JP5406040B2 - 医薬使用のためのリパーゼ変異体 - Google Patents
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Description
本出願は、コンピューター読み取り可能形での配列表を含む。そのコンピューター読み取り可能形は、引用により本明細書に組込まれる。
本発明のリパーゼは、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼと組合して使用され得る。医学的指標の例は、消化障害、膵臓外分泌機能不全(PEI)、膵炎、嚢胞性線維症、糖尿病I型及び/又は糖尿病II型の処理である。
医薬使用のための改良されたリパーゼについての必要性が当業界において存在する。
本発明はまた、治療的有効量のそのようなリパーゼ、任意には、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼと共に投与することによる、消化障害、PEI、膵炎(急性及び/又は慢性)、嚢胞性線維症、糖尿病I型及び/又は糖尿病II型の処理方法にも関する。
(a)配列番号2のアミノ酸1〜269の配列に対して少なくとも50%の同一性を有し;(b)リパーゼ活性を有し;そして(c)配列番号2のアミノ酸1〜269の配列に比較して、次の位置:9, 30, 38, 39, 63, 112, 114, 115, 117, 122, 128, 130, 136, 154, 155, 156, 161 , 163, 168, 185, 190, 239, 及び246から選択された少なくとも1つの位置で置換を含んで成るリパーゼ;及び
リパーゼ:
リパーゼは、リパーゼ活性を有するポリペプチドである。次においては、本発明の組成物、方法及び使用のためのリパーゼは、本発明のリパーゼとして言及される。本発明のリパーゼは、活性を包含するカルボン酸エステルヒドロラーゼEC3.1.1.-, 例えばEC3.1.1.3トリアシルグリセロールリパーゼ、EC3.1.1.4ホスホリパーゼA2、EC3.1.1.5リソホスホリパーゼ、EC3.1.1.26ガラクトリパーゼ、EC3.1.1.32ホスホリパーゼA1、EC3.1.1.73フェルロイルエステラーゼであり得る。特定の態様においては、リパーゼは、EC3.1.1.3トリアシルグリセロールリパーゼである。もう1つの特定の態様においては、リパーゼは、EC3.1.1.4ホスホリパーゼA2活性を有し、すなわち反応:ホスファチジルコリン+H(2)O =1-アシルグリセロホスホコリン+カルボキシレート(2位置に結合される脂肪酸を除去する)を触媒する。さらに特定の態様においては、リパーゼは、EC3.1.1.32ホスホリパーゼA1活性を有し、すなわち反応:ホスファチジルコリン+H(2)O=2−アシルグリセロホスホコリン+カルボキシレートを触媒する。
本発明のリパーゼは、親リパーゼの変異体であり得る。
用語、変異体は、1又は複数の変更、例えば、親リパーゼに比較して、ポリペプチドにおける1又は複数の特定位置での1又は複数の特定アミノ酸残基の置換、挿入、欠失及び/又は切断を含んで成るリパーゼとして、本明細書においては定義される。
用語、新規リパーゼとは、変異体が比較され、そして一列整列されるポリペプチドを言及する。親リパーゼの特定の例は、修飾、例えば置換、挿入、欠失及び/又は切断が、本発明のリパーゼ変異体を生成するために行われるリパーゼである。親リパーゼは、天然に存在する(野生型)リパーゼであるか、又はそれは、いずれかの適切な手段により調製される、その変異体であり得る。親はまた、同じ染色体遺伝子座を占有する遺伝子の複数の他の形のいずれかによりコードされるポリペプチドである対立遺伝子変異体でもあり得る。
本発明においては、リパーゼ変異体におけるアミノ酸残基位置の特定の番号付けが使用される。既知リパーゼのアミノ酸配列を一列整列することにより、いずれかのリパーゼ酵素におけるいずれかのアミノ酸残基にアミノ酸位置番号を企画することが可能である。
D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T。
このセクションは、本発明のリパーゼ、アミラーゼ及びプロテアーゼ(本発明の酵素)に適用される。
2種のアミノ酸配列間の関係は、パラメーター“同一性”により記載される。
下記純粋に推定的な一列整列の例においては、オーバーラップは、配列1のアミノ酸配列“HTWGER-NL”又は配列番号2のアミノ酸配列“NGWGEDANL”である。この例においては、ギャップは、“−”により示される。
特定の態様においては、配列番号2のアミノ酸1−269に対するポリペプチドのアミノ酸配列の同一性の%は、i)2種のアミノ酸を、BLOSUM62置換マトリックス、10のギャップ開放ペナルティー及び0.5のギャップ延長ペナルティーを伴って、Needleプログラムを用いて、一列整列し;ii)前記一列整列における正確な適合の数を計数し;iii)2種のアミノ酸配列の最短の長さにより前記正確な適合の数を割り算し;そしてiv) iii)の割り算の結果を%に転換することにより決定される。
本発明は、医薬使用のための改良されたリパーゼを提供する。好ましくは、本発明に従っての使用のための酵素は、インビボ及び/又はインビトロでの改良された効力;改良された活性;改良された安定性を有し;プロテアーゼによる分解に対して安定し;塩の存在下で安定し;そして/又は低められたアレルギー性を有する。
消化性態様は好ましくは、(I)消化モデルを用いて、(II)ペプシンの存在下でpH3での安定性を決定することにより、及び/又は(III )胆汁塩の存在下でpH5での活性を決定することにより測定される。
a)対照リパーゼを選択し;
b)それぞれ、100部/体積の食餌と、20部/体積のペプシン及び30部/体積のリパーゼ又は対照リパーゼとを混合し;
c)i)0又はii)10部/体積の緩衝液(0.8MのMES、0.8Mの酢酸ナトリウム、0.8Mのイミダゾール、pH7.0)を添加し、ここで段階i)はpH3の胃段階として言及され得、そして段階ii)はpH5の胃段階として言及され得;
d)振盪下で37℃で1時間インキュベートし;
e)20部/体積の胆汁塩、及びi)25又はii)15部/体積の緩衝液(0.8MのMES、0.8Mの酢酸ナトリウム、0.8Mのイミダゾール、pH7.0)を添加し、ここで段階i)はpH3の胃段階として言及され得、そして段階ii)はpH5の胃段階として言及され得;
f)振盪下で37℃で2時間インキュベートし;
g)1Mのリン酸中、50部/体積の10%Triton-X100を添加し;
h)遊離脂肪酸の体積を決定し;
i)下記等式:
FFA=FFAmax*[E]/([E]+K)
[式中、FFAは開放される遊離脂肪酸の量であり、FFAmaxは、リパーゼ食餌から遊離することができる遊離脂肪酸の最大量であり、「E」はリパーゼ濃度であり、そしてKはFFAmaxの半分を遊離するリパーゼ濃度である]に、用量応答曲線を適合し;
j)次の通りに改良因子(IF):
IF=K(対照)/K(リパーゼ)
[ここでK(対照)は、FFAmaxの半分を遊離する対照リパーゼの濃度であり、そしてK(リパーゼ)は、FFAmaxの半分を遊離するリパーゼ濃度である]を計算することをを含んで成る、消化性能の新規決定方法を表す。
i)対照リパーゼを選択し;
ii)それぞれ、5部/体積のリパーゼ又は対照リパーゼと、5部/体積の
a)0.001%のTriton−X100及び10mMのNaClを含む希釈剤、又は
b)150μg/mlのペプシン、4mMのCaCl2、0.01%のTriton-X100及び50mMのシトレート、pH3.0を含むペプシン処理溶液(ここでa)は未処理のサンプルとして言及され、そしてb)はペプシン処理されたサンプルとして言及される)とを混合し;
iii)段階ii)のサンプルを、20℃で3時間インキュベートし;
iv)段階iii)の個々のサンプルに、1mMのPNP−パルミテート、1.2%のTriton-X100、4mMのCaCl2、100mMのTRIS, pH8.0を含む、55部/体積の基質、及び
a)5部/体積のペプシン処理溶液、又は
b)5部/体積の希釈剤(ここでa)は未処理のサンプルを言及し、そしてb)はペプシン処理されたサンプルを言及する)を添加し;
v)iv)サンプルのOD405を一定間隔で読み取ることにより基質の分解を追跡し;
vi)直線範囲に落ちるv)からのデータを集め、そしてそれぞれ、ペプシン処理されたサンプル及び未処理のサンプルについて、mOD(ミリOD)/時でのリパーゼ活性を計算し;
vii)ペプシン処理されたサンプルのリパーゼ活性を、未処理のサンプルのリパーゼ活性により、それらが段階vi)に起因する場合、割算し、そしてその結果に100を掛算することにより%残留リパーゼ活性(%RA)を計算し;そして所望には、
viii)リパーゼの%RAと、対照リパーゼの%RAとを比較することにより、ペプシンの存在下でpH3での安定性を決定することを含んで成る、上記(II)として言及されるpH3の新規ペプシン安定性試験によって決定される。
i)対照サンプルを選択し;
ii)それぞれ、10部/体積のリパーゼ又は対照リパーゼと、23部/体積のa)水、又はb)20mMの胆汁塩とを混合し、ここでa)は未処理のサンプルとして言及され、そしてb)は胆汁塩サンプルとして言及され;
iii)ii)の個々のサンプルに、25mMのスクシネート中、1mMのPNPオレエート、2mMのCaCl2、1.2%のTriton−X100、pH5.0を含む、200部/体積の基質を転化し;
iv)段階iii)の直後、個々のサンプルから、60部/体積の前記得られる混合物を除き、そしてその15部/体積を、4つの別々の区画中に4度、移し;
v)1,2,3及び4時間後、60部/体積の100mMのTRIS(pH8.0)を、iv)の4つの区画のそれぞれの区画に添加し、すぐにOD405を読み取り、そして1,2,3及び4時間の読み取りの線状範囲に基づいて、mOD/時での活性を計算し;
vi)それぞれ、リパーゼ及び対照リパーゼの胆汁塩安定性比率に達するよう、リパーゼ及び対照リパーゼについて、胆汁塩サンプルの段階v)で得られる活性を、段階v)でまた得られるような未処理のサンプルの活性により割算し;そして
vii)リパーゼの胆汁塩安定性比率を、対照リパーゼの胆汁塩を安定性比率により割算する(得られる比率はリパーゼの改良因子として定義され得る)ことにより、胆汁塩の存在下でpH5での活性を定義する段階を含んで成る、対照リパーゼに比較して、リパーゼのインビトロでの消化性能を決定することを含んで成る、上記(III )として言及されるpH5での新規胆汁塩活性試験によっても決定され得る。
消化モデル(上記に(I)として言及される)は、膵臓外分泌機能不全を有する単胃動物(例えば、ブタ及びヒト)における消化を模倣する。
Triton X-100 (C14H22O(C2H4O)n) (CAS No. 9002-93-1)は、親水性酸化ポリエチレン基(平均して、それは9.5の酸化エチレン単位、すなわちn=9〜10を有する)及び親油性又は疎水性炭化水素基を有する非イオン性界面活性剤である。炭化水素基は、4−(1,1,3,3−テトラメチルブチル)−フェニル基である。
インビトロ消化モデルの特定の態様においては、(a)ペプシン濃度は700mg/mlであり;(b)リパーゼ及び/又は対照リパーゼは、4種の異なった濃度で、それぞれ好ましくは二重反復して分析され;そして/又は(c)反応はマイクロタイタープレートのウェルにおいて生じる。
次のことが、ペプシンの存在下でpH3での安定性を測定することにより消化性能を決定する、上記(II)として言及される方法の特定の態様である:
(a)段階ii)に使用されるリパーゼは、好ましくは次の通りにして調製される培養上清液であり:リパーゼを発現できる、単一の酵母コロニー、例えばサッカロミセス・セレビシアエJG169(例えば、アメリカ特許第7,217,433号を参照のこと)が、1部/体積(例えば、1ml)の適切な培地(例えば、例8の種培養培地)中に採取され、そして30℃及び250rpmで一晩、増殖される。リパーゼの発現は、0.020部/体積(例えば、20μl)の前記得られる種培養物を、1部/体積の適切な培地(例えば、例8の最適化された培地)中に接種し、そして、30℃及び250rpmで4〜6日間、培養することにより達成される。培養は、例えばマイクロタイタープレート、例えば24ウェルプレートにおいて、又は振盪フラスコにおいて実施され得る。リパーゼサンプルは、希釈剤により、例えば25倍に適切に希釈され得:
(c)段階v)のOD405の読取は、6度、実施され;そして基質添加の15分後、早く、及び基質転換の18時間後、実施され;
(d)段階vi)においては、リパーゼ活性が、それぞれ、ペプシン処理されたサンプル及び未処理のサンプルについて、mOD/時で計算され、そして線状範囲にあるv)からのデータが集められ;
e)段階vii)においては、ペプシン処理されたリパーゼの段階vi)からの速度を、未処理の状態のその速度により割算し、そしてその結果に100を掛けることにより、%残留リパーゼ活性(%RA)を計算し;そして/又は
(f)段階v)においては、OD540が読取られ、そしてOD405読み取りからOD540読み取りを引き算することにより、バックグラウンドODを補正するために使用される。
次のことが、胆汁塩の存在下でpH5での活性を測定することにより消化性能を決定する方法(上記(III )として言及される)の特定の態様である:
(a)段階ii)に使用されるリパーゼが精製され;(b)リパーゼが、希釈剤(例えば、0.01%のTriton−X100, 10mMのNaCl)により、適切に希釈され、典型的には、25〜200倍、例えば約8μg/lに希釈され;(c)精製されたリパーゼサンプルの濃度が、吸光係数1.24A280/mgを用いて、280nmでの吸光度から決定され;(d)約0.100〜0.475のODが線状範囲にあり;そして/又は(e)胆汁塩は、蒸留水において20mMに製造されたSigma B−8756である。
N33Q+E87K+T231R+N233R;
N33Q+N94K+T231R+N233R;
N33Q+D96Y+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R;
N26I+N33Q+T231R+N233R;
A30T+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+G91A+T231R+N233R;
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R;
P29T+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+G91E+T231R+N233R; 及び
N33Q+N94K+T231R+N233R。
N33Q+K98I+T231R+N233R;
A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+G91A+T231R+N233R;
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R;
P29T+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+G91E+T231R+N233R;及び
N33Q+N94K+T231R+N233R。
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+G91A+T231R+N233R;
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R;
N33Q+G91E+T231R+N233R;及び
N33Q+N94K+T231R+N233R。
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+G91A+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R; 及び
N33Q+G91E+T231R+N233R。
D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R;
D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R;
Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R;
N33Q+D111E+T231R+N233R;
N33Q+D122E+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T;
N11R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+N39H+T231R+N233R;
N33Q+P229R+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+N200S+T231R+N233R;
N33Q+N39S+T231R+N233R;
N33Q+E210R+T231R+N233R;
N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R;
N33Q+T231R+N233R+D254R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+D96R+T231R+N233R;
D27N+N33Q+T231R+N233R;
D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+L227F+T231R+N233R;
N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R;
N33Q+G225P+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+D254G;
N33Q+D130H+T231R+N233R;
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+E239D;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R;
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G177A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+G246A;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R;及び
N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R。
D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
N33Q+N39S+T231R+N233R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T;及び
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S。
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254;及び
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R。
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R。
N33Q+E219D+T231R+N233R;
N33Q+W117L+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
Q4R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96W+T231R+N233R; 及び
N33Q+G91N+T231R+N233R。
N33Q+E219D+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;及び
D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T。
N33Q+E219D+T231R+N233R;及び
N33Q+G91T+T231R+N233R。
N33Q+D167E+T231R+N233R;
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N33Q+E210V+T231R+N233R;
N33Q+E56K+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254G ;
N33Q+D96S+T231R+N233R;
N33Q+D122N+T231R+N233R;
N26A+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+N162T+T231R+N233R;
N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+G240L;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R;
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G163R+T231R+N233R;
N33Q+G163N+T231R+N233R;
N33Q+G163C+T231R+N233R;
N33Q+G163Q+T231R+N233R;
N33Q+G163E+T231R+N233R;
N33Q+G163H+T231R+N233R;
N33Q+G163I+T231R+N233R;
N33Q+G91K+T231R+N233R;
N33Q+G91M+T231R+N233R;
N33Q+G91F+T231R+N233R;
N33Q+G91S+T231R+N233R;
N33Q+G91W+T231R+N233R;
N33Q+G91Y+T231R+N233R;
N33Q+G163Y+T231R+N233R;
N33Q+G91C+T231R+N233R;
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G161E+T231R+N233R;
N33Q+V128A+T231R+N233R;
N33Q+V128A+T231R+N233R;
N33Q+G163E+T231R+N233R;
N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R;
N33Q+G38A+T231R+N233R;
N33Q+G163A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G163M+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+ D111A+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R;
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256T;
N33Q+T231R+N233R+D242E;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+N162G+T231R+N233R;
N33Q+G91L+T231R+N233R;
N33Q+E87H+T231R+N233R;
N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+L227F+T231 R+N233R+D254S;
N33Q+G163A+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+T231R+N233R+D254A;
N33Q+T231R+N233R+D254N;
N33Q+T231R+N233R+D254L;
N33Q+T231R+N233R+D254K;
N33Q+T231R+N233R+D254M;
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256N;
N33Q+T231R+N233R+P256G;
N33Q+T23 R+N233R+P256H;
N33Q+T231R+N233R+P256M;
N33Q+T231R+N233R+P256Y;
N33Q+T231R+N233R+P256F;
N33Q+T231R+N233R+P256V;
N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R;
N33Q+V176N+T231R+N233R;
N33Q+V176D+T231R+N233R;
N33Q+W117F+T231R+N233R;
N33Q+V176I+T231R+N233R;
N33Q+D111N+T231R+N233R;
N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R;
N33Q+W117D+T231R+N233R;
N33Q+W117H+T231R+N233R;
N33Q+W117C+T231R+N233R;
N33Q+W117C+T231R+N233R;
N33Q+W117K+T231R+N233R;
N33Q+W117V+T231R+N233R;
N11S+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+W117E+V176K+T231R+N233R;
