BRPI0611399A2 - processo para preparar um hidrolisado de gelatina de baixo peso molecular e composições de hidrolisado de gelatina - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA PREPARAR UM HIDROLISADO DE GELATINA DE BAIXO PESO MOLECULAR E COMPOSIçõES DE HIDROLISADO DE GELATINA. A presente invenção refere-se a um processo para preparar um hidrolisado de gelatina, e composições de gelatina incluindo hidrolisados de gelatina. Mais especificamente, a invenção fornece composições de gelatina tendo uma tendência reduzida a reticular e propriedades de dissolução melhoradas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOPARA PREPARAR UM HIDROLISADO DE GELATINA DE BAIXO PESOMOLECULAR E COMPOSIÇÕES DE HIDROLISADO DE GELATINA".

CAMPO DA INVENÇÃO

Este pedido reivindica prioridade de USSN 11/140.863 deposita-do em 31 de maio de 2005, cujo pedido está por este meio incorporado porreferência em sua totalidade.

A presente invenção refere-se a um hidrolisado de gelatina, umprocesso para preparar o hidrolisado de gelatina, e uma composição quecompreende o hidrolisado de gelatina. Mais especificamente, a presente in-venção fornece um hidrolisado de gelatina de baixo peso molecular que temum teor de amina primária alto, a um processo para preparar o hidrolisadode gelatina, e a uma composição de gelatina incluindo o hidrolisado de gelatina.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Gelatina é fabricada pela desnaturação de colágeno contido emmateriais tais como pele de porco, pele de gado ou couro, e ossos de ani-mais. Como sua proteína de origem, colágeno, a gelatina é definida por umaestrutura distintiva que compreende uma mistura sem igual de aminoácidos.

Colágeno nativo é uma escleroproteína baseada em uma cadeia de polipep-tídeo que compreende cerca de 1050 aminoácidos. Três destas cadeias depolipeptídeo vêm juntamente formar uma hélice tripla. A superimposição devárias destas hélices triplas produz fibrilas de colágeno que são estabiliza-das por reticulação, conseqüentemente, formando uma estrutura de redetridimensional. Esta estrutura particular torna o colágeno insolúvel; é em se-guida trazido em forma solúvel por hidrólise parcial como gelatina ou hidroli-sado de gelatina. O teor de aminoácido de colágeno e conseqüentemente dagelatina, abrange de um terço de glicina e um adicional de 22% de prolina e4-hidroxiprolina; os 45% restantes compreendem 17 aminoácidos diferentes.Gelatina tem um teor particularmente alto de aminoácidos ácidos e básicos.Dos aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), quantidadesvariáveis estão presentes na forma de amido como glutamina e asparaginaque dependem das condições de processo empregadas no processo de fa-bricação de gelatina. Cisteína está completamente ausente; dos aminoáci-dos contendo enxofre, a metionina é o único presente.

Os dados para colágeno de peixe e avícula são um pouco dife-rentes, mas a presente invenção é igualmente aplicável à gelatina e/ou hi-drolisado de gelatina derivado de colágeno de peixe e avícula.

Gelatina pode ser utilizada em uma ordem ampla de aplicaçõesdependendo de seu material de partida e método de fabricação. Isto é por-que o comportamento físico e químico da gelatina é determinado por um Ia-do por uma combinação de seu teor de aminoácido e a estrutura espacialresultante, e por outro lado por uma miríade de condições tais como pH, re-sistência iônica e reações com outras moléculas. Por exemplo, tipos diferen-tes de gelatinas são utilizados em aplicações diversas tais como alimentí-cias, fotográficas, cosméticas, e farmacêuticas.

Na indústria farmacêutica, a gelatina é empregada inter alia nafabricação de cápsulas duras e macias. Cápsulas de gelatina fornecem ummétodo conveniente e eficiente para administrar oralmente um fármaco por-que as cápsulas desintegram-se rapidamente na exposição ao teor ácido doestômago, desse modo libertando o fármaco no corpo. Enquanto cápsulasde gelatina fornecem uma maneira farmaceuticamente elegante em que ad-ministrar um fármaco, há, porém, um risco que a cápsula de gelatina podesofrer retardamento da desintegração e dissolução que são o resultado deum processo conhecido como reticulação. Acredita-se que a reticulação o-corre quando grupos carbonila em gelatina, ingredientes suficientes conten-do carbonila em cápsulas, ou decomposição de ingredientes suficientes emgrupos carbonila, reagem com aminas primárias e outros compostos nitro-genosos presentes na gelatina para formar reticulações.

Reticulação, em particular, pode ter conseqüências medonhasno desempenho de cápsulas de gelatina no armazenamento prolongado eexposição aos extremos de calor e umidade. Reticulação da gelatina exten-sa em formulações de cápsula pode levar à formação de um película muitofina, dura e insolúvel em água, normalmente referida como uma película. Apelícula age como uma camada borrachenta, insolúvel em água que poderestringir, ou prevenir a liberação dos conteúdos da cápsula.

Alguém relatou amplamente meios para prevenir reticulação emfocos de cápsulas de gelatina em produtos que agem como descontaminan-tes de carbonila, prevenindo a interação de grupos carbonila, por exemplo,grupos aldeído, com a casca da cápsula de gelatina, desse modo prevenin-do a reticulação de gelatina. Todos estes métodos geralmente sugerem aadição de produtos à composição farmacêutica contida nas cápsulas de ge-latina. Foi mostrado que a adição do aminoácido glicina e ácido cítrico emcombinação às formulações encapsuladas em cápsulas duras de gelatinamelhorou o perfil de dissolução das cápsulas duras (3). Provou-se que a adi-ção do aminoácido glicina sozinho não produz resultados satisfatórios. Masa adição de descontaminantes de carbonila tais como glicina, e ácidos car-boxílicos tal como citrato, nas quantidades necessárias para reduzir a reticu-lação em cápsulas de gelatina está significativamente proibitiva de custo.

Como tal, a adição destes produtos à gelatina não é uma solução práticapara reduzir a reticulação em cápsulas de gelatina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece um meio de custo eficaz, práticopara reduzir a reticulação na gelatina. Brevemente, a invenção abrange umhidrolisado de gelatina de baixo peso molecular que, quando misturado comgelatina de peso molecular mais alto, reduz a reticulação da gelatina e me-lhora as propriedades de dissolução aumentando-se as quantidades de gli-cina livre, outros aminoácidos, e peptídeos pequenos no produto de gelatinamisturado. Vantajosamente, porque o hidrolisado de gelatina e composiçãode gelatina misturada da invenção têm propriedades de reticulação reduzi-das alcançadas sem a adição de produtos tal como glicina como um com-posto isolado misturado com ácido cítrico, a gelatina pode ainda ser comer-cializada como um produto natural.

Entre os vários aspectos da invenção, portanto, é um processopara produzir um hidrolisado de gelatina que tem um peso molecular médiode cerca de 100 a abrange de 2000 Da, preferivelmente abrange de 1500 Da,e um teor de amina primária médio de cerca de 1,0 χ 10"3 a abrange de 1,0 χ10"2 μΜοΙ de amina primária por μς do hidrolisado de gelatina. O processocompreende contatar um material de partida de gelatina com pelo menosuma enzima proteolítica que tem atividade de endopeptidase para formar umproduto de gelatina digerido por endopeptidase. O produto de gelatina dige-rido por endopeptidase é em seguida tipicamente contatado com pelo menosuma enzima proteolítica que tem atividade de exopeptidase. Geralmente, asdigestões proteolíticas de endopeptidase e exopeptidase procedem para umcomprimento suficiente de tempo e são conduzidas sob condições de reaçãopara formar o hidrolisado de gelatina.

Outro aspecto da invenção abrange um processo para prepararum hidrolisado de gelatina. O processo compreende contatar uma um mate-rial de partida de gelatina com uma série de pelo menos três enzimas pro-teolíticas que têm atividade de endopeptidase para formar um produto degelatina digerido por endopeptidase. Tipicamente, as três enzimas proteolíti-cas consistem em Endopeptidase de Bacillus subtilis (por exemplo, Corola-se® 7089), Bromelaína (por exemplo, Concentrado de Bromelaína Enzeco®),e Papaína (por exemplo, Papain 6000L). O produto de gelatina digerido porendopeptidase é em seguida contatado com uma série de pelo menos duasenzimas proteolíticas que têm atividade de exopeptidase. Geralmente, asduas enzimas proteolíticas consistem em Exopeptidase de Aspergillus ory-zae (por exemplo, Validase® FPII) e Exopeptidase de Aspergillus sojae (porexemplo, Corolase® LAP).

Ainda um outro aspecto da invenção fornece um hidrolisado degelatina. O hidrolisado de gelatina terá tipicamente um peso molecular médiode cerca de 100 a abrange de 2000 Da, preferivelmente abrange de 1500 Dae um teor de amina primária médio de cerca de 1,0 χ 10 3 a abrange de 1,0 χ10'2 μΜοΙ de amina primária por μg de hidrolisado de gelatina. Em uma mo-dalidade, o hidrolisado de gelatina é feito por um processo compreendendocontatar um material de partida de gelatina com uma série de pelo menostrês enzimas proteolíticas que têm atividade de endopeptidase para formarum produto de gelatina digerido por endopeptidase. Tipicamente, as três en-zimas proteolíticas são selecionadas de Endopeptidase de Bacillus subtilis(por exemplo, Corolase® 7089), Bromelaína (por exemplo, Concentrado deBromelaína Enzeco®), e Papaína (por exemplo, Papain 6000L). O produtode gelatina digerido por endopeptidase é, em seguida, contatado com umasérie de pelo menos duas enzimas proteolíticas que têm atividade de exo-peptidase. Geralmente, as duas enzimas proteolíticas são selecionadas deExopeptidase de Aspergillus oryzae (por exemplo, Validase® FPII) e Exopep-tidase de Aspergillus sojae (por exemplo, Corolase® LAP).

Um aspecto adicional da invenção é direcionado a uma compo-sição de gelatina. A composição compreende um hidrolisado de gelatina egelatina. Tipicamente, a composição compreenderá de cerca de 1% a cercade 20% em peso do hidrolisado de gelatina e de cerca de 80% a abrange de99% em peso de gelatina.

