CN114720616A - 一种胰腺癌早期诊断标志物及其联合筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胰腺癌早期诊断标志物及其联合筛选方法和应用，该联合筛选方法包含以下步骤：步骤1，分别取胰腺癌病人临床组织、与其配对的正常组织；步骤2，通过色谱质谱联用代谢组学分析方法，分析鉴定胰腺癌组织和/或血清与正常组织和/或血清之间的初步差异性代谢物；步骤3，通过质谱成像可视化示出所述的初步差异性代谢物的空间分布；步骤4，对所述的异常分布的代谢物进行辅助筛选：基于组织活检和病理学的诊断，构建基于代谢组学的胰腺癌诊断Lasso模型，筛选出特异性代谢物；步骤5，通过样本间联合分析以及样本间交叉验证，筛选出早期诊断标志物，该方法得到的早期诊断标志物可用于胰腺癌早期的筛查和诊断，可有效提高筛查的准确性。

Description

一种胰腺癌早期诊断标志物及其联合筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种胰腺癌早期诊断标志物及其联合筛选方法和应用。

背景技术

胰腺导管腺癌(PDAC,Pancreatic ductal adenocarcinoma)占胰腺恶性肿瘤的90％以上，是最具侵袭性和致命性的癌症，5年生存率小于10％。而由于发病率上升、诊断延迟以及在治疗方面缺乏重大进展，PDAC的死亡率在过去十年中上升，中位生存时间小于7个月。目前，影像学成像技术，如MRI、ERCP、EUS、CT等在临床实践中常规应用于PDAC患者的筛查、诊断和分期评估。然而，由于缺乏早期症状和诊断标志物，超过80％的PDAC 患者在诊断时存在晚期或转移性疾病，错过了根治性手术的机会。

由于PDAC缺乏早期症状和诊断标志物，使用现有技术给人们带来了早期诊断和发现的困难。然而，尽管人们在针对患者血液中潜在的PDAC相关代谢物方面做了大量的努力，但这类分子很少被投入临床实践的前线，至少部分原因是缺乏低成本和高通量的分析工具，另一方面，目前针对胰腺癌早期诊断标志物筛选实验中，也有很多假阴性和假阳性的结果发生。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于CPSI-MS和 DESI-MSI的代谢组学，在组织和血清样本之间联合筛选胰腺癌早期诊断标志物，为快速分子诊断和筛查提供了强有力的方法，以辅助临床实践。

为了达到上述目的，本发明提供了一种胰腺癌早期诊断标志物的联合筛选方法，包含以下步骤：步骤1，分别取胰腺癌病人临床组织PDAC、与其配对的正常组织PNT；步骤2，通过色谱质谱联用代谢组学分析方法，分析鉴定胰腺癌组织和/或血清与正常组织和/或血清之间的初步差异性代谢物；步骤3，通过质谱成像可视化示出所述的初步差异性代谢物的空间分布，找到胰腺癌组织区域中异常分布的代谢物；步骤4，对所述的异常分布的代谢物进行辅助筛选：基于组织活检和病理学的诊断，构建基于代谢组学的胰腺癌诊断Lasso模型，筛选出特异性代谢物；步骤5，通过样本间联合分析以及样本间交叉验证，筛选出早期诊断标志物。

较佳地，步骤2中，所述的分析鉴定胰腺癌组织与正常组织之间的初步差异性代谢物包含以下步骤：

步骤2.1，以VIP大于1.0为标准保留样本离子；

步骤2.2，对步骤2.1中得到的样本离子进行T检验，以FDR<0.05为标准进一步保留样本离子；

步骤2.3，对步骤2.2中得到的样本离子进行差异倍数分析，以差异倍数大于2.0或小于0.5为标准再进一步保留样本离子；

步骤2.4，将步骤2.3得到的样本离子与代谢组数据库进行比对，得到组织中76种初步差异性代谢物。

较佳地，步骤4中，所述的辅助筛选是先在组织样本中筛选特异性代谢物，包含以下步骤：

步骤4.1，将n＝150个组织样本点作为训练集，n＝90个组织样本点作为测试集，用于评估预先训练的Lasso模型的表现；

步骤4.2，将所述的76种初步差异性代谢物纳入Lasso分类器训练集的初始输入变量，只有对分类有贡献的变量被赋予非零权重，当只保留76个变量中的22个时，Lasso分类器的性能在测试集上达到最高的准确率；

步骤4.3，引用受试者工作特征ROC曲线来评价Lasso模型的最佳诊断性能，以ROC曲线上真实阳性率最高、假阳性率最低为截断点，得到最佳诊断性能，表明CPSI-MS数据采集结合Lasso模型能够作为与组织活检互补的潜在体外诊断策略。

较佳地，所述的联合筛选方法是在组织样本和血清样本之间进行联合筛选。

较佳地，步骤5中，所述的样本间联合分析以及样本间交叉验证，包含以下步骤：

步骤5.1，采用CPSI-MS进行独立的血清代谢组学分析，分析鉴定胰腺癌患者和健康供体的血清样本中初步差异性代谢物，确定出血清中74种初步差异性代谢物；

步骤5.2，进行组织、血清联合分析以阐明差异性代谢物共存于肿瘤组织和血清中，交叉比对组织中76种初步差异性代谢物和血清中74种初步差异性代谢物，确定得到18种差异性代谢物；

