JP2017101924A - 内部標準物質試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】室温での保存安定性に優れ、かつ簡便な操作で使用することができる質量分析用内部標準物質試薬の提供。
【解決手段】安定同位体標識された式１の化合物を、溶液中に溶出可能かつ乾燥状態で、多孔性部材に保持させる。式１：（ＣＨ_３）_３Ｎ＋ＣＨ_２ＣＨ（ＯＲ^１）ＣＨ_２ＣＯＯ−（式１中、Ｒ¹は水素原子、もしくは炭素数２〜３０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸残基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。）
【選択図】なし

Description

本発明は、質量分析法を利用した試料中のアミノ酸分析に用いられる内部標準物質試薬に関する。より詳細には、安定同位体標識されたアシルカルニチンを有効成分とする内部標準物質試薬に関する。また、安定同位体標識されたアシルカルニチンを有効成分とする内部標準物質試薬の室温保存での安定化方法に関する。

アシルカルニチンは、生体内において脂肪酸がミトコンドリア内膜へ運搬される際に、脂肪酸とカルニチンとが結合して生成される化合物である。より詳しくは、ミトコンドリア外膜に存在するカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩの作用によりアシルＣｏ
Ａとカルニチンからアシルカルニチンが生成される。アシルカルニチンは、その脂肪酸部分の炭素鎖長、直鎖であるか分岐鎖である、不飽和結合の有無と数、炭素鎖に結合する水素原子の酸素原子又はヒドロキシ基への置換などにより、アセチルカルニチン、プロピオニルカルニチン、イソ吉草酸カルニチン、ステアロイルカルニチン、オレイルカルニチン、リノレイルカルニチン、マロニルカルニチン、３−ヒドロキシカルニチンなどに細分化されるが、本明細書においては、それらを総称してアシルカルニチンと記述する。また、本明細書においては脂肪酸が結合していない遊離カルニチンも、アシルカルニチンに含めるものとする。

医療の分野において代謝異常の評価を行うために、血液や尿などの生物試料中のアシルカルニチンを分析することは極めて有用であり、例えば新生児を対象とした先天性代謝異常スクリーニングの必須分析項目とされている。

特許文献１には、質量分析法により血漿中のアシルカルニチンを測定し、アシルカルニチンのプロファイルを得ることで、脂肪酸酸化障害（ＭＣＡＤ、ＶＬＣＡＤ、ＳＣＡＤ、ＭＡＤ、ＬＣＨＡＤ、及びＣＰＴＩＩ）に加え、一部の有機酸血症（プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、イソ吉草酸血症、１型グルタル酸血症、３−メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症、β−ケトリオラーゼ欠損症など）の診断に利用できると記載されている。

上記したように生物試料中のアシルカルニチンの分析方法としては、質量分析法が広く普及しているが、質量分析法により生物試料中のアシルカルニチンを定量的に分析する場合には、内部標準物質として安定同位体標識されたアシルカルニチンを使用する必要がある。安定同位体標識されたアシルカルニチン内部標準物質は、試薬メーカーから個別に購入するか、あるいは非特許文献１に示されるＮｅｏＢａｓｅ非誘導体化ＭＳＭＳキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）のようなキットを購入することにより入手可能である。しかしながら、これらの内部標準物質は凍結乾燥品でのみ供給されており、使用前に適切な液体を添加して完全に溶解させる工程が必須であった。

一方、非特許文献２には、アシルカルニチンを溶液とし液体状態で保存した場合、加水分解を受けるため長期保存ができないことが記載されている。また、非特許文献３には、アシルカルニチンを添加したろ紙血を室温保存した場合、１４日後から測定値に影響がでることが記載されており、これを踏まえた非特許文献２では、ろ紙血検体であっても常温（２１℃）ではなく、冷凍（―３０℃）での保管の徹底を結論している。このようにアシルカルニチンを室温で安定保存する方法は確立されていなかった。

