233R ； N33Q+D96Y+T231R+N233R ； N33Q+K98I+T231R+N233R ； A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R ； N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R ； N26I+N33Q+T231R+N233R ； A30T+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+G91V+T231R+N233R ； 28 200829698 N33Q+G91A+T231R+N233R ； N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R ； N33Q+K98I+T231R+N233R ; N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R ； P29T+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+G91V+T231R+N233R ； N33Q+K98I+T231R+N233R ； N33Q+G91E+T231R+N233R;與 N33Q+N94K+T231R+N233R。在第二個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自 (相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N33Q+K98I+T231R+N233R ； A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R ； N33Q+G91V+T231R+N233R ； N33Q+G91A+T231R+N233R ； N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R ； N33Q+K98I+T231R+N233R ； N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R ; P29T+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+G91V+T231R+N233R ； N33Q+K98I+T231R+N233R ； N33Q+G91E+T231R+N233R;與 N33Q+N94K+T231R+N233R。 200829698 在第三個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自 (相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N33Q+K98I+T231R+N233R ； N33Q+G91V+T231R+N233R ； N33Q+G91A+T231R+N233R ； N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R ； N33Q+K98I+T231R+N233R ； N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R ； N33Q+G91E+T231R+N233R;與 N33Q+N94K+T231R+N233R。在第四個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自 (相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N33Q+G91V+T231R+N233R ； N33Q+G91A+T231R+N233R ； N33Q+K98I+T231R+N233R;與 N33Q+G91E+T231R+N233R。具有以上所列舉的取代的SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269 之脂肪酶之變體（四個特殊具體態樣之每一者）皆具有改善的試管内消化表現，即，以下的改善係數（IF ):至少1.50 (或 1.5)、2.00(或 2.0)、2_50(或 2·5)、3·00(或 3.0)、 3.50 (或3·5 )、或至少4.00 (或4·0)，較佳地為至少5.00 (或 5·0)、6·00(或 6·0)、7·00(或 7.0)、8.00(或 8·0)、 30 200829698 ' 9.00(或9.0)、10.00(或10.0)、或至少11.00(或11.0)。較佳地係使用pH 3的胃的步驟。較佳的飲食為飲食II。可使用活性位置滴定（AST，實施例6 )及/或A28。以測定脂肪酶濃度，較佳地係使用消光係數1.24 A280/mg。 (B)在另一個第一個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R ； (1 D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R ； Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R ； N33Q+D111E+T231R+N233R ； N33Q+D122E+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； N33Q+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+ U N233R+P256T ； N11R+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+N39H+T231R+N233R ； N33Q+P229R+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+ 31 200829698 、' T231R+N233R+P256T ； ' D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+ N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+ P256T ； D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T ； N33Q+N200S+T231R+N233R ； N33Q+N39S+T231R+N233R ； f N33Q+E210R+T231R+N233R ； N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R ； N33Q+T231R+N233R+D254R ； N33Q+N94R+T231R+N233R ； N33Q+D96R+T231R+N233R ； D27N+N33Q+T231R+N233R ； D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R ； N33Q+L227F+T231R+N233R ； N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R ； N33Q+G225P+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254S ； N33Q+D96G+T231R+N233R ； N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S ； N33Q+T231R+N233R+D254G ； N33Q+D130H+T231R+N233R ； N33Q+E87A+T231R+N233R ； 32 200829698 N33Q+T231R+N233R+E239D ； N33Q+D1 11A+T231R+N233R+D254G ； N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+P256T ； N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R ； Q4R+D27R+N3 3 Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G177A+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+G246A ； D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R ;與 N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R。在另一個第二個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代 (較佳地為取代之組）的脂肪酶中： D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R ； 33 200829698 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+ N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+ P256T ； N33Q+N39S+T231R+N233R ； N33Q+N94R+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254S ； N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S ； N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R ； N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T ;與 D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 〇在另一個第三個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代 (較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S ； N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ;與 34 200829698 v % N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R。 ' 在另一個第四個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代 (較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R。具有以上所列舉的取代的SEQ ID NO: 2之胺基酸1-269 之脂肪酶之變體（四個其他特殊的具體態樣之每一者）皆具有改善的試管内消化表現，即，以下的改善係數（IF )， (〕' 較佳地為平均IF減標準差：1.00以上、或至少1.5 0(或1.5)、 2.00 (或 2.0) 、2.50 (或 2.5) 、3.00 (或 3.0) 、3.50 (或 3.5 )、或至少4.00 (或4·0 )，較佳地為至少5.00 (或5·0)、 6.00 (或 6.0) 、7.00 (或 7·0) 、8·00 (或 8.0) 、9.00 (或 9.0) 、10_00(或 10·0)、或至少 11.00(或 11.0)。較佳地係使用ρ Η 3的胃的步驟。較佳的飲食為飲食I。較佳地係使用活性位置滴定（AST，實施例6 )以測定脂肪酶濃度。 (C)在又另外的第一個特殊的具體態樣中，本發明的 V 脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N33Q+E219D+T231R+N233R ； N33Q+W117L+T231R+N233R ； D27Q+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+G91T+T231R+N233R ； D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+ N233R+P256T ； 35 200829698 * D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T23 1R+ N233R+P256T ； Q4R+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D96W+T231R+N233R;與 N33Q+G91N+T231R+N233R。在又另外的第二個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪 V 酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N33Q+E219D+T231R+N233R ； D27Q+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+G91T+T231R+N233R;與 D27R+N3 3 Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T。在又另外的第三個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪 v 酶係選自（相較於SEQ ID NO ·· 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N33Q+E219D+T231R+N233R;與 N33Q+G91T+T231R+N233R。具有以上所列舉的取代的SEQ ID NO: 2之胺基酸1-269 之脂肪酶之變體（each of the three still三個又另外的特殊具體態樣之每一者）皆具有改善的試管内消化表現，即，以下的改善係數（IF)，較佳地為平均IF減標準差：1.00 36 200829698 ^ 以上、或至少 1.50(或 1.5)、2.00(或 2·0)、2.50(或 2·5 )、 ' 3.00 (或 3·0) 、3·50(或 3.5)、或至少 4.00 (或 4.0)，較佳地為至少 5.00(或 5.0)、6.00(或 6.0)、7_00(或 7·0)、 8.00 (或 8.0) 、9.00 (或 9_0) 、10.00 (或 10·0)、或至少11.00 (或11.0)。較佳地係使用pH 3的胃的步驟。較佳的飲食為飲食II。較佳地係使用活性位置滴定（AST，實施例6)以測定脂肪酶濃度。 (D)在一個第一個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪 f 酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N33Q+D167E+T231R+N233R ； N33Q+E87A+T231R+N233R ； N33Q+E210V+T231R+N233R ； N33Q+E56K+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254G ； N33Q+D96S+T231R+N233R ；、 N33Q+D122N+T231R+N233R ； N26A+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+N162T+T231R+N233R ； N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+G240L ； N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R ； 37 200829698

- ' Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G * +T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R ； N33Q+G163R+T231R+N233R ； N33Q+G163N+T231R+N233R ； N33Q+G163C+T231R+N233R ； N33Q+G163Q+T231R+N233R ； N33Q+G163E+T231R+N233R ； ( N33Q+G163H+T231R+N233R ； N33Q+G163I+T231R+N233R ； N33Q+G91K+T231R+N233R ； N33Q+G91M+T231R+N233R ； N33Q+G91F+T231R+N233R ； N33Q+G91S+T231R+N233R ； N33Q+G91W+T231R+N233R ； N33Q+G91Y+T231R+N233R ； 1 N33Q+G163Y+T231R+N233R ； N33Q+G163V+T231R+N233R ； N33Q+G91C+T231R+N233R ； N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R ； N33Q+G91M+G161E+T231R+N233R ； N33Q+V128A+T231R+N233R ； N33Q+V128A+T231R+N233R ； N33Q+G163E+T231R+N233R ； 38 200829698 ' N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R ； ' N33Q+G38A+T231R+N233R ； N33Q+G163A+T231R+N233R ； N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R ； N33Q+G163M+T231R+N233R ； N33Q+G91V+T231R+N233R ； N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ ( D254G+P256T ； N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R ； N33Q+W117L-+-T231R+N233R+D254S ； N33Q+T231R+N233R+P256T ； N33Q+T231R+N233R+D242E ； N33Q+E87R+T231R+N233R ； N33Q+E56R+T231R+N233R ； N33Q+N162G+T231R+N233R ； N33Q+G91L+T231R+N233R ； N33Q+E87H+T231R+N233R ； N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S ； N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G163A+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+ 39 200829698 P256T ； N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254A ； N33Q+T231R+N233R+D254N ； N33Q+T231R+N233R+D254L ； N33Q+T231R+N233R+D254K ； N33Q+T231R+N233R+D254M ； D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R ； D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ; D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G +T231R+N233R+D254S+P256T ； D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+ 200829698 T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+L227G+ T231R+N233R+D254S+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T ； N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S ； N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S ； N33Q+T231R+N233R+P256N ； N33Q+T231R+N233R+P256G ； N33Q+T231R+N233R+P256H ； N33Q+T231R+N233R+P256M ； N33Q+T231R+N233R+P256W ； N33Q+T231R+N233R+P256Y ； N33Q+T231R+N233R+P256F ； N33Q+T231R+N233R+P256V ； N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R ； N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R ； N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R ； N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R ； N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R ； 200829698 N33Q+V176N+T231R+N233R ； N33Q+V176D+T231R+N233R ; 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3Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N3 3Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G +T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T ； D27R+N3 3Q+E5 6Q+D5 7N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D +L227G+T231R+N233R+D254S+P256T ； N11R+N3 3Q+I90L+G91T+N94S+D96E+G163K+T231R+N233R+ D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P +L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T ； Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+ S216P+L227G+ T231R+N233R+P256L ； 48 200829698 Q4R+D27Q+N3 3 Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210 V+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256L ； N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254Y+I255F ； N33Q+L93F+D102Y+T231R+N233R ； D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S ； N11S+N33Q+T231R+N233R ； N11R+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+G3 8A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R ； N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+ D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+P256F ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G156R+G163K+V176T+T231R+ N233R+D254S ； N33Q+G91K+D96S+G163T+T231R+N233R+Q249R ； N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+G23E+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； 49 200829698 N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ; N11R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+ D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I ； N33Q+G3 8S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R ； N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K + S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+ D254S ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+ D254S ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+ D254S ； N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+ N233R+D254S ； E1*+N11R+N33Q+G38A+G91N+N94R+G163P+V176G+T231R+ N233R+D254S ； E1N+N11R+N33Q+G3 8A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R ； 50 200829698 E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+ N233R ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254 S ； E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233 R ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R ； E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R +N233R ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R +D254S ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+ D254S+I255A+P256Q ； E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R +N233R+D254S ； N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I ； N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+T231R+ N233R ； N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176I+T231R +N233R ； N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+ N233R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+ D254S+P256T ； 51 200829698 E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+ D254S ； N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+ T231R+N233R+D254S+P256T ； N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+ D254Y+I255F+L269F ； N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+ D254Y+I255F ； N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+ N233R+D254S+P256T ； N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+ E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L ； N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S ;與 N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+ D254S 〇 52 200829698 在一個第二個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N33Q+E87A+T231R+N233R ； N33Q+E210V+T231R+N233R ； N33Q+E56K+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254G ； N33Q+D96S+T231R+N233R ； N33Q+N162T+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+G240L ； N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G163N+T231R+N233R ； N33Q+G163Q+T231R+N233R ； N33Q+G163E+T231R+N233R ； N33Q+G91M+T231R+N233R ； N33Q+G91F+T231R+N233R ； N33Q+G163Y+T231R+N233R ； N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R ； N33Q+V128A+T231R+N233R ； N33Q+G3 8A+T231R+N233R ； N33Q+G163M+T231R+N233R ； N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ 53 200829698 D254G+P256T ； N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+N94R+D111 A+Wl 17L+T231R+N233R ； N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S ； N33Q+T231R+N233R+P256T ； N33Q+T231R+N233R+D242E ； N33Q+E87R+T231R+N233R ； N33Q+E56R+T231R+N233R ； N33Q+N162G+T231R+N233R ； N33Q+G91L+T231R+N233R ； N33Q+E87H+T231R+N233R ； N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S ； N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254L ； N33Q+T231R+N233R+D254K ； N33Q+T231R+N233R+D254M ； D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+ 54 200829698 * T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+ C N233R+D254S+P256T ； N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S ； N33Q+T231R+N233R+P256N ； N33Q+T231R+N233R+P256G ； N33Q+T231R+N233R+P256M ； N33Q+T231R+N233R+P256W ； N33Q+W117F+T231R+N233R ； N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R ； l D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R ； N33Q+W117C+T231R+N233R ； N33Q+W117C+T231R+N233R ； N33Q+W117K+T231R+N233R ； N11S+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+W117G+T231R+N233R ； N33Q+W117P+T231R+N233R ； 55 200829698 N33Q+W117S+T231R+N233R ； N33Q+W117T+T231R+N233R ； D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S ； N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S ； N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R ； N33Q+N101Q+T231R+N233R ； N33Q+N94Q+T231R+N233R ； N11Q+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+G177A+T231R+N233R ； N33Q+N73Q+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+ D254S+P256T ； D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+ D254S+P256T ； N33Q+G38I+T231R+N233R ； N33Q+G38F+T231R+N233R ； N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S ； N33Q+G38T+T231R+N233R ； N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T23 1R+ N233R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S ； 56 200829698 D27R+N3 3 Q+G3 8 A+G91T+D96E+D111A+G163 A+T231R+ N233R+D254S+P256T ； D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S ； N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A ； N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R ； N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A ； N33Q G38H T231RN233R ； N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G163W+T231R+N233R ； N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ D254S+P256T ； N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R ； Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 141+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； N33Q+W117S+T231R+N233R ； N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I ； N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R ； N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+ N233R ； N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+ 57 200829698 L227G+T231R+N233R+D254S+P256T ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G +T231R+N233R+D242E+D254S+P256T ； D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+ L227G+T231R+N233R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R ； N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+ N233R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+ D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I ； N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+ D254S ； E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111 A+Wl 17L+V176W+ T231R+N233R ； N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A ； N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G +T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D +L227G+T231R+ 58 200829698 N233R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P +L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T ； Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256L ； Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256L ； D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S ； N11R+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R ； N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+ D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F ； 59 200829698 N11R+N33Q+G91T+G163N+T23 1R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T23 1R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+ D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163L+T23 1R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I ； N33Q+G3 8S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R ； N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K +S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+ D254S ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+ D254S ； N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+ N233R+D254S ； E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R ； E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+ 200829698 N233R ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+ D254S ； E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+ N233R ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+ N233R ； E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R +N233R ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R +D254S ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+ D254S+I255A+P256Q ； E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R +N233R+D254S ； N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I ； N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N23 3R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+ D254S+P256T ； E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+ D254S ； N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R +N233R+D254S+P256T ； 61 200829698 N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R ； N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+ N233R+D254S+P256T ； N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； Q4R+D27N+N3 3 Q+G3 8 A+G91T+N94S+E99D+D111A+V1761+ E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L ； N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S ;與 N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+ D254S 。在一個第三個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N33Q+E87A+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254G ； N33Q+T231R+N233R+G240L ； N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； 62 200829698 N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R ； N33Q+G163M+T231R+N233R ； N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R ; D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ D254G+P256T ； N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S ； N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S ； N33Q+T231R+N233R+D242E ； N33Q+E87R+T231R+N233R ； N33Q+E56R+T231R+N233R ； N33Q+N162G+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254L ； N33Q+T231R+N233R+D254K ； D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+E219D+L227G+T23 1R+N233R+Q249R ； D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S ； N33Q+T231R+N233R+P256N ； N33Q+T231R+N233R+P256M ； D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R ； D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S ； 63 200829698 N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R ； N33Q+G177A+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+ D254S+P256T ； N33Q+G38F+T231R+N233R ； N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S ； N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+ N233R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S ； N33Q+G3 8A+G163A+T231R+N233R+P256A ； N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R ； N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R ； Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 141+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R ； N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+ L227G+T231R+N233R+D254S+P256T ；

D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G 64 200829698 +T231R+N233R+D242E+D254S+P256T ； D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+ L227G+T231R+N233R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+I90L+G163L+T23 1R+N233R ； N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+ N233R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+ D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+ D254S ； N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G +T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N ； Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256L ； Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256L ； N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F ； 65 200829698 ' N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F ； N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+ f D254S ； N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R ； N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K + S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+ D254S ； E1N+N11R+N3 3 Q+G3 8A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R ； E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+ ^ N233R ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S ； E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R +N233R ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R +D254S ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+ D254S+I255A+P256Q ； 66 200829698 N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+ * N233R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+ D254S+P256T ； E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+ D254S ； N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+ T231R+N233R+D254S+P256T ； ^ N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R ； N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+ N233R+D254S+P256T ； I N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ; N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S ;與 N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+ D254S 。在一個第四個特殊具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： 67 200829698 N33Q+G9 1T+N94R+T231R+N233R+D254S ； N33Q+E87R+T231R+N233R ； D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S ； D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+ D254S+P256T ; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+ N233R+D254S+P256T ； N33Q+G3 8A+G163A+T231R+N233R+P256A ； N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+ D254S ； Q4R+D2 7 Q+N3 3 Q+G91T+N94 S+E99D+D111A+V176I+E210 V+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256L ； N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+ D254S ； N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R ； N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S ;與 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+ 68 200829698 ' N233R+D254S+P256T ° 在一個第五個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R ;與 N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S。具有以上所列舉的取代的SEQ ID NO: 2之胺基酸1-269 之脂肪酶之變體（五個特殊的具體態樣之每一者）皆具有改善的試管内消化表現，即，以下的改善係數（IF )，較佳地為平均IF減標準差：1.00以上、或至少1.50 (或1.5)、 2.00 (或 2.0) 、2.50 (或 2.5) 、3.00 (或 3.0) 、3.50 (或 3.5 )、或至少4.00 (或4.0)，較佳地為至少5.00 (或5.0 )、 6.00 (或 6.0) 、7.00 (或 7·0) 、8.00 (或 8.0) 、9.00 (或 9.0) 、10.00(或 10.0)、或至少 11.00(或 11.0)。較佳地係使用pH 5的胃的步驟。較佳的飲食為飲食I。較佳地

ί I 係使用活性位置滴定（AST，實施例6 )以測定脂肪酶濃度。 (E )在一個第一個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T ； N33Q+E210D+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R ； N33Q+D111A+T231R+N233R ； 69 200829698 N33Q+G91T+T231R+N233R ； D27Q+N33Q+T231R+N233R ； Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R ； N33Q+E56Q+T231R+N233R ； N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+ P256T ； N33Q+N39S+T231R+N233R ； N33Q+N94R+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+T231R+N233R ； K98I+T231R+N233R+N251S ； N33Q+G163P+T231R+N233R ； N33Q+G163D+T231R+N233R ； N33Q+G163T+T231R+N233R ； N33Q+G163W+T231R+N233R ； N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R ； N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T23 1R+N233R+ D254S+P256T ； 200829698 * N33Q+T231R+N233R+P256A ； ^ N33Q+T231R+N233R+P256S ； N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S ； N33Q+S115L+T231R+N233R ； N33Q+G3 8A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+ N233R+Q249R+D254S ； D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+ f D254S+P256T ； N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+ Q249R ； N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+ Q249R+D254S ； N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L ;與 N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。 I 在一個第二個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ P256T ； N33Q+E210D+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R ； N33Q+D111A+T231R+N233R ； 71 200829698 N33Q+G91T+T231R+N233R ； N33Q+N94R+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G163P+T231R+N233R ； N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+ Q249R+D254S ； N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S ;與 N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。在一個第三個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+T231R+N233R ； D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ;與 N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S。具有以上所列舉的取代的SEQ ID NO: 2之胺基酸1-269 之脂肪酶之變體（三個特殊的具體態樣之每一者）皆具有改善的試管内消化表現，即，以下的改善係數（IF )，較佳地為平均IF減標準差·· 1.00以上、或至少1·50 (或1·5)、 2.00 (或 2_0) 、2.50 (或 2.5) 、3.00 (或 3·0) 、3·50 (或 3 ·5)、或至少4.00(或4.0)，較佳地為至少5.00(或5·0)、 6.00 (或 6·0) 、7.00 (或 7·0) 、8.00 (或 8.0) 、9.00 (或 72 200829698 9·0) 、10.00 (或 10.0)、或至少 11.00 (或 11.0)。較佳地係使用ρ Η 3的胃的步驟。較佳的飲食為飲食I。較佳地係使用活性位置滴定（AST，實施例6 )以測定脂肪酶濃度。 (F)在一個第一個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T ； ( N33Q+E210D+T231R+N233R ； N33Q+D111A+T231R+N233R ； N33Q+G91T+T231R+N233R ； D27Q+N33Q+T231R+N233R ； Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R ； N33Q+E56Q+T231R+N233R ； N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R ； i N33Q+N94R+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+T231R+N233R ； K98I+T231R+N233R+N251S ； 73 200829698 N33Q+G163P+T231R+N233R ； N33Q+G163D+T231R+N233R ； N33Q+G163T+T231R+N233R ； N33Q+G163W+T231R+N233R ； N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R ； N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ D254S+P256T ； D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ D254S+P256T ； N33Q+T231R+N233R+D254Q ； N33Q+T231R+N233R+D254I ； N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+T231R+N233R+P256A ； N33Q+T231R+N233R+P256L ； N33Q+T231R+N233R+P256S ； N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S ； N33Q+S115L+T231R+N233R ; N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+ N233R+Q249R ； D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+ N233R+Q249R+D254S ； N33Q+G161A+T231R+N233R ； 74 200829698 ’ N33Q G38M T231RN233R ； ^ N33Q G38F T231RN233R ； N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+ Q249R ； N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+ Q249R+D254S ； N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L ;與 f N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。在一個第二個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ P256T ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ P256T ； ( N33Q+E210D+T231R+N233R ； N33Q+D111A+T231R+N233R ； N33Q+G91T+T231R+N233R ； D27Q+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+E56Q+T231R+N233R ； N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； 75 200829698 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G163P+T231R+N233R ； N33Q+G163D+T231R+N233R ； N33Q+G163W+T231R+N233R ； N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254Q ； N33Q+T231R+N233R+D254I ; N33Q+T231R+N233R+P256S ； N33Q+S115L+T231R+N233R ； N33Q+G3 8A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+ N233R+Q249R ； N33Q G38M T231RN233R ； N33Q G38F T231RN233R ； N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L ;與 N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。在一個第三個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N33Q+E210D+T231R+N233R ； N33Q + G91T+T231R+N233R ； D27Q+N33Q+T231R+N233R ； 76 200829698 N33Q + I90L + G163L + T231R+N233R ； D27N+N3 3Q+G91T+G163K+T23 1R+N23 3R+D25 4S ; D27V+N3 3Q + G91A+N94R+D1 11A+G163K+L227F + T231R +N233R+Q249R ； N33Q G38M T231R N233R ； N33Q G38F T231R N233R ； N3 3Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S ；

具有以上所列舉的取代的SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269 之脂肪酶之變體（三個特殊的具體態樣之每一者）皆具有改善的試管内消化表現，即，以下的改善係數（IF )，較佳地為平均IF減標準差：ιοο以上、或至少15〇 (或15)、 2·〇〇 (或 2·0)、2.50 (或 2·5)、3 〇〇 (或 3 〇)、3·5〇 (或 3.5)、或至少4.00(或4·〇)、較佳地為至少5 〇〇(或I。）、 6.〇〇(^6.0) ^7.0〇(^7.〇) .8.〇〇(^8〇) .9.〇〇(^ 9·')、1〇·〇〇(或 1〇·〇)、或至少 11.00(或 11.0)。較佳地係㈣pH 5的胃的步驟。較佳的飲食為飲食卜較佳地係使用八280以測定脂肪酿、g .. 辰度，較佳地係使用消光係數1.24 A280/mg 〇本發明之脂肪酶可呈古·、，τ + 善··至少丨2 /、有以下者的對參考的膽鹽比率改的脂肪酶可呈有以下二·6、1,8、或至少2·0。更佳地本發明一8、或至以下者的對參相膽以發明的脂肪酶可具有或至少 4.〇。該等。^ 3·2、3.4、3.6、3.8、 “比率亦可稱為(例如)3X、3倍、或3〇〇%， 77 200829698 ' 所有皆對應至3.0之比率-且對其他比率亦然。 * 在一個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T1141+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； : N33Q+G3 8W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+ P256T ； D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+ N233R+P256T ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S ； N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R ； Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； I N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R ； D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R +D254K+P256A ； N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+ 78 200829698 P256A ； D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111A+T114I+V168M+ E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T ； D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T ； N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P +L227G+T231R+N233R+P256T ； D27N+N33 Q+G91T+T114I+G163 S+E210D+T231R+N233R+P256Τ ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R ； D27R+N3 3 Q+T3 7Κ+Ν711+G91N+N94R+K98I+D111A+S216Ρ+ L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G +T231R+N233R+P256T+L269H ； D27R+N3 3 Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ；

N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A D2 7R+N3 3 Q+N71S+G91N+N94R+D111Α+Η13 5D+S216P+L227G 79 200829698 +T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R ； D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+P256T ； D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P +L227G+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+ Q249R ； N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S ;與 N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。在一個更佳的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S 216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+ P256T ； D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+ N233R+P256T ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S ； 200829698 N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R ； Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R ； D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R +D254K+P256A ； N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+ P256A ； D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V168M+ E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+R179T+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T ； D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T ； N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P +L227G+T231R+N233R+P256T ； D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+ P256T ； 81 200829698 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R ； D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+P256T ； N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S ;與 N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L 〇在一個最佳的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T1141+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+ P256T ； D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+ N233R+P256T ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S ； N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R ； Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R ;與 82 200829698 N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S。具有以上所列舉的取代的SEQ ID NO: 2之胺基酸i-269 之脂肪酶之變體（三個具體態樣之每一者）皆具有改善的試管内消化表現，即，在胃蛋白酶存在下於pH 3的改善的穩定性，更尤其是在於75 ug/mL胃蛋白酶的存在下於pH 3 〇與20°C (或室溫）培養3小時後於pH 8.0與20°C (或室溫）對PNP-掠櫚酸酯測量的改善的殘餘活性，較佳地為如藉由實施例8之方法測定的改善的％殘餘活性（％RA )。在特殊的具體恶樣中，％RA係至少3 0、至少5 0、至少70、至少8〇、或至少90%。改善比率可定義為所關注的脂肪酶之％尺八對參考脂肪酶之％RA之比率。此改善比率較佳地為至少15、 2·0、2·5、3·〇、3.5、4.0、4.5、或至少4 5。改善比率可自表1 〇之总果计异，其係藉由將所關注的脂肪酶之％❹除以參考脂肪酶之％RA(例如SEQID Ν〇: 2之脂肪酶、或㈣出 NO: 1、或另一種參考脂肪酶，如所敘述的）。本發明之脂肪酶可具有以下的相對於參考的膽改善··至少L2、14、丨6、手 · 或至少2·0。更佳地本發月的知肪酶可具有以下的相對 ^ r们不目對於參考的膽鹽比率改善··至少2.2、2.5、2·8、或至少]Λ苷可且右m ’ •。甚至更佳地本發明的脂肪酶 1、有以下的相對於參考的膽鹽比率改善··至少η、”、 3·ό、3·8、或至少4 〇。此等 · ^ . 3000/ 專匕革亦可稱為（例如）3Χ、3 °成3〇〇/〇，所有皆對應至3.〇亦鈇。之比率-且對其他比率在-個特殊的具體態樣中’本發明的脂肪酶係選自(相 83 200829698 • 較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+ N233R+Q249R+D254S ； N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+ Q249R ； G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； ^ D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 141+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ；

G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 141+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+D254K+P256A ； " L52I+V60E+T114I+V168M+E210D ； D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P +L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T ； ^ D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 141+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T。更佳地，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 84 200829698 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+ N233R+Q249R+D254S ； N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+ Q249R ； G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 141+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S 216P+L227G+T231R+N233R+P256T;與 N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A。甚至更佳地，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233 R+Q249R+D254S ； N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q24 9R ； G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； 85 200829698 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 141+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ;與 N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A。在一個最佳的具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T。具有以上所列舉的取代的SEQ ID NO: 2之胺基酸1-269 之脂肪酶之變體（四個具體態樣之每一者）皆具有改善的試管内消化表現，即，在2 mM膽鹽的存在下於pH 5.0對PNP-油酸酯的改善的活性，更尤其為如藉由於實施例9之方法所測定的改善的膽鹽比率。在又一個特殊具體態樣中，本發明的脂肪酶係選自（相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶）具有以下的取代（較佳地為取代之組）的脂肪酶中： N3 3Q + G91T+G163K+T231R+N23 3R+D254G ； N3 3Q + G91T+G163K+T231R+N23 3R+D254S ；與 N1 1R+N3 3Q + G91T+G163K+T231R+N23 3R+D25 4S。相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶，最佳的脂肪酶包含以下的取代，較佳地為取代之組： N11R+N33Q + G91T + G163K+T23 1R+N23 3R+D2 54S。 86 200829698 在-個特殊的具體態樣中，本發明的有改善的活性。在活性的前仕低pH具 ,Μ 後文中，低PH意指於範圍從4 至的之 pH，例如 pH 4.0、4 5、5 0 s s a n c d 5·〇、5·5、6·0、6.5、或 7 〇。較佳的低pH為pH 6 Ο 〇於击丄y土 ^ 車父佳的具體態樣中，於PH 6.0 的活性係如下測定：i)於37。。； u)使用受甘油S旨’較佳地於濃度8賴；出）其在培養酵素與受質之期間膽鹽存在，較佳祕於、、曲危旱乂仏地於辰度i〇mM; iv)使用1〇〇mM咪唑、100 mM 醋酸鹽、1 〇n 工 ^ f. 100 mM丙二酸，pH 6.〇作為分析緩衝液；v)其在培養酵素與受質期間“A存在，較佳地於 ’辰度1 m IV!，及/v i、目女沿丄命τ* )-有對應至O.OlmgEP/mL的經純化的脂肪酶之量（EP =酵素蛋白質，基於A”。）。在又更佳的具體態樣中，Wi)在分析前於5mMNaH2p〇4pH7 G將酵素稀釋（例如’以獲得用於分析目的的適當濃度）；Ηχ)將酵素與受質培養3G分鐘；ix)將酵素與受f培養於微滴定盤（micro titer plate，Μτρ )、且較佳地以 7〇〇rpm 搖動·，幻將酵素反應以停止溶液停止，較佳地（2·2% 丁出时_X1⑼、〇·22Μ磷酸），更佳地包含胃蛋白酶（7〇mg/1) ;χί)由酵素反應所產生的自由脂肪酸係藉由酵素顏色試驗（例如 NefaC)測定；及/或xii)於pH 6〇在活性的改善被表明與茶考脂肪酶（例如具有SEq ID NO : 1或2 (較佳地為2) 之胺基酸卜269的脂肪酶）或與變體lV2934在相同條件下的活性有關。關於試驗方法之更多細節，請參考實施例3，於pH 6.0有改善的活性的脂肪酶變體之特殊的實例為（相對於具有SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269的脂肪酶）： 87 200829698 LVA049、LVA349、LVA023、LVA099、SEQ ID NO : 1、 LVA061、LV2934、LV1330、LVA043、LVA041、LVA012、 LV1 857、與LV1855(對於其等的結構，參見表1)£j；lva〇49、 LVA349、LVA023、與LVA099脂肪酶變體係特佳的（相較於SEQ ID NO : 1脂肪酶亦為改善的）。lva〇49與脂肪酶變體為甚至更佳的。從pH_活性觀點來看，最佳的脂肪酶為LVA049脂肪酶變體。

