NO339319B1 - Anordning for kvantitativ analyse av en metabolittprofil - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse vedrører en anordning, spesielt en prøvepreparerings-anordning for kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve. Enn videre vedrører den foreliggende oppfinnelse et innsett for en slik anordning som er impregnert med minst en intern standard, den interne standarden i seg selv, og et kit omfattende anordningen. Videre vedrører den foreliggende oppfinnelse også et apparat inneholdende anordningen, og en fremgangsmåte for kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve anvendende anordningen.

Bakgrunnsteknikk

Metabolomikk defineres generelt som analysen av en forbindelse eller en gruppe av substanser nødvendige for, eller som tar del i en spesiell metabolsk prosess i en men-neske- eller dyrekropp. Det er også kjent som metabolomanalyse. Metabolomikk er et fagfelt i utvikling som studerer unike kjemiske fingeravtrykk reflekterende metabolske endringer relatert til sykdomsinntreden og fremskridning. Metabolittprofilering, et område innen metabolomikk, måler små molekyler eller metabolitter, inneholdt i en men-neskecelle, vev eller organ, som er involvert i primær og intermediær metabolisme. Den biokjemiske informasjonen resulterende fra metabolittanalyse viser funksjonelle ende-punkter forbundet med fysiologiske og patofysiologiske prosesser, påvirket av både genetisk predisposisjon og miljømessige faktorer, slik som ernæring, trening eller medi-sinering (Harrigan, G. G. & Goodacre, R. (2003) Metabolic profiling: Its role in biomarker discovery and gene function analysis. Kluwer Academic Publishers, Boston/Dordrecht/London; Schmidt, C. (2004), Journal of the National Cancer Institute, 96, 732-734 ; Raudys, S. (2001) Statistical og neural classifiers. Springer -Verlag, London; Daviss, B. (2005) The Scientist, 19, 25-28 ).

Metabolittprofilering i kombinasjon med dataletingstilnærmelsesmåter har potensialet til å revolusjonere klinisk diagnose og legemiddelutvikling. I særdeleshet er store far-masøytiske firmaer under kontinuerlig press for å oppdage nye mål og hittil ukjente, mer virkningsfulle og tryggere forbindelser, og fremskynder biomarkør og legemiddeloppdagelse, og generelt lavere kostnader ved farmasøytisk utvikling. Derfor er de mer og mer avhengig av bioteknologifirmaer for å fylle dette innovative gapet og fremtidige "pipelines". I denne sammenhengen vil innovative bioanalytiske og datagravingsteknik-ker spille en fundamental rolle i å redusere kostnader ved å redusere tid-til-marked og legemiddel "attrition rates".

Nylig, på grunn av signifikante fremskritt i høygjennomstrømningsteknologier, er et bredere sett av det humane metabolomet - foreløpig en i høy grad uutforsket kilde av bioinformasjon - nå tilgjengelig (Beecher, C. (2003). I Harrigan, G. G, Goodacre, R.

(Ed). Metabolic profiling: Its role in biomarker discovery and genefunction analysis (pp. 31 1-319). Kluwer Academic Publishers, Boston/ Dordrecht/Londong ; Dunn,, W.B., Bailey, N.J. & Johnson, H. E. (2005) Analyst, 130, 606-625 ). Statistisk sammenligning av metabolittprofiler kan eksponere multivariate mønstre som har potensial til å revolusjonere helsevesensystemet ved å spesifikt fange latente varselsignaler av kommende sykdommer før noen som helst sykdomssymptomer viser seg. Tidlig sykdomsscreening og forebygging, i motsetning til sen sykdomspåvisning og kostbare terapeutiske intervensjoner, er sannsynligvis den primære løsningen for å ha råd til helsevesendekning i fremtiden. Ved definisjon, er disse såkalte biomarkører "objektivt målte indikatorer av normale biologiske prosesser, patogene prosesser eller farmakologiske responser overfor en terapeutisk intervensjon, og ment å substituere for et klinisk endepunkt (forutsi fordel eller skade) basert på epidemiologiske, terapeutiske, patofysiologiske eller andre vitenskapelige bevis" (Biomarkers Definitions Working Group. (2001) Clinical Pharmacologi and Drugs, 69, 89-95 ). Interesse i oppdagelse av hittil ukjente biomar-kører stammer fra deres vide område for potensielle anvendelser og fundamentale påvirkning på farmasøytisk industris dynamikk og dagens helsevesensektorprinsipper. Suksessfull implementering av biomarkører i legemiddeloppdagelse kan redusere tiden og kostnaden ved legemiddelutvikling, mens anvendelsen til molekylær diagnostikk vil forbedre pasientsamsvar i kliniske omgivelser og redusere unødvendige kostnader resulterende fra falske diagnoser i tillegg til sen sykdomspåvisning (Stoughton, RB. & Friend, S.H. (2005) Nature Reviews. Drug Discovery, 4, 345-350; Morris, M., & Watkins, S. M. (2005). Current Opinion in Chemical Biology., 9, 407-412 ; McCandless, S. E. (2004). Primary Care, 31, 583-604).

Kvalitative og kvantitative metabolittprofileringsteknologier omfatter et område av avanserte analyttiske og dataprosesseringsverktøy, med formålet å benytte potensielle markører som et resultat av sammenligning av små molekylkomponenter av biologiske systemer. Tandem massespektrometri (MS), for eksempel, påviser hundreder av metabolitter samtidig fra mikroliter-kvantiteter av biologiske prøver, slik som helblod, serum, plasma, urin eller andre kroppsvæsker fra små mengder, med høy presisjon og sensitivitet (Roschinger, W., Olgemoller, B., Fingerhut, R., Liebl, B. & Roscher, A.A.

(2003). European Journal of Pediatrics, 162 (Suppl 1), S67-76; Strauss, A.W. (2004) . J Clin Invest 2004; 1 13:354-356; Kaltashov, LA. & Eyles, S.J. (2005) Mass spectrometry in biophysics: Conformation and dynamics of biomolecules. Wiley). Kvantifisering oppnås med referanse til et bredt område av passende interne standarder. For eksempel beskriver WO 03/005628 en fremgangsmåte for å ta frem, se på, tolke og analysere en kvantitativ database av metabolitter. Videre beskriver US 2002/0009740 fremgangsmåter for legemiddeloppdagelse, sykdomsbehandling og diagnose ved anvendelse av metabolomikk. US 6,455,321 beskriver en fremgangsmåte for å tolke tandem massespektrometridata for klinisk diagnose. US 6,258,605 beskriver en analytisk fremgangsmåte for å screene nyfødtpopulasjoners acylcarnitin og aminosyrer fra blod-prøver. US 6,627,444 beskriver en prøvetakingsanordning for å bidra til å kalibrere et feltinstrument.

Videre beskriver US 2006/0057554 en prøvesamlingsanordning omfattende en bærer bærende en inert absorberingsmatrise for en væskeprøve, hvori matrisen fortrinnsvis omfatter pre-kalibrerte valgte uorganisk analytter som interne standarder. Enn videre beskriver US 2003/0199102 en testplate omfattende en samling av celler, hvori cellene inneholder en testet intern standard. Testplaten er for å utføre en samling av tester på en biologisk væske.

For å kunne håndtere de biologiske prøvene som skal evalueres, er videre prøveanord-ninger kjent i den tidligere fagkunnskap. For eksempel beskriver Tanaka et al., Clinical Chemistry 47: 10, 1829- 1835 (2001) en mikrovolum blod-prøvetakingsanordning med lav hemolyse og høyt konsistent utbytte av serumkomponenter.

Dog viser de kjente prøveanordningene flere ulemper. I særdeleshet er anordningen beskrevet i US 6,627,444 utformet for å frigjøre kalibreringsforbindelser kun gjennom oppvarming. Den er også utformet utelukkende for å kalibrere et instrument.

Andre anordninger lignende anordningen beskrevet i US 2006/0057554 svikter i å an-vende identiske organiske forbindelser merket med stabile isotoper preinnkapslet i en spesielt utformet anordning for ekstrahering og derivatisering.