N33Q+W117G+T231R+N233R;
N33Q+W117P+T231R+N233R;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33Q+W117I+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+V176M+T231R+N233R;
N33Q+V176H+T231R+N233R;
N33Q+V176A+T231R+N233R;
D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+W117Y+T231R+N233R;
N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R;
D27R+N33Q+P136H+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S;
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G161A+T231R+N233R;
N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R;
N33Q+N94Q+T231R+N233R;
N11Q+N33Q+T231R+N233R;
N8Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+N251Q;
N33Q+N200Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R;
N33Q+N73Q+T231R+N233R;
N33Q+I86L+T231R+N233R;
N33Q+K98I+G163K+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111 A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+K98I+G163K+N200Q+T231R+N233R+N251S;
N33Q+G38S+G163K+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G38N+N73Q+T231R+N233R;
N33Q+G38D+R84E+T231R+N233R;
N33Q+G38Q+T231R+N233R;
N33Q+G38I+T231R+N233R;
N33Q+G38K+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S;
N33Q+G38L+T231R+N233R;
N33Q+G38P+T231R+N233R;
N33Q+G38T+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R+P256A;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A;
E1NN33QT231RN233R;
N33QG38HT231RN233R;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
D27R+N33Q+W117I+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254Q;
N11R+N33Q+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176W+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
E1D+N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+G163T+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231 R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D242E+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
N33Q+G38A+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+D254I;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11 R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R+D254S;
N11 R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S;
N33Q+E56Q+G156R+V176W+T231R+N233R;
E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A;
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+I90L+G91T+N94S+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254Y+I255F;
N33Q+L93F+D102Y+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R;
N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+P256F;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G156R+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91K+D96S+G163T+T231R+N233R+Q249R;
N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
N11R+G23E+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11 R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11 R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I;
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
E1*+N11R+N33Q+G38A+G91N+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S;
N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F+L269F;
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F;
N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11 R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;及び
N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S。
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N33Q+E210V+T231R+N233R;
N33Q+E56K+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254G ;
N33Q+D96S+T231R+N233R;
N33Q+N162T+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+G240L;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163N+T231R+N233R;
N33Q+G163Q+T231R+N233R;
N33Q+G163E+T231R+N233R;
N33Q+G91M+T231R+N233R;
N33Q+G91F+T231R+N233R;
N33Q+G163Y+T231R+N233R;
N33Q+V128A+T231R+N233R;
N33Q+G38A+T231 R+N233R;
N33Q+G163M+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R;
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256T;
N33Q+T231R+N233R+D242E;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+N162G+T231R+N233R;
N33Q+G91L+T231R+N233R;
N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254L;
N33Q+T231R+N233R+D254K;
N33Q+T231R+N233R+D254M;
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231 R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256N;
N33Q+T231R+N233R+P256G;
N33Q+T231R+N233R+P256M ;
N33Q+T231R+N233R+P256W;
N33Q+W117F+T231R+N233R;
N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
N33Q+W117C+T231R+N233R;
N33Q+W117C+T231R+N233R;
N33Q+W117K+T231R+N233R;
N11S+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+W117P+T231R+N233R;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33Q+W117T+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S;
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R;
N33Q+N101Q+T231R+N233R;
N33Q+N94Q+T231R+N233R;
N11Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R;
N33Q+N73Q+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+G38I+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251 S;
N33Q+G38T+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A;
N33Q G38HT231RN233R;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231 R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D242E+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I;
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S;
E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A;
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R;
N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F;
N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I;
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231 R+N233R;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N11 R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G 163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231 R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;及び
N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S。
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254G;
N33Q+T231R+N233R+G240L;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R;
N33Q+G163M+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+D242E;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+N162G+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254K;
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256N;
N33Q+T231R+N233R+P256M;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S;
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G91T+W1171+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231 R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G 163L+T231R+N233R+D254S+P256N;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F;
N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S;
N 11 R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11 R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+L227G+231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q;
N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S;
N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S; 及び
N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S。
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S; 及び
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T。
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R ;及び
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S。
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R;
N33Q+E56Q+T231R+N233R;
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
N33Q+N39S+T231R+N233R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R;
K98I+T231R+N233R+N251S;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163T+T231R+N233R;
N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+T231R+N233R+P256A;
N33Q+T231R+N233R+P256S;
N33Q+S115L+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+K98l+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L;及び
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E210D+T231 R+N233R;
N33Q+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;及び
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;及び
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S。
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R;
N33Q+E56Q+T231R+N233R;
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R;
K98I+T231R+N233R+N251S;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163T+T231R+N233R;
N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+T231R+N233R+D254Q;
N33Q+T231R+N233R+D254I;
N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+T231R+N233R+P256A;
N33Q+T231R+N233R+P256S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+S115L+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G161A+T231R+N233R;
N33Q+G38M+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+K98l+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L; 及び
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+E56Q+T231 R+N233R;
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254Q;
N33Q+T231R+N233R+D254I;
N33Q+T231R+N233R+P256S;
N33Q+S115L+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G38M+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+K98l+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L;及び
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231 R+N233R+D254S+P256L。
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G38M+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S。
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R;
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A;
D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111A+T114I+V168M+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91 N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91 N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A;
D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R;
D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;及び
N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R;
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A;
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A;
P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91 N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;及び
N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114l+G163K+E210D+T231R+N233R;及び
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S。
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+D254K+P256A;
L52I+V60E+T114I+V168M+E21OD;
D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; 及び
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T。
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;及び
N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A。
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; 及び
N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A。
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T。
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; 及び
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S。
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231 R+N233R+D254S。
さらなる特定の態様においては、本発明のリパーゼは、緩衝液におけるpH3.0での60分のインキュベーションの後、少なくとも82, 83, 84, 85, 86, 87, 88又は少なくとも89の、上記及び例4に記載のようにして決定される%残基活性を有する。
pH3.0での改良された安定性のリパーゼ変異体の特定の例は、次のものである(配列番号2のアミノ酸1〜269の配列を有するリパーゼに対する):LV2934, LVA043, LVA049, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LV1857, LVA012, LVA023, LVA041 , LVA061及びLVA099。
ペプシンの存在下でpH3.0で改良された安定性を有するリパーゼのさらなる例は、次のものである:LVA147, LVA315, LVA317, LVA319及びLVA714。それらは、配列番号2、1及びLV2934のリパーゼのいずれかに比較して改良される。胆汁塩の存在下でpH3.0で改良された安定性を有するもう1つの特に好ましいリパーゼ変異体は、LVA349である。それらのリパーゼ変異体の構造体については、表1及び例4を参照のこと。
