JP2009501748A - たんぱく質キナーゼ阻害剤としてのピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体 - Google Patents

Abstract

本発明は、式（Ｉ）のピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体およびその塩、たんぱく質キナーゼ依存性疾患の処置におけるその使用に関する。
【化１】

Description

本発明は、ピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体、たんぱく質キナーゼ依存性疾患の処置におけるそれらの使用、前記疾患を処置する薬剤組成物の製造のためのそれらの使用、前記疾患の処置におけるピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体の使用方法、前記疾患の処置のためのピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体を含んでなる薬剤製剤、新規なピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体、新規なピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体および薬剤製剤の製造方法、上述のピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体の使用または使用方法、および／または動物またはヒトの体の処置における使用のためのこうしたピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体に関する。

ピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体は、ベンゾジアゼピン受容体のリガンド(たとえば、 S. Selleri et al., Bioorg. Med. Chem 7 (12), 2705-11 (1999))、コルチコトロピン放出因子のアンタゴニスト(EP 1097709)、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト(たとえば、S. Takeshi et al., Japn. Pharm. Bull. 47 (7), 928-38 (1999))、モノオキシドシンセターゼ阻害剤(JP 10101671)、鎮痛剤(WO 9535298)、抗真菌剤(EP 071792)または抗炎症剤(WO 9218504)として文献に報告されてきた。

我々は、今やピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体骨格構造はまた、強力なキナーゼ阻害剤のデザインのための鋳型として使用することができることを見出した。

多数のたんぱく質キナーゼ阻害剤と多くの増殖性の他のたんぱく質キナーゼ関連疾患に鑑みて、たんぱく質キナーゼ阻害剤として、従って、関連疾患の処置において有用である新規な種類の化合物を提供するニーズが常にある。

可能性のある増殖性疾患の処置の観点から望ましいことは、特定のたんぱく質キナーゼまたはたんぱく質キナーゼクラスにそれぞれ合わせた極めて多数の化合物クラスを所有することであり、それによって特定の処置が可能になる。それ故、こうした特定の阻害効果を考慮して、新規なクラスの化合物を見出す強いニーズが存在する。

一つの実施の形態では、本発明は、式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ_１は、Ｈであり、
Ｒ_２は、ベンジル；無置換フェニルまたはハロ、ジ−低級アルキルアミノアルコキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ベンジルオキシ、シクロアルキル、アミノ、アセチルアミノから成る群より選択される一つまたは二つの置換基によって置換されているフェニルであり、
Ｒ_３は、Ｈであり、そしてＲ_４は、ヒドロキシアルキルであるか、または、
Ｒ_３およびＲ_４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、モルホリニル、ピロリジニル、ピペリジニルまたはピペラジニル（これらのヘテロ環類は、所望により、更に４個までのアルキル基によって置換されていることもある）を表し、
Ａは、無置換またはモノ−、ジ−またはトリ−低級アルコキシ、ジ−低級アルキルアミニル、ジ−低級アルキルアミノアルコキシ、所望によりアルキルによってジ置換されていることもあるモルホリニル、所望によりジ−低級アルキルアミニルによって置換されていることもあるピペリジニル、および所望により低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルピペラジニル、ピロリジニル、ジ−低級またはアルキルアミニルによって置換されていることもあるピペラジニルから成る群より選択される一つまたはそれ以上の置換基によって置換されているフェニルである）
の化合物またはその薬学的塩に関する。

一つの好ましい実施の形態は、上記による式Ｉにおいて、
Ｒ_１が、Ｈであり、
Ｒ_２が、フルオロまたはクロロによって置換されているフェニルであり、
Ｒ_３が、Ｈであり、そしてＲ_４が、ヒドロキシエチルであるか、または、
Ｒ_３およびＲ_４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ピペラジニルを表し、
Ａが、モノ−、ジ−またはトリ−メトキシ、ジ−メチルアミノエトキシおよびジ−エチルアミノピペリジニルから成る群より選択される一つまたはそれ以上の置換基で置換されているフェニルである、
式Ｉの化合物またはその薬学的塩である。

更なる実施の形態は、上記による式Ｉにおいて、
Ｒ_１が、Ｈであり、
Ｒ_２が、フルオロまたはクロロによって置換されているフェニルであり、
Ｒ_３およびＲ_４は、それらが結合している窒素と一緒になって、ピペラジニル基を表し、
Ａが、モノ−、ジ−またはトリ−メトキシ、ジ−メチルアミノエトキシおよびジ−エチルアミノピペリジニルから成る群より選択される一つまたはそれ以上の置換基ので置換されているフェニルである、
式Ｉの化合物またはその薬学的塩である。

更なる実施の形態は、上記による式Ｉにおいて、
Ｒ_１が、Ｈであり、
Ｒ_２が、フルオロまたはクロロによって置換されているフェニルであり、
Ｒ_３およびＲ_４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ピペラジニルを表し、
Ａが、モノ−、ジ−およびトリ−メトキシから成る群より選択される置換基の一つまたはそれ以上で置換されているフェニルである、
式Ｉの化合物またはその薬学的塩である。

別の実施の形態は、上記による式Ｉにおいて、
Ｒ_１が、Ｈであり、
Ｒ_２が、フルオロまたはクロロによって置換されているフェニルであり、
Ｒ_３が、Ｈであり、そしてＲ_４が、ヒドロキシエチルであり、
Ａが、モノ−、ジ−およびトリ−メトキシから成る群より選択される置換基の一つまたはそれ以上で置換されているフェニルである、
式Ｉの化合物またはその薬学的塩である。

一つの実施の形態では、本発明はヒトまたは動物の体の処置における使用のための式Ｉの化合物に関する。

更に別の実施の形態は、薬剤組成物の製造における上記による式Ｉの化合物の使用に関する。

更に別の実施の形態は、上記による式Ｉの化合物を含んでなる薬剤組成物である。

薬剤組成物は、好ましくは、上記による式Ｉの化合物と許容される薬学的担体を含んでなる。

別の実施の形態では、キナーゼ依存性疾患の処置に使用のための薬剤組成物の製造における上記による式Ｉの化合物の使用が提供される。

たんぱく質キナーゼ依存性疾患は、好ましくは、ｃ−Ａｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−Ｒａｆ、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、Ｈｅｒ−１、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲ−キナーゼ、ｃ−Ｓｒｃ、ＲＥＴ−受容体キナーゼ、ＦＧＦ−Ｒ１、ＦＧＦ−Ｒ２、ＦＧＦ−Ｒ３、ＦＧＦ−Ｒ４、エフリン(Ephrin)受容体キナーゼ（たとえば、ＥｐｈＢ２キナーゼ、ＥｐｈＢ４キナーゼおよび関連Ｅｐｈキナーゼ）、カゼインキナーゼ（ＣＫ−１、ＣＫ−２、Ｇ−ＣＫ）、Ｐａｋ、ＡＬＫ、ＺＡＰ７０、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ａｘｌ、Ｃｄｋ１、ｃｄｋ４、ｃｄｋ５、Ｍｅｔ、ＦＡＫ、Ｐｙｋ２、Ｓｙｋ、インシュリン受容体キナーゼ、Ｔｉｅ−２またはＢｃｒ−Ａｂｌ、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−Ｒａｆ、Ｆｌｔ−３、ＦＧＦ−Ｒ３、ＰＤＧＦ−受容体、ＲＥＴおよびＭｅｔのようなキナーゼの構成的に活性化され変異体（活性化キナーゼ）に依存する疾患、および（特に異常な高発現または活性化された）キナーゼ依存性疾患またはキナーゼ経路の活性化に依存する疾患、または上記で言及したキナーゼの任意の二つまたはそれ以上に依存する疾患である。

たんぱく質キナーゼ依存性疾患は、より好ましくは、ｃ−ａｂｌ、Ｆｌｔ−３、ＫＤＲ、ｃ−Ｓｒｃ、ＲＥＴ、ＥｐｈＢ４、ｃ−ｋｉｔ、ｃｄｋ１、ＦＧＦＲ−１、ｃ−ｒａｆ、Ｈｅｒ−１、Ｉｎｓ−ＲまたはＴｅｋに依存する疾患である。

最も好ましくは、処置される疾患は、増殖性疾患であり、好ましくは良性または特に悪性腫瘍であり、より好ましくは、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、乳房、胃(特に胃腫瘍)、卵巣、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肺、膣、甲状腺、肉腫、神経グリア芽細胞腫、多発性骨髄腫または胃腸のがん（特に結腸がんまたは結腸直腸腺腫）、または頸頭部腫瘍、表皮過剰増殖（特に乾癬、前立腺肥大症）、新生物形成（特に上皮性性質）、好ましくは、乳がん、または白血病である。

更なる実施の形態では、処置される疾患は、乾癬のような持続的な血管形成、カボジ肉腫、再狭窄（たとえば、ステントによる再狭窄）、子宮内膜症、クローン病、ホジキン病、白血病、関節リウマチのような関節炎、血管腫、血管線維腫、糖尿病性網膜症および血管新生緑内障のような眼疾患、糸球体腎炎のような腎疾患、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性細小血管症候群、移植後拒絶反応および糸球体症、肝硬変のような線維性疾患、メサンギウム細胞増殖性疾患、動脈硬化症、神経組織損傷によって引き起こされる疾患である。

本発明化合物は、血管補綴(vascular prosthetics)中、またはたとえばステントのような血管を広げておくための機械的装置を挿入した後に、免疫抑制剤として、傷跡を残さない創傷治癒の補助として使用できるように、バルーン付カテーテル処置の後の血管の再閉塞を阻止するため、そして老人斑(age spot)および接触皮膚炎を処置するためにも使用され得る。

本明細書の上記および下記に使用されている一般的用語は、別途指示しない限り、この開示の文脈内で、好ましくは次の意味を有する：

アルキルは、好ましくは７個まで、好ましくは１から５個まで(５個を含む)の炭素原子を有するアルキルである低級アルキルを含み、直鎖または分枝状である；好ましくは、低級アルキルは、ｎ−ペンチルのようなペンチル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルのようなブチル、ｎ−プロピルまたはイソプロピルのようなプロピル、エチルまたはメチルである。低級アルキルはメチル、プロピルまたはｔｅｒｔ−ブチルが好ましい。

アルキルは、置換されていてもまたは無置換であってもよく、置換されている場合は、更に、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、上記に定義されている任意のアリール基または下記に定義されている任意の官能基を含む、３個までの置換基によってなされていてもよい。

ハロまたはハロゲンは、好ましくは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードであり、フルオロ、クロロまたはブロモが最も好ましい。

化合物、塩、薬剤製剤、疾患などに複数形が使用されている場合は、それが一つの化合物、塩なども意味することを意図している。

塩は、特に式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩である。
こうした塩は、たとえば、好ましくは有機または無機酸とで、酸付加塩、特に薬学的に許容される塩として、塩基性窒素原子を有する式(Ｉ)の化合物から形成される。適切な無機酸には、たとえば、塩酸のようなハロゲン酸、硫酸、またはリン酸がある。適切な有機酸には、たとえば、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸またはスルファミン酸があり、たとえば酢酸、プロピオン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、グリコール酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸またはアスパラギン酸のようなアミノ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、シクロヘキサンカルボン酸、アダマンタンカルボン酸、安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、フタル酸、フェニル酢酸、マンデル酸、桂皮酸、メタン−またはエタン−スルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１,２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、１,５−ナフタレン−ジスルホン酸、２−、３−または４−メチルベンゼンスルホン酸、メチル硫酸、エチル硫酸、ドデシル硫酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸、Ｎ−メチル−、Ｎ−エチル−またはＮ−プロピル−スルファミン酸、またはアスコルビン酸のような他の有機プロトン酸である。

カルボキシまたはスルホのような負に荷電されたラジカルの存在下で、塩は、また塩基とで形成されてもよく、たとえば金属またはアンモニウム塩、たとえばアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、たとえばナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウム塩、またはアンモニアまたは適当な有機アミン、たとえば３級モノアミン、たとえばトリエチルアミンまたはトリ(２−ヒドロキシエチル)アミンとのアンモニウム塩、またはヘテロ環式塩基、たとえばＮ−エチル−ピペリジンまたはＮ,Ｎ'−ジメチルピペラジンである。

塩基性基および酸性基が同じ分子内に存在するとき、式(Ｉ)の化合物はまた分子内塩も形成できる。

単離または精製目的で、薬学的に許容されない塩、たとえばピクリン酸塩または過塩素酸塩を使用することも可能である。治療的使用のためには、薬学的に許容される塩または遊離化合物のみが用いられ(適用可能であれば薬剤製剤の形で)、それ故、これらが好ましい。

遊離形態の化合物と、中間体としてたとえば本化合物の精製または同定に使用できる塩を含むそれらの塩、互変異性体または互変異性体混合物およびそれらの塩の形態の化合物との密接な関係に鑑みて、上記および下記での化合物、特に式(Ｉ)の化合物に関するすべての言及は、適宜、当を得ている場合、そしてそれ以外のことが特筆されていない限り、これらの化合物、特に式(Ｉ)の化合物の対応する互変異性体、これらの化合物、特に式(Ｉ)の化合物の互変異性体混合物、または任意のこれらの塩をも言及しているものとして理解されるべきである。

“化合物...、その互変異性体；またはその塩”などと言及されているとき、これは“化合物...、その互変異性体、または化合物もしくは互変異性体の塩”を意味する。

全ての不斉炭素原子は(Ｒ)−、(Ｓ)−または(Ｒ,Ｓ)−立体配置、好ましくは(Ｒ)−または(Ｓ)−立体配置内に存在し得る。飽和結合を有する原子での環の置換基は、可能であれば、シス−(＝Ｚ−)またはトランス(＝Ｅ−)形で存在し得る。従って、本化合物は、異性体の混合物としてまたは好ましくは純粋な異性体として、好ましくはエナンチオマー−純粋なジアステレオマーもしくは純粋なエナンチオマーとして存在し得る。

本発明はまた、プロドラッグとしてイン・ビボで式(Ｉ)の化合物に変換する式（Ｉ）の化合物のプロドラッグにも関連する。それ故、式(Ｉ)の化合物のいかなる言及も、適宜、当を得ている場合、式(Ｉ)の化合物の対応するプロドラッグにも言及しているものとして理解されるべきである。

式（Ｉ）の化合物は、Alicade, E; De Mendoza, J; Garcia-Marquina, JM; Almera, C; J. Heterocycl. Chem. 11, 423 (1974)によってまたはＥＰ ２００５／０００６０２に述べられている手順に準じて製造することができる。

少なくとも１個の塩形成基を有する式(Ｉ)の化合物の塩は、それ自体公知の方法で製造できる。たとえば、酸性基を有する式(Ｉ)の化合物の塩は、好ましくは、化学量論的量のまたはわずかに過剰の塩形成剤を使用して、たとえば、化合物を、適切な有機カルボン酸のアルカリ金属塩、たとえば２−エチルヘキサン酸のナトリウム塩のような金属化合物で処理するか、有機アルカリ金属またはアルカリ土類金属化合物、たとえばナトリウムまたはカリウムの水酸化物、炭酸塩類または炭酸水素塩類のような対応する水酸化物、炭酸塩または炭酸水素塩で処理するか、対応するカルシウム化合物で処理するか、またはアンモニアまたは適切な有機アミンで処理して形成できる。式(Ｉ)の化合物の酸付加塩は、たとえば化合物を酸または適切なアニオン交換試薬で処理することによって、通例の方法で得られる。酸性および塩基性塩形成基（たとえば遊離カルボキシ基および遊離アミノ基）を含む式(Ｉ)の化合物の分子内塩は、たとえば酸付加塩のような塩を等電点まで、たとえば弱塩基を用いて中和することにより、またはイオン交換体での処理により形成できる。

