KR100951434B1 - 청국장 펩타이드 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 AMPK 활성을 가지는 청국장 펩타이드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 AMPK활성을 증가시키는 청국장 펩타이드 및 AMPK 활성을 가져서 에너지 대사 촉진 효과 및 지방 합성 저해 효과를 가지는 청국장 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명에 따른 청국장 펩타이드는 청국장 대비 에너지 대사 촉진 및 지방합성 저해가 뛰어난 소재임을 알 수 있었다. 이는 기존의 청국장보다 항비만 및 항당뇨에 대한 생리활성이 증가된 소재로서 사용시 영양학적 가치뿐만 아니라 생리활성도 증가됨으로써 일반식품 및 건강기능식품에 사용하기에 용이하다.
청국장 펩타이드, AMPK
Description
본 발명은 청국장 펩타이드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 AMPK활성을 증가시키는 청국장 펩타이드 및 에너지 대사 촉진 효과 및 지방 합성 저해 효과를 가지는 청국장 펩타이드에 관한 것이다.
청국장은 콩을 삶아 고초균(枯草菌)이라 부르는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 번식시켜서 콩 단백질을 2~3일 정도 발효하여 만든 식품으로 풍미가 독특하고, 곡류를 주식으로 하여 온 우리 민족에게 부족되기 쉬운 단백질 보충해줌으로써 영양적, 경제적으로 가장 효과적인 식품이다. 이외에도 여러 가지 생체조절 기능을 나타내는 것으로 알려지고 관심이 모아지고 있다.
청국장은 원료인 콩이 가지는 영양성 이외에도 인체의 건강증진을 위한 생리활성 물질이라고 알려진 식이섬유, 인지질, 이소플라본(isoflavone), 사포닌(saponin), 피틴산(phytic acid)등의 성분이 들어 있어 동맥경화, 심장병, 당뇨병 예방효과, 노인성 치매 예방효과, 항암효과(유방암, 대장암, 폐암 등), 비만 예방효과, 골다공증 억제 등의 성인병 예방효과가 있음이 발표되었다. (이재옥 외, 식품과학과 산업, 38(2), 69-78, 2005 ; 공개특허 제 2005-0010730)
특히 청국장의 경우 청국장에 함유되어 있는 다양한 생리활성 물질 이외에도 발효과정 중에 새로운 생리활성 물질이 생성될 수 있는 가능성도 가지고 있어서 건강에 도움을 줄 것으로 기대되고 있다(Kim, O.H., et al. Food Industry and Nutrition, 4, 40-46, 1999)
청국장 관련 기술로는 특허공개 제 2001-2980호, 제 1999-70171호, 제 1999-60113호, 제 1993-11894호, 제 1993-1812호, 제1991-7446호, 제 1988-5879호, 제 2001-18095호, 제 1999-72468호, 제 20001-25273호, 제 2001-18094호, 제 1997-64430호, 제 1999-65689호, 제 1990-12548호 및 제 1998-8040호와 특허공고 제 1994-10744호, 제 1992-2675호, 제 1993-2356호 및 제 1996-16567호 등이 있다. 그러나 이 기술들은 모두 청국장의 이취제거와 물성개선에 초점이 맞추어져 있으며, 국내특허공개 제 2002-211789호는 기능성 청국장 및 그 제조방법에 관한 것으로 항암 기능성 청국장을 기재하고 있고, 특허공개 제 2003-59985호에서는 대두발효추출물을 함유하는 성인병 예방용 발효유 및 그 제조방법을 기재하고 있으며, 이의 혈청콜레스테롤 감소 및 혈압 저하 효과를 개시하고 있다. 또한 국내특허공개 제 2005-0010730호는 항당뇨의 효과가 증강된 홍삼청국장 및 그 제조방법에 대해 기재하고 있고, 이와 같이 청국장에 관한 연구는 청국장의 이취제거, 물성개선, 제조방법에 초점이 맞춰지고 있다.
최근에는 에이엠피케이(5'-AMP-activated protein kinase; 이하 'AMPK'라 한다)가 세포 내 에너지 상태의 변화에 반응하여 대사 전환의 주된 조절자로서 탄수 화물과 지방 대사에 중요한 역할을 담당하고 있음을 보여 주고 있다 (Hardie D.G., Carling D., Carlson M., The AMP-activated/SNF1 protein kinase subfamily : metabolic sensors of the eukaryoitic cell, Ann Rev Biochem, 67, 821-855, 1998). 또한, 제 2형 당뇨병과 비만의 원인에 관여되어 있을 가능성을 제시하고 있다 (Winder WW., Hardie DG., AMP-activated protein kinase, a metabolic master switch : possible roles in type 2 diabetes., Am J Physiol., 277, 1-10, 1999, Moller, DE., New drug targets for type 2 diabetes and the metabolic syndrome, Nature, 414, 821-827, 2001, Minokoshi Y, Kim YB, Peroni OD, Fryer LG, Muller C, Carling D, Kahn BB, Leptin stimulates fatty-acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase, Nature, 415, 339-343, 2002). AMPK는 신체 내 영양상태와 외부환경의 변화에 대한 세포의 적응을 중재하는 에너지 감지기 역할을 하는 것으로 알려지고 있다.