Outros objetivos e aspectos da invenção estarão em parte evi-dentes e em parte mostrados em seguida.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 mostra a redução na reticulação induzida por formal-deído de LH-1, uma gelatina de pele com oxido de cálcio, na adição de 2hidrolisados de gelatina diferentes, Tipo BH-3 e Tipo LHSH, como medidopelo procedimento de Endurecimento de Vórtice. Hidrolisado Type BH-3 éum hidrolisado de pele com oxido de cálcio de baixo peso molecular e TipoLHSH é um hidrolisado de pele com oxido de cálcio da presente invenção.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERIDAS

A presente invenção fornece um novo hidrolisado de gelatina,um processo para preparar o hidrolisado de gelatina e composições de gela-tina que compreendem o hidrolisado de gelatina. Foi descoberto que a mis-tura de um hidrolisado de gelatina de baixo peso molecular e em particular, ohidrolisado de gelatina da presente invenção, com gelatina, reduz a tendên-cia da gelatina de retícular e melhora as propriedades de dissolução aumen-tando-se as quantidades de glicina livre, outros aminoácidos, e peptídeospequenos no produto de gelatina misturado. Vantajosamente, a presenteinvenção fornece um meio de custo eficaz para reduzir a reticulação da gela-tina com o benefício de manter a composição de aminoácido original de ge-latina e sem a necessidade de adicionar compostos não derivados de gelati-na como ácido cítrico. Como tal, as composições de hidrolisado de gelatinada presente invenção ainda podem ser comercializadas como produtos natu-rais.

l. Processo para Preparar o Hidrolisado de Gelatina

Um aspecto da presente invenção abrange um processo paraproduzir um hidrolisado de gelatina que tem um peso molecular médio de cercade 100 a cerca de 2000 Da, preferivelmente cerca de 1500 Da e um teor deamina primária médio de cerca de 1,0 χ 10"3 a cerca de 1,0 χ 10"2 μΜοΙ de ami-na primária por μg do hidrolisado de gelatina. O processo compreende con-tatar um material de partida de gelatina com pelo menos uma enzima proteo-lítica que tem atividade de endopeptidase para formar um produto de gelati-na digerido por endopeptidase. O produto de gelatina digerido por endopep-tidase é em seguida tipicamente contatado com pelo menos uma enzimaproteolítica que tem atividade de exopeptidase. Geralmente, as digestõesproteolíticas de endopeptidase e exopeptidase procedem durante um perío-do de tempo suficiente e são administradas sob condições de reação paraformar o hidrolisado de gelatina.

O material de partida de gelatina empregado no processo dainvenção é tipicamente derivado de colágeno ou tecido rico em colágenodisponível de várias matérias-primas adequadas. Tecidos ricos em colágenoincluem a pele e ossos de animais, tais como de peixe, avícula, porcos ougado. Geralmente, há dois tipos principais de gelatina derivada de colágeno,Tipo A e Tipo B que diferem-se em seu método de fabricação. Em uma mo-dalidade, o material de partida de gelatina é gelatina Tipo A. Tipo A, com umponto isoiônico de 7 a 10,0, é derivado de colágeno com pré-tratamento ex-clusivamente ácido por métodos geralmente conhecidos na técnica. Em umamodalidade alternativa, o material de partida de gelatina é gelatina Tipo B.Tipo B, com um ponto de isoiônico de 4,8 a 5,8, é o resultado de um pré-tratamento alcalino de colágeno e é produzido por métodos geralmente co-nhecidos na técnica.Em outra modalidade alternativa, o material de partida de gelati-na é uma mistura de Tipo A e Tipo B. As quantidades respectivas de gelatinaTipo A e Tipo B podem ser grandemente variadas sem efeito prejudicial so-bre as propriedades do hidrolisado de gelatina produzido.

Em princípio, qualquer um dentre gelatina Tipo A e Tipo B podeser trocado completamente ou parcialmente por gelatina enzimaticamenteproduzida. Porém, o processo enzimático para fabricar gelatina não foi até omomento amplamente empregado.

Independente da modalidade, o material de partida de gelatinaconterá normalmente de cerca de 80% a cerca de 90% em peso da proteína,de cerca de 0,1% a cerca de 2% em peso de sais minerais (correspondendoao teor de cinza) e de cerca de 10% a 15% em peso de água.

É da mesma forma considerado que as propriedades físicas domaterial de partida de gelatina pode e variará, dependendo do uso pretendi-do do hidrolisado de gelatina. O material de partida de gelatina terá um pesomolecular médio tipicamente de cerca de 50.000 Da a cerca de 200.000 Da.Em uma modalidade particularmente preferida, o material de partida de gela-tina terá um peso molecular médio menor que cerca de 150.000 Da.

Em uma modalidade, a resistência da força do material de parti-da de gelatina será de cerca de 50 a cerca de 300, o pH será de cerca de3,8 a cerca de 7,5, o ponto isoelétrico será de cerca de 4,7 a cerca de 9,0, aviscosidade será de cerca de 15 a cerca de 75 mP e a cinza será de cercade 0,1 a cerca de 2,0%.

Em uma modalidade alternativa quando o material de partida degelatina é substancialmente gelatina Tipo A, a resistência da força será decerca de 50 a cerca de 300, o pH será de cerca de 3,8 a cerca de 5,5, o pon-to isoelétrico será de cerca de 7,0 a cerca de 9,0, a viscosidade será de cer-ca de 15 a cerca de 75 mP e a cinza será de cerca de 0,1 a cerca de 2,0%.

Em uma modalidade alternativa quando o material de partida degelatina é substancialmente gelatina Tipo B, a resistência de força será decerca de 50 a cerca de 300, o pH será de cerca de 5,0 a cerca de 7,5, o pon-to isoelétrico será de cerca de 4,7 a cerca de 5,4, a viscosidade será de cer-ca de 20 a cerca de 75 mP e a cinza será de cerca de 0,5 a cerca de 2,0%.

Em uma modalidade preferida onde o hidrolisado de gelatina éempregado na fabricação de produtos farmacêuticos de cápsula dura, o ma-terial de partida de gelatina terá uma resistência de força de cerca de 200 acerca de 300, uma viscosidade de cerca de 40 a cerca de 60 mP e um pH decerca de 4,5 a cerca de 6,5. Em ainda outra modalidade preferida onde ohidrolisado de gelatina é empregado na fabricação de produtos farmacêuti-cos de cápsula de casca macia, o material de partida de gelatina terá umaresistência de força de cerca de 125 a cerca de 200, uma viscosidade decerca de 25 a cerca de 45 mP e um pH de cerca de 4,5 a cerca de 6,5.

No processo da invenção, o material de partida de gelatina étipicamente misturado ou dissolvido em água por um processo conhecidocomo dilatação para formar uma solução que compreende cerca de 10% acerca de 60% de gelatina em peso. Em uma modalidade preferida, a soluçãotem de cerca de 10% a cerca de 50% de gelatina em peso.

Em uma outra modalidade adicional, a solução tem de cerca de20% a cerca de 50% de gelatina em peso. Em ainda um modalidade maispreferida, a solução tem de cerca de 35% a cerca de 40% de gelatina empeso.

É considerado que gelatinas que têm tamanhos de partícula va-riados podem ser utilizadas na invenção como material de partida. Por e-xemplo, o tamanho de partícula da gelatina pode variar de cerca de 0,1 mma cerca de 10 mm. O tamanho de partícula de gelatina pode ser superiortendo um tamanho de partícula médio de cerca de 0,1 a cerca de 0,3 mm.

Em outra modalidade, o tamanho de partícula da gelatina pode ser médiotendo um tamanho de partícula médio de cerca de 0,3 a cerca de 0,8 mm.Em ainda outra modalidade, o tamanho de partícula de gelatina pode sergrande tendo um tamanho de partícula médio de aproximadamente maiorque cerca de 0,8 mm. Em geral, o tamanho de partícula do material de parti-da de gelatina incidirá a quantidade de tempo necessária para gelatina dis-solver na solução. Durante o processo de dilatação, a capacidade da gelati-na absorver até dez vezes seu peso em água fria é utilizada. Gelatinas quetêm uma tamanho de partícula superior dilatam dentro de alguns minutos,gelatinas que têm um tamanho de partícula médio dilatam dentro de cercade 8 a cerca de 12 minutos, e gelatinas que têm um tamanho de partículagrande dilatam dentro de cerca de uma hora. Tipicamente, soluções de gela-tina concentradas baixas, soluções que têm por exemplo, de cerca de 10% acerca de 20% em peso de gelatina, podem ser preparadas empregando to-dos os tamanhos de partícula. Para soluções altamente concentradas, solu-ções que têm, por exemplo, de cerca de 30% a cerca de 35% de gelatina empeso, partículas grossas são tipicamente empregadas porque elas tendem anão agregar-se e produzir menos bolhas de ar ao ser processadas.

Depois que a gelatina foi trazida na solução através do processode dilatação e tipicamente antes da adição das enzimas proteolíticas, o pH,temperatura e Estado de Oxirredução da solução é tipicamente ajustada pa-ra tomar cuidado de quantidades menores de peróxido residual presente nagelatina de seu processo de fabricação para otimizar a reação de hidrólise, eem particular, garantir que as enzimas proteolíticas contendo cisteína utiliza-das na reação de hidrólise funcionam próximo do seu nível de atividade ide-al. O pH da solução de gelatina é ajustado e mantido de cerca de 5 a cercade 7. Em uma modalidade particularmente preferida, o pH da solução degelatina é ajustado e mantido de cerca de 6,0 a cerca de 6,5. Neste pH, asenzimas proteolíticas detalhadas abaixo estão próximas do seu nível de ati-vidade ideal. O pH da solução de gelatina pode ser ajustado e monitorado deacordo com métodos geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, paradiminuir o pH da solução de gelatina um ácido, tal como ácido clorídrico, étipicamente adicionado. Alternativamente, para aumentar o pH da solução degelatina uma base, tal como hidróxido de sódio, é tipicamente adicionada. Atemperatura da solução de gelatina é ajustada preferivelmente e mantida decerca de 40°C a cerca de 65°C durante a reação de hidrólise de acordo commétodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade particularmente prefe-rida, a temperatura da solução de gelatina é ajustada e mantida de cerca de50°C a cerca de 60°C durante a reação de hidrólise. Em geral, temperaturasacima desta faixa podem desativar enzimas proteolíticas, enquanto tempera-turas abaixo desta faixa tendem a reduzir a atividade das enzimas proteolíti-cas. Dependendo da enzima proteolítica empregada na reação de hidrólise,o Estado de Oxirredução da solução de gelatina tipicamente deveria ser a-justado e mantido ligeiramente como neutro no lado redutor. Níveis altos deoxidantes tendem a inativar algumas das enzimas proteolíticas contendocisteína empregada na reação de hidrólise, enquanto baixos níveis de redu-tores podem servir para manter algumas das enzimas proteolíticas, tal comopapaína, ativas até que elas sejam desativadas.

