JP4829297B2 - 代謝産物特性分析のための機器及び方法 - Google Patents

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Description

本発明は、生体試料中の薬物特性及び/又は代謝産物特性を分析するための機器に関する。更にこれは、生体試料中の薬物及び/又は代謝産物特性の分析法に関する。
メタボロミクスは、一般にヒト又は動物体内の特定の代謝プロセスに必要であるか、あるいはそれに加担する物質又は物質群の分析として定義される。これはメタボローム分析としても公知である。メタボロミクスは、疾患の発症及び進行に関連した代謝の変化を反映する独自の化学的なフィンガープリントを研究する、発展しつつある学問分野である。代謝産物プロファイリングは、メタボロミクス内の領域であり、これは一次代謝及び中間代謝に関連する、ヒト細胞、組織又は臓器に含まれる小分子又は代謝産物を測定する。代謝産物分析から得られる生化学的情報は、生理学的及び病態生理学的プロセスに関連し、遺伝的要因及び栄養、運動又は投薬のような環境因子の両方により影響を受ける機能エンドポイントを明らかにしている(Harrigan. G G及びGoodacre, R.の著書、(2003) 「Metabolic profiling: Its role in biomarker discovery and gene function analysis」、Kluwer Academic Publishers, Boston/Dordrecht/London；Schmidt, C.の論文、(2004), Journal of the National Cancer Institute, 96, 732-734；Raudys, S.の著書、(2001) 「Statistical and neural classifiers」、Springer -Verlag, London；Daviss, B.の論文、(2005) The Scientist, 19, 25-28)。
データマイニング法と組み合わせた代謝産物プロファイリングには、臨床診断及び創薬を大改革する可能性がある。特に巨大な製薬企業は、新たな標的及び新規のより有効かつ安全な化合物を発見し、バイオマーカー及び薬物の発見を促進し、そして全般的に医薬品の開発コストを低下するという苦難に常に置かれている。従って企業は、この革新的ギャップ及び将来の情報ルート(pipeline)を満たすために、バイオテクノロジー企業に頼ることが増えている。このような状況において、革新的な生体解析及びデータマイニング技術は、市場に出るまでの時間の短縮及び薬物摩耗率(drug attrition rate)により、コストを削減する際の基本的な役割を果たすであろう。
近年、ハイスループット技術の著しい進展により、ヒトメタボロームの広範なセット−このため、ほとんど探索されないバイオインフォメーションの給源−に現在アクセス可能である(Beecher, C.の著書、(2003). In Harrigan, G. G., Goodacre, R.(編集) 「Metabolic profiling: Its role in biomarker discovery and gene function analysis」(311-319頁) Kluwer Academic Publishers, Boston/ Dordrecht/Londong；Dunn, W.B.、Bailey, N.J.及びJohnson, H. E.の論文、(2005) Analyst, 130, 606-625)。代謝産物特性の統計的な比較は、何らかの疾患症状が明らかになる前に、到来する疾患を潜在的に警告している徴候を明確に得ることにより、ヘルスケアシステムを革新する可能性を有する多変量パターンを明らかにすることができる。早期疾患のスクリーニング及び予防は、後期の疾患検出及び高価な治療的介入とは対照的に、将来のヘルスケアの補償範囲に余裕をもたせるために主要な解決策である。定義により、これらのいわゆるバイオマーカーは、通常の生物学的プロセス、発症プロセス又は治療的介入に対する薬理学的反応の「客観的に」測定されたインジケーターであり、そして疫学的、治療的、病態生理学的、又は他の科学的証拠に基づき、臨床エンドポイント(予想される利益又は損害)を代用することを意図している(Biomarkers Definitions Working Groupの論文、(2001) Clinical Pharmacology and Therapeutics, 69, 89-95)。新規バイオマーカーの発見への興味は、これらの広範な可能性のある適用及び医薬産業の動向及び最新のヘルスケアセクター主義への基本的影響が起源である。薬物発見におけるバイオマーカー実施の成功は、創薬の時間及び経費を削減することができる一方で、分子診断の適用は、臨床の状況における患者のコンプライアンスを改善し、そして後期疾患検出に加え誤診から生じる不必要な経費を削減する(Stoughton, R. B.及びFriend, S. H.の論文、(2005) Nature Reviews. Drug Discovery, 4, 345-350；Morris, M.,及びWatkins, S. M.の論文、(2005) . Current Opinion in Chemical Biology, 9, 407-412；McCandless, S. E.の論文、(2004). Primary Care, 31, 583-604)。
定性的及び定量的な代謝産物プロファイリング技術は、生物系の小分子成分の比較の結果として可能性のあるマーカーを利用するという目的を伴う、一連の進歩した分析ツール及びデータ処理ツールを含む。例えばタンデム質量分析(MS)は、数百の代謝産物を、微量の全血、血清、血漿、尿又は他の体液のような、マイクロリットル量の生体試料から、高い精度かつ感度で同時に検出する(Roschinger, W.、Olgemoller, B.、Fingerhut, R.、Liebl, B.及びRoscher,A.A.の論文、(2003). European Journal of Pediatrics, 162 (補遺1), S67-76；Strauss, A.W.の論文、(2004). J Clin Invest 2004； 1 13:354-356；Kaltashov, IA.及びEyles, S.J.の論文、(2005) Mass spectrometry in biophysics: Conformation and dynamics of biomolecules . Wiley)。定量化は、広範な適当な内部標準を参照し達成される。しかしながら、判断するために必要であるデータ又は結果の量は、非常に膨大である。
例えば、国際公開公報第03/005628号は、代謝産物の定量的データベースを作製し、検証し、解釈し、そして分析する方法を開示している。更に米国特許出願第2002/0009740号は、メタボロミクスを使用する薬物の発見、疾患の治療及び診断の方法を開示している。米国特許第6,455,321号は、臨床診断のためにタンデム質量分析データを解釈する方法を開示している。米国特許第6,258,605号は、血液試料から新生児集団のアシルカルニチン及びアミノ酸をスクリーニングする分析的方法を開示している。
従って本発明の目的は、管理可能な時間内において信頼できる方法により生体試料の薬物及び/又は代謝産物特性を提供するために、生体試料において関連情報を確認することが可能である方法及び機器を提供することである。
この目的は、少なくとも1の薬物及び/又は代謝産物を含有する生体試料中の薬物及び/又は代謝産物特性を分析する機器により解決される。この機器は：スクリーニングされる薬物及び/又は代謝産物の種類を入力するための、入力ユニット；試料の調製のため、並びにスクリーニングされる薬物及び/又は代謝産物の種類の入力に応じた質量分光分析のためのパラメータセットを決定するための制御ユニット；決定されたパラメータセットに応じたスクリーニングされる薬物及び/又は代謝産物の調製のための処理ユニット；パラメータセットに応じ、調製された薬物及び/又は代謝産物について質量分光分析を行うための質量分析計；質量分光分析の結果、並びに/又は薬物及び/もしくは代謝産物の調製のため及び質量分光分析のために使用されたパラメータセットの格納のためのデータベース；データベースに格納された参照結果を使用し、質量分光分析によりもたらされた結果を評価及び比較するため、そして検討されている生体試料中に含まれた薬物及び/又は代謝産物特性の分析を出力するための評価ユニット；を備える。
本発明は、生体試料を調製するため、そして生体試料中の薬物及び/又は代謝産物を分析するための機器を提供することにより、再現可能な分析条件が、広範な分析について維持されるという着想を基にしている。更に生体試料の調製及び質量分光分析のための自動化されたプロセスを提供することにより、処理されるべきデータの包括的な量を取扱うことができる。データベースに格納された参照結果を利用して質量分析の結果の評価を適合させることにより、薬物及び/又は代謝産物特性に由来した分析結果を、先の分析時に収集された知識を用いて改善することができる。更に適当な内部標準を利用することによる定量は、生体試料中の薬物及び/又は代謝産物を定量するために使用される。自動化された事前分析手順を使用することにより、結果量が削減される。複数の標準操作手順(SOP)は、スクリーニングされる薬物及び/又は代謝産物によって決まる標準化された方法での複数の生体試料の処理及び取扱いのために使用される。
