KR20080025092A - 대사산물 프로파일의 정량 분석용 기구 - Google Patents

대사산물 프로파일의 정량 분석용 기구 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기구, 특히 생물학적 샘플의 약물 및/또는 대사산물 프로파일의 정량 분석용 샘플 준비 기구에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 내부 표준물질이 포함되어 있는 상기 기구용 인써트, 내부 표준물질 및 상기 기구를 포함하는 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 기구를 포함하는 장치 및 상기 기구를 이용하여 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물을 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.

Description

대사산물 프로파일의 정량 분석용 기구{DEVICE FOR QUANTITATIVE ANALYSIS OF A METABOLITE PROFILE}
본 발명은 기구, 특히 생물학적 샘플의 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하기 위한 샘플 준비용 기구에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 내부 표준물질이 포함되어 있는 상기 기구용 인써트, 내부 표준물질 및 상기 기구를 포함하는 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 기구를 포함하는 장치 및 상기 기구를 이용하여 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물을 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.
대사체학(Metabolomics)은 일반적으로 인간이나 동물 신체의 특정 대사과정에 필수적이거나 특정 대사과정에 참여하는 물질 또는 물질 군의 분석학으로 정의된다. 대사체학은 또한 대사체(metabolome) 분석학이라고도 한다. 대사체학은 질병의 발병 및 진행과 관련있는 대사의 변화를 반영하는 독특한 화학적 핑거프린트를 연구하는 혁신적인 분야이다. 대사체 분야에서 대사산물의 프로파일을 확인함으로써, 일차 및 중간 대사에 참여하는 인간 세포, 조직 또는 장기에 함유된, 소형 분자 또는 대사산물을 측정한다. 대사산물의 분석 결과로 수득되는 생화학적 정보는 유전적 소인 및 영양, 운동 또는 약물과 같은 환경 인자에 의해 영향을 받는, 생리적 및 병태생리적 과정이 관련된 기능적 종말점을 밝혀준다(Harrigan, G. G. & Goodacre, R. (2003) Metabolic profiling: Its role in biomarker discovery and gene function analysis. Kluwer Academic Publishers, Boston/Dordrecht/London; Schmidt, C. (2004), Journal of the National Cancer Institute, 96, 732-734 ; Raudys, S. (2001) Statistical and neural classifiers. Springer -Verlag, London; Daviss, B. (2005) The Scientist, 19, 25-28).
데이타 확보 방법과 조합하여 대사산물의 프로파일을 확인하는 방법은 임상 진단 및 약물 개발에 혁명을 일으킬 가능성이 있다. 특히, 대형 제약 회사들은 새로운 표적물과 보다 효과적이고 안전한 새로운 화합물의 발견, 바이오마커 개발 및 약물 개발 진척, 일반적으로 약물의 개발 단가 절감에 대해 지속적인 압력을 받고 있다. 따라서, 이러한 혁신적인 갭을 메우고 향후 장래를 위해 점점 바이오텍 회사에 의존하고 있다. 이와 관련하여, 혁신적인 생물분석 기법과 데이타 확보 방법은 시장 출시 기간 및 약물 소모율을 감소시킴으로써 비용 절약에 근본적인 역할을 할 것이다.
최근, 고성능 기법의 현저한 발달로 인해, 지금은 광범위한 인간 대사체 세트 - 즉 거의 조사되지 않았던 생물정보원 - 에 접근할 수 있다(Beecher, C. (2003). In Harrigan, G. G., Goodacre, R. (Ed). Metabolic profiling: Its role in biomarker discovery and gene function analysis (pp. 31 1-319). Kluwer Academic Publishers, Boston/ Dordrecht/Londong ; Dunn,, W.B., Bailey, N.J. & Johnson, H. E. (2005) Analyst, 130, 606-625). 대사산물의 프로파일들 간의 통 계적 비교는, 어떠한 질병의 증상이 나타나기 전에 다가오는 질병에 대한 잠재된 경고 신호를 특이적으로 포착함으로써, 건강 관리 시스템을 혁신시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있는 다변수 패턴을 나타낼 수 있다. 말기 질병 검출 및 고비용의 치료적 개입에 반하는 조기 질병 스크리닝 및 예방은 향후 건강 관리 유효 범위를 제공할 수 있는 일차적인 해결책이다. 정의에 따르면, 이른바 바이오마커는 "정상적인 생물학적 과정, 병리적 과정 또는 치료 개입에 대한 약리 반응에 대해 객관적으로 측정된 표시자이며, 전염병학, 치료학, 병리생리학 또는 다른 과학적 증거를 토대로한 (유익함 또는 해로움을 예측하는) 임상 종말점의 대리물로 의도된 표시자"이다(Biomarkers Definitions Working Group. (2001) Clinical Pharmacology and Therapeutics, 69, 89-95). 새로운 바이오마커 발견에 대한 관심은 제약 산업 역학 및 현재의 의료시설에 대한 넓은 범위의 잠재적인 적용성 및 근본적인 영향력으로부터 발생된다. 성공적인 바이오마커 약물 발견은 약물 개발 시간과 비용을 낮출 수 있으며, 동시에 분자 진단학에서 이용하여 임상에서 환자 순응도(patient compliance)를 향상시키고 질환의 늦은 검출 뿐만 아니라 오진으로 인한 불필요한 비용을 감소시킬 수 있을 것이다(Stoughton, R.B. & Friend, S.H. (2005) Nature Reviews. Drug Discovery, 4, 345-350; Morris, M., & Watkins, S. M. (2005). Current Opinion in Chemical Biology., 9, 407-412 ; McCandless, S. E. (2004). Primary Care, 31, 583-604).
대사산물 프로파일의 정성적인 및 정량적인 확인 기법은 여러가지 개선된 분석 및 데이타 처리 도구를 포함하며, 생물 시스템의 소형 분자 성분들의 비교 결과 로서 가능성있는 마커를 활용한다. 예로, 직렬 분자 분석기(Tandem mass spectrometry, MS)는 전혈액, 혈청, 혈장, 뇨 또는 그외 미량의 체액과 같은 생물학적 샘플 1 ㎕로부터 수백개의 대사산물을 동시에 매우 정확하고 민감하게 검출한다(Roschinger, W., Olgemoller, B., Fingerhut, R., Liebl, B. & Roscher, A.A. (2003). European Journal of Pediatrics, 162 (Suppl 1), S67-76; Strauss, A.W. (2004). J Clin Invest 2004; 113:354-356; Kaltashov, I.A. & Eyles, S.J. (2005) Mass spectrometry in biophysics: Conformation and dynamics of biomolecules. Wiley). 정량은 광범위한 적정 내부 표준물질을 기준으로하여 이루어진다.
예로, WO 03/005628에는 대사산물의 생성, 검토, 해석 및 분석 방법이 기재되어 있다. 또한, US 2002/0009740에는 대사체학을 이용한 약물 발견, 약물 치료 및 진단 방법이 기재되어 있다. US 6,455,321에는 임상 진단에서의 직렬 질량 분석 데이타를 해석하는 방법이 언급되어 있다. US 6,258,605에는 신생 집단의 아실카르니틴 및 아미노산을 혈액 샘플에서 스크리닝하기 위한 분석 방법이 기재되어 있다. US 6,627,444에는 현장 측정장치를 보정하는 것을 보조하기 위한 샘플링 기구가 기재되어 있다.
또한, US 2006/0057554에는 유체 샘플에 대한 불활성 흡수 매트릭스를 가진 지지체를 포함하는 샘플 수집 기구가 기재되어있으며, 상기 매트릭스는 바람직하기로는 내부 표준물질로서 사전에 보정된 선택 무기 분석물을 포함하고 있다. 또한, US 2003/0199102에는 시험을 거친 내부 표준물질이 포함된 복수개의 셀로 구성된 테스트 트레이가 기재되어 있다. 이 테스트 트레이는 생체 체액에 대해 여러차례 의 테스트를 수행하기 위한 것이다.
분석할 생물학적 샘플을 취급하기 위한, 그외 샘플 기구들이 종래에 공지되어 있다. 그 예로, Tanaka et al., Clinical Chemistry 47: 10, 1829-1835 (2001)에는 용혈성이 낮고 혈청 성분의 수율이 일정하게 높은 마이크로크기의 혈액-샘플링 기구가 개시되어 있다.
그러나, 공지된 샘플 기구는 여러가지 문제점을 가지고 있다. 특히, US 6,627,444에 개시된 기구는 오직 가온(heating)에 의해서만 보정 화합물을 방출하도록 설계되어 있다. 또한, 이것은 장치 보정용으로만 설계되어 있다.
US 2006/0057554에 개시된 기구와 같은 다른 기구들은 추출 및 유도체화용 기구로 특수하게 설계된 기구에 미리 내재화되는(preembedded) 안정적인 동위원소로 표지된 동일한 유기 화합물을 사용할 수 없다.