步骤5.3，将所述的18种差异性代谢物纳入Lasso分类器训练集的初始输入变量，当只保留18个变量中的15个时，Lasso分类器的性能在测试集上达到最高的准确率，表明CPSI-MS数据采集结合Lasso模型能够作为血清筛查互补的潜在体外诊断策略。

本发明还提供了一种根据上述任意一项所述的胰腺癌早期诊断标志物的联合筛选方法所得到的的胰腺癌早期诊断标志物，包含2-丁酮酸、肌酐、N- 甲基烟酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、岩藻糖、色胺、辛酸、乙酰肉碱、色氨酸、丁酰肉碱、甘油磷脂酰胆碱、亚油酸、亚麻酸中的任意一种或者任意两种以上的组合。

较佳地，所述的胰腺癌早期诊断标志物可应用于制备胰腺癌早期诊断试剂或试剂盒。

本发明还提供了一种胰腺癌早期诊断的试剂，所述的试剂能够检测样本中所述的早期诊断标志物的表达水平。

较佳地，所述的样本为组织和/或血清样本。

本发明还提供了一种胰腺癌早期诊断的试剂盒，所述的试剂盒含有早期诊断标志物用于制备胰腺癌早期鉴别的诊断试剂。

本发明优点在于：

(1)本发明所提供的一种胰腺癌早期诊断标志物，通过检测早期诊断标志物的表达水平，可以达到胰腺癌早期筛查和诊断的目的；

(2)在临床代谢组学的生物标本方面，对选定的代谢物进行标本间交叉验证，作为潜在的血清标志物进行快速筛选，本发明所提供的组织-血清联合分析策略，首先在组织水平发现初步差异性代谢物，继而联合组织和血清发现交叉的差异性代谢物，确保所选的血清代谢标记物可以追溯到原发癌部位，进一步提高了胰腺癌早期诊断筛查的准确度，有效降低假阴性和假阳性结果的发生；

(3)CPSI-MS常用于冷冻组织切片或干燥的血清斑中任何感兴趣点的代谢分析，且仅需要消耗一滴溶剂(<10μL)进行代谢物提取和电离，更适用于血清样本的高通量筛选或整个组织中某些感兴趣区域的代谢状态的快速评估；DESI-MSI引入了带有随流动溶剂进行逐层扫描的电喷雾探针，并提供每个代谢物分布的空间分辨率图像，更适用于基于代谢产物的，需要复杂的区域相关代谢研究的分子病理学或更精确的外科切缘评估；结合CPSI-MS数据采集和机器学习(ML)分析可以使工作流更经济有效，CPSI-MS数据采集结合构建的Lasso模型可以作为与组织活检和病理学互补的潜在体外诊断策略。