Dokumentene US 2005/112635 og WO 2005/031304 vedrører en fremgangsmåte for å kvantifisere mengden av minst én analytt i prøven, omfattende de følgende trinn: (a) tilføre en kjent mengde av minst én dendrimer til prøven; (b) kvantifisere nivået av minst én analytt og den minst éne dendrimer i prøven ved bruk av massespektrometri; (c) bestemme differansen mellom den kjente mengde av den minst éne dendrimer i (a) og nivået av den minst éne dendrimer kvantifisert i (b); og (d) korrelere differansen av den minst éne dendrimer i (c) med nivået av den minst éne analytt i (c). Med andre ord benytter seg både US 2005/112635 og WO 2005/031304 av dendrimeren som intern standard som reagerer med analyttene som skal kvantifiseres.

Dokument WO 96/24062 (eller WO 00/72019) vedrører et immunoaggregeringsassay som er forbedret med liposomer, og en testanordning som omfatter et absorberende materiale som har atskilte berørings- og målepartier. Berøringspartiet er plassert ved eller angrensende en første ende av det absorberende materiale, mens målepartiet har en receptor for et konjugat av en analyttanalog og markør-innkapslende liposomer.

I lys av problemene av den tidligere fagkunnskap som sitert ovenfor, er det et mål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en forbedret kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve, dvs. av konsentrasjonen av primært endogene, men ikke ekskluderende eksogene forbindelser som legemidler og metabolitter derav og metabolitter fra forskjellige biologisk prøver, siden den er høyst effektiv og pålitelig. Enn videre, er det et mål å tilveiebringe en forbedret analyse som nevnt ovenfor som er relativt saltfri hvilket er et krav for massespektrometrisk analyse. I særdeleshet er det et mål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en prøveprepareringsanordning som kan anvendes for kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve. Enn videre er det også et mål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et innsett for en slik anordning, et kit omfattende anordningen og et apparat inneholdende anordningen.

Utførelser av oppfinnelsen

1. Innsett for en anordning passende for kvantitativ massespektrometrisk analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve omfattende

(a) en bærer impregnert med

(b) minst en intern standard,

hvor den interne standard er et referansemateriale i kjent absolutt mengde som tilhører samme familie som forbindelsen som skal analyseres i den biologiske prøve, og er merket med isotoper.

2. Innsett i henhold til utførelse 1, hvori bæreren omfatter et sorbentmateriale for væsker. 3. Innsett i henhold til utførelse 2, hvori sorbentmaterialet omfatter minst ett materiale valgt fra cellulosemateriale, glassfibere, glasskuler, polyakrylamidgel, porøs plastikk inert polymer og porøs grafitt. 4. Innsett i henhold til et hvilket som helst av utførelsene 1 til 3, hvori den interne standarden er innkapslet med et dekkmateriale som beskytter den interne standarden mot degradering og kjemisk reaktivitet forut for bruk. 5. Innsett i henhold til utførelse 4, hvori dekkmaterialet omfatter minst ett materiale valgt fra en polymer, en micelle-dannende forbindelse, en liposom-dannende forbindelse og en polyhydroksyforbindelse.

6. Innsett i henhold til utførelse 5, hvori innkapslingen er en mikroinnkapsling.

7. Innsett i henhold til utførelse 5 og/eller utførelse 6, hvori polymeren er en polyalkylenglykolhomopolymer eller -kopolymer eller en blanding derav, og/eller polyhydroksyforbindelsen er sorbitol og/eller glycerol. 8. Innsett i henhold til et hvilket som helst av utførelsene 5 til 7, hvori polymeren er en polyetylenglykol (PEG) eller polypropylenglykol (PPG), fortrinnsvis PEG 1000. 9. Innsett i henhold til utførelse 5 og/eller utførelse 6, hvori den micelle-dannende forbindelse er et overflateaktivt stoff og/eller den liposomdannende forbindelsen er et fosfolipid, fortrinnsvis et fosfatidylcholin eller et fosfatidyletanolamin eller derivater derav. 10. Anordning for kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve omfattende

(a) en eller flere brønner (1), og

(b) et eller flere innsett (2) som spesifisert i hvilket som helst av utførelsene 1 til 9 plassert i brønnene (1); og

(c) eventuelt en tilbakeholder (3) for innsettet (2) i brønnen (1).

11. Anordning i henhold til utførelse 10, hvori brønnen eller brønnene (1) omfatter et filter (4) for å separere faste stoffer i mikron-størrelsesorden, fortrinnsvis over 5 mikron, og et utløp (5) for fjerning av filtratet. 12. Anordning i henhold til utførelse 11, hvori filteret (4) er lokalisert mellom innsettet

(2) og utløpet (5).

13. Anordning i henhold til utførelse 11 og/eller utførelse 12, hvori utløpet (5) åpnes under applisert sentrifugalkraft eller redusert trykk, fortrinnsvis under 500 mbar. 14. Intern standard for kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve innkapslet som spesifisert i hvilket som helst av utførelsene 4 til 9. 15. Kit for kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve omfattende en anordning ifølge hvilket som helst av utførelsene 10 til 13. 16. Apparat for kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve omfattende (a) en behandlingsenhet for å forberede metabolittene som skal screenes omfattende (al) et automatisert væskehåndteringssystem, og (a2) minst en anordning som definert i hvilket som helst av utførelsene 10 til 13 for derivatisering av metabolittene som foreligger i prøven og for påfølgende ekstraksjon av derivatene; (b) et massespektrometer for kvantitativ målrettet massespektrometri-basert analyse, og (c) database for lagring av resultater av analysen. 17. Fremgangsmåte for kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve under anvendelse av innsettet som definert i hvilket som helst av utførelsene 1 til 9 eller anordningen som definert i hvilket som helst av utførelsene 10 til 13 eller den interne standarden som definert i utførelse 14 eller kittet som definert i utførelse 15 eller apparatet som definert i utførelse 16.

Henvisning til de vedlagte figurene

Figur 1 beskriver et tverrsnittsriss av en enkel anordning i henhold til oppfinnelsen inneholdende brønner eller glass og dets sammensetning fra individuelle komponenter. Referansenummer (1) viser en brønn/et glass. Referansenummer (2) viser et innsett i henhold til den foreliggende oppfinnelse omfattende en immobiliserende stasjonærfase av glass, celluloser eller andre passende materialer (dvs. en porøs bærer) inneholdende interne standarder med eventuell (mikro)innkapsling; referansenummer (3) viser en til bakeholder for å holde den porøse bæreren i brønnen eller glasset, hvilket er kjemisk inert for derivater og løsningsmiddel; referansenummer (4) viser et filter; referansenummer (5) viser et utløp, som åpnes under trykk av sentrifugal- eller gravitasjonskraft eller vakuum.

Figur 2 beskriver en "neutral loss scan" av 135 i negativmodus ved anvendelse av ione tandem massespektrometri av fenyltiorurea aminosyrederivater (PTU), som viser aminosyrer fra en rød blodcelleprøve og deres korresponderende stabile isotop interne standarder preparert med multi-anordningen beskrevet i eksempel 2. Figur 3 A beskriver et "precursor scan" 184 i positiv ionemodus (A), som viser multi-anordningenes evne til å ekstrahere fosfolipider fra en rød blodcelle prøve av eksempel 2. For eksempel er sphingomyeliner og fosfatidylcholiner observerbare i m/z-området 700 - 840, og lysofosfatidylcholiner i m/z-området 400 - 650. Figur 3B beskriver et MRM-scan ("multiple reaction monitoring") i positiv ionemodus av eksempel 2. Figur 4 beskriver et eksempel på hvordan immunoterapilegemidler Sirolimus, Everolimus, Cyklosporin A, Tacrolimus, og interne standarder Ascomycin og Cyklosporin D fra en kvalitetskontrollblodprøve analyseres med LCMS for å frembringe kvantitative data. Arealet under de integrerte toppene av den interne standarden Cyklosporin D og Ascomycin, av kjente konsentrasjoner, anvendes for sammenligning mot arealet under toppen av immunosuppressantene i de fem kvalitetskontrollprøvene inneholdende kjente konsentrasjonsmengder. Dette tilveiebringer et mål på presisjon for alle fire legemidlene. Figur 5 beskriver en kalibrasjonskurve fra kalibratorer for Sirolimus oppnådd fra multi-anordningen med celluloseinnsett (eksempel 3). Figur 6 beskriver en kalibrasjonskurve fra kalibratorer for Everolimus oppnådd fra multi-anordningen med celluloseinnsett (eksempel 3). Figur 7 beskriver en kalibrasjonskurve fra kalibratorer for Cyklosporin en oppnådd fra multi-anordningen med celluloseinnsett (eksempel 3). Figur 8 beskriver en kalibrasjonskurve fra kalibratorer for Tacrolimus oppnådd fra multi-anordningen med celluloseinnsett (eksempel 3).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vil beskrives i mer detalj heri nedenfor ved å henvise til dens særskilt foretrukne utførelsesformer.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører i grunnen en enkel anordning inneholdende

