BRPI0613478B1 - Dispositivo para análise quantitativa de um perfil de metabólito - Google Patents

Abstract

dispositivo para análise quantitativa de um perfil de metabólito. a presente invenção se refere a um dispositivo, em particular a um dispositivo de preparação de amostra para a análise quantitativa de um perfil de droga e/ou de metabólito em uma amostra biológica. além do mais, a presente invenção se refere a uma inserção para um tal dispositivo, a referida inserção sendo impregnada com pelo menos um padrão interno, ao padrão interno em si mesmo, e aum kit compreendendo o dispositivo. adicionalmente, a presente invenção também se refere a um aparelho contendo o dispositivo, e a um método para a análise quantitativa de um perfil de droga e/ou de metabólito em uma amostra biológica empregando o referido dispositivo.

Description

DISPOSITIVO PARA ANÁLISE QUANTITATIVA DE UM PERFIL DE

METABÓLITO

CAMPO TÉCNICO DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um dispositivo, em particular a um dispositivo de preparação de amostra para a análise quantitativa de um perfil de droga e/ou de metabólito em uma amostra biológica. Além do mais, a presente invenção se refere a uma inserção para um tal dispositivo sendo impregnada com pelo menos um padrão interno, ao padrão interno em si mesmo, e um kit compreendendo o dispositivo.

Adicionalmente, a presente invenção também se refere a um aparelho contendo o dispositivo, e a um método para a análise quantitativa de um perfil de droga e/ou de metabólito em uma amostra biológica empregando o dispositivo.

PANORAMA DO ESTADO DA TÉCNICA DA PRESENTE

INVENÇÃO

Metabolômica (estudo global do perfil de metabólito de uma determinada célula, tecido, fluido, órgão, organismo num determinado instante) é geralmente definida como a análise de uma substância ou grupo de substâncias necessárias para, ou fazendo parte de, um processo metabólito particular em um corpo humano ou animal.

metabolômica é também conhecida como análise de metaboloma.

Metabolômica uma disciplina em desenvolvimento que estuda identidades químicas únicas refletindo mudanças metabólicas relacionadas para começo e progressão de doença. Profiling (estabelecimento de perfil) de metabólito, uma área dentro da metabolômica, mensura pequenas moléculas ou metabólitos, contidos em uma célula, tecido ou órgão humanos, que estão envolvidos em

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2/55 metabolismo primário e intermediário.

A informação bioquímica resultante a partir de análise de metabólito revela pontos de extremidade funcionais associados com processos fisiológicos e patofisiológicos, influenciados tanto por predisposição genética e quanto por fatores ambientais, tais como nutrição, exercício ou medicação (Harrigan,

G.G & Goodacre, R.

(2003) Metabolic profiling:

Its role in biomarker discovery and gene function analysis.

Kluwer

Academic

Publishers,

Boston/Dordrecht/London:

Schmidt,

C. (2004), Journal of the National Cancer

Institute, 96, 732-734; Raudys,

S. (2001) Statistical and neural classifiers, Springer

Verlag, London; Daviss, B.

(2005) The Scientist, 19, 25-28)

Profiling de metabólito em combinação com abordagens de garimpagem de dados possuem o potencial para revolucionar diagnósticos clínicos e desenvolvimento de drogas. Em particular, grandes companhias farmacêuticas estão sob pressão contínua para descobrir novos alvos compostos novos, mais eficazes e mais seguros, estabelecer marcadores biológicos (biomarcadores) descoberta de drogas, e geralmente custos mais baixos de desenvolvimento de produtos farmacêuticos.

Conseqüentemente, estas grandes companhias farmacêuticas contam crescentemente com companhias de biotecnologia para preencher esta lacuna de inovações e futuros pipelines.

Neste contesto, inovações bioanalíticas e técnicas de garimpagem de dados irão desempenhar um papel fundamental em economia de custos pela redução de tempo para chegar ao mercado e redução de taxas de depauperação de droga.

Recentemente, devido para o fato de avanços

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significativos em tecnologias de ponta (high-throughput), um conjunto mais abrangente de metaboloma humano - por conseqüência, uma enormemente inexplorada fonte de bioinformação - está agora acessível (Breecher, C. (2003). Em Harrigan, G.G., Goodacre, R. (Ed) . Metabolic profiling: Its role in biomarker discovery and gene function analysis (páginas 311-319). Kluwer Academic Publishers, Boston/Dordrecht/London; DunnW.B., Bailey, N.J. & Johnson, H.E. (2005) Analyst, 130, 606-625). Comparação estatística de perfis de metabólito podem expor modelos multivariados que possuem o potencial de revolucionar o sistema de cuidado da saúde por especificadamente capturar sinais de alerta latente de doenças vindouras antes que quaisquer sintomas de doença venham a se mostrar. Detecção e prevenção antecipada de doença, em oposição para detecção tardia de doença e intervenções terapêuticas dispendiosas, é provavelmente a solução primária para proporcionar cobertura de cuidado da saúde no futuro. Por definição, estes assim chamados marcadores biológicos são objetivamente indicadores mensurados de processos biológicos normais, processos patogênicos ou respostas farmacológicas para uma intervenção terapêutica, e intencionados para substituir em relação a um ponto de extremidade clínico (predisposição benéfica ou prejudicial) fundamentada sobre evidência epidemiológica, terapêutica, patofisiológica ou outra evidência científica (Biomarkers Definitions Working Group. (2001) Clinical Pharmacology and Therapeutics, 69, 89-95). O interesse na descoberta de novos marcadores biológicos se origina a partir de sua abrangente faixa de aplicações potenciais e de impacto

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4/55 fundamental sobre dinâmicas de indústria farmacêutica e princípios de setor de cuidado da saúde rotineiros. Implementação bem sucedida de marcadores biológicos em descoberta de drogas pode reduzir o tempo e o custo de desenvolvimento de drogas enquanto a aplicação para diagnósticos moleculares irá aperfeiçoar aquiescência de paciente em ajustamentos clínicos e reduzir custos desnecessários resultantes a partir de falsos diagnósticos em adição para detecção tardia de doença (Stoughton, R.B. & Friend, S.H. (2005) Nature Reviews. Drug Discovery, 4, 345350; Morris, M., & Watkins, S.M. (2005). Current Opinion in Chemical Biology., 9, 407-412; McCandless, S.E. (2004).

Primary Care, 31, 583-604).

Tecnologias de profiling de metabólito qualitativas e quantitativas compreendem uma faixa de ferramentas de processamento analítico e de dados avançada, com o objetivo de utilização de marcadores potenciais como um resultado de comparação de componentes de moléculas pequenas de sistemas biológicos. Espectrometria de massa tandem (Tandem mass spectrometry - MS), por exemplo, detecta centenas de metabólitos simultaneamente a partir de quantidades de micro litro de amostras biológicas, tais como a totalidade de sangue, soro, plasma, urina ou outros fluidos corporais a partir de quantidades diminutas, com alta precisão e sensibilidade (Roschinger, W., Olgemoller, B., Fingerhut,

R. , Liebl, B. & Roscher, A. A. (2003). European Journal of

Pediatrics, 162 (Suppl. 1), S67-76; Strauss, A.W. (2004). J

Clin Invest (2004) ; 113: 354-356; Kaltashov, I.A. & Eyles,

S. J. (2005) Mass spectrometry in biophysics: Conformation and dynamics of biomolecules. Wiley). A quantificação é

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5/55 conseguida por referência a uma abrangente faixa de padrões internos apropriados.

Por exemplo, o pedido de patente internacional número WO 03/005628 descreve um método para geração, visualização, interpretando e analisando uma base de dados quantitativa de metabólitos. Adicionalmente, o pedido de patente norte americano número US 2002/0009740 descreve métodos para descoberta de drogas, tratamento de doença e diagnóstico utilizando metabolômica. A patente norte americana número US 6.455.321 descreve um método para interpretação de dados de espectrometria de massa tandem para diagnóstico clínico. A patente norte americana número US 6.258.605 descreve um método analítico para detectar as populações recém-nascidas de acilcarnitina e aminoácidos a partir de amostras de sangue. A patente norte americana número US 6.627.444 descreve um dispositivo de amostragem para auxiliar na calibragem de um instrumento de campo.

Adicionalmente, o pedido de patente norte americano número US 2006/0057554 descreve um dispositivo de coletagem de amostra compreendendo um suporte de apoio de uma matriz de absorção inerte para uma amostra de fluido, em que a matriz preferivelmente compreende analitos inorgânicos selecionados pré-calibrados como padrões internos. Além do mais, o pedido de patente norte americano número US 2003/0199102 apresenta uma bandeja de testagem compreendendo uma pluralidade de células, em que as células contêm um padrão interno de ensaio. A bandeja de testagem é para condução de uma pluralidade de testes sobre um fluido biológico.

De maneira a manipular as amostras biológicas para

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6/55 serem avaliadas dispositivos de amostra adicionais são conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, Tanaka e outros, Clinicai Chemistry 47: 10, 1829-1835 (2001) descrevem um dispositivo de amostragem de sangue de microvolume com baixa hemólise e alto rendimento de consistência de componentes de soro.

Entretanto, os dispositivos de amostra conhecidos mostram diversas desvantagens. Em particular, o dispositivo descrito na patente norte americana número US 6.627.444 10 está projetado para liberação de compostos de calibragem por intermédio de aquecimento unicamente. Este dispositivo está também projetado exclusivamente para calibragem de um instrumento.