기존 청국장의 경우 에너지 대사 촉진 및 지방합성 저해에 대한 연구가 진행되어 있을 않을 뿐만 아니라 청국장의 발효를 통해 생성되는 생리활성 물질인 펩타이드에 대한 연구가 미흡한 실정이다. 따라서, 본 발명자는 청국장 발효 후 단백 분해 효소로 가수분해하여 10,000 이하의 저분자 펩타이드 함량이 청국장 대비 2배 이상 증가한 청국장 펩타이드를 제조하였고, 이것의 AMPK 활성을 측정한 결과, 기존 발효 공정만을 이용해 제조한 청국장 대비 AMPK 활성이 3배 이상 증가한 청국장 펩타이드를 제조하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 청국장 펩타이드 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대두 증자 후 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 발효를 거쳐 청국장을 제조하고 이에 식품소재로써 기능성을 더하고자 단백 분해 효소로 가수분해 하여 저분자 펩타이드 함량이 2배 이상 증가된 청국장 펩타이드 제조에 관한 것이다. 이렇게 제조한 청국장 펩타이드는 AMPK 활성화를 통하여 에너지 대사 촉진 및 지방합성 저해 효과를 나타내었고 이는 단순 발효를 통해 제조한 청국장에 비해 3배 이상 높은 AMPK 활성을 나타내었다.
본 발명은 하기 서열번호 1의 AMPK 활성을 가지는 청국장 펩타이드를 제공한다.
서열번호 1: Thr-Pro-Gly-Lys-Phe
또한 본 발명은 상기 서열번호 1의 에너지 대사 촉진 및 지방 합성 저해 효과를 가지는 청국장 펩타이드를 제공한다.
또한 대두 증자 후 균주를 접종하여 37℃에서 48시간 내지 96시간 발효하여 청국장을 만드는 단계; 및 상기 청국장을 엔도펩티다제 및 엑소펩티다제로 가수분해하는 단계; 를 포함하는 청국장 펩타이드 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 가수분해는 엔도펩티다제와 엑소펩티다제를 순차적 또는 동시에 사용하여 이루어지는 것을 청국장 펩타이드 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 청국장 펩타이드는 청국장 대비 에너지 대사 촉진 및 지방합성 저해가 뛰어난 소재임을 알 수 있었다. 이는 기존의 청국장보다 항비만 및 항당뇨에 대한 생리활성이 증가된 소재로서 사용시 영양학적 가치뿐만 아니라 생리활성도 증가됨으로써 일반식품 및 건강기능식품에 사용하기에 용이하다.
이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
(실시예 1) 발효 후 효소 분해를 이용한 청국장 펩타이드의 제조 방법
청국장 펩타이드 제조를 위하여, 단백질 함량이 30~40 중량%을 차지하는 대두를 2~3회 세척하여 이물질을 제거한 후 18시간 이상 불려서 2시간 동안 탈수 시키고, 가압증자기를 사용하여 110~140℃에서 10분에서 30분 증자한 후 온도가 40℃~60℃가 될 때까지 방냉한다. 배양된 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis) 균주를 대두 무게 대비 0.5~5 중량%로 접종하여 37℃에서 48시간 내지 96시간 동안 발효시켜 청국장을 완성하고, 이에 청국장무게 대비 3~15배의 물을 가수한 후 단백분해 효소인 델보레이즈(Delvolase)와 플라보자임(Flavourzyme)을 0.1~10 중량%을 이용하여 45~60℃에서 2~10시간 동안 효소분해를 하였다. 이때 델보레이 즈(Delvolase)와 플라보자임(Flavourzyme)는 순차적으로 또는 동시에 처리할 수 있다. 그 후 90~100℃에서 10~20분 동안 가열하여 효소를 실활시킨 후 진공 농축기를 이용하여 20~30 브릭스(Brix)까지 농축하여 얻었다. 이를 분말화 하기 위하여 70~100℃에서 4~6시간 열풍 건조하여 청국장 펩타이드 분말을 얻었다
(비교예 1) 발효를 통한 청국장 분말 제조
대두를 이용하여 발효 후 효소분해 한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 청국장 분말을 제조하였다.
(시험예 1) 펩타이드 분자량 분포 분석
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 청국장 펩타이드 및 청국장 분말의 분자량 분포를 확인하기 위해 아래의 표 1에서와 같은 조건에서 분석을 실시하였다.
[표 1]펩타이드 분포 분석 조건
| 방 법 | SE-HPLC (BIO-RAD 방법)1) |
| 컬 럼 | Bio-Sil SEC-125 column (300 × 7.8 mm) |
| 완충액 A | 0.05 M NaH2PO4 + 0.15 M NaCl |
| 완충액 B | 0.05 M Na2HPO4 + 0.15 M NaCl |
| 유 속 | 1.0 mL/min |
| 흡광도 (UV) | 280 nm |
| 기기 시스템 | Waters 510 HPLC Pump, Waters 486 Detector |
1)Borneo, R. and Khan, K. : Cereal Chem, 76, 5, 711-717, 1999.
