BRPI0708095A2 - ingrediente bioativo, método para isolar uma fração bioativa, e, composição bioativa - Google Patents

Abstract

INGREDIENTE BIOATIVO, METODO PARA ISOLAR UMA FRAçãO BIOATIVA, E, COMPOSIçãO BIOATIVA. A presente invenção refere-se a ingredientes bioativos que incluem frações bioativas isoladas derivadas de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium). As frações bioativas são ou livres de ou substancialmente livres de <sym>-lactonas <244>- insaturadas (por exemplo, partenolídeo). Além disso, as frações bioativas tem atividade antiinflamatória e antioxidante. A presente invenção também refere-se a um método para isolar uma fração bioativa que é derivada de suco decélulas de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium) e que é pelo menos substancialmente livre de <sym>-lactonas <244>- insaturadas (por exemplo partenolídeo). A presente invenção também refere- se a um método para preparar uma fração de soro de suco de células estabilizada e uma fração de soro de suco de células concentrada estabilizada que são livres de <sym>-lactonas <244>-insaturadas (por exemplo, partenolídeo). A presente invenção também refere-se a uma composição bioativa que inclui uma mistura de uma ou mais das frações bioativas isoladas da presente invenção.

Description

"INGREDIENTE BIOATIVO, MÉTODO PARA ISOLAR UMA FRAÇÃOBIOATIVA, E, COMPOSIÇÃO BIOATIVA"

Este pedido reivindica o benefício do pedido de patenteprovisório US número de série 60/775.257, depositado em 21 de fevereiro de2006, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a ingredientes bioativos queincluem frações bioativas isoladas derivadas de suco de células de biomassafresca de uma planta de matricária {Tanacetum parthenium). As fraçõesbioativas são tanto livres de como substancialmente livres de γ-lactonas a-insaturadas (por exemplo, partenolídeo) e têm atividade antiinflamatória eantioxidante. A presente invenção refere-se também a métodos para produziros ingredientes bioativos. A presente invenção refere-se ainda a umacomposição bioativa que inclui uma mistura de uma ou mais das fraçõesbioativas da presente invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Tanacetum parthenium L. Schulz-Bip. (syn. Chrysanthemumparthenium, Leicanthemum parthenium, Matricaria parthenium, Pyrethrumparthenium) é uma planta pertencente à família Compositae (.Asteraceae,Matricaria ou margarida-dos-campos). Tanacetum parthenium é conhecidasob os nomes comuns: altamisa, amargosa, centáurea-azul, 'featherfew','featherfoil', planta antitérmica, 'feverfew', 'flirtwort', 'grande camomille','manzanila', matricária, "midsummer daisy', 'moederkruid", Santa Maria' e'varadika'. Destes nomes comuns, o nome "matricária" é mais freqüentementeusado.

Matricária é uma planta perene curta que cresce 15-80 cm emaltura. Os caules permanecem retos e são esfriados e cabeludos. As folhas sãofolhas verdes em penachos divididos duplos tendo margens serrilhadas. A flortem pétalas radiadas brancas e um centro amarelo que é plano. O odor daplanta quando tocada é forte, aromático e amargo. Matricária tem sidocultivada há pelo menos 2000 anos e é nativa da península dos Bálcãs e dasMontanhas do Cáucaso. Atualmente, matricária é cultivada na Europa,América do Norte, América do Sul, África do Norte, China, Japão e Austrália.As condições ótimas para o cultivo de matricária são: solo bem drenado tendopH = 6,0...6,7 (pH ótimo - 6,3); sol total ou sombra parcial; apropriada pararesistência em zonas de temperatura USDA de nove a cinco sem proteção. Omelhor clima para matricária são as zonas cinco e sete. Com proteção,matricária pode ser cultivada nas zonas três e quatro, embora em um climacontinental (por exemplo, Kansas, USA; Saskatchewan, Canadá) matricária àsvezes é considerada uma planta anual.

Os gregos antigos e os antigos europeus usavam matricáriapara tratar febre, inflamação e inchações, bem como para repelir insetos epara tratar mordidas e ferrões. Nos últimos 20 anos, matricária tem atraídoconsiderável interesse para o tratamento de enxaqueca, artrite e doençasinflamatórias. As partes da planta que são utilizadas são as folhas secadas oufrescas e partes aéreas florescentes. Matricária é usada na forma de uma ervacrua, pó secado, folha fresca, cápsula de folha secada por congelamento,cápsula de folha secada, cápsula de gel mole, tintura, infusão (por exemplo,chá), extratos, e ingredientes de bebidas funcionais. Aparentemente, a plantatotal de matricária age em um aspecto similar aos agentes antiinflamatóriosnão esteroidais. No entanto, extratos de matricária atuam de um modobastante similar a cortisona (ver, por exemplo, Feverfew. BotanicalMonograph, American Journal of Natural Medicine 4(6): 28-29 (1997)).

Tal discrepância e atividades de amplo espectro atraem aatenção e a investigação dos ingredientes ativos na planta e seus derivados.Os produtos químicos ativos mais conhecidos em matricária sãosesquiterpeno lactonas (teor total < 1,8%) e óleos essenciais (teor total <0,07%). A lista dos compostos ativos de matricária inclui os seguintes: (i)sesquiterpeno lactonas (incluindo artecanina, canina, 10-epicanina,crisantemolídeo, crisantemonina, epoxiartemorina, 1 β-hidroxiarbusculina, 3β-hidroxipartenóide, 8p-hidroxireinosina, magnoliolídeo, partenolídeo,reinosina, santamarina, seco- tanapartenolídeo A, tanapartina, tanapartina-la,4a-epóxido, tanapartina-1 β,4β-epóxido); (ii) sesquiterpenos (incluindocânfora, β-farneseno e germacreno); (iii) monoterpenos; (iv) flavonóis(incluindo tanetina, caemperóis, quercetagetinas, apigenina, luteolina ecrisoeritol); e (v) poliinas de éter enol espirocetal.

O grupo mais abundante destes compostos é um grupo de γ-lactonas α-insaturadas; particularmente, partenolídeo, que representa ~ 85%de γ-lactonas α-insaturadas. Partenolídeo, que está aparentemente localizadoem células oleosas na superfície das folhas de matricária é o mais bemconhecido e bem estudado (ver, por exemplo, Smith et al., J. Chromatogr.,627:255 (1992); e Smith, R.M., LC GC Int. (8 a 15 de janeiro de 1996)).Considera-se que as γ-lactonas α-insaturadas, incluindo partenolídeos são osingredientes fundamentais responsáveis pelas atividades biológicas damatricária, mas também são os mesmos ingredientes freqüentementeresponsáveis por reações alérgicas causadas por derivados de matricária.

Por exemplo, as preparações de matricária usadas emexperiências clínicas bem-sucedidas têm um teor de partenolídeo de 0,4% a0,66%, que excede as concentrações capazes de iniciar ulceração, dermatiteexsudativa e efeitos patológicos aumentando do contato externo (ver, porexemplo, Awang, D.V.C., "Feverefiv," Can. Pharm. J., 122: 266-270 (1989)).

Ao mesmo tempo, cerca de 10-18% de usuários de matricária relatam algunsefeitos adversos geralmente brandos e reversíveis (ver, por exemplo, Ernst etal., "The eficacy and safety of feverfew (Tanacetum parthenium L.): anupdate of a systematic review, iiPublic Health Nutrition, 3 (4a): 509-514(2000); Porter et al., "Feverfew in Saskatchewan,"(www.agr.gov. sk. ca/DOC S/crops/special crops/feverfew.asp?firstPick=&secondpck=&therdpick=Production%20Information) (2004)) e partenolídeo podeser responsável por estes efeitos adversos. A capacidade de γ-lactonas a-insaturadas (incluindo partenolídeo)de iniciar muitas reações alérgicas é bemdocumentada (ver, por exemplo, Arch. Dermatol. Forsch, 25 (3): 235-244(1975); Arch. Dermatol. Forsch, 255(2): 111-121 (1976); Contact Dermatitis,38(4): 207-208 (1988); Am. J. Contact Dermatol., 1: 49-50 (1998-1999); Br.J. Dermatol, 132(4) 543-547 (1995)).

Em anos recentes, esforços foram dirigidos para a preparaçãode extratos de matricária, que pretendem deve ser substancialmente livres deγ-lactonas α-insaturadas e, mais particularmente, substancialmente livres departenolídeos (ver, por exemplo, patente US 6.224.875 e patente US6.479.080). Deve ser notado que "substancialmente livre de γ-lactonas a-insaturadas" e "substancialmente livre de partenolídeo" significa um extratotendo um teor em peso de γ-lactona α-insaturada ou partenolídeo,respectivamente, abaixo de cerca de 0,1%, mais preferivelmente abaixo de0,1%, mais preferivelmente abaixo de cerca de 0,09%, e mais preferivelmenteabaixo de 0,07%. Devido aos teores acima serem mais baixos do que em umafitomassa de matricária média tendo de 0,4 a 1,8% de partenolídeos (ver, porexemplo, Marino L., "The effect of clonal micropropagation on parthenolidecontent in two genotypes of feverfew, Tanaeetum parthenium," AgroFarmTechnologies Feverfew Report, London, Ontário (2004)), muitas etapas daextração complexa usando vários solventes orgânicos e purificação, incluindoevaporação completa dos solventes e utilização de resina de mudança iônica,são requeridas para produzir extratos tendo teor diminuído de γ-lactonas a-insaturadas e particularmente partenolídeo.

Os extratos de solventes orgânicos mencionados acima sãoobtidos de fitomassa de matricária secada utilizando um processocompreendendo as seguintes etapas: (a) extrair a quantidade de material deplanta da porção aérea da planta com acetona, álcoois ou misturas destessolventes com água; (b) extrair o material da etapa (a) com um solventehidrocarboneto; (c) extrair a fase não hidrocarboneto restante com umsolvente não polar; (d) evaporar o extrato de solvente não polar e re-dissolvero resíduo em solução de água-alcoólicca, e então tratar o resíduo re-dissolvidocom uma resina básica forte; (e) eluir a resina com um álcool e remover asolução eluída; (f) tratar a resina com uma solução alcoólica ou de água-alcoólicca de um ácido, concentrando a solução e extraindo o resíduoresultante com um solvente não polar; (g) evaporar o solvente não polar daetapa (f) para formar um resíduo que é adicionado ao resíduo a partir daevaporação do extrato de hidrocarboneto da etapa (b) e à fase acetônica oualcoólica obtida após a extração com o solvente não polar da etapa (c); e (h)evaporar o solvente e secar o resíduo restante.

Os solventes preferidos para as várias etapas de extraçãoincluem, mas não estão limitados aos seguintes: para a etapa (a): acetona,metanol, etanol ou misturas dos mesmos com água; para a etapa (b): hexano,n-pentano, éter de petróleo, ligroína; para a etapa (c): cloreto de metileno,clorofórmio, acetato de etila, preferivelmente cloreto de metileno; e para aetapa (f): acetato de etila.

De acordo com as patentes US 6.224.875 e 6.479.080, esteextrato "substancialmente livre de partenolídeo" tem propriedadesfarmacológicas favoráveis junto com o risco reduzido de induzir reaçõesalérgicas. No entanto, o extrato acima é isolado com processamentoseqüencial usando solventes orgânicos, que pertencem a quatro gruposdiferentes, e que podem ter compatibilidade limitada com muitoscomponentes convencionais de formulações de cuidado da pele. Assim, aaplicabilidade do extrato acima como um ingrediente para produtos decuidado da pele tem certos limites (por exemplo, não prontamente solúvel emágua).