전술한 종래 기술의 문제점을 고려하여, 본 발명은 생물학적 샘플에서 약물의 프로파일 또는 대사산물의 프로파일의 고효율적이며 신뢰성 높은 개선된 정량 분석, 즉 약물 및 그 대사산물과 유사한 내인성 및 외인성 화합물의 농도 및 다양한 생물학적 샘플로부터 유래된 대사산물의 농도에 대한 개선된 정량 분석을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 질량 분광 분석의 요건인 비교적 무염(salt-free)인 전술한 개선된 분석을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 본 발명은 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하는데 이용할 수 있는, 샘플 준비 기구를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 기구용 인써트, 상기 기구를 포함하는 키트 및 상기 기구를 포함하는 장치 를 제공하는 것을 목적으로 한다.
발명의 개요
놀랍게도 본 발명에서 인지한 문제점들은 하기 측면을 포함하는 본 발명에 따라 해결된다.
본 발명의 제1 측면은 (a) 지지체 및 (b) 상기 지지체에 함침된(impregnated) 하나 이상의 내부 표준물질을 포함하는, 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하는데 적합한 기구용 인써트를 제공한다.
본 발명의 제2 측면은 (a) 하나 이상의 웰 또는 바이얼, 및 (b) 제1 측면에 따른 인써트를 포함하는, 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하기 위한 기구를 제공한다.
본 발명의 제3 측면은 캡슐화되며 제1 측면에 따라 이용하기에 적합한, 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하기 위한 내부 표준물질을 제공한다.
본 발명의 제4 측면은 제2 측면에 따른 기구를 포함하는, 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물 프로파일을 정량 분석하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 제5 측면은 (a) (a1) 자동 액체 취급 시스템과 (a2) 샘플에 존재하는 약물 및/또는 대사산물의 유도체화 및 이후 유도체 추출을 위한, 제2 측면에 따른 하나 이상의 기구를 포함하는, 스크리닝해야 할 약물 및/또는 대사산물을 준비하기 위한 처리 유닛; (b) 정량적으로 표적화된 질량 분석을 위한 질량 측정기; 및 (c) 분석 결과를 저장하기 위한 데이타베이스를 포함하는, 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하기 위한 장치를 제공한다.
본 발명의 제6 측면은 본 발명의 인써트 및/또는 기구 및/또는 내부 표준물질 및/또는 키트 및/또는 장치를 이용하여, 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
이하, 본 발명은 특히 바람직한 구현예를 들어 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 추가적인 처리 및 예컨대 질량 측정기로 결국 분석하기 위하여, 측정될 생물학적 샘플이 투입될 수 있는, 바이얼 또는 웰에 미리측정된 내부 표준물질(일반적으로 기준 화합물)이 함유되어 있는 간단한 기구에 관한 것이다. 상기 기구는 다공성일 수 있으며 몰량을 알고 있는 하나 이상의 표준 물질을 함유하는 인써트를 포함한다. 또한, 이들 내부 표준물질의 저장 기간을 연장하기 위해 보호 매트릭스에 캡슐화/내재화(embedded)될 수 있다. 상기 보호 매트릭스는 비제한적으로 비천연성 포스파티딜콜린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 또는 점성 글리세롤 또는 소르비톨 용액중 어느 하나를 포함한다. 상기 기구는 생물학적 샘플에서 대사산물의 프로파일을 분석하거나 및/또는 약물의 프로파일을 분석하는데(즉, 치료제 모니터링, TDM)에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 하기에서 대사산물의 프로파일 분석에 대해 언급되어 있더라도, 그 내용으로 한정되는 것은 아님을 이해하여야 한다. 실제 반대로, 동일한 사항은 약물 프로파일의 분석에도 적용된다.
하기에서, 본 발명의 기구의 구성 부재 및 상기 기구의 용도를 설명한다.
본 발명에 따른 기구는 (A) 하나 이상의 웰/바이얼, 및 (B) 하나 이상의 인써트를 포함한다. 상기 인써트는 (a) 지지체와 (b) 상기 지지체에 함침된 하나 이상의 내부 표준물질을 포함한다. 상기 인써트는 도 1에서 숫자 2로 표시된다.
인써트
용어 '인써트'는 본원에서 내부 표준 물질과 선택적으로 화합물 보호제를 포함하고 있는 다공성 지지체인 것으로 이해되어야 한다. 인써트는 기구의 웰 또는 바이얼에 인써트가 딱 들어맞는 길이의 모든 기하학적인 형태를 가질 수 있다. 바람직한 예로, 유지체를 이용하여 기구의 웰 또는 바이얼 내부에 인써트를 배열시킬 수 있다. 상기 유지체는 도 1에서 숫자 3으로 표시된다. 특히 바람직한 예로, 유지체(3)는 인써트와 웰 간에 어떠한 직접적인 접촉없이 웰 내부에 인써트가 배치되게 한다. 따라서, 인써트는 바람직하기로는 웰 바닥에서 2 내지 10 mm 위에, 더 바람직하기로는 3 내지 5 mm 떨어지도록 유지체에 의해 위치화된다. 즉, 바람직한 예로, 웰의 바닥과 인써트, 및/또는 웰의 벽과 인써트 사이에 이른바 "갭" 또는 "간격"이 있다. 바람직한 예로, 유지체는 웰의 바닥과 인써트 사이에 갭이 형성될 수 있을 만큼의 적절한 길이이다. 이러한 배치는 샘플을 지지체 위에 둘 수 있게 지지체의 표면적을 최대화한다. 또한, 설계는 적용한 후 샘플을 신속하게 건조시킬 수 있도록, 인써트 주변의 공기 또는 다른 건식 가스의 흐름에 의해 인써트에 충분히 접근가능하게 한다. 이러한 설계 원칙은 또한, 최소의 단백질 또는 염 오염물질이 있는 샘플로부터 대사산물이나 약물 추출을 가능하도록 모든 측면으로의 용액 흐름에 의해, 인써트에 충분히 접근할 수 있게 하다. 따라서, 지지체의 기공은 최소한의 용매를 사용하면서 지지체 내에서 반응(유도체화)이 진행되게 하며, 또한, 이후 과잉의 유도체 및 용매의 증발에 의한 제거는 샘플 주변의 순환성 건식 가스(공기 또는 질소)에 대한 표면적을 최대화함으로써 이루어진다. 또한 전체 지지체의 표면적 증가 및 용매 이동성 증가는 적절한 용매를 이용한 고효율적인 추출을 가능하게 한다. 즉, 상기 갭은 웰 내부에서 거의 자유로운 인써트 배치를 허용하며, 웰을 통해 흐르는 유체의 순환성을 향상시킨다.
또한, 본 발명의 바람직한 예에 따라, 기구는 쌓인 형태로 배열된 2 이상의 인써트를 포함할 수 있으며, 각각의 인써트는 유체의 순환이 가능하도록 서로 상기에서 언급한 갭을 가지며 배열되는 것이 더욱 바람직하다.
지지체
본원의 지지체는 바람직하기로는 중간 수준 이상, 바람직하기로는 높은 수준의 다공도를 가진 임의 지지체일 수 있다. 이러한 지지체는 대체적으로 종래 기술분야에서 공지되어 있으며, 또는 상업적으로 구입가능하다.
매질(즉, 지지체)의 다공도 "φ"는 물질의 총 부피에 대한 고형부를 제외한 부피의 비율로 정의되며, 하기 수학식으로 정의된다:
(수학식)
φ = Vp / Vm
상기에서, Vp는 고형부를 제외한 부분의 부피(기공과 액체)이고, Vm은 고형부와 비고형부를 포함한 물질의 총 부피이다.
따라서, 다공도는 상기 분수를 100%로 곱하여 백분율로 나타낼 수도 있지만, 전형적으로는 고형 화강암의 0.01 미만에서 이탄과 점토의 0.5 보다 높은 범위인, 0 내지 1이이다. 본 발명의 다공성 지지체의 다공도는 30% 이상, 더 바람직하기로는 50% 이상, 보다 더 바람직하기로는 70% 이상이며, 가장 바람직하기로는 90% 이상이다.
인써트에 사용되는 다공성 지지체는 임의의 적정 물질일 수 있으며, 바람직하기로는 고형 지지체이다. 더 바람직하기로는, 다공성 지지체는 액체에 대한 흡수성 물질(또한, 액체 흡수 물질이라함)으로 구성된다. 더 바람직하기로는, 상기 지지체는 액체 흡수성 물질로 이루어져 있다. 흡수성 물질은 흡착제 또는 흡착성 물질일 수 있다.
본원의 액체 흡수성 물질은 내부 표준물질의 용액과 분석하기 위한 후속적인 샘플이 기공을 통해 일정하게 흡착 또는 흡수되게하며, 부가적으로 증발에 의해 담체 용매를 제거할 수 있는 임의 물질인 것으로 이해하여야 한다.