在另一個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶在低pH 具有改善的穩定性。在穩定性的前後文中，低pH意指於從 2 至 6 的範圍之 pH，例如 pH2 〇、2 5、3 〇、3 5、4 〇、4 $、 5-〇、5.5、或6.0。較佳的低pH為3〇。經純化的脂肪酶酵素之穩定性係藉由於所欲的pH (例如3 〇 )於37。匚培養酵素1、15、45、與120分鐘，之後將殘餘脂肪酶活性於pH 8 與室溫（RT)在對-硝苯基辛酸酯測量而測定。於較佳的具體態樣中，i)使用於穩定性預培養的緩衝液（穩定性緩衝液）為2O0mM味唑、200mM醋酸鹽、2〇〇mM丙二酸，調整至所欲的pH(例如3.0);ii)將酵素首先於2〇mMNaHj〇4 P^H 7.0、0·01% Triton-X100稀釋至〇 4或〇㈣酵素蛋2白質4 每ml (較佳地係基於Am)的工作溶液，出）在預培養期間的酵素濃度係0.05《0.lmg酵素蛋白質每⑹，而^此稀釋緩衝液較佳地為酵素稀釋緩衝液：2〇mM醋酸鹽pH 6、 0.〇1% Triton_xl00; iv)預培養係於微滴定盤（Μτρ)且伴隨搖動，較佳地使用7GGn)m;v)對於之後的殘餘活性（ra) 之測定，將抽自預培養步驟的含酵素分農於以下的殘餘活 88 200829698 性緩衝液（RA緩衝液）稀釋至少2〇倍：2〇〇mM μ (參_ 羥甲基胺基甲烷、2-胺基·2_羥甲基十3·丙二醇，pH 8、〇·4%

Trit〇n-X100、lmM CaCl2 ; vi)殘餘活性係於 ρΗ 8 〇與 rt 對對··硝苯基辛酸酯測量且係藉由於4〇5 nm的動力學（速度；速率）之方式測量5分鐘；vii)%殘餘活性係如下計算：對每個抽取（1、15、45、12〇分鐘；或i、6〇、12〇分鐘）在每個pH内的速率係減去無酵素控制組的速率，若適合的話使用膽鹽或胃蛋白酶（參見以下Ηχ)與ίχ))，且接著將此經校正的速率除以每個pH内的最高值並乘以1〇〇。視需要地，將酵素在膽鹽存在下預培養Ux)，較佳地於濃度 10mM，及/或ix)在胃蛋白酶的存在下（7〇叫/1)。對於此試驗方法之細節，請參考實施例4。在進一步的特殊具體態樣中，本發明的脂肪酶在缓衝液中於PH 3.0培養120分鐘後具有如下的％殘餘活性（如以上與於實施例4所敘測定）：至少6〇、Μ '^ /2、 74、 76 、 78 、 80 、 82 、 84 、 86 、 88 、 90 、或 92 。在進一步的特殊具體態樣中，本發明的脂肪酶在緩衝液中於pH 3.0培養60分鐘後具有如下的％殘餘活性（如以上與於實施例4所敘測定）：至少82、83、84、85、W 88、或至少89。在又進一步特殊的具 -q π π曰奶崎在胃蛋白酶的存在下於ρΗ 3·〇培養45分鐘後具有如下的％殘餘活性（如以上與於實施例4所敘測定）： ’、土 ν 、40、45、 50 、 55 、 60 、 65 、 70 、 72 、 74 、 76 、 78 、 8〇、 82 、 84 、％、 89 200829698 88 、 90 、 92、或 94 〇在又進一步特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶在胃虫白_的存在下於pH 3.0培養60分鐘後具有如下的0/。殘餘活性（如以上與於實施例4所敘測定）··至少20、3〇、4〇、 50、60、70、80、82、84、86、88、或至少 89。在又進一步特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶在胃蛋白酶的存在下於ΡΗ 3·0培養120分鐘後具有如下的％殘餘活性（如以上與於實施例4所敘測定）··至少2、4、6、 8、10、20、30、40、50、60、70、或至少 71。在又進步的特殊具體態樣中，本發明的脂肪酶在膽益的存在下於pH 3 · 0培養1 5分鐘後具有如下的％殘餘活性 (如以上與於實施例4所敘測定）：至少8、1〇、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、3〇、32、34、4〇、 42 、 44 、 46 、 48 、或 50 。具有於pH 3 ·0的改善的穩定性之脂肪酶變體（相對於具有 SEQ ID NO : 2 之胺基酸1-269之序列的脂肪酶）之特

^ · ^VA147、LVA315、LVA317、

此等相較於SEQ ID NO : 2、SEQ ID 90 200829698 NO : 1、與LV2934之脂肪酶係改善的。在膽鹽的存在下於 pH 3.0具有改善的穩定性的另一個特佳的脂肪酶變體係 LVA349。關於此等脂肪酶變體之結構，參見表1與實施例 4 〇在另一個特殊的具體態樣中（其可特別有用於較未經純化的脂肪酶製劑，例如用於篩選目的），於pH 3.0的穩定性係如下測量：首先將酵素在75ug/mL胃蛋白酶的存在下於pH 3.0與室溫預培養3小時，並接著將殘餘脂肪酶活 < 性於隨時間監視活性的速率分析中測量。於較佳的具體態樣中，i )用於殘餘活性分析之受質係4-硝苯酚棕櫚酸酯，較佳地係 ImM PNP-棕櫚酸 S旨、1.2%Triton-X100、4mM CaCl2、100mM TRIS，pH 8·0 ; ii)對於殘餘性分析，OD405 讀值係從受質加入1 5分鐘後與直到受質加入1 8小時後獲得；iii ) OD4G5讀值係以mOD (毫OD)每小時表現；iv) 收集落入線性範圍的數據以及將每個經胃蛋白酶處理的樣本之殘餘脂肪酶活性與對應未經處理的樣本之殘餘脂肪酶 < 活性比較；v ) %殘餘活性（％RA )係藉由將經處理條件之速率除以未經處理條件之速率並將結果乘以1 00而計算。關於更多細節，參見實施例8。以下的變體（相較於具有SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269之序列的脂肪酶）在胃蛋白酶的存在下於pH 3.0具有改善的穩定性：具有SEQ ID NO : 1 之胺基酸 1-269 的脂肪酶、LVAR0002b、LVAR0003、 LVAR001 la 、 LVAR0013 、 LVAR0014 、 LVAR0015 、 LVAR0016、LVAR0017、LVAR0045、LVAR0046、LVAR0047、 91 200829698 LVAR004 8、LVAR005 0、LVAR005 卜 LVAR0052、LVAR005 3、 LVAR005 4、LVAR005 5、LVAR005 6、LVAR0057、LVAR005 8、 LVAR005 9、LVAR006 卜 LVAR0062、LVAR0063、LVAR0064、 LVAR006 5、LVAR0066、LVAR0067、LVAR0068、LVAR0069、 LVAR0070、LVAR0(m、LVAR0072、LVAROICH、LVAR0102、與 LVAR0106。較佳的變體係：LVAROOlla、LVAR0013、 LVAR001 7、LVAR0046、LVAR0052、LVAR0055、LVAR006 1、 LVAR006 3、LVAR0068、LVAR0070、LVARO(m、LVAR0072、 LVAR0014、LVAR0015、LVAR005 7、LVAR01CH、LVAR0102、與 LVAR0106。特佳的脂肪酶變體係：LVAR0014、 LVAR0015、LVAR0057、LVAR0101 、LVAR0102、與 LVAR0106。此等變體之結構係於表6與9顯示。在另一個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶於所欲的 pH (例如 pH 2.5、3.0、3.5、4,0、4.5、5·0、5.5、或 6.0) 與37°C在胃蛋白酶的存在下（例如在70mg/mL胃蛋白酶的存在下）係穩定的，較佳地達15、45、60、及/或120分鐘。對於更多的細節，參見以上提出實施例4的部分。在又進一步的特殊具體態樣中，本發明的脂肪酶於所欲的 pH (例如 pH 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、或 6.0 )與37°C在膽鹽的存在下（例如在10mM膽鹽的存在下）係穩定的，較佳地達15、45、及/或120分鐘。對於更多的細節，參見以上提出實施例4的部分。在又進一步的特殊具體態樣中，本發明的脂肪酶（相較於參考脂肪酶，例如具有SEQ ID NO ·· 2之胺基酸1-269 92 200829698 之序列的脂肪酶序列的脂朋酶）或具有SEQ ID NO ·· 1之胺基酸i_269之具有改善的磷脂酶活性。磷脂酶活性可如下測疋· 1 )將經純化的酵素於酵素稀釋緩衝液⑵福Na_ 醋酸鹽、0. (Η % w/w Trit〇n_x刚、pH 5 〇 )稀釋至 5mgEp/mi，例如基於a28G; u)測定對丨·肉豆蔻醯基·2_掠櫚酿基，-甘

油_3_碟膽鹼的活性，較佳地係於㈣與共μ分鐘；叫測定所釋放的自由脂肪酸並藉由Maldi_t〇f⑽^量，較佳祕在與於 50% Me0H、〇.1%TFA(基質）的 2〇mg/mL 2,5_ 氫苯甲k混合後，lu )將Ms蜂之相對訊號強度（每個峰下的面積）用於計算磷脂酶A1與A2活性間的分布。相較於參考脂肪酶（例如具有SEQidn〇: 2之胺基酸 1-269的脂肪酶、或具有SEQ m N〇: i之胺基酸卜⑽的脂肪酶）具有改善的在水解後留下的未消化鱗脂％的脂肪酶具有改善的磷脂酶活性。 ▲相較於SEQm NO·· 2具有改善的磷脂酶活性的脂肪酶變體之特殊實例係以下者·· LV1889 ' LVA023、LV133〇、 LV1 855、LV1 865、LV1874、Lvim、Lv編3、lva〇49、 V1857與LV1232。較佳的脂肪酶係LV1232與LV1889。在又進一步的特殊具體態樣中，本發明的脂肪酶相較於，、有SEQ ID NO· 2之胺基酸1·269的脂肪酶、具有SEq ID NO · 1之胺基酸！_269的脂肪酶、及/或相較於LV2934( SEq ID NO : 1之去醣化變體N33q)在試管内消化模型中具有改善的表現。試管内模型使用飲食j、或飲食π，其係於實焉双邛刀敘述。簡而言之，將1〇〇ul的飲食與2〇ul胃蛋白酶 93 200829698 (700 mg/ml)以及30ul脂肪酶（4濃度之二重複）在微滴定盤之槽孔中混合，其係於37QC伴隨搖動（750 rpm)培養 1小時，之後加入25ul缓衝液（0.8MMES ( 2-[N-嗎福林基] 乙磺酸）、0·8Μ醋酸鈉、0.8M咪唑，pH 7.0 )與20ul膽鹽 (100 mM)造成5·7至6·0的pH。接著將盤於37°C伴隨攪動培養2小時，之後藉由加入50ul於1M磷酸中的10% Triton-ΧΙΟΟ 停止反應。在於 1% Triton-ΧΙΟΟ 中稀釋 125-25 0 倍後，將自由脂肪酸之量使用比色套組（例如NEFA C套組）測定，如於實施例3所述。具有改善的試管内表現之脂肪酶之實例係： LVAR0003、LVAR0045、LVAR0046、LVAR0047、LVAR005 0、 LVAR005 卜 LVAR005 2、LVAR005 3、LVAR0054、LVAR005 6、 LVAR005 7、LVAR006 卜 LVAR0062、LVAR0063、LVAR0064、 LVAR0065、LVAR0067、LVAR0069、與 LVAR0072。其他實例為：LVAR0074、LVAR0076、LVAR0077、LVAR0078、 LVAR0079、LVAR0080、LVAR0086、LVAR0088、LVAR0091、 LVAR0094、LVAR0095、LVAR0096、LVAR0099、LVAR0101、 LVAR0102、LVAR0103、LVAR0104、LVAR0106、與 LVAR0108。較佳的實例為·· LVAR0003、LVAR0013、 LVAR0032、LVAR0050、LVAR0058、與 LVAR0069。更佳的為：LVAR0063、LVAR0067、LVAR0069、LVAR0079、 LVAR0080、LVAR0094、LVAR0095、LVAR0096、LVAR0099、 LVAR01(H、LVAR0102、LVAR0103、LVAR0104、LVAR0106、與 LVAR0108。最佳的為 LVAR0094、LVAR0099、 94 200829698 LVAR0095、與 LVAR0106。 ' 在又進一步的特殊具體態樣中，本發明的脂肪酶具有改善的活體内表現。活體内表現可在具有被誘發的胰臟外分泌不足（Pancreatic Exocrine Insufficiency，PEI)的雌性 Gdttingen迷你豬（Ellegaard )中於脂肪酶篩選試驗（如於實施例10所述）估計，及/或在完全活體内消化力試驗（如於實施例11所述）估計。表現可相對於具有SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269的脂肪酶、具有SEQ ID NO : 1之胺基酸 (、 1-269的脂肪酶、及/或LV2934 (其為具有SEQ ID NO : 1 之胺基酸1-269的脂肪酶之去醣化變體N33Q)為改善的。關於此試驗更多的細節，請參見實施例1 0。本發明的脂肪酶較佳地包含至少一個以下的取代： N26I、D27Q、D27R、D27Y、P29T、A30T、A30V、T32I、 N33Q、N33T、N33Y、P42L、E43D、E43K、E43M、E43V、 A49T、L69I、E87K、E99D、E99K、E99P、E99S、E99T、 G163K、S216P、L227G、T231R、N233R、D234K、E239V。本發明的脂肪酶較佳地包含至少一個以下的取代： N26I、D27Q、D27R、D27Y、P29T、A30T、A30V、T32I、 N33Q、N33T、N33Y、P42L、E43D、E43K、E43M、E43V、 A49T、E56C、E56S、D57A、D57G、D57N、V60L、L69I、 E87K、G91A、G91E、G91N、G91R、G91S、G91T、G91V、 G91W、L93F、N94K、N94R、N94S、D96E、D96G、D96L、 D96N、D96S、D96V、D96W、D96Y、L97M、L97Q、K98I、 E99D、E99K、E99P、E99S、E99T、D111A、D111S、T114I、 95 200829698 • L147S、G163K、E210D、S216P、L227G、T231R、N233R、 D234K、E239V、Q249R、N251S、D254N、P256T、G263Q、 L264A、I265T、G266D、T267A、及/或 L269N。在一個特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶不是：（i ) 具有SEQ ID NO : 1之胺基酸1-269的脂肪酶；（Π) ( 〇之脂肪酶之變體N33Q;(iii)SEQIDNO··l之胺基酸-5-269 (-5 至+269 )、-4-269 (-4 至+269 )、-3-269 (-3 至+269)、 -2-269 ( -2 至 + 269 )、-1-269 ( -1 至+269)、與 2-269 ; ( iv) f' ( iH)之序列之任一者之變體N33Q ;具有胺端甲硫胺酸殘基的具體態樣（i ) 、（ ii ) 、（ iii )、及/或（iv )之任一者、（v )具有聚組胺酸束的具體態樣（丨）、（π )、（ m )、 (iv )、及/或（v )之任一者；（vi )具有至少一個如w〇 2006/136159之ρ· 5第4-18行所定義的保守性取代的具體恶樣（1)、（ii)、（iii)、（iv)、（v)及/或（vi)之任者，（νϋ)如 WO 2006/136159 之 ρ· 6 第 4-14 行所定義的前述具體態樣之任一者之片段；（iix)W WO 2006/136159 \ 之ρ· 6第34行至P· 7第11行所定義的變體之特殊混合物；及/或不是（ix)於W0 2006/136159中對醫藥用途特別揭示的脂肪酶。本發明之特佳的脂肪酶係·· LV1232、LV1855、LV1857、 LV1 865、LV1874、與 LV1889。本發明之其他特佳的脂肪酶係以下的脂肪酶，其等係親本脂肪酶之變體，且包含（T231R+N233R)以及加上至少一個以下的取代：N26I、D27Q、D27R、D27Y、A30V、 96 200829698 T32I、N33Y、P42L、E43K、E43M、E43V、A49T、E56A、 E56C、E56K、E56R、E56S、D57A、D57G、D57N、E87K、 G91E、G91N、G91R、G91V、G91W、L93F、N94K、N94R、 D96G、D96L、D96N、D96S、D96V、D96W、D96Y、L97M、 L97Q、K981、E99K、E99P、E99S、E99T、D111A、D111S、 T114I、L147S、G163K、S216P、L227G、D234K、E239V、 Q249R、D2 54N、G263Q、L264A、I265T、G266D、及 /或 L269N。脂肪酶、蛋白酶、澱粉酶以下的脂肪酶亦包括於本發明之範圍内：本文所請求與所揭示的脂肪酶之任一者，其包含加上以下的N端延伸之任一者：SPIRR、PIRR、IRR、RR、與R，（分別地）對應至 SEQ ID NO : 2 之胺基酸-5 至 _1、SEQ ID NO ·· 2 之-4 至-1、SEQ ID NO : 2 之 _3 至 _1、SEQ ID NO : 2 之-2 至-1、與SEQ ID NO : 2之-1。此等N端版本之任一者之任何混合物亦特別地包括在本文内。在一個特殊的具體態樣中，本發明之脂肪酶之比活性係具有SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269的脂肪酶之比活性的至少50%。在額外的特殊具體態樣中，變體脂肪酶之比活性係具有SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269的脂肪酶之比活性的至少 60、70、75、80、85、90、或至少 95%。比活性可使用本文實施例1之脂肪酶分析之任一者測量，但較佳地係使用實施例1之LU-分析以LU/mg酵素蛋白質測量，並測定酵素蛋白質含量，例如如於實施例2所述（A28。與 GPMAW )、或使用胺基酸分析。於胺基酸分析，對脂肪酶 97 200829698 樣本之肽鍵進行酸水解，接著分離與定量所釋放的胺基酸，例如於 Biochrcm 20 Phls Amin〇 Acid Anaiyser 上其商業上 f 講自 β 1 e Bernf^PTI A / O 〇 1 tsen A/S? Sandbaekvej 5-75 DK-2610

Roedovre，Denmark，並係根據製造者的操作指南。每個個別胺基酸之量係藉由與寧海準（ninhydrin)反應而測定。 f \ 在又進一步特殊的具體態樣中，本發明的脂肪酶係結合額外的脂肪酶使用。額外的脂肪酶之實例為哺乳動物脂肪酶、與微生物脂肪酶。較佳的哺乳動物脂肪酶為騰臟粹取物，例如來自豬或牛’例如胰酶。胰酶可以未塗層（未加工）產物之形式使用、或以經調配產物之形式使用（腸塗層的（以提供對胃酸的抗性）、或非功能性塗層的（經塗層的，但未提供對胃酸的抗性））^胰酶可包含又進一步酵素的活性組成成分，如胰蛋白酶及/或胰澱粉酶。微生物脂肪酶可係（例如）基於或街生自細菌或真菌的脂肪酶。細菌的脂肪酶可衍生自（例如）芽胞桿菌（細出u〇或假單胞菌（Pseudomonas)，真菌的脂肪酶可衍生自（例如）根黴菌（Rhizopus)、念珠菌、或腐質黴菌之品系，例如德氏根徽菌（Rhizopus delemar )、爪哇根黴菌（扯〜二 ^anicus)、綠黴 _ (Rhizopus 〇ryzae)、錢毛腐質黴菌，尤其是產品脂肪酶D2™或脂肪酶D Aman〇 2〇〇〇tm (脂肪St，EC 3.1.1.3) ’其等係商業上可購自天野製藥（Aman〇 Pharmaceuticals )，曰本。本發明的脂肪酶可結合使用，有或沒有澱粉酶，如以下所述。術語「蛋白酶」於本文定義為水解肽鍵的酵 98 200829698 素。其包括任何屬於Ec 3 4 個次類別之每一者，此等酵辛# /、、、且之酵素（包含其十群 n 者此寻酵素心下稱為 -白酶之只例為哺乳動物蛋白酶較佳的哺乳動物蛋白酶A ^ ^ p /、微生物蛋白酶。刃贫白S#為胰贓粹取物，例如例如胰酶。胰酶可以未經 "， 1工土屬的（未加工使用、或以經調配的產物之之形式涂#的）#田0. ^ (躲主層的、或非功能性土層的）使用。胰酶可能包含又分，如Μ P ^ ^ 進V的酵素活性組成成刀如月夷月曰肪酶、BSSL (經脖蹢制、紅u U、工膽鹽刺激的脂肪酶（Bile Salt

Stimulated L〗pase))、及/或胰澱粉酶。微生物蛋白酶可（例如） ^ 如）基於或何生自細菌的或真菌的品糸。蛋白酶尤其可係衍 j王目题囷之口口糸，例如米麴菌 (ASPergillUS〇ryZae)或蜂蜜麴菌（AsPergillusmelleus)，尤其是產品pr〇zyme6TM(中性、鹼性蛋白酶ec34 η ^)，其係商業上可購自天野製藥，…細菌蛋白酶之實例係來自芽胞桿ϋ與㈣卡氏菌（—。叫〇之蛋白酶，例如地衣芽胞杯g (BaciUus lichenif〇rmis)蛋白酶，其具有 SEQ ID NO . 3之胺基酸胺基酸卜274之序列、擬諾卡氏菌物種蛋白酶，其具有SEQ ID N〇 : 4之胺基酸胺基酸之序列或達松維爾擬諾卡氏菌（Nocardiopsis dassonviellei)達松維爾（dassonville〇亞種蛋白酶，其具有SEQ ID NO: 5之胺基酸胺基酸ι-188之序列。SEq m N〇 : 3之胺基酸1-274之蛋白酶可（例如）如於w〇 2006/13 6160 中所述製備。SEQ ID NO : 4之胺基酸1-188-5之蛋白酶可 99 200829698 - (例如）如於 WO 2001/58276 中、或於 WO 2004/1 1 1224 中所述製備。在一個較佳的具體態樣中，本發明之蛋白酶與具有（或包含）（i) SEQ ID NO : 3 之胺基酸 1-274、（ ii) SEQ ID NO ·· 4之胺基酸1_188、及/或（iii) SEQ ID NO : 5之胺基酸1-188 的蛋白酶係至少70%相同的。於（i) 、（ π)或（iH)之額外較佳的具體態樣中，相同性的程度係至少7〗％、72%、 73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、8〇%、81%、82〇/〇、 83〇/〇、84%、85%、86%、870/〇、880/〇、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95〇/〇、96%、97。/。、98%、或至少 99%。在（i)、 (h )、或（iii )之供選擇的具體態樣中，相同性之程度係至少約 50〇/〇、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、 5 9/〇、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、6 8%、或至少69%。本發明的脂肪酶（有或沒有如上所述的蛋白酶）亦可結合:澱粉酸#用。於此處的前後文中，澱粉酶係催化澱粉與其他線性與 $支的募醣與多醣之内水解的酵素。澱粉之直鏈澱粉部分富含M-alpha-葡萄糖苷連接，而支鏈澱粉部分為更分支的且不止含有l，4-alpha_亦含有i，6_alpha_葡萄糠苷連接。在们4寸殊的具體悲樣中，澱粉酶屬於ec 3·21.ι群組的酵素。在特殊的具體態樣中，澱粉酶係哺乳動物澱粉酶或微物叙粕酶。哺礼動物澱粉酶之實例係胰臟粹取物，例如 100 200829698 來自緒或牛，例如胰酶。胰酶可以未經 y 〜的〔未加工的）產品之形式使用、或以經調配的產品〜〜式（腸塗層的、或非-功能性塗層的）使用。胰酶可能包含 5入進一步的酵素活性組成成分，如胰蛋白酶及/或胰脂肪酶。微生物澱粉酶可係（例如）基於或衍生自細菌的或真菌的品系，例如芽胞桿菌、假單胞菌、麴菌、或根黴菌。

澱粉酶尤其可衍生自麴菌之品系，例如黑麴菌 (Aspagillus niger)、米麴菌、或蜂蜜麴菌，例如衍生自米麴菌的產品澱粉酶A1™，其係商業上可購自天野製藥，曰本、或衍生自蜂蜜麴菌的澱粉酶EC™，其商業上可購自 Extract -Chemie，德國。較佳的澱粉酶係（i)包含SEQ ID NO : 6之胺基酸ι-481 (例如其胺基酸 1-481、1-484、或 1-486) 、SEQ ID NO : 7 之胺基酸1-481、及/或SEq ID NO : 8之胺基酸ι_483的澱粉酶。在一個較佳的具體態樣中，澱粉酶係具有、或包含與以下之一者至少70%相同的胺基酸序列的澱粉酶：（i)SEQ ID NO : 6 之胺基酸 1-481、（ ii) SEQ ID NO : 7 之胺基酸卜481、及 /或（iii) SEQ ID NO : 8 之胺基酸 1-483。SEQ ID NO : 6-8之澱粉酶可（例如）如於共同繫屬w〇 2006/136161 所述製備。在（i )、（ ii )、或（iii )之更佳的具體態樣中，相同性之程度係至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、 77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、9 8%、或至少 99%。在（i ) 、（ ii )、或（iii )之供 101 200829698 選擇的具體態樣中，相同性之私度係至少50%、51% 53%、54%、55%、56%、57〇/ … 57/。、58%、59%、6〇%、61 63%、64〇/〇、65〇/〇、66〇/〇、67%、以0/ 斗、68%、或至少 69%。通常，脂肪酶、蛋白酶、盥興版杨St酵素（以下稱「酵素」，即本發明之酵素）可為天然的或野生形酵素（獲自動物，尤其是哺乳動物，例如人類或豬酵素；冑自植物、或獲自微生物）、但亦可為任何j：展招& μ 巧1 Π /、展現所欲的酵素活性的突變體、變體、片段、等等、夂σ成的酵素，例如混合的（Shuffled )、雜合的、或嵌合的酵素、 τ 蚁的（consensus ) 酵素。在一個特殊的具體態樣中，酵素為低致過敏性變體，其被設計以當暴露至動物（包含人）肖會引起減小的免疫學反應。術語免疫學的反應應被理解為任何藉由暴露至酵素的動物之免疫系統的反應。一類免疫學反應為過敏反應，其在所暴露的動物中導致增加水平的IgE。低致過敏性變體可使用技術領域中已知的技術製備。例如酵素可與遮蔽涉及免疫學反應的酵素之部分或抗原決定基的聚合物部分共軛。與聚合物共軛可涉及試管内將聚合物與酵素化學偶合，例如如於 W0 96/17929、WO 98/30682、W〇 98/35026、及/ 或WO 99/00489中所述。共軛又可額外或供選擇地涉及將聚合物與酵素活體内偶合。如此共軛可藉由基因工程設計編碼酵素的核苷酸序列、於酵素插入編碼額外的醣化位置的一致序列並於能夠醣化酵素的宿主中表現酵素而達成，芩見例如WO 00/263 54。提供低致過敏性變體之另一個方法 102 200829698 • 為基因工程設計編碼酵素的核苷酸序列以便使酵素自我寡 • 聚化，導致酵素單體可遮蔽其他酵素單體之抗原決定基且藉此減低寡聚物之抗原性。如此產物與其等的製劑係於例如WO 96/16177敘述。涉及免疫學反應的抗原決定基可藉由各種各樣的方法鑑認，例如於WO 00/26230與WO 01/83559所述的嗜菌體展示法、或於EP 561907所述的隨枝方法。一旦鑑5忍出抗原決定基’可藉由已知的基因操作技術（例如位置指向性誘變（Site directed mutagenesis )(參 1 見例如 WO 00/26230、WO 00/26354 及/或 WO 00/22103 )) 改變其胺基酸序列以製造酵素之被改變的免疫學特性，及/ 或聚合物之共轆可以足夠接近抗原決定基的方式完成以使聚合物遮蔽抗原決定基。在知·殊的具體態樣中，酵素（丨）於pH 2_8，較佳地亦 ;PH 3-7 ’更佳地於pH 4_6係穩定的；（ii )於pH 4-9，較佳地於4-8係有活性的；（iii)對藉由胃蛋白酶與其他消 ( f性蛋白酶（例如胰臟蛋白酶，即，主要為胰蛋白酶與胰旋礼蛋白酶）之降解係穩定的；及/或（w)在膽鹽的存在下係穩定的及/或有活性的。術語「結合」意指根據本發明的脂肪酶、 :;粉梅的結合使用。結合使用可為同時發生的、部:及二的:的、或相繼的，此等三個術語-般係依照由醫師開立 J辱方理解。的，i °同日守發生的」意指在該情況下酵素同時為活性 <列如卷立榮· 〇 t 田/、寺壬一個或多個分開的藥學產品同時投藥、 103 200829698 或若其等係在一個與相同的醫藥組成物中投藥。術語「相繼的」意指其中一種及/或兩種酵素係先發生作用’而第二及/或第三酵素之後發生作用的情況。相繼的作用可藉由以所欲的間隔以分開的藥學調配物、或呈一個醫藥組成物投藥所關注的酵素而獲得，而於該醫藥組成物中所關注的酵素被不同地調配（隔間化 (compartmentalized ))，例如以獲得不同的釋放時間、提供改善的產物穩定性、或以最佳化酵素劑量。、，術扣冑分同時發生的」意指以下情況··料活性期間並非完全地同時發生的亦非完全地相㈣，即有比有活性的某些期間。 ’、白個/一種」（例如當使用於本發明之蛋白酶、月曰肪酶、及/或殿粉酶之前後文時），意指至少—個在特殊的具體態樣中，「— 種。 , Γ 個/一種」意指「一或多個/一或夕個種」，或「至少一個/ ' 絲 , 種」其再次意指一個/ 種、兩個/兩種、三個/二藉 y 個/一 ^ ^ 四個/四種、五個/五種等箄。本發明之酵素之活性裡年4。 ^ 使用任何適合的分析測吊，可使分析pH與分析、、w麻、里。通

值之實例為pH 2、3、4、s 々酵素。分析pH 6、 7、 8、 9、 11 分析溫度之實例為3〇、35 、 1、或12。 7〇、80、90、或 95〇c。較 4〇 45、5〇、55、6〇、65、圍，例如4、5、6、7、< 8 ^、PH值與溫度為在生理的範的溫度。的阳值，與3〇、35、37、或4以適合的酵素分析之實例係包括在實驗部分中其他實 104 200829698 之FIP或Ph.Eur.分析。這些同係屬申請案W〇 2006/136160 例為用於蛋白酶與澱粉酶活性分析係（例如）（分別地）於共與 WO 2006/136161 中敘述。醫藥品在本文的前後文中，術語「醫藥品」意指—種化合物、或化合物之混合物，其治療、預防及/或減輕疾病之徵候，