Embora o extrato de matricária descrito seja "substancialmentelivre de partenolídeo," ,ele não é material verdadeiramente livre departenolídeo devido ao teor de partenolídeo residual permitido. Atividadesespecíficas superiores bem conhecidas do partenolídeo propriamente ditopodem contribuir para tanto as propriedades farmacológicas como aalergenicidade residual do extrato, especialmente quando usado emconcentrações elevadas. É importante que as propriedades farmacológicas doextrato acima sejam limitadas por atividades de somente os ingredientes dematricária que são solubilizados em determinados solventes em certascondições. Assim, este extrato representa somente parte dos componentesativos existentes em plantas de matricária vivas. Por exemplo, folhas dematricária secadas por congelamento e folhas secadas demonstraram efeitobenéfico significativo quando comparadas a um placebo, mas extratos deetanol de matricária foram ineficazes (ver, por exemplo, Ernst et al., "Theeficacy and safety of feverfew (Tanacetum parthenium L.): An update of asystematic review," Public Health Nutrition, 3 (4a): 509-514 (2000)).

Com relação à comparação das atividades específicasencontradas em diferentes formas de produtos de matricária, deve-se notarque a preparação de folhas secadas totais demonstra ser mais efetiva do quede seus extratos, e, além disso, os extratos de matricária secada e fresca têmdiferenças marcantes nos perfis e potência farmacológica (ver, por exemplo,Barsby et al., "Feverfew and vascular smooth muscle: Extracts from fresh anddried plants show opposing pharmacological profiles, dependent uponsesquiterpene lactone content," Planta Medica, 59: 20-25 (1993)). Assim,com relação a e em contraste com os extratos de folhas de matricária secadas,os extratos de folhas frescas têm (a) corrente de potássio dependente davoltagem inativante reduzida em um modo relacionado com a concentração;(b) inibição dependente de dose da produção de leucócitos de tromboxano B2e leucotrieno B4; e (c) resposta muscular inibida para triptamina, tromboxanoe relaxamento induzido por acetilcolina reduzido.De modo interessante, o desejo intenso de maximizar aeficácia de produtos de matricária levou recentemente à produção aumentadade produtos contendo todos os componentes da planta que podem serminimamente impactados pelo processamento da planta. Dentre estesprodutos estão as preparações de folhas de matricária secadas porcongelamento, embora este material seja apropriado para aplicações limitadas,e cuidado com a pele não está entre as mesmas.

Além disso, as atividades de extratos de matricária e o nível departenolídeo nestes extratos dependem da escolha do(s) solvente(s) e métodode extração explorado (ver, por exemplo, Kaplan, M., "Comparison ofSupercritical Fluid and Solvent Extraction of Feverfew (Tanacetumparthenium)," Turk J. Chem, 26: 473-480 (2002)). Assim, material extraídopor extração de solvente e extração de fluido supercrítico difere. Por exemplo,extratos de CO2 de fluido supercrítico têm maior teor de partenóide do queextratos de clorofórmio, e mais em extratos de acetona a seguir.

A composição de matricária varia significativamente,dependendo da fonte do material da planta e condições de cultivo e decolheita.Variações enormes na quantidade de partenolídeo são verificadas.Por exemplo, plantas cultivadas nos Estados Unidos contêm < 50% deconcentração de partenolídeo encontrados em matricária cultivadas na Grã-Bretanha e França. Os teores de partenolídeo foram mais elevados para terraseca comparados com a matricária irrigada. Verificou-se que submetendomatricária a um evento de estresse em água apenas, pode-se aumentar o teorde partenolídeo (Fonseca et al., "Parthenolide and abscisic acid synthesis infeverfew are associated but environmental factors affect them dissimilarly," J.Plant Physiology, 162, 485-494 (2005)). As flores continham os maioresníveis de partenolídeo, enquanto os caules continham o menor nível departenolídeo. O teor de partenolídeo nas flores aumentou e o teor dos caules efolhas diminuiu à medida que a colheita era retardada. Matricária colhidadurante a tarde continha significativamente mais partenolídeo do que asplantas colhidas pela manhã e a exposição de matricária à luz ultravioleta(UV) resultou no teor de partenolídeo significativamente diminuído. Deve-senotar que uma ampla variação na quantidade de partenolídeo em derivados dematricária pode ser o resultado essencial da interação de dois fatores maiores:condições de cultivo e métodos de processamento. Infelizmente, as patentesUS 6.224.875 e 6.479.080 não fornecem qualquer informação com relação àreprodutibilidade de extrato de matricária "substancialmente livre departenolídeo". No entanto, como descrito acima, a grande variabilidade dematéria-prima pode ter um impacto significativo sobre as propriedades doextrato.

Assim, existem muitos fatores genéticos, geográficos,climáticos e tecnológicos que levam a uma fraca reprodutibilidade e umaqualidade menor do que a completamente ótima dos extratos e produtos dematricária convencionais (ver, por exemplo, Hepinstall et al., "Parthenolidecontent and bioactivity of feverfew (Tanacetum parthenium) (L.) Schultz-Bip.). Estimation of commercial and authenticated feverfew produtcts," J.Pharm. Pharmacol., 44: 391-395 (1992); Draves, A.H. e S.E. Walker,"Parthenolide Content of Canadian Commercial Feverfew Preparations: LabelClaims are Misleading in Most Cases," Canadian Pharm. J., 136 (10): 23-30(dezembro de 2003/ janeiro de 2004)) e estes fatores criam sérios problemaspara a ampla utilização de derivados de matricária em medicamentosherbáceos e para cuidado da pele.

Assim, existe uma necessidade de um método de produção dederivados de matricária livres de partenolídeo e altamente reprodutíveis tendoum amplo espectro de atividades biológicas desejáveis, que não estãolimitadas a somente as atividades que tem uma afinidade para algunssolventes, isto é, não são de outra forma submetidos à limitações de extraçãoquímica convencional.SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a ingredientes bioativos queincluem frações bioativas isoladas derivadas de suco de células de biomassafresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium). As fraçõesbioativas são tanto livres de como substancialmente livres de γ-lactonas a-insaturadas (por exemplo, partenolídeo). Além disso, as frações bioativas têmatividade antiinflamatória e antioxidante.

A presente invenção refere-se também a um método para isolarfrações bioativas que são derivadas de suco de células de biomassa fresca deuma planta de matricária {Tanecetum parthenium) e que são tanto livres de ousubstancialmente livres de γ-lactonas α-insaturadas (por exemplo,partenolídeo). Este método envolve a provisão de biomassa fresca a partir deuma planta de matricária (Tanaeetum parthenium). A biomassa fresca éprocessada sob condições efetivas para dar um sobrenadante de suco decélulas e uma fração de membrana. O sobrenadante de suco de células étratado sob condições efetivas para dar um primeiro sobrenadante de soro desuco de células e um precipitado de fração de citoplasma. O precipitado defração de citoplasma é então isolado como uma fração bioativa que é pelomenos substancialmente livre de γ-lactonas α-insaturadas. A presenteinvenção refere-se também a um ingrediente bioativo que inclui o precipitadode fração de citoplasma produzido por este método, e que tem atividadeantiinflamatória e antioxidante.

A presente invenção refere-se também a um método parapreparar uma fração de soro de suco de células estabilizada que é uma fraçãobioativa que é derivada de suco de células de biomassa fresca de uma plantade matricária e que é livre de γ-lactonas α-insaturadas (por exemplo,partenolídeo). Este método envolve clarificar o primeiro sobrenadante de sorode suco de células sob condições efetivas para dar um segundo sobrenadantede soro de suco de células. Um agente estabilizador é misturado com osegundo sobrenadante de soro de suco de células sob condições efetivas paradar uma fração de soro de suco de células estabilizada. A fração de soro desuco de células estabilizada é uma fração bioativa que é livre de γ-lactonas a-insaturadas. A presente invenção também refere-se a um ingrediente bioativoque inclui a fração de soro de suco de células estabilizada produzida por estemétodo, e que tem atividade antiinflamatória e antioxidante.

A presente invenção também refere-se a um método parapreparar uma fração de soro de suco de células concentrada estabilizada que éuma fração bioativa que é derivada de suco de células de biomassa fresca deuma planta de matricária (Tanacetum parthenium) e que é livre de γ-lactonasα-insaturadas (por exemplo, partenolídeo). Este método envolve aconcentração da fração de soro de suco de células estabilizada sob condiçõesefetivas para dar um sobrenadante de soro de suco de células concentrado.

Um agente estabilizador é misturado com o sobrenadante de soro de suco decélulas concentrado sob condições efetivas para dar uma fração de soro desuco de células concentrada. A fração de soro de suco de células concentradaé uma fração bioativa que é livre de γ-lactonas α-insaturadas. A presenteinvenção refere-se também a um ingrediente bioativo que inclui a fração desoro de suco de células concentrada produzida por este método, e que tematividade antiinflamatória e antioxidante.

A presente invenção, além disso, refere-se a uma composiçãobioativa que inclui uma mistura de uma ou mais das frações bioativas isoladasda presente invenção.

A presente invenção é utilizável em que ela provê um meiopara produzir derivados de matricária substancialmente livres de partenolídeoou livres de partenolídeo e altamente reprodutíveis, tendo um amplo espectrode atividades biológicas desejáveis (por exemplo, atividades antiinflamatóriase antioxidantes). Uma vantagem de presente invenção sobre a técnica anterioré que o método da presente invenção não requer o uso de solventes orgânicosagressivos para isolar as frações bioativas da presente invenção; Osingredientes bioativos da presente invenção são utilizáveis como ingredientesativos em várias aplicações tópicas e orais a mamíferos (incluindo humanos).Estas formulações podem ser usadas para inibir atividade inflamatória notecido da pele e para proteger o tecido da pele de dano induzido pela luzultravioleta. Os ingredientes bioativos da presente invenção também podemser usados para normalizar distúrbios da pele no tecido da pele de ummamífero.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é um desenho esquemático demonstrando umaforma de realização do processo para preparar os ingredientes bioativos dapresente invenção.

A figura 2 é um cromatograma de cromatografia líquida dealta pressão ("HPLC") da biomassa fresca de matricária usada em uma formade realização do processo da presente invenção. A seta descendente mostra opico de partenolídeo.

A figura 3 é um cromatograma de HPLC de materialenriquecido em fibras isolado por uma forma de realização do processo dapresente invenção. A seta descendente mostra o pico de partenolídeo.

A figura 4 é um cromatograma de HPLC do Precipitado Iisolado por uma forma de realização do processo da presente invenção. A setadescendente mostra o pico de partenolídeo.

A figura 5 é um cromatograma de HPLC do Precipitado II(ingrediente bioativo A) isolado por uma forma de realização do processo dapresente invenção. A seta descendente mostra o pico de partenolídeo.

A figura 6 é um cromatograma de HPLC do sobrenadante final(ingrediente bioativo B) isolado por uma forma de realização do processo dapresente invenção.

A figura 7 é um cromatograma de HPLC do sobrenadante finalconcentrado (ingrediente bioativo C) isolado por uma forma de realização doprocesso da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a ingredientes bioativos queincluem frações bioativas isoladas derivadas de suco de células de biomassafresca de uma placa de matricária (Tanacetum parthenium). As fraçõesbioativas são tanto livres de como substancialmente livres de γ-lactonas a-insaturadas, e mais particularmente são tanto livres de ou substancialmentelivres de partenolídeo. Como usado aqui, os termos "fração bioativa" e"ingrediente bioativo" podem ser usados intercambiavelmente. Em vista dopresente relatório, o versado na técnica saberá quando o empregointercambiável dos termos é apropriado. Os ingredientes bioativos da presenteinvenção têm atividades favoráveis, incluindo, sem limitação, atividadesantiinflamatórias e antioxidantes.