塩は、通例の方法で、遊離化合物に変換できる；金属およびアンモニウム塩は、たとえば、適切な酸での処理により、そして酸付加塩は、たとえば、適切な塩基性試薬での処理により変換できる。

本発明によって得られる異性体の混合物は、それ自体公知の方法で個々の異性体に分離することができる；ジアステレオ異性体は、たとえば、多相性溶媒混合物間の分配、再結晶および／または、たとえばシリカゲルでの、または、たとえば逆相カラムの中圧液体クロマトグラフィーでのクロマトグラフによる分離により分離することができ、そしてラセミ体は、たとえば、光学的に純粋な塩形成試薬とで塩を形成させ、そうして得られるジアステレオ異性体の混合物を、たとえば、分別結晶、または光学活性カラム材でのクロマトグラフィーによって分離することにより分離できる。

中間体および最終生成物は、たとえばクロマトグラフィー法、分配法、(再)結晶化などを使用して、標準的な方法によって後処理および／または精製することができる。

次に述べることは、一般的に上記および下記に言及されている方法のすべてに適用されるが、上記または下記に具体的に述べられている反応条件が好ましい：

上記のプロセス工程のすべては、それ自体公知の反応条件のもと、好ましくは、具体的に述べられている反応条件、溶媒または希釈剤(好ましくは使用する試薬に対して不活性であり、それらを溶解する溶媒または希釈剤)の非存在下、または通例、存在下、触媒、縮合剤または中和剤（たとえばイオン交換体、たとえばＨ^＋形態の、たとえばカチオン交換体）の非存在下または存在下、反応および／または反応体の性質に応じて、低温、常温または高温、たとえば約−１００℃から約１９０℃、好ましくは約−８０℃から約１５０℃、たとえば−８０から−６０℃、室温、−２０から４０℃の温度範囲または還流温度で、大気圧下または密封容器中、適切であれば加圧下、および／または不活性雰囲気下、たとえばアルゴンまたは窒素雰囲気下で行うことができる。

反応のすべての段階で、形成される異性体の混合物は、たとえば、“付加的方法工程(Additional process steps”の下に記載のプロセスに準じて分離して、個々の異性体、たとえばジアステレオ異性体またはエナンチオマー、あるいは異性体の任意の所望の混合物、たとえばラセミ体またはジアステレオ異性体の混合物にすることができる。

任意の特定の反応に適切な溶媒が、溶媒群から選択されうるが、この溶媒群には、具体的に言及されている溶媒群または、こうした方法の記載に別途特記されていない限り、たとえば、水、たとえば低級アルキル−低級アルカノアートであるエステル類（たとえば酢酸エチル）、たとえば脂肪族エーテルであるエーテル類、（たとえばジエチルエーテル、または環状エーテル（たとえばテトラヒドロフランまたはジオキサン））、たとえばベンゼンまたはトルエンである液体芳香族性炭化水素類、アルコール類（たとえばメタノール、エタノールまたは１−または２−プロパノール）、ニトリル類（たとえばアセトニトリル）、ハロゲン化炭化水素類（たとえば塩化メチレンまたはクロロホルム）、酸アミド類（たとえばジメチルホルムアミドまたはジメチルアセトアミド）、たとえばヘテロ環式窒素塩基である塩基類（たとえばピリジンまたはＮ−メチルピロリジン−２−オン）、たとえば低級アルカン酸無水物であるカルボン酸無水物類（たとえば酢酸無水物）、環状、直鎖または分枝状炭化水素類（たとえばシクロヘキサン、ヘキサンまたはイソペンタン）、またはこれらの溶媒の混合物、たとえば水溶液が含まれる。こうした溶媒混合物はまた、たとえばクロマトグラフィーまたは分配による後処理にも使用することができる。

その塩を含む本化合物はまた水和物の形で得ることができ、またはその結晶は、たとえば、結晶化に使用された溶媒を含み得る。異なる結晶形が存在し得る。

本発明は、本方法の任意の段階で中間体として得られる化合物を出発物質として使用し、そして残りの方法工程を行うか、または、出発物質を反応条件下で形成するかまたは誘導体（たとえば、保護された形あるいは塩の形）の形で使用するか、または、本発明による方法によって得られる化合物を本方法条件下で製造して更にインサイチュで処理するような形態にも関する。本発明の方法において、好ましくはこうした出発物質を使用し、初めに特に価値があると記載した新規な式(Ｉ)の化合物に至る。実施例に記載のものと同一または類似した反応条件が特に優先される。

式(Ｉ)の化合物は価値ある薬理学的特性を示す。これらは、たとえば、種々のたんぱく質キナーゼ阻害剤として、好ましくは、ｃ−ａｂｌ、Ｆｌｔ−３、ＫＤＲ、ｃ−Ｓｒｃ、ＲＥＴ、ＥｐｈＢ４、ｃ−ｋｉｔ、ｃｄｋ１、ＦＧＦＲ−１、ｃ−ｒａｆ、Ｈｅｒ−１、Ｉｎｓ−ＲまたはＴｅｋ阻害するものとして、最も好ましくは、エフリンＢ４受容体（ＥｐｈＢ４）キナーゼの阻害剤として、生物学的活性を示す。それ故、本発明の化合物は、キナーゼ依存性疾患の処置に（たとえば、増殖性疾患を処置する薬剤として）有用である。

“チロシンたんぱく質キナーゼ依存性疾患の処置”という用語は、前記疾患、特に下記に述べられている疾患の予防的または好ましくは治療的(軽減的および／または治癒的を含む)処置を意味する。

ＲＥＴの阻害は次の通り測定される：バキュロウイルスドナーベクターｐＦＢ−ＧＳＴＸ３を使用して、ＲＥＴの野生型キナーゼドメイン(ｗｔＲＥＴ)に対応するヒトＲＥＴ−Ｍｅｎ２Ａ、および、活性化ループＭ９１８Ｔにおける活性化変異によってｗｔＲＥＴとは異なるＲＥＴ−Ｍｅｎ２Ｂの細胞質内キナーゼドメインのアミノ酸領域６５８−１０７２(Swiss prot No. Q9BTB0)を発現する組み換えバキュロウイルスを産生する。ｗｔＲＥＴおよびＲＥＴ−Ｍｅｎ２Ｂの細胞質ドメインのコード配列は、プラスミドｐＢＡＢＥｐｕｒｏ ＲＥＴ−Ｍｅｎ２ＡおよびｐＢＡＢＥｐｕｒｏ ＲＥＴ−Ｍｅｎ２ＢからのＰＣＲにより増幅される。増幅したＤＮＡフラグメントとｐＦＢ−ＧＳＴＸ３ベクターを、ＳａｌＩおよびＫｐｎＩでの消化によってライゲーションに適合性となる。こうしたＤＮＡフラグメントのライゲーションによって、バキュロウイルスドナープラスミドｐＦＢ−ＧＸ３−ＲＥＴ−Ｍｅｎ２ＡおよびｐＦＢ−ＧＸ３−ＰＥＴ−Ｍｅｎ２Ｂが、それぞれもたらされる。

ウイルスの産生：キナーゼドメインを含むトランスファーベクターを、ＤＨ１０Ｂａｃ細胞系(GIBCO)にトランスフェクトし、選択的寒天プレートにプレーティングする。融合配列をウイルスゲノム(細菌により運搬される)へ挿入しないコロニーは、青色である。単一、白色コロニーを採取し、ウイルスＤＮＡ(bacmid)を、標準プラスミド精製手順により細菌から単離する。次いでＳｆ９細胞またはＳｆ２１(American Type Culture Collection)細胞を、セルフェクチン試薬を使用して２５ｃｍ^２フラスコ中、ウイルスＤＮＡでトランスフェクトする。

Ｓｆ９細胞中の小規模たんぱく質発現の決定：ウイルス含有培地をトランスフェクトした細胞培養から回収し、感染に使用してその力価を高める。２回の感染後に得たウイルス含有培地を大規模たんぱく質発現に使用する。大規模たんぱく質発現のために、１００cm^２丸型組織培養プレートに５×１０^７細胞／プレートを播種し、１ｍＬのウイルス含有培地(約５ＭＯＩ)で感染させる。３日後、細胞をプレートから掻き取り、５００rpmで５分間遠心分離する。１０−２０個の、１００cm^２プレートから得た細胞ペレットを５０ｍＬの氷冷溶解緩衝液(２５ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ)に再懸濁する。細胞を氷上で１５分間撹拌し、次いで、５,０００rpmで２０分間遠心分離する。

ＧＳＴ−標識たんぱく質の精製：遠心分離した細胞溶解物を２ｍＬ グルタチオン−セファロースカラム（Pharmacia）に負荷し、３回１０ｍＬの２５ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、２ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＧＳＴ標識たんぱく質を、２５ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭ 還元グルタチオン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロールの１０回の適用（各１ｍＬ）により溶出し、−７０℃で貯蔵する。

酵素活性の測定：精製したＧＳＴ−ｗｔＲＥＴまたはＧＳＴ−ＲＥＴ−Ｍｅｎ２Ｂたんぱく質のいずれかを用いるチロシンたんぱく質キナーゼアッセイを、１５ｎｇのＧＳＴ−ｗｔＲＥＴまたはＧＳＴ−ＲＥＴ−Ｍｅｎ２Ｂたんぱく質のいずれか、２０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、３μｇ／ｍＬ ポリ(Ｇｌｕ,Ｔｙｒ)４：１、１％ＤＭＳＯ、２.０μＭ ＡＴＰ(γ−[^３３Ｐ]−ＡＴＰ ０.１μＣｉ)を含んでいる最終容量３０μＬ中で行う。活性を、阻害剤の存在下または非存在下で、[γ^３３Ｐ]ＡＴＰからポリ(Ｇｌｕ,Ｔｙｒ)４：１への^３３Ｐの取り込みを測定することによりアッセイする。このアッセイを９６ウェルプレート内において周囲温度で１５分間、下記の条件のもとで行い、２０μＬの１２５ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによって停止させる。続いて、４０μＬの反応混合物を、予めメタノールで５分間浸漬したImmobilon-PVDF膜(Millipore)に移し、水ですすぎ、次いで５分、０.５％Ｈ_３ＰＯ_４で浸漬し、未接続の真空源を有する真空マニホルドにマウントする。サンプルのすべてをスポットした後、真空に接続し、各ウェルを２００μＬ ０.５％Ｈ_３ＰＯ_４ですすぐ。膜を除去し、シェーカー上で１.０％Ｈ_３ＰＯ_４を用いて４回、エタノールを用いて１回洗浄する。膜を周囲温度で乾燥させ、Packard TopCount ９６ウェルフレーム中にマウントし、１０μＬ／ウェルのMicroscint TM(Packard)の添加後に計数する。ＩＣ_５０値は、２連で４濃度(通常０.０１、０.１、１および１０μＭ)での各化合物の阻害パーセントの直線回帰分析によって計算する。たんぱく質キナーゼ活性の１単位は、３７℃で[γ^３３Ｐ]ＡＴＰから基質たんぱく質／分／ｍｇのたんぱく質に移動した１ナノモル(nmole)の^３３Ｐ ＡＴＰとして定義される。

ＩＣ_５０の計算
インプット Immobilon膜上の３×４μＬの停止アッセイ、洗浄せず
バックグラウンド(３ウェル) 酵素の代わりにＨ_２Ｏでアッセイ
ポジティブコントロール(４ウェル) 化合物の代わりに３％ＤＭＳＯ
溶液コントロール(１ウェル) 反応混合物なし
ＩＣ_５０値は、４濃度（通常、１０μＭで開始して、３倍または１０倍希釈シリーズ）の各化合物の阻害パーセントの対数回帰分析により計算される。各実験では、参照化合物による実際の阻害は、参照阻害剤の平均値に基づくＩＣ_５０値の標準化のために使用される：
標準化ＩＣ_５０＝測定したＩＣ_５０平均参照ＩＣ_５０値／測定した参照ＩＣ_５０
例：実験した参照阻害剤０.４μＭ、平均値０.３μＭ
実験した試験化合物１.０μＭ、標準化：０.３／０.４＝０.７５μＭ
たとえば、スタウロスポリンまたは合成スタウロスポリン誘導体が参照化合物として使用される。

このプロトコールを用いて、式(Ｉ)の化合物は、ＲＥＴ阻害の場合０.００５−１００μＭの範囲、好ましくは０.０１−２μＭの範囲のＩＣ_５０値を示すことが見出される。

本発明の化合物の、ｃ−Ａｂｌたんぱく質−チロシンキナーゼ活性の阻害剤としての効果は、下記の通り説明できる：イン・ビトロ酵素アッセイが、Geissler et al. in Cancer Res. 1992;52:4492-4498によって述べられているフィルター結合アッセイとして、下記の改変をして９６ウェルプレート内で行われる。ｃ−ＡｂｌのＨｉｓ標識キナーゼドメインを、Bhat et al. in J.Biol.Chem. 1997;272:16170-16175によって述べられているバキュロウイルス／Ｓｆ９系でクローニングし、発現させる。３７ｋＤたんぱく質(ｃ−Ａｂｌキナーゼ)を、コバルト金属キレートカラム、引き続いてアニオン交換カラムでの２工程手順で精製すると、１−２ｍｇ／ＬのＳｆ９細胞が得られる(Bhat et al.、引用文献)。ｃ−Ａｂｌキナーゼの純度は、クーマシーブルー染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価すると＞９０％である。このアッセイは下記を含む(総量３０μＬ)：１％ＤＭＳＯの存在下で、ｃ−Ａｂｌキナーゼ（５０ｎｇ）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０μＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ ＤＴＴおよび３０μｇ／ｍＬ ポリ−Ａｌａ,Ｇｌｕ,Ｌｙｓ,Ｔｙｒ−６：２：５：１(Poly-AEKY, Sigma P1152)を使用した０.０６μＣｉ／アッセイ[γ^３３Ｐ]−ＡＴＰ(５μＭ ＡＴＰ)。反応を１０μＬの２５０ｍＭ ＥＤＴＡの添加により停止させ、３０μＬの反応混合物を、予めメタノールに５分間浸漬したImmobilon−PVDF膜(Millipore, Bedford, MA, USA)に移し、水を用いてすすぎ、次いで５分間０.５％Ｈ_３ＰＯ_４で浸漬し、未接続の真空源を有する真空マニホルドにマウントする。サンプルのすべてをスポットした後、真空に接続し、各ウェルを２００μＬ ０.５％Ｈ_３ＰＯ_４を用いてすすぐ。膜を除去し、シェーカーを用いて０.５％Ｈ_３ＰＯ_４(４回)および１回エタノールで洗浄する。膜を周囲温度で乾燥し、Packard TopCount ９６ウェルフレーム中にマウントし、１０μL／ウェルのMicroscint TM(Packard)の添加後に計数する。