配列番号2に比較して、改良されたホスホリパーゼ活性を有するリパーゼ変異体の特定の例は、次のものである:LV1889, LVA023, LV1330, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LVA043, LVA049, LV1857及びLV1232。好ましいリパーゼは、LV1232及びLV1889である。
本発明の他の特に好ましいリパーゼは、親リパーゼの変異体であり、そして(T231R+N233R)及びさらに、次の置換の少なくとも1つを含んで成るリパーゼである:N26I, D27Q, D27R, D27Y, A30V, T32I, N33Y, P42L, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56C, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, E87K, G91E, G91N, G91 R, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M. L97Q, K98I, E99K, E99P, E99S, E99T, D111A, D111S, T114I, L147S, G163K, S216P, L227G, D234K, E239V, Q249R, D254N, G263Q, L264A, I265T, G266D及び/又は L269N。
次のリパーゼはまた、本発明の範囲内ni包含される:それぞれ、配列番号2のアミノ酸-5〜-1、配列番号2の-4〜-1、配列番号2の-3〜-1、配列番号2の-2〜-1及び配列番号2の-1に対応する、次のN−末端延長:SPIRR, PIRR, IRR, RR及びRのいずれか1つを、さらに含んで成る、請求項に記載され、そして本明細書に開示されるリパーゼのいずれか1つ。それらのN−末端バージョンのいずれかの混合物が、特別に本明細書に包含される。
本明細書においては、アミラーゼは、澱粉及び他の線状及び枝分かれ鎖のオリゴ−多糖の末端−加水分解を触媒する酵素である。澱粉のアミロース部分は、1,4−α−グルコシド結合に富んでおり、そしてアミロペクチン部分は、1,4−α−のみならず、また、1,6−α−グルコシド結合を含む枝分かれ鎖である。特定の態様においては、アミラーゼは、EC3.2.1.1グループに属する酵素である。
用語“同時”とは、酵素が、それらが1又は複数の別々の医薬製品と同時に投与される場合、又はそれらが1つの及び同じ医薬組成物において投与される場合、同時に活性的である環境を言及する。
用語“1つの(a)”とは、例えば本発明のプロテアーゼ、リパーゼ、及び/又はアミラーゼに関して使用される場合、少なくとも1種を意味する。特定の態様においては、“1つの”とは、1,2,3,4,5、等を再び意味する、“1つ又はそれ以上”又は“少なくとも1つ”を意味する。
本明細書においては、用語“薬剤”とは、疾病の徴候を処理し、予防し、そして/又は軽減する;好ましくは疾病の徴候を処理し、そして/又は軽減する、化合物、又は化合物の混合物を意味する。薬剤は、医者により処方され得るか、又はそれは店頭取引製品であり得る。
本発明の酵素の単離、精製及び濃縮は、従来の手段により実施され得る。例えばそれらは、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除)、電気泳動方法(例えば、分離用等電点電気泳動)、示差溶解性(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)、SDS−PAGE又は抽出(但し、それらだけには限定されない)により精製され得る(例えば、Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publlishers, New York, 1989を参照のこと)。
従って、次の方法及び補助材料は単なる例示であり、そして制限的ではない。
特定の態様においては、本発明の医薬組成物は、腸、好ましくは経口投与のためである。
組成物のさらなる特定の態様においては、プロテアーゼは、組成物中の他の酵素成分、例えばリパーゼ及び/又はアミラーゼから分離される。
アミド(ペプチド)結合、及びアミノ及びカルボキシ末端は、経口投与に対してより高い安定性に修飾され得る。カルボキシ末端はアミド化され得る。
本発明のリパーゼは、任意には、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼ(本発明の酵素)と組合して、動物における種々の疾病又は障害及び/又は予防処理において有用である。用語、動物とは、すべての動物及び特にヒトを包含する。動物の例は、非反芻動物、及び反芻動物、例えば、羊、ヤギ、及び牛、例えば蓄牛、及び乳牛及び子牛を包含する。特定の態様においては、動物は非反芻動物である。非反芻動物は、単一の胃を有する動物、例えば馬、ブタ(子ブタ、成長しているブタ及び雌ブタを包含するが、但しそれらだけには限定されない);家禽類、例えば七面鳥、鴨及び鶏(ブロイラー鶏、産卵鶏を包含するが、但しそれらだけには限定されない);子牛;ペット、例えばネコ及び犬;及び魚(サケ、マス、ティラピア、ナマズ、及び鯉を包含するが、但しそれだけには限定されない);及び甲殻類(小エビ及び車えびを包含するが、但しそれだけには限定されない)を包含する。特定の態様においては、動物は哺乳類、より特定にはヒトである。
本明細書に記載される発明は、本明細書に開示される特許の態様により範囲を限定されるものではない。何故ならば、それらの態様は本発明のいくつかの観点を例示するものである。いずれかの同等の態様が本発明の範囲内で意図される。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの修飾の他に、本発明の種々の修飾は、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はまた本発明の範囲内にある。
本発明はまた、配列番号2のアミノ酸1〜269の配列に比較して、請求項1〜2及び5〜9のいずれか1項記載の置換、例えば置換N33Q、T231R及びN233R、及び次のものから選択された少なくとも1つの追加の置換を含んで成る、薬剤として使用するためのリパーゼにも関する:E1*,D,N;Q4H,P,R;D5E;N8L,Q;Q9H;F10L; N11C,D,H,L,P,Q,R,S; G23E; N26A,H,I;D27I,N,Q,R,S,V; P29T; A30T,V; T37K,M; G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q1S,T,W,Y; N39H,S; E43K;K46M; A49T; L52I,R; E56K,Q,R,S; D57G,N; V60E,S; G61R; V63R; A68V; L69I; N71I,S;N73Q,Y; I76T; R84E; I86F,L; E87A,H,K,R; I90L,V; G91A,C,E,F,K,L,M,N,S,T,V,W,Y; L93*,F;N94*K,Q,R,S;F95*;D96*,E,G,N,R,S,W,Y;L97M,Q;K98I,T;E99D;N101Q;D102E,G,Y;
R108M;G109A;D111A,E,N,S;G112A;T114I;S115L;W117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y;D122E,N;Q126L;V128A;D130H;H135D;P136H;Y138F;V141E,L;A150V;V154F,I,L;A155V;G156R;G161A,E;N162G,S,T;G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;D167E;V168M;V176A,D,F,G,H,I,K,M,N,Q,T,W; G177A; R179T; L185M; G190C,D; N200Q,S; R205I;L206F; E210D,R,V,Y; S216P; E219D; G225P; T226N; L227F,G; P229R; E239D; G240L; D242E; T244S; G246A;Q249R;N251Q,S;D254A,G,I,K,L,M,N,R,Q,S,Y;I255A,F;P256A,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y; 及び L269F,H;前記リパーゼはさらに、
(b)非常に低い(好ましくは、低い、中位の、中位の高い、高い、又は最も好ましくは非常に高い)緊縮条件下で、(i)引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第5,869,438号の配列番号1のコード配列(配列番号2のリパーゼをコードするDNA配列)、又は(ii)(i)の十分の長さの相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ;そして/又は
(c)さらに、好ましくは保存性質の、配列番号1の成熟ポリペプチドの1又は複数(例えば、いくつかの)のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含んで成る変異体である。
(a)前記変更は独立して、
(i)前記位置のすぐ下流のアミノ酸の挿入、
(ii)前記位置を占有するアミノ酸の欠失、及び/又は
(iii)前記位置を占有するアミノ酸の置換であり;
(b)前記変更は、請求項1〜2及び5〜9のいずれか1項記載の変更から選択され;
(c)前記変異体は、リパーゼ活性を有し;そして
(d)個々の位置は、配列番号2のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に対応する。
LVA012
=LVA013 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
LVA023 N33Q+E210D+T231R+N233R;
LVA041 N33Q+D111A+T231R+N233R;
LVA043 N33Q+G91T+T231R+N233R;
LVA055 N33Q+E219D+T231R+N233R;
LVA060 N33Q+W117L+T231R+N233R;
LVA061 D27Q+N33Q+T231R+N233R;
LVA063 N33Q+G91T+T231R+N233R;
LVA089 D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T;
LVA094 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T;
LVA099 D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA103 Q4R+N33Q+T231R+N233R;
LVA113 N33Q+T231R+N233R+Q249R;
LVA120 N33Q+D96W+T231R+N233R;
LVA130 D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R;
LVA139 Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R;
LVA140 N33Q+D111E+T231R+N233R;
LVA143 N33Q+D122E+T231R+N233R;
LVA147 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA162 N33Q+D167E+T231R+N233R;
LVA179 N33Q+G91N+T231R+N233R;
LVA180 N33Q+T231R+N233R+P256T;
LVA182
D27R+N33Q+G91 A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T;
LVA185 N11R+N33Q+T231R+N233R;
LVA198 N33Q+N39H+T231R+N233R;
LVA202 N33Q+P229R+T231R+N233R;
LVA206 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA208 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R;
LVA211 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T;
LVA214 N33Q+E87A+T231R+N233R;
LVA216 N33Q+E56Q+T231R+N233R;
LVA217 N33Q+E210V+T231R+N233R;
LVA218 N33Q+E56K+T231R+N233R;
LVA220 N33Q+T231R+N233R+D254G;
LVA221 N33Q+D96S+T231R+N233R;
LVA222 N33Q+D122N+T231R+N233R;
LVA228 N26A+N33Q+T231R+N233R;
LVA229 N33Q+N162T+T231R+N233R;
LVA230 N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R;
LVA231 N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
LVA234 N33Q+T231R+N233R+G240L;
LVA238 D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
LVA243 N33Q+N200S+T231R+N233R;
LVA245 N33Q+N39S+T231R+N233R;
LVA247 N33Q+E210R+T231R+N233R;
LVA248 N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R;
LVA249 N33Q+T231R+N233R+D254R;
LVA250 N33Q+N94R+T231R+N233R;
LVA252 N33Q+D96R+T231R+N233R;
LVA254 D27N+N33Q+T231R+N233R;
LVA256 D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R;
LVA257 N33Q+L227F+T231R+N233R;
LVA272 N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R;
LVA273 N33Q+G225P+T231R+N233R;
LVA275 N33Q+T231R+N233R+D254S;
LVA277 N33Q+D96G+T231R+N233R;
LVA280 N33Q+T231R+N233R+D254G;
LVA281 N33Q+D130H+T231R+N233R;
LVA284 N33Q+E87A+T231R+N233R;
LVA287 N33Q+T231R+N233R+E239D;
LVA307 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G;
LVA308 N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
LVA310 N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
LVA315 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
LVA317 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA319 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231 R+N233R+D254S;
LVA325 Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA327 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R;
LVA330 Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA331 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA334 N33Q+G177A+T231R+N233R;
LVA338 N33Q+T231R+N233R+G246A;
LVA341 D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA345 D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R;
LVA347 N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R;
LVA349 K98I+T231R+N233R+N251S;
LVA353 N33Q+G163R+T231R+N233R;
LVA355 N33Q+G163N+T231R+N233R;
LVA357 N33Q+G163C+T231R+N233R;
LVA359 N33Q+G163Q+T231R+N233R;
LVA360 =LVA415 N33Q+G163E+T231R+N233R;
LVA362 N33Q+G163H+T231R+N233R;
LVA364 N33Q+G163I+T231R+N233R;
LVA368 N33Q+G163P+T231R+N233R;
LVA371 N33Q+G91K+T231R+N233R;
LVA373 N33Q+G91M+T231R+N233R;
LVA375 N33Q+G91F+T231R+N233R;
LVA379 N33Q+G91S+T231R+N233R;
LVA381 N33Q+G91W+T231R+N233R;
LVA383 N33Q+G91Y+T231R+N233R;
LVA387 N33Q+G163T+T231R+N233R;
LVA389 N33Q+G163W+T231 R+N233R;
LVA391 N33Q+G163Y+T231R+N233R;
LVA393 N33Q+G163V+T231R+N233R;
LVA399 N33Q+G91C+T231R+N233R;
LVA411 N33Q+G91 Y+Q126L+T231R+N233R;
LVA412 N33Q+G91M+G161 E+T231R+N233R;
=LVA414 N33Q+V128A+T231R+N233R;
LVA416 N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R;
LVA417 N33Q+G38A+T231R+N233R;
LVA420 N33Q+G163A+T231R+N233R;
LVA421 N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R;
LVA437 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
LVA438 N33Q+G163M+T231R+N233R;
LVA440 N33Q+G91V+T231R+N233R;
LVA442 N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R;
LVA444 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
LVA449 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA450 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
LVA451 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
LVA453 N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R;
LVA454 N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S;
LVA458 N33Q+T231R+N233R+D242E;
LVA460 N33Q+E87R+T231R+N233R;
LVA461 N33Q+E56R+T231R+N233R;
LVA463 N33Q+N162G+T231R+N233R;
LVA464 N33Q+G91L+T231R+N233R;
LVA468 N33Q+E87H+T231R+N233R;
LVA470 N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R;
LVA471 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
LVA472 N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S;
LVA473 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA474 N33Q+G163A+T231R+N233R;
LVA480 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA482 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R;
LVA483 N33Q+T231R+N233R+D254A;
LVA486 N33Q+T231R+N233R+D254Q;
LVA488 N33Q+T231R+N233R+D254I;
LVA490 N33Q+T231R+N233R+D254L;
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LVA494 N33Q+T231R+N233R+D254M;
LVA503 N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA505 D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R;
LVA506 N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA507 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R;
LVA509 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA512 N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA513 D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA516 N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA518 D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA519 D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA523 D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA526 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA527 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA530 D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA532 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA535 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA540 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA542 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA547 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
LVA548 N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S;
LVA553 N33Q+T231R+N233R+P256A;
LVA555 N33Q+T231R+N233R+P256N;
LVA561 N33Q+T231R+N233R+P256G;
LVA562 N33Q+T231R+N233R+P256H;
LVA565 N33Q+T231R+N233R+P256M;
LVA566 N33Q+T231R+N233R+P256S;
LVA567 N33Q+T231R+N233R+P256W;
LVA569 N33Q+T231R+N233R+P256Y;
LVA576 N33Q+T231R+N233R+P256F;
LVA578 N33Q+T231R+N233R+P256V;
LVA580 N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R;
