BRPI0409816B1

BRPI0409816B1 - genes de glifosato-n-acetiltransferase (gat), construtos os compreendendo, célula bacteriana, polipeptídeo tendo atividade de gat, bem como método para a produção de uma planta transgênica resistente ao glifosato e métodos para controlar ervas daninhas em um campo contendo uma safra

Info

Publication number: BRPI0409816B1
Application number: BRPI0409816A
Authority: BR
Inventors: Fred Mccutchen Billy; Ivy Cristina; Siehl Dan; Minshull Jeremy; A Castle Linda; J Giver Lorraine; B Duck Nicholas; A Patten Phillip; Gorton Rebecca; Kemble Roger; Hong Chen Yong
Original assignee: Du Pont; Pioneer Hi Bred Int; Verdia Inc
Priority date: 2003-04-29
Filing date: 2004-04-29
Publication date: 2019-12-17
Also published as: MXPA05011585A; EP1620557A2; EP2322629A2; AU2004260931B2; AU2004260931A1; EP2535414A8; EP2535414A1; SG155063A1; CA2662092C; CN1863914B; JP2007500514A; CA2521284C; WO2005012515A3; WO2005012515A8; ZA200509602B; CA2662092A1; BRPI0409816A; AU2004260931B9; BRPI0409816B8; CA2521284A1

Abstract

"genes de glifosato-n-acetiltransferase (gat)". novas proteínas são proporcionadas aqui, incluindo proteínas capazes de catalisar a acetilação de glifosato e outras proteínas estruturalmente relacionadas. também proporcionados são novos polínucleotídeos capazes de codificar essas proteínas, composições que incluem uma ou mais dessas novas proteínas e/ou polinucleotídeos, células recombinantes e plantas transgênicas compreendendo esses novos compostos, métodos de diversificação envolvendo os novos compostos e métodos de uso dos compostos. alguns dos novos métodos e compostos proporcionados aqui podem ser usados para tornar um organismo, tal como uma planta, resistente ao glifosato.

Description

GENES DE GLIFOSATO-N-ACETILTRANSFERASE (GAT), CONSTRUTOS OS COMPREENDENDO, CÉLULA BACTERIANA, POLIPEPTÍDEO TENDO ATIVIDADE DE GAT, BEM COMO MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA RESISTENTE AO GLIFOSATO E MÉTODOS PARA CONTROLAR ERVAS DANINHAS EM UM CAMPO CONTENDO UMA SAFRA

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Antecedentes da Invenção:

A seletividade de safra a herbicidas específicos pode ser conferida através de manipulação de genes em safras os quais codificam enzimas que metabolizam herbicidas apropriados. Em alguns casos, essas enzimas, e os ácidos nucleicos que codificam as mesmas, se originam em uma planta. Em outros casos, elas são derivadas de outros organismos, tais como micróbios. Veja, por exemplo, Padgette e colaboradores (1996) “New weed control opportunities: Development of soybeans with a Round UP Ready™ gene” e Vasil (1996) Phosphinothricin-resistant crops”, ambos em Herbicide-Resistant Crops, ed. Duke (CRC Press, Boca Raton, Flórida) páginas 54-84 e páginas 85-91. Na verdade, plantas transgênicas foram manipuladas para expressar uma variedade de genes que metabolizam/de tolerância a herbicida, de uma variedade de organismos. Por exemplo, sintase de acetohidróxi ácido, a qual descobriu-se

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2/314 que torna as plantas que expressam essa enzima resistentes a múltiplos tipos de herbicidas, foi introduzida em uma variedade de plantas (veja, por exemplo, Hattori e colaboradores (1995) Mol. Gen. Genet. 246: 419) . Outros genes que conferem tolerância a herbicidas incluem: um gene que codifica uma proteína quimérica de citocroma P4507A1 de rato e oxidoreductase de NADPH-citocroma P450 de levedo (Shiota e colaboradores (1994) Plant Physiol. 106: 17), genes para reductase de glutationa e dismutase de superóxido (Aono e colaboradores (1995) Plant Cell Physiol. 36: 1687 e genes para várias fosfotransferases (Datta e colaboradores (1992) Plant Mol. Biol. 20: 619).

Um herbicida o qual é o assunto de muita investigação a esse respeito é N-fosfonometilglicina, comumente referido como glifosato. O glifosato é o herbicida top de linha no mundo, com vendas projetadas para atingir $5 bilhões em 2003. Ele é um herbicida de amplo espectro que mata plantas do tipo folhas largas e capim. Um modo com sucesso do nível comercial de resistência do glifosato em plantas transgênicas é através de introdução de um gene modificado CP4 da sintase de 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato de Agrobacterium (aqui depois referida como sintase de EPSP ou EPSPS). O transgene é objetivado ao cloroplasto onde ele é capaz de continuar a sintetizar EPSP a partir de ácido fosfoenolpirúvico (PEP) e shikimato-3-fosfato na presença de glifosato. Em contraste, a sintase de EPSP nativa é inibida pelo glifosato. Sem o transgene, plantas pulverizadas com glifosato morrem rapidamente em virtude de inibição da sintase de EPSP, a qual bloqueia a via a jusante necessária para a biossíntese de aminoácido

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3/314 aromático, hormônio e vitamina. Plantas transgênicas de soja resistentes à CP4 de glifosato são comercializadas, por exemplo, pela Monsanto sob a marca “Round UP Ready™.

No ambiente, o mecanismo predominante pelo qual o glifosato é degradado é através metabolismo de microflora no solo. O metabólito primário de glifosato no solo foi identificado como acido aminometilfosfônico (AMPA), o qual, por fim, é convertido em amônia, fosfato e dióxido de carbono. O esquema metabólico proposto que descreve a degradação de glifosato no solo através da via de AMPA é mostrado na Fig. 8. Uma via metabólica alternativa para a quebra de glifosato por determinadas bactérias no solo, a via de sarcosina, ocorre através de clivagem inicial da ligação C-P para proporcionar fosfato inorgânico e sarcosina, conforme representado na Fig. 9.

Outro conjunto de herbicida/safra transgênica com sucesso é glifosinato (fosfinotricina) e a característica Liberty Link™ comercializada, por exemplo, pela Aventis. O glifosinato é também um herbicida de amplo espectro. Seu alvo é a enzima sintase de glutamato do cloroplasto. Plantas resistentes trazem o gene bar de Streptomyces

hygroscopicus	e	obtêm	resistência através da atividade	de
N-acetilação	do	bar,	o qual modifica e destoxifica	o
glifosinato.
Uma enzima	capaz	de acetilação da amina primária	do

AMPA é reportada no Pedido PCT No. WO 00/29596. A enzima não foi descrita como sendo capaz de acetilar um composto com uma amina secundária (por exemplo, glifosato).

Embora uma variedade de estratégias de resistência a herbicida esteja disponível conforme observado acima,

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4/314 abordagens adicionais teriam valor comercial considerável. A presente invenção proporciona novos polinucleotídeos e polipeptídeos para conferir tolerância a um herbicida, bem como numerosos outros benefícios, conforme se tornará evidente durante revisão da divulgação.

Sumário da Invenção:

A presente invenção proporciona métodos e reagentes para tornar um organismo, tal como uma planta, resistente ao glifosato através de uma ou mais das modalidades descritas abaixo.

Uma modalidade da invenção proporciona novos polipeptídeos referidos aqui como polipeptídeos de Nacetiltransferase de glifosato (GAT). Polipeptídeos de GAT são caracterizados por sua similaridade estrutural uns aos outros, por exemplo, em termos de similaridade de seqüência quando os polipeptídeos de GAT são alinhados uns com os outros. Os polipeptídeos de GAT da presente invenção possuem atividade de N-acetiltransferase de glifosato, isto é, a capacidade de catalisar a acetilação de glifosato. Esses polipeptídeos de GAT transferem o grupo acetila de acetil CoA para o N do glifosato. Além disso, alguns polipeptídeos de GAT transferem o grupo propionila de propionil CoA para o N do glifosato. Alguns polipeptídeos de GAT também são capazes de catalisar a acetilação de análogos de glifosato e/ou metabólitos de glifosato, por exemplo, acido aminometilfosfônico. Polipeptídeos de GAT exemplificativos correspondem à SEQ ID NO: 568, 569, 570,

571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582,

583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594,

595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606,

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607,	608,	609,	610,	611,	612,	613, 614,	615,	616,	617,	618,
619,	621,	623,	625,	627,	629,	631, 633,	635,	637,	639,	641,
643,	645,	647,	649,	651,	653,	655, 657,	659,	661,	663,	665,
667,	6 69,	671,	673,	675,	677,	679, 681,	683,	685,	687,	689,
691,	693,	695,	697,	699,	701,	703, 705,	707,	709,	711,	713,
715,	717,	719,721,	723,	725,	727, 729,	731,	733,	735,	737,
739,	741,	743,	745,	747,	749,	751, 753,	755,	757,	759,	761,
763,	765,	767,	769,	771,	773,	775, 777,	779,	781,	783,	785,
787,	789,	791,	793,	795,	797,	799, 801,	803,	805,	807,	809,
811,	813,	815,	817,	819,	821,	823, 825,	833,	835,	837,	839,
841,	843,	845,	847,	849,	851,	853, 855,	857,	859,	861,	863,
865,	867,	869,	871,	873,	875,	877, 879,	881,	883,	885,	887,
889,	891,	893,	895,	897,	899,	901, 903,	905,	907,	909,	911,
913,	915,	917,	919,	921,	923,	925, 927,	929,	931,	953,	954,
955,	956,	957,	958,	959,	960,	961, 962,	963,	964,	965,	966,
967,	968,	969,	970,	971	e 972	•
	Também proporcionados	são novos polinucleotídeos
referidos	aqui	como polinucleotídeos de GAT	, por	exemplo,
SEQ	ID NO	: 516, 517, 518, 519, 520,	521,	522,	523,	524,
525,	526,	527,	528,	529,	530,	531, 532,	533,	534,	535,	536,
537,	538,	539,	540,	541,	542,	543, 544,	545,	546,	547,	548,
549,	550,	551,	552,	553,	554,	555, 556,	557,	558,	559,	560,
561,	562,	563,	564,	565,	566,	567, 620,	622,	624,	626,	628,
630,	632,	634,	636,	638,	640,	642, 644,	646,	648,	650,	652,
654,	656,	658,	660,	662,	664,	666, 668,	670,	672,	674,	676,
678,	680,	682,	684,	686,	688,	690, 692,	694,	696,	698,	700,
702,	704,	706,	708,	710,	712,	714, 716,	718,	720,	722,	724,
726,	728,	730,	732,	734,	736,	738, 740,	742,	744,	746,	748,
750,	752,	754,	756,	758,	760,	762, 764,	768,	770,	772,	774,
776,	778,	780,	782,	784,	786,	788, 790,	792,	794,	796,	798,

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800,	802,	804,	806,	808,	810,	812,	814,	816,	818,	820,	822,
824,	832,	834,	836,	838,	840,	842,	844,	846,	848,	850,	852,
854,	856,	858,	860,	862,	864,	866,	868,	870,	872,	874,	876,
878,	880,	882,	884,	886,	888,	890,	892,	894,	896,	898,	900,
902,	904,	906,	908,	910,	912,	914,	916,	918,	920,	922,	924,
926,	928,	930,	932,	933,	934,	935,	936,	937,	938,	939,	940,
941,	942	, 943,	944,	945	, 947,	949,	951	e	952.

Polinucleotídeos de GAT são caracterizados por sua capacidade de codificar polipeptídeos de GAT. Em algumas modalidades da invenção, um polinucleotídeo de GAT é manipulado para melhor expressão em plantas através de substituição de um ou mais códons originais por um códon equivalente que é, de preferência, usado em plantas com relação ao códon original. Em outras modalidades, um polinucleotídeo de GAT é modificado através da introdução de uma seqüência de nucleotídeos que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto N-terminal. Em outras modalidades, um polinucleotídeo de GAT é modificado através de inserção de um ou mais códons contendo G+C (tais como GCG ou GCT) imediatamente a jusante de e adjacente ao códon inicial Met.

Polipeptídeos de GAT, polinucleotídeos de GAT e atividade de N-acetiltransferase de glifosato são descritos em maiores detalhes abaixo. A invenção ainda inclui determinados fragmentos dos polipeptídeos de GAT e polinucleotídeos de GAT descritos aqui.

A invenção inclui variantes não-nativas dos polipeptídeos e polinucleotídeos descritos aqui, em que um ou mais aminoácidos do polipeptídeo codificado sofreram mutação.

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7/314

Em determinadas modalidades preferidas, os polipeptídeos de GAT da presente invenção são caracterizados como segue. Quando otimamente alinhados com uma seqüência de aminoácidos de referência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 300, 445 e 457 para gerar um escore de similaridade de pelo menos 460 usando a matriz BLOSUM62, uma penalidade por existência de gap de 11 e uma penalidade por extensão de gap de 1, uma ou mais das seguintes posições se conformam às seguintes restrições: (i) nas posições 18 e 38, um resíduo de aminoácido Z5; (ii) na posição 62, um resíduo de aminoácido Z1; (iii) na posição 124, um resíduo de aminoácido Z6; e (iv) na posição 144, um resíduo de aminoácido Z2, em que: Z1 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P.

A invenção ainda proporciona um polipeptídeo isolado ou recombinante compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dos grupos consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 577; (b) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 578; (c) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 621; (d) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 579; (e) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 602; (f) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 697;

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8/314 (g) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 712; (h) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 613; (i) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 89% idêntica à SEQ ID NO: 677; (j) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 584; (k) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 707;

(l) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 616; (m) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 612; e (n) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 590.

A invenção ainda proporciona um polipeptídeo isolado ou recombinante compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dos grupos consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica às posições 2-146

de	SEQ ID	NO:	919 (	tais	como,	por	exemplo, SEQ ID	NO:	917,
919	, 921,	923,	925,	927,	833,	835,	839, 843, 845,	859,	863,
873	, 877,	891,	895	, 901	, 905	, 907	, 913, 915 ou	950);	(b)

uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 929 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 929, 931, 835, 843, 849 ou 867); (c) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 847 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 845 ou 847); (d) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 851; (e) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 853; (f) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 855 (tais como,

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9/314 por exemplo, SEQ ID NO: 835 ou 855); (g) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 857; (h) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 861 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 839, 861 ou 883); (i) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 871; (j) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 875; (k) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 881; (l) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 885 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 845 ou 885); (m) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 887; (n) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 889 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 863, 889, 891 ou 903);

(o) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 893; (p) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 897; (q) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 899; (r) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 909 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 883 ou 909); (s) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 911; (t) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 837; (u) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO:

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841; (v) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 865; (w) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 869; e (x) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 879. Em algumas modalidades da invenção, a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo compreende Met,

Met-Ala ou Met-Ala-Ala sobre o lado N-terminal do aminoácido correspondendo à posição 2 da seqüência de aminoácidos de referência.

A invenção ainda proporciona um polipeptídeo isolado ou recombinante compreendendo uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica às posições 2-146 de SEQ ID NO: 929 e a qual compreende um resíduo de Gly ou Asn na posição de aminoácido correspondendo à posição 33 de SEQ ID

NO: 929 (	tais	como, por	exemplo, SEQ ID	NO:	837, 849, 893,
897, 905,	921	, 927, 929 ou 931). Em algumas	modalidades	da
invenção,	a	seqüência	de aminoácidos	do	polipeptídeo
compreende Met, Met-Ala	ou Met-Ala-Ala	sobre o lado	N-
terminal	do	aminoácido	correspondendo	à	posição 2	da
seqüência	de	aminoácidos	de referência.

A invenção ainda proporciona um construto de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da invenção. O construto pode ser um vetor, tal como um vetor de transformação de planta. Em alguns aspectos, um vetor da invenção compreenderá uma seqüência de T-DNA. O construto pode, opcionalmente, incluir a seqüência regulatória (por exemplo, um promotor) operavelmente ligado a um polinucleotídeo de GAT, onde o promotor é heterólogo com relação ao polinucleotídeo e eficaz para causar expressão

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11/314 suficiente do polipeptídeo codificado para intensificar a tolerância ao glifosato de uma célula de planta transformada com o construto de ácido nucleico.

Em alguns aspectos da invenção, um polinucleotídeo de GAT funciona como um marcador selecionável, por exemplo, em uma planta, bactérias, actinomicete, levedo, alga ou outro fungo. Por exemplo, um organismo que foi transformado com um vetor, incluindo um marcador selecionável de polinucleotídeo de GAT, pode ser selecionado baseado em sua capacidade de se desenvolver na presença de glifosato. Um gene marcador de GAT pode ser usado para seleção ou triagem de células transformadas expressando o gene.

A invenção ainda proporciona vetores com características empilhadas, isto é, vetores que codificam um polipeptídeo de GAT e que também incluem uma segunda seqüência de polinucleotídeo que codifica uma segunda polipeptídeo que confere uma característica fenotípica detectável a uma célula ou organismo expressando o segundo polipeptídeo em um nível eficaz, por exemplo, resistência à doenças ou resistência a pestes. A característica fenotípica detectável pode também funcionar como um marcador selecionável, por exemplo, conferindo resistência a herbicida ou proporcionando algum tipo de marcador visível.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição compreendendo dois ou mais polinucleotídeos da invenção. De preferência, os polinucleotídeos de GAT codificam polipeptídeos de GAT tendo diferentes parâmetros cinéticos, isto é, uma variante de GAT tendo uma Km menor pode ser combinada com uma tendo uma kcat maior. Em uma

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12/314 outra modalidade, os diferentes polinucleotídeos de GAT podem ser acoplados a uma seqüência de trânsito de cloroplasto ou outra seqüência sinalizadora, desse modo, proporcionando expressão de polipeptídeo de GAT em diferentes compartimentos celulares ou organelas ou secreção de um ou mais dos polipeptídeos de GAT.

Conseqüentemente, composições contendo dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos de GAT codificados são uma característica da invenção. Em alguns casos, essas composições são bibliotecas de ácidos nucleicos contendo, por exemplo, pelo menos 3 ou mais de tais ácidos nucleicos. Composições produzidas através de digestão dos ácidos nucleicos da invenção com uma endonuclease de restrição, uma DNAse ou uma RNAse ou, de outro modo, fragmentação dos ácidos nucleicos, por exemplo, através de cisalhamento mecânico, clivagem química, etc., são também uma característica da invenção, assim como composições produzidas através de incubação de um ácido nucleico da invenção com trifosfato deoxiribonucleotídeos e uma polimerase de ácido nucleico, tal como uma polimerase de ácido nucleico termoestável.

Células transduzidas por um vetor da invenção ou as quais, de outro modo, incorporam um ácido nucleico da invenção, são um aspecto da invenção. Em uma modalidade preferida, as células expressam um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico da invenção.

Em algumas modalidades, as células incorporando os ácidos nucleicos da invenção são células de planta. Plantas transgênicas, células de planta transgênica e explantes de planta transgênica incorporando os ácidos

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13/314 nucleicos da invenção são também uma característica da invenção. Em algumas modalidades, as plantas transgênicas, células de planta transgênica ou explantes de planta transgênica expressam um polipeptídeo exógeno com atividade de N-acetiltransferase de glifosato codificado pelo ácido nucleico da invenção. A invenção também proporciona sementes transgênicas produzidas pelas plantas transgênicas da invenção.

A invenção ainda proporciona plantas transgênicas, células de planta transgênica, explantes de planta transgênica ou sementes transgênicas tendo tolerância intensificada ao glifosato em virtude da expressão de um polipeptídeo com atividade de N-acetiltransferase de glifosato e um polipeptídeo que confere tolerância ao glifosato através de outro mecanismo, tal como um 5enolpiruvilshikimato-3-fosfato CP4 de Agrobacterium tolerante ao glifosato e/ou uma oxidoreductase de glifosato tolerante ao glifosato. Em uma outra modalidade, a invenção proporciona plantas transgênicas ou explantes de planta transgênica tendo tolerância intensificada ao glifosato, bem como tolerância a um herbicida adicional em virtude da expressão de um polipeptídeo com atividade de Nacetiltransferase de glifosato, um polipeptídeo que confere tolerância ao glifosato através de outro mecanismo, tais como um 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato CP4 de Agrobacterium tolerante ao glifosato e/ou uma óxidoreductase de glifosato tolerante ao glifosato e um polipeptídeo que confere tolerância ao herbicida adicional, tais como uma dioxigenase de hidróxifenilpiruvato com mutação, uma sintase de acetolactato tolerante à

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14/314 sulfonamida, uma sintase de acetohidróxi ácido tolerante à sulfonamida, uma sintase de acetolactato tolerante à imidazolinona, uma sintase de acetohidróxi ácido tolerante à imidazolinona, uma acetiltransferase de fosfinotricina e uma oxidase de protoporfirinogênio com mutação.

A invenção também proporciona plantas transgênicas, células de planta transgênica, explantes de planta transgênica ou sementes transgênicas tendo tolerância intensificada ao glifosato, bem como tolerância a um herbicida adicional em virtude da expressão de um polipeptídeo com atividade de N-acetiltransferase de glifosato e um polipeptídeo que confere tolerância a um herbicida adicional, tais como uma dioxigenase de hidróxifenilpiruvato com mutação, uma sintase de acetolactato tolerante à sulfonamida, uma sintase de acetohidróxi ácido tolerante à sulfonamida, uma sintase de acetolactato tolerante à imidazolinona, uma sintase de acetohidróxi ácido tolerante à imidazolinona, uma fosfinotricina acetiltransferase e uma oxidase de protoporfirinogênio com mutação. A invenção também proporciona plantas transgênicas, células de planta transgênica, explantes de planta transgênica ou sementes transgênicas tendo tolerância intensificada ao glifosato, bem como características desejáveis adicionais as quais podem ser conferidas por um ou mais transgenes adicionais.

Métodos de produção dos polipeptídeos da invenção através de introdução dos ácidos nucleicos que codificam os mesmos em células e, então, expressando e opcionalmente recuperação dos mesmos das células ou meio de cultura são uma característica da invenção. Em modalidades preferidas,

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15/314 as células expressando os polipeptídeos da invenção são células de planta transgênica.

Métodos para aumentar o nível de expressão de um polipeptídeo da invenção em uma planta ou célula de planta através de inserção, na seqüência de codificação do polipeptídeo, de um ou dois códons ricos em G/C (tais como GCG ou GCT) imediatamente adjacentes ao e a jusante do códon ATG da metionina de iniciação e/ou substituição, na seqüência de codificação do polipeptídeo, de um ou mais códons os quais são menos freqüentemente utilizados em plantas por códons que codificam o(s) mesmo(s) aminoácido(s) os quais são mais freqüentemente utilizados em plantas e introdução da seqüência de codificação modificada em uma planta ou célula de planta e expressão da seqüência de codificação modificada, são também uma característica da invenção.

Polipeptídeos que são especificamente ligados por um

anti-soro	policlonal que	reage contra um antígeno	derivado
de SEQ ID	NO:	568,	569,	570,	571, 572, 573,	574,	575,	576,
577,	578,	579,	580,	581,	582,	583, 584, 585,	586,	587,	588,
589,	590,	591,	592,	593,	594,	595, 596, 597,	598,	599,	600,
601,	602,	603,	604,	605,	606,	607, 608, 609,	610,	611,	612,
613,	614,	615,	616,	617,	618,	619, 621, 623,	625,	627,	629,
631,	633,	635,	637,	639,	641,	643, 645, 647,	649,	651,	653,
655,	657,	659,	661,	663,	665,	667, 669, 671,	673,	675,	677,
679,	681,	683,	685,	687,	689,	691, 693, 695	, 697,	699,	701,
703,	705,	707,	709,	711,	713,	715, 717, 719	,721,	723,	725,
727,	729,	731,	733, 735, 737, 739, 741,	743,	745,	747,
749,	751,	753,	755,	757,	759,	761, 763, 765,	767,	769,	771,
773,	775,	777,	779,	781,	783,	785, 787, 789,	791,	793,	795,

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	797,	799,	801,	803,	805,	807,	809,	811,	813,	815,	817,	819,
	821,	823,	825,	833,	835,	837,	839,	841,	843,	845,	847,	849,
	851,	853,	855,	857,	859,	861,	863,	865,	867,	869,	871,	873,
	875,	877,	879,	881,	883,	885,	887,	889,	891,	893,	895,	897,
5	899,	901,	903,	905,	907,	909,	911,	913,	915,	917,	919,	921,
	923,	925,	927,	929,	931,	953,	954,	955,	956,	957,	958,	959,
	960,	961,	962,	963,	964,	965,	9 6 6,	967,	, 968,	969,	970	, 971
	e 972, mas não a	uma	seqüência	relacionada que ocorre
	naturalmente,	por	exemplo	, tal	como	um	peptídeo
10	representado por uma sub-seqüência daquelas	do	número de
	acesso ao	GenBank	CAA7 0	664,	bem como	anticorpos	os	quais
	são	produzidos	através	de	administração de um	antígeno
	derivado	de qualquer uma ou	mais	de SEQ ID	NO:	568,	569,
	570,	571,	572,	573,	574,	575,	576,	577,	578,	579,	580,	581,
15	582,	583,	584,	585,	586,	587,	588,	589,	590,	591,	592,	593,
	594,	595,	596,	597,	598,	599,	600,	601,	602,	603,	604,	605,
	606,	607,	608,	609,	610,	611,	612,	613,	614,	615,	616,	617,
	618,	619,	621,	623,	625,	627,	629,	631,	633,	635,	637,	639,
	641,	643,	645,	647,	649,	651,	653,	655,	657,	659,	661,	663,
20	665,	667,	669,	671,	673,	675,	677,	679,	681,	683,	685,	687,
	689,	691,	693,	695,	697,	699,	701,	703,	705,	707,	709,	711,
	713,	715,	717,	719,	721,	723,	725,	727,	729,	731,	733,	735,
	737,	739,	741,	743,	745,	747,	749,	751,	753,	755,	757,	759,
	761,	763,	765,	767,	769,	771,	773,	775,	777,	779,	781,	783,
25	785,	787,	789,	791,	793,	795,	797,	799,	801,	803,	805,	807,
	809,	811,	813,	815,	817,	819,	821,	823,	825,	833,	835,	837,
	839,	841,	843,	845,	847,	849,	851,	853,	855,	857,	859,	861,
	863,	865,	867,	869,	871,	873,	875,	877,	879,	881,	883,	885,
	887,	889,	891,	893,	895,	897,	899,	901,	903,	905,	907,	909,
30	911,	913,	915,	917,	919,	921,	923,	925,	927,	929,	931,	953,

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954,	955, 956,	957, 958, 959,	960, 961, 962, 963,	964,	965,
9 6 6,	967, 968,	969, 970, 971	e 972 e/ou os quais	se	ligam
especificamente	a tais antígenos e os quais não	se	ligam

especificamente a um polipeptídeo que ocorre naturalmente correspondendo àqueles do número de acesso ao GenBank CAA70664, são todos características da invenção.

Outro aspecto da invenção se refere a métodos de diversificação de polinucleotídeo para produzir novos polinucleotídeos e polipeptídeos de GAT através de recombinação ou mutação dos ácidos nucleicos da invenção in vitro ou in vivo. Em uma modalidade, a recombinação produz pelo menos uma biblioteca de polinucleotídeos de GAT recombinantes. As bibliotecas assim produzidas são modalidades da invenção, assim como células compreendendo as bibliotecas. Além disso, métodos de produção de um polinucleotídeo de GAT modificado através de mutação de um ácido nucleico da invenção são modalidades da invenção. Polinucleotídeos e polipeptídeos de GAT recombinantes e mutantes produzidos por meio dos métodos da invenção são também modalidades da invenção.

Em alguns aspectos da invenção, a diversificação é obtida através do uso de recombinação recursiva, a qual pode ser realizada in vitro, in vivo, in silico ou uma combinação dos mesmos. Alguns exemplos de métodos de diversificação descritos em maiores detalhes abaixo são métodos de embaralhamento de família e métodos de embaralhamento sintético. A invenção proporciona métodos para a produção de uma planta transgênica ou célula de planta resistente ao glifosato que envolve transformação de uma planta ou célula de planta com um polinucleotídeo que

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18/314 codifica uma N-acetiltransferase de glifosato e, opcionalmente, regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de planta transformada. Em alguns aspectos, o polinucleotídeo é um polinucleotídeo de GAT, opcionalmente um polinucleotídeo de GAT derivado de uma fonte bacteriana. Em alguns aspectos da invenção, o método pode compreender desenvolvimento da planta ou célula de planta transformada em uma concentração de glifosato que inibe o crescimento de uma planta do tipo silvestre da mesma espécie sem inibição do crescimento da transformada planta. O método pode compreender desenvolvimento da planta ou célula de planta transformada ou prole da planta ou célula de planta em concentrações crescentes de glifosato e/ou em uma concentração de glifosato que é letal para uma planta do tipo silvestre ou célula de planta da mesma espécie. A planta transgênica resistente ao glifosato produzida por meio desse método pode ser propagada, por exemplo através de cruzamento da mesma com uma segunda planta, de modo que pelo menos alguma prole do cruzamento mostre tolerância ao glifosato.

A invenção ainda proporciona métodos para o controle seletivo de ervas daninhas em um campo contendo a safra que envolve plantio do campo com sementes ou plantas de safra as quais são tolerantes ao glifosato como um resultado de serem transformadas com um gene que codifica uma Nacetiltransferase de glifosato e aplicação, à safra e ervas daninhas no campo, de uma quantidade suficiente de glifosato para controlar as ervas daninhas sem afetar significativamente a safra.

A invenção ainda proporciona métodos para o controle

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19/314 de ervas daninhas em um campo e prevenção da emergência de ervas daninhas resistentes ao glifosato em um campo contendo a safra o qual envolve plantio do campo com sementes ou plantas de safra que são tolerantes ao glifosato como um resultado de serem transformadas com um gene que codifica uma N-acetiltransferase de glifosato e um gene que codifica um polipeptídeo que confere tolerância ao glifosato através de outro mecanismo, tais como um 5enolpiruvilshikimato-3-fosfato CP4 de Agrobacterium tolerante ao glifosato e/ou uma óxido-reductase de glifosato tolerante ao glifosato e aplicação, à safra e às ervas daninhas no campo, de uma quantidade suficiente de glifosato para controlar as ervas daninhas sem afetar significativamente a safra.

Em uma outra modalidade, a invenção proporciona métodos para o controle de ervas daninhas em um campo e prevenção da emergência de ervas daninhas resistentes a herbicida em um campo contendo a safra o qual envolve plantio do campo com sementes ou plantas de safra que são tolerantes ao glifosato como um resultado de serem transformadas com um gene que codifica uma Nacetiltransferase de glifosato, um gene que codifica um polipeptídeo que confere tolerância ao glifosato através de outro mecanismo, tais como um 5-enolpiruvilshikimato-3fosfato CP4 de Agrobacterium tolerante ao glifosato e/ou uma óxido-reductase de glifosato tolerante ao glifosato e um gene que codifica um polipeptídeo que confere tolerância a um herbicida adicional, tal como uma dioxigenase de hidróxifenilpiruvato com mutação, uma sintase de acetolactato tolerante à sulfonamida, uma sintase de

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20/314 acetohidróxi ácido tolerante à sulfonamida, uma sintase de acetolactato tolerante à imidazolinona, uma sintase de acetohidróxi ácido tolerante à imidazolinona, uma fosfinotricina acetiltransferase e uma oxidase de protoporfirinogênio com mutação e aplicação, à safra e às ervas daninhas no campo, de uma quantidade suficiente de glifosato e um herbicida adicional, tal como um inibidor de dioxigenase de hidróxifenilpiruvato, sulfonamida, imidazolinona, bialaphos, fosfinotricina, azafenidina, butafenacila, sulfosato, glifosinato e um inibidor de protox para controlar as ervas daninhas sem afetar significativamente a safra.

A invenção ainda proporciona métodos para o controle de ervas daninhas em um campo e prevenção da emergência de ervas daninhas resistentes a herbicida em um campo contendo a safra o qual envolve plantio do campo com sementes ou plantas de safra que são tolerantes ao glifosato como um resultado de serem transformadas com um gene que codifica uma N-acetiltransferase de glifosato e um gene que codifica um polipeptídeo que confere tolerância a um herbicida adicional, tal como uma dioxigenase de hidróxifenilpiruvato com mutação, uma sintase de acetolactato tolerante à sulfonamida, uma sintase de acetohidróxi ácido tolerante à sulfonamida, uma sintase de acetolactato tolerante à imidazolinona, uma sintase de acetohidróxi ácido tolerante à imidazolinona, uma fosfinotricina acetiltransferase e uma oxidase de protoporfirinogênio com mutação e aplicação, à safra e às ervas daninhas no campo, de uma quantidade suficiente de glifosato e um herbicida adicional, tal como um inibidor de dioxigenase de hidróxifenilpiruvato,

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21/314 sulfonamida, imidazolinona, bialaphos, fosfinotricina, azafenidina, butafenacila, sulfosato, glifosinato e um inibidor de protox para controlar as ervas daninhas sem afetar significativamente a safra.

A invenção ainda proporciona métodos para a produção de uma planta geneticamente transformada que é tolerante ao glifosato que envolve inserção, no genoma de uma célula de planta, uma molécula de DNA fita dupla recombinante compreendendo: (i) um promotor o qual funciona em células de planta para causar a produção de uma seqüência de RNA; (ii) uma seqüência de DNA estrutural que causa a produção de uma seqüência de RNA a qual codifica uma GAT; e (iii) uma região não-traduzida 3' a qual funciona em células de planta para causar a adição de a trecho de nucleotídeos poliadenila à extremidade 3' da seqüência de RNA; onde o promotor é heterólogo com relação à seqüência de DNA estrutural e adaptado para causar expressão suficiente do polipeptídeo codificado para intensificar a tolerância ao glifosato de uma célula de planta transformada com a molécula de DNA; obtenção de uma célula de planta transformada; e regeneração, a partir da célula de planta transformada, de uma planta geneticamente transformada a qual tem tolerância aumentada ao glifosato.

A invenção ainda proporciona métodos para a produção de uma safra que envolve desenvolvimento de uma planta de safra que é tolerante ao glifosato como um resultado de ser transformada com um gene que codifica uma Nacetiltransferase de glifosato, sob condições de modo que a planta de safra produz uma safra; e colheita de uma safra a partir da planta de safra. Esses métodos incluem,

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22/314 freqüentemente, aplicação de glifosato à planta de safra em uma concentração eficaz para controlar ervas daninhas. Plantas de safra exemplificativas incluem algodão, milho e soja.

A invenção também proporciona computadores, meios legíveis em computador e sistemas integrados, incluindo bancos de dados que são compostos de registros de seqüência, incluindo partes de caracteres correspondendo à SEQ ID NO: 1-10, 16, 48, 190, 193, 196, 202, 205, 268, 300, 442, 445, 448, 454, 457, 515-830 e 832-972. Tais sistemas integrados incluem, opcionalmente, uma ou mais conjuntos de instruções para seleção, alinhamento, tradução, tradução invertida ou visualização de qualquer uma ou mais partes de caracteres correspondendo à SEQ ID NO: 1-10, 16, 48, 190, 193, 196, 202, 205, 268, 300, 442, 445, 448, 454, 457, 515830 e 832-972, uns com os outros e/ou com qualquer ácido nucleico ou seqüência de aminoácidos adicional.

Breve Descrição das Figuras:

A Figura 1 representa a N-acetilação de glifosato catalisada por uma N-acetiltransferase de glifosato (GAT).

A Figura 2 ilustra detecção espectroscópica de massa de N-acetilglifosato produzido por uma cultura de Bacillus exemplificativa expressando uma atividade de GAT nativa.

A Figura 3 é uma tabela ilustrando a identidade relativa entre seqüências de GAT isoladas de diferentes gêneros de bactérias e yitI de Bacillus subtilis.

A Figura 4 é um mapa do plasmídio pMAXY2120 para expressão e purificação da enzima GAT de culturas de E. coli.

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A Figura 5 é uma produção por espectrometria de massa mostrando produção aumentada de N-acetilglifosato ao longo do tempo in a mistura de reação de enzima GAT típica.

A Figura 6 é uma plotagem dos dados cinéticos da enzima GAT a partir da qual uma Km de 2,9 mM para o glifosato foi calculada.

A Figura 7 é uma plotagem dos dados cinéticos tomados a partir dos dados da Figura 6 a partir da qual uma Km de 2 μΜ foi calculada para Acetil CoA.

A Figura 8 é um esquema que descreve a degradação de glifosato no solo através da via de AMPA.

A Figura 9 é um esquema que descreve a via de degradação de glifosato por sarcosina.

A Figura 10 é a matriz BLOSUM62.

A Figura 11 é um mapa do plasmídio pMAXY2190.

A Figura 12 representa um construto de T-DNA com o marcador selecionável GAT.

A Figura 13 representa um vetor de expressão de levedo com o marcador selecionável GAT.

A Figura 14 ilustra o efeito do glifosato sobre a altura da planta quando de formação de pendões.

As Figuras 15A e 15B proporcionam uma comparação dos parâmetros cinéticos Km e kcat/Km, respectivamente, para várias enzimas GAT analisadas na ausência de KCl adicionado (barras não sombreadas) ou na presença de KCl a 20 mM (barras sombreadas) conforme descrito no Exemplo 18. Barras de erro representam o desvio padrão de ensaios múltiplos, onde disponível.

As Figuras 16A, 16B e 16C proporcionam uma comparação dos parâmetros cinéticos Km, kcat e kcat/Km, respectivamente,

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24/314 de várias enzimas GAT da invenção (barras não sombreadas) com os parâmetros cinéticos de algumas enzimas GAT ainda produzidas da invenção (barras sombreadas), conforme descrito no Exemplo 19. Barras de erro representam o desvio padrão de ensaios múltiplos, onde disponível.

A Figura 17 representa atividade de GAT restante após incubação em várias temperaturas, conforme descrito no Exemplo 16.

A Figura 18 representa o efeito do pH sobre a Kcat e Km, conforme descrito no Exemplo 30.

Descrição Detalhada da Invenção:

A presente invenção se refere a uma nova classe de enzimas exibindo atividade de N-acetiltransferase. Em um aspecto, a invenção se refere a uma nova classe de enzimas capaz de acetilação de glifosato e análogos de glifosato, por exemplo, enzimas possuindo atividade de Nacetiltransferase de glifosato (GAT). Tais enzimas são caracterizadas pela capacidade de acetilar a amina secundária de um composto. Em alguns aspectos da invenção, esse composto é um herbicida, por exemplo, glifosato, conforme ilustrado esquematicamente na Figura 1. Esse composto pode também ser um análogo de glifosato ou um produto metabólico da degradação de glifosato, por exemplo, acido aminometilfosfônico. Embora a acetilação de glifosato seja uma etapa catalítica chave em uma via metabólica para o catabolismo de glifosato, a acetilação enzimática de glifosato por enzimas que ocorrem naturalmente, isoladas ou recombinantes não foi anteriormente descrita. Assim, os ácidos nucleicos e polipeptídeos da invenção proporcionam uma nova via

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25/314 bioquímica para manipulação de resistência a herbicida.

Em um aspecto, a invenção proporciona novos genes codificam polipeptídeos de GAT. Polinucleotídeos de que

GAT isolados e recombinantes correspondendo a polinucleotídeos que ocorrem naturalmente, bem como polinucleotídeos de GAT recombinantes e manipulados, por exemplo, diversificados são uma característica da invenção.

Polinucleotídeos de

GAT	são exemplificados p	9or SEQ ID	NO:	516,	517,	518,	519
520,	521, 522, 523, 524,	525, 526,	527,	528,	529,	530,	531
532,	533, 534, 535, 536,	537, 538,	539,	540,	541,	542,	543
544,	545, 546, 547, 548,	549, 550,	551,	552,	553,	554,	555
556,	557, 558, 559, 560,	561, 562,	563,	564,	565,	566,	567
620,	622, 624, 626, 628,	630, 632,	634,	636,	638,	640,	642
644,	646, 648, 650, 652,	654, 656,	658,	660,	662,	664,	666
668,	670, 672, 674, 676,	678, 680,	682,	684,	686,	688,	690
692,	694, 696, 698, 700,	702, 704,	706,	708,	710,	712,	714
716,	718, 720, 722, 724,	726, 728,	730,	732,	734,	736,	738
740,	742, 744, 746, 748,	750, 752,	754,	756,	758,	760,	762
764,	768, 770, 772, 774,	776, 778,	780,	782,	784,	786,	788
790,	792, 794, 796, 798,	800, 802,	804,	806,	808,	810,	812
814,	816, 818, 820, 822,	824, 832,	834,	836,	838,	840,	842
844,	846, 848, 850, 852,	854, 856,	858,	860,	862,	864,	866
868,	870, 872, 874, 876,	878, 880,	882,	884,	886,	888,	890
892,	894, 896, 898, 900,	902, 904,	906,	908,	910,	912,	914
916,	918, 920, 922, 924,	926, 928,	930,	932,	933,	934,	935
936,	937, 938, 939, 940,	941, 942,	943,	944,	945,	947,	949

específicas de

951 polinucleotídeos e e 952. Seqüências polipeptídeos de GAT são proporcionadas como Exemplos para ajudar a ilustrar a invenção e não se destinam a limitar o escopo do gênero de polinucleotídeos e polipeptídeos de GAT

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26/314 descrito e/ou reivindicado aqui.

A invenção também proporciona métodos para a geração e seleção de bibliotecas diversificadas para produzir polinucleotídeos de GAT adicionais, incluindo polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de GAT com características aperfeiçoadas e/ou intensificadas, por exemplo, Km alterada para o glifosato, taxa de catálise aumentada, estabilidade aumentada, etc., baseado em seleção de um polinucleotídeo constituinte da biblioteca para as atividades novas ou aperfeiçoadas descritas aqui. Tais polinucleotídeos são, de modo especialmente favorável, empregados na produção de plantas transgênicas resistentes ao glifosato.

Os polipeptídeos de GAT da invenção exibem uma nova atividade enzimática. Especificamente, a acetilação enzimática do herbicida sintético glifosato não foi reconhecida antes da presente invenção. Assim, os polipeptídeos aqui descritos, por exemplo, conforme

exemplificado pela SEQ ID NO:	568,	569,	570,	571,	572,	573
574, 575, 576, 577, 578, 579,	580,	581,	582,	583,	584,	585
586, 587, 588, 589, 590, 591,	592,	593,	594,	595,	596,	597
598, 599, 600, 601, 602, 603,	604,	605,	606,	607,	608,	609
610, 611, 612, 613, 614, 615,	616,	617,	618,	619,	621,	623
625, 627, 629, 631, 633, 635,	637,	639,	641,	643,	645,	647
649, 651, 653, 655, 657, 659,	661,	663,	665,	667,	669,	671
673, 675, 677, 679, 681, 683,	685,	687,	689,	691,	693,	695
697, 699,701, 703, 705, 707, 70	9, 711,	713,	715,	717
719,721, 723, 725, 727, 729,	731,	733,	735,	737,	739,	741
743, 745, 747, 749, 751, 753,	755,	757,	759,	761,	763,	765

767, 769, 771, 773, 775, 777, 779, 781, 783, 785, 787, 789,

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27/314

791,	793,	795,	797,	799,	801,	803,	805,	807,	809,	811,	813,
815,	817,	819,	821,	823,	825,	833,	835,	837,	839,	841,	843,
845,	847,	849,	851,	853,	855,	857,	859,	861,	863,	865,	867,
869,	871,	873,	875,	877,	879,	881,	883,	885,	887,	889,	891,
893,	895,	897,	899,	901,	903,	905,	907,	909,	911,	913,	915,
917,	919,	921,	923,	925,	927,	929,	931,	946,	948,	950,	953,
954,	955,	956,	957,	958,	959,	960,	961,	962,	963,	964,	965,
966,	967,	968,	969,	970,	971	e 972, definem uma	nova	via

bioquímica para a destoxificação de glifosato que é funcional in vivo, por exemplo, em plantas.

Conseqüentemente, os ácidos nucleicos e polipeptídeos da invenção são de utilidade significativa na geração de plantas resistentes ao glifosato através do fornecimento de novos ácidos nucleicos, polipeptídeos e vias bioquímicas para a manipulação de seletividade por herbicida em plantas transgênicas.

Definições:

Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve ser compreendido que a presente invenção não está limitada a composições ou sistemas biológicos em particular, os quais podem, naturalmente, variar. Também deve ser compreendido que a terminologia usada aqui é para fins de descrição de modalidades em particular apenas e não se destina a ser limitativa. Conforme usado na presente especificação e nas reivindicações em anexo, as formas no singular um, uma, o e a incluem os referentes no plural, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Assim, por exemplo, referência a um dispositivo inclui uma combinação de dois ou mais de tais dispositivos, referência a um construto de fusão genética inclui

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28/314 misturas de construtos e semelhantes.

A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por aqueles habilitados na técnica à qual a presente invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática para testagem da presente invenção, exemplos específicos de materiais e métodos apropriados são descritos aqui.

Na descrição e reivindicação da presente invenção, a seguinte terminologia será usada de acordo com as definições apresentadas abaixo.

Conseqüentemente, para fins da presente invenção, o termo glifosato deverá ser considerado para incluir qualquer forma herbicidamente eficaz de Nfosfonometilglicina (incluindo qualquer sal da mesma) e outras formas as quais resultam na produção do ânion de glifosato em uma planta. O termo “análogo de glifosato” se refere a qualquer análogo estrutural de glifosato que tem a capacidade de inibir EPSPS em níveis de modo que o análogo de glifosato é herbicidamente eficaz.

Conforme usado aqui, o termo “atividade de Nacetiltransferase de glifosato” ou “atividade de GAT” se refere à capacidade de catalisar a acetilação do grupo amina secundária do glifosato, conforme ilustrado, por exemplo, na Figura 1. Uma “N-acetiltransferase de glifosato” ou “GAT” é uma enzima que catalisa a acetilação do grupo amina do glifosato, um análogo de glifosato e/ou um metabólito primário de glifosato (isto é, AMPA ou sarcosina). Em algumas modalidades preferidas da invenção,

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29/314 a GAT é capaz de transferir o grupo acetila de Acetil CoA para a amina secundária do glifosato e a amina primária de AMPA. Além disso, algumas GATs são também capazes de transferir o grupo propionila de propionil CoA para glifosato, indicando que a GAT é também uma aciltransferase. As GATs exemplificativas descritas aqui são ativas em um pH de cerca de 5-9, com atividade ótima em um pH na faixa de cerca de 6,5-8,0. A atividade pode ser quantificada usando vários parâmetros cinéticos os quais são bem conhecidos na técnica, por exemplo, kcat, Km e kcat/KM. Esses parâmetros cinéticos podem ser determinados conforme descrito abaixo no Exemplo 7 ou Exemplo 19.

Os termos polinucleotídeo, seqüência de nucleotídeos, e ácido nucleico são usados para se referir a um polímero de nucleotídeos (A, C, T, U, G, etc. ou análogos de nucleotídeo que ocorrem naturalmente ou artificiais), por exemplo, DNA ou RNA ou uma representação dos mesmos, por exemplo, um trecho de caractere, etc., dependendo do contexto relevante. Um determinado polinucleotídeo ou polinucleotídeo complementar pode ser determinado a partir de qualquer seqüência de nucleotídeos especificada.

Similarmente, uma seqüência de aminoácidos é um polímero de aminoácidos (uma proteína, polipeptídeo, etc.) ou um trecho de caractere representando um polímero de aminoácido, dependendo do contexto. Os termos proteína, polipeptídeo, e peptídeo são usados permutavelmente aqui.

Um polinucleotídeo, polipeptídeo ou outro componente é isolado quando ele é parcial ou completamente separado de

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30/314 componentes com os quais ele está normalmente associado (outras proteínas, ácidos nucleicos, células, reagentes sintéticos, etc.). Um ácido nucleico ou polipeptídeo é recombinante quando ele é artificial ou manipulado ou derivado de uma proteína ou ácido nucleico artificial ou manipulado. Por exemplo, um polinucleotídeo que é inserido em um vetor ou qualquer outro local heterólogo, por exemplo, em um genoma de um organismo recombinante, de modo que ele não esta associado à seqüência de nucleotídeos que normalmente flanqueia o polinucleotídeo conforme ele é encontrado na natureza é um polinucleotídeo recombinante. Uma proteína expressa in vitro ou in vivo a partir de um polinucleotídeo recombinante é um exemplo de um polipeptídeo recombinante. Da mesma forma, uma seqüência de polinucleotídeo que não aparece na natureza, por exemplo, uma variante de um gene que ocorre naturalmente, é recombinante.

Os termos polipeptídeo de N-acetiltransferase de glifosato e polipeptídeo de GAT são usados permutavelmente para se referir a qualquer um da família de novos polipeptídeos proporcionados aqui.

Os termos polinucleotídeo de N-acetiltransferase de glifosato e polinucleotídeo de GAT são usados

permutavelmente para se	referir a um	polinucleotídeo	que
codifica um polipeptídeo	de	GAT.
Uma sub-seqüência	ou	fragmento	é	qualquer parte	de
uma seqüência inteira.
A numeração de	um	polímero	de	aminoácido	ou
nucleotídeo corresponde	à	numeração	de	um polímero	de

aminoácido ou ácido nucleico selecionado quando a posição

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31/314 de um determinado componente monomérico (resíduo de aminoácido, nucleotídeo incorporado, etc.) do polímero corresponde à mesma posição de resíduo em um polipeptídeo ou polinucleotídeo selecionado de referência.

Um vetor é uma composição para facilitar a transdução/transformação de células por um ácido nucleico selecionado ou a expressão do ácido nucleico na célula. Vetores incluem, por exemplo, plasmídios, cosmídios, vírus, YACs, bactérias, poli-lisina, vetores de integração em cromossoma, vetores epissomais, etc.

Substancialmente uma extensão toda de um polinucleotídeo ou seqüência de aminoácidos” se refere pelo menos cerca de 70%, geralmente pelo menos cerca de 80% ou tipicamente cerca de 90% ou mais de uma seqüência.

Conforme usado aqui, um anticorpo” se refere uma proteína compreendendo um ou mais polipeptídeos substancial ou parcialmente codificados por genes de imunoglobulina ou fragmentos de genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, epsilon e mu, bem como genes de região variável da miríade de imunoglobulina. Cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou epsilon, as quais, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Uma unidade estrutural típica de imunoglobulina (anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia leve” (cerca de 25 kD) e uma pesada” (cerca de 50-70 kD) . O N-término de

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32/314 cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis por reconhecimento de antígeno. Os termos cadeia leve variável (Vl) e cadeia pesada variável (Vh) se referem a essas cadeias leve e pesadas, respectivamente. Anticorpos existem como imunoglobulinas intactas ou como uma série de fragmentos bem caracterizados produzidos através de digestão com várias peptidases. Assim, por exemplo, a pepsina digere um anticorpo abaixo as ligações de dissulfeto na região de dobradiça para produzir F(ab)'2, um dímero de Fab o qual é, em si, uma cadeia leve unida a uma VH-CH1 através de uma ligação de dissulfeto. O F(ab)'2 pode ser reduzido sob condições suaves para romper a ligação de dissulfeto na região de dobradiça, desse modo convertendo o dímero (Fab')2 em um monômero Fab'. O monômero Fab' é essencial um Fab com parte da região de dobradiça (veja, Paul, ed. (1998) Fundamental Immunology (4^th Edição, Raven Press, NY) , para uma descrição mais detalhada de outros fragmentos de anticorpo). Embora vários fragmentos de anticorpo sejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, aqueles habilitados apreciarão que tais fragmentos Fab' podem ser sintetizados de novo quimicamente ou utilizando a metodologia de DNA recombinante. Assim, o termo anticorpo, conforme usado aqui, também inclui fragmentos de anticorpo produzidos através da modificação de anticorpos inteiros ou sintetizados de novo usando metodologias de DNA recombinante. Anticorpos incluem anticorpos com cadeia simples, incluindo anticorpos Fv com cadeia simples (sFv) nos quais uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável são unidas (diretamente ou através

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33/314 de um ligante peptídico) a fim de forma um polipeptídeo contínuo.

Um peptídeo de trânsito de cloroplasto é uma seqüência de aminoácidos a qual é traduzida em conjunto com uma proteína e direciona a proteína ao cloroplasto ou outros tipos de plastídio na célula na qual a proteína é feita. Seqüência de trânsito de cloroplasto se refere uma seqüência de nucleotídeos que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto.

Um peptídeo sinalizador é uma seqüência de aminoácidos a qual é traduzida em conjunto com uma proteína e direciona a proteína ao sistema secretório (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42: 21-53). Se a proteína tem de ser direcionada para um vacúolo, um sinal de objetivação a vacúolo pode ainda ser adicionado ou, se ao retículo endoplasmático, um sinal de retenção ao retículo endoplasmático pode ser adicionado. Se a proteína tem de ser direcionada ao núcleo, qualquer peptídeo sinalizador presente deverá ser removido e, ao invés, um sinal de localização nuclear incluído (Raikhel. (1992) Plant Phys. 100: 1627-1632).

Os termos diversificação e diversidade, quando aplicado a um polinucleotídeo, se refere à geração de uma pluralidade de formas modificadas de um polinucleotídeo original ou pluralidade de polinucleotídeos originais. No caso onde o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo, a diversidade numa seqüência de nucleotídeos do polinucleotídeo pode resultar em diversidade no polipeptídeo codificado correspondente, por exemplo, um reservatório diverso de polinucleotídeos que codificam uma

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34/314 pluralidade de polipeptídeo variantes. Em algumas modalidades da invenção, essa diversidade de seqüência é explorada através de triagem/seleção de uma biblioteca de polinucleotídeos diversificados para variantes com atributos funcionais desejáveis, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de GAT com características funcionais intensificadas.

O termo “que codifica” se refere à capacidade de uma seqüência de nucleotídeos de codificar um ou mais aminoácidos. O termo não requer um códon inicial ou de término. Uma seqüência de aminoácidos pode ser codificada em qualquer uma de seis redes de leitura diferentes proporcionadas por uma seqüência de polinucleotídeos e seu complemento.

