BRPI0708095B1 - método para isolar uma fração bioativa, e, ingrediente bioativo - Google Patents

Abstract

INGREDIENTE BIOATIVO, MÉTODO PARA ISOLAR UMA FRAÇÃO BIOATIVA, E, COMPOSIÇÃO BIOATIVA. A presente invenção refere-se a ingredientes bioativos que incluem frações bioativas isoladas derivadas de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium). As frações bioativas são ou livres de ou substancialmente livres de (Gama)-lactonas (Alfa)-insaturadas (por exemplo, partenolídeo). Além disso, as frações bioativas tem atividade antiinflamatória e antioxidante. A presente invenção também refere-se a um método para isolar uma fração bioativa que é derivada de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium) e que é pelo menos substancialmente livre de (Gama)-lactonas (Alfa)-insaturadas (por exemplo partenolídeo). A presente invenção também refere- se a um método para preparar uma fração de soro de suco de células estabilizada e uma fração de soro de suco de células concentrada estabilizada que são livres de (Gama)-lactonas (Gama)-insaturadas (por exemplo, partenolídeo). A presente invenção também refere-se a uma composição bioativa que inclui uma mistura de uma ou mais das frações bioativas isoladas da presente invenção

Description

Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisório US número de série 60/775.257, depositado em 21 de fevereiro de 2006, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a ingredientes bioativos que incluem frações bioativas isoladas derivadas de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium). As frações bioativas são tanto livres de como substancialmente livres de Y-lactonas α- insaturadas (por exemplo, partenolídeo) e têm atividade antiinflamatória e antioxidante. A presente invenção refere-se também a métodos para produzir os ingredientes bioativos. A presente invenção refere-se ainda a uma composição bioativa que inclui uma mistura de uma ou mais das frações bioativas da presente invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Tanacetum parthenium L. Schulz-Bip. (syn. Chrysanthemum parthenium, Leicanthemum parthenium, Matricaria parthenium, Pyrethrum parthenium) é uma planta pertencente à família Compositae (Asteraceae, Matricaria ou margarida-dos-campos). Tanacetum parthenium é conhecida sob os nomes comuns: altamisa, amargosa, centáurea-azul, 'featherfew', 'featherfoil', planta antitérmica, 'feverfew', 'flirtwort', 'grande camomille', 'manzanila', matricária, "midsummer daisy', 'moederkruid'', Santa Maria' e 'varadika'. Destes nomes comuns, o nome “matricária” é mais freqüentemente usado.

Matricária é uma planta perene curta que cresce 15-80 cm em altura. Os caules permanecem retos e são estriados e cabeludos. As folhas são folhas verdes em penachos divididos duplos tendo margens serrilhadas. A flor tem pétalas radiadas brancas e um centro amarelo que é plano. O odor da planta quando tocada é forte, aromático e amargo. Matricária tem sido cultivada há pelo menos 2000 anos e é nativa da península dos Bálcãs e das Montanhas do Cáucaso. Atualmente, matricária é cultivada na Europa, América do Norte, América do Sul, África do Norte, China, Japão e Austrália. As condições ótimas para o cultivo de matricária são: solo bem drenado tendo pH = 6,0...6,7 (pH ótimo = 6,3); sol total ou sombra parcial; apropriada para resistência em zonas de temperatura USDA de nove a cinco sem proteção. O melhor clima para matricária são as zonas cinco e sete. Com proteção, matricária pode ser cultivada nas zonas três e quatro, embora em um clima continental (por exemplo, Kansas, USA; Saskatchewan, Canadá) matricária às vezes é considerada uma planta anual.

Os gregos antigos e os antigos europeus usavam matricária para tratar febre, inflamação e inchações, bem como para repelir insetos e para tratar mordidas e ferrões. Nos últimos 20 anos, matricária tem atraído considerável interesse para o tratamento de enxaqueca, artrite e doenças inflamatórias. As partes da planta que são utilizadas são as folhas secadas ou frescas e partes aéreas florescentes. Matricária é usada na forma de uma erva crua, pó secado, folha fresca, cápsula de folha secada por congelamento, cápsula de folha secada, cápsula de gel mole, tintura, infusão (por exemplo, chá), extratos, e ingredientes de bebidas funcionais. Aparentemente, a planta total de matricária age em um aspecto similar aos agentes antiinflamatórios não esteroidais. No entanto, extratos de matricária atuam de um modo bastante similar a cortisona (ver, por exemplo, Feverfew. Botanical Monograph, American Journal of Natural Medicine 4(6): 28-29 (1997)).

Tal discrepância e atividades de amplo espectro atraem a atenção e a investigação dos ingredientes ativos na planta e seus derivados. Os produtos químicos ativos mais conhecidos em matricária são sesquiterpeno lactonas (teor total < 1,8%) e óleos essenciais (teor total < 0,07%). A lista dos compostos ativos de matricária inclui os seguintes: (i) sesquiterpeno lactonas (incluindo artecanina, canina, 10-epicanina, crisantemolideo, crisantemonina, epoxiartemorina, 1 β-hidroxiarbusculina, 3β- hidroxipartenóide, 8β-hidroxireinosina, magnoliolideo, partenolideo, reinosina, santamarina, seco- tanapartenolideo A, tanapartina, tanapartina- 1 α,4oc-epoxido, tanapartina-Iβ,4 β-epoxido); (ii) sesquiterpenes (incluindo cânfora, β-fameseno e germacreno); (iii) monoterpenos; (iv) flavonóis (incluindo tanetina, caemperóis, quercetagetinas, apigenina, luteolina e crisoeritol); e (v) poliinas de éter enol espirocetal.

O grupo mais abundante destes compostos é um grupo de y- lactonas oc-insaturadas; particularmente, partenolideo, que representa ~ 85% de y-lactonas oc-insaturadas. Partenolideo, que está aparentemente localizado em células oleosas na superfície das folhas de matricária é o mais bem conhecido e bem estudado (ver, por exemplo, Smith et ah, J. Chromatogr., 627:255 (1992); e Smith, R.M., LC GC Int. (8 a 15 de janeiro de 1996)). Considera-se que as y-lactonas oc-insaturadas, incluindo partenolídeos são os ingredientes fundamentais responsáveis pelas atividades biológicas da matricária, mas também são os mesmos ingredientes freqüentemente responsáveis por reações alérgicas causadas por derivados de matricária.

Por exemplo, as preparações de matricária usadas em experiências clínicas bem-sucedidas têm um teor de partenolideo de 0,4% a 0,66%, que excede as concentrações capazes de iniciar ulceração, dermatite exsudativa e efeitos patológicos aumentando do contato externo (ver, por exemplo, Awang, D.V.C., “Feverefw,” Can. Pharm. J, 122: 266-270 (1989)). Ao mesmo tempo, cerca de 10-18% de usuários de matricária relatam alguns efeitos adversos geralmente brandos e reversíveis (ver, por exemplo, Emst et al., “The eficacy and safety of feverfew (Tanacetum parthenium L.): an update of a systematic review, “Public Health Nutrition, 3 (4a): 509-514 (2000); Porter et al., “Feverfew in Saskatchewan,” (www.agr.gov.sk.ca/DOCS/crops/special crops/feverfew.asp?firstPick=&sec ondpck=&therdpick-Production%20Information) (2004)) e partenolideo pode ser responsável por estes efeitos adversos. A capacidade de y-lactonas oc- insaturadas (incluindo partenolídeo)de iniciar muitas reações alérgicas é bem documentada (ver, por exemplo, Arch. Dermatol. Forsch, 25 (3): 235-244 (1975); Arch. Dermatol. Forsch, 255(2): 111-121 (1976); Contact Dermatitis, 38(4): 207-208 (1988); Am. J. Contact Dermatol., 1: 49-50 (1998-1999); Br. J. Dermatol, 132(4) 543-547 (1995)).

Em anos recentes, esforços foram dirigidos para a preparação de extratos de matricária, que pretendem deve ser substancialmente livres de y-lactonas oc-insaturadas e, mais particularmente, substancialmente livres de partenolídeos (ver, por exemplo, patente US 6.224.875 e patente US 6.479.080). Deve ser notado que “substancialmente livre de y-lactonas cc- insaturadas” e “substancialmente livre de partenolideo” significa um extrato tendo um teor em peso de y-lactona oc-insaturada ou partenolideo, respectivamente, abaixo de cerca de 0,1%, mais preferivelmente abaixo de 0,1 %, mais preferivelmente abaixo de cerca de 0,09%, e mais preferivelmente abaixo de 0,07%. Devido aos teores acima serem mais baixos do que em uma fitomassa de matricária média tendo de 0,4 a 1,8% de partenolídeos (ver, por exemplo, Marino L., “The effect of clonal micropropagation on parthenolide content in two genotypes of feverfew, Tanacetum partheniumf AgroFarm Technologies Feverfew Report, London, Ontário (2004)), muitas etapas da extração complexa usando vários solventes orgânicos e purificação, incluindo evaporação completa dos solventes e utilização de resina de mudança iônica, são requeridas para produzir extratos tendo teor diminuído de y-lactonas oc- insaturadas e particularmente partenolideo.

Os extratos de solventes orgânicos mencionados acima são obtidos de fitomassa de matricária secada utilizando um processo compreendendo as seguintes etapas: (a) extrair a quantidade de material de planta da porção aérea da planta com acetona, álcoois ou misturas destes solventes com água; (b) extrair o material da etapa (a) com um solvente hidrocarboneto; (c) extrair a fase não hidrocarboneto restante com um solvente não polar; (d) evaporar o extrato de solvente não polar e re-dissolver o resíduo em solução de água-alcoólicca, e então tratar o resíduo re-dissolvido com uma resina básica forte; (e) eluir a resina com um álcool e remover a solução eluída; (f) tratar a resina com uma solução alcoólica ou de água- alcoólicca de um ácido, concentrando a solução e extraindo o resíduo resultante com um solvente não polar; (g) evaporar o solvente não polar da etapa (f) para formar um resíduo que é adicionado ao resíduo a partir da evaporação do extrato de hidrocarboneto da etapa (b) e à fase acetônica ou alcoólica obtida após a extração com o solvente não polar da etapa (c); e (h) evaporar o solvente e secar o resíduo restante.

Os solventes preferidos para as várias etapas de extração incluem, mas não estão limitados aos seguintes: para a etapa (a): acetona, metanol, etanol ou misturas dos mesmos com água; para a etapa (b): hexano, n-pentano, éter de petróleo, ligroína; para a etapa (c): cloreto de metileno, clorofórmio, acetato de etila, preferivelmente cloreto de metileno; e para a etapa (f): acetato de etila.