Como usado aqui, o termo "matricária" é o nome comum paraa planta iiTanacetum parthenium".

Como usado aqui, os termos "substancialmente livre de γ-lactonas α-insaturadas" e "substancialmente livre de partenolídeo" referem-sea uma fração bioativa ou ingrediente bioativo de matricária tendo um teor empeso de γ-lactonas α-insaturadas ou partenolídeo, respectivamente, igual a oumenor do que cerca de 0,01%, mas dentro do limite detectável para γ-lactonasα-insaturadas ou partenolídeo usando testes analíticos de cromatografialíquida de alta pressão ("HPLC") bem conhecidos na técnica. Como usadoaqui, todas as porcentagens usadas referem-se ao teor em peso ouconcentração de γ-lactonas α-insaturadas ou partenolídeo nos ingredientesbioativos/ frações bioativas da presente invenção, a menos que indicado aocontrário, referem-se à porcentagem em peso (comumente abreviada pelosímbolo "%p" ou pela expressão "porcento em peso").

Como usado aqui, os termos "livre de γ-lactonas a-insaturadas" e "livre de partenolídeo" referem-se a uma fração bioativa ouingrediente bioativo de matricária tendo um teor em peso de γ-lactonas ct-insaturadas ou partenolídeo, respectivamente, que está abaixo do limitedetectável para γ-lactonas α-insaturadas ou partenolídeo usando teste analíticode HPLC padrão bem conhecidos na técnica. Em uma forma de realização, osingredientes bioativos/ frações bioativas que são livres de partenolídeo têmum teor em peso de partenolídeo que é menos do que 0,00007%/p. Osversados na técnica podem reconhecer os ingredientes bioativos/ fraçõesbioativas da presente invenção que são "livres de γ-lactonas α-insaturadas" ou"livres de partenolídeo" a serem caracterizados como sendo "completamentelivres de γ-lactonas α-insaturadas" ou "completamente livres departenolídeo", respectivamente.

Um método apropriado para detectar a quantidade departenolídeo é ainda descrito no exemplo 6 {infra). Resumidamente, estemétodo para detectar partenolídeo envolve a detecção a 225 nm, ondeconcentrações de partenolídeo são determinadas usando uma curva decalibração de múltiplos pontos desenvolvida com seis padrões de partenolídeo(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO) na faixa de 30 μg departenolídeo/g de amostra a 900 μg de partenolídeo/g de amostra. Em umaforma de realização, o limite de detecção de partenolídeo nestas condições é0,7 μg de partenolídeo/ml de amostra (isto é, 0,00007%). Cerca de 30 μg departenolídeo/g de amostra (isto é, 0,003%) podem ser quantificados usandoeste conjunto de condições.

Em uma forma de realização, o ingrediente bioativo dapresente invenção corresponde a um "precipitado de fração de citoplasma"como definido aqui. Com referência ao esquema do processo descrito nafigura 1, esta forma de realização inclui uma categoria de ingrediente bioativoà qual o "Precipitado II 36" pode pertencer. Além disso, como descrito naseção Exemplos {infra), esta forma de realização inclui uma categoria deingrediente ativo à qual o "Ingrediente Bioativo A" poderia pertencer. Comodemonstrado nos exemplos, em uma forma de realização do IngredienteBioativo A da presente invenção foi mostrado conter cerca de 0,01%/p departenolídeo, e, assim, poderia qualificar como sendo substancialmente livrede partenolídeo. Em uma outra forma de realização, o ingrediente bioativocorrespondente ao "precipitado de fração de citoplasma" pode ter um perfil deHPLC correspondente ao perfil mostrado na figura 5, ou semelhante.

Em uma outra forma de realização, o ingrediente bioativo dapresente invenção corresponde a uma "fração de soro de suco de célulasestabilizada" como definido aqui. Com referência à seção Exemplos (infra) eo esquema do processo descrito na figura 1, esta forma de realização incluiuma categoria de ingrediente bioativo à qual o "Ingrediente Bioativo B" e"Ingrediente Bioativo B 60 poderia pertencer. Como demonstrado nosexemplos, uma forma de realização do Ingrediente Bioativo B da presenteinvenção foi mostrada conter abaixo de 0,00007%/p de partenolídeo, e, assim,é definida como sendo livre de partenolídeo. Em outras palavras, verificou-seque a quantidade de partenolídeo nesta forma de realização do ingredientebioativo está abaixo do limite de detecção do procedimento analítico usadopara detectar partenolídeo (ver exemplo 6, "Method for Determination ofParthenolide Content"). Em uma outra forma de realização, o ingredientebioativo correspondente à "fração de soro de suco de células estabilizada"pode ter um perfil de HPLC correspondente ao perfil mostrado na figura 6, ousemelhante. O ingrediente bioativo desta forma de realização é prontamentesolúvel em água.

Ainda em uma outra forma de realização, o ingredientebioativo da presente invenção corresponde a uma "fração de soro de suco decélulas estabilizada" como definido aqui. Com referência à seção Exemplos(infra) e à esquemática do processo descrito na figura 1, esta forma derealização inclui uma categoria de ingrediente bioativo à qual o "IngredienteBioativo C" e "Ingrediente Bioativo C 80" poderiam pertencer. Comodemonstrado nos exemplos, uma forma de realização do Ingrediente BioativoC da presente invenção foi mostrada conter abaixo de 0,00007%/p departenolídeo, e, assim, é definida como sendo livre de partenolídeo. Em outraspalavras, verificou-se que a quantidade de partenolídeo nesta forma derealização está abaixo do limite de detecção do procedimento analítico usadopara detectar partenolídeo (ver exemplo 6, infra). Em uma outra forma derealização, o ingrediente bioativo correspondente à "fração de soro de suco decélulas estabilizada" pode ter um perfil de HPLC correspondente ao perfilmostrado na figura 7, ou semelhante. O ingrediente bioativo desta forma derealização é prontamente solúvel em água.

A fração bioativa da presente invenção tem atividadeantiinflamatória e antioxidante.

Com relação à atividade antiinflamatória, esta atividade podeser determinada usando um teste de inibição de elastase (ver, por exemplo,exemplo 6, "Método para a determinação da atividade de elastase"). Em umaforma de realização, o ingrediente bioativo da presente invenção tem umaatividade antiinflamatória expressada em valores IC50 na faixa de cerca de0,1% (v/v) a cerca de 2,0% (v/v), particularmente de cerca de 0,3% (v/v) acerca de 1,7% (v/v). Como usado aqui para definir atividade antiinflamatória,o termo "valor IC50" refere-se à concentração de ingrediente bioativorequerida para diminuir a velocidade de reação enzimática de elastase em50%. Como mostrado nas tabelas 4, 7, 10 e 13, a atividade antiinflamatória(em valores IC50) dos ingredientes bioativos pode ser expressada em termosde volume (por exemplo, microlitros, pL), e então recalculada em termos deuma concentração volume por volume (v/v). Os dados antiinflamatóriosmostrados nas tabelas 4, 7, 10 e 13 foram baseados em um volume de 3,0 mlda mistura de reação.

Com relação à atividade antioxidante, esta atividade pode serdeterminada usando um teste de remoção de superóxido (ver, por exemplo,exemplo 6, "Método para a determinação de atividade superóxido"). Em umaforma de realização, o ingrediente bioativo da presente invenção tem umaatividade antioxidante expressada em valores IC50 na faixa de cerca de0,007% (v/v) e cerca de 1,0% (v/v), particularmente de cerca de 0,067% (v/v)a cerca de 0,27% (v/v). Como usado aqui para definir a atividadeantioxidante, o termo "valor IC50" refere-se à concentração de ingredientebioativo requerida para diminuir a velocidade de redução citocromo c em50%. Como mostrado nas tabelas 4, 7, 10 e 13, a atividade antioxidante (emvalores IC50) dos ingredientes bioativos identificados pode ser expressada emtermos de volume (por exemplo, microlitros, |jL), e então recalculada emtermos de uma concentração volume por volume (v/v). O antioxidantemostrado nas tabelas 4, 7, 10 e 13 foi baseado em um volume de 3,0 ml damistura de reação.

Em uma forma de realização, o ingrediente bioativo pode serusado para aplicações tópicas com ou sem um agente estabilizador. Agentesestabilizadores apropriados são os convencionalmente usados na técnica, epodem incluir, sem limitação, um emulsificador, um conservante, umantioxidante, uma matriz polimérica, e misturas dos mesmos.

Como usado aqui, "aplicação tópica" geralmente refere-se atécnicas relacionadas a assentar diretamente sobre ou espalhar os ingredientesbioativos da presente invenção ou formulações contendo estes ingredientesbioativos sobre a pele externa usando, por exemplo, as mãos ou um aplicadorcomo um pano de limpeza.

Os ingredientes bioativos (e formulações contendo os mesmos)são "cosmeticamente aceitáveis". Como usado aqui, o termo "cosmeticamenteaceitáveis" refere-se a ingredientes bioativos, formulações, agentescosmeticamente ativos, ou ingredientes inertes que são apropriados para usoem contato com tecidos de mamíferos (por exemplo, a pele de humanos) semtoxicidade, incompatibilidade, instabilidade, irritação, resposta alérgicaindevidos, e outros, proporcionais com uma relação benefício/risco razoável.

Os ingredientes bioativos (e formulações contendo os mesmos)são utilizáveis para aplicação tópica e oral a humanos, e podem ser aplicadosem uma "quantidade segura e efetiva". Como usado aqui, o termo"quantidade segura e efetiva" refere-se a uma quantidade de ingredientebioativo ou formulação suficiente para induzir significativamente umamodificação positiva na condição a ser regulada ou tratada, mas baixa obastante para evitar efeitos colaterais sérios. A quantidade segura e efetiva doingrediente bioativo ou formulação contendo o ingrediente bioativo variarácom a condição particular sendo tratada, a idade e condição física, do usuáriofinal, a severidade da condição sendo tratada/ prevenida, a duração dotratamento, a natureza da terapia simultânea, o ingrediente bioativo específicoou formulação empregada, o veículo tópico cosmeticamente aceitávelparticular utilizado, e outros fatores.

As formulações contendo os ingredientes bioativos da presenteinvenção pode ser preparada usando metodologia que é bem conhecida pelosversados na técnica.

A presente invenção também refere-se a um método para isolarfrações bioativas que são derivadas de suco de células de biomassa fresca deuma planta de matricária {Tanecetum parthenium) e que são tanto livres ousubstancialmente livres de γ-lactonas α-insaturadas (por exemplo,partenolídeo). Este método envolve a provisão de biomassa fresca de umaplanta de matricária (Tanacetum parthenium). Biomassa fresca apropriadapode incluir qualquer parte da planta de matricária, incluindo, por exemplo,suas folhas, flores, brotos, caules e raízes. A biomassa fresca é processada sobcondições efetivas para dar um sobrenadante de suco de células e uma fraçãode membrana. O sobrenadante de suco de células é tratado sob condiçõesefetivas para dar um primeiro sobrenadante de soro de suco de células e umprecipitado de fração de citoplasma. Em uma forma de realização, o"precipitado de fração de citoplasma" corresponde ao Ingrediente Bioativo A(ver figura 1 e a seção Exemplos). O precipitado de fração de citoplasma éentão isolado como uma fração bioativa que é substancialmente livre de γ-lactonas α-insaturadas, particularmente substancialmente livre departenolídeo.