土地會治療及/或減輕疾病之徵候。醫藥品可由醫師開立藥方’其可為成藥產物。里組成物、本&月之酵素之分離、純化、與濃縮可藉由常見的方去進订。例如，其等可自發酵液體培養基藉由常見的程序 (包合，但是不限於，離心、過濾、粹取、噴乾、蒸發、成）回收，並進一步藉由種種技術領域中已知的程序 (匕a但不限於，色層分析（例如，離子交換、親和力、 L月曰〖生色層焦集（chromatofocusing )、與尺寸排除）、電泳程序（例如，製備性等電焦集（isoelectric f0Cusing ))、 L別丨生/合解度（dlfferential solubility，例如，硫酸銨沈澱）、 PAGE、或粹取）純化（參見（例如） J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New

York，1989) 〇例如’ SEQ ID NO: 2之脂肪酶之變體（例如SEQ ID NO :

1之脂肪酶）可（例如）基於US專利案第5,869,438號（其中SEQ ID NO : 1為編碼本文的SEq id NO : 2之脂肪酶的 DNA序列）製備，即藉由在適合的宿主細胞中重組表現DNA 105 200829698 序列，其為該us專利之SEQ ID N0: 1之修反映本文的SEQ Ιϋ NO : 1盥2門的胺Λ萨至以 > 改 , 〇 2間的胺基酸差異。如此修改可猎由位置指向性誘變製造，如技術領域中已知的。、在一個特殊的具體態樣中，每個酵素的經濃縮固體或液體製劑係分開地製備。此等農一 ^ /辰滩物亦可（至少部分地）分開地調配，如以下更詳細敘述的。錢：步的特殊具體態樣中，酵素係以固體濃縮物的本發明之醫藥組成物中。酵素可藉由技術領域中处曰#山骽狀匕、例如，固體狀態可為二^分子係布置成高度有序的形式、或沈殿物，八中酵素分子料置成心有序的、或無序的形式。 2可（例如）於接近酵素之？1的pH以及於低導電〇鐵111或更少）進行，如於EP 691982所述。係，士的具體態樣中，用於根據本發明使用的脂肪酶備。脂肪酶結晶可進= :_B1之實施請^ 為又耳外’如於WO 2006/044529中所迷。，種各樣的沈殺方法於技術領域中係已知的，包含以 :r 錢、及/或硫酸納）沈殺；以有機溶劑（例如 _二w八丙醇）沈殿；或以聚合物（例如PEG (聚乙 t ?,,,...、、，酵素可藉由各種各樣技術領域 f 例如凍乾、蒸發（例如於減壓）、及/或喷，ί *劑（典型地為水）自溶液沈澱。在一個進-步的特殊具體態樣中，酵素之固體濃縮物 106 200829698 麥知固體濃縮物之總蛋白質含量具有至少50% ( w/w)的活性酵素蛋白質之含量。在又進一步特殊的具體態樣中，活 14酵素蛋白質之含量相對於固體濃縮物之總蛋白質含量係至少 55、60、65、7〇、75、8〇、85、9〇、或至少 95%( w/w)。蛋白質含量可如技術領域中已知的方式測量，例如藉由密度計掃描經考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠，例如使用得自 BIO-RAD的GS-800經校正的密度計；藉由使用商業上的套組’例如蛋白質分析ESL ( Pnytein Assay ESL)，訂購編號 1767003，其係商業上可購自R〇che;或基於在w〇〇i/58276 之實施例8中所述的方法。較佳地，酵素蛋白質（例如，脂肪酶酵素蛋白質）構成用於根據本發明使用的固體酵素濃縮物之蛋白少 50%，更佳地為至少 55、60、65、7〇、75、8〇、8^9()、 92、94、95、96、或至少97%，如藉由密度斯染色的SDS-PAGE凝膠而測量。如此酵素可稱為「經分離的」、「經純化的」、或「經純化與分離的」酵素或多肽。對於在㈣中表現且包含各種各樣的N端形式之混合物的脂肪酶（如於WO2006/136159之實施例5所解釋在SDS-PAGE凝膠上的相關條帶係位於對應至分子量心〇 kDa的位置。對於非經醣化的變體（例如seq比n…丄 N33Q(LV2934 ))，相關的條帶係位於大約3〇咖的^ 較佳地呈經濃縮的酵 ’加上至少一種醫藥本發明之醫藥組成物包含酵素，素製劑的形式，更佳地為固體濃縮物 107 200829698 上可接受的輔助性（或附屬性）載劑及/或賦形劑；< (ii)至少 ^如（1)至少一種劑、及/或佐劑。視需要#，i Ί賦u、稀釋 r脱古比达— 八他組成部分之非限制性實例 (所有白為醫藥上可接受的）為崩 J马朋解劑、潤滑劑、緩衝劑、濕潤劑、防腐劑、調味劑、溶劑、制 π ^… ^ /合解劑、懸浮劑、乳化釗、穩疋劑、推進劑、與媒液（vehicie)。通常，依據所關注的醫學適應症而定物可經設計以用於所有技術領域中e 4 # *月之、'且成 ί ρ社次中已知的投藥之方式，其較么地包含經腸投藥（通 ^naA 為化道）。因此，組成物可呈固體、+固體、液體、或翁 & ^’例如錠劑、膠囊、扣末顆粒、微球、軟膏、乳帝相泡沫、溶液、栓劑、注射物、吸入物、凝膠、洗劑、、g #、自a 一乳洛膠。醫師會知道去挑不利的投藥途徑。、曰去避免潛在危險的或否則 =下时㈣㈣性物質因此亦僅係㈣性的且不以 ( 任何方式構成限制。對於料可單獨使u結合適當的添加训以製造藥丸（llet) 1双糸丸（micropellet )、鉸劑、微錠劑（miCrotablet)、於* )私末、顆粒或膠囊，例如，使用常 / ’例如乳糖、甘露糖醇、玉㈣粉、或馬鈴薯澱 =用賦形劑或黏合劑’例如晶狀（或微晶狀）纖維素、 =素衍生物、阿拉伯樹膠、玉米殿粉、或明膠；使用崩使二;例如玉米澱粉、馬鈴薯趨粉、或叛甲基纖維素納；使用潤滑劑，例如棕摘峨、白缲、蟲膠、無水石夕膠、自15〇〇 108 200829698 至20000的聚乙二醇（pEG，亦稱為macr〇g〇i )，尤其是peG 4000、PEG 6000、PEG 8000、聚乙烯吡咯啶酮（p〇vid〇ne )、滑石、m〇n〇lein、或硬脂酸鎂；且若想要，使用稀釋劑、佐劑、緩衝劑、濕湖劑、防腐劑，例如曱基對羥苯甲酸醋 (E218)、著色劑，例如二氧化鈦（Εΐ7ι)、與調味劑，例如魚糖、糖精、橘子油、擰檬油、肖香草精。口服製劑為用於m療PEI之醫學適應症的較佳製劑之實例。酵素亦可（頗常）調配成㈣口服劁劑，其藉由將其等溶解、懸浮、或乳化在水性溶劑（例如水）+，或在非水性溶劑（例如植物或其他類似的油、合成的脂肪族酸甘油酉旨、較多碳數脂肪族酸之醋、丙二醇、$乙二醇，例如觸侧、或較低碳數的醇，例如線性或分枝的ci_c4醇，例如2丙西子）中，且若想要，使用常見的附屬性物質或添加例士助'合』<左劑、稀釋劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑、與防腐劑。 “此外，酵素通常可製造成用於直腸投藥之嫌其係错由與種種的(例如乳化性基質或水溶性基質）混合。栓劑可包括㈣，例如可可脂、卡波蠟與聚乙二醇，其等於體溫融化，但於室溫為固體。將脂質體用作為# # # + / # A I媒液係另一種一般可能感興趣的方法。脂質體與標的位置之細胞融合並遞送腔之内容物至細胞内。㈣體維持與細胞接觸足夠的時間以融合，其使用各種各樣的方法以維拉類似者。於本發明之—=，：如分離、黏合劑、以及口方面’月曰質體經設計以氣溶膠化 109 200829698 以用於肺的投藥。脂質體可使用經純化的蛋白質或肽製備，該等蛋白質或肽介導膜之融合，例如仙台病毒或流行性感冒病毒、等等。脂質可為任何已知的脂質體形成性脂質（包含陽離子性或兩性離子性脂質，例如碟脂醯膽驗）之有= 組合。剩下的脂質正常會係中性或酸性脂f，例如膽固醇、石粦脂酸絲胺酸、碟脂醯甘油、以及類似者。對於製備脂質體，可使用 Kato 等人（1991) j 福 Chem 266: 3361 = 敘述的程序。可提供用於口服或亩腺# +话&十，胃服名直％杈樂之早位劑量形式（例如糖漿劑、，劑、粉末、與懸浮液），其中每個劑量單位（例如，-茶起、-大匙、膠囊、鍵劑或栓劑）含有預先決定的酵素之量。同樣地’用於注射或靜脈内投藥的單位劑量形式可包含在呈於無菌水、正常食鹽水、或另一種醫藥上可接受的載劑中的溶液的組成物的酵素。、 \ 用於本文，術語「單位劑量形式」，意指適合作為用 :人類與動物受藥者的單一劑量的物理分開的單位早位含有呈足以製造所欲效果之量的預先決定量的酵素。 _在一個特殊的具體態樣中’本發明之醫藥組成物係用於經腸的（較佳地為口服的）投藥。在進一步的特殊具體態樣中，口服組成物係⑴ 酵素之結晶的液體組成物；⑻（高度）經純化酵素澱物之液體懸浮液；（出）含有 ^ 素的凝體或經溶解形式的酵 U疋化酵素或吸附至細粒以及類似者的 …、之液體m或（v)呈含酵素粉末、藥丸、顆粒、 110 200829698 或微球之形式、竑4目面口要…，想要讀劑、膠囊、或類似者（其視需 a例如使用酸穩定的塗層）之形式的固體組成物。自、、且成物之特殊具體態樣中，_素被隔間，即彼此刀開，例如藉由分開塗層之方法。、在又進-步的組成物之特殊具體態樣中，蛋白酶係自成物之他酵素成分（例如脂肪酶、及/或殿粉酶）分開。酵素之劑量變化會很大，其依據欲投藥之特定酵素、投藥之頻#、投藥之方法、徵候之嚴重性、與受藥者對副作用的敏感性、與類似者而$。有些特定的酵素可能比其他者更有效。 μ ’、本發明之酵素之固體口服製劑之實例包含：（丨）本發明之脂肪酶；（ii)與選自由以下者所組成的群組的蛋白酶具有至少70%的相同性的蛋白酶：〇具有_⑴ ·· 3 之胺基酸1·274的蛋白酶、b)具有SEQ ID N〇 : 4之胺基酸H88的蛋白酶、與c)具有SEq⑴N〇 : 5之胺基酸^ =及/或（iii)與選自由以下者所組成的群組的澱粉酶具有至少7〇%的相同性的澱粉酶·· a)具有seq⑴ NO : 6之胺基酸1β481的澱粉酶、b)具有沾卩①Μ。： 7 的胺基酸1-481的澱粉酶、與c)具有SEQ m n〇 : 8之胺基酸1-483的澱粉酶；其中較佳地、與（⑴）之酵素之所預期的每日臨床劑量係如下（所有皆為酵素蛋白質每公斤體重（bw)):對於（i)之脂肪酶：〇〇1_1〇〇〇、 0.05-500、0.1-250、或 0.5-100 mg/kg bw;對於（Η)之澱粉酶·· 0.001-250、0.005_100、0·01_50、或〇〇5」〇叫心 _ ; 111 200829698 對於（iii)之蛋白酶：0.005_500、〇〇1_25〇、〇〇51〇〇、或 0· 1 -50 mg/kg bw。本發明之酵素之固體口服製劑之較佳實例包含：（i) 本發明之脂肪酶、與（ii)包含SEQ ID N〇 : 6之胺基酸^ 481的殿粉酶、及/或（iH)包含（較佳地為具有）seqid心 3之胺基酸1-274的蛋白酶。一〇)、（⑴、與（出）之酵素之所預期的每曰臨床劑量之實例係如下（所有皆為mg酵素蛋白質每公斤體重 (bw)).對於（υ 之脂肪酶：〇 i_25〇、或 1一 mg/kg bw ;對於（u)之澱粉酶：〇〇ι_5〇、〇〇5_1〇、或〇 ^ 5 mg/kg bw;對於(m)之蛋白酶：〇〇5_1〇〇、〇㈣、或… mg/kg bw。醯胺（肽）鍵，以及胺基與缓端，可被修改以得口服杈樂的較大穩定性。例如，羧端可被醯胺化。、本發明之醫藥組成物之特殊具體態樣（其適合用於治療消化性失調症、PEI、胰臟炎、囊腫性纖維化、第】型：尿病、及/或第II型糖尿病）可藉由將本發明之酵素併入藥丸中而製備。藥丸通常可包含自1G_9G%(W/W，相對於所得藥丸之乾重）的生理上可接受的有機聚合物、從崎 (w/w，相對於所得藥丸之乾重）的纖維素或纖維素衍生物、。轉=80-20% ( w/w，相對於所得藥丸之乾重）的酵素，而戋κ p物、纖維素或纖維素衍生物與酵素總共量實例中構成100%。生理上可接受的有機聚合物可選自由以下者所組成的 112 200829698 群組：$乙二醇1500、聚乙二醇2〇〇 Γ ^ /mnn ^ G 二醇 3000、聚乙一酉子4000、聚乙二醇6〇〇〇、聚乙二醇一* 二_)、聚乙二醇2_、經丙基甲基纖維素、 …稀勉丙稀之共聚物與該等有機之知⑼係g的生理上可接受的有機聚合物。纖維素或纖維素衍生物可（例如）係維素醋酸醋、纖維素脂肪酸，、纖維、、::：醚纖 ( Γ基纖維素、乙基纖維素、經乙基纖維素、：=唯

^甲基纖較、甲基乙基纖維素與甲“WP 广、准素（尤其微晶纖維素）係、物。厂截、，隹素或纖維素衍生 :得：丸可使用適合的腸塗層、其他的非功能性塗層塗層或热如此塗層直接使用。此外，所得藥丸可充入適合大小的膠囊中（例如硬明勝勝囊或無明膠膠囊）以用於失調症或疾病之治療法’如於以上所更詳細敛述的。在一個本發明之具體態樣中’自不同的酵素種類（尤其是自脂肪酶、蛋白酶及/或澱粉酶）製造的藥丸可被充入該膠囊中。當以不同的酵素種類填充膠囊時，單一酵素種類（即脂肪酶、蛋白酶或殿粉酶）的劑量可根據某些適應症群或某些患者次群之特冑需要而㈣，其係藉由將脂肪酶、蛋白酶及或;’、又知酶之任何者之所指明量加入膠囊，即可製造其等月曰肪酶·蛋白酶··澱粉酶之比率會變化的膠囊。車乂 ^的本發明之脂肪酶之醫藥組成物係於W〇 2005/0923 70敘述’尤其是包含其中所提及的較佳用藥的調 113 200829698 配物。在—個特佳的具《射，醫藥組錢包含單·、雙-與三-醯f甘油酯與脂肪族C6-C22羧基酸之聚乙二醇 (PEG)單-與雙，之macr〇g〇】甘油醋混合物、以及也可能包含小部分之甘油與自由聚乙二醇。在macrogoI甘油醋混合物中所含的聚乙二醇（咖）較佳係具有平均6個至至多4〇個環氧乙燒單元每分子或介於200與2000之分子量的pEG。本I月之固進一步方面供了本發明之酵素之醫藥組成物以包含由介面活性劑、共介面活性劑與親脂性相所組成的系統，而該系統具有大於或等於1〇的lvb (Hydr〇philic_Lipophilic叫咖，親水性_親月旨性平衡）值以及大於或等於30〇C 、炫：愛上。j 士 ^ ^ ^在一個較佳的具體態樣中， n统具有1〇至16的LVB值、較佳地為12至Η，且呈有介於3G與的溶點，較佳地為介於40 i着c。^ 其’特徵為LVB值與溶點之該系統係單_、雙-與三醯基甘油醋和聚乙二醇（PEG)與具有8個至2〇個（較佳為“固 =18幻碳原子的脂肪族竣酸之單-與二酉旨之混合物，藉此乙二醇較佳地具有約6個工 ^ U芏、、0 32個1衣虱乙烷單元每分 ’且該系統視需要含有自由甘油及/或自由聚乙二醇。如 ":統之LVB值較佳地係藉由咖之鏈長調節。如此系統之熔點係藉由脂肪酸之鏈長、 ’、、 ^ m 硬我PEG之鏈長與脂肪酸鏈（且此用於製備maCr〇g〇1甘油酉旨混合物的起度調節。田）您铯和耘「脂肪族C8-⑴緩酸」係指其中含有顯著且多變比率 114 200829698 的羊羶酸（C8 )、羊脂酸（c i 〇 )、月桂酸（c j 2 )、肉笪蔻酸（C14)、棕櫚酸（C16)與硬脂酸（C18)(若此等酸為飽和的）、與相對應不飽和C8_C18羧酸的混合物。此等脂肪酸之比率可根據起始油變化。如此單_、雙-與三醯基甘油酯和聚乙二醇（pEG)與具有8個至丨8個碳原子的脂肪族羧酸之單-與二酯的混合物可 (例如）藉由具有介於200與1500的分子量的聚乙二醇與起始油間的反應而獲得，該起始油係由與脂肪酸（其係選自含有羊羶酸、羊脂酸、月桂酸、肉苴蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸油酸與亞麻油酸（個別地或呈混合物）的群組）混合的三甘油酯所組成。視需要地’如此反應之產物亦可含有小比率的甘油與自由聚乙二醇。如此混合物係商業上可購得的，例如以商品名Ge_ lucire®購得。一個本發明之有益的具體態樣提供了商品名 %為 GelUCire®(尤其是「Gelucire⑧ 5〇/13」及/或「，GeluciR⑧ 4/1 4」）的產σ口代表用於根據本發明中的藥學製劑的適合的混合物。

Gelucire⑧50/13係具有單_、雙_與三醯基甘油酯以及聚乙二醇（其具有分別地構成所結合脂肪酸之主要比率的40% 至50%與48%至58%的棕櫚酸（C16)與硬脂酸（C18)) 之單•與二酯的混合物。在每個實例中羊羶酸（c8 )與羊脂酉欠（C 1 0 )之比率係小於3%，且在每個實例中月桂酸（c 1 2 ) 與肉菫蔻酸（C 14 )之比率係小於5%。

Gelucire⑧44/14係單-、雙與三醯基甘油酯以及聚乙二 115 200829698 酉子之早-與二酯的混合物，而個別的比率如下：棕櫚酸（ο” 為4至25%、硬脂酸（C18)為5至⑽、羊擅酸（c8)為小於15%、羊脂酸（cl〇)為小於12%、月桂酸（ci2)為至50%而肉丑宼酸（C14)為5至25%。卜⑽44/14 可：如藉由使用椋櫚仁油與聚乙二醇15〇〇的醇咖而製備。、車乂仏的本^明之具體怨樣提供本發明之酵素之醫藥組、八匕3 3有單—、雙與二醯基-甘油酯以及脂肪族C8-C18魏酸之聚乙二醇單-與 .^ 軸且也可能包含小比率的甘油由聚乙二醇之混合物的系統’該系統具有介於㈣與 55 C的熔點與在介於12與15的範圍的lvb值。更佳的，該糸統具有介於44°c與5G°C的炼點與在從U - 14的範圍的LVB值。供選擇地，該系 ϋ具有大約4代的熔點與14 的LVB值，或該系統具有大約 l的熔點與13的LVB值。治瘵方法_ 用於根據本發明使用的脂肪_(視需要結合蛋白酶、及/或澱粉酶（本發明之酵素）） ^ X^ 係有用於治療性（及/或預防性）/口療在動物中各種各樣 ^ ^ ^ ^ 疾病或失调症。術語「動物」已括所有動物、且尤其是私你、作c如貝動物之實例為非反芻動物舁反籍動物，例如綿羊、f 、，你1生— 山平、與牛，例如肉牛、興礼牛。在一個特殊的具體態樣中，北応叙#A仏—L 動物為非反羁動物0 非反舞動物包括單胃動物，例

乳豬、生長中的豬、與母豬）豬(但不限W 魏C句人r加、豕禽’例如火雞、鴨、與崔隹C包含（但不限於）肉雞、蛋雞）；年輕小牛；寵物’ 116 200829698 例如貓和狗；盘备（七人 *、…… 含（但不限於）鞋魚、鱒魚、吳郭 …、…^…、鯉魚）；以及甲殼綱動物（包含（作不限於）二在一個特殊的具體態樣中動物為哺乳動物’ 例：，酵素係有用於治療消化性失調症，例如消化不心㈣⑽仙或dyspepsia)，其等往往導因於正常自胃、 =騰臟分泌的消化性酵素製造不足及/或分泌至胃腸道不足° ^卜’酵素係特別有用於治療pEI。m可使用B。喂㈣① 二 J ⑽⑽8 (線上）2002; 3 (5) : 116_125) I:貫’且其可導因於例如以下者的疾病與病況"夷臟癌、及/或胃手術，例如騰臟之總體或部分切除術、胃切除術、胃腸繞道手術後（例如則r〇thII胃腸造口術）；慢性胰臟炎；Shwaehman鑽石症候群（shwaeh_ ;胰臟或總膽管之管阻塞（例如自瘤）；及/或囊腫性纖維化（_籀；眚楂 ★咏種^傳疾病，其中一層厚厚的黏液阻塞胰臟吕）帛素亦可係有用於治療急性姨臟炎。酵素對消化性失調症之功效可如於Ep_〇868中所一 ^敛述地測量，於其中實施们敘述用於在胃的條件下測置脂肪酶穩定性的試管内消化力試驗，而實施例3敛述對在膽鹽的存在下脂肪酶活性的試管内消化力試驗。可為蛋白酶/、歲畚酶设立相對應試驗。w〇也揭示適合

Kfe，例如⑴肖於於豬試驗飼难斗中測量脂質消化的試吕内4驗’與（2 )使用胰臟分泌不足的豬活體内試驗，其 117 200829698 中脂肪、蛋白質與殿粉之消化力被測量。 /戈第作：二個貫例，酵素係有用於治療第1型糖尿病、及 /或弟II型糖尿病， m 久碉症之楂尸Λ 4 尤其用於在通常伴隨此疾病的消化性失口周症之糖尿病治療法中欲凌中的辅佐治療，以縮小晚期的併酵素對糖尿病之功— 又效可猎由一或多種於WO 00/54799 中所述的方法測定，你| 如例如猎由控制經醣化的血紅素之水平、血液葡萄糖水平、侦^ q * •匍甸糖發作（hypoglycaemic attack )、脂溶性維生素（例如维

— 、1』々、准生素A、D與)之狀態、胰倒素之母日所需劑量、妒會扣垂體重心數、與高血葡萄糖期間。 t文所述與所請求之發明並非限於本文所揭示的特殊 ^體悲^之耗目’因為此等具體態樣係異域意欲作為本發月之才夕方面之說明。任何同等的具體態樣係意欲被納入本發明之範圍内0畫垂u 国門事貝上，除了該等於本文所顯示與敘述 2卜σ種各樣的本發明之修改在參照之前的敘述後對熟 X員技術者會係明顯的。如此修改亦意欲被納入所附申請專利範圍之範圍Μ。在有矛盾的實例中，由本文之揭示 (包含定義）決定。體態樣本發明亦關於脂肪酶，較佳地用作為醫藥品，其中該月曰肪酶（與SEQ ID Ν〇 : 2之胺基酸U69之序列相比）包含申請專利範圍第3_6與項中之任一項的取代，例如取代N33Q、T231R、與N23 3R，以及至少一個選自以下者的附加的取代：

E1*，D，N Q4H，P，R ; D5E ; N8L，Q ; Q9H ; F10L ; 118 200829698 N11C，D，H，L，P，Q，R，S ; G23E ; N26A，H，I ; D27I，N，Q，R，S，V ; P29T ； A30T，V ； T37K，M ； G38A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y; N39H，S; E43K; K46M ; A49T; L5 2I，R; E5 6K，Q，R，S; D5 7G，N; V60E，S; G61R; V63R ; A68V ； L69I ； N71I，S ; N73Q，Y ; I76T ; R84E ; I86F，L ; E87A，H，K，R ; I90L，V ; G91A，C，E，F，K，L，M，N，S，T，V，W，Y ; L93*，F ; N94*，K，Q，R，S ; F95* ; D96*，E，G，N，R，S，W，Y ; L97M，Q; K98I，T; E99D; N101Q; D102E，G，Y; R108M; G109A ; D111A，E，N，S ； G112A ； T114I ； S115L ； W117C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y ; D122E，N ; Q126L ; V128A ; D130H ; H135D ; P136H ; Y138F ; V141E，L ; A15 0V ; V154F，I，L ; A155V ; G156R ; G161A，E ; N162G，S，T ; G163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y ； D167E ； V168M ; V176A，D，F，G，H，I，K，M5N，Q，T，W ; G177A ; R179T ; L185M ; G190C，D ; N200Q，S ; R205I ; L206F ; E210D，R，V，Y ; S216P ； E219D ； G225P ； T226N ； L227F,G ； P229R ； E239D ； G240L ； D242E ； T244S ； G246A ； Q249R ； N251Q，S ； D254A，G，I，K，L，M，N，R，Q，S，Y ； 1255 A，F ； P256A，F，G，H，I，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y;與 L269F，H;該脂肪酶進一步： (a)與SEQ ID NO ·· 2之胺基酸1至269之序列具有至少50%的相同性； (b )係由在非常低度（較佳地為低度、中度、中度-高度、高度、或最佳地為非常高度）嚴格條件下與以下者雜 119 200829698 合的多核苦酸所編碼：⑴us專利第5,869,438號之卿⑴ 之全長互 NO: k編碼㈣，其以引时式納人本文中（編碼本文 ID NO · 2之脂肪酶的DNA序列）、或（^ )(; 補股；及/或 (例如，數個）、刪除、及/或插 (c)為一變體，其另外包含一或多個 SEQ ID NO : 1之成熟多肽之胺基酸之取代入，較佳地為保守性天性。

非常低度至非常高度嚴袼條件係定義為於5χ SMB、〇·3% SDS、2〇〇微g/ml經剪斷且經變性的鮭魚精子d财中在42。〇，以及對於非常低度與低度嚴格度為乃。/。甲醛、對於中度與中度·高度嚴格度| 35%甲駿、對於高度與非常高度嚴格度為且50%甲醛，最理想地按照標準南方墨= (Southern blotting )程序共12至24小時的預雜合與雜:二將載運物質最終清洗三次每次共15分鐘，其使用2χΜ〔、〇·2% SDS，較佳地係於45cC (非常低度嚴格度）、更佳地於5 0°C (低度嚴格度）、更佳地於55cC (中度嚴格度）、更佳地於60〇C (中度-高度嚴格度）、甚至更佳地於&65乂 (高度嚴格度）、且最佳地於7〇〇c (非常高度嚴格度）。保守性本質之胺基酸改變不會明顯地影響蛋白質之折疊及/或活性，且包括小型刪除，典型地為一個至約3〇個胺基fee，小型胺基-或繞基_端延伸，例如胺端曱硫胺酸殘基；至多達約20個-25個殘基的小型連接子肽；或藉由改變靜電荷或另一種功能（例如聚-組胺酸束、抗原性抗原決定基或結合功能域）而促進純化的小型延伸。 120 200829698 本發明進一步關於親本脂肪酶之變體，較佳地用作為醫藥品，而該變體包含位於一或多個位置之改變，該位置對應至一或多個在親本酵素中的位置，其中： (a )改變獨立地為 (1 )该位置之立即下游的胺基酸之插入， (ii) 佔據該位置之胺基酸之刪除，及/或 (iii) 佔據該位置之胺基酸之取代； (b) 該改變係選自申請專利範圍第3_6與14_16項中任一項的改變； (b )該變體具有脂肪酶活性；且 (c) 每個位置對應至具有SEQ 1〇 N〇: 2之胺基酸序列的酵素之胺基酸序列的一個位置。在一個特殊的具體態樣中，變體（及/或親本）與SEQ ID NO · 2之胺基酸1至269之序列具有至少5〇%的相同性。在憂體中改變之總數較佳地為二十一個、二十個、十九個、十八個、十七個、或十六個。更佳地改變之總數為十五個，甚至更佳地為十四個、甚至更佳地為十三個、甚至更佳地為十二個、甚至更佳地為十一個、甚至更佳地為十個、甚至更佳地為九個、甚至更佳地為八個、甚至更佳地為七個、甚至更佳地為六個、甚至更佳地為五個、甚至更佳地為四個、甚至更佳地為三個、甚至更佳地為兩個、且最佳地為一個。變體可藉由重排（shuffling ) —或多個編碼一或多種同源的親本脂肪酶的聚核苷酸而製造。術語「重排」意指介 121 200829698 於兩個或更多個同源的核苷酸序列間的核苷酸序列之重 * 組，其造成所重組的核苷酸序列（即，具有已接受到重排循環的核苷酸序列）相較於起始核苷酸序列具有一些核普酸被交換。以下的SEQ ID NO : 2之脂肪酶之變體係申請專利範圍第6與1 6項中的脂肪酶之實例： LVA012= D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T ； LVA013 ( LVA023 N33Q+E210D+T231R+N233R ； LVA041 N33Q+D111A+T231R+N233R ； LVA043 N33Q+G91T+T231R+N233R ; LVA055 N33Q+E219D+T231R+N233R ； LVA060 N33Q+W117L+T231R+N233R ； LVA061 D27Q+N33Q+T231R+N233R ; LVA063 N33Q+G91T+T231R+N233R ；

LVA089 D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R ( +P256T ; LVA094 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T ；