De acordo com as patentes US 6.224.875 e 6.479.080, este extrato “substancialmente livre de partenolídeo” tem propriedades farmacológicas favoráveis junto com o risco reduzido de induzir reações alérgicas. No entanto, o extrato acima é isolado com processamento seqüencial usando solventes orgânicos, que pertencem a quatro grupos diferentes, e que podem ter compatibilidade limitada com muitos componentes convencionais de formulações de cuidado da pele. Assim, a aplicabilidade do extrato acima como um ingrediente para produtos de cuidado da pele tem certos limites (por exemplo, não prontamente solúvel em água).

Embora o extrato de matricária descrito seja “substancialmente livre de partenolideo,” ele não é material verdadeiramente livre de partenolideo devido ao teor de partenolideo residual permitido. Atividades específicas superiores bem conhecidas do partenolideo propriamente dito podem contribuir para tanto as propriedades farmacológicas como a alergenicidade residual do extrato, especialmente quando usado em concentrações elevadas. E importante que as propriedades farmacológicas do extrato acima sejam limitadas por atividades de somente os ingredientes de matricária que são solubilizados em determinados solventes em certas condições. Assim, este extrato representa somente parte dos componentes ativos existentes em plantas de matricária vivas. Por exemplo, folhas de matricária secadas por congelamento e folhas secadas demonstraram efeito benéfico significativo quando comparadas a um placebo, mas extratos de etanol de matricária foram ineficazes (ver, por exemplo, Emst et al., “The eficacy and safety of feverfew (Tanacetum parthenium L.): An update of a systematic review,” Public Health Nutrition, 3 (4a): 509-514 (2000)).

Com relação à comparação das atividades específicas encontradas em diferentes formas de produtos de matricária, deve-se notar que a preparação de folhas secadas totais demonstra ser mais efetiva do que de seus extratos, e, além disso, os extratos de matricária secada e fresca têm diferenças marcantes nos perfis e potência farmacológica (ver, por exemplo, Barsby et al., “Feverfew and vascular smooth muscle: Extracts from fresh and dried plants show opposing pharmacological profiles, dependent upon sesquiterpene lactone content,” Planta Medica, 59: 20-25 (1993)). Assim, com relação a e em contraste com os extratos de folhas de matricária secadas, os extratos de folhas frescas têm (a) corrente de potássio dependente da voltagem inativante reduzida em um modo relacionado com a concentração; (b) inibição dependente de dose da produção de leucócitos de tromboxano B2 e leucotrieno B4; e (c) resposta muscular inibida para triptamina, tromboxano e relaxamento induzido por acetilcolina reduzido.

De modo interessante, o desejo intenso de maximizar a eficácia de produtos de matricária levou recentemente à produção aumentada de produtos contendo todos os componentes da planta que podem ser minimamente impactados pelo processamento da planta. Dentre estes produtos estão as preparações de folhas de matricária secadas por congelamento, embora este material seja apropriado para aplicações limitadas, e cuidado com a pele não está entre as mesmas.

Além disso, as atividades de extratos de matricária e o nível de partenolídeo nestes extratos dependem da escolha do(s) solvente(s) e método de extração explorado (ver, por exemplo, Kaplan, M., “Comparison of Supercritical Fluid and Solvent Extraction of Feverfew (Tanacetum parthenium),” Turk J. Chem, 26: 473-480 (2002)). Assim, material extraído por extração de solvente e extração de fluido supercrítico difere. Por exemplo, extratos de CO2 de fluido supercrítico têm maior teor de partenóide do que extratos de clorofórmio, e mais em extratos de acetona a seguir.

A composição de matricária varia significativamente, dependendo da fonte do material da planta e condições de cultivo e de colheita.Variações enormes na quantidade de partenolídeo são verificadas. Por exemplo, plantas cultivadas nos Estados Unidos contêm < 50% de concentração de partenolídeo encontrados em matricária cultivadas na Grã- Bretanha e França. Os teores de partenolídeo foram mais elevados para terra seca comparados com a matricária irrigada. Verificou-se que submetendo matricária a um evento de estresse em água apenas, pode-se aumentar o teor de partenolídeo (Fonseca et al., “Parthenolide and abscisic acid synthesis in feverfew are associated but environmental factors affect them dissimilarly,” J. Plant Physiology, 162, 485-494 (2005)). As flores continham os maiores níveis de partenolídeo, enquanto os caules continham o menor nível de partenolídeo. O teor de partenolídeo nas flores aumentou e o teor dos caules e folhas diminuiu à medida que a colheita era retardada. Matricária colhida durante a tarde continha significativamente mais partenolideo do que as plantas colhidas pela manhã e a exposição de matricária à luz ultravioleta (UV) resultou no teor de partenolideo significativamente diminuído. Deve-se notar que uma ampla variação na quantidade de partenolideo em derivados de matricária pode ser o resultado essencial da interação de dois fatores maiores: condições de cultivo e métodos de processamento. Infelizmente, as patentes US 6.224.875 e 6.479.080 não fornecem qualquer informação com relação à reprodutibilidade de extrato de matricária “substancialmente livre de partenolideo”. No entanto, como descrito acima, a grande variabilidade de matéria-prima pode ter um impacto significativo sobre as propriedades do extrato.

Assim, existem muitos fatores genéticos, geográficos, climáticos e tecnológicos que levam a uma fraca reprodutibilidade e uma qualidade menor do que a completamente ótima dos extratos e produtos de matricária convencionais (ver, por exemplo, Hepinstall et al., “Parthenolide content and bioactivity of feverfew (Tanacetum parthenium) (L.) Schultz- Bip.). Estimation of commercial and authenticated feverfew produtcts,” J. Pharm. Pharmacol., 44: 391-395 (1992); Draves, A.H. e S.E. Walker, “Parthenolide Content of Canadian Commercial Feverfew Preparations: Label Claims are Misleading in Most Cases,” Canadian Pharm. J., 136 (10): 23-30 (dezembro de 2003/ janeiro de 2004)) e estes fatores criam sérios problemas para a ampla utilização de derivados de matricária em medicamentos herbáceos e para cuidado da pele.

Assim, existe uma necessidade de um método de produção de derivados de matricária livres de partenolideo e altamente reprodutíveis tendo um amplo espectro de atividades biológicas desejáveis, que não estão limitadas a somente as atividades que tem uma afinidade para alguns solventes, isto é, não são de outra forma submetidos à limitações de extração química convencional.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a ingredientes bioativos que incluem frações bioativas isoladas derivadas de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium). As frações bioativas são tanto livres de como substancialmente livres de y-lactonas oc- insaturadas (por exemplo, partenolideo). Além disso, as frações bioativas têm atividade antiinflamatória e antioxidante.

A presente invenção refere-se também a um método para isolar frações bioativas que são derivadas de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanecetum parthenium) e que são tanto livres de ou substancialmente livres de y-lactonas oc-insaturadas (p°r exemplo, partenolideo). Este método envolve a provisão de biomassa fresca a partir de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium). A biomassa fresca é processada sob condições efetivas para dar um sobrenadante de suco de células e uma fração de membrana. O sobrenadante de suco de células é tratado sob condições efetivas para dar um primeiro sobrenadante de soro de suco de células e um precipitado de fração de citoplasma. O precipitado de fração de citoplasma é então isolado como uma fração bioativa que é pelo menos substancialmente livre de y-lactonas oc-insaturadas. A presente invenção refere-se também a um ingrediente bioativo que inclui o precipitado de fração de citoplasma produzido por este método, e que tem atividade antiinflamatória e antioxidante.

A presente invenção refere-se também a um método para preparar uma fração de soro de suco de células estabilizada que é uma fração bioativa que é derivada de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária e que é livre de y-lactonas oc-insaturadas (por exemplo, partenolideo). Este método envolve clarificar o primeiro sobrenadante de soro de suco de células sob condições efetivas para dar um segundo sobrenadante de soro de suco de células. Um agente estabilizador é misturado com o segundo sobrenadante de soro de suco de células sob condições efetivas para dar uma fração de soro de suco de células estabilizada. A fração de soro de suco de células estabilizada é uma fração bioativa que é livre de y-lactonas oc- insaturadas. A presente invenção também refere-se a um ingrediente bioativo que inclui a fração de soro de suco de células estabilizada produzida por este método, e que tem atividade antiinflamatória e antioxidante.

A presente invenção também refere-se a um método para preparar uma fração de soro de suco de células concentrada estabilizada que é uma fração bioativa que é derivada de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium) e que é livre de y-lactonas oc-insaturadas (p°r exemplo, partenolídeo). Este método envolve a concentração da fração de soro de suco de células estabilizada sob condições efetivas para dar um sobrenadante de soro de suco de células concentrado. Um agente estabilizador é misturado com o sobrenadante de soro de suco de células concentrado sob condições efetivas para dar uma fração de soro de suco de células concentrada. A fração de soro de suco de células concentrada é uma fração bioativa que é livre de y-lactonas oc-insaturadas. A presente invenção refere-se também a um ingrediente bioativo que inclui a fração de soro de suco de células concentrada produzida por este método, e que tem atividade antiinflamatória e antioxidante.

A presente invenção, além disso, refere-se a uma composição bioativa que inclui uma mistura de uma ou mais das frações bioativas isoladas da presente invenção.

A presente invenção é utilizável em que ela provê um meio para produzir derivados de matricária substancialmente livres de partenolídeo ou livres de partenolídeo e altamente reprodutíveis, tendo um amplo espectro de atividades biológicas desejáveis (por exemplo, atividades antiinflamatórias e antioxidantes). Uma vantagem de presente invenção sobre a técnica anterior é que o método da presente invenção não requer o uso de solventes orgânicos

agressivos para isolar as frações bioativas da presente invenção; Os ingredientes bioativos da presente invenção são utilizáveis como ingredientes ativos em várias aplicações tópicas e orais a mamíferos (incluindo humanos). Estas formulações podem ser usadas para inibir atividade inflamatória no tecido da pele e para proteger o tecido da pele de dano induzido pela luz ultravioleta. Os ingredientes bioativos da presente invenção também podem ser usados para normalizar distúrbios da pele no tecido da pele de um mamífero.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é um desenho esquemático demonstrando uma forma de realização do processo para preparar os ingredientes bioativos da presente invenção.

A figura 2 é um cromatograma de cromatografia líquida de alta pressão (“HPLC”) da biomassa fresca de matricária usada em uma forma de realização do processo da presente invenção. A seta descendente mostra o pico de partenolideo.