forhåndsoppmålte interne standarder i et glass eller en brønn, til hvilket biologisk prøver som skal måles kan tilsettes for videre behandling og eventuell analyse av for eksempel massespektrometri, hvor den interne standard er et referansemateriale i en kjent mengde som tilhører samme familie som forbindelsen som skal analyseres i detn biologiske prøve, og er merket med isotoper. Anordningen omfatter et innsett som kan være porøst og inneholder en eller flere interne standarder av kjente molare mengder. Ytterligere kan disse interne standardene også være innkapslet/innstøpt inn i en beskyttende matrise for å forlenge lagringsbestandigheten. Den beskyttende matrisen omfatter, men ikke begrenset til, enten et ikke-naturlig forekommende fosfatidylcholin, en poly-etylenglykolpolymer eller en viskøs glyserol- eller sorbitolløsning. Anordningen kan anvendes for å analysere en metabolittprofil i en biologisk prøve. Således skal det forstås at selv om den foreliggende oppfinnelse vil beskrives i det følgende for analyse av en metabolittprofil.

I det følgende vil komponentene som utgjør anordningen i henhold til oppfinnelsen, så vel som anvendelsen av anordningen, forklares.

Anordningen i henhold til oppfinnelsen inneholder (A) en eller flere brønner/glass, og

(B) minst et innsett. Innsettet omfatter (a) en bærer som er (b) impregnert med minst en intern standard, hvor den interne standard er et referansemateriale i en kjent mengde

som tilhører samme familie som forbindelsen som skal analyseres i detn biologiske prøve, og er merket med isotoper. Innsettet er indikert som referansenummer (2) i figur 1.

Innsett

Benevnelsen "innsett" som anvendt i oppfinnelsen, skal forstås å være den porøse bæreren inneholdende de interne standardene med en eventuell kjemisk beskytter. Innsettet kan ha enhver geometrisk form så lenge innsettet passer inn i brønnen eller vimlen av anordningen. I en foretrukket utførelsesform arrangeres innsettet innen brønnen eller glasset av anordningen ved anvendelse av en tilbakeholder. Tilbakeholderen indikeres som referansenummer (3) i figur 1.1 en særskilt foretrukket utførelsesform tillater tilba keholderen (3) innsettet å anbringes i brønnen uten noen direkte kontakt mellom innsettet og brønnen. Således lokaliseres innsettet ovenfor brønnens bunn fortrinnsvis i en avstand av 2 til 10 mm, mer fortrinnsvis 3 til 5 mm ved anvendelse av tilbakeholderen. Med andre ord er det i en foretrukket utførelsesform, et såkalt "gap" eller "avstand" mellom brønnens bunn og innsettet og/eller mellom veggene av brønnen og innsettet. Som tilbakeholderen er, i den foretrukkede utførelsesformem, enhver tilbakeholder passende så lenge den tillater dannelsen av mellomrommet mellom brønnens bunn og innsettet. Et slikt arrangement tillater maksimalt overflateareal av bæreren å presipitere prøvene på. Utformingen sikrer videre at innsettet er fullt tilgjengelig ved luftstrøm eller annen tørkegass rundt innsettet for å muliggjøre hurtig tørking av prøve etter anvendelse. Dette utformingsprinsippet sikrer også at innsettet er fullt tilgjengelig ved strøm av løsning fra alle sider muliggjørende metabolitt eller legemiddelekstraksjon fra prøve med minimerte protein- eller saltforurensninger. Således tillater porene av bæreren en reaksjon (derivatisering) å fremskride innen bæreren i seg selv, minimerende løsnings-middelbruk og også påfølgende fjerning ettersom evaporasjon av overflødig derivat og løsningsmidler tilveiebringes ved maksimalt overflateareal til sirkulerende tørkegasser (luft eller nitrogen) rundt prøven. Det økte overflatearealet og løsningsmobiliteten rundt hele bæreren sikrer også høye ekstraksjonseffektiviteter ved anvendelse av passende løsningsmidler. Med andre ord, det ovenfor-nevnte gapet tillater et nesten fritt arrangement av innsettet i brønnen og en forbedret sirkulering av væsker strømmende gjennom brønnen.

Enn videre kan, i henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen, anordningen omfatte fler enn et innsett arrangert i stabler, hvori de respektive innsettene mer fortrinnsvis arrangeres med de ovenfor-nevnte gap mellom hverandre for å kunne tillate sirkuleringen av væsker.

Bærer

Bæreren som anvendt i oppfinnelsen kan være enhver bærer, fortrinnsvis med minst medium grad, fortrinnsvis en høy grad av porøsitet. En slik bærer er i prinsippet kjent i den tidligere fagkunnskap og er også kommersielt tilgjengelig.

Porøsiteten " O " av et medie (dvs. bæreren) defineres å være proporsjonen av det ikke-faste volumet til det totale volumet av materiale, og defineres ved forholdet:

hvor Vp er det ikke-faste volumet (porer og væsker) og Vm er det totale volumet av materialet, inklusive de faste og ikke-faste delene.

Således er porøsitet en verdi mellom 0 og 1, typisk i området fra mindre enn 0,01 for fast granitt til mer enn 0,5 for torv og leire, selv om den også kan representeres i pro-sentuttrykk ved å multiplisere fraksjonen med 100 %. Den porøse bæreren av oppfinnelsen har en porøsitet på minst 30 %, mer fortrinnsvis minst 50 %, enda mer fortrinnsvis minst 70 %, og mest foretrukket minst 90 %.

Den porøse bæreren som anvendt i innsettet kan være av hvilket som helst passende materiale, men det er fortrinnsvis et fast bærermateriale. Mer fortrinnsvis består den porøse bæreren av et sorbentmateriale for væsker (også benevnt væskesorbentmateriale). Enda mer fortrinnsvis består bæreren av væskesorbentmaterialet. Sorbentmaterialet kan være et adsorbent eller et absorbent materiale.

Et væskesorbentmateriale som anvendt i oppfinnelsen skal forstås å være et hvilket som helst materiale som tillater løsninger av interne standarder og påfølgende prøver for analyse å adsorberes eller absorberes uniformt gjennom porene ytterligere tillatende bærerløsningfjerning ved evaporasjon.

Væsken som tillates å være ad- eller absorbert av bærermaterialet, kan være hvilken som helst type av væske, men det er fortrinnsvis en flyktig væske ved atmosfærisk trykk, for eksempel en væske som har et kokepunkt mindre enn omtrent 250 grader Cel-sius (C) ved atmosfærisk trykk.

Mer fortrinnsvis omfatter væskesorbentmaterialet i henhold til oppfinnelsen minst en av et karbohydratmateriale, slik som cellulosemateriale, glassfibere, glasskuler, polyakrylamidgel, porøs plastikk inert polymer og porøs grafitt. Det nevnte porøse sorbentmaterialet kan mer fortrinnsvis omfatte et karbohydratmateriale eller derivat derav, slik som agarose, agar, cellulose, dextran, chitosan, eller konjac, carrageenan, gellan, eller algi-nat. Væskesorbentmaterialet er, dog, mest foretrukket laget av cellulose eller glassfibere. Formen av bæreren eller væske sorbentmateriale begrenses ikke særskilt, men er fortrinnsvis av en sirkulær, kvadratisk eller spiral eller "nautilus" form. I henhold til oppfinnelsen tilpasses formen av bæreren eller sorbentmaterialet til formen av brønnen eller glasset av anordningen. Som nevnt kan den porøse bæreren eller sorbentmaterialet fikseres eller sikres i dets posisjon i brønnen eller glasset ved en fikseringsstruktur slik som en tilbakeholder (indikert som (3) i figur 1).