以下において、本発明は、代謝産物特性の分析に関して説明される。しかしながら、本発明はそれに限定されず、同様の方法で薬物特性の分析(すなわち治療薬物モニタリング、TDM)にも適用可能であることが理解されるであろう。
本発明のひとつの観点において、生体試料中の代謝産物特性の分析方法が提供され、これは以下の工程を含む：少なくとも1の代謝産物の分析のために、生体試料を機器へ提供する工程；スクリーニングされる代謝産物の情報を機器へ提供する工程；スクリーニングされる代謝産物の情報に応じ生体試料を調製する工程；調製された代謝産物を抽出する工程；試料抽出物を質量分析計に提供する工程；調製された代謝産物について1回又は複数回の質量分光分析を実行する工程；スクリーニングされる代謝産物の質量分析の結果を処理及び評価し、そして参照値及び標的の代謝産物の予め-注釈づけされた情報と比較する工程；そして、出力データを産生する工程。
従って代謝産物特性の分析方法は、試料の調製及び代謝産物の分離、質量分析の使用による分析及びデータ処理の工程を、一般に含む。
代謝産物プロファイリングに適用することができる２つの戦略が存在する。質量分析に基づく代謝産物プロファイリングを使用する場合、定性的な標的化されない方法及び定量的な標的の方法を使用することができる。選択された戦略に応じ、後のデータ処理の範囲及び種類が決定される。
標的のプロファイリングスキームは、マルチプルリアクションモニタリング(MRM)、プリカーサー及びニュートラルロススキャンを用いて公知の小分子代謝産物を定量的にスクリーニングするために本発明に従い使用される。複数の異なる種類の化合物(例えば、アミノ酸、ペプチド、アシルカルニチン、単糖、脂質、及びリン脂質など)が、分析のために選択される。これらの化合物は、調査される疾患の関連する代謝経路を対象としている。生体試料の化合物における代謝産物の定量は、適当な内部標準を参照して達成される。
従って本発明は、生体試料と組み合わせられる既知量の内部標準を使用する。代謝産物プロファイリングのための機器及び方法を使用することにより、スクリーニングされる生体試料の一部又は一定分量は、複数の異なる内部標準と組み合わせられる。これらの内部標準は、同定され、定量され、その結果、既知の濃度に対応する質量分析データを生じる。更に、生体試料を複数の一定分量へ分割することにより、少量の生体試料のみを必要とする。各一定分量は、標準化された方法で処理され調製され、これは標準操作手順(SOP)由来のパラメータセットの使用により制御される。スクリーニングされる代謝産物に応じ、自動化された試料調製(処理)及び分離(例えば、誘導体化、抽出)を使用することにより、各一定分量の各抽出物について質量分光分析を実行し、調製されかつ分離された一定分量に含まれる代謝産物の複数のピーク並びに既知濃度に相当する内部標準のピークを有する質量分析の結果を作製することが可能である。
質量分析の後、質量分光分析の結果についてデータ処理が行われる。このデータ処理は、同位体補正、ノイズフィルタリング、標準化及びスケーリング、結果の内容によるフィルタリング、並びに適当な内部標準の公知の特徴及びデータベース内の予め注釈づけされた情報を利用する標的の検出された代謝産物の定量化及び注釈づけを含む、ケモメトリクス手法及び統計的手法を用いることができる。処理された結果は格納され、そしてデータベースに格納された参照値と比較され、これらの結果の代謝産物は、例えば健常者もしくは罹患した患者に属するかどうか、又はある病期に特徴的であるかどうか、又は薬理学的物質もしくは薬物への反応を反映しているかどうかの情報を導き出す。このデータベースは、質量分析の結果をデータベースに格納された参照値と比較する間に導き出された情報に基づき適合される。この学習プロセスは、パラメータセット及び/又は標準操作手順への適合を提供するために使用することができ、これは代謝産物特性の分析のために生体試料を処理するために使用される。代謝産物特性を分析する方法の結果は、患者の疾患もしくは正常な健常状態の変化、又は薬理学的物質もしくは薬物への反応を示す少なくとも1種又はそれよりも多い非常に重大な代謝産物を特徴付ける、いわゆるバイオマーカーであってよい。
本発明の更なる利点は、添付された「特許請求の範囲」から誘導することができる。
以下に、例証的態様を、添付された図面とともに説明する。
図面に基づき態様を説明する前に、定義又は説明を記す。
内部標準
本発明において使用される内部標準は、所定の試料中に存在する未知量の化合物の定量化のために、類似化合物又は同一化合物との比較に使用される絶対量がわかっている任意の参照物質であると理解される。好ましくは内部標準は、有機性内部標準である。本発明において使用される内部標準は、生体試料中の分析される化合物と同じ群又はファミリーに属してよい。しかしながら、これらは、試料の代謝産物と内部標準の間で適切に識別することができるように同位体で標識されることが好ましい。しかしながら、試料中の代謝産物を内部標準から識別するための別のいずれかの方法も使用することができる。例えば、非天然化合物もまた、内部標準として使用できる。
本発明において使用される内部標準の具体例を、表1に示す。
表1
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(生体試料)
本明細書において使用される生体試料は、成長及び消化のような生物学的プロセスに関係する、これらにより引き起こされる、又は生命もしくは生存生物に影響を及ぼす任意の試料であると理解される。
生体試料の例は、血液、細胞培養物上清、唾液、涙液、尿、血液、血清、血漿、汗、膣液、精液、糞便、粘膜、乳汁、腹水、リンパ液、胸水、滑液、骨髄、脳脊髄液、及び体腔洗浄液(例えば、気管支洗浄液)、毛髪、組織、骨、又は歯を含むが、これらに限定されるものではない。
好ましい生体試料は、液体試料である。より好ましくは、生体試料は、血液であり、最も好ましくは、ヒト血液である。液体とは、水のように、25℃で限定された容積であるが限定された形状でない物質を意味する。
(消費物質)
消費物質は、代謝産物の誘導体化及び抽出において使用されるのに適したいずれかの化合物であると理解されるであろう。
(代謝産物特性)
本発明において使用される代謝産物特性は、別の試料もしくは試料群に由来した参照値又は特性との比較に使用することができる代謝産物に関する定量的結果の値のいずれかの規定されたセットと理解されるであろう。例えば罹患した患者由来の試料の代謝産物特性は、同様に合致した健常者由来の試料の代謝産物特性とは著しく異なる。
例えば、限定されるわけではないが、アミノ酸、ペプチド、アシルカルニチン、単糖、脂質及びリン脂質、プロスタグランジン、ヒドロキシエイコサテトラエン酸、ヒドロキシオクタデカジエン酸、ステロイド、胆汁酸及び糖脂質及びリン脂質のような代謝産物は、検出及び/又は定量することができる。
検出及び/又は定量することができる代謝産物の例は、表2に列記される。特に所定の脂肪酸残基のC4:XからC46:X(ここで飽和度Xは0〜8の範囲である)の脂質種が示される。これらの脂質は、スフィンゴ脂質及びスフィンゴ糖脂質も含む。
検出及び定量することができるアミノ酸は、タンパク質新生又は非タンパク質新生アミノ酸である。表2に示されたタンパク質新生アミノ酸及び非タンパク質新生アミノ酸が好ましい。
C4:XからC18:X(ここでXは、飽和度であり、所定の酸残基中で0〜8の範囲である)のアシルカルニチンを、検出及び/又は分析することができる。好ましいアシルカルニチンの例も、表2に列記されている。
単糖は、好ましくは還元又は非還元炭水化物である。単糖の例もまた、表2に列記されている。
表2−本発明の質量分光分析に適している代謝産物
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(薬物特性)
本発明において使用される薬物特性は、特定の試料中の1種若しくは複数の薬物又は薬物代謝産物に関する定量結果の値のいずれかの規定されたセットであると理解される。更に具体例として、免疫抑制薬もまた、検出され、そして定量され得る。例えば、移植患者の薬物特性は、医師に、使用時の1種又は複数の薬物療法の即時循環量を提供し、その結果、その後の用量は、最良の治療範囲を実現するために測定された量に応じ増減されるであろう。このような分析は、治療薬物モニタリング(TDM)と称される。本発明の免疫抑制薬は、免疫系の活性を阻害又は抑制するための免疫抑制療法において使用することができる薬物として理解される。臨床的に、これらは、移植された臓器及び組織の拒絶反応を防止するため、並びに関節リウマチ、重症筋無力症、全身紅斑性狼瘡、クローン病、及び潰瘍性大腸炎のような、自己免疫疾患の治療において使用される。本明細書において定義される免疫抑制薬は、基本的に4群に分類することができる：糖質コルチコイド、細胞増殖抑制薬、抗体、及びイムノフィリンに作用する薬物である。本発明において使用される免疫抑制薬の好ましい例は、シクロスポリンA、シロリムス、エベロリムス及びタクロリムスである。
(多連装置)
本発明において使用されるマルチ装置は、マイクロタイタープレート標準型のようなマルチ装置を形成するために、互いに連結された任意の多連装置であると理解される。
本発明において使用されるマイクロタイタープレートは、生物学的又は化学的研究施設において使用されるいずれかのプラスチック製の試料ホルダーであると理解されるであろう。マイクロタイタープレート標準は、1996年に生体分子科学会議(SBS)により一定の形とされた。これは典型的には、2:3の長方形マトリックス内に配列された6、24、96、384又は1536個の試料ウェルを有する。この標準は、ウェル寸法(例えば、直径、間隔及び深度)に加え、プレート特性(例えば、寸法及び剛性)を左右する。