特表２００７−５０３８１８号公報

「３０４０−００１０ ＮｅｏＢａｓｅ Ｎｏｎ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ＭＳＭＳ ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）」の使用説明書 「液体サンプル中のアシルカルニチンの安定性について」、平成２３年度厚生労働科学研究費補助金（成育疾患克服等次世代育成基盤研究事業）分担研究報告書、研究課題名「タンデムマス導入による新生児マススクリーニング体制の整備と質的向上に関する研究」、山口清次ら、４０―４３頁 厚生労働省 ２０１２年 Ｆｉｎｇｅｒｈｕｔ Ｒ．， ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２００９ ＭａｙＩ１；８１（９）：３５７１−３５７５

本発明者らは、アシルカルニチンの室温保存での安定化方法について、鋭意検討を行ったところ、驚くべきことに、アシルカルニチンそれ自体をろ紙に含浸させ乾燥させた場合には、室温で長期間保存した場合でも、加水分解をうけることなく安定に保存できることを見出し、本発明を完成させた。

本発明は、以下の構成を有する。
（１）安定同位体標識された式１の化合物が、溶液中に溶出可能かつ乾燥状態で、多孔性部材に保持されていることを特徴とする、質量分析用内部標準物質試薬。
式１：（ＣＨ₃）₃Ｎ⁺ＣＨ₂ＣＨ（ＯＲ¹）ＣＨ₂ＣＯＯ^-
（式１中、Ｒ¹は水素原子、もしくは炭素数２〜２２の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸残基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。）
（２）安定同位体が、²Ｈ、¹³Ｃ、¹⁵Ｎ、¹⁸Ｏからなる群より選ばれる安定同位体である、上記（１）に記載の試薬。
（３）多孔性部材が、ろ紙、不織布、織布、シート状発泡体からなる群より選ばれる部材である、上記（１）又は（２）に記載の試薬。
（４）さらに検査対象アミノ酸が溶液中に溶出可能かつ乾燥状態で当該多孔性部材に保持されている、上記（１）〜（３）に記載の試薬。
（５）上記（１）に記載の質量分析用内部標準物質試薬、及びメタノールを含有する試料抽出液又は安定同位体標識された検査対象アミノ酸を溶液中に溶出可能かつ乾燥状態に保持している多孔性部材を含む質量分析用試料前処理キット。
（６）上記（１）に記載の質量分析用内部標準物質試薬がマイクロプレートのウェル（ｗｅｌｌ）中に収納されている、上記（５）に記載の前処理キット。
（７）安定同位体標識された式１の化合物を、溶液中に溶出可能かつ乾燥状態で、多孔性部材に保持させることを特徴とする、質量分析用内部標準物質試薬の室温保存での安定化方法。
式１：（ＣＨ₃）₃Ｎ⁺ＣＨ₂ＣＨ（ＯＲ¹）ＣＨ₂ＣＯＯ^-
（式１中、Ｒ¹は水素原子、もしくは炭素数２〜２２の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。）

本発明によれば、使用時に溶解の必要が無く、かつ室温での保存が可能なアシルカルニチン内部標準物質試薬が提供される。

本発明において、アシルカルニチンとは、式１で表される化合物群をいう。
式１：（ＣＨ₃）₃Ｎ⁺ＣＨ₂ＣＨ（ＯＲ¹）ＣＨ₂ＣＯＯ^-
（式１中、Ｒ¹は水素原子、もしくは炭素数２〜３０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸残基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。）

炭素数２〜３０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基としては、表１に記載の脂肪酸のカルボキシ基から水素原子が脱離した残基が挙げられ、これらのうち、炭素数２〜１８の脂肪酸残基が、好適に使用される。該脂肪酸残基は、直鎖又は分岐鎖のいずれであってもよい。

本発明で好適なアシルカルニチンは、臨床での分析項目とされているアシルカルニチンである。それらを表２に記載した。本発明ではこれらの１種類以上を多孔性部材に保持させる。

本発明において多孔性部材とは、アシルカルニチンを室温で保存した場合の安定性を損なわないことを限度として、試料抽出液に不溶性で、かつアシルカルニチンを溶液中に溶出可能でかつ乾燥状態で保持できる能力を有していれば制限なく使用することができる。