Outros dispositivos, como o dispositivo apresentado no 15 pedido de patente norte americano número US 2006/0057554 falha para utilização de compostos orgânicos idênticos marcados com isótopos estáveis pré-englobados em um dispositivo especialmente projetado para extração e derivação.

Em vista dos problemas do estado da técnica como anteriormente citados, é um objetivo da presente invenção o de proporcionar para uma análise quantitativa aperfeiçoada de um perfil de droga ou um perfil de metabólito em uma amostra biológica, isto é, de concentrações primariamente de endógenos, mas não excluindo compostos exógenos como drogas e metabólitos da mesma e metabólitos a partir de diversas amostras biológicas, sendo altamente eficiente e confiável. Além do mais, é um objetivo da presente invenção o de proporcionar para uma análise aperfeiçoada como 30 mencionada anteriormente sendo relativamente livre de sal,

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7/55 o que é um requerimento para análise de espectrometria de massa. Em particular, é um objetivo da presente invenção o de proporcionar para um dispositivo de preparação de amostra que pode ser utilizado para a análise quantitativa de um perfil de droga e/ou de metabólito em uma amostra biológica. Além do mais, é também um objetivo da presente invenção o de proporcionar para uma inserção para um tal dispositivo, um kit compreendendo o dispositivo e um aparelho contendo o dispositivo.

RESUMO DA PRESENTE INVENÇÃO

Os problemas subjacentes à presente invenção foram surpreendentemente solucionados em concordância com a presente invenção compreendendo os aspectos posteriormente.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma inserção para um dispositivo adequado para a análise quantitativa de um perfil de droga e/ou um perfil de metabólito em uma amostra biológica compreendendo: (a) um suporte impregnado com (b) pelo menos um padrão interno.

Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um dispositivo para a análise quantitativa de um perfil de

droga e/ou de metabólito	em uma	amostra	biológica
compreendendo: (a) um ou	mais	poços ou	redomas,	e (b) uma
inserção em concordância	com o	primeiro	aspecto	da presente
invenção.
Em um terceiro	aspecto, a	presente	invenção

proporciona um padrão interno para a análise quantitativa de um perfil de droga e/ou de metabólito em uma amostra biológica estando encapsulada e adequada para ser empregada em concordância com o primeiro aspecto da presente invenção.

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Em um quarto aspecto, a presente invenção proporciona um kit para a análise quantitativa de um perfil de droga e/ou de metabólito em uma amostra biológica compreendendo o dispositivo em concordância com o segundo aspecto da presente invenção.

Em um quinto aspecto, a presente invenção proporciona um aparelho para a análise quantitativa de um perfil de droga e/ou de metabólito em uma amostra biológica

compreendendo:	(a) uma unidade de tratamento para
preparação da	droga e/ou metabólito a serem detectados
compreendendo:	(a1) um sistema de manipulação de líquido
automatizado,	e (a2) pelo menos um dispositivo em

concordância com o segundo aspecto da presente invenção para derivatização das drogas e/ou metabólitos presentes na amostra biológica e para extração subseqüente dos derivados; (b) um espectrômetro de massa para a análise fundamentada em espectrometria de massa de alvo quantitativo, e (c) base de dados para armazenamento de resultados da análise.

Em um sexto aspecto, a presente invenção proporciona um método para a análise quantitativa de um perfil de droga e/ou de metabólito em uma amostra biológica empregando a inserção, e/ou o dispositivo, e/ou o padrão interno, e/ou o kit, e/ou o aparelho da presente invenção.

REFERÊNCIA PARA AS FIGURAS ANEXAS DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção irá ser descrita em maiores detalhes posteriormente, de uma maneira não limitante, para fins de exemplificação, com referência para os desenhos acompanhantes, nos quais:

A Figura 1 descreve uma vista da seção transversal de

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9/55 um dispositivo singular em concordância com a presente invenção contendo poços ou redomas e suas montagens a partir de componentes individuais. O número de referência (1) mostra um poço/redoma. O número de referência (2) mostra uma inserção em concordância com a presente invenção compreendendo uma fase estacionária de imobilização de vidro, celuloses ou outro material adequado (isto é, um suporte poroso) contendo padrões internos com (micro) emcapsulização opcional; o número de referência (3) mostra um retentor (uma contenção) para conter o suporte poroso no poço ou redoma, que é quimicamente inerte para derivados e solvente; o número de referência (4) mostra um filtro; o número de referência (5) mostra uma saída, que abre sob pressão de força centrifuga ou gravitacional ou de vácuo.

A Figura 2 descreve um scan 135 de perda neutra em modo negativo utilizando espectrometria de massa tandem de íon de derivados de ácido amino feniltiouréia (PTU), mostrando aminoácidos a partir de uma amostra de célula vermelha de sangue e seus correspondentes padrões internos de isótopo estável preparados com o dispositivo múltiplo descrito no Exemplo 2.

A Figura 3A descreve um scan 184 de precursor em modo de íon positivo (A), mostrando a habilidade de dispositivos múltiplos para extração de fosfolipídios a partir de uma amostra de célula vermelha de exemplo, esfingomielinas e observáveis na faixa de m/z sangue do Exemplo 2. Por fosfatidilcolinas são de 700 - 840, e liso fosfatidilcolinas na faixa de m/z de 400 - 650.

A Figura 3B descreve um scan de MRM (monitoramento de reação múltipla) em modo de íon positivo do Exemplo 2.

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A Figura 4 descreve um exemplo de como drogas de imunoterapia Sirolimus, Everolimus, Ciclosporina A. Tacrolimus, e padrões internos de Ascomicina e Ciclosporina D a partir de uma amostra de sangue de controle de qualidade são analisadas com LCMS para geração de dados quantitativos. A área sob os picos integrados do padrão interno de Ciclosporina D e Ascomicina, de concentrações conhecidas, é utilizada para comparação contra a área sob o pico dos imunodepressores nas cinco amostras de controle de qualidade contendo quantidades de concentração conhecidas. Isto proporciona uma mensuração de precisão para todas as quatro drogas.

A Figura 5 descreve uma curva de calibrador a partir de calibradores para Sirolimus obtida a partir de dispositivo múltiplo com inserção de celulose (Exemplo 3).

A Figura 6 descreve uma curva de calibrador a partir de calibradores para Everolimus obtida a partir de dispositivo múltiplo com inserção de celulose (Exemplo 3) .

A Figura 7 descreve uma curva de calibrador a partir de calibradores para Ciclosporin A obtida a partir de dispositivo múltiplo com inserção de celulose (Exemplo 3) .

A Figura 8 descreve uma curva de calibrador a partir de calibradores para Tacrolimus obtida a partir de dispositivo múltiplo com inserção de celulose (Exemplo 3) .

As Figuras são somente representações esquemáticas e a presente invenção não está limitada para estas concretizações.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção irá ser descrita em maiores detalhes aqui posteriormente por se fazer referência para

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11/55 suas concretizações particularmente preferidas.

A presente invenção basicamente se refere a um dispositivo simples contendo padrões internos prémensurados (compostos de referência em geral) em uma redoma ou poço, para os quais amostras biológicas a serem mensuradas podem ser adicionadas para tratamento adicional e eventual análise, por exemplo, pela espectrometria de massa. O dispositivo compreende uma inserção que pode ser porosa e contém um ou mais padrões internos de quantidades molares conhecidas. Adicionalmente, estes padrões internos podem também ser encapsulados/englobados em uma matriz de proteção para prolongar a vida de concha (cápsula). A matriz de proteção compreende, mas não se limita, tanto a uma fosfatidilcolina não ocorrendo naturalmente, um polímero de polietileno glicol ou um glicerol viscoso ou solução de sorbitol. O dispositivo pode ser utilizado para análise de um perfil de metabólito e/ou para análise de um perfil de droga (isto é, monitoramento de droga terapêutica, TDM) em uma amostra biológica. Por conseqüência, deveria ser compreendido que mesmo se a presente invenção venha a ser descrita a posteriormente para a análise de um perfil de metabólito, a presente invenção não está limitada para a mesma. Exatamente em contraste, as mesmas considerações também se aplicam para a análise de um perfil de droga.

Posteriormente, os componentes constituintes do dispositivo em concordância com a presente invenção, e bem como a utilização do dispositivo irão ser explicados.

O dispositivo em concordância com a presente invenção contém (A) uma ou mais poços/redomas e (B) pelo menos uma

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12/55 inserção. Referida inserção compreende (a) um suporte que está (b) impregnado com pelo menos um padrão interno. A inserção está indicada como número de referência (2) na Figura 1.