A figura 3 é um cromatograma de HPLC de material enriquecido em fibras isolado por uma forma de realização do processo da presente invenção. A seta descendente mostra o pico de partenolideo.

A figura 4 é um cromatograma de HPLC do Precipitado I isolado por uma forma de realização do processo da presente invenção. A seta descendente mostra o pico de partenolideo.

A figura 5 é um cromatograma de HPLC do Precipitado II (ingrediente bioativo A) isolado por uma forma de realização do processo da presente invenção. A seta descendente mostra o pico de partenolideo.

A figura 6 é um cromatograma de HPLC do sobrenadante final (ingrediente bioativo B) isolado por uma forma de realização do processo da presente invenção.

A figura 7 é um cromatograma de HPLC do sobrenadante final concentrado (ingrediente bioativo C) isolado por uma forma de realização do processo da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a ingredientes bioativos que incluem frações bioativas isoladas derivadas de suco de células de biomassa fresca de uma placa de matricária (Tanacetum parthenium). As frações bioativas são tanto livres de como substancialmente livres de y-lactonas oc- insaturadas, e mais particularmente são tanto livres de ou substancialmente livres de partenolideo. Como usado aqui, os termos “fração bioativa” e “ingrediente bioativo” podem ser usados intercambiavelmente. Em vista do presente relatório, o versado na técnica saberá quando o emprego intercambiável dos termos é apropriado. Os ingredientes bioativos da presente invenção têm atividades favoráveis, incluindo, sem limitação, atividades antiinflamatórias e antioxidantes.

Como usado aqui, o termo “matricária” é o nome comum para a planta “Tanacetumparthenium”.

Como usado aqui, os termos “substancialmente livre de y- lactonas oc-insaturadas” e “substancialmente livre de partenolideo” referem-se a uma fração bioativa ou ingrediente bioativo de matricária tendo um teor em peso de y-lactonas oc-insaturadas ou partenolideo, respectivamente, igual a ou menor do que cerca de 0,01%, mas dentro do limite detectável para y-lactonas oc-insaturadas ou partenolideo usando testes analíticos de cromatografia líquida de alta pressão (“HPLC”) bem conhecidos na técnica. Como usado aqui, todas as porcentagens usadas referem-se ao teor em peso ou concentração de y-lactonas oc-insaturadas ou partenolideo nos ingredientes bioativos/ frações bioativas da presente invenção, a menos que indicado ao contrário, referem-se à porcentagem em peso (comumente abreviada pelo símbolo “%p” ou pela expressão “porcento em peso”).

Como usado aqui, os termos “livre de y-lactonas a- insaturadas” e “livre de partenolídeo” referem-se a uma fração bioativa ou ingrediente bioativo de matricária tendo um teor em peso de y-lactonas α- insaturadas ou partenolídeo, respectivamente, que está abaixo do limite detectável para y-lactonas oc-insaturadas ou partenolídeo usando teste analítico de HPLC padrão bem conhecidos na técnica. Em uma forma de realização, os ingredientes bioativos/ frações bioativas que são livres de partenolídeo têm um teor em peso de partenolídeo que é menos do que 0,00007%/p. Os versados na técnica podem reconhecer os ingredientes bioativos/ frações bioativas da presente invenção que são “livres de y-lactonas oc-insaturadas” ou “livres de partenolídeo” a serem caracterizados como sendo “completamente livres de y-lactonas oc-insaturadas” ou “completamente livres de partenolídeo”, respectivamente.

Um método apropriado para detectar a quantidade de partenolídeo é ainda descrito no exemplo 6 (infra). Resumidamente, este método para detectar partenolídeo envolve a detecção a 225 nm, onde concentrações de partenolídeo são determinadas usando uma curva de calibração de múltiplos pontos desenvolvida com seis padrões de partenolídeo (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO) na faixa de 30 μg de partenolídeo/g de amostra a 900 μg de partenolídeo/g de amostra. Em uma forma de realização, o limite de detecção de partenolídeo nestas condições é 0,7 μg de partenolídeo/ml de amostra (isto é, 0,00007%). Cerca de 30 μg de partenolídeo/g de amostra (isto é, 0,003%) podem ser quantificados usando este conjunto de condições.

Em uma forma de realização, o ingrediente bioativo da presente invenção corresponde a um “precipitado de fração de citoplasma” como definido aqui. Com referência ao esquema do processo descrito na figura 1, esta forma de realização inclui uma categoria de ingrediente bioativo à qual o “Precipitado II 36” pode pertencer. Além disso, como descrito na seção Exemplos (infra), esta forma de realização inclui uma categoria de ingrediente ativo à qual o “Ingrediente Bioativo A” poderia pertencer. Como demonstrado nos exemplos, em uma forma de realização do Ingrediente Bioativo A da presente invenção foi mostrado conter cerca de 0,01%/p de partenolideo, e, assim, poderia qualificar como sendo substancialmente livre de partenolideo. Em uma outra forma de realização, o ingrediente bioativo correspondente ao “precipitado de fração de citoplasma” pode ter um perfil de HPLC correspondente ao perfil mostrado na figura 5, ou semelhante.

Em uma outra forma de realização, o ingrediente bioativo da presente invenção corresponde a uma “fração de soro de suco de células estabilizada” como definido aqui. Com referência à seção Exemplos (infra) e o esquema do processo descrito na figura 1, esta forma de realização inclui uma categoria de ingrediente bioativo à qual o “Ingrediente Bioativo B” e “Ingrediente Bioativo B 60 poderia pertencer. Como demonstrado nos exemplos, uma forma de realização do Ingrediente Bioativo B da presente invenção foi mostrada conter abaixo de 0,00007%/p de partenolideo, e, assim, é definida como sendo livre de partenolideo. Em outras palavras, verificou-se que a quantidade de partenolideo nesta forma de realização do ingrediente bioativo está abaixo do limite de detecção do procedimento analítico usado para detectar partenolideo (ver exemplo 6, “Method for Determination of Parthenolide Content”). Em uma outra forma de realização, o ingrediente bioativo correspondente à “fração de soro de suco de células estabilizada” pode ter um perfil de HPLC correspondente ao perfil mostrado na figura 6, ou semelhante. O ingrediente bioativo desta forma de realização é prontamente solúvel em água.

Ainda em uma outra forma de realização, o ingrediente bioativo da presente invenção corresponde a uma “fração de soro de suco de células estabilizada” como definido aqui. Com referência à seção Exemplos (infra) e à esquemática do processo descrito na figura 1, esta forma de realização inclui uma categoria de ingrediente bioativo à qual o “Ingrediente

Bioativo C” e “Ingrediente Bioativo C 80” poderiam pertencer. Como demonstrado nos exemplos, uma forma de realização do Ingrediente Bioativo C da presente invenção foi mostrada conter abaixo de 0,00007%/p de partenolídeo, e, assim, é definida como sendo livre de partenolídeo. Em outras palavras, verificou-se que a quantidade de partenolídeo nesta forma de realização está abaixo do limite de detecção do procedimento analítico usado para detectar partenolídeo (ver exemplo 6, infra). Em uma outra forma de realização, o ingrediente bioativo correspondente à “fração de soro de suco de células estabilizada” pode ter um perfil de HPLC correspondente ao perfil mostrado na figura 7, ou semelhante. O ingrediente bioativo desta forma de realização é prontamente solúvel em água.

A fração bioativa da presente invenção tem atividade antiinflamatória e antioxidante.

Com relação à atividade antiinflamatória, esta atividade pode ser determinada usando um teste de inibição de elastase (ver, por exemplo, exemplo 6, “Método para a determinação da atividade de elastase”). Em uma forma de realização, o ingrediente bioativo da presente invenção tem uma atividade antiinflamatória expressada em valores IC50 na faixa de cerca de 0,1% (v/v) a cerca de 2,0% (v/v), particularmente de cerca de 0,3% (v/v) a cerca de 1,7% (v/v). Como usado aqui para definir atividade antiinflamatória, o termo “valor IC5θ” refere-se à concentração de ingrediente bioativo requerida para diminuir a velocidade de reação enzimática de elastase em 50%. Como mostrado nas tabelas 4, 7, 10 e 13, a atividade antiinflamatória (em valores IC5o) dos ingredientes bioativos pode ser expressada em termos de volume (por exemplo, microlitros, μL), e então recalculada em termos de uma concentração volume por volume (v/v). Os dados antiinflamatórios mostrados nas tabelas 4, 7, 10 e 13 foram baseados em um volume de 3,0 ml da mistura de reação.

Com relação à atividade antioxidante, esta atividade pode ser determinada usando um teste de remoção de superóxido (ver, por exemplo, exemplo 6, “Método para a determinação de atividade superóxido”). Em uma forma de realização, o ingrediente bioativo da presente invenção tem uma atividade antioxidante expressada em valores IC50 na faixa de cerca de 0,007% (v/v) e cerca de 1,0% (v/v), particularmente de cerca de 0,067% (v/v) a cerca de 0,27% (v/v). Como usado aqui para definir a atividade antioxidante, o termo “valor IC5θ” refere-se à concentração de ingrediente bioativo requerida para diminuir a velocidade de redução citocromo c em 50%. Como mostrado nas tabelas 4, 7, 10 e 13, a atividade antioxidante (em valores IC5o) dos ingredientes bioativos identificados pode ser expressada em termos de volume (por exemplo, microlitros, μL), e então recalculada em termos de uma concentração volume por volume (v/v). O antioxidante mostrado nas tabelas 4, 7, 10 e 13 foi baseado em um volume de 3,0 ml da mistura de reação.

Em uma forma de realização, o ingrediente bioativo pode ser usado para aplicações tópicas com ou sem um agente estabilizador. Agentes estabilizadores apropriados são os convencionalmente usados na técnica, e podem incluir, sem limitação, um emulsificador, um conservante, um antioxidante, uma matriz polimérica, e misturas dos mesmos.

Como usado aqui, “aplicação tópica” geralmente refere-se a técnicas relacionadas a assentar diretamente sobre ou espalhar os ingredientes bioativos da presente invenção ou formulações contendo estes ingredientes bioativos sobre a pele externa usando, por exemplo, as mãos ou um aplicador como um pano de limpeza.

Os ingredientes bioativos (e formulações contendo os mesmos) são “cosmeticamente aceitáveis”. Como usado aqui, o termo “cosmeticamente aceitáveis” refere-se a ingredientes bioativos, formulações, agentes cosmeticamente ativos, ou ingredientes inertes que são apropriados para uso em contato com tecidos de mamíferos (por exemplo, a pele de humanos) sem toxicidade, incompatibilidade, instabilidade, irritação, resposta alérgica indevidos, e outros, proporcionais com uma relação benefício/risco razoável.