本明細書においてマルチ装置と称される多連型の装置は、異なる型を有することもできる。例えば、6ウェルのような予め包埋された、いくつかのバイアルは、複数の較正化合物による6点較正をもたらす。既知の代謝産物及び/又は複数の薬物濃度を含有する品質コントロール試料も、予め包埋されている。
加えて、本発明の好ましい態様に従う装置は、化学的に不活性の保持構造により、少なくとも1つのウェル内に保持されることが好ましい。例としてセルロース又はグラスファイバーのような多孔質支持体を備える。多孔質支持体は、好ましくは、乾燥状態で内部標準へ包埋され；任意に、保護的又は被覆する物質又は化学物質の混合物、例えば、ポリエチレングリコール1000、ホスファチジルコリン、グリセロール又はソルビトールなどで、マイクロカプセル化される(コーティングされる)。
(インサート)
本発明の特に好ましい態様に従い使用される用語「インサート」は、前述のような任意の化学保護剤と共に内部標準を含む多孔質支持体であると理解されるであろう。インサートが装置のウェル又はバイアルに適合する限りは、インサートは、あらゆる幾何学的形状を有することができる。好ましい態様において、インサートは、固定器具を使用することにより、装置のウェル又はバイアル内に配置される。該固定器具は、図7において参照番号(3)として記される。特に好ましい態様において、固定器具(3)は、インサートとウェルの間の直接の接触を伴うことなく、インサートをウェル内に配列することができる。従ってインサートは、固定器具を用い、好ましくは2〜10mm、より好ましくは3〜5mmの距離で、ウェルの底の上に配置される。別の表現をすると、好ましい態様において、ウェルの底とインサートの間、及び/又はウェル壁とインサートの間には、いわゆる「ギャップ」又は「距離」が存在する。好ましい態様における固定器具として、それがウェル底とインサートの間にギャップを形成することができる限りは、あらゆる固定器具が適している。このような配置は、その上に試料を沈殿させることができる支持体の最大表面積を許容する。この設計は更に、インサートが、適用後の試料を急速乾燥できるように、インサートの周囲の空気又は他の乾燥気体の流れにより十分にアクセスされることを保証にする。この設計原理は、インサートが、最小化されたタンパク質又は塩夾雑物を伴い、試料からの代謝産物又は薬物の抽出を可能にする全ての側面から溶媒流れにより、十分にアクセスされることも確実にする。従って支持体の細孔は、反応(誘導体化)が、支持体それ自身内で進行し、溶媒の使用を最小化することを可能にし、そしてまた、後の過剰な誘導体及び溶媒の蒸発としての除去は、試料の周囲を循環する乾燥気体(空気又は窒素)に対する最大表面積により提供される。この増加した表面積及び全支持体の周囲の溶媒移動度も、適当な溶媒を使用する高い抽出効率を保証にする。別の表現をすると、前述のギャップは、ウェル内のインサートのほぼ自在な配置及びウェルを通って流れる流体の改善された循環を可能にする。
更に本発明の好ましい態様に従い、装置は、スタック内に配置された1以上のインサートを備えることができ、ここで各インサートは、流体の循環を可能にするために、互いの間に前述のギャップを伴い配置されることがより好ましい。
しかしながら、本発明は、上述のインサートを必ずしも含まないことが理解されるべきである。しかしながら好ましい態様では、インサートが使用される。
(支持体)
本発明において使用される支持体は、好ましくは少なくとも中等度の、好ましくは高度の多孔度を伴う任意の支持体であることができる。このような支持体は原則として、先行技術において公知であり、市販もされている。
媒体(すなわち支持体)の多孔度「φ」は、物質の総容積に対する非固体容積の割合として定義され、下記の比により定義される：
φ＝Vp/Vm
ここで、Vpは非固体容積(細孔及び液体)であり、並びにVmは固体及び非-固体部分を含む物質の総容積である。
従って多孔度は、0〜1の間の値、典型的には固体花崗岩(solid granite)については0.01未満から、ピート及びクレイについては0.5以上までの範囲であるが、これは該割合に100を掛けることによりパーセントの表現で表すこともできる。本発明の多孔質支持体は、少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％、更により好ましくは少なくとも70％、及び最も好ましくは少なくとも90％の多孔度を有する。
インサートにおいて使用されるような多孔質支持体は、いずれか好適な材料であってよいが、これは固形支持体が好ましい。より好ましくは、多孔質支持体は、液体のための収着物質(液体収着物質とも称される)で構成される。更により好ましくは、支持体は、液体収着物質からなる。収着物質は、吸着物質又は吸収物質であってもよい。
本発明において使用される液体収着物質は、分析のために内部標準及び後の試料の溶液が、細孔を通じ均一に吸着又は吸収されることを可能にし、加えて担体溶媒の蒸発による除去を可能にするいずれかの物質であると理解されるであろう。
支持体物質により吸着又は吸収される液体は、いずれかの種類の液体であってよいが、これは好ましくは大気圧で揮発性の液体、例えば、大気圧で約250℃未満の沸点を有する液体である。
より好ましくは、本発明の液体収着物質は、セルロース物質のような炭水化物物質、グラスファイバー、グラスビーズ、ポリアクリルアミドゲル、多孔質プラスチック不活性ポリマー及び多孔質グラファイトの少なくとも1種を含む。該多孔質収着物質は、より好ましくは、炭水化物又はそれらの誘導体、例えば寒天ロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサンもしくはコンニャク、カラゲナン、ゲラン、又はアルギン酸塩で構成されてよい。しかし液体収着物質は、最も好ましくは、セルロース又はグラスファイバーで製造される。支持体又は液体収着物質の形状は、特に限定されるものではないが、好ましくは円形、四角形又は渦巻き又はオウムガイ寸法である。本発明において、支持体又は収着物質の形状は、装置のウェル又はバイアルの形状に適合される。前述のように、多孔質支持体又は収着物質は、固定器具(図7において(3)と記される)のような固定用構造により、ウェル又はバイアル中のその位置に固定又は緊締され得る。
液体収着物質を含む多孔質支持体は主に、２つの機能を有する。第一は、下記のとおり、生体試料の添加のために用意された所定の濃度において内部標準(参照物質)を包埋することである。第二は、各試料の内容物の固定化である。この固定化工程は、細胞溶解、タンパク質固定化/沈殿、並びに各試料由来の塩及び多くの他の薬物又は代謝産物の保持を誘導する。その後支持体の多孔度は、分析のために添加される誘導体化剤及びまた抽出溶媒の両方に最大曝露されるために必須である。
(標準のカプセル化)
本発明の好ましい態様に従う内部標準は、使用前の分解及び化学反応から内部標準を保護する被覆物質又は保護物質によりカプセル化される。内部標準の分解及び化学反応からの保護は、例えば、太陽光、温度、及び微生物の作用の防止、特に内部標準を崩壊産物もしくは分解産物に変換し、これにより定量分析の結果に影響を及ぼすプロセスからの防止のように、内部標準の崩壊又は化学修飾の多くの形を防止することができる。
本発明において使用される保護/被覆物質は、内部標準(複数)を分解に対し遮蔽するか又は遮蔽するように設計されたいずれかの物質であると理解されるであろう。
本発明の保護/被覆物質は、前述の環境の影響から内部標準を保護するのに適したいずれかの物質であってよい。本発明の被覆物質は、ポリマー、ミセル形成化合物、リポソーム形成化合物及びポリヒドロキシ化合物の少なくとも1種、又はそれらのいずれかの混合物を含むことが好ましい。
被覆物質がポリマーである場合、本発明において使用される該ポリマーは、特に限定されるものではないが、天然又は合成のいずれかの、その構造はモノマーの反復小型ユニットにより表すことができる、重量平均分子量が少なくとも500g/mol又は少なくとも1,000g/mol又は少なくとも5,000g/mol又は少なくとも10,000g/molであるような、高分子量の有機化合物であると理解される。合成ポリマーは、モノマーの付加重合又は縮重合反応のような、当該技術分野において公知の手段で形成される。本発明のポリマーは、2種又はそれよりも多い異なるモノマーが関与する場合は、コポリマーであってもよい。ホモポリマーは、1種のみのモノマーから形成されるポリマーである。
本発明のポリマーは好ましくは、ポリアルキレングリコールホモポリマー又はコポリマー又はそれらの混合物である。その重量平均分子量は好ましくは、約1000ダルトン(Da)である。より好ましくは本発明のポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)又はポリプロピレングリコール(PPG)であり、好ましくは重量平均分子量約1000Daを有するPEG 1000であり、この理由は、これは高極性及び低極性から無極性の溶媒に可溶性又は混和性であるためである。
被覆物質がミセル形成化合物である場合、本発明において使用される該化合物は、コロイド系における液滴のように、分子の超微視的な凝集を誘導することができるいずれかの化合物であると理解されるであろう。本発明のミセル形成化合物は、好ましくは界面活性剤である。
本明細書において使用される界面活性剤は、２つの液体間の表面張力を低下するいずれかの化合物；又は、製品の乳化、発泡、分散、拡散及び湿潤特性を増強する表面活性物質、特にその分子が一方の末端に親水基を及び他方の末端に親油基を含む有機化合物であると理解される。好適な界面活性剤は、陽イオン性、陰イオン性、非イオン性、及び両イオン性の界面活性剤を含む。界面活性剤は、ホスファチジル(C 17:0)2であることが好ましい。