LVA099 D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R +P256T ； LVA103 Q4R+N33Q+T231R+N233R ； LVA113 N33Q+T231R+N233R+Q249R ； LVA120 N33Q+D96W+T231R+N233R ； LVA129 D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R ； 122 200829698 LVA130 D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R ； LVA139 Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R ； LVA140 N33Q+D111E+T231R+N233R ； LVA143 N33Q+D122E+T231R+N233R ； LVA147 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256丁； LVA162 N33Q+D167E+T231R+N233R ； LVA179 N33Q+G91N+T231R+N233R ； LVA180 N33Q+T231R+N233R+P256T ； LVA182 D27R+N33Q+G91 A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+ N233R+P256T ； LVA185 N11R+N33Q+T231R+N233R ； LVA198 N33Q+N39H+T231R+N233R ； LVA202 N33Q+P229R+T231R+N233R ； LVA206 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+ T231R+N233R+256T ； / V LVA208 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R ； LVA210 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R+256T ； LVA211 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+ N233R+P256T ； LVA214 N33Q+E87A+T231R+N233R ； LVA216 N33Q+E56Q+T231R+N233R ； LVA217 N33Q+E210V+T231R+N233R ； 123 200829698 LVA218 N33Q+E56K+T231R+N233R ； LVA220 N33Q+T231R+N233R+D254G ； LVA221 N33Q+D96S+T231R+N233R ； LVA222 N33Q+D122N+T231R+N233R ； LVA228 N26A+N33Q+T231R+N233R ； LVA229 N33Q+N162T+T231R+N233R ； LVA230 N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R ； LVA231 N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R ；、 LVA234 N33Q+T231R+N233R+G240L ； LVA238 D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+ P256T ； LVA241 D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T ； LVA243 N33Q+N200S+T231R+N233R ； LVA245 N33Q+N39S+T231R+N233R ； LVA247 N33Q+E210R+T231R+N233R ； LVA248 N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R ；、 LVA249 N33Q+T231R+N233R+D254R ； LVA250 N33Q+N94R+T231R+N233R ； LVA252 N33Q+D96R+T231R+N233R ； LVA254 D27N+N33Q+T231R+N233R ； LVA256 D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R ； LVA257 N33Q+L227F+T231R+N233R ； LVA272 N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R ； LVA273 N33Q+G225P+T231R+N233R ； 124 200829698 LVA275 N33Q+T231R+N233R+D254S ； LVA277 N33Q+D96G+T231R+N233R ； LVA279 N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S ； LVA280 N33Q+T231R+N233R+D254G ； LVA281 N33Q+D130H+T231R+N233R ； LVA284 N33Q+E87A+T231R+N233R ； LVA287 N33Q+T231R+N233R+E239D ； LVA307 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G ；、 LVA308 N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； LVA310 N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； LVA315 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G ； LVA317 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； LVA319 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； LVA325 Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+256T ； LVA327 / N33Q+G91T+N94S+D111 A+Vl76I+T231R+N233R ； K LVA330 Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G +T231R+N233R+P256T ； LVA331 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+256T ； LVA333 N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T ； LVA334 N33Q+G177A+T231R+N233R ； LVA338 N33Q+T231R+N233R+G246A ； LVA341 D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； 125 200829698 LVA345 D27Q+N33Q+G91 T+Gl63K+E219D+T231R+N233R ； LVA347 N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R ； LVA349 K98I+T231R+N233R+N251S ； LVA353 N33Q+G163R+T231R+N233R ； LVA355 N33Q+G163N+T231R+N233R ； LVA357 N33Q+G163C+T231R+N233R ； LVA359 N33Q+G163Q+T231R+N233R ； LVA360 ’ 二LVA415 N33Q+G163E+T231R+N233R ； LVA362 N33Q+G163H+T231R+N233R ； LVA364 N33Q+G163I+T231R+N233R ; LVA368 N33Q+G163P+T231R+N233R ； LVA370 N33Q+G163D+T231R+N233R ； LVA371 N33Q+G91K+T231R+N233R ； LVA373 N33Q+G91M+T231R+N233R ； LVA375 N33Q+G91F+T231R+N233R ； v LVA379 N33Q+G91S+T231R+N233R ； LVA381 N33Q+G91W+T231R+N233R ； LVA383 N33Q+G91Y+T231R+N233R ； LVA387 N33Q+G163T+T231R+N233R ； LVA389 N33Q+G163W+T231R+N233R ； LVA391 N33Q+G163Y+T231R+N233R ； LVA393 N33Q+G163V+T231R+N233R ； LVA399 N33Q+G91C+T231R+N233R ； 126 200829698 LVA411 N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R ； LVA412 N33Q+G91M+G161E+T231R+N233R ； LVA413 N33Q+V128A+T231R+N233R ； =LVA414 LVA416 N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R ； LVA417 N33Q+G38A+T231R+N233R ； LVA420 N33Q+G163A+T231R+N233R ; LVA421 N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R ； LVA437 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R ； LVA438 N33Q+G163M+T231R+N233R ； LVA440 N33Q+G91V+T231R+N233R ; LVA442 N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R ; LVA444 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S ； LVA449 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ D254S+P256T ； LVA450 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ D254G+P256T ； LVA451 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S ； LVA453 N33Q+G91T+N94R+D111 A+Wl 17L+T231R+N233R ； LVA454 N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S ; LVA456 N33Q+T231R+N233R+P256T ； LVA458 N33Q+T231R+N233R+D242E ； LVA460 N33Q+E87R+T231R+N233R ; LVA461 N33Q+E56R+T231R+N233R ； 127 200829698 LVA463 N33Q+N162G+T231R+N233R ； LVA464 N33Q+G91L+T231R+N233R ； LVA468 N33Q+E87H+T231R+N233R ； LVA470 N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R ； LVA471 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S ； LVA472 N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S ； LVA473 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ D254S+P256T ； LVA474 N33Q+G163A+T231R+N233R ； LVA480 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+ P256T ； LVA482 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R ； LVA483 N33Q+T231R+N233R+D254A ； LVA484 N33Q+T231R+N233R+D254N ； LVA486 N33Q+T231R+N233R+D254Q ； LVA488 N33Q+T231R+N233R+D254I ； v LVA490 N33Q+T231R+N233R+D254L ； LVA492 N33Q+T231R+N233R+D254K ； LVA494 N33Q+T231R+N233R+D254M ； LVA503 N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R ； LVA505 D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R ； LVA506 N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R ； LVA507 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R ； LVA509 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R ； 128 200829698 LVA512 LVA513 LVA516 LVA518 LVA519 LVA520 LVA523 LVA526 LVA527 LVA530 LVA532 LVA535 LVA540 LVA542 LVA547 LVA548 N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R+256T ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+ L227G+T231R+233R+P256T ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+ L227G+T231R+233R+D254S+P256T ； D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+256T ； 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； 142 200829698 LVAR0108 LVAR204 LVAR205 LVAR207 LVAR208 LVAR209 LVAR214 LVAR215 LVAR216 LVAR218 LVAR219 LVAR220 LVAR223 N33Q+N94K+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+ L227G+T231R+233R+P256T ； D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+ L227G+T231R+233R+P256T ； D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+256T ； D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G +T231R+233R+P256T ； D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V168M +E21OD+216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P +L227G+231R+N233R+P256T ； Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G +T231R+233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231 R+N233R+256T ； D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227 G+T231R+233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R+256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+ L227G+T231R+233R+P256T+L269H ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+ 143 200829698 LVAR225 LVAR226 LVAR230 LVAR231 LVAR234 LVAR235 LVAR277 LVAR280 LVAR281 LVAR282 LVAR283 LVAR284 LVAR285 L227G+T231R+233R+P256T ；

D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E +S216P+227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 141 +S216P+227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+ S216P+L227G+231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+ S216P+L227G+231R+N233R+P256T ； N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+ S216P+L227G+231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R +N233R+D254K+256A ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+ N233R ； N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+ P256A ； D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R ； D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+ P256T ； N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R ； 144 200829698 LVAR286 N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R ； LVAR287 N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+ P256T ； LVAR288 D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R +N233R+256T ； LVAR290 N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A ； LVAR828: N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+ LVA828 Q249R ； i LVAR861 G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E +S216P+227G+T231R+N233R+P256T ； LVAR863 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 141 +S216P+227G+T231R+N233R+P256T ； LVAR955 N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S ； LVAR956 N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L ； LVA957 N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L ； LVAR1042 G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E •C +S216P+227G+T231R+N233R+P256T ;與 LVAR1043 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 141 +S216P+227G+T231R+N233R+P256T。以下者為本發明之額外的特殊具體態樣（SEQ ID NO : 1之脂肪酶係SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269之脂肪酶之變體(T231R+N233R)): 1. 一種用作為醫藥品的脂肪酶，其中該脂肪酶係一親本脂肪酶之變體，該變體（a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸 145 200829698 1至269具有至少50%的相同性；且（b )具有脂肪酶活性；且（c )包含至少一個選自以下者的取代取代·· N26I、D27Q、 D27R、D27Y、P29T、A30T、A30V、T32I、N33Q、N33T、 N33Y、P42L、E43D、E43K、E43M、E43V、A49T、E56A、 E56C、E56K、E56R、E56S、D57A、D57G、D57N、V60L、 L69I、E87K、G91A、G91E、G91N、G91R、G91S、G91T、 G91V、G91 W、L93F、N94K、N94R、N94S、D96E、D96G、 D96L、D96N、D96S、D96V、D96W、D96Y、L97M、L97Q、 K98I、E99D、E99K、E99P、E99S、E99T、D111A、D111S、 T114I、L147S、G163K、E210D、S216P、L227G、T231R、 N233R、D234K、E239V、Q249R、N251S、D254N、P256T、 G263Q、L264A、I265T、G266D、T267A、與 L269N，其中每個位置對應至SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269之一個位置；且（d)其前提為該變體並非（i)具有SEQ ID NO: 1 之胺基酸1-2 69的脂肪酶，且非（ii) ( i)之脂肪酶之變體 N33Q。 2. —種用作為醫藥品的脂肪酶，其中該脂肪酶係一親本脂肪酶之變體，該變體（a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸 1至269具有至少50%的相同性；且（b )具有脂肪酶活性；且（c)包含取代T231R與N233R而且包含至少一個選自以下取代的取代：N26I、D27Q、D27R、D27Y、P29T、A30T、 A30V、T32I、N33Q、N33T、N33Y、P42L、E43D、E43K、 E43M、E43V、A49T、E56A、E56C、E56K、E56R、E56S、 D57A、D57G、D57N、V60L、L69I、E87K、G91A、G91E、 146 200829698 G91N、G91R、G91S、G91T、G91V、G91W、L93F、N94K、 N94R、N94S、D96E、D96G、D96L、D96N、D96S、D96V、 D96W、D96Y、L97M、L97Q、K98I、E99D、E99K、E99P、 E99S、E99T、D111A、D111S、T114I、L147S、G163K、E210D、 S216P、L227G、D234K、E239V、Q249R、N251S、D254N、 P2 5 6T、G263Q、L264A、I265T、G266D、T267A、與 L269N，其中每個位置對應至SEQ ID N〇 : 2之胺基酸1至269之一個位置；且（d)其前提為該脂肪酶並非SEQ ID NO : 1之胺基酸1-269之變體N33Q。 3 · —種用作為醫藥品的脂肪酶，其中該脂肪酶係一親本脂肪酶之變體，該變體（a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸 1至269具有至少50%的相同性；且（b )具有脂肪酶活性；且（c)在位置30、42、114、及/或163之至少一者中包含至少一個取代，其中每個位置對應至SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269之一個位置。 4. 一種用作為醫藥品的脂肪酶，其中該脂肪酶係一親本脂肪酶之變體，該變體（a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸 1至269具有至少50%的相同性；且（b )具有脂肪酶活性；且（c )包含至少一個選自以下取代的取代·· A30T、A30V、 P42L、ΤΙ 141、與G163K，其中每個位置對應至SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269之位置。 5. —種用作為醫藥品的脂肪酶，其中該脂肪酶係一親本脂肪酶之變體，該變體（a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸 1至269具有至少50%的相同性；且（b )具有脂肪酶活性； 147 200829698 且（c)係選 LVA012 ： LVA023 ： LVA041 ： LVA043 : LVA049 ： LVA061 ： LVA099 ·· LVA349 ： LV1232 ： LV1330 ： LV1855 ： LV1857 ： LV1865 ： LV1874 ： LV1889 ： LVAR0002b LVAR0003 ： LVAROOlla LVAR0013 ： LVAR0014 自以下的變體： D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ P256T、 N33Q+E210D+T231R+N233R、 N33Q+D111A+T231R+N233R、 N33Q+G91T+T231R+N233R、 N33Q+G163K+T231R+N233R、 D27Q+N33Q+T231R+N233R、 D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T、 K98I+T231R+N233R+N251S、 G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A +L269N、 N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R、 D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T、 D27R+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T、 D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T > D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T、 D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T > T32I+G91V+T231R+N233R、 K98I+T231R+N233R、 G91A+T231R+N233R、 G91V+T231R+N233R、 N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R、 148 200829698 LVAR0015 LVAR0016 LVAR0017 LVAR0032 ： LVAR0045 ： LVAR0046 ： LVAR0047 ： LVAR0048 ' LVAR0050 ： LVAR0051 ： LVAR0052 ： LVAR0053 ： LVAR0054 ： LVAR0055 LVAR0056 ： LVAR0057 ： ( LVAR0058 ： LVAR0059 LVAR0061 ： LVAR0062 ： LVAR0063 ： LVAR0064 ： LVAR0065 ： LVAR0066 P42L+D57N+G91E+T231R+N233R、 K98I+T231R+N233R、 V60L+G91V+T231R+N233R、 D57G+L93F+T231R+N233R、 A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R > E99T+T114I+D254N+T231R+N233R、 D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R > E43K+E56S+E87K+T231R+N233R、 E56S++E87K+D96L+E99D+T231R+N233R、 E56A+D57A+T114I+T231R+N233R ^ G91E+T231R+N233R、 E56K+D96G+D111A+T231R+N233R > E87K+D111S+T231R+N233R、 E43V+G91R+T231R+N233R、 E56S+E87K+T231R+N233R、 E87K+G91E+T231R+N233R、 D27Y+E87K+T231R+N233R、 E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R、 E56K+E87K+D111A+T231R+N233R、 ' E87K+E99P+T231R+N233R、 E87K+D96L+E99P+T231R+N233R、 E56C+E87K+T231R+N233R > E56R+E87K+D96L+T231R+N233R、 E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R、 149 200829698 LVAR0067 ： E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R、 LVAR0068 E87K+L147S+T231R+N233R、 LVAR0069 ： D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R、 LVAR0070 E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R LVAR0071 E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R、 LVAR0072 ： D96V+D111A+T231R+N233R、 LVAR0074 ： N33Q+E87K+T231R+N233R、 LVAR0076 ： N33Q+N94K+T231R+N233R、 ( LVAR0077 ： N33Q+D96Y+T231R+N233R、 LVAR0078 ： N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R、 LVAR0079 ： N33Q+K98I+T231R+N233R > LVAR0080 ： A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R > LVAR0086 ： N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R、 LVAR0088 ： N26I+N33Q+T231R+N233R、 LVAR0091 ： A30T+N33Q+T231R+N233R、 LVAR0094 ： N33Q+G91V+T231R+N233R、 l LVAR0095 ： N33Q+G91A+T231R+N233R、 LVAR0096 ： N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R、 LVAR0099 ： N33Q+K98I+T231R+N233R、 LVAR0101 ： N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R > LVAR0102 ： P29T+N33Q+T231R+N233R、 LVAR0103 ： N33Q+G91V+T231R+N233R、 LVAR0104 ： N33Q+K98I+T231R+N233R、 LVAR0106 ： N33Q+G91E+T231R+N233R、與 150 200829698 LVAR0108 ： N33Q+N94K+T231R+N233R、其中每個位置對應至SEQ ID NO ·· 2之胺基酸1至269 之一個位置。 6.為親本脂肪酶之變體的脂肪酶，該變體（a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269具有至少50%的相同性；且（b) 具有脂肪酶活性；且（c)在位置30、42、114、及/或163 之任一者中包含至少一個取代，其中每個位置對應至SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269之一個位置。 7·為親本脂肪酶之變體的脂肪酶，該變體（a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269具有至少50%的相同性；且（b) 具有脂肪酶活性；且（c )包含至少一個以下的取代：D27Y、 P29T、A30T、A30V、T32I、N33T、N33Y、P42L、D57A、 D5 7N、G91V、T114I、G163K、N251S，其中每個位置對應至SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269之一個位置。 8.為親本脂肪酶之變體的脂肪酶，該變體（a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269具有至少50%的相同性；且（b) 具有脂肪酶活性；且（C )係選自以下的變體： LVA012 ： D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+ P256T、 LVA023 ： N33Q+E210D+T231R+N233R、 LVA041 ： N33Q+D111A+T231R+N233R、 LVA043 ： N33Q+G91T+T231R+N233R、 LVA049 ： N33Q+G163K+T231R+N233R、 LVA061 ： D27Q+N33Q+T231R+N233R、 151 200829698 LVA099 ： D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T、 LVA349 ： K98I+T231R+N233R+N251S、 LV1232 ： G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A +L269N、 LV1330 ： N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R、 LV1855 ： D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T、 LV1857 ： D27R+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T > LV1865 ： D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T、 LV1874 ： D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T、 LV1889 ·· D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T、 LVAR0002b T32I+G91V+T231R+N233R、 LVAR0003 ： K98I+T231R+N233R、 LVAROOlla G91A+T231R+N233R、 LVAR0013 ： G91V+T231R+N233R、 LVAR0014 N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R、 LVAR0015 P42L+D57N+G91E+T231R+N233R、 LVAR0016 K98I+T231R+N233R、 LVAR0017 V60L+G91V+T231R+N233R、 LVAR0032 ： D57G+L93F+T231R+N233R、 LVAR0045 ： A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R、 LVAR0046 ： E99T+T114I+D254N+T231R+N233R > LVAR0047 ： D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R、 LVAR0048 E43K+E56S+E87K+T231R+N233R > 152 200829698

LVAR0050 ： LVAR0051 ： LVAR0052 ： LVAR0053 ： LVAR0054 ： LVAR0055 LVAR0056 : LVAR0057 : LVAR0058 ： LVAR0059 LVAR0061 ： LVAR0062 ： LVAR0063 ： LVAR0064 ： LVAR0065 ： LVAR0066 LVAR0067 ： LVAR0068 LVAR0069 ： LVAR0070 LVAR0071 LVAR0072 ： LVAR0074 ： LVAR0076 : E56S++E87K+D96L+E99D+T231R+N233R、 E56A+D57A+T114I+T231R+N233R、 G91E+T231R+N233R、 E56K+D96G+D111A+T231R+N233R、 E87K+D111S+T231R+N233R、 E43V+G91R+T231R+N233R、 E56S+E87K+T231R+N233R、 E87K+G91E+T231R+N233R、 D27Y+E87K+T231R+N233R、 E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R、 E56K+E87K+D111A+T231R+N233R、 E87K+E99P+T231R+N233R、 E87K+D96L+E99P+T231R+N233R、 E56C+E87K+T231R+N233R、 E56R+E87K+D96L+T231R+N233R > E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R、 E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R > E87K+L147S+T231R+N233R、 D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R、 E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R > E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R、 D96V+D111A+T231R+N233R、 N33Q+E87K+T231R+N233R、 N33Q+N94K+T231R+N233R、 153 200829698 LVAR0077 ： N33Q+D96Y+T231R+N233R、 LVAR0078 ： N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R > LVAR0079 ： N33Q+K98I+T231R+N233R、 LVAR0080 ： A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R > LVAR0086 ： N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R、 LVAR0088 ： N26I+N33Q+T231R+N233R > LVAR0091 ： A30T+N33Q+T231R+N233R > LVAR0094 ： N33Q+G91V+T231R+N233R、 LVAR0095 ： N33Q+G91A+T231R+N233R、 LVAR0096 ： N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R、 LVAR0099 ： N33Q+K98I+T231R+N233R > LVAR0101 ： N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R > LVAR0102 ： P29T+N33Q+T231R+N233R、 LVAR0103 ： N33Q+G91V+T231R+N233R、 LVAR0104 ： N33Q+K98I+T231R+N233R、 LVAR0106 ： N33Q+G91E+T231R+N233R、與 LVAR0108 ： N33Q+N94K+T231R+N233R、其中每個位置對應至SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269 之位置。 9.具體態樣1-8之任一者之脂肪酶，其結合蛋白酶或澱粉酶，以用作為醫藥品。 10·具體態樣1-8之任一者之脂肪酶，其結合蛋白酶與澱粉酶，以用作為醫藥品。 1 1.根據具體態樣9或10的結合蛋白酶及/或澱粉酶的 154 200829698 脂肪酶’其中（1 )該蛋白酶與選自由以下者所組成的群組的蛋白酶具有至少70%的相同性：a)具有SEQ ID NO : 3 之胺基酸1-274的蛋白酶、b)具有SEq id NO : 4之胺基酸1-188的蛋白酶、與〇具有SEq m NO : 5之胺基酸l 188的蛋白酶；（ϋ )該澱粉酶與選自由以下者所組成的群組的澱粉酶具有至少70%的相同性·· a)具有SEQ m N0 : ό之胺基酸1_481的澱粉酶、b)具有SEQ ID NO : 7的胺基酸1-481的殿粉酶、與〇)具有SEq m NO : 8之胺基酸 4 8 3的殿粉酶。 12·具體態樣丨_8之任一者中所定義的脂肪酶或脂肪酶之混合物之用途，其係用於製造用於治療消化性失調症、胰臟外分泌不足、胰臟炎、囊腫性纖維化、第〗型糖尿病、及/或弟II型糖尿病的醫藥品。 13·具體態樣12之用途，進一步包含使用蛋白酶或澱粉酶。

14. 粉酶。具體態樣 12之用途’進一步包含使用蛋白酶與澱及/或殿 15.具體態樣13或14之用途，其中該蛋白酶粉酶係如於具體態樣11中所定義。 16.如具體態樣1-8之任一者中所定義的脂肪酶，盆用於治療消化性失調症、胰臟外分泌不足、胰臟炎、囊腫性纖維化、第I型糖尿病、及/或第„型糖尿病。 17. 18. 具體態樣16之脂肪酶，具體態樣16之脂肪酶，其結合蛋白酶或澱粉酶· 其結合蛋白酶與澱粉酶。 155 200829698 19. 具體態樣η或18之脂肪酶 ▲ 澱粉酶係如具體態樣1丨中所定義。 /、中5亥蛋白酶及/或 20. -種醫藥組成物，其包含如具體所定義的脂肪酶或脂肪酶之混合物，加二：之：：者可接受的輔助性物質。 ^'種w藥上 21. 具體態m 2〇《組成物，其粉酶。 ^包合蛋白酶或澱

粉酶 22.具體態樣2〇之組成物，其進一步包含蛋白酶與殿 23·具體怨樣21或22之組成物，其中該蛋白酶及/或殿粉酶係如具體態樣1 1所定義。 24· —種用於治療消化性失調症、胰臟外分泌不足、胰臟炎、囊腫性纖維化、第〗型糖尿病、及/或第„型糖尿病的方法’其係藉由投藥治療有效量的如具體態樣1 - 8之任一者所定義的脂肪酶或脂肪酶之混合物。

25·具體態樣24之方法，其進一步包含投藥治療有效量的蛋白酶或澱粉酶。 26. 具體態樣24之方法，進一步包含投藥治療有效量的蛋白酶與殿粉酶。 27. 具體態樣25或26之方法，其中該蛋白酶及/或澱粉酶係如具體態樣11所定義。對於各各本文所引用的文獻，其等之完整揭示係以引用方式併入本文中。 156 200829698 實施例所使用的化學品係至少試劑等級之商業產品。去離子水係來自 Milli-Q系統（QPAKl，Millipore，目錄編號 CPMQ004R1 )。實施例1 :酵素分析對於豬胰酶之脂肪酶、蛋白酶與澱粉酶活性的分析已由 FIP ( Federation Internationale Pharmaceutique)以及歐洲藥典（European Pharmacopoeia )與美國藥典（Uinted States Pharmacopeia)發表。1 FIP-單位=1 ph.Eur·-單位（歐洲樂典）。分析係如於例如以下者所述：F0d6ration Internationale Pharmaceutique, 科學章節··對於藥學酵素之標準化的國際委員會（Scientific Section : International Commission for the standardisation of pharmaceutical enzymes ) . a) 「藥學的酵素(Pharmaceutical Enzymes)」編者：R. Ruyssen 與 A. Lauwers，E. Story Scientia，Ghent， Belgium ( 1978) 、b)歐洲藥典。亦參見Deem ester等人於

Lauwers A，Scharpe S ( eds ):藥學的酵素（Pharmaceutical Enzymes )，New York，Marcel Dekker，1997，p. 343-3 85 〇適當的酵素標準品可自對藥學酵素之國際委員會（International Commission on Pharmaceutical Enzymes ) ， Centre for

Standards，Harelbekestraat 72，B-9000 Ghent 取得0 脂肪酶FIP分析以及其他適合的對於脂肪酶、蛋白酶與澱粉酶的分析係於以下敘述。 157 200829698 脂肪醢FIP公#· 對於測量騰酶之解脂活性，係使用在歐洲藥典Η中所發表的m非另加中明’對於载微生物脂肪酶之解曰！生得、使用Φ FIP戶斤發表之對於米根徽菌（处^㈣ oryzae)脂肪酶的分析。脂肪醢dNP公析叉質：對-硝基-苯基（pNp)戊酸酯分析pH : 7.7

分析溫度：40oC 反應時間：25分鐘呈黃色的經消化產物具有於4〇5nm的吸收之特徵。其 i係藉由分光光度法測定。脂肪酶活性可相對於已知活性的酵素標準品測定。活性可以Lip〇lase單位（LU)表現。一 LU(Lip〇lase單位）係在以上標準條件下每分鐘釋放1 mmol可滴定酪酸的酵素之量。1 KLU = 1000 LU。更細節的分析敘述，AF95/6-GB (脂肪酶/酯酶-對對甘油三丁酸酯受質（LU)的pH-STAT方法）、以及LU標準品係可應要求得自 Novozymes A/S，Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd，丹麥。脂肪酶LU分析在此分析中，0.16M 的甘油三丁酸酯（Merck 1.01958.000 )於 pH 7·00 與 30°C ( +/- 1°C)的脂肪酶催化性降解之後為所釋放酪酸使用0.025 Μ經除氣、無C02氫氧化納（氫氧化鈉titrisol，Merck 9956 )之pH-stat滴定。 158 200829698 滴定劑之消耗係以時間之函數紀錄。受質係以0.6% w/v亞拉伯樹膠乳化劑 :心一〜一水至…二 =，=溶解’加入· ml甘油，將pH調整至45。將90 ml的甘油二丁醅酷盥 .^ t 141〇〗“ 曰與300 ml亞拉伯樹膠乳化劑以及

Silv m广、，質化水混合，並於7000 rPm使用例如 ::議礼L4RT均質化3 y分鐘，並接著調整至pH .。將脂肪酶樣本首先於〇·ιμ甘胺酸緩衝液稀釋’接著於去礦物質化水稀釋，目標為15乂〇Lu/mi的活性水平。將15ml的經乳化受質溶液倒入滴定管。加入u d樣本溶液，並將PH於滴定期間維持在7.0。測量每分鐘力^以維㈣定PH的較紅量。活性計㈣基於滴定曲線之線性範圍之平均斜率。可使用已知活性的標準品作為水平檢查。 # 1 LU (脂肪酶單元）係以上所給分析條件下每分鐘釋放1微莫耳可滴定酪酸的酵素之量。IkLU (千脂肪酶單元）二 1000 LU。可應要求得自 Bagsvaerd，丹更詳細的分析敘述，EB-SM-0〇95.〇2， Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 麥。廬肪酶pH stat公^ 此分析係基於在〇. 6 5 油乳液之脂肪酶催化的釋化劑乳化（175 g撖欖油以 mM膽鹽的存在下脂肪酸自撖欖放。受質係以亞拉伯樹膠作為乳 630 ml亞拉伯樹膠溶液（ 474·6§ 159 200829698 亞拉伯樹膠、64 g氯化鈣，於4000 ml水）在攪拌器申乳化 1 5分4里，在冷部至室溫後，將pH使用4 M NaOH調整至pH 6.8 - 7.0)。對於測疋’於反應管中混合19 ml的乳液與1 〇 mi膽鹽溶液（將492 mg膽鹽溶解於水中並加水至5〇〇 mi)並加熱至36.9。C至37.5。〇藉由加入ι·〇 mi的酵素溶液開始反應。藉由加入0·1 Μ氫氧化鈉於pH 7 〇自動地滴定所釋放的酸總共5分鐘。自介於丨“與分鐘間的滴定曲線之斜率計算活性。對於校準，於三種不同的活性水平測量標準。蛋白酶Suc-AAPF-pNA分析受質·· Suc-AAPF-pNA ( Sigma S-7388 ) · 分析緩衝液·· lOOmM琥轴酸、i〇0mM HEPES ( Sigma

H-3375 )、100mMCHES (Sigma C-2885 )、l〇0mMCABS (Sigma C-5580 )、ImM CaCl2、150mM KC1、〇·〇”/〇 Triton-X 1 00 (—種具有以下分子式的非離子性介面活性劑： CMH22〇 ( c^o) n，其中每分子的環氧乙烷單位之平均數

目係大約 9 或 10，CAS # : 9002-93-1 )使用 HC1 或 NaOH 調整至pH 9.0。分析溫度：25QC. 將3 00μ1經稀釋的蛋白酶樣本與15ml的分析緩衝液混合，並藉由加入1.5mlPNA受質（50mg溶解於1〇mlDMs〇並進一步以0.01% Trit〇n-Xl〇〇稀釋45χ)開始活性反應，並在混合後，藉由分光光度計監測在的增加作為蛋白酶活性之測量。將蛋白酶樣本在活性測量前進行稀釋以確 160 200829698 保所有的活性測量落入對分析的劑量反應曲線之線性部分0 蛋白酶AU分析經變性的血紅素（〇·65% ( w/w )，於含尿素6.7mM KH2P04/Na0H緩衝液，PH 7.50中）係於25〇C藉由蛋白酶降解ίο分鐘，並將未降解的血紅素以三氯醋酸（trichloroacetic acid ’ TC A )沈澱並藉由過濾移出。在濾液中的可溶於tcA 的血紅素降解產物係使用Folin & Ciocalteu氏紛試劑（1體積的 Folin-Ciocalteu Phenol Reagent Merck 9001.0500 對 2 體積的去礦物質化水）測定，其給出具有許多胺基酸（於 75 〇nm測量）的藍色。活性單位（activity unit，AU)係藉由參照標準而測量並界定。經變性血紅素受質可如下製備：將 1 154 g 尿素（Harnstoff，Merck 8487 )溶解於 1〇〇〇 ml 去礦物質化水，加入240.3 g NaOH並接著（緩緩地）加入63.45 g血紅素（Merck 4300)，接著加入315.6 g ΚΗ2Ρ04，與去礦物質化水ad 3260 g。將pH調整至7.63。更多細節與適合的 Alcalase標準品可應要求得自 Novozymes A/S， Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，丹麥（分析編號 EB-SM-0349.01 ) ° 澱粉酶受質：Phadebas 錠劑（Pharmacia Diagnostics ;交聯的、不溶的、藍色殿粉聚合物，其係與牛血清白蛋白和缓衝物質混合，並製造成錠劑）