Uma forma de realização para processar a biomassa fresca sobcondições efetivas para dar o sobrenadante de suco de células e a fração demembrana, é como se segue: (i) a biomassa fresca é separada em umcomponente do suco de células e um material enriquecido em fibras; (ii) ocomponente de suco de células é clarificado para dar um componente de sucode células clarificado; e (iii) o componente de suco de células clarificado éseparado no sobrenadante de suco de células e na fração de membrana.

A presente invenção refere-se também a um método parapreparar um fração de soro de suco de células estabilizada que é uma fraçãobioativa que é derivada de suco de células de biomassa fresca de uma plantade matricária (!Tanacetum parthenium) e que é livre de γ-lactonas a-insaturadas (por exemplo, partenolídeo). Este método envolve clarificar oprimeiro sobrenadante de soro de suco de células (descrito acima) sobcondições efetivas para dar um segundo sobrenadante de soro de suco decélulas. Um agente estabilizador (cujos exemplos apropriados são descritosaqui) é misturado com o segundo sobrenadante de soro de suco de células sobcondições efetivas para dar uma fração de soro de suco de célulasestabilizada. A fração de soro de suco de células estabilizada é uma fraçãobioativa que é livre de γ-lactonas α-insaturadas, e particularmente livre departenolídeo. Em uma forma de realização, a "fração de soro de suco decélulas estabilizada" corresponde ao ingrediente bioativo B (ver figura 1 eseção dos Exemplos).

A presente invenção refere-se também a um método parapreparar uma fração de soro de suco de células concentrada estabilizada que éuma fração bioativa que é derivada de suco de células de biomassa fresca deuma planta de matricária (Tanacetum parthenium) e que é livre de γ-lactonasα-insaturadas, particularmente livre de partenolídeo. Este método envolveconcentrar a fração de soro de suco de células estabilizada (descrita acima)sob condições efetivas para dar um sobrenadante de soro de suco de célulasconcentrado. Um agente estabilizador (cujos exemplos apropriados sãodescritos aqui) é misturado com o sobrenadante de soro de suco de célulasconcentrado sob condições efetivas para dar uma fração de soro de suco decélulas concentrada estabilizada. A fração de soro de suco de célulasconcentrada estabilizada é uma fração bioativa que é livre de γ-lactonas a-insaturadas, e particularmente livre de partenolídeo. Em uma forma derealização, "fração de soro de suco de células concentrada estabilizada"corresponde ao ingrediente bioativo C (ver figura 1 e seção exemplos).

A presente invenção também refere-se aos ingredientesbioativos produzidos a partir dos métodos descritos acima, incluindo, porexemplo, ingredientes bioativos que contêm (i) o precipitado de fração decitoplasma produzido pelo método da presente invenção; (ii) a fração de sorode suco de células estabilizada produzida pelo método da presente invenção; e(iii) a fração de soro de suco de células concentrada estabilizada produzidapelo método da presente invenção. Estes ingredientes bioativos têm atividadeantiinflamatória e antioxidante.

A título de exemplo, uma forma de realização do processoglobal para preparar os ingredientes bioativo da presente invenção (porexemplo, ingrediente bioativo A, ingrediente bioativo B e ingrediente bioativoC) é mostrada esquematicamente na figura 1. Detalhes das etapas desteprocesso são ainda descritos abaixo e na descrição detalhada e nos exemplos.

Como descrito na figura 1, matricária fresca 10 (isto é,biomassa fresca de matricária) é provida. Em uma forma de realização, aetapa descrita neste parágrafo corresponde à etapa definida como "proverbiomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium)."

Matricária fresca 10 é submetida a moagem, maceração eprensagem 12 sob condições efetivas para separar matricária fresca 10 nosuco de células 16 e material enriquecido em fibras 14. O suco de células 16 éentão submetido à clarificação 18 sob condições efetivas para dar suco decélulas clarificado 20. O suco de células clarificado 20 é submetido a ajustede pH/ tratamento com microondas 22 e então resfriamento/ centrifugação 24sob condições efetivas para dar o precipitado I 26 (fração de membrana) e osobrenadante I 30 (sobrenadante de suco de células). Esta etapa é efetiva nadivisão de uma quantidade substancial de γ-lactonas a-insaturadas(particularmente partenolídeo) no precipitado I 26, que também inclui muitasdas membranas encontradas no suco de células clarificado 20. Como usadopara descrever a quantidade de γ-lactonas α-insaturadas (particularmentepartenolídeo) contidas no precipitado I 26, o termo "quantidade substancial"refere-se a um teor de γ-lactonas α-insaturadas (particularmente partenolídeo)que excede 0,01%/p e/ou que é comparável ao teor de γ-lactonas a-insaturadas (particularmente partenolídeo) em matricária fresca. Assim, osobrenadante 130 que é produzido por esta etapa inclui suco de células que épelo menos substancialmente livre de γ-lactonas α-insaturadas, eparticularmente pelo menos substancialmente livre de partenolídeo. Em umaforma de realização, a etapa descrita neste parágrafo corresponde à etapadefinida como "processar a biomassa fresca sob condições efetivas para darum sobrenadante de suco de células e uma fração de membrana,"

O sobrenadante I 30 é submetido a precipitação isoelétrica 32e depois centrifugação 34 sob condições efetivas para dar o sobrenadante II40 (por exemplo, primeiro sobrenadante de soro de suco de células) eprecipitado II 36 (por exemplo, precipitado de fração de citoplasma). Em umaforma de realização, a etapa descrita neste parágrafo corresponde à etapadefinida como "tratar o sobrenadante de suco de células sob condiçõesefetivas para dar um primeiro sobrenadante de soro de suco de células e umprecipitado de fração de citoplasma."

O precipitado II 36 é então isolado. Em uma forma derealização, o precipitado II 36 corresponde ao ingrediente bioativo A, e ésubstancialmente livre de γ-lactonas α-insaturadas, e particularmentepartenolídeo. Em uma forma de realização, a etapa descrita neste parágrafocorresponde à etapa definida como "isolar o precipitado de fração decitoplasma." O precipitado II 36 (ingrediente bioativo A) também tem váriasbioatividades favoráveis, incluindo, mas não limitadas a, atividadeantiinflamatória e antioxidante.

O sobrenadante II 40 (por exemplo, primeiro sobrenadante desoro de suco de células) é submetido a ajuste de pH 42 e depois submetido aclarificação 44 sob condições efetivas para dar o sobrenadante final 50(também referido em uma forma de realização o "segundo sobrenadante desoro de suco de células"). O sobrenadante final 50 é então submetido amisturação com o estabilizador 52 sob condições efetivas para dar oingrediente bioativo B 60 (também referido em uma forma de realizaçãocomo a "fração de soro de suco de células estabilizada"). O ingredientebioativo B 60 é substancialmente livre de γ-lactonas α-insaturadas, eparticularmente substancialmente livre de partenolídeo. Em uma forma derealização. As etapas coletivas descritas nesta parágrafo correspondem à etapadefinida como (i) "clarificar o primeiro sobrenadante de soro de suco decélulas sob condições efetivas para dar um segundo sobrenadante de soro desuco de células"; e (ii) "misturar um agente estabilizador com o segundosobrenadante de soro de suco de células sob condições efetivas para dar umafração de soro de suco de células estabilizada." O ingrediente bioativo B 60também tem várias bioatividades favoráveis, incluindo, mas não limitadas a,atividade antiinflamatória e antioxidante.O ingrediente bioativo B 60 é submetido à evaporação 62 sobcondições efetivas para concentrar o ingrediente bioativo B 60 para dar osobrenadante final concentrado 70 (também referido em uma forma derealização como o "sobrenadante de soro de suco de células concentrado").

Em uma forma de realização, esta etapa corresponde à etapa definida como"concentrar a fração de soro de suco de células estabilizada sob condiçõesefetivas para dar um sobrenadante de soro de suco de células concentrado." Osobrenadante final concentrado 70 é então submetido a misturação com oestabilizador 72 sob condições efetivas para dar o ingrediente bioativo C 80(também referido em uma forma de realização como a "fração de soro de sucode células concentrada estabilizada"). Em uma forma de realização, esta etapacorresponde à etapa de "misturar um agente estabilizador com o sobrenadantede soro de suco de células concentrado sob condições efetivas para dar umafração de soro de suco de células concentrada estabilizada." O ingredientebioativo C 80 é livre de γ-lactonas α-insaturadas, e particularmente livre departenolídeo. O ingrediente bioativo C 80 também tem várias bioatividadesfavoráveis, incluindo, mas não limitadas a, atividade antiinflamatória eantioxidante.

Os ingredientes bioativos da presente invenção incluem todasas frações bioativas derivadas de suco de células descritas na figura 1, a saber,as frações bioativas representadas pelos seguintes: (i) sobrenadante I 30; (ii)sobrenadante II 40; (iii) precipitado II 36 (ingrediente bioativo A); (iv)sobrenadante final 50; (v) ingrediente bioativo B 60; (vi) sobrenadante final70 concentrado; e (vii) ingrediente bioativo C 80. As frações bioativasrepresentadas pelas listadas neste parágrafo são cada uma tanto livres decomo substancialmente livres de γ-lactonas α-insaturadas, e particularmentelivres de ou substancialmente livres de partenolídeo. Além disso, as fraçõesbioativas representadas pelas listadas neste parágrafo têm cada uma atividadeantiinflamatória e antioxidante.A presente invenção também refere-se a composiçõesbioativas que incluem uma mistura de uma ou mais frações bioativasderivadas de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária(:Tanacetum parthenium). Frações bioativas apropriadas podem incluir, semlimitação, qualquer uma das frações bioativas da presente invenção. Emparticular, as frações bioativas apropriadas são cada uma tanto livres de comosubstancialmente livres de atividade antiinflamatória e antioxidante, eparticularmente livres de ou substancialmente livres de partenolídeo. Alémdisso, as frações bioativas apropriadas têm atividade antiinflamatória eantioxidante. Em uma forma de realização, a composição bioativa podeincluir, sem limitação, uma mistura de uma ou mais das frações bioativas/ingredientes bioativos descritos na figura 1, a saber, sobrenadante I 30,sobrenadante II 40, precipitado II 36 (ingrediente bioativo A), sobrenadantefinal 50, ingrediente bioativo B 60, sobrenadante final 70 concentrado e/ouingrediente bioativo C 80. As composições bioativas da presente invenção sãotanto livres de como substancialmente livres de γ-lactonas α-insaturadas, eparticularmente livres de ou substancialmente livres de partenolídeo. Ascomposições bioativas também têm atividade antiinflamatória e antioxidante.Em uma forma de realização, a composição bioativa inclui um agenteestabilizador. Métodos para combinas a uma ou mais frações bioativas dapresente invenção para dar as composições bioativas da presente invenção sãobem conhecidos na técnica, e são contemplados como parte da presenteinvenção.

Os ingredientes bioativos e composições bioativas da presenteinvenção podem ser usados em vários métodos destinados aos mamíferos(incluindo humanos). Além disso, devido à baixa concentração departenolídeo (ou à ausência total de partenolídeo) nos ingredientes bioativos,métodos para usar os ingredientes bioativos podem incluir aplicações que sãoseguras não somente para adultos, mas também para crianças de todas asidades (incluindo, sem limitação, bebês, crianças que estão começando aandar, e jovens e adolescentes).

Outras formas de realização dos ingredientes bioativos dapresente invenção são resumidas abaixo.

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativos sãoderivados de biomassa serial fresca de matricária em qualquer estágio decrescimento, incluindo, mas não limitado por, estágios provendo rendimentomáximo: a partir do estágio inicial de floração total (10% de flores) até oestágio de floração total (100% de flores).