Quando usado aqui, o termo variante artificial” se refere um polipeptídeo tendo atividade de GAT, o qual é codificado por um polinucleotídeo de GAT modificado, por exemplo, a forma modificada de qualquer uma de SEQ ID NO:

516, 517, 518,

528, 529, 530,

540, 541, 542,

552, 553, 554,

564, 565, 566,

636, 638, 640,

660, 662, 664,

684, 686, 688,

708, 710, 712,

732, 734, 736,

756, 758, 760,

782, 784, 786,

519, 520, 521,

531, 532, 533,

543, 544, 545,

555, 556, 557,

567, 620, 622,

642, 644, 646,

666, 668, 670,

690, 692, 694,

714, 716, 718,

738, 740, 742,

762, 764, 768,

788, 790, 792,

522, 523, 524,

534, 535, 536,

546, 547, 548,

558, 559, 560,

624, 626, 628,

648, 650, 652,

672, 674, 676,

696, 698, 700,

720, 722, 724,

744, 746, 748,

770, 772, 774,

794, 796, 798,

525, 526, 527,

537, 538, 539,

549, 550, 551,

561, 562, 563,

630, 632, 634,

654, 656, 658,

678, 680, 682,

702, 704, 706,

726, 728, 730,

750, 752, 754,

776, 778, 780,

800, 802, 804,

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35/314

806,	808,	810,	812,	814,	816,	818,	820,	822,	824,	832,	834,
836,	838,	840,	842,	844,	846,	848,	850,	852,	854,	856,	858,
860,	862,	864,	866,	868,	870,	872,	874,	876,	878,	880,	882,
884,	886,	888,	890,	892,	894,	896,	898,	900,	902,	904,	906,
908,	910,	912,	914,	916,	918,	920,	922,	924,	926,	928,	930,
932,	933,	934,	935,	936,	937,	938,	939,	940,	941,	942,	943,
944,	945,	947,	949,	951	e 952	ou	de um	polinucleotídeo de

GAT que ocorre naturalmente isolado de um organismo. O polinucleotídeo modificado, a partir do qual uma variante artificial do através de intervenção humana por meio de modificação de um polinucleotídeo de GAT.

O termo construto de ácido nucleico” ou construto de polinucleotídeo” significa um molécula de ácido nucleico, quer fita simples ou fita dupla, a qual é isolada de um gene que ocorre naturalmente ou a qual foi modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiria, de outro modo, na natureza. O termo construto de ácido nucleico é sinônimo do termo cassete de expressão” quando o construto de ácido nucleico contém as seqüências de controle requeridas para expressão de uma seqüência de codificação da presente invenção.

O termo seqüências de controle” é definido aqui para incluir todos os componentes os quais são necessários ou vantajosos para a expressão de um polipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controle pode ser nativa ou estranha a uma seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo. Tais seqüências de controle incluem, mas não estão limitadas a, uma seqüência líder, uma seqüência de poliadenilação, uma seqüência de pró-peptídeo, uma seqüência promotora, uma seqüência sinalizadora de peptídeo

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36/314 e uma seqüência de término de transcrição. No mínimo, as seqüências de controle incluem um promotor e sinais de término de transcrição e tradução. As seqüências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para fins de introdução de sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das seqüências de controle à região de codificação de uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo.

O termo operavelmente ligado” é definido aqui como uma configuração na qual uma seqüência de controle está apropriadamente colocada em uma posição, com relação à seqüência de codificação duma seqüência de DNA, de modo que uma seqüência de controle direciona a expressão de um polipeptídeo.

Quando usado aqui, o termo seqüência de codificação” se destina a abranger uma seqüência de nucleotídeos a qual especifica diretamente uma seqüência de aminoácidos de seu produto de proteína. As ligações de uma seqüência de codificação são, geralmente, determinadas através de uma rede de leitura aberta a qual, usualmente, começa com o códon inicial ATG. A seqüência de codificação inclui, tipicamente, um DNA, cDNA e/ou seqüência de nucleotídeos recombinante.

No presente contexto, o termo expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitado a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-traducional e secreção.

No presente contexto, o termo vetor de expressão” abrange uma molécula de DNA, linear ou circular, que

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37/314 compreende um segmento que codifica um polipeptídeo da invenção e a qual é operavelmente ligada a segmentos adicionais que proporcionam sua transcrição.

O termo célula hospedeira, conforme usado aqui, inclui qualquer tipo de célula a qual é passível de transformação com um construto de ácido nucleico.

O termo planta inclui plantas inteiras, órgãos/estruturas vegetativas de brotos (por exemplo, folhas, caules e tubérculos), raízes, flores e órgãos/estruturas florais (brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelos, anteros e óvulos), sementes (incluindo embrião, endosperma e envoltórios de sementes) e frutos (o ovário maduro), tecido de planta (por exemplo, tecido vascular, tecido triturado e semelhantes) e células (por exemplo, células de proteção, células-ovo, tricomas e semelhantes) e proles das mesmas. A classe de plantas que pode ser usada no método da invenção é, geralmente, tão ampla quanto a classe de plantas superiores e inferiores passíveis de técnicas de transformação, incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samambaias e algas multicelulares. Ele inclui plantas de uma variedade de níveis plóides, incluindo aneuplóide, poliplóide, diplóide, haplóide e hemizigótico.

O termo “heterólogo”, conforme usado, aqui descreve a relação entre dois ou mais elementos a qual indica que os elementos não são normalmente encontrados em proximidade um com o outro na natureza. Assim, por exemplo, uma seqüência de polinucleotídeo é “heteróloga a” um organismo ou uma segunda seqüência de polinucleotídeo se ela se origina de uma espécie estranha ou, se da mesma espécie, é modificada

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38/314 com relação à sua forma original. Por exemplo, um promotor operavelmente ligado a uma seqüência de codificação heteróloga se refere uma seqüência de codificação de uma espécie diferente daquela da qual o promotor foi derivado ou, se da mesma espécie, uma seqüência de codificação a qual não é naturalmente associada ao promotor (por exemplo, uma seqüência de codificação geneticamente manipulada ou um alelo de um ecotipo ou variedade diferente). Em exemplo de um polipeptídeo heterólogo é um polipeptídeo expresso a partir de um polinucleotídeo recombinante em um organismo transgênico. Polinucleotídeos e polipeptídeos heterólogos são formas de moléculas recombinantes.

Uma variedade de termos adicionais é definida ou, de outro modo, caracterizada aqui.

N-Acetiltransferases de Glifosato:

Em um aspecto, a invenção proporciona uma nova família de enzimas isoladas ou recombinantes referidas aqui como N-acetiltransferase de glifosatos, GATs ou “enzimas GAT.” GATs são enzimas que têm atividade de GAT, de preferência atividade suficiente para conferir algum grau de tolerância ao glifosato a uma planta transgênica manipulada para expressar a GAT. Alguns exemplos de GATs incluem polipeptídeos de GAT, descritos em maiores detalhes abaixo.

A tolerância ao glifosato GAT-mediada é um complexo funcional de atividade de GAT, de níveis de expressão de GAT na planta transgênica, da planta em particular e numerosos outros fatores incluindo, mas não limitado, à natureza e momento de aplicação do herbicida. Aqueles habilitados na técnica podem determinar, sem experimentação

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39/314 indevida, o nível de atividade de GAT requerido para obter tolerância ao glifosato em um contexto em particular.

A atividade de GAT pode ser caracterizada usando os parâmetros cinéticos convencionais kcat, Km e kcat /Km. Uma Kcat pode ser encarada como uma medida da taxa de acetilação, particularmente em elevadas concentrações de substrato, uma Km é uma medida da afinidade da GAT por seus substratos (por exemplo, acetil CoA, propionil CoA e glifosato) e uma Kcat/KM é uma medida de eficiência catalítica que ceva em conta a afinidade por substrato e taxa catalítica. A kcat/Km é particularmente importante na situação onde a concentração de um substrato limita, pelo menos parcialmente, a taxa. Em geral, uma GAT com uma maior kcat ou kcat/KM é um catalisador mais eficaz do que outra GAT com menor kcat ou kcat/KM. Uma GAT com uma menor Km é um catalisador mais eficaz do que outra GAT com uma maior Km. Assim, para determinar se uma GAT é mais eficaz do que outra, pode-se comparar os parâmetros cinéticos para as duas enzimas. A importância relativa duma Kcat, kcat/KM e Km variará, dependendo do contexto no qual espera-se que a GAT funcione, por exemplo, a concentração eficaz prevista de glifosato com relação à Km para o glifosato. A atividade de GAT pode também ser caracterizada em termos de qualquer uma de uma série de características funcionais incluindo, mas não limitado, à estabilidade, suscetibilidade à inibição ou ativação por outras moléculas.

Polipeptídeos de N-Acetiltransferase de Glifosato:

Em um aspecto, a invenção proporciona uma nova família de polipeptídeos isolados ou recombinantes referidos aqui como “polipeptídeos de N-acetiltransferase de glifosato” ou

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40/314 polipeptídeos de GAT.” Polipeptídeos de GAT são caracterizados por sua similaridade estrutural a uma nova família de GATs. Muitos, mas nem todos, os polipeptídeos de GAT são GATs. A diferença é que GATs são definidas em termos funcionais, enquanto que polipeptídeos de GAT são definidos em termos de estrutura. Um subconjunto dos polipeptídeos de GAT consiste daqueles polipeptídeos de GAT que têm atividade de GAT, de preferência em um nível que funcionará para conferir resistência ao glifosato a uma planta transgênica expressando a proteína em um nível eficaz. Alguns polipeptídeos de GAT preferidos para uso para conferir tolerância ao glifosato têm uma Kcat de pelo menos 1 min^-1 ou, mais preferivelmente, pelo menos 10 min^-1, 100 min^-1 ou 1000 min^-1. Outros polipeptídeos de GAT preferidos para uso para conferir tolerância ao glifosato têm uma Km não maior do que 100 mM ou, mais preferivelmente, não maior do que 10 mM, 1 mM ou 0,1 mM. Ainda outros polipeptídeos de GAT preferidos para uso para conferir tolerância ao glifosato têm uma Kcat/KM de pelo menos 1 mM^-1min^-1 ou mais, de preferência pelo menos 10 mM¹min^-1, 100 mM^-1min^-1, 1000 mM^-1min^-1 ou 10, 000 mM^-1min^-1.

Polipeptídeos de GAT exemplificativos foram isolados e caracterizados a partir de uma variedade de gêneros bacterianos. Um exemplo de um polipeptídeo de GAT monomérico que foi isolado e caracterizado tem um raio molecular de aproximadamente 17 kD. Uma enzima GAT exemplificativa isolada de um gênero de B. licheniformis, SEQ ID NO: 7, exibe uma Km para o glifosato de aproximadamente 2,9 mM e uma Km para acetil CoA de aproximadamente 2 uM, com uma Kcat igual a 6/minuto.

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O termo “polipeptídeo de GAT” se refere a qualquer polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos que pode ser otimamente alinhada com uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 300, 445 e 457 para gerar um escore de similaridade de pelo menos 460 usando a Matriz BLOSUM62, uma penalidade por existência de gap de 11 e uma penalidade por extensão de

gap	de 1, em que	pelo menos uma das	seguintes posições se
conforma às seguintes	restrições: (i)	nas	posições 18 e	38,
existe	um	resíduo	de	aminoácido Z5;	(ii	na	posição	62,
existe	um	resíduo	de	aminoácido Z1;	iii)	na	posição	124,
existe	um	resíduo	de	aminoácido Z6; e	(iv	) na	posição	144,
existe	um	resíduo	de	aminoácido Z2, em	que	: Z1	é um resíduo

de aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P. Alguns aspectos da invenção se referem a polipeptídeos de GAT compreendendo uma seqüência de aminoácidos que pode ser otimamente alinhada com uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 300, 445 e 457 para gerar um escore de similaridade de pelo menos 440, 445, 450, 455, 460, 465,

470,	475,	480,	485,	490,	495,	500,	505,	510,	515, 520,	525,
530,	535,	540,	545,	550,	555,	560,	565,	570,	575, 580,	585,
590,	595,	600,	605,	610,	615,	620,	625,	630,	635, 640,	645,
650,	655,	660,	665,	670,	675,	680,	685,	690,	695, 700,	705,
710,	715,	720,	725,	730	, 735	, 740, 745, 750, 755 ou	760

usando a Matriz BLOSUM62, uma penalidade por existência de

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42/314 gap de 11 e uma penalidade por extensão de gap de 1, em que uma ou mais das seguintes posições se conformam às seguintes restrições: (i) nas posições 18 e 38, um resíduo de aminoácido Z5; (ii) na posição 62, um resíduo de aminoácido Z1; (iii) na posição 124, um resíduo de aminoácido Z6; e (iv) na posição 144, um resíduo de aminoácido Z2, em que: Z1 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P.

Duas seqüências são “otimamente alinhadas” quando elas são alinhadas para escore de similaridade usando uma matriz de substituição de aminoácidos definida (por exemplo, BLOSUM62), penalidade por existência de gap e penalidade por extensão de gap de modo a chegar ao escore mais alto possível para esse par de seqüências. Matrizes de substituição de aminoácidos e seu uso na quantificação de similaridade entre duas seqüências são bem conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, em Diahoff e colaboradores (1978) A model of evolutionary change in proteins do Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, Supl. 3 (ed. M.O. Diahoff), paginas 345-352. Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC e Henikoff e colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1091510919. Uma matriz BLOSUM62 (Fig. 10) é, freqüentemente, usada como a matriz de substituição de escore de default em protocolos de alinhamento de seqüência, tal como Gapped BLAST 2.0. A penalidade por existência de gap é imposta

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43/314 para a introdução de uma única gap de aminoácido em uma das seqüências alinhadas e a penalidade por extensão de gap é imposta para cada posição de aminoácido vazia adicional inserida em uma gap já aberta. O alinhamento é definido pelas posições de aminoácidos de cada seqüência na qual o alinhamento começa e termina e, opcionalmente, através de inserção de uma gap ou gaps múltiplas em uma ou ambas as seqüências de modo a chegar no maior escore possível. Embora alinhamento e escore ótimos possam ser realizados manualmente, o processo é facilitado pelo uso de um algoritmo de alinhamento implementado em computador, por exemplo, Gapped BLAST 2.0, descrito em Altschul e colaboradores (1997) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 e tornado disponível ao público no Website do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov). Alinhamentos ótimos, incluindo alinhamentos múltiplos, podem ser preparados usando, por

exemplo,	PSI-BLAST,	disponível através	do website do NCBI	e
descrito	por Altschul e colaboradores	(1997) Nucl. Acids
Res. 25:	3389-3402.
Com	relação a	uma seqüência de	aminoácidos que	é
otimamente alinhada	a uma seqüência	de referência,	um

resíduo de aminoácido “corresponde” à posição na seqüência de referência com a qual o resíduo é emparelhado no alinhamento. A “posição” é denotada por uma série que identifica seqüencialmente cada aminoácido na seqüência de referência, baseado em sua posição com relação ao Ntérmino. Por exemplo, em SEQ ID NO:300, a posição 1 é M, a posição 2 é I, a posição 3 é E, etc. Quando uma seqüência de teste é otimamente alinhada à SEQ ID NO: 300, um resíduo

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44/314 na seqüência de teste que se alinha a E na posição 3 é referido como “correspondendo à posição 3” de SEQ ID NO: 300. A despeito de deleções, inserções, truncamentos, fusões, etc., que devem ser levados em conta quando de determinação de um alinhamento ótimo, em geral, o número do resíduo de aminoácido em uma seqüência de teste, conforme determinado simplesmente através de contagem a partir do Ntérmino, não será necessariamente o mesmo que o número de sua posição correspondente na seqüência de referência. Por exemplo, em um caso onde existe uma deleção em uma seqüência de teste alinhada, não existirão aminoácidos que correspondam à posição na seqüência de referência no local da deleção. Onde existe uma inserção em uma seqüência de referência alinhada, essa inserção não corresponderá à qualquer posição de aminoácido na seqüência de referência. No caso de truncamentos ou fusões, podem existir trechos de aminoácidos na seqüência de referência ou alinhada que não correspondem a qualquer aminoácido na seqüência correspondente.

O termo “polipeptídeo de GAT” ainda se refere a qualquer polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 577; (b) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 578; (c) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 621; (d) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 579; (e) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 602; (f) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à

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SEQ ID NO: 697; (g) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 721; (h) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 613; (i) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 89% idêntica à SEQ ID NO: 677; (j) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 584; (k) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 707; (l) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 616; (m) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 612; e (n) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 590.

O termo polipeptídeo de GAT” ainda se refere a qualquer polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 89% de identidade de seqüência aos resíduos 1-96 de uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 677; uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de seqüência aos resíduos 1-96 de uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 697; uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 96% de identidade de seqüência aos resíduos 1-96 de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 584, 612 e 721; uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 97% de identidade de seqüência aos resíduos 1-96 de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 578, 613 e 621; uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 98% de identidade de seqüência aos resíduos 1-96 de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 577, 579, 590, 602, 616 e 707.

O termo polipeptídeo de GAT” ainda se refere a

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46/314 qualquer polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 89% de identidade de seqüência aos resíduos 51-146 de uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 677; uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de seqüência aos resíduos 51-146 de uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 697; uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 96% de identidade de seqüência aos resíduos 51-146 de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 584, 612 e 721; uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 97% de identidade de seqüência aos resíduos 51-146 de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 578, 613 e 621; uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 98% de identidade de seqüência aos resíduos 51-146 de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 577, 579, 590, 602, 616 e 707.

O termo “polipeptídeo de GAT” ainda se refere a qualquer polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 919; (b) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica aos resíduos 2146 de SEQ ID NO: 929; (c) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 847; (d) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 851; (e) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 853; (f) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2

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146 de SEQ ID NO: 855 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 835 ou 855) ; (g) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 857;

(h) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 861; (i) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 871; (j) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2146 de SEQ ID NO: 875; (k) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 881; (l) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 885; (m) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 887; (n) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2146 de SEQ ID NO: 889; (o) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 893; (p) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 897; (q) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 899; (r) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2146 de SEQ ID NO: 909; (s) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 911; (t) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 837; (u) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 841; (v) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica aos resíduos 2146 de SEQ ID NO: 865; (w) uma seqüência de aminoácidos que

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48/314 é pelo menos 99% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 8 69; e (x) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica aos resíduos 2-146 de SEQ ID NO: 879.

O termo “polipeptídeo de GAT” ainda se refere a qualquer polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos resíduos 2146 de SEQ ID NO: 929 e o qual compreende um resíduo Gly ou Asn na posição de aminoácido correspondendo à posição 33 de SEQ ID NO: 929.

O termo “polipeptídeo	de	GAT”	ainda	se	refere	a
qualquer polipeptídeo compreendendo	uma	seqüência		de
aminoácidos que compartilha	pelo	menos	60%,	65%,	70%,	75	%,
80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%	, 86%	, 87%,	88%,	89%,	90%,	91	%,
92%, 93%, 94%, 95%, 96%,	97%	, 98%	, 99%	ou	mais		de

identidade de seqüência a um polipeptídeo de GAT exemplificativo divulgado aqui. Assim, por exemplo, polipeptídeos de GAT da invenção incluem polipeptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácidos que compartilha pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NO: 953, 954, 955, 956, 957, 958, 959, 960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971 e 972 .

Conforme usado aqui, o termo “identidade” ou “identidade percentual”, quando usado com relação a um par de seqüência de aminoácidos alinhada em particular, se refere à identidade percentual de seqüência de aminoácidos que é obtida através de análise pelo ClustalW (versão W 1.8 disponível da European Bioinformatics Institute, Cambridge,

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UK), contagem do número de combinações idênticas no alinhamento e divisão de tal número de combinações idênticas pelo maior de (i) o comprimento das seqüências alinhadas e (ii) usando os seguintes parâmetros de default no ClustalW para se obter alinhamentos de pares precisos/lentos - Penalidade por Abertura de Gap: 10; Penalidade por Extensão de Gap: 0,10; matriz de peso de proteína: série Gonnet; matriz de peso de DNA: IUB; alinhamentos de par Toggle Slow/Fast = Alinhamento SLOW ou FULL.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende pelo menos 20 ou alternativamente, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 130, pelo menos 135, pelo menos 140, pelo menos 141, pelo menos 142, pelo menos 143, pelo menos 144 ou pelo menos 145 aminoácidos contínuos de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 577; (b) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 578; (c) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 621; (d) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 579;

(e) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 602; (f) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 697; (g) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 721; (h) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 613; (i) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 89% idêntica à SEQ ID NO: 677;

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50/314 (j) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 584; (k) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 707; (l) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à 5 SEQ ID NO: 616; (m) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 612; e (n) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 590.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um

	polipeptídeo	compreendendo	os resíduos 2-146	de	uma
10	seqüência de	aminoácidos selecionada do grupo consistindo
	de SEQ ID NO:	568, 569, 570,	571, 572, 573, 574,	575,	576,
	577, 578, 579,	580, 581, 582,	583, 584, 585, 586,	587,	588,
	589, 590, 591,	592, 593, 594,	595, 596, 597, 598,	599,	600,
	601, 602, 603,	604, 605, 606,	607, 608, 609, 610,	611,	612,
15	613, 614, 615,	616, 617, 618,	619, 621, 623, 625,	627,	629,
	631, 633, 635,	637, 639, 641,	643, 645, 647, 649,	651,	653,
	655, 657, 659,	661, 663, 665,	667, 669, 671, 673,	675,	677,
	679, 681, 683,	685, 687, 689,	691, 693, 695, 697,	699,	701,
	703, 705, 707,	709, 711, 713,	715, 717, 719,721,	723,	725,
20	727, 729, 731	, 733, 735, 737, 739, 741, 743,	745,	747,
	749, 751, 753,	755, 757, 759,	761, 763, 765, 767,	769,	771,
	773, 775, 777,	779, 781, 783,	785, 787, 789, 791,	793,	795,
	797, 799, 801,	803, 805, 807,	809, 811, 813, 815,	817,	819,
	821, 823 e 82	5. Em algumas	modalidades da invenção,	uma
25	seqüência de	aminoácidos do	polipeptídeo compreende	Met,
	Met-Ala ou	Met-Ala-Ala sobre o lado N-terminal	do

aminoácido correspondendo à posição 2 de uma seqüência de aminoácidos de referência.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção podem ser otimamente alinhados com uma seqüência de

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51/314 aminoácidos de referência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO:300, 445 e 457 para gerar um escore de similaridade de pelo menos 460 usando a Matriz BLOSUM62,

uma penalidade	por	existência	de	gap	de	11 e	uma
penalidade	por	extensão de gap	de	1, em	que	pelo menos
uma das	seguintes	posições se conforma	às	seguintes
restrições	: (i)	nas	posições 18	e 38,	existe	um	resíduo	de
aminoácido	Z5;	(ii)	na posição	62,	existe	um	resíduo	de
aminoácido	Z1;	(iii)	na posição	124,	existe	um	resíduo	de
aminoácido	Z6;	e (iv	) na posição	144,	existe	um	resíduo	de
aminoácido	Z2,	em	que: Z1 é	um resíduo	de	aminoácido
selecionado do	grupo	consistindo	de A,	I, L,	M e	V; Z2 é	um
resíduo de	aminoácido selecionado do	grupo	consistindo	de
F, W e Y;	Z5	é um	resíduo de	aminoácido	selecionado	do

grupo consistindo de D e E; e Z6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P e ainda em que dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que corresponde às seguintes posições, pelo menos 90% se

conformam às seguintes	restrições:	(a)	nas	posições 2, 4,
15,	19, 26, 28, 31, 45	, 51, 54, 86	, 90	, 91	, 97, 103, 105,
106,	114, 123, 129, 139	e/ou 145, o	resíduo	de aminoácido é
B1;	e (b) nas posições	3, 5, 8, 10,	11,	14,	17, 24, 27, 32,
37,	47, 48, 49, 52, 57,	58, 61, 63,	68,	69,	79, 80, 82, 83,
89,	92, 100, 101, 104,	119, 120,	125,	126,	128, 131 e/ou
143,	o resíduo de aminoácido é	B2;	em	que B1 é um

aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M, F, W, Y e V; e B2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, N, D, C, Q, E, G, H, K, P, S e T. Quando usadas para especificar um aminoácido ou resíduo de aminoácido, as letras A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N,

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P, Q, R, S, T, V, W e Y têm seu significado padrão conforme usado na técnica e conforme proporcionado na Tabela 1 aqui.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção podem ser otimamente alinhados com uma seqüência de aminoácidos de referência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 300, 445 e 457 para gerar um escore de similaridade de pelo menos 460 usando a Matriz BLOSUM62, uma penalidade por existência de gap de 11 e uma penalidade por extensão de gap de 1, em que pelo menos uma das seguintes posições se conforma às seguintes restrições: (i) nas posições 18 e 38, existe um resíduo de aminoácido Z5; (ii) na posição 62, existe um resíduo de aminoácido Z1; (iii) na posição 124, existe um resíduo de aminoácido Z6; e (iv) na posição 144, existe um resíduo de aminoácido Z2, em que: Z1 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P e ainda em que, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que corresponde às seguintes posições, pelo menos 80% se conformam às seguintes restrições: (a) nas posições 2, 4, 15, 19, 26, 28, 51, 54, 86, 90, 91, 97, 103,

105, 106, 114, 129, 139 e/ou 145, o resíduo de aminoácido é

Z1; (b) nas posições 31 e/ou 45, o resíduo de aminoácido é

Z2; (c) na posição 8, o resíduo de aminoácido é Z3; (d) na posição 89, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z6; (e) nas posições 82, 92, 101 e/ou 120, o resíduo de aminoácido é Z4; (f) nas posições 3, 11, 27 e/ou 79, o resíduo de

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53/314 aminoácido é Z5; (g) na posição 18, o resíduo de aminoácido é Z4 ou Z5; (h) na posição 123, o resíduo de aminoácido é Z1 ou Z2; (i) nas posições 12, 33, 35, 39, 53, 59, 112, 132, 135, 140 e/ou 146, o resíduo de aminoácido é Z1 ou Z3;

(j) na posição 30, o resíduo de aminoácido é Z1; (k) na posição 6, o resíduo de aminoácido é Z6; (l) na posição

81, o resíduo de aminoácido é Z2 ou Z4; (m) na posição 113, o resíduo de aminoácido é Z3; (n) na posição 138, o resíduo de aminoácido é Z4; (o) na posição 142, o resíduo de aminoácido é Z2; (p) nas posições 57 e/ou 126, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z4; (q) na posição 5, 17, e 61, o resíduo de aminoácido é Z4; (r) na posição 24, o resíduo de aminoácido é Z3; (s) na posição 104, o resíduo de aminoácido é Z5; (t) nas posições 52 e/ou 69, o resíduo de aminoácido é Z3; (u) nas posições 14 e/ou 119, o resíduode aminoácido é Z5; (v) nas posições 10, 32, 63 e/ou 83, o resíduo de aminoácido é Z5; (w) nas posições 48 e/ou 80, o resíduo de aminoácido é Z6; (x) na posição 40, o resíduode aminoácido é Z1 ou Z2; (y) na posição 96, o resíduode aminoácido é Z3 ou Z5; (z) na posição 65, o resíduode aminoácido é Z3, Z4 ou Z6; (aa) nas posições 84 e/ou 115, o resíduo de aminoácido é Z3; (ab) na posição 93, o resíduo de aminoácido é Z4; (ac) na posição 130, o resíduode aminoácido é Z2; (ad) na posição 58, o resíduo de aminoácido é Z3, Z4 ou Z6; (ae) na posição 47, o resíduo de

aminoácido	é Z4 ou Z6	;	(af) nas posições	49 e/ou	100,	o
resíduo	de	aminoácido	é	Z3	ou	Z4; (ag) na	posição	68,	o
resíduo	de	aminoácido	é	Z4	ou	Z5; (ah) na	posição	143,	o
resíduo	de	aminoácido	é	Z4;	(ai	) na posição	131, o resíduo
de aminoácido é Z5;	(aj)	nas	posições 125 e/ou	128,	o

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resíduo de	aminoácido	é Z5; (ak) na posição	67,	o resíduo
de aminoácido	é Z3 ou	Z4;	(al)	na posição 60	, o	resíduo de
aminoácido	é	Z5; e	(am)	na	posição 37,	o	resíduo de
aminoácido	é	Z4 ou	Z6;	em	que Z1 é	um	aminoácido
selecionado	do	grupo consistindo de A, I, L,	M e	V; Z2 é um

aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z3 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de N, Q, S e T; Z4 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, He K; Z5 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção ainda compreendem o resíduo de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que corresponde às posições especificadas em (a)-(am), em que pelo menos 90% se conformam às restrições de resíduos de aminoácido especificadas em (a)-(am).

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem, adicionalmente, resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, em que pelo menos 90% se conformam às seguintes restrições: (a) nas posições 1, 7, 9, 13, 20, 36, 42, 46, 50, 56, 64, 70, 72, 75, 76, 78, 94, 98, 107, 110, 117, 118, 121 e/ou 141, o resíduo de aminoácido é B1; e (b) nas posições 16, 21, 22, 23, 25, 29, 34, 41, 43, 44, 55, 66, 71, 73, 74, 77, 85, 87, 88, 95, 99, 102, 108, 109, 111, 116, 122, 127, 133, 134, 136 e/ou 137, o resíduo de aminoácido é B2; em que B1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M, F, W, Y e V; e B2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, N, D, C, Q, E, G, H, K, P, S e T.

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Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem, adicionalmente, resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, em que pelo menos 90% se conformam às seguintes restrições: (a) nas posições 1, 7, 9, 13, 20, 42, 46, 50, 56, 64, 70, 72, 75, 76, 78, 94, 98, 107, 110, 117, 118, 121 e/ou 141, o resíduo de aminoácido é B1; e (b) nas posições

16,	21, 22,	23,	25, 29, 34, 36, 41, 43,	44, 55,	66, 71, 73,
74,	77, 85,	87	, 88, 95, 99,102, 108,	109, 111	, 116, 122,
127	, 133, 134,	136 e/ou 137, o resíduo	de aminoácido é B2;
em	que B1 é	um	aminoácido selecionado	do grupo	consistindo
de	A, I,	L,	M, F, W, Y e V; e	B2 é um	aminoácido
selecionado	do	grupo consistindo de R,	N, D, C,	Q, E, G, H,
K,	P, S e T

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem, adicionalmente, resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, em que pelo menos 90% se conformam às seguintes restrições: (a) nas posições 1, 7, 9, 20, 42, 50, 72, 75,

76, 78, 94, 98, 110, 121 e/ou 141, o resíduo de aminoácido é Z1; (b) nas posições 13, 46, 56, 70, 107, 117, e/ou 118, o resíduo de aminoácido é Z2; (c) nas posições 23, 55, 71,

77, 88 e/ou 109, o resíduo de aminoácido é Z3; (d) nas posições 16, 21, 41, 73, 85, 99 e/ou 111, o resíduo de aminoácido é Z4; (e) nas posições 34 e/ou 95, o resíduo de aminoácido é Z5; (f) na posição 22, 25, 29, 43, 44, 66, 74, 87, 102, 108, 116, 122, 127, 133, 134, 136 e/ou 137, o resíduo de aminoácido é Z6; em que Z1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z3

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56/314 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de N, Q, S e T; Z4 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, He K; Z5 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção ainda compreendem um resíduo de aminoácido na posição 36 o qual é selecionado do grupo consistindo de Z1 e Z3. Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção ainda compreendem um resíduo de aminoácido na posição 64 o qual é selecionado do grupo consistindo de Z1 e Z2.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção ainda compreendem resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, em que pelo menos 80% se conformam às seguintes restrições: (a) na posição 2, o resíduo de aminoácido é I ou L; (b) na posição 3, o resíduo de aminoácido é E; (c) na posição 4, o resíduo de aminoácido é V ou I; (d) na posição 5, o resíduo de aminoácido é K; (e) na posição 6, o resíduo de aminoácido é P; (f) na posição 8, o resíduo de aminoácido é

N; (g)	na	posição 10, o	resíduo de aminoácido	é E;	(h)	na
posição	11, o resíduo	de aminoácido é	D	ou	E;	(i)	na
posição	12	, o resíduo de	aminoácido é T;	(j)	na	posição	14,
o resíduo	de aminoácido	é E ou D; (k)	na	posição	15	, o

resíduo de aminoácido é L; (l) na posição 17, o resíduo de aminoácido é H; (m) na posição 18, o resíduo de aminoácido é R, E ou K; (n) na posição 19, o resíduo de aminoácido é I ou V; (o) na posição 24, o resíduo de aminoácido é Q; (p) na posição 26, o resíduo de aminoácido é M, L, V ou I; (q) na posição 27, o resíduo de aminoácido é E; (r) na posição

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28, o resíduo de aminoácido é A ou V; (s) na posição 30, o

resíduo de	aminoácido é	M;	(t)	na posição 31	, o	resíduo	de
aminoácido	é	Y	ou	F;	(u)	na	posição 32,	o	resíduo	de
aminoácido	é	E	ou	D;	(v)	na	posição 33,	o	resíduo	de
aminoácido	é	T	ou	S;	(w)	na	posição 35,	o	resíduo	de
aminoácido	é	L;	(x)	na	posição	37, o resíduo	de	aminoácido
é R, G, E	ou	Q;	(y)	na	posição	39, o resíduo	de	aminoácido
é A ou S;	(z)	na	posição 40,	o	resíduo de aminoácido é F	ou

L; (aa) na posição 45, o resíduo de aminoácido é Y ou F; (ab) na posição 47, o resíduo de aminoácido é R ou G; (ac) na posição 48, o resíduo de aminoácido é G; (ad) na posição 49, o resíduo de aminoácido é K, R ou Q; (ae) na posição 51, o resíduo de aminoácido é I ou V; (af) na posição 52, o resíduo de aminoácido é S; (ag) na posição 53, o resíduo de aminoácido é I ou V; (ah) na posição 54, o resíduo de aminoácido é A; (ai) na posição 57, o resíduo de aminoácido é H ou N; (aj) na posição 58, o resíduo de aminoácido é Q,

K, R ou	P;	(ak)	na posição	59, o resíduo	de	aminoácido é	A;
(al) na	posição 60, o	res	íduo de aminoácido é	E;	(am)	na
posição	61,	o	resíduo	de	aminoácido	é	H	ou	R;	(an)	na
posição	63,	o	resíduo	de	aminoácido	é	E	ou	D;	(ao)	na
posição	65,	o	resíduo	de	aminoácido é	E	,	P ou	Q;	(ap)	na
posição	67,	o	resíduo	de	aminoácido	é	Q	ou	R;	(aq)	na
posição	68,	o	resíduo	de	aminoácido	é	K	ou	E;	(ar)	na
posição	69,	o	resíduo	de	aminoácido é	Q	;	(as)	na	posição

79, o resíduo de aminoácido é E; (at) na posição 80, o resíduo de aminoácido é G; (au) na posição 81, o resíduo de aminoácido é Y, H ou F; (av) na posição 82, o resíduo de aminoácido é R; (aw) na posição 83, o resíduo de aminoácido é E ou D; (ax) na posição 84, o resíduo de aminoácido é Q;

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(ay) na posição 86	, o	resíduo de aminoácido	é	A; (az)	na
posição 89	, o	resíduo >	de aminoácido é G, T ou	S; (ba)	na
posição 90	, o	resíduo	de aminoácido é L; (bb)	na posição
91, o resíduo	de aminoácido	é L, I ou V; (bc)	na posição
92, o resíduo	de aminoácido	é R ou K; (bd) na	posição 93,	o
resíduo de	aminoáci	do é	H; (be) na posição 96,	o resíduo	de
aminoácido	é	E ou	Q;	(bf)	na posição 97,	o	resíduo	de
aminoácido	é	I;	(bg)	na	posição 100, o		resíduo	de
aminoácido	é	K ou	N ;	(bh)	na posição 101,	o	resíduo	de
aminoácido	é	K ou	R;	(bi)	na posição 103,	o	resíduo	de
aminoácido	é	A ou	V;	(bj)	na posição 104,	o	resíduo	de
aminoácido	é	D;	(bk)	na	posição 105, o		resíduo	de
aminoácido	é M, L <	ou I;	; (bl	) na posição 106,	o	resíduo	de
aminoácido	é	L;	(bm)	na	posição 112, o		resíduo	de
aminoácido	é	T ou	A;	(bn)	na posição 113,	o	resíduo	de
aminoácido	é	S ou	T;	(bo)	na posição 114,	o	resíduo	de
aminoácido	é	A;	(bp)	na	posição 115, o		resíduo	de
aminoácido	é	S;	(bq)	na	posição 119, o		resíduo	de
aminoácido	é	K ou	R;	(br)	na posição 120,	o	resíduo	de
aminoácido	é	K ou	R;	(bs)	na posição 123,	o	resíduo	de
aminoácido	é	F ou	L;	(bt)	na posição 125,	o	resíduo	de
aminoácido	é	E;	(bu)	na	posição 126, o		resíduo	de
aminoácido	é	Q ou	H;	(bv)	na posição 128,	o	resíduo	de
aminoácido	é	E ou	D;	(bw)	na posição 129,	o	resíduo	de
aminoácido	é	V ou	I;	(bx)	na posição 130,	o	resíduo	de
aminoácido	é	F;	(by)	na	posição 131, o		resíduo	de
aminoácido	é	D ou	E;	(bx)	na posição 132,	o	resíduo	de
aminoácido	é	T;	(ca)	na	posição 135, o		resíduo	de
aminoácido	é	V;	(cb)	na	posição 138, o		resíduo	de
aminoácido	é	H;	(cc)	na	posição 139, o		resíduo	de

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 66/331

59/314

aminoácido	é	I;	(cd)	na	posição 140, o	resíduo	de
aminoácido	é	L	ou	M;	(ce)	na posição 142,	o	resíduo	de
aminoácido	é		Y;	(cf)	na	posição 143, o		resíduo	de
aminoácido	é	K	ou	R;	(cg)	na posição 145,	o	resíduo	de
aminoácido	é	L	ou	I; e	(ch)	na posição 146,	o	resíduo	de

aminoácido é T.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção ainda compreendem resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às posições especificadas em (a) - (ch) acima, em que pelo menos 90% se conformam às restrições de resíduos de aminoácidos especificadas em (a) - (ch).

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção podem ser otimamente alinhados com uma seqüência de aminoácidos de referência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 300, 445 e 457 para gerar um escore de similaridade de pelo menos 460 usando a matriz BLOSUM62,

uma penalidade	por	existência	de	gap	de	11 e	uma
penalidade	por	extensão de gap	de	1, em	que	pelo menos
uma das	seguintes	posições se conforma	às	seguintes
restrições	: (i)	nas	posições 18	e 38,	existe	um	resíduo	de
aminoácido	Z5;	(ii)	na posição	62,	existe	um	resíduo	de
aminoácido	Z1;	(iii)	na posição	124,	existe	um	resíduo	de
aminoácido	Z6;	e (iv	) na posição	144,	existe	um	resíduo	de
aminoácido	Z2;	em	que: Z1 é	um resíduo	de	aminoácido
selecionado do	grupo	consistindo	de A,	I, L,	M e	V; Z2 é	um
resíduo de	aminoácido selecionado do	grupo	consistindo	de
F, W e Y;	Z5	é um	resíduo de	aminoácido	selecionado	do

grupo consistindo de D e E; e Z6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P e ainda em

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 67/331

60/314 que, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, pelo menos 80% se conformam às seguintes restrições: (a) nas posições 9, 76, 94 e 110, o resíduo de aminoácido é A; (b) nas posições 29 e 108, o resíduo de aminoácido é C; (c) na posição 34, o resíduo de aminoácido é D; (d) na posição 95, o resíduo de aminoácido é E; (e) na posição 56, o resíduo de aminoácido é F; (f) nas posições 43, 44, 66, 74, 87, 102, 116, 122, 127 e 136, o resíduo de aminoácido é G; (g) na posição 41, o resíduo de aminoácido é H; (h) na posição 7, o resíduo de aminoácido é I; (i) na posição 85, o resíduo de aminoácido é K; (j) nas posições 20, 42, 50, 78 e 121, o resíduo de aminoácido é L; (k) nas posições 1 e 141, o resíduo de aminoácido é M; (l) nas posições 23 e 109, o resíduo de aminoácido é N; (m) nas posições 22, 25, 133, 134 e 137, o resíduo de aminoácido é P; (n) na posição 71, o resíduo de aminoácido é Q; (o) nas posições 16, 21, 73, 99 e 111, o resíduo de aminoácido é R; (p) na posição 55, o resíduo de aminoácido é S; (q) na posição 77, o resíduo de aminoácido é T; (r) na posição 107, o resíduo de aminoácido é W; e (s) na posição 13, 46, 70 e 118, o resíduo de aminoácido é Y.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção ainda compreendem seqüências de aminoácidos em que os resíduos de aminoácidos vão de encontro a pelo menos uma das seguintes restrições: (a) na posição 36, o resíduo de

aminoácido

é

M,

L

ou

T;

(b)

na

posição

72,

o

resíduo

de

aminoácido

é

L

ou

I;

(c)

na

posição

75,

o

resíduo

de

aminoácido

é

M

ou

V;

(d)

na

posição

64,

o

resíduo

de

aminoácido

é

L,

I

ou

F;

(e)

na

posição

88,

o

resíduo

de

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 68/331

61/314 aminoácido é T ou S; e (f) na posição 117, o resíduo de aminoácido é Y ou F.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem uma seqüência de aminoácidos em que os resíduos de aminoácidos vão de encontro a pelo menos uma das seguintes restrições adicionais: (a) na posição 14, o resíduo de aminoácido é D; (b) na posição 18, o resíduo de aminoácido é E; (c) na posição 26, o resíduo de aminoácido é M ou V; (e) na posição 30, o resíduo de aminoácido é I; (f) na posição 32, o resíduo de aminoácido é D; (g) na posição 36, o resíduo de aminoácido é M ou T; (i) na posição 37, o resíduo de aminoácido é C; (j) na posição 38, o resíduo de aminoácido é D; (j) na posição 53, o resíduo de aminoácido é V; (k) na posição 58, o resíduo de aminoácido é R; (l) na posição 61, o resíduo de aminoácido é R; (m) na posição 62, o resíduo de aminoácido é L; (n) na posição 64, o resíduo de aminoácido é I ou F; (o) na posição 65, o resíduo de aminoácido é P; (p) na posição 72, o resíduo de aminoácido é I; (q) na posição 75, o resíduo de aminoácido é V; (r) na posição 88, o resíduo de aminoácido é T; (s) na posição 89, o resíduo de aminoácido é G; (t) na posição 91, o resíduo de aminoácido é L; (u) na posição 98, o resíduo de aminoácido é I; (v) na posição 105, o resíduo de aminoácido I; (w) na posição 112, o resíduo de aminoácido é A; (x) na posição 124, o resíduo de aminoácido é G ou C; (y) na posição 128, o resíduo de aminoácido é D; (z) na posição 140, o resíduo de aminoácido é M; (aa) na posição 143, o resíduo de aminoácido é R; e (ab) na posição 144, o resíduo de aminoácido é W.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção

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62/314 compreendem uma seqüência de aminoácidos em que, dos resíduos de aminoácidos que correspondem às posições especificadas em (a) a (ab) conforme descrito acima, pelo menos 80% se conformam às restrições de resíduos de aminoácido especificadas em (a) a (ab).

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção têm uma seqüência de aminoácidos que compreende resíduos de aminoácidos, pelo menos um dos quais vai de encontro às seguintes restrições adicionais: (a) na posição 41, o resíduo de aminoácido é H; (b) na posição 138, o resíduo de aminoácido é H; (c) na posição 34, o resíduo de aminoácido é N; e (d) na posição 55, o resíduo de aminoácido é S.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 577; (b) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 578; (c) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 621; (d) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 579; (e) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 602; (f) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 697; (g) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 721; (h) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 613; (i) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 89% idêntica à SEQ ID NO: 677; (j) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 584; (k) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 707; (l) uma

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 70/331

63/314 seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 616; (m) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 612; e (n) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 590.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 577; (b) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 578; (c) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 621; (d) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 579; (e) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 602; (f) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 697; (g) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 721; (h) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 613; (i) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 89% idêntica à SEQ ID NO: 677;

(j) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 584; (k) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 707; (l) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 616; (m) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 612; e (n) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 590, em que pelo menos uma das seguintes posições ainda se conforma às seguintes restrições: (i) nas posições 18 e 38, existe um resíduo de aminoácido Z5; (ii) na posição 62, existe um resíduo de aminoácido Z1; (iii) na posição 124,

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 71/331

64/314 existe um resíduo de aminoácido Z6; e (iv) na posição 144, existe um resíduo de aminoácido Z2, em que: Z1 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 577; (b) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 578; (c) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 621; (d) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 579; (e) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 602; (f) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 697; (g) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 721; (h) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 613; (i) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 89% idêntica à SEQ ID NO: 677; (j) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 584; (k) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 707; (l) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 616; (m) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 612; e (n) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 590,

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 72/331

65/314 em que, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, pelo menos 90% se conformam às seguintes restrições adicionais:

(a) nas posições 2, 4, 15, 19, 26, 28, 31, 45, 51, 54, 86,

90, 91, 97, 103, 105, 106, 114, 123, 129, 139 e/ou 145, o resíduo de aminoácido é B1; e (b) nas posições 3, 5, 8, 10,

11,	14, 17,	24,	27, 32, 37, 47, 48, 49,	52, 57,	58, 61, 63,
68,	69, 79,	80	, 82, 83, 89, 92, 100,	101, 104	, 119, 120,
125	, 126, 128,	131 e/ou 143, o resíduo	de aminoácido é B2;
em	que B1 é	um	aminoácido selecionado	do grupo	consistindo
de	A, I,	L,	M, F, W, Y e V; e	B2 é um	aminoácido
selecionado	do	grupo consistindo de R,	N, D, C,	Q, E, G, H,
K,	P, S e T

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 577; (b) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 578; (c) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 621; (d) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 579; (e) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 602; (f) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 697; (g) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 721; (h) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 613; (i) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 89% idêntica à SEQ ID NO: 677; (j) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 584; (k) uma seqüência de aminoácidos

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 73/331

66/314 que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 707; (l) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 616; (m) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 612; e (n) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 590, em que, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, pelo menos 80% se conformam às seguintes restrições adicionais:

(a) nas posições 2, 4, 15, 19, 26, 28, 51, 54, 86, 90, 91, 97, 103, 105, 106, 114, 129, 139 e/ou 145, o resíduo de aminoácido é Z1; (b) nas posições 31 e/ou 45, o resíduo de aminoácido é Z2; (c) na posição 8, o resíduo de aminoácido é Z3; (d) na posição 89, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z6; (e) nas posições 82, 92, 101 e/ou 120, o resíduo de aminoácido é Z4; (f) nas posições 3, 11, 27 e/ou 79, o resíduo de aminoácido é Z5; (g) na posição 18, o resíduo de aminoácido é Z4 ou Z5; (h) na posição 123, o resíduo de aminoácido é Z1 ou Z2; (i) nas posições 12, 33, 35, 39, 53, 59, 112, 132, 135, 140 e/ou 146, o resíduo de aminoácido é Z1 ou Z3; (j) na posição 30, o resíduo de aminoácido é Z1;

(k) na	posição	6, o resíduo de aminoácido	é	Z6;	(l)	na
posição	81, o	resíduo de aminoácido é Z2	ou	Z4;	(m)	na
posição	113, o	resíduo de aminoácido é Z3;	(n)	na	posição
138, o	resíduo	de aminoácido é Z4; (o) na	posição	142,	o

resíduo de aminoácido é Z2; (p) nas posições 57 e/ou 126, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z4; (q) na posição 5, 17 e 61, o resíduo de aminoácido é Z4; (r) na posição 24, o resíduo de aminoácido é Z3; (s) na posição 104, o resíduo de aminoácido é Z5; (t) nas posições 52 e/ou 69, o resíduo de aminoácido é Z3; (u) nas posições 14 e/ou 119, o resíduo

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 74/331

67/314 de aminoácido é Z5; (v) nas posições 10, 32, 63 e/ou 83, o resíduo de aminoácido é Z5; (w) nas posições 48 e/ou 80, o resíduo de aminoácido é Z6; (x) na posição 40, o resíduo de aminoácido é Z1 ou Z2; (y) na posição 96, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z5; (z) na posição 65, o resíduo de aminoácido é Z3, Z4 ou Z6; (aa) nas posições 84 e/ou 115, o resíduo de aminoácido é Z3; (ab) na posição 93, o resíduo de aminoácido é Z4; (ac) na posição 130, o resíduo de aminoácido é Z2; (ad) na posição 58, o resíduo de aminoácido é Z3, Z4 ou Z6; (ae) na posição 47, o resíduo de aminoácido é Z4 ou Z6; (af) nas posições 49 e/ou 100,o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z4; (ag) na posição 68,o resíduo de aminoácido é Z4 ou Z5; (ah) na posição 143,o resíduo de aminoácido é Z4; (ai) na posição 131, o resíduo de aminoácido é Z5; (aj) nas posições 125 e/ou 128, o resíduo de aminoácido é Z5; (ak) na posição 67, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z4; (al) na posição 60, o resíduo de aminoácido é Z5; e (am) na posição 37, o resíduo de aminoácido é Z4 ou Z6; em que Z1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z3 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de N, Q, S e T; Z4 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, He K; Z5 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção ainda compreendem resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às posições especificadas em (a)-(am), em que pelo menos 90% se conformam às

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 75/331

68/314 restrições de resíduos de aminoácido especificadas em (a)(am) .

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, em que pelo menos 90% se conformam às seguintes restrições

adicionais:	(a)	nas posições	1, 7, 9,	13,	20, 36, 42,	46,
50,	56, 64,	70,	72, 75, 76, 7	8, 94, 98,	107	, 110, 117,	118,
121	e/ou 141,	o resíduo de	aminoácido é	B1; e (b)	nas
posições 16	, 21	, 22, 23, 25,	29, 34,	41,	43, 44, 55,	66,
71,	73, 74,	77,	85, 87, 88,	95, 99,	102,	108, 109,	111,
116,	122,	127,	133, 134,	136 e/ou	137,	o resíduo	de

aminoácido é B2; em que B1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M, F, W, Y e V; e B2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, N, D, C, Q, E, G, H, K, P, S e T.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem resíduos de aminoácidos em uma seqüência de

aminoácidos	que	correspondem às	seguintes posições, em	que
pelo menos	90	% se conformam	às seguintes restrições
adicionais:	(a)	nas	posições 1,	7, 9, 13, 20, 42, 46,	50,
56, 64, 70,	72,	75,	76, 78, 94,	98, 107, 110, 117, 118,	121
e/ou 141, o	resíduo	de aminoácido é B1; e (b) nas posições
16, 21, 22,	23,	25,	29, 34, 36,	41, 43, 44, 55, 66, 71,	73,
74, 77, 85,	87,	88	, 95, 99,102	, 108, 109, 111, 116,	122,
127, 133, 134,	136	e/ou 137, o	resíduo de aminoácido é	B2;

em	que	B1 é	um	aminoácido selecionado	do	grupo	consistindo
de	A,	I,	L,	M, F,	W, Y e V;	e	B2	é um	aminoácido
selecionado	do	grupo	consistindo de	R,	N,	D, C,	Q, E, G, H,

K, P, S e T.

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 76/331

69/314

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições em que pelo menos 90% se conformam às seguintes restrições adicionais: (a) nas posições 1, 7, 9, 20, 42, 50, 72, 75,

76, 78, 94, 98, 110, 121 e/ou 141, o resíduo de aminoácido é Z1; (b) nas posições 13, 46, 56, 70, 107, 117 e/ou 118, o resíduo de aminoácido é Z2; (c) nas posições 23, 55, 71,

77, 88 e/ou 109, o resíduo de aminoácido é Z3; (d) nas posições 16, 21, 41, 73, 85, 99 e/ou 111, o resíduo de aminoácido é Z4; (e) nas posições 34 e/ou 95, o resíduo de aminoácido é Z5; (f) na posição 22, 25, 29, 43, 44, 66, 74, 87, 102, 108, 116, 122, 127, 133, 134, 136 e/ou 137, o resíduo de aminoácido é Z6; em que Z1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z3 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de N, Q, S e T; Z4 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, He K; Z5 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção ainda compreendem uma seqüência de aminoácidos em que o resíduo de aminoácido na posição 36 é selecionado do grupo consistindo de Z1 e Z3. Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção ainda compreendem uma seqüência de aminoácidos em que o resíduo de aminoácido na posição 64 é selecionado do grupo consistindo de Z1 e Z2.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem uma seqüência de aminoácidos em que, dos

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resíduos	de aminoácidos que	correspondem	às	seguintes
posições,	pelo menos	8 0% se	! conformam	às	seguintes
restrições	adicionais:	(a) na	posição 2,	o	resíduo de
aminoácido	é I ou L;	(b) na	posição 3,	o	resíduo de
aminoácido	é E; (c) na	posição 4	, o resíduo	de aminoácido é

V ou I; (d) na posição 5, o resíduo de aminoácido é K; (e) na posição 6, o resíduo de aminoácido é P; (f) na posição 8, o resíduo de aminoácido é N; (g) na posição 10, o resíduo de aminoácido é E; (h) na posição 11, o resíduo de aminoácido é D ou E; (i) na posição 12, o resíduo de aminoácido é T; (j) na posição 14, o resíduo de aminoácido é E ou D; (k) na posição 15, o resíduo de aminoácido é L;

(l) na posição 17, o resíduo de aminoácido é H; (m) na posição 18, o resíduo de aminoácido é R, E ou K; (n) na posição 19, o resíduo de aminoácido é I ou V; (o) na

posição 24, o	resíduo de	aminoácido é Q;	(p)	na	posição	26,
o resíduo de	aminoácido	é M,	L, V ou I;	(q)	na	posição	27,
o resíduo de	aminoácido	é E;	(r) na posição	28	, o resíduo
de aminoácido	é A ou V;	(s)	na posição	30,	o	resíduo	de

aminoácido é M; (t) na posição 31, o resíduo de aminoácido é Y ou F; (u) na posição 32, o resíduo de aminoácido é E ou

D; (v) na posição 33, o resíduo de aminoácido é T ou S; (w) na posição 35 o resíduo de aminoácido é L; (x) na posição

37, o resíduo de aminoácido

39, o resíduo de aminoácido

resíduo	de	aminoácido	é	F
resíduo	de	aminoácido	é	Y
resíduo	de	aminoácido	é	R

é R,	G,	E ou	Q;	(y) na posição
é A	ou	S; (z)	na	posição	40,	o
ou	L;	(aa)	na	posição	45,	o
ou	F;	(ab)	na	posição	47,	o
ou	G;	(ac)	na	posição	48,	o

o resíduo de resíduo de aminoácido é G; (ad) na posição 49 aminoácido é K, R ou Q; (ae) na posição 51, o resíduo de

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71/314 aminoácido é I ou V; (af) na posição 52, o resíduo de aminoácido é S; (ag) na posição 53, o resíduo de aminoácido é I ou V; (ah) na posição 54, o resíduo de aminoácido é A; (ai) na posição 57, o resíduo de aminoácido é H ou N; (aj) na posição 58, o resíduo de aminoácido é Q, K, R ou P; (ak) na posição 59, o resíduo de aminoácido é A; (al) na posição 60, o resíduo de aminoácido é E; (am) na posição 61, o resíduo de aminoácido é H ou R; (an) na posição 63, o resíduo de aminoácido é E ou D; (ao) na posição 65,o resíduo de aminoácido é E, P ou Q; (ap) na posição 67, o resíduo de aminoácido é Q ou R; (aq) na posição 68,o resíduo de aminoácido é K ou E; (ar) na posição 69,o resíduo de aminoácido é Q; (as) na posição 79, o resíduo de aminoácido é E; (at) na posição 80, o resíduo de aminoácido é G; (au) na posição 81, o resíduo de aminoácido é Y, H ou F; (av) na posição 82, o resíduo de aminoácido é R; (aw) na posição 83, o resíduo de aminoácido é E ou D; (ax) na posição 84, o resíduo de aminoácido é Q; (ay) na posição 86, o resíduo de aminoácido é A; (az) na posição 89, o resíduo de aminoácido é G, T ou S; (ba) na posição 90, o resíduo de aminoácido é L; (bb) na posição 91, o resíduo de aminoácido é L, I ou V; (bc) na posição 92, o resíduo de aminoácido é R ou K; (bd) na posição 93, o resíduo de aminoácido é H; (be) na posição 96, o resíduo de aminoácido é E ou Q; (bf) na posição 97, o resíduo de aminoácido é I;

(bg) na posição 100, o resíduo de aminoácido é K ou N ;

(bh) na posição 101, o resíduo de aminoácido é K ou R; (bi) na posição 103, o resíduo de aminoácido é A ou V; (bj) na posição 104, o resíduo de aminoácido é D; (bk) na posição 105, o resíduo de aminoácido é M, L ou I; (bl) na posição

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106, o resíduo de	aminoácido é L; (bm) na posição 112,	o
resíduo de	aminoácido	é T	ou A; (bn) na posição 113,	o
resíduo de	aminoácido	é S	ou T; (bo) na posição 114,	o
resíduo de	aminoácido é	A;	(bp) na posição 115	, o resíduo
de aminoácido	é S	; (bq) na posição 119,	o	resíduo	de
aminoácido	é	K ou	R;	(br)	na posição 120,	o	resíduo	de
aminoácido	é	K ou	R;	(bs)	na posição 123,	o	resíduo	de
aminoácido	é	F ou	L;	(bt)	na posição 125,	o	resíduo	de
aminoácido	é	E;	(bu)	na	posição 126, o		resíduo	de
aminoácido	é	Q ou	H;	(bv)	na posição 128,	o	resíduo	de
aminoácido	é	E ou	D;	(bw)	na posição 129,	o	resíduo	de
aminoácido	é	V ou	I;	(bx)	na posição 130,	o	resíduo	de
aminoácido	é	F;	(by)	na	posição 131, o		resíduo	de
aminoácido	é	D ou	E;	(bx)	na posição 132,	o	resíduo	de
aminoácido	é	T;	(ca)	na	posição 135, o		resíduo	de
aminoácido	é	V;	(cb)	na	posição 138, o		resíduo	de
aminoácido	é	H;	(cc)	na	posição 139, o		resíduo	de
aminoácido	é	I;	(cd)	na	posição 140, o		resíduo	de
aminoácido	é	L ou	M;	(ce)	na posição 142,	o	resíduo	de
aminoácido	é	Y;	(cf)	na	posição 143, o		resíduo	de
aminoácido	é	K ou	R;	(cg)	na posição 145,	o	resíduo	de
aminoácido	é	L ou	I; e	(ch)	na posição 146,	o	resíduo	de
aminoácido	é T.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem uma seqüência de aminoácidos na qual, dos resíduos que correspondem às posições especificadas em (a) - (ch) acima, pelo menos 90% se conformam às restrições de resíduos de aminoácido especificadas em (a) - (ch).