多孔性部材としては公知のものが使用でき、例えばろ紙、不織布、織布又はシート状発泡体等からなる多孔性部材が挙げられる。材質としては、公知の天然高分子及び合成高分子等が使用でき、例えば、綿、羊毛、セルロース、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリウレタン、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、絹、フィブロイン、リグニン、ヘミセルロース、キチン、エボナイト、ゴム、ガラス、石英及びセラミックス等が挙げられる。これらのうち、天然高分子が好ましく、さらに好ましくはセルロース及び綿であり、特に好ましくはセルロースである。

ろ紙としては、例えば、ＪＩＳ Ｐ３８０１（１９９５年）又はＴＡＰＰＩ（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）Ｔ２０５に規定されるろ紙等が挙げられる。不織布としては、例えば、ポリオレフィン不織布、ニトロセルロース不織布、セルロースアセテート不織布、ポリエステル不織布、エポキシ不織布、ガラス不織布及びセラミックス不織布等が挙げられる。織布としては、例えば、綿布、羊毛布、セルロース布、ポリオレフィン布、ニトロセルロース布、セルロースアセテート布、エポキシ布、ガラス布及びセラミックス布等が挙げられる。シート状発泡体としては、例えば、発泡ポリスチレン、発泡ポリオレフィン、発泡ポリウレタン、発泡ポリエステル、発泡エポキシ樹脂、発泡ガラス及び発泡セラミックス等が挙げられる。これらのうち、単位体積又は単位面積当たりに吸収する液体の量が一定になりやすいという（定量精度向上）観点から、ろ紙、不織布及びシート状発泡体が好ましく、さらに好ましくはろ紙及び不織布、特に好ましくはろ紙である。

多孔性部材の厚さ（ｍｍ）は、適宜選択することができるが、０．１以上が好ましく、さらに好ましくは０．２以上、特に好ましくは０．３以上である。また３．０以下が好ましく、さらに好ましくは１．０以下、特に好ましくは０．６以下である。多孔性部材の大きさ（面積）（ｃｍ²）は、保管及び輸送時などの操作性を考慮して自由に設定できる。また、多孔性部材の孔径は自由に設定選択できる。

本発明は、内部標準物質試薬は、以下のようにして使用することができる。
検査対象の個体より適宜な方法で採血を行い、ろ紙血を作製し乾燥させる。該ろ紙血をマイクロプレートのウェル（ｗｅｌｌ）に入れた後、本発明の内部標準物質試薬を同じｗｅｌｌに入れ、メタノールを含む試料抽出液をｗｅｌｌに添加し、試料の抽出を行う。検査対象であるアシルカルニチンが抽出された測定試料を質量分析する。

上記、試料抽出液は、メタノールを軽水で希釈したものが好適であり、メタノールの濃度は８０％以上が好適である。

本発明の内部標準物質試薬にはさらに、検査対象アミノ酸を溶液中に溶出可能かつ乾燥状態で前記多孔性部材に保持させることができる。こうすることにより、いわゆる有機酸代謝異常の検出とアミノ酸代謝異常の検出に同時に使用することができるので、利便性を向上させることができる。

本発明において、検査対象アミノ酸とは、アミノ酸代謝異常スクリーニングでの分析項目とされているアミノ酸をいい、表３に記載の１以上をいう。

本発明は、上記（１）に記載の質量分析用内部標準物質試薬、及びメタノールを含有する試料抽出液又は安定同位体標識された検査対象アミノ酸を溶液中に溶出可能かつ乾燥状態に保持している多孔性部材を含む質量分析用試料前処理キットも提供する。

また、本発明は、上記（１）に記載の質量分析用内部標準物質試薬がマイクロプレートのｗｅｌｌ中に収納されている、上記（６）に記載の前処理キットも提供する。

さらにまた、本発明は、安定同位体標識された式１の化合物を、溶液中に溶出可能かつ乾燥状態で、多孔性部材に保持させることを特徴とする、質量分析用内部標準物質試薬の室温保存での安定化方法も提供する。
式１：（ＣＨ₃）₃Ｎ⁺ＣＨ₂ＣＨ（ＯＲ¹）ＣＨ₂ＣＯＯ^-
（式１中、Ｒ¹は水素原子、もしくは炭素数２〜２２の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。）