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativos podemser derivados de fitomassa fresca, que pode ser colhida de plantas cultivadasno primeiro e/ou nos seguintes anos da cultura.

Em outra forma de realização, os ingredientes bioativos podemser derivados de fitomassa fresca, que é cultivada nos campos e/ou nas estufase/ou em fitotron e/ou em culturas de tecidos e/ou em calos.

Os ingredientes bioativos apropriados podem incluir, semlimitação, quaisquer componentes de uma célula de planta, que não têmnenhuma ligação e/ou afinidade com γ-lactonas a-insaturadas,particularmente com partenolídeo.

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativosapropriados podem incluir, sem limitação, quaisquer componentes de umacélula de planta que têm propriedades antiinflamatórias e não têm nenhumaligação e/ou afinidade com γ-lactonas α-insaturadas, particularmente compartenolídeo.

Em outra forma de realização, os ingredientes bioativosapropriados podem incluir, sem limitação, quaisquer componentes de célulade planta que têm atividade inibidora contra proteinases liberadas durante aresposta antiinflamatória em tecidos humanos. As proteinases podem incluir,mas não estão limitadas a, elastase de neutrófilos humanos, que é uma dasenzimas mais destrutivas dentre as proteinases. Devido à elastase poderdegradar os múltiplos componentes da matriz extracelular dos tecidoshumanos, os inibidores de elastase são considerados como bioativosimportantes capazes de reduzir o dano ao tecido associado com uma amplavariedade de condições inflamatórias. Embora partenolídeo purificadosozinho demonstre certa atividade anti-elastase, verificou-se inesperadamenteque os ingredientes bioativos substancialmente livres de partenolídeo ecompletamente livres de partenolídeo da presente invenção têm atividadeinibidora de elastase maior, que é cerca de duas ordens de magnitude maiordo que a atividade de partenolídeo purificado.

Verificou-se que os ingredientes bioativos da presenteinvenção, que não têm nenhuma ligação e/ou afinidade com γ-lactonas a-insaturadas, particularmente com partenolídeo, têm uma atividade anti-elastase que é superior à atividade de partenolídeo puro.

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativosapropriados da presente invenção podem incluir, sem limitação, quaisquercomponentes de células de planta que têm propriedades inibidoras de elastasee não têm nenhuma ligação e/ou afinidade com γ-lactonas a-insaturadas,particularmente com partenolídeo.

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativosapropriados da presente invenção podem incluir, sem limitação, quaisquercomponentes de célula de planta que têm propriedades antioxidante e não têmnenhuma ligação e/ou afinidade com γ-lactonas a-insaturadas,particularmente com partenolídeo.

A presente invenção também refere-se a ingredientesbioativos, que são (i) substancialmente ou completamente livres de γ-lactonasα-insaturadas, particularmente de partenolídeo, e têm (ii) propriedadesantiinflamatórias e (iii) antioxidantes desejáveis para cuidado da peleincluindo aplicações tópicas e orais.Em uma forma de realização, os ingredientes bioativos dapresente invenção podem incluir, sem limitação, quaisquer componentes decélula de planta que têm propriedades antiinflamatórias e antioxidantes e nãotêm nenhuma ligação e/ou afinidade com γ-lactonas a-insaturadas,particularmente com partenolídeo.

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativosapropriados podem incluir, sem limitação, quaisquer componentes de célulade planta que têm propriedades inibidoras de elastase e antioxidantes e nãotêm nenhuma ligação e/ou afinidade com γ-lactonas a-insaturadas,particularmente com partenolídeo.

A presente invenção refere-se também a um método para isolardo suco de células de biomassa fresca de uma matricária {Tanacetumparthenium) os ingredientes bioativos para cuidado da pele, que são (i)substancialmente ou totalmente livres de γ-lactonas a-insaturadas,particularmente de partenolídeo, e que possuem (ii) propriedadesantiinflamatórias; e/ou (iii) propriedades antioxidantes.

A presente invenção refere-se também a um método para isolardo suco de células de biomassa fresca de uma matricária {Tanacetumparthenium) os ingredientes bioativos para cuidado da pele, que são (i)substancialmente ou completamente livres de γ-lactonas a-insaturadas,particularmente de partenolídeo, e que possuem (ii) propriedades inibidorasde elastase, e/ou (iii) propriedades antioxidantes.

Em uma forma de realização, o método da presente invençãoenvolve biomassa fresca de uma matricária (Tanacetum parthenium). Abiomassa fresca é então separada no suco de células e um materialenriquecido em fibras.

Deve-se notar que, dependendo das condições do cultivo dematricária, ano de cultivo, e colheita em particular, o teor de matéria seca nabiomassa da planta pode variar significativamente e pode impactar aconsistência das propriedades do suco de células e, assim, a reprodutibilidadedos ingredientes bioativos derivados do suco de células. A presente invençãopermite a padronização das propriedades do suco de células para melhorar areprodutibilidade dos ingredientes ativos.

Em uma forma de realização, a padronização das propriedadesdo suco de células é melhorada explorando as condições uniformes de cultivoe colheita de matricária.

Em outra forma de realização, o ajuste apropriado de regimesde moagem, maceração e prensagem de matricárias frescas permite que osuco de células seja obtido tendo um teor de matéria seca que é variado emuma faixa relativamente estreita (por exemplo, 7,0 ± 1,6%). Por exemplo, se oteor de matéria seca na biomassa da planta é diminuído devido a impactoambiental, a moagem fina de matricária e pressão mais alta permitem que oteor de matéria seca no suco de células seja aumentado e sua reprodutibilidademelhorada. Se o teor de matéria seca na biomassa da planta for aumentado,moagem e pressão mais baixa podem ser utilizadas, como evidente.

Em outra forma de realização, a padronização de suco decélulas é provida sem aumento indesejável de sua temperatura.

Deve ser apontado que os ajustes acima se dirigem àreprodutibilidade de suco de células e não necessariamente diminuem o teorde γ-lactonas α-insaturadas, particularmente de partenolídeo, no suco decélulas quando comparado em uma base de matéria seca com matricáriafresca ou com material enriquecido em fibras. Apesar de partenolídeo seraparentemente concentrado em células oleosas, que estão localizadas nasuperfície das folhas de matricária (ver, por exemplo, Smith et al., J.Chromatogr., 627: 255 (1992); e Smith. R.M. LC GC Int., 8 de Janeiro de1996, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade), verificou-se inesperadamente que partenolídeo não é predominantemente concentradoem material enriquecido em fibras mas, ao contrário, distribuído entre omaterial acima e suco de células.

Em uma forma de realização, o material enriquecido em fibrasé secado ou pode ser armazenado em condições de congelamento.

Em outra forma de realização, material enriquecido em fibrascontendo partenolídeo é utilizado para aplicações convencionais de derivadosde matricária que são comumente usados na técnica.

O suco de células de matricária fresco é uma dispersãocoloidal relativamente estável tendo uma cor verde escuro. Esta cor é devidoaos cloroplastos e seus fragmentos, que são dispersos em fase de suco decélulas contínua tendo cor marrom e enriquecidos com outros componentesdo citoplasma. Verificou-se inesperadamente que em nesta dispersão coloidalγ-lactonas α-insaturadas, particularmente partenolídeo, têm uma ligação e/ouatividade fortes com cloroplastos e seus fragmentos.

Em uma forma de realização, a remoção de cloroplastos e deseus fragmentos do suco de células permitiu a obtenção de uma fase de sucode células contínua, que é substancialmente livre de γ-lactonas a-insaturadas,particularmente partenolídeo. A remoção destes compostos indesejáveis dosuco de células pode ser obtida por diferentes tratamentos, mas não limitadosa, ajuste de pH, tratamento térmico, radiação de microondas, centrifugação,micro-filtração, ultrafiltração, e combinações dos mesmos.

Em uma forma de realização, suco de células de matricáriafresco é separado em um precipitado em pasta de tom verde escuroconsistindo de cloroplastos e um sobrenadante líquido marrom, que ésubstancialmente livre de γ-lactonas α-insaturadas, particularmente departenolídeo.

Em outra forma de realização, a separação acima pode serobtida por centrifugação em velocidade média e em velocidade alta (> 15.000g). Como um resultado, todos os cloroplastos e seus fragmentos podem serconcentrados em um precipitado (a seguir precipitado I), e o sobrenadante gcompletamente livre de clorofila. Como um resultado, quase toda a poça departenolídeo desta dispersão coloidal é concentrada no precipitado I e, assim,o sobrenadante I tem um teor de partenolídeo > 20 vezes menor (por exemplo,0,03%) comparado ao suco de células inicial, isto é, o sobrenadante I acimada presente invenção deve ser categorizado como substancialmente livre de γ-lactonas α-insaturadas, particularmente de partenolídeo. (O sobrenadante dapresente invenção tem um teor de partenolídeo residual significativamentemais baixo comparado ao nível de realização preferido em extrato dematricária como descrito nas patentes US 6.224.875 e 6.479.080, que são aquiincorporadas por referência em sua totalidade).

Centrifugações em velocidades média e alta têm algumaslimitações técnicas e/ou econômicas especialmente em uma escala industrialgrande. Em uma forma de realização, o suco de células de matricária fresco étratado para diminuir a estabilidade de cloroplasto e seus fragmentos, e entãosuco de células desestabilizado é efetivamente separado usando configuraçãoem baixa velocidade (> 3.000 g). O critério de separação efetiva é a ausênciade característica máxima de clorofila nos espectros do sobrenadante I.

A presente invenção inclui vários tratamentos para diminuir aestabilidade de fase de suco de células de matricária iniciando coagulação decloroplastos e seus fragmentos. Em uma forma de realização, a estabilidadedo suco de células pode ser diminuída usando tratamentos de congelamento-descongelamento (> 1 ciclo), tratamento térmico (> 40°C), ajuste de pH (pH =3,0... 4,0), e/ou combinações dos mesmos. Os tratamentos acima de suco decélulas de matricária com subseqüente configuração em baixa velocidadepermitem a obtenção do sobrenadante I de suco de células contendo 6,5-7,3%de matéria seca e somente 0,01 - 0,035% de partenolídeo. A separação doscloroplastos e seus fragmentos permite a produção do sobrenadante I, que ésubstancialmente livre de γ-lactonas α-insaturadas, particularmente departenolídeo.Em uma forma de realização, o teor de matéria seca nosobrenadante I pode ser aumentado sem mudanças significativas em seu teorde partenolídeo. Assim, antes da separação, o suco de células é tratado comagitação intensiva (por exemplo, usando rotostato) ou homogeneização (porexemplo, usando homogeneizador politron) ou com tratamento ultra-sônicoou com radiação de microondas, e/ou combinações dos mesmos para permitirque parte dos componentes de cloroplastos tendo nenhuma ligação e/ounenhuma afinidade com γ-lactonas α-insaturadas, particularmente departenolídeo, mova-se na fase contínua (solúvel) da dispersão. O processoacima permite ainda aumentar o teor de matéria seca no sobrenadante I semelevação do teor de γ-lactonas α-insaturadas, particularmente de partenolídeo.Como um resultado, os cloroplastos separados e seus fragmentos podemcapturar no precipitado I somente 15-20% da matéria seca do suco de célulastotal e, assim, 80-85% da matéria seca total permanecem no sobrenadante I desuco de células enriquecido.

Em uma forma de realização, o precipitado I enriquecido comγ-lactonas α-insaturadas, particularmente de partenolídeo, é armazenado natemperatura de > -20°C. Em uma outra forma de realização, o precipitado I ésecado (por exemplo, usando liofilizador ou secador por pulverização ousecados de camada de fluido). Em uma outra forma de realização, oprecipitado I é conservado (por exemplo, com 0,75% de glucono delta lactonae 0,25% de eritrobato de sódio ou com 1,0% de fenótipo) e então armazenadoem condições refrigeradas.