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem uma seqüência de aminoácidos selecionada do

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73/314 grupo consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 577; (b) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 578; (c) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 621; (d) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 579;

(j) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 584; (k) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 707; (l) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 616; (m) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 612; e (n) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 590, ainda em que, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, pelo menos 80% se conformam às seguintes restrições: (a) nas posições 9, 76, 94 e 110, o resíduo de aminoácido é A; (b) nas posições 29 e 108, o resíduo de aminoácido é C; (c) na posição 34, o resíduo de aminoácido é D; (d) na posição 95, o resíduo de aminoácido é E; (e) na posição 56, o resíduo de aminoácido é F; (f) nas posições 43, 44, 66, 74, 87, 102, 116, 122, 127 e 136, o resíduo de aminoácido é G; (g) na posição 41, o resíduo de aminoácido é H; (h) na posição

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7, o resíduo de aminoácido é I; (i) na posição 85, o resíduo de aminoácido é K; (j) nas posições 20, 42, 50, 78 e 121, o resíduo de aminoácido é L; (k) nas posições 1 e 141, o resíduo de aminoácido é M; (l) nas posições 23 e 109, o resíduo de aminoácido é N; (m) nas posições 22, 25, 133, 134 e 137, o resíduo de aminoácido é P; (n) na posição 71, o resíduo de aminoácido é Q; (o) nas posições 16, 21, 73, 99 e 111, o resíduo de aminoácido é R; (p) na posição 55, o resíduo de aminoácido é S; (q) na posição 77, o resíduo de aminoácido é T; (r) na posição 107, o resíduo de aminoácido é W; e (s) na posição 13, 46, 70 e 118, o resíduo de aminoácido é Y.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção ainda compreendem uma seqüência de aminoácidos na qual pelo menos um dos seguintes critérios é reunido: (a) na posição 14, o resíduo de aminoácido é D; (b) na posição 18, o resíduo de aminoácido é E; (c) na posição 26, o resíduo de aminoácido é M ou V; (e) na posição 30, o resíduo de aminoácido é I; (f) na posição 32, o resíduo de aminoácido é D; (g) na posição 36, o resíduo de aminoácido é M ou T; (i) na posição 37, o resíduo de aminoácido é C; (j) na posição 38, o resíduo de aminoácido é D; (j) na posição 53, o resíduo de aminoácido é V; (k) na posição 58, o resíduo de aminoácido é R; (l) na posição 61, o resíduo de aminoácido é R; (m) na posição 62, o resíduo de aminoácido é L; (n) na posição 64, o resíduo de aminoácido é I ou F; (o) na posição 65, o resíduo de aminoácido é P; (p) na posição 72, o resíduo de aminoácido é I; (q) na posição 75, o resíduo de aminoácido é V; (r) na posição 88, o resíduo de aminoácido é T; (s) na posição 89, o resíduo de

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75/314 aminoácido é G; (t) na posição 91, o resíduo de aminoácido é L; (u) na posição 98, o resíduo de aminoácido é I; (v) na posição 105, o resíduo de aminoácido I; (w) na posição 112, o resíduo de aminoácido é A; (x) na posição 124, o resíduo de aminoácido é G ou C; (y) na posição 128, o resíduo de aminoácido é D; (z) na posição 140, o resíduo de aminoácido é M; (aa) na posição 143, o resíduo de aminoácido é R; e (ab) na posição 144, o resíduo de aminoácido é W.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção ainda compreendem uma seqüência de aminoácidos em que, dos resíduos de aminoácidos que correspondem às posições especificadas em (a) a (ab) conforme descrito acima, pelo menos 80% se conformam às restrições de resíduos de aminoácido especificadas em (a) a (ab).

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção ainda compreendem uma seqüência de aminoácidos em que seguintes condições são também reunidas: (a) na posição 41,

o resíduo de aminoácido é	H;	(b) na posição	138, o resíduo
de aminoácido é H; (c)	na	posição 34,	o resíduo de
aminoácido é N; e (d)	na	posição 55,	o resíduo de
aminoácido é S.
Alguns polipeptídeos	de	GAT preferidos	da invenção,

quando otimamente alinhados com uma seqüência de aminoácidos de referência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 300, 445 e 457 para gerar um escore de similaridade de pelo menos 460 usando a matriz BLOSUM62, uma penalidade por existência de gap de 11 e uma penalidade por extensão de gap de 1, têm seqüências de aminoácidos de modo que uma ou mais das seguintes posições se conformam às seguintes restrições: (i) nas posições 18 e

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38, existe	um resíduo	de aminoácido	Z5	; (ii	) na posição	62,
existe	um	resíduo	de	aminoácido	Z1;	(	iii)	na	posição	124,
existe	um	resíduo	de	aminoácido	Z6;	e	(iv)	na	posição	144,
existe	um	resíduo	de	aminoácido	Z2,	em	que:	Z1	é um resíduo

de aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P. Em alguns dos polipeptídeos de GAT antes mencionados, o resíduo de aminoácido no polipeptídeo correspondendo à posição 28 é V, I ou A. Valina ou isoleucina na posição 28 geralmente se correlaciona com uma Km reduzida, embora alanina nessa posição geralmente se correlacione com uma Kcat aumentada. Treonina na posição 89 e arginina na posição 58 geralmente se correlacionam com Km reduzida. Outros polipeptídeos de GAT preferidos são caracterizados por terem I27 (isto é, uma I na posição 27), M30, D34, S35, R37, S39, H41, G48, K49, N57, Q58, P62, T62, Q65, Q67, K68, V75, E83, S89, A96, E96, R101, T112, A114, K119, K120, E128, V129, D131, T131, V132, V134, V135, H138, R144, I145 ou T146 ou qualquer combinação dos mesmos.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 568, 569, 570, 571, 572,

573,	574,	575,	576,	577,	578,	579,	580,	581,	582,	583,	584
585,	586,	587,	588,	589,	590,	591,	592,	593,	594,	595,	596
597,	598,	599,	600,	601,	602,	603,	604,	605,	606,	607,	608
609,	610,	611,	612,	613,	614,	615,	616,	617,	618,	619,	621
623,	625,	627,	629,	631,	633,	635,	637,	639,	641,	643,	645

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647,	649,	651,	653,	655, 657,	659,	661,	663,	665,	667,	669
671,	673,	675,	677,	679, 681,	683,	685,	687,	689,	691,	693
695,	697,	699,	701,	703, 705,	707,	709,	711,	713,	715,	717
719,	721,	723,	725,	727, 729,	731,	733,	735,	737,	739,	741
743,	745,	747,	749,	751, 753,	755,	757,	759,	761,	763,	765
767,	769,	771,	773,	775, 777,	779,	781,	783,	785,	787,	789
791,	793,	795,	797,	799, 801,	803,	805,	807,	809,	811,	813
815,	817,	819,	821,	823 e 825

Em outro aspecto, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende pelo menos 20 ou alternativamente, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 130, pelo menos 135, pelo menos 140, pelo menos 141, pelo menos 142, pelo menos 143, pelo menos 144 ou pelo menos 145 aminoácidos contínuos de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupos consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 919 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 917, 919, 921, 923, 925, 927, 833, 835, 839, 843, 845, 859, 863, 873, 877, 891, 895, 901, 905, 907, 913, 915 ou 950); (b) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 929 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 929, 931, 835, 843, 849 ou 867); (c) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 847 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 845 ou 847); (d) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 851; (e) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 853; (f) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 855 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 835 ou 855); (g) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98%

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78/314 idêntica à SEQ ID NO: 857; (h) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 861 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 839, 861 ou 883); (i) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 871; (j) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 875; (k) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 881; (l) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 885 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 845 ou 885); (m) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98%

idêntica à SEQ ID	NO:	887;	(n)	uma seqüência	de	aminoácidos
que	é pelo menos	98%	idêntica	à SEQ ID NO:	889	(tais como,
por	exemplo, SEQ	ID	NO:	863,	889, 891 ou	903	); (o) uma

seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 893; (p) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 897; (q) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 899;

(r) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 909 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 883 ou 909); (s) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 911; (t) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 837; (u) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 841; (v) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 865; (w) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 869; e (x) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 879.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende pelo

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79/314 menos 20 ou alternativamente, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 130, pelo menos 135, pelo menos 140, pelo menos 141, pelo menos 142, pelo menos 143, pelo menos 144 ou pelo menos 145 aminoácidos contínuos de uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 929 e a qual compreende um resíduo Gly ou Asn na posição de aminoácido correspondendo à posição 33 de SEQ ID NO: 929 (tais como, por exemplo, SEQ ID NO: 837, 849, 893, 897, 905, 921, 927, 929 ou 931).

Em outro aspecto, a invenção proporciona um polipeptídeo compreendendo os resíduos 2-146 de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo

de SEQ ID	NO:	833,	835, 837,	839,	841,	843,	845,	847,	849,
851, 853,	855,	857,	859, 861,	863,	865,	867,	869,	871,	873,
875, 877,	879,	881,	883, 885,	887,	889,	891,	893,	895,	897,
899, 901,	903,	905,	907, 909,	911,	913,	915,	917,	919,	921,
923, 925,	927,	929,	931, 953,	954,	955,	956,	957,	958,	959,
960, 961,	962,	963,	964, 965,	966,	967,	968,	969,	970,	971
e 972. Em algumas	modalidades da	invenção,	uma	seqüência

de aminoácidos do polipeptídeo compreende Met, Met-Ala ou Met-Ala-Ala sobre o lado N-terminal do aminoácido correspondendo à posição 2 de uma seqüência de aminoácidos de referência.

Alguns polipeptídeos de GAT preferidos da invenção compreendem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 833, 835, 837, 839, 841,

843,	845,	847,	849,	851,	853,	855,	857,	859	, 861, 863,	865,
867,	869,	871,	873,	875,	877,	879,	881,	883	, 885, 887,	889,
891,	893,	895,	897,	899,	901,	903,	905,	907	, 909, 911,	913,
915,	917,	919,	921,	923	, 925	, 927	, 92	9,	931, 946,	948 e

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 87/331

80/314

950 .

A invenção ainda proporciona polipeptídeos de GAT preferidos que são caracterizados por uma combinação das restrições de posição de aminoácidos precedentes.

Além disso, a invenção proporciona polinucleotídeos de GAT que codificam os polipeptídeos de GAT preferidos descritos acima e seqüência de nucleotídeos complementares dos mesmos.

Alguns aspectos da invenção se referem, particularmente, ao subconjunto de qualquer uma das categorias acima descritas de polipeptídeos de GAT tendo atividade de GAT, conforme descrito aqui. Esses polipeptídeos de GAT are preferidos, por exemplo, para uso como agentes para conferir resistência ao glifosato a uma planta. Exemplos de níveis desejados de atividade de GAT são descritos aqui.

Em um aspecto, os polipeptídeos de GAT compreendem uma seqüência de aminoácidos codificada por uma forma recombinante ou isolada dos ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente isolados de uma fonte natural, por exemplo, um gênero bacteriano. Polinucleotídeos do tipo silvestre que codificam tais polipeptídeos de GAT podem ser especificamente selecionados por meio de métodos padrões conhecidos na técnica. Os polipeptídeos definidos por SEQ ID NO: 6 - 10, por exemplo, foram descobertos através de clonagem por expressão de seqüências de gêneros Bacillus exibindo atividade de GAT, conforme descrito em maiores detalhes abaixo.

A invenção também inclui polipeptídeos isolados ou recombinantes os quais são codificados por um

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 88/331

81/314 polinucleotídeo isolado ou recombinante compreendendo uma seqüência de nucleotídeos a qual se hibridiza sob condições estringentes sobre substancialmente o comprimento todo de

	uma	seqüência	de	nucleotídeos selecionada	do	grupo
5	consistindo de	SEQ	ID NO: 516, 517, 518, 519,	520,	521,
	522,	523, 524,	525,	526, 527, 528, 529, 530, 531,	532,	533,
	534,	535, 536,	537,	538, 539, 540, 541, 542, 543,	544,	545,
	546,	547, 548,	549,	550, 551, 552, 553, 554, 555,	556,	557,
	558,	559, 560,	561,	562, 563, 564, 565, 566, 567,	620,	622,
10	624,	626, 628,	630,	632, 634, 636, 638, 640, 642,	644,	646,
	648,	650, 652,	654,	656, 658, 660, 662, 664, 666,	668,	670,
	672,	674, 676,	678,	680, 682, 684, 686, 688, 690,	692,	694,
	6 9 6,	698, 700,	702,	704, 706, 708, 710, 712, 714,	716,	718,
	720,	722, 724,	726,	728, 730, 732, 734, 736, 738,	740,	742,
15	744,	746, 748,	750,	752, 754, 756, 758, 760, 762,	764,	768,
	770,	772, 774,	776,	778, 780, 782, 784, 786, 788,	790,	792,
	794,	796, 798,	800,	802, 804, 806, 808, 810, 812,	814,	816,
	818,	820, 822	e 824, seus complementos e seqüências de

nucleotídeos que codificam uma seqüência de aminoácidos

20	selecionada do	grupo consistindo de SEQ ID	NO: 568,	569,
	570, 571, 572,	573, 574, 575, 576, 577, 578,	579, 580,	581,
	582, 583, 584,	585, 586, 587, 588, 589, 590,	591, 592,	593,
	594, 595, 596,	597, 598, 599, 600, 601, 602,	603, 604,	605,
	606, 607, 608,	609, 610, 611, 612, 613, 614,	615, 616,	617,
25	618, 619, 621,	623, 625, 627, 629, 631, 633,	635, 637,	639,
	641, 643, 645,	647, 649, 651, 653, 655, 657,	659, 661,	663,
	665, 667, 669,	671, 673, 675, 677, 679, 681,	683, 685,	687,
	689, 691, 693,	695, 697, 699,701, 703, 705,	707, 709,	711,
	713, 715, 717,	719,721, 723, 725, 727, 729,	731, 733,	735,
30	737, 739, 741,	743, 745, 747, 749, 751, 753,	755, 757,	759,

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 89/331

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761,	763,	765,	767,	769,	771,	773, 775, 777, 779,	781,	783,
785,	787,	789,	791,	793,	795,	797, 799, 801, 803,	805,	807,
809,	811,	813,	815	, 817	, 819	, 821, 823 e 825,	incluindo

seus complementos.

A invenção também inclui polipeptídeos isolados ou recombinantes os quais são codificados por um polinucleotídeo isolado ou recombinante compreendendo uma seqüência de nucleotídeos a qual se hibridiza sob condições estringentes sobre substancialmente o comprimento todo de

uma	seqüência	de	nucleotídeos	selecionada	do	grupo
consistindo de	SEQ	ID NO: 832, 834, 836, 838,	840,	842,
844,	846, 848,	850,	852, 854, 856,	858, 860, 862,	864,	866,
868,	870, 872,	874,	876, 878, 880,	882, 884, 886,	888,	890,
892,	894, 896,	898,	900, 902, 904,	906, 908, 910,	912,	914,
916,	918, 920,	922,	924, 926, 928	e 930, seus complementos
e seqüências de	nucleotídeos que codificam uma seqüência de
aminoácidos selecionada do grupo consistindo de	SEQ ID NO:
833,	835, 837,	839,	841, 843, 845,	847, 849, 851,	853,	855,
857,	859, 861,	863,	865, 867, 869,	871, 873, 875,	877,	879,
881,	883, 885,	887,	889, 891, 893,	895, 897, 899,	901,	903,
905,	907, 909,	911,	913, 915, 917,	919, 921, 923,	925,	927,
929,	931, 953,	954,	955, 956, 957,	958, 959, 960,	961,	962,
963,	964, 965,	966,	967, 968, 969,	970, 971 e 972	.

A invenção ainda inclui qualquer polipeptídeo tendo

atividade	de GAT	que é codificado por	um fragmento	de
qualquer	um dos	polinucleotídeos que	codificam	GAT
descritos	aqui.
A	invenção	também proporciona	fragmentos	de
polipeptídeos de	GAT que pode ser unidos	para formar	um

polipeptídeo de GAT funcional. A união pode ser realizada

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83/314 in vitro ou in vivo e pode envolver cis- ou trans-união (isto é, união intramolecular ou intermolecular) . Os fragmentos em si podem, mas não precisam, ter atividade de GAT. Por exemplo, dois ou mais segmentos de um polipeptídeo de GAT podem ser separado por inteínas; remoção da seqüência de inteína através de cis-união resulta em um polipeptídeo de GAT funcional. Em outro exemplo, um polipeptídeo de GAT encriptado pode ser expresso como dois ou mais fragmentos distintos; transunião desses segmentos resulta em recuperação de um polipeptídeo de GAT funcional. Vários aspectos de cis- e trans-união, encriptação de gene e introdução de seqüências intervenientes são descritos em maiores detalhes nos Pedidos de Patente U.S. Nos. de Série 09/517.933 e 09/710.686, ambos os quais são incorporados por referência aqui em sua totalidade.

Em geral, a invenção inclui qualquer polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo modificado de GAT derivado através de mutação, recombinação recursiva de seqüência e/ou diversificação da seqüência de polinucleotídeos descrita aqui. Em alguns aspectos da invenção, um polipeptídeo de GAT é modificado através de uma única ou de substituições múltiplas de aminoácidos, uma deleção, uma inserção ou uma combinação de um ou mais desses tipos de modificações. Substituições podem ser conservativas ou não-conservativas, podem alterar a função ou não e podem adicionar novas funções. Inserções e deleções podem ser substanciais, tal como o caso de um truncamento de um fragmento substancial de uma seqüência ou na fusão de uma seqüência adicional, quer internamente

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84/314 ou no N ou C término. Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo de GAT é parte de uma proteína de fusão compreendendo uma função adicional tal como, por exemplo, um sinal de secreção, um peptídeo de trânsito de cloroplasto, uma tag de purificação ou qualquer um de numerosos outros grupos funcionais que serão evidentes para aqueles habilitados na técnica e os quais são descritos em maiores detalhes em alguma parte da presente especificação.

Polipeptídeos da invenção podem conter um ou mais aminoácidos modificados. A presença de aminoácidos modificados pode ser vantajosa, por exemplo, em (a) aumento da meia-vida do polipeptídeo in vivo, (b) redução ou aumento da antigenicidade do polipeptídeo e (c) aumento da estabilidade ao armazenamento do polipeptídeo. Aminoácido são modificados, por exemplo, co-traducionalmente ou póstraducionalmente durante produção recombinante (por exemplo, glicosilação N-ligada nos motivos N-X-S/T durante expressão em células de mamífero) ou modificados através de meios sintéticos.

Exemplos não-limitativos de aminoácidos modificados incluem um aminoácido glicosilado, um aminoácido sulfatado, um aminoácido prenilado (por exemplo, farnesilado, geranilgeranilado), um aminoácido acetilado, um aminoácido acilado, um aminoácido PEG-ilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido carboxilado, um aminoácido fosforilado e semelhantes. Referências adequadas para orientar aqueles habilitados na modificação de aminoácidos são diversas na literatura. Protocolos exemplificativos são encontrados em Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM (Humana Press, Towata, NJ).

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85/314

Métodos recombinantes para a produção e isolamento dos polipeptídeos de GAT da invenção são descritos aqui. Além disso, para produção recombinante, os polipeptídeos podem ser produzidos através de síntese de peptídeo direta usando técnicas em fase sólida (por exemplo, Stewart e colaboradores (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis (WH Freeman Co, San Francisco); e Merricampo (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154) . A síntese de peptídeo pode ser realizada usando técnicas manuais ou através de automatização. Síntese automatizada pode ser obtida, por exemplo, usando um sintetizador de peptídeo Applied Biosystem 431 (Perkin Elmer, Foster City, CA) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Por exemplo, subseqüências podem ser quimicamente sintetizadas separadamente e combinadas usando métodos químicos para proporcionar polipeptídeos de GAT de comprimento total. Peptídeos podem também ser adquiridos de uma variedade de fontes.

Em outro aspecto da invenção, um polipeptídeo de GAT da invenção é usado para produzir anticorpos os quais têm, por exemplo, usos diagnósticos, por exemplo, relacionados à atividade, distribuição e expressão de polipeptídeos de GAT, por exemplo, em vários tecidos de uma planta transgênica.

Polipeptídeos homólogos de GAT para a indução de anticorpos não requerem atividade biológica atividade; contudo, o polipeptídeo ou oligopeptídeo deve ser antigênico. Peptídeos usados para induzir a anticorpos específicos podem ter uma seqüência de aminoácidos consistindo de pelo menos 10 aminoácidos, de preferência

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86/314 pelo menos 15 ou 20 aminoácidos. Trechos curtos de um polipeptídeo de GAT podem ser fundidos a outra proteína, tal como hemocianina de cepa de keyhole e um anticorpo

produzido contra a	molécula	quimérica.
Métodos de	produção	de anticorpos	pol	iclonais e
monoclonais são	conhecidos	por aqueles	habilitados na
técnica e muitos	anticorpos	estão disponíveis.	Veja, por
exemplo, Coligan	(1991) Current Protocols	in	Immunology
(Wiley/Greene, NY	); Harlow	e Lane (1989)	Antibodies: A
Laboratory Manual	(Cold Spring Harbor Press,	NY	); Stites e
colaboradores (eds	.) Basic e	Clinical Immunology, 4a edição
(Lange Medical Publications,	Los Altos, CA)	e	referências
citadas no mesmo	; Goding	(1986) Monoclonal	Anticorpos:

Principles e Practice, 2^a edição (Academic Press, New York, NY); e Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495-497. Outras técnicas adequadas para o preparo de anticorpos incluem seleção de bibliotecas de anticorpos recombinantes em vetores de fago ou similares. Veja, Huse e colaboradores (1989) Science 246: 1275-1281; e Ward e colaboradores (1989) Nature 341: 544-546. Anticorpos monoclonais e policlonais e anti-soros específicos usualmente se ligarão com uma Kd de pelo menos cerca de 0,1 μΜ, de preferência pelo menos cerca de 0,01 μΜ ou melhor e, mais tipicamente e de preferência, 0,001 μΜ ou melhor.

Detalhes adicionais da produção de anticorpos e técnicas de manipulação podem ser encontrados em Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering, 2a ed. (Freeman e Company, NY); McCafferty e colaboradores (1996) Antibody Engineering, A Practical Approach (IRL na Oxford Press, Oxford, Inglaterra); e Paul (1995) Antibody

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Engineering Protocols (Humana Press, Towata, NJ).

Variações de Seqüência:

Os polipeptídeos de GAT da presente invenção incluem variações conservativamente modificadas de uma seqüência

divulgada	aqui	como SEQ	ID	NO: 568,	569,	570,	571,	572,
573,	574,	575,	576,	577,	578,	579, 580,	581,	582,	583,	584,
585,	586,	587,	588,	589,	590,	591, 592,	593,	594,	595,	596,
597,	598,	599,	600,	601,	602,	603, 604,	605,	606,	607,	608,
609,	610,	611,	612,	613,	614,	615, 616,	617,	618,	619,	621,
623,	625,	627,	629,	631,	633,	635, 637,	639,	641,	643,	645,
647,	649,	651,	653,	655,	657,	659, 661,	663,	665,	667,	669,
671,	673,	675,	677,	679,	681,	683, 685,	687,	689,	691,	693,
695,	697,	699,701,	703,	705,	707, 709,	711,	713,	715,	717,
719,	721,	723, 725,	727,	729,	731, 733,	735,	737,	739,	741,
743,	745,	747,	749,	751,	753,	755, 757,	759,	761,	763,	765,
767,	769,	771,	773,	775,	777,	779, 781,	783,	785,	787,	789,
791,	793,	795,	797,	799,	801,	803, 805,	807,	809,	811,	813,
815,	817,	819,	821,	823,	825,	833, 835,	837,	839,	841,	843,
845,	847,	849,	851,	853,	855,	857, 859,	861,	863,	865,	867,
869,	871,	873,	875,	877,	879,	881, 883,	885,	887,	889,	891,
893,	895,	897,	899,	901,	903,	905, 907,	909,	911,	913,	915,
917,	919,	921,	923,	925,	927,	929, 931,	953,	954,	955,	956,
957,	958,	959,	960,	961,	962,	963, 964,	965,	966,	967,	968,
969,	970	, 971	e	972.	Tais variações conservativamente

modificadas compreendem substituições, adições ou deleções as quais alteram, adicionam ou deletam um único aminoácido ou um pequeno percentual de aminoácidos (tipicamente menos do que cerca de 5%, mais tipicamente menos do que cerca de

4%,	2% ou	1%)	em qualquer uma	de SEQ ID	NO:	568,	569,	570,
571,	572,	573,	574, 575, 576,	577, 578,	579,	580,	581,	582,

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 95/331

88/314

	583,	584,	585,	586,	587,	588,	589,	590, 591, 592, 593,	594,
	595,	596,	597,	598,	599,	600,	601,	602, 603, 604, 605,	606,
	607,	608,	609,	610,	611,	612,	613,	614, 615, 616, 617,	618,
	619,	621,	623,	625,	627,	629,	631,	633, 635, 637, 639,	641,
5	643,	645,	647,	649,	651,	653,	655,	657, 659, 661, 663,	665,
	667,	669,	671,	673,	675,	677,	679,	681, 683, 685, 687,	689,
	691,	693,	695,	697,	699,	701,	703,	705, 707, 709, 711,	713,
	715,	717,	719,	721,	723,	725,	727,	729, 731, 733, 735,	737,
	739,	741,	743,	745,	747,	749,	751,	753, 755, 757, 759,	761,
10	763,	765,	767,	769,	771,	773,	775,	777, 779, 781, 783,	785,
	787,	789,	791,	793,	795,	797,	799,	801, 803, 805, 807,	809,
	811,	813,	815	, 817	, 819, 82	1, 82	3, 825, 833, 835,	837,
	839,	841,	843,	845,	847,	849,	851,	853, 855, 857, 859,	861,
	863,	865,	867,	869,	871,	873,	875,	877, 879, 881, 883,	885,
15	887,	889,	891,	893,	895,	897,	899,	901, 903, 905, 907,	909,
	911,	913,	915,	917,	919,	921,	923,	925, 927, 929, 931,	953,
	954,	955,	956,	957,	958,	959,	960,	961, 962, 963, 964,	965,
	966,	967,	968,	969,	970,	971	e 972	•
		Por	exemplo, uma variação conservativamente modificada
20	(por	exemplo,	deleção)	do polipeptídeo de aminoácido	146

identificado aqui como SEQ ID NO: 6 terá um comprimento de pelo menos 140 aminoácidos, de preferência pelo menos 141 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 144 aminoácidos e ainda mais preferivelmente pelo menos 145 25 aminoácidos, correspondendo a uma deleção de menos do que cerca de 5%, 4%, 2% ou cerca de 1% ou menos da seqüência de polipeptídeo.

Outro exemplo de uma variação conservativamente modificada (por exemplo, uma “variação conservativamente 30 substituída”) do polipeptídeo identificado aqui como SEQ ID

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NO: 6 conterá substituições conservativas,” de acordo com os seis grupos de substituição apresentados na Tabela 2, em até cerca de 7 resíduos (isto é, menos do que cerca de 5%) do polipeptídeo com 146 aminoácidos.

Os homólogos de seqüência de polipeptídeo de GAT da invenção, incluindo seqüências conservativamente substituídas, podem estar presentes como parte de seqüências de polipeptídeo maiores, tal como ocorre em um polipeptídeo de GAT, em uma fusão de GAT com uma seqüência sinalizadora, por exemplo, uma seqüência de objetivação a cloroplasto ou quando da adição de um ou mais domínios para purificação de uma proteína (por exemplo, segmentos poli his, segmentos FLAG tag, etc.). No último caso, os domínios funcionais adicionais têm pouco ou nenhum efeito sobre a atividade da parte GAT de uma proteína ou onde os domínios adicionais podem ser removidos através de etapas de processamento pós-síntese, tal como através de tratamento com uma protease.

Definição de Polipeptídeos Através de ImunoReatividade:

Em virtude do fato de os polipeptídeos da invenção proporcionarem uma nova classe de enzimas com uma atividade definida, isto é, a acetilação e acilação de glifosato, os polipeptídeos também proporcionam novas características estruturais as quais podem ser reconhecidas, por exemplo, em ensaios imunológicos. A geração de anti-soro o qual se liga especificamente aos polipeptídeos da invenção, bem como a polipeptídeos os quais são ligados por tal antisoro, são uma característica da invenção.

A invenção inclui polipeptídeos de GAT que se ligam

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90/314 especificamente a ou que são especificamente imuno-reativos a um anticorpo ou anti-soro gerado contra um imunogênio compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada de uma ou mais de SEQ ID NO: 568, 569, 570, 571, 572, 573,

574,	575,	576,	577,	578,	579,	580,	581,	582,	583,	584,	585,
586,	587,	588,	589,	590,	591,	592,	593,	594,	595,	596,	597,
598,	599,	600,	601,	602,	603,	604,	605,	606,	607,	608,	609,
610,	611,	612,	613,	614,	615,	616,	617,	618,	619,	621,	623,
625,	627,	629,	631,	633,	635,	637,	639,	641,	643,	645,	647,
649,	651,	653,	655,	657,	659,	661,	663,	665,	667,	6 69,	671,
673,	675,	677,	679,	681,	683,	685,	687,	689,	691,	693,	695,
697,	699,	701,	703,	705	, 707, 709, 711, '	713,	715,	717,
719,	721,	723,	725,	727,	729,	731,	733,	735,	737,	739,	741,
743,	745,	747,	749,	751,	753,	755,	757,	759,	761,	763,	765,
767,	769,	771,	773,	775,	777,	779,	781,	783,	785,	787,	789,
791,	793,	795,	797,	799,	801,	803,	805,	807,	809,	811,	813,
815,	817,	819,	821,	823,	825,	833,	835,	837,	839,	841,	843,
845,	847,	849,	851,	853,	855,	857,	859,	861,	863,	865,	867,
869,	871,	873,	875,	877,	879,	881,	883,	885,	887,	889,	891,
893,	895,	897,	899,	901,	903,	905,	907,	909,	911,	913,	915,
917,	919,	921,	923,	925,	927,	929,	931,	953,	954,	955,	956,
957,	958,	959,	960,	961,	962,	963,	964,	965,	9 6 6,	967,	968,
969,	970,	971	e 972. Para eliminar reatividade	cruzada a
outros homólogos	de GAT,	o anticorpo ou anti-soro é
subtraído	de proteína relacionadas	disponíveis,	tais	como

aquelas representadas por proteínas ou peptídeos correspondendo aos números de acesso ao GenBank disponíveis como a data de depósito do presente pedido e exemplificadas por CAA70664, Z99109 e Y09476. Onde o número de acesso corresponde a um ácido nucleico, um polipeptídeo codificado

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91/314 pelo ácido nucleico é gerado e usado para fins de subtração de anticorpo/anti-soro. A Figura 3 mostra a identidade relativa entre seqüências de GAT exemplificativas e a seqüência relacionada mais próxima disponível no Genbank,

5 YitI. A	função da	YitI nativa ainda não	foi	esclarecida,
mas	foi	mostrado	que a enzima possui	atividade de GAT
detectável.
	Em	um formato	típico, o imunoensaio	usa	um anti-soro

	policlonal	o	qual	foi	estimulado c	ontra	um	ou	mais
10	polipeptídeos	compreendendo uma ou mais de	uma	seqüências
	correspondendo	a uma ou	mais de SEQ ID	NO:	568,	569,	570,
	571, 572,	573,	574,	575,	576, 577, 578,	579,	580,	581,	582,
	583, 584,	585,	586,	587,	588, 589, 590,	591,	592,	593,	594,
	595, 596,	597,	598,	599,	600, 601, 602,	603,	604,	605,	606,
15	607, 608,	609,	610,	611,	612, 613, 614,	615,	616,	617,	618,
	619, 621,	623,	625,	627,	629, 631, 633,	635,	637,	639,	641,
	643, 645,	647,	649,	651,	653, 655, 657,	659,	661,	663,	665,
	667, 669,	671,	673,	675,	677, 679, 681,	683,	685,	687,	689,
	691, 693,	695,	697,	699,	701, 703, 705,	707,	709,	711,	713,
20	715, 717,	719,	721,	723,	725, 727, 729,	731,	733,	735,	737,
	739, 741,	743,	745,	747,	749, 751, 753,	755,	757,	759,	761,
	763, 765,	767,	769,	771,	773, 775, 777,	779,	781,	783,	785,
	787, 789,	791,	793,	795,	797, 799, 801,	803,	805,	807,	809,
	811, 813,	815,	817,	819,	821, 823, 825,	833,	835,	837,	839,
25	841, 843,	845,	847,	849,	851, 853, 855,	857,	859,	861,	863,
	865, 867,	869,	871,	873,	875, 877, 879,	881,	883,	885,	887,
	889, 891,	893,	895,	897,	899, 901, 903,	905,	907,	909,	911,
	913, 915,	917,	919,	921,	923, 925, 927,	929,	931,	953,	954,
	955, 956,	957,	958,	959,	960, 961, 962,	963,	964,	965,	966,
30	967, 968,	969, 970,	971 e 972 ou	uma	sub	-seqüência

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92/314 substancial das mesmas (isto é, pelo menos cerca de 30% da seqüência de comprimento total proporcionada). O conjunto todo de imunogênios polipeptídicos potenciais derivados de SEQ ID NO: 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576,

5	577,	578,	579,	580,	581,	582,	583,	584,	585,	586,	587,	588,
	589,	590,	591,	592,	593,	594,	595,	596,	597,	598,	599,	600,
	601,	602,	603,	604,	605,	606,	607,	608,	609,	610,	611,	612,
	613,	614,	615,	616,	617,	618,	619,	621,	623,	625,	627,	629,
	631,	633,	635,	637,	639,	641,	643,	645,	647,	649,	651,	653,
10	655,	657,	659,	661,	663,	665,	667,	669,	671,	673,	675,	677,
	679,	681,	683,	685,	687,	689,	691,	693	, 695	, 697,	699,	701,
	703,	705,	707,	709,	711,	713,	715,	717	, 719	, 721,	723,	725,
	727,	729,	731,	733, 735, 737, 7	39,	741,	743,	745,	747,
	749,	751,	753,	755,	757,	759,	761,	763,	765,	767,	769,	771,
15	773,	775,	777,	779,	781,	783,	785,	787,	789,	791,	793,	795,
	797,	799,	801,	803,	805,	807,	809,	811,	813,	815,	817,	819,
	821,	823,	825,	833,	835,	837,	839,	841,	843,	845,	847,	849,
	851,	853,	855,	857,	859,	861,	863,	865,	867,	869,	871,	873,
	875,	877,	879,	881,	883,	885,	887,	889,	891,	893,	895,	897,
20	899,	901,	903,	905,	907,	909,	911,	913,	915,	917,	919,	921,
	923,	925,	927,	929,	931,	953,	954,	955,	956,	957,	958,	959,
	960,	961,	962,	963,	964,	965,	966,	967	, 968	, 969,	970,	971

e 972 é coletivamente referido abaixo como “o(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s) O anti-soro resultante é 25 opcionalmente selecionado para ter baixa reatividade cruzada contra outras seqüências relacionadas e qualquer reatividade cruzada é removida através de imunoabsorção de uma ou mais das seqüências relacionadas, antes de uso do anti-soro policlonal no imunoensaio.

De forma a produzir anti-soro para uso em um

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93/314 imunoensaio, um ou mais dos polipeptídeos imunogênicos são produzidos e purificados conforme descrito aqui. Por exemplo, proteína recombinante pode ser produzida em uma linhagem de células bacterianas. Um gênero endógamo de camundongos (usado nesse ensaio porque os resultados são mais reproduzíveis em virtude da identidade genética virtual dos camundongos) é imunizado com o(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s) em combinação com a adjuvante padrão, tal como adjuvante de Freund, usando um protocolo padrão de imunização de camundongo (veja, Harlow e Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York), para uma descrição padrão de geração de anticorpos, formatos de imunoensaios e condições que podem ser usadas para determinar imunoreatividade específica). Alternativamente, um ou mais polipeptídeo sintéticos ou recombinantes derivados de uma das seqüências divulgadas aqui são conjugados a uma proteína veículo e usados como um imunogênio.

Soro policlonal é coletado e titulado contra o(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s) em um imunoensaio, por exemplo, um imunoensaio em fase sólida com uma ou mais das proteínas imunogênicas imobilizadas sobre um suporte sólido. Anti-soro policlonal com uma titulação de 10⁶ ou maior são selecionados, empoçados e subtraídos de polipeptídeos relacionados, por exemplo, aqueles identificados a partir do GENBANK conforme observado, para produzir anti-soro policlonal subtraído, empoçado, titulado.

O anti-soro policlonal subtraído, empoçado, titulado é testado com relação à reatividade cruzada contra os

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94/314 polipeptídeos relacionados. De preferência, pelo menos duas das GATs imunogênicas são usadas nessa determinação, de preferência em conjunto com pelo menos dois polipeptídeos relacionados, para identificar anticorpos os quais são especificamente ligados pelo(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s).

Nesse ensaio comparativo, condições de ligação discriminatórias são determinadas para o anti-soro policlonal subtraído, titulado o que resulta em uma proporção de sinal para ruído pelo menos cerca de a 5-10 vezes maior para a ligação do anti-soro policlonal titulado com relação aos polipeptídeos imunogênicos de GAT, quando comparado à ligação aos polipeptídeos relacionados. Isto é, a estringência da reação de ligação é ajustada através da adição de competidores não-específicos, tais como albumina ou leite desnatado em pó ou através de ajuste das condições de sal, temperatura ou semelhantes. Essas condições de ligação são usadas em ensaios subseqüentes para determinar se um polipeptídeo de teste é especificamente ligado pelo anti-soro policlonal empoçado, subtraído. Em particular, um polipeptídeo de teste o qual mostra uma proporção de ruído para sinal pelo menos 2-5 vezes maior do que o polipeptídeo de controle sob condições de ligação discriminatórias e uma proporção de sinal para ruído de pelo menos cerca de quando comparado ao(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s), compartilha similaridade estrutural substancial com o(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s) quando comparado à GAT conhecida e é, portanto um polipeptídeo da invenção.

Em outro exemplo, imunoensaios no formato de ligação competitiva são usados para a detecção de um polipeptídeo

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95/314 de teste. Por exemplo, conforme observado, anticorpos com reação cruzada são removidos da mistura de anti-soro empoçada através de imunoabsorção com os polipeptídeos de GAT de controle. O(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s) são então, imobilizados a um suporte sólido o qual é exposto ao anti-soro subtraído empoçado. Proteínas de teste são adicionadas ao ensaio para competir pela ligação ao antisoro subtraído empoçado. A capacidade da(s) proteína(s) de teste de competir pela ligação ao anti-soro empoçado, subtraído quando comparado à(s) proteína(s) imobilizada(s) é comparada à capacidade do(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s) adicionados ao ensaio de competir pela ligação ao(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s) (competir eficazmente com os polipeptídeo(s) imunogênico(s) imobilizado(s) pela ligação ao anti-soro empoçado). A reatividade cruzada percentual para as proteínas de teste é calculada, usando cálculos padrões.

Em um ensaio paralelo, a capacidade das proteínas de controle de competir pela ligação ao anti-soro empoçado, subtraído é opcionalmente determinada quando comparado à capacidade do(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s) de competir pela ligação ao anti-soro. Novamente, a reatividade cruzada percentual para os polipeptídeos de controle é calculada, usando cálculos padrões. Onde a reatividade cruzada percentual é pelo menos 5-10x maior para os polipeptídeos de teste, os polipeptídeos de teste são mencionados como se ligando especificamente ao anti-soro empoçado, subtraído.

Em geral, o anti-soro imunoabsorvido e empoçado pode ser usado em um imunoensaio de ligação competitiva conforme descrito aqui para comparar qualquer polipeptídeo de teste

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96/314 ao(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s). De forma a fazer essa comparação, os dois polipeptídeos são, cada um, analisados em uma ampla faixa de concentrações e a quantidade de cada polipeptídeo requerida para inibir 50% da ligação do antisoro subtraído à proteína imobilizada é determinada usando técnicas padrões. Se a quantidade do polipeptídeo de teste requerida é menor do que duas vezes a quantidade do(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s) que é requerida, então, o polipeptídeo de teste é mencionado como se ligando especificamente a um anticorpo gerado ao(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s), contanto que a quantidade seja pelo menos cerca de 5-10x maior para um polipeptídeo de controle.

Como uma determinação final de especificidade, o antisoro empoçado é, opcionalmente, imunoabsorvido totalmente com o(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s) (ao invés dos polipeptídeos de controle) até que pouca ou nenhuma ligação do anti-soro subtraído, empoçado ao(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s) seja detectável. Esse anti-soro totalmente imunoabsorvido é, então, testado com relação à reatividade ao polipeptídeo de teste. Se pouca ou nenhuma reatividade é observada (isto é, não mais do que 2x a proporção de sinal para ruído observada para ligação do anti-soro totalmente imunoabsorvido ao(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s)), então, o polipeptídeo de teste é especificamente ligado pelo anti-soro estimulado pelo(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s).

Polinucleotídeos de N-Acetiltransferase de Glifosato:

Em um aspecto, a invenção proporciona uma nova família de polinucleotídeo isolados ou recombinantes referidos aqui como “polinucleotídeos de N-acetiltransferase de glifosato”

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97/314 ou polinucleotídeos de GAT.” Seqüências de polinucleotídeos de GAT são caracterizadas pela capacidade de codificar um polipeptídeo de GAT. Em geral, a invenção inclui qualquer seqüência de nucleotídeo que codifica qualquer um dos novos polipeptídeos de GAT descritos aqui. Em alguns aspectos da invenção, um polinucleotídeo de GAT que codifica um polipeptídeo de GAT com atividade de GAT é preferido.

Em um aspecto, os polinucleotídeos de GAT compreendem formas recombinantes ou isoladas que ocorrem naturalmente de ácidos nucleicos isolados de um organismo, por exemplo, um gênero bacteriano. Polinucleotídeos de GAT exemplificativos, por exemplo, SEQ ID NO:1 - 5, foram descobertos através de clonagem por expressão de seqüências de gêneros Bacillus exibindo atividade de GAT. Resumidamente, uma coleção de aproximadamente 500 gêneros de Bacillus e Pseudomonas foi selecionada com relação à capacidade nativa de N-acetilar o glifosato. Os gêneros foram desenvolvidos em LB durante a noite, coletados através de centrifugação, permeabilizados em tolueno diluído e, então, lavados e resuspensos em uma mistura de reação contendo tampão, glifosato a 5 mM e acetil-CoA a 200 μΜ. As células foram incubadas na mistura de reação durante entre 1 e 4 8 horas, tempo no qual um volume igual de metanol foi adicionado à reação. As células foram, então, empelotados através de centrifugação e o sobrenadante foi filtrado ante de análise através de espectrometria de massa no modo de íons original. O produto da reação foi positivamente identificado como Nacetilglifosato através de comparação do perfil de

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98/314 espectrometria de massa da mistura de reação a um padrão de N-acetilglifosato, conforme mostrado na Figura 2. A detecção de produto era dependente da inclusão de ambos os substratos (acetil CoA e glifosato) e foi eliminada através de desnaturação térmica das células bacterianas.

Polinucleotídeos de GAT individuais foram, então, clonados a partir dos gêneros identificados por meio de seleção funcional. DNA genômico foi preparado e parcialmente digerido com enzima Sau3A1. Fragmentos de aproximadamente 4 kb foram clonados em um vetor de expressão de E. coli e transformados em E. coli eletrocompetente. Clones individuais exibindo atividade de GAT foram identificados através de espectrometria de massa após a reação, conforme descrito previamente, exceto que a lavagem com tolueno foi substituída por permeabilização com PMBS. Fragmentos genômicos foram seqüenciados e a rede de leitura aberta que codifica o polipeptídeo de GAT putativo foi identificada. A identidade do gene de GAT foi confirmada através de expressão da rede de leitura aberta em E. coli e detecção de altos níveis de N-acetilglifosato produzidos a partir das misturas de reação.

Em outro aspecto da invenção, polinucleotídeos de GAT são produzidos através de diversificação, por exemplo, recombinação e/ou mutação um ou mais polinucleotídeos de GAT isolados ou recombinantes que ocorrem naturalmente. Conforme descrito em maiores detalhes em alguma parte aqui, freqüentemente é possível gerar polinucleotídeos de GAT diversificados que codificam polipeptídeos de GAT com atributos funcionais superiores, por exemplo, função catalítica aumentada, estabilidade aumentada ou maior nível

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99/314 de expressão, do que um polinucleotídeo de GAT usado como um substrato ou original no processo de diversificação.

Os polinucleotídeos da invenção têm uma variedade de usos, por exemplo, em: produção recombinante (isto é, expressão) dos polipeptídeos de GAT da invenção; como transgenes (por exemplo, para conferir resistência a herbicida em plantas transgênicas); como marcadores selecionáveis para transformação e manutenção de plasmídio; como imunogênios; como sondas diagnósticas com relação à presença de ácidos nucleicos complementares ou parcialmente complementares (incluindo para a detecção de ácidos nucleicos que codificam GAT naturais); como substratos para geração adicional de diversidade, por exemplo, reações de recombinação ou reações de mutação para produzir homólogos de GAT novos e/ou aperfeiçoados e semelhantes.

É importante observar que determinadas utilidades específicas, substanciais e possíveis de polinucleotídeos de GAT não requerem que o polinucleotídeo codifique um polipeptídeo com atividade de GAT substancial. Por exemplo, polinucleotídeos de GAT que não codificam enzimas ativas podem ser fontes valiosas de polinucleotídeos originais para uso em procedimentos de diversificação para chegar a variantes de polinucleotídeos de GATs ou nãopolinucleotídeos de GAT, com propriedades funcionais desejáveis (por exemplo, elevada kcat ou kcat/Km, baixa Km, elevada estabilidade com relação ao calo ou outros fatores ambientais, elevadas taxas de transcrição ou tradução, resistência à clivagem proteolítica, redução de antigenicidade, etc.). Por exemplo, a seqüência de

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100/314 nucleotídeos que codifica variantes de protease com pouca ou nenhuma atividade detectável foi usada como polínucleotídeos originais em experimentos de embaralhamento de DNA para produzir uma prole que codifica proteases altamente ativas (Ness e colaboradores (1999) Nature Biotech. 17: 893-96).

Seqüências de polinucleotídeos produzida através de métodos de geração de diversidade ou métodos de recombinação recursiva de seqüência (RSR) (por exemplo, embaralhamento de DNA) são uma característica da invenção. Métodos de mutação e recombinação usando os ácidos nucleicos descritos aqui são uma característica da invenção. Por exemplo, um método da invenção inclui recombinação recursiva de uma ou mais seqüências de nucleotídeos da invenção conforme descrito acima e abaixo com um ou mais nucleotídeos adicionais. As etapas de recombinação são, opcionalmente, realizadas in vivo, ex vivo, in silico ou in vitro. Essa geração de diversidade ou recombinação recursiva de seqüência produz pelo menos uma biblioteca de polinucleotídeos modificados de GAT recombinantes. Polipeptídeos codificados por membros dessa biblioteca são incluídos na invenção.

Também considerados são usos de polinucleotídeos, também referidos aqui como oligonucleotídeos, tipicamente tendo pelo menos 12 bases, de preferência pelo menos 15, mais preferivelmente pelo menos 20, 30 ou 50 ou mais bases, os quais se hibridizam sob condições estringentes ou altamente estringentes a uma seqüência de polinucleotídeo de GAT. Os polinucleotídeos podem ser usados as sondas, primers, agentes senso e anti-senso e semelhantes, de

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101/314 acordo com métodos conforme observado aqui.

De acordo com a presente invenção, polinucleotídeos de GAT, incluindo seqüências de nucleotídeos que codificam polipeptídeos de GAT, fragmentos de polipeptídeos de GAT, proteínas de fusão relacionadas ou equivalentes funcionais dos mesmos, são usados em moléculas de DNA recombinantes que direcionam a expressão dos polipeptídeos de GAT em células hospedeiras apropriadas, tais como células bacterianas ou de planta. Em virtude da degenerância inerente do código genético, outras seqüências de ácido nucleico as quais codificam substancialmente a mesma ou uma seqüência de aminoácidos funcionalmente equivalente também podem ser usadas para clonar a expressar os polinucleotídeos de GAT.

A invenção proporciona polinucleotídeos de GAT que codificam os produtos de transcrição e/ou tradução que são

subseqüentemente unidos	para,	por	fim,	produzir
polipeptídeos	funcionais	de GAT.	A	união	pode	ser
realizada in	vitro ou in	vivo e	pode	envolver cis-	ou
trans-união.	O substrato para	a	união	pode	ser

polinucleotídeos (por exemplo, transcritos de RNA) ou polipeptídeos. Um exemplo de cis-união de um polinucleotídeo é onde um íntron inserido em uma seqüência de codificação é removido e as duas regiões de éxon de flanqueamento são unidas para gerar uma seqüência que codifica um polipeptídeo de GAT. Um exemplo de trans-união seria onde um polinucleotídeo de GAT é encriptado através de separação da seqüência de codificação em dois ou mais fragmentos que podem ser separadamente transcritos e, então, unidos para formar a seqüência que codifica GAT de

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102/314 comprimento total. O uso de uma seqüência intensificadora de união (a qual pode ser introduzida em um construto da invenção) pode facilitar a união em cis ou trans. Cis- e trans-união de polipeptídeos são descritas em maiores detalhes em alguma parte aqui e nos Pedidos de Patente U.S. Nos. de Série 09/517.933 e 09/710.686.

Assim, alguns polinucleotídeos de GAT não codificam diretamente um polipeptídeo de GAT de comprimento total mas, antes, codificam um fragmento ou fragmentos de um polipeptídeo de GAT. Esses polinucleotídeos de GAT podem ser usados para expressar um polipeptídeo de GAT funcional através de um mecanismo envolvendo união, onde união pode ocorrer ao nível de polinucleotídeo (por exemplo, íntron/éxon) e/ou polipeptídeo (por exemplo, inteína/exteína). Isso pode ser útil, por exemplo, no controle de expressão de atividade de GAT, uma vez que o polipeptídeo funcional de GAT será expresso apenas se todos os fragmentos requeridos são expressos em um ambiente que permite processos de união para gerar o produto funcional. Em outro exemplo, a introdução de uma ou mais seqüências de inserção em um polinucleotídeo de GAT pode facilitar a recombinação com um polinucleotídeo de baixa homologia; o uso de um íntron ou inteína para a seqüência de inserção facilita a remoção da seqüência interveniente, desse modo, restaurando a função da variante codificada.

Conforme será compreendido por aqueles habilitados na técnica, pode ser vantajoso modificar uma seqüência de codificação para intensificar sua expressão em um hospedeiro em particular. O código genético é redundante com 64 códons possíveis, mas a maioria dos organismos usa,

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103/314 de preferência, um subconjunto desses códons. Os códons que são utilizados mais freqüentemente em uma espécie são denominados códons ótimos e aqueles não utilizados muito freqüentemente são classificados como códons raros ou de baixo uso (veja, por exemplo, Zhang e colaboradores (1991) Gene 105: 61-72) . Códons podem ser substituídos para refletir o uso de códon preferido do hospedeiro, um processo algumas vezes denominado “otimização de códon” ou “controle de tendência de códon por espécie”.

Seqüências de codificação otimizadas contendo códons preferidos para um hospedeiro procariota ou eucariota em particular (veja também, Murray e colaboradores (1989) Nucl. Acids Res. 17: 477-508) podem ser preparadas, por exemplo, para aumentar a taxa de tradução ou para produzir transcritos de RNA recombinante tendo propriedades desejáveis, tais como uma meia-vida mais longa, quando comparado a transcritos produzidos a partir de uma seqüência não otimizada. Códons de término de tradução também podem ser modificados para refletir a preferência do hospedeiro. Por exemplo, códons terminais preferidos para

S. cerevisiae e mamíferos são UAA e UGA, respectivamente. O códon terminal preferidos para plantas monocotiledôneas é UGA, enquanto que insetos e E. coli preferem usar UAA como o códon terminal (Dalphin e colaboradores (1996) Nucl. Acids Res. 24: 216-218) . Metodologia para otimização de uma seqüência de nucleotídeos para expressão em uma planta é proporcionada, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.015.891 e nas referências citadas na mesma.