Inserção

O termo “inserção como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser o suporte poroso contendo os padrões internos com um protetor químico opcional. A inserção pode possuir qualquer forma geométrica tanto quanto a inserção venha a se adaptar para o poço ou redoma do dispositivo. Em uma concretização preferida da presente invenção, a inserção está disposta dentro do poço ou redoma do dispositivo pela utilização de um retentor (uma contenção). Referido retentor está indicado como número de referência (3) na Figura 1. Em uma concretização particular preferida da presente invenção, o retentor (3) possibilita que a inserção venha a estar disposta dentro do poço sem qualquer contato direto entre a inserção e o poço. Por conseqüência, a inserção está localizada acima do fundo do poço preferivelmente dentro de uma distância de 2 mm até 10 mm, mais preferivelmente de 3 mm até 5 mm pela utilização do retentor. Em outras palavras, em uma concretização preferida da presente invenção, existe uma assim chamada “fenda (folga) ou “distância entre o fundo do poço e a inserção e/ou entre as paredes do poço e a inserção. Como o retentor na concretização preferida da presente invenção, qualquer retentor é adequado tanto quanto este retentor venha a possibilitar a formação da fenda entre o fundo do poço e a inserção. Uma tal disposição possibilita para que a área de superfície máxima

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13/55 do suporte venha a precipitar as amostras em cima dele. O projeto adicionalmente assegura que a inserção venha a ser completamente acessada pelo fluxo de ar ou outro gás de secagem em torno da inserção para garantia de rápida secagem de amostra depois de aplicação. Este projeto principalmente também assegura que a inserção venha a ser completamente acessada pelo fluxo de solvente a partir de todos os lados garantindo extração de metabólito ou de droga a partir da amostra com proteína minimizada ou contaminantes de sal. Por conseqüência, os poros do suporte possibilitam que uma reação (derivatização) venha a prosseguir dentro do suporte em si mesmo, minimizando aplicação de solvente e também subseqüente remoção como evaporação de derivado em excesso e solventes é proporcionada pela área de superfície máxima para circulação de gases de secagem (ar ou nitrogênio) em torno da amostra. A área da superfície aumentada e mobilidade de solvente em torno da integridade de suporte também assegura elevadas eficiências de extração utilizando solventes apropriados. Em outras palavras, a fenda anteriormente mencionada possibilita uma disposição quase livre da inserção dentro do poço e uma circulação aperfeiçoada de fluidos fluindo através do poço.

Além do mais, em concordância com uma concretização preferida da presente invenção, o dispositivo pode compreender mais do que uma inserção disposta em pilhas, em que as respectivas inserções estão mais preferivelmente dispostas com a fenda anteriormente mencionada entre cada uma delas de maneira a possibilitar a circulação de fluidos.

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Suporte

O suporte, como utilizado na presente invenção, pode ser qualquer suporte, preferivelmente com pelo menos um grau médio de porosidade, preferivelmente um alto grau de porosidade. Um tal suporte, em princípio, é conhecido no estado da técnica e também comercialmente disponível.

A porosidade φ de um meio (isto é, do suporte) é definida para ser a proporção do volume não sólido para o volume total de material, e é definida pela relação:

f = Vp / V_m onde Vp é o volume não sólido (poros e líquido) e Vm é o volume total de material, incluindo as partes sólidas e não sólidas.

Por conseqüência, porosidade é um valor entre 0 e 1, tipicamente estando na faixa a partir de menos do que 0,01 para granito sólido para mais do que 0,5 para turfa e argila, embora porosidade possa ser também ser representada em termos de percentagem pela multiplicação da fração por 100 %. O suporte poroso da presente invenção possui uma porosidade de pelo menos 30 %, mais preferivelmente de pelo menos 50 %, e até mesmo mais preferivelmente de pelo menos 70 %, e o mais preferivelmente de pelo menos 90 %.

O suporte poroso, como utilizado na inserção, pode ser de qualquer material adequado, mas o suporte é preferivelmente um suporte sólido. Mais preferivelmente, o suporte poroso é compreendido de um material sorvente para líquidos (também chamado material sorvente líquido). Ainda mais preferivelmente, o suporte é constituído do material sorvente líquido. O material sorvente pode ser um absorvente ou um material absorvente.

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Um material sorvente líquido como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser qualquer material que possibilita que soluções de padrões internos e subseqüentes amostras para análise venham a ser absorvidas ou absorvidas uniformemente através de todos os poros adicionalmente possibilitando executar remoção de solvente pela evaporação.

O líquido possibilitado para ser adsorvido ou absorvido pelo material de suporte pode ser qualquer espécie de líquido, mas este líquido é preferivelmente um líquido volátil em pressão atmosférica, por exemplo, um líquido possuindo um ponto de ebulição menor do que cerca de 250 graus Centígrados (⁰C) em pressão atmosférica.

Mais preferivelmente, o material sorvente líquido em concordância com a presente invenção compreende pelo menos um de um material de carbohidrato, tal como material de celulose, fibras de vidro, pérolas de vidro, gel de poliacrilamida, polímero inerte de plástico poroso e grafite poroso. O referido material sorvente poroso pode mais preferivelmente ser compreendido de um material de carbohidrato ou derivado do mesmo, tais como agarose, agar, celulose, dextrana, quitosana, ou konjac, carragenana, gelana, ou alginato. O material sorvente líquido é, entretanto, o mais preferivelmente feito de celulose ou fibras de vidro.

A configuração do suporte ou material sorvente líquido não é particularmente limitada, mas preferivelmente é de uma dimensão circular, quadrada ou enrolada ou náutila (argonauta). Em concordância com a presente invenção, a configuração do suporte ou material sorvente está adaptada para a configuração do poço ou

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16/55 redoma do dispositivo. Como mencionado, o suporte poroso ou material sorvente pode ser fixado ou assegurado em sua posição no poço ou redoma por uma estrutura de fixação tal como um retentor [indicado como (3) na Figura 1 ] .

O suporte poroso compreendendo o material sorvente líquido principalmente possui duas funções. A primeira é a de embutir os padrões internos (material de referência) como descrito posteriormente em concentração pré-definida pronta para adição da amostra biológica. A segunda é a de imobilização dos conteúdos de cada amostra. Esta etapa de imobilização induz lise (dissolução, destruição) de célula, imobilização/precipitação de proteína e sal e muitas outras retenções de droga ou de metabólito a partir de cada uma das amostras. A porosidade do suporte é então essencial para máxima exposição tanto para agentes de derivatização e quanto também para o solvente de extração a ser adicionado para a análise.

Padrão Interno

Um padrão interno, como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser quaisquer materiais de referência de quantidades absolutas conhecidas que são utilizados para comparações com compostos similares ou idênticos de maneira a quantificar quantidades desconhecidas de compostos presentes em uma determinada amostra. Preferivelmente, o padrão interno é um padrão interno orgânico. Padrões internos, como utilizados na presente invenção, podem pertencer para o mesmo grupo ou família de compostos a serem analisados na amostra biológica. Entretanto, eles são preferivelmente marcados com isótopos de maneira a apropriadamente possibilitar uma

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17/55 distinção entre os metabólitos da amostra e o padrão interno. Qualquer outra maneira de distinção dos metabólitos da amostra a partir dos padrões internos, entretanto, pode também ser utilizada. Por exemplo, 5 compostos ocorrendo não naturalmente podem também ser utilizados como padrões internos.

Exemplos específicos para o padrão interno, como utilizado na presente invenção, estão listados na Tabela 1 abaixo.

Ver TABELA 1 nas próximas páginas 18/55 até 21/55.

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TABELA 1

Lipídios

Abreviação	Nome completo	Comentários
		Comprimento de cadeia de ácido graxo
SM (d18:1/6:0)	N-hexanoil-esfingo-4-enina-1- fosfocolina	6
GPCho (9:0/0:0)	1-nonanoil-sn-glicero-3- fosfocolina	9
GPCho (14:0/14:0)	1,2-ditetradecanoil-sn-glicero-3fosfocolina	28
GPlns (16:0/16:0)	1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3- fosfo-(1'-mio-inositol)	32
GPCho (20:0/20:0)	1,2-di-(3,7,11,15-tetrametil hexadecanoil)-sn-glicero-3fosfocolina	40
GPSer (20:0/20:0)	1,2-di-(3,7,11,15-tetrametil hexadecanoil)-sn-glicero-3fosfoserina	40
GPSer (6:0/6:0)	1,2-dihexanoil-sn-glicero-3fosfoserina	12

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TABELA 1 - continuação

Amino ácidos

Abreviação	Nome completo	Comentários
13C2-15N-Gli	13C2-15n-glicina
D4-DL-Ala	D4-DL-alanina
15N2-L-Argl	15N2-L-arginina HCl
D3-DL-Asp	D3-DL-ácido aspártico
15N2-L-Asn	15N2-L-asparagina H2O
D3-L-Glu	D3-L-ácido glutâmico
D5-L-Gln	D5-L-glutamina
13C6-L-His	13C6-L-histidina H2O
13C6-L-Ile	13C6-L-isoleucina
13C-L-Lis	13C-L-lisina 2HCl
D3-L-Met	D3-L-metionina
D6-L-Orn	D6-L-ornitina HCl
D5-L-Fe	D5-L-fenilalanina (anel 5-fenila)
D7-L-Pro	D7-L-prolina
D3-DL-Se	D3-DL-serina
13C4-L-Tir	13C4-L-treonina
15N2-L-Trp	15N2-L-triptofano
D4-L-Tir	D4-L-tirosina (anel 5-tirosina)
D8-DL-Val	D8-DL-valina