지지체 물질에 의해 흡착 또는 흡수가능한 액체는 모든 종류의 액체일 수 있지만, 바람직하기로는 대기압에서의 휘발성 액체, 예컨대 대기압에서 끓는 점이 약 섭씨 250(C) 미만인 액체가 바람직하다.
더 바람직하기로는, 본 발명에 따른 액체 흡수성 물질은 셀룰로스와 같은 카보하이드레이트 물질, 유리 섬유, 유리 비드, 폴리아크릴아미드 겔, 다공성 플라스틱 불활성 폴리머 및 다공성 흑연 중에서 하나 이상을 포함한다. 상기 다공성 흡수성 물질은 더 바람직하기로는 아가로스, 아가, 셀룰로스, 덱스트란, 키토산 또는 곤약과 같은 카보하이드레이트 물질이나 그 유도체, 카나기난, 젤란 또는 알기네이트를 포함할 수 있다. 그러나, 가장 바람직하기로는, 액체 흡수성 물질은 셀룰로스나 유리 섬유로 제조된다. 지지체 또는 액체 흡수성 물질의 형태는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하기로는 구형, 사각형 또는 소용돌이형이거나 또는 노틸러스 구조(nautilus dimension)이다. 본 발명에서, 지지체 또는 흡수성 물질의 형태는 기구의 웰 또는 바이얼의 형태에 맞게 변경된다. 전술한 바와 같이, 다공성 지지체 또는 흡수성 물질은 유지체와 같은 고정 구조에 의해 웰 또는 바이얼에서 제 위치로 고정 또는 부착될 수 있다(도 1의 3).
액체 흡수성 물질을 포함하는 다공성 지지체는 대개 2가지 기능을 가지고 있다. 첫번째는, 후술되는 바와 같이, 생물학적 샘플 첨가를 대비하여 내부 표준물질을 미리 결정된 농도로 함유하는 것이다. 두번째는, 각 샘플의 내용물을 고정화하는 것이다. 이러한 고정화 단계는 세포 용해(cell lysis), 단백질 고정화/침전 및 각 샘플에서 염과 그외 다수의 약물이나 대사산물 보유를 유도한다. 지지체의 다공성은, 유도체화제 및 분석을 위해 첨가되는 추출 용매 모두에 최대한으로 노출되게 하는데 필수적이다.
내부 표준물질
본 발명에 사용되는 내부 표준물질은 주어진 샘플에 존재하는 화합물의 양을 정량하기 위해, 유사한 또는 동일한 화합물에 대한 비교로 사용되는, 양을 알고있는 절대량의 비교 물질인 것으로 이해하여야 한다. 바람직하기로는, 내부 표준물질은 유기성 내부 표준물질이다. 본 발명에 사용되는 내부 표준물질은 생물학적 샘플에서 분석할 화합물과 동일한 그룹 또는 패밀리에 속할 수 있다. 그러나, 이것은 샘플의 대사산물과 내부 표준물질간의 적절한 구별을 위해, 동위원소로 표지된다. 샘플의 대사산물을 내부 표준물질과 구별하는 다른 방법도 또한 사용할 수 있다. 예로, 비천연성 화합물을 내부 표준물질로서 사용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 내부 표준물질의 구체적인 예는 하기 표 1에 기재되어 있다.
표 1
지질
약어 명칭 코멘트
지방산의 체인 수
SM(d18:1/6:0) N-헥사노일-스핑-4-에닌-1-포스포콜린 6
GPCho(9:0/0:0) 1-노나노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 9
GPCho(14:0/14:0) 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 28
GPIns(16:0/16:0) 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-미오-이노시톨) 32
GPCho(20:0/20:0) 1,2-디-(3,7,11,15 테트라메틸 헥사데카노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 40
GPSer(20:0/20:0) 1,2-디-(3,7,11,15 테트라메틸 헥사데카노일)-sn-글리세로-3-포스포세린 40
GPser(6:0/6:0) 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포세린 12
아미노산
약어 명칭 코멘트
13C-15N-Gly 13C2-15N-글리신
D4-DL-Ala D4-DL-알라닌
15N2-L-Argl 15N2-L-아르기닌 HCl
D3-DL-Asp D3-DL-아스파르트산
15N2-L-Asn 15N2-L-아스파라긴 H2O
D3-L-Glu D3-L-글루탐산
D5-L-Gln D5-L-글루타민
13C6-L-His 13C6-L-히스티딘 H2O
13C6-L-Ile 13C6-L-이소루신
13C-L-Lys 13C-L-라이신 2HCl
D3-L-Met D3-L-메티오닌
D6-L-Orn D6-L-오르니틴 HCl
D5-L-Phe D5-L-페닐알라닌(ring 5-Phe)
D7-L-Pro D7-L-프롤린
D3-DL-Se D3-DL-세린
13C4-L-Thr 13C4-L-트레오닌
15N2-L-Trp 15N2-L-트립토판
D4-L-Tyr D4-L-티로신(ring 4-tyr)
D8-DL-Val D8-DL-발린
아실카르니틴
약어 명칭 측쇄 길이
D3-C0 [d-메틸]-카르니틴 HCl C = 0
D9-C0 [d9-트리메틸]-카르니틴 HCl C = 0
D3-C2 [d3]-아세틸-L-카르니틴 HCl C = 2
D3-C3 [3,3,3-d3]-프로피오닐-L-카르니틴 HCl C = 3
D3-C4 [4,4,4-d3]-부티릴-L-카르니틴 HCl C = 3
D7-C4 [d7]-이소부티릴-L-카르니틴 HCl C = 4
D3-C5 [5,5,5-d3]-발레릴-L-카르니틴 HCl C = 4
D9-C5 [d9]-이소발레릴-L-카르니틴 HCl C = 5
D3-C6 [6,6,6-d3]-헥사노일-L-카르니틴 HCl C = 6
D3-C8 [8,8,8-de]-옥타노일-L-카르니틴 HCl C = 8
D3-C10 [10,10,10-de]-데카노일-L-카르니틴 HCl C = 10
D3-C12 [12,12,12-d3]-도데카노일-L-카르니틴 HCl C = 12
D3-C14 [14,14,14-d3]-테트라데카노일-L-카르니틴 HCl C = 14
D3-C16 [16,16,16-d3]-헥사데카노일-L-카르니틴 HCl C = 16
D3-C18 [18,18,18-d3]-옥타데카노일-L-카르니틴 HCl C = 18
환원성 단당류
약어 명칭 코멘트
13C6-Glc 13C6-글루코스
피루베이트/락테이트
약어 명칭 코멘트
13C3-Pyr 13C3-피루베이트
크레아티닌
약어 명칭 코멘트
[d3-메틸]-크레아티닌
면역억제제
약어 명칭 코멘트
아스코마이신
사이클로스포린D
32-데스메톡시라파마이신
생물학적 샘플
본 발명에 사용되는 생물학적 샘플은 생명 또는 살아있는 유기체, 성장 및 소화와 같은 생물학적 과정과 관련있는, 그에 의해 초래된, 또는 영향을 미치는, 임의 샘플인 것으로 이해하여야 한다.
생물학적 샘플의 예는, 혈액, 세포 배양 상층물, 타액, 눈물, 뇨, 혈액, 혈청, 혈장, 땀, 질 분비물, 정액, 대변, 점액, 모유, 복수, 림프, 흉막삼출물, 활액(synovial fluid), 골수, 뇌척수액 및 신체의 강(예, 기관지 세척액), 모발, 조직, 뼈 또는 치아의 세척액을 비제한적으로 포함할 수 있다.
바람직하기로는, 생물학적 샘플은 액체 샘플이다. 더 바람직하기로는, 생물학적 샘플은 혈액이며, 가장 바람직하기로는 인간의 혈액이다. 액체는 물처럼 25도에서 한정된 모양을 갖지 않는 한정된 체적을 갖는 물질의 상태를 의미한다.
대사산물 프로파일
본 발명에 사용되는 대사산물 프로파일은 다른 샘플이나 샘플 그룹으로부터 유래된 비교 수치 또는 프로파일과 비교하는데 사용할 수 있는, 대사산물의 규정된 정량적 결과치 세트인 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 병에 걸린 환자로부터 수득한 샘플의 대사산물 프로파일은 유사하게 매치되는 건강한 환자의 샘플의 대사산물과 현저하게 달라야 한다.
비제한적으로 아미노산, 펩티드, 아실카르니틴, 단당류, 지질 및 인지질과 같은 대사산물, 프로스타글란딘, 하이드록시에이코사테트라에노익산, 하이드록시옥타데카디에노익산, 스테로이드, 담즙산 및 글리코- 및 인지질을 검출 및/또는 정량할 수 있다.
본 발명에 따라 질량 측정기에 의해 분석가능한 대사산물의 예는 표 2에 나열되어 있다. 특히, 기재된 지질산 잔기에서 C4:X 내지 C46:X (X는 포화 정도로 0 내지 8임)인 지질 종을 나타낸다. 지질은 또한 스핑고리피드 및 글리코스핑고리피드를 포함한다.