Os ingredientes bioativos (e formulações contendo os mesmos) são utilizáveis para aplicação tópica e oral a humanos, e podem ser aplicados em uma “quantidade segura e efetiva”. Como usado aqui, o termo “quantidade segura e efetiva” refere-se a uma quantidade de ingrediente bioativo ou formulação suficiente para induzir significativamente uma modificação positiva na condição a ser regulada ou tratada, mas baixa o bastante para evitar efeitos colaterais sérios. A quantidade segura e efetiva do ingrediente bioativo ou formulação contendo o ingrediente bioativo variará com a condição particular sendo tratada, a idade e condição física, do usuário final, a severidade da condição sendo tratada/ prevenida, a duração do tratamento, a natureza da terapia simultânea, o ingrediente bioativo específico ou formulação empregada, o veículo tópico cosmeticamente aceitável particular utilizado, e outros fatores.

As formulações contendo os ingredientes bioativos da presente invenção pode ser preparada usando metodologia que é bem conhecida pelos versados na técnica.

A presente invenção também refere-se a um método para isolar frações bioativas que são derivadas de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanecetum partheniuní) e que são tanto livres ou substancialmente livres de y-lactonas oc-insaturadas (p°r exemplo, partenolideo). Este método envolve a provisão de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum partheniuní). Biomassa fresca apropriada pode incluir qualquer parte da planta de matricária, incluindo, por exemplo, suas folhas, flores, brotos, caules e raízes. A biomassa fresca é processada sob condições efetivas para dar um sobrenadante de suco de células e uma fração de membrana. O sobrenadante de suco de células é tratado sob condições efetivas para dar um primeiro sobrenadante de soro de suco de células e um precipitado de fração de citoplasma. Em uma forma de realização, o “precipitado de fração de citoplasma” corresponde ao Ingrediente Bioativo A (ver figura 1 e a seção Exemplos). O precipitado de fração de citoplasma é então isolado como uma fração bioativa que é substancialmente livre de y- lactonas oc-insaturadas, particularmente substancialmente livre de partenolídeo.

Uma forma de realização para processar a biomassa fresca sob condições efetivas para dar o sobrenadante de suco de células e a fração de membrana, é como se segue: (i) a biomassa fresca é separada em um componente do suco de células e um material enriquecido em fibras; (ii) o componente de suco de células é clarificado para dar um componente de suco de células clarificado; e (iii) o componente de suco de células clarificado é separado no sobrenadante de suco de células e na fração de membrana.

A presente invenção refere-se também a um método para preparar um fração de soro de suco de células estabilizada que é uma fração bioativa que é derivada de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium) e que é livre de y-lactonas oc- insaturadas (por exemplo, partenolídeo). Este método envolve clarificar o primeiro sobrenadante de soro de suco de células (descrito acima) sob condições efetivas para dar um segundo sobrenadante de soro de suco de células. Um agente estabilizador (cujos exemplos apropriados são descritos aqui) é misturado com o segundo sobrenadante de soro de suco de células sob condições efetivas para dar uma fração de soro de suco de células estabilizada. A fração de soro de suco de células estabilizada é uma fração bioativa que é livre de y-lactonas oc-insaturadas, e particularmente livre de partenolídeo. Em uma forma de realização, a “fração de soro de suco de células estabilizada” corresponde ao ingrediente bioativo B (ver figura 1 e seção dos Exemplos).

A presente invenção refere-se também a um método para preparar uma fração de soro de suco de células concentrada estabilizada que é uma fração bioativa que é derivada de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium) e que é livre de y-lactonas oc-insaturadas, particularmente livre de partenolideo. Este método envolve concentrar a fração de soro de suco de células estabilizada (descrita acima) sob condições efetivas para dar um sobrenadante de soro de suco de células concentrado. Um agente estabilizador (cujos exemplos apropriados são descritos aqui) é misturado com o sobrenadante de soro de suco de células concentrado sob condições efetivas para dar uma fração de soro de suco de células concentrada estabilizada. A fração de soro de suco de células concentrada estabilizada é uma fração bioativa que é livre de y-lactonas oc- insaturadas, e particularmente livre de partenolideo. Em uma forma de realização, “fração de soro de suco de células concentrada estabilizada” corresponde ao ingrediente bioativo C (ver figura 1 e seção exemplos).

A presente invenção também refere-se aos ingredientes bioativos produzidos a partir dos métodos descritos acima, incluindo, por exemplo, ingredientes bioativos que contêm (i) o precipitado de fração de citoplasma produzido pelo método da presente invenção; (ii) a fração de soro de suco de células estabilizada produzida pelo método da presente invenção; e (iii) a fração de soro de suco de células concentrada estabilizada produzida pelo método da presente invenção. Estes ingredientes bioativos têm atividade antiinflamatória e antioxidante.

A título de exemplo, uma forma de realização do processo global para preparar os ingredientes bioativo da presente invenção (por exemplo, ingrediente bioativo A, ingrediente bioativo B e ingrediente bioativo C) é mostrada esquematicamente na figura 1. Detalhes das etapas deste processo são ainda descritos abaixo e na descrição detalhada e nos exemplos.

Como descrito na figura 1, matricária fresca 10 (isto é, biomassa fresca de matricária) é provida. Em uma forma de realização, a etapa descrita neste parágrafo corresponde à etapa definida como “prover biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium).”

Matricária fresca 10 é submetida a moagem, maceração e prensagem 12 sob condições efetivas para separar matricária fresca 10 no suco de células 16 e material enriquecido em fibras 14. O suco de células 16 é então submetido à clarificação 18 sob condições efetivas para dar suco de células clarificado 20. O suco de células clarificado 20 é submetido a ajuste de pH/ tratamento com microondas 22 e então resfriamento/ centrifugação 24 sob condições efetivas para dar o precipitado I 26 (fração de membrana) e o sobrenadante I 30 (sobrenadante de suco de células). Esta etapa é efetiva na divisão de uma quantidade substancial de y-lactonas oc-insaturadas (particularmente partenolideo) no precipitado I 26, que também inclui muitas das membranas encontradas no suco de células clarificado 20. Como usado para descrever a quantidade de y-lactonas oc-insaturadas (particularmente partenolideo) contidas no precipitado I 26, o termo “quantidade substancial” refere-se a um teor de y-lactonas oc-insaturadas (particularmente partenolideo) que excede 0,01%/p e/ou que é comparável ao teor de y-lactonas oc- insaturadas (particularmente partenolideo) em matricária fresca. Assim, o sobrenadante I 30 que é produzido por esta etapa inclui suco de células que é pelo menos substancialmente livre de y-lactonas oc-insaturadas, e particularmente pelo menos substancialmente livre de partenolideo. Em uma forma de realização, a etapa descrita neste parágrafo corresponde à etapa definida como “processar a biomassa fresca sob condições efetivas para dar um sobrenadante de suco de células e uma fração de membrana,”

O sobrenadante I 30 é submetido a precipitação isoelétrica 32 e depois centrifugação 34 sob condições efetivas para dar o sobrenadante II 40 (por exemplo, primeiro sobrenadante de soro de suco de células) e precipitado II 36 (por exemplo, precipitado de fração de citoplasma). Em uma forma de realização, a etapa descrita neste parágrafo corresponde à etapa definida como “tratar o sobrenadante de suco de células sob condições efetivas para dar um primeiro sobrenadante de soro de suco de células e um precipitado de fração de citoplasma.”

O precipitado II 36 é então isolado. Em uma forma de realização, o precipitado II 36 corresponde ao ingrediente bioativo A, e é substancialmente livre de y-lactonas oc-insaturadas, e particularmente partenolideo. Em uma forma de realização, a etapa descrita neste parágrafo corresponde à etapa definida como “isolar o precipitado de fração de citoplasma.” O precipitado II 36 (ingrediente bioativo A) também tem várias bioatividades favoráveis, incluindo, mas não limitadas a, atividade antiinflamatória e antioxidante.

O sobrenadante II 40 (por exemplo, primeiro sobrenadante de soro de suco de células) é submetido a ajuste de pH 42 e depois submetido a clarificação 44 sob condições efetivas para dar o sobrenadante final 50 (também referido em uma forma de realização o “segundo sobrenadante de soro de suco de células”). O sobrenadante final 50 é então submetido a misturação com o estabilizador 52 sob condições efetivas para dar o ingrediente bioativo B 60 (também referido em uma forma de realização como a “fração de soro de suco de células estabilizada”). O ingrediente bioativo B 60 é substancialmente livre de y-lactonas oc-insaturadas, e particularmente substancialmente livre de partenolideo. Em uma forma de realização. As etapas coletivas descritas nesta parágrafo correspondem à etapa definida como (i) “clarificar o primeiro sobrenadante de soro de suco de células sob condições efetivas para dar um segundo sobrenadante de soro de suco de células”; e (ii) “misturar um agente estabilizador com o segundo sobrenadante de soro de suco de células sob condições efetivas para dar uma fração de soro de suco de células estabilizada.” O ingrediente bioativo B 60 também tem várias bioatividades favoráveis, incluindo, mas não limitadas a, atividade antiinflamatória e antioxidante.

O ingrediente bioativo B 60 é submetido à evaporação 62 sob condições efetivas para concentrar o ingrediente bioativo B 60 para dar o sobrenadante final concentrado 70 (também referido em uma forma de realização como o "sobrenadante de soro de suco de células concentrado”). Em uma forma de realização, esta etapa corresponde à etapa definida como “concentrar a fração de soro de suco de células estabilizada sob condições efetivas para dar um sobrenadante de soro de suco de células concentrado.” O sobrenadante final concentrado 70 é então submetido a misturação com o estabilizador 72 sob condições efetivas para dar o ingrediente bioativo C 80 (também referido em uma forma de realização como a “fração de soro de suco de células concentrada estabilizada”). Em uma forma de realização, esta etapa corresponde à etapa de “misturar um agente estabilizador com o sobrenadante de soro de suco de células concentrado sob condições efetivas para dar uma fração de soro de suco de células concentrada estabilizada.” O ingrediente bioativo C 80 é livre de y-lactonas a-insaturadas, e particularmente livre de partenolídeo. O ingrediente bioativo C 80 também tem várias bioatividades favoráveis, incluindo, mas não limitadas a, atividade antiinflamatória e antioxidante.