附图说明

图1为本发明的PDAC组织的非靶向代谢组学结果。

图中，(A)CPSI-MSI原位代谢谱图；

(B)PDAC和PNT的偏最小二乘判别分析(PLS-DA，Partial least square-discriminant analysis)分类；

(C)最终保存PDAC中与PNT标本相比有显著变化的代谢物的逐步统计分析；

(D)火山图突出显示了与PNT相比，在2.0或小于0.5的PDAC中，代谢产物离子的显著变化(FDR<0.05)；

(E)40种具有代表性的代谢产物在PNTs和PDACs中的相对表达水平热图。

图2为本发明的PNT(A)和PDAC(B)组织在全MS扫描模式下的平均质谱。

图3为本发明的组织中代谢物的原位验证和互补诊断性能。

图中，(A)DESI-MSI与机器学习过程示意图；

(B)典型的一对PDACs的光学图像，其相邻的PNTs和正常对照NC组织用苏木精和伊红(H&E)染色；

(C)与PNTs相比，PDACs中具有代表性的代谢物发生显著变化的图像；

(D)Lasso分类器给出的所有240个组织点评分图；

(E)混淆矩阵，呈现针对PDAC的测试由开发的Lasso模型设置的分类；

(F)ROC(Receiver operating characteristic)曲线用于评估Lasso模型在训练

集和测试集上的诊断性能；

(G)与PNTs相比，PDACs中其他代谢物发生显著变化的图像。

图4为本发明的对所发现的特征性代谢标志物的组织-血清联合验证结果。

图中，(A)健康供体(HD)、PDAC患者和CPSI-MS血清代谢组学和PDAC 筛查的队列图；

(B)维恩图显示最终选择作为血清筛选标记物并用于定量估计的代谢物数量；

(C)热图可视化显示这些特征代谢物在组织和血清中的一致性趋势；

(D)血清中具有代表性的10个代谢物标志物的定量比较；

(E)Lasso分类器对381个PDAC和HD血清样本的预测评分；

(F)直方图显示HD和PDAC样本在训练集和测试集的分布；

(G)评估代谢标志物Lasso模型用于PDAC筛选的ROC曲线。

图5为本发明的CPSI-MS和DESI-MSI在PDAC筛查和诊断中的临床应用推荐场景。

图中，(A)高危人群筛查可通过CPSI-MS进行，CPSI-MS仅消耗每个临床受者3μL血清，完成代谢谱数据采集时间不超过1分钟；

(B)代谢谱和快速PDAC诊断可以通过CPSI-MS进行，CPSI-MS只消耗来自这些高度可疑患者的微量活检组织(少于1mg)；

(C)对于手术切除PDAC组织的患者，通过DESI-MSI结合分子病理学可以进行更精确的诊断和空间分辨率的代谢谱分析。

图6为本发明的对失调酶、转运体和相关底物的验证。

图中，(A)通过在代谢分析中搜索丰富的代谢途径；

(B)KEGG和Reactome中搜索得到的富集酶和转运蛋白；

(C)酶和转运体所涉及的受影响的生物功能的等级；

(D)PDZD、PISD、TYMP和SLC1A5的亚细胞位置和功能示意图；

(E)免疫组织化学检测PISD、PDZD11、TYMP、SLC1A5在组织芯片上的表达水平；

(F)PDAC和PNT在不同组织(PDAC和PNT)中PISD、PDZD11、TYMP 和SLC1A5的表达水平；

(G)SLC1A5的高、低表达与PDAC进展性TNM分期的相关性；

(H)SLC1A5低表达和高表达PDAC患者的生存分析。

图7为本发明的PISD诱导的PS/PE转化是PDAC进展和预后的关键代谢过程，抑制肿瘤转移。

图中，(A)PISD转换PS/PE示意图；

(B)以PS(36:1)和PE(36:1)为典型例子，采用DESI-MSI表征PS和PE图像；

(C)PE与PS在图像像素基础上的强度比图；

(D)对过表达PISD的肿瘤细胞进行transwell实验；

(E)对过表达PISD的肿瘤细胞进行迁移实验。比例尺:10μm。试验设3 个重复，进行t检验。数值以平均值±SDs表示。*p<0.05，**p<0.01。

图8为本发明的SLC1A5上调PDAC中的谷氨酰胺代谢。

图中，(A)SLC1A5介导谷氨酰胺(Gln)与丙氨酸(Ala)跨膜交换及GLS1 催化谷氨酰胺与谷氨酸(Glu)转化示意图，V9302和CB839分别是针对 SLC1A5和GLS1的抑制剂；

(B)PDAC(用白虚线描绘)和PNT区域Ala、Gln、Glu分布的DESI图像；

(C)PDAC患者M0和M1期血清中Gln和Ala的相对水平；

(D)谷氨酰胺与Ala、谷氨酸与谷氨酰胺的像素-像素强度比；

(E)正常胰腺细胞株(H6C7)与胰腺癌细胞株(SW1990和PANC1)SLC1A5 mRNA表达水平的差异；

(F)SLC1A5抑制剂V9302治疗后SW1990胰腺癌细胞系的Gln和Ala 水平；

(G)不同抑制剂处理SW1990细胞的增殖情况；

(H)吉西他滨(Gem)与CB-839、V-9302联合应用的体外细胞活力检测；

(I)吉西他滨对不同处理SW1990细胞的剂量抑制关系。

图9为本发明的PDZD11上调PDAC中嘌呤和嘧啶的转运并促进肿瘤转移。

图中，(A)PDZD11和TYMP的脱氧尿苷转运和回收示意图；

(B)脱氧尿苷和尿嘧啶穿过PDAC(用白线描绘)和PNT区域的DESI图像和相应盒图；

(C)脱氧尿苷与尿嘧啶的比值图像，用于间接估计TYMP的表达或活性。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

实验材料与方法

1.1实验细胞系和试剂

H6C7、SW1990、PANC1细胞(Manassas,VA,USA)、谷氨酰胺酶 (GLS1)抑制剂CB-839、SCL1A5抑制剂V-9302、CCK8(Cell Counting Kit) 试剂盒(MedChemExpress,MonmouthJunction,NJ,USA)、强力霉素 (Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)、Ab197011谷氨酰胺测定试剂盒 (Colorimetric)、Amplite^TM比色法L-丙氨酸测定试剂盒(Abcam,Waltham, MA,USA)、8um Transwell小室(BD Biosciences,New Jersey,USA)等。

1.2实验仪器

LTQ Orbitrap Velos质谱仪(Thermo Scientific,San Jose,CA,USA.)、商业2DDESI系统(Prosolia,Indianapolis,USA)、显微镜(Leica,Wetzlar, Germany)、InfiniteF500(Tecan)多功能酶标仪、恒温箱(ThermoFisher, Waltham,MA,USA)等。