Em geral, a reação de hidrólise é conduzida adicionando-se en-zimas proteolíticas à solução de gelatina. Várias enzimas proteolíticas sãoadequadas para uso no processo da invenção. Em uma modalidade preferi-da, as enzimas proteolíticas serão enzimas de grau alimentício que têm ati-vidade de endopeptidase ou exopeptidase em um pH de cerca de 5 a cercade 7 e em uma temperatura de cerca de 40°C a cerca de 65°C. Em umamodalidade particularmente preferida, as enzimas proteolíticas serão enzi-mas de grau alimentício que têm atividade de exopeptidase ou endopeptida-se em um pH de cerca de 6 a cerca de 6,5 e em uma temperatura de cercade 50°C a cerca de 60°C.

Em uma modalidade, a endopeptidase será uma serina protei-nase de grau alimentício que pertence a EC 3.4.21. Em uma alternativa des-ta modalidade, a serina proteinase é uma quimiotripsina proteinase. Em umaoutra alternativa desta modalidade, a serina proteinase é uma subtilisina pro-teinase. Em outra modalidade, a endopeptidase será uma cisteína proteina-se de grau alimentício que pertence a EC 3.4.22. Em ainda outra modalida-de, a endopeptidase será um aspártico proteinase de grau alimentício quepertence a EC 3.4.23. Em uma outra modalidade, o endopeptidase será umametaloproteinase de grau alimentício que pertencem a EC 3.4.24. Exemplosnão Iimitantes exemplares de endopeptidases de grau alimentício que po-dem ser utilizados no processo da invenção incluem Validase® AFP, Valida-se® FP 500, Concentrado de Protease Alcalina, Validase® TSP, Concentra-do de Bromelaína Enzeco®, Corolase® 7089, Papain 600L e Concentradode Papaína Livre de Sulfito Validase®.Em uma outra modalidade, a exopeptidase será um amino pep-tidase de grau alimentício que pertence a EC 3.4.11. Em outra modalidade, aexopeptidase será uma dipeptidase de grau alimentício que pertencem a EC3.4.13. Em ainda outra modalidade, a exopeptidase será uma peptidildi outripeptidase de grau alimentício que pertencem a EC 3.4.14. Em ainda outramodalidade, a exopeptidase será uma peptidildipeptidase de grau alimentícioque pertencem a EC 3.4.15. Em uma outra modalidade, a exopeptidase seráuma carbóxi peptidase tipo serina de grau alimentício que pertence a EC3.4.16. Em ainda outra modalidade, a exopeptidase será uma metalo carbóxipeptidase de grau alimentício que pertence a EC 3.4.17. Em uma outra mo-dalidade, a exopeptidase será uma carbóxi peptidase tipo cisteína de graualimentício que pertence a EC 3.4.18. Em ainda uma outra modalidade, aexopeptidase será uma omega peptidase de grau alimentício que pertence aEC 3.4.19. Um exemplo exemplar de uma exopeptidase de grau alimentícioque pode ser utilizada no processo da invenção inclui Validase® FP Il ouCorolase LAP®.

Outro exemplo de uma enzima hidrolítica de grau alimentício quepode ser empregada no processo da invenção é Concentrado de Validase®FP. Exemplos de outras enzimas de grau alimentício proteolíticas adequa-das são mostradas na Tabela A.

Tabela A

<table>table see original document page 12</column></row><table>Tabela A continuação

<table>table see original document page 13</column></row><table>

Tipicamente, combinações de endopeptidases e exopeptidasesserão empregadas para catalisar a reação de hidrólise. As enzimas proteolí-ticas são selecionadas preferivelmente considerando-se a atividade de pro-tease das enzimas e selecionando-se as enzimas que maximizarão a cliva-gem de ligações de peptídeo no material de partida de gelatina. Em umamodalidade preferida, enzimas com atividade de endopeptidase preferencialsão adicionadas à solução de gelatina primeiro para formar um produto degelatina digerido por endopeptidase. O produto de gelatina digerido por en-dopeptidase é em seguida contatado com enzimas que têm atividade de e-xopeptidase preferencial sem desativar a(s) endopeptidase(s). É da mesmaforma considerado que em certas modalidades enzimas tendo atividade deexopeptidase podem ser adicionadas antes ou ao mesmo tempo que as en-zimas que têm atividade de endopeptidase.

Em uma modalidade preferida, a endopeptidase é selecionada apartir do grupo que consiste em Corolase® 7089, Validase® AFP, Validase®FP 500, Concentrado de Protease Alcalina, Validase® TSP, Concentrado deBromelaína Enzeco®, Papain 6000L e Concentrado de Papaína Livre deSulfito Validase®; e a exopeptidase é Validase® FP Il ou Corolase® LAP.Em ainda outra modalidade, a endopeptidase é selecionada a partir do grupoque consiste em Corolase® 7089, Concentrado de Bromelaína Enzeco®, ePapain 6000L; e a exopeptidase é selecionada a partir do grupo que consis-te em Validase® FPII e Corolase® PAL. Em uma modalidade preferida, cadaenzima proteolítica é consecutivamente adicionada ao material de partida degelatina na seguinte ordem: Corolase® 7089, Concentrado de BromelaínaEnzeco®, Papain 6000L, Validase® FPII e Corolase® LAP. Em uma alterna-tiva desta modalidade, cada enzima proteolítica digere o material de partidade gelatina durante aproximadamente cerca de 0,5 a cerca de 2 horas antesda adição da enzima proteolítica subseqüente.

A quantidade de enzima proteolítica adicionada à reação de hi-drólise pode e variará, dependendo do grau desejado de hidrólise de gelati-na e da duração da reação de hidrólise. Em geral, cerca de 0,025% a cercade 0,15% (p/p) da enzima proteolítica que tem atividade de endopeptidase éadicionado e de cerca de 0,025% a cerca de 0,15% (p/p) da enzima proteolí-tica que tem atividade de exopeptidase é adicionado para uma reação dehidrólise permanecendo por uma duração de cerca de 5 horas a cerca de 24horas. Em uma modalidade preferida, cerca de 0,05% a cerca de 0,15%(p/p) de Corolase® 7089, cerca de 0,025% a cerca de 0,075% (p/p) de Con-centrado de Bromelaína Enzeco®, cerca de 0,05% a cerca de 0,15% (p/p)de Papain 6000L, cerca de 0,025% a cerca de 0,075% (p/p) de Validase®FPII, e cerca de 0,05% a cerca de 0,15% (p/p) de Corolase® LAP são adi-cionados ao material de partida de gelatina.

A reação de hidrólise procederá tipicamente durante até cercaaproximadamente 24 horas. Tipicamente, depois de cerca de 24 horas aqualidade do hidrolisado de gelatina, em termos de cor e odor, começará adiminuir notoriamente. Em outra modalidade, a reação de hidrólise procede-rá de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas. Em ainda outra modalidade, areação de hidrólise procederá de cerca de 3 horas a cerca de 15 horas. Emainda uma modalidade mais preferida, a reação de hidrólise procederá decerca de 5 horas a cerca de 12 horas. Dentro deste período de tempo, con-dições de processo altamente econômicas e qualidade constante do hidroli-sado de gelatina são facilmente realizáveis. Para terminar a reação de hidró-lise, a solução de gelatina hidrolisada pode ser aquecida em aproximada-mente 90-C para desativar as enzimas proteolíticas. Uma etapa adicionalpara desativar a cisteína proteases pode ser requerida. Se desse modo re-querido, a adição de peróxido de hidrogênio ou outro agente oxidando podeser adicionada, geralmente não excede 1000 ppm. O hidrolisado de gelatinapode em seguida ser purificado a partir da solução de hidrólise por qualquermeio geralmente conhecido na técnica, por exemplo, microfiltração.

Tipicamente, o grau de hidrólise (DH) do material de gelatina departida no processo da invenção é maior que cerca de 13%. Em certas mo-dalidades, o DH é de cerca de 10% a cerca de 20%. Em outras modalida-des, o DH é de cerca de 20% a cerca de 30%. Em outra modalidade, o DH éde cerca de 30% a cerca de 40%. Em ainda outra modalidade, o DH é decerca de 40% a cerca de 50%. Em ainda outra modalidade, o DH é de cercade 50% a cerca de 60%. Em uma outra modalidade, o DH é de cerca de60% a cerca de 70%. Em ainda uma outra modalidade adicional, o DH é decerca de 70% a cerca de 80%. Em ainda outra modalidade, o DH é de cercade 80% a cerca de 90%. Em ainda outra modalidade, o DH é maior que cer-ca de 90%. O DH é a porcentagem do número total de ligações de peptídeono material de partida de gelatina que foi hidrolisado por enzimas proteolíti-cas. O DH pode ser calculado por métodos geralmente conhecidos na técni-ca, tal como de acordo com o método de Adler-Nissen (19).

Foi observado que hidrolisados de gelatina com um peso mole-cular médio mais baixo são mais eficazes na prevenção do processo de reti-culação. Como uma conseqüência, a quantidade de hidrolisado na formula-ção de gelatina pode ser reduzida a qual otimiza os custos.

II. Hidrolisado de Gelatina

Ainda outro aspecto da invenção abrange um hidrolisado de ge-latina feito pelo processo da invenção. Em geral, o hidrolisado de gelatina,comparado ao material de partida de gelatina, compreenderá uma misturade peptídeo de comprimentos diferentes que têm um aumento nas quantida-des de glicina livre, outros aminoácidos, e peptídeos pequenos. O hidrolisa-do de gelatina da mesma forma terá um peso molecular médio mais baixo eteor de amina primária mais alto comparado ao material de partida de gelatina.

O hidrolisado de gelatina terá tipicamente um peso molecularmédio de pelo menos cerca de 100 Da. Em outras modalidades, o hidrolisa-do de gelatina terá tipicamente um peso molecular médio que não excedecerca de 2000 Da. Em algumas modalidades, o hidrolisado de gelatina teráum peso molecular médio de cerca de 100 Da a cerca de 2.000 Da. Em ou-tras modalidades, o hidrolisado de gelatina terá um peso molecular médio decerca de 700 Da a cerca de 1800 Da. Em outra modalidade, o hidrolisado degelatina terá um peso molecular médio de cerca de 700 Da a cerca de 1500Da. Em ainda outras modalidades, o hidrolisado de gelatina terá um pesomolecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 1200 Da.

