KR20090101930A

KR20090101930A - 약학적 사용을 위한 리파아제 변형체

Info

Publication number: KR20090101930A
Application number: KR1020097014850A
Authority: KR
Inventors: 알란 스벤드센; 마이클 스쾨트; 데비 야버; 라스 레만 힐링 크리스텐슨; 시그네 에스킬드센 라르센; 니나 런딘; 마이클 람사; 피터 콜린 그레고리
Original assignee: 노보자임스 에이/에스; 노보자임스 인코포레이티드; 솔베이 파머슈티컬스 게엠베하
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2007-12-12
Publication date: 2009-09-29
Also published as: EP2455461B1; IL198893A0; EP2455459B1; US20150209414A1; US8273348B2; WO2008079685A2; CN105112386A; US20120308543A1; WO2008079685A3; CN101743308B; CA3081308A1; MX2009006597A; JP5406040B2; US20100034797A1; BRPI0721103A2; AR064494A1; CA2670643C; EP2455462A3; EP2455459A2; EP2455462A2

Abstract

리파아제의 약학적 사용은 선택적으로 프로테아제 및/또는 아밀라아제와 조합하여 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 포함하는 써모마이세스 라누기노서스(후미콜라 라누기노사) 리파아제와 관련된다. 의학적 징후의 예는 소화장애, 췌장 외분비 기능부전 (PEI), 췌장염, 낭포성 섬유증, I형 당뇨병, 및/또는 II형 당뇨병의 치료이다. 본 발명의 리파아제는, 예를 들어, 생체 밖에서 개선된 소화 성능, 중성 범위의 pH에서 개선된 활성, 낮은 pH에서 개선된 활성을 가지며, 프로테아제-분해에 대해 안정하고 및/또는 펩신 및 담즙산염의 존재하에 안정하다. 본 발명은 또한 리파아제의 생체 밖 소화 성능을 결정하고 T. 라누기노서스의 리파아제의 신규 변형체를 확인하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

약학적 사용을 위한 리파아제 변형체{LIPASE VARIANTS FOR PHARMACEUTICAL USE}

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 컴퓨터 판독가능한 형태로 서열 목록을 함유한다. 컴퓨터 판독가능한 형태는 참고로써 본원에 포함된다.

기술분야

본 발명은 리파아제가 (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 서열에 적어도 50% 동일성을 가지며; (b) 리파아제 활성을 가지고; (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 269의 아미노산과 비교하여 치환 N33Q, T231R, 및 N233R 및 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 치환을 포함하는 약제로서 사용을 위한 리파아제에 관한 것이다:

본 발명은 또한 이들 리파아제를 포함하는 약학 조성물 뿐 아니라 일부의 이러한 이들 리파아제에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 리파아제의 생체 밖 소화 성능을 결정하고 선택적으로 비교하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 리파아제는 프로테아제 및/또는 아밀라아제와 조합에 사용될 수 있다. 의학적 표시의 예는: 소화 장애, 췌장 외분비 기능부전(PEI), 췌장염, 낭포성 섬유증, I형 당뇨병 및/또는 II형 당뇨병의 치료이다.

SEQ ID NO: 2의 리파아제는 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) DSM 4109 (동의어: 써모마이세스 라누기노서스(Thermomyces lanuginosus))로부터 유래된 야생형 리파아제이다.

미국 특허 번호 5,614,189 (EP 600868 B1)는 예를 들어, 낭포성 섬유증을 겪고 있는 환자의 치료에서, 췌장효소 대체요법에서 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa)로부터 유래되는 리파아제의 사용을 기술한다. 이 리파아제는 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) DSM 4109로부터 유래되고 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 아미노산 서열을 가진다.

WO 92/05249, WO 92/19726, WO 94/25577, WO 95/09909, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 99/42566, WO 00/32758, WO 00/60063, WO 01/83559, WO 01/83559, WO 2002/055679, WO 2002/062973, WO 2002/062973, WO 2004/099400, 및 WO 2004/111216는 SEQ ID NO: 2의 다수의 변형체를 기술하지만, 그것의 약학적 사용은 기술하지 않는다.

WO 2006/136159는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269 및 그것의 변형체 N33Q를 가지는 리파아제의 약학적 사용을 기술한다.

약학적 사용을 위해 개선된 리파아제에 대한 당업계의 요구가 있다.

발명의 개요

본 발명은 약학적 사용을 위한 개선된 리파아제를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 사용을 위한 효소는 생체내 및/또는 생체밖에서 개선된 효능; 개선된 활성; 개선된 안정성을 가지며; 프로테아제에 의한 분해에 안정하고; 담즙산염의 존재에서 안정하고; 및/또는 감소된 알레르기 반응을 가진다. 더 바람직하게는, 본 발명의 리파아제는 치환 N33Q+T231R+N233R로 SEQ ID NO: 2의 서열을 가지는 기준 리파아제와 비교하여 개선된 생체 밖 소화 성능을 가진다.

본 발명은 약제로서 사용을 위한 리파아제에 관한 것이며, 리파아제는 (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 서열에 적어도 50% 동일성을 가지며; (b) 리파아제 활성을 가지고; (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 269의 아미노산과 비교하여 치환 N33Q, T231R 및 N233R 및 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 부가 치환을 포함하는 약제로서 사용을 위한 리파아제에 관한 것이다:

본 발명은 추가로 소화 장애, PEI, 췌장염, 낭포성 섬유증, I형 당뇨병 및/또는 II형 당뇨병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 이러한 리파아제의 사용에 관한 것으로, 이들 사용은 선택적으로 프로테아제, 및/또는 아밀라아제의 사용을 추가로 포함하며; 이뿐 아니라 선택적으로 프로테아제 및/또는 아밀라아제와 조합하는 이들 질환의 치료에서 사용을 위한 이러한 리파아제에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 보조 물질과 함께 이러한 리파아제를 포함하며, 선택적으로 프로테아제 및/또는 아밀라아제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 이러한 리파아제의 치료적으로 유효한 양을 선택적으로 프로테아제 및/또는 아밀라아제와 함께 투여함으로써 소화장애, PEI, 췌장염 (급성 및/또는 만성), 낭포성 섬유증, I형 당뇨병, 및/또는 II형 당뇨병의 치료를 위한 방법에 관한 것이다.

최종적으로, 본 발명은 생체 밖 리파아제 소화 성능; 및 특정 리파아제, 예를 들어: (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열에 적어도 50% 동일성을 가지고; (b) 리파아제 활성을 가지고; (c) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열과 비교하여 9, 30, 38, 39, 63, 112, 114, 115, 117, 122, 128, 130, 136, 154, 155, 156, 161, 163, 168, 185, 190, 239 및 246으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에서 치환을 포함하는 리파아제; 및

(a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열에 적어도 50% 동일성을 가지고; (b) 리파아제 활성을 가지고; 및

(c1) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열과 비교하여, E1N; Q4H; N8L,Q; Q9H; N11C,D,H,L,P,S; G23E; D27I; P29T; A30T,V; T37K,M; G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; N39H,S; D57N; G61R; V63R; N71I,S; N73Q,Y; I76T; I86F,L; E87H; G91F,K,L,M,V,Y; N94Q; F95^*; D96^*; N101Q; D111E; G112A; T114I; S115L; W117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; D122E,N; Q126L; V128A, D130H, H135D, P136H; V141E,L; V154F,I,L; A155V; G156R; G161A,E; N162G,S; G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; V168M; L185M; G190C,D; R205I; G240L; G246A; N251Q,S; 및 L269F,H로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하고; 또는,

(c2) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열과 비교하여 표시된 위치에서 다음의 아미노산 1N; 4H; 8L,Q; 9H; 11C,D,H,L,P,S; 23E; 27I; 29T; 30T,V; 37K,M; 38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; 39H,S; 57N; 61R; 63R; 71I,S; 73Q,Y; 76T; 86F,L; 87H; 91F,K,L,M,V,Y; 94Q; 95^*; 96^*; 101Q; 111E; 112A; 114I; 115L; 117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; 122E,N; 126L; 128A, 130H, 135D, 136H; 141 E,L; 154F,I,L; 155V; 156R; 161A,E; 162G,S; 163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; 168M; 185M; 190C,D; 205I; 240L; 246A; 251Q,S; 및 269F,H 중 적어도 하나를 포함하는 리파아제를 선택적으로 비교하여 결정하기 위한 방법에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

리파아제

리파아제는 리파아제 활성을 가지는 폴리펩티드이다. 하기에서, 본 발명의 조성물, 방법 및 사용에서 사용을 위한 리파아제는 본 발명의 리파아제로서 언급된다. 본 발명의 리파아제는 카르복실산 에스테르 가수 분해 효소 EC 3.1.1.-일 수 있으며, 이는 EC 3.1.1.3 트리아실글리세롤 리파아제, EC 3.1.1.4 포스포리파아제 A2, EC 3.1.1.5 리소포스포리파아제, EC 3.1.1.26 갈락토리파아제, EC 3.1.1.32 포스포리파아제 A1, EC 3.1.1.73 가용성 에스테라아제와 같은 활성을 포함한다. 특정 구체예에서, 리파아제는 EC 3.1.1.3 트리아실글리세롤 리파아제이다. 다른 특정 구체예에서, 리파아제는 EC 3.1.1.4 포스포리파아제 A2 활성을 가지며, 즉, 반응: 포스파티딜콜린 + H(2)O = 1-아실글리세로포스포콜린 + 카르복실레이트 (2-위치에 부착되는 지방산을 제거)을 촉매한다. 또 추가의 특정 구체예에서, 리파아제는 EC 3.1.1.32 포스포리파아제 A1 활성을 가지며, 즉, 반응: 포스파티딜콜린 + H(2)O = 2-아실글리세로포스포콜린 + 카르복실레이트를 촉매한다.

EC 수는 Eur . J. Biochem., 1994, 223: 1-5; Eur . J. Biochem ., 1995, 232: 1-6; Eur. J. Biochem ., 1996, 237: 1-5; Eur . J. Biochem ., 1997, 250: 1-6; 및 Eur. J. Biochem ., 1999, 264: 610-650; 각각에서 공개된 부록 1-5를 포함하는 캘리포니아 샌디에고 아카데믹 프레스 NC-IUBMB로부터의 효소 명명법을 말한다. 명명법은 정기적으로 보충되고 업데이트된다: 예를 들어, 월드 와이드 웹 www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html 참조.

본 발명의 리파아제는 모 리파아제의 변형체일 수 있다.

변형체

용어 변형체는 모 리파아제와 비교하여 폴리펩티드 중에 하나 이상의 특정 위치에서 하나 이상의 특정 아미노산 잔기의 하나 이상의 변경, 예로써, 치환, 삽입, 결실 및/또는 절단을 포함하는 리파아제로서 본원에 정의된다.

모 리파아제

용어 모 리파아제는 변형체와 비교되고 결합되는 폴리펩티드를 말한다. 모 리파아제의 특정 예는 변형, 예를 들어, 치환(들), 삽입(들), 결실(들) 및/또는 절단(들)이 본 발명의 리파아제 변형체를 만들도록 하는 리파아제이다. 본 발명은 자연적으로 발생하는(야생형) 리파아제일 수 있고, 또는 어떤 적당한 수단에 의해 생성되는 그것의 변형체일 수 있다. 모 리파아제는 또한 동일한 염색체 자리를 점유하는 유전자의 어떤 둘 이상의 또 다른 형태로 코딩된 폴리펩티드인 대립유전자 변형체일 수 있다.

특정 구체예에서, 본 리파아제는 SEQ ID NO: 2에서 보이는 T. 라누기노수스(T. lanuginosus) 리파아제의 아미노산 1-269의 서열에 적어도 50% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 진균 리파아제이다. 모 리파아제는 효모 리파아제, 예로써, 칸디다균(Candida), 클뤼베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 시키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 또는 야로이야(Yarrowia) 폴리펩티드; 또는 더 바람직하게는, 사상 진균 리파아제, 예로써, 아크레모늄(Acremonium), 아스페르길루스(Aspergillus), 아우레오바시디움(Aureobasidium), 효모균류(Cryptococcus), 필로바시디움(Filobasidium), 푸사리움(Fusarium), 후미콜라(Humicola), 마그나포스(Magnaporthe), 무코르(Mucor), 마이셀리오프토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 네우로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 피로마이세스(Piromyces), 스키조필룸(Schizophyllum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 서모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 또는 트리코데르마(Trichoderma) 리파아제- 또는 이것의 어떤 변형체일 수 있다. 바람직한 모 리파아제는 자냥균 리파아제, 바람직하게는 후미콜라(Humicola), 탈라로미케스(Talaromyces) 또는 서모마이세스(Thermomyces)의 균주, 예를 들어, 후미콜라 푸스코아트라(Humicola fuscoatra), 후미콜라 그리세아(Humicola grisea), 후미콜라 인졸렌스(Humicola insolens), 후미콜라 루테아(Humicola lutea), 후미콜라 니그레스첸스(Humicola nigrescens), 후미콜라 속(Humicola sp.), 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa)(서모마이세스 라노기노수스(Thermomyces lanoginosus)), 서모마이세스 이바다넨시스(Thermomyces ibadanensis), 서모마이세스 베르루코수스(Thermomyces verrucosus), 탈라로마이세스 서모필루스(Talaromyces thermophilus), 탈라로마이세스 에멀소나이(Talaromyces emersonii), 또는 탈라로마이세스 바이소클라미도이데스( Talaromyces byssochlamydoides)의 균주 또는 이들의 어떤 변형체로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 모 리파아제는 (i) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269를 가지는 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 리파아제, 또는 (ii) 그것의 변형체이다.

리파아제 변형체의 명명법

본 발명에서, 리파아제 변형체 중에 아미노산 잔기 위치의 특정 넘버링이 사용된다. 알려진 리파아제의 아미노산 서열을 정렬함으로써, 어떤 리파아제 효소에서 임의의 아미노산 잔기에 아미노산 위치 수를 지정할 수 있다.

본원에 기술된 정렬을 사용하는 다른 리파아제의 아미노산 서열로 정렬된 SEQ ID NO: 2에서 개시된 리파아제의 아미노산 서열로부터 시작하는 넘버링 시스템을 사용하여 어떤 다른 리파아제에서 각 아미노산 잔기의 부분을 나타낼 수 있다. 따라서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열과 비교되는 본 발명의 어떤 리파아제에 대해, 각 위치 및/또는 치환은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 위치와 대응한다.

본 발명의 다양한 리파아제 변형체를 기술하는데, 하기 기술되는 명명법이 참조의 용이함을 위해 적합하다. 모든 경우에, 허용되는 IUPAC 한 글자 또는 세 글자 아미노산 약어가 사용된다.

아미노산 치환을 위해, 하기 명명법이 사용된다: 원래의 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 따라서, 위치 26에서 아스파라긴의 이소류신으로의 치환은 N26I로서 명시된다. 다중 돌연변이는 부가 마크 (+)로 분리되며, 예를 들어, N33Q+E210D+T231R+N233R는 아스파라긴 (N)이 글루타민 (Q)으로, 글루탐산 (E)가 아스파르트산(D)로, 트레오닌(T)이 아르기닌(R)로 및 아스파라긴(N)이 아르기닌 (R)로 각각 치환되는 위치 33, 210, 231 및 233에서 돌연변이를 나타낸다.

아미노산 결실에 대해, 하기 명명법이 사용된다: 원래 아미노산, 위치, ^*. 따라서, 위치 1에서 글루탐산 (E)의 결실은 "E1^*"로서 명시된다. 다중 결실은 부가 마크 ("+")로 분리되며, 예를 들어, 위치 93, 94, 95, 및 96 각각에서 류신(L), 아스파라긴 (N), 페닐알라닌 (F), 및 아스파르트산 (D)의 결실은 "L93^*+N94^*+F95^*+D96^*"로서 명시된다.

따라서, 본 목적을 위해, 결실은 사실상 치환의 예, 즉, 본래 아미노산의 무존재와의 치환이 고려될 수 있다. SEQ ID NO:2의 아미노산 1-269의 리파아제의 하기의 변형체는 따라서 전체에서 11번의 치환: 다른 아미노산으로 7번의 치환, 및 무존재로 4번의 치환, 즉 4번의 결실을 포함하는 것으로 언급될 수 있다:

D27R+N33Q+G91A+L93^*+N94^*+F95^*+D96^*+D111A+T231R+N233R+P256T.

따라서, 특정 아미노산이 2 이상의 다른 아미노산으로 치환 또는 결실될 때, 이는 치환으로서 표시되며, 결실을 포함하는 또 다른 치환은 콤마로써 분리된다. 예를 들어, 명칭 "E1^*,D,N"은 모 리파아제(E1) 위치 1에서 글루타민이 무존재(즉, 결실됨)(*)으로 치환되고, 아스파르트산(D)으로 치환되고 또는 아스파라긴(N)으로 치환될 수 있음을 의미한다.

배열 및 동일성 계산

이 부분은 본 발명의 리파아제, 아밀라아제, 및 프로테아제(본 발명의 효소)를 사용한다.

2개의 아미노산 서열 간의 관련은 변수 "동일성"에 의해 기술된다.

본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열의 배열은 EMBOSS 패키지(http://emboss.org) 버전 2.8.0으로부터 니들(Needle) 프로그램을 사용하여 결정된다. 니들 프로그램 방법 글로벌 배열 알고리즘은 Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol . Biol. 48: 443-453에서 기술된다. 사용된 치환 매트릭스는 BLOSUM62이고, 갭 열림 페널티는 10이고 갭 확장 페널티는 0.5이다.

본 발명의 아미노산 서열("본 서열"; 예를 들어, 다음 4개의 치환 N33Q+E210D+T231R+N233R로 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열을 가지는 변형체 LVA023)과 다른 아미노산("외래 서열"; 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269) 서열 간의 동일성의 정도는 "본 서열"의 길이 또는 "외래 서열"의 길이에 의해 나누어지는 어느 쪽이든지 가장 짧은 2개의 서열의 배열에서 정확하게 매치되는 수로서 계산된다. 결과는 백분율 동일성으로서 표현된다.

정확한 매치는 "본 서열"과 "외래 서열"이 중복(하기 배열 예에서 이는 "|"로 나타낸다)의 동일 부분에서 동일한 아미노산 잔기를 가질 때 발생한다. 서열의 길이는 서열 내 아미노산 잔기의 수이다(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 길이는 269이다).

순수하게 가정하는 하기 배열예에서, 중복은 서열 1의 아미노산 서열 "HTWGER-NL"; 또는 서열 2의 아미노산 서열 "HGWGEDANL"이다. 예에서 갭은 "-"로 표시된다.

가정 배열예:

따라서, 서열 1 내지 서열 2의 동일성의 백분율은 50%에 대응하는 6/12=0.5이다.

특정 구체예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 또는 이것에 대한 폴리펩티드의 아미노산 서열의 동일성의 백분율은 i) BLOSUM62 치환 매트릭스, 10의 갭 열림 페널티 및 0.5의 갭 확장 페널티로 니들 프로그램을 사용하여 2 개의 아미노산 서열을 배열하는 단계; ii) 배열 내 정확한 매치의 수를 카운팅하는 단계; iii) 2개의 아미노산 서열의 가장 짧은 길이로써 정확한 매치의 수를 나누는 단계, 및 iv) iii)의 분리의 결과를 백분율로 전환하는 단계에 의해 결정된다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제와 적어도 51% 동일하다. 추가 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제와 적어도 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 또는 적어도 60% 동일하다. 추가 바람직한 구체예에서, 동일성의 백분율은 적어도 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 또는 적어도 70%이다. 추가 바람직한 구체예에서, 동일성의 백분율은 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 또는 적어도 80% 이다. 추가 바람직한 구체예에서, 동일성의 백분율은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 또는 적어도 90%이다. 추가 바람직한 구체예에서, 동일성의 백분율은 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99%이다.

다른 바람직한 구체예에서, 모 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제와 적어도 51% 동일하다. 추가 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제에 적어도 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99% 동일하다.

개선된 특성

본 발명은 약학적 사용을 위한 개선된 리파아제를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 사용을 위한 효소는 생체내 및/또는 생체밖에서 개선된 효능; 개선된 활성; 개선된 안정성을 가지며; 프로테아제에 의한 분해에 안정하고; 담즙산염의 존재에서 안정하고; 및/또는 감소된 알레르기 반응을 가진다.

본 발명의 리파아제는 바람직하게는 정제되며, 더 바람직하게는, 예를 들어, WO 2006/136159의 실시예 5에 기술된 바와 동일하다. 정제된 리파아제 제제는 SDS-PAGE로 분석될 수 있고, 리파아제는 30-40 kDa에서 주요 단백질 밴드로서 확인될 수 있다. 쿠마씨-염색된 SDS-PAGE 겔의 농도계 스캐닝에 의해, 이 밴드는 바람직하게는 90-97%의 단백질 스펙트럼을 구성한다. 농도계는 예를 들어, BIO-RAD로부터 캘리브레이션된 농도계 GS-800이다.

본 발명의 리파아제는 기준 리파아제와 비교하여 개선된 소화 성능, 바람직하게는 생체내에서 개선된 소화 성능을 가진다.

소화 성능은 (I) 소화 모델을 사용하여, (II) 펩신의 존재에서 pH 3으로 안정성을 결정함으로써, 및/또는 (III) 담즙산염의 존재에서 pH 5로 활성을 결정함으로써 바람직하게 결정된다.

방법 (I), (II), 및 (III) 각각에 대해, 하기에서 추가로 논의되며, SEQ ID NO: 2의 리파아제 변형체 N33Q+T231R+N233R은 기준 리파아제의 바람직한 예이다(WO 2006/136159에서 논의). 기준 리파아제의 다른 예는: SEQ ID NO: 1의 리파아제(SEQ ID NO: 2의 N33Q+T231 R) 및 SEQ ID NO: 2의 리파아제이다. 기준 리파아제의 또 다른 추가 예는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 + 1 내지 +269의 리파아제의 평균 및 그것의 변형체 N33Q이다.

소화 모델 (I)은 소화 성능을 결정하는 신규 방법을 나타내며, 이는 하기 단계들을 포함한다:

a) 기준 리파아제를 선택하는 단계;

b) 100 부피부(parts per volume)의 규정식과 20 부피부 펩신 및 30 부피부의 리파아제 또는 기준 리파아제를 각각 혼합하는 단계;

c) i) 0 부피부 또는 ii) 10 부피부의 완충제(0.8 M MES, 0.8 M 아세트산 나트륨, 0.8 M 이미다졸, pH 7.0)를 첨가하는 단계, 단계 i)은 pH 3의 위(gastric) 단계로서 언급될 수 있고, 단계 ii)는 pH 5의 위 단계로서 언급될 수 있다;

d) 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하는 단계;

e) 20 부피부의 담즙산염을 첨가하는 단계, 및 i) 25 부피부 또는 ii) 15부피부의 완충제(0.8 M MES, 0.8 M 아세트산 나트륨, 0.8 M 이미다졸, pH 7.0)를 첨가하는 단계, 단계 i)은 pH 3의 위 단계에 대응하고, 단계 ii)는 pH 5의 위 단계에 대응한다;

f) 37℃에서 교반하면서 2시간 동안 인큐베이팅하는 단계;

g) 1 M 인산 중 50 부피부의 10% 트리톤-X100을 첨가하는 단계;

h) 자유 지방산의 양을 결정하는 단계;

i) 하기 식에 용량 반응 곡선을 적합화시키는 단계;

FFA = FFAmax*[E]/([E]+K)

FFA는 방출된 자유 지방산의 양이고, FFAmax는 리파아제가 규정식으로부터 유리될 수 있는 자유 지방산의 최대량이며, [E]는 리파아제 농도이고, K는 FFAmax의 절반을 유리시키는 리파아제 농도이다;

j) 하기와 같은 개선 인자 (IF)를 계산하는 단계:

IF = K(기준) / K(리파아제),

K(기준)은 FFAmax의 절반을 유리시키는 기준 리파아제의 농도이고 K(리파아제)는 FFAmax의 절반을 유리시키는 리파아제 농도이다.