Uma modalidade da invenção inclui um polinucleotídeo de GAT tendo códons ótimos para expressão em um hospedeiro

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104/314 relevante, por exemplo, uma planta transgênica hospedeira. Isso é particularmente desejável quando um polinucleotídeo de GAT de origem bacteriana é introduzido em uma planta transgênica, por exemplo, para conferir resistência ao glifosato à planta.

As seqüências de polinucleotídeos da presente invenção podem ser manipuladas de forma a alterar um polinucleotídeo de GAT por uma série de razões incluindo, mas não limitado, a alterações as quais modificam a clonagem, processamento e/ou expressão do produto genético. Por exemplo, alterações podem ser introduzidas usando métodos que são bem conhecidos na técnica, por exemplo, mutagênese sítiodirigida, para inserir novos sítios de restrição, alterar padrões de glicosilação, alterar a preferência de códon, introduzir sítios de união, etc.

Conforme descrito em maiores detalhes aqui, os polinucleotídeos da invenção incluem seqüências as quais codificam novos polipeptídeos de GAT e seqüências complementares às seqüências de codificação e novos fragmentos de seqüências de codificação e complementos das mesmas. Os polinucleotídeos podem estar na forma de RNA ou na forma de DNA e incluem mRNA, cRNA, RNA e DNA sintéticos, DNA e cDNA genômico. Os polinucleotídeos podem fita dupla ou fita simples e, se fita simples, podem ser a fita de codificação ou não codificação (anti-senso, fita complementar). Os polinucleotídeos, opcionalmente, incluem a seqüência de codificação de um polipeptídeo de GAT (i) em isolamento, (ii) em combinação com uma seqüência de codificação adicional, de modo a codificar, por exemplo, uma proteína de fusão, uma pré-proteína, uma pré-pró

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105/314 proteína ou semelhante, (iii) em combinação com seqüências de não codificação, tais como íntrons ou inteínas, elementos de controle, tais como um elemento promotor, intensificador, terminador ou regiões não traduzidas 5' e/ou 3' eficaz para a expressão de um seqüência de codificação em um hospedeiro adequado e/ou (iv) em um vetor ou ambiente hospedeiro no qual o polinucleotídeo de GAT é um gene heterólogo. Seqüências pode também ser encontradas em combinação com formulações composicionais típicas de ácidos nucleicos, incluindo na presença de veículos, tampões, adjuvantes, excipientes e semelhantes.

Os polinucleotídeos e oligonucleotídeos da invenção podem ser preparados através de métodos padrões em fase sólida, de acordo com métodos sintéticos conhecidos. Tipicamente, fragmentos de até cerca de 100 bases são individualmente sintetizados, então, unidos (por exemplo, através de métodos de ligação enzimática ou química ou métodos mediados por polimerase) para formar essencialmente qualquer seqüência contínua desejada. Por exemplo, polinucleotídeos e oligonucleotídeos da invenção podem ser preparados através de síntese química usando, por exemplo, o método clássico com fosforamidita descrito por Beaucage e colaboradores (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-69 ou o método descrito por Matthes e colaboradores (1984) EMBO J. 3: 801-05, por exemplo, conforme é tipicamente praticado em métodos de síntese automática. De acordo com o método com fosforamidita, oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador automático de DNA, purificados anelados, ligados e clonados em vetores apropriados.

Além disso, essencialmente qualquer ácido nucleico

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106/314 pode ser comumente adquirido de qualquer uma de uma variedade de fontes comerciais, tais como The Midland Certified Reagente Company (mcrc@oligos.com), The Great American Gene Company (www.genco.com), ExpressGen Inc.

(www.expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitas outras. Similarmente, peptídeos e anticorpos pode ser comumente adquiridos de qualquer uma de uma variedade de fontes, tais como PeptidoGenic (pkim@ccnet.com), HTI Bio-products, Inc. (www.htibio.com), BMA Biomedicals Ltda. (Reino Unido), Bio.Synthesis, Inc. e muitas outras.

Polinucleotídeos podem também ser sintetizados através de métodos bem conhecidos conforme descrito na literatura técnica. Veja, por exemplo, Carruthers e colaboradores, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418 (1982) e Adams e colaboradores (1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661. Fragmentos de DNA fita dupla podem, então, ser obtidos através de síntese da fita complementar e anelamento das fitas juntas sob condições apropriadas ou através de adição da fita complementar usando DNA polimerase com uma seqüência primer apropriada.

Textos gerais os quais descrevem técnicas de biologia molecular úteis aqui, incluindo mutagênese, incluem Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Volume 152 (Academic Press, Inc., San Diego, CA); Sambrook e colaboradores (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2^a ed., Volumes 1-3 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York); e Ausubel e colaboradores, eds. (2000) Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley &

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Sons, Inc.). Exemplos de técnicas suficientes para orientar aqueles habilitados na técnica com relação a métodos de amplificação in vitro, incluindo a reação em cadeia de polimerase (PCR), a reação em cadeia de ligase (LCR), amplificação por Οβ-replicase e outras técnicas mediadas por RNA polimerase (por exemplo, NASBA) são encontradas em Berger, Sambrook e Ausubel, bem como em Mullis e colaboradores (1987) Patente U.S. No. 4.683.202; Innis e colaboradores, eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to

Methods and Applications (Academic Press Inc. San Diego, CA); Arnheim & Levinson (1 de Outubro de 1990) Chemistry and Engineering News 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; Kwoh e colaboradores (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli e colaboradores (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 1874; Lomell e colaboradores (1989) J. Clin. Chem. 35: 1826; Landegren e colaboradores (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu e Wallace (1989) Gene 4: 560; Barringer e colaboradores (1990) Gene 89: 117 e Sooknanan e Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. Métodos aperfeiçoados de clonagem de ácidos nucleicos amplificados in vitro são descritos em Wallace e colaboradores Pat. U.S. No. 5.426.039. Métodos aperfeiçoados de amplificação de grandes ácidos nucleicos através de PCR são resumidos em Cheng e colaboradores (1994) Nature 369: 684-685 e nas referências citadas na mesma, no qual amplicons de PCR de até 40 kb são gerados. Aqueles habilitados apreciarão que essencialmente qualquer RNA pode ser convertido a um DNA fita dupla adequado para digestão por restrição, expansão por PCR e seqüenciamento

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108/314 usando transcriptase reversa e uma polimerase. Veja, Ausbel, Sambrook e Berger, todos supra.

Um aspecto da invenção proporciona um polinucleotídeo isolado ou recombinante selecionado do grupo consistindo de

5	SEQ	ID NO	: 516, 517, 518, 519, !	20,	521,	522,	523,	524,
	525,	526,	527, 528, 529, 530, 531,	532,	533,	534,	535,	536,
	537,	538,	539, 540, 541, 542, 543,	544,	545,	546,	547,	548,
	549,	550,	551, 552, 553, 554, 555,	556,	557,	558,	559,	560,
	561,	562,	563, 564, 565, 566, 567,	620,	622,	624,	626,	628,
10	630,	632,	634, 636, 638, 640, 642,	644,	646,	648,	650,	652,
	654,	656,	658, 660, 662, 664, 666,	668,	670,	672,	674,	676,
	678,	680,	682, 684, 686, 688, 690,	692,	694,	696,	698,	700,
	702,	704,	706, 708, 710, 712, 714,	716,	718,	720,	722,	724,
	726,	728,	730, 732, 734, 736, 738,	740,	742,	744,	746,	748,
15	750,	752,	754, 756, 758, 760, 762,	764,	768,	770,	772,	774,
	776,	778,	780, 782, 784, 786, 788,	790,	792,	794,	796,	798,
	800,	802,	804, 806, 808, 810, 812,	814,	816,	818,	820,	822,
	824,	832,	834, 836, 838, 840, 842,	844,	846,	848,	850,	852,
	854,	856,	858, 860, 862, 864, 866,	868,	870,	872,	874,	876,
20	878,	880,	882, 884, 886, 888, 890,	892,	894,	896,	898,	900,
	902,	904,	906, 908, 910, 912, 914,	916,	918,	920,	922,	924,
	926,	928,	930, 932, 933, 934, 935,	936,	937,	938,	939,	940,
	941,	942,	943, 944, 945, 947, 949,	951	e 952	.

Polinucleotídeos preferidos da presente invenção incluem uma seqüência que codifica um polinucleotídeo isolado ou recombinante e seqüências de aminoácidos que podem ser otimamente alinhadas com uma seqüência de aminoácidos de referência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 300, 445 e 457 para gerar um escore de similaridade de pelo menos 460 usando a matriz BLOSUM62,

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uma penalidade por existência de gap de 11 e uma

penalidade por

extensão de gap de 1, em que uma ou mais

das seguintes posições se conformam às seguintes

restrições: (i)	nas posições 18 e 38, existe um resíduo de
aminoácido Z5;	(ii) na posição 62, existe um resíduo de
aminoácido Z1;	(iii) na posição 124, existe um resíduo de
aminoácido Z6;	e (iv) na posição 144, existe um resíduo de

aminoácido Z2, em que: Z1 é um resíduo de aminoácido

selecionado do

grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um

resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de

F, W e Y; Z5

é um resíduo de aminoácido selecionado do

grupo consistindo de D e E; e Z6 é um resíduo de aminoácido

selecionado do

grupo consistindo de C, G e P e ainda em

que, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, pelo menos 90% se conformam às seguintes restrições: (a) nas

posições 2, 4,

15, 19, 26, 28, 31, 45, 51, 54, 86, 90, 91,

97, 103, 105, 106, 114, 123, 129, 139 e/ou 145, o resíduo de aminoácido é B1; e (b) nas posições 3, 5, 8, 10, 11, 14,

17, 24, 27, 32,

37, 47, 48, 49, 52, 57, 58, 61, 63, 68, 69,

79, 80, 82, 83, 89, 92, 100, 101, 104, 119, 120, 125, 126, 128, 131 e/ou 143, o resíduo de aminoácido é B2; em que B1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I,

L, M, F, W, Y

e V; e B2 é um aminoácido selecionado do

grupo consistindo de R, N, D, C, Q, E, G, H, K, P, S e T.

Quando usadas para especificar um aminoácido ou resíduo de

aminoácido, as

letras A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N,

P, Q, R, S, T, V, W e Y têm seu significado padrão, conforme usado na técnica e conforme proporcionado na Tabela 1 aqui.

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Alguns polinucleotídeo preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos de modo que, quando uma seqüência é otimamente alinhada com uma seqüência de aminoácidos de referência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 300, 445 e 457 para gerar um escore de similaridade de pelo menos 460 usando a matriz BLOSUM62, uma penalidade por existência de gap de 11 e uma penalidade por extensão de gap de 1, uma ou mais das seguintes posições se conformam às seguintes restrições: (i) nas posições 18 e 38, existe um resíduo de aminoácido Z5; (ii) na posição 62, existe um resíduo de aminoácido Z1; (iii) na posição 124, existe um resíduo de aminoácido Z6; e (iv) na posição 144, existe um resíduo de aminoácido Z2, em que: Z1 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P e ainda em que, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, pelo menos 80% se conformam às seguintes restrições: (a) nas posições 2, 4, 15, 19, 26, 28, 51, 54, 86, 90, 91, 97, 103, 105, 106, 114, 129, 139 e/ou 145, o resíduo de aminoácido é Z1; (b) nas posições 31 e/ou 45, o resíduo de aminoácido é Z2; (c) na posição 8, o resíduo de aminoácido é Z3; (d) na posição 89, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z6; (e) nas posições 82, 92, 101 e/ou 120, o resíduo de aminoácido é Z4; (f) nas posições 3, 11, 27 e/ou 79, o resíduo de aminoácido é Z5; (g) na posição 18, o

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111/314 resíduo de aminoácido é Z4 ou Z5; (h) na posição 123, o resíduo de aminoácido é Z1 ou Z2; (i) nas posições 12, 33, 35, 39, 53, 59, 112, 132, 135, 140 e/ou 146, o resíduo de aminoácido é Z1 ou Z3; (j) na posição 30, o resíduo de aminoácido é Z1; (k) na posição 6, o resíduo de aminoácido é Z6; (l) na posição 81, o resíduo de aminoácido é Z2 ou Z4; (m) na posição 113, o resíduo de aminoácido é Z3; (n) na posição 138, o resíduo de aminoácido é Z4; (o) na posição 142, o resíduo de aminoácido é Z2; (p) nas posições 57 e/ou 126, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z4;

(q) na posição 5, 17 e 61, o resíduo de aminoácido é Z4;

(r) na posição 24, o resíduo de aminoácido é Z3; (s) na posição 104, o resíduo de aminoácido é Z5; (t) nas posições 52 e/ou 69, o resíduo de aminoácido é Z3; (u) nas posições 14 e/ou 119, o resíduo de aminoácido é Z5; (v) nas posições 10, 32, 63 e/ou 83, o resíduo de aminoácido é Z5; (w) nas posições 48 e/ou 80, o resíduo de aminoácido é Z6; (x) na posição 40, o resíduo de aminoácido é Z1 ou Z2;

(y) na posição 96, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z5; (z) na posição 65, o resíduo de aminoácido é Z3, Z4 ou Z6; (aa) nas posições 84 e/ou 115, o resíduo de aminoácido é Z3; (ab) na posição 93, o resíduo de aminoácido é Z4; (ac) na posição 130, o resíduo de aminoácido é Z2; (ad) na posição 58, o resíduo de aminoácido é Z3, Z4 ou Z6; (ae) na posição 47, o resíduo de aminoácido é Z4 ou Z6; (af) nas posições 49 e/ou 100 o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z4;

(ag) na posição 68, o resíduo de aminoácido é Z4 ou Z5;

(ah) na posição 143, o resíduo de aminoácido é Z4; (ai) na posição 131, o resíduo de aminoácido é Z5; (aj) nas posições 125 e/ou 128, o resíduo de aminoácido é Z5; (ak)

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112/314 na posição 67, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z4; (al) na posição 60, o resíduo de aminoácido é Z5; e (am) na posição 37, o resíduo de aminoácido é Z4 ou Z6; em que Z1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z3 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de N, Q, S e T; Z4 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, H e K; Z5 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos ainda compreendendo o resíduo de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às posições especificadas em (a)-(am), pelo menos 90% se conformam às restrições de resíduos de aminoácido especificada in(a)(am) .

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos de modo que, quando uma seqüência é otimamente alinhada com SEQ ID NO: 300, 445 ou 457, pelo menos 90% dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos se conformam às seguintes restrições: (a) nas posições 1, 7,

9, 13, 20,	36,	42,	46,	50,	56, 64, 70,	72,	75,	76,	78,	94,
98, 107,	110,	117	,	118,	121 e/ou	141,	o	resíduo	de
aminoácido	é B1	; e	(b)	nas posições	16,	21,	22,	23,	25,
29, 34, 41,	43,	44,	55,	66,	71, 73, 74,	77,	85,	87,	88,	95,

99, 102,	108, 109, 111, 116, 122, 127,	133,	134,	136	e/ou
137, o	resíduo de aminoácido é B2;	em	que	B1	é um
aminoácido selecionado do grupo consistindo	de A,	I,	L, M,

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F, W, Y e V; e B2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, N, D, C, Q, E, G, H, K, P, S e T.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos de modo que, quando uma seqüência é otimamente alinhada com SEQ ID NO: 300, 445 ou 457, pelo menos 90% dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos se

conformam	às seguintes	restrições:	(a)	nas	posições 1,	7,
9, 13, 20,	42, 46, 50,	56, 64, 70,	72,	75,	76, 78, 94,	98,
107, 110,	117, 118, 121	e/ou 141, o	resíduo	de aminoácido é
B1; e (b)	nas posições	16, 21, 22,	23,	25,	29, 34, 36,	41,

43, 44, 55, 66, 71, 73, 74, 77, 85, 87, 88, 95, 99, 102, 108, 109, 111, 116, 122, 127, 133, 134, 136 e/ou 137, o resíduo de aminoácido é B2; em que B1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M, F, W, Y e V; e B2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, N, D, C, Q, E, G, H, K, P, S e T.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos de modo que, quando uma seqüência é otimamente alinhada com SEQ ID NO:

300, 445 ou 457, pelo menos 90% dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos se

conformam às	seguintes	restrições	: (a)	nas	posições 1,	7,
9, 20, 42, 50	, 72, 75,	76, 78, 94,	98,	110,	121	e/ou 141	, o
resíduo de aminoácido	é Z1; (b)	nas posições	13, 46,	56,
70, 107, 117	e/ou 118,	o resíduo	de aminoácido é Z2;	(c)
nas posições	23, 55,	71, 77, 88	e/ou	109	, o	resíduo	de
aminoácido é	Z3; (d) nas posições 16,	21,	41,	73, 85,	99
e/ou 111, o resíduo de	aminoácido	é Z4;	(e)	nas	posições	34
e/ou 95, o resíduo de	aminoácido	é Z5;	(f)	na	posição	22,

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 121/331

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25, 29, 43, 44, 66, 74, 87, 102, 108, 116, 122, 127, 133, 134, 136 e/ou 137, o resíduo de aminoácido é Z6; em que Z1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, Me V; Z2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z3 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de N, Q, S e T; Z4 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, H e K; Z5 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos ainda compreendendo na posição 36 um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de Z1 e Z3. Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos ainda compreendendo na posição 64 um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de Z1 e Z2.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos de modo que, quando uma seqüência é otimamente alinhada com SEQ ID NO: 300, 445 ou 457, pelo menos 80% dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos se conformam às seguintes restrições: (a) na posição 2, o resíduo de aminoácido é I ou L; (b) na posição 3, o resíduo de aminoácido é E; (c) na posição 4, o resíduo de aminoácido é V ou I; (d) na posição 5, o resíduo de aminoácido é K; (e) na posição 6, o resíduo de aminoácido é P; (f) na posição 8, o resíduo de aminoácido é N; (g) na posição 10, o resíduo de aminoácido é E; (h) na posição 11,

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o resíduo	de	aminoácido é	D ou E; (i) na	pos	ição 12, o
resíduo de	aminoácido é T;	(j)	na posição 14	, o	resíduo de
aminoácido	é	E ou D; (k)	na	posição 15,	o	resíduo de
aminoácido	é	L; (l) na posição	17, o resíduo	de	aminoácido

é H; (m) na posição 18, o resíduo de aminoácido é R, E ou

K; (n) na posição 19, o resíduo de aminoácido é I ou V; (o)

na posição 24,	o resíduo de	aminoácido é	Q;	(p) na	posição
26, o resíduo	de aminoácido	é M,	L,	V ou	I;	(q) na	posição
27, o resíduo	de aminoácido é	E;	(r)	na	posição	28, o
resíduo de aminoácido é A	ou	V;	(s)	na	posição	30, o

resíduo de aminoácido é M; (t) na posição 31, o resíduo de

aminoácido	é	Y	ou	F;	(u) na	posição	32,	o	resíduo	de
aminoácido	é	E	ou	D;	(v) na	posição	33,	o	resíduo	de
aminoácido	é	T	ou	S;	(w) na	posição	35,	o	resíduo	de
aminoácido	é	L;	(x)	na	posição	37, o resíduo	de	aminoácido
é R, G, E	ou	Q;	(y)	na	posição	39, o resíduo	de	aminoácido
é A ou S;	(z)	na	posição 40, o	resíduo de	aminoácido é F	ou
L ; (aa) na	posição	45,	o resí	duo de aminoácido	é Y ou	F;

(ab) na posição 47, o resíduo de aminoácido é R ou G; (ac) na posição 48, o resíduo de aminoácido é G; (ad) na posição 49, o resíduo de aminoácido é K, R ou Q; (ae) na posição 51, o resíduo de aminoácido é I ou V; (af) na posição 52, o resíduo de aminoácido é S; (ag) na posição 53, o resíduo de aminoácido é I ou V; (ah) na posição 54, o resíduo de aminoácido é A; (ai) na posição 57, o resíduo de aminoácido é H ou N; (aj) na posição 58, o resíduo de aminoácido é Q,

K, R ou P; (ak) na posição 59, o resíduo de aminoácido é A;

(al) na posição 60, o resíduo de aminoácido é E; (am) na posição 61, o resíduo de aminoácido é H ou R; (an) na posição 63, o resíduo de aminoácido é E ou D; (ao) na

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posição	65,	o	resíduo	de	aminoácido é	E,		P ou	Q;	(ap)	na
posição	67,	o	resíduo	de	aminoácido	é	Q	ou	R;	(aq)	na
posição	68,	o	resíduo	de	aminoácido	é	K	ou	E;	(ar)	na
posição	69,	o	resíduo	de	aminoácido é	Q;		(as)	na	posição

(ay) na posição 86, o resíduo de aminoácido é A; (az) na

posição	89, o	resíduo	de aminoácido	é	G,	T ou	S;	(ba) na
posição	90, o	resíduo	de aminoácido	é	L;	(bb)	na	posição
91, o resíduo	de aminoácido é L, I	ou	V;	(bc)	na	posição

92, o resíduo de aminoácido é R ou K; (bd) na posição 93, o resíduo de aminoácido é H; (be) na posição 96 o resíduo de

aminoácido	é	E	ou	Q;	(bf)	na posição 97,	o	resíduo	de
aminoácido	é		I;	(bg)	na	posição 100, o		resíduo	de
aminoácido	é	K	ou	N ;	(bh)	na posição 101,	o	resíduo	de
aminoácido	é	K	ou	R;	(bi)	na posição 103,	o	resíduo	de
aminoácido	é	A	ou	V;	(bj)	na posição 104,	o	resíduo	de
aminoácido	é		D;	(bk)	na	posição 105, o		resíduo	de
aminoácido	é	M,	L	ou I;	’ (bl)	na posição 106,	o	resíduo	de
aminoácido	é		L;	(bm)	na	posição 112, o		resíduo	de

aminoácido é T ou A; (bn) na posição 113, o resíduode aminoácido é S ou T; (bo) na posição 114, o resíduode aminoácido é A; (bp) na posição 115, o resíduode aminoácido é S; (bq) na posição 119, o resíduode

aminoácido	é	K	ou	R;	(br)	na	posição	120,	o	resíduo	de
aminoácido	é	K	ou	R;	(bs)	na	posição	123,	o	resíduo	de
aminoácido	é	F	ou	L;	(bt)	na	posição	125,	o	resíduo	de

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aminoácido	é	E;	(bu)	na	posição 126,	o	resíduo	de
aminoácido	é	Q	ou	H;	(bv)	na	posição	128,	o	resíduo	de
aminoácido	é	E	ou	D;	(bw)	na	posição	129,	o	resíduo	de
aminoácido	é	V	ou	I;	(bx)	na	posição	130,	o	resíduo	de

aminoácido é F; (by) na posição 131, o resíduo de aminoácido é D ou E; (bx) na posição 132, o resíduo de

aminoácido	é	T;	(ca)	na	posição	135,	o	resíduo	de
aminoácido	é	V;	(cb)	na	posição	138,	o	resíduo	de
aminoácido	é	H;	(cc)	na	posição	139,	o	resíduo	de
aminoácido	é	I;	(cd)	na	posição	140,	o	resíduo	de

aminoácido é L ou M; (ce) na posição 142, o resíduo de aminoácido é Y; (cf) na posição 143, o resíduo de aminoácido é K ou R; (cg) na posição 145, o resíduo de aminoácido é L ou I; e (ch) na posição 146, o resíduo de aminoácido é T.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos de modo que, quando uma seqüência é otimamente alinhada com SEQ ID NO: 300, 445 ou 457, pelo menos 90% dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos se conformam às restrições de resíduos de aminoácido especificadas em (a) - (ch) acima.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos que, quando otimamente alinhada com uma seqüência de aminoácidos de referência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 300, 445 e 457 para gerar um escore de similaridade de pelo menos 460 usando a matriz BLOSUM62, uma penalidade por existência de gap de 11 e uma penalidade por extensão de gap de 1, uma ou mais das

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 125/331

118/314 seguintes posições se conformam às seguintes restrições: (i) nas posições 18 e 38, existe um resíduo de aminoácido Z5; (ii) na posição 62, existe um resíduo de aminoácido Z1;

(iii) na posição 124, existe um resíduo de aminoácido Z6; e (iv) na posição 144, existe um resíduo de aminoácido Z2, em que: Z1 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P, ainda em que, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, pelo menos 80% se conformam às seguintes restrições: (a) nas posições 9, 76, 94 e 110, o resíduo de aminoácido é A; (b) nas posições 29 e 108, o resíduo de aminoácido é C; (c) na posição 34, o resíduo de aminoácido é D; (d) na posição 95, o resíduo de aminoácido é E; (e) na posição 56, o resíduo de aminoácido é F; (f) nas posições 43, 44, 66, 74, 87, 102, 116, 122, 127 e 136, o resíduo de aminoácido é G; (g) na posição 41, o resíduo de aminoácido é H; (h) na posição 7, o resíduo de aminoácido é I; (i) na posição 85, o resíduo de

aminoácido	é K; (j)	nas	posições 20	, 42, 50,	78	e	121, o
resíduo de	aminoácido	é	L; (k)	nas	posições	1	e	141, o
resíduo de	aminoácido	é	M; (l)	nas	posições	23	e	109, o
resíduo de	aminoácido	é	N; (m)	nas	posições	22,	25	, 133,

134 e 137, o resíduo de aminoácido é P; (n) na posição 71, o resíduo de aminoácido é Q; (o) nas posições 16, 21, 73, 99 e 111, o resíduo de aminoácido é R; (p) na posição 55, o resíduo de aminoácido é S; (q) na posição 77, o resíduo

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 126/331

119/314 de aminoácido é T; (r) na posição 107, o resíduo de aminoácido é W; e (s) na posição 13, 46, 70 e 118, o resíduo de aminoácido é Y.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos a qual se conforma a pelo menos uma das

seguintes	restrições	adicionais: (a)	na	posição	36,	o
resíduo	de	aminoácido	é	M,	L ou T; (b)	na	posição	72,	o
resíduo	de	aminoácido	é	L	ou I; (c)	na	posição	75,	o
resíduo	de	aminoácido	é	M	ou V; (d)	na	posição	64,	o
resíduo	de	aminoácido	é	L,	I ou F; (e)	na	posição	88,	o
resíduo	de	aminoácido	é	T	ou S; (f)	na	posição	117,	o
resíduo	de	aminoácido é Y	ou	F.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos na qual pelo menos uma das seguintes condições adicionais é reunida: (a) na posição 14, o resíduo de aminoácido é D; (b) na posição 18, o resíduo de aminoácido é E; (c) na posição 26, o resíduo de aminoácido é M ou V; (e) na posição 30, o resíduo de aminoácido é I; (f) na posição 32, o resíduo de aminoácido é D; (g) na posição 36, o resíduo de aminoácido é M ou T; (i) na posição 37, o resíduo de aminoácido é C; (j) na posição 38, o resíduo de aminoácido é D; (j) na posição 53, o resíduo de aminoácido é V; (k) na posição 58, o resíduo de aminoácido é R; (l) na posição 61, o resíduo de aminoácido é R; (m) na posição 62, o resíduo de aminoácido é L; (n) na posição 64, o resíduo de aminoácido é I ou F; (o) na posição 65, o resíduo de aminoácido é P; (p) na posição 72, o resíduo de aminoácido é I; (q) na posição 75, o resíduo de aminoácido é V; (r) na

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 127/331

120/314 posição 88, o resíduo de aminoácido é T; (s) na posição 89, o resíduo de aminoácido é G; (t) na posição 91, o resíduo de aminoácido é L; (u) na posição 98, o resíduo de aminoácido é I; (v) na posição 105, o resíduo de aminoácido I; (w) na posição 112, o resíduo de aminoácido é A; (x) na posição 124, o resíduo de aminoácido é G ou C; (y) na posição 128, o resíduo de aminoácido é D; (z) na posição 140, o resíduo de aminoácido é M; (aa) na posição 143, o resíduo de aminoácido é R; e (ab) na posição 144, o resíduo de aminoácido é W.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos em que, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às posições especificadas em (a) a (ab) conforme descrito acima, pelo

menos 80%	se conformam às	restrições de	resíduos	de
aminoácido	especificadas em (a)	a (ab).
Alguns	polinucleotídeos	preferidos	isolados	ou
recombinant	es da invenção codificam uma	seqüência	de

aminoácidos a qual se conforma a pelo menos uma das seguintes restrições adicionais: (a) na posição 41, o resíduo de aminoácido é H; (b) na posição 138, o resíduo de aminoácido é H; (c) na posição 34, o resíduo de aminoácido é N; e (d) na posição 55, o resíduo de aminoácido é S.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção são selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 577; (b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que

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121/314 é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 578; (c) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 621;

(d) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 579; (e) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 602; (f) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 697; (g) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 721;

(h) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 613; (i) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 89% idêntica à SEQ ID NO: 677; (j) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 584; (k) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 707;

(l) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 616; (m) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 612; e (n) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 590.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção são selecionada do grupo

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122/314 consistindo de: (a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 577; (b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 578; (c) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 621;

(l) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 616; (m) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 612; e (n) uma seqüência de

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123/314 nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 590, em que seguintes posições se conformam às seguintes restrições: (i) nas posições 18 e 38, existe um resíduo de aminoácido Z5; (ii) na posição 62, existe um resíduo de aminoácido Z1;

(iii) na posição 124, existe um resíduo de aminoácido Z6; e (iv) na posição 144, existe um resíduo de aminoácido Z2, em que: Z1 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção são selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 577; (b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 578; (c) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 621; (d) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 579; (e) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 602; (f) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 697; (g) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de

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124/314 aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 721;

(l) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 616; (m) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 612; e (n) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 590, ainda em que, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, pelo menos 90% se conformam às seguintes restrições: (a) nas posições 2, 4, 15, 19, 26, 28, 31, 45, 51, 54, 86, 90, 91, 97, 103, 105, 106, 114, 123, 129, 139 e/ou 145, o resíduo de aminoácido é B1; e (b) nas posições 3, 5, 8, 10, 11, 14, 17, 24, 27, 32, 37, 47, 48, 49, 52, 57, 58, 61, 63, 68, 69, 79, 80, 82, 83, 89, 92, 100, 101, 104, 119, 120, 125, 126, 128, 131 e/ou 143, o resíduo de aminoácido é B2; em que B1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M, F, W, Y e V; e B2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, N, D, C, Q, E, G, H, K, P, S e T.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou

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125/314 recombinantes da invenção são selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 577; (b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 578; (c) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 621;

(l) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 616; (m) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96%

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126/314 idêntica à SEQ ID NO: 612; e (n) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 590 e ainda em que, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, pelo menos 80% se conformam às seguintes restrições: (a) nas posições 2, 4, 15, 19, 26, 28, 51, 54, 86, 90, 91, 97, 103, 105, 106, 114, 129, 139 e/ou 145, o resíduo de aminoácido é Z1; (b) nas posições 31 e/ou 45, o resíduo de aminoácido é Z2; (c) na posição 8, o resíduo de aminoácido é Z3; (d) na posição 89, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z6; (e) nas posições 82, 92, 101 e/ou 120, o resíduo de aminoácido é Z4; (f) nas posições 3, 11, 27 e/ou 79, o resíduo de aminoácido é Z5; (g) na posição 18, o resíduo de aminoácido é Z4 ou Z5; (h) na posição 123, o resíduo de aminoácido é Z1 ou Z2; (i) nas posições 12, 33, 35, 39, 53, 59, 112, 132, 135, 140 e/ou

146, o	resíduo	de	aminoácido	é	Z1 ou Z3; (j)	na posição
30, o	resíduo	de	aminoácido	é	Z1; (k) na	posição 6, o
resíduo	de aminoácido é Z6;	(l)	na posição	81, o resíduo

de aminoácido é Z2 ou Z4; (m) na posição 113, o resíduo de aminoácido é Z3; (n) na posição 138, o resíduo de aminoácido é Z4; (o) na posição 142, o resíduo de aminoácido é Z2; (p) nas posições 57 e/ou 126, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z4; (q) na posição 5, 17 e 61, o resíduo de aminoácido é Z4; (r) na posição 24, o resíduo de aminoácido é Z3; (s) na posição 104, o resíduo de aminoácido é Z5; (t) nas posições 52 e/ou 69, o resíduo de aminoácido é Z3; (u) nas posições 14 e/ou 119, o resíduo de aminoácido é Z5; (v) nas posições 10, 32, 63 e/ou 83, o resíduo de aminoácido é Z5 ; (w) nas posições 48 e/ou 80,

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127/314 o resíduo de aminoácido é Z6; (x) na posição 40, o resíduo de aminoácido é Z1 ou Z2; (y) na posição 96, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z5; (z) na posição 65, o resíduo de aminoácido é Z3, Z4 ou Z6; (aa) nas posições 84 e/ou 115, o resíduo de aminoácido é Z3; (ab) na posição 93, o resíduo de aminoácido é Z4; (ac) na posição 130, o resíduo de aminoácido é Z2; (ad) na posição 58, o resíduo de aminoácido é Z3, Z4 ou Z6; (ae) na posição 47, o resíduo de aminoácido é Z4 ou Z6; (af) nas posições 49 e/ou 100, o resíduo de aminoácido é Z3 ou Z4; (ag) na posição 68, o resíduo de aminoácido é Z4 ou Z5; (ah) na posição 143, o resíduo de aminoácido é Z4; (ai) na posição 131, o resíduo de aminoácido é Z5; (aj) nas posições 125 e/ou 128, o resíduo de aminoácido é Z5; (ak) na posição 67, o resíduo

de aminoácido	é Z3	ou	Z4;	(al)	na posição 60, o	resíduo de
aminoácido	é	Z5;	e	(am)	na	posição 37, o	resíduo de
aminoácido	é	Z4	ou	Z6;	em	que Z1 é um	aminoácido

selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; Z2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z3 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de N, Q, S e T; Z4 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, He K; Z5 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e P.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos ainda em que, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às posições especificadas em (a)-(am), pelo menos 90% se conformam às restrições de resíduos de aminoácido especificada in(a)Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 135/331

128/314 (am) .

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos na qual, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, pelo menos 90% se conformam às seguintes restrições adicionais: (a) nas posições 1, 7, 9, 13, 20, 36, 42, 46, 50, 56, 64, 70, 72, 75, 76, 78, 94, 98, 107,

110, 117, 118, 121 e/ou 141, o resíduo de aminoácido é B1; e (b) nas posições 16, 21, 22, 23, 25, 29, 34, 41, 43, 44, 55, 66, 71, 73, 74, 77, 85, 87, 88, 95, 99, 102, 108, 109,

111, 116, 122, 127, 133, 134, 136 e/ou 137, o resíduo de aminoácido é B2; em que B1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M, F, W, Y e V; e B2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, N, D, C, Q, E, G, H, K, P, S e T.

43, 44, 55, 66, 71, 73, 74, 77, 85, 87, 88, 95, 99,102, 108, 109, 111, 116, 122, 127, 133, 134, 136 e/ou 137, o resíduo de aminoácido é B2; em que B1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M, F, W, Y e V; e B2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de

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129/314

R, N, D, C, Q, E, G, H, K, P, S e T.

conformam às seguintes	restrições:	(a)	nas	posições 1,	7,
9, 20, 42, 50, 72, 75,	76, 78, 94,	98,	110,	121	e/ou 141	, o
resíduo de aminoácido	é Z1; (b)	nas	posições	13, 46,	56,
70, 107, 117, e/ou 11	8, o resíduo de	aminoácido é Z2;	(c)
nas posições 23, 55,	71, 77, 88	e/ou 109	, o	resíduo	de
aminoácido é Z3; (d) nas posições 16,	21,	41,	73, 85,	99
e/ou 111, o resíduo de	aminoácido	é Z4	; (e)	nas	posições	34
e/ou 95, o resíduo de	aminoácido	é Z5	; (f)	na	posição	22,
25, 29, 43, 44, 66, 74, 87, 102,	108,	116,	122	, 127, 1	33,

134, 136 e/ou 137, o resíduo de aminoácido é Z6; em que Z1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, Me V; Z2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de F, W e Y; Z3 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de N, Q, S e T; Z4 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, H e K; Z5 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de D e E; e Z6 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de C, G e

P.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos ainda compreendendo na posição 36 um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de Z1 e Z3. Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de

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130/314 aminoácidos ainda compreendendo na posição 64 um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de Z1 e Z2.

é H; (m) na posição 18, o resíduo de aminoácido é R, E ou K; (n) na posição 19, o resíduo de aminoácido é I ou V; (o) na posição 24, o resíduo de aminoácido é Q; (p) na posição

26, o resíduo de aminoácido é M, L, V ou I; (q) na posição

27, o resíduo de aminoácido é E; (r) na posição 28, o resíduo de aminoácido é A ou V; (s) na posição 30, o resíduo de aminoácido é M; (t) na posição 31, o resíduo de aminoácido é Y ou F; (u) na posição 32, o resíduode aminoácido é E ou D; (v) na posição 33, o resíduode aminoácido é T ou S; (w) na posição 35, o resíduode aminoácido é L; (x) na posição 37, o resíduo de aminoácido é R, G, E ou Q; (y) na posição 39, o resíduo de aminoácido

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 138/331

131/314 é A ou S; (z) na posição 40, o resíduo de aminoácido é F ou L ; (aa) na posição 45, o resíduo de aminoácido é Y ou F; (ab) na posição 47, o resíduo de aminoácido é R ou G; (ac) na posição 48, o resíduo de aminoácido é G; (ad) na posição 49, o resíduo de aminoácido é K, R ou Q; (ae) na posição 51, o resíduo de aminoácido é I ou V; (af) na posição 52, o resíduo de aminoácido é S; (ag) na posição 53, o resíduo de aminoácido é I ou V; (ah) na posição 54, o resíduo de aminoácido é A; (ai) na posição 57, o resíduo de aminoácido é H ou N; (aj) na posição 58, o resíduo de aminoácido é Q,

(ay) na posição 86, o resíduo de aminoácido é A; (az) na

92, o resíduo de aminoácido é R ou K; (bd) na posição 93, o resíduo de aminoácido é H; (be) na posição 96, o resíduo de aminoácido é E ou Q; (bf) na posição 97, o resíduo de

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132/314 aminoácido é I; (bg) na posição 100, o resíduo de

aminoácido	é	K	ou	N ;	(bh)	na	posição	101,	o	resíduo	de
aminoácido	é	K	ou	R;	(bi)	na	posição	103,	o	resíduo	de
aminoácido	é	A	ou	V;	(bj)	na	posição	104,	o	resíduo	de

aminoácido é D; (bk) na posição 105, o resíduode aminoácido é M, L ou I; (bl) na posição 106, o resíduo de aminoácido é L; (bm) na posição 112, o resíduode aminoácido é T ou A; (bn) na posição 113, o resíduode aminoácido é S ou T; (bo) na posição 114, o resíduode aminoácido é A; (bp) na posição 115, o resíduode aminoácido é S; (bq) na posição 119, o resíduode

aminoácido é E; (bu) na posição 126, o resíduo de

aminoácido	é	Q	ou	H;	(bv)	na	posição	128,	o	resíduo	de
aminoácido	é	E	ou	D;	(bw)	na	posição	129,	o	resíduo	de
aminoácido	é	V	ou	I;	(bx)	na	posição	130,	o	resíduo	de

aminoácido é F; (by) na posição 131, o resíduode aminoácido é D ou E; (bx) na posição 132, o resíduode aminoácido é T; (ca) na posição 135, o resíduode aminoácido é V; (cb) na posição 138, o resíduode aminoácido é H; (cc) na posição 139, o resíduode aminoácido é I; (cd) na posição 140, o resíduode aminoácido é L ou M; (ce) na posição 142, o resíduode aminoácido é Y; (cf) na posição 143, o resíduode aminoácido é K ou R; (cg) na posição 145, o resíduode aminoácido é L ou I; e (ch) na posição 146, o resíduo de aminoácido é T.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou

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133/314 recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos de modo que, quando uma seqüência é otimamente alinhada com SEQ ID NO: 300, 445 ou 457, pelo menos 90% dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos se conformam às restrições de resíduos de aminoácido especificadas em (a) - (ch) acima.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção são selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 577; (b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 578; (c) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 621; (d) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 579; (e) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 602; (f) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 697; (g) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 721; (h) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 613; (i) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 89% idêntica à SEQ ID NO: 677; (j) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que

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134/314 é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 584; (k) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 707;

(l) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 616; (m) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 612; e (n) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 590 e ainda em que, dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos que correspondem às seguintes posições, pelo menos 80% se conformam às seguintes restrições: (a) nas posições 9, 76, 94 e 110, o resíduo de aminoácido é A; (b) nas posições 29 e 108, o resíduo de aminoácido é C; (c) na posição 34, o resíduo de aminoácido é D; (d) na posição 95, o resíduo de aminoácido é E; (e) na posição 56, o resíduo de aminoácido é F; (f) nas posições 43, 44, 66, 74, 87, 102, 116, 122, 127 e 136, o resíduo de aminoácido é G; (g) na posição 41, o resíduo de aminoácido é H; (h) na posição 7, o resíduo de aminoácido é I; (i) na posição 85, o resíduo de

134 e 137, o resíduo de aminoácido é P; (n) na posição 71, o resíduo de aminoácido é Q; (o) nas posições 16, 21, 73, 99 e 111, o resíduo de aminoácido é R; (p) na posição 55, o resíduo de aminoácido é S; (q) na posição 77, o resíduo de aminoácido é T; (r) na posição 107, o resíduo de

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135/314 aminoácido é W; e (s) na posição 13, 46, 70 e 118, o resíduo de aminoácido é Y.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos ainda compreendendo pelo menos uma resíduo de aminoácido que vai de encontro aos seguintes critérios: (a) na posição 14, o resíduo de aminoácido é D; (b) na posição 18, o resíduo de aminoácido é E; (c) na posição 26, o resíduo de aminoácido é M ou V; (e) na posição 30, o resíduo de aminoácido é I; (f) na posição 32, o resíduo de aminoácido é D; (g) na posição 36, o resíduo de aminoácido é M ou T; (i) na posição 37, o resíduo de aminoácido é C; (j) na posição 38, o resíduo de aminoácido é D; (j) na posição 53, o resíduo de aminoácido é V; (k) na posição 58, o resíduo de aminoácido é R; (l) na posição 61, o resíduo de aminoácido é R; (m) na posição 62, o resíduo de aminoácido é L; (n) na posição 64, o resíduo de aminoácido é I ou F; (o) na posição 65, o resíduo de aminoácido é P; (p) na posição 72, o resíduo de aminoácido é I; (q) na posição 75, o resíduo de aminoácido é V; (r) na posição 88, o resíduo de aminoácido é T; (s) na posição 89, o resíduo de aminoácido é G; (t) na posição 91, o resíduo de aminoácido é L; (u) na posição 98, o resíduo de aminoácido é I; (v) na posição 105, o resíduo de aminoácido I; (w) na posição 112, o resíduo de aminoácido é A; (x) na posição 124, o resíduo de aminoácido é G ou C; (y) na posição 128,

o resíduo de aminoácido é	D; (z) na posição	140, o resíduo
de aminoácido é	M;	(aa)	na posição	143,	o resíduo	de
aminoácido é R;	e	(ab)	na posição	144,	o resíduo	de

aminoácido é W.

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Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos de modo que, quando uma seqüência é otimamente alinhada com SEQ ID NO: 300, 445 ou 457, pelo menos 80% dos resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos se conformam às restrições de resíduos de aminoácido especificadas em (a) a (ab) acima.

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção compreendem uma seqüência de nucleotídeos a qual codifica uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 919 (tais como, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos a qual codifica SEQ ID NO: 917, 919, 921, 923, 925, 927, 833, 835, 839, 843, 845, 859, 863, 873, 877, 891, 895, 901, 905, 907, 913, 915 ou 950); (b) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 929 (tais como, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos a qual codifica SEQ ID NO: 929, 931, 835, 843, 849 ou 867); (c) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 847 (tais como, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos a qual codifica SEQ ID NO: 845 ou 847); (d) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 851; (e) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 853; (f) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 855 (tais como, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos a qual codifica SEQ ID NO: 835 ou 855); (g) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 857; (h) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à

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SEQ ID NO: 861 (tais como, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos a qual codifica SEQ ID NO: 839, 861 ou 883);

(i) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 871; (j) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 875; (k) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 881; (l) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 885 (tais como, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos a qual codifica SEQ ID NO: 845 ou 885); (m) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 887; (n) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 889 (tais como, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos a qual codifica SEQ ID NO: 863, 889, 891 ou 903); (o) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 893; (p) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 897; (q) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 899;

(r) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 909 (tais como, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos a qual codifica SEQ ID NO: 883 ou 909); (s) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 911; (t) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 837; (u) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 841; (v) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 865; (w) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 869; e (x) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 879.

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Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção são selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 919 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 916, 918, 920, 922, 924, 926, 832, 834, 838, 842, 844, 858, 862, 872, 876, 890, 894, 900, 904, 906, 912, 914, 939, 940, 941, 942, 943, 944, 949, 951 ou 952); (b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 929 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 928, 930, 834, 842, 848, 866, 936 ou 937); (c) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 847 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 844 ou 846); (d) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 851 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 850); (e) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 853 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 852); (f) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 855 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 834 ou 854); (g) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 857 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 856) ; (h) uma seqüência

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139/314 de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos

que é pelo	menos 98%	idêntica à SEQ	ID	NO:	861	(por
exemplo,	uma	seqüência	de nucleotídeos	tais	como	SEQ ID	NO:
838, 860	ou	882); (i)	uma seqüência	de	nucleotídeos	que
codifica	uma	seqüência	de aminoácidos	que	é	pelo	menos	98%

idêntica à SEQ ID NO: 871 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 870); (j) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 875 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 874); (k) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 881 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 880); (l) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 885 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 844 ou 884); (m) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 887 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 886); (n) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 889 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 862, 888, 890 ou 902); (o) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 893 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 892); (p) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 897 (por

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140/314 exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 896); (q) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 899 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 898); (r) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 909 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 882 ou 908); (s) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 911 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 910); (t) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 837 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 836);

(u) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 841 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 840); (v) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 865 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 864);

(w) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 869 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 868); e (x) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 879 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 878).

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou

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141/314 recombinantes da invenção compreendem uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 929 e a qual compreende um resíduo de Gly ou Asn na posição de aminoácido correspondendo à posição 33 de SEQ ID NO: 929 (tais como, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos a qual codifica SEQ ID NO: 837, 849, 893, 897, 905, 921, 927, 929 ou 931) . Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção compreendem uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 929 e a qual compreende um resíduo de Gly ou Asn na posição de aminoácido correspondendo à posição 33 de SEQ ID NO: 929 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos tais como SEQ ID NO: 836, 848, 892, 896, 904, 920, 926, 928, 930, 938).

Alguns polinucleotídeos preferidos isolados ou recombinantes da invenção codificam uma seqüência de aminoácidos a qual ainda compreende um ou mais resíduos de aminoácidos que vão de encontro aos seguintes critérios: (a) na posição 41, o resíduo de aminoácido é H; (b) na posição 138, o resíduo de aminoácido é H; (c) na posição 34, o resíduo de aminoácido é N; e (d) na posição 55, o resíduo de aminoácido é S.

Embora a descrição dos polipeptídeos da invenção seja, algumas vezes, expressa aqui como uma lista de possíveis restrições sobre quais resíduos de aminoácidos são encontrados em posições em particular, em algumas modalidades, um polipeptídeo da invenção vai de encontro a todo um conjunto em particular de possíveis restrições. Isto é, em alguns casos aqui, uma lista de possíveis

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142/314 restrições é expressa como uma lista de opções relacionadas através da conjunção e/ou e, em algumas modalidades, cada uma de tais conjunções opera como um e ao invés de como ou. Em algumas modalidades, possíveis restrições as quais 5 são expressas como possibilidades alternativas são todas encontradas no polipeptídeo da invenção; isso é verdade apenas onde as possibilidades alternativas não são mutuamente exclusivas.

Variações de Seqüência:

Será apreciado por aqueles habilitados na técnica que, em virtude da degenerância do código genético, uma série de seqüências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos de GAT da invenção podem ser produzida, algumas das quais trazendo identidade substancial às seqüências de ácido 15 nucleico explicitamente divulgadas aqui.

Tabela 1: Tabela de Códons

Aminoácidos			Códon
Alanina	Ala	A	GCA	GCC	GCG	GCU
Cisteína	Cys	C	UGC	UGU
Ácido	Asp	D	GAC	GAU
aspártico
Ácido	Glu	E	GAA	GAG
glutâmico
Fenilalanina	Phe	F	UUC	UUU
Glicina	Gly	G	GGA	GGC	GGG	GGU
Histidina	His	H	CAC	CAU
Isoleucina	Ile	I	AUA	AUC	AUU
Lisina	Lys	K	AAA	AAG
Leucina	Leu	L	UUA	UUG	CUA	CUC	CUG	CUU
Metionina	Met	M	AUG

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Aminoácidos			Códon
Asparagina	Asn	N	AAC	AAU
Prolina	Pro	P	CCA	CCC	CCG	CCU
Glutamina	Gln	Q	CAA	CAG
Arginina	Arg	R	AGA	AGG	CGA	CGC	CGG	CGU
Serina	Ser	S	AGC	AGU	UCA	UCC	UCG	UCU
Treonina	Thr	T	ACA	ACC	ACG	ACU
Valina	Val	V	GUA	GUC	GUG	GUU
Triptofano	Trp	W	UGG
Tirosina	Tyr	Y	UAC	UAU

Por exemplo, inspeção da tabela de códons (Tabela 1) mostra que os códons AGA, AGG, CGA, CGC, CGG e CGU codificam todos o aminoácido arginina. Assim, em cada posição nos ácidos nucleicos da invenção onde uma arginina é especificada através de um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos acima sem alteração do polipeptídeo codificado. Deve ser compreendido que U em uma seqüência de RNA corresponde a T em uma seqüência de DNA.

Usando como um exemplo a seqüência de ácido nucleico correspondendo aos nucleotídeos 1-15 de SEQ ID NO:1 (ATG ATT GAA GTC AAA (SEQ ID NO: 826)), uma variação silenciosa dessa seqüência inclui AGT ATC GAG GTG AAG (SEQ ID NO: 827); ambas as seqüências codificam uma seqüência de aminoácidos MIEVK (SEQ ID NO: 828), a qual corresponde aos aminoácidos 1-5 de SEQ ID NO: 6.

Tais “variações silenciosas” são uma espécie de “variações conservativamente modificadas,” conforme discutido abaixo. Aqueles habilitados reconhecerão que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, o qual é

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144/314 comumente o único códon para metionina) pode ser modificado através de técnicas padrões para codificar um polipeptídeo funcionalmente idêntico. Conseqüentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico o qual codifica um polipeptídeo está implícita em qualquer seqüência descrita. A invenção proporciona cada e toda variação possível da seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção que poderia ser feita através de combinações selecionadas baseado em possíveis escolhas de códon. Essas combinações são feitas de acordo com o código genético triplo padrão (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 1) quando aplicado a uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo homólogo de GAT da invenção. Todas de tais variações de cada ácido nucleico aqui são especificamente proporcionadas e descritas levando-se em conta uma seqüência em combinação com o código genético. Qualquer variante pode ser produzida conforme observado aqui.

Um grupo de dois ou mais códons diferentes que, quando traduzidos no mesmo contexto, codificam todos o mesmo aminoácido, é referido aqui como “códons equivalentes.” Conforme descrito aqui, em alguns aspectos da invenção, um polinucleotídeo de GAT é manipulado para uso otimizado de códon em um organismo hospedeiro desejado, por exemplo um hospedeiro vegetal. O termo “otimizado ou “ótimo” não se destina a estar limitado à melhor combinação possível de códons, mas simplesmente indica que a seqüência de codificação como um todo possui um uso de códon aperfeiçoado com relação a um polinucleotídeo precursor a partir do qual ela foi derivada. Assim, em um aspecto, a

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145/314 invenção proporciona um método para a produção um polinucleotídeo variante de GAT através de substituição de pelo menos um códon original em uma seqüência de nucleotídeos por um códon equivalente que é, de preferência, usado em um organismo hospedeiro desejado, por exemplo, uma planta, com relação ao códon original.

“Variações conservativamente modificadas” ou simplesmente “variações conservativas” de uma seqüência de ácido nucleico em particular se refere àqueles ácidos nucleicos os quais codificam seqüências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas ou, onde o ácido nucleico não codifica uma seqüência de aminoácidos, seqüências essencialmente idênticas. Aqueles habilitados reconhecerão que substituições, deleções ou adições individuais as quais alteram, adicionam ou deletam um único aminoácido ou um pequeno percentual de aminoácidos (tipicamente menos do que 5%, mais tipicamente menos do que 4%, 2% ou 1% ou menos) em uma seqüência codificada são “variações conservativamente modificadas” onde as alterações resultam na deleção de um aminoácido, adição de um aminoácido ou substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar.

Tabelas de substituição conservativa proporcionando aminoácidos funcionalmente similar são bem conhecidas na técnica. A Tabela 2 apresenta seis grupos os quais contêm aminoácidos que são “substituições conservativas” uns pelos outros.

Tabela 2: Grupos com substituição conservative

1	Alanina (A)	Serina (S)	Treonina (T)
2	Ácido	Ácido

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	aspártico (D)	glutâmico (E)
3	Asparagina (N)	Glutamina (Q)
4	Arginina (R)	Lisina (K)
5	Isoleucina (I)	Leucina (L)	Metionina (M)	Valina (V)
6	Fenilalanina (F)	Tirosina (Y)	Triptofano (W)

Assim, “variações conservativamente substituídas de uma seqüência de polipeptídeo listada da presente invenção incluem substituições de um pequeno percentual, tipicamente menos do que 5%, mais tipicamente menos do que 2% e freqüentemente menos do que 1%, dos aminoácidos da seqüência de polipeptídeo, por um aminoácido conservativamente selecionado do mesmo grupo de substituição conservativa. Assim, uma variação de polipeptídeo conservativamente substituída da invenção pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições com uma variação conservativamente substituída do mesmo grupo de substituição conservativa.

Por exemplo, uma variação conservativamente substituída do polipeptídeo identificado aqui como SEQ ID NO: 6 conterá “substituições conservativas” de acordo com os seis grupos definidos acima, em até 7 resíduos (isto é, 5% dos aminoácidos) no polipeptídeo com 146 aminoácidos.

Em um outro exemplo, se quatro substituições conservativas estiverem localizadas na região correspondendo aos aminoácidos 21 a 30 de SEQ ID NO: 6, exemplos de variações conservativamente substituídas dessa região, RPN QPL EAC M (SEQ ID NO: 829), incluem:

KPQ QPV ESC M (SEQ ID NO: 830) e

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KPN NPL DAC V (SEQ ID NO: 831) e semelhantes, de acordo com as substituições conservativas listadas na Tabela 2 (no exemplo acima, as substituições conservativas estão sublinhadas). A listagem de seqüências de proteína aqui, em conjunto com a tabela de substituição acima, proporciona uma listagem expressa de todas as proteínas conservativamente substituídas.