分析溫度：37°C 161 200829698 分析pH : 4·3 (或7·0，若想要）反應時間·· 20分鐘在懸浮液於水中後，將殿粉藉由阿伐-澱粉酶水解，得到可溶性藍色片段。所得藍色溶液之吸收（於620 nm測量）係阿伐-澱粉酶活性之函數。阿伐-澱粉酶活性可相對於已知活性之標準品而測定，例如表現成真菌的阿伐-澱粉酶單位 (Fungal alpha-Amylase Units，FAU) 。一 FAU 係於標準分析條件每小時打斷5.26 g澱粉（Merck，Amylum solubile Erg· Β· 6, Batch 9947275 )的酵素之量。更詳細的分析敘述、 APTSMYQI-3207、與 FAU 標準可應要求得自 Novozymes A/S， Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd，丹麥。實施例2:具有改善的磷脂酶活的脂肪酶變艟將編碼於以下表1顯示的脂肪酶變體的DNA轉型入米麴菌品系ToC1512 (於W02005070962 A1敘述），其使用於US專利案第5,869,438號之實施例22中敘述的方法，除了使用PyrG挑選（於W02004069872 A1中敘述）取代AMDS 挑選。米麴菌宿主之孢子係自瓊脂斜面取得並用於接種丨〇ml YPM ( 10 g 酵母菌粹取物、Difco + 2〇 g Pept〇ne、Difc〇，加水至1 L，高壓蒸氣滅菌；加無菌經過濾麥芽糖至2〇/〇 (W/W))。將經接種的試管以18〇 rpm在New Brunswick Scientific Innova 2300搖動器於30〇c培養三天。藉由使用 Mira-Cloth (Calbiochem)過濾培養物並接著以〇 45um (微米）過濾無菌過濾而收取上清液。將脂肪酶變體如於us專 162 200829698 • 利案第5,869,438號之實施例23中所通常敘述而純化。

表1 :脂肪酶變體I

變體設計相較於SEQ ID NO : 2之取代 LVA012 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+職魯PWT LVA023 N33Q+E210D+T231R+N233R LVA041 N33Q+D111A+T231R+N233R LVA043 N3 3 Q+G91T+T231R+N233R LVA049 N33Q+G163K+T231R+N233R LVA061 D27Q+N33Q+T231R+N233R LVA099 D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T LVA103 Q4R+N33Q+T231R+N233R LVA120 N33Q+D96W+T231R+N233R LVA349 K98I+T231R+N233R+N251S LV1330 N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R LV1855 D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T LV1857 D27R+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T LV1865 D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T LV1874 D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T LV1889 D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T LV2934 N33Q+T231R+N233R 163 200829698 以下的脂肪酶係用於比齡曰冗知且亦係如上述製備：野生型脂肪酶來自絨毛腐暂 +

戈七腐貝Μ囷DSM 1800具有SEQ ID NO · 2之胺基酸1 _269之库別日从，/ , <序列且於（例如）US專利案第 5,6 14,189號被序述用於醫筚、，， w + 用途）、以及其（T231R+N233R) -變體具有SEQ ID NO: 1之胗其缺， <版基酸 1-269,於 WO 2006/136159 被敘述用於醫藥用途。以下的脂肪酶係作為陽性控制組（對磷脂酶活性為陽性）：相車乂於SEQ ID NO : 2具有以下取代的變體[ν 1232 : G91A + D96W + E99K + G263Q + L264A + I265T + G266D + T267A + L269N。此等脂肪酶係如以下所述對磷脂酶活性試驗。酵素：將酵素樣本於酵素稀釋緩衝液（2〇 mM Na-醋酸鹽、 0·01°/〇 w/w Triton-Xl〇〇、pH 5.0)稀釋至 5mg/mL (每 ml 的酵素蛋白質（EP )之mg )。酵素濃度係基於a28g與所計算的莫耳濃度吸收係數測定（程式GPMAW ( Lighthouse Data， Odense，丹麥；http: //welcome.to/gpmaw ;亦參見 Gill，S. C·與v〇n Hippel，Ρ· H. ( 1989 ):自胺基酸序列數據的蛋白質消光係數之計算（Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data)，Anal. Biochem. 182, 319-326) 〇受質：受質1-肉豆蔻醯基-2-棕櫚醯基j心甘油-3-磷膽鹼之溶 164 200829698 液（以下稱為「磷脂醯膽鹼」）（其商業上可購自Avanti p〇lar Lipids lnc.，700 Industrial Park DrWe，Α1__，al 35〇〇7, U S,目錄編號8 5 0 4 4 5 )係如下製備· 1將37.5mg磷脂醯膽鹼溶解於75〇uL(微升）去離子水 2於室溫攪拌lh 3 力口入 37.5uL 0.321VL CaCl2 4攪拌1-2分鐘 5加入375uL 16mM去氧膽酸鈉 6加入7 5 0 u L去離子水 7 於室溫攪拌30分鐘酵素反應： 1將100uL受質轉移至2mL_eppendorf管 2加入5uL酵素，稀釋至5mg/mL如上述 3 於 eppendorf thermomixer 在 40°C、lOOOrpm 培養 20 分鐘 4將1 OuL反應混合物轉移至新的eppendorf管並加入 990uL 50% 曱醇（MeOH ) 、〇·ΐ% ( w/w )三氟醋酸 (trifluoroacetic acid，TFA ) 5將此在與以下介質混合後藉由MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight mass spectrometry，介質輔助雷射脫附離子化飛行時間質譜測定法）分析：於50% MeOH、0.1%TFA的20mg/mL 2,5-二氫苯甲酸納入受質控制組，其中於步驟2加入5uL酵素稀釋緩 165 200829698 四個獨立的測定。

衝液取代酵素。於步驟5為每個樣本作所使用的MALDI-TOF 式有正離子化的Voyager DE PRO儀器 Biosystems)。藉由選擇具有不同長度的醋結合性酸的基於甘油的受質，藉由測量經消化甘油骨架之質量而區別酵素的專一= (攻擊1-位置或2-位置）係可能的。各種各樣可能的經消化甘油骨架之質量為： 706 Da 磷脂醯膽鹼 496 Da A1水解（磷脂醯膽鹼減肉豆蔻醯基（ci4) 於位置1 ) 468 Da A2水解（磷脂醯膽鹼減棕櫚醯基（ci6)於位置2 ) ' 25 8 Da A1與A2水解（未降解的磷脂酿膽驗減c14 輿 C16) 使用代表706、496、468、與258Da之Mw，s的MS峰之相對的訊號強度（峰下面積）作為計算磷脂酶Ai與A2 (PLA1-與PLA2-)活性間之分佈的基礎。顯示。來自兩個不同實驗（ί與π)的結果係於以下表2與3 通常’ Α1/Α2相對於Α2/Α1之高於10-15%之訊號強度可象徵真實的雙重活性或不純的樣本。 166 200829698

/ 表2 :實驗I :脂肪酶變體之磷脂酶活性所試驗的酵素活性之 PLA-1 % ，分佈 PLA-2 % 水解後留下的未消化的磷脂 % SEQ ID NO ： 1 72 28 44 SEQIDNO ： 2 78 22 42 LVA012 66 34 65 LVA023 78 22 40 LVA041 79 21 55 LVA061 73 27 46 LVA099 71 29 45 LVA103 69 31 68 LVA349 80 20 46 LVA120 75 25 47 LV1889 63 37 26 LV2934 60 40 62 LV1232 68 32 1.4 受質控制組 82 167 200829698 表3 :實驗II :脂肪酶變體之磷脂酶活性所試驗的酵素活性戈 PLA-1 % L分佈 PLA-2 % 水解後留下的未消化的磷脂 % SEQIDNO： 1 73 27 82 LV1330 86 15 54 LV1855 84 16 58 LV1865 78 22 65 LV1874 84 17 56 LV1889 89 11 4.6 LVA043 82 18 51 LVA049 82 18 50 LV1857 86 14 42 LV1232 91 9.3 1.3 受質控制組 100 結論：所有所試驗的脂肪酶皆具有某種程度的磷脂酶活性，主要為PLA1-活性。正控制組（LV1232 )在兩個實驗中皆顯示高磷脂酶活性。 SEQ ID NO : 1與2之先前技術脂肪酶當於相同的實驗 (實驗I )中試驗時對於磷脂酶活性顯示幾乎相同的表現，在水解後（分別地）留下大約44%與42%未消化的磷脂。思量到以下的脂肪酶變體相較於SEQ ID NO : 2具有改善的磷脂酶活性：LV123 2、LV18 89與LVA023 (實驗I)、 168 200829698 與 LV1232、LV 1330、LV1855、LV1865、LV1874、LV1889、 LVA043、LVA049、與 LV1857 (實驗 Π)。變體 LVi232 與LV 1 889在兩個實驗皆尤其顯示非常改善的磷脂酶活性。實施例3:於pH 6具有改善活性的脂肪酶變髏在1 OmM贍鹽的存在下於pH 6試驗一些於以上表1中顯示的經純化脂肪酶變體的活性。如於實施例丨，納入Seq id NO · 2與1之脂肪酶以供比較。化學品與試劑：

分析緩衝液pH 6: 100mM咪唑、1〇〇 mM醋酸鹽、100 mM 丙二酸，pH 6.0 酵素稀釋緩衝液：5mMNaH2PO4pH7.0 7 mM CaCl2 ( Merck, 1.023 82.0500 ) 膽鹽（80mM):得自 Solvay Pharmaceuticals 的脂肪酶活化性膽鹽混合物，批號176 〇1-PA_7374

Trilinolein(二亞麻油酸甘油醋，sigma T9517) 胃蛋白酶：（Merck VL 317492437，目錄編號 1.0792.0001 ) 停止溶液：10% Triton-Xl〇〇、1M 填酸。受質：受質工作乳液係如下製備： 1·將2.188mL膽鹽（80mM)與6.68mL去離子水混合。 2.加入0.133 mL Trilinolein(三亞麻油酸甘油酯，Sigma T9517) 〇 169 200829698 3·於室溫使用ultraturex混合器（黃線DI 25基本 (yellow line DI 25 basic))混合 1 分鐘。此得到受質之工作乳液，其具有19.44mM膽鹽與 15.56mM Trilinolein 〇酵素：將酵素樣本於5mM NaH2P04 pH 7.0稀釋至0.07mg/mL (每ml之酵素蛋白質mg )。酵素濃度係基於A28g。將酵素於5mM NaHjO4兩倍稀釋（總共製造六個稀釋與無酵素/ 緩衝液控制組）。此等稀釋得到以下的最終濃度的在槽孔中之酵素：0.01 mg/m卜 0.05、0.025、0.0125、0.0625、0.03 125、 and 0.01 5625 mg/ml 〇分析程序： 1 ·於微滴定盤（Micro Titer Plate ，MTP)混合 35ul (议升）分析緩衝液與25ul 7mM CaCl2。加入9〇ul受質工作乳液。於3 7。C、700 rpm預培養20分鐘。 2.加入25ul個別的酵素稀釋液，並於37。(：、700 rpm 培養30分鐘（最終體積175ul)。在Μτρ槽孔中最終膽鹽與Trilinolein之濃度（分別地）為1〇1^與8mM。 3·加入 50nl 停止溶液（10% Trit〇n_xl〇〇、ιΜ 磷酸）與25ul胃蛋白酶（ 700mg/1)。於室溫培養1〇分鐘。加入胃蛋白酶（其為一種蛋白酶）以避免當pH於之後的程序（自由脂肪酸（FF A )之測定）增加時脂肪酶蛋白質之再活化。 4·立刻於1% Tdton-XlOO稀釋樣本1〇倍以藉由NefaC ^ ^ FFA( Wako5 Nefa C ACS-ACOD Method Enzymatic color 170 200829698 test Code No ·· 999-75406 ) ° 藉由NefaC套組偵測自由脂肪酸（Nefa C ACS-ACOD Method Enzymatic color test Code No: 999-75406 ) ·· 1. 製作溶液A :瓶子Ria係以i〇的瓶子R1 (來自 NefaC套組）溶解。製作溶液B :瓶子R2a係以20 ml的瓶子R2 (來自NefaC套組）溶解。 2. 將 Call Nefa C 標準油酸（28.2 mg/dl - lmmol/L) 於1% Triton-X 100中稀釋以獲得以下用於NefaC標準品的濃度：ImM、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、與 0.0 1 5625mM 〇 3·將25ul標準品/脂肪酶樣本與5〇ul溶液a混合。於室溫、700 rpm培養15分鐘。 4_加入l〇〇ul溶液B，於室溫、7〇〇rpin培養μ分鐘。結果 ·· 王mM的FFA之濃度係自Nefa C標準曲線測定。將脂肪酶活性結果擬合至類Michealis_Menten擬合（Michealis_ Menten-like fit ): A=A0+Amax*[E]/ ( [E]+K) 測疋 V0 ( mm〇i FFA/g 酵素/min)，並為 SEq ID N〇 : l之脂肪酶測定對vo之比率。於每個MTp上納入seq⑴ NO : 1之脂肪酶與變體LV2934 ( SEQ m N〇 : 1之非醣化變體）作為控制組。、、、。果（針對SEQ ID NO : 1正常化）係於以下表4顯示。 171 200829698

表4 :對三亞麻油酸醋於pH 6的脂肪酶活性所試驗的酵素相對的VO (mmol FFA/g酵素/分鐘） SEQ ID NO ： 2 0.35 LVA049 1.45 LVA349 1.10 LVA023 1.06 LVA099 1.02 SEQ ID NO ： 1 (I) 1.00 SEQ ID NO ： 1 (II) 1.00 SEQ ID NO ： 1 (III) 1.00 LVA061 0.90 LV2934-I 0.80 LV2934-II 0.77 LV2934-III 0.73 LV1330 0.79 LVA043 0.75 LVA041 0.72 LVA012 0.64 LV1857 0.47 LV1855 0.36 LV1889 0.34 LV1874 0.33 LV1865 0.23 172 200829698 結論：基於以上的結果，相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶，思量到（除了 LV1889、LV1874與LV1 865外）所有所試驗的變體使用具有1 OmM膽鹽的三亞麻油酸酯受質於pH 6皆具有較高的活性。 LVA049、LVA349、LVA023、與 LVA099 月旨肪酶變體似乎在此方面遠較SEQ ID NO : 2的比較性脂肪酶為佳，事實上比SEQ ID NO : 1脂肪酶更加。此尤其對於LVA049與 LVA349月旨肪酶變體，更尤其是對於LVA049月旨肪酶變體為真。實施例4:於pH 3具有改善的穩定性的脂肪酶變髏對一些於以上表1中所列的脂肪酶變體試驗在2-8的pH 範圍之pH穩定性。如於之前的實施例，納入SEQ ID NO : 2與1之脂肪酶以用於比較。亦試驗以下的SEQ ID NO ·· 2 之脂肪酶之變體：

LVA147 ： D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R

+N233R+P256T

LVA315 ： N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G

LVA317 ： N33Q+G91T+G163K+T231R+N33R+D254S

LVA319 : N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S

LVA714 : D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R

+N233R+Q249R+D254S 每個酵素皆以兩種濃度（0.05與1.0 mg酵素蛋白質/ml) 173 200829698 複试驗°另外，使用與不使用膽M lGmM、以及使用與不使用胃蛋白酶（70 mgM )試驗酵素。簡而言之，酵素係於所欲的pH於37〇c培養hb、45、人120刀釦（或i、6〇、與12〇分鐘），之後於pH 8與室 /m ( RT )對對-硝苯基辛酸酯測量殘餘的脂肪酶活性。化學品/試劑：酵素稀釋緩衝液：20mM醋酸鹽pH 6、0.01% Triton-X100 〇穩定性緩衝液：200mM咪唑、200mM醋酸鹽、200mM 丙二酸，調整至 PH2.0、3.0、4.0、5·0、6·0、7·0、與 8·0。殘餘活性緩衝液（RA緩衝液）：200mM Tris (參-羥曱基胺基甲烷、2-胺基-2-羥甲基-1，3-丙二醇，CAS-編號：77-86-1 ) pH 8、0.4〇/〇 Triton-X100、ImM CaCl2 pNP-辛酸醋（C8) : Sigma N-0752 胃蛋白酶（700mg/l ) : Merck，VL 317492437 (1.0792.0001 ) 膽鹽（80mM):得自 Solvay Pharmaceuticals 的脂肪酶活化性膽鹽混合物（batch 176.01-PA-7374) 酵素：將酵素於 20mM NaH2P04 pH 7.0、0.01% Triton-Xl〇〇稀釋成0.4或0.8mg酵素蛋白質每ml (基於A280)的工作溶液。穩定性分析： 1 )將 5Oul 穩定性緩衝液、20ul 0· 1 % Triton-X 1 00、25ul 174 200829698 膽鹽（80mM)或20ul胃蛋白酶（ 700mg/1)或去離子水加至微滴定盤（microtiter plate ，MTP )之每個槽孔。加入去離子水至每槽孔最終體積175ul。所有的樣本都作二重複。於 37。(：預熱 20min，700 rpm。 2)加入25ul酵素（最終濃度0·05或〇 lmg酵素蛋白貝母ml)。對於母個pH納入具有胃蛋白酶與膽鹽之無酵素控制組，即將 25ul 2〇mM NaH2P〇4pH 7.0、〇.〇i% THt〇n-χιοο加入此等槽孔。於37〇c 700rpm培養1、l5、45與i2〇分鐘。 3抽取20ul之分裝並以1 80ul殘餘活性緩衝液pH 8.0 稀釋樣本，將樣本保持在冰上。 4) 稀釋樣本（最小稀釋2〇χ以增加1^至8)。對^分鐘樣本pH 8作最初殘餘活性（residual㈣吻，ra)，稀釋20χ 40χ、8 0x、160χ、與320χ以測定在分析獲得線性所需的稀釋。

5) 如以下所述於ρΗ8·〇使用pNp-辛酸酯受質測量ra。受質：受質儲存溶液係藉由混合14.2ul董卜硝苯基辛酸酿 (叫⑽N-0752 )與1如2-丙醇而製備。此儲存溶液係於殘餘活性緩衝液PH8.0稀釋5〇χ以得到工作溶液，而將mu 的工作〉谷液加入每個槽孔。用於測定殘餘活性（RA )之程序· 1 50ul受質工 1)在新的MTP混合20ul經稀釋樣本與作溶液。 175 200829698 2)於4〇5nm測量動力學5分鐘（混合第〆次’每12 秒讀取，室溫）。結果： %殘餘活性係如下計算··將每次抽取（1、15、45、12〇分麵）每個pH内之比率減去具有膽鹽或胃蛋白酶的無酵素才工制、、且之比率。將此經校正比率接著除以每個pH内的最高值並乘以1〇〇。 f 以下表5顯不該等相較於SEQ ID NO : 2為改善的變體 i 於PH 3的穩定性（分別為 J馮在緩衝液中、在胃蛋白酶的存在下、或在膽鹽的存在下）。版一廿你卜」。僅顯不於pH 3的穩定性结果，因為在此PH觀察到最明顯的差別。、 176 200829698 逛昶雄傲H籲谱运餿忘趔轉进鹄e 食：膽Ά 100.0 L ——_______________________________________________ 卜 d 50.2 cn ι-l 36.4 寸〇 14.6 m· 胃蛋白酶 100.0 寸 (N 90.4 I vq d 67.5 CN m 31.5 <Ν <Ν 1 loo.o 1 — _________ ____ ______ — 寸〇 85.0 Os Ο 66.5 Τ—Η r-H 30.3 Ο 緩衝液 100.0 Os 寸 92.0 85.4 〇〇 74.6 τ-Η 」漏 1 卜 Ο 92.1 rn r"H 90.6 O o 88.4 r-H cn 100.0 1 _ .____ __________ _ 〇〇 cn 92.5 寸 Ο 92.8 r-H Ο 92.7 卜 d 時間標準差 1分鐘標準差 15分鐘標準差 45分鐘標準差 120分鐘標準差 1分鐘標準差 15分鐘標準差 45分鐘標準差 120分鐘標準差 1分鐘標準差 15分鐘標準差 45分鐘標準差 120分鐘標準差脂肪酶 LVA049 LV1855 LV1865 膽鹽 100.0 r-H r—( CN — 〇 (Ν y—i (N Ο m ο 100.0 39.2 <N 〇 20.5 T—H cn 10.5 r-H 胃蛋白酶 100.0 1—Η oi ο r—Η 00 ο -1.2 <Ν ι—Η 100.0 (N (N T-H o r-H d o o ο ο ο ο 緩衝液 100.0 <N 82.6 CN r—^ 80.9 Ch (N 59.0 100.0 r-H rn 72.2 ^T) o | 62.2 | ΠΊ o 「59.2 cn Η 100.0 (N 84.9 ο 73.9 寸 ο 62.6 r-H τ—Η 時間標準差 1分鐘標準差 15分鐘標準差 45分鐘標準差 120分鐘1 標準差 1 1分鐘1 I標準差| | 15分鐘1 I標準差| i 45分鐘1 標準差 120分鐘 i標準差 1分鐘標準差 15分鐘標準差 45分鐘標準差 120分鐘標準差脂肪酶 SEQ ID NO ： 2 _ SEQ ID NO ： 1 LV2934 200829698 膽鹽胃蛋白酶 100.0 〇〇 cn 72.3 1—( in 60.5 Ο) τ-Η 23.6 Ο) τ·Η 緩衝液 100.0 〇 1> 84.9 τ—Η 89.7 VO (Ν 87.9 卜 r-H 100.0 〇 cn 85.3 ON (N 80.1 〇 rn 69.6 〇\ 100.0 Τ—Η rn 87.8 os (N 83.0 〇 77.6 (N 時間標準差 1分鐘標準差 15分鐘標準差 45分鐘標準差 120分鐘標準差 1分鐘標準差 15分鐘標準差 45分鐘標準差 120分鐘標準差 1分鐘標準差 15分鐘標準差 45分鐘標準差 120分鐘標準差脂肪酶 LV1874 LVA041 LVA061 膽鹽胃蛋白酶 100.0 51.0 34.3 1—Η Vsd 25.1 T—Η to 100.0 rn 68.2 (N Vsd 36.0 寸 uS 〇〇 1> 00 (N 100.0 cn 80.3 (N (N 54.2 寸 (N 17.8 Η 緩衝液 100.0 寸 cn 91.2 卜 (Ν 91.7 寸 cn 83.4 r-H <rl 100.0 <N 97.4 〇 92.8 寸 ON 88.0 卜 (ή 100.0 〇 95.8 卜〇 94.5 〇〇 T-H 72.4 (Ν cn 時間標準差 1分鐘標準差 15分鐘標準差 45分鐘標準差 120分鐘標準差 1分鐘標準差 15分鐘標準差 45分鐘標準差 120分鐘標準差 1分鐘標準差 15分鐘標準差 45分鐘標準差 120分鐘標準差脂肪酶 LVA043 LV1889 LV1857 200829698 膽鹽 100.0 (N 00 44.2 12.2 24.2 13.3 ! 31.2 18.3 胃蛋白酶 100.0 〇〇 (N 93.8 r-H 95.2 (N 94.0 寸 (N 100.0 Os 〇 70.9 cn 54.4 Ό cn 緩衝液 100.0 〇 — 93.3 cn 89.9 寸 ΓΛ 1 74.7 〇 ON 100.0 〇\ (N 89.1 Ο 84.7 〇時間標準差 1分鐘標準差 15分鐘標準差 45分鐘標準差 120分鐘標準差 1分鐘 I標準差| 15分鐘標準差 45分鐘 ^標準差| 120分鐘標準差 1分鐘標準差 60分鐘標準差 120分鐘標準差脂肪酶 LVA099 LVA349 LVA714 膽鹽胃蛋白酶 100.0 1—Η 83.1 p r-H 54.8 cn τ" i 20.1 I 緩衝液 100.0 〇 98.3 寸 ^0 88.2 v〇寸 78.4 100.0 1 r-H cn 94.7 (N in | 88.8 I 83.7 (N 100.0 (N (N 20.1 卜寸寸〇時間標準差 1分鐘標準差 15分鐘標準差 45分鐘標準差！ | 120分鐘| 1標準差1 1 1分鐘| 標準差 | 15分鐘| 1標準差Ί 45分鐘標準差 120分鐘標準差 1分鐘標準差 60分鐘標準差 120分鐘標準差脂肪酶 LVA012 LVA023 LVA147 6卜1 200829698 膽鹽胃蛋白酶 100.0 (N cn 63.5 27.5 Os VsO cn in (N 緩衝液時間標準差 | 1分鐘| 標準差 15分鐘 1標準差| | 45分鐘| 標準差 120分鐘標準差脂肪酶 LVA317 膽鹽胃蛋白酶 100.0 vd 68.4 (N 〇〇 28.5 11.2 (T) ^6 00 寸 100.0 00 寸 27.2 C\ 〇 in On Ο q 緩衝液時間標準差 1分鐘標準差 15分鐘 I標準差| | 45分鐘I I標準差| | 120分鐘| I標準差| 1分鐘 I標準差| | 15分鐘| 1標準差| | 45分鐘I 標準差| 120分鐘標準差脂肪酶 LVA319 LVA315 200829698 結論：以下的脂肪酶變體於pH 3具有改善的穩定性（相較於 SEQ ID NO : 2 之脂肪酶）：LV2934、LVA043、LVA049、 LV1 855、LV1 865、LV1874、LV1889、LV1857、LVA012、 LVA023、LVA04卜 LVA06卜 LVA099、LVA147、與 LVA714。以下的脂肪酶變體使用胃蛋白酶於pH 3具有改善的穩定性（相較於SEQ ID NO: 2之脂肪酶）：LVA043、LV1855、 LV1 865、LV1874、LV1889、LV1857、LVA012、LVA099、 LVA315、LVA317、LVA319、與 LVA714。以下的變體使用膽鹽於pH 3具有改善的穩定性（相較於 SEQ ID NO : 2 之脂肪酶）：LVA349。實施例5:脂肪酶變«之微純化於以下表6顯示的額外的脂肪酶變體係如於實施例2 所述製備，至且包含發酵上清液無菌之過濾。

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f. I

表6 :脂肪酶變體II 變髏設計相較於SEQ ID NO : 2的取代 LVAR0003 K98I+T231R+N233R LVAR0013 G91V+T231R+N233R LVAR0032 D57G+L93F+T231R+N233R LVAR0045 A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R LVAR0046 E99T+T114I+D254N+T231R+N233R LVAR0047 D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R LVAR0050 E56S+E87K+D96L+E99D+T231R+N233R LVAR0051 E56A+D57A+T114I+T231R+N233R LVAR0052 G91E+T231R+N233R LVAR0053 E56K+D96G+D111A+T231R+N233R LVAR0054 E87K+D111S+T231R+N233R LVAR0056 E56S+E87K+T231R+N233R LVAR0057 E87K+G91E+T231R+N233R LVAR0058 D27Y+E87K+T231R+N233R LVAR0061 E56K+E87K+D111A+T231R+N233R LVAR0062 E87K+E99P+T231R+N233R LVAR0063 E87K+D96L+E99P+T231R+N233R LVAR0064 E56C+E87K+T231R+N233R LVAR0065 E56R+E87K+D96L+T231R+N233R LVAR0067 E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R LVAR0069 D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R LVAR0072 D96V+D111A+T231R+N233R LVAR0074 N33Q+E87K+T231R+N233R LVAR0076 N33Q+N94K+T231R+N233R LVAR0077 N33Q+D96Y+T231R+N233R LVAR0078 N33T+E43 V+E56K+D96G+T231R+N233R LVAR0079 N33Q+K98I+T231R+N233R LVAR0080 A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R LVAR0086 N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R LVAR0088 N26I+N33Q+T231R+N233R LVAR0091 A30T+N33Q+T231R+N233R LVAR0094 N33Q+G91V+T231R+N233R 182 200829698

LVAR0095 N33Q+G91Α+Τ231R+N233R LVAR0096 N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R LVAR0099 N33Q+K98I+T231R+N233R LVAR0101 N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R LVAR0102 P29T+N33Q+T231R+N233R LVAR0103 N33Q+G91V+T231R+N233R LVAR0104 N33Q+K98I+T231R+N233R LVAR0106 N33Q+G91E+T231R+N233R LVAR0108 N33Q+N94K+T231R+N233R 將經無菌過濾的含脂肪酶培養上清液使用以下的方法微純化：將大約5 Oul (微升）的XpressLine ProA色層分析培養基（商業上可構自Upfront色層分析A/S，Lersoe Parkalle 42，DK-2100 Copenhagen，丹麥）加入過濾盤（Uni filter 800, 25um (微米）熔化聚丙烯過濾器，Whatman )之槽孔。將色層分析培養基藉由加入200ul 1Μ醋酸納，pH 5·0而平衡。攪動10分鐘後將平衡緩衝液藉由真空（Uni-Vac 3, Whatman)移出。重複平衡步驟。接著加入100ul結合緩衝液（1M醋酸納，pH 5·0)與400ul培養上清液並與色層分析培養基混合30分鐘。將未結合物質藉由真空移出。重複結合步驟。將具有結合的脂肪酶的色層分析培養基使用具有漸減緩衝能力的200ul清洗缓衝液（100 / 50 / 10 mM 醋酸鈉，pH 5 ·0)清洗3次。在每個清洗步驟加入緩衝液，將盤攪動10分鐘，將清洗緩衝液藉由真空移出。最終，將結合的脂肪酶藉由加入兩次 100ul 100mM Tris、0.02% Brij 35 (聚氧乙烯（23 )月桂基醚），pH 9.0而溶析。對 200829698 於每個溶析步驟在藉由真空於微滴定盤中收集所溶析的脂肪酶之前將盤攪動15分鐘。實施例6:测定脂肪酶變髏之濃度已經純化的脂肪酶變體（如於實施例2中所一般敘述地常見地純化、及/或於實施例6中所述微純化）之濃度係藉由爆發活性位置滴定（burst active site titration )測定，如以下所述。將經純化的脂肪酶於001〇/〇 Triton-X100中稀釋（若需要）以得到低於以下5uM的濃度（對應至150 Ug酵素蛋白質/ml )。於黑色微滴定盤之槽孔中將1 〇〇ui經純化的脂肪酶與大約l00ul溶解於1M Tris，、4mM SDS (十二烧基硫酸鈉），pH 9.0的40uM的試鹵靈（resorufin，乙基試鹵靈基（resoruHnyl )庚基磷酸酯；一種脂肪酶抑制劑）混合。試齒靈的精確濃度並不重要，其僅僅必須以相較於 5uM的脂肪酶為過量之量加入。在混合後，立刻每分鐘測量來自所釋放試鹵靈的螢光之動力學共U小時（直到爆發結束）（於5 15 nm激發，於590 nm發射，在得自BMG Lab Technologies GmbH 的 POLARstar 螢光強度測量儀琴上測量）。將所測量螢光值擬合至以下方程式： F = F0 + Burst *(l-exp(-(t + dt)* ln(2)/ TY2)+ 斜率 *(t + dt) 其中F為所測量的螢光，f 0為來自抑制劑與脂肪酶的 184 200829698 金光背景，1：為首次榮来淨,I^一贸九則里後經過的時間，dt為從脂肪轉與抑制劑混合至首次螢光測詈里的日守間，Burst為螢光爆發’ T %為指數性爆發之一半千的時間’且斜率為螢光中線性改變的斜率，例如因為脂肪酶- 々啊G基庚基磷酸酯複合物之水解及/或試鹵靈之脫色。活性脂、匕庄舳肪辰度係以介於所計算爆發與试_靈標準曲線之斜率深I针半C〇*4uM;包括於微滴定盤上）的比率測定。 1-4280 Mjt 濃廣亦使用消光係數i .24 A28〇/mg自於28〇 nm的吸收估計經純化脂肪酶變體的濃度。實施例7:脂肪酶變艟之試管内試驗經純化的脂肪酶變體係如以下所述於試管内消化模型中試驗。於試管内模型中使用兩種飲食（分別地與飲食I、與飲食II )之一。飲食I之組成為34%( w/w)脂肪、45%( w/w) 碳水化合物、2%( w/w)蛋白質（剩下的為水、鹽，等等）。 I人食II之組成為·脂肪313、蛋白質146、與殿粉358 (無氮粹取物，NfE，可至432 )，所有皆為g/kg乾重。飲食 I 係藉由使用 UltraTurrex ( YellowLine m 25 basic)混合247.2 g牛奶（ι·5%脂肪）、29.9 g撖欖油、87 g Calshake (商業上可購自 Fresenius Kabi 且具有 2077kJ/g 的能量含量、4.3 g乳蛋白質/i〇0g的蛋白質含量、與24 4 g 脂肪/100g的脂肪含量）、以及9.9 g Methocel (食物等級， 185 200829698 E5 Premium LV FG ( E464 ) ; Dow)共 2 分鐘而製備。為減小黏性，將飲食於50°C於pH 8.0以0.5ug/ml的 SAVINASE 16.0 LEX 蛋白酶（商業上可購自 N〇vozymes A/S， Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd，丹麥）處理 4 小時。接著將蛋白酶藉由減小pH至3並於70°C培養30分鐘、或於50QC培養60分鐘而失活。飲食II係由73 g/kg(濕重）禽肉粉（Altromin)、73 g/kg 豌豆粉、73 g/kg酪蛋白（在酸性條件下沈澱，得自