소화 성능은 또한 상기 (II)와 같이 언급된 pH 3에서 신규 펩신 안정성 테스트로써 결정될 수 있고, 본 방법은 하기 단계들을 포함한다:

i) 기준 리파아제를 선택하는 단계;

ii) 각각 5 부피부의 리파아제 또는 기준 리파아제와 5 부피부의

a) 0.01% 트리톤-X100와 10 mM NaCl을 함유하는 희석제 또는

b) 150 ug/mL 펩신, 4 mM CaCl₂, 0.01% 트리톤-X100, 및 50 mM 시트레이트, pH 3.0을 함유하는 펩신 처리 용액을 혼합하는 단계,

a)는 미처리된 샘플로서 언급되고, b)는 펩신 처리된 샘플로서 언급된다;

iii) 3시간 동안 20℃에서 단계 ii)의 샘플을 인큐베이팅하는 단계

iv) 단계 iii)의 각 샘플에 55 부피부의 1 mM PNP-팔미테이트, 1.2% 트리톤-X100, 4 mM CaCl₂, 100 mM TRIS, pH 8.0를 함유하는 기질을

a) 5 부피부의 펩신-처리 용액, 또는

b) 5 부피부의 희석제를 함께 첨가하는 단계

a)는 미처리된 샘플을 말하며, b)는 펩신-처리된 샘플을 말한다;

v) 간격을 두고 iv)의 샘플의 OD₄₀₅를 판독함으로써 기질의 분해를 따르는 단계;

vi) 선형 범위와 일치하는 v)로부터 데이터를 수집하고 시간 당 mOD (밀리 OD)로 펩신-처리된 샘플 및 미처리된 샘플 각각에 대해 리파아제 활성을 계산하는 단계;

vii) 단계 vi)로부터 초래되는 것과 같이 펩신-처리된 샘플의 리파아제 활성을 미처리된 샘플의 그것으로 나눔으로써 % 잔여 리파아제 활성(%RA)을 계산하고, 결과를 100으로 곱하는 단계; 및, 원한다면,

viii) 리파아제의 %RA를 기준 리파아제의 그것과 비교하는 단계.

소화 성능은 또한 상기 III과 같이 언급되는 pH 5에서 신규 담즙산염 활성 시험에 의해 결정될 수 있으며, 이 방법은 하기 단계들을 포함한다:

i) 기준 리파아제를 선택하는 단계;

ii) 10 부피부의 리파아제 또는 기준 리파아제를 각각 23 부피부의 a) 물, 또는 b) 20mM 담즙산염과 혼합하는 단계, a)는 미처리된 샘플로서 언급되며, b)는 담즙산염 샘플로서 언급된다;

iii) ii)의 각 샘플에, 200 부피부의 25 mM 숙시네이트 중 1 mM PNP 올레이트, 2 mM CaCl₂, 1.2% 트리톤-X100, pH 5.0을 함유하는 기질을 첨가하고 혼합하는 단계;

iv) 단계 iii) 후 즉시, 각 샘플로부터 60 부피부의 결과 혼합물을 제거하고 그것의 15 부피부를 4개의 별개의 구획에 4회 옮기는 단계;

v) 1, 2, 3, 및 4 시간 후 60 부피부의 100 mM TRIS, pH 8.0을 iv)의 4개의 구획의 각 칸에 첨가하고, 즉시 OD 405를 판독하고, 1, 2, 3, 및 4 시간 판독의 선형 범위를 기초로 mOD/시간에서 활성을 계산하는 단계;

vi) 리파아제 및 기준 리파아제에 대해, 단계 v)에서 획득한 담즙산염 샘플의 활성을 또한 단계 v)에서 획득한 미처리된 샘플의 활성으로 나누어서 리파아제와 기준 리파아제 각각의 담즙산염 안정성 비율에 도달하는 단계; 및

vii) 리파아제의 담즙산염 안정성 비율을 기준 리파아제의 담즙산염 안정성 비율로 나누는 단계, 이 결과 비율은 리파아제의 개선 인자로서 정의될 수 있다.

방법 (I), (II) 및 (III)은 놀랍게도 개선된 리파아제를 확인하는 것으로 발견되었고, 이것의 높은 비율은 또한 생체 내에서 개선될 수 있다.

방법 (I)

소화 모델(상기 (I)로서 언급됨)은 췌장 외분비 기능부전을 겪고 있는 단위(monogastric) 동물(예로써, 돼지 및 인간)에서 소화를 모방한다.

트리톤 X-100(C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)_n) (CAS No. 9002-93-1)은 친수성 폴리에틸렌 옥시드 기(평균 9.5 에틸렌 옥시드 단위, 즉 n=9-10을 가짐) 및 탄화수소 친유성 또는 소수성 기를 가지는 비이온성 계면활성제이다. 탄화수소기는 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐기이다.

용어 "부피부"는 바람직하게는 약칭된 ul, uL, μl, 또는 μL일 수 있는 마이크로리터를 의미한다.

생체 밖 소화 모델의 특정 구체예에서, (a) 펩신 농도는 700 mg/ml이고; (b) 리파아제 및/또는 기준 리파아제는 각각 바람직하게는 중복하여 4개의 다른 농도로 분석되며; 및/또는 (c) 반응은 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 발생한다.

생체 밖 소화 모델의 추가의 특정 구체예에서, (d) 담즙산염의 농도는 50 g/l이고; (e) 단계 e)에서 담즙산염 및 완충제의 첨가 후 결과 pH는 5.7 내지 6.0의 범위에 있고; 및/또는 (f) 단계 g)에서 첨가될 때 트리톤-X100은 반응을 멈추도록 돕는다.

생체 밖 소화 모델의 추가의 특정 구체예에서, (g) 자유 지방산의 양은 125-250회와 같은 적절한 희석 후 바람직하게는 1% 트리톤-X100에서 결정되며, 바람직하게는 Wako Chemicals제의 NEFA C 키트를 사용하여 결정되며, 이는 실시예 3)에서 기술되고; (h) 단계 i)의 용량 반응 곡선은 반응을 보여주는 곡선, 즉, 리파아제 용량의 기능으로서 자유 지방산의 양을 말하며; 및/또는 (i) FFAmax는 리파아제, 즉 기준 리파아제 및 당해 리파아제(들)과 동일한 것으로 가정한다.

생체 밖 소화 모델의 추가 특정 구체예에서, (j) 활성 자리 적정(AST, 실시예 6)은 리파아제 농도를 결정하기 위해 사용되며; 및/또는 (k) A₂₈₀은 리파아제 농도를 결정하기 위해 사용되며, 바람직하게는 흡광계수 1.24 A₂₈₀/mg을 사용한다.

개선된 리파아제는 1.00 이상의 개선인자를 가지는 리파아제로서 정의된다. 특정 구체예에서, (i) 개선 인자는 평균 개선 인자이며; (ii) 개선 인자는 평균 개선인자 - 표준 편차이고; 및/또는 (iii) 개선인자는 1.0 이상 또는 1 이상이다. 평균 및 표준 편차는 실험 변동으로 계산하고 당업계에 공지된 바와 같이, 예를 들어, 표준편차 = (합(IF-Avg(IF)) / (n-1))^Λ0.5로서 계산될 수 있고, 여기서 IF는 개선인자이고 Avg(IF)는 계산된 개선 인자의 평균이고, n은 계산된 개선 인자의 수이다. 역 V는 exp을 의미한다.

생체 밖 소화 모델의 규정식은 바람직하게는 250 내지 400 g 지방/kg, 더 바람직하게는 300 내지 350 g 지방/kg, 가장 바람직하게는 313 내지 340 g 지방/kg을 함유한다. 탄수화물과 단백질의 함량은 적절하지 않지만, 바람직하게는 보통의 및 전형적인 음식 필요 및 추천, 예를 들어, 250-500 g/kg의 탄수화물 함량, 및 10 내지 200 g/kg의 단백질 함량을 반영한다. 규정식은 예를 들어, 규정식 I (340 g 지방/kg, 450 g 탄수화물/kg, 20 g 단백질/kg), 또는 규정식 II (313 g 지방/kg, 358 g 탄수화물/kg, 및 146 g 단백질/kg)으로부터 선택될 수 있다.

규정식 I은 소 우유 (1.5% 지방)의 247.2 중량부, 올리브 오일의 29.9 중량부, Calshake의 87 중량부(Fresenius Kabi로부터 구매가능하며 2077kJ/g의 에너지 함량, 4.3 g 우유 단백질/100 g의 단백질 함량, 24.4 g 지방/100 g의 지방 함량을 가짐), 및 메토셀(Methocel)의 9.9 중량부(Food Grade, E5 Premium LV FG (E464); Dow)를 함유한다. 성분은, 예를 들어 UltraTurrex (YellowLine Dl 25 basic)를 사용하여 2분 동안 혼합된다. 선택적으로, 규정식은 점성도를 감소시키기 위해 0.5 ug/ml의 SAVINASE 16.0 LEX 프로테아제 (Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark로부터 구매가능)로 pH 8.0에서 4 시간 동안 50℃에서 처리되었다. 프로테아제는 그 후에 pH를 3으로 감소시킴으로써 불활성화되고 30분 동안 70℃에서 또는 60분 동안 50℃에서 인큐베이팅한다. 용어 "중량부"는 바람직하게는 그램(g)을 말한다.

규정식 II는 바람직하게는 73 g/kg (습시료 중량) 가금 식사(Altromin), 73 g/kg 완두콩 식사, 73 g/kg 카세인 (Altromin으로부터 산성 조건하에서 침전됨), 290 g/kg 밀가루, 290 g/kg 감자 전분, 125 g/kg 라드, 76 g/kg 비타민, 미네랄 및 미량원소, 및 375 g/kg 소의 크림 (33% 지방)으로 구성되는 것을 함유한다.

방법 ( II )

하기는 펩신의 존재하에 pH 3에서 안정성을 측정함으로써 소화 성능을 결정하는 방법의 특정 구체예이며, 본 방법은 상기 II로서 언급된다.

(a) 단계 ii)에서 사용되는 리파아제는 바람직하게는 하기와 같이 제조되는 배양 상청액이다: 리파아제를 발현할 수 있는 단일 효모 군체, 예로써, 사카로마이세스 세레비아제(Saccharomyces cerevisiae) JG169의 군체(예를 들어, 미국 특허 번호 7,217,433 참조)는 적당한 배지(예를 들어, 실시예 8의 종자 배양 배지)의 1부피부(예를 들어, 1mL)에 채집하였고, 30℃로 250rpm에서 밤새 성장시켰다. 리파아제의 발현은 적당한 배지(예를 들어, 실시예 8의 최적화된 배지)의 1 부피부에 결과 종자 배양의 부피(예를 들어, 20 uL) 당 0.020부분을 넣음으로써 달성되고 30℃로 250 rpm에서 4-6일 동안 배양하였다. 배양을 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트, 예를 들어, 24-웰 플레이트에서 또는 진탕 플라스크에서 수행할 수 있다. 리파아제 샘플을 적절하게, 예를 들어 25-배 희석제로 희석할 수 있다;

(b) 단계 iii)의 3시간의 배양은 실온에서 할 수 있다;

(C) 단계 v)의 OD₄₀₅의 판독은 예를 들어 6회로, 예를 들어, 기질 첨가 후 15분 만큼 일찍 및 기질 첨가 후 18시간 만큼 길게 일어날 수 있다;

(d) 단계 vi)에서, 리파아제 활성은 펩신-처리된 샘플 및 미처리된 샘플 각각에 대해 시간 당 mOD(밀리 OD)로 계산되며, v)로부터의 데이터는 선형 범위에 속하도록 수집된다;

(e) 단계 vii)에서, 펩신-처리된 리파아제의 단계 vi)로부터의 비율을 미처리된 조건의 비율로써 나눔으로써 % 잔여 리파아제 활성(%RA)를 계산하고 결과를 100으로 곱한다; 및/또는

(f) 단계 v)에서, OD 540이 또한 판독되며, OD405 판독으로부터 OD540 판독을 뺌으로써 배경 OD를 수정하는데 사용한다.

방법( III )

하기는 담즙산염의 존재하에 pH 5에서 활성을 측정함으로써 소화 성능을 결정하는 방법의 특정 구체예이다(상기 (III)으로서 언급됨):

(a) 단계 ii)에서 사용되는 리파아제가 정제되고; (b) 리파아제는 전형적으로 25-배 내지 200-배 희석제(예로써, 0.01% 트리톤-X100, 10 mM NaCl)로 예를 들어, 대략 8 마이크로그램/mL로 적절하게 희석되며; (c) 정제된 리파아제 샘플의 농도는 흡광계수 1.24 A₂₈₀/mg을 사용하여 280nm에서 흡광도로부터 결정되며; (d) 약 0.100 내지 0.475의 OD는 선형 범위에 있고; 및/또는 (e) 담즙산염은 증류수에서 20mM로 만들어지는 Sigma B-8756이다.

추가 특정 구체예 (f)에서 단계 vi)에서 pH 5.0로 담즙산염의 존재하에 활성의 비는, "담즙산염" 활성에 대한 시간 및 희석에 대해 보정된 단계 v)에서 획득된 모든 선형 데이터의 평균을 "담즙산염이 없는" 활성에 대한 시간 및 희석에 대해 보정된 모든 선형 데이터의 평균으로 나누어 계산함으로써 백분율로서 표현된다

(A) 제 1 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다.

제 2 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

제 3의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

제 4의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

상기 열거된 치환(각각 4개의 특정 구체예)을 가지는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 리파아제의 변형체는 모두 개선된 생체 밖 소화 성능, 즉 적어도 1.50 (또는 1.5), 2.00 (또는 2.0), 2.50 (또는 2.5), 3.00 (또는 3.0), 3.50 (또는 3.5), 또는 적어도 4.00 (또는 4.0), 바람직하게는 적어도 5.00 (또는 5.0), 6.00 (또는 6.0), 7.00 (또는 7.0), 8.00 (또는 8.0), 9.00 (또는 9.0), 10.00 (또는 10.0), 또는 적어도 11.00 (또는 11.0)의 개선 인자(IF)를 가진다. pH 3의 위 단계가 바람직하게 사용된다. 바람직한 규정식은 규정식 II이다. 활성 자리 적정(AST, 실시예 6) 및/또는 A₂₈₀은 바람직하게는 흡광계수 1.24 A₂₈₀/mg을 사용하여 리파아제 농도를 결정하기 위해 사용된다.

(B) 다른 제 1 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다.

다른 제 2 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

다른 제 3 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

다른 제 4 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

상기 열거된 치환(각각 4개의 다른 특정 구체예)을 가지는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 리파아제의 변형체는 모두 개선된 생체 밖 소화 성능, 즉 1.00 이상, 또는 적어도 1.50 (또는 1.5), 2.00 (또는 2.0), 2.50 (또는 2.5), 3.00 (또는 3.0), 3.50 (또는 3.5), 또는 적어도 4.00 (또는 4.0), 바람직하게는 적어도 5.00 (또는 5.0), 6.00 (또는 6.0), 7.00 (또는 7.0), 8.00 (또는 8.0), 9.00 (또는 9.0), 10.00 (또는 10.0), 또는 적어도 11.00 (또는 11.0)의 개선 인자(IF), 바람직하게는 평균 IF - 표준 편차를 가진다. pH 3의 위 단계가 바람직하게 사용된다. 바람직한 규정식은 규정식 I이다 활성 자리 적정(AST, 실시예 6)은 리파아제 농도를 결정하기 위해 바람직하게 사용된다.

(C) 또 다른 제 1 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

또 다른 제 2 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

또 다른 제 3 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

상기 열거된 치환(각각 3개의 또 다른 특정 구체예)을 가지는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 리파아제의 변형체는 모두 개선된 생체 밖 소화 성능, 즉 1.00 이상, 또는 적어도 1.50 (또는 1.5), 2.00 (또는 2.0), 2.50 (또는 2.5), 3.00 (또는 3.0), 3.50 (또는 3.5), 또는 적어도 4.00 (또는 4.0), 바람직하게는 적어도 5.00 (또는 5.0), 6.00 (또는 6.0), 7.00 (또는 7.0), 8.00 (또는 8.0), 9.00 (또는 9.0), 10.00 (또는 10.0), 또는 적어도 11.00 (또는 11.0)의 개선 인자 (IF), 바람직하게는 평균 IF - 표준 편차를 가진다. pH 3의 위 단계가 바람직하게 사용된다. 바람직한 규정식은 규정식 II이다 활성 자리 적정(AST, 실시예 6)은 리파아제 농도를 결정하기 위해 바람직하게 사용된다.

(D) 제 1 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

제 5의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

상기 열거된 치환(각각 3개의 특정 구체예)을 가지는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 리파아제의 변형체는 모두 개선된 생체 밖 소화 성능, 즉 1.00 이상, 또는 적어도 1.50 (또는 1.5), 2.00 (또는 2.0), 2.50 (또는 2.5), 3.00 (또는 3.0), 3.50 (또는 3.5), 또는 적어도 4.00 (또는 4.0), 바람직하게는 적어도 5.00 (또는 5.0), 6.00 (또는 6.0), 7.00 (또는 7.0), 8.00 (또는 8.0), 9.00 (또는 9.0), 10.00 (또는 10.0), 또는 적어도 11.00 (또는 11.0)의 개선 인자 (IF), 바람직하게는 평균 IF - 표준 편차를 가진다. pH 3의 위 단계가 바람직하게 사용된다. 바람직한 규정식은 규정식 I이다 활성 자리 적정(AST, 실시예 6)은 리파아제 농도를 결정하기 위해 바람직하게 사용된다.

(E) 제 1 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

제 3 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

상기 열거된 치환(각각 3개의 특정 구체예)을 가지는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 리파아제의 변형체는 모두 개선된 생체 밖 소화 성능, 즉 1.00 이상, 또는 적어도 1.50 (또는 1.5), 2.00 (또는 2.0), 2.50 (또는 2.5), 3.00 (또는 3.0), 3.50 (또는 3.5), 또는 적어도 4.00 (또는 4.0), 바람직하게는 적어도 5.00 (또는 5.0), 6.00 (또는 6.0), 7.00 (또는 7.0), 8.00 (또는 8.0), 9.00 (또는 9.0), 10.00 (또는 10.0), 또는 적어도 11.00 (또는 11.0)의 개선 인자 (IF), 바람직하게는 평균 IF - 표준 편차를 가진다. pH 3의 위 단계가 바람직하게 사용된다. 바람직한 규정식은 규정식 I이다. 활성 자리 적정(AST, 실시예 6)은 리파아제 농도를 결정하기 위해 바람직하게 사용된다.

(F) 제 1 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

상기 열거된 치환(각각 3개의 특정 구체예)을 가지는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 리파아제의 변형체는 모두 개선된 생체 밖 소화 성능, 즉 1.00 이상, 또는 적어도 1.50 (또는 1.5), 2.00 (또는 2.0), 2.50 (또는 2.5), 3.00 (또는 3.0), 3.50 (또는 3.5), 또는 적어도 4.00 (또는 4.0), 바람직하게는 적어도 5.00 (또는 5.0), 6.00 (또는 6.0), 7.00 (또는 7.0), 8.00 (또는 8.0), 9.00 (또는 9.0), 10.00 (또는 10.0), 또는 적어도 11.00 (또는 11.0)의 개선 인자 (IF), 바람직하게는 평균 IF - 표준 편차를 가진다. pH 5의 위 단계가 바람직하게 사용된다. 바람직한 규정식은 규정식 I이다. A₂₈₀은 바람직하게는 흡광계수 1.24 A₂₈₀/mg을 사용하여 리파아제 농도를 결정하기 위해 바람직하게 사용된다.

본 발명의 리파아제는 담즙산염 비율 개선 vs 적어도 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 또는 적어도 2.0의 기준을 가질 수 있다. 더 바람직하게는 본 발명의 리파아제는 담즙산염 비율 개선 vs 적어도 2.2, 2.5, 2.8, 또는 적어도 3.0의 기준을 가질 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는 본 발명의 리파아제는 담즙산염 비율 개선 vs 적어도 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 또는 적어도 4.0의 기준을 가질 수 있다. 이 비율은 또한 예를 들어, 3.0의 비율에 모두 상응하는 3 X, 3-배, 또는 300% 및 그 반대로서 다른 비율에 대해서 언급될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

더 바람직한 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

상기 열거된 치환(각각 3개의 구체예)을 가지는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 리파아제의 변형체는 모두 개선된 생체밖 소화 성능, 즉 펩신의 존재하에 pH 3에서 개선된 안정성, 더 구체적으로는 pH 3.0 및 20 ℃(또는 실온)에서 3시간 동안 75 ug/mL 펩신의 존재하에 배양 후 pH 8.0 및 20 ℃(또는 실온)에서 PNP-팔미테이트 중에 측정된 개선된 잔여 활성, 바람직하게는 실시예 8의 방법에 의해 결정된 개선된 % 잔여 활성을 가진다. 특정 구체예에서, % RA는 적어도 30, 적어도 50, 적어도 70, 적어도 80, 또는 적어도 90%이다. 개선 비율은 당해 리파아제의 % RA 대 기준 리파아제의 % RA의 비율로서 정의될 수 있다. 이 개선 비율은 바람직하게는 적어도 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 또는 적어도 4.5이다. 개선 비율은 당해 리파아제의 % RA를 기준 리파아제의 % RA로 나눔으로써 표 10의 결과로부터 계산될 수 있다(예를 들어, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 1의 리파아제, 또는 요망되는 다른 기준 리파아제).

본 발명의 리파아제는 적어도 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 또는 적어도 2.0의 담즙산염 비율 개선 vs 기준을 가질 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명의 리파아제는 적어도 2.2, 2.5, 2.8 또는 적어도 3.0의 담즙산염 비율 개선 vs 기준을 가질 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 본 발명의 리파아제는 적어도 3.2, 3.4, 3.6, 3.8 또는 적어도 4.0의 담즙산염 비율 개선 vs 기준을 가질 수 있다. 이들 비율은 또한 예를 들어, 3.0의 비율에 대응하는 모든 3X, 3-배 또는 300% 및 다른 비율에 대해 그 반대로서 언급될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

더 바람직하게는, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

훨씬 더 바람직하게는, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

상기-열거된(각각 4개의 구체예) 치환을 가지는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 리파아제의 변형체 모두는 개선된 생체 밖 소화 성능, 즉 2mM 담즙산염의 존재하에서 pH 5.0에서 PNP-올레이트 상의 개선된 활성, 더욱 구체적으로는 실시예 9의 방법으로 결정되는 개선된 담즙산염 비율을 가진다.

추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 가지는 리파아제들로부터 선택된다:

가장 바람직한 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 하기 치환, 바람직하게는 치환의 세트를 포함한다:

특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 낮은 pH에서 개선된 활성을 가진다. 활성 문맥에서, 낮은 pH는 4 내지 7의 범위에 있는 pH, 예를 들어, pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 또는 7.0을 의미한다. 바람직한 낮은 pH는 pH 6.0이다. 바람직한 구체예에서, pH 6.0에서 활성은 i) 37℃에서; ii) 트리리놀레인의 기질과 함께, 바람직하게는 8 mM의 농도에서; iii) 효소와 기질의 배양 동안 존재하는 담즙산염과 함께, 바람직하게는 10mM의 농도에서; iv) 분석 완충제 100mM 이미다졸, 100 mM 아세테이트, 100mM 말론산, pH 6.0을 사용하여; v) 효소 및 기질의 배양 동안 존재하는 CaCl₂와 함께, 바람직하게는 1mM의 농도에서; 및/또는 vi) 0.01 mg EP/mL (EP = 효소 단박질, A₂₈₀ 을 기초로 함)에 대응하는 정제된 리파아제의 양으로 결정된다. 추가 바람직한 구체예에서, vii) 효소는 분석(예를 들어, 분석 목적을 위한 적절한 농도를 얻기 위함) 전에 5 mM NaH₂PO₄ pH 7.0에서 희석되며; iix) 효소 및 기질은 30분 동안 배양되고; ix) 효소 및 기질은 마이크로타이터 플레이트(MTP)에서 배양되고, 바람직하게는 700 rpm으로 진탕되고; x) 효소적 반응은 바람직하게는 (2.2% 트리톤-X100, 0.22 M 인산), 더 바람직하게는 펩신(70 mg/l)을 포함하는 종결 용액으로 멈춰지며; xi) 효소 반응의 결과로서 발생된 자유 지방산은 NefaC와 같은 효소적 색상 시험에 의해 결정되며; 및/또는 xii) pH 6.0에서 활성의 개선은 SEQ ID NO: 1 또는 2, 바람직하게는 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제와 같은 기준 리파아제의 동일 조건하의 활성에 관하여 또는 변형체 LV2934에 관하여 표시된다. 시험 방법에 관하여 더욱 상세하게는, 실시예 3을 참조. pH 6.0에서 개선된 활성의 리파아제 변형체의 특정 예는(SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제에 관하여): LVA049, LVA349, LVA023, LVA099, SEQ ID NO: 1, LVA061, LV2934, LV1330, LVA043, LVA041, LVA012, LV1857, 및 LV1855 (그것의 구조에 대해 표 1을 참조)이다. LVA049, LVA349, LVA023, 및 LVA099 리파아제 변형체가 특히 바람직하다(또한 SEQ ID NO: 1 리파아제와 비교하여 개선됨). LVA049 및 A349 리파아제 변형체가 훨씬 더 바람직하다. pH-활성의 관점에서 가장 바람직한 리파아제는 LVA049 리파아제 변형체이다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 낮은 pH에서 개선된 안정성을 가진다. 안정성 문맥에서, 낮은 pH는 2 내지 6의 범위에 있는 pH, 예를 들어, pH 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 또는 6.0을 의미한다. 바람직한 낮은 pH는 3.0이다. 정제된 리파아제 효소의 안정성은 1, 15, 45, 및 120 분 동안 요망되는 pH(예를 들어, 3.0)로 37℃에서 효소를 배양함으로써 결정되고, 후에 잔여 리파아제 활성은 pH 8 및 실온(RT)에서 p-니트로페닐 카프릴레이트에서 측정된다. 바람직한 구체예에서, i) 안정성 전배양을 위해 사용된 완충제(안정성 완충제)는 200mM 이미다졸, 200mM 아세테이트, 200mM 말론산이며, 요망되는 pH(예를 들어, 3.0)으로 조절되고; ii) 효소는 ml 당 0.4 또는 0.8 mg 효소의 작업 용액에 바람직하게는 A₂₈₀을 기초로, 20 mM NaH₂PO₄ pH 7.0, 0.01% 트리톤-X100에서 우선 희석되고, iii) 사전-배양 동안 효소 농도는 ml 당 0.05 또는 0.1 mg 효소이며, 이 용액에 대해 완충제는 바람직하게는 효소 희석 완충제: 20 mM 아세테이트 pH 6, 0.01% 트리톤-X100이고; iv) 사전-배양은 진탕하면서, 바람직하게는 700 rpm으로 마이크로타이터 플레이트(MTP)에 있고; v) 잔여 활성(RA)의 이후의 결정을 위해, 사전-배양 단계로부터 효소-함유 알리쿼트 회수는 하기 잔여 활성 완충제(RA 완충제): 200 mM 트리스 (트리스-히드록시메틸 아미노메탄, 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올, pH 8, 0.4% 트리톤-X100, 1 mM CaCl₂에서 적어도 20배 희석되며; vi) 잔여 활성은 pH 8.0 및 RT에서 p-니트로페닐 카프릴레이트 상에서 측정되고 5분 동안 405nm로 동역학(속력; 속도)의 방법으로 측정되고; vii) % 잔여 활성은 하기와 같이 계산된다: 각 회수를 위한 각 pH에서의 속도는(1, 15, 45, 120 분; 또는 1, 60, 120 분)은 만약 적용가능하다면 담즙산염 또는 펩신(하기 iix) 및 ix) 참조)으로 어떤 효소 조절도 없는 것에 대한 속도를 빼며, 이 보정된 속도는 그 후 각 pH내에서 가장 높은 값으로 나눠지고 100을 곱한다. 선택적으로, 효소는 담즙산염의 존재에서 및/또는 펩신(70 mg/l)의 존재에서 바람직하게는 10mM의 농도에서 사전-배양된다. 본 시험 방법에 관하여 더욱 상세하게는, 실시예 4를 참조.