Finalmente, a adição de seqüências as quais não alteram a atividade de uma molécula de ácido nucleico codificada, tal como a adição de uma seqüência de nãocodificação ou não-funcional, é uma variação conservativa do ácido nucleico básico.

Aqueles habilitados apreciarão que muitas variações conservativas de construtos de ácido nucleico as quais são divulgadas proporcionam um construto funcionalmente idêntica. Por exemplo, conforme discutido acima, a despeito da degenerância do código genético, substituições silenciosas” (isto é, substituições em uma seqüência de ácido nucleico as quais não resultam em uma alteração em um polipeptídeo codificado) são uma característica implicada de cada seqüência de ácido nucleico a qual codifica um aminoácido. Similarmente, “substituições conservativas de aminoácido,” em um ou em uns poucos aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos são substituídas por diferentes aminoácidos com propriedades altamente similares, sendo também prontamente identificadas como sendo altamente similares ao construto divulgado. Tais variações conservativas de cada seqüência divulgada são uma característica da presente invenção.

Modificações não-conservativas de um ácido nucleico em

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148/314 particular são aquelas as quais substituem qualquer aminoácido não caracterizado como uma substituição conservativa. Por exemplo, qualquer substituição a qual cruza as ligações dos seis grupos apresentados na Tabela 2. Essas incluem substituições de aminoácidos básicos ou ácidos por aminoácidos neutros, (por exemplo, Asp, Glu, Asn ou Gln por Val, Ile, Leu ou Met) , aminoácidos aromaticos por aminoácidos ácidos (por exemplo, Phe, Tyr ou Trp por Asp, Asn, Glu ou Gln) ou qualquer outra substituição que não substituiu um aminoácido por um aminoácido semelhante.

Hibridização de Ácido Nucleico:

Ácidos nucleicos “se hibridizam quando eles se associam, tipicamente em solução. Ácidos nucleicos se hibridizam em virtude de uma variedade de forças físicoquímicas bem caracterizadas, tais como ligação de hidrogênio, exclusão de solvente, empilhamento de base e semelhantes. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrada em Tijssen (1993) Laboratory Techniques em Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays (Elsevier, New York (Tijssen)), bem como em Ausubel, supra, Hames e Higgins (1995) Gene Probes 1, IRL Press at Oxford Universidade Press, Oxford, Inglaterra (Hames e Higgins 1) e Hames e Higgins (1995) Gene Probes 2, IRL Press at Oxford Universidade Press, Oxford, Inglaterra (Hames e Higgins 2) e proporcionam detalhes sobre a síntese, rotulação, detecção e quantificação de DNA e RNA, incluindo oligonucleotídeos.

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Condições de lavagem de hibridização estringentes” no contexto de experimentos de hibridização de ácido nucleico, tais como hibridizações de Southern e Northern, são seqüência-dependentes e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993), supra e em Hames e Higgins 1 e Hames e Higgins 2, supra.

Para fins da presente invenção, geralmente, condições de hibridização e lavagem altamente estringentes” são selecionadas para ser cerca de 5°C ou menos do que o ponto de fusão térmica (Tm) para a seqüência específica em uma resistência iônica e pH definidos (conforme observado abaixo, condições altamente estringentes podem também ser referidas em termos comparativos). A Tm é a temperatura (sob resistência iônica e pH definidos) na qual 50% da seqüência de teste se hibridiza a uma sonda perfeitamente combinada. Condições muito estringentes são selecionadas para serem iguais à Tm para uma sonda em particular.

A Tm de uma dupla de ácido nucleico indica a temperatura na qual a dupla é 50% desnaturada sob as condições fornecidas e isso representa uma medida direta da estabilidade do híbrido de ácido nucleico. Assim, a Tm corresponde à temperatura correspondendo ao ponto mediano na transcrição de hélice em bobina aleatória e ela depende do comprimento, composição de nucleotídeo e resistência iônica para longos trechos de nucleotídeos.

Após hibridização, material de ácido nucleico não hibridizado pode ser removido através de uma série de lavagens, a estringência da qual pode ser ajustada,

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150/314 dependendo dos resultados desejados. Condições de lavagem em baixa estringência (por exemplo, usando maior concentração de sal e menor temperatura) aumentam a sensibilidade, mas pode produzir sinais de hibridização não específicos e elevados sinais de fundo. Condições de maior estringência (por exemplo, usando menor concentração de sal e maior temperatura que está mais próxima da temperatura de hibridização) diminuem o sinal de fundo, tipicamente com apenas o sinal específico restante. Veja Rapley, R. e Walker, J.M. eds., Molecular Biomethods Handbook (Humana Press, Inc. 1998) (aqui depois “Rapley e Walker”), o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade para todas as finalidades.

A Tm de uma dupla de DNA-DNA pode ser estimada usando a Equação 1 como segue:

Tm (°C) = 81,5°C + 16,6 0,72 (%f) - 500/n, onde M monovalentes (usualmente Na+) nucleotídeos guanosina (G) percentual de formalina e (log10M) + 0,41 (% G + C) é a molaridade dos cátions , (%G + C) é o percentual de e citosina (C), (%f) é o n é o número de bases de nucleotídeo (isto é, comprimento) do híbrido. Veja Rapley e Walker, supra.

A Tm de uma dupla de RNA-DNA pode ser estimada através de uso da Equação 2 como segue:

Tm (°C) = 79,8°C + 18,5 (logoM) + 0,58 (% G + C) 11,8(% G + C)² - 0,56 (%f) - 820/n, onde M é a molaridade dos cátions monovalentes (usualmente Na+), (% G + C) é to percentual de nucleotídeos guanosina (G ) e citosina (C), (%f) é o percentual de formamida e n é o número de bases de nucleotídeo (isto é, comprimento) do híbrido. Id.

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As Equações 1 e 2 são, tipicamente, precisas apenas para duplas de híbridos maiores do que cerca de 100-200 nucleotídeos.

A Tm de seqüências de ácido nucleico menores do que 50 nucleotídeos pode ser calculada como segue:

Tm (°C) = 4(G + C) + 2 (A + T), onde A (adenina), C, T (timina) e G são os números dos nucleotídeos correspondentes.

Um exemplo de condições de hibridização estringentes para hibridização de ácidos nucleicos complementares os quais têm mais do que 100 resíduos complementares sobre um filtro em uma Southern ou northern blot é 50% de formalina com 1 mg de heparina a 42°C, com a hibridização sendo realizada durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem estringentes é uma lavagem de 0,2x SSC a 65°C durante 15 minutos (veja Sambrook, supra para uma descrição do tampão SSC). Freqüentemente, a lavagem em elevada estringência é precedida por uma lavagem em baixa estringência para remover o sinal de sonda de fundo. Em exemplo de lavagem em baixa estringência é 2x SSC a 40°C durante 15 minutos.

Em geral, uma proporção de sinal para ruído de 2,5x-5x (ou maior) do que observado para uma sonda não relacionada em um ensaio de hibridização em particular indica a detecção de uma hibridização específica. A detecção de hibridização estringente entre duas seqüências no contexto da presente invenção indica similaridade estrutural ou homologia relativamente forte, por exemplo, os ácidos nucleicos da presente invenção proporcionados em uma das listagens de seqüência aqui.

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Conforme observado, condições altamente estringentes” são selecionadas para ser cerca de 5°C ou menos do que o ponto de fusão térmica (Tm) para a seqüência específica em uma resistência iônica e pH definidos. Seqüências alvo que são intimamente relacionadas ou idênticas a uma seqüência de nucleotídeos de interesse (por exemplo, sondas”) podem ser identificadas sob condições altamente estringentes. Condições de menor estringência são apropriadas para seqüências que são menos complementares. Veja, por exemplo, Rapley e Walker, supra.

Hibridização comparativa pode ser usada para identificar os ácidos nucleicos da invenção e esse método de hibridização comparativa é um método preferido para distinguir os ácidos nucleicos da invenção. Detecção de hibridização altamente estringente entre duas seqüência de nucleotídeos no contexto da presente invenção indica similaridade estrutural/homologia relativamente forte, por exemplo, aos ácidos nucleicos proporcionados em uma listagem de seqüência aqui. Hibridização altamente estringente entre duas seqüências de nucleotídeos demonstra um grau de similaridade ou homologia de estrutura, composição de bases de nucleotídeo, disposição ou ordem que é maior do que o detectado através de condições de hibridização estringentes. Em particular, detecção de hibridização altamente estringente no contexto da presente invenção indica forte similaridade estrutural ou homologia estrutural (por exemplo, estrutura de nucleotídeo, composição de base, disposição ou ordem), por exemplo, aos ácidos nucleicos proporcionados nas listagens de seqüência aqui. Por exemplo, é desejável identificar ácidos

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153/314 nucleicos de teste que se hibridizam aos ácidos nucleicos exemplificativos aqui sob condições estringentes.

Assim, uma medida de hibridização estringente é a capacidade de se hibridizar a um dos ácidos nucleicos

5	listados	(por	exemplo,	seqüências	de	ácido	nucleico	como
	SEQ ID NO	: 516, 517, 518, 519, 520,	521,	522, 523,	524,
	525, 526,	527,	528, 529,	530, 531,	532,	533,	534, 535,	536,
	537, 538,	539,	540, 541,	542, 543,	544,	545,	546, 547,	548,
	549, 550,	551,	552, 553,	554, 555,	556,	557,	558, 559,	560,
10	561, 562,	563,	564, 565,	566, 567,	620,	622,	624, 626,	628,
	630, 632,	634,	636, 638,	640, 642,	644,	646,	648, 650,	652,
	654, 656,	658,	660, 662,	664, 666,	668,	670,	672, 674,	676,
	678, 680,	682,	684, 686,	688, 690,	692,	694,	696, 698,	700,
	702, 704,	706,	708, 710,	712, 714,	716,	718,	720, 722,	724,
15	726, 728,	730,	732, 734,	736, 738,	740,	742,	744, 746,	748,
	750, 752,	754,	756, 758,	760, 762,	764,	768,	770, 772,	774,
	776, 778,	780,	782, 784,	786, 788,	790,	792,	794, 796,	798,
	800, 802,	804,	806, 808,	810, 812,	814,	816,	818, 820,	822,
	824, 832,	834,	836, 838,	840, 842,	844,	846,	848, 850,	852,
20	854, 856,	858,	860, 862,	864, 866,	868,	870,	872, 874,	876,
	878, 880,	882,	884, 886,	888, 890,	892,	894,	896, 898,	900,
	902, 904,	906,	908, 910,	912, 914,	916,	918,	920, 922,	924,
	926, 928,	930,	932, 933,	934, 935,	936,	937,	938, 939,	940,
	941, 942,	943,	944, 945,	947, 949,	951	e 952	e seqüência de
25	polinucleotídeo complementares das	mesmas),	sob condições
	altamente	estringentes (	ou condições muito	estringentes ou
	condições	de	hibridização ultra-elevada estringência ou
	condições	de	hibridização de	ultra-	ultra elevada

estringência). Condições de hibridização e lavagem estringentes (bem como condições de hibridização altamente

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154/314 estringentes, de ultra-elevada estringência ou ultra-ultra elevada estringência) podem ser facilmente determinadas empiricamente para qualquer ácido nucleico de teste. Por exemplo, na determinação de condições de hibridização e 5 lavagem altamente estringentes, as condições de hibridização e lavagem são gradualmente aumentadas (por exemplo, através de aumento da temperatura, diminuição da concentração de sal, aumento da concentração de detergente e/ou aumento da concentração de solventes orgânicos, tal 10 como formalina, na hibridização ou lavagem), até que um conjunto de critérios selecionado seja obtido. Por exemplo, as condições de hibridização e lavagem são gradualmente aumentadas até que uma sonda compreendendo uma ou mais seqüências de ácido nucleico selecionadas de SEQ ID

15	NO:	516,	517,	518,	519,	520,	521,	522,	523,	524,	525,	526
	527,	528,	529,	530,	531,	532,	533,	534,	535,	536,	537,	538
	539,	540,	541,	542,	543,	544,	545,	546,	547,	548,	549,	550
	551,	552,	553,	554,	555,	556,	557,	558,	559,	560,	561,	562
	563,	564,	565,	566,	567,	620,	622,	624,	626,	628,	630,	632
20	634,	636,	638,	640,	642,	644,	646,	648,	650,	652,	654,	656
	658,	660,	662,	664,	6 6 6,	668,	670,	672,	674,	676,	678,	680
	682,	684,	686,	688,	690,	692,	694,	69 6,	698,	700,	702,	704
	706,	708,	710,	712,	714,	716,	718,	720,	722,	724,	726,	728
	730,	732,	734,	736,	738,	740,	742,	744,	746,	748,	750,	752
25	754,	756,	758,	760,	762,	764,	768,	770,	772,	774,	776,	778
	780,	782,	784,	786,	788,	790,	792,	794,	796,	798,	800,	802
	804,	806,	808,	810,	812,	814,	816,	818,	820,	822,	824,	832
	834,	836,	838,	840,	842,	844,	846,	848,	850,	852,	854,	856
	858,	860,	862,	864,	866,	868,	870,	872,	874,	876,	878,	880
30	882,	884,	886,	888,	890,	892,	894,	896,	898,	900,	902,	904

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155/314

	906,	908,	910,	912,	914,	916,	918,	920,	922, 924,	926,	928,
	930,	932,	933,	934,	935,	936,	937,	938,	939, 940,	941,	942,
	943,	944,	945	, 947, !	949,	951	e 952 e seqüências de
	polinucleotídeo	complementare	s às	mesmas, se liguem	a um
5	alvo	complementar	perfeitamente combinado (novamente	, um
	ácidc	nucleico	compreendendo	uma	ou	mais seqüências de
	ácidc	nucleico	selecionadas de SEQ ID	NO: 516,	517,	518,
	519,	520,	521,	522,	523,	524,	525,	526,	527, 528,	529,	530,
	531,	532,	533,	534,	535,	536,	537,	538,	539, 540,	541,	542,
10	543,	544,	545,	546,	547,	548,	549,	550,	551, 552,	553,	554,
	555,	556,	557,	558,	559,	560,	561,	562,	563, 564,	565,	566,
	567,	620,	622,	624,	626,	628,	630,	632,	634, 636,	638,	640,
	642,	644,	646,	648,	650,	652,	654,	656,	658, 660,	662,	664,
	666,	668,	670,	672,	674,	676,	678,	680,	682, 684,	686,	688,
15	690,	692,	694,	696,	698,	700,	702,	704,	706, 708,	710,	712,
	714,	716,	718,	720,	722,	724,	726,	728,	730, 732,	734,	736,
	738,	740,	742,	744,	746,	748,	750,	752,	754, 756,	758,	760,
	762,	764,	768,	770,	772,	774,	776,	778,	780, 782,	784,	786,
	788,	790,	792,	794,	796,	798,	800,	802,	804, 806,	808,	810,
20	812,	814,	816,	818,	820,	822,	824,	832,	834, 836,	838,	840,
	842,	844,	846,	848,	850,	852,	854,	856,	858, 860,	862,	864,
	866,	868,	870,	872,	874,	876,	878,	880,	882, 884,	886,	888,
	890,	892,	894,	896,	898,	900,	902,	904,	906, 908,	910,	912,
	914,	916,	918,	920,	922,	924,	926,	928,	930, 932,	933,	934,
25	935,	936,	937,	938,	939,	940,	941,	942,	943, 944,	945,	947,
	949,	951	e	952 e	seqüências	de polinucleotídeo

complementares das mesmas), com uma proporção de sinal para ruído que é pelo menos cerca de 2,5x e opcionalmente cerca de 5x ou mais tão alta quanto a observada para hibridização 30 da sonda a um alvo não combinado. Nesse caso, o alvo não

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156/314 combinado é um ácido nucleico correspondendo a um ácido nucleico (outro que não aquele na listagem de seqüência em anexo) que está presente em um banco de dados público, tal como GenBank™, no momento de depósito do pedido em questão. Tais seqüências podem ser identificadas no GenBank por aqueles habilitados. Exemplos incluem Nos. de Acesso Z99109 e Y09476. Tais seqüências adicionais podem ser identificadas, por exemplo, no GenBank, por aqueles habilitados na técnica.

Um ácido nucleico de teste é referido como se hibridizando especificamente a um ácido nucleico sonda quando ele se hibridiza pelo menos às cavidades da sonda como o alvo perfeitamente combinado, isto é, com uma proporção de sinal para ruído pelo menos tão alta quanto a hibridização da sonda ao alvo sob condições nas quais a sonda perfeitamente combinada se liga ao alvo complementar perfeitamente combinado com uma proporção de sinal para ruído que é pelo menos cerca de 2x-10x e ocasionalmente 20x, 50x ou maior do que a observada para hibridização a qualquer um dos polinucleotídeos não combinados com Nos. de Acesso Z99109 e Y09476.

Condições de hibridização e lavagem de ultra elevadaestringência são aquelas nas quais a estringência das condições de hibridização e lavagem são aumentadas até que a proporção de sinal para ruído para ligação da sonda a um ácido nucleico complementar alvo perfeitamente combinado é pelo menos 10x tão alta quanto a observada para hibridização a qualquer um dos ácidos nucleicos alvo não combinados com Números de acesso ao GenBank Z99109 e Y09476. Um ácido nucleico alvo o qual se hibridiza a uma

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157/314 sonda sob tais condições, com uma proporção de sinal para ruído de pelo menos M aquela do ácido nucleico alvo perfeitamente combinado é mencionada como se ligando à sonda sob condições de ultra-elevada estringência condições.

Similarmente, mesmo níveis maiores de estringência podem ser determinadas através de aumento gradual das condições de hibridização e/ou lavagem do ensaio de hibridização relevante. Por exemplo, aquelas nas quais a estringência das condições de hibridização e lavagem são aumentadas até que a proporção de sinal para ruído para ligação da sonda ao ácido nucleico alvo complementar perfeitamente combinado é pelo menos 10x, 20x, 50x, 100x ou 500x ou mais tão alta quanto a observada para hibridização a qualquer um dos ácidos nucleicos alvo não combinados com Números de acesso ao GenBank Z99109 e Y09476. Um ácido nucleico alvo o qual se hibridiza a uma sonda sob tais condições, com uma proporção de sinal para ruído de pelo menos M aquela do ácido nucleico alvo complementar perfeitamente combinado é mencionada como se ligando à sonda sob condições de ultra-ultra-elevada estringência.

Ácidos nucleicos alvo os quais se hibridizam aos ácidos nucleicos representados por SEQ ID NO: 516, 517,

518,	519,	520,	521,	522,	523,	524,	525,	526,	527,	528,	529
530,	531,	532,	533,	534,	535,	536,	537,	538,	539,	540,	541
542,	543,	544,	545,	546,	547,	548,	549,	550,	551,	552,	553
554,	555,	556,	557,	558,	559,	560,	561,	562,	563,	564,	565
566,	567,	620,	622,	624,	626,	628,	630,	632,	634,	636,	638
640,	642,	644,	646,	648,	650,	652,	654,	656,	658,	660,	662
664,	666,	668,	670,	672,	674,	676,	678,	680,	682,	684,	686

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158/314

688,	690,	692,	694,	696,	698,	700,	702,	704,	706,	708,	710,
712,	714,	716,	718,	720,	722,	724,	726,	728,	730,	732,	734,
736,	738,	740,	742,	744,	746,	748,	750,	752,	754,	756,	758,
760,	762,	764,	768,	770,	772,	774,	776,	778,	780,	782,	784,
786,	788,	790,	792,	794,	796,	798,	800,	802,	804,	806,	808,
810,	812,	814,	816,	818,	820,	822,	824,	832,	834,	836,	838,
840,	842,	844,	846,	848,	850,	852,	854,	856,	858,	860,	862,
864,	866,	868,	870,	872,	874,	876,	878,	880,	882,	884,	886,
888,	890,	892,	894,	896,	898,	900,	902,	904,	906,	908,	910,
912,	914,	916,	918,	920,	922,	924,	926,	928,	930,	932,	933,
934,	935,	936,	937,	938,	939,	940,	941,	942,	943,	944,	945,
947,	949,	951	e 952	sob	condições	de elevada,	ultra-elevada

e ultra-ultra elevada estringência são uma característica da invenção. Exemplos de tais ácidos nucleicos incluem aqueles com uma ou umas poucas substituições conservativas de ácido nucleico quando comparado a uma determinada seqüência de ácido nucleico.

Ácidos nucleicos os quais não se hibridizam uns aos outros sob condições estringentes serão substancialmente idênticos se os polipeptídeos os quais eles codificam são substancialmente idênticos. Isso ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando a degenerância máxima de códon permitida pelo código genético

ou	quando	anti-soro	ou anti-soro gerado	contra uma ou	mais
de	SEQ ID	NO:	568,	569, 570, 571, 572,	573, 574,	575,	576,
577	, 578,	579,	580,	581, 582, 583, 584,	585, 586,	587,	588,
589	, 590,	591,	592,	593, 594, 595, 596,	597, 598,	599,	600,
601	, 602,	603,	604,	605, 606, 607, 608,	609, 610,	611,	612,
613	, 614,	615,	616,	617, 618, 619, 621,	623, 625,	627,	629,
631	, 633,	635,	637,	639, 641, 643, 645,	647, 649,	651,	653,

Petição 870170093969, de 04/12/2017, pág. 166/331

159/314

655,	657,	659,	661,	663,	665,	667,	669,	671,	673,	675,	677,
679,	681,	683,	685,	687,	689,	691	, 693	, 695	, 697	, 699,	701,
703,	705,	707,	709,	711,	713,	715	, 717	, 719	,721,	723,	725,
727,	729,	731,	733, 735, 737,	739,	741,	743,	745,	747,
749,	751,	753,	755,	757,	759,	761,	763,	765,	767,	769,	771,
773,	775,	777,	779,	781,	783,	785,	787,	789,	791,	793,	795,
797,	799,	801,	803,	805,	807,	809,	811,	813,	815,	817,	819,
821,	823,	825,	833,	835,	837,	839,	841,	843,	845,	847,	849,
851,	853,	855,	857,	859,	861,	863,	865,	867,	869,	871,	873,
875,	877,	879,	881,	883,	885,	887,	889,	891,	893,	895,	897,
899,	901,	903,	905,	907,	909,	911,	913,	915,	917,	919,	921,
923,	925,	927,	929,	931,	946,	948,	950,	953,	954,	955,	956,
957,	958,	959,	960,	961,	962,	963,	964,	965,	966,	967,	968,
969,	970,	971	e	972,	o qual	foi subtraído	usando os

polipeptídeos codificados por uma seqüência de nucleotídeos conhecida, incluindo aquelas com Número de acesso ao GenBank CAA70664. Outros detalhes sobre identificação imunológica de polipeptídeos da invenção são encontrados abaixo. Adicionalmente, para distinguir entre duplas com seqüências de menos do que cerca de 100 nucleotídeos, um procedimento de hibridização TMAC1 conhecido por aqueles habilitados na técnica pode ser usado. Veja, por exemplo, Sorg, U. e colaboradores, Nucleic Acids Res. (11 de Setembro de 1991) 19(17), incorporado aqui por referência em sua totalidade para todas as finalidades.

Em um aspecto, a invenção proporciona um ácido

nucleico	o qual compreende	uma única	sub-seqüência	em um
ácido nucleico	selecionado	de SEQ ID	NO: 516,	517,	518,
519, 520,	521,	522, 523, 524	, 525, 526,	527, 528,	529,	530,
531, 532,	533,	534, 535, 536	, 537, 538,	539, 540,	541,	542,

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160/314

	543,	544,	545,	546,	547,	548,	549,	550,	551,	552,	553,	554,
	555,	556,	557,	558,	559,	560,	561,	562,	563,	564,	565,	566,
	567,	620,	622,	624,	626,	628,	630,	632,	634,	636,	638,	640,
	642,	644,	646,	648,	650,	652,	654,	656,	658,	660,	662,	664,
5	6 6 6,	668,	670,	672,	674,	676,	678,	680,	682,	684,	686,	688,
	690,	692,	694,	696,	698,	700,	702,	704,	706,	708,	710,	712,
	714,	716,	718,	720,	722,	724,	726,	728,	730,	732,	734,	736,
	738,	740,	742,	744,	746,	748,	750,	752,	754,	756,	758,	760,
	762,	764,	768,	770,	772,	774,	776,	778,	780,	782,	784,	786,
10	788,	790,	792,	794,	796,	798,	800,	802,	804,	806,	808,	810,
	812,	814,	816,	818,	820,	822,	824,	832,	834,	836,	838,	840,
	842,	844,	846,	848,	850,	852,	854,	856,	858,	860,	862,	864,
	866,	868,	870,	872,	874,	876,	878,	880,	882,	884,	886,	888,
	890,	892,	894,	896,	898,	900,	902,	904,	906,	908,	910,	912,
15	914,	916,	918,	920,	922,	924,	926,	928,	930,	932,	933,	934,
	935,	936,	937,	938,	939,	940,	941,	942,	943,	944,	945,	947,
	949,	951	e 952 .	A sub	(-seqüência	única é	única quando
	comparado	a um	ácido nucleico	correspondendo	a qualquer um
	dos	Números de	aces	so ao	GenBank Z99109	e Y09476.	Tais	sub-
20	seqüências	únicas	podem ser determinadas através	de
	alinhamento de	qualquer	uma de SEQ ID	NO: .	516,	517,	518,
	519,	520,	521,	522,	523,	524,	525,	526,	527,	528,	529,	530,
	531,	532,	533,	534,	535,	536,	537,	538,	539,	540,	541,	542,
	543,	544,	545,	546,	547,	548,	549,	550,	551,	552,	553,	554,
25	555,	556,	557,	558,	559,	560,	561,	562,	563,	564,	565,	566,
	567,	620,	622,	624,	626,	628,	630,	632,	634,	636,	638,	640,
	642,	644,	646,	648,	650,	652,	654,	656,	658,	660,	662,	664,
	666,	668,	670,	672,	674,	676,	678,	680,	682,	684,	686,	688,
	690,	692,	694,	696,	698,	700,	702,	704,	706,	708,	710,	712,
30	714,	716,	718,	720,	722,	724,	726,	728,	730,	732,	734,	736,

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161/314

	738,	740,	742,	744,	746,	748,	750, 752, 754,	756, 758,	760,
	762,	764,	768,	770,	772,	774,	776, 778, 780,	782, 784,	786,
	788,	790,	792,	794,	796,	798,	800, 802, 804,	806, 808,	810,
	812,	814,	816,	818,	820,	822,	824, 832, 834,	836, 838,	840,
5	842,	844,	846,	848,	850,	852,	854, 856, 858,	860, 862,	864,
	866,	868,	870,	872,	874,	876,	878, 880, 882,	884, 886,	888,
	890,	892,	894,	896,	898,	900,	902, 904, 906,	908, 910,	912,
	914,	916,	918,	920,	922,	924,	926, 928, 930,	932, 933,	934,
	935,	936,	937,	938,	939,	940,	941, 942, 943,	944, 945,	947,
10	949,	951	e 952 contra	o conjunto complementar de ácidos
	nucleicos	representado pelos	Números de ace	sso ao GenBank
	Z991	09 e	Y09476	ou	outras seqüências	relacionadas
	disponíveis em bancos i	de dados públicos como a data de
	depósito	do	pedido em que	stão. Alinhamento pode	ser
15	realizado	usando	o algoritmo BLAST ajustado para os
	parâmetros	de	default. Qualquer sub-seqüência única é	útil,
	por	exemplo,	como	uma	sonda	para identificar os ácidos
	nucleicos	da invenção.
		Similarmente,	a invenção	inclui um polipeptídeo o	qual
20	compreende	! uma única	sub-seqüência em um polipeptídeo
	selecionado de: SEQ ID	NO: 5	68, 569, 570,	571, 572,	573,
	574,	575,	576,	577,	578,	579,	580, 581, 582,	583, 584,	585,
	586,	587,	588,	589,	590,	591,	592, 593, 594,	595, 596,	597,
	598,	599,	600,	601,	602,	603,	604, 605, 606,	607, 608,	609,
25	610,	611,	612,	613,	614,	615,	616, 617, 618,	619, 621,	623,
	625,	627,	629,	631,	633,	635,	637, 639, 641,	643, 645,	647,
	649,	651,	653,	655,	657,	659,	661, 663, 665,	667, 669,	671,
	673,	675,	677,	679,	681,	683,	685, 687, 689,	691, 693,	695,
	697,	699,	701,	703,	705	, 707	, 709, 711, 713, 715,	717,
30	719,	721, 723,	725,	727,	729, 731, 733, 735,	737, 739,	741,

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162/314

743,	745,	747,	749,	751,	753,	755,	757,	759,	761,	763,	765,
767,	769,	771,	773,	775,	777,	779,	781,	783,	785,	787,	789,
791,	793,	795,	797,	799,	801,	803,	805,	807,	809,	811,	813,
815,	817,	819,	821,	823,	825,	833,	835,	837,	839,	841,	843,
845,	847,	849,	851,	853,	855,	857,	859,	861,	863,	865,	867,
869,	871,	873,	875,	877,	879,	881,	883,	885,	887,	889,	891,
893,	895,	897,	899,	901,	903,	905,	907,	909,	911,	913,	915,
917,	919,	921,	923,	925,	927,	929,	931,	946,	948,	950,	953,
954,	955,	956,	957,	958,	959,	960,	961,	962,	963,	964,	965,
966,	967,	968,	969,	970,	971	e 972. Aqui, a	sub-	seqüência

única é única quando comparado a um polipeptídeo correspondendo ao Número de acesso ao GenBank CAA70664. Aqui novamente, o polipeptídeo é alinhado contra uma seqüência representada pelo número de acesso CAA70664.

Observe que se uma seqüência corresponde a uma seqüência não-traduzida, tal como a pseudo gene, o polipeptídeo correspondendo é gerado simplesmente através de tradução in silico da seqüência de ácido nucleico em uma seqüência de aminoácidos, onde a rede de leitura é selecionada para corresponder à rede de leitura de polinucleotídeos de GAT homólogos.

A invenção também proporciona ácidos nucleicos alvos se hibridizam, oligonucleotídeo sub-seqüência em

569, 570, sob condições de codificação um polipeptídeo estringentes, a qual codifica selecionado de os quais único única

ID NO: 568,

578, 579, 580,

590, 591, 592,

602, 603, 604,

614, 615, 616,

571,

581, 582, 583,

593, 594, 595,

605, 606, 607,

617, 618, 619,

572, 573, 574,

584, 585, 586,

596, 597, 598,

608, 609, 610,

621, 623, 625, um uma

SEQ

575, 576, 577,

587, 588, 589,

599, 600, 601,

611, 612, 613,

627, 629, 631,

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163/314

	633,	635,	637,	639,	641,	643, 645, 647,	649,	651,	653,	655,
	657,	659,	661,	663,	665,	667, 669, 671,	673,	675,	677,	679,
	681,	683,	685,	687,	689,	691, 693, 695	, 697,	699,	701,	703,
	705,	707,	709,	711,	713,	715, 717, 719	,721,	723,	725,	727,
5	729,	731,	733	;, 735, 737, 739, 741,	743,	745,	747,	749,
	751,	753,	755,	757,	759,	761, 763, 765,	767,	769,	771,	773,
	775,	777,	779,	781,	783,	785, 787, 789,	791,	793,	795,	797,
	799,	801,	803,	805,	807,	809, 811, 813,	815,	817,	819,	821,
	823,	825,	833,	835,	837,	839, 841, 843,	845,	847,	849,	851,
10	853,	855,	857,	859,	861,	863, 865, 867,	869,	871,	873,	875,
	877,	879,	881,	883,	885,	887, 889, 891,	893,	895,	897,	899,
	901,	903,	905,	907,	909,	911, 913, 915,	917,	919,	921,	923,
	925,	927,	929,	931,	946,	948, 950, 953,	954,	955,	956,	957,
	958,	959,	960,	961,	962,	963, 964, 965,	966,	967,	968,	969,
15	970,	971	e 972,	em	que a	sub-seqüência	única	é única quando
	comparado	a um	polipeptídeo correspondendo	a qualquer um

dos polipeptídeos de controle. Seqüências únicas são determinadas conforme observado acima.

Em um exemplo, as condições estringentes são selecionadas de modo que um oligonucleotídeo perfeitamente complementar ao oligonucleotídeo de codificação se hibridiza ao oligonucleotídeo de codificação com uma proporção de sinal para ruído pelo menos cerca de 2,5x-10x maior, de preferência pelo menos cerca de 5-10x maior do que para a hibridização do oligonucleotídeo perfeitamente complementar a um ácido nucleico de controle correspondendo a qualquer um dos polipeptídeos de controle. Condições podem ser selecionadas de modo que proporções maiores de sinal para ruído sejam observadas no ensaio o qual é usado em particular, por exemplo, cerca de 15x, 20x, 30x, 50x ou

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164/314 mais. Nesse exemplo, o ácido nucleico alvo se hibridiza ao oligonucleotídeo de codificação único com uma proporção de sinal para ruído pelo menos 2x maior quando comparado à hibridização do ácido nucleico de controle ao oligonucleotídeo de codificação. Novamente, maiores proporções de sinal para ruído podem ser selecionadas, por exemplo, cerca de 2,5x, 5x, 10x, 20x, 30x, 50x ou mais. O sinal em particular dependerá do rótulo usado no ensaio relevante, por exemplo, um rótulo fluorescente, um rótulo colorimétrico, um rótulo radioativo ou semelhante.

Vetores, Promotores e Sistemas de Expressão:

A presente invenção também inclui construtos recombinantes compreendendo uma ou mais das seqüências de ácido nucleico conforme amplamente descrito acima. Os construtos compreendem um vetor, tal como um plasmídio, um cosmídio, um fago, um vírus, um cromossoma bacteriano artificial (BAC), um cromossoma de levedo artificial (YAC) ou semelhante, no qual uma seqüência de ácido nucleico da invenção foi inserida, em uma orientação correta ou invertida. Em um aspecto preferido dessa modalidade, o construto ainda compreende seqüências regulatórias, incluindo, por exemplo, um promotor, operavelmente ligado à seqüência. Grandes números de vetores e promotores adequados são conhecidos por aqueles habilitados na técnica e estão comercialmente disponíveis.

Conforme previamente discutido, textos gerais os quais descrevem técnicas de biologia molecular úteis aqui, incluindo o uso de vetores, promotores e muitos outros tópicos relevantes, incluem Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology Volume

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152, (Academic Press, Inc., San Diego, CA) (Berger); Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2^a ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (“Sambrook”) e Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel e colaboradores, eds., Current Protocols, um lançamento conjunto entre a Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplementado em 1999) (“Ausubel”). Exemplos de protocolos suficientes para orientar aqueles habilitados na técnica através de métodos de amplificação in vitro, incluindo a reação em cadeia de polimerase (PCR), a reação em cadeia de ligase (LCR), amplificação com Οβreplicase e outras técnicas mediadas por RNA polimerase (por exemplo, NASBA), por exemplo, para a produção de ácidos nucleicos homólogos da invenção são encontrados em Berger, Sambrook e Ausubel, bem como em Mullis e colaboradores (1987) Patente U.S. No. 4.683.202; Innis e colaboradores, eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press Inc. San Diego, CA) (Innis); Arnheim & Levinson (1 de Outubro de 1990) C&EN 36-47; The Journal de NIH Research (1991) 3: 81-94; Kwoh e colaboradores (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli e colaboradores (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 1874; Lomell e colaboradores (1989) J. Clin.

Chem 35: 1826; Landegren e colaboradores (1988) Science

241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu e Wallace (1989) Gene 4: 560; Barringer e colaboradores (1990) Gene 89:117; e Sooknanan e Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. Métodos aperfeiçoados para clonagem de ácidos nucleicos amplificados in vitro são

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166/314 descritos em Wallace e colaboradores, Pat. U.S. No. 5.426.039. Métodos aperfeiçoados para amplificação de grandes ácidos nucleicos através de PCR são resumidos em Cheng e colaboradores (1994) Nature 369: 684-685 e nas referências citadas no mesmo, na qual amplicons de PCR de até 40 kb são gerados. Aqueles habilitados apreciarão que essencialmente qualquer RNA pode ser convertido em um DNA fita dupla adequado para digestão por restrição, expansão por PCR e seqüenciamento usando transcriptase reversa e uma polimerase. Veja, por exemplo, Ausubel, Sambrook e Berger, todos supra.

A presente invenção também se refere a células hospedeiras manipuladas que são transduzidas (transformadas ou transfectadas) com um vetor da invenção (por exemplo, um vetor de clonagem da invenção ou um vetor de expressão da invenção), bem como a produção de polipeptídeos da invenção através de técnicas recombinantes. Os vetores podem ser, por exemplo, um plasmídio, uma partícula viral, um fago, etc. As células hospedeiras manipuladas podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para ativação de promotores, seleção de transformantes ou amplificação do gene homólogo de GAT. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para aqueles habilitados na técnica e nas referências citadas aqui incluindo, por exemplo, Sambrook, Ausubel e Berger, bem como, por exemplo, Freshney (1994) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3^a ed. (WileyLiss, New York) e as referências citadas no mesmo.

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Os polipeptídeos de GAT da invenção podem ser produzidos em células não-animais tais como plantas, levedo, fungo, bactérias e semelhantes. Além de Sambrook, Berger e Ausubel, detalhes com relação à cultura de células não-animais podem ser encontrados em Payne e colaboradores (1992) Cell Plant and Tissue Culture in Liquid System (John Wiley & Sons, Inc. New York, NY); Gamborg e Phillips, eds. (1995) Cell Plant, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods/ Springer Lab Manual (Springer-Verlag, Berlin); e Atlas e Parks, eds., The Handbook de Microbiologic Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser incorporados em qualquer um de uma variedade de vetores de expressão adequados para expressando um polipeptídeo. Vetores adequados incluem seqüências de DNA cromossômicas, não cromossômicas e sintéticas, por exemplo, derivadas de SV40; plasmídios bacterianos; DNA de fago; baculovírus; plasmídios de levedo; vetores derivados de combinações de plasmídios e DNA de fago, DNA viral tal como rubéola, adenovírus, vírus da catapora, pseudo-raivas, adenovírus, vírus adeno-associados, retrovírus e muitos outros. Qualquer vetor que transduz material genético em uma célula e, se replicação é desejada, o qual é reproduzível e viável no hospedeiro relevante pode ser usado.

Quando incorporado em um vetor de expressão, um polinucleotídeo da invenção é operativamente ligado a uma seqüência de controle de transcrição apropriada (promoter) para direcionar a síntese de mRNA. Exemplos de tais seqüências de controle de transcrição particularmente adequadas para uso em plantas transgênicas incluem os

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168/314 promotores do vírus mosaico da couve-flor (CaMV), vírus mosaico de figo (FMV) e vírus de formação de listras no veio de morango (SVBV), descritos no Pedido Provisório U.S. No. 60/245,354. Outros promotores conhecidos por controlar a expressão de genes em células procariotas ou eucariotas ou seus vírus e os quais podem ser usado em algumas modalidades da invenção incluem o promotor SV40, promoter lac ou trp de E. coli e o promotor de fago lambda Pl. Um vetor de expressão contém, opcionalmente, um sítio de ligação ribossômica para início de tradução e um terminador de transcrição, tal como PinII. O vetor também inclui, opcionalmente, seqüências apropriadas para expressão por amplificação, por exemplo, um intensificador.

Além disso, os vetores de expressão da presente invenção contêm, opcionalmente, um ou mais genes marcadores selecionáveis para proporcionar a característica fenotípica para seleção de células hospedeiras transformada. Usualmente, o gene marcador selecionável codifica resistência a antibiótico ou herbicida. Genes adequados incluem aqueles que codificam resistência ao antibiótico espectinomicina ou estreptomicina (por exemplo, o gene Aada), 0 gene de fosfotransferase de estreptomicina (SPT) que codifica resistência à estreptomicina, o gene de fosfotransferase de neomicina (NPTII) que codifica resistência à canamicina ou geneticina, o gene de fosfotransferase de higromicina (HPT) codifica resistência à higromicina. Genes marcadores selecionáveis adicionais incluem reductase de dihidrofolato ou resistência à neomicina para cultura de células eucariotas e resistência à tetraciclina ou ampicilina em E. coli.

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Genes adequados que codificam resistência a herbicidas incluem aqueles os quais atuam para inibir a ação de sintase de acetolactato (ALS), em particular os herbicidas do tipo sulfoniluréia (por exemplo, o gene de sintase de acetolactato (ALS) contendo mutações que levam a tal resistência, em particular as mutações S4 e/ou Hra), aqueles os quais atuam para inibir a ação de sintase de glutamina, tais como fosfinotricina ou basta (por exemplo, o gene bar) ou outros de tais genes conhecidos na técnica. O gene bar codifica resistência ao herbicida basta e o gene ALS codifica resistência ao herbicida chlorsulfuron. Em alguns casos, os genes de GAT modificados são usados como marcadores selecionáveis.

Vetores da presente invenção podem ser empregados para transformar um hospedeiro apropriado para permitir que o hospedeiro expresse uma proteína ou polipeptídeo da invenção. Exemplos de hospedeiros de expressão adequados incluem: células bacterianas, tais como E. coll, B. subtilis, Streptomyces e Salmonella typhimurium; células fúngicas, tais como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e Neurospora crassa; células de inseto, tais como Drosophila e Spodoptera frugiperda; células de mamífero, tais como CHO, COS, BHK, HEK 293 ou melanoma de Bowes; ou células de planta ou explantes, etc. Deve ser compreendido que nem todas as células ou linhagens de células precisam ser capazes de produzir polipeptídeos de GAT totalmente funcionais; por exemplo, fragmentos antigênicos de um polipeptídeo de GAT podem ser produzidos. A presente invenção não está limitada pelas células hospedeiras empregadas.

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No sistema bacteriano, uma série de vetores de expressão pode ser selecionada, dependendo do uso pretendido para o polipeptídeo de GAT. Por exemplo, quando grandes quantidades de polipeptídeo de GAT ou fragmentos do mesmo são necessários para a produção comercial ou para a indução de anticorpos, vetores os quais direcionam expressão de proteínas de fusão em altos níveis que são prontamente purificados podem ser desejáveis. Tais vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores de expressão e de clonagem multifuncionais em E. call, tal como BLUESCRIPT (Stratagene), no qual a seqüência de codificação do polipeptídeo de GAT pode ser ligada no vetor em-rede com seqüências para o Met amino-terminal e os 7 resíduos subseqüentes de beta-galactosidase, de modo que uma proteína híbrida é produzida; vetores pIN (Van Heeke & Schuster (1989) J. Bial. Chem. 264: 5503-5509); vetores pET (Novagen, Madison WI); e semelhantes.

Similarmente, no levedo Saccharomyces cerevisiae, uma série de vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis, tais como o fator alfa, oxidase de álcool e PGH podem ser usados para a produção dos polipeptídeos de GAT da invenção. Para revisões, veja Ausubel (supra) e Grant e colaboradores (1987) Methods in Enzymology 153: 516-544.

Em células hospedeiras mamíferos, uma variedade de expressão sistema, incluindo sistemas baseados em vírus, podem ser utilizados. Em casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, uma seqüência de codificação, por exemplo, de um polipeptídeo de GAT, é opcionalmente ligada em um complexo de transcrição/tradução de adenovírus consistindo do último promoter e a seqüência líder

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171/314 tripartida. A inserção de uma região de codificação de polipeptídeo de GAT em uma região não essencial E1 ou E3 do genoma viral resultará em um vírus viável capaz de expressar a GAT em células hospedeiras infectadas (Logan e Shenk (1984) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659) . Além disso, intensificadores de transcrição, tal como o intensificador do vírus de sarcoma de Rous (RSV), podem ser usados para aumentar a expressão em células hospedeiras de mamífero.

Similarmente, em células de planta, a expressão pode ser acionada a partir de um transgene integrado no cromossoma de uma planta ou citoplasmicamente a partir de um ácido nucleico viral ou epissomal. No caso de transgenes estavelmente integrados, freqüentemente é desejável proporcionar seqüências capazes de acionar expressão constitutiva ou induzível dos polinucleotídeos de GAT da invenção, por exemplo, usando seqüências regulatórias virais, por exemplo, CaMV ou derivadas de plantas. Numerosas seqüências regulatórias derivadas de planta foram descritas, incluindo seqüências as quais direcionam a expressão de uma maneira tecido-específica, por exemplo, TobRB7, patatina B33, promotores do gene GRP, o promotor rbcS-3A e semelhantes. Alternativamente, expressão em alto nível pode ser obtida através de expressão transitória de seqüências exógenas de um vetor viral de planta, por exemplo, TMV, BMV, etc. Tipicamente, plantas transgênicas expressando constitutivamente um polinucleotídeo de GAT da invenção serão preferidas e são selecionadas seqüências regulatórias adequadas para assegurar expressão constitutiva estável do polipeptídeo de GAT.

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Vetores típicos úteis para expressão de ácidos nucleicos em plantas superiores são bem conhecidos na técnica e incluem vetores derivados do plasmídio de indução a tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers e colaboradores (1987) Meth. Enzymol. 153: 253-277. Vetores exemplificativos de A. tumefaciens úteis aqui são os plasmídios pKYLX6 e pKYLX7 de Schardl e colaboradores (1987) Gene 61: 1-11 e Berger e colaboradores (1989) Proc.

Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 86: 8402-8406. Outro vetor útil aqui é o plasmídio pBI101.2 que está disponível da Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA). Uma variedade de vírus de planta que podem ser empregados como vetores é conhecida na técnica e inclui o vírus mosaico da couve-flor (CaMV), geminivírus, vírus mosaico de capim e vírus mosaico de tabaco.

Em algumas modalidades da presente invenção, um construto de polinucleotídeo de GAT adequada para transformação de células de planta é preparada. Por exemplo, um polinucleotídeo de GAT desejado pode ser incorporado em um cassete de expressão recombinante para facilitar a introdução do gene em uma planta e subseqüente expressão do polipeptídeo codificado. Um cassete de expressão compreenderá, tipicamente, um polinucleotídeo de GAT ou fragmento funcional do mesmo, operavelmente ligado a uma seqüência de promotor e outras seqüências regulatórias de início de transcrição e tradução as quais direcionarão a expressão de uma seqüência em nos tecidos desejados (por exemplo, planta inteira, folhas, sementes) da planta transformada.

Por exemplo, um promotor de planta forte ou fracamente

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173/314 constitutivo pode ser empregado, o qual direcionará a expressão do polipeptídeo de GAT em todos os tecidos de uma planta. Tais promotores são ativos sob a maioria das condições ambientais e estados de desenvolvimento ou diferenciação celular. Exemplos de promotores constitutivos incluem a região de início de transcrição 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV), o promotor 1'- ou 2'derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor de ubiquitina 1, o promotor Smas, o promotor de dehidrogenase de álcool cinamílico (Patente U.S. No. 5.683.439), o promotor Nos, o promotor pEmu, o promotor rubisco, o promotor GRP1-8 e outras regiões de início de transcrição de vários genes de planta conhecidos por aqueles habilitados. Em situações nas quais super expressão de um polinucleotídeo de GAT é prejudicial para a planta ou, de outro modo, indesejável, aqueles habilitados, quando de revisão da presente divulgação, reconhecerão que promotores constitutivos fracos podem ser usados para baixos níveis de expressão. Naqueles casos onde altos níveis de expressão não são prejudiciais para a planta, um promotor forte, por exemplo, um promotor pol III ou outro de t-RNA ou um promotor pol II forte, tal como o promotor do vírus mosaico da couve-flor, pode ser usado.

Alternativamente, um promotor de planta pode estar sob o controle ambiental. Tais promotores são referidos aqui como promotores induzíveis. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição através de promotores induzíveis incluem ataque por agente patogênico, condições anaeróbicas ou a presença de neve. Em particular, exemplos de promotores induzíveis são o promotor Adh1, o

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174/314 qual é induzível através de hipóxia ou estresse pelo frio, o promotor Hsp70, o qual é induzível através de estresse pelo calor e o promotor PPDK, o qual é induzível pela neve. Também úteis são promotores os quais são quimicamente induzíveis.

Os promotores usados na presente invenção podem ser tecido-específicos e, como tal, sob o controle de desenvolvimento em que o polinucleotídeo é expresso apenas em determinada tecidos, tais como folhas, raízes, frutos, flores e/ou sementes. Um promotor exemplificativo é o promotor antero-específico 5126 (Patentes U.S. Nos. 5.689.049 e 5.689.051). Exemplos de promotores sementepreferidos incluem, mas não estão limitados a, promotor de gama zeína de 27 kD e o promotor de cera, Boronat e colaboradores 1986) Plant Sci. 47, 95-102; Reina e colaboradores (1990) Nucleic Acid Res. 18 (21) : 6426; e Kloesgen e colaboradores (1986) Mol. Gen. Genet. 203: 237244. Promotores que expressam o embrião, pericarpo e endosperma são divulgados nos Pedidos de Patente U.S. Nos. de Série 60/097.233 depositado em 20 de Agosto de 1998 e 60/098.230 depositado em 28 de Agosto de 1998. As divulgações cada um desses são incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Em modalidades nas quais uma ou mais seqüências de ácido nucleico endógenas ao sistema da planta são incorporadas no construto, os promotores endógenos (ou variantes dos mesmos) desses genes podem ser empregados para direcionar a expressão dos genes na planta transfectada. Promotores tecido-específicos podem também ser usados para direcionar a expressão de polinucleotídeos heterólogos.

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Em geral, o promotor usado embalagem no cassete de expressão em plantas depende da aplicação pretendida. Promotores heterólogos ou não-heterólogos (isto é, endógenos) podem ser empregados para direcionar a expressão dos ácidos nucleicos da presente invenção. Esses promotores podem também ser usado, por exemplo, em cassetes de expressão para acionar a expressão de ácidos nucleicos anti-senso para reduzir, aumentar ou alterar a concentração e/ou composição de uma proteína da presente invenção em um tecido desejado. Qualquer um de uma série de promotores os quais direcionam a transcrição em células de planta é adequado. O promotor pode ser constitutivo ou induzível. Além dos promotores observados acima, promotores de origem bacteriana os quais operam em plantas incluem o promotor de sintase de octopina, o promotor de sintase de nopalina sintase promoter e outros promotores derivados de plasmídios Ti nativos (veja, Herrara-Estrella e colaboradores (1983) Nature 303: 209-213). Promotores viral incluem os promotores de RNA 35S e 19S do vírus mosaico da couve-flor (Odell e colaboradores (1985) Nature 313: 810812). Outros promotores de planta incluem o promotor da pequena subunidade de carboxilase de ribulose-1,3bisfosfato e o promoter de faseolina. A seqüência de do gene E8 e outros genes pode também ser usada. O isolamento e a seqüência do promoter E8 são descritos em detalhes em Deikman e Fischer (1988) EMBO J. 7: 3315-3327.

Para identificar promotores candidatos, as partes 5' de um clone genômico são analisadas com relação às características de seqüência da seqüência do promotor. Por exemplo, elementos da seqüência de promotor incluem a

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176/314 seqüência de consenso com a caixa TATA (TATAAT) , a qual está usualmente 20 a 30 pares de base a montante do sítio de início de transcrição. Em plantas, ainda a montante da caixa TATA, nas posições -80 a -100, existe, tipicamente, um elemento promotor com uma série de adeninas circundando o trinucleotídeo G (ou T) conforme descrito por Messing e colaboradores (1983) Genetic Engineering in Plants, eds. Kosage e colaboradores, páginas 221-227.

No preparo de construtos de polinucleotídeo, por exemplo, vetores, da invenção, outras seqüências que não o promotor e o polinucleotídeo associado podem também ser empregadas. Se expressão normal do polipeptídeo é desejada, uma região de poliadenilação na extremidade 3' de uma região que codifica um gene de GAT pode ser incluída. A região de poliadenilação pode ser derivada, por exemplo, de uma variedade de genes de planta ou de T-DNA. A seqüência na extremidade 3' a ser adicionada pode ser derivada, por exemplo, dos genes da sintase de nopalina ou sintase de octopina ou, alternativamente, de outro gene de planta ou, menos de preferência, de qualquer outro gene eucariota.

Uma seqüência de íntrons pode ser adicionada à região não traduzida 5' da seqüência de codificação ou da seqüência de codificação parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula. Veja, por exemplo, Buchman e Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405 e Callis e colaboradores (1987) Genes Dev. 1: 1183-1200. O uso de íntrons de milho Adh1, íntron 1, 2 e 6 e o íntron Bronze-1 é conhecido na técnica. Veja, de modo geral, Freeling e Walbot, eds. (1994) The Maize Handbook (Springer, New York), capítulo 116.

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O construto pode também incluir um gene marcador o qual confere um fenotipo selecionável a células de planta. Por exemplo, o marcador pode codificar tolerância a biocida, particularmente tolerância a antibiótico, tal como tolerância à canamicina, G418, bleomicina, higromicina ou tolerância a um herbicida, tal como tolerância ao chlorsulfuron ou fosfinotricina (o ingrediente ativo nos herbicidas bialaphos e Basta).

Sinais de início específicos podem auxiliar na tradução eficaz de uma seqüência que codifica um polinucleotídeo de GAT da presente invenção. Esses sinais podem incluir, por exemplo, o códon de início ATG e seqüências adjacentes. Em casos onde uma seqüência que codifica um polipeptídeo de GAT, seu códon inicial e seqüências a montante são inseridos em um vetor de expressão apropriado, nenhum sinal de controle de tradução adicional é necessário. Contudo, em casos onde apenas a seqüência de codificação (por exemplo, uma seqüência de codificação de uma proteína madura) ou uma parte da mesma é inserida, sinais de controle de transcrição exógenos, incluindo o códon inicial, devem estar na rede de leitura correta para assegurar transcrição do inserto todo. Elementos transcricionais exógenos e códons iniciais podem ser de várias origens, naturais e sintéticas. A eficácia de expressão pode ser intensificada através da inclusão de intensificadores apropriados ao sistema de célula em uso (Scharf e colaboradores (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-62 e Bittner e colaboradores (1987) Methods in Enzymol 153: 516-544).

Seqüências de Secreção/Localização:

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Os polinucleotídeos da invenção podem também ser fundidos, por exemplo, em-rede a ácidos nucleicos que codificam uma seqüência de secreção/localização, para objetivar expressão do polipeptídeo a um compartimento celular, membrana ou organela desejado de uma célula hospedeira ou para direcionar secreção do polipeptídeo ao espaço periplásmico ou no meio de cultura de célula. Tais seqüências são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e incluem peptídeos lideres de secreção, seqüências de objetivação a organelas (por exemplo, seqüências de localização nuclear, sinais de retenção de ER, seqüências de trânsito mitocondriais e seqüências de trânsito de cloroplasta), seqüências de localização/âncora em membrana (por exemplo, seqüências de transferência terminais, seqüências âncora de GPI) e semelhantes.