本試験系を使用すると、式Ｉの化合物は、ｃ−Ａｂｌ阻害の場合、０.００２〜１００Ｍの範囲、通常０.００２〜５Ｍの阻害のＩＣ_５０値を示す。

ＫＤＲたんぱく質−チロシンキナーゼ活性の阻害剤としての本発明化合物の効果は、下記の通り証明できる：ＶＥＧＦ誘発受容体自己リン酸化を阻害することは、永続的にヒトＶＥＧＦ−Ｒ２受容体(ＫＤＲ)を発現するトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のような細胞を、６ウェル細胞培養プレート中の完全培養培地(１０％ウシ胎児血清＝ＦＣＳを含む)に播種し、５％ＣＯ_２のもと、３７℃で約８０％コンフルエンシーを示すまでインキュベートする、更なる細胞中でのイン・ビトロ実験で確認できる。次いで試験化合物を、培養培地(ＦＣＳを含まず、０.１％ウシ血清アルブミンを含む)中に希釈し、細胞に加える。(対照群は、試験化合物を含まない培地から成る)。３７℃で２時間インキュベーション後、組み換えＶＥＧＦを加える；ＶＥＧＦの終濃度は２０ｎｇ／ｍｌである。更に３７℃で５分間、インキュベーションした後、細胞を２回氷冷ＰＢＳ(リン酸緩衝食塩水)で洗浄し、直ちに１００μl 溶解緩衝液／ウェルに溶解する。次いで溶解物を遠心分離して細胞核を除去し、そして上清のたんぱく質濃度を、市販のたんぱく質アッセイ(BIORAD)を用いて決定する。この溶解物はそれから直ちに使用することもできるしまたは、必要であれば−２０℃で貯蔵することもできる。

サンドイッチＥＬＩＳＡを行い、ＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化を測定する：ＶＥＧＦ−Ｒ２に対するモノクローナル抗体(たとえばMab 1495.12.14; ProQinase, Freiburg, Germany)を黒色ＥＬＩＳＡプレート(PackardのOptiPlateTM HTRF-96)に固定する。次いでこのプレートを洗浄し、次に残存している遊離たんぱく質結合部位を、ツイーン２０^{(登録商標）}(ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノラウレート、ICI／Uniquema)(ＰＢＳＴ)を含むリン酸緩衝食塩水中の３％TopBlock^{(登録商標）}(Juro, Cat. # TB232010)で飽和する。次いでこの細胞溶解物(ウェルあたり２０μｇたんぱく質）を、これらのプレート中、４℃でアルカリホスファターゼと結合した抗ホスホチロシン抗体(PY20：ZymedからのAP)と共に終夜インキュベートする。この(プレートを再び洗浄し)次いでこの抗ホスホチロシン抗体が捕捉ホスホリル化受容体に結合することが、発光ＡＰ基質(CDP-Star、即時使用型、Emerald IIと;Applied Biosystems)を用いて証明される。発光をPackard Top Count Microplate Scintillation Counterで測定する。陽性対照(ＶＥＧＦで刺激)のシグナルと陰性対照(ＶＥＧＦで刺激しない)のシグナルの差異は、ＶＥＧＦ誘発ＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化(＝１００％)に対応する。試験物質の活性を、最大阻害の半分を誘発する物質の濃度をＩＣ_５０(５０％阻害の阻害用量)として定義して、ＶＥＧＦ誘発ＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化の阻害パーセントとして計算する。ここでの式Ｉの化合物は、ＫＤＲ阻害の場合、０.００５〜２０μＭの範囲、好ましくは０.００５と１μＭの間のＩＣ_５０を示す。

Ｆｌｔ３キナーゼ阻害は下記のように決定される：バキュロウイルスドナーベクターｐＦｂａｃＧ０１(GIBCO)を使用して、ヒトＦｌｔ−３の細胞質キナーゼドメインのアミノ酸領域アミノ酸５６３−９９３を発現する組み換えバキュロウイルスを産生する。Ｆｌｔ−３の細胞質ドメインのコード配列を、ヒトｃ−ＤＮＡライブラリー(Clontech)からＰＣＲによって増幅する。増幅したＤＮＡフラグメントおよびｐＦｂａｃＧ０１ベクターを、ＢａｍＨ１およびＨｉｎｄIIIでの消化・切断によりライゲーションに適合性とする。これらのＤＮＡフラグメントのライゲーションにより、バキュロウイルスドナープラスミドＦｌｔ−３(１.１)がもたらされる。ウイルスの産生、Ｓｆ９細胞中のたんぱく質発現およびＧＳＴ−融合たんぱく質の精製は、下記の通り行う：
ウイルスの産生：Ｆｌｔ−３キナーゼドメインを含むトランスファーベクター(ｐＦｂａｃＧ０１−Ｆｌｔ−３)を、ＤＨ１０Ｂａｃ細胞系(GIBCO)にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を、選択的寒天プレートにプレーティングする。融合配列のウイルスゲノムへの挿入がないコロニーは(細菌により運搬される)、青色である。単一の白色コロニーを採取し、そしてウイルスＤＮＡ(bacmid)を、標準プラスミド精製手順により細菌から単離する。次いでＳｆ９細胞またはＳｆ２１細胞(American Type Culture Collection)を、セルフェクチン試薬を使用して、フラスコ中でウイルスＤＮＡと共にトランスフェクトする。

Ｓｆ９細胞中の小規模たんぱく質発現の決定：ウイルス含有培地をトランスフェクトした細胞培養から回収し、感染に使用してその力価を高める。２回の感染後に得たウイルス含有培地を大規模たんぱく質発現に使用する。大規模たんぱく質発現のために、１００cm^２丸型組織培養プレートに５×１０^７細胞／プレートを播種し、１ｍＬのウイルス含有培地(約５ＭＯＩ)で感染させる。３日後、この細胞をプレートから掻き取り、５００rpmで５分間遠心分離する。１０−２０個の、１００ｃｍ^２プレートから得た細胞ペレットを５０ｍＬの氷冷溶解緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中で再懸濁する。この細胞を氷上で１５分間撹拌し、次いで５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。

ＧＳＴ−標識たんぱく質の精製：遠心分離した細胞溶解物を２ｍＬ グルタチオン−セファロースカラム（Pharmacia）に負荷し、１０ｍＬの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２００ｍＭ ＮａＣｌで３回洗浄する。次いでＧＳＴ標識たんぱく質を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭ 還元グルタチオン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロールを１０回、適用（各１ｍＬ）して溶出し、−７０℃で貯蔵する。

酵素活性の測定：精製ＧＳＴ−Ｆｌｔ−３を用いるチロシンたんぱく質キナーゼアッセイが、酵素たんぱく質２００−１８００ｎｇ（比活性による）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、３ｍＭ ＭｎＣｌ_２、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、３μｇ／ｍＬ ポリ（Ｇｌｕ,Ｔｙｒ）４：１、１％ＤＭＳＯ、８.０μＭ ＡＴＰおよび０.１μＣｉ［γ^３３Ｐ］ＡＴＰを含む最終容量３０μＬで行われる。活性を、阻害剤の存在下または非存在下で、［γ^３３Ｐ］ＡＴＰからポリ（Ｇｌｕ,Ｔｙｒ）基質への^３３Ｐの取り込みを測定することによりアッセイする。このアッセイ（３０μＬ）を、９６ウェルプレートで周囲温度で２０分間、下記の条件下で行い、２０μＬの１２５ｍＭ ＥＤＴＡ添加により停止させる。続いて、４０μＬの反応混合物を、予めメタノールで５分間浸漬したImmobilon-PVDF膜（Millipore,Bedford,MA,USA）に移し、水ですすぎ、次いで５分間、０.５％Ｈ_３ＰＯ_４で浸漬し、未接続の真空源を有する真空マニホルドにマウントする。全サンプルをスポットした後、真空に接続し、各ウェルを２００μＬ ０.５％Ｈ_３ＰＯ_４ですすぐ。膜を除去し、シェーカー上で１.０％Ｈ_３ＰＯ_４で４回、エタノールで１回洗浄する。膜を周囲温度で乾燥させ、Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔ ９６ウェルフレーム上にマウントし、１０μＬ／ウェルのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ＴＭ（Packard）の添加後に計数する。ＩＣ_５０値を、各化合物について２連で、４濃度（通常０.０１、０.１、１および１０μＭ）での阻害パーセントの直線回帰分析により計算する。たんぱく質キナーゼ活性の１単位は、３７℃で［γ^３３Ｐ］ＡＴＰから基質たんぱく質／分／ｍｇのたんぱく質に移動した１ｎｍｏｌｅの^３３Ｐ ＡＴＰと定義される。式Ｉの化合物は、Ｆｌｔ−３阻害の場合、０.０１〜１００μＭの範囲、好ましくは０.０５〜１０μＭのＩＣ_５０値を示す。

式Ｉの化合物はまた、特にｃ−Ｓｒｃキナーゼ、ｃ−Ｋｉｔ、ＶＥＧＦ−Ｒおよび／またはＦＧＦＲのような、他のチロシンたんぱく質キナーゼを阻害する；これらの全ては、動物、特にヒト細胞を含む哺乳類細胞の増殖制御および形質転換において役割を演じる。適切なアッセイはAndrejauskas-Buchdunger et al., Cancer Res. 52, 5353-8(1992)に記載されている。この試験系を使用すると、式Ｉの化合物は、ｃ−Ｓｒｃの阻害の場合、０.００５〜１００μＭの範囲、通常０.００５〜５μＭのＩＣ_５０値を示す。式Ｉの化合物はまた、ｃ−ｋｉｔ阻害の場合、０.００５〜１０μＭの範囲、通常０.００５〜５μＭのＩＣ_５０値を示し；そしてＦＧＦＲ−１阻害の場合は、１０μＭで９５％阻害までを示す。

ＩＧＦ−１ＲおよびＩｎｓ−Ｒの阻害は下記の通り決定できる：バキュロウイルスドナーベクターｐｆｂｇｘ３ＩＧＦｌＲｃｄを使用して、ヒトＩＧＦ−ＩＲの成熟ペプチド細胞質ドメインのアミノ酸領域９５０−１３３７を発現する組み換えバキュロウイルスを産生する。ヒトインスリン受容体の細胞質内キナーゼドメインのアミノ酸領域９１９−１３４３をコードするｃＤＮＡフラグメントを産生するために、ｐＣ５ｈＩｎｓＲが使用される。ヒトＩＧＦ−ＩＲおよびＩｎｓ−Ｒのフラグメントを、組み換えバキュロウイルス産生のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ^(商標）系(GIBCO BRL)を使用し、第Ｘａ因子開裂可能グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)−融合たんぱく質としてクローン化し、発現し、小規模精製する。ウイルス含有培地をトランスフェクトした細胞培養から回収し、感染に使用してその力価を高める。２回の感染後に得たウイルス含有培地を大規模たんぱく質発現に使用する。細胞抽出物を調製し、グルタチオン−セファロース(Pharmacia)カラムに負荷する。洗浄後、ＧＳＴ−標識たんぱく質を、次いで、グルタチオン含有緩衝液で溶出する。精製たんぱく質を、溶出緩衝液中−７０℃で貯蔵する。精製したＧＳＴ−ＩＧＦ−１ＲおよびＧＳＴ−Ｉｎｓ−Ｒでのチロシンたんぱく質キナーゼアッセイを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０.０１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１％ＤＭＳＯ、１ｍＭ ＤＴＴ、３μｇ／ｍＬ ポリ（Ｇｌｕ,Ｔｙｒ）４：１および１０μＭ ＡＴＰ（γ−［^３３Ｐ］−ＡＴＰ ０.１μＣｉ）を含む最終容量３０μｌで行う。本アッセイを、９６ウェルプレート中、周囲温度で２０分間行い、２５μｌ ０.０５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.０の添加により停止させる。分取試料４０μlを、低真空源に接続したMillipore MicrotiterフィルターマニホルドにマウントしたWhatman P81膜に、多チャンネルディスペンサーでスポットする。液体除去後、膜を順に０.５％Ｈ_３ＰＯ_４含有洗浄浴（４回）、ＥｔＯＨ含有洗浄浴（１回）に移し(各１０分間振盪インキュベーション)、乾燥させ、Hewlett Packard TopCountマニホルド上にマウントし、１０μl Microscint^{(登録商標）}を添加し、計数する。式(Ｉ)の化合物は、１０,０００ｎＭでＩｎｓ−Ｒの９０％までの阻害、好ましくは６０−９０％阻害を示す。

Ｔｅｋの阻害は下記の通り決定できる：これらのキナーゼの発現、精製およびアッセイの方法は記載されている。Fabbro et al., Pharmacol. Ther. 82(2-3)293-301(1999)。簡潔に述べれば、ｐＡｃＧ１ベクター(Pharmingen)からのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)遺伝子を、ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＩで摘出し、ｐＡｃＧ１融合ベクター(ＦＢＧ０)由来のＮ末端クローニング部位を有する５５３０ｂｐベクターを作り出すＦａｓｔ−Ｂａｃバキュロウイルスベクター(GIBCO)のクローニング部位に挿入する。Ｃ末端クローニング部位は、使用するＮ末端クローニング部位の下流の任意のクローニング部位(Ｆａｓｔ−Ｂａｃベクター由来)でありうる。Ｎ末端でＧＳＴ−融合した(ｐＡｃＧ１、Pharmingen)ＫＤＲ、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｋ−１、ＴｅｋおよびＰＤＧＦＲ−βキナーゼドメインは、ProQinase, Freiburg, Germanyから得られる。Ｔｅｋは、ＥｃｏＲＩ摘出およびＥｃｏＲＩ消化ＦＢＧ１へのライゲーションによって、ＦＢＧ１ベクターに再クローン化する(ＦＢＧ１−Ｔｅｋ)。ｃ−Ｋｉｔ(ａａ ５４４−９７６)およびｃ−Ｆｍｓ(ａａ ５３８−９７２)の全細胞質ドメインのコード配列を、ヒト子宮およびヒト骨髄ｃＤＮＡライブラリー(Clontech)からそれぞれＰＣＲにより増幅する。増幅したＤＮＡフラグメントを、それらをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ挿入物としてＦＢＧ１にクローニングすることによりＧＳＴと融合させると、ＦＢＧ１−ｃ−ＫｉｔおよびＦＢＧ１−ｃ−Ｆｍｓが産生する。Ｔｅｋを、ＥｃｏＲＩ摘出およびＥｃｏＲＩ消化ＦＢＧ０へのライゲーションによってＦＢＧ０トランスファーベクターに再クローン化する(ＦＢＧ−Ｔｉｅ２／Ｔｅｋ)。ＦＧＦＲ−１およびｃ−ｍｅｔキナーゼドメインは、ヒトＡ４３１細胞からＰＣＲにより得られる。Ｎ末端プライマーは突出ＥｃｏＲＩ部位を含むが、Ｃ末端プライマーはＸｈｏＩ部位を含み、トランスファーベクターへのクローニングに役立つ。ＰＣＲフラグメントおよびＦＢＧ０の両方の消化の後、開裂産物をゲル精製し、一緒にライゲートしてキナーゼ構築物(ＦＢＧ−Ｍｅｔ、ＦＢＧ−ＦＧＦＲ−１)を形成する。

各々のキナーゼのためのウイルスが、GIBCOにより供給されたプロトコールに従って作成される。簡潔に述べれば、キナーゼドメイン含有トランスファーベクターを、ＤＨ１０Ｂａｃ細胞系(GIBCO)にトランスフェクトし、推奨濃度のＢｌｕｅ−Ｇａｌ、ＩＰＴＧ、カナマイシン、テトラサイクリン、およびゲンタマイシンを含む寒天プレートにプレーティングする。融合配列をウイルスゲノムに挿入していないコロニー(細菌により運搬)は、青色である。単一の白色コロニーを通常どおりに採取し、ウイルスＤＮＡ(bacmid)を細菌から標準プラスミド・ミニプレップ法により単離する。次いでＳｆ９細胞またはHigh Five細胞(GIBCO)を、２５cm^２フラスコ内で、ウイルスＤＮＡと共に、セルフェクチン試薬およびＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃキット(GIBCO)を供給されたプロトコールを使用してトランスフェクトする。ウイルス含有培地をトランスフェクトした細胞培養から回収し、感染に使用してその力価を高める。２回の感染後に得たウイルス含有培地を大規模たんぱく質発現に使用する。大規模たんぱく質発現のために、１００ｃｍ^２丸型組織培養プレートに５ｘ１０^７細胞／プレートを播種し、１ｍＬのウイルス含有培地(約５ＭＯＩ)で感染させる。３日後、細胞をプレートから掻き取り、５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。