Os ingredientes bioativos da presente invenção incluem todas as frações bioativas derivadas de suco de células descritas na figura 1, a saber, as frações bioativas representadas pelos seguintes: (i) sobrenadante I 30; (ii) sobrenadante II 40; (iii) precipitado II 36 (ingrediente bioativo A); (iv) sobrenadante final 50; (v) ingrediente bioativo B 60; (vi) sobrenadante final 70 concentrado; e (vii) ingrediente bioativo C 80. As frações bioativas representadas pelas listadas neste parágrafo são cada uma tanto livres de como substancialmente livres de y-lactonas a-insaturadas, e particularmente livres de ou substancialmente livres de partenolídeo. Além disso, as frações bioativas representadas pelas listadas neste parágrafo têm cada uma atividade antiinflamatória e antioxidante.

A presente invenção também refere-se a composições bioativas que incluem uma mistura de uma ou mais frações bioativas derivadas de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium). Frações bioativas apropriadas podem incluir, sem limitação, qualquer uma das frações bioativas da presente invenção. Em particular, as frações bioativas apropriadas são cada uma tanto livres de como substancialmente livres de atividade antiinflamatória e antioxidante, e particularmente livres de ou substancialmente livres de partenolideo. Além disso, as frações bioativas apropriadas têm atividade antiinflamatória e antioxidante. Em uma forma de realização, a composição bioativa pode incluir, sem limitação, uma mistura de uma ou mais das frações bioativas/ ingredientes bioativos descritos na figura 1, a saber, sobrenadante I 30, sobrenadante II 40, precipitado II 36 (ingrediente bioativo A), sobrenadante final 50, ingrediente bioativo B 60, sobrenadante final 70 concentrado e/ou ingrediente bioativo C 80. As composições bioativas da presente invenção são tanto livres de como substancialmente livres de y-lactonas oc-insaturadas, e particularmente livres de ou substancialmente livres de partenolideo. As composições bioativas também têm atividade antiinflamatória e antioxidante. Em uma forma de realização, a composição bioativa inclui um agente estabilizador. Métodos para combinas a uma ou mais frações bioativas da presente invenção para dar as composições bioativas da presente invenção são bem conhecidos na técnica, e são contemplados como parte da presente invenção.

Os ingredientes bioativos e composições bioativas da presente invenção podem ser usados em vários métodos destinados aos mamíferos (incluindo humanos). Além disso, devido à baixa concentração de partenolideo (ou à ausência total de partenolideo) nos ingredientes bioativos, métodos para usar os ingredientes bioativos podem incluir aplicações que são seguras não somente para adultos, mas também para crianças de todas as idades (incluindo, sem limitação, bebês, crianças que estão começando a andar, e jovens e adolescentes).

Outras formas de realização dos ingredientes bioativos da presente invenção são resumidas abaixo.

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativos são derivados de biomassa serial fresca de matricária em qualquer estágio de crescimento, incluindo, mas não limitado por, estágios provendo rendimento máximo: a partir do estágio inicial de floração total (10% de flores) até o estágio de floração total (100% de flores).

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativos podem ser derivados de fitomassa fresca, que pode ser colhida de plantas cultivadas no primeiro e/ou nos seguintes anos da cultura.

Em outra forma de realização, os ingredientes bioativos podem ser derivados de fitomassa fresca, que é cultivada nos campos e/ou nas estufas e/ou em fitotron e/ou em culturas de tecidos e/ou em calos.

Os ingredientes bioativos apropriados podem incluir, sem limitação, quaisquer componentes de uma célula de planta, que não têm nenhuma ligação e/ou afinidade com y-lactonas oc-insaturadas, particularmente com partenolideo.

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativos apropriados podem incluir, sem limitação, quaisquer componentes de uma célula de planta que têm propriedades antiinflamatórias e não têm nenhuma ligação e/ou afinidade com y-lactonas a-insaturadas, particularmente com partenolideo.

Em outra forma de realização, os ingredientes bioativos apropriados podem incluir, sem limitação, quaisquer componentes de célula de planta que têm atividade inibidora contra proteinases liberadas durante a resposta antiinflamatória em tecidos humanos. As proteinases podem incluir, mas não estão limitadas a, elastase de neutrófilos humanos, que é uma das enzimas mais destrutivas dentre as proteinases. Devido à elastase poder degradar os múltiplos componentes da matriz extracelular dos tecidos humanos, os inibidores de elastase são considerados como bioativos importantes capazes de reduzir o dano ao tecido associado com uma ampla variedade de condições inflamatórias. Embora partenolídeo purificado sozinho demonstre certa atividade anti-elastase, verificou-se inesperadamente que os ingredientes bioativos substancialmente livres de partenolídeo e completamente livres de partenolídeo da presente invenção têm atividade inibidora de elastase maior, que é cerca de duas ordens de magnitude maior do que a atividade de partenolídeo purificado.

Verificou-se que os ingredientes bioativos da presente invenção, que não têm nenhuma ligação e/ou afinidade com y-lactonas oc- insaturadas, particularmente com partenolídeo, têm uma atividade anti- elastase que é superior à atividade de partenolídeo puro.

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativos apropriados da presente invenção podem incluir, sem limitação, quaisquer componentes de células de planta que têm propriedades inibidoras de elastase e não têm nenhuma ligação e/ou afinidade com y-lactonas a-insaturadas, particularmente com partenolídeo.

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativos apropriados da presente invenção podem incluir, sem limitação, quaisquer componentes de célula de planta que têm propriedades antioxidante e não têm nenhuma ligação e/ou afinidade com y-lactonas a-insaturadas, particularmente com partenolídeo.

A presente invenção também refere-se a ingredientes bioativos, que são (i) substancialmente ou completamente livres de y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolídeo, e têm (ii) propriedades antiinflamatórias e (iii) antioxidantes desejáveis para cuidado da pele incluindo aplicações tópicas e orais.

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativos da presente invenção podem incluir, sem limitação, quaisquer componentes de célula de planta que têm propriedades antiinflamatórias e antioxidantes e não têm nenhuma ligação e/ou afinidade com y-lactonas oc-insaturadas, particularmente com partenolideo.

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativos apropriados podem incluir, sem limitação, quaisquer componentes de célula de planta que têm propriedades inibidoras de elastase e antioxidantes e não têm nenhuma ligação e/ou afinidade com y-lactonas ot-insaturadas, particularmente com partenolideo.

A presente invenção refere-se também a um método para isolar do suco de células de biomassa fresca de uma matricária (Tanacetum partheniuní) os ingredientes bioativos para cuidado da pele, que são (i) substancialmente ou totalmente livres de y-lactonas oc-insaturadas, particularmente de partenolideo, e que possuem (ii) propriedades antiinflamatórias; e/ou (iii) propriedades antioxidantes.

A presente invenção refere-se também a um método para isolar do suco de células de biomassa fresca de uma matricária (Tanacetum parthenium) os ingredientes bioativos para cuidado da pele, que são (i) substancialmente ou completamente livres de y-lactonas oc-insaturadas, particularmente de partenolideo, e que possuem (ii) propriedades inibidoras de elastase, e/ou (iii) propriedades antioxidantes.

Em uma forma de realização, o método da presente invenção envolve biomassa fresca de uma matricária (Tanacetum parthenium). A biomassa fresca é então separada no suco de células e um material enriquecido em fibras.

Deve-se notar que, dependendo das condições do cultivo de matricária, ano de cultivo, e colheita em particular, o teor de matéria seca na biomassa da planta pode variar significativamente e pode impactar a consistência das propriedades do suco de células e, assim, a reprodutibilidade dos ingredientes bioativos derivados do suco de células. A presente invenção permite a padronização das propriedades do suco de células para melhorar a reprodutibilidade dos ingredientes ativos.

Em uma forma de realização, a padronização das propriedades do suco de células é melhorada explorando as condições uniformes de cultivo e colheita de matricária.

Em outra forma de realização, o ajuste apropriado de regimes de moagem, maceração e prensagem de matricárias frescas permite que o suco de células seja obtido tendo um teor de matéria seca que é variado em uma faixa relativamente estreita (por exemplo, 7,0 ± 1,6%). Por exemplo, se o teor de matéria seca na biomassa da planta é diminuído devido a impacto ambiental, a moagem fina de matricária e pressão mais alta permitem que o teor de matéria seca no suco de células seja aumentado e sua reprodutibilidade melhorada. Se o teor de matéria seca na biomassa da planta for aumentado, moagem e pressão mais baixa podem ser utilizadas, como evidente.

Em outra forma de realização, a padronização de suco de células é provida sem aumento indesejável de sua temperatura.

Deve ser apontado que os ajustes acima se dirigem à reprodutibilidade de suco de células e não necessariamente diminuem o teor de y-lactonas ot-insaturadas, particularmente de partenolideo, no suco de células quando comparado em uma base de matéria seca com matricária fresca ou com material enriquecido em fibras. Apesar de partenolideo ser aparentemente concentrado em células oleosas, que estão localizadas na superfície das folhas de matricária (ver, por exemplo, Smith et al., J. Chromatogr., 627: 255 (1992); e Smith. R.M. LC GC Int., 8 de Janeiro de 1996, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade), verificou- se inesperadamente que partenolideo não é predominantemente concentrado em material enriquecido em fibras mas, ao contrário, distribuído entre o material acima e suco de células.

Em uma forma de realização, o material enriquecido em fibras é secado ou pode ser armazenado em condições de congelamento.

Em outra forma de realização, material enriquecido em fibras contendo partenolídeo é utilizado para aplicações convencionais de derivados de matricária que são comumente usados na técnica.

O suco de células de matricária fresco é uma dispersão coloidal relativamente estável tendo uma cor verde escuro. Esta cor é devido aos cloroplastos e seus fragmentos, que são dispersos em fase de suco de células contínua tendo cor marrom e enriquecidos com outros componentes do citoplasma. Verificou-se inesperadamente que em nesta dispersão coloidal y-lactonas a-insaturadas, particularmente partenolídeo, têm uma ligação e/ou atividade fortes com cloroplastos e seus fragmentos.

Em uma forma de realização, a remoção de cloroplastos e de seus fragmentos do suco de células permitiu a obtenção de uma fase de suco de células contínua, que é substancialmente livre de y-lactonas a-insaturadas, particularmente partenolídeo. A remoção destes compostos indesejáveis do suco de células pode ser obtida por diferentes tratamentos, mas não limitados a, ajuste de pH, tratamento térmico, radiação de microondas, centrifugação, micro-filtração, ultrafiltração, e combinações dos mesmos.

Em uma forma de realização, suco de células de matricária fresco é separado em um precipitado em pasta de tom verde escuro consistindo de cloroplastos e um sobrenadante líquido marrom, que é substancialmente livre de y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolídeo.