검출 및 정량할 수 있는 아미노산은 단백질을 형성하거나 형성하지 않는 아미노산이다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 단백질을 형성하는 아미노산과 형성하지 않는 아미노산이 바람직하다.
C4:X 내지 C18:X(X는 포화 정도이며, 주어진 산 잔기에서 0 내지 8임)의 아실카르니틴을 검출 및/또는 분석할 수 있다. 바람직한 아실카르니틴은 표 2에 나열되어 있다.
단당류는 바람직하기로는 환원성 또는 비-환원성 카보하이드레이트이다. 단당류의 예 역시 표 2에 기재되어 있다.
표 2
지질:
약어 지질 서브타입의 명칭 코멘트
글리세로인지질, 스핑고리피드 및 글리코스핑고리피드 지방산의 체인 길이
Shp 스핑고신 없음
Cer 세라마이드 C6:X - C36:X
SM 스핑고마이엘린 C6:X - C36:X
Sph pchol 스핑고실포스포릴콜린 없음
Sph dh 디하이드로스핑고신 없음
PC 포스파티딜콜린 C4:X - C46:X
PI 포스파티딜이노시톨 C4:X - C46:X
PS 포스파티딜세린 C4:X - C46:X
PC(a) 리소포스파티딜콜린 C4:X - C32:X
PI(a) 리소포스파티딜이노시톨 C4:X - C32:X
PS(a) 리소포스파티딜세린 C4:X - C32:X
PC(e) 플라스메닐포스파티딜콜린 C4:1 - C32:X
PC(e) 플라스마닐포스파티딜콜린 C4:0 - C32:0
아미노산
단백질을 형성하는 아미노산
약어 명칭 코멘트
A Ala 알라닌
D Asp 아스파르트산
E Glu 글루탐산
F Phe 페닐알라닌
G Gly 글리신
H His 히스티딘
Xle 루신/이소루신
K Lys 라이신
M Met 메티오닌
P Pro 프롤린
R Arg 아르기닌
S Ser 세린
T Thr 트레오닌
V Val 발린
W Trp 트립토판
Y Tyr 티로신
ADMA 비대칭성 디메틸 아르기닌 LS MS 방법
SDMA 대칭성 디메틸아르기닌 LS MS 방법
Q Gln 글루타민
N Asn 아스파라긴
니트로티로신 LS MS 방법
하이드록시프롤린 LS MS 방법
키뉴레닌 LS MS 방법
3-하이드록시 키뉴레닌 LS MS 방법
단백질을 형성하지 않는 아미노산
약어 명칭 코멘트
O Orn 오르니틴
Cit 시트룰린
아실카르니틴
약어 명칭 코멘트
C0 카르니틴(유리형 카르니틴) C0
C2:X - C18:X 아실카르니틴 C0:X - C26:X
C3:X-OH - C18:2-OH 하이드록실아실카르니틴 C3-OH - C18:2-OH
C3:0-DC - C18:2-DC 디카르복실아실카르니틴 C3:0-DC - C12:0-DC
환원성 단당류
약어 명칭 코멘트
H 헥소스
P 펜토스
dH 데옥시헥소스
기타
약어 명칭 코멘트
Cr 크레아티닌
스페르미딘 LS MS 방법
스페르민 LS MS 방법
푸트레신 LS MS 방법
도파민 LS MS 방법
세로토닌 LS MS 방법
프로스타글란딘 LS MS 방법
하이드록시에이코사테트라에네오익(HETE) LS MS 방법
하이드록시옥타데카디에노익(HODE) LS MS 방법
루카트리엔 LS MS 방법
트롬복산 LS MS 방법
담즙산 LS MS 방법
스테롤 LS MS 방법
콜레스테롤 LS MS 방법
비타민 및 보조인자
약물 및 약물 대사산물 LS MS 방법
약물 프로파일
본 발명에 사용되는 약물 프로파일은 특정 샘플에서 하나 이상의 약물 또는 약물 대사산물의 한정된 정량 결과치 세트로 이해하여야 한다. 더욱이, 특정 예로서 면역억제제를 검출 및 정량할 수 있다. 예로, 이식 환자의 약물 프로파일은 의사에게 실시중인 하나 이상의 약물 치료제의 즉각적인 순환 함량을 제공할 것이며, 따라서 최상의 치료 효과를 이루기 위하여 측정된 함량에 따라 투여량은 증가 또는 감소할 수 있다. 이러한 분석은 치료약물 모니터링(TDM)이라고 한다. 본 발명에 있어, 면역억제제는 면역계의 활성을 저해 또는 방지하기 위하여 면역억제 요법에 사용될 수 있는 약물로서 이해된다. 임상적으로, 이를 사용하여 이식한 장기 및 조직의 거부 반응을 방지하고, 류마티스 관절염, 근무력증, 전신 홍반성 루푸스, 크론 질병 및 궤양성 대장염과 같은 자가면역 질환을 치료한다. 본원에서 언급된 면역억제제는 기본적으로 4가지 그룹으로 분류할 수 있다: 글루코코르티코이드, 세포증식억제제(cytostatics), 항생제 및 이뮤노필린(immunophilin)에 작용하는 약물. 본 발명에 사용되는 면역억제제의 바람직한 예는 사이클로스포린 A, 시롤리무스, 에베롤리무스 및 타크롤리무스이다.
표준물질의 캡슐화
본 발명에 따른 내부 표준물질은 피복성 물질이나 보호성 물질로 캡슐화하여, 사용하기 전에 내부 표준물질의 분해 및 화학 반응성을 방지하는 것이 바람직하다. 분해 및 화학 반응성으로부터 내부 표준물질을 보호하여, 햇빛, 온도 및 미생물의 작용 방지와 같이, 다양한 형태의 내부 표준물질 파괴 또는 화학적 변형을 방지할 수 있으며, 특히 내부 표준물질을 파괴 또는 분해 산물로 변환시키는 임의 과정을 방지하여, 따라서 정량 분석 결과에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에서 사용되는 보호/피복 물질은 차폐용 물질, 또는 내부 표준물질(들)을 분해로부터 차폐시키도록 되어있는 임의 물질인 것으로 이해하여야 한다.
본 발명에 있어 보호/피복 물질은 전술한 바와 같이 환경 영향으로부터 내부 표준물질을 보호하기에 적합한 임의 물질일 수 있다. 본 발명에 있어 피복 물질은 바람직하기로는 하나 이상의 폴리머, 마이셀 형성 화합물, 리포좀 형성 화합물, 폴리하이드록시 화합물, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
피복 물질이 폴리머라면, 본 발명에서 폴리머는 특별히 제한되지 않으며, 그 구조가 소형 단량체 유닛의 반복으로 표시되는, 평균 분자량이 500 g/mol 이상, 1,000 g/mol 이상, 5,000 g/mol 이상, 또는 10,000 g/mol 이상인 화합물과 같은 고분자량의, 천연 또는 합성 유기 화합물인 것으로 이해된다. 합성 폴리머는 단량체의 첨가 또는 축합 중합 반응과 같이 당업계에 공지된 방법으로 만든다. 본 발명의 폴리머에 또한 2 이상의 상이한 단량체가 참여하는 경우에, 코폴리머일 수 있다. 호모폴리머는 한 종류의 단량체로만 구성된 폴리머이다.
본 발명에 따른 폴리머는 바람직하기로는 폴리알킬렌 글리콜 호모폴리머, 코폴리머 또는 이의 혼합이다. 평균 분자량은 바람직하기로는 약 1000 달톤(Da)이다. 더 바람직하기로는, 본 발명에 따른 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)이며, 바람직하기로는, 비극성 용매에 비해 극성이 높거나 낮은, 용매에 가용적이거나 혼화가능한, 평균 분자량 약 1000 Da의 PEG 1000이다.
피복 물질이 마이셀 형성 화합물이라면, 본 발명에 사용되는 화합물은 콜로이달 시스템에서 액적(droplet)으로서 초현미경적 분자 응집을 유도할 수 있는 임의 화합물인 것으로 이해하여야 한다. 본 발명에 따른 마이셀 형성 화합물은 바람직하기로는 계면활성제이다.
본 발명에 사용되는 계면활성제(surfactant)는 2종의 액체 사이에 표준 장력을 감소시키는 임의 화합물, 또는 산물의 에멀젼화, 발포(foaming), 분산, 확산 및 습윤 특징을 증가시키는 임의 계면-활성제(surface-active agent), 특히 한쪽 말단에 친수성기를 포함하고 다른 쪽 말단에 친지성 기를 포함하는 임의 유기 화합물인 것으로 이해하여야 한다. 적합한 계면활성제로는 양이온성, 음이온성, 비이온성 및 양쪽성 계면활성제가 있다. 바람직하기로는, 계면활성제는 포스파티딜(C17:0)2이다.