被覆物質が、リポソーム形成化合物である場合、本発明において使用される該化合物は、ワクチン、薬物、酵素、又は他の物質を標的細胞又は臓器へ輸送するために使用される、1種又は複数のリン脂質層中に閉じ込められた水性コアからなる人工の微視的な小胞を構築することができるいずれかの化合物であると理解されるであろう。
本発明において使用されるリン脂質は、当業界の一般法において理解され、そして結合したリン酸基を伴いグリセロール及び脂肪酸で生成された、レシチン及びセファリンのようなリン含有脂質を含む。より好ましくは、リポソーム形成化合物は、ホスファチジルコリンもしくはホスファチジルエタノールアミン又はそれらの誘導体のような、リン脂質である。
被覆物質がポリヒドロキシ化合物である場合、本発明において使用される該化合物は、少なくとも2個のヒドロキシ基を含むと理解されるであろう。最も好ましいポリヒドロキシ化合物は、ソルビトール及び/又はグリセロールである。
好ましくは本発明のカプセル化は、マイクロカプセル化である。本発明において使用されるマイクロカプセル化は、圧力による破壊、溶解又は溶融時にそれらの内容物を放出するように設計された、小型で、好ましくは微視的なカプセルであるマイクロカプセルへのカプセル化であると理解されるであろう。特に本発明のカプセルは好ましくは、直径100μm未満、より好ましくは10μm未満、及び最も好ましくは1μm未満を有する。
マイクロカプセル化された内部標準は、貯蔵及び輸送に関して頑強であり、酸化及び分解プロセスに関して安定しており、これらは比較的長い貯蔵期間を有する。マイクロカプセル化は、好ましくは、マイクロカプセル化された成分に基づき、合成品質コントロール物質を調製するために標準化される。すなわち、典型的には、内部標準及び他の保護された試料を、リン脂質についてのクロロホルム/メタノール混合物のように、これらの化合物に好適な溶媒である溶媒中に、被覆物質と共に、乾燥することにより実現される。典型的にはこれらの試料への水の添加は、ミセル及び/又はリポソーム形成が生じることを誘導し、そしてこれらの内部及び外部標準を包埋し、その結果、親油性に保護された化合物が水中で生じることを可能にする。
例えばこの装置は、以下のように調製される：好適な溶媒に溶解された内部標準は、既知量で、多孔質支持体上にピペッティングされ、乾燥される。この手順は、装置において使用される各内部標準又は内部標準のクラスについて反復される。カプセル化が提供される場合、最終工程として、好ましくは好適な溶媒内の、カプセル化/被覆物質は、内部標準を含む支持体(すなわちインサート)上に配置され、乾燥される。その後インサートは、ウェルへ、好ましくは緊締手段又は固定器具のような固定用構造を使用し、挿入される。あるいは支持体は、ウェルに挿入され、その後内部標準及び任意の被覆物質が支持体上にピペッティングされてもよい。
(ウェル)
本発明において使用されるウェルは、そこで抽出又は化学反応が生じ得る、好ましくは溶媒及び誘導体に耐性である物質からなる任意のバイアル又はチューブであると理解されるであろう。装置の1個又は複数のウェル(図1において(18)及び図7において(1)として示す)は、好ましくはミクロンサイズの固形物を分離するためのフィルターを少なくとも1個、より好ましくはミクロンサイズの固形物を分離するためのフィルター(図7において(4)として示す)を正確に1個備える。装置の1個又は複数のウェルは、好ましくは、濾液の放出のための少なくとも1個の排出口(図7において(5)として示す)を備える。本発明において使用されるウェルに含まれるフィルターは、流体を懸濁粒状物質から分離するために、これを通り液体又は気体が通過するいずれかの多孔質物質であると理解されるであろう。フィルターは、好ましくは細孔サイズ50〜0.01μm、より好ましくは5〜0.1μm、更により好ましくは1〜0.3μmを有する。最も好ましくは、該フィルターは細孔サイズ0.45μmを有する。フィルターはウェル内に置かれる。更には、本発明の排出口は、遠心力又は減圧下、好ましくは500mbar以下の適用下で開口することが好ましい。減圧は好ましくは、ウェルの排出口側に適用される。あるいはウェルから排出口への流れを保証にするために、ウェルの上側に増大した圧力を適用することができる。
(機器)
更に先に説明されたようにマイクロタイタープレートは、生体試料中の代謝産物特性の定量分析用機器において使用することもできる。該機器は、典型的には試料中に存在する代謝産物の誘導体化及びそれに続く誘導体の抽出のための装置；定量的に標的の質量分析-ベースの分析のための質量分析計、及び分析結果を格納するためのデータベースが組み合わせられた、自動化された液体取扱いシステムを含む、スクリーニングされる代謝産物を調製するための処理ユニットを備える。
本発明において使用されるプラットフォームとも称されるこの機器は、質量分析による分析にそのまま使用される生体試料の完全な調製が可能であるいずれかの機器であると理解されるであろう。これは、誘導体化、脱塩、濃縮及び抽出のプロセスを包含している。これは、完全に自動化された方法におけるこれらのプロセスの一部又は全てのあらゆる可能な組み合わせも含み、好ましくは試料遠心分離装置、試料の加熱及び冷却装置、試料振盪装置、試料乾燥装置、試料ピペッティング装置及び試料ホモジネーション装置と組みあわせた液体取扱いシステムを組込んでいる。本発明において使用される液体取扱いシステムは、バイアル及びマイクロタイタープレートの内及び外へ多くの種類の溶媒を正確に吸引及び分配することが可能である、いずれかの機械装置であると理解されるであろう。この液体取扱いシステムは、このような液体取扱いシステムにおいて使用されるコンピュータ及び制御用ソフトウェアにより制御することができる。
本発明において使用されるデータベースは、探索及び検索の容易さ及び速度のために手配されたデータのいずれかの集合と理解されるであろう。
本発明において使用される標的の質量分光分析は、具体的には、標的の代謝産物の同定のために、対応する被検体について特徴的である公知の断片化パターンにより、公知の代謝産物を規定及び表示する、1種又は複数の設定されたイオン対が使用される質量分光分析であると理解されるであろう。得られたイオン強度は、適当な内部標準と共に使用され、標的の代謝産物の濃度を計算する。内部標準は、特徴的なイオン対(又は複数)を用いることにより同定され、得られたこれらのイオン強度は、既知濃度の内部標準に関連づけ、対応する標的の代謝産物の定量を可能にする。標的の代謝産物のセットは、前もって公知であり、及び予め注釈づけすることができる。従って検出され、定量された代謝産物は既に注釈づけされており、迅速かつ直接的な解釈が可能である。タンデム質量分析計は、より詳細にイオン種を識別するためのMSMS分析が可能な質量分析計として特に好ましい。好ましくはこの機器は、自動化され標準化された試料調製手法及び高解像度タンデム質量解析手法が可能である。特に自動化された試料調製手法は、日々の信頼できる結果の再現性を高め、そしてより低い変数の係数(CV)をもたらす。例えば、誘導体化された糖をプリカーサーイオンスキャンにより分析する場合、この誘導体自体は、質量分析計により検出することができる。陽性イオンモードにおいて、これは好ましくは、フェニルメチルピラゾロン(PMP)(MH)＋イオンのm/z 175での形成である。炭水化物自体又は別の異性体の組成は、検出可能である。
(標準操作手順(SOP))
SOPは、代謝産物分析の実行の高い品質及び均一性を保証する目的で、使用説明書に詳述されている。この文脈において、試料処理、質量分光分析及びデータ処理に関するような、全ての作業工程及び処理工程は、対応するパラメータと共に、標準化された代謝産物試料の収集、取扱い、調製、分析及びデータ処理を促進するように規定されており、これは低い日内変動及び日間変動を伴う再現性のある結果につながる。典型的には、具体的なSOPは、1種又は複数の試料物質型に関する1種又は複数の代謝産物クラスの分析に関する。
(パラメータセット)
SOPの全ての工程及び対応するパラメータは、データベースにおいて格納及び管理される。ひとつ又はいくつかのSOPが、試料又は試料収集物(すなわち、マイクロタイタープレート上の試料)に割り当てられる場合、試料調製に関する全てのパラメータは、制御ユニットに送信され、処理ユニットにおける試料調製プロセスを管理及びモニタリングする。ピペッティング、誘導体化、インキュベーション及び抽出を含む全ての工程は、対応するパラメータセットにより制御される。質量分光(MS)分析は、パラメータセットの対応するパラメータを適用する制御ユニットにより同様の方法で制御される。これらのパラメータは、マルチプルリアクションモニタリング(MRM)、プリカーサー及びニュートラルロススキャンのためのスキャン時間及び陽イオン化又は陰イオン化のような、MS-法を規定する。更に、例えば質量対及び質量許容差(mass tolerances)のような、標的の代謝産物及び関連した内部標準の同定のため、並びに内部標準の濃度、反応因子、検出限界及び線形範囲などの定量のための全てのパラメータは、このパラメータセットに含まれる。
(フィルタリング)
データ処理は、典型的にはフィルタリングと称されるデータ削減工程に関連している。ノイズフィルターは、計算されたノイズ閾値に基づきデータを削減する。これに関して、一定のシグナル対ノイズ比を下回るデータが取り除かれる。結果の内容に基づき、フィルタリングは、例えば、研究下の疾患の関連のある代謝の観点について集中するために、疾患特異的な知識を活用する。
(比較及び評価)