Altromin )、290 g/kg 小麥麵粉、290 g/kg 馬鈴薯殿粉、125 g/kg豬油、76 g/kg維生素、礦物質與微量元素、375 g/kg 牛乳脂（33%脂肪）組成。在微滴定盤之槽孔中將lOOul的飲食與20ul胃蛋白酶 (Merck VL 3 17492437，目錄編號 1.0792.0001，700 mg/ml) 和3 0ul脂肪酶（4濃度之二重複）混合。若於pH 5進行胃的步驟，則加入l〇ul緩衝液（〇_8M MES ( 2-[N-嗎福林基]乙石黃酸）、0.8M醋酸納、0.8M味口坐，pH 7.0)，而若將pH 3使用於胃的步驟則不加入緩衝液。將微滴定盤伴隨搖動（Eppendorf Thermomixer，750 rpm)於 37°C 培養 1

小時，之後加入以下者：1 5ul (若將pH 5使用於胃的步驟）或25u1 (若將PH 3使用於胃的步驟）緩衝液（〇.8M MES (2-[N-嗎福林基]乙石黃酸）、〇·8Μ醋酸鈉、〇·8Μ 口米峻，pH 7·〇)與 20ul 膽鹽（50 gn，對應至 100 mM，使用 500 g/m〇l 的平均分子量）；得自Solvay Pharmaceuticals的脂肪酶活化性膽鹽混合物（批次)，得到5.7至 186 200829698 ,6·0的PH。接著將盤伴隨攪動於37°C培養2小時，之後藉由加入50ul於1M磷酸中的1〇〇/〇 Triton-χιοο停止反應。在於1% Triton-ΧΙΟΟ中稀釋ι25-25〇倍後，使用得自Wak〇 Chemicals的NEFA C套組測定自由脂肪酸之量，如於實施例3所述。將劑ΐ反應曲線擬合至以下方程式： FFA = FFAmax * [E] / ( [E] + K) f 其中FFA係所釋放自由脂肪酸之量，FFAmax係脂肪酉母可自飲食釋放的自由脂肪酸最大之量，系脂肪酶濃度，而K係釋放FFAmax的一半的脂肪酶濃度。假設FFAmax 對脂肪酶係相同的，改善係數（IF)係定義為： IF = K ( ref) / K (脂肪酶）、曲其中K (ref)為釋放FFAmax的一半的參考脂肪酶之曲又而κ (月日肪酶）為釋放FFAmax❸—半的脂肪酶變體

吾人已使用SEQ ID (於表1的LV2934 ) x( K( SEQ ID NO : 對於列於以下表7a與8a的變體， 1之知肪每與其去醣化變體N3 3 〇之平均作為參考脂肪酶，即K(ref) = i/2 1 ) + K ( LV2934))。改盖係：以下表7a與8a的脂肪酶變體皆具有高於！·〇的肪酶二:::ΓΓ較於參考脂肪酶需要較低量的此等脂吻D:〇的功效。任何脂肪酶變，考月曰肪酶之改善係數除以SEQ ID N〇: 2 187 200829698 • 7對於茶考脂肪酶之（固^ )改善係數，其於以下表7a中才曰出。當使用例如活性位置滴定（Active She m⑽。^ ， AST，實施例6 )以測定脂肪酶濃度，且若對所關注的變體的改善純係相對於SEQIDN〇:2之脂㈣而計算時，可將所關注的變體之平均IF除以SEQIDN〇:2之平均抒，其係0 · 8 8 ’较佳地為〇 · 9。對於列於以下表7b、8b、8c、與8d中的額外的脂肪 f .酶變體，係使用SEQIDNO: 1之去醣化變體N33Q (於表 1的LV2934 )作為參考脂肪酶。此等脂肪酶之每一者具有局於1 ·00的改善係數（平均改善係數減標準差）。對於挑選改善的脂肪酶，係使用IF值與具有兩位小數點的標準差。此等數量之後大約至一位小數點。 200829698 表7a :具有改善的試管内（經微純化的）表現的脂肪酶變體改善係數（IF) 所試驗的酵素 AST A280 飲食I (pH3於胃的步驟） SEQIDNO ： 2 0.9+/-0.1 0.9+Λ 0.2 LVAR0003 1.9+/-0.4 2.4? 2.1+/-0.4 LVAR0045 4.1 晒 LVAR0046 5.5 LVAR0047 4.3 顧 LVAR0050 4.1 麵 LVAR0051 1.8 麵 LVAR0052 3.2 LVAR0053 3.5 晒 LVAR0054 3.8 LVAR0056 2.2+A0.6 痛 LVAR0057 3.0 麵 LVAR0061 2.3 晒 LVAR0062 2.4 LVAR0063 6.6 瞧 LVAR0064 2.0+/-0.0 一 LVAR0065 4.6 — LVAR0067 8.0 舞 LVAR0069 7.3 LVAR0072 2.5 麵 189 200829698

飲食II (pH3於胃的步驟） LVAR0074 3.3 2.2 LVAR0076 5.0 3.2 LVAR0077 4.5 2.5 LVAR0078 2.9 1.5 LVAR0079 6.7 7.7 LVAR0080 7.1 5.9 LVAR0086 4.3 2.7 LVAR0088 1.8 3.1 LVAR0091 5.2 4.3 LVAR0094 11.0 10.5 LVAR0095 9.3 11.5 LVAR0096 8.3 6.6 LVAR0099 11.1 11.8 LVAR0101 8.1 8.2 LVAR0102 6.0 4.1 LVAR0103 7.5 4.3 LVAR0104 7.9 5.9 LVAR0106 10.0 9.7 LVAR0108 6.1 6.5 -意指「未經測定」 190 200829698 ί 表7b :具有改善的試管内表現的額外脂肪酶變體脂肪酶相較於SEQ ID NO ·· 2的取代 IF(AST) 钦食I pH 3於胃的步驟 LVA129 D27Y+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R 5.7+/-2.0 LVA130 D27Y+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R 1.5+/-0.4 LVA139 Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R 2.4+/-1.2 LVA140 N33Q+D111E+T231R+N233R 1.8+/-0.3 LVA143 N33Q+D122E+T231R+N233R 1.8+/-0.5 LVA147 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T 5.6+/-3.4 LVA180 N33Q+T231R+N233R+P256T 2.3+/-0.7 LVA182 D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+ Dll 1A+T231R+N233R+P256T 1.2+/-0.0 LVA185 N11R+N33Q+T231R+N233R 1.9+/-0.7 LVA198 N33Q+N39H+T231R+N233R 1.4+/-0.3 LVA202 N33Q+P229R+T231R+N233R 1.5+/-0.5 LVA206 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T 2.9+/-0.8 LVA208 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R 4.6+/-2 LVA210 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T 1.3+/-0.3 LVA211 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+ T231R+N233R+P256T 4.3+/-1.2 LVA238 D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+ D254G+P256T 3.8 LVA241 D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+ P256T 1.8 191 200829698 LVA243 N33Q+N200S+T231R+N233R 1.9+/-0.3 LVA245 N33Q+N39S+T231R+N233R 3.6+/-0.0 LVA247 N3 3 Q+E210R+T231R+N233R 3.3+/-0.6 LVA248 N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R 2.4+/-0.9 LVA249 N33Q+T231R+N233R+D254R 3.1+/-0.4 LVA250 N33Q+N94R+T231R+N233R 4.0+/-0.1 LVA252 N33Q+D96R+T231R+N233R 2.3+/-0.1 LVA254 D27N+N33Q+T231R+N233R 1.5+/-0.1 LVA256 D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R 2.6+/-1.2 LVA257 N33Q+L227F+T231R+N233R 2.3+/-0.7 LVA272 N33Q+N73 Y+G225P+T231R+N233R 2.3+/-0.2 LVA273 N33Q+G225P+T231R+N233R 1.9+/-0.2 LVA275 N33Q+T231R+N233R+D254S 6.2+/-1.5 LVA277 N33Q+D96G+T231R+N233R 1.8+/-0.1 LVA279 N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S 6.1+/-0.6 LVA280 N33Q+T231R+N233R+D254G 2.1+/-0.1 LVA281 N33Q+D130H+T231R+N233R 1.2+/-0.0 LVA284 N33Q+E87A+T231R+N233R 2.1+/-0.1 LVA287 N33Q+T231R+N233R+E239D 1.2 LVA307 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G 2.2 LVA308 N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S 5.9 LVA310 N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S 7.6 LVA315 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G 3.4 LVA317 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 5.5 LVA319 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 6.6 LVA325 Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T 1.2 192 200829698 LVA327 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R 9.2 LVA330 Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T 1.1 LVA331 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T 1.2 LVA333 N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T 3.5 LVA334 N33Q+G177A+T231R+N233R 1.0 LVA338 N33Q+T231R+N233R+G246A 1.1 LVA341 D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 4.2 LVA345 D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R 2.3 LVA347 N3 3 Q+G91T+E219D+T231R+N233R 1.2 飲食II (pH3於胃的步驟） LVA055 N33Q+E219D+T231R+N233R 5.1 LVA060 N33Q+W117L+T231R+N233R 2.4 LVA061 D27Q+N33Q+T231R+N233R 2.6 LVA063 N33Q+G91T+T231R+N233R 5.1 LVA089 D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+ T231R+N233R+P256T 2.2 LVA094 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+ P256T 1.0 LVA099 D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T 2.5 LVA103 Q4R+N33Q+T231R+N233R 1.3 LVA113 N33Q+T231R+N233R+Q249R 1.3 LVA120 N33Q+D96W+T231R+N233R 1.1 LVA179 N33Q+G91N+T231R+N233R 1.7+/-0.6 193 200829698 # 表8a :具有改善的試管内（經純化的）表現的脂肪酶變體改善係數（IF) 所試驗的酵素 AST A280

飲食I (pH3於胃的步驟） LVAR0003 5.2+/-0.3 4.6+/-0.2 LVAR0013 5.5+/-0.7 4.8+A0.6 LVAR0032 3.7+/-1.4 3.3+/-1.0 LVAR0050 3.9+/-0.4 1.5+/-0.1 LVAR0058 3.6+/-0.4 2.7+/-0.4 LVAR0069 5.0+/-0.8 1.4+Λ0.2 表8b :具有改善的試管内表現的額外脂肪酶變體脂肪酶相較於SEQ ID NO : 2的取代 IF (AST) 飲食I (pH 5於胃的步驟） LVA162 N33Q+D167E+T231R+N233R 1.4+/-0.2 LVA214 N33Q+E87A+T231R+N233R 2.7+/-0.4 LVA217 N33Q+E210V+T231R+N233R 2.8+/-0.9 LVA218 N33Q+E56K+T231R+N233R 2.4+/-0.5 LVA220 N33Q+T231R+N233R+D254G 2.0+/-0.2 LVA221 N33Q+D96S+T231R+N233R 2.1+/-0.4 LVA222 N33Q+D122N+T231R+N233R 1.6+/-0.2 LVA228 N26A+N33Q+T231R+N233R 1.2+/-0.2 LVA229 N33Q+N162T+T231R+N233R 3.5+M.9 LVA230 N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R 1.6+/-0.3 194 200829698 LVA234 N33Q+T231R+N233R+G240L 2.8+/-0.2 LVA308 N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S 2.9+/-0.1 LVA310 N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S 3.0+/-0.4 LVA327 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+ N233R 2.0+/-0.6 LVA330 Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+ E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T 1.1+/-0.0 LVA347 N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R 1.7+/-0.3 LVA353 N33Q+G163R+T231R+N233R 1.5+/-0.1 LVA355 N33Q+G163N+T231R+N233R 2.2+/-0.4 LVA357 N33Q+G163C+T231R+N233R 1.6+/-0.3 LVA359 N33Q+G163Q+T231R+N233R 1.6+/-0.0 LVA360 N33Q+G163E+T231R+N233R 1.7+/-0.1 LVA362 N33Q+G163H+T231R+N233R 1.3+/-0.1 LVA364 N33Q+G163I+T231R+N233R 1.5+/-0.4 LVA371 N33Q+G91K+T231R+N233R 2.1+/-0.9 LVA373 N33Q+G91M+T231R+N233R 2.0+A0.4 LVA375 N33Q+G91F+T231R+N233R 1.9+/-0.1 LVA379 N33Q+G91S+T231R+N233R 1.4+/-0.1 LVA381 N3 3 Q+G91W+T231R+N23 3R 1.5+/-0.2 LVA383 N33Q+G91Y+T231R+N233R 1.6+/-0.3 LVA391 N33Q+G163Y+T231R+N233R 1.9+/-0.1 LVA393 N33Q+G163V+T231R+N233R 1.6+/-0.5 LVA399 N33Q+G91C+T231R+N233R 1.2+/-0.0 LVA411 N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R 2·2+/-0·0 LVA412 N33Q+G91M+G161E+T231R+N233R 2.6+/-0.2 LVA413 N33Q+V128A+T231R+N233R 1.6+/-0.1 195 200829698 LVA414 N33Q+V128A+T231R+N233R 1.4+A0.0 LVA415 N33Q+G163E+T231R+N233R 1.9+/-0.5 LVA416 N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R 1.4+/-0.3 LVA417 N33Q+G38A+T231R+N233R 1.6+/-0.1 LVA420 N33Q+G163 A+T231R+N233R 1.2+/-0.0 LVA421 N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R 1.2+/-0.1 LVA438 N33Q+G163M+T231R+N233R 2.4+/-0.2 LVA440 N33Q+G91V+T231R+N233R 1.5+/-0.2 LVA442 N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R 2.6+A0.4 LVA450 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+ T231R+N233R+D254G+P256T 2.7+/-0.1 LVA451 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S 3.2+/-0.1 LVA453 N33Q+G91T+N94R+D111 A+Wl 17L+T231R +N233R 2.0+/-0.5 LVA454 N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S 2.3+/-0.3 LVA456 N33Q+T231R+N233R+P256T 1.7+/-0.1 LVA458 N33Q+T231R+N233R+D242E 2.7+/-0.0 LVA460 N33Q+E87R+T231R+N233R 3.8+/-0.1 LVA461 N33Q+E56R+T231R+N233R 2.4+/-0.2 LVA463 N33Q+N162G+T231R+N233R 2.3+/-0.2 LVA464 N33Q+G91L+T231R+N233R 1.7+/-0.1 LVA468 N33Q+E87H+T231R+N233R 2.1+/-0.2 LVA470 N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R 2.9+/-1.2 LVA471 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S 4.2+/-2.7 LVA472 N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S 2.0+/-0.1 LVA474 N33Q+G163A+T231R+N233R 2.5+/-1.1 LVA480 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+ 1.7+/-0.6 196 200829698 N233R+D254S+P256T LVA482 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R 1.9+/-0.0 LVA483 N33Q+T231R+N233R+D254A 1.5+AO.l LVA484 N33Q+T231R+N233R+D254N 1.1+/-0.0 LVA490 N33Q+T231R+N233R+D254L 2.4+/-0.1 LVA492 N33Q+T231R+N233R+D254K 3.1+/-0.2 LVA494 N33Q+T231R+N233R+D254M 1.8+/-0.2 LVA505 D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+ N233R+Q249R 4.5+/-0.6 LVA506 N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R 2.6+/-0.1 LVA507 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R 1.5+/-0.2 LVA509 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R 1.4+/-0.1 LVA512 N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R 3.9+Λ0.3 LVA513 D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R 1.3+/-0.0 LVA516 N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+ Q249R 1.5+/-0.1 LVA518 D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+ Q249R 1.2+/-0.2 LVA519 D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+ Q249R 2.5+/-0.2 LVA520 N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+ Q249R 3.6+/-0.0 LVA523 D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T 2.0+Λ0.2 LVA526 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+ D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T 2.2+/-0.4 LVA527 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+ D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S 1.9+/-0.7 197 200829698

+P256T LVA530 D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T 1.5+Λ0.4 LVA532 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R+D254S+P256T 1.8+/-0.1 LVA535 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R+D254S+P256T 1.8+/-0.0 LVA540 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+ S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T 1.6+/-0.3 LVA542 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+ L227G+T231R+N233R+D254S+P256T 1.7+/-0.2 LVA547 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S 2.1+/-0.1 LVA548 N33Q+D111 A+Wl 17L+T231R+N233R+ D254S 1.7+/-0.4 LVA555 N33Q+T231R+N233R+P256N 2.1+/-0.1 LVA561 N33Q+T231R+N233R+P256G 1.6+/-0.0 LVA562 N33Q+T231R+N233R+P256H 1.2+/-0.1 LVA565 N33Q+T231R+N233R+P256M 3.0+/-0.3 LVA567 N33Q+T231R+N233R+P256W 2.2+/-0.4 LVA569 N33Q+T231R+N233R+P256Y 1.7+/-0.4 LVA576 N33Q+T231R+N233R+P256F 2.0+/-1.0 LVA578 N33Q+T231R+N233R+P256V 1.9+/-0.5 LVA580 N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R 1.4+/-0.3 LVA581 N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R 1.7+/-0.6 LVA582 N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R 1.7+/-0.7 LVA583 N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R 1.3+/-0.2 LVA586 N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R 1.3+/-0.3 200829698 LVA602 N33Q+V176N+T231R+N233R 1.7+/-0.7 LVA604 N33Q+V176D+T231R+N233R 1.2+/-0.2 LVA614 N33Q+W117F+T231R+N233R 1.6+/-0.1 LVA622 N33Q+V176I+T231R+N233R 1.3+/-0.0 LVA623 N33Q+D111N+T231R+N233R 1.1+/-0.0 LVA627 N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R 1.9+/-0.3 LVA629 N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R 1.4+/-0.1 LVA631 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R 2.4+/-0.4 LVA632 N33Q+G91M+G163P+T231R+N233R 1.5+/-0.1 LVA634 N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R 1.3+/-0.1 LVA639 N33Q+W117D+T231R+N233R 1.4+/-0.2 LVA640 N33Q+W117H+T231R+N233R 1.3+/-0.1 LVA649 N33Q+W117C+T231R+N233R 1.6+/-0.1 LVA650 N33Q+W117C+T231R+N233R 1.7+/-0.1 LVA651 N33Q+W117K+T231R+N233R 1.7+/-0.1 LVA653 N33Q+W117V+T231R+N233R 1.2+/-0.1 LVA656 N11S+N33Q+T231R+N233R 2.0+/-0.4 LVA658 N33Q+W117E+V176K+T231R+N233R 2.2+/-0.8 LVA659 N33Q+W117G+T231R+N233R 1.8+/-0.3 LVA664 N33Q+W117P+T231R+N233R 2.3+/-0.7 LVA665 N33Q+W117S+T231R+N233R 1.7+/-0.1 LVA666 N33Q+W117T+T231R+N233R 1.8+/-0.1 LVA667 N33Q+W117I+T231R+N233R 1.3+/-0.1 LVA670 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+ D254S 4.1+/-0.8 LVA696 N33Q+V176M+T231R+N233R 1.3+/-0.2 199 200829698 LVA697 N33Q+V176H+T231R+N233R 1.2+/-0.2 LVA700 N33Q+V176A+T231R+N233R 1.2+/-0.0 LVA702 D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R 1.3+/-0.3 LVA705 N33Q+W117Y+T231R+N233R 1.1+/-0.1 LVA707 N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R 1.4+/-0.3 LVA715 D27R+N33Q+P136H+L227G+T231R+N233R+ Q249R+D254S 1.3+/-0.2 LVA718 N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S 2.0+/-0.5 LVA721 N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+ N233R+D254S 3.0+/-0.3 LVA722 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+ N233R+D254S 2.3+/-0.2 LVA723 N33Q+G161A+T231R+N233R 1.5+/-0.2 LVA731 N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R 2.9+/-0.6 LVA732 N33 Q+Nl 01Q+T231R+N233R 2.5+/-0.6 LVA733 N33Q+N94Q+T231R+N233R 2.0+/-0.1 LVA736 N11Q+N33Q+T231R+N233R 2.0+/-0.2 LVA738 N8Q+N33Q+T231R+N233R 1.6+/-0.2 LVA740 N33Q+T231R+N233R+N25 IQ 1.3+/-0.1 LVA743 N33Q+N200Q+T231R+N233R 1.4+/-0.0 LVA744 N33Q+G177A+T231R+N233R 2.3+/-0.3 LVA746 N33Q+N73Q+T231R+N233R 1.8+/-0.2 LVA749 N33Q+I86L+T231R+N233R 1.6+/-0.4 LVA753 N33Q+K98I+G163K+T231R+N233R 1.5+/-0.3 LVA754 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+ T231R+N233R+D254S+P256T 2.0+/-0.4 LVA755 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+ 3.9+/-0.3 200 200829698 T231R+N233R+D254S+P256T LVA770 D27R+N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+ Q249R 1.6+/-0.2 LVA771 N33Q+K98I+G163K+N200Q+T231R+N233R+ N251S 1.7+/-0.5 LVA772 N33Q+G38S+G163K+T231R+N233R 1.7+/-0.6 LVA774 N33Q G38Y T231RN233R 1.3+/-0.2 LVA777 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T 1.4+A0.2 LVA778 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T 1.3+/-0.0 LVA782 N33Q+G38N+N73Q+T231R+N233R 1.9+/-0.9 LVA783 N33Q+G38D+R84E+T231R+N233R 1.8+/-0.6 LVA784 N33Q+G38Q+T231R+N233R 1.8+/-0.5 LVA786 N33Q+G38I+T231R+N233R 2.2+/-0.3 LVA788 N33Q+G38K+T231R+N233R 1.4+A0.1 LVA792 N33Q+G38F+T231R+N233R 2.4+/-0.2 LVA799 N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S 2.2+/-0.2 LVA800 N33Q+G38L+T231R+N233R 1.8+/-0.3 LVA804 N33Q+G38P+T231R+N233R 1.5+/-0.3 LVA805 N33Q+G38T+T231R+N233R 1.9+/-0.1 LVA806 N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+ N233R+D254S 2.6+/-0.4 LVA808 D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+ G163K+T231R+N233R+D254S+P256T 3.7+/-0.2 LVA809 N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+ N233R+D254S 2.6+/-0.2 LVA811 D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+ 2.2+/-0.3 201 200829698 G163A+T231R+N233R+D254S+P256T LVA813 D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R +Q249R+D254S 2.6+/-0.4 LVA814 N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R+P256A 1.8+/-0.5 LVA816 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A 3.1+/-0.1 LVA817 N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R 2.8+/-0.8 LVA818 N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A 2.3+/-0.8 LVA819 E1NN33Q T231RN233R 2.3+/-1.2 LVA821 N33Q G38H T231RN233R 2.0+A0.4 LVA830 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+ N233R+D254S 1.8+Λ0.3 LVA831 N33Q+K98I+T231R+N233R 1.2+/-0.1 LVA834 D27R+N33Q+W117I+V176Q+L227G+T231R+ N233R+Q249R+D254S 1.4+/-0.0 LVA835 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+ N233R+D254S 1.9+/-0.4 LVA839 N33Q+G163W+T231R+N233R 1.9+/-0.3 LVA841 N33Q+G38A+G163 A+T231R+N233R 1.9+/-0.2 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N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+ 5.9+/-1.7 207 200829698 D254S LVA985 N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+ D254S 2.2+/-0.2 LVA987 N11R+G23E+N33Q+G91T+G163K+T231R+ N233R+D254S 1.4+Λ0.0 LVA988 N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+ N233R+D254S 2.0+/-0.4 LVA989 N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+ N233R+D254S 4.2+/-1.2 LVA990 N11R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+ N233R+D254S 1.8+/-0.7 LVA991 N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+ N233R+D254S 3.1+/-0.7 LVA993 N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N 233R+D254S 3.0+/-0.5 LVA994 N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N 233R+D254S 3.4+Λ1.9 LVA995 N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+ T231R+N233R+D254S 2.8+/-0.2 LVA997 N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+ D254S 2.7+/-0.8 LVA998 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+ D254S+P256I 2.2+/-0.7 LVA999 N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R +N233R 6.4+/-0.2 LVA1000 N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+ N94R+D111S+G163K+S216P+L227G+T231R +N233R+D254S+P256T 2.8+/-0.8 200829698 LVA1002 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+ T231R+N233R+D254S 1.4+/-0.2 LVA1003 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T 231R+N233R+D254S 2.6+/-0.7 LVA1004 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+ T231R+N233R+D254S 3.2+/-0.8 LVA1005 N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+ V176G+T231R+N233R+D254S 2.3+Λ0.4 LVA1006 E1*+N11R+N33Q+G38A+G91N+N94R+ G163P+V176G+T231R+N233R+D254S 1.4+/-0.1 LVA1007 E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+ V176F+T231R+N233R 2.3+/-0.3 LVA1008 E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+ G163P+V176F+T231R+N233R 2.5+/-0.1 LVA1009 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+ T231R+N233R+D254S 2.7+/- 0.2 LVA1010 E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+ V176F+T231R+N233R 1.9+/-0.3 LVA1011 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+ L227F+T231R+N233R 2.1+/-0.3 LVA1012 E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+ G163P+V176F+T231R+N233R 2.4+/-0.3 LVA1013 E1N+N33Q+G3 8 A+G91 T+Gl 63P+V176F+ L227F+T231R+N233R+D254S 3.4+/-1.2 LVA1014 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+ T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q 2.2+Λ0.2 LVA1015 E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+ G163P+V176F+T231R+N233R+D254S 1.9+AO.l 209 200829698 LVA1017 N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I 2.4+/-0.3 LVA1018 N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+ V176W+T231R+N233R 1.9+/-0.6 LVA1019 N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+ V176I+T231R+N233R 1.3+/-0.3 LVA1021 N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+ G163K+T231R+N233R+D254S+P256T 2.5+/-0.3 LVA1023 N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+ T231R+N233R+D254S+P256T 2.3+/-0.1 LVA1027 E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+ N233R+G246A+D254S 3.1+/-0.1 LVA1028 N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D11 1A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T 3.7+/-1.4 LVA1029 N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R +Q249R 3.4+/-0.0 LVA1031 N3 3 Q+I8 6F+L93 F+D102 Y+E210 Y+L227F+ T231R+N233R+D254Y+I255F+L269F 1.4+/-0.1 LVA1032 N3 3 Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+ T231R+N233R+D254Y+I255F 1.5+/-0.2 LVA1033 N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+ D254S 2.5+/-0.1 LVA1034 N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+ D254S 4.3+/-0.0 LVA1035 N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+ D254S 2.2+/-0.0 LVA1036 N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+ D254S 4.1+/-1.2 LVA1037 N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+ 3.4+/-0.0 210 200829698 f N233R+D254S LVA1038 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+ G163K+T231R+N233R+D254S+P256T 5.6+Λ1.8 LVA1040 N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+ D254S 3.0+/-1.0 LVA1041 Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+ E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256L 2.5+/-0.9 LVA1044 N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+ D254S 2.9+/-0.5 LVA1045 N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+ D254S 2.0+/-0.1 LVA1046 N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+ D254S 2.8+/-0.1 LVA1048 N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+ T231R+N233R+D254S 2.5+/-0.3