1.3实验方法

本说明书中未具体提及的实验方法均为本领域常规操作方法。

1.3.1 CPSI-MS代谢组学分析

以甲醇-水为溶剂，体积比为1:1。每次组织切片，在组织表面滴入5 μL溶剂。充分提取代谢产物30秒后，将液滴吸回，转移到离MS入口 13.0mm处的导电聚合物底物尖端。为了减少组织异质性的影响，在每个组织切片上随机微移三等份溶剂液滴，分别用CPSI-MS检测。液滴萃取加载完成后，接通对导电聚合物尖端施加的4.5kV直流高压，触发高电场诱导的液滴喷雾电离。该过程将代谢产物离子带入LTQ Orbitrap Velos 质谱仪，在正模式下记录m/z 50-1000范围内的非靶向代谢谱。MS毛细管温度275℃，S-lens电压55V。微扫描次数设置为1次扫描，最大注射时间为400微秒。每个病例的数据采集周期为15秒，以收集足够的代谢组学数据。

1.3.2 CPSI-MS验证血清中的代谢物标志物

3μL血清干燥后在导电聚合物尖端形成斑点，以甲醇-水作为喷雾溶剂，溶解干燥后血清斑点内的内源性代谢物。如上所述，在正模式下，对 m/z 501000范围内的代谢组学数据采集施加+4.5kV高压。从至少10次连续扫描中自动提取每个目标离子的精确m/z的平均强度。用平均总离子电流(TIC)归一化各代谢物离子的平均强度。每个特征代谢物的血清浓度是通过将其归一化强度与添加到血清中的商业化代谢物标准产生的浓度进行定量估计的。质控样本(QC标本)采用等体积的血清标本汇集制备， PDAC组20份，HD组20份。QC样品在整个运行过程中进行分析，以评估系统波动。PDAC和健康供体HD血清交替安排运行，QC样品每30 个样品均匀插入整个序列。

实施例1使用CPSI-MS发现PDAC相关代谢谱和初步差异性代谢物的特征

如图1的A所示，收集了40例先前未接受治疗的I-IV期PDAC患者的新鲜冷冻配对PDAC组织和相邻的正常组织(adjacent normal tissue，PNT)。取15μm厚的冷冻切片进行组织病理学评价。经苏木精和伊红(H&E)染色后，由两位实验人员分别标注切片以确定PDACs和PNTs的区域。随后，利用 CPSI-MS对冷冻切片进行代谢分析。针对PDAC/PNT区域从每个切片中随机选择三个点(点直径约2.0mm)进行CPSI-MS数据采集。如图2所示，根据代谢产物种类的分子量分布范围，全MS扫描m/z 50-1000范围内正、负两种模式下回收的代谢产物包括氨基酸、羧酸、lyo-磷酸甘油脂、核苷酸、核苷、酰基肉碱、二酰基甘油脂、脂肪酸、甘油磷脂和多胺，CPSI-MS获得了每个样品中3829个离子的相对丰度。

如图1的B所示，根据偏最小二乘判别分析法PLS-DA评分图显示， PDACs和PNTs的样本点可以分为两个簇，为了发现PDAC初步差异性代谢物，如图1的C所示，采用几个标准来进行逐步筛选。首先，以变量重要性投影VIP>1.0作为标准，保留n＝1151个对样本分组有高度贡献的离子，此后，在PDAC和PNT冷冻切片之间，对得到的1151个离子进行T检验，以FDR<0.05为标准进一步保留样本离子，发现n＝695个离子存在显著差异。为了进一步选择最显著的差异性代谢物，将范围缩小到n＝626个离子，以差异倍数(FC,fold change)大于2.0或小于0.5为标准进一步筛选。通过检索人类代谢组数据库和Metlin代谢组学数据库，推测注释了n＝222个离子，其中确定的代谢物n＝76个(如表1)。如图1的D所示，火山图突出了前10个上调和下调的小代谢物。如图1的E所示，热图显示了PDAC中具有代表性的小代谢物的显著变化。下调的种类包括脂肪酸(如FA8:0,FA16:0,FA18:1, FA18:3)、天冬酰胺(Asn)、鞘氨醇1-磷酸(S1P)、s-腺苷同型半胱氨酸(SAH)、胞苷、胸腺嘧啶、谷氨酰胺(Gln)，而上调的种类包括谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、亮氨酸(Leu)、瓜氨酸、次黄嘌呤(Hypo)、磷酸丝氨酸(serp)和酰基肉碱(例如肉碱C2:0,C4:0,C16:0,C18:0,C18:1)。