質量分光分析に由来した予備処理されたデータが技術的に検証された後、統計解析を進めることができる。代謝産物プロファイリング試験の設計に応じ、健常対照及び患者に由来するひとつの試料又はいくつかの試料が比較され、差異、すなわち分子レベルで疾患を特徴付けるために利用することができるバイオマーカーを明らかにする。別の態様において、試料は、臨床試験に参加している患者に由来し、ここで新規薬物化合物が、調査され、承認薬と比較される。代謝産物プロファイリングの評価は、薬力学特性及び治験化合物又は用量の差異である。これらの薬力学特性は、個々の化合物により引き起こされる有効性及び副作用を指摘する。
以下に、本発明の機器の構造例が説明される。図1を参照すると、機器10は、処理ユニット11及び質量分析計14を備える。更に、入力ユニット16に連結された制御ユニット12が存在する。制御ユニット12は、データベース13に接続されている。データベース13は、評価/比較及び出力ユニット20に連結されている。データベース13は、処理ユニット15の結果を受け取る。処理ユニット15は、質量分析計14からの結果を受け取る。処理ユニット15は、制御ユニット12と組み合わせられるか、あるいは個別のユニットとして認めることができる。
以下に、図2に示されるように、処理ユニット11の構成部品が、より詳細に説明される。処理ユニット11は、マイクロタイタープレート22を取扱うロボットを備える。更にこれは、内部標準、消費物質又は溶媒の、マイクロタイタープレート22のウェルへの導入を取扱う。処理ユニット11は、液体取扱いシステムを備える。処理ユニット11は更に、自動試料採取器を備え、これは生体試料を、マイクロタイタープレート22のウェルへ提供される複数の一定分量へ分割する。
本発明のひとつの態様において、マイクロタイタープレート22は、1種の生体試料のみに由来している一定分量を含む。しかしながら、マイクロタイタープレート22の異なるウェル中に分配されている、異なる生体試料を有することも可能である。
処理ユニット11は更に、多様な内部標準、消費物質又は溶媒を含有する容器を備える。該ロボットは、内部標準、消費物質又は溶媒を、ウェル内の各一定分量に添加するために、異なる容器にアクセスしている。
更なる構成部品が、複数の組み合わせた一定分量を調製するために必要とされる。これは、一定分量を減圧又は加圧下に置くために必要とされることがある。加えて、内部標準、消費物質及び溶媒の一定分量との信頼できる混合を提供するために、振盪機及び/又は遠心機が手配される。処理ユニットの追加の構成部品は、例えば、ドラフト及びピペット洗浄ユニットである。
マイクロタイタープレート22は、上側及び下側プレートを含み、これらは処理ユニット11内において一緒にされた試料の処理後に互いに分離することができる。上側プレートは、支持体を把持するためのホルダー又は固定器具を有し、これは1種又は複数の内部標準、消費物質又は溶媒で含浸することができる。
液体において内部標準、消費物質又は溶媒を供給する代わりに、これらは多孔質支持体上に先に提供されてもよい。多孔質支持体は、上側プレートのウェルに挿入することができる。従って、生体試料の一定分量は、処理時に内部標準、消費物質又は溶媒を可溶化することができる。
以下に、生体試料中の代謝産物特性の分析方法が、図3に基づき説明される。
工程S1において、調査される生体試料、例えば健常者の血液が処理ユニット11へ供給され、そこで自動試料採取器の使用により複数の一定分量18nへ分けられる。一定分量は、96ウェルを伴うマイクロタイタープレート22のウェルへ供給される。マイクロタイタープレート22は、その後、内部標準、消費物質又は溶媒を挿入するための場所へロボットにより移動される。いずれの内部標準、消費物質又は溶媒が、ある一定分量と組み合わせられる必要があるかどうかの決定は、いずれの代謝産物がスクリーニングされるかという情報に基づき行われる。特にSOP及び対応するパラメータセットを試料又は試料収集物へ割り当てることにより、試料(複数)を取扱う方法が、規定されかつ標準化される。
工程S2において、いずれの代謝産物がスクリーニングされるかの情報は、入力ユニット16により入力され、これは制御ユニット12へ供給される。この情報を基に、制御ユニット12は、パラメータセット/SOPを決定し、これは試料の調製、分離、並びに組み合わせられかつ分離された各生体試料の質量分光分析に使用される。このパラメータセットは、処理工程及び対応する標準操作手順(SOP)のパラメータを反映している。制御ユニット12は、生体試料の処理及び質量分光分析の実行に必要とされるパラメータセット/SOPのデータを含むデータベース13にアクセスする。パラメータセット/SOPをデータベース13から誘導することにより、制御ユニット12は、試料の調製、誘導体化及び代謝産物の抽出をいかにして実行するかを決定する。このパラメータセットは、処理の時間値、加熱の温度値、及び消費物質/溶媒の種類を含むことができ、これは特定の試料等と組み合わせられる。
使用者は、実験室情報管理システム(LIMS)に、プロジェクト及び試料関連情報を入力し、独自の試料識別子、バーコードを伴う作業リストを規定し、そして標準操作手順(SOP)を割り当てるように依頼することができる。LIMSは、調製、処理及び質量分光分析時に生体試料を追跡するため及び品質コントロール及び管理のために利用することができる。ひとつの態様において、LIMSは、入力、制御、処理及び評価ユニット、並びにデータベースを備えることができるが、他のユニットとインターフェースで接続されている個別のユニットとして認めることもできる。
工程S5において、生体試料の一定分量18nは、内部標準、消費物質及び溶媒の少なくとも1種と組み合わせられる。特に、異なる消費物質/溶媒を各一定分量に組み合わせることが可能である。
組み合わせられた後、複数の組み合わせた試料又は一定分量は、スクリーニングされる代謝産物に応じて、工程S6において処理される。いずれの種の代謝産物がスクリーニングされるかという情報は、入力ユニット16に対して、例えば、使用者により入力される。これは更に、例えば処理ユニット11への供給前又は供給時に、生体試料を含む装置上のバーコードを読みとる自動化された読み取り装置により、いずれの代謝産物がスクリーニングされるかという情報を入力することが可能である。バーコードは、どの代謝産物がスクリーニングされるかを示す。この処理は、溶媒混合物の極性に応じた抽出、試料の添加、多孔質支持体上の試料の乾燥、誘導体化、遠心(又は真空)による乾燥及び抽出を含むことができる、液体取扱いシステムにおいて実行される。処理後、マイクロタイタープレート22の上側プレートが取り外される。下側プレートは、抽出された代謝産物を含み、これは質量分光分析に提供される。
工程S7において、各一定分量18nの抽出物は、自動試料採取器を使用することにより、個別に質量分析計14へ提供される。
工程S8において、質量分析が実行される。質量分光分析は、パラメータセット14の対応するパラメータを適用する制御ユニットにより、同様の方法で制御される。これらのパラメータは、マルチプルリアクションモニタリング(MRM)、プリカーサー及びニュートラルロススキャンのためのスキャン時間及び陽イオン化又は陰イオン化のような、MS-法を規定する。更に、例えば質量対及び質量許容差のような、標的の代謝産物及び関連した内部標準の同定のため、並びに内部標準の濃度、反応因子、検出限界及び線形範囲などの定量のための全てのパラメータは、このパラメータセットに含まれる。工程S9において、質量分光分析の結果が受け取られる。
先に説明したように、一定分量試料の各抽出物は、質量分光分析へ個別に提供される。従ってマイクロタイタープレート22中には96個ウェルが存在するため、工程S7からS9は、96回実行される。
これらの結果は、処理ユニット15で受け取られる。処理ユニット15において、データ処理を含む工程S10が実行され、これはノイズフィルタリング、結果の内容物に基づくフィルタリング、定量、及び検出された代謝産物の注釈づけを含む。処理され、そしてフィルタリングされた結果は、工程S11においてデータベース13に格納される。処理ユニット15は、標的の代謝産物及び対応する内部標準を検出し、そして各試料18nの内部標準の濃度は公知であるので、代謝産物の濃度を計算する。濃度の計算後、フィルタリングが実行される。非常に大きい量の質量分析データが存在するため、誘導された結果は、フィルタリングされることが必要であり、ここで多様なフィルタリング法が、データ量を削減するために適用することができる。その後フィルタリングされたデータが格納される。質量分光分析の調製又は処理された結果が格納された後、これらの結果は参照値と比較され、これは工程12においてデータベース13に格納され、正常又は病的疾患状態、あるいは治療的介入に対する薬理学的反応を示す情報を導く。
これらの結果は、工程S13において、モニター又は印刷の使用により出力される。質量分析の結果のデータベース13に格納された参照値との比較時に誘導され得る情報に基づき、データベースを適合することができる。この学習プロセスは、代謝産物特性の解析のための生体試料の処理のために使用されるパラメータセットの適合を提供するために使用することができる。
図4を参照し、生体試料の代謝産物特性を作製するために、複数の結果を誘導する例を示す。
定性的及び定量的な代謝産物プロファイリング法を利用するII型糖尿病に関する前臨床試験を、疾患マウスモデルの代謝的な特徴の決定及び新規候補薬クラスの詳細な薬力学的な説明のために行った。治療、未治療又は承認薬による治療のいずれかにおける、健常マウス及び疾患マウスからなる6群を試験した。