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TABELA 1 - continuação

Acilcarnitinas

Abreviação	Nome completo	Comprimento de cadeia lateral
D3-C0	[d3-metil]-carnitina.HCl	C = 0
D9-D0	[d9-trimetil]-carnitina.HCl	C = 0
D3-C2	[d3]-acetil-L-carnitina.HCl	C = 2
D3-C3	[3,3,3-d3]-propionil-L- carnitina.HCl	C = 3
D3-C4	[4,4,4-d3]-butiril-L- carnitina.HCl	C = 3
D7-C4	[d7]-isobutiril-L-carnitina.HCl	C = 4
D3-C5	[5,5,5-d3]-valeril-L- carnitina.HCl	C = 4
D9-C5	[d9]-isovaleril-L-carnitina.HCl	C = 5
D3-C6	[6,6,6-d3]-hexanoil-l- carnitina.HCl	C = 6
D3-C8	[8,8,8-d3]-octanoil-L- carnitina.HCl	C = 8
D3-C10	[10,10,10-d3]-decanoil-L-carnitina.HCl	C = 10
D3-C12	[12,12,12-d3]-dodecanoil-L-carnitina.HCl	C = 12
D3-C14	[14,14,14-d3]-tetradecanoil-L- carnitina.HCl	C = 14
D3-C16	[16,16,16-d3]-hexadecanoil-L- carnitina.HCl	C = 16
D3-C18	[18,18,18-d3]-octadecanoil-L- carnitina.HCl	C = 18

Monossacarídeos de redução

Abreviação	Nome completo	Comentários
13C6-Glc	13C6-glucose

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21/55

TABELA 1 - continuação

Piruvato/Lactato

Abreviação	Nome completo	Comentários
13C3-Pir	13C3-piruvato

Creatinina

Abreviação	Nome completo	Comentários
	[d3-metil]-creatinina

Imunodepressores

Abreviação	Nomes completos	Comentários
	ascomicim
	ciclosporina D
	3 2-de smetoxi rapamicina

Amostra biológica

A amostra biológica, como utilizada na presente invenção, deveria ser compreendida para ser qualquer amostra de, relacionada para, provocada por, ou afetando a vida ou organismos vivos, processos biológicos, tais como crescimento e digestão.

Exemplos de uma amostra biológica podem incluir, mas não estão limitados a sangue, sobrenadante de cultura de célula, saliva, lágrimas, urina, sangue, soro, plasma, suor, fluidos vaginais, sêmen (esperma), muco, leite

Petição 870180152549, de 19/11/2018, pág. 30/69

22/55 materno, ascites, linfa, efusão de pleura, fluido sinovial, medula óssea, fluido de coluna cervical, e lavagens a partir de cavidades corporais (por exemplo, lavagem bronquial), cabelo, tecido, ossos, ou dentes.

Preferivelmente a amostra biológica é uma amostra líquida. Mais preferivelmente, a amostra biológica é sangue, e o mais preferivelmente sangue humano. Líquido significa um estado de matéria com volume definido, mas sem nenhuma configuração definida em 25 ⁰C, tal como água.

Perfil de metabólito

Um perfil de metabólito, como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser qualquer definido conjunto de valores de resultados quantitativos para metabólitos que podem ser utilizados para comparação para valores ou perfis de referência derivados a partir de uma outra amostra ou de um grupo de amostras. Por exemplo, um perfil de metabólito de uma amostra a partir de um paciente doente poderia ser significativamente diferente a partir de um perfil de metabólito de uma amostra a partir de um paciente saudável similarmente emparelhado.

Metabólitos, tais como, mas não limitados para, aminoácidos, peptídeos, acilcarnitinas, monossacarídeos, lipídios e fosfolipídios, prostaglandinas, ácidos hidroxieicosatetraenoicos, ácidos hidroxioctadecadienoicos, esteróides, ácidos de bile e glico-ácidos e fosfolipídios podem ser detectados e/ou quantificados.

Exemplos de metabólitos que são receptivos para análises de espectrometria de massa em concordância com a presente invenção estão listados na Tabela 2. Em particular, espécies de lipídios a partir de C4:X até C46:X

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23/55 (onde X é o grau de saturação, estão na faixa a partir de 0 até 8) em qualquer determinado resíduo de ácido graxo estão mostrados. Os lipídios incluem também esfingolipídios e glicoesfingolipídios.

Aminoácidos, que podem ser detectados e quantificados, são aminoácidos proteogênicos ou não proteogênicos. Os aminoácidos proteogênicos e os aminoácidos não proteogênicos, como indicado na Tabela 2, são preferidos.

Acilcarnitinas a partir de C4:X para C18:X (onde X é o grau de saturação, estão na faixa a partir de 0 até 8 em qualquer determinado resíduo de ácido) podem ser detectadas e/ou analisadas. Exemplos para acilcarnitinas que são preferidas estão também listados na Tabela 2.

Monossacarídeos são preferivelmente carboidratos de 15 redução ou carboidratos de não redução. Exemplos de monossacarídeos estão também listados na Tabela 2.

Ver TABELA 2 nas próximas páginas 24/55 até 27/55.

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24/55

TABELA 2

Lipídios

Abreviação	Nome completo de subtipo de lipídio	Comentários
	Glicerofosfolipídios,	Comprimento
	esfingolipídios e	de cadeia de
	glicoesfingolipídios	ácido graxo
Sph	esfingosina	Nome
Cer	ceramida	C6:X - C36:X
SM	esfingomielina	C6:X - C36:X
Sph pchol	esfingosilfosforilcolina	Nome
Sph dh	dihidrosfingosina	Nome
PC	fosfatidilcolina	C4:X - C46:X
PI	fosfatidilinositol	C4:X - C46:X
PS	fosfatidilserina	C4:X - C46:X
PC (a)	lisofosfatidilcolina	C4:X - C32:X
PI (a)	lisofosfatidilinositol	C4:X - C32:X
PS (a)	lisofosfatidilserina	C4:X - C32:X
PC (e)	plasmenilfosfatidilcolina	C4:1 - C32:X
PC (e)	plasmanilfosfatidilcolina	C4:0 - C32:0

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25/55

TABELA 2 - continuação:

Aminoácidos

Aminoácidos proteinogênicos

	Abreviação	Nome completo	Comentários
A	Ala	alanina
D	Asp	ácido aspártico
E	Glu	ácido glutâmico
F	Fe	fenilalanina
G	Gli	glicina
H	His	histidina
	Xle	leucinao/isoleucina
K	Lis	lisina
M	Met	metiomina
P	Pro	prolina
R	Arg	arginima
S	Ser	serina
T	Thr	treonina
V	Val	valina
W	Trp	triptofano
Y	Tir	tirosina
	ADMA	dimetil arginina assimétrica	método LC MS
	SDMA	dimetil arginina simétrica	método LC MS
Q	Gln	glutamina
N	Asn	asparagina
		nitrotirosina	método LC MS
		hidroxiprolina	método LC MS
		quinurenina	método LC MS
		3-hidroxi quinurenina	método LC MS

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26/55

TABELA 2 - continuação

Aminoácidos não proteinogênicos

	Abreviação	Nome completo	Comentários
O	Orn	ornitina
	Cit	citrulina

Acilcarnitinas

Abreviação	Nome completo	Comentários
CO	carnitina (carnitina livre)	CO
C2:X até C18:X	acilcarnitina	C0:X até C26:X
C3:X-OH até	hidroxilacilcarnitina	C3-OH até
C18:2-OH		C18:2-OH
C3:0-DC até	dicarboxiacilcarnitinas	C3:0-DC até
C18:2-DC		C12:0-DC

Monossacarídeos de redução

Abreviação	Nome(s) completo(s)	Comentários
H	hexose
P	pentose
dH	desoxihexose

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27/55

TABELA 2 - continuação

Outros

Abreviação	Nome completo	Comentários
Cr	creatinina
	espermidina	método LC MS
	espermina	método LC MS
	putrescina	método LC MS
	dopamina	método LC MS
	serotonina	método LC MS
	prostaglandinas	método LC MS
	hidroxieicosatetraeneoico (HETEs)	método LC MS
	hidroxioctadecadienoico(HODEs)	método LC MS
	leucatrienos	método LC MS
	tromboxanos	método LC MS
	ácidos de bile	método LC MS
	esteróis	método LC MS
	colesteróis	método LC MS
	vitaminas e co-fatores
	drogas e metabólitos de drogas	método LC MS

Perfil de droga

Um perfil de droga, como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser qualquer definido conjunto de valores de resultados quantitativos 10 para uma ou mais drogas ou metabólitos de drogas em uma amostra especificada. Alem do mais, imunodepressores como exemplos específicos podem também ser detectados e

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28/55 quantificados. Por exemplo, um perfil de droga de um paciente de transplante deveria determinar ao médico as quantidades de circulação imediata de uma ou mais terapias de drogas em utilização, e dosagens futuras poderiam conseqüentemente ser aumentadas ou diminuídas em concordância com as quantidades mensuradas para conseguir a melhor faixa terapêutica. Uma tal análise é designada como monitoramento de droga terapêutica (TDM) . Imunodepressores em concordância com a presente invenção são para serem compreendidos como drogas que podem ser utilizadas em terapia imunodepressiva para inibir ou prevenir atividade do sistema imunológico. Clinicamente, elas são utilizadas para prevenir a rejeição de órgãos e tecidos transplantados e em tratamento de doenças autoimunes tais como artrite reumática, miastenia grave, lupus eritematoso sistêmico, doença de Crohn, e colite ulcerativa. Imunodepressores, como aqui definidos, fundamentalmente podem ser classificados em quatro grupos:

glucocorticóides, citoestáticos, anticorpos, drogas atuando sobre imunofilinas.

utilizado na

Exemplos preferidos de imunodepressores, como presente invenção, são Ciclosporina A,

Sirolimus, Everolimus e Tacrolimus.