１０−２０個の１００ｃｍ^２プレートからの細胞ペレットを５０ｍｌの氷冷溶解緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中で再懸濁する。細胞を氷上で１５分間撹拌し、次いで５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。上清を２ｍｌ グルタチオン−セファロースカラムに負荷し、３回、１０ｍｌの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＧＳＴ−標識たんぱく質を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭ 還元グルタチオン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロールの１０回の適用（各１ｍｌ）により溶出し、−７０℃で貯蔵する。

アッセイ（３０μｌ）は酵素たんぱく質２００−１８００ｎｇ（比活性による）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、３ｍＭ ＭｎＣｌ_２、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、３μｇ／ｍｌ ポリ（Ｇｌｕ,Ｔｙｒ）４：１、８μＭ ＡＴＰ（γ−［^３３Ｐ］−ＡＴＰ ０.１μＣｉ）を含む。反応物を、２０分間、周囲温度でインキュベートし、次いで２５μｌ ０.２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７.０）を添加して停止させる。分取試料４０μｌを、低真空源に接続したMillipore MicrotiterフィルターマニホルドにマウントしたImmobilon P膜に、多チャンネルディスペンサーでスポットする。液体除去後、膜を順に０.５％Ｈ_３ＰＯ_４含有洗浄浴（４回）およびＥｔＯＨ含有洗浄浴（１回）(各１０分間振盪インキュベーション)に移し、乾燥させ、Hewlett Packard TopCountマニホルド上にマウントし、１０μｌ Microscint^{(登録商標）}を添加し、計数する。式(Ｉ)の化合物は、直線回帰分析で計算して、Ｔｅｋ阻害の場合、約０.１−１００μＭのＩＣ_５０値を示す。

Ｃｄｋ１の阻害は、下記の通り決定できる：Ｃｄｋ１／ｃｙｃＢ：Ｃｄｋ１／ｃｙｃＢは、ProQinase, Freiburg, Germanyから得られる。ヒトデ卵母細胞を、１０μＭ １−メチルアデニンで細胞サイクルのＭ期に入るように誘導し、液体窒素で凍結し、−８０℃で貯蔵する。必要に応じて、この卵母細胞を、記載されているように均質化し、遠心分離する(Arion et al., Cell 55: 371-378(1988)およびRialet et al., AntiCancer Res. 11:1581-1590(1991))。Ｃｄｋ１／ｃｙｃＢキナーゼを、記載されているように、ｐ９^{ＣＫＳｈｓ}−セファロースビーズで精製し、組み換えヒトｐ９^{ＣＫＳｈｓ}で溶出する(Azzi et al., Eur. J. Biochem. 203: 353-360. (1992))。簡潔に述べると、卵母細胞からの上清を、３０分間、４℃で、一定回転のもとで、ｐ９^{ＣＫＳｈｓ}−セファロースビーズで平衡化する。このビーズを徹底的に洗浄し、活性化ｃｄｋ１／ｃｙｃＢキナーゼを精製ｐ９ＣＫＳｈｓ(３ｍｇ／ｍｌ)で溶出する。Ｃｄｋ１／ｃｙｃＢの活性を、記載のように測定する(Arion et al., Cell 55: 371-378(1988), Meijer et al., EMBO J. 1989; 8: 2275-2282およびMeijer et al., EMBO J. 1991 ; 8 : 2275-2282)。このアッセイを、わずかに改変して、９６ウェルプレート中周囲温度で２０分間行う。最終容量３０μｌは、０.１−０.３ＵのＣｄｋ１／ｃｙｃＢ、基質として１ｍｇ／ｍｌ ヒストンＨ１、６０ｍＭ β−グリセロホスフェート、３０ｍＭ ニトロフェニルホスフェート、２５ｍＭ ＭＯＰＳ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、０.１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１５μＭ ＡＴＰおよび０.１μＣｉ γ−^３３Ｐ−ＡＴＰ（７５μＭ、８８００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含む。反応を、２５μｌ ０.０５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ７.０の添加により停止させる。分取試料４０μｌを、低真空源に接続したMillipore MicrotiterフィルターマニホルドにマウントしたImmobilon P膜に、多チャンネルディスペンサーでスポットする。液体除去後、膜を順に０.５％Ｈ_３ＰＯ_４含有洗浄浴（４回）およびＥｔＯＨ包含洗浄浴（１回）(各１０分振盪インキュベーション)に移し、乾燥させ、Hewlett Packard TopCountマニホルド上にマウントし、１０μｌ Microscint^{(登録商標）}を添加し、計数する。式(Ｉ)の化合物は、１０,０００ｎＭで１００％までのＣｄｋ１阻害を示す。

ｃ−Ｒａｆ−１の阻害は、下記の通り決定できる：組み換えｃ−Ｒａｆ−１たんぱく質の産物が、活性ｃ−Ｒａｆ−１キナーゼ産生に必要なＧＳＴ−ｃ−Ｒａｆ−１組み換えバキュロウイルスと、ｖ−Ｓｒｃおよびｖ−Ｒａｓ組み換えバキュロウイルスとで、Ｓｆ２１細胞を３回感染させることにより得られる(Williams et al., PNAS 1992; 89: 2922-2926)。活性Ｒａｓ(ｖ−Ｒａｓ)は、ｃ−Ｒａｆ−１を細胞膜に動員するのに必要であり、そしてｖ−Ｓｒｃは、ｃ−Ｒａｆ−１をリン酸化してそれを完全に活性化するのに必要である(Williams et al., PNAS 1992; 89: 2922-2926)。細胞を１５０ｍｍ皿あたり２.５×１０^７細胞で播種し、ＲＴで１時間、１５０ｍｍ皿に付着させた。培地（１０％ＦＢＳ含有ＳＦ９００ＩＩ）を吸引し、組み換えバキュロウイルス；ＧＳＴ−Ｃ−Ｒａｆ−１、ｖ−Ｒａｓおよびｖ−Ｓｒｃを、それぞれ３.０、２.５および２.５のＭＯＩで、総量４−５ｍｌで加える。細胞をＲＴで１時間インキュベートし、次いで１５ｍｌの培地を加える。感染した細胞を、２７℃で４８−７２時間インキュベートする。感染したＳｆ２１細胞を掻き取り、５０ｍｌの管に集め、Sorvall遠心器中、１０分間、４℃、１１００ｇで遠心分離する。細胞ペレットを１回氷冷ＰＢＳで洗浄し、２.５×１０^７細胞あたり０.６ｍｌ 溶解緩衝液で溶解させる。細胞の完全な溶解は、時折ピペッティングしながら氷上での１０分間置くと達成される。細胞溶解物を、Sorvall遠心器中、ＳＳ−３４ローターで１０分間、４℃、１４,５００ｇで遠心分離し、上清を新しい管に移し、−８０℃で貯蔵する。ｃ−Ｒａｆ−１を、２.５×１０^７細胞あたり、氷冷ＰＢＳで平衡化された１００μＬのパックされたグルタチオン−セファロース４Ｂビーズを使用して細胞溶解物から精製する。ＧＳＴ−ｃ−Ｒａｆ−１を、ビーズに４℃で１時間、揺らしながら結合させた。結合したＧＳＴ−ｃ−Ｒａｆ−１とビーズをカラムに移した。このカラムを溶解緩衝液で１回そして氷冷Ｔｒｉｓ緩衝食塩水で２回洗浄する。氷冷溶出緩衝液を加え、カラム流動を停止させて、遊離グルタチオンがＧＳＴ−ｃ−Ｒａｆ−１のグルタチオンセファロースビーズとの相互作用を中断させることができるようにする。フラクション（１ｍｌ）を、予め凍らせた試験管に回収する。各管は、凍結融解サイクル中キナーゼ活性を維持するために１０％グリセロール（終濃度）を含む。ＧＳＴ−ｃ−Ｒａｆ−１キナーゼたんぱく質の精製フラクションを−８０℃で貯蔵する。

ＩκＢをｃ−Ｒａｆ−１キナーゼの基質として使用した。ＩκＢはＨｉｓ−標識たんぱく質として細菌中で発現する(クローン化され、Dr. Eder;ABM, Novartis, Baselから好意で提供された)。ＩκＢプラスミドを含むＢＬ２１ ＬｙｓＳ細菌を、ＬＢ培地中で０.６のＯＤ_６００まで増殖させ、次いでｋｂを発現するように３時間、３７℃でＩＰＴＧ（１ｍＭの終濃度）で誘発し、次いで細菌を超音波処理により溶解させ（マイクロチップ設定限界、３回、１分、各々超音波緩衝液中［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ］、１０,０００ｇで１５分間遠心分離する。上清を硫酸アンモニウムと混合し、３０％の終濃度とする。この混合物を４℃で１５分間、振盪し、次いで１０,０００ｇで１５分間回転させる。このペレットを、１０ｍＭ ＢＳＡ含有結合緩衝液(Novagen)中に再懸濁する。この溶液をNovagenマニュアルに従いＮｉ−アガロース(Novagen)に適用し、洗浄する。ＩκＢは、このカラムから溶出緩衝液（０.４Ｍ イミダゾール、０.２Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.９）を使用して溶出する。たんぱく質含有フラクションを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＤＴＴ中で透析する。

ｃ−Ｒａｆ−１たんぱく質キナーゼの活性を、阻害剤の存在下または非存在下、[γ^３３Ｐ]ＡＴＰからＩＢへの^３３Ｐの取り込みを測定することによりアッセイする。このアッセイを９６ウェルプレート中、周囲温度で６０分行う。これは(総容量３０μｌ）下記を含む：ｃ−ｒａｆｌ１キナーゼ（４００ｎｇ）、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７.５、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、１０μＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ ＤＴＴおよび１％ＤＭＳＯ存在下６００ｎｇ ＩＢを用いて０.３μＣｉ／アッセイ［γ^３３Ｐ］−ＡＴＰ（１０μＭ ＡＴＰ）。反応を１０μＬの２５０ｍＭ ＥＤＴＡの添加により停止し、３０μＬのこの反応混合物を、予めメタノールで５分間浸漬したImmobilon−ＰＶＤＦ膜(Millipore, Bedford, MA, USA)に移し、水ですすぎ、次いで５分間、０.５％Ｈ_３ＰＯ_４で浸漬し、未接続の真空源を有する真空マニホルドにマウントする。全サンプルをスポットした後、真空に接続し、各ウェルを２００μＬ ０.５％Ｈ_３ＰＯ_４ですすぐ。膜を除去し、シェーカー上で０.５％Ｈ_３ＰＯ_４を用いて４回、エタノールを用いて１回、洗浄する。膜を周囲温度で乾燥させ、Packard TopCount ９６ウェルフレーム上にマウントし、１０μＬ／ウェルのMicroscint TM(Packard)の添加後に計数する。

式(Ｉ)の化合物は、０.１〜５０μＭの範囲で、好ましくは０.１〜１０μＭの範囲で、ｃ−Ｒａｆ−１阻害を示す。

エフリンＢ４受容体（ＥｐｈＢ４）キナーゼ阻害剤としての本発明化合物の有効性は、次の通り証明できる：
Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃＴＭ(Invitrogen Life Technologies, Basel, Switzerland)ＧＳＴ−融合発現ベクターの生成：ＥｐｈＢ−系の全細胞質コード領域を、ヒト胎盤または脳に由来するｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、それぞれ増幅する。ヒトＥｐｈＢ４受容体(SwissProt Database, Accession No. P54760)のアミノ酸領域５６６−９８７を発現する組み換えバキュロウイルスを生成する。ＧＳＴ配列を、ｐＦａｓｔＢａｃ１^{(登録商標）}ベクター(Invitrogen Life Technologies, Basel, Switzerland)にクローン化し、そしてＰＣＲ増幅を行う。ＥｐｈＢ４−受容体ドメインをコードしているｃＤＮＡを、それぞれ、読み枠がずれないようにＧＳＴ配列の３’端(prime)にこの改変ＦａｓｔＢａｃ１ベクターにクローン化して、ｐＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ^(商標）ドナーベクターを生成する。形質転換から生じる単一コロニーを播種し、小規模プラスミド調製のための培養を終夜行う。プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって、予想される大きさのインサートを含むいくつかのクローンが明らかになる。自動シークエンシングによって、このインサートおよび約５０ｂｐのフランキングベクター配列が両方のストランドで確認される。

ウイルスの産生：それぞれのキナーゼのウイルスが、別途述べられていない限り、GIBCOが販売するプロトコールに従って作製される。簡潔に述べれば、キナーゼドメインを含んでいるトランスファーベクターをＤＨ１０Ｂａｃ細胞系(GIBCO)にトランスフェクトし、そして選択的寒天プレートにプレーティングする。融合配列をウイルスゲノムへ挿入しないコロニーは(細菌により運搬される)、青色である。単一の白色コロニーを採取し、ウイルスＤＮＡ(bacmid)を、標準プラスミド精製手順により細菌から単離する。次いでＳｆ９細胞またはＳｆ２１細胞を、ウイルスＤＮＡと一緒に、セルフェクチン試薬を使用して２５ｃｍ２フラスコ中で、プロトコールに従ってトランスフェクトする。

ＧＳＴ−標識キナーゼの精製：遠心分離した細胞溶解物を２ｍｌ グルタチオン−セファロースカラム（Pharmacia）に負荷し、３回１０ｍｌの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、２Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＧＳＴ標識たんぱく質を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭ 還元グルタチオン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロールの１０回の適用（各１ｍｌ）により溶出し、−７０℃で貯蔵する。

たんぱく質キナーゼアッセイ：たんぱく質キナーゼ活性は、阻害剤の存在下または非存在下で、[□３３Ｐ]ＡＴＰから、基質としてのグルタミン酸のポリマーおよびチロシン（ポリ(Ｇｌｕ,Ｔｙｒ)）への３３Ｐの取り込みを測定することによりアッセイする。精製ＧＳＴ−ＥｐｈＢ（３０ｎｇ）を用いるキナーゼアッセイは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３−５０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０.０１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１％ＤＭＳＯ、１ｍＭ ＤＴＴ、３μｇ／ｍｌ ポリ(Ｇｌｕ,Ｔｙｒ)４：１(Sigma; St. Louis, Mo., USA)および２.０−３.０μＭ ＡＴＰ(γ−[３３Ｐ]−ＡＴＰ ０.１μＣｉ)を含んでいる最終容量３０□Ｌ中、１５−３０分間、周囲温度で行う。このアッセイは、２０μＬの１２５ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによって停止される。続いて、４０μｌの反応混合物を、予めメタノールで５分間浸漬したImmobilon-PVDF膜(Millipore, Benfold, MA, USA)に移し、水ですすぎ、次いで５分間、０.５％Ｈ３ＰＯ４で浸漬し、未接続の真空源を有する真空マニホルドにマウントする。サンプルのすべてをスポットした後、真空に接続し、各ウェルを２００μｌ ０.５％Ｈ３ＰＯ４ですすぐ。膜を除去し、シェーカー上で１.０％Ｈ３ＰＯ４を用いて４回、エタノールを用いて１回洗浄する。膜を周囲温度で乾燥させ、Packard TopCount ９６ウェルフレーム上にマウントし、１０μＬ／ウェルのMicroscint TM(Packard)の添加後に計数する。ＩＣ_５０値は、２連で４濃度(通常０.０１、０.１、１および１０μＭ)での各化合物の阻害パーセントの直線回帰分析によって計算する。たんぱく質キナーゼ活性の１単位は、３７℃で[γ３３Ｐ]ＡＴＰから基質たんぱく質／分／ｍｇのたんぱく質に移動した１ナノモル(nmole)の３３Ｐ ＡＴＰとして定義される。式Ｉの化合物は、最小１ｎＭまでＥｐｈＢ４阻害を示し、好ましくは、ＩＣ５０値は０.００１−５.０μＭである。