Em uma modalidade preferida, um polinucleotídeo da invenção é fundido em rede a uma seqüência de trânsito de cloroplasto N-terminal (ou seqüência peptídica de trânsito de cloroplasto) derivada de um gene que codifica um polipeptídeo que é normalmente objetivado ao cloroplasto. Tais seqüências são, tipicamente, ricas em serina e treonina; são deficientes em aspartato, glutamato e tirosina; e geralmente têm um domínio central rico em aminoácidos positivamente carregados.

Hospedeiros de Expressão:

Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere a células hospedeiras contendo os construtos acima descritas A célula hospedeira pode ser uma célula eucariota, tal como uma célula de mamífero, uma célula de levedo ou uma célula de planta ou a célula hospedeira pode

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179/314 ser uma célula procariota, tal como uma célula bacteriana. A introdução do construto na célula hospedeira pode ser realizada através de transfecção com fosfato de cálcio, transfecção, DEAE-Dextrana mediada, eletroporação ou outras técnicas comuns (Davis e colaboradores, Basic Methods in Molecular Biology) .

A célula hospedeira é opcionalmente escolhida com relação à sua capacidade de modular a expressão das seqüências inseridas ou processar a proteína expressa do modo desejado. Tais modificações de uma proteína incluem, mas não estão limitadas a, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Processamento pós-traducional que confere uma forma pré ou pré-pró de uma proteína podem também ser importantes para inserção, duplicação e/ou função correta. Diferentes células hospedeiras, tais como E. coli, Bacillus sp., levedo ou células de mamífero, tais como CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293, WI38, etc., têm maquinaria e mecanismos característicos celulares específicos, por exemplo, para atividades pós-traducionais, e podem ser escolhidas para assegurar a modificação e processamento desejados da proteína estranha introduzida.

Para produção a longo prazo com elevado rendimento de proteínas recombinantes, sistemas de expressão estáveis podem ser usados. Por exemplo, células de planta, explantes ou tecidos, por exemplo, brotos ou discos de folha, os quais expressam estavelmente um polipeptídeo da invenção são transduzidas usando vetores de expressão os quais contêm origens de replicação viral ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável. Após a

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180/314 introdução do vetor, as células podem ser deixadas se desenvolver durante um período determinado como sendo apropriado para o tipo de célula, por exemplo, 1 ou mais horas para células bacterianas, 1-4 dias para células de planta, 2-4 semanas para alguns explantes de plantas, em um meio enriquecido antes que ele seja trocado por meio seletivo. A finalidade do marcador selecionável é conferir resistência à seleção e sua presença permite crescimento e recuperação de células as quais expressam com sucesso as seqüências introduzidas. Por exemplo, plantas transgênicas expressando os polipeptídeos da invenção podem ser selecionadas diretamente com relação à resistência ao herbicida glifosato. Embriões resistentes derivados de explantes estavelmente transformados podem ser proliferados, por exemplo, usando técnicas de cultura tecidual apropriadas ao tipo de célula.

Células hospedeiras transformadas com uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da invenção são opcionalmente cultivadas sob condições adequadas para a expressão e recuperação da proteína codificada da cultura de células. A proteína ou fragmento da mesma produzido pela célula recombinante pode ser secretado, membrana-ligado ou contido intracelularmente, dependendo da seqüência e/ou do vetor usado. Conforme será compreendido por aqueles habilitados na técnica, vetores de expressão contendo os polinucleotídeos de GAT da invenção podem ser projetados com seqüências sinalizadoras as quais direcionam a secreção dos polipeptídeos maduros através da membrana de uma célula procariota ou eucariota.

Seqüências Adicionais de Polipeptídeo:

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Os polinucleotídeos da presente invenção podem também compreender uma seqüência de codificação fundida em-rede a uma seqüência marcadora que, por exemplo, facilita a purificação do polipeptídeo codificado. Tais domínios de facilitação de purificação incluem, mas não estão limitados a, peptídeos de quelação de metal, tais como módulos de histidina-triptofano que permitem a purificação sobre metais imobilizados, uma seqüência a qual se liga à glutationa (por exemplo, GST), uma tag de hemaglutinina (HA) (correspondendo a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina de influenza; Wilson e colaboradores (1984) Cell 37: 767), seqüências de proteína de ligação à maltose, o epítopo FLAG utilizado no sistema de purificação por extensão/afinidade FLAGS (Immunex Corp, Seattle, WA) e semelhantes. A inclusão de uma seqüência de ligação da polipeptídeo protease-clivável entre o domínio de purificação e a seqüência homóloga de GAT é útil para facilitar a purificação. Um vetor de expressão considerado para uso nas composições e métodos descritos aqui proporciona expressão de uma proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo da invenção fundido a uma região de polihistidina separada por um sítio de clivagem de enteroquínase. Os resíduos de histidina facilitam a purificação sobre IMIAC (cromatografia por afinidade com íons de metal imobilizados, conforme descrito em Porath e colaboradores (1992) Protein Expression and Purification 3: 263-281), embora o sítio de clivagem de enteroquínase proporcione um meio para separação do polipeptídeo homólogo de GAT homologue da proteína de fusão. Vetores pGEX (Promega; Madison, WI) podem também ser usados para

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182/314 expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com S-transferase de glutationa (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas de células submetidas à lise através de adsorção a glóbulos de ligante-agarose (por exemplo, glutationa-agarose no caso de GST-fusão), seguido por eluição na presença de ligante livre.

Produção e Recuperação de Polipeptídeo:

Após transdução do hospedeiro adequado e desenvolvimento das células hospedeiras até uma densidade apropriada, o promotor selecionado é induzido por meios apropriados (por exemplo, desvio de temperatura ou indução química) e as células são cultivadas durante um período adicional. As células são, tipicamente, coletadas através de centrifugação, rompidas através de meios físicos ou químicos e o extrato bruto resultante retido para purificação adicional. Células microbianas empregadas na expressão de proteínas podem ser rompidas através de qualquer método conveniente, incluindo ciclos de congelamento-descongelamento, ultra-som, ruptura mecânica ou uso de agentes de lise de células ou outros métodos, os quais são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Conforme observado, muitas referências estão disponíveis para a cultura e produção de muitas células, incluindo células de origem bacteriana, de plantas, animais (especialmente mamíferos) e archebacteriana. Veja, por exemplo, Sambrook, Ausubel e Berger (todos supra), bem como Freshney (1994) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3^a ed. (Wiley-Liss, New York) e as referências

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183/314 citadas no mesmo; Doyle e Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques (John Wiley e Sons, NY); Humason (1979) Animal Tissue Techniques, 4^a ed. (W.H. Freeman e Company); e Ricciardelli e colaboradores (1989) In Vitro Cell Dev. Biol. 25: 1016-1024. Para a cultura e regeneração de células de planta, veja Payne e colaboradores (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems (John Wiley & Sons, Inc., New York, NY);

Gamborg e Phillips, eds. (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods/ Springer Lab Manual (Springer-Verlag, Berlin); Jones, ed. (1984) Plant gene Transference and Expression Protocols (Humana Press, Totowa, New Jersey); e Croy, ed. (1993) Plant Molecular Biology (Bios Scientific Publishers, Oxford, Reino Unido), ISBN 0 12 198370 6. Meios de cultura de células são, em geral, apresentados em Atlas e Parks, eds. (1993) The Handbook de Microbiologic Media (CRC Press, Boca Raton, FL). Informação adicional para cultura de células é encontrada na literatura comercial disponível, tal como o catálogo Life Science Research Cell Culture (1998) da Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO) (Sigma-LSRCCC) e, por exemplo, The Plant Culture Catalogue e suplemento (1997), também da Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO) (SigmaPCCS”). Outros detalhes com relação à transformação de células de planta e produção de plantas transgênicas são encontrados abaixo.

Os polipeptídeos da invenção podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes através de qualquer um de uma série de métodos bem conhecidos na técnica, incluindo precipitação com sulfato

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184/314 de amônio ou etanol, extração com ácido, cromatografia por troca de ânions ou cátions, cromatografia por fosfocelulose, cromatografia por interação hidrofóbica, cromatografia por afinidade (por exemplo, usando qualquer um dos sistemas de rotulação observados aqui), cromatografia com hidróxiapatita e cromatografia com lecitina. Etapas de reduplicação de proteína podem ser usadas, conforme desejado, para completar a configuração da proteína madura. Finalmente, cromatografia de líquido de elevado desempenho (HPLC) pode ser empregada nas etapas finais de purificação. Além das referências conforme observado supra, uma variedade de métodos de purificação é bem conhecida na técnica incluindo, por exemplo, aqueles apresentados em Sandana (1997) Bioseparation of Proteins (Academic Press, Inc.; Bollag e colaboradores (1996) Protein Methods, 2^a ed. (Wiley-Liss, NY); Walker (1996) A Protein Protocols Handbook (Humana Press, NJ) , Harris e Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach (IRL Press em Oxford, Oxford, Inglaterra); Harris e Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach (IRL Press em Oxford, Oxford, Inglaterra); Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice, 3^a ed. (Springer Verlag, NY); Janson e Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, 2a ed. (Wiley-VCH, NY); e Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM (Humana Press, NJ).

Em alguns casos, é desejável produzir o polipeptídeo de GAT da invenção em larga escala, adequada para aplicações industriais e/ou comerciais. Em tais casos, procedimentos de fermentação em massa são empregados.

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Resumidamente, um polinucleotídeo de GAT, por exemplo, um polinucleotídeo compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:

	516,	517,	518,	519,	520,	521,	522,	523,	524,	525,	526,	527,
	528,	529,	530,	531,	532,	533,	534,	535,	536,	537,	538,	539,
5	540,	541,	542,	543,	544,	545,	546,	547,	548,	549,	550,	551,
	552,	553,	554,	555,	556,	557,	558,	559,	560,	561,	562,	563,
	564,	565,	566,	567,	620,	622,	624,	626,	628,	630,	632,	634,
	636,	638,	640,	642,	644,	646,	648,	650,	652,	654,	656,	658,
	660,	662,	664,	666,	668,	670,	672,	674,	676,	678,	680,	682,
10	684,	686,	688,	690,	692,	694,	696,	698,	700,	702,	704,	706,
	708,	710,	712,	714,	716,	718,	720,	722,	724,	726,	728,	730,
	732,	734,	736,	738,	740,	742,	744,	746,	748,	750,	752,	754,
	756,	758,	760,	762,	764,	768,	770,	772,	774,	776,	778,	780,
	782,	784,	786,	788,	790,	792,	794,	796,	798,	800,	802,	804,
15	806,	808,	810,	812,	814,	816,	818,	820,	822,	824,	832,	834,
	836,	838,	840,	842,	844,	846,	848,	850,	852,	854,	856,	858,
	860,	862,	864,	866,	868,	870,	872,	874,	876,	878,	880,	882,
	884,	886,	888,	890,	892,	894,	896,	898,	900,	902,	904,	906,
	908,	910,	912,	914,	916,	918,	920,	922,	924,	926,	928,	930,
20	932,	933,	934,	935,	936,	937,	938,	939,	940,	941,	942,	943,
	944,	945,	947,	949,	951	e 952 ou	outros ácidos	nucleicos
	que	codificam	polipeptídeos	de GAT da	invenção	podem	ser
	clonados	em um	vetor de	expressão.	Por	exemplo,	a Patente

U.S. No. 5.955.310 para Widner e colaboradores “METHODS FOR 25 THE PRODUCTION OF A POLIPEPTIDE IN A BACILLUS CELL,” descreve um vetor com promotores aleatórios e seqüências de estabilização operavelmente ligadas a uma seqüência que codifica um polipeptídeo. Após inserção do polinucleotídeo de interesse em um vetor, o vetor é transformado em um 30 hospedeiro bacteriano, por exemplo, um gênero de Bacillus

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186/314 subtilis PL1801IIE (amyE, apr, npr, spoIIE::Tn917). A introdução de um vetor de expressão em uma célula de Bacillus pode, por exemplo, ser realizada através de transformação de protoplasta (veja, por exemplo, Chang e Cohen (1979)_Mol. Gen. Genet. 168: 111), através do uso de células competentes (veja, por exemplo, Young e Spizizin (1961) J. Bacteriol. 81: 823 ou Dubnau e Davidoff-Abelson (1971) J. Mol. Biol. 56: 209), através de eletroporação (veja, por exemplo, Shigekawa e Dower (1988) Biotechniques 6: 742) ou através de conjugação (veja, por exemplo, Koehler e Thorne (1987) J. Bacteriol. 169: 5271), veja também, Ausubel, Sambrook e Berger, todos supra.

As células transformadas são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos que são conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada através de cultura em um frasco de agitação, fermentação em pequena escala ou larga escala (incluindo fermentações contínua, em bateladas, alimentadas em batelada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizada em um meio adequado e sob condições que permitem que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. A cultura ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). O polipeptídeo secretado pode ser recuperado diretamente do meio.

O polipeptídeo resultante pode ser isolado através de

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187/314 métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser isolado do meio nutriente através de procedimentos convencionais incluindo, mas não limitado a, centrifugação, filtração, extração, pulverização-secagem, evaporação ou precipitação. O polipeptídeo isolado pode, então, ser adicionalmente purificado através de uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a, cromatografia (por exemplo, troca de íons, afinidade, hidrofóbicos, cromatofocalização e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio) ou extração (veja, por exemplo, Bollag e colaboradores (1996) Protein Methods, 2^a ed. (Wiley-Liss, NY) e Walker (1996) A Protein Protocols Handbook (Humana Press, NJ) .

Sistemas de transcrição/tradução isentos de células podem também ser empregados para produzir polipeptídeos usando DNAs ou RNAs da presente invenção. Vários de tais sistemas estão comercialmente disponíveis. Um guia geral para protocolos de transcrição e tradução in vitro é encontrado em Tymms (1995) In Vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology (Garland Publishing, NY), vol. 37.

Substratos e Formatos para Recombinação de Seqüência:

Os polinucleotídeos da invenção são, opcionalmente, usados como substratos para uma variedade de procedimentos de geração de diversificação, por exemplo, reações de mutação, recombinação e recombinação recursiva, além de seu uso em métodos padrões de clonagem conforme apresentado,

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188/314 por exemplo, em Ausubel, Berger e Sambrook, para produzir polinucleotídeos e polipeptídeos de GAT adicionais com propriedades desejadas. Uma variedade de protocolos para geração de diversidade está disponível e é descrita na técnica. Os procedimentos podem ser usados separadamente e/ou em combinação para produzir uma ou mais variantes de um polinucleotídeo ou conjunto de polinucleotídeos, bem como variantes de proteínas codificadas. Individual e coletivamente, esses procedimentos proporcionam formas robustas, amplamente aplicáveis de geração de polinucleotídeos e conjuntos de polinucleotídeos diversificados (incluindo, por exemplo, bibliotecas de polinucleotídeo) úteis, por exemplo, para a manipulação ou desenvolvimento rápido de polinucleotídeos, proteínas, vias, células e/ou organismos com características novas e/ou aperfeiçoadas. O processo de alteração de uma seqüência pode resultar, por exemplo, em uma única substituição de nucleotídeo, múltiplas substituições de nucleotídeo e inserção ou deleção de regiões da seqüência de ácido nucleico.

Embora distinções e classificações sejam feitas no curso da discussão em questão para clareza, será apreciado que as técnicas freqüentemente não são mutuamente exclusivas. Na verdade, os vários métodos podem ser usado unicamente ou em combinação, em paralelo ou em série, para acessar diversas variantes de seqüência.

O resultado de qualquer um dos procedimentos de geração de diversidade descritos aqui pode ser a geração de um ou mais polinucleotídeos, a qual pode ser selecionada com relação a polinucleotídeos que codificam proteínas com

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189/314 ou os quais conferem propriedades desejáveis. Após diversificação através de um ou mais dos métodos descritos aqui ou, de outro modo, disponíveis para aqueles habilitados, qualquer polinucleotídeo que é produzido pode ser selecionado com relação a uma atividade ou propriedade desejada, por exemplo, Km alterada para o glifosato, Km alterada para acetil CoA, uso de co-fatores alternativos (por exemplo, propionil CoA) Kcat aumentada, etc. Isso pode incluir identificação de qualquer atividade que pode ser detectada, por exemplo, em um formato automático ou automatizável, através de qualquer um dos ensaios na técnica. Por exemplo, homólogos de GAT com atividade específica aumentada podem ser detectados através de ensaio da conversão de glifosato em N-acetilglifosato, por exemplo, através de espectrometria de massa. Alternativamente, a capacidade aperfeiçoada para conferir resistência ao glifosato pode ser analisada através de desenvolvimento de bactérias transformadas com um ácido nucleico da invenção sobre agar contendo concentrações crescentes de glifosato ou através de pulverização de plantas transgênicas incorporando um ácido nucleico da invenção com glifosato. Uma variedade de propriedades relacionadas (ou mesmo não relacionadas) pode ser avaliada, em série ou em paralelo, a discernimento do perito. Detalhes adicionais com relação à recombinação e seleção de tolerância a um herbicida podem ser encontrados, por exemplo, em “DNA SHUTTLE FOR PRODUCING HERBICIDE RESISTENT CROPS (Pub. U.S. No. 2002/0058249) depositada em 12 de Agosto de 1999.

Descrições de uma variedade de procedimentos para a

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190/314 geração de diversidade, incluindo embaralhamento de genes múltiplos e métodos para a geração de seqüências modificadas de ácido nucleico que codificam domínios enzimáticos múltiplos são encontradas nas seguintes publicações e nas referências citadas nas mesmas: Soong, N. e colaboradores (2000) Nat. Genet. 25(4): 436-39; Stemmer e colaboradores (1999) Tumor Alvoíng 4: 1-4; Ness e colaboradores (1999) Nature Biotech. 17: 893-896; Chang e colaboradores (1999) Nature Biotech. 17: 793-797; Minshull e Stemmer (1999) Current Opinion in Chemistry Biology 3: 284-290; Christians e colaboradores (1999) Nature Biotech. 17: 259-264; Crameri e colaboradores (1998) Nature 391: 288-291; Crameri e colaboradores (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Zhang e colaboradores (1997) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Patten e colaboradores (1997) Current Opinion in Biotech. 8: 724-733; Crameri e colaboradores (1996) Nature Med. 2: 100-103; Crameri e colaboradores (1996) Nature Biotech. 14: 315-319; GATes e colaboradores (1996) J. Mol. Biol. 255: 373-386; Stemmer (1996) “Sexual PCR and Assembly PCR” em The Encyclopedia of Molecular Biology (VCH Publishers, New York) páginas 447457; Crameri e Stemmer (1995) BioTechniques 18: 194-195;

Stemmer e colaboradores, (1995) Gene 164: 49-53; Stemmer (1995) Science 270: 1510; Stemmer (1995) Bio/Technology 13: 549-553; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; e Stemmer (1994) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751.

Métodos de geração de diversidade por mutação incluem, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida (Ling e colaboradores (1997) “Approaches to DNA mutagenesis: an overview” Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale e

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191/314 colaboradores (1996) Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the fosforotioate method” Methods Mol. Biol. 57: 369-374; Smith (1985) In vitro mutagenesis” Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) Estratégias e aplicações de em vitro mutagenesis” Science 229: 1193-1201; Carter (1986) Site-directed mutagenesis” Biochem. J. 237: 1-7; e Kunkel (1987) The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis” em Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. e Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin)); mutagênese usando modelos contendo uracila (Kunkel (1985) Rapid and efficient sitespecific mutagenesis without phenotypic selection” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel e colaboradores (1987) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Methods in Enzymol. 154, 367382; e Bass e colaboradores (1988) Mutant Trp repressors with new DNA-liGATion specificities” Science 242: 240-245); mutagênese oligonucleotídeo-dirigida (Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith (1982) Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derivated vectors: an efficient and general procedure for a production of point mutations in any DNA fragment” Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500; Zoller & Smith (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors” Methods in Enzymol. 100: 468-500; e Zoller & Smith (1987) Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template” Methods in Enzymol. 154:329-350); mutagênese de DNA fosforotioateomodificado (Taylor e colaboradores (1985) The use of

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192/314 phosphorotioate-modificated DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA” Nucl. Acids Res. 13: 87498764; Taylor e colaboradores (1985) “The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorotioate-modificated DNA” Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787; Nakapodeme & Eckstein (1986) Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage through phosphorotioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers e colaboradores (1988) Y-T Exonucleases in phosphorotioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 16: 791-802; e Sayers e colaboradores (1988) Strand specific cleavage of phosphorotioate-contained DNA through reaction with restriction endonuclease in the presence of ethidium bromide” Nucl. Acids Res. 16: 803-814); mutagênese usando DNA com duplo vão (Kramer e colaboradores (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation structuration” Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. Oligonucleotidedirected structuration of mutations via gap duplex DNA” 154:350-367; Kramer e colaboradores (1988) Improved enzymatic in vitro reaction in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed structuration of mutations” Nucl. Acids Res. 16: 7207; e Fritz e colaboradores (1988) Oligonucleotide-directed structuration of mutations: a gap duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro” Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999).

Métodos adicionais adequados incluem reparo de

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193/314 combinação errônea por pontos (Kramer e colaboradores (1984) “Point Mismatch Repair” Cell 38: 879-887), mutagênese usando gêneros hospedeiros reparo-deficientes (Carter e colaboradores (1985) “Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors” Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; e Carter (1987) “Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors” Methods in Enzymol. 154: 382-403), mutagênese por deleção (Eghtedarzadeh & Henikoff (1986) “Use of oligonucleotides for generation of large deletions” Nucl. Acids Res. 14: 5115), seleção por restrição e restrição-purificação (Well e colaboradores (1986) “Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin” Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), mutagênese através de síntese total de gene (Nambiar e colaboradores (1984) “Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein” Science 223: 12991301; Sakamar e Khorana (1988) “Total synhtesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-liGATion protein (transducin)” Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Well e colaboradores (1985) “Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites” Gene 34: 315-323; e Grundstrom e colaboradores (1985) “Oligonucleotide-directed mutagenesis through microscale 'shot-gun' gene synthesis” Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316); Double-Strand Break Repair (Mandecki (1986); Arnold (1993) “Protein engineering for unusual environments” Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455; e “Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site

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194/314 specific mutagenesis” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 71777181). Detalhes adicionais sobre muitos dos métodos acima podem ser encontrados em Methods in Enzymology, Volume 154, o qual também descreve controles úteis para resolução de problemas com vários métodos de mutagênese.

Detalhes adicionais com relação a vários métodos de geração de diversidade podem ser encontrados nas seguintes Patentes U.S., publicações PCT e publicações EPO: Pat. U.S. No. 5.605.793 para Stemmer (25 de Fevereiro de 1997), “Methods for in vitro Recombination;” Pat. U.S. No. 5.811.238 para Stemmer e colaboradores (22 de Setembro de 1998) “Methods for generation of polinucleotide having desired characteristics through Iterative Selection and recombination;” Pat. U.S. No. 5.830.721 para Stemmer e colaboradores (3 de Novembro de 1998), “DNA Mutagenesis through Random Fragmentation and Reassembly;” Pat. U.S. No. 5.834.252 para Stemmer e colaboradores (10 de Novembro de 1998) “End-Complementary Polimerase Reaction;” Pat. U.S. No. 5.837.458 para Minshull e colaboradores (17 de Novembro de 1998), “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;” WO 95/22625, Stemmer e Crameri, “Mutagenesis through Random Fragmentation and Reassembly;” WO 96/33207 para Stemmer e Lipschutz “End Complementary Polimerase Chain Reaction;” WO 97/20078 para Stemmer e Crameri “Methods for generation of polinucleotide having desired characteristics through iterative selection and Recombination;” WO 97/35966 para Minshull e Stemmer, “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;” WO 99/41402 para Punnonen e colaboradores “Targeting of genetic Vaccine Vectors;” WO 99/41383 para

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Punnonen e colaboradores “Antigen Library Immunization;” WO 99/41369 para Punnonen e colaboradores “Genetic Vaccine Vector Engineering;” WO 99/41368 para Punnonen e colaboradores “Optimization of Immunomodulatory Properties of genetic Vaccines;” EP 752008 para Stemmer e Crameri, “DNA Mutagenesis through Random Fragmentation and Reassembly;” EP 0932670 para Stemmer “Evolving Cellular DNA Uptake through Recursive Sequence Recombination;” WO 99/23107 para Stemmer e colaboradores, “Modification of Virus Tropism and Host Range through Viral Genome Shuttle;” WO 99/21979 para Apt e colaboradores, “Human Papillomavirus Vectors;” WO 98/31837 para del Cardiare e colaboradores “Evolution of Whole Cells and Organisms through Recursive Sequence Recombination;” WO 98/27230 para Patten e Stemmer, “Methods and Compositions for Polipeptide Engineering;” WO 98/13487 para Stemmer e colaboradores, “Methods for Optimization of gene Therapy through Recursive Sequence Shuttle and Selection;” WO 00/00632, “Methods for generation Highly Diverse Libraries;” WO 00/09679, “Methods for Obtaining in vitro Recombined polinucleotide sequence Banks e Resulting Sequences;” WO 98/42832 para Arnold e colaboradores, “Recombintion of polinucleotide sequences using Random or Defined Primers;” WO 99/29902 para Arnold e colaboradores, “Method for Creating Polinucleotide and Polipeptide Sequences;” WO 98/41653 para Vind, “An in vitro Method for Structurating of a DNA Library;” WO 98/41622 para Borchert e colaboradores, “Method for Structurating a Library Using DNA Shuttle;” WO 98/42727 para Pati e Zarling, “Sequence Alterating using Homologous Recombination;” WO 00/18906 para Patten e colaboradores,

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Shuttle of Codon-Alterated Genes; WO 00/04190 para del Cardiare e colaboradores Evolution of Whole Cells and Organisms through Recursive Recombination; WO 00/42561 para Crameri e colaboradores, Oligonucleotide Mediated Acid Nucleic Recombination; WO 00/42559 para Selifonov e Stemmer Methods of Populating Data Structures for use in Evolutionary Simulations; WO 00/42560 para Selifonov e colaboradores, Methods for Making Parts of characters, Polinucleotides & Polipeptides Having Desired Characteristics; WO 01/23401 para Welch e colaboradores, Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuttle; e WO 01/64864 Single-Stranded Nucleic Acid Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation para Affholter.

Determinados pedidos U.S. proporcionam detalhes adicionais com relação a vários métodos de geração de diversidade, incluindo SHUTTLE OF CODON ALTERATED GENES por Patten e colaboradores, depositado em 28 de Setembro de 1999, (USSN 09/407,800); EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS THROUGH RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION, por Cardiare e colaboradores depositado em 15 de Julho de 1998 (USSN 09/166, 188) e 15 de Julho de 1999 (Patente U.S. No. 6.379.964); OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION por Crameri e colaboradores, depositado em 28 de Setembro de 1999 (Patente U.S. No. 6.376.246); OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION por Crameri e colaboradores, depositado em 18 de Janeiro de 2000 (WO 00/42561); USE OF CODON-BASED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUTLLE por Welch e colaboradores, depositado em 28 de Setembro de 1999 (Patente U.S. No.

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6.436.675); “METHODS FOR MAKING CHARACTERS PARTS, POLINUCLEOTIDES & POLIPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS” por Selifonov e colaboradores, depositado em 18 de Janeiro de 2000, (WO 00/42560) ; “METHODS FOR MAKING CHARACTERS PARTS, POLINUCLEOTIDES & POLIPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS” por Selifonov e colaboradores, depositado em 18 de Julho de 2000 (USSN 09/618,579); “METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS” por Selifonov e Stemmer (WO 00/42559), depositado em 18 de Janeiro de 2000; e “SINGLESTRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND

NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION” por Affholter (USSN 60/186,482, depositado em 2 de Março de 2000).

Em resumo, várias classes gerais diferentes de métodos de modificação de seqüência, tais como mutação, recombinação, etc., são aplicáveis à presente invenção e apresentados nas referências acima. Isto é, alterações nas seqüências de ácido nucleico componentes para produzir construtos de fusão genéticas modificadas podem ser realizadas através de qualquer um de uma série de protocolos descritos, quer antes de conjugação das seqüências ou após a etapa de conjugação. O seguinte exemplifica alguns dos diferentes tipos de formatos preferidos para geração de diversidade no contexto da presente invenção incluindo, por exemplo, determinados formatos de geração de diversidade baseados em recombinação.

Ácidos nucleicos pode ser recombinados in vitro através de qualquer uma de uma variedade de técnicas discutidas nas referências acima incluindo, por exemplo,

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198/314 digestão com DNAse de ácidos nucleicos a serem recombinados, seguido por ligação e/ou remontagem por PCR dos ácidos nucleicos. Por exemplo, mutagênese por PCR sexual pode ser usada, na qual fragmentação aleatória (ou pseudo aleatória ou mesmo não-aleatória) da molécula de DNA é obtida através de recombinação, baseado em similaridade de seqüência, entre moléculas de DNA com seqüências de DNA diferentes, mas relacionadas, in vitro, seguido por fixação do cruzamento através de extensão em uma reação em cadeia de polimerase. Esse processo e muitas variantes de processo são descritos em várias das referências acima, por exemplo, em Stemmer (1994) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91: 1074710751.

Similarmente, ácidos nucleicos pode ser recursivamente recombinados in vivo, por exemplo, permitindo que recombinação ocorra entre ácidos nucleicos em células. Muitos de tais formatos de recombinação in vivo são apresentados nas referências conforme observado acima. Tais formatos proporcionam, opcionalmente, recombinação direta entre ácidos nucleicos de interesse ou proporcionam recombinação entre vetores, vírus, plasmídios, etc., compreendendo os ácidos nucleicos de interesse, bem como outros formatos. Detalhes com relação a tais procedimentos são encontrados nas referências conforme observado acima.

Métodos de recombinação do genoma todo podem também ser usados, nos quais os genomas todos de células ou outros organismos são recombinados, opcionalmente incluindo spiking das misturas de recombinação genômica com componentes de bibliotecas desejadas (por exemplo, genes correspondendo às vias da presente invenção). Esses métodos

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199/314 têm muitas aplicações, incluindo aquelas nas quais a identidade de um gene alvo não é conhecida. Detalhes sobre tais métodos são encontrados, por exemplo, no WO 98/31837 para Cardiare e colaboradores “Evolution of Whole Cells ans Organisms through Recursive Sequence Recombination;” e, por exemplo, no WO 00/04190 para Cardiare e colaboradores, também intitulado “Evolution of Whole Cells and Organisms through Recursive Sequence Recombination.” Assim, qualquer um desses processos e técnicas para recombinação, recombinação recursiva e recombinação do genoma todo, sozinhas ou em combinação, pode ser usada para gerar as seqüências de ácido nucleico modificadas e/ou construtos de fusão genética modificadas da presente invenção.

Métodos de recombinação sintética podem também ser usados, nos quais oligonucleotídeos correspondendo aos alvos de interesse são sintetizados e remontados em reações de PCR ou de ligação as quais incluem oligonucleotídeos que correspondem a mais de um ácido nucleico original, desse modo, gerando novos ácidos nucleicos recombinados. Oligonucleotídeos podem ser feitos através de métodos padrões de adição de nucleotídeo ou podem ser feitos, por exemplo, através de abordagens sintéticas de trinucleotídeo. Detalhes com relação a tais abordagens são encontrados nas referências conforme observado acima, incluindo, por exemplo, WO 00/42561 para Crameri e colaboradores, “Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination;” WO 01/23401 para Welch e colaboradores, “Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis for Synthetic Shutlle;” WO 00/42560 para Selifonov e colaboradores, “Methods for Making characters parts,

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200/314 polinucleotides and polipeptides having Desired characteristics;” e WO 00/42559 para Selifonov e Stemmer “Methods of Populating Data Structures for use in Evolutionary Simulations.”

Métodos de recombinação in silica podem ser realizados, nos quais algoritmos genéticos são usados em um computador para recombinar trechos de seqüência os quais correspondem a ácidos nucleicos homólogos (ou mesmo nãohomólogos). Os trechos de seqüência recombinados resultantes são, opcionalmente, convertidos em ácidos nucleicos através de síntese de ácidos nucleicos os quais correspondem às seqüências recombinadas correspondentes, por exemplo, em conjunto com técnicas de remontagem de gene por síntese de oligonucleotídeo. Essa abordagem pode gerar variantes aleatórias, parcialmente aleatórias ou projetadas. Muitos detalhes com relação à recombinação in silica, incluindo o uso de algoritmos genéticos, operadores genéticos e semelhantes em sistemas computadorizados, combinado com geração de ácidos nucleicos correspondentes (e/ou proteínas), bem como combinações de ácidos nucleicos e/ou proteínas projetados (por exemplo, baseados em seleção por sítio com cruzamento), bem como métodos de recombinação projetada, pseudo-aleatória ou aleatórias são descritos no WO 00/42560 por Selifonov e colaboradores, “Methods for Making characters parts, polinucleotides and polipeptides having Desired Characteristics” e WO 00/42559 por Selifonov e Stemmer “Methods of Populating Data Structures for use in Evolutionary Simulations.” Detalhes extensivos com relação a métodos de recombinação in silica são encontrados nesses pedidos. Essa metodologia é geralmente aplicável à

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201/314 presente invenção para proporcionar recombinação de seqüências de ácido nucleico e/ou construtos de fusão genéticas que codificam proteínas envolvidas em várias vias metabólicas (tais como, por exemplo, vias biossintéticas de carotenóide, vias biossintéticas de ectoína, vias biossintéticas de polihidróxialcanoato, vias biossintéticas de policetídeo e semelhantes) in silica e/ou a geração de ácidos nucleicos ou proteínas correspondentes.

Muitos métodos para acessar diversidade natural, por exemplo, através de hibridização de diversos ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleico a modelos com fita simples, seguido por polimerização e/ou ligação a seqüências regeneradas de comprimento total, opcionalmente seguido por degradação dos modelos e recuperação dos ácidos nucleicos modificados resultantes pode ser similarmente usado. Em um método empregando um modelo com fita simples, a população de fragmentos derivada da biblioteca genômica é anelada com DNA ou RNA parcial ou, freqüentemente, de comprimento aproximadamente total correspondendo à fita oposta. A montagem de genes quiméricos complexos a partir dessa população é, então, mediada através de remoção baseada em nuclease de extremidades de fragmento nãohibridizados, polimerização para preencher gaps entre tais fragmentos e subseqüente ligação da fita simples. A fita do polinucleotídeo original pode ser removida através de digestão (por exemplo, se RNA ou contendo uracila), separação magnética sob condições de desnaturação (se rotulado de uma maneira que conduz a tal separação) e outros métodos disponíveis de separação/purificação. Alternativamente, a fita original é opcionalmente co

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202/314 purificada com as fitas quiméricas e removida durante etapas subseqüentes de seleção e processamento. Detalhes adicionais com relação a essa abordagem são encontrados, por exemplo, em “Single-Stranded Nucleic Acid TemplateMediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation” por Affholter, WO 01/64864.

Em outra abordagem, moléculas fita simples são convertidas em DNA fita dupla (dsDNA) e as moléculas de dsDNA são ligadas a um suporte sólido através de ligação ligante-mediada. Após separação do DNA não ligado, as moléculas de DNA selecionadas são liberadas do suporte e introduzidas em uma célula hospedeira adequada para gerar uma biblioteca de seqüências enriquecidas a qual se hibridize à sonda. A biblioteca produzida dessa maneira proporciona um substrato desejável para diversificação adicional usando qualquer um dos procedimentos descritos aqui .

Qualquer um dos formatos de recombinação gerais precedentes pode ser praticado de um modo reiterativo (por exemplo, um ou mais ciclos de mutação/recombinação ou outros métodos de geração de diversidade, opcionalmente seguido por um ou mais métodos de seleção) para gerar um conjunto mais diverso de ácidos nucleicos recombinantes.

Mutagênese empregando métodos de término de cadeia também foi proposta (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.965.408, “Method of DNA reassembly through interrupting synthesis” para Short e as referências acima) e pode ser aplicada à presente invenção. Nessa abordagem, DNAs fita dupla correspondendo a um ou mais genes compartilhando regiões de similaridade de seqüência são combinados e

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203/314 desnaturados, na presença ou ausência de primers específicos para o gene. Os polinucleotídeos fita simples são, então, anelados e incubados na presença de uma polimerase e um reagente de término de cadeia (por exemplo, ultravioleta, irradiação gama ou raios-X; brometo de etídio ou outros intercaladores; proteínas de ligação a DNA, tais como proteínas de ligação fita simples, fatores de ativação de transcrição ou histonas; hidrocarbonetos policíclicos aromáticos; cromo trivalente ou um sal de cromo trivalente; ou polimerização abreviada mediada por termociclização rápida; e semelhantes), resultando na produção de moléculas duplas parciais. As moléculas duplas parciais, por exemplo, contendo cadeias parcialmente estendidas, são, então, desnaturadas e reaneladas em ciclos subseqüentes de replicação ou replicação parcial, resultando em polinucleotídeos os quais compartilham graus variados de similaridade de seqüência e os quais são diversificados com relação à população de moléculas de DNA de iniciação. Opcionalmente, os produtos ou poços de produtos parciais podem amplificados em um ou mais estágios no processo. Polinucleotídeos produzidos através do método de término de cadeia, tal como descrito acima, são substratos adequados para qualquer outro formato de recombinação descrito.

Diversidade também pode ser gerada em ácidos nucleicos ou populações de ácidos nucleicos usando um procedimento de recombinação denominado truncamento crescente para a criação de enzimas híbridas” (“ITCHY”) descrito em Ostermeier e colaboradores (1999) “A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology” Nature Biotech 17: 1205. Essa approach pode ser usada para gerar

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204/314 uma biblioteca inicial de variantes a qual pode, opcionalmente, servir como um substrato para um ou mais métodos de recombinação in vitro ou in vivo. Veja também Ostermeier e colaboradores (1999) “Combinatorial Protein Engineering through Incremental Truncation,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 3562-67; e Ostermeier e colaboradores (1999), “Incremental Truncation as a Strategy in the Engineering of news Biocatalysts,” Biologic and Medicinal Chemistry, 7: 2139-44.

Métodos de mutação os quais resultam na alteração de nucleotídeos individuais ou grupos de nucleotídeos contínuos ou não contínuos pode ser favoravelmente empregados para introduzir diversidade de nucleotídeo nas seqüências de ácido nucleico e/ou construtos de fusão genética da presente invenção. Muitos métodos de mutagênese são encontrados nas referências citadas acima; detalhes adicionais com relação a métodos de mutagênese podem ser encontrados a seguir, os quais também podem ser aplicados à presente invenção.

Por exemplo, PCR propensa a erro pode ser usada para gerar variantes de ácido nucleico. Usando essa técnica, PCR é realizada sob condições onde a fidelidade de cópia da DNA polimerase é baixa, de modo que uma elevada taxa de mutações por pontos é obtida ao longo de todo o comprimento do produto de PCR. Exemplos de tais técnicas são encontrados nas referências acima e, por exemplo, em Leung e colaboradores (1989) Technique 1: 11-15 e Caldwell e colaboradores (1992) PCR Methods Applic. 2: 28-33. Similarmente, PCR para montagem pode ser usada, em um processo o qual envolves a montagem do produto de PCR a

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205/314 partir de uma mistura de pequenos fragmentos de DNA. Um grande número de diferentes reações de PCR pode ocorrer em paralelo na mesma mistura de reação, com os produtos de uma reação produzindo os produtos de outra reação.

Mutagênese oligonucleotídeo-dirigida pode ser usada para introduzir mutações sítio-específicas em uma seqüência de ácido nucleico de interesse. Exemplos de tais técnicas são encontrados nas referências acima e, por exemplo, em Reidhaar-Olson e colaboradores (1988) Science 241: 53-57. Similarmente, mutagênese em cassete pode ser usada em um processo que substitui uma pequena região de uma molécula de DNA fita dupla por um cassete de oligonucleotídeo sintético que difere da seqüência nativa. O oligonucleotídeo pode conter, por exemplo, seqüências nativas parcial e/ou completamente aleatorizadas.

Mutagênese por estruturação recursiva é um processo no qual o algoritmo para mutagênese de proteína é usado para produzir diversas populações dos mutantes fenotipicamente relacionados, membros dos quais diferem quanto a seqüência de aminoácidos. Esse método usa um mecanismo de feedback para monitorar ciclos sucessivos de mutagênese em cassete combinatorial. Exemplos dessa abordagem são encontrados em Arkin & Youvan (1992) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89: 78117815.

Mutagênese por estruturação exponencial pode ser usada para a geração de bibliotecas combinatoriais com um elevado percentual de mutantes únicos e funcionais. Pequenos grupos de resíduos em uma seqüência de interesse são aleatorizados em paralelo para identificar, em cada posição alterada, aminoácidos os quais levam à proteínas funcionais. Exemplos

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206/314 de tais procedimentos são encontrados em Delegrave & Youvan (1993) Biotech. Res. 11: 1548-1552.

Mutagênese in vivo pode ser usada para gerar mutações aleatórias em qualquer DNA clonado de interesse através de propagação do DNA, por exemplo, em um gênero de E. coli que traz mutações em uma ou mais das vias de reparo de DNA. Esses gêneros com mutação têm uma maior taxa de mutação aleatória do que o original do tipo. Propagação do DNA em desses gêneros eventualmente gerará mutações aleatórias dentro do DNA. Tais procedimentos são descritos nas referências conforme observado acima.

Outros procedimentos para introdução de diversidade em um genoma, por exemplo, um genoma bacteriano, fúngico, de animal ou planta, podem ser usados em conjunto com os métodos acima descritos e/ou mencionados. Por exemplo, além dos métodos acima, foram propostas técnicas as quais produzem multímeros de ácido nucleico adequados para transformação em uma variedade de espécies (veja, por exemplo, Schellenberger Patente U.S. No. 5.756.316 e as referências acima). A transformação de um hospedeiro adequado com tais multímeros, consistindo de genes que são divergentes uns com relação aos outros (por exemplo, derivados de diversidade natural ou através de aplicação de mutagênese sítio dirigida, PCR propensa a erro, passagem através de gêneros bacterianos mutagênicos e semelhantes), proporciona uma fonte de diversidade de ácido nucleico para diversificação de DNA, por exemplo, através de um processo de recombinação in vivo, conforme indicado acima.

Alternativamente, uma multiplicidade de polinucleotídeos monoméricos compartilhando regiões de

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207/314 similaridade parcial de seqüência podem ser transformados em uma espécie hospedeira e recombinados in vivo pela célula hospedeira. Ciclos subseqüentes de divisão celular podem ser usados para gerar bibliotecas, os membros das quais incluem uma única população homogênea ou poço de polinucleotídeos monoméricos. Alternativamente, os ácidos nucleicos monoméricos podem ser recuperados através de técnicas padrões, por exemplo, PCR e/ou clonagem e recombinados em qualquer um dos formatos de recombinação, incluindo formatos de recombinação recursiva, descritos acima.

Métodos para a geração de bibliotecas de expressão multiespécies foram descritos (além das referências conforme observado acima, veja, por exemplo, Peterson e colaboradores (1998) Pat. U.S. No. 5.783.431 METHODS FOR GENERATION AND SCREENING NEW METAABOLIC VIA;” e Thompson e colaboradores (1998) Pat. U.S. No. 5.824.485 METHODS FOR GENERATION AND SCREENING NEW METABOLIC VIA) e seu uso para identificar atividades de proteínas de interesse foi proposto (além das referências conforme observado acima, veja, Short (1999) Pat. U.S. No. 5.958.672 PROTEIN ACTIVITY SCREENING OF CLONES HAVING DNA FROM UNCULTIVATED MICROORGANISMS”). Bibliotecas de expressão multiespécie incluem, em geral, bibliotecas compreendendo seqüências de cDNA ou genômicas de uma pluralidade de espécies ou gêneros, operavelmente ligadas a seqüências regulatórias apropriadas, em um cassete de expressão. As seqüências de cDNA e/ou genômicas são, opcionalmente, aleatoriamente ligadas para intensificar adicionalmente a diversidade. O vetor pode ser um vetor embaralhado adequado para

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208/314 transformação e expressão em mais de uma espécie de organismo hospedeiro, por exemplo, uma espécie bacteriana ou células eucariotas. Em alguns casos, a biblioteca é desviada através de pré-seleção de seqüências as quais codificam uma proteína de interesse ou as quais se hibridize a um ácido nucleico de interesse. Qualquer uma de tais bibliotecas pode ser proporcionada como substratos para qualquer um dos métodos aqui descritos.

Os procedimentos acima descritos foram grandemente dirigidos ao aumento de diversidade de ácido nucleico e/ou proteína codificada. Contudo, em muitos casos, nem toda a diversidade é útil, por exemplo, funcional e contribui meramente para aumento da base de variantes que devem ser selecionada ou selecionadas para identifica as poucas variantes favoráveis. Em algumas aplicações, é desejável pré-selecionar ou fazer uma pré-triagem das bibliotecas (por exemplo, uma biblioteca amplificada, uma biblioteca genômica, uma biblioteca de cDNA, uma biblioteca normalizada, etc.) ou outros ácidos nucleicos substratos antes de diversificação, por exemplo, através de procedimentos de mutagênese baseada em recombinação ou para, de outro modo, desviar os substratos para ácidos nucleicos que codificam produtos funcionais. Por exemplo, no caso de manipulação de anticorpo, é possível desviar o processo de geração de diversidade geração para anticorpos com sítios de ligação a antígeno funcionais tomando-se vantagem de eventos de recombinação in vivo antes de manipulação através de qualquer um dos métodos descritos. Por exemplo, CDRs recombinadas derivadas de bibliotecas de cDNA de células B podem ser amplificadas e montadas em

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209/314 regiões de rede (por exemplo, Jirholt e colaboradores (1998) “Exploiting sequence space: shutlle in vivo formed complementarity determining regions into a master framework” Gene 215: 471) antes de diversificação de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui.

Bibliotecas podem ser desviadas para ácidos nucleicos os quais codificam proteínas com atividades enzimáticas desejáveis. Por exemplo, após identificação de um clone a partir de uma biblioteca a qual exibes uma atividade especificada, o clone pode sofrer mutação usando qualquer método conhecido para introdução de alterações em DNA. A biblioteca compreendendo os homólogos com mutação é, então, selecionada com relação a uma atividade desejada, a qual pode ser a mesma que ou diferente da atividade inicialmente especificada. Um exemplo de tal procedimento é proposto em Short (1999) Patente U.S. No. 5.939.250 para “PRODUCTION OF ENZYMES HAVING DESIRED ACTIVITIES THROUGH MUTAGENESIS.” As atividades desejadas podem ser identificadas através de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, o WO 99/10539 propõe que bibliotecas de gene podem ser selecionadas através de combinação de extratos da biblioteca de gene com componentes obtidos de células metabolicamente ricas e identificação de combinações as quais exibem a atividade desejada. Também foi proposto (por exemplo, WO 98/58085) que clones com as atividades desejadas podem ser identificados através de inserção de substratos bioativos em amostras da biblioteca e detecção de fluorescência bioativa correspondendo ao produto da atividade desejada usando um analisador fluorescente, por exemplo, um dispositivo de citometria de fluxo, uma CCD, um

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210/314 fluorômetro ou um espectrofotômetro.

Bibliotecas podem também ser desviadas para ácidos nucleicos os quais têm características especificadas, por exemplo, hibridização a uma sonda de ácido nucleico selecionada. Por exemplo, o WO 99/10539 propõe que polinucleotídeos que codificam uma atividade desejada (por exemplo, uma atividade enzimática, por exemplo: uma lipase, uma esterase, uma protease, uma glicosidase, uma glicosil transferase, uma fosfatase, uma quínase, uma oxigenase, uma peroxidase, uma hidrolase, uma hidratase, uma nitrilase, uma transaminase, uma amidase ou uma acilase) podem ser identificados dentre seqüências de DNA genômico. Em particular, moléculas de DNA fita simples de uma população de DNA genômico são hibridizadas a uma sonda conjugada a ligante. O DNA genômico pode ser derivado de um microorganismo cultivado ou não cultivado ou de uma amostra ambiental. Alternativamente, o DNA genômico pode ser derivado de um organismo multicelular ou um tecido derivado do mesmo. A síntese de uma segunda fita pode ser conduzida diretamente a partir da sonda de hibridização usada na captura, com ou sem liberação prévia do meio de captura ou através de uma ampla variedade de outras estratégias conhecidas na técnica. Alternativamente, a população de DNA genômico fita simples isolada pode ser fragmentada sem clonagem adicional e usada diretamente, por exemplo, em uma abordagem baseada em recombinação que emprega um modelo fita simples, conforme descrito acima.

Métodos de geração de ácidos nucleicos e polipeptídeos não-estochásticos são descritos em Short “Non-Stochastic Generation of Genetic Vaccines and Enzymes” WO 00/46344.

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Esses métodos, incluindo reestruturação de polinucleotídeo não-estochástica proposta e métodos de mutagênese por sítio-saturação podem ser aplicados à presente invenção também. Mutagênese aleatória ou semi-aleatória usando oligonucleotídeos revestidos ou degenerados também é descrita, por exemplo, em Arkin e Youvan (1992) Optimizing nucleotides mixtures to codify specific subsets of aminoacid for semi-random mutagenesis Biotechnology 10: 297-300; Reidhaar-Olson e colaboradores (1991) Random mutagenesis of protein sequences using oligonucleotide cassettes Methods Enzymol. 208: 564-86; Lim e Sauer (1991) The role of internal packing interations in determining the structure and stability of a protein J. Mol. Biol. 219: 359-76; Breyer e Sauer (1989) Mutational analysis of the fine specificity of binding of monoclonal antibody 51F to lambda repressor J. Biol. Chem. 264: 13355-60); Walk-Through Mutagenesis (Crea, R; Patentes U.S. Nos. 5.830.650 e 5.798.208 e Patente EP 0527809 B1.

Será prontamente apreciado que qualquer uma das técnicas descritas acima adequadas para enriquecimento de uma biblioteca antes de diversificação pode também ser usada para selecionar os produtos ou bibliotecas de produtos, produzidas através dos métodos de geração de diversidade. Qualquer um dos métodos descritos acima pode ser praticado recursivamente ou em combinação para alterar ácidos nucleicos, por exemplo, polinucleotídeos que codificam a GAT.

Kits para mutagênese, estruturação de bibliotecas e outros métodos de geração de diversidade também estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, kits estão

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212/314 disponíveis, por exemplo, da Stratagene (por exemplo, kit de mutagênese sítio-dirigida QuickChange^TM; e kit de mutagênese sítio-dirigida, fita-dupla Chameleon™); Bio/Can Scientific, Bio-Rad (por exemplo, usando o método de Kunkel descrito acima); Boehringer Mannheim Corp.; Clonetech Laboratories; DNA Technologies; Epicentre Technologies (por exemplo, kit 5 prime 3 prime); Genpak Inc.; Lemargo Inc.; Life Technologies (Gibco BRL); New England Biolabs; Pharmacia Biotech; Promega Corp.; Quantum Biotechnologies; Amersham International plc (por exemplo, usando o método de Eckstein acima); e Anglian Biotechnology Ltda. (por exemplo, usando o método de Carter/Winter acima).

As referências acima proporcionam muitos formatos mutacionais, incluindo recombinação, recombinação recursiva, mutação recursiva e combinações de recombinação com outras formas de mutagênese, bem como muitas modificações desses formatos. A despeito do formato de geração de diversidade geração que é usado, os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser recombinados (uns com os outros ou com seqüências relacionadas (ou mesmo não relacionadas)) para produzir um conjunto diverso de ácidos nucleicos recombinantes para uso no construto de fusão genética e construto de fusão genética modificada da presente invenção incluindo, por exemplo, conjuntos de ácidos nucleicos homólogos, bem como polipeptídeos correspondentes.

Muitas das metodologias descritas acima para a geração de polinucleotídeo modificados geram um grande número de diversas variantes da seqüência ou seqüências originais. Em algumas modalidades preferidas da invenção, a técnica de

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213/314 modificação (por exemplo, alguma forma de embaralhamento) é usada para gerar uma biblioteca de variantes que é, então, selecionada com relação a um polinucleotídeo modificado ou poço de polinucleotídeos modificados que codifica alguns atributos funcionais desejados, por exemplo, atividade aperfeiçoada de GAT. Atividades enzimáticas exemplificativas que podem ser selecionadas incluem taxas catalíticas (convencionalmente caracterizadas em termos de constantes cinéticas, tais como kcat e Km) , especificidade de substrato e suscetibilidade à ativação ou inibição pelo substrato, produto ou outras moléculas (por exemplo, inibidores ou ativadores).

Um exemplo de seleção por uma atividade enzimática desejada requer desenvolvimento de células hospedeiras sob condições que inibem o crescimento e/ou sobrevivência de células que não expressam suficientemente uma atividade enzimática de interesse, por exemplo, a atividade de GAT. Usando tal processo de seleção, pode-se eliminar de consideração todos os polinucleotídeos modificados, exceto aqueles que codificam uma atividade enzimática desejada. Por exemplo, em algumas modalidades da invenção, células hospedeiras são mantidas sob condições que inibem o crescimento ou sobrevivência das células na ausência de níveis suficientes de GAT, por exemplo, uma concentração de glifosato que é letal ou inibe o crescimento de uma planta do tipo silvestre da mesma variedade que carece ou não expressa um polinucleotídeo de GAT. Sob essas condições, apenas a célula hospedeira abrigando um ácido nucleico modificado que codifica a atividade ou atividades enzimáticas capaz de catalisar a produção de níveis

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214/314 suficientes do produto sobreviera e crescerá. Algumas modalidades da invenção empregam ciclos múltiplos de seleção em concentrações crescentes de glifosato ou um análogo de glifosato.

Em algumas modalidades da invenção, espectrometria de massa é usado to detect a acetilação de glifosato ou um análogo de glifosato ou metabólito. The use de espectrometria de massa é descrita em maiores detalhes em the Exemplos abaixo.

Por conveniência e elevado rendimento, freqüentemente é desejável selecionar/fazer triagem de ácidos nucleicos modificados desejados em um microorganismo, por exemplo, uma bactéria, tal como E. coli. Por outro lado, a seleção em células de planta ou plantas pode, em alguns casos, ser preferível onde o objetivo final é gerar um ácido nucleico modificado para expressão em um sistema de planta.

Em algumas modalidades preferidas da invenção, o rendimento é aumentado através de seleção de poços de células hospedeiras expressando diferentes ácidos nucleicos modificados, quer sozinhos ou como parte de um construto de fusão genética. Qualquer poço mostrando atividade significativa pode ser pesquisado para identificar clones únicos expressando a atividade desejável.

Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que o ensaio, método de triagem ou seleção relevante variarão, dependendo do organismo hospedeiro desejado e outros parâmetros conhecidos na técnica. Normalmente, é vantajoso empregar um ensaio que pode ser praticado em um formato com elevado rendimento.

Em ensaios com elevado rendimento, é possível

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215/314 selecionar até vários milhares de diferentes variantes em um único dia. Por exemplo, cada cavidade de uma lâmina de microtitulação pode ser usada para operar um ensaio distinto ou, se efeitos de concentração ou tempo de incubação têm de ser observados, cada 5-10 cavidades podem testar uma única variante.