第一例のこれらの6群は、疾患群(T2D)、健常群、候補薬で治療した疾患群、候補薬で治療した健常群、承認薬で治療した疾患群、及び承認薬で治療した健常群である。各群に関して、予め決定された数の動物が試験される。各動物に関して、4種の物質が、生体試料として使用される。この態様において、尿試料、血漿試料、赤血球試料及び肝臓試料が、各動物から採取される。各試料は、本発明の機器に提供され、代謝産物の4種の異なるクラスについて試験される。代謝産物の各クラス(アミン、カルニチン、糖、脂質)は、具体的な標準操作手順(SOP)により特徴付けられる。赤血球分析について、尿の試験とは異なる手順が必要であることに注意する。更に組み合わせられた内部標準、消費物質及び溶媒は異なる。最後に組み合わせられた一定分量の処理及び分離は異なる。しかしながら、実証された試験を実行するために、各群の各試料は、4種の異なるSOPを使用してスクリーニングされる。
全試験手順の実行後、これらの試験の120000を超える定量的な特徴が誘導される。これらの定量的な特徴は、統計手順の使用により分析する必要がある。加えて、データベースの知識を用い、データマイニングを実行することができる。
定性的LC-MS代謝産物プロファイリングに関する情報を誘導するために、マウス尿及び血漿試料を逆相クロマトグラフィーにより分離し、エレクトロスプレー源を装備した四重極飛行時間型(qTOF)質量分析計により分析した。原スペクトルをフィルタリングし、並置し、拡大縮小し、引き続きデータを統計解析した。定量的標的のMS/MS分析については、マウス尿、血漿、赤血球及び肝臓試料を誘導体化し(アミノ酸、アシルカルニチン、糖)、固相によるか又は液体-取扱い-システムによりFolch液(糖脂質及びリン脂質)中で抽出し、エレクトロスプレー源を装備した三連四重極(QqQ)MSにより、マルチプルリアクションモニタリング(MRM)、プリカーサー及びニュートラルロススキャンと組み合わせたフローインジェクションにより分析した。濃度は、原MSスペクトルから算出し、フィルタリングし、標準化し(クレアチニン、総タンパク質に対し)、拡大縮小し、予め注釈づけされた代謝産物の統計解析及び生化学解釈を続けた。この手順は、図5に図示されている。
定量的に標的の代謝産物プロファイリングは、予め規定され予め注釈づけされ、かつMRM、プリカーサー及びニュートラルロススキャンにより検出された検体(内部標準)に集中する。フローインジェクション分析(FIA)は、豊富なシグナルにつながるイオンの定常流れ(TIC)に勝るシグナル平均化を可能にする。特徴的質量転移は、代謝産物及び関連内部標準(IS)の同定に使用される。脱同位体化(de-isotoping)は、タンパク質分析に使用される。しかし同位体補正も、ある種の小分子化合物及びクラスについては推奨される。これらのアルゴリズムは、これらの同位体の重複の測定されたピーク強度を補正するために、標的の検体の計算された同位体割合を利用する。最後に、代謝産物濃度は、既知濃度の内部標準を測定されたイオンの1秒当たりのカウント数(cps)と関連付けることにより計算される。
本発明の標的の代謝産物プロファイリング法は、高い再現性及び低い変動係数(CV)が保証されているマイクロタイター型における、完全に自動化され、そして並行化された試料調製のための液体取扱いシステムにおいて利用される。更に、検体及び対応する代謝産物は、迅速かつ直接の生化学的及び生物学的解釈が可能であるように、前もって注釈づけされた。
最大825種の代謝産物が各コンパートメントから得られ、そして各群の比較は動物疾患モデルの群で同定を可能にし、迅速な薬効の生化学的な特徴決定を促進した。
図6は、質量分析の結果を図示しており、ここで多様なアミノ酸が、既知の内部標準(*で示された)のピークと比較して示されている。
標的の代謝産物濃度プロファイリングは、より高いスループット並びに多様な生体液及び組織の標準化された分析の多用途性を促進し、これは包括的な疾患特徴決定、並びに動物モデル実験における有効性及び毒性評価のために特に重要である。直接又は代理の単変量又は多変量のマーカーは、分子レベルで疾患を説明するという観点から、データマイニング技術により明らかにされ、これはその後、多様なコンパートメント及び組織において代謝変化及び薬力学的変化を研究するために使用されることが多い。
一般に同じ技術は、細胞-ベースシステム、動物モデルから臨床試験に及ぶ、医薬品開発の多様な段階で適用することができる。例えば、正常な生物学的プロセス及び病因プロセス又は治療的介入対する薬理学的反応の特徴決定のためのような、前臨床相において発見されかつ検証された推定バイオマーカーは、臨床試験における同じ分析技術により臨床的に検証することができる。意図される診断適用において、臨床試験は、臨床的慣習における候補バイオマーカーの推定性能及び汎化力を評価し、ここで典型的に高い特異性が、他の疾患を排除するために必要とされる。
それぞれの成功的な代謝産物プロファイリングのバイオマーカーを発見する試験は、管理された臨床試験における通常の実践と同じく、明確に規定された目的、前もっての詳細なプラン及び品質コントロール手順を伴う慎重に計画された実験設計に頼っている。十分に考え尽くされた(thought-through)実験設計は、所定の実験作業から得られた情報を最大化し、価値のある客観的な結論を生じる。
実験の不備及び偏りは、統計学的に決定されたバイオマーカーの推定性能及び汎化力を危うくする。このような状況において、代謝産物プロファイリングは、過去から学ばねばならず、ここで初期の臨床検証試験における不充分な実験設計及び欠損した再現性は、血清タンパク質プロファイリング技術の広範な使用を制限する。
当然、統計学的有意性を超える、生物学的意義の問題点が存在する。発現(expression)又は濃度の変化は統計学的に有意であるという理由で、その変化は基礎となる生物学に何らかの影響を有することを常に暗示するものではない。一部の遺伝子、タンパク質又は代謝産物は、厳密に調節され、従って存在量の小さい変化は生物学的に関連があるが、その他のものは、緩く調節され、生物学的作用を伴わずにかなり変動し得る。
まとめると、本発明の代謝産物特性の分析を実行する場合には、数百と多い代謝産物を、事前分析工程を用い、高速で正確かつ感度よく生物学的物質のマイクロタイター量から同時に分析することができる。品質保証(QA)データは、ものの数分で個々の試料から作製され、そして最先端の統計学的ソフトウェアツールを用い解釈される。この方法は、事前統計学的標準化及び自動化、並びに使用者に優しい統計学的及び生化学的データ解釈により、存在する統計学的障害も克服する。本発明の方法の全ての構成部品の新規技術プラットフォームへのこの統合は、広範な適用のためにアクセス可能である「生化学指紋」を作製し、そしてメタボロミクスの広がりを早めるであろう。
本発明は、更に以下の非限定的な実施例により例証される。
(マルチ装置の調製及び条件)
ひとつのマルチ装置を、Solvinertマイクロタイタープレート(MSRP N04, Millipore Corp MA, 米国)の96ウェルの各々の中の多孔質支持体として、7mmセルローススポット(汎用カード-10 539 859から切断、Schleicher Schuell Biosciences GmbH, ダッセル, 独国)を用いて調製した。これらは、ポリプロピレンから製造された固定器具(Biocrates, チロル, オーストリア)により、所定の位置に固定した。
試料由来の代謝産物の選択されたサブセット、この場合、アミノ酸、アシルカルニチン及びリン脂質を分析するために、試料からの20種のタンパク質新生、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン及び各々の溶解（lyso)種を全て表すために、安定した同位体で標識された、アミノ酸、アシルカルニチン及び脂質の好適な内部標準の選択を使用した。これらは、既知量の各内部標準クラスをピペッティングし、多孔質支持体内で各々を乾燥させ、その後内部標準の次の混合物を添加し、乾燥させるなどにより、マルチ装置の多孔質支持体に予め包埋した。該実施例において、二重の目的に役立つ化合物である、0.1w/w％ポリエチレングリコール1000(PEG 1000)を含有する水溶液中に、アシルカルニチン、引き続きアミノ酸、最後にリン脂質の内部標準の混合物が添加された。界面活性剤として、PEG 1000が多孔質支持体の細孔内に存在し、全ての内部標準をコーティングし、これは酸素及び水への曝露の分解作用に対して保護障壁をもたらす。
次に完全に乾燥している時点で、マルチ装置技術検証試料を、まずマルチ装置の5個のウェルに添加した。
ウェル1：ブランク、
ウェル2及び3：非標識代謝産物のコントロール混合物、
ウェル4：低濃度代謝産物による品質コントロール(正常レベル又は1倍)、並びに
ウェル5：高濃度代謝産物による品質コントロール(正常の10倍のレベル)。
その後ウェル1から5における追加のコントロール試料と共に予め包埋された内部標準を含むマルチ装置は、直ぐ使用することができるように4℃で貯蔵された。
(マルチ装置の使用法)
[実施例1]
単に例証を目的として、以下に、どのようにして、先に特定されたような装置を使用し、代謝産物の選択の分析のために試料を処理するかを説明する。