あるいは、ＥｐｈＢ４受容体自己リン酸化は、次のように測定することができる：
ＥｐｈＢ４受容体自己リン酸化を阻害することは、永続的にヒトＥｐｈＢ４(SwissProt AccNo P54760)を発現するトランスフェクトされたＡ３７５ヒトメラノーマ細胞(ATCC Number: CRL-1619)のような細胞を、６ウェル細胞培養プレート中の完全培養培地(１０％ウシ胎児血清＝ＦＣＳを含む)に播種し、５％ＣＯ２の下、３７℃で約９０％コンフルエンシーを示すまでインキュベートする、イン・ビトロ実験で確認することができる。次いで試験化合物を、培養培地(ＦＣＳを含まず、０.１％ウシ血清アルブミンを含む)に希釈し、細胞に加える。(対照群は、試験化合物を含まない培地から成る)。リガンド誘発自己リン酸化は、１マイクログラム／ｍｌの可溶性エフリンＢ２−Ｆｃ（ｓ−エフリンＢ２−Ｆｃ： R&D Biosystems, CatNr 496-EB)および０.１マイクロＭのオルトバナデートの添加によって誘発される。３７℃で更に２０分間インキュベーション後、細胞を２回氷冷ＰＢＳ(リン酸緩衝食塩水)で洗浄し、直ちに２００μl 溶解緩衝液／ウェルに溶解する。次いで溶解物を遠心分離して細胞核を除去し、そして上清のたんぱく質濃度を、市販のたんぱく質アッセイ(PIERCE)を用いて決定する。次いでこの溶解物は直ちに使用することもできるし、または必要であれば−２０℃で貯蔵することもできる。

サンドイッチＥＬＩＳＡを行い、ＥｐｈＢ４リン酸化を測定する：リン酸化ＥｐｈＢ４たんぱく質を捕捉するために、１００ｎｇ／ウェルのエフリンＢ２−Ｆｃ（ｓ−エフリンＢ２−Ｆｃ： R&D Biosystems, CatNr 496-EB)がMaxiSorb (Nunc) ELISAプレートに固定される。次いでこのプレートを洗浄し、次に残存している遊離たんぱく質結合部位を、ツイーン２０^{(登録商標）}(ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノラウレート、ICI／Uniquema)(ＰＢＳＴ)を含むリン酸緩衝食塩水中の３％TopBlock^{(登録商標）}(Juro, Cat. # TB232010)で飽和する。次いでこの細胞溶解物(ウェルあたり１００μｇたんぱく質）を、これらのプレート中、室温で１時間インキュベートする。このウェルをＰＢＳで３回洗浄した後、アルカリホスファターゼと結合した抗ホスホチロシン抗体(PY20 コンジュゲートされたアルカリホスフェート: ZYMED, Cat Nr03-7722)を加え、そしてさらに１時間インキュベートする。このプレートを再び洗浄し、次いでこの抗ホスホチロシン抗体の捕捉ホスホリル化受容体への結合が証明され、次に基質として１０ｍＭのＤ−ニトロフェニルホスフェートを用いて量を定め、そして０.５時間から１時間後に４０５ｎｍでのＯＤを測定する。陽性対照(バナデートおよびｓ−エフリンＢ２−Ｆｃで刺激)のシグナルと陰性対照(刺激しない)のシグナルの差異は、最大ＥｐｈＢ４リン酸化(＝１００％)に対応する。試験物質の活性は、最大ＥｐｈＢ４リン酸化の阻害パーセントとして計算され、そこで最大阻害の半分を誘発する物質の濃度をＩＣ_５０(５０％阻害の阻害用量)として定義する。

式(Ｉ)の化合物の抗腫瘍活性を証明するためのイン・ビボ実験：たとえば、式(Ｉ)の化合物、たとえば下記実施例１の化合物が、ＶＥＧＦ介在血管形成をイン・ビボで阻害するか否かを試験するために、マウスにおける増殖因子インプラントモデルにおいて、ＶＥＧＦにより誘発された血管新生応答に対するその効果を試験する：多孔性Teflonチャンバー(容量０.５ｍｌ）に、増殖因子（２μｇ／ｍｌヒトＶＥＧＦ）含有または非含有の、ヘパリン（２０単位／ｍｌ）含有０.８％ｗ／ｖ寒天を満たし、Ｃ５７／Ｃ６マウスの横腹の背面に皮下的にインプラントする。このマウスを試験化合物（たとえば２５、５０または１００ｍｇ／ｋｇ ｐ.ｏ.１日１回）または媒体で処置し、チャンバーのインプラントの日に開始し、その後４日間続ける。処置の最後に、マウスを殺し、チャンバーを除去する。チャンバー周辺で増殖した血管新生組織を注意深く除き、秤量し、血液含有量を組織中のヘモグロビン含量の測定により評価する(Drabkins method;Sigma, Deisenhofen, Germany)。これらの増殖因子は、チャンバーの周辺で増殖する(繊維芽細胞および小血管の含有により組織学的に特徴付けられる)組織の重量および血液含有量の用量依存性増加を誘発し、この応答がＶＥＧＦを特異的に中和する抗体で遮断されることがこれまで示されている(Wood JM et al., Cancer Res. 60(8), 2178-2189, (2000);およびSchlaeppi et al., J. Cacner Res. Clin. Oncol. 125, 336-342, (1999))。このモデルで、式(Ｉ)の化合物の場合に阻害を示すことができる。

本発明はまた、式（Ｉ）の化合物を含んでなる薬剤組成物、キナーゼ依存性疾患、特に上記に言及された好ましい疾患の治療（本発明の広範な局面ではまた予防）処置または処置方法におけるその使用、または、前記使用のための化合物および特に前記使用のための薬剤製剤の製造に関する。

本発明はまた、イン・ビボで式(Ｉ)の化合物それ自体に変換する式（Ｉ）の化合物のプロドラッグに関する。それ故、式(Ｉ)の化合物のいかなる言及もまた、適宜、当を得ている場合、式(Ｉ)の化合物の対応するプロドラッグをも言及するものとして理解されるべきである。

本発明の薬理学的に許容される化合物は、たとえば、有効量の式(Ｉ)の化合物、またはその薬学的に許容される塩を活性成分として、しかるべき量の一つまたはそれ以上の無機または有機、固体または液体の、薬学的に許容される担体と共にまたは混合して含んでなる、薬剤組成物の製造に使用することができる。

本発明はまた、薬剤組成物に関連し、キナーゼ活性の阻害に応答する疾患の処置、または、本発明の広範な局面では、防止(＝予防)のための、前記阻害に有効な量の式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を、特にその中に、少なくとも１個の薬学的に許容される担体と共に含んでなる、温血動物、特にヒト(または温血動物、特にヒト由来の細胞または細胞系、たとえばリンパ球)に投与するのに適した薬剤組成物に関する。

本発明による薬剤組成物は、有効な用量の薬理学的に活性な成分を単独でまたはしかるべき量の薬学的に許容される担体と共に含んでなる、温血動物(特にヒト)に経鼻、直腸または経口のような経腸、たとえば、または筋肉内または静脈内のような非経口投与するための組成物である。活性成分の用量は、温血動物の種、体重、年齢および個体の状態、個体の薬物動態データ、処置すべき疾患および投与方式に左右される。

本発明はまた、(言及した疾患に対して)予防的または特に治療的有効量の本発明による式(Ｉ)の化合物を、特に、言及した疾患の一つのため、こうした処置を必要とする温血動物、たとえばヒトに投与することを含んでなる、キナーゼの阻害に応答する疾患の処置方法に関する。

体重約７０kgの温血動物、たとえばヒトに投与すべき式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の用量は、好ましくは約３ｍｇから約１０ｇ、より好ましくは約１０ｍｇから約１.５ｇ、最も好ましくは約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇ／ヒト／日であり、好ましくはたとえば同じ大きさであってもよい、１−３個の単一用量に分割する。通常、小児には成人の半量が与えられる。

本薬剤組成物は、約１％〜約９５％、好ましくは約２０％〜約９０％の活性成分を含んでなる。本発明の薬剤組成物は、たとえば、アンプル、バイアル、坐薬、糖衣錠、錠剤またはカプセルのような単位投与形態であることができる。

本発明の薬剤組成物は、それ自体公知の方法で、たとえば慣用の溶解、凍結乾燥、混合、造粒または糖剤プロセスによって調製する。

活性成分の溶液、およびまた懸濁液、および特に等張性水溶液または懸濁液を使用することが好ましく、たとえば、活性成分を単独でまたは担体（たとえばマンニトール）と共に含んでなる凍結乾燥組成物の場合、こうした溶液または懸濁液を使用前に調製することが可能である。本薬剤組成物は滅菌してもよいしおよび／または賦形剤（たとえば防腐剤、安定化剤、湿潤剤および／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧調整用塩および／または緩衝剤)を含んでよく、それ自体公知の方法で、たとえば慣用の溶解または凍結乾燥プロセスによって調製される。前記溶液または懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンのような増粘物質を含み得る。

油中懸濁液は、油成分として注射目的に慣習的な植物油、合成油または半合成油を含んでなる。特に酸成分としては、８−２２個、特に１２−２２個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸、たとえばラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸または対応する不飽和酸、たとえばオレイン酸、エライジン酸、エルカ酸、ブラシジン酸またはリノール酸を含む、液体脂肪酸エステルのようなものを言及でき、所望であれば抗酸化剤、たとえばビタミンＥ、β−カロテンまたは３,５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエンを添加する。こうした脂肪酸エステルのアルコール成分は、最大６個の炭素原子を有し、モノ−またはポリ−ヒドロキシ、たとえばモノ−、ジ−またはトリ−ヒドロキシ、アルコール、たとえばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールまたはペンタノールまたはそれらの異性体であるが、特にグリコールおよびグリセロールである。それ故、下記の脂肪酸エステルの例が言及されうる：特に綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、ダイズ油および更に殊に落花生油のような植物油以外にはオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、“LabrafilM 2375”(ポリオキシエチレングリセロールトリオレエート、Gattefosse, Paris)、“Miglyol 812”(Ｃ８からＣ１２の鎖長の飽和脂肪酸のトリグリセリド、Huels AG, Germany)。

経口投与用薬剤組成物は、活性成分と固体担体を混合して一体とし、所望によりその結果生じた混合物を造粒し、そして所望によりまたは必要に応じてこの混合物を、しかるべき賦形剤を添加した後に、錠剤、糖衣錠コアまたはカプセルに加工することによって得ることができる。活性成分が適度の量で拡散または放出することを可能にするプラスチック担体にそれらを組み込むことも可能である。

適切な担体は、特に増量剤、たとえば糖、たとえばラクトース、サッカロース、マンニトールまたはソルビトール、セルロース製剤および／またはカルシウムホスフェート、たとえばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム、および結合剤、たとえばコーン、小麦、コメまたはジャガイモデンプンを使用した、たとえばデンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドン、および／または、所望により、崩壊剤、たとえば上記デンプン、および／またはカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、たとえばアルギン酸ナトリウムである。賦形剤は、特に流動調節剤および滑沢剤、たとえばケイ酸、タルク、ステアリン酸またはその塩、たとえばステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、および／またはポリエチレングリコールである。糖衣錠コアは、適切な、所望により腸溶性コーティングを施してよく、それは、特にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタンを含み得る濃縮糖溶液、または適切な有機溶媒中のコーティング溶液、または腸溶性コーティングの製造のために、適切なセルロース製剤溶液、たとえばエチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートを使用する。カプセルは、ゼラチン製の乾燥充填カプセルならびにゼラチンおよび可塑剤、たとえばグリセロールまたはソルビトールからなる密封軟カプセルである。乾燥充填カプセルは、たとえば増量剤、たとえばラクトース、結合剤、たとえばデンプン、および／または流動促進剤(glidant)、たとえばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、および所望により安定化剤と共に、顆粒の形の活性剤を含み得る。軟カプセルにおいて、活性成分は、好ましくは適切な油性賦形剤、たとえば脂肪油、パラフィン油または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁しており、安定化剤および／または抗菌剤を添加することも可能である。染料または色素を、錠剤または糖衣錠コーティングまたはカプセル殻に、たとえば同定目的でまたは活性成分の異なる量を指示するために添加してよい。

式（Ｉ）の化合物はまた、他の抗増殖性薬剤と組み合わせて有利に使用することができる。こうした抗増殖性化合物には、アロマターゼ阻害剤；抗エストロゲン剤；トポイソメラーゼＩ阻害剤；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤；微小管活性薬剤；アルキル化剤；ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤；細胞分化プロセスを誘発する化合物；シクロオキシゲナーゼ阻害剤；ＭＭＰ阻害剤；ｍＴＯＲ阻害剤；抗新生物性代謝拮抗剤；白金化合物；たんぱく質または脂質キナーゼ活性を標的とする／低下させる化合物および更に抗血管形成化合物；たんぱく質または脂質ホスファターゼの活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物；ゴナドレリンアゴニスト；抗アンドロゲン剤；メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤；ビスホスホネート；生物学的応答調整剤；抗増殖性抗体；ヘパラナーゼ阻害剤；Ｒａｓ発がん性アイソフォーム阻害剤；テロメラーゼ阻害剤；プロテアソーム阻害剤；血液系悪性腫瘍の処置に使用される薬剤；Ｆｌｔ−３活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物；Ｈｓｐ９０阻害剤；テモゾロマイド（テモダール^{（登録商標）})；およびロイコボリンが含まれる（ただしこれらには限定されない）。

本明細書で使用されている“アロマターゼ阻害剤”という用語は、エストロゲン産生物を阻害する、すなわち、基質アンドロステンジオンおよびテストステロンをエストロンおよびエストラジオールにそれぞれ変換する化合物に関連する。この用語には、ステロイド、特にアタメスタン、エキセメスタンおよびホルメスタンそして、殊に、非ステロイド、特に、アミノグルテチミド、ログレチミド(roglethimide)、ピリドグルテチミド、トリロスタン、テストラクトン、ケトコナゾール、ボロゾール、ファドロゾール、アナストロゾールおよびレトロゾールが含まれる（ただしこれらには限定されない）。エキセメスタンは、たとえば、商標アロマシン(AROMASIN)のもとで市販されているような方式で投与することができる。ホルメスタンは、たとえば、商標レンタロン(LENTARON)のもとで市販されているような方式で投与することができる。ファドロゾールは、たとえば、商標アフェマ(AFEMA)のもとで市販されているような方式で投与することができる。アナストロゾールは、たとえば、商標アリミデックス(ARIMIDEX)のもとで市販されているような方式で投与することができる。レトロゾールは、たとえば、商標フェマーラ(FEMARA)またはフェマー(FEMAR)のもとで市販されているような方式で投与することができる。アミノグルテチミドは、たとえば、商標オリメテン(ORIMETEN)のもとで市販されているような方式で投与することができる。アロマターゼ阻害剤である化学療法剤を包含する本発明の組み合わせは、ホルモン受容体陽性腫瘍、たとえば、乳がんの処置に特に有用である。