추가 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 상기 및 실시예 4에 기술되는 바과 같이 결정되는, 완충제에서 pH 3.0으로 120분의 배양 후 적어도 60, 65, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90 또는 92의 % 잔여 활성을 가진다.

추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 상기 및 실시예 4에 기술되는 바와 같이 결정되는, 완충제에서 pH 3.0으로 60분의 배양 후 적어도 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 또는 적어도 89의 % 잔여 활성을 가진다.

또한 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 상기 및 실시예 4에 기술되는 바과 같이 결정되는, 펩신의 존재에서 pH 3.0으로 45분의 배양 후 적어도 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 또는 94의 % 잔여 활성을 가진다.

또한 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 상기 및 실시예 4에 기술되는 바과 같이 결정되는, 펩신의 존재에서 pH 3.0으로 60분의 배양 후 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 82, 84, 86, 88, 또한 적어도 89의 % 잔여 활성을 가진다.

또한 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 상기 및 실시예 4에 기술되는 바과 같이 결정되는, 펩신의 존재에서 pH 3.0으로 120분의 배양 후 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 또는 적어도 71의 % 잔여 활성을 가진다.

또한 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 상기 및 실시예 4에 기술되는 바과 같이 결정되는, 담즙산염의 존재에서 pH 3.0으로 15분의 배양 후 적어도 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 또는 50의 % 잔여 활성을 가진다.

pH 3.0에서 개선된 안정성의 리파아제 변형체의 특정 예는(SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열을 가지는 리파아제에 관하여): LV2934, LVA043, LVA049, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LV1857, LVA012, LVA023, LVA041, LVA061, 및 LVA099 이다. 펩신의 존재하에 pH 3.0에서 개선된 안정성을 가지는 특정의 바람직한 리파아제는 LVA043, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LV1857, LVA012, 및LVA099이다. 펩신의 존재하에 pH 3.0으로 개선된 안정성을 가지는 리파아제의 추가 예는 LVA147, LVA315, LVA317, LVA319, 및 LVA714이다. 이는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1, 및 LV2934의 리파아제 중 하나와 비교하여 개선된다. 담즙산염의 존재하에 pH 3.0에서 개선된 안정성을 가지는 다른 특정의 바람직한 리파아제 변형체는 LVA349이다. 이들 리파아제 변형체의 구조에 대해 표 1 및 실시예 4를 참조.

다른 특정의 구체예에서, 이는 예를 들어, 스크리닝 목적을 위해 덜 정제된 리파아제 제제에 특히 유용할 수 있으며, pH 3.0에서 안정성은 하기와 같이 측정된다: 제 1 효소는 75 ug/mL 펩신의 존재하에 pH 3.0 및 실온에서 3시간 동안 전-배양되며, 그 후 잔여 리파아제 활성은 시간에 걸쳐 활성을 모니터링하는 속도 분석으로 측정된다. 바람직한 구체예에서, i) 잔여 활성 분석을 위한 기질은 4-니트로페놀 팔미테이트, 바람직하게는 1 mM PNP-팔미테이트, 1.2% 트리톤-X100, 4 mM CaCl₂, 100 mM 트리스, pH 8.0이고; ii) 잔여 활성 분석을 위해, OD₄₀₅ 판독은 기질 첨가 후 15분에 및 기질 첨가 후 18시간 까지 확인되고; iii) OD₄₀₅ 판독은 시간 당 mOD(밀리 OD)로서 표현되고; iv) 선형 범위에 속하는 데이터가 수집되며 각 펩신-처리된 샘플의 잔여 리파아제 활성은 대응하는 미처리 샘플의 잔여 리파아제 활성과 비교되고; v) % 잔여 활성 (%RA)은 처리 조건의 속도를 미처리된 조건의 속도로 나누고 그 결과에 100을 곱함으로써 계산된다. 더욱 상세하게는 실시예 8을 참조. 하기 변형체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열을 가지는 리파아제와 비교하여 펩신의 존재에서 pH 3.0에서 개선된 안정성을 가진다: SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제, LVAR0002b, LVAR0003, LVAROOHa, LVAR0013, LVAR0014, LVAR0015, LVAR0016, LVAR0017, LVAR0045, LVAR0046, LVAR0047, LVAR0048, LVAR0050, LVAR0051, LVAR0052, LVAR0053, LVAR0054, LVAR0055, LVAR0056, LVAR0057, LVAR0058, LVAR0059, LVAR0061, LVAR0062, LVAR0063, LVAR0064, LVAR0065, LVAR0066, LVAR0067, LVAR0068, LVAR0069, LVAR0070, LVAR0071, LVAR0072, LVAR0101, LVAR0102, 및 LVAR0106. 바람직한 변형체는 LVAROOHa, LVAR0013, LVAR0017, LVAR0046, LVAR0052, LVAR0055, LVAR0061, LVAR0063, LVAR0068, LVAR0070, LVAR0071, LVAR0072, LVAR0014, LVAR0015, LVAR0057, LVAR0101, LVAR0102, 및 LVAR0106이다. 특히 바람직한 리파아제 변형체는 LVAR0014, LVAR0015, LVAR0057, LVAR0101, LVAR0102, 및 LVAR0106이다. 이들 변형체의 구조는 표 6 및 9에 나타낸다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 펩신의 존재하에서, 예를 들어 70 mg/ml 펩신의 존재하에서, 바람직하게는 15, 45, 60, 및/또는 120 분 동안 요망되는 pH (e.g. pH 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 또는 6.0) 및 37℃에서 안정하다. 더욱 상세하게는, 실시예 4를 다루는 상기 단락을 참조.

또한 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 담즙산염의 존재, 예를 들어, 10mM 담즙산염의 존재에서, 바람직하게는 15, 45, 및/또는 120 분 동안 요망되는 pH (예를 들어, pH 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 또는 6.0) 및 37℃에서 안정하다. 더욱 상세하게는, 실시예 4를 다루는 상기 단락을 참조.

또한 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열을 가지는 리파아제 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269의 서열을 가지는 리파아제와 같은 기준 리파아제와 비교하여 개선된 포스포리파아제 활성을 가진다. 포스포리파아제 활성 하기와 같이 결정될 수 있다: i) 정제된 효소는 예를 들어, A₂₈₀을 기준으로 5 mgEP/ml에 대해 효소 희석 완충제(20 mM Na-아세테이트, 0.01% w/w 트리톤-X100, pH 5.0)에서 희석되며; ii) 1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 상의 활성이 바람직하게는 40℃에서 20분 동안 결정되고; iii) 유리된 자유 지방산은 바람직하게는 50% MeOH, 0.1%TFA (매트릭스) 중 20 mg/mL 2,5-디히드로-벤조산과 혼합 후 MALDI-TOF MS로 결정되고 정량화되고; iii) MS 피크의 상대적인 신호 강도(각 피크하 면적)은 포스포리파아제 A1과 A2 활성 사이의 분포의 계산을 위해 사용된다.

SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제와 같은 기준 리파아제와 비교하여 가수분해 후 남은 개선된 % 소화되지 않은 인지질을 가지는 리파아제는 개선된 포스포리파아제 활성을 가진다.

SEQ ID NO: 2와 비교하여 개선된 포스포리파아제 활성을 가지는 리파아제 변형체의 특정 예는 LV1889, LVA023, LV1330, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LVA043, LVA049, LV1857, 및 LV1232이다. 바람직한 리파아제는 LV1232 및 LV1889이다.

또한 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제와 같은 기준 리파아제와 비교하여, 및/또는 LV2934(SEQ ID NO: 1의 디글리코실화된 변형체 N33Q)와 비교하여 생체밖 소화 모델에서 개선된 성능을 가진다. 생체 밖 모델은 규정식 I, 또는 규정식 II의 사용을 만들며, 이는 실험 부분에서 기술된다. 간단히 말하면, 100 ul의 규정식은 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 20 ul 펩신 (700 mg/ml)과 30 ul 리파아제(4 농도의 2배)와 함께 혼합되며, 이는 5.7 내지 6.0의 pH를 야기하는 25 ul 완충제 (0.8 M MES (2-[N-모르폴리노]에탄술폰산), 0.8 M 아세트산나트륨, 0.8 M 이미다졸, pH 7.0) 및 20 ul 담즙산염(100 mM)을 첨가하기 전에 진탕(750 rpm)하면서 37℃에서 1 시간 동안 배양된다. 플레이트를 그 후 2시간 동안 37℃에서 교반하면서 배양한 후 1 M 인산 중 50 ul 10% 트리톤-X100을 첨가함으로써 반응을 멈춘다. 1% 트리톤-X100 중 125-250 회 희석시킨 후, 자유 지방산의 양은 실시예 3에서 기술하는 NEFA C 키트와 같은 비색 키트를 사용하여 결정된다.

생체 밖 개선된 성능의 리파아제의 예는 LVAR0003, LVAR0045, LVAR0046, LVAR0047, LVAR0050, LVAR0051, LVAR0052, LVAR0053, LVAR0054, LVAR0056, LVAR0057, LVAR0061, LVAR0062, LVAR0063, LVAR0064, LVAR0065, LVAR0067, LVAR0069, 및 LVAR0072이다. 다른 예는 LVAR0074, LVAR0076, LVAR0077, LVAR0078, LVAR0079, LVAR0080, LVAR0086, LVAR0088, LVAR0091, LVAR0094, LVAR0095, LVAR0096, LVAR0099, LVAR0101, LVAR0102, LVAR0103, LVAR0104, LVAR0106, 및 LVAR0108이다. 바람직한 예는 LVAR0003, LVAR0013, LVAR0032, LVAR0050, LVAR0058, 및 LVAR0069이다. 더 바람직하게는 LVAR0063, LVAR0067, LVAR0069, LVAR0079, LVAR0080, LVAR0094, LVAR0095, LVAR0096, LVAR0099, LVAR0101, LVAR0102, LVAR0103, LVAR0104, LVAR0106, 및 LVAR0108이다. 가장 바람직하게는 LVAR0094, LVAR0099, LVAR0095, 및 LVAR0106이다.

또한 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 생체 내 개선된 성능을 가진다. 생체 내 성능은 실시예 10에서 기술되는 유발된 췌장 외분비 기능부전(PEI)을 가지는 암컷 괴팅겐 미니돼지(Ellegaard)에서 및/또는 실시예 11에서 기술되는 전체 생체 내 소화가능성 실험에서 리파아제 스크리닝 시험 중에 측정될 수 있다. 성능은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제 및/또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제의 탈글리코실화된 변형체 N33Q이 되는 LV2934에 대해 개선될 수 있다. 이 시험에 대해 더욱 상세하게는, 실시예 10을 참조.

본 발명의 리파아제는 바람직하게는 하기 치환 중 적어도 하나를 포함한다: N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, L69I, E87K, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, G163K, S216P, L227G, T231R, N233R, D234K, E239V.

본 발명의 리파아제는 바람직하게는 하기 치환 중 적어도 하나를 포함한다: N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, E56C, E56S, D57A, D57G, D57N, V60L, L69I, E87K, G91A, G91 E, G91N, G91R, G91S, G91T, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, N94S, D96E, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M, L97Q, K98I, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, D111A, D111S, T114I, L147S, G163K, E210D, S216P, L227G, T231R, N233R, D234K, E239V, Q249R, N251S, D254N, P256T, G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A, 및/또는 L269N.

특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제; (ii) (i)의 리파아제의 변형체 N33Q (iii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 -5-269 (-5 내지 +269), -4-269 (-4 내지 +269), -3-269 (-3 내지 +269), -2-269 (-2 내지 + 269), -1-269 (-1 내지 +269), 및 2-269; (iv) (iii)의 서열 중 어떤 하나의 변형체 N33Q; 아미노-말단 메티오닌 잔기를 가지는 어떤 하나의 구체예 (i), (ii), (iii), 및/또는 (iv), (v) 폴리히스티딘 트랙을 가지는 어떤 하나의 구체예 (i), (ii), (iii), (iv), 및/또는 (v); (vi) WO 2006/136159의 5p, 4-18 줄에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 보존적치환을 가지는 구체예 (i), (ii), (iii), (iv), (v) 및/또는 (vi) 중 어떤 하나; (vii) WO 2006/136159의 p. 6, 4-14 줄에서 정의되는 앞의 구체예 중 어떤 하나의 부분; (iix) WO 2006/136159의 p.6, 34줄 내지 p. 7, 11 줄에서 정의되는 변형체의 특정 혼합물; (ix) 및/또는 WO 2006/136159에서 약학적 사용을 위해 구체적으로 개시되는 리파아제가 아니다.

본 발명의 특히 바람직한 리파아제는 LV1232, LV1855, LV1857, LV1865, LV1874, 및 LV1889이다.

본 발명의 다른 특정의 바람직한 리파아제는 모 리파아제의 변형체인 하기의 리파아제이며, (T231R+N233R) 및 추가로 적어도 하나의 하기 치환을 포함한다: N26I, D27Q, D27R, D27Y, A30V, T32I, N33Y, P42L, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56C, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, E87K, G91E, G91N, G91 R, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M. L97Q, K98I, E99K, E99P, E99S, E99T, D111A, D111S, T114I, L147S, G163K, S216P, L227G, D234K, E239V, Q249R, D254N, G263Q, L264A, I265T, G266D, 및/또는 L269N.

리파아제, 프로테아제, 아밀라아제

하기 리파아제는 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다: 어떤 하나의 리파아제가 청구되며 본원에 개시되고, 추가로 하기 N-말단 확장 중 어떤 하나를 포함한다: 각각 아미노산 SEQ ID NO: 2의 -5 내지 -1, SEQ ID NO: 2의 -4 내지 -1, SEQ ID NO: 2의 -3 내지 -1, SEQ ID NO: 2의 -2 내지 -1 및 SEQ ID NO: 2의 -1에 대응하는 SPIRR, PIRR, IRR, RR, 및 R. 또한 어떤 이들 N-말단 버전 중 어떤 혼합물은 본원에 구체적으로 포함된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제의 특정 활성은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제의 특정 활성의 적어도 50%이다. 추가의 특정 구체예에서, 변형체 리파아제의 특정 활성은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제의 특정 활성의 적어도 60, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 적어도 95%이다. 특정 활성은 본원의 실시예 1의 어떤 리파아제 분석을 사용하여 측정될 수 있지만, 바람직하게는 실시예 1의 LU-분석을 사용하여 LU/mg 효소 단백질에서 측정되고, 예를 들어, 실시예 2에서 기술하는((A₂₈₀ 및 GPMAW) 효소 단백질 함량을 결정하고 또는 아미노산 분석을 사용한다. 아미노산 분석에서, 리파아제 샘플의 펩티드 결합은 산 가수분해를 받은 후, 예를 들어, Bie & Bemtsen A/S, Sandbaekvej 5-7, DK-2610 Roedovre, Denmar로부터 구매가능한 Biochrom 20 Plus Amino Acid Analyser에서 제조업자의 설명서에 따라 방출된 아미노산의 분리 및 정량을 받는다. 각 개별 아미노산의 양은 닌히드린과 반응으로 결정된다.

또한 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 리파아제는 추가 리파아제와 조합에 사용된다. 추가 리파아제의 예는, 포유동물 리파아제, 미생물 리파아제이다. 바람직한 포유동물 리파아제는 예를 들어, 돼지 또는 황소로부터의 판크레아틴과 같은 췌장 추출물이다. 판크레아틴은 미코팅(미가공) 생성물의 형성, 또는 제형으로 된 생성물의 형성(장 코팅(위산에 대한 저항을 제공), 또는 비-기능적 코팅(코팅이지만 위산에 대한 저항을 제공하지 않음))에 사용될 수 있다. 판크레아틴은 잠재적으로 또한 췌장 프로테아제 및/또는 췌장 아밀라아제와 같은 추가의 효소적 활성 성분을 포함한다. 미생물 리파아제는, 예를 들어, 박테리아 또는 진균 리파아제를 기초로 하거나 또는 이것으로부터 유래될 수 있다. 박테리아 리파아제는, 예를 들어, 바실루스(Bacillus) 또는 슈도모나스(Pseudomonas)로부터 유래될 수 있고, 진균 리파아제는 예를 들어, 리조푸스(Rhizopus), 칸디다(Candida), 또는 후피콜라(Humicola), 예로써, 리조푸스 델레마르(Rhizopus delemar), 리조푸스 자바니쿠스(Rhizopus javanicus), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 또는 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa)의 균주, 특히 Amano Pharmaceuticals, Japan으로부터 구매가능한 생성물 Lipase D2™ 또는 Lipase D Amano 2000™(리파아제, EC 3.1.1.3)중 하나로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 리파아제는 하기 기술되는 아밀라아제와 함께 또는 아밀라아제 없이 프로테아제와 조합하여 사용될 수 있다. 용어 "프로테아제"는 펩티드 결합을 가수분해하는 효소로서 본원에 정의된다. 이는 EC 3.4 효소군에 속하는 어떤 효소를 포함한다(각각 그것의 13개의 하위 분류를 포함하며, 이들 효소는 하기에 "EC 3.4.-.- 군에 속함"으로서 언급된다).

프로테아제의 예는 포유동물 프로테아제 및 미생물 프로테아제이다. 바람직한 포유동물 프로테아제는 예를 들어, 돼지 또는 황소로부터의 췌장 추출물, 예로써 판크레아틴이다. 판크레아틴은 미코팅(미처리) 생성물의 형태 또는 제형으로 된 생성물의 형태(장 코팅, 또는 비-기능적으로 코팅)에서 사용될 수 있다. 판크레아틴은 잠재적으로 또한 추가의 효소 활성 성분 유사 췌장 리파아제, BSSL(Bile Salt Stimulated Lipase) 및/또는 췌장 아밀라아제를 포함한다.

미생물 프로테아제는, 예를 들어, 박테리아 또는 진균 균주를 기초로 하거나 이것으로부터 유래될 수 있다. 프로테아제는 아스페르길루스(Aspergillus), 예로써 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 또는 아스페르길루스 멜레우스(Aspergillus melleus)의 균주, 특히 Amano Pharmaceuticals, Japan으로부터 구매가능한 생성물 Prozyme 6™ (중성, 알칼린 프로테아제 EC 3.4.21.63)로부터 유래될 수 있다. 박테리아 프로테아제의 예는 바실러스(Bacillus) 및 노카르디옵시스(Nocardiopsis), 예로써, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274의 아미노산 서열을 가지는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 프로테아제, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188의 아미노산 서열을 가지는 노카르디옵시스 속(Nocardiopsis sp.) 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188의 아미노산 서열을 가지는 노카르디옵시스 다손빌레이 아속 다손빌레이 프로테아제(Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei)로부터의 프로테아제이다. SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274의 프로테아제는, 예를 들어, WO 2006/136160에서 기술되는 바와 같이 제조될 수 있다. SEQ ID NO: 4-5의 아미노산 1-188의 프로테아제는 예를 들어, WO 2001/58276 또는 WO 2004/111224에서 기술되는 바와 같이 제조될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 프로테아제는 (i) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274, (ii) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188 중 하나를 가지거나 포함하는 프로테아제와 적어도 70% 동일하다. (i), (ii) 또는 (iii) 중의 하나의 추가 바람직한 구체예에서, 동일성의 정도는 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99%이다. (i), (ii), 또는 (iii) 중 하나의 또 다른 구체예에서, 동일성의 정도는 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 적어도 69%이다.

상기 기술된 바와 같은 프로테아제와 함께 또는 없이 본 발명의 리파아제는 또한 아밀라아제와 조합하여 사용될 수 있다.

본 문맥에서, 아밀라아제는 전분 및 다른 선형 및 분지형 올리고- 및 폴리사카라이드의 엔도-가수분해를 촉매하는 효소이다. 전분의 아밀로오스 부분은 1,4-알파-글루코시드 결합에서 풍부하며, 한편 아밀로펙틴 부분은 1,4-알파- 뿐 아니라 1,6-알파-글루코시드 결합을 함유하여 더욱 분지된다. 특정 구체예에서, 아밀라아제는 EC 3.2.1.1 군에 속하는 효소이다.

특정 구체예에서, 아밀라아제는 포유동물 아밀라아제 또는 미생물 아밀라아제이다. 포유동물 아밀라아제의 예는 돼지 또는 황소로부터의 췌장 추출물, 예로써 판크레아틴이 있다. 판크레아틴은 미코팅(미정제) 생성물의 형태, 또는 제형으로 된 생성물(장 코팅, 또는 비-기능적으로 코팅)의 형태로 사용될 수 있다. 판크레아틴은 잠재적으로 또한 추가의 효소 활성 성분 유사 췌장 프로테아제 및/또는 췌장 리파아제를 포함한다. 미생물 아밀라아제는, 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 아스페르길루스(Aspergillus), 또는 리조푸스(Rhizopus)와 같은 박테리아 또는 진균 균주를 기초로 또는 이로부터 유래될 수 있다.

아밀라아제는 특히 아스페르길루스(Aspergillus), 예로써, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 또는 아스페르길루스 멜레우스(Aspergillus melleus), 예를 들어, Amano Pharmaceuticals, Japan으로부터 구매가능한 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae)로부터 유래되는 생성물 Amylase A1™ 또는 Extract-Chemie, Germany로부터 구매가능한 아스페르길루스 멜레우스(Aspergillus melleus)로부터 유래되는 Amylase EC™ 중 하나의 균주로부터 유래될 수 있다.

바람직한 아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481(예로써, 그것의 아미노산 1-481, 1-484, 또는 1-486), SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481, 및/또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483을 포함하는 아밀라아제이다. 바람직한 구체예에서, 아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483 중 하나와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 가지거나 포함한다. SEQ ID NOs: 6-8의 아밀라아제는, 예를 들어, 동시 계류중인 WO 2006/136161에서 기술되는 바와 같이 제조될 수 있다. 추가의 바람직한 구체예에서, (i), (ii), 또는 (iii) 중 하나는, 동일성의 정도가 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99%이다. 또 다른 구체예에서, (i), (ii), 또는 (iii) 중의 하나는, 동일성의 정도가 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 적어도 69%이다.

일반적으로, 리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제 효소(본원에서 후에, "효소(들)" 즉, 본 발명의 효소)는 천연 또는 야생형 효소(동물, 특히 포유동물, 예를 들어 인간 또는 돼지 효소로부터; 식물 또는 미생물로부터 획득)이지만, 또한 요망되는 효소 활성 및 셔플링, 하이브리드 또는 키메릭 효소 및 콘센서스 효소와 같은 합성 효소를 나타내는 그것의 어떤 돌연변이, 변형체, 분획 등일 수 있다.