Em outra forma de realização, a separação acima pode ser obtida por centrifugação em velocidade média e em velocidade alta (> 15.000 g). Como um resultado, todos os cloroplastos e seus fragmentos podem ser concentrados em um precipitado (a seguir precipitado I), e o sobrenadante g completamente livre de clorofila. Como um resultado, quase toda a poça de partenolideo desta dispersão coloidal é concentrada no precipitado I e, assim, o sobrenadante I tem um teor de partenolideo > 20 vezes menor (por exemplo, 0,03%) comparado ao suco de células inicial, isto é, o sobrenadante I acima da presente invenção deve ser categorizado como substancialmente livre de y- lactonas oc-insaturadas, particularmente de partenolideo. (O sobrenadante da presente invenção tem um teor de partenolideo residual significativamente mais baixo comparado ao nível de realização preferido em extrato de matricária como descrito nas patentes US 6.224.875 e 6.479.080, que são aqui incorporadas por referência em sua totalidade).

Centrifugações em velocidades média e alta têm algumas limitações técnicas e/ou econômicas especialmente em uma escala industrial grande. Em uma forma de realização, o suco de células de matricária fresco é tratado para diminuir a estabilidade de cloroplasto e seus fragmentos, e então suco de células desestabilizado é efetivamente separado usando configuração em baixa velocidade (> 3.000 g). O critério de separação efetiva é a ausência de característica máxima de clorofila nos espectros do sobrenadante I.

A presente invenção inclui vários tratamentos para diminuir a estabilidade de fase de suco de células de matricária iniciando coagulação de cloroplastos e seus fragmentos. Em uma forma de realização, a estabilidade do suco de células pode ser diminuída usando tratamentos de congelamento- descongelamento (> 1 ciclo), tratamento térmico (> 40°C), ajuste de pH (pH = 3,0... 4,0), e/ou combinações dos mesmos. Os tratamentos acima de suco de células de matricária com subseqüente configuração em baixa velocidade permitem a obtenção do sobrenadante I de suco de células contendo 6,5-7,3% de matéria seca e somente 0,01 - 0,035% de partenolideo. A separação dos cloroplastos e seus fragmentos permite a produção do sobrenadante I, que é substancialmente livre de y-lactonas oc-insaturadas, particularmente de partenolideo.

Em uma forma de realização, o teor de matéria seca no sobrenadante I pode ser aumentado sem mudanças significativas em seu teor de partenolídeo. Assim, antes da separação, o suco de células é tratado com agitação intensiva (por exemplo, usando rotostato) ou homogeneização (por exemplo, usando homogeneizador politron) ou com tratamento ultra-sônico ou com radiação de microondas, e/ou combinações dos mesmos para permitir que parte dos componentes de cloroplastos tendo nenhuma ligação e/ou nenhuma afinidade com y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolídeo, mova-se na fase contínua (solúvel) da dispersão. O processo acima permite ainda aumentar o teor de matéria seca no sobrenadante I sem elevação do teor de y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolídeo. Como um resultado, os cloroplastos separados e seus fragmentos podem capturar no precipitado I somente 15-20% da matéria seca do suco de células total e, assim, 80-85% da matéria seca total permanecem no sobrenadante I de suco de células enriquecido.

Em uma forma de realização, o precipitado I enriquecido com y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolídeo, é armazenado na temperatura de > -20°C. Em uma outra forma de realização, o precipitado I é secado (por exemplo, usando liofilizador ou secador por pulverização ou secados de camada de fluido). Em uma outra forma de realização, o precipitado I é conservado (por exemplo, com 0,75% de glucono delta lactona e 0,25% de eritrobato de sódio ou com 1,0% de fenótipo) e então armazenado em condições refrigeradas.

Em uma forma de realização, o partenolídeo contendo o precipitado I é utilizado para aplicações convencionais de derivados de matricária que são comumente usados na técnica.

Embora o sobrenadante I seja substancialmente livre de y- lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolídeo, a presente invenção permite a remoção quantitativa destes componentes indesejáveis dosobrenadante sem diminuir suas bioatividades desejáveis.

Em uma forma de realização, a remoção quantitativa de y- lactonas oc-insaturadas residuais, particularmente partenolideo, é obtida utilizando tratamentos adicionais diferentes do sobrenadante I. Estes tratamentos incluem, mas não estão limitados ao seguinte: (i) aumento do pH do sobrenadante I (6,0 < pH < 10,0), que inicia a precipitação isoelétrica dos componentes tendo afinidade para y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolideo; (ii) separação dos componentes precipitados usando centrifugação e/ou precipitação para permitir a concentração dos componentes acima no precipitado II; (iii) ajuste do pH do sobrenadante II obtido para o valor de pH inicial do suco de células; e (iv) clarificação adicional do sobrenadante II usando centrifugação e/ou filtração ou micro-filtração (tamanho de poro < 0,22 μm) ou ultrafiltração (corte de peso molecular > 10.000 Dalton) para permitir a obtenção do sobrenadante final. O acima resultou no isolamento do sobrenadante final, que é completamente livre de y- lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolideo, mas contém todas as bioatividades desejáveis.

Em uma forma de realização, o precipitado II resultante é secado (por exemplo, usando liofilizador ou secador por pulverização ou secador de leito fluido). Em uma outra forma de realização, o precipitado II é armazenado em condições de congelamento.

Em uma forma de realização, a estabilização do sobrenadante final é completada adicionando conservantes como foi previamente descrito na publicação do pedido de patente US 2003/0175235, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade, e incubando a mistura até solubilização total ser obtida. Os conservantes usados incluíram os seguintes: 0,1% de sorbato de potássio, 0,1% de benzoato de sódio, 0,1% metil parabeno de sódio, 0,1% de metabissulfito de sódio e 0,1% de ácido cítrico a 75%. O sobrenadante final conservado é armazenado em condições ambientes.

Em uma forma de realização, o sobrenadante final é concentrado usando evaporação de diálise ou eletro-diálise ou osmose reversa ou combinação das mesmas. A evaporação é selecionada como a técnica preferível porque ela possibilita que a integridade dos ingredientes bioativos seja preservada sem remoção indesejável de quaisquer componentes diferentes de água.

Em outra forma de realização, o sobrenadante final concentrado, que é uma suspensão na cor marrom escuro opalescente instável capaz de formar espontaneamente precipitado de cor bege claro, é misturado com estabilizador, incluindo, mas não limitado por > 5,0% de glicerina ou pentileno glicol (1,2 pentanodiol ou 1,2-di-hidroxipentano).

A presente invenção refere-se ainda a ingredientes bioativos isolados, que são substancialmente livres ou completamente livres de y- lactonas oc-insaturadas, particularmente de partenolideo, e têm bioatividades desejáveis. O precipitado II (ingrediente bioativo A), sobrenadante final (ingrediente bioativo B) e sobrenadante final concentrado (ingrediente bioativo C).

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativos isolados são combinados com um agente estabilizador. Agentes estabilizadores apropriados particulares podem incluir, sem limitação, um conservante, um antioxidante, e/ou misturas dos mesmos.

Em outra forma de realização, os ingredientes bioativos isolados são concentrados e então estabilizados para outra utilização em cuidado da pele para aplicações orais e tópicas.

Os ingredientes bioativos da presente invenção podem ainda ser incluídos em sistemas de liberação que são comumente usados na técnica.

Todos os ingredientes bioativos da presente invenção podem ser usados como soluções, suspensões, dispersões, pastas ou pós secados incorporados em produtos de cuidado da pele, incluindo aplicações tópicas eorais.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos se destinam a ilustrar as formas de realização particulares da presente invenção, mas não devem, de nenhum modo, ser destinados a limitar o escopo da presente invenção.

Exemplo 1 - Preparação de ingredientes bioativos derivados de matricária fresca

Apresenta-se abaixo uma descrição de aspectos relevantes de uma forma de realização do método da presente invenção.

Quantidade suficiente de partes aéreas de matricária fresca (Tanacetum parthenium) foi colhida no estágio de floração total de crescimento para dar aproximadamente 100 kg de matéria seca. O nível de matéria seca na matricária fresca foi medido como sendo de 23,77%, requerendo a colheita de aproximadamente 420,7 kg de fitomassa de planta fresca para dar 100 k de matéria seca. O cromatograma de HPLC da matricária utilizada é apresentado na figura 2.

Foi tomado cuidado para conservar o teor de umidade inerente de matricária fresa e para impedir o definhamento devido à perda de umidade. A colheita foi conduzida de um modo a impedir ou minimizar cortes, amassamentos e esmagamentos da matricária nova colhida. Todas as etapas foram completadas no período de tempo mais curto possível. Isto foi feito para minimizar a exposição de matricária fresca ao sol, temperatura elevada, e outros fatores ambientais negativos.

Então, a etapa de lavagem foi realizada para remover as partículas de solo e outros resíduos das plantas antes de outro processamento. Ela foi realizado lavando a matricária colhida durante < 5 minutos em < 1 kg/cm de pressão de água. A lavagem com água residual não contém quaisquer pigmentos verdes ou marrons, indicando pressão de água apropriada e duração da lavagem. O excesso de água foi removido dafitomassa lavada.

A matricária lavada passou por moagem, maceração e prensagem para obter o teor intracelular (isto é, suco de células) e para separar a mesma do material enriquecido em fibras. Um moinho de martelos (modelo VS 35, Vincent Corporation, Tampa, FL) tendo um motor de 5 HP e conjunto de telas foi usado para moer a biomassa para dar partículas de tecido de matricária de tamanho apropriadamente pequeno em uma quantidade mais curta de tempo e sem aumento significativo da temperatura da biomassa. O moinho de martelos foi fixado para produzir o tamanho máximo de partículas de planta maceradas de < 2,0 centímetros durante < 10 segundos de tratamento. A temperatura da biomassa foi aumentada somente em < 5°C.

Uma prensa de parafuso contínua horizontal (Compact Press CP-6, Vincent Corporation, Tampa, FL), equipada com cone suportado por ar comprimido, foi imediatamente usada para obter suco de células de matricária macerada. A pressão no cone foi mantida em um nível de > 20 kg/cm2, com uma velocidade de parafuso de 12 rpm e somente um aumento de temperatura de > 5°C.

Este tratamento deu material enriquecido em fibras e suco de células. As partículas de fibra pequenas residuais foram adicionalmente removidas do suco de células usando, para sua clarificação, centrífuga de fluxo contínuo semi-automática (modelo 12-413V, AML Industries, Inc., Hatboro, PA) em > 3.000 rpm e tempo de retenção de > 30 s. O precipitado foi coletado e combinado com material enriquecido em fibras obtido após prensagem da matricária.