Den porøse bæreren omfattende væskesorbentmateriale har hovedsaklig to funksjoner. Den første er å innkapsle de interne standardene (referansemateriale) som beskrevet nedenfor ved predefinert konsentrasjon klar for tilsetning av den biologiske prøven. Den andre er immobilisering av innholdene av hver prøve. Dette immobiliseringstrinnet fremkaller cellelysering, proteinimmobilisering / utfelling og salt og mange andre legemiddel eller metabolittretensjon fra hver av prøvene. Porøsiteten av bæreren er således essensiell for maksimal eksponering til både derivatiseringsmidlene og også ekstrak-sjonsløsningen som skal tilsettes for analysen.

Intern standard

En intern standard som anvendt i oppfinnelsen skal forstås å være ethvert referansemateriale av kjente absolutte mengder som anvendes for sammenligninger med lignende eller identiske forbindelser for å kunne kvantifisere ukjente mengder av forbindelser tilstede i en gitt prøve. Fortrinnsvis er den interne standarden en organisk intern standard. Interne standarder som anvendt i den foreliggende oppfinnelse tilhører den samme gruppen eller familien av forbindelser som analyseres i den biologiske prøven. Dog er de merket med isotoper for å kunne riktig tillate en distinksjon mellom metabolittene av prøven og den interne standarden.

Spesifikke eksempler for den interne standarden som anvendt i den foreliggende oppfinnelse listes opp i tabell 1 nedenfor.

Acylcarnitiner

Reduserende monosakkarider Kreatinin

Biologisk prøve

En biologisk prøve som anvendt i oppfinnelsen skal forstås å være enhver prøve av, relatert til, forårsaket av, eller påvirkende liv eller levende organismer, biologiske prosesser, slik som vekst og nedbrytning.

Eksempler på en biologisk prøve kan inkludere, men er ikke begrenset til, blod, celle-kultursupernatant, saliva, tårer, urin, blod, serum, plasma, svette, vaginale væsker, sæd, avføring, slim, brystmelk, ascites, lymfevæske, plevraleffusjon, synovialvæske, ben-marg, cerebro- spinal væske, og vaskinger fra kroppshulrom (for eksempel, bronkial skylling), hår, vev, ben, eller tenner.

Fortrinnsvis er den biologiske prøven en væskeprøve. Mer foretrukket er den biologiske prøven blod, og mest foretrukket humant blod. Væske betyr en materietilstand med bestemt volum, men ingen bestemt form ved 25 °C, likt vann.

Metabolittprofil

En metabolittprofil som anvendt i oppfinnelsen skal forstås å være ethvert sett av verdier av kvantitative resultater for metabolitter som kan anvendes for sammenligning med referanseverdier eller profiler avledet fra en annen prøve eller en gruppe av prøver. For eksempel kan en metabolittprofil av en prøve fra en syk pasient være signifikant forskjellig fra en metabolittprofil av en prøve fra en på lignende måte passende frisk pasient.

Metabolitter, slik som, men ikke begrenset til aminosyrer, peptider, acylcarnitiner, monosakkarider, lipider og fosfolipider, prostaglandiner, hydroksyeicosatetraenoinsyrer, hydroksyoktadecadienoinsyrer, steroider, gallesyrer og glyko- og fosfolipider kan påvises og/eller kvantifiseres.

Eksempler på metabolitter som er tilgjengelig for massespektrometriske analyser i henhold til oppfinnelsen listes opp i tabell 2.1 særdeleshet vises lipidarter fra C4:X til C46:X (hvor X, graden av metning, i området fra 0 til 8) i enhver gitt fettsyrerest. Lipidene innbefatter også sphingolipider og glykosphingolipider.

Aminosyrer, som kan påvises og kvantifiseres, er proteogene eller ikke-proteogene aminosyrer. De proteogene aminosyrene og de ikke-proteogene aminosyrene, som indikert i tabell 2, foretrekkes.

Acylcarnitiner fra C4:X til C18:X (hvori X er graden av metning og er i området fra 0 til 8 i enhver gitt syrerest) kan påvises og/eller analyseres. Eksempler for acylcarnitiner som foretrekkes opplistes også i tabell 2.

Monosakkarider er fortrinnsvis reduserende eller ikke-reduserende karbohydrater. Eksempler på monosakkarider er også opplistet i tabell 2.

Aminosyrer Proteinogene aminosyrer

Ikke-proteinogene aminosyrer Acylcarnitiner

Reduserende monosakkarider Andre

Legemiddelprofil

En legemiddelprofil som beskrevet i søknaden skal forstås å være ethvert definert sett av verdier av kvantitative resultater for et eller flere legemidler eller legemiddelmetabo-litter i en spesifisert prøve. Enn videre kan også immunosuppressanter som spesifikke eksempler påvises og kvantifiseres. For eksempel vil en legemiddelprofil av en trans-plantasjonspasient gi legen de umiddelbart sirkulerende mengder av en eller flere lege-middelbehandlinger i bruk, og fremtidige doser kan derfor økes eller reduseres i henhold til kvantitetene målt, for å oppnå best terapeutisk område. En slik analyse benevnes som terapeutisk legemiddel overvåkning (TDM). Immunosuppressanter i overensstem-melse med den foreliggende oppfinnelse, skal forstås som legemidler som kan anvendes i immunosuppressiv behandling for å inhibere eller forhindre aktivitet av immunsyste-met. Klinisk anvendes de for å forhindre avstøtning av transplanterte organer og vev og i behandling av autoimmune sykdommer slik som reumatoid artritt, myasthenia gravis, systemisk lupus erythematosus, Crohns sykdom, og ulcerativ colititt. Immunosuppres santer som definert heri kan i hovedsak klassifiseres i fire grupper: glukokorticoider, cytostatika, antistoff, og legemidler virkende på immunophiliner. Eksempler på immunosuppressanter som beskrevet i foreliggende søknad er Cyklosporin A, Sirolimus, Everolimus og Tacrolimus.

Innkapsling av standardene

Den interne standarden i henhold til oppfinnelsen innkapsles fortrinnsvis med et dekkmateriale eller beskyttende materiale som beskytter den interne standarden fra degradering og kjemisk reaktivitet foregående bruk. Beskyttelsen av den interne standarden fra degradering og kjemisk reaktivitet kan forhindre mange former av nedbrytning eller kjemisk modifisering av den interne standarden, slik som forebygging av virkningen av sollys, temperatur, og mikroorganismer, i særdeleshet forebygging av enhver prosess som transformerer den interne standarden i nedbrytnings- eller degraderingsprodukter og som derved påvirker resultatet av en kvantitativ analyse.

Et beskyttende/dekkende materiale som anvendt i oppfinnelsen, skal forstås å være ethvert materiale for skjerming eller som er utformet for å skjerme den interne standarden^) mot degradering.

Det beskyttende/dekkende materialet i henhold til oppfinnelsen kan være ethvert materiale passende for å beskytte den interne standarden fra en miljømessig påvirkning som nevnt ovenfor. Dekkmaterialet i henhold til oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis minst en av en polymer, en micelle-dannende forbindelse, en liposom-dannende forbindelse og en polyhydroksyforbindelse, eller enhver blanding derav.

Hvis dekkmaterialet er en polymer, begrenses ikke nevnte polymer som anvendt i oppfinnelsen særskilt og forstås være en høymolekylvekts organisk forbindelse, slik som har en gjennomsnittsmolekylvekt på minst 500 g/mol eller minst 1.000 g/mol eller minst 5.000 g/mol eller minst 10.000 g/ mol, som enten er naturlig eller syntetisk, hvis struk-tur kan være representert ved en gjentatt liten monomerenhet. En syntetisk polymer dannes på en måte kjent innen faget, slik som ved addisjons- eller kondenseringspoly-meriseringsreaksjon av monomere. Polymeren ifølge oppfinnelsen kan også være en kopolymer, når to eller flere forskjellige monomerer er involvert. En homopolymer er en polymer som dannes fra kun en type av monomer.