특정 구체예에서, 효소(들)은 인간을 포함하는 동물에 노출될 때 감소된 면역반응을 일으키도록 고안된 낮은-알레르기 유발 변형체이다. 용어 면역 반응은 효소(들)에 노출된 동물의 면역체계에 의한 어떤 반응으로서 이해되어야 한다. 면역 반응 중 한 종류는 노출된 동물에서 IgE의 증가된 수준을 야기하는 알레르기 반응이다. 낮은-알레르기 유발 변형체는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 효소(들)은 면역 반응에 포함된 효소(들)의 부분 또는 에피토프를 막는 폴리머 부분들과 콘쥬게이트될 수 있다. 폴리머와의 콘쥬게이션은 예를 들어, WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026, 및/또는 WO 99/00489에 기술된 바와 같이 효소(들)에 폴리머의 생체 밖 화학적 커플링을 포함할 수 있다. 콘쥬게이션은 그것에 추가로 또는 또 다르게는 효소(들)에 폴리머의 생체내 커플링을 포함할 수 있다. 이러한 콘쥬게이션은 효소(들)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 유전자 엔지니어링에 의해 효소(들) 내 첨가 글리코실화 자리를 코딩하는 콘센서스 서열을 삽입하고 효소(들)을 글리코실화할 수 있는 숙주 내 효소(들)을 발현하여 달성될 수 있다, 예를 들어, WO 00/26354 참조. 낮은-알레르기 유발 변형체를 제공하는 다른 방법은 효소(들)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 유전적 엔지니어링이며 따라서 효소를 자기-올리고머화하는 원인이 되며, 효소 모노머가 다른 효소 모노머의 에피토프를 쉴딩하고 따라서 올리고머의 항원성을 낮출 수 있도록 초래한다. 이러한 생성물 및 그것의 제제는 예를 들어, WO 96/16177에서 기술된다. 면역 반응에 포함되는 에피토프는 WO 00/26230 및 WO 01/83559에 기술되는 파지 디스플레이법과 같은 다양한 방법 또는 EP 561907에서 기술되는 무작위적 접근에 의해 확인될 수 있다. 일단 에피토프가 확인되면, 그것의 아미노산 서열은 자리 지정 돌연변이법과 같은 알려진 유전자 처리 기법에 의해 효소(들)의 변경된 면역 특성을 만들기 위해 변경될 수 있고(예를 들어, WO 00/26230, WO 00/26354 및/또는 WO 00/22103 참조) 및/또는 폴리머의 콘쥬게이션은 에피토프를 쉴딩하기 위해 폴리머에 대한 에피토프에 충분한 접근으로 될 수 있다.

특정 구체예에서, 효소(들)은 (i) pH 2-8에서, 바람직하게는 pH 3-7에서, 더 바람직하게는 pH 4-6에서 안정하고; (ii) pH 4-9, 바람직하게는 4-8에서 활성이고; (iii) 펩신에 의한 분해 및 다른 소화 프로테아제에 안정하고(예로써, 췌장 프로테아제, 즉, 주로 트립신 및 키모트립신); 및/또는 (iv) 담즙산염의 존재에서 안정 및/또는 활성이다.

용어 "조합하여"는 리파아제, 프로테아제 및/또는 아밀라아제의 본 발명에 따른 조합된 사용을 말한다. 조합된 사용은 동시, 중복 또는 순차적일 수 있으며, 이들 3개의 용어는 일반적으로 의사에 의해 지시된 처방을 고려하여 해석된다.

용어 "동시에"는, 예를 들어 그것들이 하나 이상의 별개의 약학 생성물로서 동일한 시간에 투여될 때, 또는 그것들이 하나 및 동일한 약학 조성물로 투여된다면 효소가 동일한 시간에서 활성 하의 어떤 상황에 있는 것을 말한다.

용어 "순차적"은 하나 및/또는 두 가지의 효소들이 첫번째, 및 두번째 및/또는 그 후에 세번째 효소로 작용하는 경우를 말한다. 순차적인 작용은 요망되는 간격을 가지는 별개의 약학적 제형으로서 또는 당해 효소가 별도로 제형으로 되는 하나의 약학적 조성물로서, 예를 들어, 다른 방출 시간을 얻고 개선된 생성물 안정성을 제공하고 또는 효소 투약을 최적화하기 위해 위한 견지에서 당해 효소를 투여함으로써 얻어질 수 있다.

용어 "중복"은 효소 활성 기간이 완전히 동시도 완전히 순차적인 것도 아닌, 즉, 효소가 둘 다 또는 모두 활성인 특정 기간에 있는 경우를 말한다.

단수의 용어는, 예를 들어, 본 발명의 프로테아제, 리파아제 및/또는 아밀라아제의 문맥에서 사용될 때, 적어도 하나를 의미한다. 특정 구체예에서, 단수의 용어는 또한 1, 2, 3, 4, 5 등을 의미하는 "하나 이상" 또는 "적어도 하나"를 의미한다.

본 발명의 효소(들)의 활성은 어떤 적당한 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 일반적으로, 분석-pH 및 분석-온도는 당해 효소에 적당할 수 있다. 분석-pH-값의 예는 pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12이다. 분석-온도의 예는 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 또는 95℃이다. 바람직한 pH 값 및 온도는 생리적 범위, 예로써, 4, 5, 6, 7, 또는 8의 pH 값 및 30, 35, 37, 또는 4O℃의 온도에 있다.

적당한 효소의 예는 실험적 부분에 포함된다. 다른 예는 프로테아제 및 아밀라아제 활성을 위한 FIP 또는 Ph.Eur 분석이다. 이들 분석은, 예를 들어, 각각 동시계류중인 WO 2006/136160 및 WO 2006/136161에서 기술된다.

약제

본 문맥에서, 용어 "약제"는 질병의 증상을 치료하고, 예방하고 및/또는 완화하며, 바람직하게는 질병의 증상을 치료하고 및/또는 완화하는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 의미한다. 약제는 의사에 의해 처방될 수 있고, 또는 일반의약품(over-the-counter product)일 수 있다.

약학 조성물

본 발명의 효소(들)의 분리, 정제 및 농축은 통상적인 수단에 의해 실행될 수 있다. 예를 들어, 그것들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 공정에 의해 발효 배양액으로부터 회수될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 크로마토그래피(예를 들어, 이온교화, 친화도, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기배제), 전기영동 공정(예를 들어, 분취 등전 초점화), 차별적인 용해도(예를 들어, 황산 암모늄 침전), SDS-PAGE, 또는 추출(예를 들어, 단백질 정제, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)을 포함하는 공지된 다양한 공정에 의해 추가로 정제된다.

예를 들어, SEQ ID NO: 1의 리파아제와 같은 SEQ ID NO: 2의 리파아제의 변형체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,869,438을 기초로(SEQ ID NO: 1는 본원의 SEQ ID NO: 2의 리파아제를 코딩하는 DNA 서열이다), 즉, 미국 특허의 SEQ ID NO: 1의 변형인 DNA 서열의 적당한 숙주 세포에서 재조합에 의해 제조될 수 있고, 변형은 본원의 SEQ ID NO: 1과 2 사이의 아미노산 차이를 반영한다. 이러한 변형은 당업계에서 알려진 바와 같은 자리-지정 돌연변이로 만들어질 수 있다.

특정 구체예에서, 각 효소(들)의 농축된 고체 또는 액체 제제는 개별적으로 제조된다. 이들 농축은 또한, 적어도 부분적으로, 하기에서 더욱 상세하게 설명되는 바와 같이 개별적으로 제형으로 될 수 있다.

추가의 특정 구체예에서, 효소(들)은 고체 농축물의 형태로 본 발명의 약학 조성물에 포함된다. 효소(들)은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 고체 상태로 될 수 있다. 예를 들어, 고체 상태는 효소 분자들이 매우 정돈된 형태로 배열된 결정, 또는 효소 분자들이 덜 정돈된 또는 무질서하게 배열된 형태로 배열된 침전물 중 하나 일 수 있다.

결정화는, 예를 들어, 효소(들)의 pI에 근접한 pH 및 낮은 전도도, 예를 들어, EP 691982에 기술된 바와 같이 10 mS/cm 미만에서 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따르는 사용을 위한 리파아제는 결정 리파아제이며, 이는 EP 600868 B1의 실시예 1에 기술되는 바와 같이 제조될 수 있다. 리파아제 결정은 추가로 WO 2006/044529에 기술되는 교차 결합일 수 있다.

다양한 침전 방법은 황산 암모늄 및/또는 황산 나트륨과 같은 염으로; 에탄올 및/또는 이소프로판올과 같은 유기 용매로; 또는 PEG(폴리 에틸렌 글리콜)와 같은 폴리머로 침전을 포함하여 당업계에 알려져 있다. 또 다르게는, 효소(들)은 당업계, 예를 들어, 동결건조, 증발(예를 들어 감압), 및/또는 분무 건조로 공지된 다양한 방법에 의해 용매(전형적으로 물)를 제거함으로써 용액으로부터 침전될 수 있다.

추가의 특정 구체예에서, 효소(들)의 고체 농축물은 고체 농축물의 전체 단백질 함량에 대한 기준으로써 적어도 50% (w/w)의 활성 효소 단백질의 함량을 가진다. 또한 추가의 특정 구체예에서, 고체 농축물의 전체 함량에 대한 활성 효소 단백질의 함량은 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 적어도 95% (w/w)이다. 단백질 함량은, 예를 들어, BIO-RAD로부터 GS-800 측정된 농도계를 사용하여 쿠마씨-염색 SDS-PAGE 겔의 농도계 스캐닝에 의해; Roche로부터 구매 가능한 Protein Assay ESL, 주문번호 1767003과 같은 상업적인 키트를 사용하여; 또는 WO 01/58276의 실시예 8에 기술되는 방법을 기초로 당업계에 공지된 바와 같이 측정될 수 있다.

바람직하게는, 효소 단백질(예를 들어, 리파아제 효소 단백질)은 적어도 50%, 더 바람직하게는 쿠마씨-염색 SDS-PAGE 겔의 농도계 스캐닝에 의해 측정되는 바와 같이 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96 또는 적어도 97%의 본 발명에 따르는 사용을 위한 고체 효소 농축물의 단백질 스펙트럼을 구성한다. 이러한 효소들은 지정된 "분리된", "정제된" 또는 "정제 및 분리된" 효소들 또는 폴리펩티드일 수 있다. 아스페르길루스(Aspergillus)에서 발현되고 WO 2006/136159의 실시예 5에서 설명된 바와 같은 다양한 N-말단 형태의 혼합물을 포함하는 리파아제에 대해, SDS-PAGE 겔 상의 적절한 밴드는 34-40 kDa의 분자량에 대응하여 위치된다. SEQ ID NO: 1 (LV2934)의 N33Q와 같은 비-글리코실화된 변형체에 대해, 적절한 밴드가 약 30 kDa에서 위치된다.

본 발명의 약학적 조성물은, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예로써, (i) 적어도 하나의 담체 및/또는 부형제; 또는 (ii) 적어도 하나의 담체, 부형제, 희석제 및/또는 보조제와 함께 바람직하게는 농축된 효소 제제, 더 바람직하게는 고체 농축물의 형태로 효소(들)을 포함한다. 모든 약학적으로 허용가능한 선택적인, 다른 성분들의 비-제한적 예는 붕괴제, 윤활제, 완충제, 습윤제, 보존제, 향미제, 용매, 가용화제, 현탁제, 에멀젼화제, 안정화제, 추진제 및 비히클이다.

일반적으로, 당해 의학적 표시에 의존하는, 본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 모든 투여 방식을 위해 지정될 수 있고, 바람직하게는 장 투여(소화관을 통해)를 포함한다. 따라서, 조성물은 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 형태, 예로써, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 마이크로스피어, 연고, 크림, 거품, 용액, 좌약, 주사, 흡입기, 겔, 로션 및 에어로졸일 수 있다. 의학 종사자들은 가장 적당한 투여 경로를 선택하는 것을 알 것이고 물론 잠재적으로 위험한 또는 다른 불리한 투여 경로를 피할 것이다.

하기 방법 및 보조 물질은 따라서 또한 단지 예시적이며 어떤 방법의 제한을 하는 것은 아니다.

고체 경구 제제에 대해, 효소(들)은 단독으로 또는 적절한 첨가제와 조합하여 펠렛, 마이크로펠렛, 정제, 마이크로정제, 분말, 과립 또는 캡슐, 예를 들어, 락토오스, 만니톨, 옥수수 전분, 또는 감자 전분과 같은 통상적인 담체와 함께; 결정질 또는 마이크로결정질, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 부형제 또는 결합제와 함께; 옥수수 전분, 감자 전분, 또는 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 붕괴제와 함께; 카나우바 왁스, 백랍, 셸락, 무수 콜로이드 실리카, 1500 내지 20000의 폴리에틸렌 글리콜(PEG, 또한 용어 매크로골 하에 공지), 특히 PEG 4000, PEG 6000, PEG 8000, 포비돈, 활석, 모놀레인, 또는 스테아린산 마그네슘과 같은 윤활제; 및 원한다면, 희석제, 보조제, 완충제, 습윤제, 메틸파라히드록시벤조에이트(E218)와 같은 보존제, 이산화티타늄(E171)과 같은 염색제, 및 사카로오스, 사카린, 오렌지 오일, 레몬 오일, 및 바닐린과 같은 향미제와 조합하여 사용될 수 있다. 경구 제제는 PEI의 의학적 표시의 치료를 위한 바람직한 제제의 예이다.

효소(들)은 또한, 상당히 일반적으로, 물과 같은 수성 용매에 또는 식물성 또는 다른 유사한 오일과 같은 비-수성 용매, 합성 지방산 글리세리드, 고급 지방산의 에스테르, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 예로써 PEG 4000, 또는 2-프로판올과 같은 선형 또는 분기된 C1-C4 알코올에서 원한다면, 용해제, 보조제, 희석제, 등장화제, 현탁화제, 에멀젼화제, 안정화제 및 보존제와 같은 통상적인 보조 물질 또는 첨가제와 함께 그것들을 용해, 현탁화 또는 에멀젼화 함으로써 액체 경구 제제로 제형으로 될 수 있다.

게다가, 효소(들)은 일반적으로 에멀젼 염기 또는 수용성 염기와 같은 다양한 염기와 혼합함으로써 직장 투여를 위한 좌약으로 만들어질 수 있다. 좌약은 신체 온도에서 녹고, 또한 실온에서 고형화되는 코코아 버터, 카르보왁스 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 비히클을 포함할 수 있다.

전달 비히클로서 리포좀의 사용은 가능한 일반적 관심의 다른 방법이다. 리포좀은 표적 자리의 세포와 융합하며 세포내로 내강의 내용물을 전달한다. 리포좀은 분리, 결합제 등과 접촉을 유지하기 위한 다양한 수단을 사용하여 융합을 위한 충분한 시간 동안 세포와 접촉하여 유지된다. 본 발명의 한 양태에서, 리포좀은 폐 투여를 위해 에어로졸화 되도록 고안된다. 리포좀은 정제된 단백질 또는 센다이 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 등과 같은 막의 융합을 중재하는 펩티드와 함께 제조될 수 있다. 지질은 포스파티딜콜린과 같은 양이온성 또는 쯔비터 이온성 지질을 포함하는 지질을 형성하는 공지된 리포좀의 어떤 유용한 조합일 수 있다. 남은 지질은 정상적으로 콜레스테롤, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 글리세롤 등과 같은 중성 또는 산성 지질일 수 있다. 리포좀을 제조하기 위해, Kato et al., 1991 , J. Biol. Chem. 266:3361에서 기술되는 공정이 사용될 수 있다.

시럽, 부형제, 분말 및 현탁액과 같은 경구 또는 직장 투여를 위한 단위 투약 형태가 제공될 수 있으며, 각 단위 투약, 예를 들어, 티스푼, 테이블스푼, 캡슐, 정제 또는 좌약은 효소(들)의 미리 결정된 양을 함유한다. 유사하게, 주사 또는 정맥 주사 투여를 위한 단위 투약 형태는 멸균수, 생리식염수 또는 다른 약학적으로 허용가능한 담체 중 용액으로서 조성물에서 효소(들)을 포함할 수 있다.

본원에 사용되는, 용어 "단위 투약 형태"는 인간 및 동물 피험자를 위한 단위 투약으로서 적당한 물리적으로 별개의 단위, 원하는 효과를 만들기에 충분한 양으로 효소(들)의 미리 결정된 양을 함유하는 각 단위를 말한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 장, 바람직하게는 경구, 투여이다.

추가의 특정 구체예에서, 경구 조성물은 (i) 효소(들)의 결정을 함유하는 액체 조성물; (ii) (매우) 정제된 효소(들)의 침전의 액체 현탁액; (iii) 고체 또는 용해된 형태로 효소(들)을 함유하는 겔; (iv) 고정된 효소(들) 또는 액체 등에 흡착된 효소의 액체 현탁액; 또는 (v) 효소(들)-함유 분말, 펠렛, 과립 또는 마이크로스피어의 형태, 원한다면 정제, 캡슐 등의 형태이며, 선택적으로, 예를 들어 산-안정 코팅으로 코팅되는 고체 조성물이다.

본 조성물의 다른 특정 구체예에서, 효소(들)은 구획, 즉, 예를 들어, 개별 코팅에 의해 서로 분리된다.

본 조성물의 또한 추가 특정 구체예에서, 프로테아제는 리파아제 및/또는 아밀라아제와 같은 조성물의 다른 효소 성분으로부터 분리된다.

효소(들)의 투약은 투여되는 특정 효소(들), 투여 빈도, 투여 방식, 증상의 중증도 및 부작용에 대한 피험자의 민감성 등에 의존하여 매우 광범위하다. 일부 특정 효소는 다른 것들보다 더욱 강력할 수 있다.

본 발명의 효소(들)의 고체 경구 제제의 예는: (i) 본 발명의 리파아제; (ii) a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274를 가지는 프로테아제, b) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188을 가지는 프로테아제, 및 c) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188을 가지는 프로테아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 프로테아제와 적어도 70% 동일성을 가지는 프로테아제; 및/또는 (iii) a) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481을 가지는 아밀라아제, b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481을 가지는 아밀라아제, 및 c) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483을 가지는 아밀라아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 아밀라아제와 적어도 70% 동일성을 가지는 아밀라아제를 포함하며, 바람직하게는 (i), (ii) 및 (iii)의 효소의 예상되는 매일의 임상적인 투약은 하기와 같다(체중(bw)의 kg 당 mg 효소 단백질 중 모두): (i)의 리파아제에 대해: 0.01-1000, 0.05-500, 0.1-250, 또는 0.5-100 mg/kg bw; (ii)의 아밀라아제에 대해: 0.001-250, 0.005-100, 0.01-50, 또는 0.05-10 mg/kg bw; (iii)의 프로테아제에 대해: 0.005-500, 0.01-250, 0.05-100, 또는 0.1-50 mg/kg bw.

본 발명의 효소(들)의 고체 경구 제제의 바람직한 예는: (i) 본 발명의 리파아제, 및 (ii) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라아제, 및/또는 (iii) 바람직하게는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274를 가지는 것을 포함하는 프로테아제를 포함한다.

(i), (ii), 및 (iii)의 효소의 예상되는 매일의 임상적 투약의 예는(체중(bw)의 kg 당 mg 효소 단백질 중 모두) 하기와 같다: (i)의 리파아제에 대해: 0.1-250, 0.5-100, 또는 1-50 mg/kg bw; (ii)의 리파아제에 대해: 0.01-50, 0.05-10, 또는 0.1-5 mg/kg bw; (iii)의 리파아제에 대해: 0.05-100, 0.1-50, 또는 0.5-25 mg/kg bw.

아미드(펩티드) 결합 뿐 아니라 아미노 및 카르복시 말단은 경구 투여에서 더 큰 안정성을 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 카르복시 말단이 아미드화될 수 있다.

소화장애, PEI, 췌장염, 낭포성 섬유증, I형 당뇨병, 및/또는 II형 당뇨병의 치료에 적당한, 본 발명의 약학 조성물의 특정 구체예는 본 발명의 효소(들)이 펠렛에 포함됨으로써 제조될 수 있다. 펠렛은 일반적으로 생리학적으로 허용가능한 유기 폴리머의 10-90%(w/w, 결과 펠렛의 건조 중량에 대해), 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 유도체의 10-90%(w/w, 결과 펠렛의 건조 중량에 대해), 및 효소(들)의 80-20%(w/w, 결과 펠렛의 건조 중량에 대해)를 포함할 수 있고, 유기 폴리머, 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 유도체 및 효소(들)의 전체량은 각 경우에 100%로 구성된다.

생리학적으로 허용가능한 유기 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 1500, 폴리에틸렌 글리콜 2000, 폴리에틸렌 글리콜 3000, 폴리에틸렌 글리콜 4000, 폴리에틸렌 글리콜 6000, 폴리에틸렌 글리콜 8000, 폴리에틸렌 글리콜 10000, 폴리에틸렌 글리콜 20000, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌의 공중합체 및 상기 유기 폴리머의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 4000은 생리학적으로 허용가능한 유기 폴리머로서 바람직하다.

셀룰로오스 또는 셀룰로오스 유도체는, 예를 들어, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 지방산 에스테르, 셀룰로오스 질산염, 셀룰로오스 에테르, 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 메틸 에틸셀룰로오스 및 메틸히드록시프로필 셀룰로오스로부터 선택될 수 있다. 셀룰로오스는, 특히 미정질 셀룰로오스는 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 유도체로서 바람직하다.

결과 펠렛은 적당한 장 코팅, 다른 비 기능적 코팅으로 코팅될 수 있고, 또는 이러한 코팅 없이 직접적으로 사용될 수 있다. 추가로, 결과 펠렛은 경질 젤라틴캡슐과 같은 캡슐에 또는 상기에 더욱 상세하게 기술된 질병 또는 질환의 요법을 위한 적당한 크기의 젤라틴이 없는 캡슐에 채워질 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 다른 효소 종류, 특히 리파아제, 프로테아제 및/또는 아밀라아제로부터 만들어진 펠렛은 상기 캡슐에 채워질 수 있다. 다른 효소 종류로 캡슐을 채우는 동안, 어떤 리파아제, 프로테아제 및/또는 아밀라아제의 특정량을 캡슐에 첨가함으로써 단일 효소 종류(즉, 리파아제, 프로테아제 또는 아밀라아제)의 용량 특정 표시 군 또는 특정 환자 하위군의 특정 필요에 적합하게 될 수 있으며, 즉, 캡슐은 리파아제: 프로테아제: 아밀라아제의 특정비로 다양하게 제조될 수 있다.

본 발명의 리파아제의 바람직한 약학적 조성물은 WO 2005/092370에서 기술되며, 특히 제형은 그것에 언급된 바람직한 표시를 포함한다. 구체적으로 바람직한 구체예에서, 약학 조성물은 모노-, 디- 및 트리-아실글리세리드의 마크로골글리세리드 혼합물 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 지방족 C6-C22 카르복실산의 모노- 및 디-에스테르, 및 또한 글리세롤 및 자유 폴리에틸렌 글리콜의 가능한 작은 부분을 포함한다.

마크로골글리세리드 혼합물에 함유된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 바람직하게는 분자 당 또는 200 내지 2000의 분자량 당 평균 6 내지 거의 40 산화 에틸렌 단위를 가지는 PEG이다.

본 발명의 한 추가 양태는 계면활성제, 공동-계면활성제 및 친유성 상으로 구성되는 시스템을 포함하기 위한 본 발명의 효소(들)의 약학 조성물을 제공하며, 시스템은 10 이상의 LVB 값(친수성-친유성 밸런스) 및 30℃ 이상의 융점을 가진다. 바람직한 구체예에서, 시스템은 10 내지 16, 바람직하게는 12 내지 15의 LVB 값을 가지며, 30 내지 600℃, 바람직하게는 40 내지 500℃의 융점을 가진다. 특히, LVB 값 및 융점을 특징으로 하는 시스템은 8 내지 20, 바람직하게는 8 내지 18개의 탄소 원자를 가지는 지방족 카르복실산을 가지는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드와 모노- 및 디에스테르의 혼합물이며, 폴리에틸렌 글리콜은 바람직하게는 분자 당 약 6 내지 약 32개의 산화에틸렌 단위를 가지고, 시스템은 선택적으로 자유 글리세린 및/또는 자유 폴리에틸렌 그릴콜을 함유한다. 이러한 시스템의 LVB 값은 바람직하게는 PEG의 사슬 길이에 의해 조절된다. 이러한 시스템의 융점은 지방산의 사슬 길이, PEG의 사슬 길이 및 지방산 사슬의 포화도 따라서 마크로골글리세리드 혼합물의 제제를 위한 출발 오일에 의해 조절된다.

"지방족 C8-C18 카르복실산"은 카프릴산(C8), 카프릭산 (C10), 라우르산(C12), 미리스트산 (C14), 팔미트산 (C16) 및 스테아르산(C18)이 상당한 그리고 가변적인 비율로 함유되는 혼합물을 의미하며, 이들 산이 포화된다면, 불포화된 C8-C18 카르복실산에 대응한다. 이들 지방산의 비율은 출발 오일에 따라서 다양하다.