表1：在PDAC组织中发现的具有显著变化的代谢物

实施例2利用DESI-MSI对PDAC中初步差异性代谢物进行原位验证和空间可视化

如图3的B所示，为研究病例，准备了与其PNT区域配对的PDAC冷冻切片，成功地可视化出了76种代谢物在PDAC以及CPSI-MS识别的PNT 相邻和遥远区域(PNT1和2)的空间分布(代表性图像如图3的C所示，余可见表2和图3的G)。PDAC区域表现出高度富集的乳酸、亮氨酸、酰基肉碱 (AC)、单甘油酯(MG)、磷脂酰胆碱(PC)、神经酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)。鉴于脂类可以作为膜成分和信号分子，大量脂类分子的产生与肿瘤的过度生长和进展是一致的，双甘油酯(DG)与磷脂酰胆碱(PC)之间的转化与鞘磷脂(SM)与神经酰胺(Cer)之间的转化耦合。(引自Ogretmen B(2018)Sphingolipid metabolism in cancer signalling andtherapy.Nat Rev Cancer 18:33-50.)鞘磷脂 (SM)、神经酰胺(Cer)和磷脂酰胆碱(PC)的富集增加可以推断出甘油脂(GL)种类的来源。葡萄糖、脂肪酸(FA)、双甘油酯(DG)、甘油三酯(TG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)和多胺(除腐胺外)均下调。观察发现脂质头基，包括甘油磷酸胆碱(GPCho)、甘油磷酸乙醇胺(GPEA)、甘油和甘油-3-磷酸(G3P)在PDAC区域的丰度极低，而三个磷酸化头基的丰度相对较高，包括磷酸乙醇胺(PEA)、磷酸胆碱(PCho)和磷酸丝氨酸(如表1)，这些结果也提示了异常的脂质代谢。

表2：经DESI-MSI证实，PDAC组织中代谢物明显改变

实施例3基于代谢组学的PDAC诊断模型构建

为了补充基于组织病理学的诊断，引入Lasso模型来评估判断每个 CPSI-MS样本是来自癌症还是来自正常组织的概率。基于代谢组学的建模是在由n＝150个组织样本点(n＝75PNT和n＝75PDAC组织点，来自n＝25例患者)组成的训练集上进行的。另外n＝90个样本点(n＝45PNT和n＝45PDAC组织点，来自n＝15例患者)作为测试集，用于评估预先训练的Lasso模型在未检测病例上的表现。n＝76个之前通过代谢谱和原位验证发现的代谢物被纳入训练的初始输入变量。之所以使用Lasso分类器，是因为它通过调整每个输入变量的权重系数，将特征选择嵌入到训练过程中。只有对分类有贡献的变量被赋予非零的权重。因此，当只保留76个变量中的n＝22个时，Lasso分类器的性能在测试集上达到了最高的准确率。所选代谢标志物及权重系数如表3所示。

表3：最优Lasso模型的代谢物标记物及其权重系数用于互补诊断

如图3的D所示，以0.62的lasso预测得分为阈值，PDAC组和PNT组的大多数交叉验证样本在得分图中都可以很好地区分。如图3的E所示，混淆矩阵显示了给出的最优Lasso模型的分类结果，在测试集上达到了93.3％的总体一致性(准确率)。引入受试者工作特征(Receiver operating characteristic, ROC)曲线来评价Lasso分类器的最佳诊断性能，该曲线下面积(area under curve,AUC)在测试集上的值为0.96(95％置信区间:0.93-1.00)。如图3的F所示，以ROC曲线上真实阳性率最高、假阳性率最低为截断点，诊断性能的最佳灵敏度和特异性分别为95.6％和91.1％。这些结果表明，PDAC特异性代谢组学在区分肿瘤组织和正常组织方面表现出出色的性能。因此，CPSI-MS 数据采集结合22代谢物Lasso模型可以作为与组织活检和病理学互补的潜在体外诊断策略。

实施例4联合分析确定了PDAC特异性代谢标志物用于血清筛查

为了提高公认的PDAC特异性代谢标志物的诊断价值，本发明进行了组织-血清联合分析和标本间交叉验证，然后进行了非靶向代谢组学分析。首先，在50-1000m/z全扫描模式下，采用CPSI-MS进行独立的血清代谢组学分析。如图4的A所示，该研究前瞻性地招募了n＝242名I-IV期PDAC患者和n＝139 名健康供体(HD)。如图1的C所示，继续使用上述方法进行逐步统计筛选，以T检验方法，FDR＜0.05为标准，对血清分析后发现，如表4所示，与 HD组相比，PDAC患者血清中n＝74个差异富集的代谢物。然后，进行联合分析，以阐明差异代谢组分子共存于肿瘤组织和血清。在血清代谢组学分析中，交叉比对PDAC组织中n＝76个目标代谢物的相对丰度。以FC＞2或 FC小于0.5为标准，如图4的B、图4的C所示，发现n＝30个代谢物在血清中与组织代谢组学中的差异倍数趋势相同。对30个代谢物与市售标准进行比对，如表5所示，发现30个代谢物中有21个(70％)具有市售标准，利用该标准进行定量估计，确定n＝18个代谢物。以秩和检验的方法，P＜0.05为标准，其中,与HD组相比，PDAC患者的血清中有显著差异，其中，10个代谢物上调和8个代谢物下调(10代谢物如图4的D所示，其余可见表5)。

