CN101453898A - 源自野甘菊的不含有小白菊内酯的生物活性成分及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物活性成分，该生物活性成分含有源自野甘菊植物的鲜生物量的细胞汁的分离的生物活性组分。所述生物活性组分不含有或基本不含有α－不饱和γ－内酯(例如，小白菊内酯)。此外，所述生物活性组分具有抗炎性和抗氧化活性。本发明还涉及一种生物活性组分的分离方法，该生物活性组分源自野甘菊(Tanacetum parthenium)植物的鲜生物量的细胞汁，并且该生物活性组分至少基本不含有α－不饱和γ－内酯(例如，小白菊内酯)。本发明还涉及一种稳定的细胞汁浆组分和稳定的浓缩的细胞汁浆组分的制备方法，所述稳定的细胞汁浆组分和稳定的浓缩的细胞汁浆组分不含有α－不饱和γ－内酯(例如，小白菊内酯)。本发明还涉及一种生物活性组合物，该组合物包括一种或多种本发明分离的生物活性组分的混合物。

Description

源自野甘菊的不含有小白菊内酯的生物活性成分及其制备方法
本申请要求于2006年2月21日提交的美国临时专利申请NO.60/775257的优先权，并将该临时专利申请的全部内容以引用的方式并入本申请中。
技术领域
本发明涉及生物活性成分，该生物活性成分包括源自野甘菊(Tanacetumparthenium)植物的鲜生物量的细胞汁的分离的生物活性组分。所述生物活性组分不含有或基本不含有α-不饱和γ-内酯(例如，小白菊内酯)，并具有抗炎性和抗氧化活性。本发明还涉及所述生物活性成分的制备方法。本发明还涉及一种生物活性组合物，该组合物包括一种或多种本发明分离的生物活性组分的混合物。
背景技术
野甘菊L.Schulz-Bip(别名Chrysanthemum parthenium、Leicanthemumparthenium、Matricaria parthenium、Pyrethrum parthenium)是一种属于菊科(Compositae、Asteraceae、Matricaria或雏菊)的植物。已知野甘菊具有以下通用名：阿尔塔米拉(altamisa)、amargosa、矢车菊(bachelor′s buttons)、盛夏雏菊(featherfew)、featherfoil、退热植物(febrifuge plant)、野甘菊(feverfew)、flirtwort、grande camomille、曼萨尼利亚草(manzanilla)、母菊(matricaria)、仲夏雏菊(midsummer daisy)、moederkruid、圣玛丽亚(Santa Maria)、和varadika。在这些通用名中，名称“野甘菊”是最常用的。
野甘菊是一种矮多年生植物，高15-80厘米。茎直立，具沟且多毛。叶片为具有锯齿边缘的双分裂的羽毛状绿色叶片。花具有白色辐射状花瓣和扁平的黄色芯。打碎时，所述植物的气味强烈、芳香且具有苦味。野甘菊存活了至少2000年，是巴尔干半岛和高加索山脉的当地植物。目前，野甘菊生长在欧洲、北美、南美、北非、中国、日本和澳大利亚。适于野甘菊栽培的最适条件为：pH＝6.0...6.7(最适pH＝6.3)的排水良好的土壤；全日照或部分荫蔽；在未保护的情况下，适合于美国农业部温度带9-5的锻炼。适于野甘菊的最佳气候条件为5带和7带。虽然在大陆性气候下(例如，堪萨斯州，美国；萨克其万，加拿大)野甘菊通常被认为是一年生植物，在有保护的情况下，野甘菊也可以种植在3带和4带。
远古的希腊人和早期的欧洲人使用野甘菊治疗发热、发炎和肿胀，并用于驱除昆虫以及治疗叮咬和蛰伤。在过去的20年中，野甘菊在偏头痛、关节炎、和炎性疾病的治疗方面引起了相当大的兴趣。所述被利用的的部分为干的或新鲜的叶以及地上的开花部分。野甘菊的使用形式为粗制草药、干粉、鲜叶、冷冻干燥的叶胶囊、干叶胶囊、软凝胶胶囊、酊剂(tincture)、浸剂(infusion)(例如，茶)、提取物、和功能饮料成分。看起来，野甘菊全株的作用与非类固醇类抗炎药相似。然而，野甘菊提取物的作用与肾上腺皮质素更相似(见，例如，Feverfew.Botanical Monograph，American Journal of NaturalMedicine 4(6)：28-29(1997))。
这种差异与广谱活性引起了关于植物活性成分及其衍生物的关注和研究。已知的野甘菊中的活性化学物质为倍半萜内酯(总含量≤1.8％)和精油(总含量≤0.07％)。野甘菊活性化合物的列表包括以下化合物：(i)倍半萜内酯(包括清艾菊素、卡南(canin)、10-表-卡南(10-epi-canin)、chrysanthemolide、chrysanthemonin、环氧嵩淀粉(epoxyartemorin)、1β-羟基矮艾素(1β-hydroxyarbusculin)、3β-羟基小白菊内酯、8β-羟基喘诺木烯内酯(8β-hydroxyreynosin)、magnoliolide、小白菊内酯、喘诺木烯内酯、裂叶苣荚莱内酯、开环-塔纳小白菊内酯A、tanaparthin、tanapathin-1α、4α-环氧化物、tanaparthin-1β、4β-环氧化物))；(ii)倍半萜(包括樟脑、法呢烯、和吉玛烯)；(iii)一贴类；(iv)黄酮醇(包括tanetin、山奈酚(kaempherol)、万寿菊黄素、芹菜素、木犀草素、和金圣草黄素(chrysoeritol))；和(v)螺酮缩醇烯醇醚polyines(spiroketal enol ether polyines)。
这些化合物最丰富的组为α-不饱和γ-内酯；特别是小白菊内酯，其代表了85％的α-不饱和γ-内酯。位于野甘菊叶表面的油细胞中的小白菊内酯是最为公知的且研究最为充分的(例如，见Smith等，J.Chromatogr.，627：255(1992)；和Smith，R.M.，LC GC Int.，(Jan.8-15，1996))。包括小白菊内酯在内的α-不饱和γ-内酯被认为是与野甘菊的生物活性有关的基本成分，但同样与由野甘菊衍生物引起的致敏反应有关的成分相同。
例如，成功地用于临床试验的野甘菊制剂的野甘菊含量为0.4％-0.66％，该含量超出了能够引发溃疡、渗出性皮炎、以及由外部接触引发的病理作用的浓度(例如，见，Awang，D.V.C.，＂Feverfew，＂Can.Pharm.J，122：266-270(1989))。同时，大约10-18％的野甘菊的使用者报告具有一些较轻的及可逆的不良反应(例如，见，Ernst等，＂The efficacy and safety of feverfew(Tanacetum parthenium L.)：an update of a systematic review，＂Public HealthNutrition，3(4a)：509-514(2000)；Porter等，＂Feverfew in Saskatchewan，＂(www.agr.gov.sk.ca/DOCS/crops/special_crops/feverfew.asp？firstPick＝&secondpck＝&thirdpick＝Production％20Information)(2004))，并且小白菊内酯能够对这些不良反应起作用。α-不饱和γ-内酯触发多种致敏反应的能力已经被充分地证明(例如，见，Arch.Dermatol.Forsch，251(3)：235-244(1975)；Arch.Dermatol.Forsch，255(2)：111-121(1976)；Contact Dermatitis，38(4)：207-208(1988)；Am.J.Contact Dermatol，1：49-50(1998-1999)；Br.J.Dermatol，132(4)543-547(1995))。
近些年，关于野甘菊提取物的制备方面作出了很大的努力，其目的是为了所述提取物基本上不含有α-不饱和γ-内酯，更具体地，基本上不含小白菊内酯。例如，见，美国专利No.6,224,875和美国专利No.6,479,080)。应该注意的是，“基本上不含有α-不饱和γ-内酯”和“基本上不含有小白菊内酯”是指α-不饱和γ-内酯或小白菊内酯的重量含量分别低于0.1％、更优选低于0.09％、进一步优选低于0.07％的提取物。由于上述含量低于具有0.4-1.8％的小白菊内酯的野甘菊植物量中的平均含量(例如，见，Marino L.，＂The effect ofclonal micropropagation on parthenolide content in two genotypes of feverfew，Tanacetum parthenium，＂AgroFarm Technologies Feverfew Report，London，Ontario(2004))，因而，需要使用多种有机溶剂以及提纯的多个复杂提取步骤(包括完全脱去溶剂以及离子交换树脂的使用)，以生成具有降低含量的α-不饱和γ-内酯、特别是小白菊内酯的提取物。
通过包括以下步骤的方法可以从干野甘菊植物量中得到上文提及的有机溶剂提取物：(a)通过丙酮、乙醇、或这些溶剂与水的混合物从所述植物的地上部分提取大量的植物材料；(b)通过碳氢化合物溶剂对步骤(a)中的所述材料进行提取；(c)通过非极性溶剂对剩余的非碳氢化合物相进行提取；(d)蒸发所述非极性溶剂萃取物，并使位于水-乙醇溶液中的残留物再溶解，然后通过强碱树脂对再溶解的残留物进行处理；(e)通过乙醇洗脱所述树脂并将洗脱溶液去除掉；(f)通过乙醇的或水-乙醇的酸溶液对所述树脂进行处理，使所述溶液浓缩并通过非极性溶剂对所述结果残留物进行提取；(g)从步骤(f)中蒸发出非极性溶剂以形成残留物，该残留物被加入到从步骤(b)中碳氢化合物提取物的蒸发得到的残留物中，以及被加入到通过步骤(c)的非极性溶剂的萃取后得到的丙酮或乙醇相中；和(h)蒸发出所述溶剂并对剩余的残留物进行干燥。
用于多个提取步骤的优选的溶剂包括但不限制于以下溶剂：用于步骤(a)的溶剂：丙酮、甲醇、乙醇或它们与水的混合物；用于步骤(b)的溶剂：己烷、正戊烷、石油醚、石脑油(ligroin)；用于步骤(c)的溶剂：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯，优选二氯甲烷；和用于步骤(f)的溶剂：乙酸乙酯。
根据美国专利Nos.6,224,875和6,479,080，“基本不含有小白菊内酯”的提取物具有良好的药理学性能，并且减少了引发致敏性反应的危险。然而，上述提取物是通过使用有机溶剂顺序加工而分离的，这些加工属于四种不同的类型，这限制了其与多种常规的皮肤保护制剂组分的相溶性。因此，上述提取物作为皮肤保护产品成分的应用受到了一定的限制(例如，不易溶于水)。
虽然描述的野甘菊提取物“基本上不含有小白菊内酯”，但是由于允许含有残留的小白菊内酯，所述野甘菊提取物并不是真正地不含有小白菊内酯的材料。小白菊内酯本身的众所周知的高比活性可以促成药理性质和提取物的残余抗原性，特别是在高浓度使用时。重要的是，上述提取物的药理性质仅受到在确定条件下溶解在确定溶剂中的那些野甘菊成分的活性的限制。因此，这样的提取物仅表示存在于活体野甘菊植物中的部分活性组分。例如，与安慰剂相比，冷冻干燥的野甘菊叶和干燥的叶证实了显著的有益效果，但野甘菊的乙醇提取物没有效果(例如，见，Ernst等，＂The efficacy and safety offeverfew(Tanacetum parthenium L.)：An update of a systematic review，＂PublicHealth Nutrition，3(4a)：509-514(2000))。
关于在不同形式的野甘菊产品的比活性的比较，应该注意的是完全的干燥叶被证明比其提取物更为有效，并且干燥的和鲜的野甘菊在药理学效力及分布上显示出显著差异(例如，见，Barsby等，＂Feverfew and vascular smoothmuscle：Extracts from fresh and dried plants show opposing pharmacologicalprofiles，dependent upon sesquiterpene lactone content，＂Planta Medica，59：20-25(1993))。因此，与干燥的叶提取物相关而又不同的鲜叶提取物具有：(a)在浓度相关的方法中的电压依从性钾电流的降低的钝化；(b)血栓素B2和白细胞三烯B4的白细胞产物的剂量依从性抑制；和(c)对退黑素、血栓素、和降低的乙酰胆碱诱导的舒张的抑制的肌肉反应。
有趣的是，使野甘菊产物的效能最大化的强烈愿望导致了近期含有受植物的加工过程影响最小的所有植物成分的产物的产量提高。这些产物为冷冻干燥的野甘菊叶制剂，虽然这样的材料适用于受限制的应用，但皮肤保护并不在其中。
此外，野甘菊提取物的活性和位于这些提取物中的小白菊内酯水平取决于溶剂和所用的提取方法的选择(例如，见，Kaplan，M.，＂Comparison ofSupercritical Fluid and Solvent Extraction of Feverfew(Tanacetum parthenium)＂Turk J.Chem，26：473-480(2002))。因此，通过溶剂萃取和超临界流体的萃取而得到的材料不同。例如，与氯仿提取物相比，超临界流体CO2提取物的小白菊内酯的含量更高，并且在后续的丙酮提取物中更高。
根据植物材料的来源以及栽培和收获条件，野甘菊的组成显著不同。业已发现小白菊内酯含量的巨大改变。例如，美国生长的植物含有的小白菊内酯浓度为在英国和法国生长的植物的小白菊内酯浓度的≤50％。与灌溉的野甘菊相比，干燥土地的野甘菊的小白菊内酯含量更高。发现，用单一的水分胁迫事件处理野甘菊能够提高小白菊内酯的含量(Fonseca等，＂Parthenolideand abscisic acid synthesis in feverfew are associated but environmental factorsaffect them dissimilarly，＂J.Plant Physiology，162，：485-494(2005))。花所含的小白菊内酯的水平最高，茎所含的小白菊内酯的水平最低。如果延迟收获，则花中小白菊内酯的含量升高，茎和叶中的小白菊内酯的含量降低。下午收获的野甘菊中小白菊内酯的含量显著高于早晨收获的野甘菊中小白菊内酯的含量，并且，野甘菊暴露在紫外光下导致了小白菊内酯含量的显著降低。应该注意的是，在野甘菊衍生物中的小白菊内酯的含量的广泛的改变可以是两种主要因素：栽培条件和加工方法，相互作用的本质结果。不过，美国专利Nos.6,224,875和6,479,080并没有提供与“基本不含有小白菊内酯”的野甘菊提取物的重复性相关的任何信息。然而，如上文所描述的，原料的巨大改变可以显著地影响提取物的性质。
因此，存在很多遗传的、地理的、气候的、和技术的因素，这些因素导致了较差的重复性以及使其质量低于常规野甘菊产物和提取物的最佳质量(例如，见，Hepinstall等，＂Parthenolide content and bioactivity of feverfew(Tanacetum parthenium(L.)Schultz-Bip.).Estimation of commercial andauthenticated feverfew products，＂J.Pharm.Pharmacol.，44：391-395(1992)；Draves，A.H.and S.E.Walker，＂Parthenolide Content of Canadian CommericalFeverfew Preparations：Label Claims are Misleading in Most Cases，＂CanadianPharm J，136(10)：23-30(Dec.2003/Jan.2004))，这些因素使野甘菊衍生物在草药和皮肤保护领域的广泛应用产生了严重的问题。
因此，需要一种高重复性的和不含有小白菊内酯的野甘菊衍生物的制备方法，所述野甘菊衍生物具有广谱的所需要的生物活性，这些活性不仅仅限于与确定的溶剂有关的活性，即，不受到常规化学提取的限制。
发明内容
本发明涉及生物活性成分，该成分含有：源自野甘菊植物的鲜生物量的细胞汁的分离的生物活性组分。所述生物活性组分不含有或基本不含有α-不饱和γ-内酯(例如，小白菊内酯)。此外，所述生物活性组分具有抗炎性和抗氧化活性。
本发明还涉及一种生物活性组分的分离方法，该生物活性组分源自野甘菊植物的鲜生物量的细胞汁，并且该生物活性组分基本不含有α-不饱和γ-内酯(例如，小白菊内酯)。该方法包括提供野甘菊植物的鲜生物量。在能够有效地生成细胞汁上清液以及膜组分的条件下对鲜生物量进行加工。在能够有效地生成第一细胞汁浆上清液以及细胞质组分沉淀物的条件下对细胞汁上清液进行处理。然后，对细胞质组分沉淀物进行分离，其中，所述细胞质沉淀物为生物活性组分，该生物活性组分基本不含有α-不饱和γ-内酯。本发明还涉及了一种生物活性成分，该生物活性成分包括根据此方法得到的细胞质组分沉淀物，并且具有抗炎性和抗氧化活性。
本发明还涉及一种制备稳定的细胞汁浆组分的方法，所述稳定的细胞汁浆组分为细胞活性组分且源自野甘菊植物的鲜生物量的细胞汁，所述稳定的细胞汁浆组分不含有α-不饱和γ-内酯(例如，小白菊内酯)。该方法包括：在能够有效地生成第二细胞汁浆上清液的条件下使第一细胞汁浆上清液澄清。在能够有效地生成稳定的细胞汁浆组分的条件下将稳定剂与所述第二细胞汁浆上清液混合。所述稳定的细胞汁浆组分为生物活性组分，该生物活性组分不含有α-不饱和γ-内酯。本发明还涉及一种生物活性成分，该生物活性成分包括由此方法得到的稳定的细胞汁浆组分，该组分具有抗炎性和抗氧化活性。
本发明还涉及一种制备稳定的浓缩的细胞汁浆组分的方法，所述浓缩的细胞汁浆组分为生物活性组分，且该组分源自野甘菊植物的鲜生物量的细胞汁，所述生物活性组分不含有α-不饱和γ-内酯(例如，小白菊内酯)。该方法包括：在能够有效地生成浓缩的细胞汁浆上清液的条件下，使所述稳定的细胞汁浆组分浓缩。在能够有效地生成稳定的浓缩细胞汁浆组分的条件下，将稳定剂与所述浓缩的细胞汁浆上清液混合。所述稳定的浓缩的细胞汁浆组分为生物活性组分，该生物活性组分不含有α-不饱和γ-内酯。本发明还涉及一种生物活性成分，该生物活性成分包括由此方法得到的稳定的浓缩的细胞汁浆组分，该组分具有抗炎性和抗氧化活性。
本发明还涉及一种生物活性组合物，该组合物包括：一种或多种本发明的分离的生物活性组分的混合物。
本发明是有益的，其提供了一种制备具有高重复性且不含有小白菊内酯或基本不含有小白菊内酯的野甘菊衍生物的方法，该野甘菊衍生物具有广谱的所需生物活性(例如，抗炎性和抗氧化活性)。本发明强于现有技术的一个优点在于本发明的方法不需要使用粗糙的有机溶剂来分离本发明的生物活性组分。在哺乳动物(包括人类)的多种局部和经口应用中，本发明的生物活性组分用作活性成分。这些制剂可以用于抑制皮肤组织的炎性活性以及用于保护皮肤组织免受紫外光诱导的伤害。本发明的活性成分还能够用于使哺乳动物皮肤组织的皮肤病恢复正常。
附图说明
图1为说明了制备本发明的生物活性成分的过程的一个实施方式的示意图；
图2为用于本发明的一个实施方式的方法的野甘菊鲜生物量的高压液相色谱(＂HPLC＂)的色谱图；下箭头表示小白菊内酯的峰；
图3为通过本发明的一个实施方式的方法分离得到的富含纤维的材料的HPLC色谱图；下箭头表示小白菊内酯的峰；
图4为通过本发明的一个实施方式的方法分离得到的沉淀物I的HPLC色谱图；下箭头表示小白菊内酯的峰；
图5为通过本发明的一个实施方式的方法分离得到的沉淀物II(生物活性成分A)的HPLC色谱图；下箭头表示小白菊内酯的峰；
图6为通过本发明的一个实施方式的方法分离得到的最终上清液(生物活性成分B)的HPLC色谱图；
图7为通过本发明的一个实施方式的方法分离得到的浓缩的最终上清液(生物活性成分C)的HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明涉及生物活性成分，该成分含有：源自野甘菊植物的鲜生物量的细胞汁的分离的生物活性组分。所述生物活性组分不含有或基本不含有α-不饱和γ-内酯；更确地，所述生物活性组分不含有或基本不含有小白菊内酯。此处所用的术语“生物活性组分”和“生物活性成分”可互换使用。通过阅读本发明的说明书，本领域普通技术人员将了解到，互换使用上述术语是合适的。本发明的生物活性成分具有良好的活性，包括但不限制于：抗炎性和抗氧化活性。
正如此处所用的，术语“野甘菊”为“Tanacetum parthenium”植物的通用名称。
正如此处所用的，术语“基本不含有α-不饱和γ-内酯”和“基本不含有小白菊内酯”是指α-不饱和γ-内酯或小白菊内酯的重量含量分别为≤0.01％的野甘菊生物活性成分或生物活性组分，但所述重量含量仍然位于使用本领域公知的高压液相色谱(＂HPLC＂)分析法对α-不饱和γ-内酯或小白菊内酯的检测极限的范围之内。正如此处所用的，除非另有说明，所用的涉及本发明的生物活性成分/组分中的α-不饱和γ-内酯或小白菊内酯的重量含量或浓度的百分数是指重量百分比(通常简写为＂重量％＂或短语＂重量百分比＂)。
正如此处所用的，术语“不含有α-不饱和γ-内酯”和“不含有小白菊内酯”是指α-不饱和γ-内酯或小白菊内酯的含量分别低于使用本领域公知的高压液相色谱(＂HPLC＂)分析法对α-不饱和γ-内酯或小白菊内酯的检测极限的范围之下的野甘菊生物活性成分或生物活性组分。在一个实施方式中，所述不含有小白菊内酯的生物活性成分/组分的小白菊内酯的含量小于0.00007重量％。本领域的技术人员能够认识到，本发明的“不含有α-不饱和γ-内酯”或“不含有小白菊内酯”的生物活性成分/生物活性组分分别表征为“完全不含有α-不饱和γ-内酯”或“完全不含有小白菊内酯”。
用于检测小白菊内酯的量的适宜的方法在实施例6(下文中)中进行了进一步的描述。简要地说，用于检测小白菊内酯的方法包括在225nm处进行检测，在225nm处小白菊内酯的含量可以通过使用多点校准曲线进行检测，所述多点校准曲线具有范围从30μg-900μg小白菊内酯/克样品的六个小白菊内酯标准(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO)。在一个实施方式中，小白菊内酯在这些条件下的检测极限为0.7μg小白菊内酯/ml的样品(即，0.00007％)。约30μg小白菊内酯/克样品(例如，0.003％)可以通过使用这些条件的组合来进行定量。
在一个实施方式中，本发明的生物活性成分相当于此处所描述的“细胞质组分沉淀物”。参考图1描述的过程示意图，此实施方式包括确定“沉淀物II36”所属的生物活性成分的类别。此外，如实施例部分(下文中)所描述的，此实施方式包括确定“生物活性成分A”所属的生物活性成分的类别。正如实施例中所表示的，本发明的一个实施方式的生物活性成分A显示出含有约0.01重量％的小白菊内酯，从而确定基本不含有小白菊内酯。在另一个实施方式中，与“细胞质组分沉淀物”相对应的生物活性成分具有与图5等所示的分布相应的HPLC分布。
在另一个实施方式中，本发明生物活性成分与此处所定义的“稳定的细胞汁浆组分”相对应。考虑到实施例部分(下文中)和如图1所示的过程的示意图，此实施方式包括确定“生物活性成分B”和“生物活性成分B60”所属的生物活性成分的类别。正如在实施例中所表示的，本发明的一个实施方式的生物活性成分B显示含有低于0.00007重量％的小白菊内酯，从而被确定不含有小白菊内酯。换言之，发现此实施方式中的生物活性成分的小白菊内酯的含量低于用于检测小白菊内酯的分析步骤的检测极限(见，实施例6，＂用于检测小白菊内酯含量的方法＂)。在另一个实施方式中，与＂稳定的细胞汁浆组分＂相对应的生物活性成分具有与如图6等所示的分布相对应的HPLC分布。此实施方式的生物活性成分易溶于水。
在另一个实施方式中，本发明的生物活性成分于此处所定义的＂稳定的浓缩的细胞汁浆组分＂相对应。参考实施例部分(下文中)和图1所描述的过程的示意图，此实施方式包括确定＂生物活性成分C＂和＂生物活性成分C80＂所属的生物活性成分的类别。正如在实施例中所表示的，本发明的一个实施方式的生物活性成分C显示含有低于0.00007重量％的小白菊内酯，从而被确定为不含有小白菊内酯。换言之，发现此实施方式中的生物活性成分的小白菊内酯的含量低于用于检测小白菊内酯的分析步骤的检测极限(见，实施例6，下文中)。在另一个实施方式中，与＂稳定的浓缩的细胞汁浆组分＂相对应的生物活性成分具有与如图7等所示的分布相对应的HPLC分布。此实施方式的生物活性成分易溶于水。
本发明的生物活性成分具有抗炎性和抗氧化活性。
关于抗炎性，该活性可以通过使用弹性蛋白酶抑制测定来检测(例如，见，实施例6，＂用于检测弹性蛋白酶抑制活性的方法＂)。在一个实施方式中，本发明的生物活性成分的抗炎性表示为IC50值，该值的范围为约0.1％(体积/体积)至约2.0％(体积/体积)；特别地，为约0.3％(体积/体积)至约1.7％(体积/体积)。正如此处用于对抗炎性的限定，术语＂IC50值＂是指使弹性蛋白酶的酶促反应的速度降低50％所需的生物活性成分的浓度。如图4、7、10、和13所示，鉴定的生物成分的抗炎性(IC50值)可以以体积(例如，微升，μL)来表示，然后根据每体积的体积(体积/体积)浓度再进行计算。如表4、7、10、和13所示的抗炎性数据是是基于3.0mL的反应混合物的体积得到的。
关于抗氧化活性，该活性可以通过清除活性氧的检测来进行检测(例如，见，实施例6，＂用于检测超氧化物清除活性的方法＂)。在一个实施方式中，本发明的生物活性成分的抗氧化活性表示为IC50值，该值的范围为约0.007％(体积/体积)至约1.0％(体积/体积)；特别地，为约0.067％(体积/体积)至约0.27％(体积/体积)。正如此处用于对抗氧化活性的限定，术语＂IC50值＂是指使细胞色素C还原反应的速度降低50％所需的生物活性成分的浓度。如图4、7、10、和13所示，鉴定的生物成分的抗氧化活性(IC50值)可以以体积(例如，微升，μL)来表示，然后根据每体积的体积(体积/体积)浓度再进行计算。如表4、7、10、和13所示的抗炎性数据是基于3.0mL的反应混合物的体积得到的。
在一个实施方式中，所述生物活性成分可以用于具有或不具有稳定剂的局部应用。适合的稳定剂可以为本领域常规使用的稳定剂，包括但不限制于：乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、聚合物基质、和它们的混合物。
正如此处所用的，＂局部应用＂通常是指例如使用手或施用器如擦布(wipe)直接将本发明的生物活性成分或含有这些生物活性成分的制剂放置或涂敷在外部皮肤上。
所述生物活性成分(以及含有它们的制剂)为＂化妆品可接受的＂。正如此处所用的，术语＂化妆品可接受的＂是指适用于与哺乳动物组织(例如，人类皮肤)接触，而不具有过度毒性、不相容性、不稳定性、刺激作用、过敏反应等且具有合理的效益风险比的生物成分、制剂、化妆品活性剂、或惰性成分。
所述生物活性成分(以及含有它们的制剂)用于人体局部或口服应用，并且可以以＂安全和有效量＂来施用。正如此处所用的，术语＂安全和有效量＂是指在待调整的或治疗的条件下能够显著地诱导积极改变但足够低以避免严重的副作用的生物活性成分或制剂的量。所述生物活性组分或含有生物活性组分的制剂的安全和有效量将根据待处理的特定条件、最终使用者的年龄和身体条件、待治疗的/预防的状况的严重程度、治疗的持续时间、同步治疗的性质、使用的具体的生物活性成分或制剂、利用的具体的化妆品可接受的局部载体等因素而发生改变。
本发明的含有所述生物活性成分的制剂可以通过本领域普通技术人员公知的方法进行制备。
本发明还涉及了一种分离生物活性组分的方法，所述生物活性组分源自
本发明还涉及一种生物活性组分的分离方法，该生物活性组分源自野甘菊植物的鲜生物量的细胞汁。该方法包括提供野甘菊植物的鲜生物量。适宜的鲜生物量可以包括野甘菊植物的任何部位，例如，包括其叶、花、枝条、茎、和根。在能够有效地生成细胞汁上清液以及膜组分的条件下对鲜生物量进行加工。在能够有效地生成第一细胞汁浆上清液以及细胞质组分沉淀物的条件下对细胞汁上清液进行处理。在一个实施方式中，＂细胞质部分沉淀物＂与生物活性成分A相对应(见图1和实施例部分)。然后，对细胞质组分沉淀物进行分离，其中，所述细胞质沉淀物为生物活性组分，该生物活性组分基本不含有α-不饱和γ-内酯，特别地，基本不含有小白菊内酯。
在能够有效地生成细胞汁上清液以及膜组分的条件下对鲜生物量进行加工的一个实施方式如以下步骤所示：(i)将鲜生物量分离成细胞汁浆组分和富含纤维的材料；(ii)使所述细胞汁浆组分澄清，以得到澄清的细胞汁浆组分；和(iii)将所述澄清的细胞汁浆组分分离成细胞汁浆上清液和膜组分。
本发明还涉及一种稳定的细胞汁浆组分的制备方法，所述稳定的细胞汁浆组分为生物活性组分且源自野甘菊植物的鲜生物量的细胞汁，所述生物活性组分不含有α-不饱和γ-内酯(例如，不含有小白菊内酯)。该方法包括在能够有效地生成第二细胞汁浆上清液的条件下使第一细胞汁上清液澄清。在能够有效地生成稳定的细胞汁浆组分的条件下将稳定剂(在此描述的适合实例)与所述第二细胞汁浆上清液混合。所述稳定的细胞汁浆组分为生物活性组分，该生物活性组分不含有α-不饱和γ-内酯，特别地，不含有小白菊内酯。在一个实施方式中，＂稳定的细胞汁浆组分＂与生物活性成分B(见图1和实施例部分)相对应。
本发明还涉及一种制备稳定的浓缩的细胞汁浆组分的方法，所述稳定的浓缩的细胞汁浆组分为生物活性组分，该生物活性组分源自野甘菊植物的鲜生物量，并且该生物活性组分不含有α-不饱和γ-内酯，特别地，不含有小白菊内酯。该方法包括在能够有效地生成浓缩的细胞汁浆上清液的条件下，使所述稳定的细胞汁浆组分浓缩(如上所述)。在能够有效地生成稳定的浓缩细胞汁浆上清液组分的条件下，将稳定剂(在此描述的适合的例子)与所述浓缩的细胞汁浆上清液混合。所述稳定的浓缩的细胞汁浆上清液组分为生物活性组分，该生物活性组分不含有α-不饱和γ-内酯；特别地，不含有小白菊内酯。在一个实施方式中，所述＂稳定的浓缩的细胞汁浆组分＂与生物活性成分C相对应(见图1和实施例部分)。
本发明还涉及由上述方法制得的生物活性成分，该生物活性成分包括，例如，含有以下组分的生物活性成分：(i)由本发明的方法得到的细胞质组分沉淀物；(ii)由本发明的方法得到的稳定的细胞汁浆组分；和(iii)由本发明的方法得到的稳定的浓缩的细胞汁浆组分。这些生物活性组分具有抗炎性和抗氧化活性。
通过实施例，用于制备本发明的生物活性成分(例如，生物活性成分A、生物活性成分B、和生物活性成分C)的全部过程的一个实施方式如图1示意性地表示。此过程的步骤细节在此详述以及实施例中有进一步的描述。
如图1所描述的，提供了新鲜的野甘菊10(即，野甘菊的鲜生物量)。在一个实施方式中，在此段落中描述的步骤与描述的为“提供野甘菊植物的鲜生物量”的步骤相对应。
在能够有效地分离新鲜的野甘菊10成为细胞汁16和富含纤维的材料14的条件下，将新鲜的野甘菊10碾碎、浸渍、和压榨12。然后，在能够有效地生成澄清的细胞汁20的条件下，使细胞汁16澄清18。在能够有效地生成沉淀物I26(膜组分)和上清液I30(细胞汁上清液)的条件下，对澄清的细胞汁20进行pH调节/微波处理22，然后在有效地生成沉淀物I26(膜组分)和上清液I30(细胞汁上清液)的条件下进行冷却/离心24。此步骤有效地将大量的α-不饱和γ-内酯(特别地，为小白菊内酯)分隔成沉淀物I26，其还包括在澄清的细胞汁20中发现的很多膜材料。正如用于描述沉淀物I26中所含的α-不饱和γ-内酯(特别地，为小白菊内酯)的量，术语＂大量＂是指α-不饱和γ-内酯(特别地，为小白菊内酯)的含量超过0.01重量％和/或该含量能够比得上新鲜的野甘菊中的α-不饱和γ-内酯(特别地，为小白菊内酯)的含量。因此，由此步骤得到的上清液I 30包括至少基本不含有小白菊内酯的细胞汁，特别地，包括至少基本不含有小白菊内酯的细胞汁。在一个实施方式中，此段中描述的步骤与被定义为＂在能够有效地生成细胞汁上清液和膜组分的条件下对鲜生物量进行处理＂的步骤相对应。
对上清液I 30进行等电沉淀32，此后在能够有效地生成上清液II 40(例如，第一细胞汁浆上清液)和沉淀物II 36(例如，细胞质组分沉淀物)的条件下，进行离心34。在一个实施方式中，在此段描述的步骤与被定义为＂在能够有效地生成第一细胞汁浆上清液和细胞质部分沉淀物的条件下对细胞汁上清液进行处理＂的步骤相对应。
然后分离沉淀物II 36。在一个实施方式中，沉淀物II 36与生物活性成分A相对应，并且其基本不含有α-不饱和γ-内酯，特别地，基本不含有小白菊内酯。在一个实施方式中，在此段中描述的步骤与被定义为＂对所述细胞质组分沉淀物进行分离＂的步骤相对应。沉淀物II 36(生物活性成分A)还具有多种优良的生物活性，包括但不限制于：抗炎性和抗氧化活性。
对上清液II 40(例如，第一细胞汁浆上清液)进行pH调节42，此后，在能够有效地生成最终上清液50(在一个实施方式中还指“第二细胞汁浆上清液”)的条件下使其澄清44。然后在能够有效地生成生物活性成分B60(在一个实施方式中还指“稳定的细胞汁浆组分”)的条件下使最终上清液50与稳定剂52混合。生物活性成分B60基本不含有α-不饱和γ-内酯，特别地，基本不含有小白菊内酯。在一个实施方式中，在此段中描述的步骤与被进行以下定义的步骤相对应：(i)＂在能够有效地生成第二细胞汁浆上清液的条件下使所述第一细胞汁浆上清液澄清＂；和(ii)＂在能够有效地生成稳定的细胞汁浆组分的条件下将稳定剂与第二细胞汁浆上清液混合＂。生物活性成分B 60还具有多种优良的生物活性，包括但不限制于：抗炎性和抗氧化活性。
在能够有效地使生物活性成分B 60浓缩以生成浓缩的最终上清液70(在一个实施方式中还指＂浓缩的细胞汁浆上清液＂)的条件下，使生物活性成分B60蒸发62。在一个实施方式中，此步骤与被定义为＂在能够有效地生成浓缩的细胞汁浆上清液的条件下使所述稳定的细胞汁浆组分浓缩＂的步骤相对应。然后，在能够有效地生成生物活性成分C 80(在一个实施方式中还指＂稳定的浓缩的细胞汁浆组分＂)的条件下使浓缩的最终上清液70与稳定剂72混合。在一个实施方式中，此步骤与步骤＂在能够有效地生成稳定的浓缩的细胞汁浆组分的条件下将稳定剂与浓缩的细胞汁浆上清液混合＂的步骤相对应。生物活性成分C 80不含有α-不饱和γ-内酯，特别地，不含有小白菊内酯。生物活性成分C 80还具有多种优良的生物活性，包括但不限制于：抗炎性和抗氧化活性。
本发明的生物活性成分包括所有如图1所描述的源自细胞汁的生物活性成分，即，如以下所表示的生物活性成分：(i)上清液I 30；(ii)上清液II 40；(iii)沉淀物II 36(生物活性成分A)；(iv)最终上清液50；(v)生物活性成分B60；(vi)浓缩的最终上清液70；和(vii)生物活性成分C 80。此段中的所列的生物活性组分各自不含有或基本不含有α-不饱和γ-内酯，特别地，不含有或基本不含有小白菊内酯。此外，此段中所列的生物活性组分各自具有抗炎性和抗氧化活性。
本发明还涉及生物活性组合物，该组合物包括源自野甘菊植物的鲜生物量的细胞汁的一种或多种分离的生物活性组分。适合的生物活性组分包括但不限制于：任何本发明的生物活性组分。特别地，所述生物活性组分各自不含有或基本不含有α-不饱和γ-内酯，特别地，不含有或基本不含有小白菊内酯。此外，适合的生物活性组合物具有抗炎性和抗氧化活性。在一个实施方式中，所述生物活性组分可以包括但不限制于：如图1所描述的一种或多种生物活性组分/生物活性成分，即，上清液I 30、上清液II 40、沉淀物II 36(生物活性成分A)、最终上清液50、生物活性成分B 60、浓缩的最终上清液70、和/或生物活性成分C 80。本发明的生物活性组合物不含有或基本不含有α-不饱和γ-内酯，特别地，不含有或基本不含有小白菊内酯。所述生物活性组合物还具有抗炎性和抗氧化活性。在一个实施方式中，所述生物活性组合物包括稳定剂。结合一种或多种本发明的生物活性组分以生成本发明的生物活性组合物的方法为本领域技术人员所公知，并作为本发明的一部分。
本发明的生物活性成分和生物活性组合物可以用于多种用于哺乳动物(包括人类)的方法。此外，由于生物活性成分中的小白菊内酯的浓度较低(或完全不存在小白菊内酯)，使用生物活性成分的方法可以包括不仅对成年人安全的应用，还包括对各种年龄的孩子的应用(包括但不限制于：婴儿、初学走路的孩子、未发育的孩子、和青少年)。
此外，本发明的生物活性成分的实施方式在下文中进行了概述。
在一个实施方式中，所述生物活性成分从各种生长阶段的野甘菊的鲜生物量中得到，包括但不限制于，提供最高产量的时期：从盛花早期(10％开花)至盛花期(100％开花)。
在一个实施方式中，所述生物活性成分可以从新鲜的植物量中得到，所述新鲜的植物量可以从培养第一年和/或随后的生长年代中的植物得到。
在另一个实施方式中，所述生物活性成分可以从新鲜的植物量中得到，所述新鲜的植物量为大地种植的和/或温室种植的和/或人工气候室种植的和/或组织培养的和/或愈伤组织培养的。
适合的生物活性成分可以包括但不限制于：任何的植物细胞组分，该植物细胞组分不与α-不饱和γ-内酯，特别地，不与小白菊内酯结合和/或不与其具有亲和力。
在一个实施方式中，适合的生物活性成分包括但不限制于：任何的植物细胞组分，该植物细胞组分具有抗炎性能且不与α-不饱和γ-内酯，特别地，不与小白菊内酯结合和/或不与其具有亲和力。
在另一个实施方式中，所述适合的生物活性成分可以包括但不限制于：任何的植物细胞组分，在人体组织的炎症应答过程中，所述植物细胞组分具有抗蛋白酶释放的抑制活性。上述蛋白酶可以包括但不限制于：人嗜中性细胞弹性蛋白酶，其是蛋白酶中多种破坏性酶中的一种。由于弹性蛋白酶能够降解人体组织的细胞外基质的多种组分，弹性蛋白酶的抑制剂被认为具有能够减少与炎症条件的巨大改变相关的组织损伤的重要生物活性能力。虽然纯化的小白菊内酯本身证明了确定的抗弹性蛋白酶活性，但意外地发现，基本不含有小白菊内酯的本发明生物活性成分和完全不含有小白菊内酯的本发明生物获悉国内成分具有更高的弹性蛋白酶抑制活性，比纯化的小白菊内酯的生物活性高两个数量级。
不与α-不饱和γ-内酯，特别地，不与小白菊内酯结合和/或不与其具有亲和力的本发明的生物活性成分具有抗弹性蛋白酶的活性，该活性优于纯的小白菊内酯的活性。
在一个实施方式中，适合的本发明的生物活性成分包括但不限制于：具有弹性蛋白酶抑制性质的且不与α-不饱和γ-内酯，特别地，不与小白菊内酯结合和/或不与其具有亲和力的任何的植物细胞组分。
在一个实施方式中，适合的本发明的生物活性成分包括但不限制于：具有抗氧化性质的且不与α-不饱和γ-内酯，特别地，不与小白菊内酯结合和/或不与其具有亲和力的任何的植物细胞组分。
本发明还涉及生物活性成分，该生物活性成分(i)基本或完全不含有α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯；以及具有皮肤保护(包括局部和口服应用)所期望的(ii)抗炎性；和(iii)抗氧化性质。
在一个实施方式中，适合的生物活性成分可以包括但不限制于：具有抗炎性和抗氧化性质且不与α-不饱和γ-内酯，特别地，不与小白菊内酯结合和/或不与其具有亲和力的任何的植物细胞组分。
在一个实施方式中，适合的生物活性组分可以包括但不限制于：具有弹性蛋白酶抑制性和抗氧化性质且不与α-不饱和γ-内酯，特别地，不与小白菊内酯结合和/或不与其具有亲和力的任何的植物细胞组分。
本发明还涉及一种用于从野甘菊的鲜生物量中分离用于皮肤保护的生物活性成分的方法，其中，所述生物活性成分(i)基本或完全不含有α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯；具有(ii)抗炎性和/或(iii)抗氧化性质。
本发明还涉及一种用于从野甘菊的鲜生物量得到的细胞汁中分离用于皮肤保护的生物活性成分的方法，其中，所述生物活性成分(i)基本或完全不含有α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯；具有(ii)弹性蛋白酶抑制性质和/或(iii)抗氧化性质。
在一个实施方式中，本发明的方法包括野甘菊的鲜生物量。然后，将鲜生物量分离成细胞汁和富含纤维的材料。
应该注意的是，根据野甘菊栽培的条件、生长的年龄、和具体的收获方式，植物生物量中干物质含量会发生很大的改变，并将影响细胞汁性质的一致性以及源自细胞汁的生物活性成分的重复性。本发明考虑了细胞汁性质的标准化，以改善生物活性成分的重复性。
在一个实施方式中，通过用于野甘菊栽培和收获的一致性条件使细胞汁性能的标准化改善。
在另一个实施方式中，新鲜野甘菊的碾碎、浸渍、和压榨体系的适当调整，能够得到干物质含量在相对较窄的范围内(例如，7.0±1.6％)改变的细胞汁。例如，如果由于环境的影响导致植物生物量中干物质含量减少，则野甘菊的精细研磨和高压能够提高细胞汁中干物质的含量，从而改善了它的重复性。如果植物生物量中干物质的含量增加，则可以使用过程研磨和低压。
在另一个实施方式中，在无需不理想的增加温度的情况下，提供了细胞汁的标准化。
应当指出，上述调整指导了细胞汁的重复性，并且与新鲜野甘菊的干物质基或具有富含纤维的材料的干物质基相比，不必降低细胞汁中α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯的含量。虽然小白菊内酯明显集中在位于野甘菊叶表面的油细胞中(例如，见，Smith等，J.Chromatogr.，627：255(1992)；和Smith，R.M.，LC GC Int.，Jan.8-15，1996，并在此通过引用的方式将其全文并入本文)，但意外地发现，所述小白菊内酯并不主要集中在富含纤维的材料中，而分散于上述材料和细胞汁之间。
在一个实施方式中，使富含纤维的材料干燥或者在冷冻条件下进行储存。
在另一个实施方式中，将含有小白菊内酯的富含纤维的材料应用在本领域通常用的野甘菊衍生物的常规应用中。
新鲜的野甘菊细胞汁为墨绿色的相对稳定的胶体分散体系。这种颜色取决于叶绿体及其碎片，它们分散在褐色的且富含其它细胞质组分的连续的细胞汁相中。意外地发现，在胶体分散体系中，α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯与叶绿体及其碎片具有很强的结合力和/或亲和力。
在一个实施方式中，从细胞汁中去除叶绿体及其碎片，得到连续的细胞汁相，该相基本不含有α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯。细胞汁中这些不需要的化合物的去除可以通过以下不同的处理方法来实现，包括但不限制于：pH调节、热处理、微波辐射、离心、过滤、超滤、和它们的组合。
在一个实施方式中，新鲜的野甘菊细胞汁被分成由叶绿体组成的墨绿色的糊状沉淀物和褐色的上清液，该上清液基本不含有α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯。
在另一个实施方式中，可以通过中速或高速离心(≥15,000g)来实现上述分离。结果，所有的叶绿体及其碎片均被富集至沉淀物(下文称沉淀物I)中，并且分离出的上清液(下文称上清液I)完全不含有叶绿素。结果，胶体分散系的几乎所有的小白菊内酯池被富集至沉淀物I中，因此，上清液I的小白菊内酯的含量比最初的细胞汁低≤20倍(例如，0.03％)，即，本发明的上述上清液I可被确定为基本不含有α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯(与美国专利Nos.6,224,875和6,479,080中描述的优选的实施方式的野甘菊提取物的水平相比，本发明的上清液具有更低的小白菊内酯的残留含量，上述两篇专利通过引用的方式将其全文并入本文)。
特别在较大的工业规模上，中速以及高速离心存在技术上和/或经济上的限制。在一个实施方式中，对新鲜的野甘菊细胞汁进行处理以降低叶绿体及其碎片的稳定性，然后通过低速离心(≤3,000g)使失稳的细胞汁有效地分离。有效的分离标准是在上清液I的光谱中不出现典型的叶绿素峰值。
本发明包括多个处理步骤，以减少野甘菊细胞汁叶绿素及其碎片的起始凝结物的相稳定性。在一个实施方式中，使用冻融处理(≥1个循环)、热处理(≥40℃)、pH调节(pH＝3.0...4.0)、和/或它们的组合，使细胞汁的稳定性降低。野甘菊细胞汁的上述处理以及低速离心能够得到含有6.5-7.3％的干物质和0.01-0.035％的小白菊内酯的细胞汁上清液I。叶绿体及其碎片的分离能够得到上清液I，该上清液I基本不含有α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯。
在一个实施方式中，上清液I中干物质的含量可以被提高，而其中的小白菊内酯含量则没有显著的变化。因此，在进行分离之前，通过强搅拌(例如，使用rotostat)、或均化处理(例如，使用polytron匀浆器)、或超声处理、或微波射线、和/或它们的组合，对所述细胞汁进行处理，以使叶绿体组分部分与α-不饱和γ-内酯，特别是与小白菊内酯不具有强结合力和/或亲和力，从而使叶绿体组分移入至连续的(可溶的)弥散相中。上述过程能够进一步提高上清液I中的干物质含量，而并不使α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯的含量提高。结果，在仅仅为全部的细胞汁干物质的15-20％的沉淀物I中可以得到分离的叶绿体及其碎片，因而，全部的细胞汁干物质的80-85％残留在浓缩的细胞汁上清液I中。
在一个实施方式中，将富含有α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯的沉淀物I储存在≤-20℃下。在另一个实施方式中，将所述沉淀物I干燥(例如，使用冻干器、或喷雾干燥器、或流化床干燥器)。在另一个实施方式中，对沉淀物I进行保存(例如，使用0.75％的葡萄糖酸δ内酯和0.25％的抗坏血酸钠，或使用1.0％的非诺尼普)，然后在冷冻条件下进行储存。
在一个实施方式中，将含有小白菊内酯的沉淀物I应用于本领域常用的野甘菊衍生物的常规应用领域。
虽然上清液I基本不含有α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯，本发明能够在不降低其期望的生物活性的情况下，从上清液中定量地将这些不需要的组分去除掉。
在一个实施方式中，通过利用额外的上清液I的不同处理，可以实现残余的α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯的定量去除。这些处理包括但不限制于以下处理：(i)提高上清液I的pH(6.0≤pH≤10.0)，以起始与α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯具有亲和力的组分的等点沉淀；(ii)使用离心和/或过滤对沉淀物组分进行分离，以浓缩位于沉淀物II中的上述组分；(iii)将得到的上清液II的pH调节至细胞汁的初始pH值；和(iv)通过离心和/或过滤或微滤(孔径≤0.22μm)或超滤(截留分子量≥10,000道尔顿)对上清液II进行额外的澄清，以得到最终上清液。上述步骤促成的最终上清液的分离，该上清液完全不含有α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯，但具有所有期望的生物活性。
在一个实施方式中，对最终的沉淀物II进行干燥(例如，通过冻干器、或喷雾干燥器、或流化床干燥器)。在另一个实施方式中，在冷冻条件下对所述沉淀物II进行储存。
在一个实施方式中，通过加入如先前在美国专利No.2003/0175235中描述的防腐剂以及对该混合物进行孵育直至完全溶解，获得了最终上清液的稳定性，该专利的全文通过引用的方式并入本文。所用的防腐剂包括：0.1％的山梨酸钾、0.1％的苯甲酸钠、0.1％的对羟基苯甲酸甲酯钠、0.1％的焦亚硫酸钠、0.1％的柠檬酸75％。在环境条件下，储存保存好的最终上清液。
在一个实施方式中，通过蒸发、或透析、或电渗析、或反渗透、或它们的组合对最终上清液进行浓缩。优选通过蒸发，因为蒸发能够使所述生物活性成分的完整性得以保存，除了去除水以外不发生不期望的任何组分的去除。
在另一个实施方式中，将浓缩的最终上清液与稳定剂混合，所述浓缩的最终上清液为能够自发形成淡米色沉淀物的不稳定的暗褐色浑浊悬浮液，所述稳定剂包括但不限制于：≥5.0％的丙三醇或戊二醇(1，2-戊二醇或1，2-二羟基戊烷)。
本发明还涉及分离的生物活性成分，该生物活性成分基本不含有或完全不含有α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯，并且该生物活性成分还具有期望的生物活性：沉淀物II(生物活性成分A)、最终上清液(生物活性成分B)、和浓缩的最终上清液(生物活性成分C)。
在一个实施方式中，所述分离的生物活性成分与稳定剂进行了组合。特别适合的稳定剂包括但不限制于：防腐剂、抗氧化剂、和/或它们的混合物。
在另一个实施方式中，对所述分离的生物活性成分进行了浓缩，然后进行稳定，以进一步用于口服和局部应用的皮肤保护。
本发明的生物活性成分还可以包括在现有技术常用的给药体系中。
所有的本发明的生物活性成分可以用作掺入在包括局部和口服应用的皮肤保护产品中的溶液、悬浮液、分散体、糊剂、或干粉末。
实施例
以下实施例用于说明本发明的具体实施方式，但并不用于限制本发明的范围。
实施例1-从新鲜野甘菊中制备生物活性组分
下面描述是对本发明一个实施方式的相关方面的描述。
在生长的盛花期，采集足够量的新鲜野甘菊的地上部分，约100kg的干物质。检测到新鲜野甘菊中干物质的水平为23.77％，需要采集约420.7kg的新鲜植物量以生成100kg的干物质。利用的野甘菊的HPLC色谱如图2所示。
保持新鲜野甘菊的含水量并避免由水分流失引起的枯萎。以这种方式进行采集以避免采集的新鲜野甘菊的切碎、捣碎、和压碎，或者使上述状况最小化。在尽可能短的时间内完成所有的步骤。这样可以使野甘菊在阳光、高温、和其它负面环境因素的暴露最小化。
然后，进行清洗步骤以在进行进一步的处理之前，从植物中去除土壤颗粒和其它碎片。通过在水压≤1kg/cm2的条件下在≤5分钟内完成采集的野甘菊的清洗步骤。残余的水清洗物不含有任何绿色或褐色色素，用于指示适合的水压和清洗时间。从清洗后的植物量中去除多余的水。
清洗后的野甘菊经过碾碎、浸泡、和压榨，得到细胞内物质(即，细胞汁)，并将细胞内物质从富含纤维的材料中分离出。使用具有5HP引擎的锤式粉碎机，在最短的时间内并以不引起生物量温度显著升高的方式，对生物量进行碾碎以得到具有适合大小的野甘菊组织颗粒。设置锤式粉碎机，以在≤10秒的处理时间内得到最大尺寸≤2.0厘米的浸软植物颗粒。所述生物量的温度仅仅升高5℃。
直接使用装配有由压缩空气支撑的锥体的水平连续螺旋压力机(Compact Press CP-6，VincentCorporation，Tampa，FL)，以立即从浸软的野甘菊中得到细胞汁。锥体的压力维持在≥20kg/cm的水平，螺旋转速为12rpm，温度的增加仅≤5℃。
该处理生成富含纤维的材料和细胞汁。使用其澄清半自动连续流离心机，在≤3,000rpm的条件下，在≥30秒的滞留时间内从细胞汁中分离出残余的小纤维颗粒(Model 12-413V，AML Industries，Inc.，Hatboro，PA)。收集沉淀物并与压榨野甘菊后得到的富含纤维的材料结合在一起。
上述描述的过程能够生成干物质水平为8.20％的217.2kg的野甘菊细胞汁，和干物质水平为40.39％的203.5kg富含纤维的材料。富含纤维的材料的HPLC色谱如图3所示。
然后将细胞汁进行包括pH调节、微波辐射和分离在内的多种处理。通过滴定法使用3.6升的5.0N的盐酸，调节新鲜野甘菊细胞汁的pH值(初始pH＝5.3)，以使所述细胞汁的pH降低至3.5。然后，使用频率为2.45GHz，输出功率为3200瓦特的特别设计的连续流系统(Microwave Research &Applications，Inc.，Laurel，MD)，将调节后的细胞汁立即暴露于微波辐射下。该系统装配有恒定速率的搅拌器BDC1850(Caframo Ltd.，Wiarton，Ontario，Canada)和温度控制探针。进行该处理直至微波室内的细胞汁的温度达到92℃，然后通过与1HP再循环冷却器(Model 6106P，Polyscience Corporation，Niles，IL)相连的连续流设备，立即对处理后的细胞汁进行泵送。
在处理后的细胞汁的温度降低至≤30℃之后，使用连续流离心机CEPALE(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH，Germany)，在15000rpm的条件下在≥30秒的时间内，对所述材料进行分离。220.8kg的处理后的细胞汁的分离，产出19.2kg的干物质含量为26.2％的墨绿色糊状沉淀物(下文称沉淀物I)，和201.6kg的干物质含量为6.34％的褐色微乳白上清液(下文称上清液I)。
沉淀物I的HPLC色谱如图4所示。值得关注的是，图4所示的沉淀物I的HPLC分布与在美国专利No.6,479,080(见，图1)中描述的野甘菊提取物的HPLC分布具有显著的差异。因此，沉淀物I的组成与美国专利No.6,479,080中描述的野甘菊提取物的组成具有显著的差异。
然后，对沉淀物I进行包括pH调节和分离在内进一步的处理。通过滴定法使用1.07升50％的氢氧化钾(KOH)进行第一pH调节，以使细胞汁上清液I的pH从3.5增至9.0。该处理使材料的乳白光改进和材料的颜色更暗，使用连续流离心机CEPA LE(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH，Germany)，在15000rm的条件下，在≥30秒的滞留时间内使该材料立即被澄清。上述分离产出0.55kg的干物质含量为38.2％的暗米色糊状沉淀物(下文称沉淀物II)，和202.12kg的干物质含量为6.22％的褐色微乳上清液(下文称上清液II)。
沉淀物II的HPLC色谱如图5所示。值得关注的是，图5所示的HPLC分布与美国专利No.6,479,080(见，图1)中描述的野甘菊提取物的HPLC分布具有显著的差异。因此，沉淀物II的组成与美国专利No.6,479,080中描述的野甘菊提取物的组成具有显著的差异。
通过HPLC分析确定的含有0.01％的小白菊内酯的沉淀物II表示为生物活性组分A，该生物活性组分A基本不含有α-不饱和γ-内酯，特别是小白菊内酯。
使用5.0N的盐酸对上清液II进行等电滴定，以使pH值被调回至上清液I的初始pH＝3.5。这样的处理导致材料微乳光的增强，但使用连续流离心机CEPA LE(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH，Germany)，在15000rpm的条件下在≥60秒的时间内使该材料有效地被澄清。通过HPLC分析检测到，澄清的材料(下文称最终上清液)含有≤0.00007％的小白菊内酯，根据检测极限，上述最终上清液应该认为不含有小白菊内酯，特别是完全不含有小白菊内酯。
通过添加防腐剂和抗氧化剂并孵育该混合物直至完全溶解，使最终上清液具有稳定性。所用的防腐剂和抗氧化剂包括：0.1％的山梨酸钾、0.1％的苯甲酸钠、0.1％的对羟基苯甲酸甲酯钠和0.2％的焦亚硫酸钠。该制备过程产出201.6kg的生物活性成分B，该生物活性成分B含有6.8％的干物质。100kg的初始野甘菊生物的干物质得到的生物活性成分B的量约为12.5kg干物质。
生物活性成分B的HPLC色谱如图6所示。值得关注的是，图6所示的生物活性成分B的HPLC分布与美国专利No.6,479,080(见，图1)中描述的野甘菊提取物的HPLC分布具有显著的差异。因此，生物活性成分B的组成与美国专利No.6,479,080中描述的野甘菊提取物的组成具有显著的差异。
利用配备有8个0.6升试管、2.550升集液器、和隔膜真空泵(Model2018B-01，Welch Rietsche Thomas，Skokie，IL)的Rapid Vap真空蒸发系统(Labconco，Kanzas City，MO)，使所述生物活性成分B浓缩。在操作压力为100mBar、温度为60℃，涡旋速率为40％的条件下，在90分钟循环内对生物活性成分B进行浓缩，产出总共63.16升(或70.11kg)的干物质含量为19.89％的浓缩的材料。然后，将5.0％(重量/重量)的戊二醇加入至浓缩的材料中，在≥60秒的适度混合之后，得到透明暗褐色的结果液体：生物活性成分C。通过HPLC分析检测到，所述生物活性成分C含有<0.00007％的小白菊内酯，根据检测极限，上述生物活性成分C应该认为不含有小白菊内酯，特别是完全不含有小白菊内酯。
生物活性成分C的HPLC色谱如图7所示。值得关注的是，图7所示的生物活性成分C的HPLC分布与美国专利No.6,479,080(见，图1)中描述的野甘菊提取物的HPLC分布具有显著的差异。因此，生物活性成分C的组成与美国专利No.6,479,080中描述的野甘菊提取物的组成具有显著的差异。
实施例2-生物活性成分B的特征和性质
根据与上述实施例1相同的方法制备生物活性成分B。对生物活性成分B进行分析，以确定其多种物理-化学特性、化学特性、和微生物学特性。选择的生物活性成分B的物理-化学特性和化学特性如表1所示。
表1-生物活性成分B的物理-化学特性和化学特性
 
参数 结果
外观 黄-褐色液体
气味 特征性
颜色(加德纳色度) 11.5
干物质，％ 6.6
比重，g/cm3 1.030
折射率，nD 1.3112
pH 4.1
最大紫外光，nm 269
小白菊内酯，％ <0.00007
生物活性成分B可以容易地以任何比例溶于水。
下面的表2描述了生物活性成分B的微生物学特性。这些数据表明生物活性成分B使皮肤保护在总的平板计数、霉菌和酵母计数方面能够满足工业需要，并且不含有病原体。
表2—生物活性成分B的微生物学特性
 
参数 结果
总的平板计数，CFU*/g <100
霉菌和酵母，CFU*/g <10
大肠杆菌 阴性
沙门氏菌 阴性
 
金黄色葡萄球菌 阴性
假单孢菌 阴性
*菌落形成单位
下表3所示的抗微生物效果检测的结果显示出，生物活性成分B具有有效的防腐剂体系。
表3—生物活性成分B的抗微生物效果检测的结果
表4中包括与生物活性成分B的抗炎性和抗氧化活性有关的数据。使用人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶检测法检测抗炎性活性，并使用细胞色素C还原分析检测抗氧化活性。
表4—生物活性成分B的抗炎性和抗氧化活性
 
参数 结果
抗炎性(IC50)，μl 48.3
抗氧化活性(IC50)，μl 7.5
生物活性成分B在避光的封闭容器内于15-25℃的温度间保存至少12个月后，检测该生物活性成分B是稳定的(即，维持物理和化学的完整性)。
实施例3—生物活性成分C的特征和性质
根据与上述实施例1相同的方法制备生物活性成分C。对生物活性C进行分析，以确定其各种物理-化学的、化学的、微生物的、和生物活性特性。
选择的生物活性成分C的物理-化学的和化学的特征如下表5所示。
图5—生物活性C的物理-化学的和化学的特性
 
参数 结果
外观 红-褐色液体
气味 特征性
颜色(加德纳色度) 18.5
干物质，％ 19.82
比重，g/cm3 1.117
折射率，nD 1.3770
pH 4.1
最大紫外光，nm 255
小白菊内酯，％ <0.00007
生物活性成分C可以容易地以任何比例溶于水。
下面的表6描述了生物活性成分C的微生物学特性。这些数据表明生物活性成分C使皮肤保护在总的平板计数、霉菌和酵母计数方面能够满足工业需要，并且不含有病原体。
表6—生物活性成分C的微生物学特性
 
参数 结果
总的平板计数，CFU*/g <100
 
霉菌和酵母，CFU*/g <10
大肠杆菌 阴性
沙门氏菌 阴性
金黄色葡萄球菌 阴性
假单孢菌 阴性
*菌落形成单位
表7涉及生物活性成分C的抗炎性和抗氧化活性。使用人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶检测法检测抗炎性活性，并使用细胞色素C还原分析检测抗氧化活性。
表7—生物活性成分C的生物学活性
 
参数 结果
抗炎性(IC50)，μl 15.2
抗氧化活性(IC50)，μl 3.1
生物活性成分C在避光的封闭容器内于15-25℃的温度保存至少12个月后，检测该生物活性成分C是稳定的(即，维持物理和化学的完整性)。
实施例4—生物活性组分A的特征和性质
根据与上述实施例1相同的方法制备生物活性组分A。对生物活性A进行分析，以确定其各种物理-化学的、化学的、微生学物的、和生物活性特性。
选择的生物活性组分A的物理-化学的和化学的特性如下图8所示。
图8—生物活性A的物理-化学的和化学的特性
 
参数 结果
外观 暗米色糊状
气味 重特征性
 
颜色(L*值) 27.83
颜色(a*值) 0.57
颜色(b*值) 8.24
干物质，％ 38.2
比重，g/cm3 1.087
pH 9.0
小白菊内酯，％ <0.01
下面的表9描述了生物活性组分A的微生物学特性。这些数据表明生物活性组分A使皮肤保护在总的平板计数、霉菌和酵母计数方面能够满足工业需要，并且不含有病原体。
表9—生物活性组分A的微生物学特性
 
参数 结果
总的平板计数，CFU*/g <100
霉菌和酵母，CFU*/g <10
大肠杆菌 阴性
沙门氏菌 阴性
金黄色葡萄球菌 阴性
假单孢菌 阴性
*菌落形成单位
表10涉及生物活性组分A的抗炎性和抗氧化活性。使用人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶检测法检测抗炎性活性，并使用细胞色素C还原分析检测抗氧化活性。
表10—生物活性组分A的生物学活性
 
参数 结果
 
抗炎性(IC50)，μl 11.2
抗氧化活性(IC50)，μl 2.2
生物活性组分A在避光的封闭容器内的冷冻装置中保存至少12个月后，检测该生物活性组分A是稳定的(即，维持物理和化学的完整性)。
实施例5—从不同的季节的不同收获物中的得到的野甘菊中得到的生物活性组分的比较
利用新鲜野甘菊分析生物活性成分的重复性，该新鲜野甘菊收获自同一片土地的两个连续的季节。此外，在同一生长期，每个季节收获两次新鲜野甘菊。利用与上述实施例1相同的方法处理上述所有的新鲜野甘菊生物量样品。生物活性成分B和C的产量、选择性特征和性质的比较相关的数据如下文所示(生物活性组分A相关的数据不包括在此实施例中，因为这种生物活性组分的产量很低)。
可以看出，从产出100kg的干物质的野甘菊的量可以生产出约12.4±2.1kg的生物活性组分的干物质。新鲜野甘菊生物量中的平均干物质含量约为20％，因此，可以得到约190kg的生物活性成分B或约62kg的生物活性成分C。
得自第一收获物和第二收获物的生物活性组分(p-值＝0.8893)，或得自两个连续的季节(p-值＝0.6531)的生物活性组分并没有显示出显著的区别。此外，生物活性组分之间的干物质含量(p-值＝0.5334)以及上述组分中的小白菊内酯的含量(p-值＝0.9923)并没有显著的区别。
所述生物活性组分的所选物理-化学的和化学的特性如下表11所示，所述生物活性组分得自不同的季节的不同收获物的新鲜野甘菊，所述特性显示出生物活性成分B和生物活性成分C具有很高的重复性。
表11—得自不同的季节的不同收获物的新鲜野甘菊的生物活性组分的重复性
 
参数 生物活性成分B平均值±标准偏差 生物活性成分C平均值±标准偏差
外观 黄-褐色液体 红-褐色液体
气味 特征性 特征性
颜色(加德纳色度) 10±2 ≥18
干物质，％ 6.6±1.8 19.8±2.3
比重，g/cm3 1.035±0.01 1.117±0.02
折射率，nD 1.3112±0.004 1.3704±0.01
pH 3.85±0.4 3.95±0.3
最大紫外光，nm 259±3 256±4
小白菊内酯，％ ≤0.00007 ≤0.00007
应该注意的是，生物活性组分中的小白菊内酯的含量低于HPLC分析过程的检测极限。
下表12描述了所述生物活性组分的微生物学特性。这些数据表明，得自不同的季节的不同收获物的新鲜野甘菊的生物活性组分使皮肤保护在总的平板计数、霉菌和酵母计数方面能够满足工业需要，并且不含有病原体。
表12—得自不同的季节的不同收获物的新鲜野甘菊的生物活性组分的微生物学特性
 
参数 生物活性成分B 生物活性成分C
总的平板计数，CFU*/g <100 <100
霉菌和酵母，CFU*/g <10 <10
大肠杆菌 阴性 阴性
沙门氏菌 阴性 阴性
金黄色葡萄球菌 阴性 阴性
 
假单孢菌 阴性 阴性
*菌落形成单位
表13涉及生物活性成分的抗炎性和抗氧化活性。使用人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶检测法检测抗炎性活性，并使用细胞色素C还原分析检测抗氧化活性。得自不同的季节的不同收获物的新鲜野甘菊的生物活性组分并没有显示出显著的差异，并且所述特性显示出生物活性成分B和生物活性成分C具有很高的重复性。
表13—得自不同的季节的不同收获物的野甘菊的生物活性组分的生物活性的重复性
 