Em uma forma de realização, o partenolídeo contendo oprecipitado I é utilizado para aplicações convencionais de derivados dematricária que são comumente usados na técnica.

Embora o sobrenadante I seja substancialmente livre de γ-lactonas α-insaturadas, particularmente de partenolídeo, a presente invençãopermite a remoção quantitativa destes componentes indesejáveis dosobrenadante sem diminuir suas bioatividades desejáveis.

Em uma forma de realização, a remoção quantitativa de γ-lactonas α-insaturadas residuais, particularmente partenolídeo, é obtidautilizando tratamentos adicionais diferentes do sobrenadante I. Estestratamentos incluem, mas não estão limitados ao seguinte: (i) aumento do pHdo sobrenadante I (6,0 < pH < 10,0), que inicia a precipitação isoelétrica doscomponentes tendo afinidade para γ-lactonas α-insaturadas, particularmentede partenolídeo; (ii) separação dos componentes precipitados usandocentrifugação e/ou precipitação para permitir a concentração dos componentesacima no precipitado II; (iii) ajuste do pH do sobrenadante II obtido para ovalor de pH inicial do suco de células; e (iv) clarificação adicional dosobrenadante II usando centrifugação e/ou filtração ou micro-filtração(tamanho de poro < 0,22 μηι) ou ultrafiltração (corte de peso molecular >10.000 Dalton) para permitir a obtenção do sobrenadante final. O acimaresultou no isolamento do sobrenadante final, que é completamente livre de γ-lactonas α-insaturadas, particularmente de partenolídeo, mas contém todas asbioatividades desejáveis.

Em uma forma de realização, o precipitado II resultante ésecado (por exemplo, usando liofilizador ou secador por pulverização ousecador de leito fluido). Em uma outra forma de realização, o precipitado II éarmazenado em condições de congelamento.

Em uma forma de realização, a estabilização do sobrenadantefinal é completada adicionando conservantes como foi previamente descritona publicação do pedido de patente US 2003/0175235, que é aqui incorporadapor referência em sua totalidade, e incubando a mistura até solubilização totalser obtida. Os conservantes usados incluíram os seguintes: 0,1% de sorbato depotássio, 0,1% de benzoato de sódio, 0,1% metil parabeno de sódio, 0,1% demetabissulfito de sódio e 0,1% de ácido cítrico a 75%. O sobrenadante finalconservado é armazenado em condições ambientes.Em uma forma de realização, o sobrenadante final éconcentrado usando evaporação de diálise ou eletro-diálise ou osmose reversaou combinação das mesmas. A evaporação é selecionada como a técnicapreferível porque ela possibilita que a integridade dos ingredientes bioativosseja preservada sem remoção indesejável de quaisquer componentesdiferentes de água.

Em outra forma de realização, o sobrenadante finalconcentrado, que é uma suspensão na cor marrom escuro opalescente instávelcapaz de formar espontaneamente precipitado de cor bege claro, é misturadocom estabilizador, incluindo, mas não limitado por > 5,0% de glicerina oupentileno glicol (1,2 pentanodiol ou 1,2-di-hidroxipentano).

A presente invenção refere-se ainda a ingredientes bioativosisolados, que são substancialmente livres ou completamente livres de γ-lactonas α-insaturadas, particularmente de partenolídeo, e têm bioatividadesdesejáveis. O precipitado II (ingrediente bioativo A), sobrenadante final(ingrediente bioativo B) e sobrenadante final concentrado (ingredientebioativo C).

Em uma forma de realização, os ingredientes bioativosisolados são combinados com um agente estabilizador. Agentesestabilizadores apropriados particulares podem incluir, sem limitação, umconservante, um antioxidante, e/ou misturas dos mesmos.

Em outra forma de realização, os ingredientes bioativosisolados são concentrados e então estabilizados para outra utilização emcuidado da pele para aplicações orais e tópicas.

Os ingredientes bioativos da presente invenção podem aindaser incluídos em sistemas de liberação que são comumente usados na técnica.

Todos os ingredientes bioativos da presente invenção podemser usados como soluções, suspensões, dispersões, pastas ou pós secadosincorporados em produtos de cuidado da pele, incluindo aplicações tópicas eorais.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos se destinam a ilustrar as formas derealização particulares da presente invenção, mas não devem, de nenhummodo, ser destinados a limitar o escopo da presente invenção.

Exemplo 1 - Preparação de ingredientes bioativos derivados dematricária fresca

Apresenta-se abaixo uma descrição de aspectos relevantes deuma forma de realização do método da presente invenção.

Quantidade suficiente de partes aéreas de matricária fresca(:Tanacetum parthenium) foi colhida no estágio de floração total decrescimento para dar aproximadamente 100 kg de matéria seca. O nível dematéria seca na matricária fresca foi medido como sendo de 23,77%,requerendo a colheita de aproximadamente 420,7 kg de fitomassa de plantafresca para dar 100 k de matéria seca. O cromatograma de HPLC damatricária utilizada é apresentado na figura 2.

Foi tomado cuidado para conservar o teor de umidade inerentede matricária fresa e para impedir o definhamento devido à perda de umidade.A colheita foi conduzida de um modo a impedir ou minimizar cortes,amassamentos e esmagamentos da matricária nova colhida. Todas as etapasforam completadas no período de tempo mais curto possível. Isto foi feitopara minimizar a exposição de matricária fresca ao sol, temperatura elevada, eoutros fatores ambientais negativos.

Então, a etapa de lavagem foi realizada para remover aspartículas de solo e outros resíduos das plantas antes de outro processamento.Ela foi realizado lavando a matricária colhida durante < 5 minutos em < 1kg/cm2 de pressão de água. A lavagem com água residual não contémquaisquer pigmentos verdes ou marrons, indicando pressão de águaapropriada e duração da lavagem. O excesso de água foi removido dafitomassa lavada.

A matricária lavada passou por moagem, maceração eprensagem para obter o teor intracelular (isto é, suco de células) e para separara mesma do material enriquecido em fibras. Um moinho de martelos (modeloVS 35, Vincent Corporation, Tampa, FL) tendo um motor de 5 HP e conjuntode telas foi usado para moer a biomassa para dar partículas de tecido dematricária de tamanho apropriadamente pequeno em uma quantidade maiscurta de tempo e sem aumento significativo da temperatura da biomassa. Omoinho de martelos foi fixado para produzir o tamanho máximo de partículasde planta maceradas de < 2,0 centímetros durante < 10 segundos detratamento. A temperatura da biomassa foi aumentada somente em < 50C.

Uma prensa de parafuso contínua horizontal (Compact PressCP-6, Vincent Corporation, Tampa, FL), equipada com cone suportado por arcomprimido, foi imediatamente usada para obter suco de células de matricáriamacerada. A pressão no cone foi mantida em um nível de > 20 kg/cm , comuma velocidade de parafuso de 12 rpm e somente um aumento de temperaturade >5°C.

Este tratamento deu material enriquecido em fibras e suco decélulas. As partículas de fibra pequenas residuais foram adicionalmenteremovidas do suco de células usando, para sua clarificação, centrífuga defluxo contínuo semi-automática (modelo 12-413V, AML Industries, Inc.,Hatboro, PA) em > 3.000 rpm e tempo de retenção de > 30 s. O precipitadofoi coletado e combinado com material enriquecido em fibras obtido apósprensagem da matricária.

Os processos descritos acima permitiram a produção de 217,2kg de suco de células de matricária tendo um nível de matéria seca de 8,20% e203,5 kg de material enriquecido em fibras tendo nível de matéria seca de40,39%. O cromatograma de HPLC do material enriquecido em fibras éapresentado na figura 3.O suco de células foi então submetido a vários tratamentosincluindo ajuste de pH, radiação de microondas e separação. O pH de suco decélulas de matricária fresco (pH inicial = 5,3) foi ajustado usando um métodode titulação utilizando 3,6 litros de ácido clorídrico (HCl) 5,0 N para diminuiro pH do suco de células para 3,5. Então, o suco de células ajustado foiimediatamente exposto a radiação de microondas usando sistema de fluxocontínuo especialmente projetado tendo freqüência de 2,45 GHz e 3.200 wattde potência de saída (Microwave Research e Applications, Inc., Laurel, MD).

Este sistema foi equipado com agitador de velocidade constante BDC 1850(Caframo Ltd., Wiarton, Ontário, Canadá) e uma sonda de controle detemperatura. Este tratamento continuou até a temperatura do suco de célulasna câmara de microondas alcançar 92°C e então o suco de células tratado foiimediatamente bombeado através de um dispositivo de fluxo contínuo que foiconectado com um resfriador de recirculação de 1 HP (modelo 6106 P,Polyscience Corporation, Niles, IL).

Após a temperatura do suco de células tratado ter diminuídopara < 3O0C, o material foi separado usando uma centrífuga de fluxo contínuoCEPA LE (Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Alemanha) a 15.000 rpm etempo de retenção de > 30 s. A separação de 220,8 kg de suco de célulastratado de 19,2 kg de precipitado em pasta na cor verde escuro (a seguirprecipitado I) tendo o teor de matéria seca de 26,2% e 201,6 kg desobrenadante líquido opalescente levemente na cor marrom (a seguirsobrenadante I) tendo um teor de matéria seca de 6,34%.

O cromatograma de HPLC do precipitado I é apresentado nafigura 4. É notável que o perfil de HPLC mostrado na figura 4 para oprecipitado I é significativamente diferente do perfil de HPLC do extrato dematricária descrito na patente US 6.479.080 (ver figura 1). Assim, acomposição do precipitado I e do extrato de matricária descrito na patente US6.479.080 são significativamente diferentes.O sobrenadante I foi então submetido a outro tratamentoincluindo ajustes de pH e separações. O primeiro ajuste de pH foi induzidousando um método de titulação utilizando 1,07 1 de hidróxido de potássio(KOH) a 50% para aumentar o pH do sobrenadante I do suco de células de 3,5para 9,0. Este tratamento resultou na cor mais escura e opalescente reveladado material que foi imediatamente clarificado usando uma centrífuga de fluxocontínuo CEPA LE (Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Alemanha) a15.000 rpm e tempo de retenção de > 30 s. A separação acima deu 0,55 kg deprecipitado em pasta na cor bege escuro (a seguir precipitado II) tendo 38,2%de teor de matéria seca e 202,12 kg de sobrenadante opalescente levemente nacor marrom (a seguir sobrenadante II) tendo 6,22% de teor de matéria seca.

O cromatograma de HPLC do precipitado II é apresentado nafigura 5. É notável que o perfil de HPLC mostrado na figura 5 para oprecipitado II é significativamente diferente do perfil de HPLC do extrato dematricária descrito na patente US 6.479.080 (ver figura 1). Assim, acomposição do precipitado II e do extrato de matricária descrito na patenteUS 6.479.080 são significativamente diferentes.

O precipitado II continha 0,01% de partenolídeo comodeterminado por análise HPLC representa o ingrediente bioativo A, que ésubstancialmente livre de γ-lactonas α-insaturadas, particularmente departenolídeo.

O sobrenadante II foi submetido à titulação isoelétricautilizando ácido clorídrico (HCl) 5,0 N para retornar o valor de pH para pH =3,5, como existia no sobrenadante I inicial. Este tratamento levou a umaopalescência leve aumentada de material, mas ele foi efetivamente clarificadousando uma centrífuga de fluxo contínuo CEPA LE (Carl PadbergZentrifugenbau GmbH, Alemanha) a 15.000 rpm e tempo de retenção de > 60s. O material clarificado (a seguir, sobrenadante final) continha <0,00007% departenolídeo como determinado por análise HPLC e, assim, de acordo com oslimites de detecção, o sobrenadante final deve ser considerado livre departenolídeo, e particularmente completamente livre de partenolídeo.