피복 물질이 리포좀 형성 화합물이라면, 본 발명에 사용되는 화합물은 백신, 약물, 효소 또는 세포 또는 장기를 타겟으로 하는 다른 물질을 전달하기 위해 사용되는, 하나 이상의 인지질층에 봉입된 수성 코어로 이루어진 인공적인 미세한 소포(microscopic vesicle)를 만들 수 있는 임의 화합물인 것으로 이해하여야 한다.
본 발명에 사용되는 인지질은 당업계에서 일반적인 방식으로 이해되며, 글리세롤 및 지방산으로 만들어지며 포스페이트기가 결합된, 렉시틴 및 세팔린과 같은 인 함유성 지질을 포함하여야 한다. 더 바람직하기로는, 리포좀 형성 화합물은 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민 또는 그 유도체와 같은 인지질이다.
피복 물질이 폴리하이드록시 화합물이라면, 본 발명에 사용되는 화합물은 2개 이상의 하이드록시 기를 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 가장 바람직하기로는, 상기 폴리하이드록시 화합물은 소르비톨 및/또는 글리세롤이다.
바람직하기로는, 본 발명에 따른 캡슐화는 마이크로캡슐화이다. 본 발명에 사용되는 마이크로캡슐화는 압력에 의해 파괴되거나 용해 또는 용융될 때 그 내용물이 방출되게 되어 있는 작은, 바람직하기로는 미세 캡슐인, 임의의 마이크로캡슐의 캡슐화일 것으로 이해하여야 한다. 특히, 본 발명의 캡슐은 직경이 바람직하기로는 100 ㎛ 미만, 더 바람직하기로는 10 ㎛ 미만, 가장 바람직하기로는 1 ㎛ 미만이다.
마이크로캡슐에 내재된 내부 표준물질은 저장 및 운반 측면에서 견고하며, 산화 및 분해 과정에 안정적이며, 비교적 저장 수명이 길다. 마이크로캡슐화는 바람직하기로는 마이크로캡슐화된 성분을 기초로 품질이 관리된 합성 물질을 제조하기 위해 표준화된다. 이는, 전형적으로 인지질에 대한 클로로포름/메탄올 혼합물과 같이 이들 화합물에 적합한 용매인 용매중에서 피복 물질과 함께 가라앉은 내부 표준물질과 그외 보호된 샘플을 건조함으로써 이룰 수 있다. 전형적으로 이들 샘플에 물 첨가는 마이셀 및/또는 리포좀 형성이 이루어지도록 유도하며, 이후 수중에서 이들 내부 또는 외부 표준 친지성의 보호된 화합물의 내재화(embedding)를 이룰 수 있다.
예컨대, 기구는 하기와 같이 제조된다: 적합한 용매에 용해된 내부 표준물질을 확정된 양으로 다공성 지지체 상에 파이펫팅하여 건조한다. 이 과정은 모든 내부 표준물질 또는 기구에 사용되는 내부 물질의 클래스에 대해 반복한다. 캡슐화를 제공한다면, 최종 단계로서, 바람직하기로는 적합한 용매 중에서 캡슐화/피복 물질을 내부 표준물질을 포함하고 있는 지지체(즉, 인써트) 상에 놓고 건조한다. 다음으로, 바람직하기로는 유지체와 같은 고착하는 수단 또는 고정하는 구조를 이용함으로써 인써트를 웰 내부에 장착한다. 대안적으로는, 내부 표준물질과 선택적으로 피복 물질을 지지체 상에 파이펫팅하기 전에 지지체를 웰에 장착할 수 있다.
멀티-기구
본 발명에 사용되는 멀티-기구는 마이크로타이터 플레이트 표준 형태와 같이 멀티-기구를 형성하기 위해 함께 조합된 복합 기구인 것으로 이해하여야 한다.
본 발명에 사용되는 마이크로타이터 플레이트는 생물학 또는 화학 연구소에서 사용되는 모든 플라스틱 샘플 홀더인 것으로 이해하여야 한다. 표준적인 마이크로타이터 플레이트는 1996년의 the Society for Biomolecular Screening (SBS)에 의해 만들어졌다. 이것은 전형적으로 2:3 직사각형 매트릭스로 배열된 6, 24, 96, 384 또는 1536개의 샘플 웰이 있다. 웰의 용적(예, 직경, 간격 및 깊이)과 플레이트 특성(예, 구조 및 강성)은 표준에 따른다.
멀티-기구에서, 구성 요소에 대해 전술한 바와 동일한 설명이 적용된다. 따라서, 멀티-기구는 바람직하기로는 화학적으로 불활성인 유지 구조에 의해 하나 이상의 웰 내부에서 유지되는, 셀룰로스 또는 유리 섬유와 같은 다공성 지지체를 포함한다. 다공성 지지체에는 건조 상태에서 그 내부에, 선택적으로 보호물질, 피복 물질 또는 화합물의 혼합물, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 1000, 포스파티딜콜린, 글리세롤 또는 소르비톨로 마이크로캡슐화된(코팅된), 표준 물질이 내재화된다.
다중적인 형태의 기구는 멀티-기구라고 하며, 또한 여러가지 형태를 갖는다. 미리-내재시키는(Pre-embedding) 수개의 바이얼, 예컨대 6개의 웰은, 복수개의 보정 화합물로 6 포인트 보정을 수행한다. 공지 대사산물 및/또는 약물을 여러 농도로 포함하고 있는 정성 관리된 샘플은 사전에 내재된다.
웰
본 발명에 사용되는 웰은, 추출 및 화학 반응이 이루어질 수 있으며, 바람직하기로는 용매 및 유도체 저항성인 물질로 이루어진 모든 바이얼 또는 튜브인 것으로 이해하여야 한다.
기구의 하나 이상의 웰(도 1의 숫자 1)은 바람직하기로는 미크론 크기의 고형물을 분리하기 위한 하나 이상의 필터(도 1의 숫자 4), 더 바람직하기로는 미크론 크기의 고형물을 분리하기 위한 실제 하나의 필터(4)를 포함한다. 기구의 한개 이상의 웰은 바람직하기로는 여과물 배출을 위한 하나 이상의 배출구(도 1의 5)를 포함한다.
본 발명에 사용되는 웰에 포함된 필터는 현탁된 미립자 물질로부터 유체를 분리하기 위해 액체나 가스가 통과하는 임의 다공성 물질인 것으로 이해하여야 한다. 필터(4)는 바람직하기로는 50 내지 0.01 ㎛, 더 바람직하기로는 5 내지 0.1 ㎛, 보다 더 바람직하기로는 1 내지 0.3 ㎛의 기공을 갖는다. 가장 바람직하기로는, 필터(4)의 기공 크기는 0.45 ㎛이다.
본 발명에 있어, 바람직하기로는 필터(4)는 인써트(2)와 배출구(5) 사이에 위치된다.
게다가, 본 발명에 따른 배출구(5)는 원심력 또는 감압, 바람직하기로는 500 mbar 미만의 감압 인가하에서 개방되는 것이 바람직하다. 감압은 바람직하기로는 웰(1)의 배출구(5) 쪽에 적용된다. 대안적으로, 인써트(2)로부터 배출구(5)로 흐르게 하기 위해, 인써트(2) 쪽의 압력을 증가시킬 수 있다.
키트
본 발명에 따른 키트는 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일 정량 분석하기 위한 키트로도 사용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 키트는, 통상적으로 분석 장치와 조합하여 대사산물 범위를 정량 표적 분석하기 위하여, 여러가지 대사산물들을 준비할 수 있는 기구에 포함된 모든 시약, 용매, 소프트웨어 시스템인 것으로 이해하여야 한다.
장치
또한, 본 발명에 따른 기구는 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하기 위한 장치에 사용할 수 있다. 상기 장치는 (a) (al) 자동 액체 취급 시스템 및 (a2) 샘플에 존재하는 약물 및/또는 대사산물의 유도체화 및 유도체의 이후 추출을 위한 전술한 하나 이상의 기구를 포함하는, 스크리닝할 약물 및/또는 대사산물을 준비하기 위한 처리 유닛; (b) 정량적으로 표적화된 질량 분석을 이용한 분석을 위한 질량 측정기; 및 (c) 분석 결과를 저장하는 데이타베이스를 포함한다.
본 발명에 사용되는 장치(또는 플랫폼)는 질량 측정기로 분석하기 위해 생물학적 샘플을 완벽하게 준비하는 임의 장치인 것으로 이해하여야 한다. 이는, 추출, 유도체화, 탈염 및 농축 과정을 포함한다. 또한, 이는 모든 가능한 조합의 이러한 과정들 중 일부 또는 전체를 전체적으로 자동화된 방식으로 포함하며, 바람직하기로는 액체 취급 시스템은 샘플 원심분리기, 샘플 열처리기, 샘플 냉각기, 샘플 교반기, 샘플 건조기, 샘플 파이펫팅기 및 샘플 균질화기와 조합된다.