O peso molecular médio é o peso de um hidrolisado de gelatinacomo medido por espectrometria de massa de cromatografia líquida de ioni-zação por eletrovaporização (ESI-LC/MS). Por exemplo, um hidrolisado degelatina que têm um peso molecular médio de cerca de 1200 Da pode teruma faixa de peso molecular de cerca de 75 Da a 8000 Da.

Em geral, o hidrolisado de gelatina terá um teor de amina primá-ria médio não menor que cerca de 1,0 χ 10"3 μΜοΙ de amina primária por μg dehidrolisado de gelatina. Em outra modalidade, o hidrolisado de gelatina terá umteor de amina primária médio não menor que cerca de 1,5 χ 10"3 μΜοΙ de aminaprimária por μg de hidrolisado de gelatina. Em ainda outra modalidade, o hidro-lisado de gelatina terá um teor de amina primária médio não menor que cer-ca de 2,0 χ 10"3 μΜοΙ de amina primária por μg de hidrolisado de gelatina.Em uma modalidade adicional, o hidrolisado de gelatina terá um teor de a-mina primária médio de cerca de 1,0 χ 10"3 a cerca de 1,0 χ 10"2 μΜοΙ de a-mina primária por μς de hidrolisado de gelatina. O teor de amina primária dohidrolisado de gelatina é medido por derivatização e absorção de UV subse-qüente (6-8) como ilustrado nos Exemplos.

O hidrolisado de gelatina da presente invenção compreende po-lipeptídeos tipicamente de até cerca de 75 aminoácidos no comprimento,preferivelmente até 50 aminoácidos no comprimento. Em uma modalidade, opolipeptídeo médio que compreende o hidrolisado de gelatina é de cerca de6 a cerca de 18 aminoácidos no comprimento. Em outra modalidade, o poli-peptídeo médio contido no hidrolisado de gelatina da presente invenção é decerca de 9 a cerca de 20 aminoácidos no comprimento. O comprimento deuma cadeia de polipeptídeo pode ser determinado indiretamente por croma-tografia de exclusão de tamanho/ cromatografia líquida de alto desempenho(SEC/HPLC).

Em uma modalidade, o hidrolisado de gelatina terá um peso mo-lecular médio de cerca de 100 Da a cerca de 2.000 Da, um teor de aminaprimária médio de cerca de 1,0 χ 10"3 a cerca de 1,0 χ 10"2 μΜοΙ de aminaprimária por μg de hidrolisado de gelatina, e um comprimento de polipeptí-deo médio de até cerca de 20 aminoácidos. Em ainda outra modalidade, ohidrolisado de gelatina terá um peso molecular médio de cerca de 700 Da acerca de 1500 Da, um teor de amina primária médio de cerca de 1,0 χ 10"3 acerca de 2,0 χ 10"3 μΜοΙ de amina primária por μg de hidrolisado de gelatina,e um comprimento de polipeptídeo médio de até cerca de 18 aminoácidos.

Em outra modalidade, o hidrolisado de gelatina terá um peso molecular mé-dio de cerca de 800 Da a cerca de 1200 Da, um teor de amina primária mé-dio de cerca de 1,0 χ 10"3 a cerca de 2,0 χ 10"3 μΜοΙ de amina primária porμg de hidrolisado de gelatina, e um comprimento de polipeptídeo médio decerca de 4 a cerca de 1 aminoácidos.

III. Composições de Gelatina

Outro aspecto da invenção abrange uma composição de gelatinaque compreende um hidrolisado de gelatina e gelatina de baixo peso mole-cular. Surpreendentemente, foi constatado que quando um hidrolisado degelatina de baixo peso molecular for misturado com gelatina de peso mole-cular mais alto, ele reduz a reticulação da gelatina e melhora as proprieda-des de dissolução aumentando-se as quantidades de glicina livre, outrosaminoácidos, e peptídeos pequenos no produto de gelatina misturado, comomostrado nos Exemplos.

Vários hidrolisados de gelatina diferentes são adequados parauso na composição de gelatina. Em uma modalidade, o hidrolisado de gela-tina será um hidrolisado enzimaticamente digerido. Por meio de exemplo nãolimitante, o hidrolisado de gelatina da presente invenção é produzido por umprocedimento de hidrólise enzimática, como detalhado acima. Em outra mo-dalidade, o hidrolisado de gelatina será um hidrolisado digerido por ácido.Por exemplo, hidrólise ácida pode ser administrada digerindo um material departida de gelatina com cerca de 6 N de ácido clorídrico durante cerca de 24horas em uma temperatura de reação de cerca de 110°C. Em ainda outramodalidade, o hidrolisado de gelatina será um hidrolisado digerido por base.Por meio de exemplo não limitante, hidrólise de base pode ser administradadigerindo um material de partida de gelatina com uma base forte, tal comohidróxido de sódio. Hidrólise de base e ácido resultará tipicamente em umhidrolisado que tem aminoácidos livre. Em cada modalidade (isto é, hidrólisede base, ácida e enzimática), materiais de partida de gelatina adequadossão detalhados na seção I acima, que delineiam propriedades estruturais efuncionais para materiais de partida de gelatina a ser empregados no pro-cesso da invenção.

Tipicamente, hidrolisados de gelatina terão um baixo peso mole-cular. Em uma modalidade, o peso molecular médio será de cerca de 400Da a cerca de 2000 Da. Em outra modalidade, o hidrolisado de gelatina teráum peso molecular médio de cerca de 700 Da a cerca de 1500 Da. Alémdisso, o hidrolisado de gelatina da mesma forma terá um teor de amina pri-mária médio que varia de cerca de 1,0 χ 10"3 a cerca de 1,0 χ 10"2 μΜοΙ deamina primária por μg de hidrolisado de gelatina.

Em outra modalidade, o teor de amina primária médio pode vari-ar de cerca de 1,0 χ 10"3 a cerca de 2,0 χ 10"3 μΜοΙ de amina primária por μςde hidrolisado de gelatina.

Em ainda outra modalidade, o teor de amina primária médio po-de variar de cerca de 2,0 χ 10"3 a cerca de 4,0 χ 10"3 μΜοΙ de amina primáriapor μς de hidrolisado de gelatina. Em ainda uma outra modalidade, o teor deamina primária médio pode variar de cerca de 4,0 χ 10"3 a cerca de 6,0 χ 10"3μΜοΙ de amina primária por μg de hidrolisado de gelatina. Em ainda umamodalidade adicional, o teor de amina primária médio pode variar de cercade 6,0 χ 10"3 a cerca de 1,0 χ 10"2 μΜοΙ de amina primária por μg de hidroli-sado de gelatina.

O hidrolisado de gelatina da mesma forma geralmente terá umcomprimento de cadeia de polipeptídeo médio de cerca de 4 a cerca de 50aminoácidos. Em uma modalidade, o polipeptídeo médio que compreende ohidrolisado de gelatina é até cerca de 30 aminoácidos no comprimento. Emoutra modalidade, o polipeptídeo médio que compreende o hidrolisado degelatina é de cerca de 9 a cerca de 20 aminoácidos no comprimento. O pesomolecular médio, teor de amina primária médio e comprimento de cadeia depolipeptídeo médio são determinados como detalhado na seção II.

Em uma modalidade preferida, o hidrolisado de gelatina empre-gado na composição será o hidrolisado da presente invenção como detalha-do na seção II. Exemplos de outros hidrolisados de gelatina exemplares quepodemk ser empregados na composição são delineados na Tabela B. Mistu-ras dos hidrolisados de gelatina anteriormente descritos podem da mesmaforma ser empregadas.

Tabela B

<table>table see original document page 19</column></row><table>Tabela B continuação

<table>table see original document page 20</column></row><table>

O hidrolisado de gelatina pode ser misturado com vários tipos degelatina que tem uma ampla faixa de propriedades físicas e funcionais. Aescolha de uma gelatina particular pode e variará, grandemente dependendodo uso planejado da composição de gelatina. Em geral, independente damodalidade ou uso planejado, a gelatina é derivada tipicamente de colágenoou tecido rico em colágeno disponível de várias matérias-primas adequadastal como da pele e ossos de animais. Em uma modalidade, a gelatina é gela-tina Tipo A. Em outra modalidade, a gelatina é gelatina Tipo B. Em aindaoutra modalidade, a gelatina é uma mistura de gelatina Tipo A e Tipo B. No-vamente, a gelatina preparada em um processo enzimático pode ser empre-gada para substituir gelatina Tipo A e/ou Tipo B.

A gelatina, independente da modalidade, conterá preferivelmen-te de cerca de 80% a cerca de 90% em peso de proteína, de cerca de 0,1%a cerca de 2% em peso de sais minerais (teor de cinza) e de cerca de 10% a15% em peso de água.

A gelatina tipicamente terá um peso molecular médio alto. Emuma modalidade, a gelatina terá um peso molecular médio maior que cercade 200.000 Da. Em outra modalidade, a gelatina terá um peso molecularmédio maior que cerca de 150.000 Da. Em ainda outra modalidade, a gelati-na terá um peso molecular médio de cerca de 100.000 Da a cerca de200.000 Da.

Em uma modalidade, a resistência de força da gelatina será decerca de 50 a cerca de 300, o pH será de cerca de 3,8 a cerca de 7,5, o pon-to isoelétrico será de cerca de 4,7 a cerca de 9,0, a viscosidade será de cer-ca de 15 a cerca de 75 mP e a cinza será de cerca de 0,1 a cerca de 2,0%.

Em uma modalidade alternativa quando a gelatina for substanci-almente gelatina Tipo A, a resistência de força será de cerca de 50 a cercade 300, o pH será de cerca de 3,8 a cerca de 5,5, o ponto isoelétrico será decerca de 7,0 a cerca de 10,0, a viscosidade será de cerca de 15 a cerca de75 mP e a cinza será de cerca de 0,1 a cerca de 2,0%.

Em uma modalidade alternativa quando a gelatina for substanci-almente gelatina Tipo B, a resistência de força será de cerca de 50 a cercade 300, o pH será de cerca de 5,0 a cerca de 7,5, o ponto isoelétrico será decerca de 4,8 a cerca de 5,8, a viscosidade será de cerca de 20 a cerca de 75mP e a cinza será de cerca de 0,5 a cerca de 2,0%.

Em uma modalidade alternativa quando a composição de gelati-na é empregada na fabricação de produtos farmacêuticos de cápsula dura, agelatina terá uma resistência de força de cerca de 200 a cerca de 300, umaviscosidade cerca de 40 a cerca de 60 mP e um pH de cerca de 4,5 a cercade 6,5.