LVA581 N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R;
LVA582 N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R;
LVA583 N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R;
LVA586 N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R;
LVA602 N33Q+V176N+T231R+N233R;
LVA604 N33Q+V176D+T231R+N233R;
LVA614 N33Q+W117F+T231R+N233R;
LVA622 N33Q+V176I+T231R+N233R;
LVA623 N33Q+D111N+T231R+N233R;
LVA627 N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R;
LVA629 N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R;
LVA631 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
LVA632 N33Q+G91M+G163P+T231R+N233R;
LVA634 N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R;
LVA639 N33Q+W117D+T231R+N233R;
LVA640 N33Q+W117H+T231R+N233R;
LVA649
=LVA650 N33Q+W117C+T231R+N233R;
LVA651 N33Q+W117K+T231R+N233R;
LVA653 N33Q+W117V+T231R+N233R;
LVA656 N11S+N33Q+T231R+N233R;
LVA659 N33Q+W117G+T231R+N233R;
LVA664 N33Q+W117P+T231R+N233R;
LVA665 N33Q+W117S+T231R+N233R;
LVA666 N33Q+W117T+T231R+N233R;
LVA667 N33Q+W117I+T231R+N233R;
LVA670 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
LVA672 N33Q+S115L+T231R+N233R;
LVA675 N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA696 N33Q+V176M+T231R+N233R;
LVA697 N33Q+V176H+T231R+N233R;
LVA700 N33Q+V176A+T231R+N233R;
LVA702 D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R;
LVA705 N33Q+W117Y+T231R+N233R;
LVA707 N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R;
LVA714 =LVAR714 D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
LVA715 D27R+N33Q+P136H+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
LVA718 N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S;
LVA721 N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
LVA722 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
LVA723 N33Q+G161A+T231 R+N233R;
LVA731 N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R;
LVA732 N33Q+N101Q+T231R+N233R;
LVA733 N33Q+N94Q+T231R+N233R;
LVA734 N33Q+G161A+T231 R+N233R;
LVA736 N11 Q+N33Q+T23 R+N233R;
LVA738 N8Q+N33Q+T231R+N233R;
LVA740 N33Q+T231R+N233R+N251Q;
LVA743 N33Q+N200Q+T231R+N233R;
LVA746 N33Q+N73Q+T231R+N233R;
LVA749 N33Q+I86L+T231R+N233R;
LVA753 N33Q+K98I+G163K+T231R+N233R;
LVA754 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA755 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA770 D27R+N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA771 N33Q+K98I+G163K+N200Q+T231R+N233R+N251S;
LVA772 N33Q+G38S+G163K+T231R+N233R;
LVA773 D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA774 N33Q+G38Y+T231R+N233R;
LVA777 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA778 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA782 N33Q+G38N+N73Q+T231 R+N233R;
LVA783 N33Q+G38D+R84E+T231 R+N233R;
LVA786 N33Q+G38I+T231R+N233R;
LVA788 N33Q+G38K+T231R+N233R;
LVA792 N33Q+G38F+T231R+N233R;
LVA799 N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S;
LVA800 N33Q+G38L+T231R+N233R;
LVA801 N33Q+G38M+T231R+N233R;
LVA803 N33Q+G38F+T231R+N233R;
LVA804 N33Q+G38P+T231R+N233R;
LVA805 N33Q+G38T+T231R+N233R;
LVA806 N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA808 D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA809 N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA811 D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA813 D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
LVA816 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
LVA817 N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R;
LVA818 N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A;
LVA819 E1N+N33Q+T231R+N233R;
LVA821 N33Q G38H T231R N233R;
LVA829
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
LVA830 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
LVA831 N33Q+K98I+T231R+N233R;
LVA834 D27R+N33Q+W117I+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
LVA835 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA839 N33Q+G163W+T231R+N233R;
LVA841 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
LVA842 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA844 N33Q+T231R+N233R+D254Q;
LVA847 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176W+T231R+N233R+D254S;
LVA848
=LVA849 N33Q+G163D+T231R+N233R;
LVA850 N33Q+G163P+T231R+N233R;
LVA853 E1D+N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S;
LVA857 N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
LUA860 Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA862
D27R+N33Q+T37K+N711+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA863 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA865 N33Q+W117S+T231R+N233R;
LVA866 N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
LVA869 N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R;
LVA871 N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
LVA875 N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+N233R;
LVA877 N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA878 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA880 N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA882 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D242E+D254S+P256T;
LVA883 D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA888 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
LVA890 N33Q+G38A+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
LVA892 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+D254I;
LVA896 N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
LVA897 N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R+D254S;
LVA899 N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
LVA904 N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA906 N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S;
LVA907 N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S;
LVA915 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S;
LVA917 N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
LVA919 N11R+N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R+D254S;
LVA921 N11 R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S;
LVA925 N33Q+E56Q+G156R+V176W+T231R+N233R;
LVA927E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231 R+N233R;
LVA928 N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A;
LVA929 N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA930 N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA933 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
LVA934 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA941 N11R+N33Q+I90L+G91T+N94S+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA942 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S;
LVA943 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
LVA945 N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S;
LVA946 N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S;
LVA947 N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
LVA948 N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
LVA949 N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S;
LVA950 N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N;
LVA952 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
LVA953 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
LVA954 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
LVA959 N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254Y+I255F;
LVA961 N33Q+L93F+D102Y+T231R+N233R;
LVA962 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
LVA964 N11S+N33Q+T231R+N233R;
LVA966 N11R+N33Q+T231R+N233R;
LVA969 N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R;
LVA970 N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA972 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
LVA973 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
LVA976 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F;
LVA977 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+P256F;
LVA978 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F;
LVA979 N11R+N33Q+G38A+G91T+G156R+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S;
LVA980 N33Q+G91K+D96S+G163T+T231R+N233R+Q249R;
LVA981 N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S;
LVA983 N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S;
LVA984 N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
LVA985 N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA987 N11R+G23E+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA989 N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA990 N11R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA991 N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA993 N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA994 N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S;
LVA995 N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S;
LVA997 N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
LVA998 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231 R+N233R+D254S+P256I;
LVA999 N33Q+G38S+G 156R+G 163K+V176W+T231R+N233R;
LVA1002 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
LVA1003 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+D254S;
LVA1004 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S;
LVA1005 N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
LVA1006 E1*+N11R+N33Q+G38A+G91N+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
LVA1007 E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
LVA1008 E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
LVA1009 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
LVA1010 E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
LVA1011 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R;
LVA1012 E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
LVA1013 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S;
LVA1014 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q;
LVA1015 E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
LVA1018 N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+T231R+N233R;
LVA1019 N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176I+T231R+N233R;
LVA1021 N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA1023 N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA1027 E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S;
LVA1028 N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA1029 N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
LVA1031 N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F+L269F;
LVA1032 N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F;
LVA1033 N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA1034 N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA1035 N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA1036 N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA1037 N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA1040 N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA1041 Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
LVA1044 N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA1045 N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
LVA1046 N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
LVA1048 N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S;
LVAR0074 N33Q+E87K+T231R+N233R;
LVAR0076 N33Q+N94K+T231R+N233R;
LVAR0077 N33Q+D96Y+T231R+N233R;
LVAR0079 N33Q+K98I+T231R+N233R;
LVAR0080 A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R;
LVAR0086 N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R;
LVAR0088 N26I+N33Q+T231R+N233R;
LVAR0091 A30T+N33Q+T231R+N233R;
LVAR0095 N33Q+G91A+T231R+N233R;
LVAR0096 N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R;