본 발명에 사용되는 액체 취급 시스템은 바이얼 및 마이크로타이터 플레이트의 내부 및 외부로 수많은 타입의 용매를 정확하게 흡인 및 분배할 수 있는 모든 기계 장치인 것으로 이해하여야 한다. 액체 취급 시스템은 액체 취급 시스템에서 컴퓨터 및 소프트웨어를 통해 조작할 수 있다.
본 발명에 사용되는 데이타베이스 또는 데이타은행은 검색 및 복원이 용이하고 신속하게 정렬된 모든 데이타 수집인 것으로 이해하여야 한다.
본 발명에서 사용되는 표적화된 질량 측정기를 이용한 분석법은 하나 이상의 프리세트 이온 쌍이 사용되며, 표적 대사산물을 동정하기 위해, 상응하는 분석물의 특징인 숙지하고 있는 분획화 패턴에 의해 공지 대사산물을 규정하고 나타내는, 질량 분석으로 이해하여야 한다. 표적 대사산물의 농도를 계산하기 위하여, 적절한 내부 표준물질과 함께, 수득되는 이온 세기를 사용한다. 내부 표준물질은 특징적인 하나의 이온 쌍(또는 수개의 이온쌍)을 이용하여 식별되며, 수득되는 이온 세기는 내부 표준물질의 알고 있는 농도와 관련있어 상응하는 표적 대사산물의 정량화가 가능하다. 표적 대사산물 세트는 사전에 공지되어 있으며, 미리-주석을 달아둘 수 있다. 따라서, 검출 및 정량된 대사산물에는 이미 주석이 달려, 빠르고 직접적인 해석이 가능하다. 직렬 질량 측정기는 보다 구체적으로 이온 종들을 구별하기 위해 MSMS 분석이 가능한 질량 측정기가 특히 바람직하다. 바람직하기로는, 장치는 자동화된 표준적인 샘플 준비가 가능하며 고행상도의 직렬식 분자 분석 과정을 수행가능하다. 특히 자동 샘플 준비 과정은 나날이 신뢰성 높은 결과와 낮은 변이 계수(CV) 재현성을 증가시킨다. 예컨대, 전구체 이온 스캔으로 유도체화된 당을 분석하는 경우에, 유도체 그 자체는 질량 분석기로 검출할 수 있다. 파지티브 이온 모드에서, m/z 175에서는 페닐메틸피라졸론(PMP) (MH) + 이온의 형성이 바람직하다. 카보하이드레이트 자체나 또는 분리된 이성질체 조성물을 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 기구를 이용하여 대사체를 분석하는 경우, 분석 전 단계를 이용하여 마이크로타이터 함량의 생물학적 물질로부터 수백개의 대사산물을 동시에, 그리고 매우 신속하고 정확하고 민감하게 분석할 수 있다. 비교적 단시간에 품질을 인정받은(QA) 데이타를 개별 샘플로부터 수득하고 최신 통계 소프트웨어 툴을 이용하여 해석한다. 또한, 이러한 방법은 분석하기 전의 표준화 및 자동화를 통해 기존의 분석 병목 현상을 해결하며, 사용자에게 친근한 통계적 및 생화학적 데이타 해석을 제공한다. 본 발명의 방법에서 이렇듯 모든 구성을 새로운 기술 플랫폼으로 통합하여, 폭넓게 적용가능한 "생화학적 핑거프린팅"을 만들며 대사체학의 전파를 촉진시킬 것이다.
도 1은 웰 또는 바이얼과 개별 구성요소의 조립체를 포함하는 본 발명에 따른 단일 기구의 횡단도이다. 숫자 1은 웰/바이얼이다. 숫자 2는 선택적으로 (미세)캡슐화된 내부 표준물질이 포함된 유리, 셀룰로스 또는 그외 적합한 물질(즉, 다공성 지지체)의 부동의 고정상(immobilising stationary phase)으로 구성된 본 발명의 인써트이고, 숫자 3은 유도체 및 용매에 화학적으로 불활성인, 웰 또는 바이얼내에서 다공성 지지체를 지지하기 위한 유지체(retainer)이고, 숫자 4는 필터이고, 숫자 5는 원심력, 중력 또는 진공 압력하에 개방되는, 배출구이다.
도 2는 적혈구 샘플의 아미노산과 실시예 2에 기재된 멀티-기구로 준비한 안정적인 동위원소로 표지된 해당 내부 표준물질을 나타낸, 페닐티오르유레아 아미노 산 유도체(PTU)의 이온 직렬 질량 측정기를 이용한, 네거티브 모드에서의 135 중성 자 소실 스캔을 나타낸 것이다.
도 3A는 실시예 2의 적혈구 세포 샘플로부터 인지질을 추출하는 멀티-기구의 능력을 나타낸 파지티브 이온 모드에서 전구체(precursor)의 184 스캔(A)을 나타낸 것이다. 예로, 스핀고마이엘린 및 포스파티딜콜린은 m/z 범위 700 - 840에서 관찰가능하며, 리소 포스파티딜콜린(lyso phosphatidylcholine)은 m/z 범위 400 - 650에서 관찰가능하다.
도 3B는 실시예 2의 파지티브 이온 모드에서의 MRM 스캔(multiple reaction monitoring)을 나타낸 것이다.
도 4는 정성 관리한 혈액 샘플로부터 면역치료제인 시롤리무스, 에베롤리무스, 사이클로스포린A, 타크롤리무스 및 내부 표준물질인 아스코마이신과 사이클로스포린 D가 어떻게 LCMS로 분석되어 정량 데이타가 수득되는지 예시한 것이다. 내부 표준물질인 사이클로스포린 D 및 아스코마이신의 일체형 피크(integrated peak)의 면적은 농도를 알고 있는 5종의 정성 관리된 샘플의 면역억제제 피크 면적과 비교하였다. 이는 모두 4종의 약물에 대한 정확한 값을 제공한다.
도 5는 셀룰로스 인써트가 장착된 멀티-기구(실시예 3)로부터 수득한, 시롤리무스에 대한 측정기(calibrator)의 보정 곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 셀룰로스 인써트가 장착된 멀티-기구(실시예 3)로부터 수득한, 에베롤리무스에 대한 측정기의 보정 곡선을 나타낸 것이다.
도 7은 셀룰로스 인써트가 장착된 멀티-기구(실시예 3)로부터 수득한, 사이클로스포린 A에 대한 측정기의 보정 곡선을 나타낸 것이다.
도 8은 셀룰로스 인써트가 장착된 멀티-기구(실시예 3)로부터 수득한, 타크롤리무스에 대한 측정기의 보정 곡선을 나타낸 것이다.
본 발명은 하기 비제한적인 예를 들어 더욱 설명한다.
멀티-기구의 제조 및 조건
마이크로타이터 플레이트의 96웰(MSRP N04, Millipore Corp. MA, USA) 각각에, 다공성 지지체로서 (Schleicher Schuell Biosciences GmbH, Dassel, Germany, generic card - 10 539 859에서 자른) 7 mm의 셀룰로스 스팟을 이용하여 하나의 멀티-기구를 만들었다. 이는 폴리프로필렌(Biocrates, Tirol, Austria)으로 제조된 유지체를 이용하여 정위치에 고정하였다.
대사산물의 선택된 서브세트를 분석하기 위해, 이 경우에는 아미노산, 아실카르니틴 및 인지질을 샘플에서 분석하기 위해, 총 20개의 단백질을 형성하는 포스파티딜콜린, 스핑고마이에린 및 각각의 리소 종을 나타내기 위해, 안정적인 동위원소로 표지된 적합한 내부 표준물질로 선택한 아미노산, 아실카르니틴 및 지질을 사용하였다. 각 내부 표준물질 클래스의 정량을 파이펫팅하고, 각각은 다공성 지지체에서 건조시킨 다음 다음 차례의 내부 표준물질 혼합물을 첨가하여 건조함으로써, 멀티-기구의 다공성 지지체에 미리 내재시켰다. 본 실시예에서, 아실카르니틴을 첨가한 다음 아미노산을 첨가하고, 마지막으로 0.1 % w/w 폴리에틸렌글리콜 1000(PEG 1000)을 포함하고 있는 수용액중의 인지질 내부 표준물질, 두가지 목적의 화합물을 첨가한다. 계면활성제로서, PEG 1000은 모든 내부 표준물질로 코팅된 다 공성 지지체의 기공에 존재시켜, 산소 및 물에 노출되었을때 분해작용에 대한 보호벽을 제공한다.
상기 멀티-기구가 완전히 건조되면, 기술적인 보정 샘플을 멀티-기구의 첫번째 웰에서부터 5개의 웰에 넣었다.
웰 1: 블랭크
웰 2 및 3: 대조군, 비표지된 대사산물의 혼합물
웰 4: 정성 대조군, 저농도의 대사산물(정상 수준 또는 1X), 및
웰 5: 정성 대조군, 고농도의 대사산물(정상 수준의 10 X).