Encapsulação dos Padrões

O padrão interno, em concordância com a presente invenção, é preferivelmente encapsulado com um material de revestimento ou material de proteção protegendo o padrão interno a partir de degradação e reatividade química previamente para utilização. A proteção do padrão interno a partir de degradação e reatividade química pode prevenir muitas formas de interrupção ou modificação química do

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29/55 padrão interno, tal como prevenção da ação de luz solar, temperatura, e microorganismos, em particular, prevenção a partir de qualquer processo que transforma o padrão interno em produtos de interrupção ou de degradação, por intermédio disso influenciando o resultado (a conseqüência) de uma análise quantitativa.

Um material de proteção/revestimento, como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser qualquer material para proteção (formação de escudo) ou projetado para proteger (criar escudo para) o(s) padrão(ões) interno(s) contra degradação.

O material de proteção/revestimento em concordância com a presente invenção pode ser qualquer material adequado para proteção do padrão interno a partir de uma influência ambiental como mencionado anteriormente. O material de revestimento em concordância com a presente invenção preferivelmente compreende pelo menos um de um polímero, um composto de formação de micela, um composto de formação de lipossoma e um composto polihidroxi, ou quaisquer misturas dos mesmos.

Se o material de revestimento é um polímero, referido polímero, como utilizado na presente invenção, não está particularmente limitado, e está compreendido para ser um composto orgânico de alto peso molecular, tal como possuindo um peso molecular de peso médio de pelo menos 500 g/mol ou de pelo menos 1.000 g/mol ou de pelo menos 5.000 g/mol ou de pelo menos 10.000 g/mol, que é tanto natural ou quanto sintético, cuja estrutura pode ser representada por uma pequena unidade repetida de um monômero. Um polímero sintético é formado de uma maneira conhecida no estado da

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30/55 técnica, tal como por reação de polimerização de adição ou de condensação de monômeros. O polímero em concordância com a presente invenção pode também ser um copolímero, quando dois ou mais diferentes monômeros estão envolvidos.

Um homopolímero é um polímero que é formado a partir de somente um tipo de monômero.

O polímero em concordância com presente invenção preferivelmente um homopolímero ou copolímero de polialquileno glicol ou uma mistura dos mesmos. O peso molecular de peso médio é preferivelmente de cerca de 1.000 daltons (Da). Mais preferivelmente, polímero em concordância com a presente invenção um polietileno glicol (PEG) ou polipropileno glicol (PPG) , preferivelmente

PEG 1000 possuindo um peso molecular de peso médio de cerca de 1.000 Da, na medida em que este solúvel ou miscível com solventes altamente polares menos polares até solventes não polares.

Se o material de revestimento é um composto de formação de micela, referido composto, como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser qualquer composto que pode induzir agregação submicroscópica de moléculas, como gotículas em um sistema coloidal. O composto de formação de micela em concordância para a presente invenção é preferivelmente um surfactante.

Um surfactante, como utilizado na presente invenção, é compreendido para ser qualquer composto químico que reduz a tensão de superfície entre dois líquidos; ou qualquer agente ativo de superfície que aumenta as propriedades de emulsificação, espumação, dispersão, espalhamento e umedecimento de um produto, em particular qualquer composto

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31/55 orgânico cujas moléculas contêm um grupo hidrofílico em uma extremidade e um grupo lipofílico na outra extremidade. Surfactantes adequados compreendem surfactantes catiônicos, aniônicos, não iônicos, e anfotéricos. Preferivelmente, o surfactante é fosfatidil (C17:0)2.

Se o material de revestimento é um composto de formação de lipossoma, referido composto, como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser qualquer composto que pode construir vesículas microscópicas artificiais consistindo de um núcleo aquoso enclausurado em uma ou mais camadas fosfolipídicas, utilizadas para transportar vacinas, drogas, enzimas, ou outras substâncias para atingir células ou órgãos.

Um fosfolipídio, como utilizado na presente invenção, está compreendido de uma maneira geral no estado da técnica, e deveria compreender lipídio contendo fósforo, tal como lecitina e cefalina, feito de glicerol e ácidos graxos, com um grupo fosfato atado. Mais preferivelmente, o composto de formação de lipossoma é um fosfolipídio, tal como uma fosfatidil colina ou uma fosfatidil etanolamina ou derivados das mesmas.

Se o material de revestimento é um composto polihidroxi, referido composto, como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para compreender pelo menos dois grupos hidroxi. Mais preferivelmente, o composto polihidroxi é sorbitol e/ou glicerol.

Preferivelmente, a encapsulação em concordância com a presente invenção, é uma microencapsulação. Uma microencapsulação, como utilizada na presente invenção, deveria ser compreendida para ser qualquer encapsulação de

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32/55 microcápsulas, que são pequenas, preferivelmente cápsulas microscópicas projetadas para liberar seus conteúdos quando quebradas por pressão, dissolvidas ou fundidas. Em particular, as cápsulas em concordância com a presente invenção preferivelmente possuem um diâmetro de menos do que 100 micrômetros, mais preferivelmente de menos do que 10 micrômetros, e o mais preferivelmente de menos do que 1 micrômetro.

Padrões internos microencapsulados são resistentes (robustos) em termos de armazenamento e transporte embarcado e são estáveis levando-se em consideração processos de oxidação e degradação, e estes possuem uma vida de concha (de cápsula) relativamente longa. A microencapsulação é preferivelmente padronizada para preparação de material de controle de qualidade sintética fundamentado sobre componentes microencapsulados. Isto é tipicamente conseguido pela secagem de padrões internos e outras amostras protegidas abaixo com o material de revestimento em um solvente que é um solvente adequado para estes compostos, como uma mistura de clorofórmio/metanol para fosfolipídios. Tipicamente, adição de água para estas amostras induz que formações de micela e/ou lipossoma venham a ocorrer, e envolvimento destes compostos protegidos de padrão interno ou externo lipofílico então se torna possível em água.

Por exemplo, o dispositivo é preparado como se segue: O padrão interno, dissolvido em um solvente adequado, é pipetado em uma quantidade conhecida em cima de um suporte poroso e secado. Este procedimento é repetido para todo padrão interno ou classe de padrões internos a serem

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33/55 empregados no dispositivo. Se uma encapsulação for proporcionada, como a etapa final, a encapsulação/material de revestimento, preferivelmente em um solvente adequado, é colocada em cima do suporte incluindo os padrões internos (isto é, a inserção) e secada. A inserção é após isso inserida para o poço, preferivelmente pela utilização um recurso de segurar (prender) ou estrutura de fixação, tal como um retentor (uma contenção). Como uma alternativa, o suporte pode ser inserido para o poço antes de pipetar os padrões internos e o material de revestimento opcional em cima do suporte.

Dispositivo múltiplo

Um dispositivo múltiplo, como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser quaisquer dispositivos múltiplos unidos juntamente para formação um dispositivo múltiplo tal como um formato padrão de de lâmina de microtitração.

Uma lâmina de microtitração, como utilizada na presente invenção, deveria ser compreendida para ser qualquer prendedor de amostra plástico utilizado em facilidades de pesquisa biológica ou química. O padrão de lâmina de microtitração foi formalizado pela Society for

Biomolecular Screening tipicamente possui 6, (SBS) em 1.996. Este padrão

24, 96, 384 ou 1.536 poços de amostras dispostos em uma matriz retangular de 2 : 3. O padrão governa (estabelece) dimensões de poço (por exemplo, diâmetro, espaçamento e profundidade) e bem como propriedades de lâmina (por exemplo, dimensões e rigidez).

Para o dispositivo múltiplo, a mesma descrição de componentes constituintes, como mencionados anteriormente

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34/55 se aplica. Conseqüentemente, também o dispositivo múltiplo inclui um suporte poroso, tal como celulose ou fibra de vidro como exemplos, preferivelmente retidos (contidos) em pelo menos um poço por uma estrutura de retenção quimicamente inerte. O suporte poroso foi englobado para seus padrões internos em um estado seco; opcionalmente microencapsulado (revestido) com um material de proteção ou de revestimento ou mistura de produtos químicos, por exemplo polietileno glicol 1000, fosfatidilcolina, glicerol ou sorbitol.

O dispositivo em formato múltiplo, aqui nomeado um dispositivo múltiplo, pode também possuir um formato diferente. Pré-englobamento de diversas redomas, como um exemplo 6 poços, determinam um ponto de calibragem 6 com compostos múltiplos de calibragem. Amostras de controle de qualidade contendo concentrações de metabólitos e/ou de drogas múltiplas conhecidas são também pré-englobadas.

Poço

Um poço, utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser qualquer redoma ou tubo consistindo de um material, que é preferivelmente resistente a solvente e derivado, em que uma extração ou reação química pode acontecer.

O um ou mais poços [indicados como número de referência (1) na Figura 1] do dispositivo preferivelmente compreendem pelo menos um filtro [indicado como referência (4) na Figura 1] para separação de sólidos de tamanho mícron, mais preferivelmente exatamente um filtro (4) para separação de sólidos de tamanho mícron. O um ou mais poços do dispositivo preferivelmente compreendem pelo menos uma

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35/55 saída (5) na Figura 1 para descarregamento do filtrado.