本明細書で使用されている“抗エストロゲン”という用語は、エストロゲン受容体レベルでエストロゲンの作用に拮抗する化合物に関連する。この用語には、タモキシフェン、フルベストラント、ラロキシフェンおよび塩酸ラロキシフェンが含まれるがこれらには限定されない。タモキシフェンは、たとえば、商標ノルバデクス(NOLVADEX)のもとで市販されているような方式で投与することができる。塩酸ラロキシフェンは、たとえば、商標エビスタ(EVISTA)のもとで市販されているような方式で投与することができる。フルベストラントは、米国特許４,６５９,５１６に開示されているように製剤化することができ、またはたとえば、商標ファスロデックス(FASLODEX)のもとで市販されているような方式で投与することができる。抗エストロゲンである化学療法剤を含んでなる本発明の組み合わせは、エストロゲン受容体陽性腫瘍、たとえば、乳がんの処置に特に有用である。

本明細書で使用されている“抗アンドロゲン剤”という用語は、アンドロゲンホルモンの生物学的作用を阻害することができる任意の物質に関連し、たとえば、米国特許４,６３６,５０５に開示されているように製剤化することができるビカルタミド(カソデックス(CASODEX))を含む（但しこれには限定されない）。

本明細書で使用されている“ゴナドレリンアゴニスト”という用語は、アバレリクス、ゴセレリンおよびゴセレリン・酢酸塩を含む（但し、これらには限定されない）。ゴセレリンは、米国特許４,１００,２７４に開示されており、たとえば、商標ゾラデックス(ZOLADEX)のもとで市販されているような方式で投与することができる。アバレリクスは、たとえば、米国特許５,８４３,９０１に開示されているように製剤化することができる。

本明細書で使用されている“トポイソメラーゼＩ阻害剤”という用語は、トポテカン、ジマテカン、イリノテカン、カンプトテシン(camptothecian)およびそのアナログ、９−ニトロカンプトテシンおよび高分子カンプトテシンコンジュゲートＰＮＵ−１６６１４８（ＷＯ ９９／１７８０４中の化合物Ａ１）を含む（但し、これらには限定されない）。イリノテカンは、たとえば、商標カンプトサル(CAMPTOSAR)のもとで市販されているような方式で投与することができる。トポテカンは、たとえば、商標ハイカムチン(HYCAMTIN)のもとで市販されているような方式で投与することができる。

本明細書で使用されている“トポイソメラーゼＩＩ阻害剤”という用語は、ドキソルビシン（リポソーム製剤、たとえば、カエリックス(CAELYX)を含む)、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびネモルビシンのようなアントラサイクリン系、アントラキノン系のミトキサントロンおよびロソキサントロン、およびポドフィロトキシン系のエトポシドおよびテニポシドを含む（但し、これらには限定されない）。エトポシドは、たとえば、商標エトポフォス(ETOPOPHOS)のもとで市販されているような方式で投与することができる。テニポシドは、たとえば、商標VM 26-BRISTOLのもとで市販されているような方式で投与することができる。ドキソルビシンは、たとえば、商標アドリブラスチン(ADRIBLASTIN)またはアドリアマイシン(ADRIAMYCIN)のもとで市販されているような方式で投与することができる。エピルビシンは、たとえば、商標ファルモルビシン(FARMORUBICIN)のもとで市販されているような方式で投与することができる。イダルビシンは、たとえば、商標ザベドス(ZAVEDOS)のもとで市販されているような方式で投与することができる。ミトキサントロンは、たとえば、商標ノバントロン(NOVANTRON)のもとで市販されているような方式で投与することができる。

“微小管活性剤”という用語は、たとえば、パクリタキセルおよびドセタキセルのようなタキサン系類、たとえば、ビンブラスチン、特に硫酸ビンブラスチン、ビンクリスチン、特に硫酸ビンクリスチン、およびビノレルビンのようなビンカアルカロイド類、ジスコデルモリド類、コルチシン(cochicine)およびたとえば、エポチロンＢもしくはＤまたはその誘導体のようなエポチロン類およびその誘導体を含む（但しこれらには限定はされない）微小管安定化、微小管不安定化剤およびマイクロチューブリンポリメリゼーション阻害剤(microtublin polymerization inhibitors)に関連する。パクリタキセルは、たとえば、市販（たとえば、タキソール(TAXOL)）されているような方式で投与することができる。ドセタキセルは、たとえば、市販（たとえば、商標タキソテール(TAXOTERE)のもとで）されているような方式で投与することができる。硫酸ビンブラスチンは、たとえば、市販（たとえば、商標ビンブラスチンR.P.(VINBLASTIN R.P.)のもとで）されているような方式で投与することができる。硫酸ビンクリスチンは、たとえば、市販（たとえば、商標ファルミスチン(FARMISTIN)のもとで）されているような方式で投与することができる。ジスコデルモリドは、たとえば、米国特許５,０１０,０９９に開示されているように得ることができる。ＷＯ ９８／１０１２１、米国特許６,１９４,１８１、ＷＯ ９８／２５９２９、ＷＯ ９８／０８８４９、ＷＯ ９９／４３６５３、ＷＯ ９８／２２４６１およびＷＯ ００／３１２４７に開示されているエポチロン誘導体もまた含まれる。特に、エポチロンＡおよび／またはＢが好ましい。

本明細書で使用されている“アルキル化剤”という用語は、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファランまたはニトロソウレア(BCNUまたはグリアデル(Gliadel))を含むが、これらには限定されない。シクロホスファミドは、たとえば、市販（たとえば、商標シクロスチン(CYCLOSTIN)のもとで)されているような方式で投与することができる。イホスファミドは、たとえば、市販（たとえば、商標ホロキサン(HOLOXAN)のもとで）されているような方式で投与することができる。

“ヒストンデアセチラーゼ阻害剤”または“ＨＤＡＣ阻害剤”という用語は、ヒストンデアセチラーゼを阻害し、そして抗増殖性活性を有する化合物に関する。これには、ＷＯ ０２／２２５７７に開示されている化合物、特にＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［（２−ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミドおよびその製薬的に許容される塩が含まれる。更に、特にスベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)が含まれる。

“抗腫瘍性代謝拮抗物質”という用語は、５−フルオロウラシルまたは５−ＦＵ、カペシタビン、ゲムシタビン、５−アザシチジンおよびデシタビン、メトトレキセートおよびエダトレキセートのようなＤＮＡ脱メチル化剤、およびペメトレキセドのような葉酸拮抗物質を含むが、これらには限定されない。カペシタビンは、たとえば、市販(たとえば、商標ゼローダ(XELODA)のもとで）されているような方式で投与することができる。ゲムシタビンは、たとえば、市販(たとえば、商標ジェムザール(GEMZAR)のもとで）されているような方式で投与することができる。またモノクローナル抗体トラスツズマブも含まれ、それは、市販（たとえば、商標ヘルセプチン(HERCEPTIN)のもとで）されているような方式で投与することができる。

本明細書で使用されている“白金化合物”という用語は、カルボプラチン、シスプラチン、シスプラチニウムおよびオキサリプラチンを含むが、これらには限定されない。カルボプラチンは、たとえば、市販（たとえば、商標カルボプラット(CARBOPLAT)のもとで)されているような方式で投与することができる。オキサリプラチンは、たとえば、市販（たとえば、商標エロキサチン(ELOXATIN)のもとで）されているような方式で投与することができる。

本明細書で使用されている“たんぱく質または脂質キナーゼ活性；またはたんぱく質または脂質ホスファターゼ活性；を標的とする／低下させる化合物；または更に抗血管形成化合物”という用語は、たんぱく質チロシンキナーゼおよび／またはセリンおよび／またはトレオニンキナーゼ阻害剤または脂質キナーゼ阻害剤を含む（但しこれらには限定されない）が、たとえば、以下のものである。
ａ）血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物で、たとえば、ＰＤＧＦＲの活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物であり、特にＰＤＧＦ受容体を阻害する化合物であり、たとえば、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、たとえば、イマチニブ、ＳＵ１０１、ＳＵ６６６８およびＧＦＢ−１１１である；
ｂ）線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）の活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物；
ｃ）インシュリン様成長因子受容体Ｉ（ＩＧＦ−ＩＲ）の活性を標的とし、低下させるか、または阻害する化合物であり、たとえば、ＩＧＦ−ＩＲの活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物であり、特にＩＧＦ−ＩＲ受容体活性を阻害する化合物であり、たとえば、ＷＯ ０２／０９２５９９に開示されているそうした化合物；
ｄ）Ｔｒｋ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物；
ｅ）Ａｘｌ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物；
ｆ）ｃ−Ｍｅｔ受容体の活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物；
ｇ）Ｋｉｔ／ＳＣＦＲ受容体チロシンキナーゼの活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物；
ｈ）Ｃ−ｋｉｔ受容体チロシンキナーゼ−（ＰＤＧＦＲファミリーの一部）の活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物であり、たとえば、ｃ−ｋｉｔチロシン受容体キナーゼファミリーの活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物であり、特にこのｃ−ｋｉｔ受容体を阻害する化合物で、たとえば、イマチニブ；

ｉ）ｃ−Ａｂｌファミリーメンバー、およびその遺伝子融合産物（たとえば、ＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼ）の活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物であって、たとえば、ｃ−Ａｂｌファミリーメンバーおよびその遺伝子融合産物の活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物であり、たとえば、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、たとえば、イマチニブ；ＰＤ１８０９７０；ＡＧ９５７；ＮＳＣ６８０４１０；またはパークデイビスからのＰＤ１７３９５５；
ｊ）たんぱく質キナーゼＣ（ＰＫＣ）およびセリン／トレオニンキナーゼのＲａｆファミリーのメンバー、ＭＥＫ、ＳＲＣ、ＪＡＫ、ＦＡＫ、ＰＤＫのメンバー、およびＲａｓ／ＭＡＰＫファミリーメンバー、またはＰＩ（３）キナーゼファミリーまたはＰＩ（３）キナーゼ関連キナーゼファミリーのメンバー、および／またはサイクリン依存性キナーゼファミリー（ＣＤＫ）のメンバーの活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物であり、特に米国特許５,０９３,３３０に開示されているそうしたスタウロスポリン誘導体であり、たとえば、ミドスタウリン；更なる化合物の例としては、たとえば、ＵＣＮ−０１、サフィンゴール、ＢＡＹ４３−９００６、ブリオスタチン１、ペリホシン；イルモホシン；ＲＯ３１８２２０およびＲＯ３２０４３２；ＧＯ６９７６；Isis３５２１；ＬＹ３３３５３１／ＬＹ３７９１９６；ＷＯ ００／０９４９５に開示されているようなイソチノリン化合物類；ＦＴＩｓ；ＰＤ１８４３５２またはＱＡＮ６９７（ＰＩ３Ｋ阻害剤）が含まれる；
ｋ）たんぱく質チロシンキナーゼ阻害剤の活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物であって、たとえば、メシル酸イマチニブ(グリベック(GLEEVEC)）またはチルホスチンを含むたんぱく質チロシンキナーゼ阻害剤の活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物。チルホスチンは、低分子量（Mr＜1500)化合物、またはその製薬的に許容される塩、特にベンジリデンマロニトリル系、またはＳ−アリールベンゼンマロニトリルまたは二基質キノリン系化合物より選択される化合物、更に特に、チルホスチンＡ２３／ＲＧ−５０８１０；ＡＧ９９；チルホスチンＡＧ２１３；チルホスチンＡＧ１７４８；チルホスチンＡＧ４９０；チルホスチンＢ４４；チルホスチンＢ４４（＋）エナンチオマー；チルホスチンＡＧ５５５、ＡＧ４９４；チルホスチンＡＧ５５６、ＡＧ９５７およびアダホスチン（４−｛［（２,５−ジヒドロキシフェニル）メチル］アミノ｝−安息香酸アダマンチルエステル；ＮＳＣ６８０４１０、アダホスチン）から成る群より選択される任意の化合物が好ましい；および

ｌ）上皮細胞増殖因子ファミリー受容体チロシンキナーゼ（ホモ−またはヘテロダイマーとしてのＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４）の活性を標的とし、低下させるか、阻害する化合物であり、たとえば、上皮細胞因子受容体ファミリーの活性を標的とし、低下させるか、または阻害する化合物であり、特にＥＧＦ受容体チロシンキナーゼファミリーメンバー、たとえば、ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４またはＥＧＦを阻害するまたはＥＧＦ関連リガンドに結合する化合物、たんぱく質または抗体であり、そして特に、一般的かつ殊にＷＯ ９７／０２２６６に開示されているそうした化合物、たんぱく質またはモノクローナル抗体、たとえば、実施例３９の化合物、またはＥＰ ０５６４４０９、ＷＯ ９９／０３８５４、ＥＰ ０５２０７２２、ＥＰ ０５６６２２６、ＥＰ ０７８７７２２、ＥＰ ０８３７０６３、米国特許５,７４７,４９８、ＷＯ ９８／１０７６７、ＷＯ ９７／３００３４、ＷＯ ９７／４９６８８、ＷＯ ９７／３８９８３、そして特にＷＯ ９６／３０３４７（たとえば、ＣＰ３５８７７４と呼ばれている化合物）、ＷＯ ９６／３３９８０（たとえば、ＺＤ１８３９の化合物）およびＷＯ ９５／０３２８３（たとえば、ＺＭ１０５１８０の化合物）；たとえば、トラスツズマブ（ハーセプチン）、セツキシマブ、イレッサ、ターセバ、ＯＳＩ−７７４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＧＷ−２０１６、Ｅ１.１、Ｅ２.４、Ｅ２.５、Ｅ６.２、Ｅ６.４、Ｅ２.１１、Ｅ６.３またはＥ７.６.３、およびＷＯ ０３／０１３５４１に開示されている７Ｈ−ピロロ−［２,３−ｄ］ピリミジン誘導体のような上皮細胞増殖因子受容体ファミリーの活性を標的とし、低下させまたは阻害する化合物。

更に、抗血管形成化合物には、その活性に関して別のメカニズムを有する化合物、たとえば、たんぱく質または脂質キナーゼ阻害に関連のない化合物、たとえば、サリドマイド（サロミド(THALOMID)）およびＴＮＰ−４７０が含まれる。

たんぱく質または脂質ホスファターゼ活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物は、たとえば、ホスファターゼ１、ホスファターゼ２Ａ、ＰＴＥＮまたはＣＤＣ２５の阻害剤であり、たとえば、オカダ酸またはその誘導体である。

細胞分化プロセスを誘発する化合物は、たとえば、レチノイン酸、α−,γ−またはδ−トコフェロールまたはα−、γ−またはδ−トコトリエノールである。

本明細書で使用されているシクロオキシゲナーゼ阻害剤という用語は、たとえば、Ｃｏｘ−２阻害剤、セレコキシブ(セレブレックス(CELEBREX))、ロフェコキシブ（バイオックス(VIOXX)）、エトリコキシブ、バルデコキシブまたは５−アルキル−２−アリールアミノフェニル酢酸、たとえば、５−メチル−２−（２’−クロロ−６’−フルオロアニリノ）フェニル酢酸、ルミラコキシブのような５−アルキル置換 ２−アリールアミノフェニル酢酸および誘導体を含むが、これらには限定されない。