8 내지 18개의 탄소 원자를 가지는 지방족 카르복실산을 가지는 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드와 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 모노- 및 디에스테르의 이러한 혼합물은 200 내지 1500의 분자량을 가지는 폴리에틸렌 글리콜과 출발 오일 사이의 반응에 의해 얻어질 수 있으며, 출발 오일은 카프릴산, 카프릭산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산 및 리놀렌산을 개별적으로 또는 혼합물로서 함유하는 군으로부터 선택되는 지방산과 트리글리세리드 혼합물로 구성된다. 선택적으로, 이러한 반응의 생성물은 또한 글리세린과 자유 폴리에틸렌 글리콜의 적은 비율을 함유할 수 있다.

이러한 혼합물은 예를 들어, 상표명 Gelucire® 하에 구매가능하다. 본 발명의 한 가지 유리한 구체예는, 상표명 Gelucire® 하에서 공지된 생성물을 제공하며, 특히 "Gelucire® 50/13" 및/또는 "Gelucire® 44/14"는 본 발명에 따르는 약학적 제제에서 사용을 위한 적당한 혼합물을 나타낸다.

Gelucire® 50/13는 각각 결합된 지방산의 주요 비율을 구성하는 40% 내지 50% 및 48% 내지 58%에서 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드와 폴리에틸렌 글리콜의 모노- 및 디에스테르, 팔미트산(C16) 과 스테아르산(C18)과의 혼합물이다. 카프릴산 (C8)과 카프릭산(C10)의 비율은 각 경우에 3% 미만이며, 각 경우에 라우르산(C12)과 미르스트산(C14)의 비율은 5% 미만이다.

Gelucire® 44/14는 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드와 폴리에틸렌 글리콜의 모노- 및 디에스테르의 혼합물이며, 팔미트산(C16)의 각 비율은 4 내지 25%, 스테아르산(C18) 5 내지 35%, 카프릴산(C8) 15% 미만, 카르릭산(C10) 12% 미만, 라우르산(C12) 30 내지 50% 및 미리스트산(C14) 5 내지 25%이다. Gelucire® 44/14는 예를 들어, 팜 커넬 오일 및 폴리에틸렌 글리콜 1500을 사용하는 알코올 분해/에스테르화 반응에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예는 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드와 지방족 C8-C18 카르복실산의 폴리에틸렌 글리콜 모노- 및 디에스테르 및 또한 가능하게는 글리세린과 자유 폴리에틸렌 글리콜의 적은 비율의 혼합물을 함유하는 시스템을 포함하는 본 발명의 효소(들)의 약학적 조성물을 제공하며, 시스템은 40℃ 내지 55℃의 융점 및 12 내지 15의 범위에 있는 LVB 값을 가진다. 더 바람직하게는, 시스템은 44℃ 내지 50℃의 융점 및 13-14의 범위에서 LVB 값을 가진다. 또 다르게는, 시스템은 약 44℃의 융점 및 14의 LVB 값을 가지며, 시스템은 약 50℃ 및 13의 LVB 값을 가진다.

처리 방법

선택적으로 프로테아제 및/또는 아밀라아제(본 발명의 효소(들))와 조합하여 본 발명에 따르는 사용을 위한 리파아제는 동물에서 다양한 질병 또는 장애의 치료적 및/또는 예방적 처리에 유용하다. 용어 "동물"은 모든 동물, 및 특히 인간을 포함한다. 동물의 예는 비-반추동물, 및 양, 염소 및 소, 예를 들어, 식용우 및 황소와 같은 반추 동물이다. 특정 구체예에서, 동물은 비-반추 동물이다. 비 반추 동물은 예를 들어, 말, 돼지(이에 제한되는 것은 아니지만, 새끼 돼지, 성장 돼지 및 암돼지를 포함); 칠면조, 오리 및 닭(이에 제한되는 것은 아니지만, 브로일러 병아리, 암탉을 포함); 어린 송아지; 고양이 및 개와 같은 애완동물; 및 어류(이에 제한되는 것은 아니지만, 연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 잉어)를 포함; 및 갑각류(이에 제한되는 것은 아니지만 새우 및 참새우를 포함)를 포함한다. 특정 구체예에서, 동물은 포유동물이며, 더 구체적으로는 인간이다.

예를 들어, 효소(들)은 위 및 췌장으로부터 정상적으로 선택되는 소화 효소의 위장관에 종종 불충분한 생산 및/또는 분비에 의해 야기되는 소화장애증 또는 소화불량과 같은 소화장애의 치료에 유용하다.

추가로, 효소(들)은 PEI의 치료에 특히 유용하다. PEI는 Borgstrom test (JOP. J Pancreas (Online), 2002; 3(5):116-125)를 사용하여 증명될 수 있으며, 췌장암, 췌장 및/또는 위 수술과 같은 질병 및 질환, 예를 들어, 췌장, 위절제술, 위장 우회술 후(예를 들어, Billroth II 위장문합술); 만성 췌장염; 슈바치만 다이아몬드 증후군; 췌장 또는 총담관의 경로 폐쇄(예를 들어, 종양); 및/또는 낭포성 섬유증 (췌장의 관을 막는 두꺼운 점액에서 유래된 질병)에 의해 야기될 수 있다.

소화장애 상의 효소(들)의 효과는 일반적으로 EP 0600868에서 기술되는 바와 같이 측정될 수 있고, 실시예 2는 위 상태 하에서 리파아제 안정성을 측정하기 위한 생체 밖 소화흡수율 시험을 기술하고 실시예 3은 담즙산염의 존재하에 리파아제 활성을 위한 생체 밖 소화흡수율을 기술한다. 대응하는 시험은 프로테아제 및 아밀라아제를 위한 설정일 수 있다. 또한 WO 02/060474는 적당한 시험은, 예를 들어, (1) 돼지 시험 사료에서 지질 소화를 측정하기 위한 생체 밖 시험, 및 (2) 지방, 단백질 및 전분의 소화흡수율이 측정되는 췌장이 부적당한 돼지로 생체 내 시도를 개시한다.

다른 예로서, 효소(들)은 특히 보조제 처리에서 보통 이 질병을 수반하는 소화장애의 당뇨병 요법에서 후기 합병증을 감소시키기 위한 관점으로 I형 및/또는 II형 당뇨병의 치료에 유용하다.

효소(들)의 당뇨병에서의 효과는, 예를 들어, 글리코실화된 헤모글로빈의 수준, 혈액 글루코오스 수준, 저혈당성 발작, 비타민 A, D, 및 E와 같은 지용성 비타민의 상태, 필요로되는 매일의 인슐린의 투약, 체중 지표 및 고혈당 기간을 조절함으로써 WO 00/54799에서 기술되는 하나 이상의 방법으로써 결정될 수 있다.

본원에 기술되고 청구되는 본 발명은 본원에 개시되는 특정 구체예로써 범주가 제한되는 것은 아니며, 이들 구체예가 본 발명의 다수의 양태의 예시로서 의도되기 때문이다. 어떤 동등한 구체예는 본 발명의 범주 내인 것으로 의도된다. 게다가, 본 발명의 다양한 변형들은 본원에 보여지고 기술되는 것들에 더하여 앞선 언급한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형들은 또한 청구항의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서를 조절할 것이다.

특정 구체예

본 발명은 또한 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-269의 서열과 비교하여 약제로서 사용을 위한 리파아제에 관한 것이며, 리파아제는 치환 N33Q, T231R, 및 N233R 및 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 치환과 같은 제 1 항 내지 제 2 항 및 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 하나의 치환을 포함한다:

추가로 상기 리파아제는:

(a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열에 적어도 50% 동일성을 가지며;

(b) 본원에 참고로써 포함되는 미국 특허 번호 5,869,438의 SEQ ID NO: 1의 서열을 코딩, 또는 (ii) (i)의 전장 상보 가닥을 가지는 매우 낮은(바람직하게는 낮음, 중간, 중간-높음, 높음, 또는 가장 바람직하게는 매우 높음) 엄격한 조건하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드로 코딩되고; 및/또는

(c) 추가로 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩티드, 바람직하게는 보존 특성의 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 변형체이다.

매우 낮은 내지 매우 높은 엄격한 조건은 5X SSPE1 0.3% SDS1 200 마이크로g/ml의 끊어지고 변성된 연어 정자 DNA에서 사전 혼성화 및 혼성화로서 정의되며, 매우 낮은 및 낮은 엄격함에 대한 25% 포름아미드, 중간 및 중간-높음의 엄격함에 대한 35% 포름아미드, 또는 높은 및 매우 높은 엄격함에 대한 50% 포름아미드 중 하나는 최적으로는 12 내지 24 시간 동안 표준 서던 블롯팅 절차를 따른다. 담체 물질은 최종적으로 바람직하게는 45℃에서(매우 낮은 엄격함), 더 바람직하게는 50℃에서(낮은 엄격함), 더 바람직하게는 55℃에서(중간의 엄격함), 더 바람직하게는 60℃에서(중간-높은 엄격함), 훨씬 더 바람직하게는 65℃에서(매우 엄격함), 및 가장 바람직하게는 70℃에서(매우 높은 엄격함) 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 3회 세척된다.

상보적 특성의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩 및/또는 활성에 중요하게 영향을 미치지 않으며, 소 결실, 전형적으로 1 내지 약 30개의 아미노산; 소 아미노- 또는 카르복실-말단 확장, 예로써 아미노-말단 메티오닌 잔기; 약 20-25 이상의 잔기의 소 링커 펩티드; 또는 순전하 또는 다른 기능을 변화시킴으로써 정제를 촉진하는 소 확장, 예로써 폴리-히스티딘 트랙, 항원 에피토프 또는 결합 도메인을 포함한다.

본 발명은 추가로 바람직하게는 약제로서 사용을 위한 다양한 모 리파아제에 관한 것이며, 이 변형체는 하나 이상의 위치에서 변형을 포함하고, 상기 위치는 모 효소에서 하나 이상의 위치에 대응한다:

(a) 또 다른 변형(들)은 독립적으로

(i) 위치의 바로 아래 부분에 아미노산의 삽입,

(ii) 위치를 점유하는 아미노산의 결실, 및/또는

(iii) 위치를 점유하는 아미노산의 치환;

(b) 변형은 제 1-2 항 및 제 5-9 항 중 어느 한 항의 변형으로부터 선택되고;

(C) 변형체는 리파아제 활성을 가지며;

(d) 각 위치는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가지는 효소의 아미노산 서열의 위치에 대응한다.

특정 구체예에서, 변형체, 및/또는 모체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 서열과 적어도 50% 동일성을 가진다.

변형체에서 변형의 총 수는 바람직하게는 22, 21, 20, 19, 18, 17, 또는 16이다. 더 바람직하게는 변형의 총 수는 15, 훨씬 더 바람직하게는 14, 훨씬 더 바람직하게는 13, 훨씬 더 바람직하게는 12, 훨씬 더 바람직하게는 11, 훨씬 더 바람직하게는 10, 훨씬 더 바람직하게는 9, 훨씬 더 바람직하게는 8, 훨씬 더 바람직하게는 7, 훨씬 더 바람직하게는 6, 훨씬 더 바람직하게는 5, 훨씬 더 바람직하게는 4, 훨씬 더 바람직하게는 3, 훨씬 더 바람직하게는 2, 및 가장 바람직하게는 1이다.

변형체는 하나 이상의 일치하는 모 리파아제를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 셔플링함으로써 제조될 수 있다. 용어 "셔플링"은 시작 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 다수의 교환된 뉴클레오티드를 가지는 재조합된 뉴클레오티드 서열(즉, 셔플링 사이클을 받는 뉴클레오티드 서열)을 야기하는 2 이상의 일치하는 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 서열(들)의 재조합을 의미한다.

SEQ ID NO: 2 의 리파아제의 하기 변형체는 제 6 항 및 제 9 항의 리파아제의 예이다:

하기는 본 발명의 추가의 특정 구체예이다(SEQ ID NO: 1의 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 리파아제의 변형체(T231R+N233R)):

1. 리파아제는 모 리파아제의 변형체이며, 변형체 (a)는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269와 적어도 50% 동일성을 가지고; (b)는 리파아제 활성을 가지고; 및 (c)는 하기 치환으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는 약제로서 사용을 위한 리파아제: N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56C, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, V60L, L69I, E87K, G91A, G91E, G91N, G91R, G91S, G91T, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, N94S, D96E, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M, L97Q, K98I, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, D111A, D111S, T114I, L147S, G163K, E210D, S216P, L227G, T231R, N233R, D234K, E239V, Q249R, N251S, D254N, P256T, G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A, 및 L269N, 각 위치는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 위치에 대응하고; (d) 단, 변형체는 (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제가 아니고, (ii) (i)의 리파아제의 변형체 N33Q가 아니다.

2. 리파아제는 모 리파아제의 변형체이며, 변형체는 (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269와 적어도 50% 동일성을 가지며; (b) 리파아제 활성을 가지고; (c) 치환 T231R 및 N233R을 포함하며 추가로 적어도 하나의 치환은 하기 치환으로부터 선택되는 약제로서 사용을 위한 리파아제: N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56C, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, V60L, L69I, E87K, G91A, G91E, G91N, G91R, G91S, G91T, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, N94S, D96E, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M, L97Q, K98I, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, D111A, D111S, T114I, L147S, G163K, E210D, S216P, L227G, D234K, E239V, Q249R, N251 S, D254N, P256T, G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A, 및 L269N, 각 위치는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 위치에 대응하고; (d) 단, 리파아제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269의 변형체 N33Q가 아니다.

3. 리파아제는 모 리파아제의 변형체이며, 변형체는 (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269와 적어도 50% 동일성을 가지고; (b) 리파아제 활성을 가지며; (c) 위치 30, 42, 114, 및/또는 163 중 적어도 하나에서 적어도 하나의 치환을 포함하고, 각 위치는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 위치에 대응하는 약제로서 사용을 위한 리파아제.

4. 리파아제는 모 리파아제의 변형체이며, 변형체는 (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269와 적어도 50% 동일성을 가지며; (b) 리파아제 활성을 가지고; (c) 하기 치환으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하며: A30T, A30V, P42L, T114I, 및 G163K, 각 위치는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 위치에 대응하는 약제로서 사용을 위한 리파아제.

5. 리파아제는 모 리파아제의 변형체이며, 변형체 (a)는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269와 적어도 50% 동일성을 가지고; (b)는 리파아제 활성을 가지고; (c)는 하기 변형체로부터 선택되는 약제로서 사용을 위한 리파아제:

각 위치는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 위치에 대응한다.

6. 변형체는 (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269에 적어도 50% 동일성을 가지며; (b) 리파아제 활성을 가지고; (c) 위치 30, 42, 114, 및/또는 163 중 적어도 하나에서 적어도 하나의 치환을 포함하고, 각 위치는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 위치에 대응하는 모 리파아제의 변형체인 리파아제.

7. 변형체는 (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269와 적어도 50% 동일성을 가지며; (b) 리파아제 활성을 가지고; (c) 하기 치환 중 적어도 하나를 포함하고: D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33T, N33Y, P42L, D57A, D57N, G91V, T1141, G163K, N251S, 각 위치는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 위치에 대응하는 모 리파아제의 변형체인 리파아제.

8. 변형체는 (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269와 적어도 50% 동일성을 가지며; (b) 리파아제 활성을 가지고; (c)는 하기 변형체로부터 선택되는 모 리파아제의 변형체인 리파아제:

9. 약제로서 사용을 위한 프로테아제 또는 아밀라아제와 조합에서 구체예 1 내지 8 중 어느 하나의 리파아제.

10. 약제로서 사용을 위한 프로테아제와 아밀라아제와 조합에서 구체예 1 내지 8 중 어느 하나의 리파아제.

11. 구체예 9 또는 10에 따르는 프로테아제 및/또는 아밀라아제와 조합한 리파아제, (i) 프로테아제는 a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274를 가지는 프로테아제, b) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188을 가지는 프로테아제, 및 c) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188을 가지는 프로테아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 프로테아제와 적어도 70% 동일성을 가지며; (ii) 아밀라아제는 a) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481을 가지는 아밀라아제, b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481을 가지는 아밀라아제, 및 c) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483을 가지는 아밀라아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 아밀라아제와 적어도 70% 동일성을 가진다.

12. 소화장애, 췌장 외분비 기능부전, 췌장염, 낭포성 섬유증, I형 당뇨병, 및/또는 II형 당뇨병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 구체예 1-8 중 어느 하나로 정의된 리파아제 또는 리파아제의 혼합물의 사용.

13. 구체예 12에 있어서, 프로테아제 또는 아밀라아제의 사용을 추가로 포함하는 사용.

14. 구체예 12에 있어서, 프로테아제 및 아밀라아제의 사용을 추가로 포함하는 사용.

15. 구체예 13 또는 14에 있어서, 프로테아제 및/또는 아밀라아제는 구체예 11에 정의된 바와 같은 사용.

16. 소화장애, 췌장 외분비 기능부전, 췌장염, 낭포성 섬유증, I형 당뇨병, 및/또는 II형 당뇨병의 치료에서 사용을 위한 구체예 1-8 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 리파아제.

17. 구체예 16에 있어서 프로테아제 또는 아밀라아제와 조합한 리파아제.

18. 구체예 16에 있어서 프로테아제 및 아밀라아제와 조합한 리파아제.

19. 구체예 16 또는 17에 있어서, 프로테아제 및/또는 아밀라아제는 구체예 11에서 정의된 바와 같은 리파아제.

20. 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 보조 물질과 함께 구체예 1-8 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 리파아제 또는 리파아제의 혼합물을 포함하는 약학 조성물.

21. 구체예 20에 있어서, 추기로 프로테아제 또는 아밀라아제를 포함하는 조성물.

22. 구체예 20에 있어서, 추가로 프로테아제 및 아밀라아제를 포함하는 조성물.

23. 구체예 21 또는 22에 있어서, 프로테아제 및/또는 아밀라아제는 구체예 11에 정의된 바와 같은 조성물.

24. 구체예 1-8 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 리파아제 또는 리파아제의 혼합물의 치료적으로 유효한 양을 투여함으로써 소화장애, 췌장 외분비 기능부전, 췌장염, 낭포성 섬유증, I형 당뇨병, 및/또는 II형 당뇨병의 치료를 위한 방법.

25. 구체예 24에 있어서, 추가로 프로테아제 또는 아밀라아제의 치료적으로 유효한 량을 투여하는 것을 포함하는 방법.

26. 구체예 24에 있어서, 추가로 프로테아제 및 아밀라아제의 치료적으로 유효한 량을 투여하는 것을 포함하는 방법.

27. 구체예 25 또는 26에 있어서, 프로테아제 및/또는 아밀라아제는 구체예 11에서 정의된 바와 같은 방법.

다양한 참고문헌이 본원에 인용되며, 이것의 개시는 그것 전체가 참고로써 포함된다.

사용된 화학물질은 적어도 시약 등급의 상업적 제품이었다. 탈이온수는 Milli-Q 시스템 (QPAK1 , Millipore, 카탈로그 번호 CPMQ004R1)로부터 얻는다.

실시예 1 : 효소 분석

돼지 판크레아틴의 리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제의 분석은 FIP (Federation Internationale Pharmaceutique) 뿐 아니라 European Pharmacopoeia 및 United States Pharmacopeia에 의해 공개되었다. 1 FIP-단위 = 1 Ph.Eur.-단위 (European Pharmacopoeia). 분석은 예를 들어, Federation Internationale Pharmaceutique, Scientific Section: International Commission for the standardisation of pharmaceutical enzymes, a) "Pharmaceutical Enzymes," Editors: R. Ruyssen and A. Lauwers, E. Story Scientia, Ghent, Belgium (1978), b) European Pharmacopoeia에서 기술된다. 또한 Deemester et al in Lauwers A, Scharpe S (eds): Pharmaceutical Enzymes, New York, Marcel Dekker, 1997, p. 343-385 참조. 적절한 효소 표준은 하기로부터 획득될 수 있다: International Commission on Pharmaceutical Enzymes, Centre for Standards, Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent. 리파아제 FIP 분석 및 리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제에 대한 다른 적당한 분석은 하기 기술된다.

리파아제 FIP 분석

판크레아틴의 지방분해 활성을 측정하기 위해, European Pharmacopoeia 5.1에 공개된 방법을 사용하였다. 달리 언급되지 않는다면, 미생물 리파아제의 지방분해 활성의 결정을 위해, FIP에 의해 공개된 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae) 리파아제에 대한 분석을 사용하였다.

리파아제 pNP 분석

기질: 파라-니트로-페닐 (pNP) 발레레이트

분석 pH: 7.7

분석 온도: 40℃

반응 시간: 25 min

황색을 띄는 증해 생성물을 405nm에서 특징적인 흡광도를 가진다. 그것의 양을 분광광도법에 의해 결정한다. 리파아제 활성은 공지된 활성의 효소 표준에 대해 결정될 수 있다. 활성은 Lipolase Units (LU)에서 발현될 수 있다. 한 LU (Lipolase Unit)는 상기 표준 조건 하에서 분 당 1 mmol 적정가능한 부티르산을 방출하는 효소의 양이다. 1 KLU = 1000 LU. 더욱 상세한 분석 기술, AF95/6-GB (트리부트린 기질에서 리파아제/에스터라아제 - pH-STAT 방법 (LU)) 및 LU 표준은 Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark으로부터 요청시 이용가능하다.

리파아제 LU 분석

이 분석에서, pH 7.00 및 30℃ (+/- 1℃)에서 0.16 M 트리부티린(글리세롤 트리부티레이트, Merck 1.01958.000)의 리파아제-촉매된 분해 후 탈기된 0.025 M로 방출된 부티르산, CO₂-없는 수산화 나트륨(수산화나트륨 티트리졸, Merck 9956)의 pH-stat 적정을 하였다. 적정제의 소비를 시간 함수로서 기록한다.

기질을 0.6% w/v 아라비아 고무 에멀젼화제로 에멀젼화 한다(20.0 g 아라비아 고무, 89.5 g NaCl, 2.05 g KH₂PO₄, 1.5 I에 물을 첨가, 완전하게 용해될 때까지 방치, 2700 ml 글리세롤을 첨가, pH를 4.5로 조절. 90 ml의 트리부티린을 300 ml 아라비아 고무 에멀젼화제와 1410 ml 탈염수와 혼합하였고, 예를 들어 7000 rpm에서 Silverson emulsifier를 사용하여 3분 동안 균질화한 후 pH 4.75로 조절하였다). 리파아제-샘플을 0.1 M 글리신 완충제 pH 10.8에서, 다음에 탈염수에서 희석시키고, 1.5-4.0 LU/ml의 활성 수준으로 맞추었다. 15 ml의 에멀젼화된 기질 용액을 적정 용기에 쏟는다. 1.0 ml 샘플 용액을 첨가하고, pH를 적정 동안 7.0으로 유지한다. 일정한 pH를 유지하기 위해 분 당 첨가된 적정제의 양을 측정한다. 활성 계산은 적정 곡선의 선형 범위의 평균 기울기를 기준으로 한다. 공지된 활성의 표준은 수준 확인으로서 사용될 수 있다.

1 LU (리파아제 단위)는 상기 주어진 분석 조건 하에서 분 당 1 마이크로 몰의 적정가능한 부티르산을 방출하는 효소의 양이다. 1 kLU (킬로 리파아제 단위) = 1000 LU.

더 상세한 분석 기술, EB-SM-0095.02는 Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark로부터의 요청시 이용가능하다.

리파아제 pH stat 분석

이 분석은 0.65 mM 담즙산염의 존재에서 올리브 오일 에멀젼으로부터 지방산의 리파아제-촉매된 방출을 기초로 한다. 기질은 에멀젼화제로서 아라비아 고무로 에멀젼화된다(블렌더에서 15분 동안 630 ml 아라비아 고무 용액(74.6 g 아라비아 고무, 4000ml 물 중 64 g 염화칼슘)으로 에멀젼화된 175g 올리브 오일; 실온으로 냉각 시킨 후, pH를 4 M NaOH를 사용하여 pH 6.8 - 7.0으로 조절한다).

결정을 위해, 19 ml의 에멀젼과 10ml 담즙산 염 용액(492 mg 담즙산염을 물에 용해시키고 500ml 까지 채운다)을 반응 용기에서 혼합하고 36.9℃ 내지 37.5℃로 가열한다. 반응을 1.0 ml의 효소 용액의 첨가로 시작한다. 방출한 산을 총 5분 동안 0.1 M 수산화 나트륨의 첨가에 의해 pH 7.0에서 자동적으로 적정한다. 활성을 1번째와 5번째 분 사이의 적정 곡선의 기울기로부터 계산한다. 계산을 위해, 표준을 활성의 3개의 다른 수준에서 측정한다.

프로테아제 Suc - AAPF - pNA 분석

기질: Suc-AAPF-pNA (Sigma S-7388).