表4：PDAC血清中发生显著变化的代谢物

表5：血清中21种代谢标志物浓度的定量评估

ns：non-significance；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001

将这18个代谢物作为初始输入变量，开发另一个Lasso分类器，用于另一n＝381个PDAC病例样本进行快速PDAC筛查。通过5倍交叉验证，Lasso 分类器在训练集(n＝318)上获得了89.2％的准确率，而在测试集(n＝63)上获得了88.9％的准确率。如表6所示，除去权重为零的代谢物，在血清代谢物分类面板中有n＝15个代谢物是保守的，分别是2-丁酮酸、肌酐、N-甲基烟酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、岩藻糖、色胺、辛酸、乙酰肉碱、色氨酸、丁酰肉碱、甘油磷脂酰胆碱、亚油酸、亚麻酸。从所有381例的Lasso 评分图中可以看出，PDAC组的大部分血清样本与HDs组的血清样本可以区分开来。如图4的F所示，Lasso评分的直方图也显示，PDAC和HD组的 381例病例理想地位于两个可分离的正态分布中。如图4的G所示，15代谢物Lasso分类器在测试集上的AUC为0.96(95％CI:0.92-1.00)，在ROC曲线的最佳截断点敏感度为85.4％，特异性为91.3％，表明其在快速血清筛查方面具有潜在的临床价值。

表6：Lasso分类器用于血清PDAC筛选的15种代谢物标志物及其权重系数

实施例5几种代谢酶和转运体的功能特征

如表1所示，为了进一步确定PDAC组织中CPSI-MS和DESI-MSI鉴定的76个初步差异性代谢物的生物学后果和代谢网络，在MetaboAnalyst上(引自Pang Z,Chong J,Zhou G,deLima Morais DA,Chang L,et al.(2021) MetaboAnalyst 5.0:narrowing the gapbetween raw spectra and functional insights.NucleicAcids Res.)进行通路富集分析(pathway enrichment analysis， PEA)，预测PDAC发展过程中的相关代谢通路。如图6的A所示，发现PDAC 组织中这些差异富集的代谢物参与了不同的代谢途径。具体来说，如表7所示，牛磺酸和次牛磺酸代谢(如半胱氨酸、牛磺酸、次牛磺酸)，甘油磷脂代谢(如PE、PC、溶血磷脂胆碱、DG、PCho、PS、GPCho、GPEA、G3P)，组氨酸代谢(如谷氨酸、尿糖酸、组氨酸、甲基组胺、组胺、天冬氨酸)，谷氨酸和谷氨酰胺代谢(如谷氨酸、谷氨酰胺、酮戊二酸)、亚油酸代谢(亚油酸、磷脂酰胆碱)、半胱氨酸和蛋氨酸代谢(如丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、磷丝氨酸)、芳香氨基酸生物合成(如苯丙氨酸、酪氨酸)和精氨酸相关代谢物(如精氨酸、瓜氨酸、天冬氨酸、鸟氨酸)在PDAC组织中富集。

表7：胰管腺癌组组织代谢途径改变综述

通过搜索KEGG和Reactome中所有的PDAC相关代谢标记物，进一步进行PEA。如图6的B、图6的C、表8所示，最初，预测56种有不同程度的抑制或激活的酶或蛋白质，其中，4种代谢酶和转运蛋白在候选基因中排名最高，差异均有统计学意义(P<0.05)。磷脂酰丝氨酸脱羧酶(PISD)下调， PDZ结构域蛋白11(PDZD11)、胸苷磷酸化酶(TYMP)和溶质载体家族1成员5(SLC1A5)上调。如图6的D所示，PDZD11和SLC1A5主要参与水溶性氨基酸、维生素、游离嘌呤和嘧啶、核苷酸和核苷(引自Scalise M,Pochini L, Console L,Losso MA,Indiveri C(2018)The Human SLC1A5(ASCT2)Amino Acid Transporter:From Function toStructure and Role in Cell Biology.Front Cell Dev Biol 6:96.)的转运。PISD主要负责磷脂酰丝氨酸(PS)转化为磷脂酰乙醇胺(PE)(引自Thomas HE,ZhangY,Stefely JA,Veiga SR,Thomas G,et al. (2018)Mitochondrial Complex I Activity Is Requiredfor Maximal Autophagy. Cell Rep 24:2404-2417e2408.)，而TYMP分别催化胸腺嘧啶/脱氧尿嘧啶转化为胸腺嘧啶/尿嘧啶(引自Tetsuhiro Goto KS,Kazuaki Yokomizo,KazumaSakuraba,Youhei Kitamura,Atsushi Shirahata,Mitsuo Saito,Gaku Kigawa, HiroshiNemoto,Yutaka Sanada,Kenji Hibi(2012)Expression Levels of ThymidylateSynthase,Dihydropyrimidine Dehydrogenase,and Thymidine Phosphorylase inPatients with Colorectal Cancer.Anticancer Research: 1757-1762.)。如图6的E、图6的F所示，使用组织芯片对92例PDAC原发癌标本进行免疫组化(IHC)分析，证实了这一结果，显示与PNT相比，PDAC 组织中PISD的表达降低，而SLC1A5、TYMP和PDZD11的表达显著增加。