本明細書で使用されている“ビスホスホネート剤”という用語は、エトリドン酸、クロドロン酸、チルドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、イバンドロン酸、リセドロン酸およびゾレドロン酸が含まれるが、これらに限定はされない。“エトリドン酸”は、たとえば、市販（たとえば、商標ジドロネル(DIDRONEL)のもとで）されているような方式で投与することができる。“クロドロン酸”は、たとえば、市販（たとえば,商標ボネホス(BONEFOS)のもとで）されているような方式で投与することができる。“チルドロン酸”は、たとえば、市販（たとえば、商標スケリド(SKELID)のもとで）されているような方式で投与することができる。“パミドロン酸”は、たとえば、市販（たとえば、商標アレディア(AREDIA)^（商標)のもとで）されているような方式で投与することができる。“アレンドロン酸”は、たとえば、市販（たとえば、商標フォサマックス(FOSAMAX)のもとで）されているような方式で投与することができる。“イバンドロン酸”は、たとえば、市販（たとえば、商標 ボンドラナット(BONDRANAT)）されているような方式で投与することができる。“リセドロン酸”は、たとえば、市販（たとえば、 商標アクトネル(ACTONEL)のもとで）されているような方式で投与することができる。“ゾレドロン酸”は、たとえば、市販（たとえば、商標ゾメタ(ZOMETA)のもとで）されているような方式で投与することができる。

“ｍＴＯＲ阻害剤”という用語は、ラパマイシン(ｍＴＯＲ)の哺乳類の標的を阻害し、シロリムス（ラパミューン(Rapamune)^(商標)）、エベロリムス(サーティカン(Certican)^(商標)）、ＣＣＩ−７７９およびＡＢＴ５７８のような抗増殖性活性を有する化合物に関する。

本明細書で使用されている“ヘパラナーゼ阻害剤”という用語は、ヘパリン硫酸分解を標的とし、低下させまたは阻害する化合物を意味する。この用語は、ＰＩ−８８を含むが、これに限定されない。

本明細書で使用されている“生物学的応答調整剤”という用語は、リンホカインまたはインターフェロン(たとえば、インターフェロンγ)を意味する。

本明細書で使用されている“Ｒａｓ腫瘍形成アイソフォーム阻害剤”、たとえば、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−ＲａｓまたはＮ−Ｒａｓという用語は、Ｒａｓの腫瘍形成活性を標的とし、低下させ、または阻害する化合物、たとえば、“ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤”たとえば、Ｌ−７４４８３２、ＤＫ８Ｇ５５７またはＰ１１５７７７(Zarnestra)を意味する。

本明細書で使用されている“テロメラーゼ阻害剤”という用語は、テロメラーゼ活性を標的とし、低下させまたは阻害する化合物を意味する。テロメラーゼ活性を標的とし、低下させまたは阻害する化合物は、特にテロメラーゼ受容体を阻害する化合物、たとえば、テロメスタチンである。

本明細書で使用されている“メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤”という用語は、メチオニンアミノペプチダーゼ活性を標的とし、低下させまたは阻害する化合物を意味する。メチオニンアミノペプチダーゼ活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物は、たとえば、ベンガミドまたはその誘導体である。

本明細書で使用されている“プロテアソーム阻害剤”という用語は、プロテアソーム活性を標的とし、低下させまたは阻害する化合物を意味する。プロテアソーム活性を標的とし、低下させまたは阻害する化合物には、たとえば、ＰＳ−３４１およびＭＬＮ３４１が含まれる。

本明細書で使用されている“マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤”または(“ＭＭＰ阻害剤”)という用語には、コラーゲンペプチド擬似物および非ペプチド擬似物阻害剤、テトラサイクリン誘導体、たとえば、ヒドロキサマートペプチド擬似物阻害剤 バチマスタットおよびその経口的に生物学的利用可能アナログ マリマスタット(ＢＢ−２５１６)、プリノマスタット(ＡＧ３３４０)、メタスタット(ＮＳＣ６８３５５１)ＢＭＳ−２７９２５１、ＢＡＹ１２−９５６６、ＴＡＡ２１１、ＭＭＩ２７０ＢまたはＡＡＪ９９６が含まれるが、これらには限定されない。

本明細書で使用されている“血液学的悪性腫瘍の処置に使用される薬剤”という用語には、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ阻害剤、たとえば、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ受容体（Ｆｌｔ−３Ｒ）活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物；インターフェロン、１−ｂ−Ｄ−アラビノフランシルシトシン（ａｒａ−ｃ）およびビスルファン；およびＡＬＫ阻害剤、たとえば、未分化リンパ腫キナーゼを標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物が含まれるが、これらには限定されない。

ＦＭＳ様チロシンキナーゼ受容体（Ｆｌｔ−３Ｒ）活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物は、特に、Ｆｌｔ−３Ｒ受容体キナーゼファミリーメンバーを阻害する化合物、たんぱく質または抗体、たとえば、ＰＫＣ４１２、ミドスタウリン、スタウロスポリン誘導体、ＳＵ１１２４８およびＭＬＮ５１８である。

本明細書で使用されている“ＨＳＰ９０阻害剤”という用語は、ＨＳＰ９０の内因性ＡＴＰａｓｅ活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物；ユビキチンプロテアソーム経路を介してＨＳＰ９０クライアントたんぱく質を分解し、標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物を含むが、これには限定されない。ＨＳＰ９０の内因性ＡＴＰａｓｅ活性を標的とし、低下させまたは阻害する化合物は、特にＨＳＰ９０のＡＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物、たんぱく質、または抗体であり、たとえば、１７−アリルアミノ、１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）、ゲルダナマイシン誘導体；他のゲルダナマイシン関連化合物；ラディシコールおよびＨＤＡＣ阻害剤である。

本明細書で使用されている“抗増殖性抗体”という用語には、トラスツズマブ(ハーセプチン^(商標))、トラスツズマブ−ＤＭ１、エルロチニブ（タルセバ^（商標））、ベバシズマブ（アバスチン^(商標）)、リツキシマブ（リツキサン^{（登録商標）}）、ＰＲＯ６４５５３（抗ＣＤ４０）および２Ｃ４抗体が含まれるが、これらには限定されない。抗体とは、たとえば、インタクト(intact)モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全抗体から形成される多重特異性抗体(multispecific antibodies)、およびそれらが所望の生物学的活性を示す限りその抗体フラグメントを意味する。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置のためには、式（Ｉ）の化合物は、標準的な白血病治療と組み合わせて、特にＡＭＬの処置に使用されている治療と組み合わせて使用することができる。特に,式（Ｉ）の化合物は、たとえば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤および／またはＡＭＬの処置に有効な、ダウノルビシン、アドリアマイシン、Ａｒａ−Ｃ、ＶＰ−１６、テニポシド、ミトキサントロン(Mitoxantrone)、イダルビシン、カルボプラチニウム(Carboplatinum)およびＰＫＣ４１２のような他の薬物と組み合わせて投与することができる。

“抗白血病性化合物”という用語には、たとえば、Ａｒａ−Ｃ、ピリミジンアナログ（これはデオキシシチジンの２’−アルファ−ヒドロキシリボース（アラビノシド）誘導体である）が含まれる。また、ヒポキサンチンのプリンアナログ、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）およびフルダラビンホスフェートも含まれる。

酪酸ナトリウムおよびスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）のようなヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の活性を標的とし、低下させまたは阻害する化合物は、ヒストンデアセチラーゼと呼ばれている酵素の活性を阻害する。特定のＨＤＡＣ阻害剤には、ＭＳ２７５、ＳＡＨＡ、ＦＫ２２８（以前はＦＲ９０１２２８）、トリコスタチンＡおよび米国特許６,５５２,０６５に開示されている化合物、特にＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、またはその製薬的に許容される塩およびＮ−ヒドロキシ−３−［４−［（２−ヒドロキシエチル）｛２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、またはその製薬的に許容される塩、特に乳酸塩が含まれる。

セリン／トレオニンｍＴＯＲキナーゼの活性を標的とし、低下させるかまたは阻害する化合物は、特にｍＴＯＲキナーゼファミリーのメンバーを阻害する化合物、たんぱく質または抗体であり、たとえば、ＲＡＤ、ＲＡＤ００１、ＣＣＩ−７７９、ＡＢＴ５７８、ＳＡＲ５４３、ラパマイシンおよびその誘導体；AriadからのＡＰ２３５７３；エベロリムス（ＣＥＲＴＩＣＡＮ）；およびシロリムスである。

本明細書で使用されているソマトスタチン受容体アンタゴニストは、オクトレオリド、およびＳＯＭ２３０のようなソマトスタチン受容体を標的とし、処置しまたは阻害する薬剤を意味する。

腫瘍細胞を損傷させる取り組みは、電離放射線(ionizing radiation)のような取り組みを意味する。上記および後に言及する“電離放射線”という用語は、電磁波（Ｘ線およびガンマ線のような）または粒子（アルファおよびベータ粒子のような）として起こる電離放射線を意味する。電離放射線は、放射線療法で提供され、そしてこの分野で知られているが、これには限定されない。Hellman,Principles of Radiation Therapy,Cancer,in Principles and Practice of Oncology,Devita et al.,Eds.,4th Edition,Vol. 1,pp. 248-275 (1993)参照。

本明細書で使用されているＥＤＧ結合剤(EDG binders)という用語は、ＦＴＹ７２０のようなリンパ球再循環現象を調節する免疫抑制剤類を意味する。

サーティカン(CERTICAN)(エベロリムス、ＲＡＤ)は、Ｔ−細胞および血管平滑筋細胞の増殖を防止する、治験中の新規増殖シグナル阻害剤である。

リボヌクレオチドリダクターゼ阻害剤という用語は、フルダラビンおよび／またはシトシンアラビノシド（ａｒａ−Ｃ）、６−チオグアニン、５−フルオロウラシル、クラドリビン、６−メルカプトプリン（特に、ＡＬＬに対するａｒａ−Ｃと組み合わせて）および／またはペントスタチンを含むが、これらには限定されないピリミジンまたはプリンヌクレオシドアナログを意味する。リボヌクレオチドリダクターゼ阻害剤は、特にヒドロキシウレアまたは２−ヒドロキシ−１Ｈ−イソインドール−１,３−ジオン誘導体であって、たとえば、Nandy et al., Acta Oncologica, Vol. 33, No. 8, pp. 953-961 (1994) に言及されているＰＬ−１、ＰＬ−２、ＰＬ−３、ＰＬ４、ＰＬ−５、ＰＬ−６、ＰＬ−７またはＰＬ−８である。

本明細書で使用されている“Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ阻害剤”という用語には、米国特許５,４６１,０７６に開示されている化合物が含まれるが、これらに限定されない。

また、特に、ＷＯ ９８／３５９５８に開示されているＶＥＧＦの化合物類、たんぱく質類またはモノクローナル抗体類であって、たとえば、１−（４−クロロアニリノ）−４−（４−ピリジルメチル）フタラジンまたはその製薬的に許容される塩、たとえば、琥珀酸塩、またはＷＯ ００／０９４９５、ＷＯ ００／２７８２０、ＷＯ ００／５９５０９、ＷＯ ９８／１１２２３、ＷＯ ００／２７８１９およびＥＰ ０７６９９４７に開示されている；Prewett et al, Cancer Res,Vol. 59,pp. 5209-5218 (1999）；Yuan et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,Vol. 93,pp. 14765-14770 (1996); Zhu et al.,Cancer Res,Vol. 58,pp. 3209-3214 (1998); およびMordenti et al.,Toxicol Pathol,Vol. 27,No. 1,pp. 14-21 (1999)に述べられているもの；ＷＯ ００／３７５０２およびＷＯ ９４／１０２０２に開示されている；O'Reilly et al.,Cell,Vol. 79,pp. 315-328 (1994)に述べられているアンジオスタチン(ANGIOSTATIN)；O'Reilly et al.,Cell,Vol. 88,pp. 277-285 (1997)に述べられているエンドスタチン（ENDOSTATIN）；アントラニル酸アミド；ＺＤ４１９０；ＺＤ６４７４；ＳＵ５４１６；ＳＵ６６６８；ベバシズマブ；または抗ＶＥＧＦ抗体または抗ＶＥＧＦ受容体抗体、たとえば、ｒｈｕＭＡｂおよびＲＨＵＦａｂ、ＶＥＧＦアプタマー(aptamer)たとえば、マクゴン；ＦＬＴ−４阻害剤、ＦＬＴ−３阻害剤、ＶＥＧＦＲ−２ ＩｇＧ１抗体、アンジオザイム(Angiozyme)（ＲＰＩ ４６１０）およびアバスタンも含まれる。

本明細書で使用されている光線力学療法は、がんを処置または防止するための光感受性薬剤と呼ばれているある薬物を使用する療法を意味する。光線力学療法の実例には、たとえば、ビスダイン(VISUDYNE)およびポルフィマーナトリウムのような薬剤を用いる処置が含まれる。

本明細書で使用されている血管静止性ステロイド(angiostatic steroids)は、たとえば、アネコルタブ、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、１１−α−エピヒドロコチゾール(11-α−epihydrocotisol)、コルテキソロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デスオキシコルチコステロン、テストステロン、エストロンおよびデキサメタゾンのような血管新生をブロックし、または阻害する薬剤を意味する。

コルチコステロイドを含むインプラント(implants)は、たとえば、フルオシノロン、デキサメタゾンのような薬剤を意味する。

他の化学療法剤には、植物アルカロイド、ホルモン剤およびアンタゴニスト；好ましくは、リンホカインまたはインターフェロンである生物学的応答調整剤；アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体；または種々の薬剤または別のまたは知られていない作用メカニズムを有している薬剤が含まれるが、これらには限定されない。

コード番号、一般または商標名によって特定化されている活性薬剤の構造は、標準的な大要の現行版である“メルクインデックス(The Merck Index)”からまたはデータベース類、たとえば、パテント・インターナショナル(Patents International)(たとえば、IMS World Publications)から得ることができる。

式（Ｉ）の化合物と組み合わせて用いることができる上記の化合物は、本技術分野（たとえば、上記に引用されているドキュメント中で）で述べられているように製造し、そして投与することができる。

式（Ｉ）の化合物は、また、公知の治療方法（たとえば、ホルモン類の投与、あるいは特に放射線）と組み合わせて、有利に使用することができる。

式（Ｉ）の化合物は、特に、放射線増感剤として、特に放射線治療に感受性が乏しい腫瘍の処置に使用することができる。

“組み合わせ”とは、一つの投与単位形態での固定された組み合わせか、あるいは、式（Ｉ）の化合物および組み合わせの相手を、同時に、独立して投与するか、または特に、組み合わせの相手が、たとえば、相乗的効果である協同的な効果を示すことができる時間間隔内で別々に投与することができるか、あるいはその任意の組み合わせ投与のための複数パーツのキットを意味する。

次の実施例は、本発明の範囲を限定することなくこの発明を説明するのに役立つ：

温度が与えられていない場合は、その反応は、周囲（室）温度で行われる。
溶媒の比率（たとえば、溶出剤または溶媒混合物における）は、体積比(ｖ／ｖ）で与えられる。

合成
フラッシュクロマトグラフィーが、シリカゲル(Merck; 40-63μｍ)を用いて行われる。薄層クロマトグラフィーの場合、プリコートシリカゲル(Merck 60 F254)プレートが使用される。成分の検出は、ＵＶ光(２５４ ｎｍ)でなされる。ＨＰＬＣは、Nucleosil 100-3 C_１８ HD １２５×４.０ｍｍ カラム [１ｍｌ／分.; ２０−１００％ ＮｅＣＮ／０.１％ ＴＦＡ ７分で)を用いるAgilent HP 1100 (方法 Ａ)で；Nucleosil 100-5 C_１８ AB ２５０ｘ４.６mm カラム (2 ｍＬ/分.; ２−１００％ ＭｅＣＮ／０.１％ ＴＦＡ １０ 分で)を用いるSpectraSystem SP8800/UV2000 (方法 Ｂ)で；Chromalith Speed ROD RP18 ５０−４.６ｍｍ カラム (Merck) (２ｍＬ／分；２−１００％ ＭｅＣＮ／０.１％ ＴＦＡ ２分で) (方法Ｃ)を用いて; または C8 2.1-50 ｍｍ ３ μｍ カラム (Waters) (２ ｍＬ／分；５−９５％ ＭｅＣＮ／０.１％ ＴＦＡ ２分で)(方法Ｄ)で行われる。エレクトロスプレー質量スペクトルは、Fisons Instruments VG Platform IIで得られる。融点はBuechi 510 融点装置を用いて測定される。商業上入手可能な溶媒および化学品が、合成のために使用される。