Em ainda outra modalidade preferida onde a composição de ge-latina é empregada na fabricação de produtos farmacêuticos de cápsula decasca macia, a gelatina terá uma resistência de força de cerca de 125 a cer-ca de 200, uma viscosidade de cerca de 25 a cerca de 45 mP e um pH decerca de 4,5 a cerca de 6,5.

A composição de gelatina da invenção geralmente compreende-rá de cerca de 1% a cerca de 20% em peso do hidrolisado de gelatina e decerca de 80% a cerca de 99% em peso da gelatina. Em outra modalidade, acomposição de gelatina compreenderá de cerca de 1% a cerca de 5% empeso do hidrolisado de gelatina e de cerca de 95% a cerca de 99% em pesoda gelatina. Em ainda outra modalidade, a composição de gelatina compre-enderá de cerca de 5% a cerca de 10% em peso do hidrolisado de gelatina ede cerca de 90% a cerca de 95% em peso da gelatina. Em outra modalida-de, a composição de gelatina compreenderá de cerca de 10% a cerca de15% em peso do hidrolisado de gelatina e de cerca de 85% a cerca de 90%em peso da gelatina. Em uma modalidade adicional, a composição de gela-tina compreenderá de cerca de 15% a cerca de 20% em peso do hidrolisadode gelatina e de cerca de 80% a cerca de 85% em peso da gelatina. Emuma modalidade típica, a composição de gelatina compreenderá uma rela-ção de hidrolisado de gelatina a gelatina de cerca de 1:4 a cerca de 1:99 (p/p)·

Em uma modalidade preferida, a composição de gelatina com-preenderá o hidrolisado de gelatina da presente invenção e uma gelatina degrau farmacêutico de peso molecular mais alto. Em uma modalidade, acomposição de gelatina compreenderá de cerca de 5% a cerca de 10% empeso do hidrolisado de gelatina e de cerca de 90% a cerca de 95% em pesoda gelatina de grau farmacêutica. Em outra modalidade, a composição degelatina compreenderá de cerca de 10% a cerca de 15% em peso do hidroli-sado de gelatina e de cerca de 85% a cerca de 90% em peso da gelatina degrau farmacêutica.

Vantajosamente, composições de gelatina da presente invençãoe desta modalidade tipicamente têm reduzido a reticulação quando medidapelo teste de endurecimento do vórtice e teste de viscosidade. Composiçõesde gelatina desta modalidade têm tipicamente um tempo de endurecimentodo vórtice de cerca de 200 a cerca de 300 segundos. Em outra modalidade,o tempo de endurecimento do vórtice é maior que cerca de 300 segundos. Oprocedimento para determinar o tempo de endurecimento do vórtice é des-crito nos Exemplos. Composições de gelatina desta modalidade tipicamenteda mesma forma têm uma viscosidade inicial média de cerca de 10 a cercade 15 cP e depois da adição de menos que cerca de 0,5% em peso de [2-(4-dimetil-carbamoil-piridino)-etano-1-sulfonato ((OB1207® de H.W. SandsCorporation) à composição de gelatina durante cerca de duas horas em umatemperatura de reação de cerca de 60°C, a composição de gelatina tem umaviscosidade média de cerca de 15 a cerca de 50 cP. O procedimento paramedir a viscosidade é descrito nos exemplos.

Em uma modalidade, glicina como um composto separado podeser adicionada à composição de gelatina da invenção. A glicina pode seradicionada à composição de gelatina em uma quantidade de cerca de 0,5%a cerca de 5% em peso. Em mais uma modalidade típica, a quantidade deglicina será de cerca de 1,5% a cerca de 2,5% em peso. Em ainda outramodalidade, ácido cítrico pode ser adicionado à composição de gelatina. Oácido cítrico pode ser adicionado em uma quantidade de cerca de 0,5% acerca de 5% em peso. Em mais uma modalidade típica, ácido cítrico é adi-cionado à composição de gelatina em uma quantidade de cerca de 0,5% acerca de 1,5%.

A composição de gelatina da invenção pode ser empregada emvárias aplicações incluindo como um ingrediente alimentício, como um in-grediente cosmético e como um ingrediente fotográfico. Por causa da ten-dência reduzida da composição de gelatina reticular para e propriedades dedissolução melhoradas, em uma modalidade preferida, a composição de ge-latina é empregada na fabricação de produtos farmacêuticos.

Em uma modalidade preferida, a composição de gelatina é em-pregada na fabricação de cápsulas de gelatina dura. Como detalhado acima,quando a composição de gelatina é empregada na fabricação de produtosfarmacêuticos de cápsula dura, a gelatina terá uma resistência de força decerca de 200 a cerca de 300, uma viscosidade de cerca de 40 a cerca de60 mP e um pH de cerca de 4,5 a cerca de 6,5. Uma formulação de cápsuladura típica compreenderá aproximadamente 30% em peso da composiçãode gelatina da invenção, aproximadamente 65% em peso de água, cerca de5% em peso de uma tintura adequada, e conterá um pigmento quando ne-cessário. As cápsulas de gelatina dura podem ser feitas de acordo comqualquer método geralmente conhecido na técnica.

Em ainda outra modalidade preferida, a composição de gelatinaé empregada na fabricação de gelatina de cápsula macia. Como detalhadoacima, quando a composição de gelatina é empregada na fabricação deprodutos farmacêuticos de cápsula de casca macia, a gelatina terá uma re-sistência de força de cerca de 125 a cerca de 200, uma viscosidade de cercade 25 a cerca de 45 mP e um pH de cerca de 4,5 a cerca de 6,5. Uma for-mulação de gelatina de cápsula macia típica compreenderá de cerca de 40%a cerca de 45% em peso da composição de gelatina da invenção, de cercade 15% a cerca de 35% em peso de plasticizador e de cerca de 20% a cercade 45% em peso de água. As cápsulas de gelatina macias podem ser feitasde acordo com qualquer método geralmente conhecido na técnica. Exem-pios típicos para plasticizadores são glicerol (normalmente empregado naforma de uma solução aquosa com 85 % em peso) e sorbitol (normalmenteempregado na forma de uma solução aquosa com 70% em peso) e misturasdestes.

Todas as publicações, patentes, pedidos de patente e outrasreferências citadas neste pedido estão aqui incorporados por referência emsua totalidade como se cada publicação individual, patente, pedido de paten-te ou outra referência fosse especificamente e individualmente indicado paraser incorporado por referência.

DEFINIÇÕES

"Anfotérica" é uma substância que pode ser tanto catiônicaquanto aniônica no caráter, tal como uma proteína.

"Valor de Força" é o grau de firmeza de um gel medido em gra-mas. O valor de Força é a força requerida para uma punção de forma defini-da e dimensão para penetrar 4 mm de profundidade na superfície de uumasolução de gelatina com 6,7% em peso. O valor de Força das gelatinas co-mercialmente disponíveis está entre 80 e 280.

"Lasca de osso" é osso cortado, desengraxado e secado doqual, subseqüente à desmineralização (vide maceração), a gelatina é produzida.

"Reticulação" refere-se ao mecanismo pelo qual, por exemplo,uma película é formada sobre uma cápsula macia farmacêutica. Tipicamen-te, a reticulação diminui as propriedades de dissolução da cápsula.

"Da" é uma abreviação para dalton.

"EC" é uma abreviação para Classificação de Enzima. É tipica-mente empregada como um prefixo na designação numérica de uma enzima.

"Endopeptidase" é uma enzima tipicamente pertencente dentroda subclasse EC 3.4, peptídeo hidrolases, que hidrolisa ligações de peptídeonão terminais em oligopeptídeos ou polipeptídeos e que compreende quais-quer subclasses de enzima EC 3.4.21-99.

"Exopeptidase" é uma enzima de um grupo de peptídeo hidrola-ses dentro da subclasse EC 3.4 que catalisa a hidrólise de ligações de pep-tídeo adjacentes ao grupo de carboxila ou amina terminal de um oligopeptí-deo ou polipeptídeo. O grupo tipicamente abrange subclasses de enzima3.4.11-3.4.19.

"Enzima de Grau Alimentício" é uma enzima que está tipicamen-te livre de organismos geneticamente modificados e está segura quandoconsumida por um organismo, tal como um ser humano. Tipicamente, a en-zima e o produto do qual a enzima pode ser derivada são produzidos de a-cordo com as diretrizes de FDA aplicáveis.

"Cápsulas duras" são cápsulas ocas de vários tamanhos feitasde gelatina pura com ou sem a adição de tintura. Elas compreendem umaparte superior e inferior; estas são unidas juntamente logo que o preenchi-mento é concluído.

"Gelatina instantânea" é gelatina em pó capaz de dilatar em á-guafria.

"Microgel" é considerado ser gelatina com um peso molecularmaior que 300.000 Da.

"Escleroproteínas" são aquelas proteínas que fornecem umafunção de apoio dentro do corpo. Elas são insolúveis em água e possuemuma estrutura fibrosa. Estas proteínas incluem, por exemplo, queratina queocorre no cabelo e unhas, as elastinas e os colágenos que ocorrem no teci-do conjuntivo e de apoio, pele, osso e cartilagem.

"Cápsulas macias" são cápsulas elásticas feitas de gelatina parapreencher com mistura de ingrediente ativo/excipiente. Elas podem ser pro-duzidas com espessura de parede diferente e com ou sem uma costura.

"Divisão" é uma matéria-prima de gelatina; meia-camada do te-cido conjuntivo da pele do gado.

"Hélice tripla" é uma estrutura básica de colágeno que consisteem 3 cadeias de proteína. Estes possuem freqüentemente seqüências deaminoácido um pouco diferentes.

"Gelatina tipo A" é gelatina digerida por ácido.

"Gelatina tipo B" é gelatina digerida por álcali (básico).

"Tipo LBSH" é um hidrolisado de osso com oxido de cálcio dapresente invenção produzido por digestão proteolítica de gelatina.

"Tipo LHSH" é um hidrolisado de pele com oxido de cálcio dapresente invenção produzido por digestão proteolítica de gelatina.

Visto que várias mudanças podem ser feitas nos compostos an-teriores, produtos e métodos sem afastarem-se do escopo extensão da in-venção, é pretendido que toda matéria contida na descrição anterior e nosexemplos dados abaixo, seja interpretada como ilustrativa e não em um sen-tido limitante.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes ilustram a invenção.