Um filtro contido no poço, como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser qualquer material poroso através do qual é passado um líquido ou gás, de maneira a separar o fluido a partir da matéria da partícula suspendida. O filtro (4) possui preferivelmente um tamanho de poro de 50 micrômetros até 0,01 micrômetro, mais preferivelmente 5 micrômetros até 0,1 micrômetro, e ainda mais preferivelmente 1 micrômetro até 0,3 micrômetros. O mais preferivelmente, o filtro (4) possui um tamanho de poro de 0,45 micrômetros.

Preferivelmente em concordância com a presente invenção, o filtro (4) está localizado entre a inserção (2) e a saída (5) .

Além do mais, a saída (5) em concordância com a presente invenção preferivelmente abre sob força centrífuga aplicada ou pressão reduzida, preferivelmente abaixo de 500 mbar. A pressão reduzida é preferivelmente aplicada sobre a lateral da saída (5) do poço (1) . Alternativamente, uma pressão aumentada sobre a lateral da inserção (2) pode ser aplicada de maneira a assegurar um fluxo a partir da inserção (2) para a saída (5) .

Kit

O dispositivo em concordância com a presente invenção pode ser adicionalmente utilizado em um kit para a análise quantitativa de um perfil de droga e/ou de metabólito em uma amostra biológica. Um kit, como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser qualquer sistema de reagentes, solventes, software inclusive do dispositivo possibilitando preparação de metabólitos para

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36/55 análise de alvo quantitativa de uma faixa de metabólitos usualmente em conjunção com um instrumento analítico.

Aparelho

Adicionalmente, o dispositivo em concordância com a presente invenção pode também ser utilizado em um aparelho para a análise quantitativa de um perfil de droga e/ou de metabólito em uma amostra biológica. Referido aparelho compreende (a) uma unidade de tratamento para preparação da droga e/ou metabólito a serem detectados compreendendo (al) um sistema de manipulação de líquido automatizado; e (a2) pelo menos um dispositivo como definido anteriormente para derivatização das drogas e/ou metabólitos presentes na amostra e para subseqüente extração dos derivados; (b) um espectrômetro de massa para a análise fundamentada em espectrometria de massa alvo de quantitativo; e (c) base de dados para armazenamento de resultados das análises.

O aparelho (ou plataforma), como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser qualquer aparelho que possibilita a preparação completa de uma amostra biológica pronta para análise por espectrometria de massa. Este aparelho engloba processos de extração, derivatização, desanilização e concentração. Este aparelho também inclui todas as possíveis combinações de alguns ou de todos destes processos em um método totalmente automatizado, preferivelmente incorporando um sistema de manipulação de líquido em combinação com um dispositivo de centrifugação de amostra, um dispositivo de aquecimento e de resfriamento de amostra, um dispositivo de agitação de amostra, um dispositivo de secagem de amostra, um dispositivo de pipetação de amostra e um dispositivo de

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37/55 homogeneização de amostra.

Um sistema de manipulação de líquido, como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser qualquer dispositivo mecânico que possibilita aspiração de precisão e dispensação de muitos tipos de solventes para as e fora das redomas e lâminas de microtitração. Um sistema de manipulação de líquido pode ser operado por intermédio de um computador e software em um tal sistema de manipulação de líquido.

Uma base de dados ou um banco de dados, como utilizado na presente invenção, deveria ser compreendido para ser qualquer coleção de dados dispostos para cômoda (fácil) e em velocidade (rápida) busca e recuperação de dados.

Uma análise de espectrometria de massa de alvo, como utilizada na presente invenção, deveria ser compreendida para ser análise da espectrometria de massa, em que um ou mais pares de íons presentes são utilizados, especificamente definindo e representando um metabólito conhecido por um modelo (padrão) de fragmentação conhecido que é característico para o analito correspondente, para identificação do metabólito de alvo. As intensidades de íons obtidas são utilizadas juntamente com o padrão interno aprimorado para calcular a concentração do metabólito alvo. O padrão interno é identificado pela utilização de um par de íons característico (ou diversos), suas intensidades de íons obtidas são relacionadas para a concentração conhecida do padrão interno possibilitando a quantificação de um correspondente metabólito alvo. O conjunto de metabólitos alvo é conhecido antecipadamente e pode ser pré-anotado. Conseqüentemente, metabólitos detectados e quantificados

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38/55 estão já anotados possibilitando uma interpretação rápida e direta. Um espectrômetro de massa tandem é particularmente preferido como um espectrômetro de massa capacitado para análises de MSMS para distinguir mais especificamente espécies de íons. Preferivelmente, o aparelho possibilita para preparação de amostra padronizada automatizada e procedimentos analíticos de massa tandem de alta resolução. Em particular, o procedimento de preparação de amostra automatizado aumenta dia a dia reprodutibilidade de resultados confiáveis e diminui coeficientes de variância (CVs). Quando, por exemplo, analisando um açúcar derivado com um scan de íon precursor, o derivado em si mesmo pode ser detectado pelo espectrômetro de massa. Em modo de íon positivo isto é preferivelmente a formação do íon fenilmetilpirazolona (PMP) (MH)+ em m/z 175. A composição do carboidrato em si mesmo ou isômeros discretos são detectáveis.

Quando realizando uma análise metabolômica utilizando o dispositivo em concordância com a presente invenção, uma quantidade de centenas de metabólitos pode ser analisada simultaneamente a partir de quantidades de microlitros de material biológico com alta velocidade, precisão e sensibilidade utilizando etapas pré-analíticas. Dados de qualidade assegurada (QA) são gerados a partir de amostras individuais em questão de minutos e interpretados empregando ferramentas de software estatísticas de borda de corte. Este método também supera até agora gargalos analíticos existentes estreitas através de padronização e automação pré-analíticas, e interpretação de dados estatísticos e bioquímicos amigáveis ao usuário. Esta

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39/55 integração de todos os componentes no método em concordância com a presente invenção em uma nova plataforma de tecnologia irá tornar “identificação bioquímica acessível para aplicação amplamente diversificada e irá estabelecer a diversificação de metabolômica.

Exemplos

A presente invenção irá ser adicionalmente ilustrada pelos Exemplos não limitativos

Preparação e condições do posteriormente.

dispositivo múltiplo

Um dispositivo múltiplo foi preparado utilizando pedaços (spots) de celulose de mm (cortados a partir de cartão genérico

539

859,

Schleicher Schuell

Bioscienses GmbH, Dassel,

Alemanha) como o suporte poroso em cada um dos 96 poços de uma lâmina de microtitração

Solvinert (MSRP N04, Milipore Corp. MA,

USA). Estes foram fixados no lugar com retentores manufaturados feitos a partir de polipropileno (Biocrates, Tirol, Áustria).

Para analisar um subconjunto selecionado de metabólitos, neste caso, aminoácidos, acilcarnitinas e fosfolipídios a partir de uma amostra, uma seleção de padrões internos adequados de aminoácidos, acilcarnitinas e lipídios marcados com isótopos estáveis para representar todos as vinte fosfatidilcolinas proteogênicas, esfingomielinas, e espécies liso (lyso) de cada uma foram utilizados. Estes foram pré-embebidos no suporte poroso do dispositivo múltiplo por quantidades conhecidas pipetadas de cada classe de padrão interno, deixando cada um secar dentro do suporte poroso antes de adicionar a próxima mistura de padrões internos, deixando secar e assim por diante. Neste exemplo, foram adicionadas acilcarnitinas

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40/55 seguidas por aminoácidos e finalmente, uma mistura de padrões internos de fosfolipídios em uma solução de água contendo 0,1 % p/p de polietilenoglicol 1000 (PEG 1000), um composto que serviu a propósitos duplos. Como um surfactante, resíduos de PEG 1000 nos poros do suporte poroso revestindo todos os padrões internos oferecendo uma barreira de proteção para ações degradantes de todo modo de exposição ao oxigênio e à água.

Quando completamente seco, as amostras de validação técnica de dispositivo múltiplo foram então adicionadas para os primeiros cinco poços do dispositivo múltiplo.

Poço 1: um blank;

Poços 2 e 3: misturas de controle de metabólitos não marcados;

Poço 4: um controle de qualidade com metabólitos de baixa concentração (níveis normais ou 1 vez o normal); e

Poço 5: um controle de qualidade com metabólitos de alta concentração (níveis 10 vezes o normal).

O dispositivo múltiplo contendo padrões internos préenglobados com amostras de controle adicionais em poços 1 até 5 é após isso armazenado pronto para utilização em temperatura de 4 ⁰C.

Método de utilização do dispositivo múltiplo [Exemplo 1]

Para propósitos de exemplo somente, o que vem a posteriormente é uma descrição de como o dispositivo como especificado anteriormente é utilizado para processar amostras para análise de uma seleção de metabólitos.