試料由来の代謝産物、アミノ酸、アシルカルニチン及びリン脂質のサブセットを分析するために、20種のタンパク質新生アミノ酸、最も豊富なアシルカルニチン、並びにホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン及び各々の溶解種を含むリン脂質の全てを表すために、安定した同位体で標識されたアミノ酸、アシルカルニチン及び脂質の好適な内部標準の選択を使用した。典型的には血漿10μlの予め規定された量の試料の添加時に、試料の内部標準及びアミノ酸をインサートの細孔の境界内で混合した。従って代謝産物の喪失又は分解を引き起こすいずれかの後の処理は、内部標準により相関されるであろう。その後アミノ酸の誘導体化をインサートの細孔の境界内で行うことができる。該実施例における誘導体化試薬は、ピリジン、水、エタノールの1:1:1溶液中の5％フェニルイソチオシアネート15μlからなる。この誘導体化プロセスは、室温において20分未満で生じる。この誘導体化溶液は完全に揮発性であるため、室温での穏やかな窒素流又は真空下において簡単に除去することができる。10mM酢酸アンモニウムを含有するメタノール溶液の添加は、誘導体化されたアミノ酸、アシルカルニチン及びリン脂質を、同時に、多孔質装置からメタノール溶媒へと抽出する。この目的のために選択されたマイクロタイタープレートは、追加的な特性を有する。これは、0.45μmフィルター、及び遠心力又は真空下でのみ開口し、各ウェルの底を構成する液体排出口を備える。試料由来のメタノール抽出物はその後、遠心により、捕獲用マイクロタイタープレートへ簡単に収集され、マイクロタイタープレートを備える装置に配置される。その後、各ウェルからの溶液の質量分光分析は、典型的には試料を質量分析計へ送達するための自動試料採取装置を用いて行うことができる。
[実施例2]
以下は、この装置が代謝産物の選択の分析のために試料を処理するために使用することができることを明らかにする。
各ウェルに対して、1人の患者由来の血液試料10μlを正確に添加した時点で、マルチ装置は、多孔質支持体(インサート)の細孔の境界内で内部標準と混合される。その結果、代謝産物の喪失又は分解を引き起こすいずれかの後の処理は、内部標準と相関するであろう。誘導体化は、実施例1のとおり実行され、次に各ウェルから得られた溶液が、典型的には試料を質量分析計へ送達するための自動試料採取装置を用いて、質量分析により分析される。
マルチ装置により誘導体化及び抽出された代謝産物の質量分析測定からの結果は、図8及び図9に示され、これらは各々アミノ酸、リン脂質及びアシルカルニチンを示している。
アミノ酸及びアシルカルニチン代謝産物の量は表3に示し、マルチ装置を用いて得られた値の精度及び分散も示している。
表3 −10回測定した単独の試料に由来するアミノ酸、脂質、乳酸塩、クレアチニン及びグルコースの量的精度及び再現性を表3に示し、そしてこれはマルチ装置を用いて得た。
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[実施例3]
(治療薬モニタリング)
免疫抑制薬は、移植後の臓器拒絶反応を阻止するために必要とされる。使用される免疫抑制薬は、エベロリムス、シクロスポリンA、タクロリムス、シロリムス、及びミコフェノール酸である。先に説明されたように同様に好適に調製されたマルチ装置から調製された治療薬モニタリングの結果は、本発明の「特許請求の範囲」のマルチ装置及び支持体の使用を更に例示するために、本明細書中に示されている。
(マルチ装置の調製及び条件)
該マルチ装置は、多孔質支持体として単独の8mmセルローススポット(汎用カード-10 539 859から切断, Schlicher Schuell, Biosciences GmbH, ダッセル, 独国)を代わりに使用すること以外は、先に説明されたものと全く同じ方法で調製された。
2個のマルチ装置ウェルへ、エベロリムス(200ng/mL)(Sigma, ウィーン, オーストリア)、シロリムス及びタクロリムスの内部標準、並びにシクロスポリンD(400ng/mL)(Sigma, ウィーン, オーストリア)、シクロスポリンAの内部標準を含有するメタノール溶液(20μl)を入れ、マルチ装置の多孔質支持体上にピペッティングし(Gilson 20μlピペット)、室温で30分間乾燥させた。較正物質混合物及び品質コントロールレベルI-V(免疫抑制薬のための全血較正物質セット(レベル0-6), 免疫抑制薬のための全血対照ClinChek R (Recipe Chemicals and Instruments GmbH, ミュンヘン, 独国)を、製造業者の指示に従い再構成し、ともに-20℃で貯蔵した。使用前に、漸増濃度のシクロスポリンD及びエベロリムスを含む6種の較正物質溶液、並びに異なる濃度のシクロスポリンA、タクロリムス、シロリムス及びエベロリムスを含む5種の品質コントロール溶液を、解凍し、室温約23℃とした。6個のウェルへ、6種の較正物質の各20μlを、マルチ装置の多孔質支持体上にピペッティング(20μl Gilsonピペット)した。5種の品質コントロールは、マルチ装置の多孔質支持体の5個の個別のウェルにピペッティングした。該マルチ装置へ、マルチ装置多孔質支持体上で、アセトニトリル(HPLC等級)を、直ちに添加し(Gilson 200mlピペット)、即座にオービタルシェーカーにより600rpm未満で30分間振盪した。装置の下側に300μl容量のマイクロタイター捕獲プレートを配置することにより、溶出液を収集し、次に500gで6分間2回遠心した。その後溶出液を、開示されている方法(T. Koal, M. Deters, B. Casetta, V. Kaever, Simultaneous determination of four immunosuppressants by means of high speed and robust on-line solid phase extraction-high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry, J. Chromator. B, Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2004 Jun 15, 805(2); 215-222)に基づき、質量分析技術により分析した。いかにして結果を得、計算したかについての代表例は、定量的データを作製するためのLCMSによるシクロスポリンA分析に関して図10に示されている。内部標準シクロスポリンDの積分されたピーク下面積を、既知量を含む5種の品質コントロール試料における免疫抑制薬シクロスポリンAのピーク下面積に対する比較のために使用した。
図11から14は、4種全ての免疫抑制薬シクロスポリンA、タクロリムス、エベロリムス及びシロリムスに関する、マルチ装置内のインサートとしてセルロース支持体を使用する、線形標準曲線を示す。表4は、分析した5種の品質保証物質の計算された濃度及び精度比較の実際を示している。
Figure 0004829297
(産業上利用可能性)
本発明は、多様な生体液及び組織の多用途かつ標準化された分析を可能にする。例えば、現在のインハウス(in-house)能力は、同時かつ完全に自動化された試料の調製及び分析を明らかにしており、これは乾燥血液10μlから、100種を超える注釈づけされた経路内で多様なクラスの代謝産物を対象とするMS運転時間6分以内に1000種以上の定量的で注釈づけされたデータ点を産生する。このように、本発明は、これまで広範な定量的メタボロミクスマイニングを妨げていた(事前)分析、自動化、並びにデータ処理及び解釈における障害のほとんどを初めて克服するものである。
先行技術の分析的方法及び装置と比べ、本発明の定量的分析は、極めて耐久的(rugged)であり、それらの結果は高度に再現可能である。特に代謝産物データは、同等のプロテーム又はトランスクリプトームデータよりもはるかに優れている。わずかに10μlの血液もしくは血清又は20μlの尿又は100,000個未満の培養細胞を必要とするだけである。
分析方法及び装置の性能特徴は、研究(発見)適用及びその後の臨床診断標準の両方に合致することができる。これは、品質保証されたデータ、実験室毎に同等である標準化されたデータ、迅速な作業所要時間、履行(ヒット)の「用意」、容易に受け取られるデータの解釈及び視覚化、並びに非常に高度の自動化及び標準化(SOP)を確実にするか、あるいは可能にする。全般的な経費/データ点は、メタボローム情報を、プロテオーム情報よりもより安価なものとする。
本発明の方法又は装置により得られた定量的情報は、体系的な(システム生物学)の状況及び拡張可能な様式における経路及び代謝産物を対象としている。従って、中間代謝の代表的機能の像又は画面例又は代謝のフィンガープリントは、マーカー代謝産物のアレイから最終的に誘導することができる。
更に、システム生物学に関するメタボローム情報を収集する、注釈づけされ、そして簡便にプロテオーム、トランスクリプトーム及びゲノムの情報源にリンクすることができる機能エンドポイント情報が、必要である。
本装置及び方法は、大規模な定量的に同定され及び注釈づけされた代謝産物特性の同時作製、並びに複雑かつ動的な複数のバイオマーカーパターンの研究のための新規な「標準」を確立するために適した統合ツール(ソフトウェア及び分析用)として使用することができる。更に、自動化されかつ標準化された試料調製のための液体取扱いシステム並びにMS-MS分析のための質量分析計からなる市販のハードウェア構成部品は、所有者(proprietary)により統合され、かつ設計された消費物質-ベースの製品及びアプリケーションソフトウェアを保護し、これは品質管理されたデータ処理のための(事前)分析手順及び革新的モジュール、技術的検証及び文書化、統計解析及び生化学的解釈を含む。
本発明における試料調製時間(90試料/マイクロタイタートレイのバッチを基にしたヒット)は、わずかにおよそ2時間であり、更にスケジューリングソフトウェアによる並列化により短縮されるであろう。定量のための広範な特異的内部標準は、ソフトウェア及びSOPと一緒にQC及びQAに必要な全ての物質を含むように、通常1又は2工程反応調製及び適用ヒットの統合部分として独自の化学(proprietary chemistry)において予め公式化されている。