Exemplo 1

O hidrolisado de gelatina da invenção pode ser feito de acordocom o seguinte processo. Uma solução que contém 34% em peso de gelati-na (gelatina de osso com oxido de cálcio Tipo B, Força = 100) foi feita adi-cionando-se 1,94 kg de água para 1,0 kg de gelatina processada desioniza-da. A gelatina foi deixada hidratar durante 1 hora e em seguida colocada emum banho de água a 55°C para dissolver. Logo que completamente dissolvi-da, o pH da solução de gelatina foi ajustado para 6,0-6,5 com hidróxido desódio aquoso. Cloreto de cálcio foi adicionado à solução de gelatina naquantidade de 0,037% em p/p com a quantidade de gelatina na solução(CDG - Gelatina Seca Comercial (tendo um teor de umidade de cerca de10% em peso), todas as adições neste procedimento foram baseadas nestaquantidade). Uma alíquota foi tirada e foi diluída em 5% em peso para testaro Estado de Oxirredução da solução. Tiras de teste de peróxido (EM Scien-ce) foram empregadas para medir rapidamente a quantidade de peróxido.Se o peróxido estiver presente, Fermcolase® 1000F (Genencor InternationalInc.) é adicionado em incrementos de 0,5 ml. Depois de cada adição, a solu-ção foi deixada reagir durante 30 minutos antes de repetir a medida de peró-xido. Adições de Fermcolase® 1000F foram repetidas até o nível de peróxi-do aproximar-se de zero.

Corolase® 7089 (AB Enzymes) foi adicionado à solução naquantidade de 0,1% em p/p. Próximo do final do tempo de reação de 1 horae antes da adição da próxima enzima, uma amostra pequena foi tirada e opeso molecular foi analisado. Este processo foi repetido para cada dentre asadições de enzima. Depois de um tempo de reação de 1 hora, 0,05% em p/pde Concentrado de Bromelaína Enzeco® (Enzyme Development Corp.) foiadicionado e a solução foi deixada reagir durante mais uma hora. Papain6000L líquida (Valley Research) foi em seguida adicionado 0,1% em p/p.Depois de 1 hora, 0,05% em p/p de Validase® FPII (Valley Research) foiadicionado à solução e foi reagido durante mais hora. A adição da enzimafinal foi 0,1% em p/p de Corolase® LAP (AB Enzymes). Depois de 1 hora, asolução foi aquecida a 90°C para desativar as enzimas funcionais restantes.

Em alguns exemplos, um adicional de 30-40 ppm de peróxido de hidrogêniofoi adicionado para assegurar-se de que a Papain 6000L foi desativada. Ne-nhuma prova da atividade enzimática depois da desativação de calor foi vis-ta. Um sumário que alista os detalhes das cinco enzimas empregadas duran-te a hidrólise é dado na Tabela 1.<table>table see original document page 28</column></row><table>O hidrolisado de gelatina obtido neste exemplo foi empregadocomo hidrolisado Tipo LHSH nos exemplos seguintes. O peso molecularmédio foi determinado para ser cerca de 1500 Da.

Exemplo 2

O seguinte procedimento foi empregado para quantificar o graude redução na reticulação para várias composições de gelatina. Nas experi-ências de controle, 10,0 ± 0,1 g de uma gelatina foi adicionado a um béquerde 250 ml, ao qual foi adicionado 90,0 + 0,5 g de água desionizada. Um vi-dro de relógio foi colocado no béquer e a gelatina foi permitida dilatar duran-te 30 - 60 minutos. A gelatina dilatada foi colocada em um banho de água a60 ± 0,10C durante 15-30 minutos ou até que toda a gelatina fosse dissolvi-da. Uma barra de agitação magnética foi colocada na solução de gelatina eo pH foi ajustado em uma placa de agitação com NaOH ou H2SO4 diluído emum pH de 7,00 ± 0,05 depois do qual a barra de agitação magnética foi re-movida. A solução foi colocada em um banho de água a 40 ± 0,10C durante15-60 minutos para resfriar. Um motor de agitação digital (Heidolph Brink-man 2102) equipado com um misturador de 4 lâminas foi empregado paracriar o vórtice em 750 ± 10 RPM. Imediatamente, 20 ± 0,5 ml de uma solu-ção de formalina a 10% tamponada por fostato de pH 7 (Fisher Scientific)foram adicionados. O tempo de endurecimento do vórtice foi registrado (emsegundos) no momento quando a solução de gelatina reticuiada desmoro-nou-se no eixo do misturador de 4 lâminas.

Em experiências que envolvem composições de gelatina quecontêm aditivos, uma porcentagem da gelatina foi substituída com o aditivodesejado (por exemplo, uma amostra adicionada ao hidrolisado a 10% conti-nha 9,0 g de gelatina e 1,0 g de hidrolisado). As gelatinas que exibem umtempo de endurecimento de vórtice mais longo são acreditadas ter tendên-cias reduzidas para reticulação induzida por formaideído.

Como mostrado na Tabela 2, o teste de endurecimento do vórti-ce confirma os resultados anteriores que a combinação de glicina e ácidocítrico pode reduzir a quantidade de reticulação da gelatina. Mais importan-temente, a adição apenas de glicina tem um efeito dramático sobre o tempode endurecimento do vórtice desta amostra de gelatina de osso com óxidode cálcio particular. A adição de citrato não reduziu a reticulação.

Curiosamente, a adição de 1,5% de citrato promoveu a reticula-ção nesta amostra particular. Estes resultados podem servir para sustentar aposição do papel da glicina como um descontaminante de aldeído neste sis-tema modelo. Os efeitos prejudiciais sobre a reticulação experimentada poruma das amostras contendo apenas citrato não puderam ser facilmente ex-plicado.

O teste de endurecimento de vórtice é aqui empregado comouma ferramenta analítica para uma rápida avaliação do impacto de aditivospara o comportamento de reticulação de composições de gelatina.

Tabela 2

<table>table see original document page 30</column></row><table>

A figura 1 detalha os efeitos da adição do hidrolisado Tipo LH-SH1 um hidrolisado de gelatina de pele com óxido de cálcio obtido em umprocesso similar ao Exemplo 1 (PM -1200 Da), e um hidrolisado de gelatinaTipo BH-3 (PM ~ 2200 Da) em LH-1, uma gelatina de pele com óxido de cál-cio típica com força de 260 g e uma viscosidade de 6,67% 45 mP. O termoviscosidade de 6,67% é empregado como uma abreviação para uma visco-sidade observada com uma solução de CDG a 6,67% em água. Os resulta-dos mostram um aumento no tempo de endurecimento de vórtice para am-bos os hidrolisados adicionados. Entretanto, o desempenho foi melhor naadição do hidrolisado da presente invenção, Tipo LHSH. Várias gelatinas depele exibiram esta reticulação muito rápida do que foi previamente visto a-penas em gelatinas de osso com óxido de cálcio com uma viscosidade de6,67% próxima a 60 mP.A Tabela 3 mostra o tempo de endurecimento de vórtice de vá-rias gelatinas de pele com oxido de cálcio em relação a propriedades dife-rentes de peso molecular. Nenhuma tendência conclusiva poderia ser dedu-zida com as exceções de uma possível correlação de uma porcentagemaumentada de microgel e viscosidade com uma reticulação aumentada euma redução subseqüente no tempo de endurecimento do vórtice.<table>table see original document page 32</column></row><table>A Tabela 4 mostra os resultados da adição de 10% de hidrolisa-do Tipo LBSH do Exemplo 1 (PM médio = 1500), um hidrolisado de gelatinaTipo BB 4, e glicina em uma gelatina de osso com oxido de cálcio de altaviscosidade com uma força de 240 g e 6,67% de viscosidade de 64 mP. Esteextrato de alta viscosidade exibe propriedades de reticulação similares comoalgumas gelatinas de osso com oxido de cálcio com viscosidade muita maisbaixa. Esta gelatina mostrou uma redução significante em reticulação napresença de todos os três aditivos. Entretanto, o hidrolisado Tipo LBSH au-mentou o tempo de endurecimento do vórtice em quase 30% em compara-ção ao Tipo BB-4. Glicina mostrou a maior redução na reticulação e aumentosubseqüente no tempo de endurecimento do vórtice como mostrado na Tabela 4.

Tabela 4

<table>table see original document page 33</column></row><table>

A Tabela 5 mostra que os resultados de uma experiência ten-tando determinar a quantidade de hidrolisado de baixo peso molecular ne-cessitando igualar o desempenho de glicina quando adicionada a uma gela-tina farmacêutica de osso com oxido de cálcio de viscosidade média (Força= 244, 6,67% vis. = 47,0 mP) como medido pelo teste de endurecimento dev vórtice. Os resultados indicam que 4 - 5% do Tipo LBSH é necessário paraigualar o desempenho de 2,5% de glicina, enquanto 5 - 6% do Tipo BB-4 énecessário. Similarmente, 10% do Tipo LBSH e 11-12% do Tipo BB-4 é ne-cessário para igualar a redução na reticulação obtida por 5,0% de glicina.Tabela 5

Amostra Endurecimento do Vórtice Médio (seg.) Desvio Padrão RelativoControle de Osso com Oxido de Cálcio de Viscosidade Média 192,5 11,1% <table>table see original document page 34</column></row><table>

Exemplo 3

O agente de endurecimento de gelatina OB1207® [2-(4-Dimetilcarbamoil-piridino)-etano-1-sulfonato] foi adquirido a partir de H.W.Sands Corporation. OB1207® foi observado como uma substituição de for-maldeído em emulsões fotográficas. A reação 1 descreve a reticulação deOB1207® com gelatina. A formação de amida e ligações de éster entre ca-deias de gelatina através da reação com OB1207® pode rigorosamente imi-tar o tipo de reticulação visto em amostras de gelatina que foram envelheci-das e/ou realçadas devido à exposição a extremos de calor e umidade.

<formula>formula see original document page 34</formula>Reação 1

Em experiências de controle, 15,0 + 0,1 g de gelatina (gelatinade osso com oxido de cálcio Tipo B, Força = 200) foram adicionados em umfrasco de 250 ml. A isto, 95,0 + 0,5 g de água desionizada e uma barra deagitação magnética foram adicionados. A gelatina foi revestida com parape-lícula e permitida inchar durante 30 - 60 minutos. O frasco foi colocado emum banho de água a 60 + 1,0°C durante 15-20 minutos ou até que toda agelatina fosse dissolvida. A viscosidade desta solução foi medida empregan-do um Brookfield DV-III + Reômetro em 50 RPM e 60,0 + 0,1 °C. Uma solu-ção feita de 0,30 g de OB1207® dissolvida em 10,0 g de água desionizadafoi lentamente adicionada à gelatina no frasco enquanto agitando em umaplaca de agitação. O frasco foi colocado outra vez no banho de água. A vis-cosidade da solução foi medida 2 horas depois. Em experiências contendo aadição de hidrolisados, uma porcentagem da gelatina de controle foi substi-15 tuída com o hidrolisado desejado (isto é, uma amostra adicionada ao hidroli-sado a 10% continha 13,5 g de gelatina e 1,5 g de hidrolisado).