表8：根据富集的代谢途径预测相关的转运体和酶

实施例6PDAC特异性代谢酶的生物学相关性

如图7的A所示，PISD催化PS转化为PE。为了进一步探索其生物学意义，通过DESI-MSI原位成像，在配对的PDAC和PNT组织冷冻切片上检测PISD的底物和产物。如图7的B所示，DESI-MSI分析显示PDAC中PE (PISD的产物)的相对丰度低于PNT区域。如图7的C所示，虽然PDAC和 PNT区域的PDAC底物PS在两个区域的丰度没有太大的差异，但PE/PS比值显著降低(P<0.05)。根据有关研究显示PISD具有抑瘤作用(引自Thomas HE, ZhangY,Stefely JA,Veiga SR,Thomas G,et al.(2018)Mitochondrial Complex I Activity Is RequiredforMaximalAutophagy.Cell Rep 24:2404-2417e2408)，本发明通过PDAC细胞株SW1990的异位表达来检测PISD的抑瘤功能。如图 7的D所示，Transwell实验显示，PISD过表达组的细胞密度明显低于对照组。如图7的E所示，细胞迁移实验显示，PISD过表达的SW1990细胞迁移距离较短。这些结果与PDAC组织中PISD的下调以及PDAC的肿瘤抑制功能相一致。

通过组织芯片免疫组化检测SLC1A5蛋白表达，然后根据多元分析确定的独立预测因子构建列线图。如图6的H所示，在PDAC患者中，SLC1A5 的高表达与TNM晚期和更高的分级显著相关。Kaplan-Meier法比较生存率曲线，显示SLC1A5表达水平与PDAC患者的总生存期呈负相关，SLC1A5 高表达组的1年和3年生存率也低于SLC1A5低表达组。

如图8的A所示，SLC1A5主要介导细胞外谷氨酰胺与胞浆丙氨酸的跨膜交换(引自Scalise M,Pochini L,Console L,Losso MA,Indiveri C(2018)The Human SLC1A5(ASCT2)Amino Acid Transporter:From Function to Structure and Role in CellBiology.Front Cell Dev Biol 6:96.)。通过DESI-MSI和 CPSI-MS分析，如图8的B所示，观察到PDAC中的谷氨酰胺和丙氨酸显著低于PNT区域。如图8的C所示，血清代谢物标记物验证进一步显示，转移(M1)期患者的谷氨酰胺和丙氨酸明显低于非转移性PDAC患者(M0)。上述结果表明，谷氨酰胺酶1(GLS1)介导的谷氨酰胺水解增加了谷氨酰胺的消耗。如图8的B、图8的D所示，PDAC区域谷氨酸水平较高，谷氨酸与丙氨酸 (SLC1A5的底物)和谷氨酸与谷氨酰胺(GLS1的产物和底物)的比值较高支持谷氨酰胺的消耗。由于产物与底物的比值表明了相应酶的相对水平或活性，这些结果与IHC结果一致，在PDAC组织中SLC1A5和GLS1的蛋白水平均明显高于PNT。此外，如图8的E所示，PDAC细胞SW1990中SLC1A5的 mRNA水平高于非致瘤细胞H6C7。为了确定这是否由SLC1A5引起，本发明用SLC1A5抑制剂V-9302处理SW1990 PDAC细胞系，如图8的F所示，谷氨酰胺水平降低，丙氨酸水平升高。如图8的G、图8的H、图8的I所示，V-9302和GLS1抑制剂CB-839可抑制细胞增殖，并增加细胞对化疗药物吉西他滨的敏感性。

同样，与PDZD11和TYMP表达增加(如图6的D、图6的F)一致，如图9的A所示，许多差异富集的小代谢物与嘌呤和嘧啶的过度转运和代谢有关。如图9的B、图9的C、图9的D，DESI-MSI结果显示，检测到的大部分嘌呤和嘧啶，包括尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胞嘧啶、脱氧尿嘧啶和胸腺嘧啶在PDAC区域均较高，其中，高水平的脱氧尿苷(产物)、胸腺嘧啶(产物)和低水平的尿嘧啶(底物)与TYMP的高表达一致。这与之前的一篇报道一致，即依赖于TYMP的胸腺嘧啶分解代谢有助于癌细胞在低营养条件下存活(引自Toi M,Rahman MA,Bando H,Chow LWC(2005) Thymidine phosphorylase(platelet-derived endothelial-cell growth factor)in cancerbiology and treatment.The Lancet Oncology 6:158-166.)。

一些实施例中，为了使15种代谢物标记物在临床筛选中切实有用，15 种代谢物的血清浓度也通过定量CPSI-MS方法进行了初步估计，为不同实验室使用不同质谱仪器测定结果的可比性和可重复性提供了参考。CPSI与三重四极杆质谱(QqQ-MS)的耦合可以极大地促进多反应监测(MRM)模式下代谢标志物的快速、定量筛选过程。

实施例中根据胰腺癌早期诊断标志物的联合筛选方法筛选得到的早期诊断标志物包含：2-丁酮酸、肌酐、N-甲基烟酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、岩藻糖、色胺、辛酸、乙酰肉碱、色氨酸、丁酰肉碱、甘油磷脂酰胆碱、亚油酸、亚麻酸中的任意一种或任意两种以上的组合。