Polymeren i henhold til oppfinnelsen er fortrinnsvis en polyalkylenglykol-homopolymer eller kopolymer eller en blanding derav. Gjennomsnittsmolekylvekten er fortrinnsvis omtrent 1000 dalton (Da). Mer fortrinnsvis er polymeren i henhold til oppfinnelsen en polyetylenglykol (PEG) eller polypropylenglykol (PPG), fortrinnsvis PEG 1000 med en gjennomsnittsmolekylvekt av omtrent 1000 Da, ettersom den er løselig eller blandbar med meget polare og mindre polare til upolare løsningsmidler.

Hvis dekkmaterialet er en micelle-dannende forbindelse, skal forbindelsen som anvendt i oppfinnelsen forstås å være enhver forbindelse som kan fremkalle submikroskopisk aggregering av molekyler, som dråper i et kolloidalt system. Den micelle-dannende forbindelsen i henhold til oppfinnelsen er fortrinnsvis et overflateaktivt stoff.

Et overflateaktivt stoff som anvendt i oppfinnelsen forstås å være enhver kjemisk forbindelse som reduserer overflatespenningen mellom to væsker; eller ethvert overflateaktivt middel som øker de emulsifiserende, skummende, dispergerende, spredende og fuktende egenskapene av et produkt, i særdeleshet enhver organisk forbindelse hvis molekyler inneholder en hydrofil gruppe ved en ende og en lipofil gruppe ved den andre enden. Passende overflateaktive stoffer omfatter kationiske, anioniske, ikkeioniske, og amfoteriske overflateaktive stoffer. Fortrinnsvis er det overflateaktive stoffet fosfatidyl (C17:0)2.

Hvis dekkmaterialet er en liposom-dannende forbindelse, skal forbindelsen som anvendt i oppfinnelsen forstås å være enhver forbindelse som kan bygge kunstige mikroskopiske vesikler bestående av en vandig kjerne omgitt av et eller flere fosfolipidlag, anvendt for å overføre vaksiner, legemidler, enzymer, eller andre substanser til målceller eller organer.

Et fosfolipid som anvendt i oppfinnelsen forstås på generell måte innen faget og skal omfatte fosforinneholdende lipid, slik som lecitin og cephalin, laget av glyserol og fett-syrer, med en fosfatgruppe tilknyttet. Mer fortrinnsvis er den liposomdannende forbindelsen et fosfolipid, slik som et fosfatidylcholin eller et fosfatidyletanolamin eller derivater derav.

Hvis dekkmaterialet er en polyhydroksyforbindelse, skal forbindelsen som anvendt i oppfinnelsen forstås å omfatte minst to hydroksygrupper. Mest foretrukket er polyhydroksyforbindelsen sorbitol og/eller glyserol.

Fortrinnsvis er innkapslingen i henhold til oppfinnelsen en mikroinnkapsling. En mikroinnkapsling som anvendt i oppfinnelsen skal forstås å være enhver innkapsling av mikrokapsyler, som er små, fortrinnsvis mikroskopiske kapsyler utformet for å frigjøre sitt innhold når ødelagt av trykk, oppløst eller smeltet. I særdeleshet har kapsylene ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis en diameter på mindre enn 100 mikrometer, mer fortrinnsvis mindre enn 10 mikrometer og mest fortrinnsvis mindre enn 1 mikrometer.

Mikroinnkapslede interne standarder er robuste med tanke på lagring og forsendelse og er stabile med hensyn på oksidasjons- og degraderings-prosesser, og de har en relativt lang lagringsbestandighet. Mikroinnkapslingen er fortrinnsvis standardisert for å frembringe syntetisk kvalitetskontrollmateriale basert på mikroinnkapslede komponenter. Dette oppnås typisk ved å tørke interne standarder og andre beskyttede prøver med dekkmaterialet i en løsning som er en passende løsning for disse forbindelsene, som en kloroform/metanolblanding for fosfolipider. Typisk fremkaller addisjon av vann til disse prøvene micelle og/eller liposomdannelser, og innkapsling av disse interne eller eksterne standard lipofile, beskyttede forbindelser muliggjøres deretter i vann.

For eksempel frembringes anordningen som følger: den interne standarden, oppløst i et passende løsningsmiddel, pipetteres i en kjent mengde på en porøs bærer og tørkes. Denne prosedyren gjentas for hver interne standard eller klasse av interne standarder som skal benyttes i anordningen. Hvis en innkapsling tilveiebringes, som det endelige trinnet, puttes innkapslings/dekkmaterialet, fortrinnsvis i en passende løsning, på bæreren inklusive de interne standardene (dvs. innsettet) og tørkes. Innsettet settes deretter inn i brønnen, fortrinnsvis ved anvendelse av et sikringsmiddel eller festestruktur slik som en tilbakeholder. Som et alternativ kan bæreren være satt inn i brønnen før pipettering av de interne standardene og det eventuelle dekkmaterialet på bæreren.

Multippel anordning

En multi-anordning som anvendt i oppfinnelsen skal forstås å være alle multiple anordninger føyd sammen for å danne en multi-anordning slik som et mikrotiter plate stan-dardformat.

En mikrotiterplate som anvendt i oppfinnelsen skal forstås å være enhver plastikk prø-veholder anvendt i biologiske eller kjemiske forskningsfasiliteter. Mikrotiter platestan-darden ble formalisert av "the Society for Biomolecular Screening (SBS)" i 1996. Den har typisk 6, 24, 96, 384 eller 1536 prøvebrønner arrangert i en 2:3 rektangulær matrise. Standarden styrer brønndimensjoner (for eksempel diameter, mellomrom og dybde) så vel som plateegenskapet (for eksempel dimensjoner og rigiditet).

For multi-anordningen gjelder den samme beskrivelsen av utgjørende komponenter som nevnt ovenfor. Derfor innbefatter også multi-anordningen en porøs bærer slik som cellulose eller glassfiber som eksempler, fortrinnsvis tilbakeholdt i minst en brønn av en kjemisk inert tilbakeholderstruktur. Den porøse bæreren har innkapslet i seg interne standarder i en tørr tilstand; eventuelt mikroinnkapslet (belagt) med et beskyttende eller dekkende materiale eller blanding av kjemikalier, for eksempel polyetylenglykol 1000, fosfatidylcholin, glyserol eller sorbitol.

Anordningen i multippelformat heri benevnt en multi-anordning kan også ha et annet format. Pre-innkapsling av flere glass, som et eksempel 6 brønner, gir en 6-punkts kalibrering med multiple kalibreringsforbindelser. Kvalitetskontrollprøver inneholdende kjente metabolitter og/ eller multiple legemiddelkonsentrasjoner er også innkapslet.

Brønn

En brønn som anvendt i oppfinnelsen skal forstås å være ethvert glass eller rør bestående av et materiale, som fortrinnsvis er løsningsmiddel- og derivatresistent, hvori en ekstraksjon eller kjemisk reaksjon kan finne sted.

De en eller flere brønnene (indikert som referanse nummer (1) i figur 1) av anordningen omfatter fortrinnsvis minst et filter (indikert som (4) i figur 1) for å separere faste stoff i mikron størrelse, mer fortrinnsvis eksakt et filter (4) for å separere faste stoff i mik-ronstørrelse. De en eller flere brønnene av anordningen omfatter fortrinnsvis minst et utløp(5) i figur 1 for fjerning av filtratet.

Et filter inneholdt i brønnen som anvendt i oppfinnelsen skal forstås å være ethvert porøst materiale en væske eller gass passeres gjennom for å kunne separere væsken fra suspendert partikulært materie. Filteret (4) har fortrinnsvis en porestørrelse av 50 til 0,01 mikrometer, mer fortrinnsvis 5 til 0,1 mikrometer, og enda mer fortrinnsvis 1 til 0,3 mikrometer. Mest fortrinnsvis har filteret (4) en porestørrelse av 0,45 mikrometer.

Fortrinnsvis i henhold til oppfinnelsen, er filteret (4) plassert mellom innsettet (2) og utløpet (5).