LVAR0099 N33Q+K98I+T231R+N233R;
LVAR0101 N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R;
LVAR0102 P29T+N33Q+T231R+N233R;
LVAR0103 N33Q+G91V+T231R+N233R;
LVAR0104 N33Q+K98I+T231R+N233R;
LVAR0106 N33Q+G91E+T231R+N233R;
LVAR0108 N33Q+N94K+T231R+N233R;
LVAR204 D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR205
D27R+N33Q+T37K+N711+G91 N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR207 D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR208 D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR209 D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111A+T114I+V168M+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR215 Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR216 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR218 D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR219 D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR220 D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+T231R+N233R+P256T+L269H;
LVAR223 D27R+N33Q+G91 N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR225 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
LVAR226 G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR230 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256;
LVAR231 D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR234 D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR235 N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR277 N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A;
LVAR281 N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R;
LVAR282 N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A;
LVAR283 D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R;
LVAR284 D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T;
LVAR285 N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R;
LVAR286 N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R;
LVAR287 N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
LVAR288 D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
LVAR290 N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A;
=LVA828 N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
LVAR861 G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR863 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR955 N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVAR956 N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L;
LVA957 N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L;
LVAR1042 G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; 及び
LVAR1043 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T。
1.(a)配列番号2のアミノ酸1〜269の配列に対して少なくとも50%の同一性を有し;そして(b)リパーゼ活性を有し;そして(c)次の置換:N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56C, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, V60L, L69I, E87K,G91A, G91 E, G91 N, G91 R, G91S, G91T, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, N94S, D96E, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M,L97Q, K98I, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, D111A, D111S, T114I, L147S, G163K, E210D, S216P, L227G, T231 R, N233R, D234K, E239V, Q249R, N251S, D254N, P256T, G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A及びL269Nから選択された少なくとも1つの置換を含んで成り、ここで個々の位置は配列番号2のアミノ酸1〜269の位置に対応し;そして(d)但し、(i)配列番号1のアミノ酸1〜269を有するリパーゼではなく、そして(ii)(i)のリパーゼの変異体N33Qではない、親リパーゼの変異体である、薬剤として使用するためのリパーゼ。
LVA012: D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T,
LVA023: N33Q+E210D+T231R+N233R,
LVA041 : N33Q+D111A+T231R+N233R,
LVA043: N33Q+G91T+T231R+N233R,
LVA049: N33Q+G163K+T231R+N233R,
LVA061 : D27Q+N33Q+T231R+N233R,
LVA099: D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T,
LVA349: K98I+T231R+N233R+N251S,
LV1232: G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N,
LV1330: N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R,
LV1855: D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1857: D27R+G9 N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1865: D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1874: D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1889: D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T,
LVAR0003: K98I+T231R+N233R,
LVAROOHa G91A+T231R+N233R,
LVAR0013: G91V+T231R+N233R,
LVARO014 N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R,
LVAR0015 P42L+D57N+G91E+T231R+N233R,
LVAR0016 K98I+T231R+N233R,
LVAR0017 V60L+G91V+T231R+N233R,
LVAR0032: D57G+L93F+T231R+N233R,
LVAR0045: A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R,
LVAR0046: E99T+T114I+D254N+T231R+N233R,
LVAR0047: D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0048 E43K+E56S+E87K+T231R+N233R,
LVAR0050: E56S++E87K+D96L+E99D+T231R+N233R,
LVAR0051 : E56A+D57A+T114I+T231R+N233R,
LVAR0053: E56K+D96G+D111A+T231R+N233R,
LVAR0054: E87K+D111S+T231R+N233R,
LVAR0055 E43V+G91R+T231R+N233R,
LVAR0056: E56S+E87K+T231R+N233R,
LVAR0057: E87K+G91E+T231R+N233R,
LVAR0058: D27Y+E87K+T231R+N233R,
LVAR0059 E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0061 : E56K+E87K+D111A+T231R+N233R,
LVAR0062: E87K+E99P+T231R+N233R,
LVAR0063: E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0064: E56C+E87K+T231R+N233R,
LVAR0065: E56R+E87K+D96L+T231R+N233R,
LVAR0066 E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R,
LVAR0067: E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0069: D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0070 E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R,
LVAR0071 E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R,
LVAR0072: D96V+D111A+T231R+N233R,
LVAR0074: N33Q+E87K+T231R+N233R,
LVAR0076: N33Q+N94K+T231R+N233R,
LVAR0077: N33Q+D96Y+T231R+N233R,
LVAR0078: N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R,
LVAR0079: N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0080: A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0086: N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R,
LVAR0088: N26I+N33Q+T231R+N233R,
LVAR0091: A30T+N33Q+T231R+N233R,
LVAR0094: N33Q+G91V+T231R+N233R,
LVAR0096: N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R,
LVAR0099: N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0101 : N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R,
LVAR0102: P29T+N33Q+T231R+N233R,
LVAR0103: N33Q+G91V+T231R+N233R,
LVAR0104: N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0106: N33Q+G91E+T231R+N233R, 及び
LVAR0108: N33Q+N94K+T231R+N233R(ここで、個々の位置は配列番号2のアミノ酸1〜269の位置に対応する)から選択される、親リパーゼの変異体である、薬剤として使用するためのリパーゼ。
LVA012: D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T,
LVA023: N33Q+E210D+T231R+N233R,
LVA041 : N33Q+D111A+T231R+N233R,
LVA043: N33Q+G91T+T231R+N233R,
LVA049: N33Q+G163K+T231R+N233R,
LVA061 : D27Q+N33Q+T231R+N233R,
LVA099: D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T,
LVA349: K98I+T231R+N233R+N251S,
LV1232: G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N,
LV1330: N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R,
LV1855: D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1857: D27R+G9N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1865: D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1874: D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1889: D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T,
LVAR0003: K98I+T231R+N233R,
LVAROOHa G91A+T231R+N233R,
LVAR0013: G91V+T231R+N233R,
LVARO014 N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R,
LVAR0015 P42L+D57N+G91E+T231R+N233R,
LVAR0016 K98I+T231R+N233R,
LVAR0017 V60L+G91V+T231R+N233R,
LVAR0032: D57G+L93F+T231R+N233R,
LVAR0045: A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R,
LVAR0046: E99T+T114I+D254N+T231R+N233R,
LVAR0047: D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0048 E43K+E56S+E87K+T231R+N233R,
LVAR0050: E56S++E87K+D96L+E99D+T231R+N233R,
LVAR0051 : E56A+D57A+T114I+T231R+N233R,
LVAR0053: E56K+D96G+D111A+T231R+N233R,
LVAR0054: E87K+D111S+T231R+N233R,
LVAR0055 E43V+G91R+T231R+N233R,
LVAR0056: E56S+E87K+T231R+N233R,
LVAR0057: E87K+G91E+T231R+N233R,
LVAR0058: D27Y+E87K+T231R+N233R,
LVAR0059 E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0061 : E56K+E87K+D111A+T231R+N233R,
LVAR0062: E87K+E99P+T231R+N233R,
LVAR0063: E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0064: E56C+E87K+T231R+N233R,
LVAR0065: E56R+E87K+D96L+T231R+N233R,
LVAR0066 E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R,
LVAR0067: E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0069: D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0070 E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R,
LVAR0071 E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R,
LVAR0072: D96V+D111A+T231 R+N233R,
LVAR0074: N33Q+E87K+T231R+N233R,
LVAR0076: N33Q+N94K+T231R+N233R,
LVAR0077: N33Q+D96Y+T231R+N233R,
LVAR0078: N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R,
LVAR0079: N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0080: A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0086: N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R,
LVAR0088: N26I+N33Q+T231R+N233R,
LVAR0091: A30T+N33Q+T231R+N233R,
LVAR0094: N33Q+G91V+T231R+N233R,
LVAR0096: N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R,
LVAR0099: N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0101 : N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R,
LVAR0102: P29T+N33Q+T231R+N233R,
LVAR0103: N33Q+G91V+T231R+N233R,
LVAR0104: N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0106: N33Q+G91E+T231R+N233R, 及び
LVAR0108: N33Q+N94K+T231R+N233R(ここで、個々の位置は配列番号2のアミノ酸1〜269の位置に対応する)から選択される、親リパーゼの変異体であるリパーゼ。
10.薬剤として使用のためにプロテアーゼ及びアミラーゼと組合しての態様1〜8のいずれか1つのリパーゼ。
13.プロテアーゼ又はアミラーゼの使用をさらに含んで成る態様12の使用。
14.プロテアーゼ及びアミラーゼの使用をさらに含んで成る態様12の使用。
15.前記プロテアーゼ及び/又はアミラーゼが態様11に定義される通りである態様13又は14の使用。
17.プロテアーゼ又はアミラーゼと組合しての態様16のリパーゼ。
18.プロテアーゼ及びアミラーゼと組合して態様16のリパーゼ。
19.前記プロテアーゼ及び/又はアミラーゼが態様11に定義される通りである態様16又は17のリパーゼ。
20.態様1〜8のいずれか1つに定義されるようなリパーゼ又はリパーゼ混合物、及び少なくとも1つの医薬的に許容できる助剤材料を含んで成る医薬組成物。
22.プロテアーゼ及びアミラーゼをさらに含んで成る態様20の組成物。
23.前記プロテアーゼ及び/又はアミラーゼが態様11に定義される通りである態様21又は22の組成物。
24.治療的有効量の態様1〜8のいずれか1つに定義されるようなリパーゼ又はリパーゼ混合物を投与することによる、消化障害、膵臓外分泌機能不全、膵炎、嚢胞性線維症、糖尿病I型及び/又は糖尿病II型の処理方法。
26.治療有効量のプロテアーゼ及びアミラーゼを投与することをさらに含んで成る態様24の方法。
27.前記プロテアーゼ及び/又はアミラーゼが態様11に定義される通りである態様25又は26の方法。
例1:酵素アッセイ:
ブタパンクレアチンのリパーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼ活性についてのアッセイは、FIP (Federation Internationale Pharmaceutique)により公開されている。IFIP−単位=1Ph.Eur.−単位(ヨーロッパ薬局方)。アッセイは、例えば医薬酵素の標準化については、Federation Internationale Pharmaceutique, Scientific Section: International Commissionに記載されている。a) "Pharmaceutical Enzymes," Editors: R. Ruyssen and A. Lauwers, E. Story Scientia, Ghent, Belgium (1978), b) European Pharmacopoeia。また、Deemester et al in Lauwers A, Scharpe S (eds): Pharmaceutical Enzymes, New York, Marcel Dekker, 1997, p. 343-385も参照のこと。適切な酵素標準は、International Commission on Pharmaceutical Enzymes, Centre for Standards, Harelbekestraat 72, B-9000 Ghentから入手され得る。
パンクレアチンの脂肪分解活性を測定するために、ヨーロッパ薬局方5.1に公開される方法を使用した。特にことわらない限り、微生物リパーゼの脂肪分解活性の決定のために、RIPにより公開されるリゾパス・オリザエ(Rhizopus oryzae)リパーゼについてのアッセイを使用した。
基質:パラ−ニトロ−フェニル(pNP)バレレート:
アッセイpH:7.7。
アッセイ温度:40℃
反応時間:25分。
このアッセイにおいては、pH7.00及び30℃(±1℃)での0.16Mのトリブチリン(グリセロールトリブチレート、Merck 1.01958.000)のリパーゼ触媒された分解に続いて、0.025Mのガス抜きされた、CO2フリーの水酸化ナトリウム(水酸化ナトリウムチトリソール、Merck9956)による開放される酪酸のpH−安定滴定を行う。滴定液の消費を、時間の関数として記録する。
このアッセイは、0.65mMの胆汁塩の存在下でオリーブ油エマルジョンからの脂肪酸のリパーゼ触媒された開放に基づかれている。基質を、乳化剤としてのアラビアガムと共に乳化する(175gのオリーブ油を、630mlのアラビアガム溶液(4000mlの水中、474.6gのアラビアガム、64gの塩化カルシウム)と共にブレンダーにおいて15分間、乳化し;室温への冷却の後、pHを、4MのNaOHを用いて、pH6.8−7.0に調節する)。
基質:Suc-AAPF−pNA(Sigma(商標) S-7388).