可以理解的是，根据所述的胰腺癌早期诊断标志物，其还可以用于制备检测上述早期诊断标志物表达水平的检测产品。

一些实施例中，检测产品能够是体外检测试剂。

一些实施例中，检测产品也能够是检测试剂盒，具体的，所述的检测试剂盒含有检测试剂。

综上所述，本发明所提出的一种胰腺癌早期诊断标志物及其联合筛选方法和应用，基于CPSI-MS和DESI-MSI的PDAC代谢组学不仅是一种方便的表征工具，可以在原位水平上对癌症代谢进行全景概述，而且是一种快速分子诊断和筛查的稳健方法，通过实验得到的胰腺癌组织/血清和正常组织/血清中的差异性代谢物，进一步降低假阴性和假阳性结果的发生率，可以作为胰腺癌早期诊断标志物使用，具有广泛的临床应用前景。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种胰腺癌早期诊断标志物的联合筛选方法，其特征在于，所述的联合筛选方法包含以下步骤：

步骤1，分别取胰腺癌病人临床组织PDAC、与其配对的正常组织PNT；

步骤2，通过色谱质谱联用代谢组学分析方法，分析鉴定胰腺癌组织和/或血清与正常组织和/或血清之间的初步差异性代谢物；

步骤3，通过质谱成像可视化示出所述的初步差异性代谢物的空间分布，找到胰腺癌组织区域中异常分布的代谢物；

步骤4，对所述的异常分布的代谢物进行辅助筛选：基于组织活检和病理学的诊断，构建基于代谢组学的胰腺癌诊断Lasso模型，筛选出特异性代谢物；

步骤5，通过样本间联合分析以及样本间交叉验证，筛选出早期诊断标志物。

2.如权利要求1所述的胰腺癌早期诊断标志物的联合筛选方法，其特征在于，步骤2中，所述的分析鉴定胰腺癌组织与正常组织之间的初步差异性代谢物包含以下步骤：

步骤2.1，以VIP大于1.0为标准保留样本离子；

步骤2.2，对步骤2.1中得到的样本离子进行T检验，以FDR<0.05为标准进一步保留样本离子；

步骤2.3，对步骤2.2中得到的样本离子进行差异倍数分析，以差异倍数大于2.0或小于0.5为标准再进一步保留样本离子；

步骤2.4，将步骤2.3得到的样本离子与代谢组数据库进行比对，得到组织中76种初步差异性代谢物。

3.如权利要求1所述的胰腺癌早期诊断标志物的联合筛选方法，其特征在于，步骤4中，所述的辅助筛选是先在组织样本中筛选特异性代谢物，包含以下步骤：

步骤4.1，将n＝150个组织样本点作为训练集，n＝90个组织样本点作为测试集，用于评估预先训练的Lasso模型的表现；

步骤4.2，将所述的76种初步差异性代谢物纳入Lasso分类器训练集的初始输入变量，只有对分类有贡献的变量被赋予非零权重，当只保留76个变量中的22个时，Lasso分类器的性能在测试集上达到最高的准确率；

步骤4.3，引用受试者工作特征ROC曲线来评价Lasso模型的最佳诊断性能，以ROC曲线上真实阳性率最高、假阳性率最低为截断点，得到最佳诊断性能，表明CPSI-MS数据采集结合Lasso模型能够作为与组织活检互补的潜在体外诊断策略。

4.如权利要求1所述的胰腺癌早期诊断标志物的联合筛选方法，其特征在于，所述的联合筛选方法是在组织样本和血清样本之间进行联合筛选。

5.如权利要求1所述的胰腺癌早期诊断标志物的联合筛选方法，其特征在于，步骤5中，所述的样本间联合分析以及样本间交叉验证，包含以下步骤：

步骤5.1，采用CPSI-MS进行独立的血清代谢组学分析，分析鉴定胰腺癌患者和健康供体的血清样本中初步差异性代谢物，确定出血清中74种初步差异性代谢物；

步骤5.2，进行组织、血清联合分析以阐明差异性代谢物共存于肿瘤组织和血清中，交叉比对组织中76种初步差异性代谢物和血清中74种初步差异性代谢物，确定得到18种差异性代谢物；

步骤5.3，将所述的18种差异性代谢物纳入Lasso分类器训练集的初始输入变量，当只保留18个变量中的15个时，Lasso分类器的性能在测试集上达到最高的准确率，表明CPSI-MS数据采集结合Lasso模型能够作为血清筛查互补的潜在体外诊断策略。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的胰腺癌早期诊断标志物的联合筛选方法所得到的胰腺癌早期诊断标志物，其特征在于，所述的胰腺癌早期诊断标志物包含：2-丁酮酸、肌酐、N-甲基烟酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、岩藻糖、色胺、辛酸、乙酰肉碱、色氨酸、丁酰肉碱、甘油磷脂酰胆碱、亚油酸、亚麻酸中的任意一种或者任意两种以上的组合。

7.如权利要求6所述的胰腺癌早期诊断标志物在制备胰腺癌早期诊断试剂或试剂盒中的应用。

8.一种胰腺癌早期诊断的试剂，其特征在于，所述的试剂能够检测样本中权利要求6所述的早期诊断标志物的表达水平。

9.如权利要求8所述的胰腺癌早期诊断的试剂，其特征在于，所述的样本为组织和/或血清样本。

10.一种胰腺癌早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有早期诊断标志物用于制备胰腺癌早期鉴别的诊断试剂。

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