Enn videre, åpner utløpet (5) i henhold til oppfinnelsen fortrinnsvis under applisert sentrifugalkraft eller redusert trykk, fortrinnsvis under 500 mbar. Det reduserte trykket appliseres fortrinnsvis på siden av utløpet (5) av brønnen (1). Alternativt kan et økt trykk på siden av innsettet (2) appliseres for å kunne sikre en gjennomstrømning fra innsettet (2) til utløpet (5).

Kit

Anordningen i henhold til beskrivelsen kan videre anvendes i et kit for kvantitativ analyse av et legemiddel og/eller metabolittprofil i en biologisk prøve. Et kit som anvendt i beskrivelsen skal forstås å være ethvert system av reagenser, løsningsmidler, idet programvare innbefattet i anordningen muliggjørende fremstilling av metabolitter for kvantitativ målrettet analyse av et område av metabolitter vanligvis i forbindelse med et analytisk instrument.

Apparat

Videre kan anordningen i henhold til den foreliggende oppfinnelse også anvendes i et apparat for kvantitativ analyse av et legemiddel og/eller metabolittprofil i en biologisk prøve. Nevnte apparat omfatter (a) en behandlingsenhet for å frembringe legemiddelet og/eller metabolitten som skal screenes omfattende (al) et automatisk væskehåndteringssystem, og (a2) minst en anordning som definert ovenfor for derivatisering av legemidlene og/eller metabolittene tilstede i prøven og for påfølgende ekstraksjon av derivatene; (b) et massespektrometer for kvantitativ målrettet massespektrometri-basert analyse, og (c) database for lagring av resultater fra analysen.

Apparatet (eller plattformen) som anvendt i oppfinnelsen, skal forstås å være ethvert apparat som muliggjør komplett fremstilling av en biologisk prøve klar for analyse ved massespektrometri. Dette omfatter prosessene av ekstraksjon, derivatisering, avsalting og oppkonsentrering. Dette innbefatter også alle mulige kombinasjoner av enkelte eller alle av disse prosessene i en fullt automatisert fremgangsmåte, fortrinnsvis inkorpore-rende et væskehåndteringssystem i kombinasjon med en prøvesentrifugeringsanordning, en prøveoppvarmings- og avkjølingsanordning, en prøveristingsanordning, en prøvetør-kingsanordning, en prøvepipetteringsanordning og en prøvehomogeniseringsanordning.

Et væskehåndteringssystem som anvendt i oppfinnelsen, skal forstås å være enhver me-kanisk anordning som muliggjør presis aspirasjon og dispensering av mange typer av løsningsmidler inn og ut av glass og mikrotiterplater. Et væskehåndteringssystem kan opereres via en datamaskin og programvare i et slikt væskehåndteringssystem.

En database eller databank som anvendt i oppfinnelsen skal forstås å være enhver samling av data arrangert med hensyn til letthet og hurtighet i forhold til søking og gjenvin-ning.

En målrettet massespektrometrianalyse som anvendt i oppfinnelsen, skal forstås å være massespektrometrianalyse, hvori et eller flere "preset" ionepar anvendes, spesifikt defi-nerende og representerende en kjent metabolitt ved et kjent fragmenteringsmønster som er karakteristisk for den korresponderende analytten, for identifisering av den målrettede metabolitten. De oppnådde ioneintensiteter anvendes sammen med den passende interne standarden for å beregne konsentrasjonen av den målrettede metabolitten. Den interne standarden identifiseres ved anvendelse av et karakteristisk ionepar (eller flere), deres oppnådde ioneintensiteter er relatert til den kjente konsentrasjonen av den interne standarden tillatende kvantifisering av en korresponderende målrettet metabolitt. Settet av målrettede metabolitter er kjent på forhånd og kan være pre-merket. Derfor er påviste og kvantifiserte metabolitter allerede merkede, noe som tillater en hurtig og direkte tolkning. Et tandem massespektrometer er spesielt foretrukket som et massespektrometer i stand til MSMS-analyser for å skille mer spesifikt ionearter. Fortrinnsvis tillater apparatet automatisert, standardisert prøvepreparering og høy-oppløsnings tandem mas-seanalytiske prosedyrer. I særdeleshet øker den automatiserte prøvepreparereingsprose-dyren dag-til-dag reproduserbarhet av pålitelige resultater og lavere varianskoeffisienter (CVs). Når, for eksempel, analyserende et derivatisert sukker med et forløper ionescan, kan derivatet selv påvises ved massespektrometeret. I positive ionemodus er dette fortrinnsvis dannelsen av fenylmetylpyrazolone(PMP) (MH)+ ion ved m/z 175. Sammen-setningen av karbohydratet i seg selv eller diskrete isomerer er påvisbare.

Når utførende en metabolomanalyse ved anvendelse av anordningen i henhold til oppfinnelsen, kan en kvantitet av hundreder av metabolitter analyseres samtidig fra mikro-titerkvantiteter av biologisk materiale med høy hastighet, presisjon og sensitivitet ved anvendelse av pre-analytiske trinn. Kvalitetssikrede (QA) data frembringes fra individuelle prøver innen minutter og tolket benyttende nyeste statistisk programvareverktøy. Denne fremgangsmåten overvinner også hittil eksisterende analytiske flaskehalser gjennom pre-analytisk standardisering og automatisering, og brukervennlig statistisk og biokjemisk datatokning. Denne integrasjonen av alle komponenter i fremgangsmåten av oppfinnelsen inn i en ny teknologiplattform vil gjøre "biokjemisk fingeravtrykk" tilgjengelig for utbredt anvendelse og vil fremskynde spredning av metabolomikk.

Eksempler

Den foreliggende oppfinnelse vil videre illustreres ved de følgende ikke-begrensende eksempler.

Forberedelse og betingelser for multi- anordningen

En multi-anordning ble forberedt ved anvendelse av 7 mm celluloseprikker (kutt fra "generic card" - 10 539 859, Schleicher Schuell Biosciences GmbH, Dassel, Tyskland) som den porøse bæreren i hver av de 96 brønnene av en Solvinert mikrotiterplate (MSRP N04, Millipore Corp. MA, USA). Disse ble fiksert på plass med fremstilte til-bakeholdere fra polypropylen (Biocrates, Tirol, Austria).

For å analysere et valgt subsett av metabolitter ble, i dette tilfellet, aminosyrer, acylcarnitiner og fosfolipider fra en prøve, et utvalg av passende interne standarder av aminosyrer, acylcarnitiner og lipider merket med stabile isotoper for å representere alle de tyve proteogene fosfatidylcholiner, sphingomyeliner, og lyso-arter av hver, anvendt. Disse var pre-innkapslet i den porøse bæreren av multi-anordningen ved pipettering av kjente mengder av hver interne standard-klasse, tillatende hver å tørke i den porøse bæreren før tilsetting av den neste blandingen av interne standarder, tillatende å tørke og så videre. I dette eksempelet ble det tilsatt acylcarnitiner etterfulgt av aminosyrer og til sist, en blanding av fosfolipid interne standarder i en vannløsning inneholdende 0,1 % w/w polyetylenglykol 1000 (PEG 1000), en forbindelse som tjente dobbelt formål. Som et overflateaktivt stoff er PEG 1000 i porene av den porøse bæreren dekkende alle interne standarder tilbydende en beskyttende barriere overfor ellers degraderende virk-ninger av eksponering overfor oksygen og vann.

Når fullstendig tørre ble de multi-anordning-teknisk valideringsprøvene så tilsatt til de første fem brønnene av multi-anordningen.

Brønn 1 : en blindprøve

Brønner 2 og 3: kontrollblandinger av umerkede metabolitter,

Brønn 4: en kvalitetskontroll med lav konsentrasjon metabolitter (normale nivåer eller 1 ganger), og

Brønn 5: en kvalitetskontroll med høy konsentrasjon metabolitter (nivåer 10 ganger normalt).

Multi-anordningen inneholdende pre-innkapslede interne standarder med ytterligere kontrollprøver i brønner 1 til 5 lagres deretter klar til anvendelse ved 4 °C.

Fremgangsmåte for anvendelse av multi- anordningen

[Eksempel 1]

For kun eksempelformål er det følgende en beskrivelse av hvordan anordningen som spesifisert ovenfor anvendes for å prosessere prøver for analyse av et utvalg av metabolitter.