[표 2] 분자량 10,000 이하 저분자 펩타이드 면적
| 실시예 1 | 비교예 1 | |
| 10,000 이하 저분자 펩타이드 면적 | 17862.4 | 8831.5 |
청국장과 청국장 펩타이드의 펩타이드 함량을 비교한 결과, 각 0.2g/10㎖의 동일 농도 하에서 분자량 10,000 이하의 저분자 펩타이드 함량이 청국장 펩타이드의 경우 청국장 대비 2 배 이상 증가하였다.
(시험예 2) AMPK 효소 발현 측정
지방세포 (3T3-L1)세포를 5%의 이산화탄소가 공급이 되고 온도가 37℃인 배양기에서 10% 에프비에스(FBS, fetal bovine serum)이 들어있는 디엠이엠(DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 세포배양 하였다. 세포 밀도가 85 ~ 90%되었을 때 분화 유도 물질인 0.5 mM 메틸이소부틸잔틴 (methylisobutylxanth-ine), 0.25 mM 덱사메타존(dexamethasone), 5 ㎍/ml 인슐린을 처리하여 지방세포로의 분화를 유도시켰다. 이후 2일 후부터는 5 ㎍/ml 인슐린이 포함된 배지로 배양한다. 분화된 세포에 분리 검은콩 펩타이드 조성물을 (100 ~ 800 ㎍/ml) 농도로 처리하였으며, AMPK 활성 측정은 분화 시작 후 9일째 지방세포(3T3-L1)를 파쇄(lysis)시켜 단백질 추출물을 얻은 후 AMPK 단백질량을 웨스턴 블럿(Western Blot)으로 측정하였다.
그 결과는 도 1과 같다. 청국장과 청국장 펩타이드 모두 AMPK 활성을 나타냈으나 청국장 펩타이드 경우 청국장 대비 3배 이상 높은 AMPK 활성을 나타냄을 알 수 있었으며, 결과적으로 청국장 대비 에너지 대사 촉진 및 지방합성 저해효과를 보이는 청국장 펩타이드를 제조하였다.
(실시예 2) 청국장 펩타이드의 구조 분석 및 서열분석
상기 실시예 1에서 제조한 청국장 유래 가수분해물을 에이치피엘씨-지피씨(HPLC-GPC)를 통해 1K 달톤(Dalton) 미만의 펩타이드 분획물을 얻어내었다. 펩타이드 가수분해물의 질량 분석은 엘티큐-오비트랩 매스 스펙트로미터(LTQ-Orbitrap Mass Spectrometer (ThermoFisher Scientific, Bremen, Germany))를 사용하였고, 분석방법은 표 3과 같다. 이렇게 분석한 데이터를 바탕으로 피이에이케이에스(PEAKS) 소프트웨어를 사용하여 펩타이드 아미노산 서열을 분석하였고, 펩타이드의 단백질 소스(Source)를 알아내기 위한 데이터베이스 탐색은 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information)로부터 얻은 단백질 데이터베이터를 이용하였다. 그 결과 신규 펜타펩타이드인 Thr-Pro-Gly-Lys-Phe(서열번호 1)으로 나타났다.
[표 3] 실험 조건
| 실험방법 | LC/MS/MS |
| 컬럼 | Waters C18 NovaPak (2.1x150mm) column |
| 완충액A | 0.1% 포름산(Formic acid) |
| 완충액B | 0.1% 포름산(Formic acid), 90% CH3CN |
| Gradient | 0%-60%(완충액B) |
| 유속 | 200 l/min |
| 기기시스템 | Surveyor MS pump plus, LTQ-Orbitrap Tune 2.0 (ThermoFisher Scientific, Bremen, Germany) |
(실시예3): 신규 펩타이드의 AMPK 활성 검증
위에서 검증한 5개의 아미노산 잔기로 구성된 펜타펩타이드를 합성하여 근육세포에서 AMPK 활성 효능을 웨스턴 블럿(western blot)을 통해 검증하였고 그 결과는 도2 와 같다. 결과적으로 청국장 펩타이드에서 에너지대사 촉진 및 지방합성 저해 효과를 보이는 펜타펩타이드 1종을 구조동정하였다.
도 1은 청국장 및 청국장 펩타이드 처리한 때의 AMPK활성을 나타낸 것이다.
도 2는 신규 펩타이드의 AMPK활성을 나타낸 것이다.
<110> Nonshim Corparation
<120> Fermented Soybeans Peptide and the Preparation of thereof
<160> 1
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Glycine max
<400> 1
Thr Pro Gly Lys Phe
1 5
Claims (4)
- 서열번호 1의 에이엠피케이(AMPK; 5'-AMP-activated protein kinase) 활성을 가지는 청국장 펩타이드.
- 서열번호 1의 에너지 대사 촉진 및 지방 합성 저해 효과를 가지는 청국장 펩타이드.
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- 삭제
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