Os processos descritos acima permitiram a produção de 217,2 kg de suco de células de matricária tendo um nível de matéria seca de 8,20% e 203,5 kg de material enriquecido em fibras tendo nível de matéria seca de 40,39%. O cromatograma de HPLC do material enriquecido em fibras é apresentado na figura 3.

O suco de células foi então submetido a vários tratamentos incluindo ajuste de pH, radiação de microondas e separação. O pH de suco de células de matricária fresco (pH inicial = 5,3) foi ajustado usando um método de titulação utilizando 3,6 litros de ácido clorídrico (HC1) 5,0 N para diminuir o pH do suco de células para 3,5. Então, o suco de células ajustado foi imediatamente exposto a radiação de microondas usando sistema de fluxo contínuo especialmente projetado tendo freqüência de 2,45 GHz e 3.200 watt de potência de saída (Microwave Research e Applications, Inc., Laurel, MD). Este sistema foi equipado com agitador de velocidade constante BDC 1850 (Caframo Ltd., Wiarton, Ontário, Canadá) e uma sonda de controle de temperatura. Este tratamento continuou até a temperatura do suco de células na câmara de microondas alcançar 92°C e então o suco de células tratado foi imediatamente bombeado através de um dispositivo de fluxo contínuo que foi conectado com um resfriador de recirculação de 1 HP (modelo 6106 P, Polyscience Corporation, Niles, IL).

Após a temperatura do suco de células tratado ter diminuído para < 30°C, o material foi separado usando uma centrífuga de fluxo contínuo CEPA LE (Cari Padberg Zentrifugenbau GmbH, Alemanha) a 15.000 rpm e tempo de retenção de > 30 s. A separação de 220,8 kg de suco de células tratado de 19,2 kg de precipitado em pasta na cor verde escuro (a seguir precipitado I) tendo o teor de matéria seca de 26,2% e 201,6 kg de sobrenadante líquido opalescente levemente na cor marrom (a seguir sobrenadante I) tendo um teor de matéria seca de 6,34%.

O cromatograma de HPLC do precipitado I é apresentado na figura 4. E notável que o perfil de HPLC mostrado na figura 4 para o precipitado I é significativamente diferente do perfil de HPLC do extrato de matricária descrito na patente US 6.479.080 (ver figura 1). Assim, a composição do precipitado I e do extrato de matricária descrito na patente US 6.479.080 são significativamente diferentes.

O sobrenadante I foi então submetido a outro tratamento incluindo ajustes de pH e separações. O primeiro ajuste de pH foi induzido usando um método de titulação utilizando 1,07 1 de hidróxido de potássio (KOH) a 50% para aumentar o pH do sobrenadante I do suco de células de 3,5 para 9,0. Este tratamento resultou na cor mais escura e opalescente revelada do material que foi imediatamente clarificado usando uma centrífuga de fluxo contínuo CEPA LE (Cari Padberg Zentrifugenbau GmbH, Alemanha) a 15.000 rpm e tempo de retenção de > 30 s. A separação acima deu 0,55 kg de precipitado em pasta na cor bege escuro (a seguir precipitado II) tendo 38,2% de teor de matéria seca e 202,12 kg de sobrenadante opalescente levemente na cor marrom (a seguir sobrenadante II) tendo 6,22% de teor de matéria seca.

O cromatograma de HPLC do precipitado II é apresentado na figura 5. E notável que o perfil de HPLC mostrado na figura 5 para o precipitado II é significativamente diferente do perfil de HPLC do extrato de matricária descrito na patente US 6.479.080 (ver figura 1). Assim, a composição do precipitado II e do extrato de matricária descrito na patente US 6.479.080 são significativamente diferentes.

O precipitado II continha 0,01% de partenolídeo como determinado por análise HPLC representa o ingrediente bioativo A, que é substancialmente livre de y-lactonas oc-insaturadas, particularmente de partenolídeo.

O sobrenadante II foi submetido à titulação isoelétrica utilizando ácido clorídrico (HC1) 5,0 N para retomar o valor de pH para pH = 3,5, como existia no sobrenadante I inicial. Este tratamento levou a uma opalescência leve aumentada de material, mas ele foi efetivamente clarificado usando uma centrífuga de fluxo contínuo CEPA LE (Cari Padberg Zentrifugenbau GmbH, Alemanha) a 15.000 rpm e tempo de retenção de > 60 s. O material clarificado (a seguir, sobrenadante final) continha <0,00007% de partenolídeo como determinado por análise HPLC e, assim, de acordo com os limites de detecção, o sobrenadante final deve ser considerado livre de partenolideo, e particularmente completamente livre de partenolideo.

A estabilização do sobrenadante final foi obtida adicionando- se conservantes e antioxidante e incubando-se a mistura até a solubilização total ser obtida. Os conservantes e antioxidante usados incluíram os seguintes: 0,1% de sorbato de potássio, 0,1% de benzoato de sódio, 0,1% de sódio metil parabeno, e 0,2% de metabissulfito de sódio. Esta separação resultou na produção de 201,6 kg de ingrediente bioativo B contendo 6,8% de matéria seca. O rendimento do ingrediente bioativo B de 100 kg de matéria seca da biomassa de matricária inicial é aproximadamente 12,5 kg de matéria seca.

O cromatograma de HPLC do ingrediente bioativo B é apresentado na figura 6. E notável que o perfil de HPLC mostrado na figura 6 para o ingrediente bioativo B é significativamente diferente do perfil de HPLC do extrato de matricária descrito na patente US 6.479.080 (ver figura 1). Assim, a composição do ingrediente bioativo B e do extrato de matricária descrito na patente US 6.479.080 são significativamente diferentes.

O ingrediente bioativo B também foi concentrado utilizando o sistema de evaporação a vácuo Rapid Vac (Labconco, Kanzas City, MO) equipado com oito tubos de 0,6 1, coletor de líquido de 2.550 1 e bomba de vácuo de diafragma (modelo 2018B-01), Welch Rietsche Thomas, Skokie, IL). Usando pressão de operação = 100 mBar, temperatura - 60°C e velocidade de vórtice = 40%, o ingrediente bioativo B foi concentrado em ciclos de 90 minutos para produzir 63,16 1 totais (ou 70,11 kg) de material concentrado tendo 19,89% de matéria seca. Então, 5,0% (p/p) de pentileno glicol foram adicionados ao material concentrado e após misturação moderada durante > 60 s líquido resultante marrom escuro transparente: ingrediente bioativo C foi produzido. O ingrediente bioativo C continha <0,00007% de partenolideo como determinado por análise HPLC e, assim, de acordo com os limites de detecção, o ingrediente bioativo C acima deve ser considerado livre de partenolideo, e particularmente completamente livre de partenolideo.

O cromatograma de HPLC do ingrediente bioativo C é apresentado na figura 7. É notável que o perfil de HPLC mostrado na figura 7 para ingrediente bioativo C é significativamente diferente do perfil de HPLC do extrato de matricária descrito na patente US 6.479.080 (ver figura 1). Assim, a composição do ingrediente bioativo C e do extrato de matricária descrito na patente US 6.479.080 são significantemente diferentes.

Exemplo 2 - Características e propriedades de ingrediente bioativo B

Ingrediente bioativo B foi preparado de acordo com o processo descrito acima no exemplo 1. Análises de ingrediente bioativo B foram conduzidas para determinar suas várias características físico-químicas, químicas, e microbianas.

As características físico-químicas e químicas selecionadas de ingrediente bioativo B são apresentadas abaixo na tabela 1.Tabela 1 - Características físico-químicas e químicas de ingrediente bioativo B

Ingrediente bioativo B é prontamente solúvel em água em qualquer proporção. Tabela 2 abaixo descreve as características microbianas de ingrediente bioativo B. Estes dados demonstram que o ingrediente bioativo B atende às exigências da indústria para o cuidado da pele com relação à contagem de placas total, contagem de mofo e levedura, e ausência depatógenos.Tabela 2 - Características microbianas de ingrediente bioativo B

* Unidades formadoras de colônia

Os resultados de testes de eficácia antimicrobiana apresentados na tabela 3 abaixo indicam, que o ingrediente bioativo B tem um sistema efetivo de conservantes. Tabela 3 - Resultados de testes de eficácia antimicrobiana de ingredientebioativo B

Tabela 4 inclui os dados relacionados para atividades antiinflamatórias e antioxidantes de ingrediente bioativo B. A atividade antiinflamatória foi determinada usando teste de elastase de neutrófiloshumanos e a atividade antioxidante foi determinada usando teste de reduçãode citocromo c. Tabela 4 - Atividades antiinflamatórias e antioxidantes de ingredientebioativo B

O ingrediente bioativo B foi determinado como sendo estável (isto é, mantendo integridade física e química) durante pelo menos 12 meses enquanto armazenado em uma temperatura entre 15 e 25°C em um recipiente fechado protegido da luz.

Exemplo 3 - Características e propriedades de ingrediente bioativo C

O ingrediente bioativo C foi preparado de acordo com o 5 processo descrito acima no exemplo 1. Análises de ingrediente bioativo C foram conduzidas para determinar suas várias características físico-químicas, químicas, microbianas, e bioatividades. As características físico-químicas e químicas selecionadas de ingrediente bioativo C são apresentadas abaixo na tabela 5.Tabela 5 - Características físico-químicas e químicas de ingredientebioativo C

O ingrediente bioativo C é facilmente solúvel em água em qualquer proporção. Tabela 6 abaixo descreve as características microbianas de 15 ingrediente bioativo C. Estes dados demonstram que o ingrediente bioativo C atende às exigências da indústria de cuidado da pele com relação à contagem de placa total, contagem de mofo e levedura, e ausência de patógenos.Tabela 6 - Características microbianas de ingrediente bioativo C

Tabela 7 refere-se às atividades antiinflamatórias e antioxidantes de ingrediente bioativo C. A atividade antiinflamatória foi determinada usando teste de elastase de neutrófilos humanos e a atividade antioxidante foi determinada usando teste de redução de citocromo c.Tabela 7 - Atividades biológicas de ingrediente bioativo C

O ingrediente bioativo C foi determinado como sendo estável (isto é, mantendo integridade física e química) durante pelo menos 12 meses enquanto armazenado em uma temperatura entre 15 e 25°C em um recipiente fechado protegido de luz.

Exemplo 4 - Características e propriedades de ingrediente bioativo A

O ingrediente bioativo A foi preparado de acordo com o processo descrito acima no exemplo 1. Análises de ingrediente bioativo A foram conduzidas para determinar suas várias características físico-químicas, químicas, microbianas e bioatividade.