A estabilização do sobrenadante final foi obtida adicionando-se conservantes e antioxidante e incubando-se a mistura até a solubilizaçãototal ser obtida. Os conservantes e antioxidante usados incluíram os seguintes:0,1% de sorbato de potássio, 0,1% de benzoato de sódio, 0,1% de sódio metilparabeno, e 0,2% de metabissulfito de sódio. Esta separação resultou naprodução de 201,6 kg de ingrediente bioativo B contendo 6,8% de matériaseca. O rendimento do ingrediente bioativo B de 100 kg de matéria seca dabiomassa de matricária inicial é aproximadamente 12,5 kg de matéria seca.

O cromatograma de HPLC do ingrediente bioativo B éapresentado na figura 6. É notável que o perfil de HPLC mostrado na figura 6para o ingrediente bioativo B é significativamente diferente do perfil deHPLC do extrato de matricária descrito na patente US 6.479.080 (ver figura1). Assim, a composição do ingrediente bioativo B e do extrato de matricáriadescrito na patente US 6.479.080 são significativamente diferentes.

O ingrediente bioativo B também foi concentrado utilizando osistema de evaporação a vácuo Rapid Vac (Labconco, Kanzas City, MO)equipado com oito tubos de 0,6 1, coletor de líquido de 2.550 1 e bomba devácuo de diafragma (modelo 2018B-01), Welch Rietsche Thomas, Skokie,IL). Usando pressão de operação = 100 mBar, temperatura = 60°C evelocidade de vórtice = 40%, o ingrediente bioativo B foi concentrado emciclos de 90 minutos para produzir 63,16 1 totais (ou 70,11 kg) de materialconcentrado tendo 19,89% de matéria seca. Então, 5,0% (p/p) de pentilenoglicol foram adicionados ao material concentrado e após misturaçãomoderada durante > 60 s líquido resultante marrom escuro transparente:ingrediente bioativo C foi produzido. O ingrediente bioativo C continha<0,00007% de partenolídeo como determinado por análise HPLC e, assim, deacordo com os limites de detecção, o ingrediente bioativo C acima deve serconsiderado livre de partenolídeo, e particularmente completamente livre departenolídeo.

O cromatograma de HPLC do ingrediente bioativo C éapresentado na figura 7. É notável que o perfil de HPLC mostrado na figura 7para ingrediente bioativo C é significativamente diferente do perfil de HPLCdo extrato de matricária descrito na patente US 6.479.080 (ver figura 1).Assim, a composição do ingrediente bioativo C e do extrato de matricáriadescrito na patente US 6.479.080 são significantemente diferentes.Exemplo 2 - Características e propriedades de ingrediente bioativo B

Ingrediente bioativo B foi preparado de acordo com o processodescrito acima no exemplo 1. Análises de ingrediente bioativo B foramconduzidas para determinar suas várias características físico-químicas,químicas, e microbianas.

As características físico-químicas e químicas selecionadas deingrediente bioativo B são apresentadas abaixo na tabela 1.

Tabela 1 - Características físico-químicas e químicas de ingredientebioativo B

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Ingrediente bioativo B é prontamente solúvel em água emqualquer proporção.

Tabela 2 abaixo descreve as características microbianas deingrediente bioativo B. Estes dados demonstram que o ingrediente bioativo Batende às exigências da indústria para o cuidado da pele com relação àcontagem de placas total, contagem de mofo e levedura, e ausência depatógenos.

Tabela 2 - Características microbianas de ingrediente bioativo B

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* Unidades formadoras de colônia

Os resultados de testes de eficácia antimicrobiana apresentadosna tabela 3 abaixo indicam, que o ingrediente bioativo B tem um sistemaefetivo de conservantes.

Tabela 3 - Resultados de testes de eficácia antimicrobiana de ingredientebioativo B

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Tabela 4 inclui os dados relacionados para atividadesàntiinflamatórias e antioxidantes de ingrediente bioativo Β. A atividadeantiinflamatória foi determinada usando teste de elastase de neutrófiloshumanos e a atividade antioxidante foi determinada usando teste de reduçãode citocromo c.

Tabela 4 - Atividades antiinflamatórias e antioxidantes de ingredientebioativo B

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O ingrediente bioativo B foi determinado como sendo estável(isto é, mantendo integridade física e química) durante pelo menos 12 mesesenquanto armazenado em uma temperatura entre 15 e 25°C em um recipientefechado protegido da luz.

Exemplo 3 - Características e propriedades de ingrediente bioativo C

O ingrediente bioativo C foi preparado de acordo com oprocesso descrito acima no exemplo 1. Análises de ingrediente bioativo Cforam conduzidas para determinar suas várias características físico-químicas,químicas, microbianas, e bioatividades.

As características físico-químicas e químicas selecionadas deingrediente bioativo C são apresentadas abaixo na tabela 5.

Tabela 5 - Características físico-químicas e químicas de ingredientebioativo C

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O ingrediente bioativo C é facilmente solúvel em água emqualquer proporção.

Tabela 6 abaixo descreve as características microbianas deingrediente bioativo C. Estes dados demonstram que o ingrediente bioativo Catende às exigências da indústria de cuidado da pele com relação à contagemde placa total, contagem de mofo e levedura, e ausência de patógenos.

Tabela 6 - Características microbianas de ingrediente bioativo C

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* Unidades formadoras de colônia

Tabela 7 refere-se às atividades antiinflamatórias eantioxidantes de ingrediente bioativo C. A atividade antiinflamatória foideterminada usando teste de elastase de neutrófilos humanos e a atividadeantioxidante foi determinada usando teste de redução de citocromo c.

Tabela 7 - Atividades biológicas de ingrediente bioativo C

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O ingrediente bioativo C foi determinado como sendo estável(isto é, mantendo integridade física e química) durante pelo menos 12 mesesenquanto armazenado em uma temperatura entre 15 e 25°C em um recipientefechado protegido de luz.

Exemplo 4 - Características e propriedades de ingrediente bioativo A

O ingrediente bioativo A foi preparado de acordo com oprocesso descrito acima no exemplo 1. Análises de ingrediente bioativo Aforam conduzidas para determinar suas várias características físico-químicas,químicas, microbianas e bioatividade.

As características físico-químicas e químicas selecionadas deingrediente bioativo A são apresentadas abaixo na tabela 8.

Tabela 8 - Características físico-químicas e químicas de ingredientebioativo A

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Tabela 9 abaixo descreve as características microbianas deingrediente bioativo A. Estes dados demonstram que o ingrediente bioativo Aatende às exigências da indústria de cuidado da pele com relação à contagemde placa total, contagem de mofo e levedura, e ausência de patógenos.Tabela 9 - Características microbianas de ingrediente bioativo A

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* Unidades formadoras de colônia

Tabela 10 refere-se às atividades antiinflamatórias eantioxidantes de ingrediente bioativo A. A atividade antiinflamatória foideterminada usando elastase de neutrófilos humanos e a atividadeantioxidante foi determinada usando teste de redução citocromo c.

Tabela 10 - Atividades biológicas de ingrediente bioativo A<table>table see original document page 43</column></row><table>

O ingrediente bioativo A foi determinado para ser estável (istoé, mantendo integridade física e química) durante pelo menos 12 mesesenquanto armazenado em freezer em um recipiente fechado protegido de luz.Exemplo 5 - Comparação de ingredientes bioativos obtidos de matricáriacoletada de colheitas diferentes e em estações diferentes

A reprodutibilidade de ingredientes bioativos foi analisadautilizando matricária fresca que foi colhida em duas estações consecutivas dosmesmos campos. Adicionalmente matricária fresca foi colhida duas vezes porestação no mesmo estágio de crescimento. Todas as amostras de biomassa dematricária fresca acima foram processadas utilizando o método descrito acimano exemplo 1. Os dados relacionados para a comparação do rendimento,características selecionadas e propriedades de ingredientes bioativos BeCsão apresentados abaixo. (Os dados relacionados com o ingrediente bioativoA não são incluídos no exemplo, porque este ingrediente resultou em umrendimento muito pequeno).

Verificou-se, que, a partir de uma quantidade de matricáriapara dar 100 kg de material seco, aproximadamente 12,4 ± 2,1 kg de materialseco ingrediente bioativo foram produzidos. O material seco em média embiomassa de matricária fresca ~ 20% e assim ~ 190 kg de ingrediente bioativoB ou ~ 62 kg de ingrediente bioativo C puderam ser obtidos.

Não foi verificada uma diferença significante entre orendimento de ingredientes bioativos obtidos da primeira e segunda colheita(valor ρ = 0,8893) e entre ingredientes bioativos obtidos em duas estaçõesconsecutivas (valor ρ = 0,6531). Adicionalmente, não foi verificada umadiferença significante entre o teor de material seco em ingredientes bioativos(valor ρ = 0,5334) e teor de partenolídeo em ingredientes acima (valor ρ =0,9923).

As características físico-químicas e químicas selecionadas deingredientes bioativos, que foram obtidos de matricária fresca coletada decolheitas diferentes e em estações diferentes, são apresentadas abaixo natabela 11 sugerindo uma reprodutibilidade elevada de ingrediente bioativo B eingrediente bioativo C.

Tabela 11 - Reprodutibilidade de ingredientes bioativos obtidos dematricária coletada de colheitas diferentes e em estações diferentes

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Deve-se notar que o teor de partenolídeo de ingredientesbioativos estava abaixo do limite de detecção de procedimento analíticoHPLC utilizado.

Tabela 12 abaixo descreve as características microbianas deingredientes bioativos. Estes dados demonstram que os ingredientes bioativosobtidos de matricária coletada de colheitas diferentes e em estações diferentesatendem às exigências da indústria de cuidado da pele com relação àcontagem de placa total, contagem de mofo e levedura, e ausência depatógenos.

Tabela 12 - Características microbianas de ingredientes bioativos obtidosde matricária coletada de colheitas diferentes e em estações diferentes

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* Unidades formadoras de colônia.

Tabela 13 refere-se às atividades antiinflamatórias eantioxidantes de ingredientes bioativos. A atividade antiinflamatória foideterminada usando teste de elastase de neutrófilos humanos e a atividadeantioxidante foi determinada usando teste de redução de citocromo c. Não foiencontrada uma diferença significante entre as atividades de ingredientesbioativos obtidos de matricária fresca coletada de colheitas diferentes e emestações diferentes sugerindo uma reprodutibilidade elevada de ingredientebioativo B e ingrediente bioativo C.

Tabela 13 - Reprodutibilidade de atividades biológicas de ingredientesbioativos obtidos de matricária coletada de colheitas diferentes e emestações diferentes

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Os ingredientes bioativos obtidos de matricária coletada decolheitas diferentes e em estações diferentes foram determinados como sendoestáveis (isto é, mantendo integridade física e química) durante pelo menos 12meses quando armazenada em congelador em um recipiente fechadoprotegido da luz.