アッセイ緩衝液:10OmM の琥珀酸, 10OmMの HEPES (Sigma H-3375), 10OmMの CHES (Sigma C-2885), 10OmMの CABS (Sigma C-5580), 1 mMの CaCl2, 15OmMの KCl, 0.01 % Triton(商標) X-100(次の分子式を有する非イオン性界面活性剤:C14H22O(C2H4O)n、ここで分子当たりの酸化エチレン単位の平均数は約9又は10である、CAS #: 9002-93-1)(HCI 又は NaOHによりpH 9.0に調節された)。
アッセイ温度:25℃。
変性されたヘモグロビン(ウレア含有の6.7mMのKH2PO4/NaOH緩衝液(pH7.50)中、0.65%(w/w))を、25℃で10分間、プロテアーゼにより分解し、そして分解されていないヘモグロビンを、トリクロロ酢酸(TCA)により沈殿せしめ、そして濾過により除去する。濾液中、TCA可溶性ヘモグロビン分解性生物を、Folin & Ciocalteuのフェノール試薬(2体積の脱イオン水に対する1体積のFolin−Ciocalteuフェノール試薬Merck9001.0500)により決定し、これは、いくつかのアミノ酸により青色を付与する(750nmで測定される)。
基質:Phadebas錠剤(Pharmacla Diagnostics:ウシ血清アルブミン及び緩衝物質と共に混合される不溶性の青色に着色された澱粉ポリマーを架橋し、そして錠剤に製造する)。
アッセイ温度:37℃。
アッセイpH:4.3(又は、7.0、所望により)。
反応時間:20分。
下記表1に示されるリパーゼ変異体をコードするDNAを用いて、アメリカ特許第5,869,438号の例22に記載の方法(但し、PyrG選択がAMDS選択の代わりに使用された(WO2004/069872号に記載される))により、アスペルギラス・オリザエ株ToC1512(WO2005/070962号に記載される)を形質転換した。アスペルギラス・オリザエ宿主の胞子を、寒天スラントから採取し、そして10mlのYPM(10gの酵母抽出物、Difco+20gのペプトン、Difco, 1Lまでの水、オートクレープされ;そして2%(w/w)まで無菌濾過されたマルトース)の接種のために使用した。接種された管を、New Brunswick Scientific Innova 2300シェーカーにおいて、180rpmで3日間、30℃でインキュベートした。培養物をMira-Cloth (Calbiochem)により濾過し、0.45μmのフィルターにより無菌濾過することにより、上清液を収穫した。リパーゼ変異体を、アメリカ特許第5,869,438号の例23に一般的に記載のようにして、精製した。
配列番号2のアミノ酸1〜269の配列を有し、そして例えばアメリカ特許第5,614,189号に医薬使用について記載される、ヒューミコラ・ラヌギノサDSM1800からの野生型リパーゼ、及びWO2006/136159号に医薬使用について記載される、配列番号1のアミノ酸1〜269を有する前記リパーゼの(T231R+N233R)−変異体。
配列番号2に比較して、次の置換を有する変異体LV1232:G91A + D96W + E99K + G263Q + L264A + I265T + G266D + T267A + L269N。
それらのリパーゼを、次に記載のようにして、ホスホリパーゼ活性について試験した。
酵素サンプルを、酵素希釈緩衝液(20mMの酢酸ナトリウム、0.1%(w/w)Triton-X100、pH5.0)により、5mg/ml(ml当たりの酵素タンパク質(EP)のmg)に希釈した。酵素濃度を、A280及び計算されたモル吸光係数(プログラムGPMAW (Lighthouse Data, Odense, Denmark; http://welcome.to/gpmaw;また、Gill and von Hippel, 1989, Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data, Anal. Biochem. 182: 319-326も参照のこと)に基づいて決定した。
Avanti Polar Lipids Inc., 700 Industrial Park Drive, Alabaster, AL 35007, US, カタログ番号850445)から市販されている、基質1−ミリストイル−2−パルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(“ホスファチジルコリン”と称す)の溶液を、次の通りにして調製した:
1.37.5mgのホスファチジルコリンを、750μlの脱イオン化された水に溶解し、
2.室温で1時間、撹拌し、
3.37.5μlの0.32MのCaCl2を添加し、
4.1〜2分間、撹拌し、
5.375μlの16mMのデオキシコール酸ナトリウムを添加し、
6.750μlの脱イオン水を添加し、
7.室温で30分間、撹拌する。
1.2mlのエペンドーフ管に100μlの基質を移し、
2.上記のようにして5mg/mlに希釈された酵素5μlを添加し、
3.エペンドーフサーモミキサーにおいて40℃、1000rpmで20分間インキュベートし、
4.10μlの反応混合物を、新しいエペンドーフ管に移し、そして990μlの50%エタノール(MeOH, 0.1(w/w)トリフルオロ酢酸(TFA)を添加し、
5.これを、このマトリックス:50%MeOH、0.1%TFA中、20mg/mlの2, 5−ジヒドロ安息香酸と共に混合した後、MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/lonization Time-Of-Flight質量分光法)により分析する。
706Da ホスファチジルコリン
496Da A1加水分解(位置1でのホスファチジルコリン−ミリストイル(C14))
468Da A2加水分解(位置2でのホスファチジルコリン−パルミトイル(C10))
258Da A1及びA2加水分解(分解されていないホスファチジルコリン−C14及びC16)
706, 496, 468及び258DaのMwを表すMSピークの相対的シグナル強度(個々のピーク下の面積)が、ホスホリパーゼA1及びA2(PLA1−及びPLA2-)活性間の分布の計算のための基礎として使用される。
一般的に、A2/A1に対するA1/A2の10〜15%以上のシグナル強度は、真の二重活性又は不純サンプルのいずれかを示すことができる。
試験されるすべてのリパーゼは、いくらかの程度、ホスホリパーゼ活性を、主にPLA1−活性として有する。陽性対照LV1232は、両実験において高いホスホリパーゼ活性を示した。
配列番号1及び2の従来技術のリパーゼは、同じ実験(実験I)において試験される場合、ホスホリパーゼ活性に関して、ほとんど同じ性能を示し、加水分解の後、末消化のリン脂質を、それぞれ約44%及び42%残した。
上記表1に示される多くの精製されたリパーゼ変異体を、10mMの胆汁塩の存在下でpH6での活性について試験した。例1におけるように、配列番号2及び1のリパーゼを比較のために包含した。
pH6でのアッセイ緩衝液:100mMのイミダゾール、100mMのアセテート、10mMのマロン酸、pH6.0。
酵素希釈緩衝液:5mMのNaH2PO4、pH7.0。
7mMのCaCl2(Merck, 1.02382.0500)。
胆汁塩(80mM):Solvay Pharmaceuticals, バッチ176.01-PA-7374からのリパーゼ活性化胆汁塩混合物。
トリリノレイン(グリセリルトリリノレエート、Sigma T9517)。
ペプシン:(Merck VL 317492437, カタログ番号1.0792.0001)。
停止溶液:10%Triton-X100, 1Mのリン酸。
基質作業エマルジョンは、次の通りにして調製された:
1.2.188mlの胆汁塩(80mM)と、6.68mlの脱イオン水とを混合し、
2.0.133mlのトリリノレイン(グリセリルトリリノレエート、Sigma T9517)を添加し、
3.Ultraturexミキサー(yellow line Dl 25 basic)により室温で1分間、混合する。
これにより、19.44mMの胆汁塩及び15.56mMのトリリノレインを含む基質の作業エマルジョンを得る。
酵素サンプルを、5mMのNaH2PO4(pH7.0)により、0.07mg/ml(mgの酵素タンパク質/ml)に希釈した。酵素濃度は、A280 に基づいた。酵素を、5mMのNaH2PO4により2倍に希釈した(合計6回の希釈を行い、そして酵素を含まない緩衝液対照)。それらの希釈により、ウェルにおいて次の最終濃度の酵素を得る:0.01 mg/ml,0.05, 0.025, 0.0125, 0.0625, 0.03125及び0.015625 mg/ml。
1.マイクロタイタープレート(MTP)において、35μlのアッセイ緩衝液と25μlの7mMのCaCl2とを混合し、90μlの基質作業エマルジョンを添加する。37℃、700ppmで20分間プレインキュベーとする。
2.25μlのそれぞれの酵素希釈溶液を添加し、そして37℃及び700rpmで30分間インキュベートする(最終体積175μl)。胆汁塩及びトリリノレインの最終濃度は、MTPウェルにおいてそれぞれ10mM及び8mMである。
4.Nefac(Wako, Nefa C ACS-ACOD Method Enzymatic 色彩試験コード番号999-75406)により、FFAの検出のために、1%Triton-X100においてすぐにはサンプルを10倍に希釈する。
1.溶液Aの製造:ボトルR1aを、10mlのボトルR1により溶解する(NefaCキットから)。溶液Bの製造:ボトルR2aを、20mlのボトルR2により溶解する(Nefacキットから)。
3.25μlの標準/リパーゼサンプルを、50μlの溶液Aと共に混合する。室温及び700rpmで15分間インキュベートする。
4.100mlの溶液Bを添加し、室温及び700rpmで15分間インキュベートする。
mMでのFFAの濃度を、Nefa C標準曲線から決定する。リパーゼ活性結果を、下記ミカエリス−メンテン−様式に適合する:
A=AO+Amax*[E]/([E]+K)
V0を決定し(mモルFFA/g酵素/分)、そして配列番号1のリパーゼについてのVOに対する比率を決定する。配列番号1のリパーゼ及び変異体LV2934(配列番号1のグリコシル化されていない変異体)が、個々のMTPに基づいて、対照として包含された。
配列番号1に標準化された結果が、下記表4に示される。
上記結果に基づいて、LV1889, LV1874 及びLV1865を除いて、試験されたすべての変異体が、配列番号2のリパーゼに比較して、10mMの胆汁塩と共にトリリノレエートを用いて、pH6での高い活性を有することが予測される。
上記表1に列挙される多くのリパーゼ変異体を、2〜8のpH範囲でのpH安定性について試験した。前の例におけるように、配列番号2及び1のリパーゼは、比較のために包含された。配列番号2のリパーゼの次の変異体をまた試験した:
LVA147: D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T
LVA315: N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G
LVA317: N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S
LVA319: N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S
LVA714: D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S。
手短には、酵素を、所望するpHで、37℃で1, 15, 45及び120分間(又は、1, 60及び120分間)インキュベートし、これに続いて、残留リパーゼ活性を、pH8及び室温(RT)で、p−ニトロフェニルカプリレートに対して測定した。
酵素希釈緩衝液:20mMのアセテート、pH6, 0.01%Triton-x100。