분석 완충제: 100 mM 숙신산, 100 mM HEPES (Sigma H-3375), 100 mM CHES (Sigma C-2885), 100 mM CABS (Sigma C-5580), 1 mM CaCl₂, 150 mM KCl, 0.01% 트리톤-X100 (분자당 산화 에틸렌의 평균수가 약 9 또는 10인 경우 분자식: C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)_n을 가지는 비이온성 계면활성제, CAS #: 9002-93-1)을 HCl 또는 NaOH로 pH 9.0으로 조절하였다.

분석 온도: 25℃.

300 마이크로리터 희석한 프로테아제 샘플을 1.5 ml의 분석 완충제와 혼합하였고, 활성 반응을 1.5 ml pNA 기질을 첨가함으로써 시작하고(1.0 ml DMSO에서 50mg을 용해하고 추가로 0.01% 트리톤-X100로 45x 희석한다), 혼합 후, A₄₀₅ 중 증가를 프로테아제 활성의 측정으로 분광광도계로 모니터링하였다. 프로테아제 샘플을 모든 활성 측정이 분석을 위한 용량-반응 곡선의 선형 부분 내로 되도록 보장하기 위해 활성 측정 전에 희석하였다.

프로테아제 AU 분석

변성시킨 헤모글로빈(요소-함유 6.7 mM KH₂PO₄/NaOH 완충제 중 0.65% (w/w), pH 7.50)을 프로테아제에 의해 10분 동안 25℃에서 분해시켰고 여과로 제거하였다. 여액 중 TCA-가용성 헤모글로빈 분해 산물을 Folin & Ciocalteu's phenol reagent(2 부피의 탈염수에 대해 1 부피의 Folin-Ciocalteu Phenol Reagent Merck 9001.0500)으로 결정하여, 다수의 아미노산을 푸른 색을 제공한다(750 nm에서 측정됨). 활성 단위(AU)를 측정하고 표준에 대한 참고로써 정의한다. 변성시킨 헤모글로빈 기질을 하기와 같이 제조할 수 있다: 1154 g 요소 (Harnstoff, Merck 8487)를 1000 ml 탈염수 중 용해시키고, 240.3 g NaOH를 첨가한 후 서서히 63.45 g 헤모글로빈(Merck 4300) 다음에, 315.6 g KH₂PO₄와 3260 g까지 탈염수를 첨가하였다. 더 상세하게는 적당한 알칼라아제 표준은 Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark (assay no. EB-SM-0349.01)로부터 요청시 이용가능하다.

아밀라아제

기질: 파데바스 정제(Pharmacia Diagnostics; 교차결합된, 불용성의 푸른색 전분 폴리머, 이는 소 혈청 알부민과 완충제 물질과 혼합되고, 정제로 제조된다)

분석 온도: 37℃

분석 pH: 4.3 (또는 원한다면 7.0)

반응 시간: 20 분

수 중 현탁 후, 전분을 알파-아밀라아제로써 가수분해하여, 가용성의 푸른 분획을 제공한다. 620nm에서 측정된 결과 푸른 용액의 흡광도는 알파-아밀라아제 활성의 함수이다. 알파-아밀라아제 활성은 예를 들어, Fungal alpha-Amylase Units(FAU)으로 표시되는 공지된 활성의 표준에 대해 결정될 수 있다. 한 FAU는 표준 분석에서 시간 당 5.26 g 전분을 분해하는(Merck, Amylum solubile Erg. B. 6, Batch 9947275) 효소의 양이다. 더 상세한 분석 기술, APTSMYQ 1-3207, 및 FAU 표준은 Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark로부터의 요청시 이용가능하다.

실시예 2: 개선된 포스포리파아제 활성을 가지는 리파아제 변형체

PyrG 선택이 AMDS 선택 대신에 사용되는(WO 2004/069872에서 기술) 것을 제외하고, 하기 표 1에 나타내는 리파아제 변형체를 코딩하는 DNA를 미국 특허 5,869,438의 실시예 22에서 기술되는 방법을 사용하여 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 균주 ToC 1512 (WO 2005/070962에서 기술)로 변형시켰다. 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 숙주의 포자를 한천사면으로부터 취하였고 10 ml YPM (1O g 효모 추출물, Difco + 2O g 펩톤, Difco, 1 L로 물을 고압증기멸균하고; 2% (w/w)로 멸균 여과한 말토오스를 첨가한다)의 접종을 위해 사용하였다. 접종 튜브를 180rpm에서 New Brunswick Scientific Innova 2300 shaker로 30℃에서 3일 동안 배양하였다. 상청액을 Mira-Cloth (Calbiochem)로 배양을 여과함으로써 수확한 후 0.45 urn (마이크로 미터) 필터로 멸균여과 하였다. 리파아제 변형체를 미국 특허 5,869,438의 실시예 23에 일반적으로 기술된 바와 같이 정제하였다.

하기 리파아제는 비교를 위해 사용되며 또한 상기 기술한 바와 같이 제조된다:

후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) DSM 1800으로부터의 야생형 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열을 가지며 미국 특허 번호 5,614,189에서 약학적 사용을 위해 기술되고, 그것의 (T231R+N233R)-변형체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 가지며, WO 2006/136159에서 약학적 사용을 기술한다.

하기 리파아제는 양성 대조군으로서 적합하다(포스포리파아제 활성을 위한 양성):

SEQ ID NO: 2와 비교하여 하기 치환을 가지는 변형체 LV1232 : G91A + D96W + E99K + G263Q + L264A + I265T + G266D + T267A + L269N.

이 리파아제들을 하기에서 기술되는 포스포리파아제 활성에 대해 시험하였다.

효소:

효소 샘플을 5 mg/mL (ml 당 효소 단백질(EP)의 mg)로 효소 희석 완충제에서 희석하였다(20 mM Na-아세테이트, 0.01% w/w 트리톤-X100, pH 5.0). 효소 농도를 A₂₈₀ 및 계산한 몰 흡수 계수를 기준으로 결정하였다(프로그램 GPMAW (Lighthouse Data, Odense, Denmark; http://welcome.to/gpmaw ; 또한 Gill and von Hippel, 1989, Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data, Anal . Biochem . 182: 319-326 참조).

물질:

Avanti Polar Lipids Inc., 700 Industrial Park Drive, Alabaster, AL 35007, US, catalogue no. 850445로부터 구매가능한 물질 1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로-S-포스포콜린("포스파티딜콜린"에 따르는 것)의 용액을 하기와 같이 제조하였다:

1 37.5 mg 포스파티딜콜린을 750 uL (마이크로리터) 탈이온수에 용해

2 실온에서 1h 교반

3 37.5 uL 0.32 M CaCl₂를 첨가

4 1-2 분 동안 교반

5 375 uL 16 mM 디옥시콜산 나트륨을 첨가

6 750 uL 탈이온수를 첨가

7 실온에서 30분 동안 교반

효소 반응:

1 2 mL-에펜도르프 튜브에 100uL 기질을 전달

2 5 uL 효소를 첨가, 상기 기술한 바와 같이 5 mg/mL로 희석

3 40℃에서, 에펜도르프 열믹서에서 1000rpm으로 20분 동안 배양

4 새로운 에펜도르프 튜브에 10uL 반응 혼합물을 전달하고 990 uL 50% 메탄올 (MeOH), 0.1% (w/w) 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가

5 이 매트릭스: 50% MeOH 중 20 mg/mL 2,5-디히드로벤조산, 0.1%TFA와 혼합한 후 이것을 MALDI-TOF MS로 분석(매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화 비행시간형 질량분석법)

기질 대조군을 포함하며, 5 uL 효소 희석 완충제를 단계 2의 효소 대신 첨가하였다. 단계 5의 각 샘플에 대해 4개의 독립적인 결정을 하였다. 사용한 MALDI-TOF MS 장치는 외부 교정(Calmix 2, Applied Biosystems)을 가지는 반사기 모드에서 포지티브 이온화를 가지는 Voyager DE PRO 기기였다.

다른 길이의 에스테르-결합된 산을 가지는 글리세롤계 기질을 선택함으로써 분해된 글리세롤 백본의 질량을 측정하여 효소 특이성 사이(1-위치 또는 2-위치에서 공격)를 구별할 수 있다. 다양한 가능한 분해된 글리세롤 백본의 질량은:

706 Da 포스파티딜콜린

496 Da A1 가수분해 (위치 1에서 포스파티딜콜린 - 미리스토일(C14))

468 Da A2 가수분해 (위치 2에서 포스파티딜콜린 - 팔미토일 (C16))

258 Da A1 및 A2 가수분해 (미분해 포스파티딜콜린 - C14 및 C16)

결과:

706, 496, 468, 및 258Da의 Mw를 나타내는 MS 피크의 상대적인 신호 강도(각 피크하 영역)를 포스포리파아제 A1과 A2(PLA1- 및 PLA2-) 활성 사이의 분포의 계산을 위한 기준으로서 사용한다.

2개의 다른 실험(I 과 II) 결과는 하기 표 2와 3에서 나타낸다. 일반적으로, A2/A1에 대한 A1/A2의 10-15% 이상의 신호 강도는 순수한 이중의 활성 또는 불순한 샘플 중 하나를 나타낼 수 있다.

결론:

시험한 모든 리파아제는 주로 PLA1-활성으로서 어느 정도는 포스포리파아제 활성을 가진다. 양성 대조군, LV1232는 실험 둘 다에서 높은 포스포리파아제 활성을 보였다.

SEQ ID NOS: 1 및 2의 선행기술의 리파아제는 동일한 실험에서 시험하였을 때(실험 I) 포스포리파아제 활성에 관해 가수분해 후 미분해 인지질이 각각 대략 44% 및 42%로 남는 거의 동일한 성과를 나타내었다.

하기 리파아제 변형체는 SEQ ID NO: 2와 비교하여 개선된 포스포리파아제 활성을 가지는 것으로 생각된다: LV1232, LV1889 및 LVA023 (실험 I), 및 LV1232, LV1330, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LVA043, LVA049, 및 LV1857 (실험 II). 특히 변형체 LV1232 및 LV1889는 실험 둘 다에서 매우 많이 개선된 포스포리파아제 활성을 보인다.

실시예 3: pH 6에서 개선된 활성을 가지는 리파아제 변형체

상기 표 1에서 보이는 다수의 정제된 리파아제 변형체를 10 mM 담즙산염의 존재에서 pH 6의 활성에 대해 시험하였다. 실시예 1에서와 같이, SEQ ID NO: 2 및 1의 리파아제를 비교를 위해 포함한다.

화학물질 및 시약:

분석 완충제 pH 6: 100 mM 이미다졸, 100 mM 아세테이트, 100 mM 말론산, pH 6.0

효소 희석 완충제: 5 mM NaH₂PO₄ pH 7.0

7 mM CaCl₂ (Merck, 1.02382.0500)

담즙산염(80 mM): Solvay Pharmaceuticals제의 담즙산염 혼합물을 활성화하는 리파아제, 배치 176.01-PA-7374

트리리놀레인 (글리세릴 트리리놀레이트, Sigma T9517)

펩신: (Merck VL 317492437, 카탈로그 번호 1.0792.0001)

정지 용액: 10% 트리톤-X100, 1 M 인산.

기질: 기질 작용 에멀젼은 하기와 같이 제조하였다:

1. 2.188 mL 담즙산염 (80 mM)을 6.68 mL 탈이온수와 혼합.

2. 0.133 mL 트리리놀레인(글리세릴 트리리놀레이트, Sigma T9517)를 첨가.

3. 실온에서 ultraturex 믹서 (황색 라인 DI 25 염기성)로 1분간 혼합.

이는 19.44 mM 담즙산염과 15.56 mM 트리리놀레인을 가지는 기질의 작용 에멀젼을 제공한다.

효소:

효소 샘플을 5 mM NaH₂PO₄ pH 7.0 내지 0.07 mg/mL (ml 당 효소 단백질의 mg)에서 희석하였다. 효소 농도는 A₂₈₀을 기준으로 하였다. 효소를 5 mM NaH₂PO₄에서 2배 희석하였다(전체 6번의 희석을 하였고 어떤 효소/완충제 조절도 없었음). 이들 희석은 웰에서 효소의 하기 최종 농도를 제공한다: 0.01 mg/ml, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.0625, 0.03125, 및 0.015625 mg/ml.

분석 순서:

1. 마이크로 타이터 플레이트(MTP)에서 35 ul (마이크로 리터) 분석 완충제를 25 ul 7 mM CaCl₂와 혼합. 90 ul 기질 작용 에멀젼을 첨가. 37℃ 700rpm에서 20분 동안 사전 배양.

2. 25 ul의 각 효소 희석을 첨가하고, 37℃, 700rpm에서 30분 동안 배양(최종 부피 175 ul). MTP 웰에서 담즙산염 및 트리리놀레인의 최종 농도는 각각 10 mM 및 8 mM이다.

3. 50 ul 정지 용액 (10% Triton-X100, 1 M 인산) 및 25 ul 펩신(700 mg/l)을 첨가. 실온에서 10분 배양. pH가 이후 처리에서 증가될 때 프로테아제인 펩신을 리파아제 단백질의 재활성을 피하기 위해 첨가한다(자유 지방산의 결정(FFA)).

4. NefaC (Wako, Nefa C ACS-ACOD Method Enzymatic color test Code No: 999-75406)에 의해 FFA의 검출을 위해 샘플을 즉시 1% Triton-X100 중 10배 희석.

NefaC 키트의 자유 지방산의 검출 (NefaC ACS-ACOD Method Enzymatic color test Code No: 999-75406):

1. 용액 A 제조: 보틀 R1a는 보틀 R1 (NefaC 키트)의 10ml로 용해한다.

용액 B 제조: 보틀 R2a는 보틀 R2(NefaC 키트)의 20 ml로 용해한다.

2. Cal1 Nefa C 표준 올레산(28.2 mg/dl - 1 mmol/L)을 1% Triton-X100에 희석하여 NefaC 표준을 위한 다음의 농도를 얻는다: 1 mM, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 및 0.015625 mM.

3. 25 ul 표준/리파아제 샘플을 50 ul 용액 A와 혼합. 실온에서 700 rpm으로 15분 배양.

4. 100 ul 용액 B를 첨가, 700 rpm으로 15 분 실온에서 배양, 700 rpm.

결과:

mM로 FFA의 농도를 Nefa C 표준 곡선으로부터 결정한다. 리파아제 활성 결과는 Michealis-Menten-유사 적합에 적합하게 된다:

A=A0+Amax^*[E]/([E]+K)

V0를 결정하고(mmol FFA/g 효소/min), SEQ ID NO: 1의 리파아제에 대해 V0에 대한 비율을 결정한다. SEQ ID NO: 1의 리파아제 및 변형체 LV2934 (SEQ ID NO: 1의 비글리코실화된 변형체)를 대조군으로서 각 MTP에 포함하였다. SEQ ID NO: 1으로 정상화된 결과를 하기 표 4에 나타낸다.

결론:

상기 결과를 기초로, LV1889, LV1874 및 LV1865를 제외하고 시험한 모든 변형체는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여, 10 mM 담즙산염과 트리리놀레이트 기질을 사용하여 pH 6에서 더 높은 활성을 가지는 것으로 생각된다.

LVA049, LVA349, LVA023, 및 LVA099 리파아제 변형체는 본 내용의 SEQ ID NO: 2의 비교 리파아제보다 훨씬 더 우수하게 보이며, 사실 SEQ ID NO: 1 리파아제 보다 더 우수하다. 이는 구체적으로는 LVA049 및 LVA349 리파아제 변형체에서, 더 구체적으로는 LVA049 리파아제 변형체에 대해 그렇다.

실시예 4: pH 3에서 개선된 안정성을 가지는 리파아제 변형체

상기 표 1에 열거한 다수의 리파아제 변형체를 2-8의 pH 범위에서 pH 안정성을 위해 시험하였다. 앞선 실시예에서와 같이, SEQ ID NO: 2 및 1의 리파아제는 비교를 위해 포함한다. SEQ ID NO: 2의 리파아제의 하기 변형체를 또한 시험하였다:

각 효소를 2가지 농도에서 두 번 시험하였다(0.05 및 1.0 mg 효소 단백질/ml). 게다가, 효소를 담즙산염 10mM과 함께 및 없이, 그리고 펩신(70 mg/l)과 함께 및 없이 시험하였다.

간단히 말해서, 효소를 1, 15, 45, 및 120 분 (또는 1, 60, 및 120 분 동안) 요망되는 pH로 37℃에서 배양한 후 잔여 리파아제 활성을 pH 8 및 실온(RT)에서 p-니트로페닐 카프릴레이트에서 측정하였다.

화학물질/시약:

효소 희석 완충제: 20 mM 아세테이트 pH 6, 0.01% 트리톤-X100.

안정 완충제: 200 mM 이미다졸, 200 mM 아세테이트, 200 mM 말론산, pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 및 8.0으로 조절.

잔여 활성 완충제 (RA 완충제): 200 mM 트리스(트리스-히드록시메틸 아미노메탄, 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올, CAS-번호: 77-86-1) pH 8, 0.4% 트리톤-X100, 1 mM CaCl₂ pNP-카프릴레이트 (C8): Sigma N-0752

펩신 (700 mg/l): Merck, VL 317492437 (1.0792.0001)

담즙산염 (80 mM):

Solvay Pharmaceuticals (배치 176.01-PA-7374)로부터 담즙산염 혼합물을 활성화하는 리파아제

효소:

효소를 A_28O을 기초로 ml 당 0.4 또는 0.8 mg 단백질의 작업 용액에 대해 20 mM NaH₂PO₄ PH 7.0, 0.01% 트리톤-X100으로 희석하였다:

안정성 분석:

1) 마이크로타이터 플레이트 (MTP)의 각 웰에 50 ul 안정 완충제, 20 ul 0.1% 트리톤-X100, 25 ul 담즙산염 (80 mM) 또는 20 ul 펩신(700 mg/l) 또는 탈이온수를 첨가한다. 웰 당 175 ul의 최종 부피로 탈이온수를 첨가한다. 모든 샘플을 2번 만든다. 20분 동안 700rpm으로 37℃에서 미리 가열한다.

2) 25 ul 효소(최종 농도는 ml 당 0.05 또는 0.1 mg 효소 단백질)를 첨가. 각 pH에 대해 어떤 효소도 펩신으로 조절하지 않으며 담즙산염을 포함하고, 즉, 25 ul 20 mM NaH₂PO₄ pH 7.0, 0.01% 트리톤-X100을 이들 웰에 첨가한다. 1, 15, 45 및 120 min 동안 37℃에서 700rpm으로 배양한다.

3) 20 ul의 알리쿼트를 회수하고 180 ul 잔여 활성 완충제 pH 8.0으로 샘플을 희석하여, 얼음에서 샘플을 보관한다.

4) 샘플을 희석한다(최소 2Ox 희석하여 pH를 8로 증가). 1분에 샘플을 pH 8로 최초 잔여 활성을 만들어, 요구되는 희석을 결정하기 위해 2Ox, 4Ox, 8Ox, 16Ox, 및 32Ox 희석하여 분석에서 선형을 얻는다.

5) 하기와 같이 기술되는 pH 8.0에서 pNP-카프릴레이트 기질을 가지는 RA를 측정한다.

기질:

기질 저장 용액을 1 ml 2-프로판올과 함께 14.2 ul p-니트로페닐 카프릴레이트(Sigma N-0752)를 혼합함으로써 제조한다. 이 저장 용액을 잔여 활성 완충제 pH 8.0에서 5Ox 희석하여 150 ul가 각 웰에 첨가되는 작업 용액을 제공한다.

잔여 활성을 결정하기 위한 순서(RA):

1) 새로운 MTP 20 ul 희석 샘플과 150 ul 기질 작업용액에서 혼합한다.

2) 5분 동안 405nm에서 동역학을 측정한다(처음으로 혼합, 실온에서 매 12초마다 판독)

결과:

% 잔여 활성을 하기와 같이 계산한다: 각 회수(1, 15, 45, 120 분)를 위한 각 pH에서 속도는 담즙산염 또는 펩신으로 어떤 효소 조절도 없는 속도가 차감된다. 이 보정된 속도는 그 후 각 pH에서 가장 높은 값으로 나누고 100을 곱한다.

하기 표 5는 SEQ ID NO: 2와 비교하여 개선된 변형체들에 대해 pH 3에서 안정성을 나타낸다(각각 완충제에서, 펩신의 존재하에 또는 담즙산염의 존재하에). pH 3에서 유일한 안정성 결과를 나타내며, 가장 명백한 차이는 이 pH에서 관찰된다.

결론:

하기 리파아제 변형체는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 pH 3에서 개선된 안정성을 가진다: LV2934, LVA043, LVA049, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LV1857, LVA012, LVA023, LVA041, LVA061, LVA099, LVA147, 및 LVA714.

하기 리파아제 변형체는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 펩신으로 pH 3에서 개선된 안정성을 가진다: LVA043, LV1855, LV1865, LV1874. LV1889, LV1857, LVA012, LVA099, LVA315, LVA317, LVA319, 및 LVA714.

하기 변형체는 SEQ ID NO: 2의 리파아제와 비교하여 담즙산염으로 pH 3에서 개선된 안정성을 가진다: LVA349.

실시예 5: 리파아제 변형체의 마이크로 정제

하기 표 6에 나타내는 추가 리파아제 변형체를 실시예 2에서 기술되는 바와 같이 제조하였고 발효 상청액의 멸균 여과를 포함한다.

멸균 여과된 리파아제-함유 배양 상청액을 하기 프로토콜을 사용하여 마이크로-정제하였다:

필터 플레이트(유니필터 800, 25 um (마이크로미터) 멜트브로운 폴리에틸렌 필터, Whatman)의 웰에 대략 50 ul (micro liter) XpressLine ProA 크로마토그래피 배지를 첨가하였다(Upfront Chromatography A/S, Lersoe Parkalle 42, DK-2100 Copenhagen, Denmark로부터 구매가능). 크로마토그래피 배지를 200 ul 1 M 아세트산 나트륨, pH 5.0을 첨가함으로써 평형을 유지하였다. 10분의 교반 후, 평행 완충제를 진공으로 제거하였다(Uni-Vac 3, Whatman). 평행 단계를 반복하였다. 그 후 100 ul 결합 완충제(1 M 아세트산 나트륨, pH 5.0)와 400 ul 배양 상청액을 첨가하였고 30분 동안 크로마토그래피 배지와 혼합하였다. 비-결합 물질을 진공으로 제거하였다. 결합 단계를 반복하였다. 결합 리파아제를 가지는 크로마토그래피 배지를 200 ul 세척 완충제로 완충 용량을 감소시키면서 3회 세척하였다(100 / 50 / 10 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0). 각 세척 단계에서, 완충제를 첨가하였고, 플레이트를 10분 동안 교반하였고, 세척 완충제를 진공으로 제거하였다. 최종적으로, 결합 리파아제를 100 ul 100 mM Tris, 0.02% Brij 35 (폴리옥시에틸렌(23)라우릴에테르), pH 9.0를 2회 첨가함으로써 용리하였다. 각 용리 단계에 대해, 플레이트를 용리된 리파아제를 진공으로써 마이크로타이터 플레이트에서 수집하기 전에 15분간 교반하였다.

실시예 6: 리파아제 변형체의 농도의 결정

활성 자리 적정

정제한(실시예 2에서 일반적으로 기술하는 바와 같이 통상적으로 정제, 및/또는 실시예 6에서 기술하는 바와 같이 마이크로 정제) 리파아제 변형체의 농도를 하기에서 기술하는 바와 같이 버스트(burst) 활성 적정으로 결정하였다.

정제한 리파아제를 0.01% 트리톤-X100으로 희석하였고, 필요하다면, 하기 5 uM (150 ug 효소 단백질/ml에 대응) 농도를 얻는다. 100 ul 정제한 리파아제를 블랙 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 1 M 트리스, 4 mM SDS (황산도데실나트륨), pH 9.0에 용해한 40 uM의 레조루핀(에틸 레조루피닐 헵틸포스포네이트; 리파아제 억제제)의 대략 100 ul와 혼합하였다. 레조루핀의 정확한 농도는 중요하지 않으며, 단지 5 uM의 리파아제와 비교하여 과량으로 첨가해야 한다. 혼합 후 즉시, 유리된 레조루핀으로부터 형광의 동역학을 1-3시간 동안 매 분 측정하였다(버스트를 끝낼 때까지)(515 nm에서 여기, 590 nm에서 방출, BMG LabTechnologies GmbH 제의 POLARstar 형광 강도 측정 기기로 측정).

측정한 형광 값을 하기 식에 적합하도록 한다:

F = FO + 버스트*(1-exp(-(t + dt)*ln(2) / T¹/₂) + 기울기*(t + dt)

F는 측정된 형광이고, FO는 억제제와 리파아제로부터의 형광 배경이고, t는 첫번째 형광 측정 이후의 시간이고, dt는 첫번째 형광 측정에 대해 억제제와 리파아제의 혼합으로부터 시간이고, 버스트는 형광 버스트이며, T¹/₂은 기하급수적인 버스트에 대한 절반의 시간이고, 기울기는 예를 들어 리파아제-에틸 헵틸포스포네이트 복합체의 가수분해 및/또는 레조루핀의 표백에 기인하여 형광에서 선형 변화를 위한 기울기이다.