Para analisar um subconjunto de metabólitos, aminoácidos, acilcarnitinas e fosfolipídios a partir de uma

Petição 870180152549, de 19/11/2018, pág. 49/69

41/55 amostra, uma seleção de padrões internos adequados de aminoácidos, acilcarnitinas e lipídios, isótopo estável marcado para representar todos os vinte aminoácidos proteogênicos, os mais abundantes de acilcarnitinas e fosfolipídios incluindo fosfatidilcolinas, esfingomielinas, e espécies liso (lyso) de cada um foram utilizados. Sob adição de uma quantidade pré-definida de amostra, tipicamente 10 μΐ de plasma, os padrões internos e aminoácidos da amostra são misturados dentro dos confins dos poros da inserção. Qualquer tratamento subseqüente que venha a provocar perda ou degradação de metabólitos irá, conseqüentemente, ser correlacionado pelo padrão interno. Derivatização dos aminoácidos pode então acontecer dentro dos confins dos poros da inserção. O reagente de derivatização, neste exemplo, consiste de 15 μΐ de um fenilisotiocinato em uma solução 1:1:1 de piridina, água, etanol. Este processo de derivatização ocorre em temperatura ambiente em menos do que 20 minutos. Na medida em que a solução de derivatização é completamente volátil, esta pode ser simplesmente removida sob uma corrente suave de nitrogênio ou vácuo em temperatura ambiente. A adição de uma solução de metanol contendo 10 mM estratos de acetato de amônio extrai os aminoácidos derivados, acilcarnitinas e os fosfolipídios simultaneamente a partir do dispositivo poroso para o solvente de metanol. A lâmina de microtitração de escolha para este propósito possui propriedades adicionais. Esta possui um filtro de 0,45 mícron e uma saída de líquido, que somente abre sob força centrífuga ou vácuo, construídos para o fundo de cada poço. O extrato de metanol a partir da amostra é então

Petição 870180152549, de 19/11/2018, pág. 50/69

42/55 simplesmente coletado por intermédio de centrifugação em uma lâmina de captura-microtitração, colocada sob o dispositivo contendo lâmina de microtitração. Análise de espectrometria de massa da solução a partir de cada poço então acontece, tipicamente utilizando um instrumento de auto-amostragem para entrega da amostra para o espectrômetro de massa.

[Exemplo 2]

A seguir irá ser demonstrado que o dispositivo pode ser utilizado para processar amostras para análise de uma seleção de metabólitos.

O dispositivo múltiplo sob adição precisa de 10 μΐ de amostras de sangue a partir de um paciente para cada poço é misturado com os padrões internos dentro dos confins dos poros do suporte poroso (inserção). Qualquer tratamento subseqüente que venha a provocar perda ou degradação de metabólitos irá ser, conseqüentemente, correlacionado para o padrão interno. Derivatização foi realizada como no Exemplo 1 e as soluções resultantes a partir de cada poço são então analisadas por métodos de espectrometria de massa, tipicamente utilizando um instrumento de autoamostragem para entrega da amostra para o espectrômetro de massa.

Resultados a partir das mensurações espectrométricas de massa dos metabólitos derivatizados e extraídos com o dispositivo múltiplo estão graficamente representados na Figura 2 e na Figura 3 mostrando os aminoácidos, os fosfolipídios e as acilcarnitinas, respectivamente.

As quantidades dos aminoácidos e metabólitos de acilcarnitina estão mostradas na Tabela 3 posteriormente,

Petição 870180152549, de 19/11/2018, pág. 51/69

43/55 também mostrando a precisão e a variância dos valores obtidos utilizando o dispositivo múltiplo.

Tabela 3 - A precisão e reprodutibilidade de quantidades dos aminoácidos, lipídios, lactato, creatina e glicose a partir de uma amostra única mensurada 10 vezes estão mostradas na Tabela 3 e foram obtidas utilizando o dispositivo múltiplo.

Ver TABELA 3 nas próximas páginas 44/55 até 47/55.

TABELA 3

Petição'870180152549, de 19/11/2018, pág. 52/69

44/55

Amino Ácidos

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69.	44.	352	CD	23.	298	168	412
05	ID	ID			34.4	p		p	1220.8
67.		23.	364	177	282	179	297
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TABELA 3 - continuação

Petição 870180152549, de 19/11/2018, pág. 53/69

45/55

Acilcarnitinas

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TABELA 3 - continuação

Petição 870180152549, de 19/11/2018, pág. 54/69

46/55

Lipídios

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TABELA 3 - continuação

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47/55

Lactato, Glucose e Creatinina

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QA baixo C11	24968	3983	238.50
QA baixo C10	22400	3949	262.74
QA baixo 09	21673	4156	263.16
QA baixo C8	23778	4486	280.19
QA baixo C7	22519	4288	233.51
QA baixo C6	22912	4235	242.64
QA baixo C5	25443	4104	243.48
QA baixo C4	25798	4383	247.02
QA baixo C3	24282	4250	270.39
QA baixo C2	21513	3826	213.62
Nome de Amostra	Lactato	Glucose	Creatinina

[Exemplo 3]

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48/55

Monitoramento de droga terapêutica

Imunodepressores são requeridos para inibir rejeição de órgão depois de transplantação. Os imunodepressores utilizados são Everolimus, Ciclosporina A, Tacrolimus, Sirolimus, e ácido micofenólico. Resultados de monitoramento de droga terapêutica preparados a partir de um dispositivo múltiplo adequadamente preparado similarmente como descrito anteriormente estão mostrados aqui para adicionalmente ilustrar a utilização do dispositivo múltiplo e suporte das reivindicações de patente da presente invenção.

Preparação e condições de dispositivo múltiplo

Este dispositivo múltiplo foi preparado com exatamente o mesmo método como descrito anteriormente, mas ao invés disso utilizando um pedaço (spot) de celulose único de 8 mm (cortado a partir de cartão genérico - 10 539 859, Schleicher Schuell Bioscienses GmbH, Dassel, Alemanha) como o suporte poroso.

Para os dois poços de dispositivos múltiplos foram colocados uma solução de metanol (20 ql) contendo

Everolimus (200 ng/mL) (Sigma, Viena, Áustria), um padrão interno para Sirolimus e Tacrolimus, e Ciclosporina D (400 ng/mL) (Sigma, Viena, Áustria), um padrão interno para

Ciclosporina A, foi pipetado (pipeta Gilson de 20 ql) em cima dos suportes porosos do dispositivo múltiplo e deixado para secar em temperatura ambiente por 30 minutos. Mistura de calibrador e níveis de controle de qualidade I - V (conjunto de calibrador de sangue integral (nível 0 - 6) para imunodepressores, ClinChek R controle de sangue integral para imunodepressores, Recipe Chemicals and

Petição 870180152549, de 19/11/2018, pág. 57/69

49/55

Instruments GmbH, Munique, Alemanha) foram reconstituídos em concordância com instrução de manufaturadores e ambos armazenados em -20 ⁰C. Previamente para utilização, seis soluções de calibrador com concentrações crescentes de Ciclosporina D e Everolimus e cinco soluções de controle de qualidade com diversas concentrações de Ciclosporina A, Tacrolimus, Sirolimus e Everolimus foram degeladas e deixadas alcançar temperatura ambiente em torno de 23 ⁰C. Para seis poços de 20 μΐ de cada um dos seis calibradores foram pipetados (pipeta Gilson de 20 μΐ) em cima de suportes porosos de dispositivo múltiplo. Os cinco controles de qualidade foram pipetados em cinco suportes porosos de poços separados de dispositivo múltiplo. Para o dispositivo múltiplo foi adicionada acetonitrila (grau HPLC) imediatamente (pipeta Gilson de 200 ml) em cima dos suportes porosos de dispositivos múltiplos e instantaneamente agitados com um agitador orbital em menos do que 600 rpm por 30 minutos. O eluente foi coletado pela colocação de uma lâmina de captura de microtitração de capacidade de 300 μΐ sob o dispositivo e após isso centrifugação dos dois em 500 g por 6 minutos. O eluente foi após isso analisado pela técnica de espectrometria de massa fundamentada sobre um método publicado (T. Koal, M. Deters, B. Casetta, V. Kaever, Simultaneous determination of four immunosuppressants by means of high speed and robust on-line solid phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, J. Chromator. B, Analyst. Technol. Biomed. Life Sci. 15 de

Junho de 2.004, 805(2); 215-222). Um exemplo representativo de como os resultados são obtidos e calculados está

Petição 870180152549, de 19/11/2018, pág. 58/69

50/55 apresentado na Figura 4 para análise de Ciclosporina A com LCMS para geração de dados quantitativos. As áreas sob os picos integrados do padrão interno de Ciclosporina D foram utilizadas para comparação contra a área sob o pico do 5 imunodepressor de Ciclosporina A nas cinco amostras de controle de qualidade contendo quantidades conhecidas.

A Figura 5 até a Figura 8 mostram curvas de padrão lineares para todos os quatro imunodepressores de Ciclosporina A, Tacrolimus, Everolimus e Sirolimus utilizando suportes de celulose como inserções dentro do dispositivo múltiplo. A Tabela 4 mostra as concentrações calculadas e as efetivas para comparações de precisão dos cinco materiais de segurança de qualidade analisados.

Ver TABELA 4 na próxima página 51/55.