安定性緩衝液:200mMのイミダゾール、200mMのアセテート、200mMのマロン酸、pH2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0及び8.0に調節される。
pNP−カプリレート(C8):Sigma N−0752。
ペプシン(700mg/l):Merck, VL 317492437 (1.0792.0001)。
胆汁塩(80mM):Solvay Pharmaceuticalsからのリパーゼ活性化胆汁塩混合物(バッチ176.01−PA−7374)。
酵素を、A280 に基づいて、0.4又は0.8mgの酵素タンパク質/mlの作業溶液に、20mMのNaH2PO4、pH7.0、0.01%Triton-X100により希釈した。
1)マイクロタイタープレート(MTP)の個々のウェルに、50μlの安定性緩衝液、20μlの0.1%Triton-X100、25μlの胆汁塩(80mM)又は20μlのペプシン(700mg/l)又は脱イオン水を添加する。脱イオン水を添加し、ウェル当たり175μlの最終体積にする。すべてのサンプルは、二重反復して製造された。37℃及び700rpmで20分間、予備加熱する。
4)サンプルを希釈する(pHを8に高めるために、最少20倍に希釈する)。1分のサンプル(pH8)に対する初期残留活性(RA)を構成し、2Ox、4Ox、8Ox、16Ox及び32Oxに希釈し、アッセイにおける直線性を得るために必要とされる希釈度を決定する。
5)下記に記載のようにして、pH8.0でのpNP−カプリレート基質対するRAを測定する。
基質原液を、14.2μlのp−ニトロフェニルカプリレート(Sigma N-0752)と、1mlの2−プロパノールとを混合することにより調製する。この原液を、残留活性緩衝液pH8.0により50倍に希釈し、作業溶液を得、この150μlを個々のウェルに添加する。
1)新しいMTPにおいて、20μlの希釈されたサンプル及び150μlの基質作業溶液を混合する。
2)405nmで5分間、運動性を測定する(最初に混合し、室温で12秒ごとに読取る)。
%残留活性を次の通りにして計算する:個々の回収(1, 15, 45, 120分)についての個々のpH内の割合から、胆汁塩又はペプシンを有さない酵素対照についての割合が引き算される。次に、この補正された割合が、個々のpH内の最高値により割算され、そして100が掛け算される。
次のリパーゼ変異体が、配列番号2のリパーゼに比較して、pH3での改良された安定性を有する:LV2934, LVA043, LVA049, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LV1857, LVA012, LVA023, LVA041 , LVA061 , LVA099, LVA147及びLVA714。
次の変異体が、配列番号のリパーゼに比較して、胆汁塩に対するpH3での改良された安定性を有する:LVA349。
下記表8に示される追加のリパーゼ変異体を、発酵上清液の無菌濾過を含めて例2に記載のようにして調製した。
フィルタープレート(Unifilter 800, 25μmの溶融吹込みポリプロピレンフィルター、Whatman)のウェルに、約50μlのXpressLine ProAクロマトグラフィー媒体を添加した(Upfront Chromatography A/S, Lersoe Parkalle 42, DK-2100 Copenhagen, Denmarkから市販されている)。クロマトグラフィー媒体を、200μlの1Mの酢酸ナトリウム(pH5.0)を添加することにより平衡化した。10分の撹拌の後、平衡化緩衝液を真空下で除去した(Uni−Vac3、Whatman)。平衡化段階を反復した。
活性部位タイトレーション:
精製された(一般的に例2に記載のようにして精製され、そして/又は例6に記載のようにしてマイクロ−精製された)リパーゼ変体の濃度を、次に記載のようにして、バースト活性部位タイトレーションにより決定した。
F = FO + Burst * (1-exp(-(t + dt) * ln(2) /T1/2) + Slope * (t + dt)
ここでFは測定された蛍光であり、FOはインヒビター及びリパーゼからの蛍光バックグラウンドであり、tは最初の蛍光測定以来の時間であり、dtはリパーゼとインヒビターとの混合から最初の蛍光測定までの時間であり、Burstは蛍光バーストであり、T1/2は、指数バーストのための半減期であり、そしてSlopeは、例えばリパーゼ−エチルヘプチルホスホネート複合体の加水分解及び/又はレソルフィンの漂白のために、蛍光の線状変化の傾斜である。
活性リパーゼ濃度を、計算されたバーストと、レソルフィン標準曲線の傾斜との間の比率として決定した(0〜4μM;マイクロタイタープレート上に包含される)。
精製されたリパーゼ変異体の濃度をまた、消衰係数1.24A280/mgを用いて、280nmでの吸光度から推定することもまた。
精製されたリパーゼ変異体を、下記に記載のようにして、インビトロ消化モデルにおいて試験した。
2種の食餌(それぞれ食餌I及び食餌II)のいずれかを、インビトロモデルにおいて使用した。食餌Iの組成は、34%(w/w)の脂肪、45%(w/w)の炭水化物、2%(w/w)のタンパク質(残りは、水、塩、等)である。食餌IIの組成は、Fat313、タンパク質146及び澱粉358であり(窒素を含まない抽出物(NfE)は、432であることが計算され得る)、すべてはg/kg乾量である。
FFA=FFAmax*[E]/([E]+K)
式中、FFAは開放される遊離脂肪酸の量であり、FFAmaxは、リパーゼ食餌から遊離することができる遊離脂肪酸の最大量であり、「E」はリパーゼ濃度であり、そしてKはFFAmaxの半分を遊離するリパーゼ濃度である。
IF=K(対照)/K(リパーゼ)
ここでK(対照)は、FFAmaxの半分を遊離する対照リパーゼの濃度であり、そしてK(リパーゼ)は、FFAmaxの半分を遊離するリパーゼ変異体濃度である。
例5における表8の変異体を、下記表24及び表25の変異体と共に、ペプシンの存在下でpH3での安定性についてスクリーンした。
スクリーニング方法は、75μg/mlのペプシンの存在下でpH3.0及び室温での3時間後、残留リパーゼ活性を測定する。残留リパーゼ活性を、非常に高い活性及び非常に低い活性のリパーゼのスクリーニングの間の検出を可能にするために、活性をモニターする速度アッセイより、一定時間にわたって測定する。
変異体の一次スクリーンにおいては、十分に高い希釈を、試験条件に対する培地又は発光成分の効果を最少にするために、ブイヨンサンプルに対して行う。一次相を通過する変異体は、試験サンプルのより高い希釈度及び反復試験を付加することにより追従スクリーニングにおける試験を受ける。
一次スクリーニング培地:
1.7gの酵母窒素基材(YNB)、及び硫酸アンモニウム (Bio 101, カタログ番号4027-532)、 0.8 gの完全サプリメント混合物-ウラシル(CSM-ura) w/40 mg のアデニン(ADE) (Bio 101 , カタログ番号4512-722)、5 g のカザミノ酸(BD, カタログ番号223050)、100 mlの50% グルコース、50 mlの 0.5 M K2HPO4 (リン酸カリウム-ニ塩基性)、1 mlの100 mM CuSO4-SH2O (JD Baker, カタログ番号1843- 01)、1 ml の100 mg/mL アンピシリン(合計体積を脱イオン水により1Lに調節する)。培地をフィルター殺菌し、そして4℃で貯蔵した。
6.7gのYNB、及び硫酸アンモニウム (Bio 101 , カタログ番号4027-532)、 5.9 g の 琥珀酸 (Sigma S-9512)、 0.8 g の CSM-ura w/40 mg ADE (Bio 101 , カタログ番号4512-722)、 20 gのガラクトース(Sigma, カタログ番号G-0625)、10 gのグルコース, 1 mlの100 mM CuSO4-5H2O 及び1 mlの100 mg/mL アンピシリン。pHをNaOHにより6.6に調節し、そして体積を、脱イオン水により1Lに調節する。
次の成分を混合する:6.7 g のYNB 、及び硫酸アンモニウム (Bio 101 , カタログ番号4027- 532)、 5 g のカザミノ酸(BD, カタログ番号223050)、100 mlの 0.5 M琥珀酸(Sigma S- 9512)、855 ml の脱イオン水H2O。前記混合物をオートクレーブ処理する。2mlの10mg/mlのクロラムフェニコール及び40mlの50%グルコースを添加する。4℃で貯蔵する。
1. 10% Triton-X100 (w/v)
2. 1 Mの TRIS, pH 8.0
3. 10% (680 mM)の CaCl2*2H2O
4. 100 mMのクエン酸, pH 3.0
5.100mMのクエン酸、0.01%Triton-X100において製造された5mg/mlのブタペプシン(Sigma P-6887, 3280 U/mg固形物, 3370 U/mg ペプシン)
6.6.10%Triton-X100において製造された50mMの4−ニトロフェノール(PNP)パルミテートリパーゼ活性アッセイのための基質:
1 mM のPNP-パルミテート, 1.2%Triton-X100, 4 mMの CaCl2, 100 mMの TRIS, pH 8.0。
150 ug/mLのペプシン, 4 mMの CaCl2, 0.01% Triton-X100, 50 mMの シトレート, pH 3.0。
希釈剤:
0.01%Triton-X100, 10mMのNaCl。
酵素:
一次スクリーンのためのリパーゼ変異体のブイヨンサンプルは、95ウェルプレートにおける一次スクリーン培地中に、寒天プレートから採取された個々のクローンに由来した。
3種の培地レセピーを用いて、リパーゼ変異体を増殖した。一次スクリーンレベルでの発現レベルは決定的ではないので、一次スクリーン培地を初期スクリーン段階のために使用した。酵母コロニーを発現する単一のリパーゼ変異体を、96ウェルプレートにおける180μlの一次スクリーン培地中に採取し、そして一次スクリーニングサンプルに関して、30℃及び250rpmで4〜6日間、増殖した。
いずれかの続くスクリーニングに関しては、単一の酵母コロニーを、24ウェルプレートにおける1mlの種子培養培地中に採取し、そして30℃及び250rpmで一晩、増殖した。リパーゼの発現は、30℃及び250rpmで4〜6日間、24ウェルプレートにおける1mlの最適化された培地中に20μlの種子培養物を接種することにより達成された。最適化された培地は、タンパク質発現レベルを最大にするために、24ウェルプレート及び振盪フラスコにおいて増殖するために使用された。
一次スクリーンにおいて、サンプルを、希釈剤により25倍に希釈し、次にその5μlを、5μlの希釈剤又はペプシン処理溶液のいずれかを含む384ウェルプレートに添加した。
室温で3時間後、基質を次の通りに個々のサンプルに添加した:ペプシン処理されたサンプルを、55μlの基質+5μの希釈剤と共に混合し、未処理のサンプルを、55μlの基質+5μlのペプシン処理された溶液と共に混合した。ペプシンpHは3.0であり、そしてpHの変化について補正しないで、活性アッセイを2種の異なったpH値で行い、その結果、これは、リパーゼの安定性に対する効果を伴わないで、アッセイpHを標準化する(基質のpHが全体のpHを8.0に上げるのに十分である場合(ペプシンが不活性である場合)、それを最後に添加することにより)。
二次スクリーンの後に測定される場合の個々のリパーゼ変異体について相対的残留物活性が下記表26及び表27に示される。それらの変異体の個々は、配列番号2のアミノ酸1〜269のリパーゼに比較して、改良されたRA(ペプシンの存在下でpH3での安定性)を有する。