활성 리파아제 농도를 계산한 버스트와 레조루핀 표준 커브의 기울기 사이의 비율로서 결정하였다(0-4 uM; 마이크로타이터 플레이트에 포함).

A ₂₈₀ 으로부터 농도 결정

정제한 리파아제 변형체의 농도를 또한 흡광계수 1.24 A₂₈₀/mg를 사용하여 280 nm에서 흡광도로부터 측정하였다.

실시예 7: 리파아제 변형체의 생체 밖 시험

정제한 리파아제 변형체를 하기 기술하는 바와 같은 생체 밖 소화 모델에서 시험하였다.

2개의 규정식(각각 규정식 I, 및 규정식 II) 중 하나를 생체 밖 모델에서 사용하였다. 규정식 I의 조성물은 34% (w/w) 지방, 45% (w/w) 탄수화물, 2% (w/w) 단백질 (나머지 물, 염 등)이다. 규정식 II의 조성물은 모두 g/kg 건조 중량으로 지방 313, 단백질 146, 및 전분 358(무 질소 추출물, NfE는 432로 계산될 수 있다)이다.

규정식 I을 2분 동안 UltraTurrex (YellowLine DI 25 basic)를 사용하여 247.2 g 소 우유 (1.5% 지방), 29.9 g 올리브 오일, 87 g Calshake (Fresenius Kabi로부터 구매가능하며 2077 kJ/g, 4.3 g 우유 단백질/100 g의 단백질 함량, 24.4 g 지방/100 g의 지방 함량의 에너지 함량을 가짐), 및 9.9 g 메토셀(Food Grade, E5 Premium LV FG (E464); Dow)을 혼합함으로써 제조하였다. 점성을 감소시키기 위해, 규정식을 50℃에서 4시간 동안 pH 8.0으로 0.5 ug/ml의 SAVINASE 16.0 LEX 프로테아제 (Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark로부터 구매가능)로 처리하였다. 그 후 프로테아제를 pH를 3으로 감소시킴으로써 불활성화하였고 30분 동안 70℃에서, 또는 60분 동안 50℃에서 배양하였다.

100 ul의 규정식을 마이크로 플레이트의 웰에서 20 ul 펩신 (Merck VL 317492437, 카탈로그 번호 1.0792.0001 , 700 mg/ml) 및 30 ul 리파아제 (4 농도로 2회)와 혼합하였다. 위 단계가 pH 5에서 실행되도록, 10 ul 완충제 (0.8 M MES (2-[N-모르폴리노]에탄술폰산), 0.8 M 아세트산 나트륨, 0.8 M 이미다졸, pH 7.0)를 첨가하였고, 한편 pH 3이 위 단계에 대해 사용된다면 어떤 완충제도 첨가하지 않았다. 15 ul (위 단계에 pH 5를 사용한다면), 또는 25 ul (위 단계에 pH 3를 사용한다면) 완충제 (0.8 M MES (2-[N-모르폴리노]에탄술폰산), 0.8 M 아세트산 나트륨, 0.8 M 이미다졸, pH 7.0) 및 20 ul 담즙산염(50 g/l, 500 g/mol의 평균 분자량을 사용하여 100 mM에 대응)를 첨가하기 전에 마이크로타이터 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 진탕하면서(Eppendorf Thermomixer, 750 rpm) 배양하였고; Solvay Pharmaceuticals제의 리파아제 활성화 담즙산염 혼합물(batch 176.01 -PA-7374))은 5.7 내지 6.0의 pH를 야기한다. 그 후 플레이트를 교반하면서 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 1M 인산 중 50 ul 10% Triton-X100을 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 1% Triton-X100에서 125-250배로 희석시킨 후, 자유 지방산의 양을 실시예 3에서 기술한 바와 같은 Wako Chemicals제의 NEFA C 키트를 사용하여 결정하였다. 용량 반응 곡선을 다음 식에 적합화시켰다:

FFA = FFAmax*[E]/([E]+K)

FFA는 방출된 자유 지방산의 양이고, FFAmax는 리파아제가 규정식으로부터 유리될 수 있는 자유 지방산의 최대량이며, [E]는 리파아제 농도이고, K는 FFAmax의 절반을 유리시키는 리파아제 농도이다. FFAmax는 리파아제에 대해 동일한 것으로 추정하며, 개선 인자는 하기와 같이 정의된다:

IF = K(기준) / K(리파아제)

K(기준)은 FFAmax의 절반을 유리시키는 기준 리파아제의 농도이며 K(리파아제)는 FFAmax의 절반을 유리시키는 리파아제 변형체 농도이다.

기준 리파아제로서 하기 표 7a 및 8a에서 열거되는 변형체에 대해, 발명자들은 SEQ ID NO: 1의 리파아제 및 그것의 탈글리코실화된 변형체 N33Q (표 1의 LV2934)의 평균, 즉, K(기준) = ¹/₂ x (K(SEQ ID NO: 1) + K(LV2934))을 사용하였다.

하기 표 7a 및 8a에서 열거하는 리파아제 변형체는 모두 1.0 이상의 개선 인자를 가진다. 이는 기준 리파아제와 비교하여 유사한 효과를 얻기 위해 이들 리파아제의 더 낮은 양이 필요로 됨을 의미한다. 예를 들어, SEQ ID NO: 2에 대해 어떤 리파아제 변형체의 개선 인자는 기준 리파아제에 대한 당해 리파아제 변형체의 개선 인자를 기준 리파아제에 대한 SEQ ID NO: 2의 (일정한) 개선 인자로 나누어서 계산할 수 있으며, 이는 하기 표 7a에서 나타낸다. 실시예 활성 자리 적정(AST, 실시예 6)에 대해 리파아제 농도를 결정하기 위해 사용할 때, 당해 변형체에 대한 개선 인자가 SEQ ID NO: 2의 리파아제에 대해 개선되는 것이라면, 하나는 당해 변형체의 평균 IF를 0.88, 바람직하게는 0.9인 SEQ ID NO: 2의 평균 IF로 나눈다.

하기 표 7b, 8b, 8c, 및 8d에서 열거되는 추가 리파아제 변형체에 대해, SEQ ID NO: 1 (표 1의 LV2934)의 탈글리코실화된 변형체 N33Q를 기준 리파아제로서 사용하였다. 각각의 이들 리파아제는 1.00 이상의 개선 인자를 가진다(평균 개선 인자 - 표준 편차). 개선된 리파아제의 선택을 위해, IF 값 및 표준편차를 소수점2자리까지 사용하였다. 이들 수를 이후에 소수점 한자리로 반올림하였다.

실시예 8: 펩신의 존재하에 pH 3에서 개선된 안정성을 가지는 리파아제 변형체

실시예 5의 표 6의 변형체를 하기 표 9의 변형체와 함께 펩신의 존재하에 pH 3에서 안정성에 대해 스크리닝 하였다.

변형체를 SEQ ID NO: 1의 아미노산 21 내지 100의 임의의 돌연변이된 효모로부터 및 D27X, E43X, E56X, D57DA, D62DA, E87EK, D96DL, E99X, D111X, D234X Q249QR, D254DN의 표적화된 변화를 가지는 SEQ ID NO: 1의 표적화된 효모 라이브러리로부터, N11R, D27RQNV, G38X, D96EW, K98X, T114I, K163WA, E210VD, R231I, D254SGQIK 및 P256TA의 표적화된 변화와 함께 G91T 및 G163K를 가지는 SEQ ID NO:1의 표적화된 효모 라이브러리로부터, G91T 및 G163K를 가지는 SEQ ID NO: 1의 임의의 돌연변이된 라이브러리로부터, D27R, G91N, N94R, D111A, S216P, L227G 및 P256T를 가지는 SEQ ID NO:1의 임의의 돌연변이된 라이브러리로부터 선택하였고, 또는 SEQ ID NO:1의 발생된 자리-지정 변형체였다. 효모는 사카로미세스 세레비지아(Sachharoymces cerevisiae) JG169 이다(MATα; ura3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-113; prd ::HIS3; prbl :: LEU2; cir+).

원리

본 스크리닝 공정은 75 ug/mL 펩신의 존재에서 pH 3.0 및 실온으로 3 시간 처리 후 잔여 리파아제 활성을 측정한다. 잔여 리파아제 활성은 스크리닝 사건 동안 검출되어야 하는 매우 높은 활성 및 매우 낮은 활성 리파아제를 허용하기 위해 시간에 걸쳐 활성을 모니터링하는 속도 분석으로 측정한다.

변형체의 1차 스크리닝에서, 시험 조건에서 배지 또는 발효의 효과를 최소화하기 위해 충분히 큰 희석을 배양액 샘플에서 수행하였다. 다음 스크리닝에서

변형체는 더 많은 희석을 첨가함으로써 이전의 제 1 상이 다음 스크리닝에서 더 많은 시험을 겪게 하였고, 시험 샘플을 복사한다.

물질과 방법

제 1 스크린 배지:

탈염수로 전체 부피가 1l로 조절된, 황산 암모늄과 함께 1.7 g의 효모 질소 염기(YNB), 0.8 g의 완전 보충 혼합물-우라실(CSM-ura) w/40 mg 아데닌 (ADE) (Bio 101 , Cat #4512-722), 5 g의 카사미노산(BD, Cat #223050), 100 ml의 50% 글루코오스, 50 ml의 0.5 M K₂HPO₄ (인산칼륨-2염기성), 1 ml의 100 mM CuSO₄-5H₂O (JD Baker, Cat#1843-01), 1 ml의 100 mg/mL 암피실린. 배지를 여과 멸균하였고 4℃에 저장하였다.

최적화 배지:

황산 암모늄(Bio 101 , Cat #4027-532)을 가지는 6.7 g의 YNB, 5.9 g의 숙신산(Sigma S-9512), 0.8 g의 CSM-ura w/40 mg ADE (Bio 101 , Cat #4512-722), 20 g의 갈락토오스(Sigma, Cat# G-0625), 10 g의 글루코오스, 1 ml의 100 mM CuSO₄-5H₂O 및 1 ml의 100 mg/mL 암피실린. pH는 NaOH로 6.6으로 조절하고, 부피를 탈이온수로 1l로 조절한다. 배지를 여과 멸균하고 4℃로 저장한다.

종자 배양 배지:

하기 성분들의 혼합한다: 황산 암모늄과 함께 6.7 g의 YNB(Bio 101 , Cat #4027- 532), 5 g의 카사미노산(BD, Cat #223050), 100 ml의 0.5 M 숙신산 (Sigma S- 9512), 855 ml의 탈이온된 H₂O. 혼합물을 고압증기 멸균한다. 2 ml의 10 mg/mL 클로르암페니콜 및 40 ml의 50% 글루코오스를 첨가한다. 4℃에서 저장한다.

기질과 펩신 처리를 하기 위한 저장 용액:

1. 10% 트리톤-X100 (w/v)

2. 1 M TRIS, pH 8.0

3. 10% (680 mM) CaCl₂*2H₂O

4. 100 mM 시트르산, pH 3.0

5. 100 mM 시트르산, 0.01% 트리톤-X100 중에 구성되는 5 mg/mL 돼지 펩신 (Sigma P-6887, 3280 U/mg 고형물, 3370 U/mg 단백질)

6. 10% 트리톤-X100 중에 구성되는 50 mM 4-니트로페놀(PNP) 팔미테이트

리파아제 활성 분석을 위한 기질:

1 mM PNP-팔미테이트, 1.2% 트리톤-X100, 4 mM CaCl₂, 100 mM TRIS, pH 8.0

펩신 처리 용액:

150 ug/mL 펩신, 4 mM CaCl₂, 0.01% 트리톤-X100, 50 mM 시트레이트, pH 3.0

희석제:

0.01% 트리톤-X100, 10 mM NaCl

효소:

96-웰 플레이트에서 1차 스크리닝을 위한 리파아제 변형체의 배양액 샘플을 한천 플레이트를 1차 스크리닝 배지로 취한 개별 클론으로부터 유도하였다.

배양의 성장:

3개의 배지 레시피를 리파아제 변형체를 성장시키기 위해 사용하였다. 1차 스크리닝 수준에서 발현 수준이 중요하지 않기 때문에, 1차 스크리닝 배지를 더 빠른 스크리닝 단계를 위해 사용하였다. 효모 군집을 발현시키는 단일 리파아제 변형체를 96-웰 플레이트에서 180 uL의 1차 스크리닝 배지에 취하였고 1차 스크리닝 샘플에 대해 4-6일 동안 30℃ 및 250rpm에서 성장시켰다.

2차 스크리닝을 위해, 1차 스크리닝 플레이트로부터 20 uL의 배양을 24-웰 플레이트 내 1 mL의 종자 배양 배지로 옮겼고 30℃ 및 250rpm에서 밤새 성장시켰다. 리파아제의 발현을 24-웰 플레이트에서 30℃ 및 250rpm에서 4-6일 동안 20 uL의 종자 배양을 1ml의 최적화 배지에 섞음으로써 달성하였다.

어떤 이후의 스크리닝에 대해, 단일 효모 군집을 24-웰 플레이트에서 1 mL의 종자 배양 배지에 취하였고 밤새 30℃ 및 250rpm에서 성장시켰다. 리파아제의 발현을 24-웰 플레이트에서 30℃ 및 250rpm에서 4-6일 동안 20 uL의 종자 배양을 1 mL의 최적화된 배지에 섞음으로써 달성하였다. 최적화된 배지를 24-웰 플레이트 및 진탕 플라스크에서 성장시키기 위해 사용하여 단백질 발현 수준을 최대화하였다.

스크리닝 절차:

1차 스크리닝에서, 샘플을 희석제 내 25-배 희석한 후, 5 uL를 희석제 또는 펩신 처리 용액 중 하나의 5uL를 함유하는 384 웰 플레이트에 첨가하였다.

실온에서 3시간 후, 기질을 하기와 같이 각 샘플에 첨가하였다: 펩신-처리한 샘플을 55 uL 기질 + 5 uL 희석제와 혼합하였고, 미처리 샘플을 55 uL 기질 + 5 uL 펩신-처리 용액과 혼합하였다. 펩신 pH는 3.0이며 pH에서 변화에 대한 보상은 없으며, 활성 분석은 2개의 다른 pH 값에서 실행되어, 이는 리파아제의 안성성에서 효과를 가지지 않고 분석 pH를 정상화한다(펩신이 활성이 아닌 경우, 기질의 pH가 전반적인 pH가 8.0으로 상승하기에 충분할 때 마지막에 첨가함으로써). OD₄₀₅ 판독을 기질 첨가 후 15분 만큼 빨리 및 기질 첨가 후 18시간 만큼 길게 382-웰 플레이트마다 6회 하였고 시간 마다 mOD(밀리 OD)로서 표시하였다. 선형 범위에 속하는 데이터를 수집하였고 각각 펩신-처리된 샘플의 잔여 리파아제 활성을 대응하는 미처리 샘플의 잔여 리파아제 활성과 비교하였다. 이는 하기에 % 잔여 활성(%RA)으로서 보고하며; 처리 조건의 속도를 미처리 조건의 속도로써 나누고 결과에 100을 곱하여 계산하였다.

플레이트를 이동시키도록 기능하고 피펫팅 단계들을 수행하는 Biomek FX 워크스테이션, 분석 플레이트로부터 데이터를 판독하기 위한 DXT 880 플레이트 판독기, 워크스테이션에 및 워크스테이션으로부터 플레이트를 옮기기 위한 캐로셀 및 컨베이어 벨트 시스템으로 구성되는 시스템을 사용하여 자동화를 수행할 수 있다. 이 순서는 96-웰 플레이트 포맷에서 샘플을 받아들이며, 동일한 포맷에서 희석을 수행한 후 처리 및 분석 단계를 위해 384-웰 플레이트를 사용한다.

결과:

2차 스크리닝 후 측정한 각 리파아제 변형체에 대해 상대적인 잔여 활성들을 하기 표 10에 나타낸다. 각각의 이들 변형체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 리파아제와 비교하여 개선된 RA(펩신의 존재하에 pH 3에서 안정)를 가진다.

실시예 9: 담즙산염의 존재하에 개선된 활성을 가지는 리파아제 변형체

담즙산염의 존재하에 개선된 활성을 가지는 리파아제 변형체를 확인하기 위해서 하기 분석을 진행하였다. 분석은 담즙산염이 없는 조건과 비교하여 2mM 담즙산염의 존재에서 리파아제 활성을 측정한다. 매우 높은 활성 및 매우 낮은 활성 리파아제가 검출되도록 시간에 걸쳐 활성을 모니터링하는 속도 분석에서 리파아제 활성을 측정하도록 시험을 설정한다. 이 분석을 시약 첨가의 타이밍을 정확하게 조절하고 pH 5.0으로부터 반응 pH의 조절을 위해 자동화하였으며, 리파아제는 OD 405에서 판독되는 방출된 PNP 기를 허용하는 pH인 pH 8.0에서 낮은 pH에서 기질과 반응한다. pH 조절이 일어난 후 즉시 플레이트를 판독한다.

분석 기질 및 담즙산염 처리를 위한 저장 용액:

1. 10% 트리톤-X100 (w/v)

2. 10O mM TRIS, pH 8.0 3. 100 mM 숙신산염, pH 5.0

4. 10% (680 mM) CaCl₂*2H₂O

5. 증류수 중에 만든 20 mM 담즙산염 (Sigma B-8756)

6. 10% 트리톤-X100 중에 만든 50 mM 4-니트로페놀(PNP) 올레이트

리파아제 활성 분석을 위한 기질:

1 mM PNP-올레이트, 1.2% 트리톤-X100, 2 mM CaCl₂, 25 mM 숙신산염, pH 5.0

희석제:

0.01% 트리톤-X100, 10 mM NaCl

효소:

정제한 리파아제 샘플을 자동화 방법을 위해 약 8 마이크로그램/mL로 희석제에서 희석한다. 정제한 리파아제 샘플의 농도를 흡광계수 1.24 A₂₈₀/mg을 사용하여 280 nm에서 흡광도로부터 결정하였다.

액체계 담즙산염 분석 스크리닝 절차:

효소 샘플을 희석제에서 25-배 및 200-배 희석한 후, 10 마이크로-L를 96-웰 플레이트 반응 플레이트에서 23 마이크로-L 물 또는 23 마이크로-L 20 mM 담즙산염 중 하나에 첨가한다. 이 후에, 200 마이크로-L의 기질(25 mM 숙신산염 중 1 mM PNP 올레이트, 2 mM CaCl₂, 1.2% 트리톤-X100, pH 5.0)을 첨가하고 혼합한다. 혼합 후 즉시, 60 마이크로-L를 제거하고 15 마이크로-L를 4개의 개별 384-웰 플레이트에 피펫팅하고, 4 쿼드런트 (4 x 96)를 리파아제 샘플의 각각 2회 희석에 대해 "+" 및 "-"를 설정하기 위해 사용한다. 4개의 384-웰 플레이트를 4회 시점 설정을 위해 사용한다(각 플레이트는 2회 희석의 리파아제 각각 "+" 및 "-" 담즙산염을 가진다). 1, 2, 3, 및 4 시간 후 60 마이크로-L의 100 mM TRIS, pH 8.0을 적절한 플레이트 및 쿼드런트에 첨가하고 즉시 판독한다(OD 405 및 OD 540). ~ 0.1과 0.475 사이의 OD는 이 분석에 대해 사용된 선형 범위이다. pH 5.0에서 담즙산염의 존재하에 활성의 비율을 "담즙산염" 활성에 대한 시간 및 희석에 대해 보정된 모든 선형 데이터의 평균을 "담즙산염이 없는" 활성에 대한 시간 및 희석에 대해 보정된 모든 선형 데이터의 평균으로 나누어 계산함으로써 백분율로서 표현한다. 활성 대 기준의 비율을(SEQ ID NO: 1의 변형체 N33Q) 변형체 + 및 - 담즙산염의 비율을 기준 + 및 - 담즙산염의 비율로 나눔으로써 계산하고 폴딩 개선으로서 보고한다(예를 들어, 3 X는 300%를 의미한다).

실시예 10: 생체내 소화흡수율 시도(스크리닝 테스트)

본 발명의 선택 정제한 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 리파아제 변형체를 유발된 췌장 외분비 기능부전(PEI)을 가지는 암컷 괴팅엔 미니돼지(Ellegaard)에서 리파아제 스크리닝 시험으로 연구하였다. 본 변형체의 아미노산 서열을 표 1, 7 및 8에서 찾는다. 효능을 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제의 변형체 N33Q의 효능과 비교하였다(변형체 LV2934; 표 12의 기준 리파아제). 미니 돼지에서 췌관의 결찰에 의해 췌장 외분비 기능부전 (PEI)을 유발하였고, 그것들을 또한 Tabeling et al. (Tabeling et al. (1999): "Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution", J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82: 251-263) 및 in Gregory et al. (Gregory et al. (1999): "Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme supplementation" in "Biology of the Pancreas in Growing Animals" (Pierzynowski & Zabielski eds), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp 381-393)에 기술된 바와 같이 모든 이소플루오란 감각상실하에 및 약 25kg의 중량에서 회맹(ileo-caecal) 재진입 캐뉼라로 적합하게 하였다. 연구를 개시하기 전 적어도 4주의 기간을 수술로부터의 회복을 위해 허용하였다. 연구 시작 전에, 각 돼지의 PEI 상태를 스툴 키모트립신 시험을 통해 확인하였다(lmmundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim, Germany, 카탈로그 번호 K 6990로부터 구매가능).

분석

리파아제 활성을 위한 스크리닝 테스트를 3 또는 4마리의 PET 미니돼지의 2 군에서 수행하였다. 연구 동안, 돼지들을 변형된 물질대사 케이지에서 기르고 물에 자유로운 접근을 허용하였고 1일 2회 먹이를 먹였다.

시험식

247.2 g 우유; Fresenius Kabi제의 1 x 87 g 사쉐 Calshake (2077KJ/100 g); 29.9 g 올리브 오일; 9.88 g 메토셀 (Colorcon GmbH제의 Methocel E5); 및 0.368 g 산화크롬. Calshake는 24.4% 지방, 3.3% 락토오스, 64.9% 탄수화물 (49% 당), 4.3% 단백질을 함유한다.

우유와 산화크롬을 Ultraturax homogenizer (9500 rpm, ca. 1 min)로 균질화한 후, 오일을 혼합하고 다시 1-2분 동안 균질화하였다. 그 후 Calshake를 혼합하였고(1-2분 동안 믹서로 교반) 최종적으로 Ultraturax로 메토셀을 서서히 첨가하였고, 한편, Ultraturax와 혼합하고, 전식을 그 후 약 3분 동안 균질화하였다.

성능

리파아제 효능을 평가하기 위해, 기준 리파아제의 다른 양 또는 리파아제 변형체의 유사한 양을 먹이기 전에 즉시 혼합하여 돼지에게 단일 시험식(51.6 g 지방을 함유)을 먹였다.

기준 리파아제 LV2934를 0.124, 1.24, 4.96, 또는 18.61 mg 효소 단백질/식사 (각각 500, 5000, 20000, 및 75000 FIP U 리파아제/식사에 대응)로 투여하였고, LV2934로 생체내 효능과 비교하기 위해 본 발명의 리파아제 변형체를 또한 mg 효소 단백질(1.24, 4.96, 및 18.61 mg/식사)에 따라서 투여하였다. 연구를 Latin Square design에 따라 수행하였다.

회장 (녹색 유미즙)에서 식사 마커의 첫 번째 출현 후 총 8h 동안 회장 유미즙을 수집하였고 2 시간 동안 샘플을 -20℃에서 냉동시켰다. 적어도 하루 개별 결정 사이에 세척을 하였다. 저지방, 액체 식사를 각 시험 전에 저녁에 제공하여 비시험식으로부터 식사 내용의 방해 가능성을 감소시켰다.

분석

냉동 회장 유미즙 샘플을 냉동건조시켰고, 분쇄하고 건조물질(DM) 및 지방에 대해 분석하였다(Naumann & Bassler 1993; Die chemische Untersuchung von Futtermitteln, 3. edition, VDLUFA-Verlag, Darmstadt (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten). DM을 냉동건조 후 103℃에서 8h 배양 후 중량을 측정하였고; 건조 샘플의 미정제 지방 함량을 ANKOMXT15 추출기에서 필터 백 기법을 사용하여 가수분해 및 페트롤 에테르 추출로 결정하였다(이는 Ankom Technology, Macedon, NY, US로부터 이용가능; 동시에 15회 추출을 수행할 수 있음); Cr₂O₃를 크롬산염으로 산화하였고 크롬 함량을 365nm에서 소광을 통해(분광광도계) Petry and Rapp in Zeitung fur Tierphysiologie (1970), vol. 27, p. 181-189 (Petry & Rapp, 1970, Z. Tierphysiol. 27: 181-189)에 기술된 바와 같이 계산하였다.