分析ＨＰＬＣ条件：
システム１
直線勾配２０−１００％ＣＨ_３ＣＮ(０.１％ＴＦＡ)およびＨ_２Ｏ(０.１％ＴＦＡ)を７分＋２分１００％ＣＨ_３ＣＮ(０.１％ＴＦＡ)；２１５nmで検出、流速３０℃で１ｍＬ／分。カラム：Nucleosil 100-3 C18HD(１２５×４mm)。

システム２
直線勾配２−１００％ＣＨ_３ＣＮ(０.１％ＴＦＡ)およびＨ_２Ｏ(０.１％ＴＦＡ)を７分＋２分１００％ＣＨ_３ＣＮ(０.１％ＴＦＡ)；２１５nmで検出、流速３０℃で１ｍＬ／分。カラム：Nucleosil 100-3 C18HD(１２５×４mm)。

実施例１：
６−（３−クロロ−フェニル）−３−（３,４−ジメトキシ−フェニル）−５−ピペラジン−１−イルメチル−ピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン
５−クロロメチル−６−（３−クロロ−フェニル）−３−（３,４−ジメトキシ−フェニル）−ピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン (実施例１; ステージ １.３)(１.５ g; ３.４９ ｍＭｏｌ)をＮ,Ｎ’−ジメチルアセトアミド (３０ｍＬ)中に室温で溶解し、引き続いて、無水ピペラジン(３.０１g；３４.９ｍＭｏｌ)を添加する。この黄色溶液を８０℃で９０分間加熱する。冷却後、この混合物を減圧下で濃縮する。この残渣をジエチルエール(２０ ｍＬ)に加え、１５分間撹拌し、引き続いて残存する粗結晶生成物をろ別する。更なる精製が、クロマトグラフィー（シリカゲル、１２０g RediSep, ISCO Sg-100、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ ４：１で溶出する)で反復して行われる。

ステージ １.１ : ２−（３−クロロ−フェニル）−３−オキソ−ブチロニトリル
３５５ｍｌのエタノールをＮ２の下で５５°Ｃに加熱する。この溶液にナトリウム（３.９１g；０.１７mol）を３０分以内で加え、次に金属のすべてが溶解するまで１.５時間撹拌する。３−クロロベンジルシアニド（１５.３１g；０.１mol）および酢酸エチル（２８.５３ｍＬ；０.２９mol）をこの無色溶液に加え、引き続いて還流下で５時間撹拌する。この反応終了後、この黄色混合物を室温に冷却し、そして減圧下で蒸発させる。この粗物質を水（２００ｍＬ）に加え、そしてクエン酸２５gを加えて中和する。この水層をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出する（２×２５０ｍＬ）。集められた有機相をＨ_２Ｏ（２×１５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４）、減圧下で濃縮し、そしてクロマトグラフィー処理する（シリカゲル、１kg,Merck 60 （０.０４０−０.０６３）、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン １：１で溶出する）と、表題化合物を黄色結晶として得る；融点 ９２−９７℃；ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝３０２.９（Ｍ＋Ｈ）^＋；ＨＰＬＣ：^Ａ _ｔＲｅｔ＝５.６７分（システム１）。

ステージ１.２：４−ブロモ−２−（３−クロロ−フェニル）−３−オキソ−ブチロニトリル
２−（３−クロロ−フェニル）−３−オキソ−ブチロニトリル（１２g；６２ｍｍｏｌ）を室温で酢酸（４００ｍＬ）に溶解し、引き続いて臭素(brom)（３.８４ｍＬ；７４.４ｍＭｏｌ）を加え、濃縮器をＣａＣｌ_２管で覆う。この黄色溶液を９０℃で９０分間撹拌する。室温に冷却後、溶媒を減圧下で除く。この油状残渣をトルエン（５０ｍＬ）に加え、そして、減圧下で溶媒を除去する；この手順を４回繰り返す。こうした精製工程後、この表題化合物が微細な、明るい黄色の結晶として単離される；融点 １２４−１３２℃；ＭＳ（ＥＳＩ−）：ｍ／ｚ＝２７１.９（Ｍ−Ｈ）⁻；ＨＰＬＣ：_ｔＲｅｔ＝６.３１分（システム２）。

ステージ１.３：５−クロロメチル−６−（３−クロロ−フェニル）−３−（３,４−ジメトキシ−フェニル）−ピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン
４−ブロモ−２−（３−クロロ−フェニル）−３−オキソ−ブチロニトリル（実施例１；ステージ１.２）；（９.４３g；３４.６ｍｍｏｌ）をエタノール（２００ｍＬ）に溶解し、引き続いて、エタノール（１.２５Ｍ溶液 １１１ｍＬ；１３８ｍｍｏｌ）中の４−（３,４−ジメトキシ−フェニル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イルアミン（１５.２g；６９.２ｍＭｏｌ）（実施例９３参照；ステージ９３.１ ＥＰ２００５／０００６０２）およびＨＣｌを室温で加える。淡黄色の懸濁液を全部で１６３時間加熱・還流する；濃縮器をＣａＣｌ_２管で覆う。室温に冷却後、この結晶生成物をろ別し、エタノールで洗浄する。更なる精製が、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ ９８：２で溶出する）によって行われ、表題化合物が黄色結晶として得られる；融点 ２０９−２１１℃；ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝４２９（Ｍ＋Ｈ）^＋；ＨＰＬＣ：_ｔＲｅｔ＝７.０６分（システム２）。

実施例２：３−（３,４−ジメトキシ−フェニル）−６−（４−フルオロ−フェニル）−５−ピペラジン−１−イルメチル−ピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン
この表題化合物は；代わりに５−クロロメチル−３−（３,４−ジメトキシ−フェニル）−６−（４−フルオロ−フェニル）−ピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミンを用いて実施例１に述べられているように製造される。

ステージ２.１：５−クロロメチル−３−（３,４−ジメトキシ−フェニル）−６−（４−フルオロ−フェニル）−ピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン
この表題化合物は、代わりに２−（４−フルオロ−フェニル）−３−オキソ−ブチロニトリル（実施例７９；ステージ ７９.１ＥＰ２００５／０００６０２）を用いて、実施例１に述べられているように製造される。表題化合物:黄色結晶 融点 ２５６−２５９℃; ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝４１３（Ｍ＋Ｈ）^＋；ＨＰＬＣ：_ｔＲｅｔ＝６.６５分（システム２）。

実施例１および２の物理化学的特性

次の実施例３〜５が、同様に製造することができる。

実施例３：６−（３−クロロ−フェニル）−３−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−５−ピペラジン−１−イルメチル−ピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン

実施例４：２−｛［７−アミノ−６−（３−クロロ−フェニル）−３−（３,４−ジメトキシ−フェニル）−ピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−５−イルメチル］−アミノ｝−エタノール

実施例５：２−｛［７−アミノ−３−（３,４−ジメトキシ−フェニル）−６−（４−フルオロ−フェニル）−ピラゾロ［１,５−ａ］ピリミジン−５−イルメチル］−アミノ｝−エタノール

実施例６：式（Ｉ）の化合物を含んでいる錠剤１
次の組成の中で活性成分として、先行する実施例中で言及されている式（Ｉ）の化合物のいずれか一つを５０ｍｇ含んでいる錠剤を定型化した方法を用いて調製する：

製造：活性成分を小麦澱粉の一部、乳糖およびコロイドシリカと混ぜ合わせ、次にこの混合物を篩で裏ごしする。残りの小麦澱粉を水浴上で５倍量の水と混ぜペーストを形成し、次に最初に作られた混合物を弱塑性塊が形成されるまでこのペーストと練り混ぜる。
この乾燥顆粒をメッシュの大きさ３ｍｍを有する篩で裏ごしし、残りのとうもろこし澱粉、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクをあらかじめ篩いにかけた（１ｍｍ篩）混合物と混ぜ、圧縮してわずかに両凸の錠剤を形成する。

実施例７：式（Ｉ）の化合物を含んでいる錠剤２
活性成分として、先行する実施例中で言及されている式（Ｉ）の化合物のいずれか一つを１００ｍｇ含んでいる錠剤を、標準的手順に従って以下の組成で調製する：

製造：活性成分を担体物質と混和し、タブレティングマシーン(Korsch EKO, Stempeldurchmesser １０mm)で圧縮する。

実施例８ カプセル
次の組成の活性成分として、先行する実施例中で言及されている式（Ｉ）の化合物のいずれか一つを１００ｍｇ含んでいるカプセル剤を標準化した手順によって調製する：

製造は、この成分を混和して、それをサイズ１のハードゼラチンカプセルに充填することによってなされる。

実施例９ 実施例１および２の化合物のＥｐｈＢ４およびｃ−Ａｂｌたんぱく質キナーゼ阻害剤としての生物学的データ
・ＥｐｈＢ４

表１：エフリンＢ４受容体キナーゼの阻害：
カラムＩ :エフリンＢ４受容体キナーゼ阻害剤としての実施例１および２の化合物の活性が、この明細書中で述べられている方法によって組み換えエフリンＢ４受容体ドメインで試験される。カラムＩＩ:ＥｐｈＢ４受容体自己リン酸化阻害剤としての実施例１および２の化合物の細胞でのイン・ビボの活性が、この明細書中で述べられているように測定される。
・ｃ−Ａｂｌ

表２：ｃ−Ａｂｌたんぱく質−チロシンキナーゼ活性の阻害：実施例１および２の化合物のｃ−Ａｂｌたんぱく質チロシンキナーゼ阻害剤としての活性が、この明細書に述べられている方法によって試験される。

Claims (10)

1. 式（Ｉ）：
   

   

   （式中、
   Ｒ_１は、Ｈであり、
   Ｒ_２は、ベンジル；無置換フェニルまたはハロ、ジ−低級アルキルアミノアルコキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ベンジルオキシ、シクロアルキル、アミノ、アセチルアミノから成る群より選択される一つまたは二つの置換基によって置換されているフェニルであり、
   Ｒ_３は、Ｈであり、そしてＲ_４は、ヒドロキシアルキルであるか、または、
   Ｒ_３およびＲ_４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、モルホリニル、ピロリジニル、ピペリジニルまたはピペラジニル（これらのヘテロ環類は、所望により、更に４個までのアルキル基によって置換されていることもある）を表し、
   Ａは、無置換またはモノ−、ジ−またはトリ−低級アルコキシ、ジ−低級アルキルアミニル、ジ−低級アルキルアミノアルコキシ、所望によりアルキルによってジ置換されていることもあるモルホリニル、所望によりジ−低級アルキルアミニルによって置換されていることもあるピペリジニル、および所望により低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルピペラジニル、ピロリジニル、ジ−低級またはアルキルアミニルによって置換されていることもあるピペラジニルから成る群より選択される一つまたはそれ以上の置換基によって置換されているフェニルである）
   の化合物またはその薬学的塩。
2. Ｒ_１が、Ｈであり、
   Ｒ_２が、フルオロまたはクロロによって置換されているフェニルであり、
   Ｒ_３が、Ｈであり、そしてＲ_４が、ヒドロキシエチルであるか、または、
   Ｒ_３およびＲ_４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ピペラジニルを表し、
   Ａが、モノ−、ジ−またはトリ−メトキシ、ジ−メチルアミノエトキシおよびジ−エチルアミノピペリジニルから成る群より選択される一つまたはそれ以上の置換基で置換されているフェニルである、
   請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的塩。
3. ヒトまたは動物の体の処置における使用のための請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物。
4. 請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物を含んでなる薬剤組成物。
5. 請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物と許容される薬学的担体を含んでなる薬剤組成物。
6. キナーゼ依存性疾患の処置に使用するための薬剤組成物の製造における請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
7. キナーゼ依存性疾患がｃ−Ａｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−Ｒａｆ、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、Ｈｅｒ−１、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲ−キナーゼ、ｃ−Ｓｒｃ、ＲＥＴ−受容体キナーゼ、ＦＧＦ−Ｒ１、ＦＧＦ−Ｒ２、ＦＧＦ−Ｒ３、ＦＧＦ−Ｒ４、エフリン受容体キナーゼ(例えば、ＥｐｈＢ２キナーゼ、ＥｐｈＢ４キナーゼおよび関連Ｅｐｈキナーゼ)、カゼインキナーゼ(ＣＫ−１、ＣＫ−２、Ｇ−ＣＫ)、Ｐａｋ、ＡＬＫ、ＺＡＰ７０、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ａｘｌ、Ｃｄｋ１、ｃｄｋ４、ｃｄｋ５、Ｍｅｔ、ＦＡＫ、Ｐｙｋ２、Ｓｙｋ、インスリン受容体キナーゼ、Ｔｉｅ−２またはＢｃｒ−Ａｂｌ、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−Ｒａｆ、Ｆｌｔ−３、ＦＧＦ−Ｒ３、ＰＤＧＦ−受容体、ＲＥＴ、およびＭｅｔのようなキナーゼの構成的に活性化された変異体(活性化キナーゼ)に依存する疾患、および(特に異常な高発現または活性化された)キナーゼ依存性疾患またはキナーゼ経路の活性化に依存する疾患、または前記に言及したキナーゼの任意の二つまたはそれ以上に依存した疾患である、たんぱく質キナーゼ依存性疾患の処置のための、請求項６に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
8. キナーゼ依存性疾患がｃ−ａｂｌ、Ｆｌｔ−３、ＫＤＲ、ｃ−Ｓｒｃ、ＲＥＴ、ＥｐｈＢ４、ｃ−ｋｉｔ、ｃｄｋ１、ＦＧＦＲ−１、ｃ−ｒａｆ、Ｈｅｒ−１、Ｉｎｓ−ＲまたはＴｅｋに依存する疾患である、請求項６または７に記載の使用。
9. 処置される疾患が、増殖性疾患、好ましくは良性または特に悪性腫瘍、より好ましくは、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、乳房、胃(特に胃腫瘍)、卵巣、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肺、膣、甲状腺のがん、肉腫、神経グリア芽細胞腫、多発性骨髄腫または胃腸のがん（特に結腸がんまたは結腸直腸腺腫）、または頸頭部腫瘍、表皮過剰増殖（特に乾癬、前立腺肥大症）、新生物形成（特に上皮性性質）、好ましくは、乳がん、または白血病である、請求項６〜８のいずれか一つに記載の使用。
10. 処置される疾患が、乾癬；カポジ肉腫；再狭窄、例えば、ステント誘発再狭窄；子宮内膜症；クローン病；ホジキン病；白血病；関節リウマチのような関節炎；血管腫；血管線維腫；糖尿病性網膜症および新生血管緑内障のような眼疾患；糸球体腎炎のような腎臓疾患；糖尿病性腎症；悪性腎硬化症；血栓性微小血管障害性症候群；移植拒絶反応および糸球体症；肝硬変のような線維性疾患；メサンギウム細胞増殖性疾患；動脈硬化症；神経組織の傷害のような持続性の血管形成により引き起こされるものである；およびバルーン付カテーテル処置後の血管再閉塞の阻害のために、血管補綴または血管を広げておくための、例えば、ステントのような機械的装置挿入後に使用するために、免疫抑制剤として、傷跡を残さない創傷治癒の補助として、ならびにエイジスポットおよび接触性皮膚炎の処置のための、請求項６〜９のいずれか一つに記載の使用。