웰 1 내지 5에 미리-내재된 내부 표준물질과 추가적인 대조군 샘플이 있는 멀티-기구를 준비하여 4 ℃에 보관하였다.
멀티-기구를 이용하는 방법
[실시예 1]
하기는 단지 예시의 목적으로, 전술한 바와 같은 기구를 사용하여 대사산물의 선별 분석용 샘플을 처리하는 방법에 대한 설명이다.
대사산물, 아미노산, 아실카르니틴 및 인지질의 서브세트를 샘플로부터 분석하기 위하여, 총 20개의 단백질을 형성하는 아미노산, 가장 많은 아실카르니틴, 포스파티딜콜린을 포함하는 인지질, 스핑고마이에린 및 각각의 리소 종을 표시하기 위해, 안정적인 동위원소로 표지된 적합한 내부 표준물질로 선택한 아미노산, 아실카르니틴 및 지질을 사용하였다. 미리 결정한 양의 샘플, 전형적으로 혈장 10 ㎕를 첨가하여, 내부 표준물질과 샘플의 아미노산을 인써트의 기공내에서만 혼합하였 다. 대사산물의 소실 또는 분해를 초래하는 후속 처리는 내부 표준물질과 상호관련있을 것이다. 다음으로 인써트의 기공에 한정되어, 아미노산의 유도체화가 이루어질 수 있다. 본 실시예에서 유도체화제는 피리딘, 물, 에탄올의 1:1:1 용액중에 5% 페닐이소티오시안트 15 ㎕로 이루어져 잇다. 이러한 유도체화 과정은 실온에서 20분 미만동안 발생된다. 유도체성 용액은 거의 휘발되므로, 실온에서 완만한 질소 흐름 또는 진공하에서 간단하게 제거할 수 있다. 10 mM 암모늄 아세테이트를 포함하는 메탄올 용액을 첨가하여 유도체화된 아미노산, 아실카르니틴 및 인지질을 다공성 기구로부터 메탄올 용매로 동시에 추출한다. 이를 위해 선택되는 마이크로타이터 플레이트는 추가적인 특징을 갖는다. 이것은 0.45 ㎛의 필터와 원심력 또는 진공하에서만 각 웰의 바닥으로 개방되는 액체 배출구를 가지고 있다. 샘플의 메탄올 추출물은 원심분리에 의해 기구를 포함하는 마이크로타이터 플레이트 아래에 위치된, 포획-마이크로타이터 플레이트로 쉽게 모운다. 전형적으로 샘플을 질량 분석기로 이동시키기 위한 자동샘플링 장치를 이용하여 각 용액의 용액에 대한 질량 분석을 수행할 수 있다.
[실시예 2]
하기는 기구를 사용하여 샘플을 대사산물 선별 분석할 수 있음을 입증한다.
각 웰에, 한명의 환자의 혈액 샘플 10 ㎕을 정확하게 둔 멀티-기구에서, 다공성 지지체(인써트)의 기공 부위에서만, 내부 물질과 혼합한다. 대사산물의 소실 또는 분해를 초래하는 어떠한 후속적인 처리는 내부 표준물질과 상호 관련있을 것이다. 실시예 1과 같이 유도체화를 수행하고, 각 웰에서 수득되는 용액을 전형적 으로 샘플을 측정기로 이동시키는 자동샘플링 장치를 이용하여 질량 측정 방법으로 분석하였다.
멀티-기구에서 유도체화 및 추출한 대사산물의 질량 분석 측정 결과는 도 2 및 3에 그래프로 도시하며, 상기 도면은 각각 아미노산, 인지질 및 아실카르니틴을 보이고 있다.
아미노산 및 아실카르니틴 대사산물의 정량은 하기 표 3에 나타내며, 멀티-기구를 이용하여 수득한 수치의 정확성 및 편차를 나타낸다.
표 3 - 하나의 샘플에서의 아미노산, 지질, 락테이트, 크레아티닌 및 글루코스를 10번 정량 분석한 결과의 정확도 및 재현성을 표 3에 나타내며, 이는 멀티-기구를 이용하여 수득하였다.
아미노산
Figure 112007094439493-PCT00001
아실카르니틴
Figure 112007094439493-PCT00002
지질
Figure 112007094439493-PCT00003
락테이트, 글루코스 및 크레아티닌
Figure 112007094439493-PCT00004
[실시예 3]
치료제 모니터링
이식 이후에 장기 거부 반응을 억제하기 위한 면역억제제가 필요하다. 사용되는 면역억제제는 에베롤리무스, 사이클로스포린 A, 타클로리무스, 시롤리무스 및 마이코페놀산이다. 전술한 바와 유사하게 적합하게 제조한 멀티-기구로부터 수득한 치료제 모니터링 결과는 본 발명의 멀티-기구의 사용을 더욱 예시하며, 본 발명의 청구항을 뒷받침하는 것으로 확인되었다.
멀티-기구의 제조 및 조건
이 멀티-기구는 전술한 방법과 실제 동일한 방법으로 제조하였지만, 다공성 지지체로는 8 mm의 셀룰로스 스팟(generic card - 10 539 859, Schlicher Schuell, Biosciences GmbH, Dassel, Germany)을 이용하였다.
2개의 멀티-기구 웰에, 시롤리무스 및 타클로리무스에 대한 내부 표준물질인 에베롤리무스(200 ng/mL)(Sigma, Vienna, Austria), 사이클로스포린 A의 내부 표준물질인 사이클로스포린 D(400 ng/mL)(Sigma, Vienna, Austria)를 포함하는 메탄올 용액(20 ㎕)을 넣었고, 멀티-기구의 다공성 지지체 상에 파이펫팅한(Gilson 20 ㎕) 다음, 실온에서 30분간 건조하였다. 보정(Calibrator) 혼합물 및 정성 관리 수준 I-V(면역억제제에 대한 전 혈액 보정물 세트(레벨 0-6), 면역억제제에 대한 ClinChek R 전 혈액 대조군, Recipe Chemicals and Instruments GmbH, Munich, Germany)을 제조사의 설명서에 따라 만든 다음 -20 ℃에 저장하였다. 사용하기 전에, 사이클로스포린 D 및 에베롤리무스의 농도가 증가되는 6개의 보정물 용액과, 사이클로스포린 A, 타크롤리무스, 시롤리무스 및 에베롤리무스의 농도가 다양한 5개의 정성 관리 용액을 해동하여, 약 23 ℃로 승온시켰다. 웰 6개에, 각 보정물 20 ㎕를 파이펫팅(20 ㎕ Gilson pipette)으로 멀티-기구의 다공성 지지체 상에 놓았다. 5개의 웰의 각 멀티-기구의 다공성 지지체에 5개의 정성 관리 샘플을 파이펫팅하였다. 상기 멀티-기구의 다공성 지지체에 즉시 아세토니트릴(HPLC 등급)을 가하고(Gilson 200 ml 파이펫), 30분간 600 rpm 이하의 오르비탈 교반기로 바로 교반하였다. 상기 기구 아래에 300 ㎕의 마이크로타이터 포획 플레이트를 둔 다음 6분간 500 g로 원심분리하여, 유출물을 모았다. 이후, 공개된 방법(T. Koal, M. Deters, B. Casetta, V. Kaever, Simultaneous determination of four immunosuppressants by means of high speed and robust on-line solid phase extraction-high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry, J. Chromator. B, Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2004 Jun 15, 805(2); 215-222)에 준한 질량 분석법으로 유출물을 분석하였다. 결과의 수득 및 계산 방법에 대한 예는, 사이클로스포린 A를 LCMS로 분석하여 정량 데이타를 얻는 경우를 들어, 도 4에 나타낸다. 내부 표준물질인 사이클로스포린 D의 일체형 피크 면적을, 정량을 포함하는 품질 관리 샘플 5개에서 면역억제제 사이클로스포린 A의 피크 면적과 비교하였다.
도 5 내지 8은 멀티-기구내 인써트로서 세룰로스 지지체를 이용한, 4개의 면역억제제, 사이클로스포린 A, 타크롤리무스, 에베롤리무스 및 시롤리무스에 대한 선형 표준 곡선이다. 표 4는 계산된 농도와 분석된 5개의 품질 인정 물질과 비교한 실제 정확도를 나타낸다.
표 4
Figure 112007094439493-PCT00005
본 발명은 다양한 생체 채액 및 조직의 다양한 및 표준화된 분석이 가능하다. 예를 들면, 현재 본 발명의 능력은, 100가지 이상의 주해가 있는 경로에서의 다양한 대사산물 클래스를 포괄하여 MS 작동 시간 6분이내에 건조 혈액 10 ㎕로부터 1000개 이상의 정량적이고 주해가 붙은 데이타 포인트를 수득하는, 동시적이고 완전히 자동화된 샘플 준비 및 분석이 가능하다. 따라서, 본 발명은 먼저 (사전) 분석, 자동화, 데이타 처리 및 해석으로 대부분의 병목 현상을 극복한다.