Os resultados de experiências de viscosidade envolvendo umaforça médio e gelatina de viscosidade (LB-1) depois da reticulação comOB1207® são determinados na Tabela 6. O controle A LB-1 não teve hidro-lisado ou OB1207® adicionado, visto que o controle B LB-1 não teve hidroli-sado, porém, foi reticulado com OB1207®. Depois de duas horas, o ControleB foi muito viscoso ao ler no reômetro de Brookfield indicando um grau muitoalto de reticulação. As amostras contendo hidrolisados mostraram um graudiminuído de reticulação, com os melhores resultados obtidos com Tipo LB-SH, o hidrolisado da presente invenção, especialmente no nível a 10%.

Tabela 6

<table>table see original document page 35</column></row><table>Tabela 6 continuação

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Exemplo 4

O seguinte procedimento foi empregado para determinar o teorde aminas primárias no hidrolisado de gelatina. O uso de ácido trinitroben-zenossulfônico (TNBS) para medir a quantidade de aminas primárias foidescrito por Alder-Nissen (6). Uma versão modificada deste procedimento foiempregada para medir as quantidades relativas de aminas primárias em hi-drolisados de gelatina. A Reação 2 descreve a derivatização de uma aminaprimária com TNBS.

<formula>formula see original document page 36</formula>

Reação 2

Glicina (Acros) na quantidade de 2,000 ± 0,002 g foi adicionadaa um béquer de 250 ml e trazida até um peso de 200,00 + 0,01 g empregan-do uma solução de dodecil sulfato de sódio a 1% ("SDS", Aldrich) (soluçãode glicina agora referida como G-1). Hidrolisados de gelatina na quantidadede 4,000 ± 0,002 g foram adicionados ao béquer de 250 ml e trazidos a umpeso de 100 + 0,01 g empregando uma solução a 1% de SDS (solução dehidrolisado agora referida como H-1). Os béqueres contendo as soluções deG-1 e H-1 foram colocados em uma chapa elétrica e aquecidos em umatemperatura de 80 - 85°C para dissolver completamente e dispersar os sóli-dos. As soluções foram resfriadas em temperatura ambiente e em seguida1,00 g de G-1 foi adicionado em um béquer de 250 ml e trazido a um pesode 200,00 ± 0,01 g empregando a solução de SDS a 1% (G-2). Diluições(padrões de G-3) de G-2 foram feitas em 50 ml de frascos volumétricos adi-cionando-se 50, 37,5, 25, 12,5, 5, e 0,5 ml de G-2, respectivamente. Os fras-cos foram trazidos até a marca empregando-se a solução de SDS a 1%. Asolução H-1 foi diluída para criar H-2 adicionando-se 1,00 g de H-1 e trazen-do até a um peso de 200,00 ± 0,01 g em um béquer de 250 ml empregandoa solução de SDS a 1%. Em um tubo de teste de 15 ml foi adicionado a 2 mlde um tampão de fosfato de 0,2125 M (feito adicionando-se de 0,2125 M deNaH2PO4 a 0,2125 M de Na2HPO4 até que um pH de 8,20 ± 0,02 seja obti-do), e 250 μΙ_ dos padrões G-3. Isto corresponde a um calibre de glicina depadrão seis contendo 0,1667, 0,1250, 0,0833, 0,0417, 0,0167, e 0,0017 μηιοίεde aminas primárias por amostra, respectivamente. Similarmente, 250 μΙ decada solução de H-2 foi adicionado a um tubo de teste de 15 ml (correspon-dendo a 50 μg de amostra) junto com 2 ml do tampão de fosfato. Uma amos-tra de controle é feita adicionando-se 250 μΙ da solução SDS a 1% em umtubo de teste de 15 ml com 2 ml de tampão. Uma solução de trinitrobenzenoa 0,1% foi feita adicionando-se 170 ± 2 μΙ de uma solução de TNBS de 1M(Sigma) em um frasco volumétrico de 50 ml e trazida até a marca com águadesionizada e imediatamente revestida com folha de alumínio quando TNBSfor sensível à luz.

As seguintes etapas foram todas administradas em um ambienteescuro fotográfico. Aos tubos de teste, 2 ml da solução de TNBS a 1% foramadicionados. Os tubos de teste foram em seguida vortexados (Fisher Scienti-fic Vortex Genie 2) durante 5 segundos. As amostras foram em seguida co-locadas em um banho de água a 50,0 ± 0,10C durante 30 minutos. As amos-tras foram, em seguida, vortexadas durante um adicional de 5 segundos ecolocadas outra vez no banho de água durante 30 minutos. As amostras fo-ram removidas do banho de água e 4 ml de solução de HCI a0,100 N foramadicionados para terminar a reação de TNBS. As soluções foram vortexadasdurante 5 segundos e permitidas resfriar durante 10 minutos (resfriamentomais longo pode levar a turvação por causa de SDS). A absorbância de cadaamostra foi lida em 340 nm (Espectrofotômetro Beckman DU-7) contra umacubeta com água de água. As quantidades de aminas primárias nas amos-tras foram calculadas empregando-se um cálculo de regressão linear combase em absorvência dos padrões de glicina.

A derivatização de aminas primárias com o-ftaldialdeído (OPA)para medir a proteólise em proteínas do leite foi descrita por Church e outros(7). Nielsen e outros (8) empregaram OPA para medir o grau de hidrólise emoutras proteínas de alimentação, incluindo aquele da gelatina. Uma vanta-gem do método de Nielsen é a substituição do ditiotreitol mais agradável aomeio ambiente (DTT - Reagente de Cleland) para β-mercaptoetanol como oagente de redução contendo enxofre. Este procedimento é adaptado a partirdo funcionamento de Nielson e outros. A reação 3 descreve a reação de a-minas primárias com OPA na presença de DTT.

<formula>formula see original document page 38</formula>

Reação 3

O reagente de OPA foi preparado adicionando-se 7,620 g dedecaidrato de tetraborato de sódio (Fisher Scientific) e 200 mg de SDS emum frasco volumétrico de 200 ml. Água desionizada na quantidade de apro-ximadamente 150 ml foi adicionada e a solução foi agitada até que comple-tamente dissolvida. OPA (AIdrich) na quantidade de 160 mg foi dissolvido em4 ml de etanol (Fisher Scientific) e quantitativamente transferida ao frascovolumétrico empregando água desionizada. DTT (AIdrich) na quantidade de176 mg foi adicionado e a solução total foi trazida até o volume com águadesionizada. Padrões de glicina foram criados adicionando-se 50 mg de gli-cina em um frasco volumétrico de 500 ml e preenchendo até marca de águade desionizada. Diluições foram feitas adicionando-se 100, 75, 50, 25, e 5 mlda solução de glicina em frascos volumétricos de 100 ml e preenchendo atéa marca com água desionizada criando padrões de glicina 5. Amostras dehidrolisado de gelatina foram preparadas adicionando-se 0,500 g de hidroli-sado em um frasco volumétrico de 100 ml e adicionando água desioniozadaà marca. A outro frasco volumétrico de 100 ml, 10 ml da solução de hidroli-sado foram adicionados e preenchidos até á marca de água desionizada.

Em um tubo de teste de 15 ml, 3,0 ml da solução de reagente de OPA foramadicionados seguido pelos 400 μΙ_ de um padrão de glicina (resultando em 40,30, 20, 10, e 2 μg de glicina) ou amostra de hidrolisado de gelatina (200 μg dehidrolisado). Uma amostra de controle empregando 400 μΙ_ de água foi damesma forma empregada para medir a absorvência apenas de OPA. A a-mostra foi vortexada durante 5 segundos. A absorvência foi lida exatamente2 minutos depois da adição da amostra contra um espaço vazio de água. Adivergência do requerimento de 2 minutos impacta significativamente a ab-sorvência. Cada amostra ou padrão foi, em seguida, testado em intervalosde dois minutos. As quantidades de aminas primárias nas amostras foramcalculadas empregando-se um cálculo de regressão linear com base na ab-sorvência dos padrões de glicina.

A Tabela 7 e a Tabela 8 mostram os resultados de TNBS e deri-vatização de OPA de aminas primárias em 6 hidrolisados de gelatina, umagelatina do primeiro extrato, um trímero de glicina, e um monômero de lisina.

O grau de hidrólise é relatado como a quantidade de aminas primárias divi-didas pelo número de aminas primárias na amostra hidrolisada de HCI (6Nde HCI durante 24 horas @ 110°C). Os pesos moleculares derivados deTNBS e OPA são o inverso da quantidade de aminas primárias por quanti-dade de amostra. Os pesos moleculares derivados de TNBS e OPA sãoconsiderados ser apenas qualitativos, a significação real sendo a quantidademedida de aminas primárias em cada dentre as amostras. Os pesos molecu-lares derivados de amina primária não levam em conta a derivatização duplade lisina e hidroxilisina, nem levam em conta o fato que as aminas secundá-rias não são derivadas por qualquer agente de derivatização. Entretanto, aoassumir que estes fatores são relativamente constantes para todos os hidro-lisados de gelatina, o peso molecular derivado de amina primária é um meioútil de comparar os graus relativos de hidrólise dentre tipos diferentes dehidrolisados de gelatina. Hidrolisados de pele com oxido de cálcio e de ossocom oxido de cálcio Tipo LBSH e Tipo LHSH, de acordo com a presente in-venção, mostraram um aumento médio de quase 30 - 130% nas aminas pri-márias sobre os hidrolisados enzimaticamente digeridos. O peso molecularmédio quando medido por metodologia de SEC/HPLC é da mesma formadeterminado. Nota-se que os pesos moleculares para Iisina e o trímero deglicina estão longe dos valores de peso molecular conhecidos. Os pesosmoleculares derivados de TNBS e OPA são da mesma forma muito similaresaos resultados esperados da amostra de gelatina hidrolisada por HCI, vistoque os dados de HPLC/SEC são quase 5 vezes esta quantidade. Isto geral-mente demonstra a inexatidão relativa da metodologia de SEC/HPLC de pe-so molecular baixo geralmente empregada para medir o peso molecular doshidrolisados de gelatina. Pesos moleculares derivados de TNBS e OPA nãosão considerados para gelatina. As complexidades da macromolécula degelatina inibem uma representação precisa do peso molecular empregandoeste modelo simplificado. A derivatização de OPA mostra-se ser um meiomuito mais seguro para medir o teor de amina primária em comparação àderivatização com TNBS.<table>table see original document page 41</column></row><table>Tabela 8