Além de abordagens fluídicas, é possível, conforme mencionado acima, simplesmente desenvolver as células sobre lâminas com meio que selecionam a função enzimática ou metabólica desejada. Essa abordagem oferece um métodos de seleção simples e com elevado rendimento.

Uma série de sistemas robóticos bem conhecidos também foi desenvolvida para químicas de fase em solução úteis em sistemas de ensaio. Esses sistemas incluem workstations automatizadas, tal como o aparelho de síntese automática desenvolvido pela Takeda Chemistry Industries, LTD. (Osaka, Japão) e muitos sistemas robóticos utilizando braços robóticos (Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, MA; e Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) os quais imitam as operações sintéticas manuais por um cientista. Qualquer um dos dispositivos acima é adequado para aplicação à presente invenção. A natureza e implementação de modificações nesses dispositivos (se houver) de modo que eles possam operar conforme discutido aqui com referência ao sistema integrado serão evidentes para aqueles habilitados na técnica relevante.

Sistemas de seleção com elevado rendimento estão comercialmente disponíveis (veja, por exemplo, Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems,

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Inc., Natick, MA, etc.). Esses sistemas, tipicamente, automatizam o procedimento todo, incluindo todo pipeteamento de amostras e reagentes, distribuição de líquidos, incubações sincronizadas e leituras finais do microlato em detector(es) apropriado(s) para o ensaio em particular. Esses sistemas configuráveis proporcionam elevado rendimento e rápido início, bem como um alto grau de flexibilidade e customização.

Os	fabricantes de	tais	sistemas proporcionam
protocol	os detalhados para	os	vários	dispositivos com
elevado	rendimento. Assim,	por	exemplo,	a Zymark Corp.

proporciona boletins técnicos descrevendo sistemas para detecção da modulação da transcrição de um gene, ligação a ligante e semelhantes. abordagens microfluídicas para manipulação de reagentes também foram desenvolvimentos, por exemplo, pela Caliper Technologies (Mountain View, CA).

As imagens ópticas visualizadas (e, opcionalmente, registradas) através de uma câmera ou outro dispositivo de registro (por exemplo, um fotodiodo e um dispositivo de armazenamento de dados) são opcionalmente ainda processadas em qualquer uma das modalidades aqui, por exemplo, através de digitalização da imagem e/ou armazenamento e análise da imagem em um computador. Uma variedade de equipamento periférico comercialmente disponível e softwares está disponível para digitalização, armazenamento e análise de um vídeo digitalizado ou imagem óptica digitalizada, por exemplo, usando computadores PC (máquinas baseadas em Intel x86 ou Pentium chip compatível DOS™, OS™ WINDOWS™, WINDOWS NT™ ou WINDOWS 95™), baseados em MACINTOSH™ ou UNIX (por exemplo, SUN™ work station).

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Um sistema convencional transporta a luz d0 dispositivo de ensaio para uma câmera de dispositivo acoplado à carga esfriada (CCD), um uso comum na técnica. Uma câmera CCD inclui uma série de elementos gráficos (pixéis). A luz da amostra tem sua imagem formada sobre a CCD. Pixéis em particular correspondendo a regiões da amostra (por exemplo, individual sítios individuais de hibridização sobre uma série de polímeros biológicos) são coletados para se obter leituras de intensidade de luz para cada posição. Pixéis múltiplos são processados em paralelo para aumentar a velocidade. O aparelho e métodos da invenção são facilmente usados para visualização de qualquer amostra, por exemplo, através de técnicas fluorescentes ou microscópicas com campo escuro.

Outras composições de polinucleotídeo:

A invenção também inclui composições compreendendo dois ou mais polinucleotídeos da invenção (por exemplo, como substratos para recombinação). A composição pode compreender uma biblioteca de ácidos nucleicos recombinantes, onde a biblioteca contém pelo menos 2, 3, 5, 10, 20 ou 50 ou mais polinucleotídeos. Os polinucleotídeos são, opcionalmente, clonados em vetores de expressão, proporcionando bibliotecas de expressão.

A invenção também inclui composições produzidas através de digestão de um ou mais polinucleotídeos da invenção com uma endonuclease de restrição, uma RNAse ou uma DNAse (por exemplo, conforme é realizado em determinados formatos de recombinação observados acima); e composições produzida através de fragmentação ou cisalhamento de um ou mais polinucleotídeos da invenção

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218/314 através de meios mecânicos (por exemplo, ultra-som, turbilhonamento e semelhantes), os quais podem também ser usados para proporcionar substratos para recombinação nos métodos acima. Similarmente, composições compreendendo conjuntos de oligonucleotídeos correspondendo a mais de um ácido nucleico da invenção são úteis como substratos de recombinação e são uma característica da invenção. Por conveniência, essas misturas de oligonucleotídeos sintetizados, fragmentados ou cisalhados são referidas como conjuntos de ácidos nucleicos fragmentados.

Também incluídas na invenção estão composições produzidas através de incubação um ou mais dos conjuntos de ácidos nucleicos fragmentados na presença de trifosfato de ribonucleotídeo ou deoxiribonucleotídeo e uma polimerase de ácido nucleico. Essa composição resultante forma uma mistura de recombinação para muitos dos formatos de recombinação observados acima. A polimerase de ácido nucleico pode ser uma RNA polimerase, uma DNA polimerase ou uma DNA polimerase RNA-dirigida (por exemplo, uma “transcriptase reversa”); a polimerase pode ser, por exemplo, uma DNA polimerase termoestável (tal como, VENT, TAQ ou semelhante).

Sistemas Integrados:

A presente invenção proporciona computadores, meios legíveis em computador e sistemas integrados compreendendo partes de caracteres correspondendo à informação de uma seqüência aqui para os polipeptídeos e ácidos nucleicos aqui incluindo, por exemplo, aquelas seqüências listadas aqui e as várias substituições silenciosas e substituições conservativas das mesmas.

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Por exemplo, vários métodos e algoritmos genéticos (GAs) conhecidos na técnica podem ser usados para detectar a homologia ou similaridade entre diferente partes de caracteres ou podem ser usados para realizar outras funções desejáveis, tal como controlar campos de saída de dados, proporcionar a base para fazer representações de informação, incluindo uma seqüência e semelhantes. Exemplos incluem o BLAST, discutido supra.

Assim, diferentes tipos de homologia e similaridade de várias estringências e extensões podem ser detectados e reconhecidos nos sistemas integrados descritos aqui. Por exemplo, muitos métodos de determinação de homologia foram projetados para análise comparativa de seqüências de biopolímeros, para verificação em processamento de texto e para recuperação de dados a partir de vários bancos de dados. Com uma compreensão de interações de complemento aos pares com dupla hélice entre 4 nucleobases principais em polinucleotídeos naturais, modelos que simulam anelamento de trechos de polinucleotídeos homólogos complementares podem também ser usados como uma base para alinhamento de seqüência ou outras operações tipicamente realizadas com partes de caracteres correspondendo a uma seqüência aqui (por exemplo, manipulações de processamento de texto, estruturação de figuras compreendendo partes de caracteres de seqüências ou sub-seqüências, tabelas de rendimento, etc. ) . Um exemplo de um pacote de software com GA para cálculo de similaridade de seqüência é o BLAST, o qual pode ser adaptado para a presente invenção através de inserção de partes de caracteres correspondendo a uma seqüência aqui .

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Similarmente, aplicações de desktop padrões, tal como um software de processamento de texto (por exemplo, Microsoft Word™ ou Corel WordPerfect™) e um software de banco de dados (por exemplo, um software de planilha eletrônica, tal como Microsoft Excel™, Corel Four Pro™ ou programas de banco de dados, tais como Microsoft Access™ ou Paradox™) pode ser adaptado à presente invenção através de inserção de um trecho de caractere correspondendo aos homólogos de GAT da invenção (quer ácidos nucleicos ou proteínas ou ambos). Por exemplo, os sistemas integrados podem incluir o software precedente tendo a informação de trecho de caractere apropriada, por exemplo, usado em conjunto com uma interface para o usuário (por exemplo, uma GUI em um sistema operacional padrão, tal como um sistema Windows, Macintosh ou LINUX) para manipular trechos de caracteres. Conforme observado, programas especializados de alinhamento, tal como BLAST, podem também ser incorporados nos sistemas da invenção para alinhamento de ácidos nucleicos ou proteínas (ou partes correspondentes de caracteres).

Sistemas integrados para análise na presente invenção incluem, tipicamente, um computador digital com software GA para alinhamento de seqüências, bem como conjuntos de dados inseridos no sistema de software compreendendo qualquer uma das seqüências aqui. O computador pode ser, por exemplo, um PC (uma máquina baseada em Intel x8 6 ou Pentium chip compatível DOS™, OS2™ WINDOWS™ WINDOWS NT™, WINDOWS95™, WINDOWS98™ LINUX, a MACINTOSH™, Power PC ou uma máquina baseada em UNIX (por exemplo, SUN™ work station)) ou outro computador comercialmente comum o qual é conhecido por

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221/314 aqueles habilitados. O software para alinhamento ou, de outro modo, manipulação de seqüências está disponível ou pode ser facilmente estruturados por aqueles habilitados usando uma linguagem de programação padrão, tal como Visualbasic, Fortran, Basic, Java ou semelhante.

Qualquer controlador ou computador inclui, opcionalmente, um monitor o qual é freqüentemente um display de tubo de raios catódicos (CRT), um display de painel plano (por exemplo, display de cristal líquido matricial, display de cristal líquido) ou outros. O circuito do computador é, freqüentemente, colocado em uma caixa a qual inclui numerosos chips de circuito integrado, tais como um microprocessador, memória, circuitos de interface e outros. A caixa também inclui, opcionalmente, um drive de disco rígido, um drive de disco flexível, um drive removível de alta capacidade, tal como um CD-ROM gravável e outros elementos periféricos comuns. Dipositivos de entrada, tais como um teclado ou mouse proporcionam, opcionalmente, entrada de um usuário e uso da seleção de seqüências a serem comparadas ou, de outro modo, manipulação no sistema de computador relevante.

O computador inclui, tipicamente, software apropriado para receber instruções do usuário, quer na forma de entradas do usuário no campo ajuste de parâmetros, por exemplo, em um GUI ou na forma de instruções préprogramadas, por exemplo, pré-programadas para uma variedade de diferentes operações específicas. O software, então, converte essas instruções para a linguagem apropriada para instruir a operação da direção de fluido e controlador de transporte para fazer a operação desejada.

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O software pode também incluir elementos de produção para o controle da síntese de ácido nucleico (por exemplo, baseado em uma seqüência ou um alinhamento de uma seqüência aqui) ou outras operações as quais ocorrem a jusante de um alinhamento ou outra operação realizada usando um trecho de caractere correspondendo a uma seqüência aqui. Equipamento de síntese de ácido nucleico pode, conseqüentemente, ser um componente em um ou mais sistemas integrados aqui.

Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona kits incorporando os métodos, composição, sistemas e aparelho aqui. Kits da invenção compreendem, opcionalmente, um ou mais dos seguintes: (1) um aparelho, sistema, componente de sistema ou componente de aparelho conforme descrito aqui; (2) instruções para a prática dos métodos descritos aqui e/ou para operação do aparelho ou componentes de aparelho aqui e/ou para uso das composições aqui; (3) uma ou mais composições ou componentes de GAT;

(4) um recipiente para contenção dos componentes ou composições e, (5) materiais de embalagem.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona o uso de qualquer aparelho, componente de aparelho, composição ou kit aqui, para a prática de qualquer método ou ensaio aqui e/ou o uso de qualquer aparelho ou kit para praticar qualquer ensaio ou método aqui.

Célula e Organismos Hospedeiros:

A célula hospedeira pode ser eucariota, por exemplo, uma célula eucariota, uma célula de planta, uma célula de animal, um protoplasta ou uma célula de cultura tecidual. A célula hospedeira compreende, opcionalmente, uma pluralidade de células, por exemplo, um organismo.

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Alternativamente, a célula hospedeira pode ser procariota incluindo, mas não limitado a, bactérias (isto é, bactérias gram positivas, bactérias púrpuras, bactérias verdes de enxofre, bactérias verdes de não-enxofre, cianobactérias, espirochetes, termatogalos, flavobactérias e bacteróides) e archaebactérias (isto é, Korarchaeota, Thermoproteus, Pyrodictium, Thermococcales, Methanogens, Archaeoglobus e extreme Halophiles).

Plantas transgênicas ou células de planta incorporando os ácidos nucleicos de GAT e/ou expressando os polipeptídeos de GAT da invenção são uma característica da invenção. A transformação de células de planta e protoplastas pode ser realizada essencialmente através de qualquer uma das várias formas conhecidas por aqueles habilitados na técnica de biologia molecular de planta incluindo, mas não limitado, aos métodos descritos aqui. Veja, em geral, Methods in Enzymology, Vol. 153 (DNA recombinant Part D) Wu e Grossman (eds.) 1987, Academic Press; e Weising e colaboradores, Ann. Rev. Genet. 22: 421477 (1988), incorporadas aqui por referência. Por exemplo, o construto de DNA pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula de planta usando técnicas tais como eletroporação, transfecção PEG-mediada, bombardeamento de partículas, distribuição de fibras de silício ou microinjeção de protoplastas de células de planta ou caule embriogênico. Veja, por exemplo, Tomes e colaboradores (1995) “Direct DNA Transference into Intact Cells Plant Via Microprojectile Bombardment,” em Cell Plant, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, eds. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlin), páginas 197-213. Outros métodos

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224/314 para transformação de várias células hospedeiras são divulgados em Klein e colaboradores (1992) “Transformation of microbes, plants and animals by particle bombardment” Bio/Technol. 10 (3) : 286-291.

A introdução de construtos de DNA usando precipitação com polietileno glicol é descrita em Paszkowski e colaboradores (1984) EMBO J. 3: 2717-2722. Técnicas de eletroporação são descritas em Fromm e colaboradores (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5824. Técnicas de transformação balística são descritas em Klein e colaboradores (1987) Nature 327: 70-73.

Alternativamente, os construtos de DNA podem ser combinadas com regiões de flanqueamento de T-DNA adequadas e introduzidas em um vetor hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens convencional. A virulência funcional do hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens direcionará a inserção do construto e do marcador adjacente no DNA da célula de planta quando a célula é infectada pelas bactérias. Veja Patente U.S. No. 5.591.616.

Técnicas de transformação Agrobacterium tumefaciensmediadas são bem descritas na literatura científica. Veja, por exemplo, Horsch e colaboradores (1984) Science 233: 496-498 e Fraley e colaboradores (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 4803. Por exemplo, transformação de milho com Agrobacterium é descrita nas Patentes U.S. Nos. 5.550.318 e 5.981.840.

Outros métodos de transformação incluem (1) transformação Agrobacterium rhizogenes-mediada (veja, por exemplo, Lichtenstein e Fuller em: Genetic Engineering, Vol. 6, PWJ Rigby, ed., Londres, Academic Press, 1987;

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Lichtenstein, C. P. e Draper, J,. em: DNA Cloning, Vol. II,

D. M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press, 1985; o WO 88/02405 descreve o uso do gênero A4 de A. rhizogenes e seu plasmídio Ri junto com vetores de A. tumefaciens pARC8 ou pARC16); (2) captação de DNA lipossoma-mediada (veja, por exemplo, Freeman e colaboradores (1984) Cell Plant Physiol. 25: 1353; (3) o método de turbilhonamento (veja, por exemplo, Kindle (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1228.

DNA pode também ser introduzido em plantas através de transferência direta de DNA no pólen conforme descrito por Zhou e colaboradores (1983) Methods in Enzymology 101: 433; D. Hess (1987) Intern Rev. Cytol. 107: 367; e Luo e colaboradores (1988) Plant Mol. Biol. Reporter 6: 165. Expressão de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeo pode ser obtida através de injeção do DNA em órgãos reprodutivos de uma planta conforme descrito por Pena e colaboradores (1987) Nature 325: 274. DNA pode também ser injetado diretamente nas células de embriões imaturos e a reidratação de embriões dessecados conforme descrito por Neuhaus e colaboradores (1987) Theor. Appl. Genet. 75: 30; e Benbrook e colaboradores (1986) em Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., páginas 27-54.

Células hospedeiras de animais e eucariotas menores (por exemplo, levedo) são competentes ou tornadas competentes para transfecção através de vários meios. Existem vários métodos bem conhecidos de introdução de DNA em células de animais. Esses métodos incluem: precipitação com fosfato de cálcio; fusão de células recipientes com protoplastas bacterianos contendo o DNA; tratamento das células recipientes com lipossomas contendo o DNA; DEAE

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226/314 dextrana; eletroporação; biolística; e micro-injeção de DNA diretamente nas células. As células transfectadas são cultivadas através de meios bem conhecidos na técnica. Veja Kuchler, R.J. (1977) Biochemistry Methods in Cell Culture and Virology (Dowden, Hutchinson e Ross, Inc.). Conforme usado aqui, o termo transformação significa alteração do genotipo de uma planta hospedeira através da introdução de uma seqüência de ácido nucleico, por exemplo, uma seqüência de ácido nucleico heteróloga ou estranha. A seqüência de ácido nucleico heteróloga não precisa, necessariamente, se originar de uma fonte diferente, mas, em algum ponto, será externa à célula na qual é introduzida.

Além de Berger, Ausubel e Sambrook, referências úteis gerais para clonagem, cultura e regeneração de células de plantas incluem Jones, ed. (1995) Plant gene transference and expression protocols-- Methods in Molecular Biology, volume 49 (Humana Press, Towata, NJ); Payne e colaboradores (1992) Cell Plant and Tissue Culture in Liquid Systems (John Wiley & Sons, Inc. New York, NY) (Payne); e Gamborg e Phillips, eds. (1995) Cell Plant, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods/ Springer Lab Manual, (Springer-Verlag, Berlin) (Gamborg). Uma variedade de meios de cultura de células é descrita em Atlas e Parks, eds. The Handbook of Microbiologic Media (CRC Press, Boca Raton, FL) (Atlas). Informação adicional para cultura de células de planta é encontrada na literatura comercial disponível, tal como O Catálogo Life Science Research Cell Culture (1998) da Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO) (Sigma-LSRCCC) e, por exemplo, o Catálogo Plant Culture e

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227/314 suplemento (1997) também da Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO) (Sigma-PCCS). Detalhes adicionais com relação à cultura de células de planta são encontrados em Croy, ed. (1993) Plant Molecular Biology (Bios Scientific Publishers, 5 Oxford, Reino Unido).

Em uma modalidade da presente invenção, vetores recombinantes incluindo um ou mais polinucleotídeos de GAT, adequados para a transformação de células de planta são preparados. Uma seqüência de DNA que codifica o 10 polipeptídeo de GAT desejado, por exemplo, selecionado

	dentre SEQ ID	NO: 516,	517,	518,	519,	520,	521,	522,	523,
	524,	525,	526,	527,	528,	529,	530,	531,	532,	533,	534,	535,
	536,	537,	538,	539,	540,	541,	542,	543,	544,	545,	546,	547,
	548,	549,	550,	551,	552,	553,	554,	555,	556,	557,	558,	559,
15	560,	561,	562,	563,	564,	565,	566,	567,	620,	622,	624,	626,
	628,	630,	632,	634,	636,	638,	640,	642,	644,	646,	648,	650,
	652,	654,	656,	658,	660,	662,	664,	666,	668,	670,	672,	674,
	676,	678,	680,	682,	684,	686,	688,	690,	692,	694,	696,	698,
	700,	702,	704,	706,	708,	710,	712,	714,	716,	718,	720,	722,
20	724,	726,	728,	730,	732,	734,	736,	738,	740,	742,	744,	746,
	748,	750,	752,	754,	756,	758,	760,	762,	764,	768,	770,	772,
	774,	776,	778,	780,	782,	784,	786,	788,	790,	792,	794,	796,
	798,	800,	802,	804,	806,	808,	810,	812,	814,	816,	818,	820,
	822,	824,	832,	834,	836,	838,	840,	842,	844,	846,	848,	850,
25	852,	854,	856,	858,	860,	862,	864,	866,	868,	870,	872,	874,
	876,	878,	880,	882,	884,	886,	888,	890,	892,	894,	896,	898,
	900,	902,	904,	906,	908,	910,	912,	914,	916,	918,	920,	922,
	924,	926,	928,	930,	932,	933,	934,	935,	936,	937,	938,	939,
	940,	941,	942	, 943	, 944, 945,	947,	949,	951	e 952, é

convenientemente usada para construir um cassete de

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228/314 expressão recombinante o qual pode ser introduzido na planta desejada. No contexto da presente invenção, um cassete de expressão compreenderá, tipicamente, um polinucleotídeo de GAT selecionado operavelmente ligado a uma seqüência promotora e outras seqüências regulatórias de início de transcrição e tradução as quais são suficientes para direcionar a transcrição da seqüência de GAT nos tecidos pretendidos (por exemplo, planta inteira, folhas, raízes, etc.) da planta transformada.

Uma série de promotores pode ser usada na prática da presente invenção. Os promotores podem ser selecionados baseado nos resultados desejados. Isto é, os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, tecido-preferidos ou outros para expressão em plantas.

Promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor central do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos divulgados no WO 99/43838 e Patente U.S. No. 6.072.050; o promotor central de CaMV 35S (Odell e colaboradores (1985) Nature 313: 810-812); actina de arroz (McElroy e colaboradores (1990) Cell Plant 2: 163-171); ubiquitina (Christensen e colaboradores (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen e colaboradores (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last e colaboradores (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten e colaboradores (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); o promotor ALS (Patente U.S. No. 5.659.026) e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles divulgados nas Patentes U.S. Nos. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463;

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5.608.142; e 6.177.611.

Promotores quimicamente regulados podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor quimicamente induzível, onde a aplicação do produto químico induz à expressão do gene ou um promotor quimicamente reprimível, onde a aplicação do produto químico reprime a expressão do gene. Promotores quimicamente induzíveis são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados, ao promotor In2-2 de milho, o qual é ativado através de agentes de segurança contra herbicida de benzeno sulfonamida; o promotor GST de milho, o qual é ativado por compostos hidrofóbicos eletrofílicos que são usados como herbicidas pré-emergentes; e o promotor PR-1um de tabaco, o qual é ativado pelo ácido salicílico. Outros promotores quimicamente regulados de interesse incluem promotores responsivos a esteróides. Veja, por exemplo, o promotor glicocorticóide-induzível em Schena e colaboradores (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421-10425 e McNellis e colaboradores (1998) Plant J. 14(2): 247-257 e os promotores tetraciclina-induzível e tetraciclinareprimível, por exemplo, GATz e colaboradores (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 e Patentes U.S. Nos. 5.814.618 e

5.789.156, aqui incorporadas por referência.

Promotores tecido-preferidos podem também ser utilizados para objetivar expressão de GAT dentro de um tecido de planta em particular. Promotores tecidopreferidos incluem aqueles divulgados em Yamamoto e colaboradores (1997) Plant J. 12(2) : 255-265; Kawamata e

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230/314 colaboradores (1997) Cell Plant Physiol. 38(7): 792-803; Hansen e colaboradores (1997) Mol. Gen Genet. 254(3): 337343; Russell e colaboradores (1997) Transgenic Res. 6(2) : 157-168; Rinehart e colaboradores (1996) Plant Physiol. 112(3) : 1331-1341; Van Camp e colaboradores (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535; Canevascini e colaboradores (1996) Plant Physiol. 112(2): 513-524; Yamamoto e colaboradores (1994) Cell Plant Physiol. 35(5): 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozco e colaboradores (1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka e colaboradores (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20): 9586-9590; e Guevara-Garcia e colaboradores (1993) Plant J. 4(3) :495-505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca.

Promotores folha-específicos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Yamamoto e colaboradores (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kwon e colaboradores (1994) Plant Physiol. 105: 357-67; Yamamoto e colaboradores (1994) Cell Plant Physiol. 35(5): 773-778; Gotor e colaboradores (1993) Plant J. 3: 509-18; Orozco e colaboradores (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; e Matsuoka e colaboradores (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20): 9586-9590.

Promotores raiz-preferidos são conhecidos e podem ser selecionados a partir de muitos disponíveis da literatura ou isolados de novo de várias espécies compatíveis. Veja, por exemplo, Hire e colaboradores (1992) Plant Mol. Biol. 20(2) : 207-218 (gene de sintetase de glutamina de soja raiz-específico); Keller e colaboradores (1991) Cell Plant 3(10): 1051-1061 (elemento de controle raiz-específico no gene GRP 1.8 de feijão Francês); Sanger e colaboradores

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231/314 (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 433-443 (promotor raizespecífico do gene da sintase de manopina (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); e Miao e colaboradores (1991) Cell Plant 3(1) : 11-22 (clone de cDNA de comprimento total que codifica sintetase de glutamina citosólica (GS), a qual é expressa em raízes e nódulos de raízes de soja) . Veja também Bogusz e colaboradores (1990) Cell Plant 2(7): 633641, o qual divulga dois promotores raiz-específicos isolados de genes de hemoglobina de Parasponia andersonii não leguminácea de fixação de nitrogênio e Trema tomentosa não leguminácea de fixação de nitrogênio relacionada. Os promotores desses genes foram ligados a um gene repórter de β-glucuronidase e introduzidos em Nicotiana tabacum não leguminácea e em Lotus miliculatus leguminácea e, em ambos os casos, a atividade de promotor raiz-específica foi preservada. Leach e colaboradores (1991) descrevem sua análise dos promotores de genes de indução de raiz rolC e rolD altamente expressos de Agrobacterium rhizogenes (veja Plant Science (Limerick) 79(1) : 69-76) . Eles concluíram que determinadas de DNA intensificadores e tecido-específicos são dissociados desses promotores. Teeri e colaboradores (1989) EMBO J. 8(2): 343-350 usaram a fusão genética a lacZ para mostrar que o gene de T-DNA de Agrobacterium que codifica sintase de octopina é especialmente ativo na epiderme da ponta da raiz e que o gene TR2' é raizespecífico na planta inteira e estimulado através de ferimento no tecido da folha, o que é uma combinação especialmente desejável de características para uso com um gene inseticida ou larvicida. O gene TR1', fundido à nptII (fosfotransferase de neomicina II), mostrou características

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232/314 similares. Promotores raiz-preferidos adicionais incluem o promotor do gene VfENOD-GRP3 (Kuster e colaboradores (1995) Plant Mol. Biol. 29(4): 759-772); o promotor ZRP2 (Patente U.S. No. 5.633.636); o promotor IFS1 (Pedido de Patente No. de Série 10/104.706) e o promotor rolB (Capana e colaboradores (1994) Plant Mol. Biol. 25(4) : 681-691) . Veja também Patentes U.S. Nos. 5.837.876; 5.750.386; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732; e 5.023.179.

Promotores sementes-preferidos incluem promotores sementes-específicos (aqueles promotores ativos durante desenvolvimento de sementes, tais como promotores de proteínas de armazenamento em sementes), bem como promotores de sementes-germinação (aqueles promotores ativos durante germinação de sementes). Veja Thompson e colaboradores (1989) BioEssays 10: 108, aqui incorporada por referência. Tais promotores sementes-preferidos incluem, mas não estão limitado, a Cim1 (mensagem citoquinina-induzida); cZ19B1 (zeina de 19 kDa de milho); milps (sintase de mio-inositol-1-fosfato); e celA (sintase de celulose) (veja Patente U.S. No. 6.225.529, aqui incorporada por referência). Gama-zeína é um promotor endosperma-específico. Glob-1 é um promotor embriãoespecífico. Para dicots, promotores semente-específicos incluem, mas não estão limitados, a β-faseolina de feijão, napina, β-conglicinina, lecitina de soja, cruciferina e semelhantes. Para monocots, promotores semente-específicos

incluem,	mas	não estão	limitados, a	zeina	de 15 kDa	de
milho, zeína	de 22 kDa,	zeína de 27	kDa,	g-zeína, cera,
shrunken	1,	shrunken 2,	globulina 1,	etc.	Veja também	WO

00/12733, o qual divulga promotores semente-preferidos de

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233/314 genes endl e end2; aqui incorporados por referência.

Em particular, um promotor de planta forte ou fracamente constitutivo que direciona a expressão de um ácido nucleico de GAT em todos os tecidos de uma planta pode ser favoravelmente empregado. Tais promotores são ativos sob a maioria das condições ambientais e estados de desenvolvimento ou diferenciação celular. Além dos promotores mencionados acima, exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor 1'- ou 2'- de Agrobacterium tumefaciens e outras regiões de início de transcrição de vários genes de planta conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Onde super expressão de um polipeptídeo de GAT da invenção é prejudicial para a planta, aqueles habilitados reconhecerão que promotores constitutivos fracos podem ser usados para baixos níveis de expressão. Geralmente, por promotor fraco entenda-se um promotor que aciona a expressão de uma seqüência de codificação em um baixo nível. Por “baixo nível” entenda-se níveis de cerca de 1/1000 transcritos a cerca de 1/100.000 transcritos, a cerca de tão baixo quanto 1/500.000 transcritos por célula. Alternativamente, é reconhecido que promotores fracos também incluem promotores que são expressos apenas em poucas células e não em outras para proporcionar um baixo nível total de expressão. Onde um promotor é expresso em níveis inaceitavelmente altos, partes da seqüência do podem ser deletadas ou modificadas para diminuir os níveis de expressão. Naqueles casos onde altos níveis de expressão não são prejudiciais para a planta, um promotor forte, por exemplo, um promotor pol III ou outro de t-RNA ou um promotor forte pol II, (por

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234/314 exemplo, o promotor do vírus mosaico da couve-flor, promotor CaMV 35S) pode ser usado.

Alternativamente, um promotor de planta pode estar sob controle ambiental. Tais promotores são referidos como promotores induzíveis. Exemplos de condições ambientais que podem alterar a transcrição através de promotores induzíveis incluem ataque por agente patogênico, condições anaeróbicas ou a presença de neve. Em alguns casos, é desejável usar promotores que são tecido-específicos e/ou estão sob controle de desenvolvimento, de modo que o polinucleotídeo de GAT é expresso apenas em determinados tecidos ou estágios de desenvolvimento, por exemplo, folhas, raízes, brotos, etc. Promotores endógenos de genes relacionados à tolerância a um herbicida e fenótipos relacionados são particularmente úteis para acionar a expressão de ácidos nucleicos de GAT, por exemplo, monooxigenases P450, glutationa-S-transferases, homoglutationa-S-transferases, oxidases de glifosato e sintases de 5-enolpiruvilshikimato-2-fosfato.

Promotores tecido-específicos podem também ser usados para dirigir a expressão de genes estruturais heterólogos, incluindo os polinucleotídeos de GAT descritos aqui. Assim, os promotores podem ser usados em cassetes de expressão recombinantes para acionar a expressão de qualquer gene cuja expressão é desejável nas plantas transgênicas da invenção, por exemplo, GAT e/ou outros genes que conferem resistência ou tolerância a um herbicida, genes os quais influenciam outras características úteis, por exemplo, heterose. Similarmente, elementos intensificadores, por exemplo, derivados das seqüências regulatórias 5' ou

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235/314 íntrons de um gene heterólogo, podem também ser usados para melhorar a expressão de um gene estrutural heterólogo, tal como um polinucleotídeo de GAT.

Em geral, o promotor usado em particular no cassete de expressão em plantas depende da aplicação pretendida. Qualquer um de uma série de promotores os quais dirigem a transcrição em células de planta pode ser adequado. O promotor pode ser constitutivo ou induzível. Além dos promotores observados acima, promotores de origem bacteriana os quais operam em plantas incluem o promotor de sintase de octopina, o promotor de sintase de nopalina e outros promotores derivados de plasmídios Ti. Veja, Herrera-Estrella e colaboradores (1983) Nature 303: 209. Promotores virais incluem os promotores 35S e 19S RNA de CaMV. Veja Odell e colaboradores (1985) Nature 313: 810. Outros promotores de planta incluem o promotor da pequena subunidade de carboxilase de ribulose-1,3-bisfosfato e o promotor de faseolina. A seqüência promotora do gene E8 (veja Deikman e Fischer (1988) EMBO J 7: 3315) e outros genes são também favoravelmente usados. Promotores específicos para espécies monocotiledôneas são também considerados (McElroy e Brettell (1994) “Foreign gene expression in transgenic cereals” Trends Biotech. 12: 6268). Alternativamente, novos promotores com características úteis podem ser identificados a partir de qualquer fonte viral, bacteriana ou de planta através de métodos, incluindo análise de seqüência, contenção de intensificador ou promoter e semelhantes, conhecidos na técnica.

No preparo dos vetores de expressão da invenção, outras seqüências que não o promotor e o gene que codifica

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236/314 a GAT são também favoravelmente usados. Se expressão apropriada de polipeptídeo é desejada, uma região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes de planta ou de T-DNA. Peptídeos sinalizadores/de localização os quais, por exemplo, facilitam a translocação do polipeptídeo expresso para inserir organelas (por exemplo, cloroplastos) ou secreção extracelular, podem também ser empregados.

O vetor compreendendo o polinucleotídeo de GAT também pode incluir um gene marcador o qual confere um fenotipo selecionável sobre células de planta. Por exemplo, o marcador pode codificar tolerância a um biocida, particularmente tolerância a antibióticos, tal como tolerância à canamicina, G418, bleomicina, higromicina ou tolerância a um herbicida, tal como tolerância a chlorosulfuron ou fosfinotricina. Genes repórteres, os quais são usados para monitorar a expressão de gene e localização de proteína via produtos de reação passíveis de visualização (por exemplo, beta-glucuronidase, betagalactosidase e acetiltransferase de cloranfenicol) ou através de visualização direta do produto genético em si (por exemplo, proteína verde fluorescente, GFP; Sheen e colaboradores (1995) The Plant Journal 8: 777) pode ser usado, por exemplo, para monitoramento de expressão transitória de gene em células de planta. Sistemas de expressão transitória podem ser empregados em células de planta, por exemplo, em seleção de culturas de células de planta com relação à atividades de tolerância a um herbicida.

Transformação de Plantas:

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Protoplastas:

Numerosos protocolos para estabelecimento de protoplastas transformáveis a partir de uma variedade de tipos de plantas e subseqüente transformação dos protoplastas cultivados estão disponíveis na técnica e são incorporados aqui por referência. Por exemplo, veja Hashimoto e colaboradores (1990) Plant Physiol. 93: 857; Fowke e Constabel, eds. (1994) Plant Protoplasts; Saunders e colaboradores (1993) Aplications of Plant In vitro Technology Symposium, UPM 16-18; e Lyznik e colaboradores (1991) BioTechniques 10: 295, cada um dos quais é incorporado aqui por referência.

Cloroplastos:

Cloroplastos são um sítio de ação de algumas atividades de tolerância a um herbicida e, em alguns casos, o polinucleotídeo de GAT é fundido a uma seqüência de peptídeo de trânsito de cloroplasto para facilitar a translocação dos produtos genéticos em cloroplastos. Nesses casos, pode ser vantajoso transformar o polinucleotídeo de GAT em cloroplastos de células de plantas hospedeiras. Numerosos métodos estão disponíveis na técnica para realizar transformação e expressão de cloroplasto (por exemplo, Daniell e colaboradores (1998) Nature Biotech. 16: 346; O'Neill e colaboradores (1993) The Plant Journal 3: 729; e Maliga (1993) TIBTECH 11:1) . O construto de expressão compreende um seqüência regulatória de transcrição funcional em plantas operavelmente ligada a um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de GAT. Cassetes de expressão que são projetados para funcionar em cloroplastos (tal como um cassete de expressão incluindo um

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238/314 polinucleotídeo de GAT) incluem uma seqüência necessária para assegurar expressão em cloroplastos. Tipicamente, a seqüência de codificação é flanqueada por duas regiões de homologia ao genoma cloroplastóide para obter recombinação homóloga com o genoma do cloroplasto; freqüentemente, um gene marcador selecionável também está presente dentro as seqüências de DNA que flanqueiam o plastídio para facilitar a seleção de cloroplastos geneticamente transformados estáveis nas células de planta transplastônicas resultantes (veja, por exemplo, Maliga (1993) e Daniell (1998) supra e referências citadas no mesmo).

Métodos Gerais de Transformação:

Os construtos de DNA da invenção podem ser introduzida no genoma do hospedeiro vegetal desejado através de uma variedade de técnicas convencionais. Técnicas para a transformação de uma ampla variedade de espécies de plantas superiores são bem conhecidas e descritas na literatura técnica e científica. Veja, por exemplo, Payne, Gamborg, Croy, Jones, etc., todos supra, bem como, por exemplo, Weising e colaboradores (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421 e Patentes U.S. Nos. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 e 5.316.931, aqui incorporadas por referência.

Uma variedade de outros protocolos de transformação são considerados na presente invenção. Protocolos de transformação, bem como protocolos para a introdução de seqüências de nucleotídeos em plantas podem variar, dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocot ou dicot, objetivada para transformação. Métodos adequados de introdução de seqüências de nucleotídeos em células de planta e subseqüente inserção no genoma da

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239/314 planta incluem microinjeção (Crossway e colaboradores (1986) Biotechniques 4: 320-334), eletroporação (Riggs e colaboradores (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 56025606), transformação Agrobacterium-mediada (Patentes U.S. Nos. 5.563.055 e 5.981.840), transferência direta de gene (Paszkowski e colaboradores (1984) EMBO J. 3: 2717-2722) e aceleração de partículas por balística (veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.945.050; Patente U.S. No. 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes e colaboradores (1995) Direct DNA Transference into Intact Cells Plant via Microprojectile Bombardment em Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Eds., Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe e colaboradores (1988) Biotechnology 6: 923-926); e transformação com Lec1 (WO 00/28058). Veja também, Weissinger e colaboradores (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford e colaboradores (1987) Particulate Science e Technology 5: 27-37 (cebola); Christou e colaboradores (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (soja); McCabe e colaboradores (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (soja); Finer e McMullen (1991) In vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh e colaboradores (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (soja); Datta e colaboradores (1990) Biotechnology 8: 736740 (arroz); Klein e colaboradores (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (milho); Klein e colaboradores (1988) Biotechnology 6: 559-563 (milho); Patentes U.S. Nos. 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646; Klein e colaboradores (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (maize); Fromm e colaboradores (1990) Biotechnology 8: 833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren e colaboradores (1984) Nature

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240/314 (Londres) 311: 763-764; Patente U.S. No. 5.736.369 (cereais); Bytebier e colaboradores (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (Liliaceae); De Wet e colaboradores (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Eds., Chapman e colaboradores (Longman, New York), páginas 197-209 (pólen); Kaeppler e colaboradores (1990) Cell Plant Reports 9: 415-418 e Kaeppler e colaboradores (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (transformação whisker-mediada); D'Halluin e colaboradores (1992) Cell Plant 4: 1495-1505 (eletroporação); Li e colaboradores (1993) Cell Planta Reports 12: 250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda e colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (milho via Agrobacterium tumefaciens); todos os quais são aqui incorporados por referência.

Por exemplo, DNAs podem ser introduzidos diretamente no DNA genômico de uma célula de planta usando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastas de células de plantas ou os construtos de DNA podem ser introduzidas diretamente no tecido de planta usando métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas de DNA. Alternativamente, os construtos de DNA podem ser combinadas com regiões de flanqueamento de T-DNA adequadas e introduzidas em um vetor hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens convencional. A virulência funcional do hospedeiro Agrobacterium direcionará a inserção do construto e marcador adjacente no DNA da célula de planta quando a célula de planta é infectada pelas bactérias.

Métodos de microinjeção são conhecidos na técnica e bem descritos na literatura de patente e científica. A

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241/314 introdução de construtos de DNA usando precipitação com polietileno glicol é descrita em Paszkowski e colaboradores (1984) EMBO J 3: 2717. Técnicas de eletroporação são descritas em Fromm e colaboradores (1985) Proc Nat'l Acad Sci USA 82: 5824. Técnicas de transformação balística são descritas em Klein e colaboradores (1987) Nature 327: 70; e Semanas e colaboradores Plant Physiol 102: 1077.

Em algumas modalidades, técnicas de transformação Agrobacterium-mediadas são usadas para transferir seqüências de GAT da invenção para plantas transgênicas. Transformação Agrobacterium-mediada é amplamente usada para a transformação de dicots, contudo, determinadas monocots podem também ser transformadas por Agrobacterium. Por exemplo, a transformação de arroz com Agrobacterium é descrita por Hiei e colaboradores (1994) Plant J. 6: 271; Patente US No. 5.187.073; Patente US No. 5.591.616; Li e colaboradores (1991) Science in China 34: 54; e Raineri e colaboradores (1990) Bio/Technology 8: 33. Milho, cevada, triticale e aspargos transformados através de transformação Agrobacterium-mediada foram também descritos (Xu e colaboradores (1990) Chinese J Bot 2: 81) .

Técnicas de transformação Agrobacterium-mediadas tiram vantagem da capacidade do plasmídio de tumor-indução (Ti) de A. tumefaciens de se integrar no genoma de uma célula de planta, para co-transferir um ácido nucleico de interesse para uma célula de planta. Tipicamente, um vetor de expressão é produzido em que o ácido nucleico de interesse, tal como um polinucleotídeo de GAT da invenção, é ligado a um plasmídio de replicação autônoma o qual também contém seqüências de T-DNA. Seqüências de T-DNA flanqueiam,

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242/314 tipicamente, o cassete de expressão de ácido nucleico de interesse e compreendem as seqüências de integração do plasmídio. Além do cassete de expressão, T-DNA também inclui, tipicamente, uma seqüência marcadora, por exemplo, genes de resistência a antibióticos. O plasmídio com o TDNA e o cassete de expressão é, então, transfectado em células de Agrobacterium. Tipicamente, para transformação eficaz de células de planta, a bactéria A. tumefaciens também possui as regiões vir necessárias sobre um plasmídio ou integradas em seus cromossomas. Para uma discussão de transformação Agrobacterium-mediada, veja Firoozabady e Kuehnle, (1995) em Plant tissue cell and Organ Culture Fundamental Methods, eds. Gamborg e Phillips.

Em determinadas modalidades, os polinucleotídeos da presente invenção pode ser empilhados com qualquer combinação de seqüências de polinucleotídeo de interesse de forma a criar plantas com um fenotipo desejado. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser empilhados com quaisquer outros polinucleotídeos que codificam polipeptídeos tendo atividade pesticida e/ou inseticida, tais como proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (descrita nas Patentes U.S. Nos. 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser e colaboradores (1986) Gene 48: 109), lecitinas (Van Damme e colaboradores (1994) Plant Mol. Biol. 24: 825, pentina (descrita na Patente U.S. No. 5.981.722) e semelhantes. As combinações geradas podem também incluir cópias múltiplas de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse. Os polinucleotídeos da presente invenção podem também ser empilhados com qualquer outro gene ou combinação de genes

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243/314 para produzir plantas com uma variedade de características combinadas desejadas incluindo, mas não limitado a, características desejáveis para alimentação de animais, tais como genes de elevado teor de óleo (por exemplo, Patente U.S. No. 6.232.529); aminoácidos equilibrados (por exemplo, hordotioninas (Patentes U.S. Nos. 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802; e 5.703.409); cevada com elevado teor de lisina (Williamson e colaboradores (1987) Eur. J. Biochem. 165: 99-106; e WO 98/20122) e proteínas com elevado teor de metionina (Pedersen e colaboradores (1986) J. Biol. Chem. 261: 6279; Kirihara e colaboradores (1988) Gene 71: 359; e Musumura e colaboradores (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123)); digestabilidade aumentada (por exemplo, proteínas de armazenamento modificadas (Pedido U.S. No. de Série 10/053.410, depositado em 7 de Novembro de 2001); e tioredoxinas (Pedido U.S. No. de Série 10/005.429, depositado em 3 de Dezembro de 2001)); as divulgações dos quais são aqui incorporadas por referência.

Os polinucleotídeos da presente invenção pode também ser empilhados com características desejáveis para resistência à doença ou um herbicida (por exemplo, genes de destoxificação de fumonisina (Patente U.S. No. 5.792.931); genes de resistência à doença e virulência (Jones e colaboradores (1994) Science 266: 789; Martin e colaboradores (1993) Science 262: 1432; Mindrinos e colaboradores (1994) Cell 78: 1089); mutantes de sintase de acetolactato (ALS) que levam à resistência a herbicida, tais como as mutações S4 e/ou Hra; inibidor des de glutamina sintase, tal como fosfinotricina ou basta (por exemplo, gene bar); e resistência ao glifosato (gene

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EPSPS)); e características desejáveis para processamento ou produtos de processo, tal como elevado teor de óleo (por exemplo, Patente U.S. No. 6.232.529 ); óleos modificados (por exemplo, genes de desaturase de ácido graxo (Patente U.S. No. 5.952.544; WO 94/11516)); amidos modificados (por exemplo, ADPG pirofosforilases (AGPase) , sintases de amido (SS), enzimas de ramificação de amido (SBE) e enzimas de desramificação de amido (SDBE)); e polímeros ou bioplásticos (por exemplo, Patente U.S. No. 5.602.321; beta-cetotiolase, sintase de polihidróxibutirato e reductase de acetoacetil-CoA (Schubert e colaboradores (1988) J. Bacteriol. 170: 5837-5847) facilitam a expressão de polihidróxialcanoatos (PHAs)); as divulgações dos quais são aqui incorporadas por referência. Também se poderia combinar os polinucleotídeos da presente invenção com polinucleotídeos que proporcionam características agronômicas, tais como esterilidade masculina (por exemplo, veja Patente U.S. No. 5.583.210), resistência a epidemias, tempo de floração ou características de tecnologia de transformação, tais como regulação do ciclo celular ou objetivação de gene (por exemplo, WO 99/61619, WO 00/17364 e WO 99/25821); as divulgações dos quais são aqui incorporadas por referência.

Essas combinações empilhadas podem ser criadas através de qualquer método incluindo, mas não limitado a, cruzamento de plantas através de qualquer metodologia convencional TopCross ou transformação genética. Se as características são empilhadas através de transformação genetica das plantas, a seqüência de polinucleotídeo de interesse pode ser combinada em qualquer momento e em

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245/314 qualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênica compreendendo uma ou mais características desejadas pode ser usada como o alvo para introduzir outras características através de transformação subseqüente. As características podem ser introduzidas simultaneamente em um protocolo de co-transformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos através de qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exemplo, se duas seqüências têm de ser introduzidas, as duas seqüências podem estar contidas em cassetes de transformação distintos (trans) ou contidas dentro do mesmo cassete de transformação (cis). A expressão de uma seqüência pode ser acionada pelo mesmo promoter ou por promotores diferentes. Em determinados casos, pode ser desejavel introduzir um cassete de transformação que suprima a expressão do polinucleotídeo de interesse. Esse pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação desejada de características na planta. É ainda reconhecido que a seqüência de polinucleotídeos pode ser empilhada em um local genômico desejado usando um sistema de recombinação sítio-específico. Veja, por exemplo, WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, todos os quais são aqui incorporados por referência.

Regeneração de Plantas Transgênicas:

Células de planta transformadas as quais são derivadas através de técnicas de transformação de plantas, incluindo aquelas discutidas acima, pode ser cultivadas para regenerar uma planta inteira a qual possui o genotipo transformado (isto é, um polinucleotídeo de GAT) e, assim,

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246/314 o fenotipo desejado, tal como resistência adquirida (isto é, tolerância) ao glifosato ou um análogo de glifosato. Tais técnicas de regeneração contam com manipulação de determinados fitohormônios em um meio de crescimento de cultura tecidual, tipicamente contando com um marcador biocida e/ou herbicida o qual foi introduzido junto com as seqüências de nucleotídeo desejadas. Para transformação e regeneração de milho veja Gordon-Kamm e colaboradores, The Cell plant, 2: 603-618 (1990). Alternativamente, seleção por resistência ao glifosato conferida pelo polinucleotídeo de GAT da invenção pode ser realizada. A regeneração de plantas a partir de protoplastas cultivados é descrita em Evans e colaboradores (1983) Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Cell Plant Culture, páginas 124-176, Macmillan Publishing Company, New York; e LiGATion (1985) Regeneration of Plants, Plant Protoplasts páginas 21-73, CRC Press, Boca Raton. Regeneração pode também ser obtida a partir do caule de uma planta, órgãos de explante ou partes dos mesmos. Tais técnicas de regeneração são descritas, de modo geral, em Klee e colaboradores (1987) Ann Rev of Plant Phys 38: 467. Veja também, por exemplo, Payne e Gamborg.

Células de planta transformadas, caule ou explantes podem ser cultivados sobre meio de regeneração no escuro durante várias semanas, geralmente cerca de 1 a 3 semanas para permitir que embriões somáticos maturem. Meios de regeneração preferidos incluem meios contendo sais de MS. As células de planta, caule ou explante são, então, tipicamente, cultivadas sobre meio de enraizamento em um ciclo de claro/escuro até que brotos e raízes se

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247/314 desenvolvam. Métodos para a regeneração de plantas são conhecidos na técnica e métodos preferidos são proporcionados por Kamo e colaboradores, (Bot. Gaz. 146(3): 324-334, 1985); West e colaboradores, (The Cell plant 5: 1361-1369, 1993); e Duncan e colaboradores (Plant 165: 322332, 1985).

Pequenas mudas podem, então, ser transferidas para tubos contendo meio de enraizamento e deixadas crescer e desenvolver mais raízes durante aproximadamente uma semana. As plantas podem, então, ser transplantadas para uma mistura de solo em vasos na estufa.

A regeneração de plantas contendo o gene estranho introduzido através de Agrobacterium pode ser obtida conforme descrito por Horsch e colaboradores, Science, 227: 1229-1231 (1985) e Fraley e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 4803 (1983). Esse procedimento produz, tipicamente, brotos dentro de duas a quatro semanas e esses brotos transformantes são, então, transferidos para um meio de indução de raiz apropriado contendo o agente seletivo e um antibiótico para prevenir crescimento bacteriano. As plantas transgênicas da presente invenção podem ser férteis ou estéreis.

Regeneração pode também ser obtida a partir do caule de uma planta, órgãos de explantes ou partes dos mesmos. Tais técnicas de regeneração são descritas, de modo geral, em Klee e colaboradores, Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467486 (1987). A regeneração de plantas a partir de protoplastas de uma única planta ou vários explantes é bem conhecida na técnica. Veja, por exemplo, Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach e H. Weissbach, eds.,

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Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988). Para cultura e regeneração de células de milho veja, de modo geral, The Maize Handbook, Freeling e Walbot, eds., Springer, New York (1994); Maize and Maize Improvement, 3^aEd., Sprague e Dudley eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988).

Após transformação com Agrobacterium, os explantes são, tipicamente, transferidos para meio de seleção. aqueles habilitados na técnica reconhecerão que o meio de seleção depende do marcador selecionável que foi cotransfectado com os explantes. Após um período de tempo adequado, transformantes começam a formar brotos. Após os brotos terem cerca de 1-2 cm de comprimento, os brotos deverão ser transferidos para um meio de raiz e broto adequado. A pressão de seleção deverá ser mantida no meio de raiz e broto.

Tipicamente, os transformantes desenvolverão raízes em cerca de 1-2 semanas e formarão mudas. Após as mudas terem cerca de 3-5 cm de altura, elas são colocadas em solo estéril em vasos de fibra. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que diferentes procedimentos de aclimatação são usados para se obter plantas transformadas de diferentes espécies. Por exemplo, após desenvolvimento de uma raiz e brotos, cortes, bem como embriões somáticos das plantas transformadas são transferidos para meio para estabelecimento de mudas. Para uma descrição de seleção e regeneração de plantas transformadas veja, por exemplo, Dodds e Roberts (1995) Experiments in tissue plant culture, 3^a Ed., Cambridge Universidade Press.

Existem também métodos para transformação de

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Arabidopsis por Agrobacterium usando infiltração a vácuo (Bechtold N., Ellis J. e Pelletier G., 1993, em Plant Agrobacterium mediated gene transference by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plant. CR Acad Sci Paris Life Sci 316: 1194-1199) e imersão simples de plantas em floração (Desfeux, C., Clough S.J. e Bent A.F., 2000, Female reproductive tissue are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method. Plant Physiol. 123: 895-904). Usando esses métodos, sementes transgênicas são produzidas sem a necessidade de cultura tecidual.

Existem variedades de plantas para as quais protocolos eficazes de transformação Agrobacterium-mediada ainda têm de ser desenvolvidos. Por exemplo, transformação de tecido com sucesso associada à regeneração do tecido transformado para produzir uma planta transgênica não foi reportada para alguns dos cultivares de algodão mais comercialmente relevantes. Contudo, uma abordagem que pode ser usada com essas plantas envolve introdução estável do polinucleotídeo em uma variedade de planta relacionada via transformação Agrobacterium-medidas, confirmando a operatividade e, então, transferindo o transgene para o gênero comercial desejado usando cruzamento sexual padrão ou técnicas de recruzamento. Por exemplo, no caso de algodão, Agrobacterium pode ser usada para transformar uma linhagem de Coker de Gossypium hirustum (por exemplo, linhagens de Coker 310, 312, 5110 Deltapine 61 ou Stoneville 213) e, então, o transgene pode ser introduzido em outro cultivar de G. hirustum mais comercialmente relevante através de recruzamento.

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As plantas transgênicas da presente invenção podem ser caracterizadas genotípica ou fenotipicamente para determinar a presença do polinucleotídeo de GAT da invenção. Análise genotípica pode ser realizada através de qualquer uma de uma série de técnicas bem conhecidas, incluindo amplificação por PCR de DNA genômico e hibridização de DNA genômico com sondas rotuladas específicas. Análise fenotípica inclui, por exemplo, sobrevivência de plantas ou tecido de plantas expostos a um herbicida selecionado, tal como glifosato.

Aqueles habilitados reconhecerão que, após o cassete de expressão contendo o gene de GAT ser estavelmente incorporado em plantas transgênicas e se confirmar ser operável, ele pode ser introduzido em outras plantas através de cruzamento sexual. Qualquer uma de uma série de técnicas padrões de reprodução pode ser usada, dependendo da espécie a ser cruzada.

Em safras vegetativamente propagadas, plantas transgênicas maduras podem ser propagadas tomando-se cortes ou através de técnicas de cultura tecidual para produzir múltiplas plantas idênticas. Seleção de transgênicos desejáveis é feita e novas variedades são obtidas e propagadas vegetativamente para uso comercial. Em safras propagadas a partir de sementes, plantas transgênicas maduras podem ser auto-cruzadas para produzir uma planta endógama homozigótica. A planta endógama produz sementes contendo o ácido nucleico heterólogo recentemente introduzido. Essas sementes pode ser desenvolvidas para produzir plantas que produzirão o fenotipo selecionado.

Partes obtidas a partir da planta regenerada, tais

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251/314 como flores, sementes, folhas, ramos, frutos e semelhantes são incluídos na invenção, contanto que essas partes compreendam células compreendendo o ácido nucleico isolado de GAT. Prole e variantes e mutantes das plantas regeneradas são também incluídos dentro do escopo da invenção, contanto que essas partes compreendam as seqüências de ácido nucleico introduzidas.