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１

〔内部標準物質溶液：ＩＳ液の調製〕
²Ｈ標識アセチルアシルカルニチン：Ｃ２（Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ社、カタログ番号７１−１７３２）を軽水に溶解しＩＳ液を調製した。
〔内部標準物質を保持する担体：ＩＳ試薬の調製〕
上記ＩＳ液０．０３ ｍＬを、ろ紙（アドバンテック東洋社、新生児マススクリーニング用）にスポット状に添加し、ドライヤーで乾燥させＩＳ試薬を調製した。調製したＩＳ試薬は、アルミ袋中に、乾燥剤スティックと一緒に密封封入した。

〔安定性確認試験〕
上記アルミ袋に封入されたＩＳ試薬を、４５℃で２４時間保存後、後述する性能試験を実施し、保存直前のピーク面積との相対比（残存率％）を求めた。
〔性能試験〕
ＩＳ試薬をパンチにより直径０．３ｃｍの円盤状に切断した。該切断したＩＳ試薬の１片を、マイクロプレートの１ｗｅｌｌに投入した。そこに８０％メタノールを含む軽水 １００μＬを添加し、４５分間静置後、後述するタンデムマス分析を行いピーク面積を算出した。
〔タンデムマス分析方法〕
（１）タンデムマス装置：４０００ Ｑ Ｔｒａｐ（ＡＢ ＳＣＩＥＸ社）
（２）Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｄｅ：ＥＳＩ
（３）Ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ：Ｔｕｒｂｏ Ｉｏｎ Ｓｐｒａｙ
（４）スキャンタイプ：ＭＲＭ
（５）Ｐｏｌａｒｉｔｙ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
（６）注入サンプル量：５μＬ
〔比較試験：比較例１〕
上記ＩＳ液を、ガラス容器に気密封入し、４５℃で、２４時間保存後、タンデムマス分析を行いピーク面積を算出し、保存直前のピーク面積との相対比（残存率％）を求めた。
成績と比較した。

実施例１のＩＳ試薬の４５℃、２４時間保存後の残存率は１００％であったが、比較例１のＩＳ液の４５℃、２４時間保存後の残存率は８％であった。本発明の内部標準物質試薬は、温度安定性に優れていることが確認された。

本発明によれば、使用時に溶解の必要が無く、かつ室温での保存が可能なアシルカルニチン内部標準物質試薬が提供させる。

Claims (7)

1. 安定同位体標識された式１の化合物が、溶液中に溶出可能かつ乾燥状態で、多孔性部材に保持されていることを特徴とする、質量分析用内部標準物質試薬。
   式１：（ＣＨ₃）₃Ｎ⁺ＣＨ₂ＣＨ（ＯＲ¹）ＣＨ₂ＣＯＯ^-
   （式１中、Ｒ¹は水素原子、もしくは炭素数２〜２２の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸残基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。）
2. 安定同位体が、²Ｈ、¹³Ｃ、¹⁵Ｎ、¹⁸Ｏからなる群より選ばれる安定同位体である、請求項１に記載の試薬。
3. 多孔性部材が、ろ紙、不織布、織布、シート状発泡体からなる群より選ばれる部材である、請求項１又は２に記載の試薬。
4. さらに検査対象アミノ酸が溶液中に溶出可能かつ乾燥状態で当該多孔性部材に保持されている、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の試薬。
5. 請求項１に記載の質量分析用内部標準物質試薬、及びメタノールを含有する試料抽出液又は安定同位体標識された検査対象アミノ酸を溶液中に溶出可能かつ乾燥状態に保持している多孔性部材を含む質量分析用試料前処理キット。
6. 請求項１に記載の質量分析用内部標準物質試薬がマイクロプレートのウェル（ｗｅｌｌ）中に収納されている、請求項５に記載の前処理キット。
7. 安定同位体標識された式１の化合物を、溶液中に溶出可能かつ乾燥状態で、多孔性部材に保持させることを特徴とする、質量分析用内部標準物質試薬の室温保存での安定化方法。
   式１：（ＣＨ₃）₃Ｎ⁺ＣＨ₂ＣＨ（ＯＲ¹）ＣＨ₂ＣＯＯ^-
   （式１中、Ｒ¹は水素原子、もしくは炭素数２〜２２の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。）