종래의 분석 방법과 기구와 비해, 본 발명의 정량 분석은 매우 견고하며 그 결과는 재현성이 높다. 특히 대사산물의 데이타는 비교되는 단백질 유전 정보(proteome) 또는 전사체(transcriptome) 데이타 보다 훨씬 우수하다. 혈액 또는 혈청 10 ㎕이나 뇨 20 ㎕, 또는 100,000 이하의 배양 세포가 필요할 뿐이다.
분석 방법 및 기구의 수행 특성은 검색(발견) 활용 및 이후의 임상 진단 표준 둘다를 충족시킬 수 있다. 이는, 품질 인정받은 데이타, 표준화된 데이타를 보장 또는 수득할 수 있으며, 실험실간에 비교가능하며, 반환시간(turn-around time)이 빠르고, "레디 투 고(ready to go)" 이행(hits)이 가능하며, 수신된 데이타를 해석 및 시각화하기 용이하며, 자동화 및 표준화(SOP) 정도가 매우 높다. 총 비용/데이타 포인트는, 대사체 정보를 단백질 유전 정보에 비해 훨씬 저렴하게 한다.
본 발명의 방법 또는 기구에 의해 수득된 정량 정보는 조직의(시스템 생물학) 전후 관계 및 측정가능한 형태로 경로 및 대사산물을 포괄한다. 그로인해, 대표적인 기능적 묘사 또는 스크린 샷이나 매개 대사의 대사적 핑거프린트를 대사산 물 마커 어레이로부터 최종적으로 유추할 수 있다.
또한, 주석이 달려 있으며 단백질 유전 정보, 전사체 및 게놈의 정보 소스와 편리하게 연계시킬 수 있는 기능적 종말 정보는 시스템 생물학의 요구에 대한 대사체 정보를 보강하다.
기구 및 방법은 대규모의 정량적으로 동정된 주석이 붙은 대사산물의 프로파일들의 동시 생성과 복합적이고 동적인 다중 마커 패턴을 연구하기 위한 새로운 "표준"을 확립하기에 적합한 통합 툴(소프트웨어 및 분석)로 사용할 수 있다. 더욱이, 자동화 및 표준화된 샘플 준비를 위한 액체 취급 시스템과 MS-MS 분석에 대한 질량 분석기로 구성된 시판되는 하드웨어 부품은, 독점적이고 보호된 제작 소모 제품 및 (사전) 분석 과정 및 품질 관리된 데이타 처리, 기술적 검증 및 문서화, 통계 분석 및 생화학적 해석를 위한 혁신적인 모듈을 포함하는, 적용 소프트웨어로 통합될 수 있다.
본 발명에서 샘플 준비 시간은 약 2시간에 불과하며(마이크로타이터 트레이당 90개의 샘플 배치 기준), 계획된 소프트웨어를 통한 병렬화에 의해 더욱 단축된다. 정량하기 위한 매우 많은 구체적인 내부 표준물질은, QC 및 QA에 필요한 모든 물질이 소프트웨어 및 SOP와 조합하여 포함되는 것처럼, 한 단계 또는 두 단계 반응 준비 및 적용 히트의 구성 성분으로서, 독점적인 화합물로 미리-제형화된다.
산업적인 이용으로는, 질병 질단, 치료 효과 또는 독성에 대해 검증된 바이오마커를 이용하기 위한 목적의, 바이오마커 발견 및 상품화가 있다. 주로 약제 개발에서의 이용 분야는 약물 대사체 및 약물동태학, 독성학 및 안전성, 약물 효과 및 약력학 분야이다. 그외 분야로는, 예컨대 초기에 민감하고 특이적인 진단 및 정확한 등급 확인은 값비싼 개입 대신 질병 예방을 촉진시키며, 개인 맞춤형 치료를 가능하게 하며, 개인 맞춤 치료를 뒷받침하도록 치료 효과를 상세하게 모니터링 할 수 있는, 임상 진단 및 치료 진단(theranostics)이 있다. 또한, 적용 분야로는, 영양 산업, 건강 관리, 국토 안보(homeland security) 및 기초 생물학이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 예로, 기구는 흡수 물질을 포함하는 지지체; 및 상기 지지체에 함침되어(impregnated) 건조된 복수개의 질량 분석용 유기성 대사산물 표준물질을 포함한다. 더 바람직하기로는, 질량 분석용 유기성 대사산물 표준 물질은 안정적인 동위원소로 표지된 아미노산, 안정적인 동위원소로 표지된 폴리펩티드, 안정적인 동위원소로 표지된 지질 또는 안정적인 동위원소로 표지된 아실카르니틴을 포함한다.
본 발명의 바람직한 다른 예로, 기구는 흡수 물질을 포함하는 지지체; 및 상기 지지체에 함침되어 건조된 복수개의 질량 분석용 면역억제제 표준물질을 포함한다. 더 바람직하기로는, 면역억제제 표준물질은 하나 이상의 에베롤리무스 및 사이클로스포린 D를 포함한다.

Claims (17)

  1. (a) 지지체(support) 및 (b) 상기 지지체에 함침된(impregnated) 하나 이상의 내부 표준물질을 포함하는, 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하는데 적합한 기구용 인써트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 지지체는 액체 흡수 물질인 것을 특징으로 하는 인써트.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 흡수 물질은 셀룰로스, 유리 섬유, 유리 비드, 폴리아크릴아미드 겔, 다공성 플라스틱 불활성 폴리머 및 다공성 흑연 중에서 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 인써트.
  4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한항에 있어서, 상기 내부 표준물질은 사용하기 전에 내부 표준물질을 분해 및 화학 반응성으로부터 보호하는 피복 물질로 캡슐화된 것을 특징으로 하는 인써트.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 피복 물질은 폴리머, 마이셀 형성 화합물, 리포좀 형성 화합물 및 폴리하이드록시 화합물 중에서 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 인써트.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 캡슐화는 마이크로캡슐화인 것을 특징으로 하는 인써트.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜 호모폴리머, 코폴리머 또는 이들의 혼합물이며, 및/또는 상기 폴리하이드록시 화합물은 소르비톨 및/또는 글리세롤인 것을 특징으로 하는 인써트.
  8. 제 5항 내지 제 7항중 어느 한항에 있어서, 상기 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)이며, 바람직하기로는 PEG 1000인 것을 특징으로 하는 인써트.
  9. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 마이셀 형성 화합물은 계면활성제이며 및/또는 상기 리포좀 형성 화합물은 인지질, 바람직하기로는 포스파티딜 콜린 또는 포스파티딜 에탄올아민, 또는 그 유도체인 것을 특징으로 하는 인써트.
  10. (a) 하나 이상의 웰(1)
    (b) 상기 웰(1) 내부에 위치된, 제 1항 내지 제 9항중 어느 한항에 따른 하나 이상의 인써트(2); 및
    (c) 선택적으로 상기 웰(1)의 인써트(2)에 대한 유지체(retainer)(3)
    을 포함하는, 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하기 위한 기구.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 하나 이상의 웰(1)은 미크론 크기의 고형물, 바람직하기로는 5 ㎛ 이상의 고형물을 분리하기 위한 필터(4)와 여과물을 배출하기 위한 배출구(5)를 포함하는 것을 특징으로 하는 기구.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 필터(4)는 인써트(2)와 배출구(5) 사이에 위치된 것을 특징으로 하는 기구.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 배출구(5)는 원심력 또는 감압, 바람직하기로는 500 mbar 미만에서 개방되는 것을 특징으로 하는 기구.
  14. 제 4항 내지 제 9항중 어느 한항에 따라 캡슐화된, 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하기 위한 내부 표준물질.
  15. 제 10항 내지 제 13항중 어느 한항에 따른 기구를 포함하는, 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하기 위한 키트.
  16. (a) (a1) 자동 액체 취급 시스템과 (a2) 샘플에 존재하는 약물 및/또는 대사 산물의 유도체화 및 이후의 유도체 추출을 위한, 제 10항 내지 제 13항중 어느 한항에 따른 하나 이상의 기구를 포함하는, 스크리닝해야 할 약물 및/또는 대사산물을 준비하기 위한 처리 유닛;
    (b) 정량적으로 표적화된 질량 측정 분석용 질량 측정기; 및
    (c) 분석 결과를 저장하기 위한 데이타베이스
    를 포함하는, 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하기 위한 장치.
  17. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한항에 따른 인써트 및/또는 제 10항 내지 제 13항중 어느 한항에 따른 기구 및/또는 제 14항에 따른 내부 표준물질 및/또는 제 15항에 따른 키트 및/또는 제 16항에 따른 장치를 이용하여, 생물학적 샘플에서 약물 및/또는 대사산물의 프로파일을 정량 분석하는 방법.
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