As características físico-químicas e químicas selecionadas de ingrediente bioativo A são apresentadas abaixo na tabela 8.Tabela 8 - Características físico-químicas e químicas de ingrediente bioativo A

Tabela 9 abaixo descreve as características microbianas de ingrediente bioativo A. Estes dados demonstram que o ingrediente bioativo A atende às exigências da indústria de cuidado da pele com relação à contagem de placa total, contagem de mofo e levedura, e ausência de patógenos.Tabela 9 - Características microbianas de ingrediente bioativo A

* Unidades formadoras de colônia Tabela 10 refere-se às atividades antiinflamatórias e antioxidantes de ingrediente bioativo A. A atividade antiinflamatória foi determinada usando elastase de neutrófilos humanos e a atividade antioxidante foi determinada usando teste de redução citocromo c.Tabela 10 - Atividades biológicas de ingrediente bioativo A

O ingrediente bioativo A foi determinado para ser estável (isto é, mantendo integridade física e química) durante pelo menos 12 meses enquanto armazenado em freezer em um recipiente fechado protegido de luz. Exemplo 5 - Comparação de ingredientes bioativos obtidos de matricária coletada de colheitas diferentes e em estações diferentes

A reprodutibilidade de ingredientes bioativos foi analisada utilizando matricária fresca que foi colhida em duas estações consecutivas dos mesmos campos. Adicionalmente matricária fresca foi colhida duas vezes por estação no mesmo estágio de crescimento. Todas as amostras de biomassa de matricária fresca acima foram processadas utilizando o método descrito acima no exemplo 1. Os dados relacionados para a comparação do rendimento, características selecionadas e propriedades de ingredientes bioativos B e C são apresentados abaixo. (Os dados relacionados com o ingrediente bioativo A não são incluídos no exemplo, porque este ingrediente resultou em um rendimento muito pequeno).

Verificou-se, que, a partir de uma quantidade de matricária para dar 100 kg de material seco, aproximadamente 12,4 ±2,1 kg de material seco ingrediente bioativo foram produzidos. O material seco em média em biomassa de matricária fresca ~ 20% e assim ~ 190 kg de ingrediente bioativo B ou ~ 62 kg de ingrediente bioativo C puderam ser obtidos.

Não foi verificada uma diferença significante entre o rendimento de ingredientes bioativos obtidos da primeira e segunda colheita (valor p — 0,8893) e entre ingredientes bioativos obtidos em duas estações consecutivas (valor p = 0,6531). Adicionalmente, não foi verificada uma diferença significante entre o teor de material seco em ingredientes bioativos 10 (valor p = 0,5334) e teor de partenolídeo em ingredientes acima (valor p = 0,9923).

As características físico-químicas e químicas selecionadas de ingredientes bioativos, que foram obtidos de matricária fresca coletada de colheitas diferentes e em estações diferentes, são apresentadas abaixo na 15 tabela 11 sugerindo uma reprodutibilidade elevada de ingrediente bioativo B e ingrediente bioativo C.Tabela 11 - Reprodutibilidade de ingredientes bioativos obtidos de matricária coletada de colheitas diferentes e em estações diferentes

Deve-se notar que o teor de partenolídeo de ingredientes 20 bioativos estava abaixo do limite de detecção de procedimento analítico HPLC utilizado. Tabela 12 abaixo descreve as características microbianas de ingredientes bioativos. Estes dados demonstram que os ingredientes bioativos obtidos de matricária coletada de colheitas diferentes e em estações diferentes atendem às exigências da indústria de cuidado da pele com relação à contagem de placa total, contagem de mofo e levedura, e ausência de patógenos.Tabela 12 - Características microbianas de ingredientes bioativos obtidos de matricária coletada de colheitas diferentes e em estações diferentes

Tabela 13 refere-se às atividades antiinflamatórias e antioxidantes de ingredientes bioativos. A atividade antiinflamatória foi 10 determinada usando teste de elastase de neutrofilos humanos e a atividade antioxidante foi determinada usando teste de redução de citocromo c. Não foi encontrada uma diferença significante entre as atividades de ingredientes bioativos obtidos de matricária fresca coletada de colheitas diferentes e em estações diferentes sugerindo uma reprodutibilidade elevada de ingrediente 15 bioativo B e ingrediente bioativo C.Tabela 13 - Reprodutibilidade de atividades biológicas de ingredientes bioativos obtidos de matricária coletada de colheitas diferentes e em estações diferentes

Os ingredientes bioativos obtidos de matricária coletada de colheitas diferentes e em estações diferentes foram determinados como sendo estáveis (isto é, mantendo integridade física e química) durante pelo menos 12 meses quando armazenada em congelador em um recipiente fechado protegido da luz.

Exemplo 6 - Protocolos usados para determinar determinadas características de ingredientes bioativos

Os seguintes são vários métodos usados para determinar certas características de ingredientes bioativos. Estes métodos foram referidos completamente nos exemplos acima. As referências abaixo para os “produtos testados” ou as “amostras de teste” referem-se aos ingredientes bioativos.

Método para determinação de material seco:

O procedimento para determinação de material seco incluía a evaporação do produto testado no banho d’água a 100°C até completar evaporação de água, armazenamento em forno da amostra a 105°C durante 3 horas, resfriamento em temperatura ambiente, e determinação imediata do peso do recipiente com material sólido.

Método para determinação de valores L*a*b*:

O procedimento para determinação de valores L*a*b* utilizaram colorímetro de geometria fixa Hunter Labscan com uma geometria de 0745°. Iluminante D65 padrão com uma janela de mostrador voltada para cima foi usado. O recipiente com ingrediente bioativo testado foi colocado na janela de mostrador e medido através do fundo. As seguintes equações CIELAB foram usadas:

Método para determinação de teor de partenolideo:

As amostras foram extraídas usando metanol e tratamento ultra-sônico de 30 min. A coluna de fase reversa Cl8 foi usada como a fase estacionária e 44% de acetonitrila: 56% de água e 0,1% de ácido fosfórico foram usados como uma fase móvel. A detecção de partenolideo foi a 225 nm e concentrações de partenolideo foram determinadas usando uma curva de calibração de múltiplos pontos revelada com seis padrões de partenolideo (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO) na faixa de 30 μg/g a 900 μg/g. O limite de detecção sob estas condições é de 0,7 μg/ml. Cerca de 30 μg/g de partenolideo podem ser quantificados usando este conjunto de condições.

Método para determinação de características microbiológicas:

As características microbiológicas de amostras testadas foram determinadas de acordo com o método da Farmacopéia Americana (USP) UPS XXVII, NF 22, <61>, Microbiological Limit Tests, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Os testes acima incluem contagem aeróbica total, mofos e levedura totais (contagem de placa aeróbica), determinação de Salmonella (sp.), E. coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas sp.

Estudos de desafio com os conservantes foram realizados usando método USP XXVII, NF 22, <51>, Antimicrobial Effective Testing, pp. 2148 - 2150, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Incubação dos artigos de teste inoculados foi realizada a 20 a 25 °C e testados em intervalos de tempo de 7, 14, 21 e 28 dias.

Método para determinação de atividade inibidora de elastase:

A atividade inibidora de elastase de ingredientes bioativos testados foi determinada usando o teste, que emprega elastase de neutrófilos humanos (Elastin Products Company, Inc., Owenswille, MO) e substrato solúvel de peptídeo sintético N-MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p-NA (Sigma- Aldrich Corporation, St. Louis, MO). Este teste inclui procedimento modificado como descrito em Elastin Products Company’s Catalog, “Determination of human elastase activity,” Research Biochemical Catalog, Elasting Product Company, Inc., Owensville, MO, pagina 84 (2004), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade. A divagem enzimática do substrato foi medida a 410 nm e 25°C usando 0,1 M de tampão Tris-HCl pH 7,5 contendo 50 mM de NaCl. O volume total de meio de reação na cubeta do espectrofotômetro foi de 3,0 mL. Cada ingrediente bioativo testado foi testado em concentrações requeridas para obter 50% de inibição (IC5o) de velocidade de reação enzimática.

Método para determinação de atividade de remoção de superóxido:

O método usado foi com base no procedimento descrito no artigo Quick et al., “Rapid microplate assay for superoxide scavenging eficiency,” J. Neuroscience Methods, 97: 139 - 144 (2000), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

Este teste permitiu um teste rápido e preciso de ingredientes bioativos para determinar a atividade antioxidante comparativa de remoção de superóxido. O teste incluiu hipoxantina, xantina oxidase e citocromo c. Hipoxantina serviu como o substrato e foi metabolisada por xantina oxidase em um processo de duas etapas, produzindo dois ânions superóxido. Estes ânions livres reduziram citocromo c, resultando em um aumento de pico notável a 550 nm. O volume total de meio de reação na cubeta do espectrofotômetro foi de 3,0 mL.

Apesar de formas de realização preferidas terem sido apresentadas e descritas em detalhes aqui, será evidente para os versados na técnica relevante que várias modificações, adições, substituições e outros, podem ser feitos sem sair do espírito da invenção e que estes são, assim, considerados como estando dentro do escopo da invenção como definida nas reivindicações que seguem.

Claims (2)

1. Método para isolar uma fração bioativa que é derivada do suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium), e que é substancialmente livre de Y-lactonas a-insaturadas, caracterizado pelo fato de compreender: prover biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium); processar a biomassa fresca sob condições efetivas para obter um sobrenadante de suco de células que é pelo menos substancialmente livre de Y-lactonas a-insaturadas e uma fração de membrana contendo Y-lactonas a- insaturadas, dito processamento de biomassa fresca compreendendo: (i) separação da biomassa fresca em um componente de suco de células e um material enriquecido em fibras; e (ii) submeter o componente de suco de células a uma etapa de ajuste de pH e tratamento com microondas combinados para obter o sobrenadante de suco de células que é pelo menos substancialmente isento de Y-lactonas a-insaturadas, em que o ajuste de pH compreende diminuir o pH para uma faixa de 3-4; tratar o sobrenadante do suco de células sob condições efetivas para obter um primeiro sobrenadante de soro de suco de células e um precipitado de fração de citoplasma, e isolar o precipitado de fração de citoplasma, em que referido precipitado de fração de citoplasma é uma fração bioativa que é substancialmente livre de Y-lactonas a-insaturadas, em que as referidas Y- lactonas a-insaturadas compreendem partenolídeo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de processar a biomassa fresca compreende: clarificar o componente de suco de células para produzir um componente de suco de células clarificado antes de submeter o componente

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