Exemplo 6 - Protocolos usados para determinar determinadascaracterísticas de ingredientes bioativos

Os seguintes são vários métodos usados para determinar certascaracterísticas de ingredientes bioativos. Estes métodos foram referidoscompletamente nos exemplos acima. As referências abaixo para os "produtostestados" ou as "amostras de teste" referem-se aos ingredientes bioativos.Método para determinação de material seco:

O procedimento para determinação de material seco incluía aevaporação do produto testado no banho d'água a IOO0C até completarevaporação de água, armazenamento em forno da amostra a 105°C durante 3horas, resfriamento em temperatura ambiente, e determinação imediata dopeso do recipiente com material sólido.Método para determinação de valores L*a*b*:

O procedimento para determinação de valores L*a*b*utilizaram colorímetro de geometria fixa Hunter Labscan com uma geometriade 0745°. Iluminante D65 padrão com uma janela de mostrador voltada paracima foi usado. O recipiente com ingrediente bioativo testado foi colocado najanela de mostrador e medido através do fundo. As seguintes equaçõesCIELAB foram usadas:

C* = (a*2 + b*2)'ÁDE* = [(DL)2 + (Da*)2 + (Db*)2]*DH = [(DE*)2 - (DL*)2 - (DC*)2f

Método para determinação de teor de partenolídeo:

As amostras foram extraídas usando metanol e tratamentoultra-sônico de 30 min. A coluna de fase reversa Cl8 foi usada como a faseestacionária e 44% de acetonitrila: 56% de água e 0,1% de ácido fosfóricoforam usados como uma fase móvel. A detecção de partenolídeo foi a 225 nme concentrações de partenolídeo foram determinadas usando uma curva decalibração de múltiplos pontos revelada com seis padrões de partenolídeo(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO) na faixa de 30 μg/g a 900 μg/g.O limite de detecção sob estas condições é de 0,7 μg/ml. Cerca de 30 μg/g departenolídeo podem ser quantificados usando este conjunto de condições.

Método para determinação de características microbiológicas:

As características microbiológicas de amostras testadas foramdeterminadas de acordo com o método da Farmacopéia Americana (USP)UPS XXVII, NF 22, <61>, Microbiological Limit Tests, que é incorporadoaqui por referência em sua totalidade. Os testes acima incluem contagemaeróbica total, mofos e levedura totais (contagem de placa aeróbica),determinação de Salmonella (sp.), E. coli, Staphylococcus aureus ePseudomonas sp.

Estudos de desafio com os conservantes foram realizadosusando método USP XXVII, NF 22, <51>, Antimicrobial Effective Testing,pp. 2148 - 2150, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.Incubação dos artigos de teste inoculados foi realizada a 20 a 25°C e testadosem intervalos de tempo de 7, 14, 21 e 28 dias.

Método para determinação de atividade inibidora de elastase:

A atividade inibidora de elastase de ingredientes bioativostestados foi determinada usando o teste, que emprega elastase de neutrófiloshumanos (Elastin Products Company, Inc., Owenswille, MO) e substratosolúvel de peptídeo sintético N-MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p-NA (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO). Este teste inclui procedimentomodificado como descrito em Elastin Products Company's Catalog,"Determination of human elastase activity," Research Biochemical Catalog,Elasting Product Company, Inc., Owensville, MO, pagina 84 (2004), que éincorporado aqui por referência em sua totalidade. A clivagem enzimática dosubstrato foi medida a 410 nm e 25°C usando 0,1 M de tampão Tris-HCl pH7,5 contendo 50 mM de NaCl. O volume total de meio de reação na cubeta doespectrofotômetro foi de 3,0 mL. Cada ingrediente bioativo testado foi testadoem concentrações requeridas para obter 50% de inibição (IC5o) de velocidadede reação enzimática.

Método para determinação de atividade de remoção de superóxido:

O método usado foi com base no procedimento descrito noartigo Quick et al., "Rapid microplate assay for superoxide scavengingeficiency," J. Neuroscience Methods, 97: 139 - 144 (2000), que é incorporadoaqui por referência em sua totalidade.

Este teste permitiu um teste rápido e preciso de ingredientesbioativos para determinar a atividade antioxidante comparativa de remoção desuperóxido. O teste incluiu hipoxantina, xantina oxidase e citocromo e.Hipoxantina serviu como o substrato e foi metabolisada por xantina oxidaseem um processo de duas etapas, produzindo dois ânions superóxido. Estesânions livres reduziram citocromo c, resultando em um aumento de piconotável a 550 nm. O volume total de meio de reação na cubeta doespectrofotômetro foi de 3,0 mL.

Apesar de formas de realização preferidas terem sidoapresentadas e descritas em detalhes aqui, será evidente para os versados natécnica relevante que várias modificações, adições, substituições e outros,podem ser feitos sem sair do espírito da invenção e que estes são, assim,considerados como estando dentro do escopo da invenção como definida nasreivindicações que seguem.

Claims (22)

1. Ingrediente bioativo, caracterizado pelo fato decompreender:uma fração bioativa isolada derivada do suco de células debiomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetum parthenium), em quereferida fração bioativa é livre de ou substancialmente livre de γ-lactonas a-insaturadas, referidas γ-lactonas α-insaturadas compreendendo partenolídeo, eem que referida fração bioativa tem atividade antiinflamatória e antioxidante.

2. Ingrediente bioativo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a fração bioativa é livre de partenolídeo.

3. Ingrediente bioativo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a fração bioativa é substancialmente livre departenolídeo.

4. Ingrediente bioativo de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a fração bioativa tem uma concentração departenolídeo igual a ou menor do que cerca de 0,01 porcento em peso.

5. Ingrediente bioativo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a fração bioativa tem uma atividadeantiinflamatória na faixa de um valor IC50 de entre cerca de 0,01 porcento(volume em volume) e cerca de 2,0 porcento (volume em volume), em quereferido valor IC50 representa a concentração de ingrediente bioativorequerida para diminuir a velocidade de reação enzimática de elastase em 50porcento.

6. Ingrediente bioativo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a fração bioativa tem uma atividadeantioxidante na faixa de um valor IC50 de entre cerca de 0,007 porcento(volume em volume) e cerca de 1,0 porcento (volume em volume), em quereferido valor IC50 representa a concentração de ingrediente bioativorequerida para diminuir a velocidade de redução de citocromo c em 50porcento.

7. Ingrediente bioativo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de ainda compreender um agente estabilizante.

8. Método para isolar uma fração bioativa que é derivada dosuco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária (Tanacetumparthenium), e que é substancialmente livre de γ-lactonas a-insaturadas,caracterizado pelo fato de compreender:prover biomassa fresca de uma planta de matricária(Tanacetum parthenium);processar a biomassa fresca sob condições efetivas para darum sobrenadante de suco de células e uma fração de membrana;tratar o sobrenadante do suco de células sob condições efetivaspara dar um primeiro sobrenadante de soro de suco de células e umprecipitado de fração de citoplasma, eisolar o precipitado de fração de citoplasma, em que referidoprecipitado de fração de citoplasma é uma fração bioativa que ésubstancialmente livre de γ-lactonas α-insaturadas, em que referidas γ-lactonas α-insaturadas compreendem partenolídeo.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que a etapa de processar a biomassa fresca compreende:separar a biomassa fresca em um componente de suco decélulas e um material enriquecido em fibras;clarificar o componente de suco de células para dar umcomponente de suco de células clarificado; eseparar o componente de suco de células clarificado nosobrenadante de suco de células e a fração de membrana.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de ainda compreender:clarificar o primeiro sobrenadante de soro de suco de célulassob condições efetivas para dar um segundo sobrenadante de soro de suco decélulas;misturar um agente estabilizante com o segundo sobrenadantede soro de suco de células sob condições efetivas para dar uma fração de sorode suco de células estabilizada,em que referida fração de soro de suco de células estabilizadaé uma fração bioativa que é substancialmente livre de γ-lactonas a-insaturadas, referidas γ-lactonas α-insaturadas compreendendo partenolídeo.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de ainda compreender:concentrar a fração de soro de suco de células estabilizada sobcondições efetivas para dar um sobrenadante de soro de suco de célulasconcentrado.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de ainda compreender:misturar um agente estabilizante com o sobrenadante de sorode suco de células concentrado sob condições efetivas para dar uma fração desoro de suco de células concentrada estabilizada,em que referida fração de soro de suco de células concentradaestabilizada é uma fração bioativa que é livre de γ-lactonas a-insaturadas,referidas γ-lactonas α-insaturadas compreendendo partenolídeo.

13. Ingrediente bioativo, caracterizado pelo fato decompreender o precipitado de fração de citoplasma produzido de acordo como método da reivindicação 8, em que referido precipitado de fração decitoplasma é uma fração bioativa que é substancialmente livre de γ-lactonasα-insaturadas, referidas γ-lactonas α-insaturadas compreendendo partenolídeo.

14. Ingrediente bioativo, caracterizado pelo fato decompreender a fração de soro de suco de células estabilizada produzida deacordo com a reivindicação 10, em que referida fração de soro de suco decélulas estabilizada é uma fração bioativa que é substancialmente livre de γ-lactonas α-insaturadas, referidas γ-lactonas α-insaturadas compreendendopartenolídeo.

15. Ingrediente bioativo de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que referida fração de soro de suco de célulasestabilizada tem uma atividade antiinflamatória na faixa de um valor IC50 deentre cerca de 0,01 porcento (volume em volume) e cerca de 2,0 porcento(volume em volume), em que referido valor IC50 representa a construção deingrediente bioativo requerido para diminuir a velocidade da reaçãoenzimática de elastase em 50 porcento.

16. Ingrediente bioativo de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que referida fração de soro de suco de célulasestabilizada tem uma atividade antioxidante na faixa de um valor IC50 de entrecerca de 0,007 porcento (volume em volume) e cerca de 1,0 porcento (volumeem volume), em que referido valor IC50 representa a concentração deingrediente bioativo requerido para diminuir a velocidade de redução decitocromo c em 50 porcento.

17. Ingrediente bioativo, caracterizado pelo fato decompreender a fração de soro de suco de células concentrada estabilizadaproduzida de acordo com a reivindicação 12, em que referida fração de sorode suco de células concentrada estabilizada é uma fração bioativa que é livrede γ-lactonas α-insaturadas, referidas γ-lactonas α-insaturadas compreendendopartenolídeo.

18. Ingrediente bioativo de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que referida fração de soro de suco de célulasconcentrada estabilizada tem uma atividade antiinflamatória na faixa de umvalor IC50 de entre cerca de 0,01 porcento (volume em volume) e cerca de 2,0porcento (volume em volume), em que referido valor IC50 representa aconcentração de ingrediente bioativo requerida para diminuir a velocidade dereação enzimática de elastase em 50 porcento.

19. Ingrediente bioativo de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que referida fração de soro de suco de célulasconcentrada estabilizada tem uma atividade antioxidante na faixa de um valorIC50 de entre cerca de 0,007 porcento (volume em volume) e cerca de 1,0porcento (volume em volume), em que referido valor IC50 representa aconcentração de ingrediente bioativo requerida para diminuir a velocidade deredução de citocromo c em 50 porcento.

20. Composição bioativa, caracterizada pelo fato decompreender:uma mistura de uma ou mais frações bioativas isoladasderivadas de suco de células de biomassa fresca de uma planta de matricária{Tanacetum parthenium), em que as frações bioativas são cada ou livres de ousubstancialmente livres de γ-lactonas α-insaturadas, referidas γ-lactonas α-insaturadas compreendendo partenolídeo, e em que as frações bioativas tematividade antiinflamatória e antioxidante.

21. Composição bioativa de acordo com a reivindicação 20,caracterizada pelo fato de que a uma ou mais frações bioativas isoladascompreende frações bioativas selecionadas dentre o grupo consistindo desobrenadante I, sobrenadante II, precipitado II (ingrediente bioativo A),sobrenadante final, ingrediente bioativo B, sobrenadante final concentrado, eingrediente bioativo C.

22. Composição bioativa de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de ainda compreender um agente estabilizante.