소화흡수율 값(지방 흡수의 계수; CFA)을 화기 식에 따르는 마커 방법으로써 추정하였다:

결과 및 결론

CFA 결과를 표 12에 나타낸다. 리파아제 투약은 식사마다 효소 단백질의 밀리그램으로 표시한다(mg/meal).

LV1330, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LVA043, LVA049, LVA012, LVA023, LVA099, LVA041 , LVA061, LVA103, LV1857, LV1232, 및 LVA473를 포함하는 추가 리파아제 변형체를 동일한 스크리닝 시험에서 연구한다.

시험한 모든 리파아제 변형체는 생체내 활성이었고 CFA에서 용량-의존적 개선을 야기한다. 리파아제 변형체 LVA129, LVA147, LVA238, LVA315, LVA317, LVA319, 및 LVA368는 모두 기준 리파아제와 비교하여 상당히 개선되었다.

실시예 11: 전체 생체내 소화흡수율 시도

정제한 리파아제 변형체 LVA319를 6마리의 암컷 괴팅겐 미니돼지(Ellegaard)의 군에서 전체 소화흡수율 연구로 시험하였다. 효능을 동일한 규정식을 먹인 PEI 미니돼지에서 시험한 SEQ ID NO: 1의 리파아제의 효능과 비교하였다. 췌장 외분비 기능부전 (PEI)을 췌관의 결찰로써 미니돼지에서 유발하였고, 그것들을 또한 Tabeling et al. (Tabeling et al., 1999, "Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution", J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82: 251-263) 및 Gregory et al. (Gregory et al., 1999, "Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme supplementation" in "Biology of the Pancreas in Growing Animals" (Pierzynowski & Zabielski eds), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp. 381-393)에 기술된 바와 같이 모든 이소플루오란 감각상실하에 및 약 25kg의 중량에서 회맹(ileo-caecal) 재진입 캐뉼라로 적합하게 하였다. 연구를 개시하기 전 적어도 4주의 기간은 수술로부터 회복하도록 하였다. 연구를 시작하기 전, 각 돼지의 PEI 상태를 스툴 키모트립신 시험을 통해 확인하였다(lmmundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim, Germany, 카탈로그 번호 K 6990로부터 구매가능).

분석

연구 동안, 돼지를 12:12 h 명암 주기로 펜스에서 기르고 물에 자유로운 접근을 허용하고 1일 2회 식사를 먹였다.

시험식

연구 동안, 돼지에게 200 g 이중-분쇄된 규정식 (Altromin) + 25 g 올리브 오일, 75 g 크림 및 1리터 물과 혼합한 0.625 g Cr₂O₃(표 13 참조)을 함유하는 300 g의 고지방 "인간-유사" 규정식을 매일 2회씩 먹였다. 시험식은 돼지에 대한 영양요구량 당 31% 지방, 15% 단백질, 36% 전분 및 비타민, 미네랄 및 미량원소를 함유하였다.

크림, 올리브 오일 다음에 수돗물 및 최종적으로 다른 양/다른 효소 보충물을 미리 중량을 단 건조 식량(산화 크롬 마커를 포함)에 즉시 혼합한 후 돼지에게 먹였다.

성능

리파아제 효능을 평가하기 위해, 다른 양의 하나 또는 다른 2개의 리파아제들을 급식 전에 즉시 혼합하여 돼지에게 2회 300 g 시험식/day를 먹였다. 투여한 각 리파아제의 양, 즉, 미생물 FIP U 리파아제/식사에서 활성 (리파아제 FIP 단위, 실시예 1 참조을 표 15의 괄호에 나타낸다. 각 효소 투약을 14일 동안 먹였다: 돼지에게 9일 동안 고-지방식 + 각각의 신규 효소 투약을 먹인 후 모든 배설물을 다음 5일에 걸쳐 수집하였고, 중량을 달고 분석까지 -20℃에서 저장하였다.

분석

각 돼지의 냉동시킨 배설물을 냉동건조하고, 다시 중량을 달고 분쇄하였다. 5일 분쇄 샘플의 각각의 알리쿼트(매일의 배설물 생산에 따라)를 그 후 풀링하고 함께 혼합하였고; 즉, 효소의 각 용량에 대해 각 돼지에 대한 풀링된 샘플을 제공하였다. 각각의 풀링한 샘플로부터 건조 물질 및 미정제 지방의 함량을 결정하였다(Naumann & Bassler 1993; Die chemische Untersuchung von Futtermitteln, 3. edition, VDLUFA-Verlag, Darmstadt (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten). 건조 물질을 냉동-건조 후 103℃에서 8h 배양한 후 중량을 측정하였고; 건조 샘플의 미정제 지방 함량을 산 가수분해 및 ANKOM^XT15 추출기에서 필터 백 기법을 사용하여 페트롤 에테르 추출로 결정하였고; Cr₂O₃를 크롬산염으로 산화하였고, 크롬 함량을 365 nm (분광 광도계)에서 여기를 통해 Petry and Rapp in Zeitung fur Tierphysiologie, 1970, vol. 27, p. 181-189. (Petry & Rapp 1970; Z. Tierphysiol. 27; 181-189)에서 기술된 바와 같이 계산하였다.

소화흡수율 값(지방 흡수의 계수; CFA)을 하기 식에 따르는 마커 방법으로 측정하였다:

결과 및 결론

표 14의 결과로부터 리파아제 변형체 LVA319가 SEQ ID NO: 1의 기준 리파아제보다 훨씬 더 우수하게 수행한다는 것은 명백하다.

본 발명의 리파아제는 지방 소화흡수율에서 매우 강하며 용량-의존적 개선을 야기하였고, 이미 시험한 낮은 용량에서 높은 유효한 개선을 보였다.

실시예 12: 약학 조성물

펠렛

정제한 리파아제 변형체 LVA129의 액체 리파아제 농축물(실시예 10에서 생체내 시험)을 제조한다. 액체 농축물을 통상적인 수단으로 건조시키고, 건조 분말의 리파아제 단백질 함량을 측정하고 바람직하게는 50%이상으로 한다. 그 후, 500 g 건조시킨 리파아제 분말을 구매가능한 믹서에서 200 g 미정질 셀룰로오스 및 300 g 폴리에틸렌 글리콜 4000 (Macrogol™ 4000)과 함께 건조 사전-혼합한다. 충분한 양의 통상적으로 사용되는 습윤제를 첨가하고 결과 습윤체를 실온에서 완전히 혼합한다. 균질화한 덩어리를 그 후 0.8 mm의 구멍 직경을 가지는 피어싱 금형으로 적합화된 구매가능한 분출기에서 분출하여 원통형 펠렛을 형성한다. 생산한 압출물을 필요한 양의 통상적으로 사용되는 습윤제를 첨가함으로써 구매가능한 스페로나이저로 구형의 펠렛으로 둥글게 한다. 펠렛을 구매가능한 진공 건조기에서 대략 40℃의 생성물 온도로 건조시킨다. 건조시킨 펠렛을 그 후 0.7 및 1.4 mm 스크린을 가지는 기계적 체분석기를 사용하여 분리하였다. > 0.7 mm 및 < 1.4 mm의 체 부분을 수집하였고 크기 2의 캡슐로 각각 200 mg 펠렛의 부분을 채웠다

결과 펠렛을 실시예 1에서 기술한 리파아제 pH-stat 분석을 사용함으로써 지방분해 활성을 시험한다.

결과 펠렛을 Pharm. Eur. 2.9.1.에 따라 분해에 대해 시험한다(Section "Disintegration of tablets and capsules") (시험 용액: 0.1 M 말론산, pH 6.0 - 500 ml, 37℃).

SEQUENCE LISTING <110> Solvay Pharmaceuticals GmbH Novozymes North America, Inc. Novozymes A/S Svendsen, Allan Skjoet, Michael Christensen , Lars HC Larsen, Signe E. Lundin, Nina Lamsa, Michael Gregory, Peter C. Yaver, Debbie <120> Lipase Variants for Pharmaceutical Use <130> 11143.204-WO <160> 8 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 274 <212> PRT <213> Humicola lanuginosa <220> <221> VARIANT <222> (1)..(274) <220> <221> mat_peptide <222> (6)..(274) <400> 1 Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn -5 -1 1 5 10 Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp 15 20 25 Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu 30 35 40 Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly 45 50 55 Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu 60 65 70 75 Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly 80 85 90 Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys 95 100 105 Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr 110 115 120 Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg 125 130 135 Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala 140 145 150 155 Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr 160 165 170 Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val 175 180 185 Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val 190 195 200 Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu 205 210 215 Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile 220 225 230 235 Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn 240 245 250 Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr 255 260 265 Cys Leu <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> Humicola lanuginosa <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(269) <400> 2 Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr 20 25 30 Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp 35 40 45 Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr 50 55 60 Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe 65 70 75 80 Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp 85 90 95 Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly 100 105 110 Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val 115 120 125 Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly 130 135 140 His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg 145 150 155 160 Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val 165 170 175 Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr 180 185 190 Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro 195 200 205 Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser 210 215 220 Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly 225 230 235 240 Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro 245 250 255 Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu 260 265 <210> 3 <211> 274 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(274) <400> 3 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val 1 5 10 15 Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly 50 55 60 Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val 65 70 75 80 Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn 85 90 95 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp 100 105 110 Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala 115 120 125 Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg 130 135 140 Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn 145 150 155 160 Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val 165 170 175 Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly 180 185 190 Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr 195 200 205 Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro 210 215 220 His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu 225 230 235 240 Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu 245 250 255 Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala 260 265 270 Ala Gln <210> 4 <211> 188 <212> PRT <213> Nocardiopsis sp. <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(188) <400> 4 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile 85 90 95 Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val 115 120 125 Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr 180 185 <210> 5 <211> 188 <212> PRT <213> Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(188) <400> 5 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Thr Gly Thr Phe Gln Asn Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Gly Gly Tyr Gln Ser Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala 85 90 95 Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val 115 120 125 Tyr Ser Leu Thr Arg Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Ser Val Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly Val Arg Ile Arg Thr 180 185 <210> 6 <211> 513 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <220> <221> VARIANT <222> (1)..(513) <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(513) <400> 6 Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu 1 5 10 15 Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn 20 25 30 Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys 35 40 45 Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp 50 55 60 Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr 65 70 75 80 Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met 85 90 95 Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly 100 105 110 Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln 115 120 125 Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe 130 135 140 Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His 145 150 155 160 Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro Glu 195 200 205 Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr Thr 210 215 220 Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser 225 230 235 240 Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys Pro 245 250 255 Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Leu His 260 265 270 Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asp Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Ala Pro 275 280 285 Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala Phe Asp 290 295 300 Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Thr Leu 305 310 315 320 Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala Leu 325 330 335 Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr 355 360 365 Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile Asp Pro 370 375 380 Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr 385 390 395 400 Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Gly Thr Glu 405 410 415 Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val Phe Tyr 435 440 445 Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Asp Gly 450 455 460 Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val Pro 465 470 475 480 Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr Arg Pro 485 490 495 Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val Ala Trp 500 505 510 Pro <210> 7 <211> 481 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220> <221> VARIANT <222> (1)..(481) <400> 7 Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp 1 5 10 15 Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp 20 25 30 Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser 35 40 45 Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu 50 55 60 Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu 65 70 75 80 Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr 85 90 95 Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp 100 105 110 Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser 115 120 125 Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg 130 135 140 Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe Asp Gly 145 150 155 160 Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln 165 170 175 Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Asp 180 185 190 Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Val Ala 195 200 205 Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp 210 215 220 Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg 225 230 235 240 Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr 245 250 255 Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu 260 265 270 Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr 275 280 285 Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys 290 295 300 Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr 305 310 315 320 Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr 325 330 335 Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg 340 345 350 Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys 355 360 365 Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro 370 375 380 Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr 385 390 395 400 Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser 405 410 415 Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His 435 440 445 Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly 450 455 460 Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln 465 470 475 480 Arg <210> 8 <211> 483 <212> PRT <213> Bacillus sp. <220> <221> VARIANT <222> (1)..(483) <400> 8 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Lys Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 Phe Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn 210 215 220 Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly 245 250 255 Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala 260 265 270 Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp 275 280 285 Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly Gly Asn 290 295 300 Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Lys His Pro 305 310 315 320 Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu 325 330 335 Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser Lys Ile 370 375 380 Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg Gln Asn 385 390 395 400 Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn 405 410 415 Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Ala 420 425 430 Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val 435 440 445 Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Lys Ala Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp 465 470 475 480 Val Asn Lys

Claims

(a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 서열에 적어도 50% 동일성을 가지며;

(b) 리파아제 활성을 가지고;

(c) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 269의 아미노산과 비교하여 치환 N33Q, T231R, 및 N233R 및 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 부가 치환을 포함하는 약제로서 사용을 위한 리파아제:
제 1 항에 있어서, 치환 N33Q+T231R+N233R로 SEQ ID NO: 2의 서열을 가지는 기준 리파아제와 비교하여 생체 밖에서 개선된 소화 성능을 가지는 것을 특징으로 하는 리파아제.
하기 단계들을 포함하는, 기준 리파아제와 비교하여 리파아제의 생체 밖 소화 성능을 결정하기 위한 방법:

a) 기준 리파아제를 선택하는 단계;

b) 100 부피부의 규정식과 20 부피부 펩신 및 30 부피부의 리파아제 또는 기준 리파아제를 각각 혼합하는 단계;

c) i) 0 부피부 또는 ii) 10 부피부의 완충제(0.8 M MES, 0.8 M 아세트산 나트륨, 0.8 M 이미다졸, pH 7.0)를 첨가하는 단계, 단계 i)은 pH 3의 위 단계로서 언급될 수 있고, 단계 ii)는 pH 5의 위 단계로서 언급될 수 있다;

d) 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하는 단계;

e) 20 부피부의 담즙산염을 첨가하는 단계, 및 i) 25 부피부 또는 ii) 15부피부의 완충제(0.8 M MES, 0.8 M 아세트산 나트륨, 0.8 M 이미다졸, pH 7.0)를 첨가하는 단계, 단계 i)은 pH 3의 위 단계에 대응하고, 단계 ii)는 pH 5의 위 단계에 대응한다;

f) 37℃에서 교반하면서 2시간 동안 인큐베이팅하는 단계;

g) 1 M 인산 중 50 부피부의 10% 트리톤-X100를 첨가하는 단계;

h) 자유 지방산의 양을 결정하는 단계;

i) 하기 식에 용량 반응 곡선을 적합화시키는 단계;

FFA = FFAmax*[E]/([E]+K)

FFA는 방출된 자유 지방산의 양이고, FFAmax는 리파아제가 규정식으로부터 유리될 수 있는 자유 지방산의 최대량이며, [E]는 리파아제 농도이고, K는 FFAmax의 절반을 유리시키는 리파아제 농도이다;

j) 하기와 같이 개선 인자 (IF)를 계산하는 단계:

IF = K(기준) / K(리파아제),

K(기준)은 FFAmax의 절반을 유리시키는 기준 리파아제의 농도이고 K(리파아제)는 FFAmax의 절반을 유리시키는 리파아제 농도이다.
하기 단계들을 포함하는, 기준 리파아제와 비교하여 리파아제의 생체 밖 소화 성능을 결정하는 방법:

a) 펩신의 존재하에 pH 3에서 하기 단계들로써 안정성을 결정하는 단계:

i) 기준 리파아제를 선택하는 단계;

ii) 각각 5 부피부의 리파아제 또는 기준 리파아제와 5 부피부의

a) 0.01% 트리톤-X100와 10 mM NaCl을 함유하는 희석제 또는

b) 150 ug/mL 펩신, 4 mM CaCl₂, 0.01% 트리톤-X100, 및 50 mM 시트레이트, pH 3.0을 함유하는 펩신 처리 용액을 혼합하는 단계,

a)는 미처리된 샘플로서 언급되고, b)는 펩신 처리된 샘플로서 언급된다;

iii) 3시간 동안 20℃에서 단계 ii)의 샘플을 인큐베이팅하는 단계

iv) 단계 iii)의 각 샘플에 1 mM PNP-팔미테이트, 1.2% 트리톤-X100, 4 mM CaCl₂, 100 mM TRIS, pH 8.0를 함유하는 기질의 55 부피부를

a) 5 부피부의 펩신-처리 용액, 또는

b) 5 부피부의 희석제를 첨가하는 단계

a)는 미처리된 샘플을 말하며, b)는 펩신-처리된 샘플을 말한다;

v) 간격을 두고 iv)의 샘플의 OD₄₀₅를 판독함으로써 기질의 분해를 따르는 단계;

vi) 선형 범위와 일치하는 v)로부터 데이터를 수집하고 시간 당 mOD (밀리 OD)로 펩신-처리된 샘플 및 미처리된 샘플 각각에 대해 리파아제 활성을 계산하는 단계;

vii) 펩신-처리된 샘플의 리파아제 활성을 미처리된 샘플의 그것으로 나눔으로써 그것들이 단계 vi)로부터 초래되는 것과 같이 % 잔여 리파아제 활성(%RA)을 계산하고, 100으로 결과를 곱하는 단계; 및, 원한다면,

viii) 리파아제의 %RA를 기준 리파아제의 그것과 비교하는 단계; 및/또는

b) 담즙산염의 존재 하에 pH 5에서 하기 단계들로써 활성을 결정하는 단계:

i) 기준 리파아제를 선택하는 단계;

ii) 10 부피부의 리파아제 또는 기준 리파아제를 각각 23 부피부의 a) 물, 또는 b) 20mM 담즙산염과 혼합하는 단계, a)는 미처리된 샘플로서 언급되며, b)는 담즙산염 샘플로서 언급되며;

iii) ii)의 각 샘플에, 25 mM 숙시네이트 중 1 mM PNP 올레이트, 2 mM CaCl₂, 1.2% 트리톤-X100, pH 5.0을 함유하는 기질의 200 부피부를 첨가하고 혼합하는 단계;

iv) 단계 iii) 후 즉시, 각 샘플로부터 60 부피부의 결과 혼합물을 제거하고 그것의 15 부피부를 4개의 별개의 구획에 4회 옮기는 단계;

v) 1, 2, 3, 및 4 시간 후 60 부피부의 100 mM TRIS, pH 8.0을 iv)의 4개의 구획의 각 칸에 첨가하고, 즉시 OD₄₀₅를 판독하고, 1, 2, 3, 및 4 시간 판독의 선형 범위를 기초로 mOD/시간에서 활성을 계산하는 단계;

vi) 리파아제 및 기준 리파아제에 대해, 단계 v)에서 획득한 바와 같은 미처리된 샘플의 활성에 의한 담즙산염의 단계 v)에서 획득한 활성으로 나누어서 리파아제와 기준 리파아제 각각의 담즙산염 안정성 비율에 도달하는 단계; 및

vii) 기준 리파아제의 담즙산염 안정성 비율로 리파아제의 담즙산염 안정성 비율을 나누는 단계, 이 결과 비율은 리파아제의 개선 인자로서 정의될 수 있다.
제 2 항에 있어서, 생체 밖 소화 성능은 제 3 항 또는 제 4 항의 방법을 사용하여 결정되는 것을 특징으로 하는 리파아제.
제 1 항 내지 제 2 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택되는 치환의 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 리파아제.
(a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열에 적어도 50% 동일성을 가지고;

(b) 리파아제 활성을 가지고;

(c) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열과 비교하여 9, 30, 38, 39, 63, 112, 114, 115, 117, 122, 128, 130, 136, 154, 155, 156, 161, 163, 168, 185, 190, 239 및 246로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에서 치환을 포함하는 리파아제.
(a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열에 적어도 50% 동일성을 가지고;

(b) 리파아제 활성을 가지고; 및

(c) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열과 비교하여, E1N; Q4H; N8L,Q; Q9H; N11C,D,H,L,P,S; G23E; D27I; P29T; A30T,V; T37K,M; G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; N39H,S; D57N; G61R; V63R; N71I,S; N73Q,Y; I76T; I86F,L; E87H; G91F,K,L,M,V,Y; N94Q; F95^*; D96^*; N101Q; D111E; G112A; T114I; S115L; W117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; D122E,N; Q126L; V128A, D130H, H135D, P136H; V141E,L; V154F,I,L; A155V; G156R; G161A,E; N162G,S; G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; V168M; L185M; G190CD; R205I; G240L; G246A; N251Q,S; 및 L269F,H로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는 리파아제.
(a)는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열과 적어도 50% 동일성을 가지며;

(b)는 리파아제 활성을 가지고;

(c) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 서열과 비교하여, 하기로부터 선택되는 치환의 세트를 포함하는 리파아제:
제 1 항 내지 제 2 항 및 제 5 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용을 위한 프로테아제 또는 아밀라아제와 조합하는 것을 특징으로 하는 리파아제.
제 1 항 내지 제 2 항 및 제 5 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용을 위한 프로테아제 및 아밀라아제와 조합하는 것을 특징으로 하는 리파아제.
제 10 항 또는 제 11 항 있어서, 하기 프로테아제 및/또는 아밀라아제와 조합하는 것을 특징으로 하는 리파아제.

(i) 프로테아제는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 프로테아제와 적어도 70% 동일성을 가지며

a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274의 서열을 가지는 프로테아제,

b) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188의 서열을 가지는 프로테아제, 및

c) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188의 서열을 가지는 프로테아제;

(ii) 아밀라아제는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 아밀라아제와 적어도 70% 동일성을 가진다,

a) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481의 서열을 가지는 아밀라아제,

b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481의 서열을 가지는 아밀라아제, 및

c) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483의 서열을 가지는 아밀라아제.
소화장애, 췌장 외분비 기능부전, 췌장염, 낭포성 섬유증, I형 당뇨병, 및/또는 II형 당뇨병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 2 항 및 제 5 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 정의된 리파아제 또는 리파아제 혼합물의 사용.
제 13 항에 있어서, 프로테아제 또는 아밀라아제의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
제 13 항에 있어서, 프로테아제 및 아밀라아제의 사용을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 프로테아제 및/또는 아밀라아제는 제 12 항에 정의된 것을 특징으로 하는 사용.
소화장애, 췌장 외분비 기능부전, 췌장염, 낭포성 섬유증, I형 당뇨병, 및/또는 II형 당뇨병의 치료에서 사용을 위한 제 1 항 내지 제 2 항 및 제 5 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 정의된 리파아제.
제 17 항에 있어서, 프로테아제 또는 아밀라아제와 조합하는 것을 특징으로 하는 리파아제.
제 17 항에 있어서, 프로테아제 및 아밀라아제와 조합하는 것을 특징으로 하는 리파아제.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 프로테아제 및/또는 아밀라아제는 제 12항에 정의된 것을 특징으로 하는 리파아제.
적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 보조 물질과 함께 제 1 항 내지 제 2 항 및 제 5 항 내지 제 6 항에 정의된 리파아제 또는 리파아제의 혼합물을 포함하는 약학 조성물.
제 21 항에 있어서, 프로테아제 또는 아밀라아제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 21 항에 있어서, 프로테아제 및 아밀라아제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 프로테아제 및/또는 아밀라아제는 제 12 항에 정의된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 2 항 및 제 5 항 내지 제 6 항에 정의된 리파아제 또는 리파아제의 혼합물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 것에 의해 소화장애, 췌장 외분비 기능부전, 췌장염, 낭포성 섬유증, I형 당뇨병, 및/또는 II형 당뇨병의 치료를 위한 방법.
제 25 항에 있어서, 프로테아제 또는 아밀라아제의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항에 있어서, 프로테아제 및 아밀라아제의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항 또는 제 27 항에 있어서, 프로테아제 및/또는 아밀라아제는 제 12항에 정의된 것을 특징으로 하는 방법.
리파아제는 모 리파아제의 변형체이며, 변형체는

(a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269와 적어도 50% 동일성을 가지고;

(b) 리파아제 활성을 가지고;

(c) 하기 치환들로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하며: N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56C, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, V60L, L69I, E87K, G91A, G91E, G91N, G91R, G91S, G91T, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, N94S, D96E, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M. L97Q, K98I, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, D111A, D111S, T114I, L147S, G163K, E210D, S216P, L227G, T231R, N233R, D234K, E239V, Q249R, N251S, D254N, P256T, G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A, 및 L269N, 각 위치는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 위치에 대응하고;

(d) 단, 변형체는

(i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제가 아니고,

(ii) (i)의 리파아제의 변형체 N33Q가 아닌 약제로서 사용을 위한 리파아제.
리파아제는 모 리파아제의 변형체이며, 변형체는

(a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269와 적어도 50% 동일성을 가지고;

(b) 리파아제 활성을 가지고;

(C) 위치 30, 42, 114, 및/또는 163 중 적어도 하나에서 적어도 하나의 치환을 포함하며, 각 위치는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 위치에 대응하는 약제로서 사용을 위한 리파아제.
리파아제는 모 리파아제의 변형체이며, 변형체는

(a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269와 적어도 50% 동일성을 가지고;

(b) 리파아제 활성을 가지고;

(C) 치환 A30T, A30V, P42L, T114I, 및 G163K으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하며, 각 위치는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269의 위치에 대응하는 약제로서 사용을 위한 리파아제.
리파아제는 모 리파아제의 변형체이며, 변형체는

(a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 269와 적어도 50% 동일성을 가지고;

(b) 리파아제 활성을 가지고;

(C) 하기 변형체로부터 선택되는 약제로서 사용을 위한 리파아제: