BRPI0613870A2

BRPI0613870A2 - derivados da pirazol[1,5-a]pirimidinil-7-il amina como inibidores da proteìna quinase

Info

Publication number: BRPI0613870A2
Application number: BRPI0613870-5A
Authority: BR
Inventors: Patricia Imbach; Pascal Furet; Georg Martiny-Baron
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2005-07-21
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2011-02-15
Also published as: AU2006271924A1; EP1910368A1; CA2615433A1; RU2008106056A; CN101228167A; US20080234284A1; GB0515026D0; WO2007009773A1; MX2008000898A; JP2009501748A; KR20080036997A

Abstract

DERIVADOS DA PIRAZOL[1 ,5-A]PIRIMIDIN-7-IL AMINA COMO INIBIDORES DA PROTEìNA QUINASE. A presente invenção refere-se aos derivados da pirazol[1 ,5- a]pirimidin-7-il amina de acordo com a fórmula (1): e os sais da mesma, e o seu uso para o tratamento de doenças dependen-tes da proteína quinase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DERIVADOSDA PIRAZOL[1,5-A]PIRIMIDIN-7-IL AMINA COMO INIBIDORES DA PRO-TEÍNA QUINASE".

A presente invenção refere-se aos derivados da pirazol[1,5-a]pirimidin-7-il amina, os seus usos para o tratamento de doenças depen-dentes da proteína quinase, os seus usos para a produção de composiçõesfarmacêuticas para o tratamento das ditas doenças, aos métodos de uso dosderivados da pirazol[1,5-a]pirimidin-7-il amina para o tratamento das ditasdoenças, às preparações farmacêuticas compreendendo derivados da pira-zol[1,5-a]pirimidin-7-il amina para o tratamento das ditas doenças, a novosderivados da pirazol[1,5-a]pirimidin-7-il amina, a processos para produção denovos derivados da pirazol[1,5-a]pirimidin-7-il amina e de preparações far-macêuticas, ao uso ou métodos de uso do derivados da pirazol[1,5-a]pirimidin-7-il amina tal como acima mencionado, e/ou a esses derivados dapirazol[1,5-a]pirimidin-7-il amina para uso no tratamento de um animal ou serhumano.

Os derivados da pirazol[1,5-a]pirimidin-7-il amina foram relata-dos na literatura como sendo Iigantes de receptores da benzodiazepina (porexemplo, S. Selleri et al., Bioorg. Med. Chem 7 (12), 2705-11 (1999)), anta-gonistas do fator de liberação da corticotropina (EP 1097709), antagonistasdo receptor da angiotensina Il (por exemplo, S. Takeshi et al., Japn. Pharm.Buli. Al (7), 928-38 (1999)), inibidores da monóxido sintetase (JP 10101671),analgésicos (WO 9535298), fungicidas (EP 071792) ou reagentes antiinfla-matórios (WO 9218504).

Encontrou-se agora que substrato da pirazol[1,5-a]pirimidin-7-ilamina pode ser também ser usado como um padrão do desenho de potentesinibidores da quinase.

Em vista do grande número de inibidores da proteína quinase eda diversidade de doenças proliferativas e outras relacionadas com a proteí-na quinase, existe uma necessidade permanente para fornecer novas clas-ses de compostos que são úteis como inibidores da proteína quinase e as-sim para o tratamento das doenças relacionadas.O que é desejável do ponto de vista de tratamentos possíveis dedoenças proliferativas é que deve haver uma abundância de classes decompostos cada um destinado a uma proteína quinase específica ou a clas-ses da proteína quinase, permitindo assim a realização de tratamentos es-pecíficos. Desse modo, existe uma forte necessidade para se encontrar no-vas classes de compostos que permitam tais efeitos inibidores específicos.

Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um com-posto de acordo com a Fórmula (I):

<formula>formula see original document page 3</formula>

Em que:

R1 é H

R2 é benzila; fenila não-substituída ou fenila substituída por umou dois substituintes escolhidos do grupo composto de halogênio, dialquila-minoalcóxi inferior, hidróxi, alcóxi, benzilóxi, cicloalquila, amino e acetil ami-no;

R3 é H e R4 é hidroxialquila ou

R3 e R4 juntamente com o átomo de nitrogênio são ligados pararepresentar as morfolinila, pirrolinila, piperidinila ou piperazinila, os heteroci-clos sendo opcionalmente também substituídos por até quatro grupos alquila;

A é fenila não-substituída ou substituída por um ou mais dossubstituintes escolhidos do grupo composto de mono, di ou trialcóxi inferior,dialquilaminila inferior; dialquilaminoalcóxi inferior; morfolinila que é opcio-nalmente dissubstituída por alquila; piperidinila que é opcionalmente substi-tuída por dialquilaminila inferior; e piperazinila que é opcionalmente substitu-ida por alquila inferior, alcóxi inferior, alquil inferior piperazinila, pirrolinila,dialquilaminila inferior ou dialquilaminila; ou um sal farmacêutico do mesmo.Uma modalidade preferencial é um composto de acordo com aFórmula (I) de acordo com o acima citado, em que:

R1 é H

R2 é fenila substituída por flúor ou cloro;

R3 é H e R4 é hidroxietila ou

R3 e R4 juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estãoligados para representar piperazinila;

A é fenila que é substituída com um ou mais dos substituintesescolhidos do grupo consistindo em: mono, di ou trimetóxi, dimetilaminoetóxie dietilamino piperidinil ou um sal farmacêutico do mesmo.

Uma modalidade adicional é um composto de acordo com aFórmula (I) de acordo com o acima citado, em que:

R1 é H;

R2 é fenila substituída por flúor ou cloro;

R3 e R4 juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estãoligados para representar a piperazinila;

A é fenila que é substituída com um ou mais dos substituintesescolhidos do grupo consistindo em: mono, di ou trimetóxi, dimetilaminoetóxie dietilamino piperidinila ou um sal farmacêutico do mesmo.

R1 é H;

R2 é fenila substituída por flúor ou cloro;

A é fenila que é substituído com um ou mais dos substituintesescolhidos do grupo consistindo em: mono, di e trimetóxi ou um sal farma-cêutico do mesmo.

Uma outra modalidade é um composto de acordo com a Fórmula(I) de acordo com o acima citado, em que:

R1 é H;

R2 é fenila substituída por flúor ou cloro;R3 é H e R4 é hidroxietila;

A é fenila que é substituída com um ou mais dos substituintesescolhidos do grupo consistindo em: mono, di e trimetóxi ou um sal farma-cêutico do mesmo.

Em uma modalidade a presente invenção se refere a um com-posto de acordo com a Fórmula (I) para uso no tratamento de um corpo ani-mal ou um corpo humano.

Em ainda uma outra modalidade é o uso de um composto deacordo com a Fórmula (I) de acordo com o acima citado na preparação deuma composição farmacêutica.

Em ainda uma outra modalidade é uma composição farmacêuti-ca compreendendo um composto de acordo com a Fórmula (I) de acordocom o acima citado.

A composição farmacêutica compreende preferivelmente umcomposto de acordo com a Fórmula (I) de acordo com o veículo acima cita-do e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em uma outra modalidade, é fornecido o uso de um compostode acordo com a Fórmula (I) de acordo com o acima citado na preparaçãode composições farmacêuticas para uso no tratamento de uma doença de-pendente da quinase.

Uma doença dependente da proteína quinase é preferivelmenteuma que dependa das seguintes proteínas c-Abl, Bcr-Abl, c-Kit, c-Raf, Flt-1,Flt-3, Her-1, KDR, PDGFR-quinase, c-Src, RET-receptor quinase, FGF-R1,FGF-R2, FGF-R3, FGF-R4, quinases do receptor de Efrina (por exemplo, E-phB2 quinase, EphB4 quinase e quinases relacionadas com Eph), as quina-ses da caseína (CK-1, CK-2, G-CK), Pak, ALK, ZAP70, Jak1, Jak2, Axl,Cdkl, cdk4, cdk5, Met, FAK, Pyk2, Syk, quinase do receptor de insulina, Tie-2 ou mutações constutivamente de ativação das quinases (quinases de ati-vação) tal como de Bcr-Abl, c-Kit, c-Raf, Flt-3, FGF-R3, receptores PDGF,RET, MET (especial, aberrante e altamente expressada ou ativada) e doen-ças dependentes da quinase ou doenças dependentes da ativação dos ca-minhos da quinase, ou uma doença dependente de quaisquer duas ou maisdas quinases apenas acima mencionadas.

Uma doença dependente da proteína quinase é uma mais prefe-rivelmente aquela que dependa de c-abl, Flt-3, KDR, c-Src, RET, EphB4, c-Kit, cdkl, FGFR-1, c-raf, Her-1, Ins-R ou Tek.

Bem mais preferivelmente, a doença a ser tratada é uma doençaproliferativa, preferivelmente um tumor benigno ou especialmente um tumormaligno, mais preferivelmente carcinoma do cérebro, do rim, do fígado, daglândula adrenal, da bexiga, do seio, do estômago (especialmente tumoresgástricos), dos ovários, do cólon, do reto, da próstata, do pâncreas, do pul-mão, da vagina, da tiróide, sarcoma, glioblastomas, mieloma múltiplo oucâncer gastrointestinal, especialmente carcinoma do cólon ou adenoma co-lorretal, ou um tumor da garganta e da cabeça, uma hiperproliferação epi-dérmica, especialmente, a hiperplasia da próstata, uma neoplasia, especial-mente de caráter epitelial, do carcinoma preferivelmente mamário ou umaleucemia.

Em uma modalidade também adicional, a doença a ser tratada éuma doença que é provocada pela angiogênese persistente, tal como a pso-ríase; o sarcoma de Kaposi; a restenose, por exemplo, a restenose induzidapor stent; a endometriose; a doença de Crohn; a doença de Hodgkin; a Ieu-cernia; a artrite, tal como a artrite reumatóide; o hemangioma; angiofibroma;doenças dos olhos, tais como o glaucoma neovascular e retinopatia diabéti-ca; doenças renais, tais como o glomerulonefrite; nefropatia diabética; ne-frosclerose maligna; síndrome das microangiopatias trombóticas; rejeição detransplantes e glomerulopatia; doenças fibróticas, tais como a cirrose do fí-gado; doenças proliferativas das células mesangiais; arteriosclerose; os fe-rimentos do tecido dos nervos.

Os compostos da presente invenção podem também ser usadospara a inibição da reoclusão de vasos após o tratamento com cateter balão,para o uso em próteses vasculares ou após ter introduzido dispositivos me-cânicos para manter abertos os vasos, tal como, por exemplo, após o uso destents, ou como imunossupressores, como um auxiliar para a cura de feri-mentos sem produção de cicatrizes e para o tratamento manchas senís e dadermatite de contato.

Os termos gerais utilizados até aqui e daqui por diante possuempreferivelmente dentro do escopo da presente descrição os seguintes signifi-cados, a menos que de outra maneira seja indicado:

O termo alquila inclui uma alquila inferior preferivelmente alquilacom até 7 átomos de carbono, preferivelmente de 1 a incluindo 5, e é linearou ramificado; preferivelmente, a alquila inferior é pentila, tal como a n-pentila, butila, tal como n-butila, sec-butila, isobutila, tert-butila, propila, talcomo n-propila ou isopropila, etila ou metila. Uma alquila preferivelmenteinferior é metila, propila ou tert-butila. A alquila pode ser substituída ou não-substituída e quando substituída pode ser com até 3 substituintes incluindouma outra alquila, cicloalquila, alquenila, alquinila, ou quaisquer dos substitu-intes definidos acima para a arila ou quaisquer dos grupos funcionais defini-dos abaixo.

Os termos halo ou halogênio são preferivelmente flúor, cloro,bromo ou iodo, mais preferivelmente flúor, cloro ou bromo.

Onde a forma plural é usada para compostos, sais, preparaçõesfarmacêuticas, doenças e similares, tal forma pretende significar também umúnico composto, sal, ou similares. Os sais são especialmente os sais farma-ceuticamente aceitáveis dos compostos de acordo com a Fórmula (I). Taissais são formados, por exemplo, como sais de adição ácida, preferivelmentecom ácidos orgânicos ou inorgânicos, dos compostos de acordo com a Fór-mula (I) com um átomo básico do nitrogênio, especialmente os sais farma-ceuticamente aceitáveis. Os ácidos inorgânicos adequados são, por exem-pio, ácidos de halogênios, tais como o ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ouácido fosfórico. Os ácidos orgânicos adequados são, por exemplo, ácidoscarboxílicos, ácido fosfônico, ácido sulfônico ou ácido sulfâmico, por exem-plo, ácido acético, ácido propiônico, ácido octanóico, ácido decanóico, ácidododecanóico, ácido glicólico, ácido lático, ácido fumárico, ácido succínico,ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azeláico, ácido málico,ácido tartárico, ácido cítrico, aminoácidos, tais como o ácido glutâmico ou oácido aspártico, ácido maléico, ácido hidroximaléico, ácido metilmaléico, áci-do cicloexanocarboxílicos, ácido adamantanocarboxílicos, ácido benzóico,ácido salicílico, ácido 4-aminossalicílico, ácido ftálico, ácido fenilacético, áci-do mandélico, ácido cinâmico, ácido metano ou etano sulfônico, ácido 2-hidroxietanossulfônico, ácido etano-1,2-dissulfônico, ácido benzenossulfôni-co, ácido 2-naftalenossulfônico, ácido 1,5-naftalenodissulfônico, ácido 2, 3ou 4-metilbenzenossulfônico, ácido metilsulfúrico, ácido etilsulfúrico, ácidododecilsulfúrico, ácido N-cicloexil sulfâmico, ácido N-metila, N-etila ou N-propil-sulfâmico, ou outros ácidos orgânicos protônicos, tais como o ácidoascórbico.

Na presença de radicais negativamente transportados, tais comoo carbóxi ou o sulfo, os sais podem também ser formados com bases, porexemplo, sais de metal ou de amônio, tais como sais de metais alcalinos oualcalinos-terrosos, por exemplo, sódio, potássio, os sais do magnésio ou docálcio, ou os sais do amônio com amônia ou aminas orgânicas adequadas,tais como monoaminas terciárias, por exemplo, trietilamina ou tri(2-hidroxietil)amina, ou bases heterocíclicas, por exemplo, N-etil-piperidina ouΝ,Ν'-dimetilpiperazina.

Quando um grupo básico e um grupo ácido estão presentes namesma molécula, um composto de acordo com a Fórmula (I) também podeformar sais internos.

Para finalidades de isolamento ou de purificação também é pos-sível usar sais farmaceuticamente inaceitáveis, por exemplo, picratos oupercloratos. Para uso terapêutico, somente os sais ou compostos livres far-maceuticamente aceitáveis são empregados (onde aplicável, na forma depreparações farmacêuticas), e estes são conseqüentemente preferidos.

Devido à proximidade de relações entre os compostos na formalivre e aqueles na forma de seus sais, incluindo aqueles sais que podem serusados como intermediários, por exemplo, na purificação ou na identificaçãodos compostos, as formas dos tautômeros ou as misturas tautoméricas e osseus sais, qualquer referência aos compostos citados até aqui e daqui pordiante especialmente os compostos de acordo com a Fórmula (I), deve sercompreendida como estando relacionada também aos tautomers correspon-dentes desses compostos, especialmente dos compostos de acordo com aFórmula (I), as misturas tautoméricas desses compostos, especialmente doscompostos de acordo com a Fórmula (I), ou sais de quaisquer desses, con-forme seja apropriado e vantajoso ou mesmo que de outro modo não tenhasido mencionado.

Onde for mencionado o período "um composto..., um tautômerodo mesmo; ou um sal do mesmo" ou algo assemelhado for mencionado, talperíodo pretende possuir o seguinte significado "um composto..., um tautô-mero do mesmo, ou um sal do composto ou do tautômero".

Qualquer átomo de carbono assimétrico pode estar presente nasconfigurações (R), (S) ou (R,S), preferivelmente nas configurações (R) ou(S). Os substituintes em um anel em átomos com ligações saturadas podem,se possível, estar presentes na forma eis (= Z-) ou trans (= E-). Os compos-tos podem assim estar presentes como misturas de isômeros ou preferivel-mente como isômeros puros, preferivelmente como diastereoisômeros naforma enanciomérica pura ou enanciômeros puros.

A presente invenção também se refere aos pró-fármacos de umcomposto de acordo com a Fórmula (I) que se convertem in vivo no compos-to de acordo com a Fórmula (I). Qualquer referência a um composto de a-cordo com a Fórmula (I) deve conseqüentemente ser compreendida comofazendo referência também aos pró-fármacos correspondentes do compostode acordo com a Fórmula (I), como apropriado e vantajoso.

Os compostos de acordo com a Fórmula (I) podem ser prepara-dos analogamente ao procedimento descrito por Alicade, E; De Mendoza, J;Garcia-Marquina, JM; Almera, C; J. Heterocycl. Chem. 11. 423 (1974) ou naEP2005/000602.

Os sais dos compostos de acordo com a Fórmula (I) possuindopelo menos um grupo de formação de sal podem ser preparados por méto-dos já por si próprios conhecidos. Por exemplo, os sais dos compostos deacordo com a Fórmula (I) possuindo grupos ácidos podem ser formados, porexemplo, tratando os compostos com compostos metálicos, tais como saisde metais alcalinos de ácidos carboxílicos orgânicos adequados, por exem-pio, o sal de sódio do ácido 2-etilexanóico, com os compostos orgânicos demetais alcalinos ou de metais alcalinos-terrosos, tais como os corresponden-tes hidróxidos, carbonatos ou bicarbonatos, tais como o hidróxido de sódioou de potássio, o carbonato ou o bicarbonato, com os compostos correspon-dentes do cálcio ou com amônia ou um amina orgânica apropriada, emquantidades estequiométricas ou somente um pequeno excesso do agentede formação de sal que está sendo usado preferivelmente. Os sais da adi-ção ácida dos compostos de acordo com a Fórmula (I) são obtidos na ma-neira habitual, por exemplo, tratando os compostos com um reagente ácidoou como ragente de troca aniônica adequado. Os sais internos dos compos-tos de acordo com a Fórmula (I) contendo grupos de formação de sais áci-dos e básicos, por exemplo, um grupo livre carbóxi e um grupo livre amino,podem ser formados, por exemplo, pela neutralização dos sais, tal como aadição de ácido ao sal, até ponto isoelétrico, por exemplo, com bases fracas,ou pelo tratamento resinas de troca iônica.

Os sais podem ser convertidos na maneira habitual nos seuscompostos livres; os sais de metal e de amônio podem ser convertidos, porexemplo, pelo tratamento com ácidos adequados, e sais da adição ácida,por exemplo, pelo tratamento com um agente básico apropriado.

As misturas dos isômeros que podem se obtidos de acordo coma presente invenção podem ser separadas em seus isômeros individuais pormétodos já conhecidos por si próprios; os diastereoisômeros podem ser se-parados, por exemplo, pelo particionamento entre misturas de solventes poli-fásicos, a recristalização e/ou a separação cromatográfica, por exemplo, so-bre sílica-gel ou, por exemplo, cromatografia líquida de média pressão emuma coluna de fase reversa, e os racematos podem ser separados, por e-xemplo, pela formation dos sais com reagentes de formação de sal otica-mente puros e pela separação da mistura dos diastereoisômeros assim obti-dos, por exemplo, por meio do cristalização fracionada, ou por cromatografiaem coluna sobre um material oticamente ativo.

Os intermediários e os produtos finais podem ser manipuladose/ou purificados de acordo com métodos padrão, por exemplo, usando mé-todos cromatográficos, métodos de distribuição, recristalização, e similares.

As seguintes condições aplicam-se em geral a todos os proces-sos mencionados anteriormente e daqui por diante, enquanto que são prefe-ridas as condições reacionais especificamente mencionadas acima ou abaixo.

Todas as etapas de processos acima mencionadas podem serrealizadas sob as condições de reação que são conhecidas por si próprias,preferivelmente aquelas mencionadas especificamente, na ausência ou, ha-bitualmente, na presença dos solventes ou dos diluentes, preferivelmente ossolventes ou os diluentes que são inertes para os reagentes usados que osdissolvem, na ausência ou na presença de agentes catalisadores, de con-densação ou de neutralização, por exemplo, resinas de troca iônica, tais co-mo de troca catiônica, por exemplo, na forma de H+, dependendo da nature-za da reação e/ou dos reagentes em temperaturas reduzidas, normais ouelevadas, por exemplo, em uma faixa de temperatura de aproximadamente -100-C a aproximadamente 1909C, preferivelmente de aproximadamente -80-C a aproximadamente 150 9C, por exemplo, em uma faixa de -80 9C a -60-C, na temperatura ambiente, na faixa de -20 9C a 40 9C ou na temperaturade refluxo, sob a pressão atmosférica ou em um vaso fechado, onde a sub-pressão apropriada e/ou uma atmosfera inerte, por exemplo, sob uma at-mosfera de argônio ou de nitrogênio.

Em todos os estágios das reações, as misturas dos isômerosque são formados podem ser separadas nos isômeros individuais, por e-xemplo, diastereoisômeros ou enanciômeros, ou em quaisquer misturas de-sejadas de isômeros, por exemplo, racematos ou misturas dos diastereoi-sômeros, por exemplo, analogamente aos métodos descritos sob o título"Etapas Adicionais do Processo".

Os solventes a partir dos quais aqueles solventes que são ade-quados para qualquer reação particular podem ser selecionados incluemaqueles mencionados especificamente ou, por exemplo, água, ésteres, taiscomo alquil inferior alcanoatos inferiores, por exemplo, acetato de etila, éte-res, tais como éteres alifáticos, por exemplo, éter dietílico, ou os éteres cícli-cos, por exemplo, o tetraidrofurano ou o dioxano, hidrocarbonetos aromáti-cos líquidos, tais como benzeno ou tolueno, álcoois, tais como metanol, eta-nol ou 1-propanol ou 2-propanol, nitrilas, tais como a acetonitrila, hidrocar-bonetos halogenados, tais como o cloreto de metileno ou clorofórmio, ami-das ácidas, tais como a dimetilformamida ou dimetil acetamida, bases, taiscomo bases nitrogenadas heterocíclicas, por exemplo, piridina ou N-metilpirrolidinona-2, anidridos de ácidos carboxílicos, tais como anidridosinferiores de ácidos alcanóicos, por exemplo, anidrido acético, hidrocarbone-tos cíclico, lineares ou ramificados, tais como cicloexano, hexano ou isopen-tano, ou as misturas daqueles solventes, por exemplo, soluções aquosas, amenos que indicado de outra maneira na descrição dos processos. Tais mis-turas solventes podem também ser usadas na manipulação, por exemplo,por cromatografia ou particionamento.

Os compostos, incluindo seus sais, também podem ser obtidosna forma de hidratos, ou seus cristais podem, por exemplo, incluir o solventeusado para a cristalização. Diferentes formas cristalinas podem estar pre-sentes.

A presente invenção também se refere a aquelas formas de pro-cesso em que um composto que podem ser obtido como intermediário emqualquer etapa do processo é usado como material de partida e as etapasrestantes do processo são realizadas, ou em que um material de partida éformado sob condições reacionais ou usado na forma de um derivado, porexemplo, na forma protegida ou na forma de um sal, ou um composto quepode ser obtido pelo processo de acordo com a presente invenção são pro-duzidos sob condições de processo e processados também in situ. No pro-cesso de acordo com a presente invenção aqueles materiais de partida sãousados preferivelmente resultando em novos compostos de acordo com aFórmula (I) descritos no início como sendo especialmente valiosos. É dadapreferência especialmente às condições de reação que são idênticas ouanálogas aquelas mencionadas nos exemplos.

Os compostos de acordo com a Fórmula (I) possuem proprieda-des farmacológicas valiosas. Exibem sua atividade biológica, por exemplo,como inibidores de diferentes proteínas quinases, inibindo preferivelmente c-abl, Flt-3, KDR1 c-Src, RET, EphB4, c-Kit, cdkl, FGFR-1, c-raf, Her-1, Ins-Rou Tek, mais preferivelmente como inibidores de quinases do receptor deEfrina B4 (EphB4). Conseqüentemente, o composto da presente invenção éútil para o tratamento de doenças dependentes de quinase, por exemplo,como fármacos para o tratamento de doenças proliferativas.

O termo "tratamento de doenças dependentes da proteína qui-nase da tirosina" se refere ao tratamento profilático ou preferivelmente tera-pêutico (incluindo paliativo e/ou curativo) das ditas doenças, especialmentedas doenças mencionadas abaixo.

A inibicão da RET é medida como se seque:

O vetor doador pFB-GSTX3 do baculovírus é usado para gerarum baculovírus recombinante que expressa a região 658-1072 do aminoáci-do (Protocolo Suiço Nq Q9BTB0) do domínio intra-citoplasmático da quinaseda RET-Men2A humana que corresponde ao domínio da quinase RET (w-tRET) e do RET-Men2B do tipo selvagem, que difere da wtRET pela muta-ção de ativação no laço de ativação M918T. As seqüências de codificaçãopara o domínio citoplasmático da wtRET e da RET-Men2B são amplificadaspela PCR da pBABEpuro RET-Men2A e da pBABEpuro RET-Men2B dosplasmídios. Os fragmentos amplificados do DNA e o vetor pFB-GSTX3 sãotornados compatíveis para ligação pela digestão com Sall e Kpnl. A ligaçãodesses fragmentos de DNA resulta nos plasmídios doadores do baculovírus,pFB-GX3-RET-Men2A e pFB-GX3-RET-Men2B, respectivamente.

Produção do vírus:

Os vetores de transferência contendo os domínios da quinasesão transfectados na linhagem celular da DHIOBac (GIBCO) e semeado emplacas de ágar seletivas. As colônias sem inserção da seqüência da fusãono genoma viral (transportado pelas bactérias) são azuis. As únicas, colô-nias brancas são escolhidas e o DNA viral (bacmid) é isolado das bactériaspor procedimentos padrão de purificação do plasmídio. As células Sf9 ou ascélulas Sf21 (Coleção da Cultura do Tipo Americano) são transfectadas en-tão em frascos de 25 cm2 com o DNA viral usando o reagente de Cellfectin.Determinação da expressão da proteína em pequena escala nas células Sf9:Os meios contendo vírus são coletados da cultura de célulastransfectadas e usados para que a infecção aumente seu título. Os meioscontendo vírus obtidos após dois ciclos da infecção são usados para a ex-pressão em ampla escala da proteína. Para a expressão em ampla escalada proteína placas redondas para cultivo de tecido com 100 cm2 são semea-das com 5 χ 107 células/placa e infectadas com 1 mL dos meios contendovírus (aproximadamente 5 MOIs). Após 3 dias, as células são raspadas daplaca e centrifugadas em 500 RPM por 5 minutos. Os péletes da células de10 a 20, placas de 100 cm2, são ressuspensos em 50 mL do tampão de Iiseresfriado com gelo (25 mM de tris-HCI, de pH 7,5, EDTA a 2 mM, 1% NP-40,1 mM DTT, 1 mM P-MSF). As células são agitadas sobre gelo por 15 minu-tos e centrifugadas então a 5.000 rpms por 20 minutos.

Purificação de proteínas GST marcadas:

O lisado celular centrifugado é transportado para uma coluna deum glutationa-sefarose de 2 mL (Pharmacia) e lavado 3 χ com 10 mL de 25mM tris-HCI, pH 7,5, EDTA a 2 mM, 1 mM DTT, 200 mM de NaCI. As proteí-nas GST marcadas são então eluídas por 10 aplicações (de 1 mL cada) de25 mM tris-HCI, pH 7,5, 10 mM de glutationa reduzida, 100 mM de NaCI, 1mM DTT1 glicerol a 10% e são armazenadas em -70 °C.

Medição da atividade da enzima:

Os ensaios da proteína quinase da tirosina com purificados daproteína GST-wtRET ou da proteína GST-RET-Men2B são realizados emum volume final de 30 μί contendo 15 ng da proteína GST-wtRET ou da pro-teína GST-RET-Men2B, 20 mM de tris-HCI, pH 7,5, 1 mM MnCI2, 10 mM deMgCI2, 1 mM DTT, 3 pg/mL poli(Glu,Tyr) 4:1, 1% DMSO, 2,0 μΜ ATP (γ-[33PJ-ATP 0,1 pCi). A atividade é ensaiada na presença ou na ausência dosinibidores, medindo a incorporação de 33P do [Y33P] ATP no substrato po-li(GIu1Tyr) 4:1. O ensaio é realizado em microplacas de 96 cavidades natemperatura ambiente por 15 minutos sob as condições descritas abaixo eterminadas pela adição de 20 μί de EDTA a 125 mM. Posteriormente, 40 pLda mistura de reação são transferidos sobre a membrana de Immobilon-PVDF (MiIIipore) embebida previamente por 5 minutos com metanol, enxa-guada com água, depois embebida por 5 minutos com H3PO4 a 0,5% e mon-tada na linha de vácuo com fonte de vácuo desconectada. Após ter tingidotodas as amostras, o vácuo é conectado e cada cavidade é enxagüado com200 μL H3PO4 a 0,5%. As membranas são removidas e lavadas 4 χ em umagitador com H3PO4 a 0,5% uma vez com etanol. As membranas são conta-das após secagem na temperatura ambiente, montando na moldura de mi-croplaca de 96 cavidades da Packard TopCount, e uma adição de 10pL/cavidade de Microscint TM (Packard). Os valores de IC50 são calculadospela análise da regressão linear da inibição percentual de cada compostoem duplicata, em 4 concentrações (geralmente 0,01 μΜ, 0,1 μΜ, 1 μΜ e 10μΜ). Uma unidade da atividade da proteína quinase é definida como 1 nmolde 33P ATP transferido do [Y33P] ATP ao substrato proteína/minuto/mg daproteína a 37°C.

Cálculos do ICSo·

Entrada: ensaio parado 3 χ 4 μΐ_ sobre membrana de Immobilon, não-lavado.Linha de base (3 cavidades): ensaio com o H2O em vez do controle positivoda enzima.

Controle positivo (4 cavidades): DMSO a 3% em vez do composto.

Controle do banho (1 cavidade): nenhuma mistura reacional.

Os valores de IC50 da reação são calculados pela análise da re-gressão logarítmica da inibição percentual de cada composto em 4 concen-trações (geralmente diluições em série de 3x ou 10x iniciando em 10 μΜ).Em cada experimento, a inibição real pelo composto de referência é usadapara normalização dos valores de IC50 para com base no valor médio do ini-bidor da referência:

IC5o(normalizado) = IC50(medido) χ IC5o ref.(médio)IC50 ref.(medido)

Exemplo: Inibidor de referência no experimento 0,4 μΜ, média de 0,3 μΜ.

Composto do teste no experimento 1,0 μΜ, normalização =0,3/0,4 = 0,75 μΜ.

Por exemplo, a estauroporina ou um derivado sintético da estau-roporina são usados como compostos de referência.

Usando este protocolo, os compostos de acordo com a Fórmula(I) são encontrados mostrando os valores de IC50 para a inibição RET nafaixa de 0,005 μΜ a 100 μΜ, preferivelmente na faixa de 0,01 μΜ a 2 μΜ.

Eficácia dos compostos da presente invenção como inibidores da atividadeda quinase da tirosina da proteína c-Abl pode ser demonstrada como se seque:

O ensaio in vitro da enzima é realizado em microplacas de 96cavidades como um ensaio de ligação do filtro tal como descrito por Geissleret ai., em Câncer Res. 1992; 52:4492-4498, com as seguintes modificações.

O domínio da quinase com His-marcada da c-Abl é clonado e expressado nosistema baculovírus/Sf9 tal como descrito por Bhat et al., no J. Biol.Chem.1997; 272:16170-16175. Uma proteína de 37 kD (quinase da c-Abl) é purifi-cada por um procedimento em duas etapas sobre uma coluna do quelato decobalto metálico seguida por uma coluna de troca aniônica com um rendi-mento de 1 mg/L a 2 mg/L das células Sf9 (Bhat et al., referência citada). Apureza da quinase da c-Abl é >90% tal como avaliado por SDS-PAGE apóstingimento com Coomassie azul. O ensaio (volume total de 30 μΙ_) contém:quinase da c-Abl (50 ng), 20 mM Tris.HCI, pH 7,5, 10 mM de MgCI2, 10 μΜNa3VO4, 1 mM DTT e 0,06 μΟί/βηεβίο [γ 33P]-ATP (ATP a 5 μΜ) usando 30μg/mL de poli-Ala,Glu,Lys,Tyr-6:2:5:1 (Poli-AEKY, Sigma P1152) na presen-ça de DMSO 1 %. As reações são terminadas pela adição de 10 μί de ED-TA a 250 mM e 30 μΙ_ da mistura da reação são transferidos sobre a mem-brana de ImmobiIon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, USA) embebida previa-mente por 5 minutos com metanol, enxaguada com água, depois embebidapor 5 minutos com 0,5 % de H3PO4 e montada na linha de vácuo com fontedesconectada do vácuo. Após ter tingido todas as amostras, o vácuo é co-nectado e cada cavidade é enxaguado com 200 μΙ_ 0,5 % de H3PO4. Asmembranas são removidas e lavadas em um agitador com 0,5 % de H3PO4(4 vezes) e uma vez com etanol. As membranas são contadas após seca-gem na temperatura ambiente, montando na moldura de microplaca de 96cavidades da Packard TopCount, e uma adição de 10 μL/cavidade de Mi-croscint TM (Packard). Usando este sistema do teste, compostos de acordocom a Fórmula I mostram os valores IC5o da inibição para a inibição da c-Ablna faixa de 0,002 M a 100 M, geralmente entre 0,002 M e 5 M.

Eficácia dos compostos da presente invenção como inibidores da atividadeda proteína quinase tirosina de KDR pode ser demonstrada tal como se segue:

A inibição do receptor induzido da VEGF da autofosforilação po-de ser confirmada com um experimento adicional in vitro nas células tal co-mo as células de CHO transfectadas, que permanentemente expressam oreceptor humano VEGF-R2 (KDR)1 são semeados no meio de cultura com-pleto (com soro bovino fetal de 10% = FCS) em placas de cultura celular de6 cavidades e incubada a 37°C sob CO2 a 5% até que mostrem uma conflu-ência de aproximadamente 80%. Os compostos a serem testados são entãodiluídos no meio de cultura (sem FCS, com 0,1% albumina de soro bovino) eadicionados às células, (os controles compreendem o meio sem compostosde teste). Após uma incubação de duas horas em 37°C, VEGF recombinanteé adicionado; a concentração final de VEGF é 20 ng/ml). Após uma incuba-ção adicional de cinco minutos a 37°C, as células são lavadas duas vezescom PBS resfriado com gelo (tamponado com fosfato de solução salina) eIisadas imediatamente no tampão de Iise em 100 μΙ por cavidade. Os Iisadoscentrifugados são então centrifugados para remover os núcleos das células,e as concentrações da proteína dos sobrenadantes são determinadas usan-do um teste comercial para proteína (BIORAD). Os Iisados podem então ouserem usados imediatamente ou, se necessário, serem armazenados a -20°C.

Uma reação ELISA sanduíche é realizada para medir a fosforilação daVEGF-R2:

Um anticorpo monoclonal para a VEGF-R2 (por exemplo, Mab1495.12.14; ProQinase, Freiburg, Germany) é imobilizado em placas pretasde ELISA (OptiPIacaTM HTRF-96 da Packard). As placas são então lavadase os sítios livres de ligação com proteína restantes são saturados com 3%TopBlock® (Juro, Catálogo Nq TB232010) em tampão de fosfato de soluçãosalina com Tween 20® (monolaurato de polioxietileno(20)sorbitano, I-Cl/Uniquema) (PBST). Os Iisados de célula (20 pg de proteína por cavidade)são então incubados nestas placas durante a noite a 4 0C junto com um an-ticorpo de antifosfotirosina ligado com fosfatase alcalina (PY20:AP da Zy-med). A (as placas são lavadas outra vez e) ligação do anticorpo da antifos-fotirosina com o receptor fosforilado capturado é demonstrada então usandoum substrato Iuminescent AP (CDP-Star, pronto para uso, com Emerald II;Applied Biosystems). A luninescência é medida em um contador de cintila-ção de microplaca Packard Top Count Microplate Scintillation Counter. Adiferença entre o sinal do controle positivo (estimulado com VEGF) e aqueledo controle negativo (não-estimulado com VEGF) corresponde à fosforilaçãoVEGF-R2 induzida por VEGF (= 100 %). A atividade das substâncias testa-das é calculada como a inibição percentual da fosforilação VEGF-R2 induzi-da por VEGF, em que a concentração da substância que induz a metade dainibição máxima é definida como o IC5o (dose inibitória para a inibição de50%). Compostos de acordo com a Fórmula I mostram aqui um IC50 na faixade 0,005 μΜ a 20 μΜ, preferivelmente entre 0,005 μΜ e 1 μΜ para a inibiçãode KDR.

A inibição da quinase Flt3 é determinada como se seque:

O vetor doador pFbacGOl do baculovírus (GIBCO) é usado paragerar um baculovírus recombinante que expressa os aminoácidos da regiãodo aminoácido 563-993 do domínio citoplasmático da quinase de Flt-3 hu-mano. A seqüência de codificação para o domínio citoplasmático da Flt-3 éamplificada por PCR a partir das bibliotecas de c-DNA humano (Clontech).

Os fragmentos amplificados do DNA e o vetor pFbacGOl são tornados com-patíveis para ligação pela digestão com BamHI e Hindlll. Ligação destesfragmentos de DNA resulta no baculovírus flt-3(1.1) doador do plasmídio. Aprodução dos vírus, a expressão das proteínas nas células Sf9 e a purifica-ção das proteínas fundidas de GST são realizados como se segue:

Produção do vírus:

O vetor de transferência (pFbacGOl-Flt-3) contendo o domínioda quinase Flt-3 é transfectado na linhagem celular da DHIOBac (GIBCO) eas células transfectadas são semeadas em placas de ágar seletivo. As colô-nias sem inserção da seqüência da fusão no genoma viral (transportado pe-las bactérias) são azuis. As únicas colônias brancas são escolhidas e o DNAviral (bacmid) é isolado das bactérias por procedimentos padrão de purifica-ção do plasmídio. As células Sf9 ou Sf21 (Coleção de Culturas do Tipo Ame-ricano) são transfectadas então em frascos com o DNA viral usando o rea-gente de Cellfectin.

Determinação da expressão da proteína em pequena escala nas células Sf9:

O meio contendo os virus é coletado da cultura de células trans-fectadas e usado para que a infecção aumente seu título. O meio contendoos vírus obtidos após dois ciclos de infecção é usado para a expressão emampla escala da proteína. Para a expressão em ampla escala da proteínaplacas redondas para cultivo de tecido com 100 cm2 são semeados com os5 χ 107 células/placa e infectadas com 1 ml_ dos meios contendo vírus (a-proximadamente 5 MOIs). Após 3 dias as células são raspadas da placa ecentrifugadas em 500 RPM por 5 minutos. Os péletes da células de 10 a 20,placas de 100 cm2, são ressuspensos em 50 mL do tampão de Iise resfriadocom gelo (25 mM de tris-HCI, de pH 7,5, EDTA a 2 mM, 1% NP-40, 1 mMDTT, 1 mM P-MSF). As células são agitadas sobre gelo por 15 minutos ecentrifugadas então a 5.000 rpms por 20 minutos.

Purificação de proteínas GST marcadas:

O Iisado celular centrifugado é transportado em uma coluna deum glutationa-sefarose de 2 mL (Pharmacia) e lavado três vezes com 10 mLde 25 mM Tris-HCI, pH 7,5, EDTA de 2 mM, 1 mM DTT, 200 mM de NaCI.

As proteínas GST marcadas são então eluídas por 10 aplicações (de 1 mLcada) de 25 mM tris-HCI, pH 7,5, 10 mM de glutationa reduzida, 100 mM deNaCI, 1 mM DTT, glicerol a 10% e são armazenadas em -70 °C.

Medição da atividade da enzima:

Os ensaios da proteína quinase da tirosina com GST-Flt-3 purifi-cados são transportados para um volume final de 30 pL contendo 200 a1800 ng da proteína da enzima (dependendo da atividade específica), 20mM Tris-HCI, pH 7,6, 3 mM MnCI2, 3 mM MgCI2, 1 mM DTT, 10 μΜ Na3VO4,3 μg/mL poly(Glu.Tyr) 4:1, 1 % DMSO, 8,0 μΜ ATP e 0,1 μΟΐ [γ33 Ρ] ATP). Aatividade é ensaiada na presença ou na ausência dos inibidores, medindo aincorporação de 33P do [/3P] ATP no substrato poli(Glu,Tyr). O ensaio (30μL) é realizado em uma microplacas de 96 cavidades na temperatura ambi-ente por 20 minutos sob as condições descritas abaixo e terminadas pelaadição de 20 μL de EDTA 125 mM. Posteriormente, 40 μL da mistura de re-ação são transferidos sobre a membrana de ImmobiIon-PVDF (Millipore,Bedford, MA, USA) embebida previamente por 5 minutos com metanol, en-xaguada com água, depois embebida por 5 minutos com H3PO4 a 0,5% emontada na linha de vácuo com fonte de vácuo desconectada. Após ter go-tejado todas as amostras, o vácuo é conectado e cada cavidade é enxagüa-da com 200 pL H3PO4 a 0,5%. As membranas são removidas e lavadas 4 χem um agitador com H3PO4 a 0,5% uma vez com etanol. As membranas sãocontadas após secagem na temperatura ambiente, montando na moldura demicroplaca de 96 cavidades da Packard TopCount, e uma adição de 10pL/cavidade de Microscint TM (Packard). Os valores de IC50 são calculadospela análise da regressão linear da inibição percentual de cada compostoem duplicata, em 4 concentrações (geralmente 0,01 μΜ, 0,1 μΜ, 1 μΜ e 10μΜ). Uma unidade da atividade da proteína quinase é definida como 1 nmolde 33P ATP transferido do [T33P] ATP ao substrato proteína/minuto/mg daproteína a 37°C. Os compostos de acordo com a Fórmula I mostram valoresde IC50 para a inibição Flt-3 na faixa entre 0,01 μΜ e 100 μΜ, preferivelmen-te entre 0,05 μΜ e 10 μΜ.

Os compostos de acordo com a Fórmula I inibem também outrasquinases de proteína da tirosina tais como especialmente a quinase c-Src, c-Kit, VEGF-R e/ou FGFR; todas tomando parte na regulação do crescimentoe na transformação nas células animais, especialmente ns células de mamí-feros, incluindo as células humanas. Um ensaio apropriado é descrito emAndrejauskas-Buchdunger et al., Câncer Res. 52, 5353-8 (1992). Usandoeste sistema de teste, compostos de acordo com a Fórmula I mostram osvalores IC50 para a inibição da c-Src na faixa de 0,005 μΜ a 100 μΜ, geral-mente entre 0,005 μΜ e 5 μΜ. Os compostos de acordo com a Fórmula Imostram também os valores IC5o para a inibição do c-Kit na faixa de 0,005μΜ a 10 μΜ, geralmente entre 0,005 μΜ a 5 μΜ; e para a inibição da FGFR-1, inibição de até 95% a 10 μΜ.

A inibição de IGF-1R e de Ins-R pode ser determinada como se segue:

O vetor doador pfbgx3IGFIRcd do baculovírus é usado para ge-rar um baculovírus recombinante que expresse a região 950-1337 do amino-ácido do domínio citoplasmático do peptídio maduro do IGF humano IR. Pa-ra gerar o fragmento do DNA codificando a região 919-1343 do aminoácidodo domínio intracitoplasmático da quinase do receptor humano da insulina, éusado o pC5hlnsR. Os fragmentos do IGF-IR e do Ins-R humanos são clo-nados, expressados e purificados em pequena escala como um fator da pro-teína de fusão glutationa-S-transferase clivável do Xa usando o sistema Bac-to-Bac® (GIBCO BRL) de geração recombinante do baculovírus. O víruscontendo o meio é coletado da cultura de células transfectadas e usado paraque a infecção aumente seu título. Vírus contendo os meios obtidos apósdois ciclos de iss da infecção são usados para a expressão em ampla escalada proteína. Os extratos da célula são preparados e transportados em umacoluna do glutationa-Sefarose (Pharmacia). Após a lavagem, as proteínasGST marcadas são eluídas então com um tampão contendo glutationa. Aproteína purificada é armazenada a -70°C no tampão de eluição. Os ensaiosda proteína quinase da tirosina com GST-IGF-1R e GST-GST-Ins-R purifica-dos são transportados dentro de um volume final de 30 μΙ contendo 20 mMTris-HCI, pH 7,6, 10 mM de MgCI2, 0,01 mM Na3VO4, 1% DMSO, 1 mM DTT,3 μ g/m I poli(Glu,Tyr) 4:1 e 10 μΜ ATP (γ-[33Ρ]-ΑΤΡ 0.1 μΟΐ). O ensaio é rea-Iizado em microplacas de 96 cavidades na temperatura ambiente por 20 mi-nutos e terminado por uma adição de 25 μΙ de EDTA pH 7,0 a 0,05 M. Umaalíquota de 40 μΙ é gotejada com um dispensador multicanal sobre as mem-branas Whatman P81 montadas em um distribuidor do filtro do microtituladorMillipore conectado a uma fonte de baixo vácuo. Após a eliminação do líqui-do, a membrana é transferida a uma seqüência de 4 banhos de lavagemcontendo H3PO4 a 0,5% e um com EtOH (incubação agitada por 10 minutoscada uma), seca, montada em um distribuidor de Hewlett Packard TopCountadicionado 10 μl de Microscint® e contada. Os compostos de acordo com aFórmula (I) mostram a inibição de até 90% do Ins-R a 10.000 nM, preferi-velmente uma inibição entre 60 a 90%.

A inibicão da Tek pode ser determinada como seque:

O procedimento da expressão, purificação e ensaio dessas qui-nases foi antriormente descrito. Fabbro et al., Pharmacol. Ther. 82(2-3) 293-301 (1999). Em resumo, o gene da glutationa S-transferase (GST) do vetorpAcG1 (Pharmingen) é extraído com EcoRV e EcoRI e é introduzido no sítioda clonagem do vetor baculoviral Fast-Bac (GIBCO) que cria um vetor de5530 bp com os sítios de clonagem no N-terminal derivados do vetor da fu-são pAcG1 (FBGO). O sítio da clonagem do C-terminal pode ser qualquersítio de clonagem (do vetor Fast-Bac) a jusante do sítio da clonagem do Nterminal usado. Fundidos no GST através do N terminal (pAcG1, Pharmin-gen) os domínios KDR, Flt-1, Flk-1, Tek e PDGFR-β da quinase são obtidosda ProQinase1 Freiburg, Germany. Tek é reclonado no vetor FBG1 por exci-são e ligação do EcoRI no EcoRI digerido pelo FBG1 (FBGI-Tek). As se-qüências de codificação para todo o domínio citoplasmático do c-Kit (aa 544-976) e do c-Fms (aa 538-972) são amplificadas por PCR do útero humano eda medula óssea das bibliotecas humanas de DNA (Clontech), respectiva-mente. Os fragmentos amplificados do DNA são fundidos a GST por clona-gem no FBG1 como inserções de BamHI-EcoRI, para produzir FBG1-c-Kit eFBG1 -c-Fms. O Tek é reclonado no vetor de transferência FBGO por excisãode EcoRI e ligação em EcoRI digerido por FBGO (FBG-Tie2/Tek). Os domí-nios FGFR-1 e os domínios c-met da quinase são obtidos por PCR das célu-lasA431 humanas.

Os iniciadores (primers) com N-terminal contêm um sítio EcoRI amais pendente, enquanto que os iniciadores com C-terminal contêm um sítioXhol para auxiliar na clonagem dos vetores de transferência. Após a diges-tão dos fragmentos de PCR e de FBGO os produtos da clivagem são purifi-cados em gel e unidos para formar os constructos da quinase (FBG-Met,FBG-FGFR-1).

Os vírus para cada uma das quinases são feitos de acordo com0 protocolo fornecido pela GIBCO. Em resumo, os vetores de transferênciacontendo os domínios da quinase estão transfectados na linhagem celularde DHIOBac (GIBCO), semeados em placa de ágar contendo as concentra-ções recomendadas de Blue-Gal, de IPTG, de canamicina, de tetraciclina, ede gentamicina. As colônias sem inserção da seqüência da fusão no geno-ma viral (transportado pelas bactérias) são azuis. Uma única colônia brancageralmente é escolhida e o DNA viral (bacmid) é isolada das bactérias porprocedimentos de minipreparativos do plasmídio padrão. As células Sf9 ouas cinco células elevadas (GIBCO) são transfectadas então em frascos de25 cm2 com o DNA viral usando o reagente e o protocolo de Cellfectin forne-cidos com o kit Bac-to-Bac (GIBCO). O meio contendo o vírus é coletado dacultura de células transfectadas e usado para que a infecção aumente seutítulo. O vírus contendo os meios obtidos após dois ciclos da infecção é usa-do para a expressão em ampla escala da proteína. Para a expressão emampla escala da proteína placas redondas para cultivo de tecido com 100cm2 são semeados com 5x107 células/placa e infectadas com 1 ml dos mei-os contendo vírus (aproximadamente 5 MOIs). Após 3 dias as células sãoraspadas da placa e centrifugadas em 500 RPM por 5 minutos.

Os péletes da células de 10 a 20, placas de 100 cm2, são res-suspensos em 50 mL do tampão de Iise resfriado com gelo (25 mM de tris-HCI, de pH 7,5, EDTA a 2 mM, 1% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM P-MSF). Ascélulas são agitadas sobre gelo por 15 minutos e centrifugadas então a5.000 rpms por 20 minutos. O sobrenadante é transportado para uma colunade um glutationa-sefarose de 2 mL (Pharmacia) e lavado 3 χ com 10 mL de25 mM tris-HCI, pH 7,5, EDTA a 2 mM, 1 mM DTT, 200 mM de NaCI. As pro-teínas GST marcadas são então eluídas por 10 aplicações (de 1 mL cada)de 25 mM tris-HCI, pH 7,5, 10 mM de glutationa reduzida, 100 mM de NaCI,1 mM DTT, glicerol a 10% e são armazenadas em -70 °C. Os ensaios (30 μΙ)contêm 200 a 1800 ng da proteína da enzima (dependendo da atividade es-pecífica), 20 mM Tris-HCI, pH 7,6, 3 mM MnCI2, 3 mM MgCI2, 1 mM DTT,10 μΜ Na3VO4, 3 μg/ml poly(Glu,Tyr) 4:1, 8 μΜ ATP (γ-[33Ρ]-ΑΤΡ 0,1 μΟϊ).As reações são incubadas por 20 minutos na temperatura ambiente e sãoentão paradas pela adição de 25 μΙ de EDTA a 0,25 M (pH 7,0). Uma alíquo-ta de 40 μl é gotejada com um dispensador multicanal sobre as membranasWhatman P81 montadas em um distribuidor do filtro do microtitulador Millipo-re conectado a uma fonte de baixo vácuo. Após a eliminação do líquido, amembrana é transferida a uma seqüência de 4 banhos de lavagem contendoH3PO4 a 0,5% e um com EtOH (incubação agitada por 10 minutos cada u-ma), seca, montada em Um distribuidor de Hewlett Packard TopCount adi-cionado 10 μl de Microscint® e contada. Os compostos de acordo com aFórmula (I) mostram os valores IC5o, calculados pela análise da regressãolinear, para a inibição de Tek de aproximadamente 0,1 μΜ a 100 μΜ.

A inibição de Cdkl pode ser determinada como seque:Cdk1/cvcB:

Cdk1/cycB são obtidos da ProQinase, Freiburg, Germany. Osoócitos das estrelas do mar são induzidos para incorporar a fase de M dociclo celular com 10 μΜ de 1-metiladenina e congelados em nitrogênio líqui-do e armazenados a -80 0C. Quando necessários, os oócitos são homogeni-zados e centrifugadas tal como descrito (Arion et al., Cell 55: 371-378 (1988)e Rialet et al., Anticancer Fies. 11: 1581-1590 (1991)). A quinase deCdk1/cycB é purificada em contas de p9CKShs-sefarose e eluída com p9CKShshumano recombinante tal como descrito (Azzi et al., Eur. J. Biochem. 203:353-360. (1992)). Rapidamente, o sobrenadante dos oócitos é equilibradopor 30 minutos a 4°C sob rotação constante com as contas de pgCKShs.sefarose. As contas são lavadas extensivamente e a quinase ativa decdkl/cycB é eluída com p9CKShs purificadas (3 mg/ml). A atividade deCdk1/cycB é medida tal como descrito (Arion et al., Cell 55: 371 -378 (1988),Meijer et al., EMBO J. 1989; 8: 2275-2282 e Meijer et al., EMBO J. 1991; 8:2275-2282). O ensaio é transportado com ligeiras modificações em micro-placas de 96 cavidades na temperatura ambiente por 20 minutos. O volumefinal de 30 μΙ_ contém 0,1 a 0,3U de Cdk1/cycB, 1 mg/ml de histona H1 comoum substrato, 60 mM de β-glicerofosfato, 30 mM de nitrofenilfosfato, 25 mMMOPS, 5 mM EGTA, 15 mM MgCI2, 1 mM DTT, 0,1 mM Na3VO4, 15 μΜ ATPe 0,1 μΟΐ γ-33Ρ-ΑΤΡ (75 μΜ, 8800 cpm/pmol). A reação é terminada por umaadição de 25 μΙ de EDTA pH 7,0 a 0,05 M. Uma alíquota de 40 μΙ é gotejadacom um dispensador multicanal sobre as membranas Whatman P81 monta-das em um distribuidor do filtro do microtitulador Millipore conectado a umafonte de baixo vácuo. Após a eliminação do líquido, a membrana é transferi-da a uma seqüência de 4 banhos de lavagem contendo H3PO4 a 0,5% e umcom EtOH (incubação agitada por 10 minutos cada uma), seca, montada emum distribuidor de Hewlett Packard TopCount adicionado 10 μΙ de Micros-cint® e contada. Os compostos de acordo com a Fórmula (I) mostram a ini-bição Cdkl de até 100% em 10.000 nM.

A inibicão da c-Raf-1 pode ser determinada como seque:

A produção da proteína c-Raf-1 recombinante é obtida pela in-fecção tripla das células Sf21 com o baculovírus GST-c-Raf-1 recombinantejunto com os baculovírus recombinante do v-Src e dos v-Ras que são ne-cessários para a produção ativa da quinase c-Raf-1 (Williams et al., PNAS1992; 89: 2922-2926). A Ras ativa (v-Ras) é requerida para recrutar c-Raf-1para a membrana da célula e v-Src para o c-Raf-1 fosforilado para ativá-lointeiramente (Williams et al., PNAS 1992; 89: 2922-2926). As células foramsemeadas a 2,5 χ 107células por placa de 150 mm e permitidas se ligarem auma placa de 150 mm por 1 hora na temperatura ambiente. O meio (SF900IIcontendo 10 % de FBS) é aspirado e o baculovírus recombinante; GST-C-Raf-1, v-Ras e v-Src são adicionados a MOI de 3,0, 2,5 e 2,5 receptivamenteem um volume total de 4 a 5 mL. As células são incubadas por 1 hora natemperatura ambiente e 15 mL do meio são então adicionados. As célulasinfectadas são incubadas por 48 a 72 horas a 27 9C. As células Sf21 infecta-das são raspadas e coletadas em um tubo de 50 mL e centrifugadas por 10minutos a 4 9C em 1100 χ g em uma centrífuga de Sorvall. O pélete da célu-la é IavadO uma vez com PBS frio com gelo e Iisadas com tampão de Iise de0,6 mL para 2,5 χ 107 células. A Iise completa das células é conseguida após10 minutos sobre gelo com pipetagem ocasional. Os Iisados das células sãocentrifugados por 10 minutos a 4 9C em 14.500 χ g em uma centrífuga deSorvall com o rotor SS-34 e o sobrenadante é transferido para um tubo fres-co e armazenado a -80 9C. O c-Raf-1 é purificado dos Iisados da célula u-sando 100 uL de contas 4B empacotados com Glutationa-Sefarose equili-brado sobre PBS resfriado com gelo para 2,5 χ 107 células. O GST-c-Raf-1foi deixado se ligar aos contas a 4 9C por 1 hora com agitação. O GST-c-Raf-1 ligado com contas foi transferido a uma coluna. A coluna é lavada umavez com tampão de Iise e duas vezes com o tampão de solução salina Trisresfriado com gelo. O tampão frio de eluição do gelo é adicionado e o fluxoda coluna é parado para permitir que a glutationa livre rompa a interação daGST-c-Raf-1 com as contas do sefarose da glutationa. As frações (1 mL) sãocoletadas nos tubos pré-congelados. Cada tubo contém 10 % de glicerol(concentração final) para manter a atividade da quinase durante os ciclos defusão do congelado. As frações purificados da proteína da quinase GST-c-Raf-1 são armazenadas a -80 QC.

O IkB foi usado como substrato para a quinase c-Raf-1. O IkB éexpressado nas bactérias como uma proteína His-marcada (clonado e gen-tilmente cedido pelo Dr. Eder; Abm, Novartis, Basiléia). As bactérias de BL21LysS contendo o plasmídio de IkB são crescidas a uma OD6OO de 0,6 nomeio LB e a seguir induzidas a expressar o kb com IPTG (concentração finalde 1 mM) por 3 horas a 37° C e então as bactérias são Iisadas por ação ul-trassônica (o limite da microponteira se ajusta por 3 vezes em 1 minuto cadauma no tampão ultrassônico [50 mM Tris pH 8,0, 1 mM DTT, 1 mM EDTA] ecentrifugadas em 10.000 χ g por 15 minutos. O sobrenadante é misturadocom o sulfato do amônio para dar uma concentração final de 30 %. Esta mis-tura é balançada por 15 minutos a 4 -C e depois girada a 10.000 χ g por 15minutos. O pélete é ressuspenso em tampão de ligação (Novagen) contendo10 mM de BSA. Esta solução é aplicada a Ni-agarose (Novagen) e lavada deacordo com o manual da Novagen. O IkB é eluído da coluna usando o tam-pão de eluição (imidazol a 0,4 M, NaCI a 0,2 M, 8 mM Tris pH 7,9). As fra-ções contendo a proteína são dializadas em 50 mM Tris pH 8, 1 mM DTT.

A atividade da proteína quinase c-Raf-1 é ensaiada na presençaou na ausência dos inibidores, medindo a incorporação de 33P para [γ33Ρ]ATP no IB. O ensaio é realizado em microplacas de 96 cavidades na tempe-ratura ambiente por 60 minutos. Contendo (um volume total de 30 μΙ): c-rafl1quinase (400 ng), 25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 5 mM MgCI2, 5 mM MnCI2, 10 μΜNa3VO4, 1 mM DTT e 0,3 pCi/ensaio [γ33 P]-ATP (ATP a 10 μΜ) usando 600ng IB na presença de 1 % de DMSO. As reações são terminadas pela adiçãode 10 μl do EDTA a 250 mM e 30 μΙ_ da mistura da reação são transferidossobre a membrana de ImmobiIon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, USA) em-bebida previamente por 5 minutos com metanol, enxaguada com água, de-pois embebida por 5 minutos com 0,5 % de H3PO4 e montada na linha devácuo com fonte desconectada do vácuo. Após ter tingido todas as amos-tras, o vácuo é conectado e cada cavidade é enxaguado com 200 μΙ_ 0,5 %de H3PO4. As membranas são removidas e lavadas em um agitador com 0,5% de H3PO4 (4 vezes) e uma vez com etanol. As membranas são contadasapós secagem na temperatura ambiente, montando na moldura de micropla-ca de 96 cavidades da Packard TopCount, e uma adição de 10 μL/cavidadede Microscint TM (Packard).

Os compostos de acordo com a Fórmula (I) mostram a inibiçãoc-Raf-1 na faixa entre 0,1 μΜ e 50 μΜ, preferivelmente entre 0,1 μΜ e 10μΜ.A eficácia dos compostos da presente invenção como inibidores de quinasesdo receptor de Efrina B4 (EphB4) pode ser demonstrado como se seque:

A geração do Bac-to-Ba® (Invitrogen Life Technologies, Basiléia,Suíssa) à expressão dos vetores de fusão GST: As regiões citoplasmáticasinteiras de codificação da classe EphB são amplificadas por PCR das biblio-tecas do DNA derivadas da placenta ou do cérebro humano, respectivamen-te. Os baculovírus recombinantes são gerados expressando a região 566-987 do aminoácido do receptor EphB4 humano (Banco de Dados SwissProt,Acesso No. P54760). A seqüência de GST é clonada no vetor pFastBad®(Invitrogen Life Technologies, Basiléia, Suíssa) e amplificada por PCR. cD-NAs codificando os domínios do receptor de EphB4, respectivamente sãoclonados na moldura do iniciador 3' da seqüência de GST no vetor FastBacImodificado para gerar vetores doadores pBac-to-Bac®. As únicas colôniasque cresceram da transformação são inoculadas para fornecer as culturasdurante a noite para a preparação do plasmídio em pequena escala. A análi-se da enzima de restrição do DNA do plasmídio revela diversos clones con-tendo inserções do tamanho previsto. Pelo seqüenciamento automatizadodas inserções e de aproximadamente 50 bp das seqüências do vetor deflanqueamento são confirmados em ambos os filamentos.

Produção dos vírus:

Os vírus para cada um das quinases são feitos de acordo com oprotocolo fornecido por GIBCO se não for indicado de outra maneira. Emresumo, os vetores de transferência contendo os domínios da quinase sãotransfectados na linhagem celular de DHIOBac (GIBCO) e semeados emplacas de ágar seletivas. As colônias sem inserção da seqüência da fusãono genoma viral (transportado pelas bactérias) são azuis. As únicas colôniasbrancas são escolhidas e o DNA viral (bacmid) é isolado das bactérias porprocedimentos padrão de purificação do plasmídio. As células Sf9 ou as cé-lulas Sf21 são transfectados então em frascos de 25 cm2 com o DNA viralusando o reagente de Cellfectin de acordo com o protocolo.

Purificação de quinases GST-marcadas:

O Iisado celular centrifugado é transportado para uma coluna deglutationa-sefarose de 2 ml_ (Pharmacia) e lavado três vezes com 10 ml_ demM Tris-HCI, pH 7.5, EDTA de 2mM, 1 mM DTT1 200 mM de NaCI. Asproteínas GST marcadas são então eluídas por 10 aplicações (1 mL cada)20 de 25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM de glutationa reduzida, 100 mM de NaCI,1 mM DTT, 10 % de glicerol e são armazenadas a -70°C.

Ensaios da proteína quinase:

As atividades da proteínas quinase são ensaiadas na presençaou na ausência dos inibidores, medindo a incorporação de 33P do [V33P] ATPem um polímero do ácido glutâmico e da tirosina (poli(Glu,Tyr)) como umsubstrato. Os ensaios da quinase com GST-EphB purificados (30 ng) sãorealizados por 15 a 30 minutos na temperatura ambiente em um volume finalde 30 μΙ_ contendo 20 mM Tris.HCI, pH 7,5, 10 mM de MgCI2, 3 a 50 mMMnCI2, 0,01 mM Na3VO4, 1 % de DMSO, 1 mM DTT, 3 pg/mL poli(Glu.Tyr)4:1 (sigma; St. Louis, MO, EUA) e ATP de 2,0 a 3,0 μΜ (y-pPJ-ATP 0.1 pCi).

O ensaio é terminado pela adição de 20 μΙ_ de 125 mM de EDTA. Posterior-mente, 40 pL da mistura de reação são transferidos sobre a membrana deImmobilon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, USA) embebida previamente por 5minutos com metanol, enxaguada com água, depois embebida por 5 minutoscom H3PO4 a 0,5% e montada na linha de vácuo com fonte de vácuo desco-nectada. Após ter gotejado todas as amostras, o vácuo é conectado e cadacavidade é enxagüada com 200 μL H3PO4 a 0,5%. As membranas são re-movidas e lavadas 4 χ em um agitador com H3PO4 a 0,5% uma vez com e-tanol. As membranas são contadas após secagem na temperatura ambiente,montando na moldura de microplaca de 96 cavidades da Packard TopCount,e uma adição de 10 pL/cavidade de Microscint TM (Packard). Os valores deIC5O são calculados pela análise da regressão linear da inibição percentualde cada composto em duplicata, em 4 concentrações (geralmente 0,01 μΜ,0,1 μΜ, 1 μΜ e 10 μΜ). Uma unidade da atividade da proteína quinase édefinida como 1 nmol de 33P ATP transferido do [Y33P] ATP ao substrato pro-teína/minuto/mg da proteína a 37°C. Os compostos de acordo com a Fórmu-la I mostram inibição do EphB4 baixada para 1 nM e preferivelmente valoresde IC50 entre 0,001 μΜ e 5,0 μΜ.

Alternativamente, a autofosforilacão do receptor EphB4 pode ser medidacomo se segue:

A inibição do autofosforilação do receptor EphB4 pode ser con-firmada com uma experiência in vitro nas células como as células transfec-tadas humanas do melanoma A375 (ATCC N-: CRL-1619), que expressampermanentemente EphB4 humano (Lei de Proteção Suíça Ns P54760), sãosemeadas no meio de cultura completo (com 10% de soro fetal bovino =FCS) em placas de cultura celular de 6 cavidades e incubadas a 37°C sobCO2 a 5% até que mostrem uma confluência de aproximadamente 90%. Oscompostos a serem testados são então diluídos no meio de cultura (semFCS, com 0,1% de albumina de soro bovino) e adicionados às células. Oscontroles compreendem o meio sem os compostos do teste. A autofosforila-ção induzida do Iigante é induzida pela adição de 1 pg/ml de efrinaB2-Fcsolúvel (s-efrinaB2-Fc: R&D Biosystems, Cat. N9 496-EB) e 0,1 μΜ de orto-vanadato. Após uma incubação adicional de 20 minutos a 37°C, as célulassão lavadas duas vezes com PBS resfriado com gelo (tampão de fosfatosalino) e Iisadas imediatamente no tampão de Iise com 200 μΙ por cavidade.

Os Iisados são então centrifugados para remover os núcleos da célula, e asconcentrações da proteína dos sobrenadantes são determinadas usando umensaio comercial da proteína (PIERCE). Os Iisados podem então imediata-mente ser usados ou, se necessário, ser armazenados a -20°C.

Uma reação ELISA em sanduíche é realizada para medir a fosforilacão daEphB4:

Para capturar EphB4 fosforilado a proteína da efrinaB2-Fc 100ng/cavidade (s-ephrinB2-Fc : R&D Biosystems, Cat. Ne 496-EB) são imobili-zada em placas de MaxiSorb (Nunc) ELISA. As placas são então lavadas eos sítios livres de ligação com proteína restantes saturado com 3% Top-Block® (Juro, Catálogo Ns TB232010) em tampão de fosfato de solução sa-lina com Tween 20® (monolaurato de polioxietileno(20)sorbitano, I-Cl/Uniquema) (PBST). Os Iisados da célula (proteína de 100 pg por cavida-de) são então incubados nestas placas por 1 h na temperatura ambiente.

Após ter lavado as cavidades três vezes com PBS um anticorpo da antifosfo-tirosina ligado com fosfatase alcalina (fosfato alcalino de PY 20 conjugado:ZYMED, Catálogo N- 03-7722) é adicionado e são incubadas por uma outrahora. As placas são lavadas outra vez e ligação do anticorpo do antifosfoti-rosina ao receptor fosforilado capturado é demonstrada e depois quantifica-da usando 10 mM D-nitrofenilfosfato como o subtraio e medir o OD em 405nm depois de 0,5h a 1 h. A diferença entre o sinal do controle positivo (esti-mulado com vanadato e s-efrinaB2-Fc) e aquele do controle negativo (não-estimulado) corresponde à fosforilação máxima EphB4 (= 100 %). A ativida-de das substâncias testadas são calculadas como a inibição percentual dofosforilação EphB4 máximo, em que a concentração da substância que induza metade da inibição máxima é definida como o IC50 (dose inibitória para ainibição de 50%).

Experimentos para demonstrar a atividade antitumor dos compostos de a-cordo com a Fórmula (!) in vivo:

Por exemplo, a fim testar se um composto de acordo com aFórmula (I), por exemplo, que ò Exemplo 1 fornecido abaixo, inibe a angio-gênese mediada pela VEGF in vivo, seu efeito na resposta angiogenica in-duzida por VEGF em um modelo de implante do fator do crescimento nosratos é testado: Uma câmara porosa do Teflon (volume 0,5 mL) é cheia com0,8 % p/v de ágar contendo heparina (20 unidades/ml) com ou sem fator docrescimento (2 μg/ml de VEGF humano) implantado subcutaneamente noflanco dorsal dos ratos C57/C6. Os ratos são tratados com o composto doteste (por exemplo, 25 mg/kg, 50 mg/kg ou 100 mg/kg uma vez diariamente)ou com o veículo começando no dia do implante da câmara e que continuapor 4 dias em seguida. No fim do tratamento, os ratos são mortos, e as câ-maras são removidas. O tecido vascularizado que cresce em torno da câma-ra é removido com cuidado e pesado, e o teor de sangue é avaliado medin-do o índice de hemoglobina do tecido (método de Drabkins; Sigma, Deise-nhofen, Germany). Foi mostrado previamente que estes fatores do cresci-mento induzem a aumentos dependentes da dose, no peso e no índice dosangue deste tecido que cresce (caracterizado histologicamente como con-tendo fibroblastos e pequenos vasos de sangue) em torno das câmaras eque esta resposta está obstruída pelos anticorpos que neutralizam especifi-camente a VEGF (veja: Wood JM et al., Câncer Res. 60(8), 2178-2189,(2000); e Schlaeppi et al., J. CancerRes. Clin. Oncoi 125, 336-342, (1999)).

Com este modelo, a inibição pode ser mostrada no caso de compostos deacordo com a Fórmula (I).

A presente invenção também se refere às composições farma-cêuticas compreendendo um composto de acordo com a Fórmula (I), e seuuso (em um aspecto mais amplo da presente invenção, também profilático)para o tratamento terapêutico ou a um método de tratamento de uma doençadependente da quinase, especialmente as doenças preferidas acima men-cionadas, aos compostos para uso do mesmo e à formulação de prepara-ções farmacêuticas, especialmente para os usos dos mesmos.

A presente invenção também se refere aos pró-fármacos de umcomposto de acordo com a Fórmula (I) que se convertem in vivo ao compos-to de acordo com a Fórmula (I) tal como é. Qualquer referência a um com-posto de acordo com a Fórmula (I) deve conseqüentemente ser compreen-dida como fazendo referência também aos pró-fármacos correspondentes docomposto de acordo com a Fórmula (I), como apropriado e vantajoso.

Os compostos farmacologicamente aceitáveis de acordo com apresente invenção podem ser usados, por exemplo, para a preparação dascomposições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de umcomposto de acordo com a Fórmula (I), ou de um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo, como o componente ativo junto ou misturado com umaquantidade significativa de um ou mais veículos inorgânicos ou orgânicos,sólido ou líquido, farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção também se refere a uma composição far-macêutica que seja apropriada para á administração a um animal de sanguequente, especialmente um ser humano (ou às células ou às linhagens dascélulas que se derivaram de um animal de sangue quente, especialmente deum ser humano, por exemplo, linfócitos), para o tratamento ou, em um as-pecto mais amplo de acordo com a presente invenção, a prevenção (= profi-laxia contra) de uma doença que responda à inibição da atividade da quina-se, compreendendo uma quantidade de um composto de acordo com aFórmula (I) ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que sejaeficaz para a dita inibição, especialmente, junto com pelo menos um veículofarmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas de acordo com a presente inven-ção são aquelas para administração enteral, tal como nasal, retal ou oral, ouparenteral, tal como intramuscular ou intravenosa, aos animais de sanguequente (especialmente um ser humano), compreendendo uma dose eficazdo componente farmacologicamente ativo, sozinho ou junto com uma quan-tidade significativa de um veículo farmaceuticamente aceitável. A dose docomponente ativo depende da espécie de animal de sangue quente, do pesocorporal, da idade e da condição individual, dos dados farmacocinéticos indi-viduais, da doença a ser tratadas e do modo de administração.

A presente invenção também se refere a um método de trata-mento para uma doença que responda à inibição de uma quinase; que com-preende a administração (contra a doença mencionada) profilaticamente ouespecialmente terapeuticamente de uma quantidade eficaz de um compostode acordo com a Fórmula (I) de acordo com a invenção, especialmente a umanimal de sangue quente, por exemplo, um ser humano, que em relação àuma das doenças mencionadas, requeira tal tratamento.

A dose de um composto de acordo com a Fórmula (I) ou de umsal farmaceuticamente aceitável do mesmo a ser administrada aos animaisde sangue quente, por exemplo, seres humanos de aproximadamente 70quilogramas de peso corporal, é preferivelmente de aproximadamente 3 mga aproximadamente 10 g, mais preferivelmente de aproximadamente 10 mga aproximadamente 1,5 g, mais preferivelmente de aproximadamente 100mg a aproximadamente 1.000 mg/indivíduo/dia, dividido preferivelmente em1 a 3 doses únicas que podem, por exemplo, ser do mesmo tamanho. Ge-ralmente, as crianças recebem a metade da dose do adulto.

As composições farmacêuticas compreendem de aproximada-mente 1% a aproximadamente 95%, preferivelmente de aproximadamente20% a aproximadamente 90%, do componente ativo. As composições far-macêuticas de acordo com a presente invenção podem estar, por exemplo,na forma de uma dose unnitária, como na forma das ampolas, de frascos,em supositórios, drágeas, comprimidos ou cápsulas.

As composições farmacêuticas de acordo com a presente inven-ção são preparadas por métodos já por si próprios conhecidos, por exemplo,por meio de processos convencionais de dissolução, de liofilização, de mis-tura, de granulação ou de confeito.

As soluções do componente ativo, e também as suspensões, eespecialmente as soluções aquosas ou as suspensões isotônicas, são usa-das preferivelmente, sendo possível, por exemplo, no caso das composiçõesIiofilizadas compreendendo o componente ativo sozinho ou junto com umveículo, por exemplo, o manitol, para que tais soluções ou suspensões se-jam produzidas antes do uso. As composições farmacêuticas podem ser es-terilizadas e/ou podem compreender excipientes, por exemplo, conservan-tes, estabilizantes, umectantes e/ou agentes emulsificantes, solubilizantes,sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões, e são preparadas pormétodos já por si próprios conhecidos, por exemplo, por meio dos processosde dissolução ou de liofilização convencionais. As ditas soluções ou suspen-sões podem compreender substâncias com viscosidadea crescentes, taiscomo a carboximetilcelulose de sódio, a carboximetilcelulose, o dextrano, apolivinilpirrolidona ou a gelatina.

As suspensões em óleo compreendem como o componente ole-oso os óleos vegetais, sintéticos ou semi-sintéticos habituais para finalidadesde injeção. Podem ser mencionados tais como ésteres especialmente líqui-dos de ácidos graxos contendo como componente ácido um ácido graxo decadeia longa possuindo de 8 a 22, especialmente de 12 a 22 átomos de car-bono, por exemplo, ácido laurílico, ácido tridecílico, ácido mirístico, ácidopentadecílico, ácido palmítico, ácido margárico, ácido esteárico, ácido ara-quídico, ácido beênico ou os ácidos insaturados correspondentes, por e-xemplo, ácido oléico, ácido elaídico, ácido erúcico, ácido brasídico ou ácidolinoleico, se desejado com a adição dos antioxidantes, por exemplo, a vita-mina Ε, o β-caroteno ou o 3,5-di-terc-butil-4-hidroxitolueno. O componentedo álcool daqueles ésteres do ácido graxo tem um máximo de 6 átomos decarbono e são um mono ou polihidróxi, por exemplo, um mono, di ou tritrii-dróxi, álcool, por exemplo, metanol, etanol, propanol, butanol ou pentanol ouos isômeros dos mesmos, mas especialmente glicol e glicerol. Os seguintesexemplos de ésteres de ácido graxo devem conseqüentemente ser mencio-nados: oleato de etila, miristato do isopropila, palmitato do isopropila, "Labra-fil M 2375" (trioleato de glicerol do polioxietileno, Gattefossé, Paris), "Miglyol812" (triglicerídio de ácidos graxo saturado com um comprimento de cadeiade C8 a Ci2, Hüls AG, Germany), mas especialmente óleos vegetais, taiscomo o óleo de semente de algodão, o óleo de amêndoa, o óleo oliva verde,o óleo de rícino, o óleo de gergelim, o óleo de soja e mais especialmente oóleo de amendoim.

As composições farmacêuticas para a administração oral podemser obtidas combinando o componente ativo com os veículos sólidos, se de-sejado granulando a mistura resultante, e processando a mistura, se deseja-do ou necessário, após a adição de excipientes adequados, em comprimi-dos, em drágeas duras ou em cápsulas. Também é possível para elas seremincorporadas em veículos plásticos que permitam que os componentes ati-vos difundam ou sejam liberados em quantidades medidas.

Os veículos adequados são especialmente enchimentos, taiscomo açúcares, por exemplo, lactose, sacarose, manitol ou sorbitol, as pre-parações de celulose e/ou os fosfates de cálcio, por exemplo, fosfato tricálci-co, por exemplo, ou o bifosfato de cálcio, e as pastas, tais como pastas deamido usando-se, por exemplo, milho, trigo, amido de arroz ou de batata,gelatina, tragacanto, metilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, carboximetilcellulose e/ou polivinilpirrolidona de sódio, e/ou, se desejado, os desintegra-dores, tais como os amidos acima mencionados, e/ou carboximetil amido,polivinilpirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico ou um sal do mesmo, talcomo o alginato de sódio. Os excipientes são especialmente condicionado-res e lubrificantes do fluxo, por exemplo, ácido silícico, o talco, ácido esteári-co ou sais dos mesmos, como o estearato de magnésio ou de cálcio, e/ou opolietileno glicol. Os núcleos das drágeas são fornecidos quando apropria-dos, opcionalmente entéricos, os revestimentos, sendo usados entre outrascoisa, as soluções concentradas de açúcar que podem compreender a gomaarábica, o talco, a polivinilpirrolidona, o polietilenoglicol e/ou o dióxido do ti-tânio, ou soluções de revestimento em solventes orgânicos adequados, ou,para a preparação de revestimentos entéricos, soluções de preparações a-propriadas da celulose, tais como etilcelulose ftalato ou hidroxipropilmetilcel-Iulose ftalato. As cápsulas são cápsulas secas preenchidas feitas de gelatinae cápsulas seladas macias feitas do gelatina e de um plastificante, tais comoo glicerol ou o sorbitol. As cápsulas secas preenchidas podem compreendero componente ativo na forma de grânulos, por exemplo, com enchimentos,tais como a lactose, pastas, tais como amidos, e/ou ligantes, tais como oestearato de talco ou de magnésio, e se desejado com estabilizadores. Emcápsulas macias o componente ativo é preferivelmente dissolvido ou sus-penso em excipientes oleosos adequados, tais como óleos graxos, óleo deparafina ou polietileno glicol líquido, sendo possível também que os estabili-zadores e/ou os agentes antibacterianos sejam adicionados. As tinturas ouos pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou aos revestimentosdas drágeas ou nas embalagens das cápsulas, por exemplo, para finalida-des da identificação ou indicar as diferentes dosagens do componente ativo.

Um composto de acordo com a Fórmula (I) também pode serusado vantajosamente em combinação com outros agentes antiproliferati-vos. Tais agentes antiproliferativos incluem, mas nao estao limitados aosinibidores da aromatase; antiestrogenos; inibidores do topoisomerase I; ini-bidores do topoisomerase II; agentes ativos do microtúbulo; agentes alqui-lantes; inibidores da deacetilase da histone; compostos que induzem pro-cessos de diferenciação celular; inibidores da cicloxigenase; inibidores daMMP; inibidores da mTOR; antimetabolitos antineoplásicos; compostos deplatina; compostos direcionados ou para diminuição de uma atividade daproteína quinase ou do lipídio e compostos antiangiogênicos adicionais;compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de uma fosfata-se da proteína ou do lipídio; agonistas da gonadorelina; antiandrogênicos;inibidores da aminopeptidase da metionina; bisfosfonatos; modificadoresbiológicos de resposta; anticorpos antiproliferativos; inibidores da heparana-se; inibidores de isoformas oncogênicas de Ras; inibidores da telomerase;inibidores da proteasoma; agentes usados para o tratamento de doençasmalignas hematológicas; compostos que direcionam, diminuem ou inibem aatividade da Flt-3; Inibidores da Hsp90; temozolomida (TEMODAL®); e Ieu-covorina.

O termo "inibidor da aromatase" tal como aqui utilizado se referea um composto que inibe a produção do estrogeno, isto é, a conversão dossubstratos de androstenediona e de testosterona a estrona e ao estradiol,respectivamente. O termo inclui, mas não é limitado aos esteróides, especi-almente atamestano, exemestano e formestano e, em particular, não-esteróides, especialmente aminoglutetimida, rogletimida, piridoglutetimida,trilostano, testolactona, cetoconazol, vorozol, fadrozol, anastrozol e letrozol.

O exemestano pode ser administrado, por exemplo, na forma em que é co-mercializado, por exemplo, sob a marca registrada AROMASIN. O formesta-no pode ser administrado, por exemplo, na forma em que é comercializado,por exemplo, sob a marca registrada LENTARON. O fadrozol pode ser ad-ministrado, por exemplo, na forma em que é comercializado, por exemplo,sob a marca registrada AFEMA. O anastrozol pode ser administrado, porexemplo, na forma em que é comercializado, por exemplo, sob a marca re-gistrada ARIMIDEX. O Ietrozol pode ser administrado, por exemplo, na formaFEMAR. A aminoglutetimida pode ser administrada, por exemplo, na formaem que é comercializada, por exemplo, sob a marca registrada ORIMETEN.

Uma combinação de acordo com a presente invenção compreendendo umagente quimioterapêutico que é um inibidor da aromatase é particularmenteútil para o tratamento de tumores positivos para o receptor de hormônio, porexemplo, tumores do seio.

O termo "antiestrogeno" tal como aqui utilizado se refere a umcomposto que antagoniza o efeito dos estrogenos no nível do receptor doestrogeno. O termo inclui, mas não é limitado ao tamoxifeno, fulvestrante,raloxifeno e cloridrato de raloxifeno. O tamoxifeno pode ser administrado, porexemplo, na forma em que é comercializado, por exemplo, sob a marca re-gistrada NOLVADEX. O cloridrato de raloxifeno pode ser administrado, porexemplo, na forma em que é comercializado, por exemplo, sob a marca re-gistrada EVISTA. O fulvestrante pode ser formulado tal como descrito naPatente Americana US 4.659.516 ou pode ser administrado, por exemplo, naforma em que é comercializado, por exemplo, sob a marca registrada FAS-LODEX. Uma combinação de acordo com a presente invenção compreen-dendo um agente quimioterapêutico que seja um antiestrogeno é particular-mente útil para o tratamento de tumores positivos do receptor do estrogeno,por exemplo, tumores do seio.

O termo "antiandrogeno" tal como aqui utilizado se refere a qual-quer substância que seja capaz de inibir os efeitos biológicos dos hormôniosandrogênicos e inclui, mas não é limitado ao bicalutamida (CASODEX), quepode ser formulado, por exemplo, como descrito na Patente Americana US4.636.505.

O termo do "agonista da gonadorelina" tal como aqui utilizadoinclui, mas não é limitado ao abarelix, goserelina e acetato de goserelina. Agoserelina como descrito na Patente Americana US 4.100.274 e pode seradministrada, por exemplo, na forma em que é comercializada, por exemplo,sob a marca registrada ZOLADEX. O abarelix pode ser formulado, por e-xemplo, como descrito na Patente Americana US 5.843.901.

O termo "inibidor da topoisomerase I" tal como aqui utilizado in-clui, mas não está limitado ao topotecan, ao gimatecan, ao irinotecan, aocamptotecina e seus análogos, 9-nitrocamptotecina e o conjugado macromo-lecular PNU-166148 da camptotecina (composto A1 da W099/17804). Oirinotecan pode ser administrado, por exemplo, na forma em que é comercia-lizado, por exemplo, sob a marca registrada CAMPTOSAR. O topotecan naforma em que é comercializado, por exemplo, sob a marca registrada HY-CAMTIN.

O termo "inibidores da topoisomerase II" tal como aqui utilizadoinclui, mas não é limitado às antraciclinas tais como a doxorrubicina (formu-lação lipossômica incluindo, por exemplo, CAELYX), a daunorrubicina, epir-rubicina, idarrubicina e nemorrubicina, as antraquinonas mitoxantrona e Io-soxantrona, e as podofilotoxinas etoposídio e teniposídio. O etoposídio podeser administrado, por exemplo, na forma em que é comercializado, por e-xemplo, sob a marca registrada ETOPOPHOS. Teniposídio pode ser admi-nistrado, por exemplo, na forma em que é comercializado, por exemplo, soba marca registrada VM 26-BRISTOL. A doxorrubicina pode ser administrada,por exemplo, na forma em que é comercializada, por exemplo, sob a marcaregistrada ADRIBLASTIN ou ADRIAMYCIN. A epirrubicina pode ser adminis-trada, por exemplo, na forma em que é comercializada, por exemplo, sob amarca registrada FARMORUBICIN. A idarrubicin pode ser administrada, porexemplo, na forma em que é comercializada, por exemplo, sob a marca re-gistrada ZAVEDOS. A mitoxantrona pode ser administrada, por exemplo, naforma em que é comercializado, por exemplo, sob a marca registrada NO-VANTRON.

O termo do "agente ativo microtubular" se refere ao agente esta-bilizador do microtúbulo, agente desestabilizador do microtúbulo e inibidoresdesestabilizadores da polimerização da microtubulina incluindo, mas não-Iimitado aos taxanos, por exemplo, paclitaxel e docetaxel, alcalóides da vin-ca, por exemplo, vinblastina, especialmente o sulfato de vinblastina, vincris-tina, especialmente o sulfato de vincristina e vinorelbina, discodermolídios,coquicina e epotilonas e derivados dos mesmos, por exemplo, a epotilona Bou D ou os derivados dos mesmos. A paclitaxel pode ser administrada, porexemplo, na forma em que é comercializada, por exemplo, sob a marca re-gistrada TAXOL. A docetaxel pode ser administrada, por exemplo, na formaem que é comercializada, por exemplo, sob a marca registrada TAXOTERE.O sulfato de vinblastino pode ser administrado, por exemplo, na forma emque é comercializado, por exemplo, sob a marca registrada VINBLASTINR.P. O sulfato de vincristina pode ser administrado, por exemplo, na formaem que é comercializado, por exemplo, sob a marca registrada FARMISTIN.O discodermolídio pode ser obtido, por exemplo, tal como descrito na Paten-te Americana US 5.010.099. São incluídos também os derivados da epotilo-na que são descritos no WO 98/10121, no US 6.194.181, no WO 98/25929,no WO 98/08849, no WO 99/43653, na WO 98/22461 e na WO 00/31247.Especialmente preferidas são as epotilonas A e/ou B.

O termo "agente alquilante" tal como aqui utilizado inclui, masnão é limitado a, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan ou nitrosouréia (BCNUou Gliadel). A ciclofosfamida pode ser administrada, por exemplo, na formaem que é comercializada, por exemplo, sob a marca registrada CYCLOSTIN.A ifosfamide pode ser administrada, por exemplo, na forma em que é comer-cializada, por exemplo, sob a marca registrada HOLOXAN.

O termo "inibidores da deacetilase histona" ou "inibidores daHDAC" se refere aos compostos que inibem o deacetilase da histona e quepossuem atividade antiproliferativa. Isto inclui os compostos descritos no WO02/22577, especialmente o N - hidróxi - 3 -[4- [[(2- hidroxietil)-[2- (1H - indolil- 3)- etil]- amino]- metil]- fenil] - 2E - 2 - propenamida, N - hidróxi - 3 -[4- [[[2-(2 - metil -1H - indolil - 3)- etil]- amino]- metil]- fenil] - 2E - 2 - propenamida efarmaceuticamente sais aceitáveis dos mesmos. Isso também inclui especi-almente o ácido hidroxâmico de suberoilanilida (SAHA).O termo "antimetabolito antineoplásico" inclui, mas não é limita-do a, 5-fluorouracila ou 5-FU, capecitabina, gemcitabina, agentes de desmiti-lação do DNA1 tais como 5-azocitidina e decitabina, metotrexato e edatrexa-to, e os antagonistas do ácido fólico tal como o pemetrexed. A capecitabinapode ser adminitrada, por exemplo, na forma em que é comercializada, porexemplo, sob a marca registrada XELODAi A gemcitabina pode ser admini-trada, por exemplo, na forma em que é comercializada, por exemplo, sob amarca registrada GEMZAR. Também incluído está o anticorpo monoclonaltrastuzumab que pode ser adminitrado, por exemplo, na forma como é intro-duzido no mercado, por exemplo, sob a marca registrada HERCEPTIN.

O termo "composto da platina" tal como aqui utilizado inclui, masnão é limitado a, carboplatina, cis-platina, cisplatina e oxaliplatina. A carbo-platin pode ser administrada, por exemplo, na forma em que é comercializa-da, por exemplo, sob a marca registrada CARBOPLAT. A oxaliplatina podeser adminitrada, por exemplo, na forma em que é comercializada, por exem-plo, sob a marca registrada ELOXATIN.

O termo "composto direcionando/diminuindo uma atividade daproteína quinase ou do lipídio; ou uma atividade dA fosfatase da proteína oudo lipídio; ou os compostos antiangiogênicos adicionais" tal como os aquiutilizados incluem, mas não são limitados a: inibidores da quinase da tirosinada proteína e/ou da quinase da serina e/ou do treonina ou inibidores da qui-nase do lipídio, por exemplo:

a) os compostos que direcionam, diminuem ou inibem a ativida-de dos receptores do fator de crescimento derivados das plaquetas (PDG-FR), como os compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade doPDGFR1 especialmente os compostos que inibem o receptor do PDGF, porexemplo, um derivado de N-fenil-2-pirimidina-amina, por exemplo, imatinib,SU101, SU6668, eGFB-111;

b) composto para direcionar, diminuir ou inibir a atividade dosreceptores do fator de crescimento do fibroblasto (FGFR);

c) composto para direcionar, diminuir ou inibir a atividade do re-ceptor I (IGF-IR) do fator do crescimento semelhante a insulina, tal como oscompostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da IGF-IR, es-pecialmente os compostos que inibem o receptor da IGF-IR, tal como aque-les compostos descritos no WO 02/092599;

d) composto para direcionar, diminuir ou inibir a atividade do re-ceptor da Trk da família da quinase da tirosina;

e) composto para direcionar, diminuir ou inibir a atividade do re-ceptor da Axl da família da quinase da tirosina;

f) composto para direcionar, diminuir ou inibir a atividade do re-ceptor da c-Met;

g) composto para direcionar, diminuir ou inibir a atividade do re-ceptor da Kit/SCFR da quinase da tirosina;

h) composto para direcionar, diminuir ou inibir a atividade do re-ceptor da C-Kit da quinase da tirosina (parte da família do PDGFR), tais co-mo os compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade do recep-tor C-Kit da família da quinase da tirosina, especialmente os compostos queinibem o receptor C-Kit, por exemplo, o imatinib;

i) composto para direcionar, diminuir ou inibir a atividade dosmembros da família da c-Abl e de seus produtos da fusão de genes (por e-xemplo, quinase da BCR-Abl), tais como os compostos que direcionam, di-minuem ou inibem a atividade dos membros da família do c-Abl e de seusprodutos da fusão do gene, por exemplo, um derivado da N-fenil-2-pirimidina-amina, por exemplo, a imatinib; PD180970; AG957; NSC 680410;ou PD173955 da ParkeDavis;

j) composto para direcionar, diminuir ou inibir a atividade dosmembros da proteína quinase C (PKC) e da família da Raf das quinases daserina/treonina, membros membros da família do MEK, do SRC, do JAK, doFAK, do PDK e do Ras/MAPK, ou a família da Pl(3) quinase, ou da famíliada quinase relacionada com a família da Pl(3) quinase, e/ou de membros dafamília da quinase (CDK) dependente da ciclina e especialmente aquelesderivados da estauroporina descritos na Patente Americana US 5.093.330,por exemplo, midostaurina; exemplos de compostos adicionais incluem porexemplo, o UCN-01, safingol, BAY 43-9006, Bryostatina 1, Perifosina Ilmofo-sina; RO 318220 e RO 320432; GO 6976; Isis 3521; LY333531/LY379196;os compostos da isoquinolina tais como aqueles descritos no WO 00/09495;FTIs; PD184352 ou QAN697(um inibidor da P13K);

k) composto para direcionar, diminuir ou inibir a atividade de ini-bidores da quinase da proteína tirosina, tais como os compostos que dire-Cionamj diminuem ou inibem a atividade de inibidores da quinase da proteí-na tirosina incluindo o mesilato de imatinib (GLEEVEC) ou a tirfostina. Umatirfostina é preferivelmente um composto de baixo peso molecular (Mr <1500), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, especialmente umcomposto selecionado da classe benzilidenomalonitrila ou da classe doscompostos da S-arilbenzenomalonirila ou de bissubstrato da quinolina, maisespecialmente composto selecionado do grupo que consiste em TirfostinaA23/RG-50810; AG 99; Tirfostina AG 213; Tirfostina AG 1748; Tirfostina AG490; Tirfostina B44; Enantiômero (+) da Tirfostina B44; Tirfostina AG 555;AG 494; Tirfostina AG 556, AG957 e adafostina (éster adamantílico do ácido4-{[(2,5-dihidroxifenil)- metil]- amino}- benzóico; NSC 680410, adafostina); e

I) os compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividadeda família do fator do crescimento epidérmico do receptor das quinases datirosina (EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 como o homodímeros ou heterodíme-ros), como os compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividadeda família do receptor do fator do crescimento epidérmico são especialmenteos compostos, as proteínas ou os anticorpos que inibem os membros da fa-mília do receptor de EGF da quinase da tirosina, por exemplo, receptor deEGF1 ErbB2, ErbB3 e ErbB4 ou que ligam com a EGF ou Iigantes relaciona-dos com a EGF, e são particularmente aqueles compostos, proteínas ou an-ticorpos monoclonais genérica e especificamente descritos no WO 97/02266,por exemplo, o composto do Exemplo 39, ou na EP 0 564 409, WO99/03854, EP 0520722, EP 0 566 226, EP 0 787 722, EP 0 837 063, US5.747.498, WO 98/10767, WO 97/30034, WO 97/49688, WO 97/38983 e,especialmente no WO 96/30347 (por exemplo, o composto conhecido comoPC 358774), WO 96/33980 (por exemplo, o composto ZD 1839) e WO95/03283 (por exemplo, o composto ZM105180); por exemplo, trastuzumab(HERCEPTIN), cetuximab, Iressa, Tarceva, derivados OSI-774, CI-1033,EKB-569, GW-2016, E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 ou E7.6.3, e7H-pirrol-[2,3-d]pirimidina que são descritos no WO 03/013541.

Compostos adicionais antiangiogênicos incluem os compostospossuindo um outro mecanismo para sua atividade, por exemplo, não-relacionados com a inibição da proteína quinase ou do lipídio quinase, porexemplo, a talidomina (THALOMID) e TNP-470.

Compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade deuma fosfatase de proteína ou de lipídio são, por exemplo, inibidores da fosfa-tase 1, da fosfatase 2A, do PTEN ou do CDC25, por exemplo, ácido ocadai-co ou um derivado do mesmo.

Compostos que induzem os processos de diferenciação celularsão, por exemplo, ácido retinóico, α- γ- ou δ-tocoferol ou a- γ- or δ-tocotrienol.

O termo inibidor da ciclooxigenase tal como aqui utilizado inclui,mas não é limitado a, por exemplo, os inibidores da Cox-2, o ácido 2-arilaminofenilacético 5-alquila substituído e derivados, tais como o celecoxib(CELEBREX), rofecoxib (VIOXX), etoricoxib, valdecoxib ou um ácido 5-alquil-2-aril-aminofenilacético, por exemplo, ácido 5 - metil - 2 - (2' - cloro -6' - fluoroanilino)fenil acético, lumiracoxib.

O termo "bisfosfonatos" tal como aqui utilizado inclui, mas não élimitado a, ácido etridônico, clodrônico, tiludrônico, pamidrônico, alendrônico,ibandrônico, risedrônico e zoledrônico. O "ácido etridônico" pode ser admi-nistrado, por exemplo, na forma em que é comercializado, por exemplo, soba marca registrada DIDRONEL. O "ácido clodrônico" pode ser administrado,por exemplo, na forma em que é comercializado, por exemplo, sob a marcaregistrada BONEFOS. O "ácido tiludrônico" pode ser administrado, por e-xemplo, na forma em que é comercializado, por exemplo, sob a marca regis-trada SKELID. O "ácido pamidrônico" pode ser administrado, por exemplo,na forma em que é comercializado, por exemplo, sob a marca registradaAREDIA®. O "ácido alendrônico" pode ser administrado, por exemplo, naforma em que é comercializado, por exemplo, sob a marca registrada FO-SAMAX. O "ácido ibandrônico" pode ser administrado, por exemplo, na for-ma em que é comercializado, por exemplo, sob a marca registrada BON-DRANAT. O "ácido risedrônico" pode ser administrado, por exemplo, na for-ma em que é comercializado, por exemplo, sob a marca registrada ACTO-NEL. O "ácido zoledrônico" pode ser administrado, por exemplo, na formaem que é comercializado, por exemplo, sob a marca registrada ZOMETA.

O termo "inibidores do mTOR" se refere aos compostos que ini-bem o alvo mamífero da rapamicina (mTOR) e que possuem atividade anti-proliferativa tal como o sirolimus (Rapamune®), everolimus (Certican®),CCI-779 e ABT578.

O termo "inibidores da heparanase" tal como aqui utilizado serefere aos compostos que direcionam, diminuem ou inibem a degradação dosulfato de heparina. O termo inclui, mas não é limitado a, Pl 88.

O termo "modificador biológico de resposta" tal como aqui utili-zado se refere a uma Iinfocina ou as interferonas, por exemplo, interferona γ.

O termo "inibidor de isoformas oncogênicas de Ras", por exem-plo, H-Ras, K-Ras, ou N-Ras, tal como aqui utilizado se refere aos compos-tos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade oncogênicas de Ras,por exemplo, "um inibidor da farnesil transferase" por exemplo, L-744832,DK8G557 ou P115777 (Zarnestra).

O termo "inibidores da telomerase" tal como aqui utilizado serefere aos compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade datelomerase. Compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade datelomerase são especialmente os compostos que inibem o receptor da telo-merase, por exemplo, a telomestatina.

O termo "inibidores da metionina aminopeptidase" tal como aquiutilizado se refere aos compostos que direcionam, diminuem ou inibem aatividade da aminopeptidase da metionina. Compostos que direcionam, di-minuem ou inibem a atividade da aminopeptidase da metionina são, por e-xemplo, a bengamida ou um derivado do mesmo.

O termo "inibidor proteasoma" tal como aqui utilizado se refereaos compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da protea-soma. Compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da pro-teasoma incluem, por exemplo, a PS-341 e a MLN 341.

O termo "inibidor da matriz da metaloproteinase" ou ("inibidorMMP") tal como aqui utilizado inclui, mas não é limitado aos inibidores pepti-diomiméticos e não peptidiomiméticos do colágeno, derivados da tetraciclina,por exemplo, inibidor hidroxamato peptidio mim ético do batimastat e seu aná-logo oral biodisponível 0 marimastat (BB-2516), prinomastat (AG3340), me-tastat (NSC 683551) BMS-279251, BAÍA 12-9566, TAA211, MMI270B ouAAJ996.

O termo "agentes usados para o tratamento de doenças malig-nas hematológicas" tal como aqui utilizado inclui, mas não é limitado aosinibidores da quinase da tirosina semelhantes ao FMS, por exemplo, com-postos para direcionar, diminuir ou inibir a atividade dos receptors da quina-se da tirosina semelhantes ao FMS (Flt-3R); interferona, 1-b-D-arabinofuransilcitosina (ara-c) e bissulfano; e os inibidores de ALK, por e-xemplo, compostom que direcionam, diminuem ou inibem a quinase anaplá-sica do limfoma.

Compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade dosreceptors da quinase da tirosina semelhantes ao FMS (Flt-3R) são especi-almente os compostos, as proteínas ou os anticorpos que inibem os mem-bros da família da quinase do receptor da Flt-3R, por exemplo, a PKC412, amidostaurina, um derivado da estauroporina, SU11248 e MLN518.

O termo de "inibidores da HSP90" tal como aqui utilizado inclui,mas não é limitado a, não composto para direcionar, diminuir ou inibir daatividade intrínseca da ATPase da HSP90; degradando, direcionando, dimi-nuindo ou inibindo as proteínas clientes da HSP90 através da via da protea-soma da ubiquitina. Composto para direcionar, diminuir ou inibir a atividadeintrínseca do ATPase da HSP90 são especialmente os compostos, as prote-ínas ou os anticorpos que inibem a atividade da ATPase da HSP90, por e-xemplo, 17-alilamino, 17-demetoxigeldanamicina (17AAG), um derivado dogeldanamicina; outros compostos relacionados com a geldanamicina; radici-col e inibidores da HDAC.O termo "anticorpos antiproliferativos" tal como aqui utilizadoinclui, mas não está limitado ao trastuzumab (Herceptin®), Trastuzumab-DM1, erlotinib (Tarceva®), bevacizumab (Avastin®), rituximab (Rituxan®),PR064553 (anti-CD40) e anticorpo 2C4. Por anticorpos se deseja significar,por exemplo, os anticorpos monoclonais intactos, os anticorpos policlonais,os anticorpos mu Itispec íficos formados pelo menos de 2 anticorpos intactose de fragmentos de anticorpos, enquanto exibirem a atividade biológica de-sejada.

Para o tratamento da leucemia mielóide aguda (AML), os com-postos de acordo com a Fórmula (I) podem ser usados em combinação comterapias padrão da leucemia, especialmente em combinação com as terapi-as usadas para o tratamento da AML. Particularmente, os compostos de a-cordo com a Fórmula (I) podem ser administrados em combinação com, porexemplo, os inibidores da farnesil transferase e/ou com outros fármacos ú-teis para o tratamento da AML, tal como a daunorubicina, adriamicína, Ara-C, VP-16, teniposídio, mitoxantrona, idarubicina, carboplatina e PKC412.

O termo "compostos antileucêmicos" inclui, por exemplo, a Ara-C, um análogo da pirimidina, que é o derivado da 2' - alfa - hidroxirribose(arabinosídio) da desoxicitidina. É incluído também o análogo da purina dahipoxantina, da 6-mercaptopurina (6-MP) e do fosfato de fludarabina.

Compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade deinibidores do deacetilase da histona (HDAC) tais como o butirato de sódio eo ácido hidroxâmico da suberoilanilida (SAHA) inibem a atividade das enzi-mas conhecidas como deacetilases da histona. Os inibidores específicos daHDAC incluem os MS275, SAHA1 FK228 (anteriormente FR901228), Tricos-tatin A e compostos descritos na Patente Americana US 6.552.065, particu-larmente, o N - hidróxi - 3 -[4- [[[2- (2 - metil - 1H - indolil - 3)- etil]- amino]-metil]- fenil] - 2E - 2 - propenamida, ou um sal farmaceuticamente aceitáveldo mesmo e o N - hidróxi - 3 -[4- [(2- hidroxietil) - {2- (1H - indolil - 3)- etil]-amino] metil] fenil] - 2E - 2 - propenamida, ou um sal farmaceuticamente a-ceitável do mesmo, especialmente o sal do lactato.

Compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade daquinase do mTOR da serína/treonina são especialmente os compostos, asproteínas ou os anticorpos que inibem membros da família da quinase domTOR, por exemplo, RAD, RAD001, CCI-779, ABT578, SAR543, rapamicinae derivados do mesmo; AP23573 do Ariad; everolimus (CERTICAN); e sirolimus.

Os antagonistas do receptor da somatoststina ta! como aqui uti-lizados se referem aos agentes que direcionam, tratam ou inibem o receptordo somatostatina tal como o octreoride, e o SOM230.

As abordagens de danificação da célula do tumor se referem àsabordagens tais como a radiação de ionização. O termo de "radiação de io-nização" referido à radiação acima e daqui por diante, significa a radiação deionização que ocorre ou com raios eletromagnéticos (tais como raios X eraios do gamma) ou com partículas (tais como as partículas alfa e beta). Aradiação de ionização é fornecida, mas não limitada a, terapia de radiação eé conhecida na técnica. Veja Hellman, Principies of Radiation Therapy, Cân-cer, in Principies and Practice of Oncology, Devita et al., Eds., 4- Edição,Vol.1,pp. 248-275(1993).

O termo "aglutinante EDG" tal como aqui utilizado se refere auma classe de imunossupressores que modula a recirculação do linfócito, talcomo o FTY720.

O CERTICAN (everolimus, RAD) é um novo inibidor investigatio-nal do sinal de proliferação da que impede a proliferação das células T e dascélulas vasculares da musculatura lisa.

O termo "inibidores da ribonucleotídio redutase" se refere aosnucleosídios análogos da pirimidina ou da purina incluindo, mas não limita-dos a, fludarabina e/ou arbinosídio citosina (ara-C), 6-tioguanina, 5-fluorouracila, cladribina, 6-mercaptopurina (especialmente em combinaçãocom o ara-C contra a ALL) e/ou pentostatina. Os inibidores da ribonucleotí-dio redutase são especialmente a hidroxiuréia ou derivados da 2-hidróxi-1 H-isoindol-1,3-diona, tais como PL-1, PL-2, PL-3, PL 4, PL-5, PL-6, PL-7 ouPL-8 mencionados em Nandy et al., Acta Oncologica, Vol. 33, Nq 8, pp. 953-961 (1994).O termo "inibidores da descarboxilase S-adenosilmetionina" talcomo aqui utilizado inclui, mas não é limitado aos compostos descritos naPatente Americana US 5.461.076.

São incluídos também particularmente aqueles compostos, pro-teínas ou anticorpos monoclonais da VEGF descritos no WO 98/35958, porexemplo, 1-(4-c!oroan!!ino)-4-(4-p!rid!!met!!)fta!azir!a ou um sal farmaceutica-mente aceitável do mesmo, por exemplo, o succinato, ou no WO 00/09495,no WO 00/27820, no WO 00/59509, no WO 98/11223, no WO 00/27819 e noEP 0 769 947; tais como aqueles descritos por Prewett et al, Câncer Res,Vol. 59, pp. 5209-5218 (1999); Yuan et al., Proc Natl Acad Sci U S A, Vol.93, pp. 14765-14770 (1996); Zhu et al., CancerRes, Vol. 58, pp. 3209-3214(1998); e Mordenti et al., Toxicol Pathol, Vol. 27, Nq 1, pp. 14-21 (1999); noWO 00/37502 e WO 94/10202; ANGIOSTATIN, descrita por 0'Reilly et al.,Cell, Vol. 79, pp. 315-328 (1994); ENDOSTATIN, descrita por 0'Reilly et al.,Cell, Vol. 88, pp. 277-285 (1997); amidas do ácido antranílico; ZD4190;ZD6474; SU5416; SU6668; bevacizumab; ou anticorpos anti-VEGF ou re-ceptores dos anticorpos anti-VEGF, por exemplo, rhuMAb e RHUFab, VEGFaptâmeros, por exemplo, Macugon; inibidores FLT-4, inibidores FLT-3, anti-corpo IgGI VEGFR-2, Angiozima (RPI 4610) e Avastan.

A terapia fotodinâmica, tal como aqui usada se refere à terapiausando determinados produtos químicos conhecidos como agentes fotos-sensibilizantes para tratar ou impedir o câncer. Os exemplos da terapia foto-dinâmica incluem o tratamento com agentes, tais como, por exemplo, Vl-SUDYNE e porfímero de sódio.

Os esteróides angiostáticos tal como aqui utilizados se referemaos agentes que obstruem ou inibem a angiogênese, tal como, por exemplo,anecortave, triamcinolona, hidrocortisona, 11-a-epiidrocotisol, cortexolona,17-a-hidroxiprogesterona, corticosterona, desoxicorticosterona, testosterona,estrona e dexametasona.

Os implantes contendo corticosteróides se referem aos agentes,tais como, por exemplo, a fluocinolona, dexametasona.

Outros agentes quimioterapêutico incluem, mas não são limita-dos a, alcalóides de plantas, agentes hormonais e antagonistas; modificado-res da resposta biológica, preferivelmente Iinfocinas ou interferonas; oligonu-cleotídios anti-sentido ou derivados de oligonucleotídio; ou agentes variadosou agentes com outros mecanismos desconhecidos de ação.

A estrutura dos agentes ativos identificados por números de có-digos, nomes genéricos ou nomes comerciais pode ser conseguida da sdi=ção atual do compêndio padrão "The Merck Index" ou das bases de dados,por exemplo, das Patentes Internacionais (por exemplo, publicações mundi-ais da IMS).

Os compostos acima mencionados, que podem ser usados emcombinação com um composto de acordo com a Fórmula (I), podem serpreparados e administrado tal como descrito na técnica como nos documen-tos acima citados.

Um composto de acordo com a Fórmula (I) também pode serusado com vantagem em combinação com processos terapêuticos conheci-dos, por exemplo, administração de hormônios ou especialmente a radiação.

Um composto de acordo com a Fórmula (I) pode particularmenteser usado como um radiossensibilizante, especialmente para o tratamentodos tumores que exibem uma pobre sensibilidade à radioterapia.

Por "combinação", se deseja sinificar ou uma combinação fixaem uma forma de dosagem unitária, ou um Kit com partes para a adminis-tração combinada onde um composto de acordo com a Fórmula (I) e um as-sociado na composição podem ser administrados independentemente, aomesmo tempo, ou separadamente, dentro de intervalos do tempo que permi-tem especialmente que os associados na composição mostrem um efeitocooperativo, por exemplo, sinergístico, ou qualquer combinação dos mes-mos.

Exemplos

Os seguintes exemplos servem para ilustrar a presente invençãosem limitar o escopo da mesma:

Abreviaturas.

DMSO dimetilsulfóxido.MS(ESI) Espectrometria de massa usando ionização por eletroatomização.

EtOAc Acetato de etila.

HPLC Cromatografia líquida de alta pressão.

mL mililitro.

T.A. temperatura ambiente.

tRET tempo de retencao na HPLC em minutos

TFA ácido trifluoroacético.

THF tetraidrofurano.

TLC cromatografia em camada fina,

TMSCI cloreto de trimetilsilila.

Onde nenhuma temperatura é fornecida, a reação ocorre natemperatura ambiente.

As proporções dos solventes, por exemplo, nos eluentes ou nasmisturas de solventes, são dadas em volume por volume (v/v).

Sínteses.