211 200829698 表8c :具有改善的試管内表現的額外脂肪酶變體脂肪酶相較於SEQ ID NO : 2的取代 IF (A280) 钦食I (pH3於胃的步驟） LVA012 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T2 31R+N233R+P256T 2.5+Λ0.4 LVA023 N33Q+E210D+T231R+N233R 1.9+/-0.2 LVA027 N33Q+T231R+N233R 1.8+/-0.2 LVA041 N33Q+D111A+T231R+N233R 2.0+/-0.3 LVA043 N33Q+G91T+T231R+N233R 3.1 LVA061 D27Q+N33Q+T231R+N233R 1.7+/-0.4 LVA139 Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R 2.3+M.0 LVA216 N33Q+E56Q+T231R+N233R 1.3+/-0.1 LVA231 N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R 1.3+/-0.2 LVA238 D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+ N233R+D254G+P256T 1.3+/- 0.3 LVA245 N33Q+N39S+T231R+N233R 1.7+/-0.7 LVA250 N33Q+N94R+T231R+N233R 3.3+/-1.8 LVA275 N33Q+T231R+N233R+D254S 4.3+Λ2.7 LVA315 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G 1.4+/-0.2 LVA317 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 1.8+/-0.4 LVA319 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+ D254S 2.2+/-0.3 LVA341 D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+ D254S 2.3+/-0.1 LVA348 N33Q+T231R+N233R 1.4+/-0.2 LVA349 K98I+T231R+N233R+N251S 1.4+/-0.2 212 200829698 LVA368 N33Q+G163P+T231R+N233R 1.7+/-0.1 LVA370 N33Q+G163D+T231R+N233R 1.3+/-0.1 LVA387 N33Q+G163T+T231R+N233R 1.1+/-0.1 LVA389 N33Q+G163 W+T231R+N233R 1.3+/-0.0 LVA437 N33Q+G38A+G163 A+T231R+N233R 1.4+/-0.0 LVA444 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S 1.2+/-0.0 LVA473 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T2 31R+N233R+D254S+P256T 1.2+/-0.2 LVA553 N33Q+T231R+N233R+P256A 1.2+/-0.0 LVA566 N33Q+T231R+N233R+P256S 1.2+/-0.1 LVA620 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+ N233R+D254S 1.2+/-0.1 LVA672 N33Q+S115L+T231R+N233R 1.1+/-0.0 LVA675 N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+ D254S 1.6+/-0.2 LVA714 D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+ L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S 1.1+/-0.0 LVA773 D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+T2 31R+N233R+D254S+P256T 1.3+/-0.1 LVA828 N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+ T231R+N233R+Q249R 1.6+/-0.3 LVA829 N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+ T231R+N233R+Q249R+D254S 1.7+/-0.0 LVA955 N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N 233R+D254S 3.3+/-1.0 LVA956 N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+ D254S+P256L 1.8+/-0.4 LVA957 N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+ D254S+P256L 2.3+/-0.5 213 200829698 表8d :具有改善的試管内表現的額外脂肪酶變體脂肪酶相較於SEQ ID NO : 2的取代 IF (A280) 飲食I (pH5於胃的步驟） LVA012 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+ T231R+N233R+P256T 2.1+/-0.5 LVA013 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+ T231R+N233R+P256T 1.6+/-0.0 LVA023 N33Q+E210D+T231R+N233R 3.2+/-U LVA041 N33Q+D111A+T231R+N233R 2.2+/-0.6 LVA043 N33Q+G91T+T231R+N233R 3.9+/-1.1 LVA061 D27Q+N33Q+T231R+N233R 2.4+/-0.8 LVA139 Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R 1.5+/-0.3 LVA208 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R 1.4+/-0.1 LVA216 N33Q+E56Q+T231R+N233R 1.9+Λ0.2 LVA231 N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R 2.0+Λ0.0 LVA250 N33Q+N94R+T231R+N233R 1.9+/-0.5 LVA275 N33Q+T231R+N233R+D254S 1.8+/-0.5 LVA315 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G 1.9+Λ0.3 LVA317 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 2.1+/-0.4 LVA319 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+ D254S 2.3+Λ0.8 LVA341 D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+ D254S 2.4+A0.1 LVA348 N33Q+T231R+N233R 1.6+/-0.3 LVA349 K98I+T231R+N233R+N251S 1.7+Λ0.5 LVA368 N33Q+G163P+T231R+N233R 1.7+/-0.1 214 200829698 LVA370 N33Q+G163D+T231R+N233R 2.0+/-0.4 LVA387 N33Q+G163T+T231R+N233R 1.4+/-0.0 LVA389 N33Q+G163 W+T231R+N233R 1.5+/-0.0 LVA437 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R 1.9+/-0.3 LVA444 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S 1.2+/-0.2 LVA449 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+ T231R+N233R+D254S+P256T 1.4+/-0.1 LVA473 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+ T231R+N233R+D254S+P256T 1.4+/-0.4 LVA486 N33Q+T231R+N233R+D254Q 1.9+/-0.1 LVA488 N33Q+T231R+N233R+D254I 1.6+/-0.1 LVA503 N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R 1.3+/-0.1 LVA553 N33Q+T231R+N233R+P256A 1.1+/-0.1 LVA564 N33Q+T231R+N233R+P256L 1.2+/-0.1 LVA566 N33Q+T231R+N233R+P256S 1.7+/-0.2 LVA620 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+ N233R+D254S 1.5+/-0.2 LVA672 N33Q+S115L+T231R+N233R 1.7+/-0.1 LVA675 N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+ D254S 2.2+/-0.4 LVA713 D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+ L227F+T231R+N233R+Q249R 2.7+/-0.2 LVA714 D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+ L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S 1.2+/-0.0 LVA734 N33Q+G161A+T231R+N233R 1.3+/-0.1 LVA801 N33Q G38M T231RN233R 3.3+A0.9 LVA803 N33Q G38F T231RN233R 3.2+/-0.4 215 200829698 LVA828 N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+ T231R+ N233R+Q249R 2.0+Λ0.9 LVA829 N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+ T231R+N233R+Q249R+D254S 2.8+Λ1.5 LVA955 N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+ N233R+D254S 4.2+Λ1.7 LVA956 N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+ D254S+P256L 2.6+Λ0.8 LVA957 N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+ D254S+P256L 2.1+/-0.3 實施例8:在胃蛋白酶的存在下於pH 3具有改善的稳定性的脂肪酶變髏對實施例5中之表6的變體，以及以下表9之變體篩選在胃蛋白酶存在下於pH 3的穩定性。

變體係選自兩種SEQ ID NO : 1之胺基酸21至100之經隨機誘變的酵母菌文庫與選自具有以下所靶定的改變的 SEQ ID NO ·· 1之靶定性酵母菌文庫：D27X、E43X、E56X、 D57DA、D62DA、E87EK、D96DL、E99X、D111X、D234X Q249QR、D2 54DN，選自具有G91T與G163K且具有以下所靶定的改變的 SEQ ID NO : 1之靶定性酵母菌文庫： N11R、D27RQNV、G38X、D96EW、K98X、T114I、K163WA、 E210VD、R231I、D254SGQIK 與 P256TA，選自具有 G91T 與G163K的SEQ ID NO : 1之經隨機誘變的文庫，選自具有 D27R、G91N、N94R、D111A、S216P、L227G 與 P256T 216 200829698 的SEQ ID NO : 1之經隨機誘變文庫或係SEQ ID NO : 1 之位置針對性產生的變體。酵母菌為啤酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae) JG169 ( MAT a ； ura3-52 ； leu 2-3，1 1 2 ; his 3-D200 ; pep 4-113 ; prd : : HIS3 ; prbl :: LEU2 ； cir+) 〇

表9 :脂肪酶變體III

變體設計相較於SEQ ID NO : 2的取代 LVAR0002b T32I+G91V+T231R+N233R LVAROOlla G91A+T231R+N233R LVAR0014 N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R LVAR0015 P42L+D57N+G91E+T231R+N233R LVAR0016 K98I+T231R+N233R LVAR0017 V60L+G91V+T231R+N233R LVAR0048 E43K+E56S+E87K+T231R+N233R LVAR0055 E43 V+G91R+T231R+N233R LVAR0059 E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R LVAR0066 E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R LVAR0068 E87K+L147S+T231R+N233R LVAR0070 E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R LVAR0071 E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R LVAR230 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+ T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVAR226 G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 141+ V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVAR287 N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233 R+P256T 217 200829698

LVAR288 D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+ T231R+N233R+P256T LVAR280 N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S LVAR286 N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R LVAR214 Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVAR281 N3 3 Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+ N233R LVAR205 / D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVAR215 Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T LVAR277 N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+ N233R+D254K+P256A LVAR282 N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254 G+P256A LVAR209 D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111 A+Tl 141+ V168M+E210D+S216P+L227G+T231R+N23 3R+P256T ( LVAR223 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+R179T+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T LVAR231 D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D +S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVAR204 D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T LVAR235 N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C +S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVAR284 D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R +P256T 218 200829698

LVAR225 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R +N233R LVAR205 D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVAR283 D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233 R LVAR219 D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T LVAR220 D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+ L227G+T231R+N233R+P256T+L269H LVAR216 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T LVAR290 N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A LVAR218 D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T LVAR285 N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R LVAR208 D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T LVAR207 D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T LVAR234 D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T LVAR828 N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+ N233R+Q249R LVAR955 N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S LVAR956 N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L 219 200829698 〜：篩選方法在75Ug/mL胃蛋白酶之存在下於ΡΗ3·〇與 =在處S 3小時後測量殘餘脂肪酶活性。殘餘脂肪酶活係於隨時間監測活性的比率分析中測量，以在篩選事件期間债;則到非常高的活性與非常低的活性脂肪酶。

在變體之初級筛選中，對液體培養基樣本進行足夠大地稀釋以最小化培養基或發酵組成成分對試驗條件的效果。使其通過初級階段的變體在之後的篩選中藉由加入試驗樣本之更多稀釋與重複而經歷更多試驗。材料與方法初級筛選培養基·· 1.7g的具有硫酸銨的酵母菌氮基（YNB) ( Bio 101，

Cat #4027-532) 、0.8 g 的具有 4 Omg 腺嘌呤（ADE)的完全補充混合物-尿嘴唆（〇01!^^681^91611^1^]^\1：1^-

Uracil，CSM_ura)( Bio 101，Cat #4512-722 )、5g 的 Casamino acids ( BD，Cat #223 050 ) 、100ml 的 5 0% 葡萄糖、50ml 的 0.5M K2HP〇4(鱗酸氫二鉀）、lml 的 1 OOmM CuS04-5H20 (JD Baker，Cat# 1843-01) 、1ml 的 1 OOmg/mL 胺丫青黴素，總共體積以去離子水調整至11。將培養基過濾滅菌並儲存於4。0。經最佳化培養基： 6.7g 具有硫酸銨的 YNB ( Bio 101，Cat #4027-532 )、 5.9g 的琥珀酸（Sigma S-9512) 、0.8g 具有 40 mg ADE 的 CSM-ura( Bio 101，Cat #4512-722 )、20g 的半乳糖（Sigma ’ 220 200829698

Cat#G-0625) 、10g 的葡萄糖、1血的 1〇〇mMCuS〇4_5H2〇與1ml的100mg/mL胺丫青黴素。將pH使用ν&〇η調整至6.6亚將體積使用去離子水調整至u。將培養基過濾滅菌並儲存於4°C。種子培養培養基：混合以下的組成部分·· 6 7g具有硫酸銨的γΝΒ ( Bi〇 101，Cat #4027-532 )、5g 的 Casamino acids (BD，Cat #223050 )、100ml 的〇·5Μ 琥珀酸（sigma s_9512)、855ml 的去離子HA。高壓蒸氣滅菌混合物。加入2ml的丨〇mg/mL 氯黴素與40ml的50%葡萄糖。儲存於4°C。用於製造受質與胃蛋白酶處理的儲存溶液： 1. 10% Triton-XlOO ( w/v ) 2· 1M TRIS，pH 8.0 3. 10% ( 680mM) CaCl2*2H20 4· 100mM 檸檬酸，pH 3.0 5·於 lOOmM 檸檬酸、0.01% Triton-X100 中的 5mg/mL 豬胃蛋白酶（Sigma P-6887，3280 U/mg 固體，3370 U/mg 蛋白質） 6.於 10°/〇 Triton-XlOO 中的 50mM 4-硝苯酚（PNP) 棕櫚酸酯用於脂肪酶活性分析的受質：

ImM PNP-標櫊酸酉旨、1.2%Triton-X100、4mM CaCl2、 lOOmM TRIS，pH 8·0 221 200829698 胃蛋白酶處理溶液： 150ug/mL 胃蛋白酶、4m]y[ CaCl2、0.01% Triton-Xioo、 5OmM檸檬酸鹽，pH 3.0 稀釋劑： 0.01% Triton-χιοο、10mM NaC1 酵素：用於初級篩選的脂肪酶變體之液體培養基樣本係衍生 (自從瓊脂盤挑出置入96槽孔盤中的初級篩選培養基的個別殖系。培養物之生長：使用二個培養基配方以生長脂肪酶變體。因為於初級篩選水平之表現水平並不重要，將初級篩選培養基使用於較早的篩選期。將單一脂肪酶變體表現性酵母菌菌落挑出並且置入於96槽孔盤中的18 OuL的初級篩選培養基，並於30°C與25 0 rpm生長4-6天以用於初級篩選樣本。 ( 對於次級篩選，將來自初級篩選盤的2〇uL的培養物轉移至於24槽孔盤的lml的種子培養培養基，並於3〇(>c 與25 0 rpm生長過夜。脂肪酶之表現係藉由將2quL的種子培養接種至1 ml於24槽孔盤中的的最佳化培養基並於3 q〇c 與25 0 rpm培養4-6天而達成。對於任何之後的篩選，將單一酵母菌菌落挑出並置入 1ml於24槽孔盤中的種子培養培養基，並於3〇〇c與250 rpm 生長過夜。脂肪酶之表現係藉由將20uL的種子培養物接種入1 ml在24槽孔盤中的最佳化培養基並於3〇Qc與250 222 200829698 24槽孔生長W天而達成。使用經最佳化培養基於在皿中生長亚榣動燒瓶以最大化蛋白質表現水平。篩選程序：於初級篩選中，將5uL加至含有5uL 槽孔盤。將樣本於稀釋劑中稀釋25倍，接著的稀釋劑或胃蛋白酶處理溶液的3料

—在放置於室溫3小時後，將受質加至每個樣本如下：將’、、二月蛋白酶處理的樣本與55uL受質+ 5此稀釋劑混人，將未經處理的樣本肖55uL受質+ 5uL胃蛋㈣_處理㈣胃蛋㈣pH為3·0且並未對在pH的改變補償，活性分析會於兩種不同的PH值進行，因此正常化分析pH 而不具有對脂肪酶之穩定性的纽（藉由於最後當受質之 PH足以提高整體pH至8.〇時加入其，其中胃蛋白酶為非活性的）。每個384槽孔盤獲取〇1)^5讀值6次；早至加入受質—後15分鐘且晚至加人受f後料時且係以(毫 OD )每小k表現。收集落人線性範圍的數據並將經胃蛋白酶處理的樣本之殘餘脂肪酶活性與相對應未經處理的樣本之殘餘脂肪酶活性比較。此於以下以％殘餘活性（％ra) 報導；藉由將經處理條件之比率除以未經處理條件之比率計算並將結果乘以100。可使用包含以下者的系統完成自動化：Biomek FX工作站，其會運行以移動盤並進行移液步驟、DXT 880讀盤機以自分析盤紀錄數據、旋轉器與輸送帶系統以至與自工作站運送盤。此程序接受呈96槽孔盤形式的樣本，於相 223 200829698 同形式進行稀釋，接著使用384槽孔盤於處理與分析步驟。結果：於次級篩選後所測量的對於每個脂肪酶變體的相對殘餘活性係於以下表1 0顯示。此等變體之每一相較於SEQ ID NO : 2之脂肪酶之胺基酸1-269皆具有改善的RA (在胃蛋白酶的存在下於pH 3的穩定性）。表10 :在胃蛋白酶的存在下於pH 3培養後殘餘脂肪酶活性所試驗的酵素殘餘活性（RA)、％ SEQIDNO ： 2 2.3 SEQIDNO ： 1 9.7 LVAR0002b 37 LVAR0003 37 LVAROOlla 58 LVAR0013 56 LVAR0014 80 LVAR0015 70 LVAR0016 37 LVAR0017 62 LVAR0045 33 LVAR0046 61 LVAR0047 45 LVAR0048 39 LVAR0050 45 224 200829698 LVAR0051 40 LVAR0052 58 LVAR0053 44 LVAR0054 30 LVAR0055 66 LVAR0056 37 LVAR0057 71 LVAR0058 42 LVAR0059 36 LVAR0061 63 LVAR0062 31 LVAR0063 59 LVAR0064 33 LVAR0065 40 LVAR0066 34 LVAR0067 32 LVAR0068 57 LVAR0069 45 LVAR0070 52 LVAR0071 60 LVAR0072 52 LVAR0101 95 LVAR0102 76 LVAR0106 86 225 200829698 LVAR230 91 LVAR226 100 LVAR287 96 LVAR288 94 LVAR280 93 LVAR286 91 LVAR214 90 LVAR281 90 LVAR205 89 LVAR215 88 LVAR277 87 LVAR282 87 LVAR209 86 LVAR223 85 LVAR231 84 LVAR204 84 LVAR235 83 LVAR284 83 LVAR225 81 LVAR205 80 LVAR283 80 LVAR219 80 LVAR220 79 226 200829698 LVAR216 79 LVAR290 78 LVAR218 78 LVAR285 78 LVAR208 77 LVAR207 76 LVAR234 75 LVAR828 75 LVAR955 96 LVAR956 85 f 實施例9:在膽鹽的存在下具有改善的活性的脂肪醃變髏為了鑑認在膽鹽的存在下具有改善的活性的脂肪酶變體，開發以下的分析。該分析測量相較於無膽鹽條件下在 2 mM膽鹽的存在下的脂肪酶活性。設立此試驗使得脂肪酶活性係於隨時間監測活性的比率分析中測量以允許偵測到非常高活性與非常低活性脂肪酶。自動化此分析以精確地控制加入試劑之時間並將反應之pH自pH 5.0 (於該情況下脂肪酶在低pH與受質反應）調整至pH 8.0 (允許於 OD 405讀取所釋放的PNP基的pH)。在pH調整發生之後立刻讀盤。用於分析受質與膽鹽的儲存溶液： 1. 10% Triton-XlOO ( w/v ) 2. 100 mM TRIS ^ pH 8.0 227 200829698 3. 100 mM 琥珀酸鹽，pH 5.0 4. 10% ( 680mM) CaCl2*2H2〇 5. 於蒸餾水中的20 mM膽鹽（Sigma B-8756 ) 6. 於 10% Triton-X100 中的 50mM 4-硝苯酚（PNP) 油酸酯用於脂肪酶活性分析的受質：

ImM PNP-油酸酯、1.2%Triton-X100、2mM CaCl2、25mM 琥珀酸鹽，pH 5.0 稀釋劑： 0.01% Triton-X100 > lOmMNaCl 酵素：將經純化的脂肪酶樣本於稀釋劑中稀釋至大約 8 Kg/mL以用於自動化方法。經純化的脂肪酶樣本之濃度係使用消光係數1.24 A280/mg自於280 nm的吸收測定。基於液體的膽鹽分析篩選程序：將酵素樣本於稀釋劑中稀釋25倍與200倍，接著於96 槽孔盤反應盤中將1〇μΙ^加至23 μ!^水或23 pL 20 mM膽鹽。在此之後’加入200 pL的受質（於25 mM琥珀酸鹽、 2 mM CaCl2、1.2°/〇 Triton-XlOO，pH 5.0 的 1 mM PNP 油酸酯）並混合。混合後，立刻移出60 pL並將15 kL移液至四個分開的3 84槽孔盤，其中使用4重複（4 X 96 )以為脂肪酶樣本之2稀釋之每一者設立「+」與「—」膽鹽條件。使用該四個3 84槽孔盤以設立4個時間點（使得每個盤具有脂肪酶之2稀釋每個「+」與「—」膽鹽）。在1、2、3、 228 200829698 與4小時後將60 pL的100 mM TRIS，pH 8.0加至適當的盤與四重複並立刻讀取（〇D 405與OD 540 )。介於〜0·1 與0·475的OD為使用於此分析的線性範圍。於pH 5.0在膽鹽的存在下的活性之比率係呈百分比表現，其係藉由計算「膽鹽」活性對時間與稀釋校正的所有線性數據之平均除以「無膽鹽」活性對時間與稀釋校正的所有線性數據之平均。相對於參考物（SEQ ID NO : 1之變體N33Q)的活性之比率係藉由將變體加或減膽鹽之比率除以參考物加與減膽鹽之比率而計算，且係以改善倍數報導（例如，3 X 意指300%)。表11

變髏相對於參考的膽籮比相較於SEQ ID NO : 2的取代 LVAR714 3X D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163 K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S LVAR828 3X N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L22 7F+T231R+N233R+Q249R LVAR1042 4X G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+ D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+L227G+T2 31R+N233R+P256T LVAR1043 3X D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+ N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+L227G+T23 1R+N233R+P256T 229 200829698

LVAR861 3X G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+ D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T LVAR863 2.5X D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+ N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T LVAR290 3X N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A LVAR277 2X N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+ E210V+D254K+P256A LVAR209 2X L52I+V60E+T114I+V168M+E210D LVAR234 2X D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A +Y13 8F+G163R+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T LVAR208 2X D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+ D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T LVAR230 2X D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+ N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T 實施例ίο :活艘内消化力試驗（篩選試驗）本發明之經挑選經純化的絨毛腐質黴菌脂肪酶變體係在具有誘發性胰臟外分泌不足（Pancreatic Exocrine 230 200829698

Insufficiency’ PEI)的雌性 Gottingen 迷你豬（Ellegaard) 中於脂肪酶篩選試驗研究。變體之胺基酸序列可於表1、7 與8找到。功效係與具有seQ ID NO : 1之胺基酸1-269 的脂肪酶之變體N33Q (變體LV2934 ;表12之參考脂肪酉母）之功效比較。騰臟外分泌不足（Exocrine Insufficiency ，PEI )係於迷你豬中藉由結紮胰管誘發，且其等亦安裝迴盲腸凹插管（ileo-caecal re-entrant cannula )，所有皆於異氟烷（isofluorane )麻醉下並於約 25 kg的體重，如於Tabeling等人之文獻（Tabeling等人 (1999 ) : “Studies on nutrient digestibilities (pre_caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution”，J· Anim. Physiol· A· Anim· Nutr· 82: 251-263 )以及於Gregory等人之文獻（Gregory等人（1999): “Growth and digestion in pancreatic duot ligated pigs，Effect of enzyme supplementation”於 “Biology of the Pancreas in Growing Animals”（ SG Pierzynowski & R. Zabielski eds )， Elsevier Science BV，Amsterdam，pp 381-393 )中戶斤述。允許至少4週自手術恢復的期間，之後開始研究。在研究開始之前，通過糞便胰凝乳蛋白酶試驗（商業上可購自 Immundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4，D-64625 Bensheim，德國，具有目錄編號K 6990 )確認每隻豬的PEI狀態。分析在兩組3隻或4隻PEI迷你豬進行用於脂肪酶活性的篩選試驗。在研究期間’使猪住在經修改的新陳代謝籠並 231 200829698 允許其等自由地獲得水並每天餵食兩次。試驗餐 247.2 g 牛奶；獲自 Fresenius Kabi ( 2077KJ/100g)的 1 x 87g 小袋 Calshake ; 29·9 g 橄欖油；9.88g Methocel (Methocel E5，獲自 Colorcon GmbH );與 0.368g 氧化鉻。 Calshake動含有24.4%脂肪、3.3%乳糖、64.9%碳水化合物 (49%糖）、4.3%蛋白質。

將牛奶與氧化鉻使用Ultratixrax均質化器均質化（9500 rpm，ca· 1分鐘），之後將油混入並再次均質化1 _2分鐘。接著將Calshake混入（以混合器攪拌1-2分鐘）並最後緩緩加入Methocel同時以Ultraturax混合，而接著將整個餐均質化大約 3分鐘。為評估脂肪酶功效，將豬以單一試驗餐（含有5 i 6 脂肪）餵食，於餐中在緊接餵食前將不同量的參考脂肪酶g 或類似量的脂肪酶變體混入。將參考脂肪酶LV2934以O.mmy %、或18 6 酵素蛋白質/餐（分別地對應至5〇〇、5〇〇〇、2〇〇〇〇、與75_ fip U脂肪酶/餐）的量仏+ 士里、、、°予且本發明之脂肪酶變體亦係據叫酵素蛋白質（1.24、4.96、與㈣mg/餐）給予，、 (L'LVS2934比較活體内功效。此研究係根據拉丁方格 I Latin Square )設計進行。在食物標記在迴腸（綠色食糜腸食摩魄it 8 (垆*收 T百人出現後收集迴、小％並將兩小時樣本冷;東在々心在分開的 232 200829698 測定間允許至少一天清洗（washout )。於夜晚在每個試驗前給予低脂肪、液體餐以減小來自非試驗餐的餐含量之干擾的可能性。分析冷凍乾燥經冷凍的迴腸食糜樣本、磨成粉並分析乾物質（dry matter，DM)與脂肪（Naumann & Bassler 1993 ; Die chemische Untersuchung von Futtermitteln,第 3 版， VDLUFA-Yerlag, Darmstadt ( VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und

Forschungsanstalten)。DM係藉由在冷凍乾燥接著於i〇3〇c 培養8小時後秤重而估計；經乾燥樣本之粗脂肪含量係藉由酸水解與汽油醚粹取而測定，其係於ANKOMXT1 5粹取器（其可獲自 Ankom Technology，Macedon，NY，US ; —次能夠進行15個粹取）使用過濾袋技術；將cr2〇3氧化成鉻酸鹽且鉻含量係如Petry與Rapp在zeitung ftir Tierphysiologie( 1970 ) ^ vol. 27^ p. 1 8 1 -1 89. ( Petry & Rapp 1970 ; Z. Tierphysiol. 27 ; 18H89)中所述通過於 365 nm 的消光（分光光度計）計算。消化力值（脂肪吸收之係數（coefficient 〇f fat absorption) ，CFA)係根據以下公式藉由標記方法估計： C7^4(%) = 100 - Ci〇3 於飼料]糜 [% 02(93於迴腸食4 脂肪於飼料1 ·100 233 200829698 結果與結論 CFA結果係於表12顯示。脂肪酶劑量係以毫克酵素蛋白質每餐（mg/餐）顯示。 234 200829698 該贫W (碱举w^彰运餿)vdu^鍥龢谱绽餿W驭僉4-31< 18.61 (mg/餐)磁* 65.48+/- 5.88* 75.47 74.00 72.05 80.91 81.14 83.82 75.50 4.96 (mg/餐)*磁 54.69+/-1.52** 58.47 54.84 57.33 64.87 68.57 73.43 51.45 1.24 (mg/餐)*磁 35.41+/-5.41* 30.02 41.44 37.74 1 37.03 43.7 63.72 34.21 0.124 (mg/餐)**** 17.53+/-4.95*** 27.07 〇 14.56+/- 5.94 85.8+/-3.2 脂肪酶變醴無脂肪酶控制組動物(無PEI) | 參考脂肪酶(L V293句* * * * LVA129 LVA147 LVA238 LVA315 LVA317 LVA319 LVA368 t^^dldt 00SA 硃 00003, ooos , OS : ¥ i-Ktw n did w 寸Γη6(ΝΛΊ 谱狯餿%妹洲^架：** ¥蛛鲽客Η犮龠弒运爿隳單寸孤 * * * (8寸ΓηνΛΊ^Α(ΝονΛΊ ) _蛛鲽客鰣犮龠^客爿隳學㈡偃 ** 8寸£¥>1破/^〇¥>1^^命初10"甽^#客衅^#^客4隳舉9·*

lr)e(N 200829698 包含 LV1330、LV1 855、LV1865、LV1874、LV1889、 LVA043、LVA049、LVA012、LVA023、LVA099、LVA041、 LVA061、LVA103、LV1857、LV1232、與 LVA473 的額外的脂肪酶變體係於相同的筛選試驗中研究。所有所試驗脂肪酶變體在活體内皆為活性的，且造成在CFA的劑量依賴性改善。脂肪酶變體LVA129、LVA147、 LVA238、LVA315、LVA317、LVA319、與 LVA368 相較於參考脂肪酶皆頗改善。實施例11 :完全活«内消化力試驗將經純化的脂肪酶變體LVA319於一組6隻雌性 Gottingen迷你豬（Ellegaard )中於完全消化力研究中試驗。功效已與於餵食相同飲食的PEI迷你豬中試驗的SEQ ID NO : 1之脂肪酶之功效比較。胰臟外分泌不足（Pancreatic Exocrine Insufficiency ，PEI )係於迷你豬中藉由結紮胰管誘發，且其等亦安裝迴盲腸凹插管，所有皆於異氟烷麻醉下並於約 25 kg的體重，如於Tabeling等人之文獻 (Tabeling 等人（1999 ) : “Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution’’，J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr· 82: 251-263 )以及於 Gregory 等人之文獻（Gregory 等人（1999 ) : “Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs，Effect of enzyme supplementation”於 “Biology of the Pancreas in Growing Animals”（SG Pierzynowski & R. 236 200829698

Zabielski eds)，Elsevier Science BV? Amsterdam, pp 393 )，Elsevier Science BV，Amsterdam，pp 381-393 )中所述。允許至少4週自手術恢復的期間，之後開始研究。在研究開始之前，通過糞便胰凝乳蛋白酶試驗（商業上可購自 Immundiagnostik AG，Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim，德國，具有目錄編號K 6990 )確認每隻豬的PEI狀態。分析在研究期間，使豬住在有12 : 12小時光暗週期的畜攔中並允許自由地獲得水並每天餵食兩次。試驗餐在研究期間，將豬每日（08.00、20.00h)以含有以下者的300g的高脂肪「類似人類的」飲食餵食兩次：200 g 雙重磨粉的（double-milled)飲食（得自 Altromin )、加上25 g橄欖油、75g奶油與0.625 g Cr203，混合1公升水 (參見表13)。試驗餐含有31%脂肪、15%蛋白質、36% 澱粉以及維生素、礦物質與微量元素作為豬的營養需求。 237 200829698 表13 :實驗性「類似人類的」飲食之組成飲食组成成分含量（g/kg濕重）禽肉粉 73 5宛丑粉 73 酪蛋白（於酸條件下沈澱） 73 小麥麵粉 290 馬鈴薯澱粉 290 豬油 125 維生素、礦物質、微量元素 76 將以下加入200g的以上混合物：奶油（32%脂肪） 75 g 橄欖油 25 g 氧化鉻 0.625 g 水 1000 ml

緊接餵食豬之前，將奶油、橄欖油接著自來水與最後為不同量/不同的酵素補充物混合入預先秤重的乾口糧（包含氧化鉻標記）。進行為評估脂肪酶功效，將豬餵以兩個300 g試驗餐/天，且於緊鄰餵食之前將不同量的兩種脂肪酶之一或另一者混入該餐中。所投藥的每種脂肪酶之量於表1 5中係於括弧中顯示，即呈微生物FIP U脂肪酶/餐（脂肪酶FIP單位，參見實施例1 )的活性。將每種酵素劑量餵食14天：將豬 238 200829698 以高脂肪飲食加上每種新的酵素劑量飯食9天，之後接下來的5天之㈣收#所有排泄物’秤重並儲存於_2〇〇c直到分析。分析將來自每隻緒的冷束排泄物冷康乾燥、再次种重並磨成粉。接著將5天磨成粉的樣本之每—者之分裝（根據每曰排泄產ϊ )倒在一起並混合在一起；即對每個酵之劑量 f^對每隻豬得到一混合樣本。從每個混合樣本測定乾物質與粗脂肪之含量（Naumann & Bassler 1993; Die chemische