<table>table see original document page 42</column></row><table>

REFERÊNCIAS

Todas as referências citadas no texto anterior do pedido de pa-tente ou à seguinte lista de referência, na medida que elas fornecem proce-dimentos exemplares, ou outros detalhes suplementares àqueles menciona-dos aqui, são especificamente incorporadas por referência na mesma exten-são como se cada pedido de patente ou publicação individual fosse especifi-camente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

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Claims (40)

1. Processo para preparar um hidrolisado de gelatina, o hidroli-sado de gelatina tendo um peso molecular médio a partir de cerca de 100 acerca de 2000 Da e um teor de amina primária médio de cerca de 1,0 χ 10 3a cerca de 1,0 χ 10"2 μΜοΙ de amina primária por μg de hidrolisado de gelati-na, o processo compreendendo:(a) contatar um material de partida de gelatina com pelo me-nos uma enzima proteolítica tendo atividade de endopepti-dase para formar um produto de gelatina digerido por en-dopeptidase, e(b) contatar o produto de gelatina digerido por endopeptidasecom pelo menos uma enzima proteolítica tendo atividadede exopeptidase, em que as digestões proteolítica de en-dopeptidase e exopeptidase procedem por uma duraçãosuficiente de tempo e são conduzidas sob condições dereação para formar o hidrolisado de gelatina.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, em que as enzi-mas proteolíticas são enzimas de grau alimentício tendo atividade de endo-peptidase ou exopeptidase em um pH de cerca de 5 a cerca de 7 e a umatemperatura de cerca de 40°C a cerca de 65°C.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que asenzimas proteolíticas são selecionadas a partir do grupo consistindo em En-dopeptidase de Bacillus subtilis (por exemplo Corolase® 7089), Bromelaína(por exemplo, Concentrado de Bromelaína Enzeco®), Papaína (por exem-pio, Papain 6000L), Exopeptidase from Aspergillus oryzae (por exemplo, Va-lidase® FPII) e Exopeptidase de Aspergillus sojae (por exemplo, Corolase® LAP).

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, em que cerca de 0,025% a cerca de 0,15% (p/p) da enzima proteolíticatendo atividade de endopeptidase é contatado com o material de partida degelatina e cerca de 0,025% a cerca de 0,15% (p/p) da enzima proteolíticatendo atividade de exopeptidase é contatado com o produto de gelatinadigerido por endopeptidase.

5. Processo para preparar um hidrolisado de gelatina, o proces-so compreendendo:(a) contatar um material de partida de gelatina com uma sériede pelo menos três enzimas proteolíticas tendo atividadede endopeptidase para formar um produto de gelatina dige-rido por endopeptidase, as três enzimas proteolíticas con-sistindo em Endopeptidase de Bacillus subtilis (por exem-plo, Corolase® 7089), Bromelaína (por exemplo, Concen-trado de Bromelaína Enzeco®), e Papaína (por exemplo,Papain 6000L); e(b) contatar o produto de gelatina digerido por endopeptidasecom uma série de pelo menos duas enzimas proteolíticastendo atividade de exopeptidase, as duas enzimas proteolí-ticas consistindo em Exopeptidase de Aspergillus oryzae(por exemplo Validase® FPII) e Exopeptidase de Aspergil-Ius sojae (por exemplo, Corolase® LAP).

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, em que cada en-zima proteolítica é seqüencialmente adicionada ao material de partida degelatina na seguinte ordem:Endopeptidase de Bacillus subtilis (por exemplo, Corolase®7089), Bromelaína (por exemplo, Concentrado de Bromelaína Enzeco®),Papaína (por exemplo, Papain 6000L), Exopeptidase de Aspergillus oryzae(por exemplo, Validase® FPII) e Exopeptidase de Aspergillus sojae (por e-xemplo, Corolase® LAP); e em que cada enzima proteolítica digere o materi-al de partida de gelatina durante aproximadamente 0,5 a cerca de 2 horasantes da adição da enzima proteolítica subseqüente.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 6, em que a digestão proteolítica é permitida proceder durante cerca de 5 acerca de 12 horas.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 7, em que o material de partida de gelatina tem uma resistência de forçamenor do que cerca de 150 e uma viscosidade menor do que cerca de 30mP a aproximadamente 60°C e a uma concentração de gelatina de 6,67%em peso.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que uma solução aquosa contendo cerca de 10% a cerca de 50%(p/p) do material de partida de gelatina é contatado com as enzimas proteolíticas.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 9, em que material de partida de gelatina é uma gelatina de grau farmacêutico.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5a 10, em que cerca de 0,05% a cerca de 0,15% (p/p) de Corolase® 7089,cerca de 0,025% a cerca de 0,075% (p/p) de Concentrado de BromelaínaEnzeco®, cerca de 0,05% a cerca de 0,15% (p/p) de Papain 6000L, cerca de 0,025% a cerca de 0,075% (p/p) de Validase® FPII, e cerca de 0,05% a cer-ca de 0,15% (p/p) de Corolase® LAP são adicionados ao material de partidade gelatina.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 11, em que as digestões proteolíticas são conduzidas em um pH de cercade 5 a cerca de 7 e em uma temperatura de cerca de 40°C a cerca de 65°C.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 12, em que o peso molecular médio do hidrolisado de gelatina está na fai-xa a partir de cerca de 100 a cerca de 1500 Da.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, em que o pesomolecular médio do hidrolisado de gelatina está na faixa a partir de cerca de 400 a cerca de 1200 Da, mais preferivelmente a partir de cerca de 700 acerca de 1200 Da.

15. Hidrolisado de gelatina tendo um peso molecular médio apartir de cerca de 100 a cerca de 2000 Da e um teor de amina primária mé-dio de cerca de 1,0 χ 10"3 a cerca de 1,0 χ 10"2 μΜοΙ de amina primária porpg de hidrolisado de gelatina.

16. Hidrolisado de gelatina, de acordo com a reivindicação 15,em que o hidrolisado de gelatina tem um grau de hidrólise maior do que cer-ca de 13%.

17. Hidrolisado de gelatina, de acordo com a reivindicação 15 ou-16, em que o peso molecular médio do hidrolisado de gelatina está na faixaa partir de cerca de 100 a cerca de 1500 Da.

18. Hidrolisado de gelatina, de acordo com a reivindicação 17,em que o peso molecular médio está entre cerca de 400 e cerca de 1200Da, mais preferivelmente a partir de cerca de 700 a cerca de 1200 Da.

19. Hidrolisado de gelatina de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15 a 18, em que o polipeptídeo médio no hidrolisado de gela-tina é de cerca de 4 a cerca de 18 aminoácidos no comprimento.

20. Hidrolisado de gelatina produzido por um processo comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

21. Composição de gelatina compreendendo de cerca de 1% acerca de 20% em peso de um hidrolisado de gelatina e de cerca de 80% acerca de 99% em peso da gelatina.

22. Composição de gelatina, de acordo com a reivindicação 21,em que a composição compreende de cerca de 5% a cerca de 10% em pesodo hidrolisado de gelatina e de cerca de 90% a cerca de 95% em peso dagelatina.

23. Composição de gelatina de acordo com a reivindicação 21ou 22, em que a composição compreende uma relação de hidrolisado degelatina para gelatina de cerca de 1 :4a cerca de 1 : 99 (p/p).

24. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 23, em que a gelatina tem um peso molecular médiomaior do que cerca de 150.000 Da.

25. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 23, em que a gelatina tem um peso molecular médio apartir de cerca de 100.000 a cerca de 150.000.

26. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 25, em que a gelatina é uma gelatina de grau farmacêutico.

27. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 26, em que a gelatina é gelatina Tipo B.

28. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 21 a 26, em que a gelatina é gelatina Tipo A.

29. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 28, em que o hidrolisado de gelatina tem um peso mole-cular médio de cerca de 100 a cerca de 2000 Da, preferivelmente de cercade 100 a cerca de 1500 Da, mais preferivelmente dentre 400 a cerca de 1200 Da, ainda mais preferivelmente a partir de cerca de 700 a cerca de 1200 Da.

30. Composição de gelatina, de acordo com a reivindicação 29,em que o hidrolisado de gelatina tem um peso molecular médio entre cercade 100 e cerca de 1500 Da e um teor de amina primária médio de cerca de 1,0 χ 10"3 a cerca de 1,0 χ 10"2 μΜοΙ de amina primária por pg do hidrolisadode gelatina.

31. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 28, em que o hidrolisado de gelatina é uma gelatina hi-drolisada proteolítica obtida em um processo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 14 ou um hidrolisado de gelatina como definidoem qualquer uma das reivindicações 15 a 20.

32. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 30, em que o hidrolisado de gelatina é uma gelatina hi-drolisada ácida.

33. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 32, também compreendendo glicina.

34. Composição de gelatina, de acordo com a reivindicação 33,em que a quantidade de glicina é de cerca de 0,5% a cerca de 5% em peso.

35. Composição de gelatina, de acordo com a reivindicação 33ou 34, também compreendendo ácido cítrico.

36. Composição de gelatina, de acordo com a reivindicação 35,em que a quantidade de ácido cítrico é de cerca de 0,5% a cerca de 5% empeso.

37. Composição de gelatina, de acordo com a reivindicação 33,em que a quantidade de glicina adicionada é de cerca de 1,5% a cerca de-2,5% em peso e a quantidade de citrato adicionada é de cerca de 0,5% acerca de 1,5% em peso.

38. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 37, em que a composição tem um tempo de endureci-mento de vórtice a partir de cerca de 200 a cerca de 300 segundos.

39. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 37, em que a composição tem um tempo de endureci-mento de vórtice maior do que cerca de 300 segundos.

40. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 39, em que a composição tem uma viscosidade média apartir de cerca de 10 a cerca de 15 cP e em que depois da adição de cercade 0,5% em peso de [2-(4-dimetilcarbamoil-piridino)-etano-1-sulfonato] àcomposição e reação do mesmo durante cerca de 2 horas em uma tempera-tura de reação de cerca de 60°C, a composição tem uma viscosidade médiaa partir de cerca de 15 a cerca de 50 cP.