TABELA 4

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51/55

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Ciclosporina A

Tacrolimus

Aplicabilidade industrial

A presente invenção torna possível uma análise

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52/55 versátil e padronizada de diversos biofluidos e tecidos. Por exemplo, capacidades domésticas rotineiras podem demonstrar preparação de amostra e análise simultâneas e totalmente automatizadas, gerando mais do que 1.000 pontos de dados quantitativos e anotados a partir de 10 μΐ de sangue seco dentro de 6 minutos de tempo de máquina MS cobrindo diversas classes de metabólitos dentro de mais do que 100 rotas anotadas. Conseqüentemente, a presente invenção pela primeira vez supera (ultrapassa) a maior parte dos gargalos em processamentos (pré-) analíticos, de automação e processamento de dados e interpretação que têm proibido a garimpagem de metabolômica quantitativa de se diversificar e de se expandir de forma tão abrangente quanto possível.

Comparada com os métodos analíticos e dispositivos do estado da técnica, a análise quantitativa da presente invenção é extremamente rigorosa (severa) e os resultados são altamente reprodutíveis. Em particular, os dados de metabólito são muito superiores para dados de proteoma ou transcriptoma comparáveis. Apenas 10 μΐ de sangue ou soro ou 20 μΐ de urina ou menos do que 100.000 células de cultura são necessárias.

As características de performance do método analítico e do dispositivo podem satisfazer tanto aplicação de pesquisa (descoberta) e quanto subseqüentemente padrões de diagnóstico clínico. Isto assegura ou torna possível dados assegurados de qualidade, dados padronizados, o que é comparável a partir de laboratório para laboratório, com rápido tempo de retorno, implementação (alvos) “pronto para operar, interpretação e visualização de dados facilmente

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53/55 recebidos e um grau muito alto em automação e padronização (SOPs). Os custos/ponto de dados globais tornam a informação de metaboloma de ordens de magnitudes menos dispendiosas do que informação de proteoma.

A informação quantitativa obtida pelo método ou pelo dispositivo da presente invenção cobre rotas e metabólitos em um contexto sistêmico (sistema biológico) e disposição (estilo) em escala. Conseqüentemente, uma figura funcional representativa ou screen shot (imagem instantânea) ou impressão digital metabólica de metabolismo intermediário pode ser finalmente derivada a partir de fileiras (arrays) de metabólitos marcadores.

Além do mais, informação de extremidade de ponto funcional que é anotada e pode convenientemente ser ligada para fontes de informação do proteoma, transcriptoma e genoma, recrutando informação de metaboloma para necessidades de biologia de sistema.

O dispositivo e o método podem ser utilizados em uma ferramenta integrada (software e analítico) adequada para estabelecer um novo “padrão para geração simultânea de perfis de metabólitos identificados e anotados em grande escala quantitativa e o estudo de modelos de marcadores biológicos múltiplos complexos e dinâmicos.

Além do mais, componentes de hardware comercialmente disponíveis, consistindo de um sistema de manipulação de líquido para preparação de amostra automatizada e padronizada a e um espectrômetro de massa para analíticos MS-MS, podem ser integrados por produtos apropriados e protegidos projetados fundamentados em consumo e software de aplicação, compreendendo procedimentos (pré-) analíticos e módulos

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54/55 inovativos para processamento de dados de qualidade controlada, validação técnica e documentação, análises estatísticas e interpretação bioquímica.

O tempo de preparação de amostra na presente invenção (alvo fundamentado em batelada de 90 amostras/bandeja de microtitração) é somente grosseiramente de 2 h, e irá ser adicionalmente reduzido por intermédio da paralelização através do software programado (agendado). Uma faixa abrangente de padrões internos específicos para quantificação é pré-formulada na química apropriada como parte integral de usualmente uma ou duas etapas de alvos de preparação de reação e aplicação, na medida em que está contido todo o material necessário para QC e QA em combinação com software e SOPs.

Aplicações industriais incluem descoberta e comercialização de marcadores biológicos (biomarcadores) com o objetivo de utilização de marcadores biológicos validados para diagnóstico de doença, eficácia de tratamento ou toxicidade. As aplicações primordiais em desenvolvimento farmacêutico incluem as áreas de metabolismo de droga e farmacocinética, toxicologia e segurança, eficácia de drogas e farmacodinâmica. Outros campos compreendem diagnósticos clínicos e teranósticos, onde, por exemplo, precocemente, diagnóstico sensível e específico e investigação de precisão facilita prevenção de doença ao invés de intervenções dispendiosas e possibilita tratamento personalizado, e onde efeitos terapêuticos podem ser especificadamente monitorados suportando tratamento personalizado. Áreas de aplicação adicionais, incluem, mas não estão limitadas para, indústria de nutrição, bem estar,

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55/55 segurança nacional, e biologia básica.

Em uma concretização preferida da presente invenção, o dispositivo compreende um suporte compreendendo um material sorvente; e uma pluralidade de padrões de metabólitos de espectrometria de massa, orgânicos, impregnados no suporte e secados. Mais preferivelmente, os padrões de metabólitos de espectrometria de massa, orgânicos, compreendem aminoácidos marcados com isótopos estáveis, polipeptídios marcados com isótopos estáveis, ou acilcarnitinas marcadas com isótopos estáveis.

Em uma outra concretização preferida da presente invenção, o dispositivo compreende um suporte compreendendo um material sorvente; uma pluralidade de padrões de drogas de imunodepressores de espectrometria de massa, impregnados no suporte e secados. Mais preferivelmente, os padrões de drogas de imunodepressores compreendem um ou mais de Evorolimus e Ciclosporina D.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência para concretizações específicas, deverá ser observado por aqueles especializados no estado da técnica que a presente invenção não é para ser considerada como estando limitada para as concretizações ilustrativas, preferidas e vantajosas descritas anteriormente, mas certamente, um número de variações e de modificações adicionais é conceptível dentro do escopo de proteção das reivindicações de patente posteriormente.

Claims (5)

REIVINDICAÇÕES

1. Inserção para um dispositivo adequado para a análise quantitativa por espectrometria de massa de um perfil de metabólito em uma amostra biológica, caracterizada por compreender:

(a) um suporte impregnado com (b) pelo menos um padrão interno, em que o padrão interno é um material de referência de quantidade absoluta conhecida, que pertence à mesma família do composto a ser analisado na amostra biológica e é marcado com isótopos.

2/4 um composto polihidroxi.

6. Inserção, de acordo com a reivindicação

5, caracterizada pelo fato de que o encapsulamento é uma micro-encapsulação.

7. Inserção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 e

6, caracterizada pelo fato de que o polímero é um homopolímero ou copolímero de polialquileno glicol ou uma mistura destes, e/ou o composto de polihidroxi é sorbitol e/ou glicerol.

8. Inserção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizada pelo fato de que o polímero é um polietileno glicol (PEG) ou polipropileno glicol (PPG), preferivelmente PEG 1000.

9. Inserção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 e 6, caracterizada pelo fato de que o composto de formação de micela é um surfactante e/ou o composto de formação de lipossoma é um fosfolipídio, preferivelmente uma fosfatidil colina ou uma fosfatidil etanolamina ou seus derivados.

10. Dispositivo para a análise quantitativa de um perfil de metabólito em uma amostra biológica, caracterizado por compreender: (a) um ou mais poços (1), e (b) uma ou mais inserções (2 ^, conforme defino em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, localizadas nos poços (1 ' ; e (c) opcionalmente, um retentor ( (3) para a inserção (2)

no poço (1).

11. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o um ou mais poços (1)

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2. Inserção, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o suporte compreende um material sorvente para líquidos.

3/4 compreende um filtro (4) para separação de sólidos de tamanho mícron, preferivelmente acima de 5 mícron, e uma saída (5) para descarregamento do filtrado.

12. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o filtro (4) está localizado entre a inserção (2) e a saída (5).

13. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 e 12, caracterizado pelo fato de que a saída (5) abre sob força centrífuga aplicada ou pressão reduzida, preferivelmente abaixo de 500 mbar.

14. Padrão interno para a análise quantitativa de um perfil de metabólito em uma amostra biológica, caracterizado por ser encapsulado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 9.

15. Kit para a análise quantitativa de um perfil de metabólito em uma amostra biológica caracterizado por compreender o dispositivo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 13.

16. Aparelho para a análise quantitativa de um perfil de metabólito em uma amostra biológica caracterizado por compreender:

(a) uma unidade de tratamento para preparação dos metabólitos a serem detectados compreendendo:

(a1) um sistema de manipulação de líquido automatizado, e (a2) pelo menos um dispositivo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 13 para derivatização dos metabólitos presentes na amostra e para extração subsequente dos derivados;

(b) um espectrômetro de massa para a análise

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3. Inserção, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o material sorvente compreende pelo menos um de um material de celulose, fibras de vidro, pérolas de vidro, gel de poliacrilamida, polímero inerte de plástico poroso e grafite poroso.

4/4 fundamentada em espectrometria de massa de alvo quantitativo, e (c) base de dados para armazenamento de resultados da análise.

4. Inserção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o padrão interno é encapsulado com um material de revestimento protegendo o padrão interno de degradação e reatividade química antes de utilização.

5. Inserção, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o material de revestimento compreende pelo menos um de um polímero, um composto de formação de micela, um composto de formação de lipossoma e

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5 17. Método para a análise quantitativa de um perfil de metabólito em uma amostra biológica caracterizado por empregar a inserção conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou o dispositivo conforme definido em

qualquer uma das reivindicações 10 a 13, ou o padrão 10 interno conforme definido na reivindicação 14, ou o kit conforme definido na reivindicação 15, ou o aparelho conforme definido na reivindicação 16.

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