Untersuchimg von Fimermitteln，第 3 版，VDLUFA_Verlag，

Darmstadt (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und F〇rschmigSanstalten )。乾物質係藉由在冷凍乾燥接著於 l〇3°C培養8小時後秤重而估計；經乾燥樣本之粗脂肪含里係猎由酸水解與A油驗粹取而測定’其係於ANKOMXT1 5 I 粹取器使用過濾袋技術：將Cr203氧化成鉻酸鹽且鉻含量係如 Petry 與 Rapp 在26^11叩仞1*丁16印1^31〇1〇§^( 1970 )，¥〇1· 27, ρ. 181-189. ( Petry & Rapp 1970; Z. Tierphysiol. 27; 181-18 9)中所述通過於365 nm的消光（分光光度計）計算。消化力值（脂肪吸收之係數，CFA )係根據以下公式藉由標記方法估計： CFA( %) - 100 - [_%.ChQi於飼料.%脂肪於於# 泄t [%Cr203於排泄物·％脂肪於飼料] 239 200829698 結果與結論根據於表1 4中的結果，很明顯的脂肪酶變體LVA3 1 9 比參考SEQ ID NO : 1之脂肪酶表現更佳。本發明的脂肪酶於脂肪消化力造成非常強且劑量依賴性改善，其在最低所試驗劑量已顯示高度有效的改善。表14 :酵素補充物對CFA (脂肪吸收之係數）之影響酵素補充物 0 低度中度高度無補充物 21.7±4.5 參考脂肪酶 46.3+/-4.9 59.2 +/- 7.0 75.6+/-4.7 (SEQ ID ΝΟ:1) (40101 FIP U) (155743 FIP U) (1168069 FIP U) 脂肪酶變體 59.2+/-4.4 72.0 +/- 4.3 81.4.+/- 1.3 LVA319 (9538 FIP U) (38150 FIP U) (114450 FIP U) 實施例12:醫築组成物藥丸製備經純化脂肪酶變體LVA129 (於實施例10中所活體内試驗）之液體脂肪酶濃縮物。液體濃縮物係藉由常見的方法乾燥，並測量經乾燥粉末之脂肪酶蛋白質含量且其較佳地應高於50%。接著，將500g經乾燥脂肪酶粉末於商業上可獲得的混合器與200 g微晶纖維素及300g聚乙二醇4000 ( MacrogolTM 4000 )乾燥預混合。加入足夠量的一般使用的濕潤劑並將所得濕物質於室溫完全地混合。接著將經均質化物質於安裝有具有0.8mm孔徑的穿孔模的商業上可獲得的擠製機擠製以形成圓柱狀藥丸。藉由加入必須 240 200829698 量的-般使：的濕潤劑使用商業上可獲 (Spher°nizer)使所製造的擠出物變圓成球狀藥丸。將藥丸於商業上可獲得的直空乾_機 ' …工祀诛铖中在大約40oC的製造溫度乾燥。接著將經乾燥華太蕪由札缽条凡糟由使用具有0·7與l 4mm篩 :的物理篩選機器而分開。收集”.7mm與$ 14 _的篩廷部分亚充入20〇mg藥丸之部分，各於大小2的膠囊。

藉由施用於實施例1所述的脂肪酶pH-stat分析試驗所得藥丸的解脂活性。根據 Pharm· Eur· 2·9·1· ( “Disintegration of tablets and capsules”章節）試驗所得藥丸的崩解（試驗溶液：〇1 M 丙二酸，pH 6.0 - 500mL，37 °C)。【圖式簡單說明】無【主要元件符號說明】益 241

Claims

200829698 十、申請專利範圍： l 一種測定脂肪酶相較於參考脂肪酶的試管内消化表現的方法，該方法包含以下步驟： a)挑選參考脂肪酶； b )刀別地，將丨〇〇份每體積的飲食與份每體積的胃蛋白酶以及3G份每體積的脂肪酶或參考脂肪酶混合； )力入i) 0或ii) 1〇份每體積的緩衝液（〇8mmeS、〇_8M醋酸鈉、〇·8Μ咪唾，pH 7 〇)，其中步驟丨）可稱為 pH 3的月的步驟，且步驟Η )可稱為pH 5的胃的步驟； d) 伴隨榣動於37°C培養1小時； e) 加入20份每體積的膽鹽，以及丨）25或丨丨）μ份每體積的緩衝液（0.8M MES、0.8M醋酸鈉、〇·8Μ咪唑， pH 7_0 ) ’其中步驟丨）對應於pH 3的胃的步驟，且步驟η ) 對應於pH 5的胃的步驟； f) 伴隨攪動於37°C培養2小時； g) 加入50份每體積的在1M磷酸中的10% Triton-X100 ； h )決定自由脂肪酸的量； 1 )將劑量反應曲線擬合至以下方程式： FFA = FFAmax * [E] / ( [E] + K) 其中FFA係所釋放的自由脂肪酸的量，FFAmax係脂肪_可自飲食释放的自由脂肪酸的最大量，[E]係脂肪酶濃度’且K係釋放Amax的^一半的脂肪:派度，以及 j )如下計算改善係數（improvement factor，IF )： 242 200829698 IF = K (ref) /κ (脂肪酶），其中K ( ref)係釋放FFAmax的一半的參考脂肪酶之濃度而K (脂肪酶）係釋放FFAmax的一半的脂肪酶濃度。 2. —種測定脂肪酶相較於參考脂肪酶的試管内消化表現的方法，該方法包含以下步驟·· a)決定在胃蛋白酶存在下於pH3的穩定性，其藉由： i)挑選參考脂肪酶； π)分別地’將5份每體積的脂肪酶或參考脂肪酶與$ 份每體積的以下者混合 a)含有 0·01% 丁rit〇n-Xl〇0 與 10mM NaC1 的稀釋劑，或 b )含有 15〇Ug/mL 胃蛋白酶、4ηιΜ[ CaCl2、0.01% Tm〇n-Xl〇〇、與5〇mM檸檬酸鹽，pH 3 〇的胃蛋白酶處理溶液，其中a)稱為未經處理的樣本，而b)稱為經胃蛋白酶處理的樣本；出）於20〇C培養步驟π)之樣本3小時； iv)將55份每體積的含有MM PNP-棕櫚酸酯、 1.2/〇Triton-Xl〇〇、4mM CaCl2、l〇〇mM TRIS，pH 8.0 的受貝，與以下者一起加至步驟ni )之每個樣本 a ) 5份母體積的胃蛋白酶_處理溶液，或 b ) 5份每體積的稀釋劑其中a)稱為未經處理的樣本，而b)稱為經胃蛋白酶處理的樣本； 243 200829698 V)降解受質後接著於間隔日夺間讀取iv)之樣本之 OD4〇5， w)自V)收集落人線性範圍的數據並（分別地）為經胃蛋白酶處理的樣本與未經處理的樣本以m〇D (毫〇d (milli OD))每小時計算脂肪酶活性，； VH)計算％殘餘脂肪酶活性（％ Residual Lipase Activity，％RA)，其藉由將來自步驟w)的經胃蛋白酶

處理的樣本之脂肪酶活性除以未經處理的樣本之脂肪酶活性，並將結果乘以100 ;且（若需要） Πχ)比較脂肪酶之％11八與參考脂肪酶2%RA; 及/或 b )在膽鹽存在下決定於pH 5的活性，其藉由 i)挑選參考脂肪酶； )將1 0伤每體積的脂肪酶或參考脂肪酶（分別地）與23份每體積的a)水、或b) 20 mM膽鹽混合，其中a 私為未經處理的樣本，而b )稱為膽鹽樣本；將200仞每體積含有於25 mM琥珀酸鹽、2瓜％ ⑽2、i2% Triton_xl〇〇 ’ pH 5 〇中的i祕清油酸醋的受質，加至Π)之每個樣本，並混合；份四 —lv)於步驟iii)後，立即（自每個樣本）移每體積的所得混合物並轉移四次15 #每體積的個分開的隔間； τ 、、3、兵4小時後，將60份每體積的100 mM TRIS，pH 8·〇加至iv)之四個隔間之個別的隔間，立刻讀 244 200829698 取OD405，並（基於1、2、3、與4小時讀值之線性範圍）以mOD/小時計算活性； vi )為脂肪酶以及參考脂肪酶，將（於步驟v )中獲得的）膽鹽樣本之活性除以未經處理的樣本之活性（其亦於步驟v)中獲得）以達到脂肪酶與參考脂肪酶之膽鹽穩定性比率（分別地）；並 vii )將脂肪酶之膽鹽穩定性比率除以參考脂肪酶之膽鹽穩定性比率，其所得比率可定義為脂肪酶之改善係數。 3. —種用作為醫藥品的脂肪酶，其中該脂肪酶 (a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269之序列具有至少50%的相同性； (b )具有脂肪酶活性；且其 (c)與SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269之序列相比，包含取代N33Q、T231R、與N233R，以及至少一個選自以下者的附加的取代： E1*，D，N ; Q4H，P，R ; D5E ; N8L，Q ; Q9H ; F10L ; N11C，D，H，L，P，Q，R，S ; G23E ; N26A，H，I ; D27I，N，Q，R，S，V ; P29T ； A30T，V ； T37K，M ； G38A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y ; N39H，S ; E43K ; K46M ; A49T ; L52I，R ; E56K，Q，R，S ; D57G，N ; V60E，S ; G61R; V63R; A68V; L69I; N71I，S ; N73Q，Y; I76T; R84E ; I86F，L ； E87A，H，K，R ； I90L，V ； G91A，C，E，F，K，L，M，N，S，T，V，W，Y ; L93*，F ; N94*，K，Q，R，S ; F95* ; D96*，E，G，N，R，S，W，Y ; L97M，Q ; K98I，T ; E99D ; 245 200829698 N101Q; D102E，G，Y; R108M; G109A; D111A，E，N，S; G112A ; T114I ； S115L ； W117C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y ; D122E?N； Q126L； VI28 A； D130H ； H13 5D ； P136H ； Y13 8F ； V141E，L ; A150V ; V154F，I，L ; A155V ; G15 6R ; G161A，E ; N162G，S，T ; G163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y ; D167E ; V168M ; V176A，D，F，G，H，I，K，M，N，Q，T，W ; G177A ; R179T ; L185M ; G190C，D ; N200Q，S ; R205I ; L206F ; E210D，R，V，Y ; S216P ; E219D ; G225P ; T226N ; L227F，G ; P229R ； E239D ； G240L ； D242E ； T244S ； G246A ； Q249R ； N251Q，S ; D254A，G，I，K，L，M，N，R，Q，S，Y ; I255A，F ; P256A，F，G，H，I，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y;與 L269F，H。 4·根據申請專利範圍第3項的脂肪酶，其相較於具有以下取代的SEQ ID NO : 2之序列的參考脂肪酶具有改善的試管内消化表現：N33Q + T231R+N233R。 5 ·根據申請專利範圍第4項的脂肪酶，其中試管内消化表現係使用申請專利範圍第1或2項的方法決定。 6.根據申請專利範圍第3-5項中任一項的脂肪酶，其包含選自以下者的取代之組： D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T ； N33Q+E210D+T231R+N233R ； N33Q+D111A+T231R+N233R ； N33Q+G91T+T231R+N233R ； N33Q+E219D+T231R+N233R ； N33Q+W117L+T231R+N233R ； 246 200829698 D27Q+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+G91T+T231R+N233R ； D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； Q4R+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D96W+T231R+N233R ； D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R ； D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R ； Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R ； N33Q+D111E+T231R+N233R ; N33Q+D122E+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； N33Q+D167E+T231R+N233R ； N33Q+G91N+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91 A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+ P256T ； N11R+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+N39H+T231R+N233R ； N33Q+P229R+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R + P256T ； 247 200829698 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T ； N33Q+E87A+T231R+N233R ； N33Q+E56Q+T231R+N233R ； N33Q+E210V+T231R+N233R ； N33Q+E56K+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254G ； N33Q+D96S+T231R+N233R ； N33Q+D122N+T231R+N233R ； N26A+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+N162T+T231R+N233R ； N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R ； N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+G240L ； D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T ； D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T ； N33Q+N200S+T231R+N233R ； N33Q+N39S+T231R+N233R ； N33Q+E210R+T231R+N233R ； N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R ； N33Q+T231R+N233R+D254R ； N33Q+N94R+T231R+N233R ； 248 200829698 N33Q+D96R+T231R+N233R ； D27N+N33Q+T231R+N233R ； D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R ； N33Q+L227F+T231R+N233R ； N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R ； N33Q+G225P+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254S ； N33Q+D96G+T231R+N233R ； N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S ； N33Q+T231R+N233R+D254G ； N33Q+D130H+T231R+N233R ； N33Q+E87A+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+E239D ； N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G ； N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R ； Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； 249 200829698 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G177A+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+G246A ； D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R ； N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R ； f 1 K98I+T231R+N233R+N251S ; N33Q+G163R+T231R+N233R ； N33Q+G163N+T231R+N233R ； N33Q+G163C+T231R+N233R ； N33Q+G163Q+T231R+N233R ； N33Q+G163E+T231R+N233R ； N33Q+G163H+T231R+N233R ； f N33Q+G163I+T231R+N233R ; N33Q+G163P+T231R+N233R ； N33Q+G163D+T231R+N233R ； N33Q+G91K+T231R+N233R ； N33Q+G91M+T231R+N233R ； N33Q+G91F+T231R+N233R ； N33Q+G91S+T231R+N233R ； N33Q+G91W+T231R+N233R ； N33Q+G91Y+T231R+N233R ； 250 200829698 N33Q+G163T+T231R+N233R ； N33Q+G163W+T231R+N233R ； N33Q+G163Y+T231R+N233R ； N33Q+G163V+T231R+N233R ； N33Q+G91C+T231R+N233R ； N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R ； N33Q+G91M+G161E+T231R+N233R ； N33Q+V128A+T231R+N233R ； N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R ； N33Q+G38A+T231R+N233R ； N33Q+G163A+T231R+N233R ； N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R ； N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R ； N33Q+G163M+T231R+N233R ； N33Q+G91V+T231R+N233R ； N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T ； N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+N94R+D111 A+Wl 17L+T231R+N233R ； N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S ； N33Q+T231R+N233R+P256T ； N33Q+T231R+N233R+D242E ； 251 200829698 N33Q+E87R+T231R+N233R ； N33Q+E56R+T231R+N233R ； N33Q+N162G+T231R+N233R ； N33Q+G91L+T231R+N233R ； N33Q+E87H+T231R+N233R ； N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S ； N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T ； N33Q+G163A+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T ； N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R ; N33Q+T231R+N233R+D254A ； N33Q+T231R+N233R+D254N ； N33Q+T231R+N233R+D254Q ； N33Q+T231R+N233R+D254I ； N33Q+T231R+N233R+D254L ； N33Q+T231R+N233R+D254K ； N33Q+T231R+N233R+D254M ； N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R ； D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R ； 252 200829698 N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R ； D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+ N233R+D254S+P256T ； D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+ P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+ P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+L227G+T231R+N233R+ D254S+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+ P256T ； N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S ； N33Q+D111 A+Wl 17L+T231R+N233R+D254S ； 253 200829698 N33Q+T231R+N233R+P256A ； N33Q+T231R+N233R+P256N ； N33Q+T231R+N233R+P256G ； N33Q+T231R+N233R+P256H ； N33Q+T231R+N233R+P256L ； N33Q+T231R+N233R+P256M ； N33Q+T231R+N233R+P256S ； N33Q+T231R+N233R+P256W ； N33Q+T231R+N233R+P256Y ； N33Q+T231R+N233R+P256F ； N33Q+T231R+N233R+P256V ； N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R ； N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R ； N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R ； N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R ； N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R ； N33Q+V176N+T231R+N233R ； N33Q+V176D+T231R+N233R ； N33Q+W117F+T231R+N233R ； N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S ； N33Q+V176I+T231R+N233R ； N33Q+D111N+T231R+N233R ； N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R ； N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R ； 254 200829698 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R ； N33Q+G91M+G163P+T231R+N233R ； N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R ； N33Q+W117D+T231R+N233R ； N33Q+W117H+T231R+N233R ； N33Q+W117C+T231R+N233R ； N33Q+W117K+T231R+N233R ； N33Q+W117V+T231R+N233R ； / ' N11S+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+W117E+V176K+T231R+N233R ； N33Q+W117G+T231R+N233R ； N33Q+W117P+T231R+N233R ； N33Q+W117S+T231R+N233R ； N33Q+W117T+T231R+N233R ； N33Q+W117I+T231R+N233R ； ( D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S ； N33Q+S115L+T231R+N233R ； N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+V176M+T231R+N233R ； N33Q+V176H+T231R+N233R ； N33Q+V176A+T231R+N233R ； D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+W117Y+T231R+N233R ； N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R ； 255 200829698 D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R ； D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+ D254S ； 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； N11R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I ； N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R ； N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+ L227G+T231R+N233R+D254S+P256T ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S ； 262 200829698 El *+Nl 1R+N33Q+G38A+G91N+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+ D254S ； E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R ； E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S ； E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R ； E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S ； E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+ P256Q ； E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+ D254S ； N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I ； N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+T231R+N233R ； N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176I+T231R+N233R ； N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+ P256T ； N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T ； E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S ； N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+ D254S+P256T ； N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F+ 263 200829698 L269F ； N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F ； N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ; N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+ Γ P256T ； N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256L ； N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S ； / N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S ； N33Q+E87K+T231R+N233R ； N33Q+N94K+T231R+N233R ； N33Q+D96Y+T231R+N233R ； N33Q+K98I+T231R+N233R ； A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R ； N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R ； N26I+N33Q+T231R+N233R ； A30T+N33Q+T231R+N233R ； 264 200829698 N33Q+G91V+T231R+N233R ； N33Q+G91A+T231R+N233R ； N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R ； N33Q+K98I+T231R+N233R ； N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R ； P29T+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+G91V+T231R+N233R ； N33Q+K98I+T231R+N233R ； N33Q+G91E+T231R+N233R ; N33Q+N94K+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V168M+E210D+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； 265 200829698 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+T231R+ N233R+P256T+L269H ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+R179T+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ; N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+ P256A ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S ； 266 200829698 N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R ； N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A ； D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R ； D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R ； N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R ； N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T ； D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+ P256T ； N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A ； N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R ； G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L ； N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L ； G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ;與 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T 〇 7.根據申請專利範圍第3-5項中任一項的脂肪酶，其結合蛋白酶或澱粉酶，以用作為醫藥品。 267 200829698 8.根據申請專利範圍第3_5項中任一項的脂肪酶，直結合蛋白酶與澱粉酶，以用作為醫藥品。八 9 ·根據申清專利笳a & 号〜耗圍弟3-5項中任一項的脂肪酶，其結合蛋白酶及/或激粉酿，、 ,„ .. . & X 1¾ % ’以用作為醫藥品，其中以下者所組成的群組的蛋白酶 (i)該蛋白酶與選自由具有至少70%的相同性 a) 具有SEQ ID N〇 : 3之胺基酸1-274之序列的蛋白酶， 4之胺基酸1-188之序列的蛋白 b) 具有 SEQ ID N〇 : 酶，以及之胺基酸1 -1 8 8之序列的蛋白 c) 具有 SEQ ID NO : 酶； (ii )該殿粉酶與選ό + ιν π 土 ^ 、、自由以下者所組成的群組的殿粉酶具有至少70%的相同性酶 0具有_ ID Ν〇: 6之胺基酸1-·之序列的殿粉 b )具有SEQ ID NO · 7夕脫|， 7之胺基®文1 -481之序列的澱粉酶，以及酶 c)具有 SEQ ID NO 之胺基酸1-483之序列的殿粉豆：如申請專利範圍第3-5中任-項所定義的脂肪酶，膜臟炎，、，、於治療消化性失調症、胰臟外分泌不足_ 囊腫^纖維化、第1型糖尿病、及/或第II型糖尿病。 .根據申請專利範圍第10項的脂肪酶，其結合蛋白 268 200829698 酶或殿粉酶。 12·根據申請專利範圍第10項的脂肪酶，其結合蛋白酉母與殿粉酶。 1 3 ·根據申請專利範圍第1 〇項的脂肪酶，其結合蛋白酶及/或澱粉酶，其中該蛋白酶及/或澱粉酶係如申請專利範圍第9項所定義。 14 · 一種脂肪酶，其 (a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269之序列具有至 )5 0 %的相同性； (b )具有脂肪酶活性；且其， (c )與SEQ ID NO : 2之胺基酸1_269之序列相比，於至少一個選自以下者的位置包含取代：9、30、38、39、 63、112、114、115、117、122、128、130、136、154、155、 156 、 161 、 163 、 168 、 185 、 190 、 239 、與 246 。 1 5 · —種脂肪酶，其 (a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269之序列具有至少5 0 %的相同性； (b )具有脂肪酶活性；且其， (c)與SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269之序列相比，包含至少一個選自以下者的取代：E1N; q4H; N8l，q; Q9H ; N11C，D，H，L，P，S ; G23E ; D27I ; P29T ; A30T，V ; T37K，M ; G38A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y ; N39H，S ; D57N ; G61R ; V63R ; N71I，S ; N73Q，Y ; I76T ; I86F，L ; E87H ; G91F，K，L，M，V，Y ; N94Q ; F95* ; D96* ; N101Q ; D111E ; 269 200829698 G112A; T114I; S115L; W117C，D，E，F,G，H，I，K，L，P，S，T，V，Y ; D122E，N ; Q126L ; V128A，D130H, H135D，P136H ; V141E，L; V154F，I，L; A155V; G156R; G161A，E; N162G，S ; G163A，C，D，E，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y ; V168M ； L185M ； G190C，D ; R205I ； G240L ； G246A ； N251Q，S ; 與 L269F，H。 1 6 · —種腊肪酶，其 (a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269之序列具有至少5 0%的相同性；且 (b )具有脂肪酶活性；且其， (c)與SEQ ID NO : 2之胺基酸1-269之序列相比，包含選自以下者的取代之組： D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T ； N33Q+E210D+T231R+N233R ； N33Q+D111A+T231R+N233R ； N33Q+G91T+T231R+N233R ； N33Q+E219D+T231R+N233R ； N33Q+W117L+T231R+N233R ； D27Q+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+G91T+T231R+N233R ； D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T 270 200829698 Q4R+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D96W+T231R+N233R ； D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R ； D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R ； Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R ； N33Q+D111E+T231R+N233R ； N33Q+D122E+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； N33Q+D167E+T231R+N233R ； N33Q+G91N+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+ P256T ； N11R+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+N39H+T231R+N233R ； N33Q+P229R+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R + P256T ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T ； N33Q+E87A+T231R+N233R ； 271 200829698 N33Q+E56Q+T231R+N233R ； N33Q+E210V+T231R+N233R ； N33Q+E56K+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254G ； N33Q+D96S+T231R+N233R ； N33Q+D122N+T231R+N233R ； N26A+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+N162T+T231R+N233R ； f 、 N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R ； N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+G240L ； D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T ； D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T ； N33Q+N200S+T231R+N233R ； N33Q+N39S+T231R+N233R ； N33Q+E210R+T231R+N233R ； ί N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R ； N33Q+T231R+N233R+D254R ； N33Q+N94R+T231R+N233R ； N33Q+D96R+T231R+N233R ； D27N+N33Q+T231R+N233R ； D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R ； N33Q+L227F+T231R+N233R ； N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R ； 272 200829698 N33Q+G225P+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+D254S ； N33Q+D96G+T231R+N233R ； N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S ； N33Q+T231R+N233R+D254G ； N33Q+D130H+T231R+N233R ； N33Q+E87A+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+E239D ； N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G ； N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G ； N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R ； Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G177A+T231R+N233R ； N33Q+T231R+N233R+G246A ； 273 200829698 D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S ； D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R ； N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R ； K98I+T231R+N233R+N251S ； N33Q+G163R+T231R+N233R ； N33Q+G163N+T231R+N233R ； N33Q+G163C+T231R+N233R ； N33Q+G163Q+T231R+N233R ； N33Q+G163E+T231R+N233R ； N33Q+G163H+T231R+N233R ； N33Q+G163I+T231R+N233R ； N33Q+G163P+T231R+N233R ； N33Q+G163D+T231R+N233R ； N33Q+G91K+T231R+N233R ； N33Q+G91M+T231R+N233R ； N33Q+G91F+T231R+N233R ； N33Q+G91S+T231R+N233R ； N33Q+G91W+T231R+N233R ； N33Q+G91Y+T231R+N233R ； N33Q+G163T+T231R+N233R ； N33Q+G163W+T231R+N233R ； N33Q+G163Y+T231R+N233R ； N33Q+G163V+T231R+N233R ； N33Q+G91C+T231R+N233R ； 274 200829698 N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R ； N33Q+G91M+G161E+T231R+N233R ； N33Q+V128A+T231R+N233R ； N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R ； N33Q+G38A+T231R+N233R ； N33Q+G163A+T231R+N233R ； N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R ； N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R ； f N33Q+G163M+T231R+N233R ； N33Q+G91V+T231R+N233R ； N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R ； N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T ； D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T ； N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S ；翁 N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R ； \ N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S ； N33Q+T231R+N233R+P256T ； N33Q+T231R+N233R+D242E ； N33Q+E87R+T231R+N233R ； 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P29T+N33Q+T231R+N233R ； N33Q+G91V+T231R+N233R ； N33Q+K98I+T231R+N233R ； N33Q+G91E+T231R+N233R ； N33Q+N94K+T231R+N233R ； D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V168M+E210D+ S216P+L227G+T231R+N233R+P256T ； Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； 289 200829698 D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+ P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+T231R+ N233R+P256T+L269H ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+R179T+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T ； D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+ T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+ P256A ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S ； N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R ； N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A ； 290 200829698 D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R ； D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R ； N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R ； N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T ； D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+ P256T ； N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A ； N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R ； G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ； N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S ； N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L ； N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L ； G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+V141E+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T ;與 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111 A+Tl 14I+S216P+ L227G+T231R+N233R+P256T。 17. —種如申請專利範圍第3-6中任一項所定義的脂肪酶或脂肪酶之混合物的用途，其係用於製造用於治療消化性失調症、胰臟外分泌不足、胰臟炎、囊腫性纖維化、第I型糖尿病、及/或第II型糖尿病的醫藥品。 291 200829698 1 8 ·根據申請專利範圍第丨7項的用迷，其包含進一步利用蛋白酶或澱粉酶。 19 ·根據申請專利範圍第17項的用途，其進一步包含利用蛋白酶與澱粉酶。 2〇 ·根據申請專利範圍第i 8或i 9項的用途，其中該蛋白酶及/或澱粉酶係如申請專利範圍第9項所定義。

21 · —種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第3 - 6 中任一項所定義的脂肪酶或脂肪酶之混合物，以及至少一種醫藥上可接受的辅助性物質。 22·根據申請專利範圍第21項的組成物’其進一步包含蛋白酶或澱粉酶。 23 ·根據申請專利範圍第21項的組成物，其進一步包含蛋白酶與澱粉酶。 24.根據申請專利範圍第22或23項的組成物，其中忒蛋白酶及/或澱粉酶係如申請專利範圍第9項所定義。 25·根據申請專利範圍第21項的組成物，其中該組成物係用於治療消化性失調症、胰臟外分泌不足、胰臟炎、囊腫性纖維化、第I型糖尿病、及/或第π型糖尿病的方法。 26·根據申請專利範圍第25項的組成物，其進一步包含治療有效量的蛋白酶或澱粉酶。、27.根據申請專利範圍第25項的組成物，其進—牛包含治療有效量的蛋白酶與澱粉酶。 ^ ^ ，其中義0 該蛋白酶及/或澱粉酶係如申請專利範圍第$太 292 200829698 29. —種用作為醫藥品的脂肪酶，其中該脂肪酶係一親本脂肪酶之變體，而該變體 (a)與SEQ ID NO: 2之胺基酸1至269具有至少50% 的相同性；且 (b )具有脂肪酶活性；且 (c)包含至少一個選自以下者的取代：N26I、D27Q、 D27R、D27Y、P29T、A30T、A30V、T32I、N33Q、N33T、 N33Y、P42L、E43D、E43K、E43M、E43V、A49T、E56A、 E56C、E56K、E56R、E56S、D57A、D57G、D57N、V60L、 L69I、E87K、G91A、G91E、G91N、G91R、G91S、G91T、 G91 V、G91W、L93F、N94K、N94R、N94S、D96E、D96G、 D96L、D96N、D96S、D96V、D96W、D96Y、L97M、L97Q、 K9 8I、E99D、E99K、E99P、E99S、E99T、D111A、D111S、 T114I、L147S、G163K、E210D、S216P、L227G、T231R、 N23 3R、D23 4K、E239V、Q249R、N251S、D254N、P256T、 G263Q、L264A、I265T、G266D、T267A、與 L269N，其中每個位置對應於SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269之位置；且 (d )其前提為該變體非 (i) 具有SEQ ID NO : 1之胺基酸1-269的脂肪酶，且非 (ii) (〇之脂肪酶之變體N33Q。 3 0. —種用作為醫藥品的脂肪酶，其中該脂肪酶係一親本脂肪酶之變體，而該變體 293 200829698 (a)與SEQ ID NO ·· 2之胺基酸1至269具有至少50% 的相同性；且 (b )具有脂肪酶活性；且 (c)於位置30、42、114、及/或 163之至少一者包含至少一個取代，其中每個位置對應於SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269之位置。 3 1. —種用作為醫藥品的脂肪酶，其中該脂肪酶係一親本脂肪酶之變體，而該變體 (a)與SEQ ID NO: 2之胺基酸1至269具有至少50% 的相同性；且 (b )具有脂肪酶活性；且 (c )包含至少一個選自以下取代的取代：A30T、 A3 0V、P42L、ΤΙ 141、與G163K，其中每個位置對應於SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269之位置。 3 2. —種用作為醫藥品的脂肪酶，其中該脂肪酶係一親本脂肪酶之變體，而該變體 (a)與SEQ ID NO : 2之胺基酸1至269具有至少50% 的相同性；且 (b )具有脂肪酶活性；且 (c )係選自以下者的變體： LV1232 G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+ L269N ； LV1330 N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R ； LV1855 D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T ； 294 200829698 LV1857 D27R+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T ； LV1865 D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T ； LV1874 D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T ； LV1889 D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T ； LVA049 N33Q+G163K+T231R+N233R ； LVAR0002b T32I+G91V+T231R+N233R ； LVAR0003 K98I+T231R+N233R ； LVAROOlla G91A+T231R+N233R ； M LVAR0013 G91V+T231R+N233R ； LVAR0014 N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R ； LVAR0015 P42L+D57N+G91E+T231R+N233R ； LVAR0016 K98I+T231R+N233R ； LVAR0017 V60L+G91V+T231R+N233R ； LVAR0032 D57G+L93F+T231R+N233R ； LVAR0045 A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R ； LVAR0046 LVAR0047 E99T+T114I+D254N+T231R+N233R ； D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R ； LVAR0048 E43K+E56S+E87K+T231R+N233R ； LVAR0050 E56S+E87K+D96L+E99D+T231R+N233R ； LVAR0051 E56A+D57A+T114I+T231R+N233R ； LVAR0052 G91E+T231R+N233R ； LVAR0053 E56K+D96G+D111A+T231R+N233R ； LVAR0054 E87K+D111S+T231R+N233R ； LVAR0055 E43V+G91R+T231R+N233R ； 295 200829698 LVAR0056 E56S+E87K+T231R+N233R ； LVAR0057 E87K+G91E+T231R+N233R ； LVAR0058 D27Y+E87K+T231R+N233R ； LVAR0059 E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R ； LVAR0061 E56K+E87K+D111A+T231R+N233R ； LVAR0062 E87K+E99P+T231R+N233R ； LVAR0063 E87K+D96L+E99P+T231R+N233R ； LVAR0064 E56C+E87K+T231R+N233R ； C LVAR0065 E56R+E87K+D96L+T231R+N233R ； LVAR0066 E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R ； LVAR0067 E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R ； LVAR0068 E87K+L147S+T231R+N233R ； LVAR0069 D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R ； LVAR0070 E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R ； LVAR0071 E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R ； LVAR0072 \ D96V+D111A+T231R+N233R ;與 LVAR0078 N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R 〇十一、圖式：如次頁 296