For å analysere et subsett av metabolitter, aminosyrer, acylcarnitiner og fosfolipider fra en prøve, ble et utvalg av passende interne standarder av aminosyrer, acylcarnitiner og lipider, stabil isotop merket for å representere alle de tyve proteogene aminosyrene, de hyppigst forekommende acylcarnitinene og fosfolipider inklusive fosfatidylcholinet, sphingomyeliner, og lysoarter av hver, anvendt. Ved tilsetning av en predefinert mengde av prøve, typisk 10 ul av plasma, blandes de interne standardene og aminosyrer av prøven innen grensene for porene av innsettet. Enhver påfølgende behandling som forårsaker tap eller degradering av metabolitter vil derfor korreleres for av den interne standarden. Derivatisering av aminosyrene kan deretter finne sted innen rammene av porene av innsettet. Den derivatiserende reagensen i dette eksempelet omfatter 15 ul av en 5 % fenylisotiocyante i en l:l:l-løsning av pyridin, vann, etanol. Denne derivatise-ringsprosessen skjer ved romtemperatur i mindre enn 20 minutter. Ettersom derivatise-ringsløsningen er fullstendig flyktig, kan den med letthet fjernes under en forsiktig strøm av nitrogen eller vakuum ved romtemperatur. Tilsetning av en metanolløsning inneholdende 10 mM ammoniumacetat ekstrahert de derivatiserte aminosyrene, acylcarnitinene og fosfolipidene samtidig fra den porøse anordningen inn i metanolløs-ningen. Den egnede mikrotiterplaten for dette formål har flere egenskaper. Den har en 0,45 mikrometer filter og et væskeutløp, som kun åpnes under sentrifugalkraft eller vakuum, bygd inn i bunnen av hver brønn. Metanolekstraktet fra prøven samles deretter lett via sentrifugering inn i en fangnings-mikrotiterplate, plassert under den mikroti-terplateinneholdende anordningen. Massespektrometrianalyse av løsningen fra hver brønn kan deretter finne sted, typisk ved anvendelse av et autosamplingsinstrument for å avlevere prøven til massespektrometeret.

[Eksempel 2]

Det følgende vil demonstrere at anordningen kan anvendes for å prosessere prøver for analyse av et utvalg av metabolitter.

Multi-anordningen ved presis addisjon av 10 ul av blodprøver fra en pasient til hver brønn blandes med de interne standardene innen grensene av porene av den porøse bæreren (innsett). Enhver påfølgende behandling som forårsaker tap eller degradering av metabolitter vil derfor korreleres til den interne standarden. Derivatisering ble gjen-nomført som i eksempel 1 og de resulterende løsningene fra hver brønn deretter analysert ved massespektrometrifremgangsmåter, typisk ved anvendelse av et autosamplingsinstrument for å avlevere prøven til spektrometeret.

Resultater fra massespektrometrimålingene av metabolittene derivatisert og ekstrahert med multi-anordningen avbildes grafisk i figur 2 og figur 3 som viser henholdsvis aminosyrene, fosfolipidene og acylcarnitinene.

Kvantitetene av aminosyrene og acylcarnitinmetabolitter vises i tabell 3 nedenfor, som også viser presisjonen og variansen av verdiene oppnådd ved anvendelse av multi-anordningen.

Tabell 3 - Kvantitetene, presisjon og reproduserbarhet av aminosyrene, lipidene, laktat, kreatinin og glukose fra en enkelt prøve målt 10 ganger er vist i tabell 3 og ble oppnådd ved anvendelse av multi-anordningen.

[Eksempel 3]

Terapeutisk legemiddelovervåkning

Immunosuppressanter er nødvendige for å inhibere organavstøtning etter transplanta-sjon. Immunosuppressantene anvendt er Everolimus, Cyklosporin A, Tacrolimus, Sirolimus, og Mykofenolsyre. Terapeutisk legemiddelovervåkningsresultater frembrakt fra en passende forberedt multi-anordning på lignende måte som beskrevet ovenfor vises her å videre illustrere anvendelsen av multi-anordningen.

Forberedelse og betingelser for multi-anordning

Denne multi-anordningen ble forberedt med eksakt den samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor, men i stedet anvendende en enkelt 8 mm celluloseprikk (kuttet fra "generic card" - 10 539 859, Schlicher Schuell, Biosciences GmbH, Dassel, Tyskland) som den porøse bæreren.

I de to multi-anordningsbrønnene ble det plassert en metanolløsning (20 ul) inneholdende Everolimus (200 ng/ml) (Sigma, Vienna, Østerrike), en intern standard for Sirolimus og Tacrolimus, og Cyklosporin D (400 ng/ml) (Sigma, Vienna, Østerrike), en intern standard for Cyklosporin A, ble pipettert (Gilson 20 ul pipette) på de porøse bærerne av multi-anordningen og tillatt å tørke ved romtemperatur i 30 minutter. Kalib-ratorblanding og kvalitetskontrollnivåer I-V (helblod kalibrator sett (nivå 0-6) for immunosuppressanter, "ClinChek R" helblod kontroll for immunosuppressanter, Recipe Chemicals and Instruments GmbH, Munich, Tyskland) ble rekonstituert i henhold til produsentens instruksjoner og begge lagret ved -20 °C. Foregående bruk, ble seks kalib-ratorløsninger med økende konsentrasjoner av Cyklosporin D og Everolimus og fem kvalitetskontrolløsninger med ulike konsentrasjoner av Cyklosporin A, Tacrolimus, Sirolimus og Everolimus tint og tillatt å nå romtemperatur rundt 23 °C. I seks brønner ble 20 ul av hver seks kalibratorer pipettert (20 ul Gilson pipette) på porøse bærere av multi-anordning. De fem kvalitetskontrollene ble pipettert i fem separate brønner porøse bærere av multi-anordning. Til multi-anordningen ble det tilsatt acetonitril (HPLC-grad) umiddelbart (Gilson 200 ml pipette) på multi-anordningens porøse bærere og straks ristet med en orbitalrister ved mindre enn 600 rpm i 30 minutter. Eluenten ble samlet ved å plassere en 300 ul kapasitets mikrotiterfangningsplate under anordningen og deretter sentrifugering av de to ved 500 g i 6 minutter. Eluenten ble deretter analysert ved masse spektrometrisk teknikk basert på en publisert fremgangsmåte (T. Koal, M. Deters, B. Casetta, V. Kaever, Simultaneous determination of four immunosuppressants by means of high speed and robust on-line solid phase extraction-high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry, J. Chromator. B, Analyt. Technol. Biomed. Life Sei. 2004 Jun 15, 805(2); 215-222). Et representativt eksempel på hvordan resultatene oppnås og beregnes presenteres i figur 4 for Cyklosporin A analyse med LCMS for å frembringe kvantitative data. Arealene under de integrerte toppene av den interne standarden Cyklosporin D ble anvendt for sammenligning med arealet under toppen av immunosuppressanten Cyklosporin A i de fem kvalitetskontrollprøvene inneholdende kjente mengder.

Figurene 5 til 8 viser lineære standardkurver for alle fire immunosuppressanter Cyklosporin A, Tacrolimus, Everolimus og Sirolimus ved anvendelse av cellulose-bærere som innsett i multi-anordningen. Tabell 4 viser de beregnede konsentrasjoner og de faktiske for presisjonsammenligninger av de fem kvalitetssikringsmaterialene analysert.

Industriell anvendelighet

Oppfinnelsen gjør mulig en allsidig og standardisert analyse av forskjellige biovæsker og vev. For eksempel kan, dagens interne kapasiteter utvise samtidig og fullt automatiserte prøvepreparering og analyse, frembringende mer enn 1000 kvantitative og merkede datapunkter fra 10 ul av tørket blod innen 6 minutter av MS-maskintid dekkende forskjellige klasser av metabolitter innen mer enn 100 bemerkede reaksjonsveier. Der-med overvinner oppfinnelsen for første gang, flesteparten av flaskehalsene i (pre)analytikk, automatisering og dataprosessering og tolkning som har forhindret hittil utstrakt kvantitativ metabolomikkgraving.