産業適用は、疾患診断、治療有効性又は毒性について検証されたバイオマーカーを利用することを目的としたバイオマーカー発見及び市販化を含む。医薬開発における主要な適用は、薬物代謝及び薬物動態、毒性及び安全性、薬効及び薬力学の分野を含む。他の技術分野は、臨床診断、並びに例えば、早期に感度の良い特異的診断及び正確な病期決定が、高価な介入の代わりに疾患予防を促進し、及び治療を個人化し並びにここで治療作用が特異的にモニタリングされ、個人化された治療を支援するような治療診断(theranostics)を含む。更なる適用領域は、栄養産業、健康管理、本国の防衛、及び基礎生物学を含むが、これらに限定されるものではない。
図1は、本発明の機器のブロック図を示す。 図2は、本発明の処理ユニットの構成部品を例示する概略図を示す。 図3は、本発明の方法の単純化されたフローチャートを示す。 図4は、本発明の方法及び機器を使用する前臨床試験の概略図を示す。 図5は、本発明の標的化されない及び標的の代謝プロファイリングの比較の略図を示す。 図6は、標的の代謝産物プロファイリングを使用する、本発明の代謝産物及び内部標準に関する質量分析の結果を図示する。 図7は、ウェル又はバイアルを備える本発明において好ましく使用される単独の装置の横断面図及び個々の構成部品からのその組立てを示す。参照番号(1)は、ウェル/バイアルを示す。参照番号(2)は、任意の(マイクロ)カプセル化により、任意に内部標準を含む、グラス、セルロース又は他の好適な材料(すなわち、多孔質支持体)の不動態化された固定相を備える、インサートを示す；参照番号(3)は、ウェル又はバイアル内の多孔質支持体を保持する固定器具を示し、これは誘導体及び溶媒に対し化学的に不活性である；参照番号(4)は、フィルターを示す；参照番号(5)は、遠心力もしくは重力の圧力又は真空下で開く、排出口を示す。 図8は、フェニルチオ尿素アミノ酸誘導体(PTU)のイオンタンデム質量分析を使用する、陰性モードでのニュートラルロススキャン135を説明し、これは実施例2に説明されたマルチ装置により調製された赤血球細胞試料由来のアミノ酸及びそれらの対応する安定した同位体内部標準を示す。 図9Aは、陽イオンモードでのプリカーサースキャン184を説明し(A)、これは、実施例2の赤血球細胞試料由来のリン脂質を抽出するマルチ装置の能力を示す。例えば、スフィンゴミエリン及びホスファチジルコリンは、m/z範囲700-840で、リソホスファチジルコリンは、m/z範囲400-650で観察可能である；図9Bは、実施例2の陽イオンモードでのMRMスキャン(マルチプルリアクションモニタリング)を説明する。 図10は、定量データを作製するために、品質コントロールした血液試料からの免疫療法薬シロリムス、エベロリムス、シクロスポリンA、タクロリムス、並びに内部標準アスコマイシン及びシクロスポリンDが、LCMSで分析される方法の例を説明している。既知濃度の内部標準シクロスポリンD及びアスコマイシンの積分ピーク下面積を用い、既知濃度量を含有する5種の品質コントロール試料における免疫抑制薬のピーク下面積と比較する。これは4種全ての薬物の精度の測定を提供する。 図10aを参照のこと。 図10aを参照のこと。 図11は、セルロースインサートを備えるマルチ装置から得たシロリムスに関する較正物質からの検量線を説明する(実施例3)。 図12は、セルロースインサートを備えるマルチ装置から得たエベロリムスに関する較正物質からの検量線を説明する(実施例3)。 図13は、セルロースインサートを備えるマルチ装置から得たシクロスポリンAに関する較正物質からの検量線を説明する(実施例3)。 図14は、セルロースインサートを備えるマルチ装置から得たタクロリムスに関する較正物質からの検量線を説明する(実施例3)。

Claims (9)

  1. 少なくとも１の薬物及び／又は代謝産物を含有する生体試料中の、薬物及び／又は代謝産物特性を分析するための機器であって、該生体試料は等分された試料に分割することができ、そして該機器は：
    スクリーニングされる少なくとも１つの薬物及び／又は代謝産物の種類を入力するための、入力ユニット；
    入力ユニットに連結し、かつデータベースに接続している制御ユニットであって、少なくとも１つの薬物及び／又は代謝産物の調製のため、並びにスクリーニングされる該少なくとも１つの薬物及び／又は代謝産物の種類の入力に応じた質量分光分析のためのパラメータセットを決定するための、制御ユニット；
    少なくとも１つの決定されたパラメータセットに応じてスクリーニングされる少なくとも１つの薬物及び／又は代謝産物の調製のための処理ユニットであって、ここで該処理ユニットは、さらに、試料を内部標準、消費物質及び溶媒の少なくとも１つ又はこれらの組み合わせと組み合わせるために提供され、ここで該組み合わせは、スクリーニングされる少なくとも１つの薬物及び／又は代謝産物の種類の入力に応じて実行される、処理ユニット；
    パラメータセットに応じ、少なくとも１つの調製された薬物及び／又は代謝産物について質量分光分析を行うための、質量分析計；
    分析結果、並びに薬物及び／又は代謝産物の調製のため及び質量分光分析に関するパラメータセットの格納のための、評価ユニットに連結しているデータベースであって、ここで該データベースは、質量分光分析の結果と該データベースに格納された参照結果とを比較することに由来する更新された情報を含むように提供されている、データベース、を備えており、
    ここで、質量分光分析の結果は、薬物及び／又は代謝産物特性の分析を出力するために、データベースに格納された参照結果を使用して、評価ユニットにより評価され、
    ここで、等分された試料は、複数の組み合わせとして、異なる内部標準、消費物質又は溶媒と共に、多様な方法／パラメータセットにより調製されるために処理ユニットに提供することができ、複数の調製された抽出物が得られることを特徴とする、
    機器。
  2. 前記組み合わせられた試料が、処理ユニットにおいて供給されたパラメータセットに従い処理され、調製された薬物及び／又は代謝産物を提供する、請求項１に記載の機器。
  3. 前記調製された薬物及び／又は代謝産物が、抽出された後に質量分析計へ供給される、請求項１又は２に記載の機器。
  4. 質量分析結果のデータ・フィルトレーション、濃度計算、標準化、検証及び注釈づけの少なくとも１つの工程のための処理ユニットを備える、請求項１〜３のいずれか１項に記載の機器。
  5. 生体試料中の薬物及び／又は代謝産物特性の分析のための方法であって、
    薬物及び／又は代謝産物の分析のために、試料を機器へ提供する工程；
    試料を一定分量の少試料へ分割する工程；
    スクリーニングされる薬物及び／又は代謝産物の情報を、機器へ提供する工程；
    スクリーニングされる薬物及び／又は代謝産物の情報に応じて、薬物及び／又は代謝産物の調製のため及び質量分光分析のためのパラメータセットを決定する工程；
    等分された試料の各々を、異なる内部標準、消費物質又は溶媒と組み合わせることにより、スクリーニングされる薬物及び／又は代謝産物のパラメータセットに応じて、等分された試料を調製する工程；
    パラメータセットに従い、等分された試料の各々を処理する工程；
    調製された薬物及び／又は代謝産物を抽出する工程；
    調製された薬物及び／又は代謝産物の抽出物を質量分光計へ提供し、そしてパラメータセットに基づき薬物及び／又は代謝産物を分析する工程；
    調製された薬物及び／又は代謝産物について、１又は複数の質量分光分析を実施する工程；
    スクリーニングされる薬物及び／又は代謝産物の質量分析の結果を評価及び処理し、そして参照値と比較する工程；
    評価及び処理した結果、並びに産生された薬物及び／又は代謝産物の濃度特性を、データベースに格納する工程；
    出力データを産生する工程、を含んで成る方法であって、ここでデータベースが、質量分光分析の結果と該データベースに格納された参照結果とを比較すること由来する更新された情報を含むように提供されていることを特徴とする、方法。
  6. 前記スクリーニングされる薬物及び／又は代謝産物の情報を提供する工程がさらに、
    少なくとも１の試料番号、ＩＳＴＤ、消費物質、溶媒、ＳＯＰ型、追跡のＬＩＭＳスタイルのチェックリストについて画面表示する工程を含んで成る、請求項５に記載の方法。
  7. さらに、
    試料と少なくとも１のＩＳＴＤ、消費物質もしくは溶媒又はこれらの組み合わせを組み合わせる工程；
    機器に供給されたパラメータセットに応じ、組み合わせられた試料を処理し；ここで該パラメータセットは、スクリーニングされる薬物及び／又は代謝産物の情報に応じて供給される工程、を含んで成る、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 前記薬物及び／又は代謝産物を調製する工程が：
    等分された試料から調製された薬物及び／又は代謝産物を誘導体化及び／又は抽出する工程、をさらに含んで成る、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記データベースに格納された参照結果に対する結果を評価及び比較する工程がさらに、
    注釈づけされた薬物及び／又は代謝産物の統計学解析及びケモメトリック分析；
    所定の新規の生化学経路における、注釈づけされた薬物及び／又は代謝産物の視覚化；
    更なる評価及び検証のための、注釈づけされた薬物及び／又は代謝産物のバイオマーカー候補の発見、を含んで成る、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
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