参数 生物活性成分B平均值±标准偏差 生物活性成分C平均值±标准偏差
抗炎性(IC50)，μl 48±6 14±3
抗氧化活性(IC50)，μl 7.5±2.4 3.1±0.5
得自不同的季节的不同收获物的野甘菊的生物活性成分在避光的封闭容器内的冷冻装置中保存至少12个月后，检测该生物活性成分是稳定的(即，维持物理和化学的完整性)。
实施例6—用于检测生物活性成分的特定特征的过程
下文是用于检测生物活性组分的特定特征的多种方法。在上述实施例中均参考了这些方法。下文的“检测产品”或“检测样品”指的是生物活性成分。
检测干物质的方法：
用于检测干物质的步骤包括：在100℃的水浴中蒸发检测的产品直至水分完全蒸发；在105℃的温箱内储藏所述样品3小时；冷却至室温；并立即称量含有固体物质的容器的重量。
用于检测L*a*b*值的方法：
用于检测L*a*b*值的步骤使用了测量几何为0°/45°的设置有HunterLabscan的几何比色计。使用具有向上视窗的标准发光物D65。将具有检测的生物活性成分的容器放置于视窗上，并通过其底部进行检测。使用以下CIELAB方程式：
C * = ( a * 2 + b * 2 ) 1 / 2
DE*＝[(DDLL)2+(Da*)2+(Db*)2]1/2
DH＝[(DE*)2-(DL*)2-(DC*)2]1/2。
用于检测小白菊内酯含量的方法：
使用甲醇并且进行30分钟的超声波处理，对样品进行萃取。使用C18反相柱作为静止相，并使用44％的乙腈、56％的水和0.1％的磷酸作为流动相。在225nm处检测小白菊内酯，并使用具有30μg/g-900μg/g的六个小白菊内酯标准范围(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO)的多个校准曲线来确定小白菊内酯的浓度。该条件下的检测极限为0.7μg/ml。使用这些设置的条件定量出约30μg/g的小白菊内酯。
用于检测微生物学特性的方法：
根据美国药典(USP)方法UPS XXVII，NF 22，<61>，微生物学极限检测，来确定检测的样品的微生物学特性，该方法的全部内容通过引用的方式并入本文。上述检测包括：总需氧量计数、总霉菌和酵母(需氧菌平板计数)；沙门氏菌(sp.)、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、和假单孢菌的检测。
使用美国药典(USP)方法USP XXVII，NF 22，<51>，抗微生物效果检测，pp.2148-2150，进行防腐剂的挑战性研究，该方法的全部内容通过引用的方式并入本文。在20-25℃下孵育接种的检测样品，并在时间间隔为7天、14天、21天、和28天时进行检测。
用于检测弹性蛋白酶抑制活性的方法：
通过使用了人嗜中性细胞弹性蛋白酶(Elastin Products Company，Inc.，Owenswille，MO)和合成肽可溶性底物N-MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p-NA(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO)的检测法，对检测的生物活性组分的弹性蛋白酶抑制活性进行检测。该检测法包括在Elastin Products Company的目录中描述的方法＂人弹性蛋白酶活性的测定＂Research BiochemicalCatalog，Elastin Product Company，Inc.，Owensville，MO，84页(2004)的改进方法，该方法通过引用的方式全部并入本文中。在410nm处和25℃下，使用含有50mM NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)检测所述底物的酶切。位于分光光度计的透明容器内的反应介质的总体积为3.0ml。在酶反应速率降低50％(IC50)所需的浓度下，检测每一个需要检测的生物活性组分。
用于检测超氧化物清除活性的方法：
使用基于Quick等，在＂Rapid microplate assay for superoxide scavengingefficiency，＂J.Neuroscience Methods，97：139-144(2000)中描述的过程的方法，该过程的全部内容通过引用的方式并入本文中。
所述检测考虑了检测生物活性成分的速度和精度，以确定超氧化物清除的比较的抗氧化活性。所述检测包括次黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、和细胞色素C。次黄嘌呤用作底物，并在两个步骤的过程中被黄嘌呤氧化酶所代谢，生成两个超氧化物阴离子。这些游离的阴离子还原了细胞色素C，从而在550nm处产生显著的峰增加。位于分光光度计的透明容器内的反应介质的总体积为3.0ml。
虽然在此描述了优选的实施方式，但在不背离本发明的宗旨和情况下，可以进行各种对本领域技术人员来说是显而易见的各种修改、补充和替换等，因此，本发明的范围如下文所附的权利要求书所述。

Claims (22)

1、一种生物活性成分，该成分含有：源自野甘菊(Tanacetum parthenium)植物的鲜生物量的细胞汁的分离的生物活性组分，其中，所述生物活性组分不含有或基本不含有α-不饱和γ-内酯，所述α-不饱和γ-内酯包括小白菊内酯；并且，其中，所述生物活性组分具有抗炎性和抗氧化活性。
2、根据权利要求1所述的生物活性成分，其中，所述生物活性组分不含有小白菊内酯。
3、根据权利要求1所述的生物活性成分，其中，所述生物活性组分基本不含有小白菊内酯。
4、根据权利要求3所述的生物活性成分，其中，所述生物活性组分中，小白菊内酯的含量等于或小于约0.01重量％。
5、根据权利要求1所述的生物活性成分，其中，所述生物活性组分的抗炎性IC50值为约0.01体积％至约2.0体积％，其中，所述IC50值表示使弹性蛋白酶的酶促反应的速度降低50％所需的生物活性成分的浓度。
6、根据权利要求1所述的生物活性成分，其中，所述生物活性组分的抗氧化活性IC50值为约0.007体积％至约1.0体积％，其中，所述IC50值表示使细胞色素C还原反应的速度降低50％所需的生物活性成分的浓度。
7、根据权利要求1所述的生物活性成分，其中，该生物活性成分还含有稳定剂。
8、一种生物活性组分的分离方法，该生物活性组分源自野甘菊植物的鲜生物量的细胞汁，并且该生物活性组分基本不含有α-不饱和γ-内酯，该方法包括：
提供野甘菊植物的鲜生物量；
在能够有效地生成细胞汁上清液以及膜组分的条件下对所述鲜生物量进行加工；
在能够有效地生成第一细胞汁浆上清液以及细胞质组分沉淀物的条件下对细胞汁上清液进行处理；和
对细胞质组分沉淀物进行分离，其中，所述细胞质组分沉淀物为生物活性组分，该生物活性组分基本不含有α-不饱和γ-内酯，其中所述α-不饱和γ-内酯包括小白菊内酯。
9、根据权利要求8所述的方法，其中，对所述鲜生物量进行加工的步骤包括：
将所述鲜生物量分离成细胞汁组分和富含纤维的材料；
使所述细胞汁组分澄清，以得到澄清的细胞汁组分；和
将所述澄清的细胞汁组分分离成细胞汁上清液和膜组分。
10、根据权利要求8所述的方法，该方法还包括：
在能够有效地生成第二细胞汁浆上清液的条件下使所述第一细胞汁浆上清液澄清；
在能够有效地生成稳定的细胞汁浆组分的条件下将稳定剂与所述第二细胞汁浆上清液混合，
其中，所述稳定的细胞汁浆组分为生物活性组分，该生物活性组分基本不含有α-不饱和γ-内酯，所述α-不饱和γ-内酯包括小白菊内酯。
11、根据权利要求10所述的方法，该方法还包括：在能够有效地生成浓缩的细胞汁浆上清液的条件下，使所述稳定的细胞汁浆组分浓缩。
12、根据权利要求11所述的方法，该方法还包括：在能够有效地生成稳定的浓缩的细胞汁浆组分的条件下，将稳定剂与所述浓缩的细胞汁浆上清液混合，其中，所述稳定的浓缩的细胞汁浆组分为生物活性组分，该生物活性组分不含有α-不饱和γ-内酯，所述α-不饱和γ-内酯包括小白菊内酯。
13、一种生物活性成分，该生物活性成分含有根据权利要求8所述的方法制备的细胞质组分沉淀物，其中，所述细胞质组分沉淀物为生物活性组分，该生物活性组分基本不含有α-不饱和γ-内酯，所述α-不饱和γ-内酯包括小白菊内酯。
14、一种生物活性成分，该生物活性成分含有根据权利要求10制备的稳定的细胞汁浆组分，其中，所述稳定的细胞汁浆组分为生物活性组分，该生物活性组分基本不含有α-不饱和γ-内酯，所述α-不饱和γ-内酯包括小白菊内酯。
15、根据权利要求14所述的生物活性成分，其中，所述稳定的细胞汁浆上清液的抗炎性IC50值为约0.01体积％至约2.0体积％，其中，所述IC50值表示使弹性蛋白酶的酶促反应的速度降低50％所需的生物活性成分的浓度。
16、根据权利要求14所述的生物活性成分，其中，所述稳定的细胞汁浆组分的抗氧化活性IC50值为约0.007体积％至约1.0体积％，其中，所述IC50值表示使细胞色素C还原反应的速度降低50％所需的生物活性成分的浓度。
17、一种生物活性成分，该生物活性成分含有根据权利要求12制备的稳定的浓缩的细胞汁浆组分，其中，所述稳定的浓缩的细胞汁浆上清液组分为生物活性组分，该生物活性组分不含有α-不饱和γ-内酯，所述α-不饱和γ-内酯包括小白菊内酯。
18、根据权利要求17所述的生物活性组分，其中，所述稳定的浓缩的细胞汁浆上清液组分的抗炎性IC50值为约0.01体积％至约2.0体积％，其中，所述IC50值表示使弹性蛋白酶的酶促反应的速度降低50％所需的生物活性成分的浓度。
19、根据权利要求17所述的生物活性组分，其中，所述稳定的浓缩的细胞汁浆组分的抗氧化活性IC50值为约0.007体积％至约1.0体积％，其中，所述IC50值表示使细胞色素C还原反应的速度降低50％所需的生物活性成分的浓度。
20、一种生物活性组合物，该组合物含有源自野甘菊植物的鲜生物量的细胞汁的一种或多种分离的生物活性组分的混合物，其中，所述生物活性组分各自不含有或基本不含有α-不饱和γ-内酯，所述α-不饱和γ-内酯包括小白菊内酯，并且，其中所述生物活性组分具有抗炎性和抗氧化活性。
21、根据权利要求20所述的生物活性组合物，其中，所述一种或多种分离的生物活性组分包括选自由上清液I、上清液II、沉淀物II(生物活性成分A)、最终上清液、生物活性成分B、浓缩的最终上清液、和生物活性成分C所组成的组中的生物活性组分。
22、根据权利要求1所述的生物活性组合物，该组合物还含有稳定剂。
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