Sammenlignet med tidligere kjente analytiske fremgangsmåter og anordninger, er den kvantitative analysen av oppfinnelsen ekstremt grov og resultatene er høyst reproduser-bare. I særdeleshet er metabolittdataene svært overordnet sammenlignbare proteom eller transkriptomdata. Kun 10 ul blod eller serum eller 20 ul urin eller mindre enn 100.000 dyrkede celler behøves.

Prestasjonensegenskapene av den analytiske fremgangsmåte og anordning kan møte både forskning (oppdagelse), anvendelse og deretter kliniske diagnostiske standarder. Dette sikrer eller gjør mulig kvalitetssikrede data, standardiserte data, som er sammenlignbare fra laboratorie til laboratorie, hurtig omsetningstid, "ready to go"-implementering (treff), lett mottatt datatolkning og visualisering og en svært høy grad av automatisering og standardisering (SOPs). De totale kostnadene/datapunkt gjør metabolominformasjon flere størrelsesordener billigere enn proteominformasjon.

Den kvantitative informasjonen oppnådd ved fremgangsmåten eller anordningen av oppfinnelsen dekker reaksjonsveier og metabolitter i en systemisk (systembiologisk) kontekst og skalerbar måte. Derved kan et representativt funksjonelt, bilde eller skjerm-bilde eller metabolsk fingeravtrykk av intermediær metabolisme endelig avledes fra arrayer av markørmetabolitter.

Enn videre, funksjonell endepunkt informasjon som er annotatert og kan hensiktsmessig være tilknyttet informasjonskilder av proteomet, transkriptomet og genomet, rekrutte-rende metabolominformasjon for systembiologiske behov.

Anordningen og fremgangsmåten kan anvendes i et integrert verktøy (programvare og analytisk) passende for å etablere en ny "standard" for samtidig frembringelse av stor-skala kvantitativt identifiserte og bemerkede metabolittprofiler og studien av komplekse og dynamiske multiple biomarkørmønstre. Enn videre, kan kommersielt tilgjengelig hardwarkomponenter, bestående av et væskehåndteringssystem for automatisert og standardisert prøvepreparering og et massespektrometer for MS-MS analytikk, inte-greres ved eide og beskyttede utformet forbruks-baserte produkter og applikasjonspro-gramvare, omfattende (pre-) analytiske prosedyrer og innovative moduler for kvalitets-kontrollert data prosessering, teknisk validering og dokumentering, statistisk analyse og biokjemisk tolkning.

Prøveprepareringstid i den foreliggende oppfinnelse (treff-basert i batch av 90 prøver/mikrotiterplate) er kun omtrent 2 h, og vil videre reduseres ved hjelp av parallali-sering gjennom planleggingsprogramvaren. Et bredt område av spesifikke interne standarder for kvantifisering er pre-formulert i beskyttet kjemi som integral del av vanligvis et eller to trinns reaksjonspreparering og anvendelsestreff, som det inneholder alt nød-vendig materiale for QC og QA i kombinasjon med programvare og SOPs.

Industrielle anvendelser innbefatter biomarkøroppdagelse og kommersialisering med det formål å benytte validerte biomarkører for sykdomsdiagnose, behandlingseffektivi-tet eller toksisitet. Hovedanvendelsene i farmasøytisk utvikling innbefatter områdene legemiddelmetabolisme og farmakokinetikk, toksikologi og sikkerhet, legemiddeleffek-tivitet og farmakodynamikk. Andre områder omfatter klinisk diagnose og "theranostics", hvor for eksempel tidlig, sensitiv og spesifikk diagnose og presis stadievurdering forenkler sykdomsforebygging i stedet for kostbare intervensjoner og tillater personalisert behandling, og hvor terapeutiske effekter kan spesifikt overvåkes som støtte for personalisert behandling. Videre anvendelsesområder innbefatter, men er ikke begrenset til, næringsindustri, velvære, nasjonal sikkerhet og basal biologi.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen omfatter anordningen en bærer omfattende et sorbentmateriale; og en samling av massespektrometri, organisk, metabolitt-standarder impregnert i bæreren og tørket. Mer fortrinnsvis omfatter, massespektrometri, organisk, metabolitt standardene aminosyrer merket med stabile isotoper, poly-peptider merket med stabile isotoper, lipider merket med stabile isotoper, eller acylcarnitiner merket med stabile isotoper.

Claims (17)

1. Innsett for en anordning passende for kvantitativ massespektrometrisk analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve omfattende (a) en bærer impregnert med (b) minst en intern standard, hvor den interne standard er et referansemateriale i kjent absolutt mengde som tilhører samme familie som forbindelsen som skal analyseres i den biologiske prøve, og er merket med isotoper.

2. Innsett i henhold til krav 1, hvori bæreren omfatter et sorbentmateriale for væsker.

3. Innsett i henhold til krav 2, hvori sorbentmaterialet omfatter minst ett materiale valgt fra cellulosemateriale, glassfibere, glasskuler, polyakrylamidgel, porøs plastikk inert polymer og porøs grafitt.

4. Innsett i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 3, hvori den interne standarden er innkapslet med et dekkmateriale som beskytter den interne standarden mot degradering og kjemisk reaktivitet forut for bruk.

5. Innsett i henhold til krav 4, hvori dekkmaterialet omfatter minst ett materiale valgt fra en polymer, en micelle-dannende forbindelse, en liposom-dannende forbindelse og en polyhydroksyforbindelse.

6. Innsett i henhold til krav 5, hvori innkapslingen er en mikroinnkapsling.

7. Innsett i henhold til krav 5 og/eller krav 6, hvori polymeren er en polyalkylenglykol-homopolymer eller -kopolymer eller en blanding derav, og/eller polyhydroksyforbindelsen er sorbitol og/eller glycerol.

8. Innsett i henhold til et hvilket som helst av kravene 5 til 7, hvori polymeren er en polyetylenglykol (PEG) eller polypropylenglykol (PPG), fortrinnsvis PEG 1000.

9. Innsett i henhold til krav 5 og/eller krav 6, hvori den micelle-dannende forbindelse er et overflateaktivt stoff og/eller den liposomdannende forbindelsen er et fosfolipid, fortrinnsvis et fosfatidylcholin eller et fosfatidyletanolamin eller derivater derav.

10. Anordning for kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve omfattende (a) en eller flere brønner (1), og (b) et eller flere innsett (2) som spesifisert i hvilket som helst av kravene 1 til 9 plassert i brønnene (1); og (c) eventuelt en tilbakeholder (3) for innsettet (2) i brønnen (1).

11. Anordning i henhold til krav 10, hvori brønnen eller brønnene (1) omfatter et filter (4) for å separere faste stoffer i mikron-størrelsesorden, fortrinnsvis over 5 mikron, og et utløp (5) for fjerning av filtratet.

12. Anordning i henhold til krav 11, hvori filteret (4) er lokalisert mellom innsettet (2) og utløpet (5).

13. Anordning i henhold til krav 11 og/eller krav 12, hvori utløpet (5) åpnes under applisert sentrifugalkraft eller redusert trykk, fortrinnsvis under 500 mbar.

14. Intern standard for kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve innkapslet som spesifisert i hvilket som helst av kravene 4 til 9.

15. Kit for kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve omfattende en anordning ifølge hvilket som helst av kravene 10 til 13.

16. Apparat for kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve omfattende (a) en behandlingsenhet for å forberede metabolittene som skal screenes omfattende (al) et automatisert væskehåndteringssystem, og (a2) minst en anordning som definert i hvilket som helst av kravene 10 til 13 for derivatisering av metabolittene som foreligger i prøven og for påfølgende ekstraksjon av derivatene; (b) et massespektrometer for kvantitativ målrettet massespektrometri-basert analyse, og (c) database for lagring av resultater av analysen.

17. Fremgangsmåte for kvantitativ analyse av en metabolittprofil i en biologisk prøve under anvendelse av innsettet som definert i hvilket som helst av kravene 1 til 9 eller anordningen som definert i hvilket som helst av kravene 10 til 13 eller den interne standarden som definert i krav 14 eller kittet som definert i krav 15 eller apparatet som definert i krav 16.