A cromatografia instantânea é realizada usando sílica-gel(Merck; 40 a 63 μιη). Para a cromatografia de camada fina, são usadas asplacas pré-revestidas de sílica-gel (Merck 60 F254). A detecção dos compo-nentes é feita por luz UV (254 nm). O HPLC é realizado em um Agiíent HP1100 usando uma coluna Nucleosil 100-3 Ci8 HD 125 χ 4,0 mm [1 mL/min.;20 a 100% NeCN / 0,1% TFA em 7 minutos): (método A); SpectraSystemSP8800/UV2000 usando uma coluna Nucleosil 100-5 Ci8 AB 250 χ 4,6 mm(2 mL/min.; 2-100% MeCN / 0,1% TFA em 10 minutos):(método B); usandouma coluna Chromalith Speed ROD RP18 50-4,6 mm (Merck) (2 mL/min.; 2a 100% MeCN / 0,1% TFA em 2 minutos):(método C); ou uma coluna C8 2,1a 50 mm 3pm (Waters) (2 mL/min.; 5 a 95% MeCN / 0,1% TFA em 2 minu-tos):(método D). Os espectros de massa por eletroatomização são obtidoscom um Fisons Instruments VG Platform II. Os pontos de fusão são medidoscom um instrumento de medição de pontos de fusão Büchi 510. Os solven-tes e os produtos químicos usados para sínteses são comercialmente dispo-níveis.

Condições analíticas da HPLC:Sistema 1:

Gradiente linear 20 a 100% CH3CN (0,1% TFA) e H2O (0,1%TFA) em 7 min + 2 min 100% CH3CN (0,1% TFA); detecção a 215 nm, taxade fluxo 1 mL/min a 30 °C. Coluna: Nucleosil 100-3 C18HD (125 χ 4mm).

Sistema 2:

Exemplo 1:

6 - (3 - cloro - fenil) - 3 - (3.4 - dimetóxi - fenil) - 5 - piperazin - 1 - ilmetil -pirazolH .5-alpirimidin - 7 - ilamina.

5-clorometil-6-(3-cloro-fenil)-3-(3,4-dimetóxi-fenil)-pirazol[1,5-a]pirimidin-7-ilamina (exemplo 1; estágio 1.3) (1,5 g; 3,49 mMoIs) é dissolvi-do em Ν,Ν'-dimetilacetamida (30 mL) na T.A., seguido pela adição da pipe-razina anidra (3,01 g; 34,9 mMols). A solução amarela é aquecida em 80 0Cpor 90 minutos. Após resfriar a mistura é concentrada sob a pressão reduzi-da. O resíduo é tomado em éter dietílico (20 mL) e agitado por 15 minutos,seguido por separação por filtração do produto cristalino bruto restante. Umapurificação adicional foi realizada pela repetição da cromatografia (sílica-gel,120g RediSep, ISCO Sg-100, eluindo com CH2CI2/MeOH 4:1).

Estágio 1.1: 2-(3-cloro-fenil)-3-oxo-butironitrila.

355 ml de etanol são aquecidos até 55°C sob N2. A esta soluçãoé adicionado o sódio (3,91 g; 0,17 mol) dentro de 30 min. e agitados por 1,5h até todo o metal ser dissolvido. 3-clorobenzil cianida (15,31 g; 0,1 mol) eacetato de etila (28,53 mL; 0,29 mol) são adicionados à solução incolor, se-guida de agitação sob refluxo por 5 h. Após a conclusão da reação, a mistu-ra amarela é resfriada até a T.A., e evaporada sob a pressão reduzida. Omaterial bruto é tomedo em água (200 mL) e neutralizado por uma adição de25 g de ácido cítrico. A camada aquosa é extraída com CH2CI2 (2x 250 mL).

As fases orgânicas combinadas são lavadas com H2O (2 χ 150 mL), secas(Na2SO4), concentradas sob a pressão reduzida e cromatografada (sílica-gel, 1 kg, Merck 60 (0,040 a 0,063), eluindo com EtOAc/Hexanos 1:1) paraobter o composto do título como cristais amarelados; PF: 92 a 97 °C;

MS(ESI+):m/z = 302,9 (M+H)+; HPLC: Atnet = 5,67 minutos (Sistema 1).

Estágio 1.2: 4-bromo-2-(3-cloro-fenil)-3-oxo-butiro nitrila.2-(3-cloro-fenil)-3-oxo-butironitrila (12 g; 62 mmols) é dissolvido em ácidoacético (400 mL) na T.A., seguido pela adição de bromo (3,84 mL; 74,4mMois), o condensador coberto com um tubo do CaCI2. A solução amarela éagitada por 90 minutos em 90 0C. Após resfriar até T.A. o solvente é removi-do sob a pressão reduzida. O resíduo oleoso é tomado em tolueno (50 mL) elivrado do solvente sob a pressão reduzida; este procedimento está sendorepetido quatro vezes. Após essas etapas de purificação, o composto detítulo é isolado como cristais amarelos-brilhantes finos; Pf. 124 a 132°C;MS(ESI-):m/z = 271,9 (M-H)"; HPLC: tRet = 6,31 minutos (sistema 2).

Estágio 1.3: 5-clorometil-6-(3-cloro-fenil)-3-(3,4-dimetóxi-fenil)-pirazol[1,5-a]pirimidin-7-ilamina.

4-bromo-2-(3-cloro-fenil)-3-oxo-butironitrila (exemplo 1; estágio1.2); (9,43g; 34,6 mmols) é dissolvido em metanol (200 mL) seguido pelaadição de 4-(3,4-dimetóxi-fenil)-2H-pirazol-3-ilamina (15,2g; 69,2 mMol) (vejao exemplo 93; do estágio 93.1 na EP 2005/000602) e HCI em etanol (111 mLda solução de 1,25 M; 138 mmols) na T.A. A suspensão levemente amarela-da foi aquecida por refluxo por um total de 163 h; o condensador cobertocom um tubo de CaCI2. Após resfriar até a T.A. o produto cristalino foi sepa-rado por filtração e lavado com etanol. Uma purificação adicional foi realiza-da por cromatografia instantânea (sílica-gel, eluindo com CH2CI2/MeOH98:2) para obter o composto do título como cristais amarelos; Pf. 209 a211 °C; MS(ESI+):m/z = 429 (M+H)+; HPLC: tRet = 7,06 minutos (sistema 2).

Exemplo 2:

3 - (3,4 - dimetóxi - fenil) - 6 - (4 - flúor - fenil) - 5 - piperazinil - 1 - metil -pirazolíl .5-alpirimidin - 7 - ilamina.

O composto do título é preparado tal como descrito no Exemplo1; usando preferivelmente 5-clorometil-3-(3,4-dimetóxi-fenil)-6-(4-flúor-fenil)-pirazol[1,5-a]piridinil-7-amina.

Estágio 2.1: 5-clorometil-3-(3,4-dimetóxi-fenil)-6-(4-flúor-fenil)-pirazol[1,5-a]pirimidin-7-ilamina.

O composto do título é preparado tal como descrito no exemplo1; usando preferivelmente 2-(4-flúor-fenil)-3-oxo-butironitrila (exemplo 79; doestágio 79.1 na EP 2005/000602). Composto do título: cristais amareladosPf. 256 a 259°C; MS(ESI+):m/z = 413 (M+H)+; HPLC: tRet = 6,65 minutos(sistema 2).

Propriedades Fisicoquímicas dos Exemplos 1 e 2.

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Os seguintes exemplos de 3 a 5 podem ser preparados de modoanálogo.

Exemplo 3:

6 - (3 - cloro - fenil) - 3 - Í4 - (2 - dimetilamino - etóxi) - fenill - 5 - piperazinil -1 - metil - pirazolH ,5-alpirimidin - 7 - ilamina.

Exemplo 4:

2 - [\1 - amino - 6 - (3 - cloro - fenil) - 3 - (3.4 - dimetóxi - fenil) - pirazoIM .5-alpirimidin - 5 - ilmetill - amino) - etanol.

Exemplo 5:

2 - (Γ7 - amino - 3 - (3,4 - dimetóxi - fenil) - 6 - (4 - flúor - fenil) - pirazoIM .5-alpirimidin - 5 - ilmetill - amino) - etanol.

Exemplo 6:

Comprimidos 1 compreendendo os compostos de acordo com a Fórmula (I).

Comprimidos compreendendo como o componente ativo, 50 mgde qualquer um dos compostos de acordo com a Fórmula (I) mencionadosnos exemplos precedentes de acordo com a seguinte composição são pre-paradas usando métodos rotineiros:

<table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table>

Produção:

O componente ativo é combinado com parte do amido de trigo, alactose e a sílica colloidal e a mistura é prensada através de uma peneira.Uma parte adicional do amido de trigo é misturada com 5 χ a quantidade deágua em um banho da água para formar uma pasta e a mistura feita primei-ramente é sovada com esta pasta até que esteja formada uma massa fracaplástica.

Os grânulos secos são pressionados através de uma peneirapossuindo um tamanho malha de 3 mm, misturados com uma mistura pré-peneirada (peneira de 1 mm) do amido de milho, do estearato do magnésioe do talco restantes e prensados os comprimidos de forma ligeiramente bi-convexos.

Exemplo 7.

Comprimidos 2 compreendendo os compostos de acordo com a Fórmula (I).

Comprimidos compreendendo como o componente ativo, 100mg de qualquer um dos compostos de acordo com a Fórmula (I) menciona-dos nos exemplos precedentes de acordo com a seguinte composição são

<table>table see original document page 54</column></row><table>Produção:

O componente ativo é misturado com os materiais dos veículose comprimidos através de máquina de tabletagem (Korsch EKO1 Stempel-durchmesser 10 mm).

Exemplo 8.

Cápsulas.

<table>table see original document page 55</column></row><table>

A produção é feita misturando os componentes e enchendo-osem cápsulas de gelatina dura, tamanho 1.

Exemplo 9.

Dados biológicos dos compostos dos Exemplos 1 e 2 como EphB4 e c-Ablinibidores da proteína guinase.

<table>table see original document page 55</column></row><table>

Tabela 1: Inibicão da guinase do receptor de Efrina B4:

Coluna I: Atividade dos compostos do exemplo 1 e 2 como os inibidores daquinase do receptor de Efrina B4 são testados em domínios recombinantesdo receptor de Efrina B4 de acordo com o método descrito no relatório des-critivo.

Coluna II: A atividade dos compostos dos exemplos 1 e 2 como inibidores daautofosforilação do receptor EphB4 in vitro nas células é medida tal comodescrito no relatório descritivo.

c-Abl.

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Tabela 2: Inibição da atividade da quinase da proteína c-Abl da tirosina.

A atividade dos compostos dos Exemplos 1 e 2 como c-Abl osinibidores da quinase da proteína da tirosina são testados de acordo com ométodo descrito no relatório descritivo.

Claims

1. Composto de acordo com a fórmula (I):<formula>formula see original document page 57</formula>em que:R1 é HR2 é benzila; fenila não-substitiuída ou fenila substituída por umou dois substituintes escolhidos do grupo composto de halogênio, dialquila-minoalcóxi inferior, hidróxi, alcóxi, benzilóxi, cicloalquila, amino e acetil ami-no;R3 é H e R4 é hidroxialquila ouR3 e R4 juntamente com o átomo de nitrogênio são ligados pararepresentar as morfolinila, pirrolinila, piperidinila ou piperazinila, os heteroci-clos sendo opcionalmente também substituídos por até quatro grupos alqui-la;A é fenila não-substituída ou substituída por um ou mais dossubstituintes escolhidos do grupo composto de mono, di ou trialcóxi inferior,dialquilaminila inferior; dialquilaminoalcoxi inferior; morfolinila que é opcio-nalmente dissubstituída por alquila; piperidinila que é opcionalmente substi-tuída por dialquilaminila inferior; e piperazinila que é opcionalmente substitu-ída por alquila inferior, alcóxi inferior, alquila inferior piperazinila, pirrolinila,dialquilaminila inferior ou dialquilaminila;ou um sal farmacêutico do mesmo.

2. Composto de acordo com a fórmula (I) e de acordo com a rei-vindicação 1, em que:R1 é HR2 é fenila substituída por flúor ou cloro;R3 é H e R4 é hidroxietila ouR3 e R4 juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estãoligados para representar piperazinila;A é fenila que é substituída com um ou mais dos substituintesescolhidos do grupo consistindo em: mono, di ou trimetóxi, dimetilaminoetóxie dietilamino piperidinilaou um sal farmacêutico do mesmo.

3. Composto de acordo com a fórmula (I) e de acordo com a rei-vindicação 1 ou 2, para uso no tratamento de um corpo animal ou e um cor-po humano.

4. Composição farmacêutica compreendendo um composto deacordo com a fórmula (I) e como definido na reivindicação 1 ou 2.

5. Composição farmacêutica compreendendo um composto deacordo com a fórmula (I) e como definido na reivindicação 1 ou 2, e um veí-culo farmaceuticamente aceitável.

6. Uso de um composto de acordo com a fórmula (I) e como de-finido na reivindicação 1 ou 2, no preparo de composições farmacêuticaspara uso no tratamento de uma doença dependente da quinase.

7. Uso de um composto de acordo com a fórmula (I) e de acordocom a reivindicação 6, ou os sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo,para o tratamento de uma doença dependente da proteína quinase, em quea doença dependente da quinase é uma dependendo das c-Abl, Bcr-Abl,c-Kit, c-Raf, Flt-1, Flt-3, Her-1, KDR, PDGFR-quinase, c-Src, RET-receptorquinase, FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3, FGF-R4, quinases do receptor de Efrina(por exemplo, EphB2 quinase, EphB4 quinase e quinases relacionadas comEph), as quinases da caseína (CK-1, CK-2, G-CK), Pak, ALK, ZAP70, Jak1,Jak2, Axl, Cdkl, cdk4, cdk5, Met, FAK, Pyk2, Syk, quinase do receptor deinsulina, Tie-2 ou mutações constutivamente de ativação das quinases (qui-nases de ativação) tal como de Bcr-Abl, c-Kit, c-Raf, Flt-3, FGF-R3, recepto-res PDGF, RET, MET (especial aberrante e altamente expressada ou ativa-da) e doenças dependentes da quinase ou doenças dependentes da ativa-ção dos caminhos da quinase, ou uma doença dependente de quaisquerduas ou mais das quinases apenas acima mencionadas.

8. Uso de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que a doençadependente do quinase é uma dependendo das c-abl, Flt-3, KDR, c-Src,RET1 EphB4, c-Kit, cdkl, FGFR-1, c-raf, Her-1, Ins-R ou Tek.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 8,em que a doença a ser tratada é uma doença proliferativa, preferivelmenteum tumor benigno ou especialmente um tumor maligno, mais preferivelmen-te carcinoma do cérebro, do rim, do fígado, da glândula adrenal, da bexiga,do seio, do estômago (especialmente tumores gástricos), dos ovários, docólon, do reto, da próstata, do pâncreas, do pulmão, da vagina, da tiróide,sarcoma, glioblastomas, mieloma múltiplo ou câncer gastrointestinal, especi-almente carcinoma do cólon ou adenoma colorretal, ou um tumor da gargan-ta e da cabeça, uma hiperproliferação epidérmica, especialmente, a hiper-plasia da próstata, uma neoplasia, especialmente de caráter epitelial, do car-cinoma preferivelmente mamário ou uma leucemia.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 9, em que a doença a ser tratada é uma doença que é provocada pela angi-ogênese persistente, tal como a psoríase; o sarcoma de Kaposi; a reesteno-se, por exemplo, a reestenose induzida por stent; a endometriose; a doençade Crohn; a doença de Hodgkin; a leucemia; a artrite, tal como a artrite reu-matóide; o hemangioma; angiofibroma; doenças dos olhos, tais como o glau-coma neovascular e retinopatia diabética; doenças renais, tais como o glo-merulonefrite; nefropatia diabética; nefrosclerose maligna; síndrome das mi-croangiopatias trombóticas; rejeição de transplantes e glomerulopatia; doen-ças fibróticas, tais como a cirrose do fígado; doenças proliferativas das célu-las mesangiais; arteriosclerose; os ferimentos do tecido dos nervos; e para ainibição da reoclusão de vasos após o tratamento com cateter balão, parauso em próteses vasculares ou após ter introduzido dispositivos mecânicospara manter abertos os vasos, tal como, por exemplo, após o uso de stents,ou como imunossupressores, ou como um auxiliar para cura de ferimentossem produção de cicatrizes e para o tratamento manchas senís e da derma-tite de contato.