胆汁塩の存在下で改良された活性を有するリパーゼ変異体を同定するために、次のアッセイを開発した。アッセイは、胆汁塩を含まない条件に比較して、2mMの胆汁塩の存在下でのリパーゼ活性を測定する。試験は、リパーゼ活性が、非常に高い活性及び非常に低い活性リパーゼの検出を可能にするために、一定時間、活性をモニターする速度アッセイにより測定されるよう設定される。このアッセイは、試薬の添加のタイミング、及びリパーゼが低いpHで基質と反応するpH5.0から、開放されるPNP基のOD405での読取りを可能にするpH8.0への調節を正確に調節するために自動化される。前記プレートは、pH調節の直後、読取られる。
1. 10% Triton-X100 (w/v)
2. 10O mMの TRIS, pH 8.0
3. 100 mMのスクシネート, pH 5.0
4. 10% (680 mM)の CaCl2 *2H2O
5. 蒸留水において製造された20 mM の胆汁塩 (Sigma B-8756)
6. 10% Triton-X100において製造された 50 mMの 4-ニトロフェノール(PNP)オレエート。
1 mMの PNP-オレエート, 1.2%Triton-X100, 2 mMの CaCl2, 25 mMのスクシネート, pH 5.0。
希釈剤:
0.01% Triton-X100, 10 mM のNaCl。
精製されたリパーゼサンプルを、自動化された方法のために、約8μg/mlの希釈度に希釈する。精製されたリパーゼサンプルの濃度を、消衰係数1.24A280/mgを用いて、280nmでの吸光度から決定する。
酵素サンプルを、希釈剤により25倍及び200倍に希釈し、次のその20μlを、96ウェルプレート反応プレートにおける23μlの水又は23μlの20mMの胆汁塩のいずれかに添加する。この後、200μlの基質(25mlのスクシネート中、1mMのPNPオレエート、2mMのCaCl2、1.2%Triton-X100, pH5.0)を添加し、そして混合する。混合の直後、60μlを除き、そして15μlをピペットにより、4個の別々の384ウェルプレートに移し、ここで4重反復(4×96)が使用され、リパーゼサンプルの2つの希釈溶液の個々について、“+”及び“−”胆汁塩条件が設定される。
本発明の選択された、精製されたヒューミコラ・ラヌギノサリパーゼ変異体を、誘発された膵臓外分泌機能不全症(PEI)を有する雌Gottingenミニブタ(Ellegaard)におけるリパーゼスクリーニングの試験において研究した。変異体のアミノ酸配列は、表1、7及び8に見出される。効力を、配列番号1のアミノ酸1〜269を有するリパーゼの変異体N33Q(変異体LV2934; 表12の対照リパーゼ)の効力に比較した。
リパーゼ活性についてのスクリーニング試験を、3又は4匹のPEIミニブタの2つのグループにおいて実施した。研究の間、ブタは改良された代謝ケージに収容され、そして水を自由に飲むことができ、そして1日当たり2回の食事が供給された。
247.2gのミルク;Fresenlus Kabiからの1×87gの香料Calshake(2077KJ/100g);29.9gのオリーブ油;9.88gのMethocel(Colorcon GmbHからのMehocel E5);及び0.368gの酸化クロム。Calshakeは、24.4%の脂肪、3.3%のラクトース、64.9%の炭水化物(49%の糖)、4.3%のタンパク質を含む。
リパーゼ効力を評価するために、ブタに1回の試験食事(51.6gの脂肪を含む)を供給し、この食事中には、異なった量の対照リパーゼ又は類似する量のリパーゼ変異体が給餌の直前、混合されている。
凍結された回腸キームスサンプルを、凍結乾燥し、微粉砕し、そして乾燥物質(DM)及び脂肪について分析した(Naumann & Bassler 1993; Die chemische Untersuchung von Futtermitteln, 3. edition, VDLUFA-Verlag, Darmstadt (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten)。DMを、凍結乾燥、続く103℃での8時間のインキュベーションの後、重量により評価し;乾燥サンプルの粗脂肪含有率を、酸加水分解及び石油エーテル抽出により、ANKOMXT15抽出機(Ankom Technology, Macedon, NY, USから入手できる;一度に15の抽出を実施できる)でのフィルターバッグ技法を用いて、決定し;Cr2O3をクロメートに酸化し、そしてPetry and Rapp :Zeitung fur Tierphysiologie (1970), vol. 27, p. 181-189. (Petry & Rapp 1970; Z. Tierphysiol. 27; 181-189)により記載のようにして、365nmでの減衰(分光計)を通して計算した。
CFA(%)=100−[飼料における%Cr2O3]*[ 回腸キームスにおける%脂肪]・100/[回腸キームスにおける%Cr2O3]*[飼料における%脂肪]。
CFA結果が、表29に示される。リパーゼ投与量は、食事当たりのmg酵素タンパク質(mg/食事)で示される。
精製されたリパーゼ変異体LVA319を、6匹の雌Gottingenミニブタ(Ellegaard)のグループにおける完全な消化研究において試験した。効力を、同じ食餌を供給されたPEIミニブタにおいて試験される配列番号1のリパーゼの効力に比較した。膵臓外分泌機能不全症(PEI)を、膵管の連結によりミニブタにおいて誘発し、そしてそれらをまた、回腸−盲腸再入カニューレにより固定し、すべてはイソフルオラン麻酔下で及び約25kgの体重で、次に記載のようにして実施された:Tabeling など. (Tabelingなど., 1999, "Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution", J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82: 251-263) 及び Gregory など. (Gregory など., 1999, "Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme supplementation" in "Biology of the Pancreas in Growing Animals" (Pierzynowski & Zabielski eds), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp. 381-393)。
研究の間、ブタは、12:12時間の明暗サイクルに基づいて囲いに収容され、そして水へは自由に接近でき、そして1日2回の飼料が与えられた。
研究の間、ブタは、200gの二重微粉砕された食餌(Altrominからの)、及び25gのオリーブ油、75gのクリーム及び1Lの水と共に混合された、0.625gのCr2O3を含む高脂肪“ヒト−様”食餌300gを、1日2度(8.00、20.00時)与えられた(表30を参照のこと)。試験食事は、ブタのための栄養必要条件により、31%の脂肪、15%のタンパク質、36%の澱粉、並びにビタミン、鉱物及び微量元素を含んだ。
リパーゼ効力を評価するために、ブタは、1日当たり2回の300gの試験食事を供給され、この食事中に異なった量の2種のリパーゼの1つ又は他が供給の直前、混合された。投与される個々のリパーゼの量、すなわち微生物FIP Uリパーゼ/食事(リパーゼFIP単位、例1を参照のこと)での活性が、表15において括弧で示されている。個々の酵素の用量は、少なくとも14日間、供給され、すなわちブタは、高脂肪食餌+個々の新規酵素用量を9日間、与えられ、その後、すべての便が次の日、集められ、計量され、そして分析まで-20℃で貯蔵された。
個々のブタからの凍結された便を凍結乾燥し、再び計量し、そして粉砕した。次に、5日目の粉砕されたサンプル(毎日の便生成に従って)の個々のアリコートをプールし、そして一緒に混合し、すなわち個々の用量の酵素について、個々のブタについての1つのプールされたサンプルを与えた。個々のプールされたサンプルから、乾燥物質及び粗脂肪の含有率を決定した(Naumann & Bassler 1993; Die chemische Untersuchung von Futtermitteln, 3. edition, VDLUFA-Verlag, Darmstadt (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und For- schungsanstalten)。
CFA(%)=100−[飼料における%Cr2O3・便における%脂肪・100]/便における%Cr2O3・飼料における%脂肪]。
表14における結果から、リパーゼ変異体LAV319が、配列番号1の対照リパーゼよりも、より良好に遂行することが明白である。
本発明のリパーゼは、試験された最低用量で高い効果的な改良性をすでに示しているので、脂肪消化において非常に強く且つ用量依存性の改良性を引起した。
ペレット:
精製されたリパーゼ変異体LVA129(例10においてインビボ試験された)の液体リパーゼ濃縮物を調製する。この液体濃縮物を従来の手段により乾燥し、そして乾燥された粉末のリパーゼタンパク質含有率を測定し、そして好ましくは、50%以上であるべきである。次に、500gの乾燥されたリパーゼ粉末を、市販のミキサーにおいて、200gの微晶性セルロース及び300gのポリエチレングリコール400(MacrogolTM 4000)と共にプレドライブレンドする。
得られるペレットを、Pharm. Eur. 2.9.1 (“錠剤及びカプセルの分解”セクション)(試験溶液:0.1Mのマロン酸、pH6.0−500ml、37℃)に従って、分解について試験する。
Claims (9)
- 医療用リパーゼであって、
(a)配列番号:2のアミノ酸1〜269の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し;
(b)リパーゼ活性を有し;そして
(c)配列番号:2のアミノ酸1〜269の配列に比べて、置換N33Q、T231R、N233R及びD254Sを含み、そして配列番号:2のN33Q+T231R+N233Rである参照リパーゼに比べて改良された消化性能を有する;
ことを特徴とするリパーゼ。 - 配列番号:2のアミノ酸1〜269の配列に対して置換:N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254Sを含む、請求項1に記載のリパーゼ。
- プロテアーゼ及び/又はアミラーゼとの組み合わせにおける、請求項1又は2に記載のリパーゼ。
- 請求項3に記載のプロテアーゼ及び/又はアミラーゼとの組み合わせにおけるリパーゼにおいて、
(i)当該プロテアーゼが、
a)配列番号:3のアミノ酸1〜274の配列を有するプロテアーゼ;
b)配列番号:4のアミノ酸1〜188の配列を有するプロテアーゼ;及び
c)配列番号:5のアミノ酸1〜188の配列を有するプロテアーゼ、
から成る群から選択されるプロテアーゼに対して少なくとも90%の同一性を有し;
(ii)前記アミラーゼが、
a)配列番号:6のアミノ酸1〜481の配列を有するアミラーゼ;
b)配列番号:7のアミノ酸1〜481の配列を有するアミラーゼ;
c)配列番号:8のアミノ酸1〜483の配列を有するアミラーゼ、
から成る群から選択されるアミラーゼに対して少なくとも90%の同一性を有する、
ことを特徴とする請求項3に記載のリパーゼ。 - 少なくとも1種の医薬として許容される賦形剤と共に、請求項1又は2に記載のリパーゼ又はリパーゼ混合物を含んで成る医薬組成物。
- プロテアーゼ及び/又はアミラーゼを更に含んで成る、請求項5に記載の組成物。
- 前記プロテアーゼ及び/又はアミラーゼが請求項4に記載したとおりである、請求項6に記載の組成物。
- 消化系疾患、膵臓外分泌不全、膵炎、嚢胞性繊維症、I型糖尿病及び/又はII型糖尿病の治療のための医薬の製造における、請求項1又は2に記載のリパーゼ又はリパーゼ混合物の使用。
- アミラーゼ及び/又はプロテアーゼの使用をさらに含む、請求項8に記載の使用。
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