Plantas transgênicas expressando um marcador selecionável podem ser selecionadas para transmissão do ácido nucleico de GAT, por exemplo, através de imunocoloração padrão e técnicas de detecção de DNA. Linhagens transgênicas são também tipicamente avaliadas com relação aos níveis de expressão do ácido nucleico heterólogo. O nível de expressão de RNA pode ser determinado inicialmente para identificar e quantificar plantas com expressão positiva. Técnicas padrões para análise de RNA podem ser empregadas e incluem ensaios de amplificação por PCR usando primers de oligonucleotídeo projetados para amplificar apenas os modelos de RNA heterólogos e ensaios em solução de hibridização usando sondas ácido nucleico-específicas heterólogas. As plantas RNA-positivas podem, então, ser analisadas com relação à expressão de proteína através de análise por imunoblot de Western usando os anticorpos especificamente reativos da presente invenção. Além disso, hibridização in situ e imunocitoquímica de acordo com protocolos padrões podem ser feitas usando sondas de polinucleotídeo heterólogas ácido nucleico-específicas e anticorpos, respectivamente, para localizar sítios de expressão dentro do tecido transgênico. Geralmente, uma série de linhagens transgênicas são

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252/314 usualmente selecionadas para o ácido nucleico incorporado para identificar e selecionar plantas com os perfis de expressão mais apropriados.

A modalidade preferida é uma planta transgênica que é homozigótica para o ácido nucleico heterólogo adicionado; isto é, a planta transgênica que contém duas seqüências de ácido nucleico adicionadas, um gene no mesmo local sobre cada cromossoma de um par de cromossomas. Uma planta transgênica homozigótica pode ser obtida através de procriação sexual (auto) de uma planta transgênica heterozigótica que contém um único heterólogo ácido nucleico heterólogo adicionado, germinação de algumas das sementes produzidas e análise das plantas produzidas resultante no que se refere à divisão celular alterada com relação a uma planta de controle (isto é, nativa, nãotransgênica). Cruzamento a uma planta original e cruzamento externo com uma planta não-transgênica são também considerados.

Essencialmente qualquer planta pode ser transformada com os polinucleotídeos de GAT da invenção. Plantas adequadas para a transformação e expressão dos novos polinucleotídeos de GAT da presente invenção incluem espécies agronômica e horticulturalmente importantes. Tais espécies incluem, mas não estão limitadas, a membros das famílias: Graminae (incluindo milho, centeio, triticale, cevada, painço, arroz, trigo, aveia, etc.); Leguminosae (incluindo ervilha, feijão, lentilha, amendoim, inhame, feijão-de-corda, feijão-veludo, soja, trevo, alfafa, tremoço, ervilhaca, lótus, trevo doce, wisteria e ervilhade-cheiro); Compositae (a grande família de plantas

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253/314 vasculares, incluindo pelo menos 1.000 gêneros, incluindo safras comerciais importantes, tal como girassol); e Rosaciae (incluindo framboesa, abricó, amêndoa, pêra, rosa, etc.); bem como nozes (incluindo, noz, pecã, avelã, etc.); e árvores de floresta (incluindo Pinus, Quercus, Pseutotsuga, Sequoia, Populus, etc.).

Alvos adicionais para modificação através dos polinucleotídeos de GAT da invenção, bem como aqueles especificados acima, incluem plantas dos gêneros: Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena (por exemplo, aveia), Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Curcubita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Gossypium, Glycine, Helianassim, Heterocallis, Hevea, Hordeum (por exemplo, cevada), Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis ouyza (por exemplo, arroz), Panicum, Pelargonium, Pennisetum (por exemplo, painço), Petunia, Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rubus, Saccharum, Salpiglossis, Secale (por exemplo, centeio), Senecio, Setaria, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Triticum (por exemplo, trigo), Vicia, Vigna, Vitis, Zea (por exemplo, milho) e as Olyreae, as Pharoideae e muitas outras. Conforme observado, plantas na família Graminae são plantas alvo particularmente desejáveis para os métodos da invenção.

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Planta de safras comuns as quais são alvos da presente invenção incluem plantas de milho, arroz, triticale, centeio, algodão, soja, sorgo, trigo, aveia, cevada, painço, girassol, canola, ervilha, feijão, lentilha, amendoim, inhame, feijão-de-corda, feijão-veludo, trevo, alfafa, tremoço, ervilhaca, lótus, trevo doce, wisteria, ervilha-de-cheiro e nozes (por exemplo, noz, noz-pecã, etc) .

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para a produção de uma safra através de desenvolvimento da planta de safra que é tolerante ao glifosato como um resultado de ser transformada com um gene que codifica uma Nacetiltransferase de glifosato, sob condições de modo que a planta de safra produza uma safra e colheita da safra. De preferência, o glifosato é aplicado à planta ou nas proximidades da planta, em uma concentração eficaz para controlar ervas daninhas sem impedir desenvolvimento da planta transgênica de safra e produzindo uma safra. A aplicação de glifosato pode ser antes de plantio ou a qualquer momento após o plantio até e incluindo o momento de colheita. O glifosato pode ser aplicado uma ou múltiplas vezes. O momento de aplicação de glifosato, a quantidade aplicada, o modo de aplicação e outros parâmetros variarão baseado na natureza específica da planta de safra e do ambiente de desenvolvimento e podem ser prontamente determinados por aqueles habilitados na técnica. A invenção ainda proporciona uma safra produzida por meio desse método.

A invenção proporciona a propagação de uma planta contendo um transgene de polinucleotídeo de GAT. A planta

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255/314 pode ser, por exemplo, uma monocot ou uma dicot. Em um aspecto, a propagação está vinculada ao cruzamento de uma planta contendo um transgene de polinucleotídeo de GAT com uma segunda planta, de modo que pelo menos algumas das proles do cruzamento mostrem tolerância ao glifosato.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para o controle seletivo de ervas daninhas em um campo onde a safra está sendo desenvolvida. O método envolve plantio de sementes ou plantas de safra que são tolerantes ao glifosato como um resultado de serem transformadas com um gene que codifica uma GAT, por exemplo, um polinucleotídeo de GAT e aplicação, à safra e quaisquer ervas daninhas, de uma quantidade suficiente de glifosato para controlar as ervas daninhas sem um impacto adverso significativo sobre a safra. É importante observar que não é necessário que a safra seja totalmente insensível ao herbicida, na medida em que o benefício derivado da inibição de ervas daninhas supere qualquer impacto neGATivo do glifosato ou análogo de glifosato sobre a safra ou planta de safra.

Em outro aspecto, a invenção proporciona o uso de um polinucleotídeo de GAT como um gene marcador selecionável. Nessa modalidade da invenção, a presença do polinucleotídeo de GAT em uma célula ou organismo confere à célula ou organismo a característica fenotípica detectável de resistência ao glifosato, desse modo, permitindo selecionar células ou organismos que foram transformados com um gene de interesse ligado ao polinucleotídeo de GAT. Assim, por exemplo, o polinucleotídeo de GAT pode ser introduzido em um construto de ácido nucleico, por exemplo, um vetor, desse modo, permitindo a identificação de um hospedeiro

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256/314 (por exemplo, uma célula ou planta transgênica) contendo o construto de ácido nucleico através de desenvolvimento do hospedeiro na presença de glifosato e seleção com relação à capacidade de sobreviver e/ou se desenvolver em uma taxa que é discernivelmente maior do que a sobrevivência ou desenvolvimento de um hospedeiro carecendo do construto de ácido nucleico. Um polinucleotídeo de GAT pode ser usado como um marcador selecionável em uma ampla variedade of hospedeiros que são sensíveis ao glifosato, incluindo plantas, a maioria das bactérias (incluindo E. coli), actinomicetes, levedos, algas e fungos. Um benefício do uso de resistência a herbicida como um marcador em plantas, em oposição à resistência a antibióticos convencional, é que isso elimina a preocupação de algumas pessoas de que a resistência a antibióticos possa escapar para o ambiente. Alguns dados experimentais de experimentos demonstrando o uso de um polinucleotídeo de GAT como um marcador selecionável em diversos sistemas hospedeiros são descritos na seção Exemplos da presente especificação.

Seleção de Polinucleotídeos de GAT que Conferem: Resistência Intensificada ao Glifosato em Plantas Transgênicas:

Bibliotecas ácidos nucleicos diversificados que codificam GATs de acordo com os métodos descritos aqui podem ser selecionadas com relação à capacidade de conferir resistência ao glifosato em plantas transgênicas. Após um ou mais ciclos de diversificação e seleção, os genes de GAT modificados podem ser usados como um marcador de seleção para facilitar a produção e avaliação de plantas transgênicas e como um meio de conferir resistência a

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257/314 herbicida em plantas experimentais ou agrícolas. Por exemplo, após diversificação de qualquer uma ou mais de, por exemplo, SEQ ID NO:1 - 5 para produzir uma biblioteca de polinucleotídeos diversificados de GAT, uma avaliação funcional inicial pode ser realizada através de expressão da biblioteca de GAT que codifica seqüências em E. coli. Os polipeptídeos de GAT expressos podem ser purificados ou parcialmente purificados, conforme descrito acima, e selecionados com relação à cinética aperfeiçoada através de espectrometria de massa. Após um ou mais ciclos preliminares de diversificação e seleção, os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de GAT aperfeiçoados são clonados em um vetor de expressão em plantas operavelmente ligado, por exemplo, a um promotor constitutivo forte, tal como o promotor CaMV 35S. Os vetores de expressão compreendendo os ácidos nucleicos de GAT modificados são transformados, tipicamente através de transformação Agrobacterium-mediada, em plantas hospedeiras Arabidopsis thaliana. Por exemplo, hospedeiros Arabidopsis são prontamente transformados através de imersão de inflorescências em soluções de Agrobacterium e permitindo que as mesmas se desenvolvam e apresentem sementes. Milhares de sementes são recuperadas em aproximadamente 6 semanas. As sementes são, então, coletadas das plantas imersas e germinadas no solo. Dessa maneira, é possível gerar vários milhares de plantas independentemente transformadas para avaliação, constituindo um formato de transformação de plantas de elevado rendimento (HTP). Mudas desenvolvidas aleatoriamente são pulverizadas com glifosato e as mudas que sobrevivem exibindo resistência ao glifosato

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258/314 sobrevivem ao processo de seleção, enquanto que plantas não-transgênicas e plantas incorporando ácidos nucleicos de GAT menos favoravelmente modificados são danificadas ou mortas pelo tratamento com herbicida. Opcionalmente, os ácidos nucleicos que codificam a GAT que conferem resistência aperfeiçoada ao glifosato são recuperados, por exemplo, através de amplificação por PCR usando primers de T-DNA flanqueando os insertos na biblioteca e usados em outros procedimentos de diversificação ou para produzir plantas transgênicas adicionais da mesma ou de uma espécie diferente. Se desejado, ciclos adicionais de diversificação e seleção podem ser realizados usando concentrações crescentes de glifosato em cada seleção subseqüente. Dessa maneira, polinucleotídeos e polipeptídeos de GAT que conferem resistência à concentrações de glifosato úteis em condições no campo podem ser obtidos.

Resistência a herbicida:

A presente invenção proporciona uma composição compreendendo dois ou mais polinucleotídeos da invenção. De preferência, os polinucleotídeos de GAT codificam polipeptídeos de GAT tendo diferentes parâmetros cinéticos, isto é, uma variante de GAT tendo uma menor Km pode ser combinada com uma tendo uma maior kcat. Em uma outra modalidade, os diferentes polinucleotídeos de GAT podem ser acoplados a uma seqüência de trânsito de cloroplasto ou outra seqüência sinalizadora, desse modo, proporcionando expressão de polipeptídeo de GAT em diferentes organelas de compartimentos celulares ou secreção de um ou mais dos polipeptídeos de GAT.

O mecanismo de resistência ao glifosato da presente

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259/314 invenção pode ser combinado com outros modos de resistência ao glifosato conhecidos na técnica para produzir plantas e explantes de plantas com resistência superior ao glifosato. Por exemplo, plantas tolerantes ao glifosato podem ser produzidas através de inserção, no genoma da planta, da capacidade de produzir um nível maior de 5enolpiruvilshikimato-3-fosfato CP4 de Agrobacterium (EPSPS) conforme mais completamente descrito nas Patentes U.S. Nos. 6.248.876 B1; 5.627.061; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE 37.287 E; e 5.491.288; e publicações internacionais WO 97/04103; WO 00/66746; WO 01/66704; e WO 00/66747, as quais são incorporadas aqui por referência em suas totalidades para todas as finalidades. A resistência ao glifosato é também conferida à plantas que expressam um gene que codifica uma enzima óxido-reductase de glifosato, conforme descrito mais completamente nas Patentes U.S. Nos. 5.776.760 e 5.463.175, as quais são incorporadas aqui por referência em suas totalidades para todas as finalidades.

Ainda, o mecanismo de resistência ao glifosato da presente invenção podem ser combinado com outros modos de resistência a herbicida para proporcionar plantas e explantes de plantas que são resistentes ao glifosato e um ou mais de outros herbicidas. Por exemplo, as hidróxifenil piruvato dioxigenases são enzimas que catalisam a reação na qual para-hidróxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisato. Moléculas as quais inibem essa enzima e as quais se ligam a uma enzima de forma a inibir a

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260/314 transformação do HPP em homogentisato são úteis como herbicidas. Plantas mais resistentes a determinados herbicidas são descritas nas Patentes U.S. Nos. 6.245.968 B1; 6.268.549; e 6.069.115; e publicação internacional WO 99/23886, as quais são incorporadas aqui por referência em suas totalidades para todas as finalidades.

Herbicidas de sulfoniluréia e imidazólio também inibem o crescimento de plantas superiores através de bloqueio da sintase de acetolactato (ALS) ou sintase de acetohidróxi ácido (AHAS). A produção de plantas tolerantes à sulfoniluréia e imidazolinona é descrita mais completamente nas Patentes U.S. Nos. 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937; e 5.378.824; e publicação internacional WO 96/33270, os quais são incorporadas aqui por referência em suas totalidades para todas as finalidades.

A sintetase de glutamina (GS) parece ser uma enzima essencial necessária para o desenvolvimento e vida da maioria de células de planta. Inibidores de GS são tóxicos para as células de planta. Herbicidas de glifosinato foram desenvolvidos baseado no efeito tóxico em virtude da inibição de GS em plantas. Esses herbicidas são nãoseletivos. Eles inibem o crescimento de todas as diferentes espécies de plantas presentes, causando sua destruição total. O desenvolvimento de plantas contendo uma acetiltransferase de fosfinotricina exógena é descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675; 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616 B1; e 5.879.903, os quais são incorporadas aqui por referência em suas totalidades para todas as

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261/314 finalidades.

Oxidase de protoporfirinogênio (protox) é necessária para a produção de clorofila, a qual é necessária para que todas as plantas sobrevivam. A enzima protox serve como o alvo para uma variedade de compostos herbicidas. Esses herbicidas também inibem o crescimento de todas as espécies diferentes de plantas presentes, causando sua destruição total. O desenvolvimento de plantas contendo atividade alterada de protox as quais são resistentes a esses herbicidas é descrito nas Patentes U.S. Nos. 6.288.306 B1; 6.282.837 B1; e 5.767.373; e publicação internacional WO 01/12825, as quais são incorporadas aqui por referência em suas totalidade para todas as finalidades.

Conseqüentemente, a invenção proporciona métodos para o controle seletivo de ervas daninhas em um campo contendo uma safra que envolve plantio do campo com sementes ou plantas de safra as quais são tolerantes ao glifosato como um resultado de serem transformadas com um gene que codifica uma N-acetiltransferase de glifosato e aplicação, à safra e ervas daninhas no campo, de uma quantidade suficiente de glifosato para controlar as ervas daninhas sem afetar significativamente a safra.

A invenção ainda proporciona métodos para o controle de ervas daninhas em um campo e prevenção da emergência de ervas daninhas resistentes ao glifosato em um campo contendo uma safra o qual envolve plantio do campo com sementes ou plantas de safra que são tolerantes ao glifosato como um resultado de serem transformadas com um gene que codifica uma N-acetiltransferase de glifosato e um gene que codifica um polipeptídeo que confere tolerância ao

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262/314 glifosato através de outro mecanismo, tal como uma 5enolpiruvilshikimato-3-fosfato CP4 de Agrobacterium tolerante ao glifosato e/ou uma óxido-reductase de glifosato tolerante ao glifosato e aplicação, à safra e às ervas daninhas no campo, de uma quantidade suficiente de glifosato para controlar as ervas daninhas sem afetar significativamente a safra.

Em uma outra modalidade, a invenção proporciona métodos para o controle de ervas daninhas em um campo e prevenção da emergência de ervas daninhas resistentes a herbicida em um campo contendo uma safra o qual envolve plantio do campo com sementes ou plantas de safra que são tolerantes ao glifosato como um resultado de serem transformadas com um gene que codifica uma Nacetiltransferase de glifosato, um gene que codifica um polipeptídeo que confere tolerância ao glifosato através de outro mecanismo tal como uma 5-enolpiruvilshikimato-3fosfato CP4 de Agrobacterium tolerante ao glifosato e/ou uma óxido-reductase de glifosato tolerante ao glifosato e um gene que codifica um polipeptídeo que confere tolerância a um herbicida adicional, tal como uma hidróxifenil piruvato dioxigenase com mutação, uma sintase de acetolactato tolerante à sulfonamida, uma sintase de acetohidróxi ácido tolerante à sulfonamida, uma sintase de acetolactato tolerante à imidazolinona, uma sintase de acetohidróxi ácido tolerante à imidazolinona, uma acetiltransferase de fosfinotricina e uma oxidase de protoporfirinogênio com mutação e aplicação, à safra e às ervas daninhas no campo, de uma quantidade suficiente de glifosato e um herbicida adicional, tal como um inibidor de

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263/314 hidróxifenil piruvato dioxigenase, sulfonamida, imidazolinona, bialaphos, fosfinotricina, azafenidin, butafenacil, sulfosato, glifosinato e um inibidor de protox para controlar as ervas daninhas sem afetar significativamente a safra.

A invenção ainda proporciona métodos para o controle de ervas daninhas em um campo e prevenção da emergência de ervas daninhas resistentes a herbicida em um campo contendo uma safra o qual envolve plantio do campo com sementes ou plantas de safra que são tolerantes ao glifosato como um resultado de serem transformadas com um gene que codifica N-acetiltransferase de glifosato e um gene que codifica um polipeptídeo que confere tolerância a um herbicida adicional, tal como, uma hidróxifenil piruvato dioxigenase com mutação, uma sintase de acetolactato tolerante à sulfonamida, uma sintase de acetohidróxi ácido tolerante à sulfonamida, uma sintase de acetolactato tolerante à imidazolinona, uma sintase de acetohidróxi ácido tolerante à imidazolinona, uma acetiltransferase de fosfinotricina e uma oxidase de protoporfirinogênio com mutação e aplicação, à safra e às ervas daninhas no campo, de uma quantidade suficiente de glifosato e um herbicida adicional, tal como um inibidor de hidróxifenil piruvato dioxigenase, sulfonamida, imidazolinona, bialaphos, fosfinotricina, azafenidin, butafenacil, sulfosato, glifosinato e um inibidor de protox para controlar as ervas daninhas sem afetar significativamente a safra.

Exemplos:

Os Exemplos a seguir são ilustrativos e não limitativos. Aqueles habilitados reconhecerão uma variedade

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264/314 de parâmetros não críticos que podem ser alterados para conter resultados essencialmente similares.

Exemplo 1: Isolamento de Novos Polinucleotídeos de GAT Nativos:

Cinco polinucleotídeos de GAT nativos (isto é, polinucleotídeos de GAT que ocorrem naturalmente em um organismo não geneticamente modificado) foram descobertos através de clonagem por expressão de seqüências de gêneros Bacillus exibindo atividade de GAT. Suas seqüências de nucleotídeos foram determinadas e são proporcionadas aqui como SEQ ID NO:1 - 5. Resumidamente, uma coleção de aproximadamente 500 gêneros de Bacillus e Pseudomonas foi selecionada com relação à capacidade nativa de N-acetilar o glifosato. Os gêneros foram desenvolvidos em LB durante a noite, coletados através de centrifugação, permeabilizados em tolueno diluído e, então, lavados e resuspensos em uma mistura de reação contendo tampão, glifosato a 5 mM e acetil-CoA a 200 pM. As células foram incubadas na mistura de reação durante entre 1 e 4 8 horas, tempo no qual um volume igual de metanol foi adicionado à reação. As células foram, então, empelotadas através de centrifugação e o sobrenadante foi filtrado antes de análise através de espectrometria de massa no modo de íons original. O produto da reação foi positivamente identificado como Nacetilglifosato através de comparação do perfil de espectrometria de massa da mistura de reação a um padrão de N-acetilglifosato, conforme mostrado na Figura 2. A detecção do produto era dependente da inclusão de ambos os substratos (acetil CoA e glifosato) e foi eliminada através de desnaturação térmica das células bacterianas.

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Polinucleotídeos de GAT individuais foram então, clonados a partir dos gêneros identificados através de seleção funcional. DNA genômico foi preparado e parcialmente digerido com enzima Sau3A1. Fragmentos de aproximadamente 4 Kb foram clonados em um vetor de expressão de E. coli e transformados em E. coli eletrocompetente. Clones individuais exibindo atividade de GAT foram identificados através de espectrometria de massa após a reação, conforme descrito previamente, exceto que a lavagem com tolueno foi substituída por permeabilização com PMBS. Fragmentos genômicos foram seqüenciados e a rede de leitura aberta que codifica o polipeptídeo de GAT putativo foi identificada. A identidade do gene de GAT foi confirmada através de expressão da rede de leitura aberta em E. coli e detecção de altos níveis de N-acetilglifosato produzidos a partir das misturas de reação.

Exemplo 2: Caracterização de Um Polipeptídeo de GAT Isolado do Gênero B6 De B.Licheniformis:

DNA genômico do gênero B6 de B. licheniformis foi purificado, parcialmente digerido com Sau3A1 e fragmentos de 1-10 Kb foram clonados em um vetor de expressão de E. coli. Um clone com um inserto de 2,5 kb conferiu a atividade de N-acetiltransferase de glifosato (GAT) ao hospedeiro de E. coli, conforme determinado através de análise por espectrometria de massa. Seqüenciamento do inserto revelou uma única rede de leitura aberta completa de 441 pares de base. Subseqüente clonagem dessa rede de leitura aberta confirmou que ela codificava a enzima GAT. Um plasmídio, pMAXY2120, é mostrado na Figura 4. O gene que codifica a enzima GAT de B6 foi transformado no gênero XL1

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Blue de E. coli. Um inóculo a 10% de uma cultura saturada foi adicionado a caldo de Luria e a cultura foi incubada a 37° C durante 1 hora. Expressão de GAT foi induzida através da adição de IPTG em uma concentração de 1 mM. A cultura foi incubada durante mais 4 horas, apos o que as células foram coletadas através de centrifugação e a pelota de células armazenada a -80° C.

Lise das células foi realizada através da adição de 1 ml do seguinte tampão a 0,2 g de células: Hepes a 25 mM, pH de 7,3, KCl a 100 mM e metanol a 10% (HKM) mais EDTA a 0,1 mM, DTT a 1 mM, 1 mg/ml de lisozima de ovo de galinha e um coquetel inibidor de protease obtido da Sigma e usado de acordo com as recomendações do fabricante. Após 20 minutos de incubação em temperatura ambiente (por exemplo, 22-25° C), lise foi terminada com rápida sujeição a ultra-som. O lisato foi centrifugado e o sobrenadante foi dessalinizado por meio de passagem através de Sephadex G25 equilibrada com HKM. Purificação parcial foi obtida através de cromatografia por afinidade sobre CoA Agarose (Sigma). A coluna foi equilibrada com HKM e o extrato clarificado foi deixado passar sob pressão hidrostática. As proteínas nãoligadas foram removidas através de lavagem da coluna com HKM e a GAT foi eluída com HKM contendo Coenzima A a 1 mM. Esse procedimento proporcionou purificação de 4 vezes. Nesse estágio, a coloração de proteína de aproximadamente 65% observada sobre um gel de poliacrilamida SDS carregado com o lisato bruto era em virtude de GAT, com outros 20% em virtude da acetiltransferase de cloranfenicol codificada pelo vetor.

Purificação até homogeneidade foi obtida através de

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267/314 filtração em gel da proteína parcialmente purificada através de Superdex 75 (Pharmacia) . A fase móvel era HKM, na qual a atividade de GAT eluiu em um volume correspondendo a um raio molecular de 17 kD. Esse material era homogêneo, conforme julgado através de coloração com Coomassie de uma amostra de 3 μg da GAT submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida SDS sobre um gel de acrilamida a 12%, espessura de 1 mm. Purificação foi obtida com um aumento de 6 vezes na atividade específica.

A Km evidente para o glifosato foi determinada sobre misturas de reação contendo Acetil CoA saturante (200 μΜ) , concentrações variadas de glifosato e GAT purificada a 1 μΜ em tampão contendo morfolina a 5 mM ajustado para um pH de 7,7 com ácido acético e 20% de etileno glicol. As taxas de reação iniciais foram determinadas através de monitoramento contínuo da hidrólise da ligação de tioéster de Acetil CoA a 235 nm (E = 3,4 OD/mM/cm). Cinética de saturação hiperbólica foi observada (Figura 5), a partir da qual uma Km evidente de 2,9 ± 0,2 (SD) mM foi obtida.

A Km evidente para Acetil CoA foi determinada sobre misturas de reação contendo glifosato a 5 mM, concentrações variadas de Acetil CoA e GAT a 0,19 μΜ em tampão contendo morfolina a 5 mM ajustada para um pH de 7,7 com ácido acético e metanol a 50%. As taxas iniciais de reação foram determinadas usando detecção espectrométrica de massa de Nacetil glifosato. Cinco μl foram repetidamente injetados no instrumento e as taxas de reação foram obtidas através de plotagem do tempo de reação vs área do pico integrado (Figura 6). Cinética de saturação hiperbólica foi observada (Figura 7), a partir da qual uma Km evidente de 2 μΜ foi

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268/314 derivada. A partir dos valores para Vmax obtidos em uma concentração conhecida de enzima, uma Kcat de 6/min foi calculada.

Exemplo 3: Processo de Seleção por Espectrometria de Massa (Ms):

Amostras (5 |LXl) foram extraídas de uma lâmina e microtitulação com 96 cavidades em uma velocidade de uma amostra a cada 26 segundos e injetadas no espectrômetro de massa (Micromass Four LC, espectrômetro de massa com quádruplo triplo) sem qualquer separação. A amostra foi transportada para o espectrômetro de massa através de uma fase móvel de água/metanol (50:50) em uma taxa de fluxo de 500 Ul/min. Cada amostra injetada foi ionizada por um processo de ionização por eletropulverização neGATiva (tensão da agulha, -3,5 KV; tensão de cone, 20 V; temperatura da fonte, 120° C; temperatura de dessolvatação, 250° C; fluxo de gás no cone, 90 L/Hr; e fluxo de gás de dessolvatação, 600 L/Hr) . Os íons moleculares (m/z 210) formados durante esse processo foram selecionados através do primeiro quadrupolo para realizar dissociação induzida por colisão (CID) no segundo quadrupolo, onde a pressão foi ajustada a 5 x 10^-4 mBar (0,5 kPa) e a energia de colisão foi ajustada a 20 Ev. O terceiro quadrupolo foi ajustado para permitir que apenas um dos íons filhos (m/z 124) produzidos a partir dos íons originais (m/z 210) chegasse no detector para registro de sinal. Os primeiro e terceiro quadrupolos foram ajustados em uma decomposição unitária, embora o fotomultiplicador estivesse operando a 650 V. Padrões puros de N-acetilglifosato foram usados para comparação e integração de pico foi usada para estimar as

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269/314 concentrações. Foi possível detectar menos do que 200 Nm de N-acetilglifosato por meio desse método.

Exemplo 4: Detecção de Enzimas GAT Nativas ou Com Baixa Atividade:

Enzimas GAT nativas ou com baixa atividade têm, tipicamente, uma Kcat de aproximadamente 1 min^-1 e uma Km para o glifosato de 1,5-10 Mm. A Km para acetil CoA era, tipicamente, menor do que 25 μΜ.

Culturas bacterianas foram desenvolvidas e meio rico em lâminas com 96 cavidades profundas e 0,5 ml de células na fase estacionária foram coletados através de centrifugação, lavadas com acetato de morfolina a 5 mM, pH de 8 e resuspensas em 0,1 ml de mistura de reação contendo amônio acetil CoA a 200 μΜ, glifosato de amônio a 5 mM e 5 μg/ml de PMBS (Sigma) em acetato de morfolina a 5 mM, pH de

8. O PMBS permeabiliza a membrana celular, permitindo que os substratos e produtos se movam das células para o tampão sem liberação dos conteúdos celulares todos. As reações foram realizadas a 25-37°C durante 1-48 horas. As reações foram resfriadas com um volume igual de etanol a 100% e a mistura toda foi filtrada sobre uma lâmina com filtro MAHV Multiscreen de 0,45 μm (Millipore) . As amostras foram analisadas usando um espectrômetro de massa conforme descrito acima e comparadas a padrões sintéticos de Nacetilglifosato.

Exemplo 5: Detecção de Enzima GATs com Elevada Atividade:

Enzimas GAT com elevada atividade têm, tipicamente, têm uma Kcat de até 400 min^-1 e uma baixa Km pelo glifosato a 0,1 mM.

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Genes que codificam enzimas GAT foram clonados no vetor de expressão de E. coli pQE80 (Qiagen) e introduzidos no gênero de E. coli XL1 Blue (Stratagene) . As culturas foram desenvolvidas em 150 ul de meio rico (LB com 50 ug/ml de carbenicilina) em lâminas de poliestireno com 96 cavidades com fundo em U até a fase log-tardia e diluídas a 1:9 com meio fresco contendo IPTG a 1 mM (USB) . Após 4-8 horas de indução, as células foram coletadas, lavadas com acetato de morfolina a 5 mM, pH de 6,8 e resuspensas em um volume igual do mesmo tampão de morfolina. As reações foram realizadas com até 10 ul de células lavadas. Nos maiores níveis de atividade, as células foram primeiro diluídas até 1:200 e 5 ul foram adicionados a 100 ul de mistura de reação. Para medir a atividade de GAT, a mesma mistura de reação conforme descrito para baixa atividade foi usada. Contudo, para detecção de enzimas GAT altamente ativas, a concentração de glifosato foi reduzida para 0,15 - 0,5 mM, o pH foi reduzido para 6,8 e as reações foram realizadas durante 1 hora a 37°C. Processamento de reação e detecção por MS foram conforme descrito aqui.

Exemplo 6: Purificação de Enzimas GAT:

A purificação da enzima foi obtida através de cromatografia por afinidade de lisatos de células sobre CoA-agarose e gel-filtração sobre Superdex-75. As quantidades de enzima GAT purificada até 10 mg foram obtidas como segue: Uma cultura de 100 ml de E. coli trazendo um polinucleotídeo de GAT sobre um vetor pQE80 e desenvolvida durante a noite em LB contendo 50 ug/ml de carbenicilina foi usada para inocular 1 L de LB mais 50 ug/ml de carbenicilina. Após 1 hora, IPTG foi adicionado a

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271/314 mM e a cultura foi adicionalmente desenvolvida durante 6 horas. As células foram coletadas através de centrifugação. Lise foi realizada através de suspensão das células em Hepes a 25 mM (pH de 7,2), KCl a 100 mM, 10% de metanol (HKM) , EDTA a 0,1 mM, DTT a 1 mM, coquetel inibidor de protease fornecido pela Sigma-Aldrich e 1 mg/ml de lisozima de ovo de galinha. Após 30 minutos em temperatura ambiente, as células foram rapidamente submetidas a ultra-som. O material em partículas foi removido através de centrifugação e o lisato foi passado através de um leito de coenzima A-Agarose. A coluna foi lavada com vários volumes de leito de HKM e a GAT foi eluída em 1,5 volumes de leito de HKM contendo acetil CoA a 1 mM. A GAT no eluato foi concentrada através de sua retenção sobre uma membrana de ultrafiltração Centricon YM 50. Purificação adicional foi obtida passando-se a proteína através de uma coluna Superdex 75 por meio de uma série de injeções de 0,6 ml. O pico de atividade de GAT eluiu em um volume correspondendo ao peso molecular de 17 kD. Esse método resultou na purificação de enzima GAT até homogeneidade com >85% de recuperação. Um procedimento similar foi usado para obter quantidades de 0,1 a 0,4 mg de ate 96 variantes embaralhadas por vez. O volume de cultura induzida foi reduzido para 1 a 10 ml, cromatografia por afinidade com coenzima A-Agarose foi realizada em colunas de 0,15-ml acondicionadas em uma lâmina com filtro MAHV (Millipore) e Superdex 75 foi omitida.

Exemplo 7: Protocolo Padrão para Determinação de Kcat E Km:

A kcat e Km para o glifosato de proteínas purificadas

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272/314 foram determinadas usando um ensaio espectrofotométrico contínuo, no qual hidrólise da ligação de sulfoéster de Acetil CoA foi monitorada a 235 nm. As reações foram realizadas em temperatura ambiente (cerca de 23°C) nas cavidades de uma lâmina de ensaio com 96 cavidades, com os seguintes componentes presentes em um volume final de 0,3 ml: HEPES a 20 mM, pH de 6,8, 10% de etileno glicol, acetil CoA a 0,2 mM e várias concentrações de glifosato de amônio. Na comparação da cinética de duas enzimas GAT, ambas as enzimas foram analisadas sob as mesmas condições, por exemplo, ambas a 23°C. A kcat foi calculada a partir da Vmax e da concentração de enzima, determinada por meio do ensaio de Bradford. A Km foi calculada a partir das taxas iniciais de reação obtidas a partir das concentrações de glifosato, oscilando de 0,125 a 10 mM, usando a transformação Lineweaver-Burke da equação de Michaelis-Menten. A kcat/KM foi determinada dividindo-se o valor determinado para kcat pelo valor determinado para Km.

Usando essa metodologia, os parâmetros cinéticos para uma série de polipeptídeos de GAT exemplificados aqui foram determinados. Por exemplo, as kcat, Km e kcat/KM para o polipeptídeo de GAT correspondendo à SEQ ID NO:445 foram determinadas como sendo de 322 min^-1, 0,5 mM e 660 mM^-1min^-1, respectivamente, usando as condições de ensaio descritas acima. A kcat, Km e kcat/KM para o polipeptídeo de GAT correspondendo à SEQ ID NO:457 foram determinadas como sendo de 118 min^-1, 0,1 mM e 1184 mM^-1min^-1, respectivamente, usando as condições de ensaio descritas acima. A kcat, Km e kcat/KM para o polipeptídeo de GAT correspondendo à SEQ ID NO:300 foram determinadas como sendo de 296 min^-1, 0,65 mM

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273/314 e 456 mM^-1min^-1, respectivamente, usando as condições de ensaio descritas acima. Aqueles habilitados na técnica podem usar esses números para confirmar que o ensaio de atividade de GAT gera parâmetros cinéticos para uma GAT adequada para comparação com os valores fornecidos aqui. Por exemplo, as condições usadas para comparar a atividade de GATs proporcionariam as mesmas constantes cinéticas para SEQ ID NO: 300, 445 e 457 (dentro da variância experimental normal) que aquelas reportadas aqui, quando as condições são usadas para comparar uma GAT de teste com os polipeptídeos de GAT exemplificados aqui.

A Km para acetil CoA foi medida usando o método de espectrometria de massa com amostragem repetida durante a reação. Acetil CoA e glifosato (sais de amônio) foram colocados como soluções de estoque 50 vezes-concentradas em uma cavidade de uma lâmina de amostra para espectrometria de massa. As reações foram iniciadas com a adição de enzima apropriadamente diluída em um tampão volátil, tal como acetato de morfolina ou carbonato de amônio, pH de 6, 8 ou 7,7. A amostra foi repetidamente injetada no instrumento e as taxas iniciais foram calculadas a partir de plotagens do tempo de retenção e área de pico. A Km foi calculada conforme para o glifosato.

Exemplo 8: Seleção de e. Coli transformada:

Um gene de GAT produzido (uma quimera com um sítio de ligação ribossômica nativo de B. licheniformis (AACTGAAGGAGGAATCTC; SEQ ID NO: 515) preso diretamente à extremidade 5' de uma seqüência de codificação de GAT) foi clonado no vetor de expressão pQE80 (Qiagen) entre os sítios EcoRI e HindIII, resultando no plasmídio pMAXY2190

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274/314 (Figura 11). Isso eliminou o domínio His tag do plasmídio e reteve o gene de B-lactamase que confere resistência aos antibióticos ampicilina e carbenicilina. pMAXY2190 foi eletroporado (BioRad Gene Pulser) em células de E. coli XL1 Blue (Stratagene). As células foram suspensas em meio rico em SOC e deixadas recuperar durante uma hora. As células foram, então, ligeiramente empelotadas, lavadas uma vez com meio mínimo M9 carecendo de aminoácidos aromáticos (12,8 g/L de Na2HPO4.7H2O, 3,0 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 1,0 g/L de NH4Cl, 0,4% de glicose, MgSO4 a 2 mM, CaCl2 a 0,1 mM, 10 mg/L de tiamina, 10 mg/L de prolina, 30 mg/L de carbenicilina) e resuspensas em 20 ml do mesmo meio M9. Após crescimento durante a noite a 37°C a 250 rpm, volumes iguais de células foram colocados sobre meio M9 ou meios M9 mais glifosato a 1 mM. O vetor pQE80 sem gene de GAT foi similarmente introduzido em células de E. coli e colocado em lâminas para colônias simples para comparação. A Tabela 3 apresenta um resumo dos resultados, demonstrando que a atividade de GAT permite seleção e crescimento de células de E. coli transformadas com menos do que 1% de base. Observe que nenhuma indução por IPTG foi necessária para atividade de GAT suficiente para permitir crescimento de células transformadas. Transformação foi verificada através de re-isolamento de pMAXY2190 a partir de células de E. coli desenvolvidas na presença de glifosato.

Tabela 3: Seleção por glifosato de pMAXY2190 em E. coli

Número de colônias
Plasmídio	M9 - glifosato	M9 + glifosato a 1 mM

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pMAXY2190	568	512
pQE8 0	324	3

Exemplo 9: Seleção de Células de Planta Transformadas:

A transformação Agrobacterium-mediada de células de planta ocorre em baixas eficiências. Para permitir a propagação de células transformadas ao mesmo tempo em que inibe a proliferação de não-células transformadas, um marcador selecionável é necessário. Marcadores de antibiótico para canamicina e higromicina e o gene de modificação de herbicida bar, o qual destoxifica o composto herbicida fosfinotricina, são exemplos de marcadores selecionáveis usados em plantas (Methods in Molecular Biology, 1995, 49: 9-18). Aqui, nós demonstramos que a atividade de GAT serve como um marcador selecionável eficaz para transformação de plantas. Um gene de GAT produzido (0_5B8), SEQ ID NO:190, foi clonado entre um promotor de planta (vírus intensificado de formação de listras no veio de morango) e um terminador de ubiquinona e introduzido na região de T-DNA do vetor binário pMAXY3793 adequado para transformação de células de planta via Agrobacterium tumefaciens EHA105, conforme mostrado na Figura 12. Um marcador GUS selecionável estava presente no T-DNA para permitir confirmação de transformação. Mudas de tabaco transgênico foram geradas usando glifosato como o único agente de seleção.

Brotos axilares de Nicotiana tabacum L. Xanthi foram subcultivados sobre meio MS com média resistência com sacarose (1,5%) e Gelrite (0,3%) sob 16 horas de luz (35-42 pEinsteins m^-2 s^-1, lâmpadas fluorescentes brancas frias) a 24 °C a cada 2-3 semanas. Folhas jovens foram excisadas das

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276/314 plantas após 2-3 semanas de subcultura e foram cortadas em segmentos de 3 x 3 mm. A. tumefacíens EHA105 foi inoculado em meio LB e desenvolvido durante a noite até uma densidade de A600 = 1, 0. As células foram empelotadas a 4.000 rpm durante 5 minutos e resuspensas em 3 volumes de meio de cocultura líquido composto de meio de Murashige e Skoog (MS) (pH de 5,2) com 2 mg/L de N6-benziladenina (BA), 1% de glicose e acetil-siringona a 400 uM. Os pedaços de folha foram, então, totalmente submersos em 20 ml de A. tumefacíens em discos de Petri de 100 x 25 mm durante 30 min, blotted com papel filtro submetido à autoclave, então, colocados sobre meio de co-cultura sólido (0,3% de Gelrite) e incubados conforme descrito acima. Após 3 dias de cocultura, 20-30 segmentos foram transferidos meio de indução de mudas de base (BSI) composto de meio sólido MS (pH de 5,7) com 2 mg/L de BA, 3% de sacarose, 0,3% de Gelrite, glifosato a 0-200 uM e 400 ug/ml de Timentina.

Após 3 semanas, as mudas eram claramente evidentes sobre os explantes colocados sobre meios sem glifosato, a despeito da presença ou ausência do gene de GAT. Transferência de T-DNA de ambas os construtos foi confirmado através de coloração por histoquímica com GUS das folhas a partir de mudas regeneradas. Concentrações de glifosato maiores do que 20 uM inibiram completamente qualquer formação de muda a partir dos explantes carecendo de um gene de GAT. Explantes infectados com A. tumefacíens com as mudas regeneradas com construtos de GAT em concentrações de glifosato de até 200 uM (o maior nível testado). Transformação foi confirmada através de colocação por histoquímica com GUS e através de amplificação de

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277/314 fragmento por PCR do gene de GAT usando primers anelados ao promotor e regiões 3'. Os resultados são resumidos na Tabela 4.

Tabela 4. Regeneração de mudas de tabaco com seleção por glifosato.

Concentração de glifosato Regeneração % de mudas
Genes transferidos	0 uM	20 uM	40 uM	8 0 uM	200 uM
GUS	100	0	0	0	0
GAT e GUS	100	60	30	5	3

Exemplo 10: Seleção de Glifosato em Células de Levedo Transformadas:

Marcadores de seleção para transformação de levedo são usualmente genes auxotróficos que permitem o crescimento de células transformadas sobre um meio carecendo do aminoácido ou nucleotídeo específico. Em virtude do fato de o Saccharomyces cerevisiae ser sensível ao glifosato, a GAT pode também ser usada como um marcador selecionável. Para demonstrar isso, um gene de GAT produzido (0_6D10), SEQ ID NO:196, é clonado a partir do vetor de T-DNA pMAXY3793 (conforme mostrado no Exemplo 9) como um fragmento PstIClaI contendo a região de codificação toda e ligado em p424TEF digerido com PstI-ClaI (Gene, 1995, 156: 119-122) conforme mostrado na Figura 13. Esse plasmídio contém uma origem de replicação de E. coli e um gene que confere

resistência	à	carbenicilina,	bem como	um marcador
selecionável	auxotrófico de	triptofano,	TRP1, para
transformação	de	levedo.
O construto	contendo GAT é	transformada	em XL1 Blue de

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E. coli (Stratagene) e colocada sobre meio de agar LB com carbenicilina (50 ug/ml). DNA de plasmídio é preparado e usado para transformar o gênero de levedo YPH499 (Stratagene) usando um kit de transformação (Bio101). Quantidades iguais de células transformadas são colocadas sobre meio CSM-YNB-glicose (Bio101) carecendo de todos os aminoácidos aromáticos (triptofano, tirosina e fenilalanina) com glifosato adicionado. Para comparação, p424TEF carecendo do gene de GAT é também introduzido em YPH499 e colocado em lâminas conforme descrito. Os resultados demonstram que atividade de GAT funciona como um marcador selecionável eficaz. A presença do vetor contendo GAT em colônias glifosato-selecionadas pode ser confirmada através de re-isolamento do plasmídio e análise de digestão por restrição.

Exemplo 11. Testes de Pulverização de Herbicida de Plantas de Tabaco Expressando GAT:

Mudas de tabaco geradas conforme descrito no Exemplo 9 foram excisadas de explantes e transferidas meio de indução de raiz de base (BRI) composto de meio de Murashige e Skoog (MS) com resistência média, pH de 5,7, com 1,5% de sacarose, 0,3% de Gelrite, glifosato a 0-200 uM e 400 ug/ml de Timentina. As plantas enraizadas e brotos axilares foram clonalmente propagados através de corte do caule e transferência para meio BRI fresco e o número desejado de clones foi obtido. As plantas enraizadas foram cuidadosamente removidas do meio sólido. Antes de colocação das plantas em pequenos vasos no solo, as raízes foram lavadas para remover qualquer Gelrite restante. Uma cobertura plástica protetora foi mantida sobre as plantas

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279/314 durante pelo menos uma semana até que as plantas estivessem bem estabelecidas.

Para determinar de plantas de tabaco expressando GAT poderiam tolerar taxas de pulverização de glifosato simuladas no campo, linhagens clonais de vários eventos por variante de GAT foram testadas. Um teste típico foi ajustado como segue: um clone de cada evento foi pulverizado com 1 ml de solução contendo o sal de isopropilamina de glifosato (Sigma P5671) e 0,125% de Triton X-100, pH de 6,8, de modo que a quantidade de ingrediente ativo pulverizada era equivalente àquela presente em produtos comerciais de glifosato. Por exemplo, para obter 32 oz/acre ( = 0,2242 g/m² ) (1X) de herbicida contendo 40% de ingrediente ativo (ai), 2,4 ul de formulação a 40% ai foram diluídos em 1 ml de água e pulverizados sobre uma planta em um vaso de 4-polegadas quadradas (16 polegadas² = 103,22 cm²). Uma aplicação sem efeito (0X) com tensoativo apenas também foi incluída. Em alguns casos, uma segunda pulverização foi aplicada 1-4 semanas depois. As plantas foram mantidas em câmaras de crescimento controlado at 25°C e 70% umidade com 16 horas de luz.

Nesse Exemplo, 10 eventos confirmaram ser positivos para GAT0_6D10 (SEQ ID NO:196), dez para GAT0_5D3 (SEQ ID NO:193), 8 eventos para GAT0_5B8 (SEQ ID NO:190) e plantas transformadas com o vetor apenas (sem GAT) foram clonalmente propagadas, transferidas para o solo e pulverizadas quando as plantas tinham ume média de 5 folhas. Plantas desenvolvidas a partir de sementes do tipo silvestre foram também pulverizadas. Após duas semanas,

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280/314 plantas com o vetor apenas e desenvolvidas a partir de sementes pulverizadas com 0,5, 2 ou 4X glifosato pararam o desenvolvimento, penderam e se tornaram marrons. Cada uma das plantas transgênicas à GAT sobreviveu ao procedimento de pulverização sem sinais de dano pelo glifosato, tais como clorose, alongamento da folha, plantas mirradas ou formação de cor marrom. Todas as plantas 0X estavam saudáveis, incluindo as plantas de controle sem GAT. Três semanas depois, todas as plantas sobreviventes foram pulverizadas com uma dose de 8X. As plantas de controle 0X morreram dentro de duas semanas. Novamente, todas as plantas com GAT sobreviveram.

As plantas de tabaco transformadas com GAT e selecionadas com relação ao glifosato eram férteis. A floração e sementes apresentadas não eram detectavelmente diferentes de plantas do tipo silvestre.

Exemplo 12. Hereditariedade de Mendelian do Gene de GAT e Tolerância ao Fenotipo Glifosato:

A hereditariedade de Mendelian do gene de GAT e tolerância ao fenotipo glifosato foram demonstrados com Arabídopsís transformada. Plantas Arabidopsis do tipo Columbia foram desenvolvidas e transformadas através do método de imersão (Clough, SJ e Bent, AF, (1998) Plant J. 16(6): 735-43) com um construto contendo a variante de GAT denominada quimera (SEQ ID NO:16). Sementes brutas foram coletadas e plantas com GAT foram confirmadas através de PCR com primers específicos ao inserto dentro do T-DNA. Sementes T1 de eventos individuais foram plantadas no solo com 10-30 sementes por vaso de 2-polegadas quadradas ( 12,9 cm²) . Quando o primeiro conjunto de folhas verdadeiras

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281/314 estava emergindo, os vasos foram pulverizados com glifosato equivalente a 0,5 e 1X um produto comercial (conforme calculado no Exemplo 11). Após duas semanas, a segregação do transgene e fenotipo tolerante eram evidentes, conforme 5 mostrado na Tabela 5.

Tabela 5: Sumário de dados de segregação para Arabidopsis T1 tolerante a 0,5 e 1X glifosato

Evento de quimera (SEQ ID NO:16)	#Sobrevive ntes	#Mortos	Proporção de segregação
1	8	11	1:1,4
3	6	22	1:3,7
5	26	2	13: 1
13	10	9	1: 1
65	46	19	2,4:1
Vetor apenas	0	22	-
Tipo silvestre	0	29	-

Proporções próximas de 3:1 indicam um único evento dominante de segregação. Proporções maiores do que 3:1 10 indicam vários insertos de segregação. Proporções menores do que 3:1 podem ser em virtude de efeitos sobre o pequeno tamanho da amostra, dominância incompleta ou efeitos de posição que tornam a expressão muito baixa para conferir tolerância a um herbicida. Comparado aos controles, estava 15 claro que o gene de GAT foi transmitido para a geração T1 e conferiu tolerância ao glifosato.

Exemplo 13: Produção de Milho Resistente ao Glifosato

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Expressando Transgenes de GAT:

Plantas de milho expressando transgenes variantes de GAT foram produzidas usando os métodos descritos na Patente U.S. No. 5.981.849, a qual é incorporada aqui por referência. Especificamente, vetores de Agrobacterium tumefaciens foram construídos de acordo com métodos conhecidos na técnica. Cada vetor continha um inserto tendo um íntron e promotor de ubiquitina, uma variante de GAT e um terminador PinII. Embriões imaturos de milho foram excisados e infectados com um vetor de Agrobacterium tumefaciens contendo a variante de GAT de interesse. Após infecção, os embriões foram transferidos e cultivados em meio de co-cultura. Após co-cultura, os embriões imaturos infectados foram transferidos para meio contendo glifosato a 1,0 mM (Roundup ULTRA MAX™) . Essa seleção durou até que desenvolvimento ativo de caule transgênico putativo fosse identificado. O tecido de caule transgênico putativo foi coletado para PCR e ensaio de Western (dados não mostrados) para confirmar a presença do gene de GAT. O tecido de caule transgênico putativo foi mantido sobre meios de seleção com glifosato a 1,0 mM para crescimento adicional e seleção antes de regeneração da planta. Na regeneração, tecidos de caule confirmados como sendo transgênicos foram transferidos para meio de maturação contendo glifosato a 0,1 mM e cultivados para maturação de embriões somáticos. Embriões maduros foram, então, transferidos para meio de regeneração contendo glifosato a 0,1 mM para formação de raízes e brotos. Após brotos e raízes terem emergido, mudas individuais foram transferidos para tubos com meio de enraizamento contendo glifosato a 0,1 mM. Mudas com brotos

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283/314 e raízes estabelecidos foram transplantadas para vasos na estufa para crescimento adicional, o geração de dados de pulverização de T0 e a produção de sementes T1.

De forma a avaliar o nível de resistência ao glifosato de plantas transgênicas de milho expressando as variantes de transgenes de GAT, plantas T0 foram pulverizadas com glifosato (Roundup ULTRA MAX™) na estufa. Os níveis de resistência das plantas foram avaliados através de escores de descoloração das plantas e medições da altura da planta. A descoloração das plantas e altura das plantas foram avaliadas de acordo com as seguintes escalas:

Escore de descoloração a 1, 2, 3 e 4 semanas após pulverização com glifosato = sem descoloração da folha/caule = descoloração mínima da folha/caule = descoloração grave da folha/caule = planta gravemente descolorida ou planta morrendo = planta morta

Medições de altura da planta

Antes de pulverização com glifosato após pulverização com glifosato a 1, 2, 3 e 4 semanas plantas maduras (quando de formação de pendões)

Duas plantas foram enviadas para a estufa de cada evento (caule transgênico independente) listado na Tabela

6. A planta 1 foi mentida para a produção de sementes e não foi pulverizada com glifosato. A planta 2 foi pulverizada a 4x glifosato (1x glifosato = 26 onças/acre = 0,1821 g/m²) a 14 dias após plantio. Os escores de descoloração de plantas T0 com pulverização de 4x a 7 e 14 dias após a pulverização são mostrados nas Tabelas 6 e 7. Os dados de altura quando

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284/314 de formação de pendões são mostrados na Figura 14. Um experimento adicional foi realizado, no qual plantas T0 foram pulverizadas com 6x glifosato. Os escores de descoloração de plantas T0 com pulverização de 6x a 10 dias 5 após pulverização são mostrados na Tabela 8.

Tabela 6: Escores de resistência a 7 dias após tratamento com 4x glifosato

construto	# eventos testados com 4x	% eventos	% eventos	% eventos a <7
a	9	a	7
18534 (SEQ ID NO:196)	169	30%	(50)	59%	(101)	11% (18)
18537 (SEQ ID NO:193)	72	40%	(29)	54%	(39)	6% (4)
18540 (SEQ ID NO:190)	111	32%	(36)	61%	(67)	7% (8)
total	352	33%	(115)	59%	(207)	8% (30)

Tabela 7: Escores de resistência a 14 dias após tratamento com 4x glifosato

construto	# eventos testados com 4x	% eventos a 9
18534 (SEQ ID NO:196)	169	29%	(49)
18537 (SEQ ID NO:193)	72	50%	(36)
18540 (SEQ ID NO:190)	111	29%	(32)
total	352	33%	(117)

Tabela 8: Escores de resistência a 10 dias após tratamento com 6X glifosato

construto

# eventos testados com 6X

% eventos sem dano após tratamento com glifosato

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		(esco	re= 9)
19286 (SEQ ID NO: 814)	312	51%	(160)
19288 (SEQ ID NO: 549)	310	52%	(163)
19900 (SEQ ID NO: 738)	231	56%	(129)
19902 (SEQ ID NO: 638)	230	42%	(96)
21895 (SEQ ID NO: 848)	55	30%	(17)
21896 (SEQ ID NO: 912)	61	61%	(37)
21905 (SEQ ID NO: 906)	32	70%	(25)
total	1231	51%	(627)

Exemplo 14: GAT é Também uma Aciltransferase:

A capacidade das variantes de GAT (B6 (SEQ ID NO: 7),

0_6D10 (SEQ ID NO:448), 17-15H3 (SEQ ID NO: 601) e 20-8H12c (SEQ ID NO: 817)) se transferir o grupo propionila de 5 propionil CoA para o glifosato foi testada em misturas de reação contendo glifosato a 5 mM ou nenhum glifosato.

Propionil CoA estava presente a 1 mM. Após 30 minutos, as

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286/314 reações foram terminadas e a presença de propionil CoA livre foi determinada através da adição de DTNB. Todas as variantes mostraram hidrólise de propionil CoA glifosatodependente. Esses resultados indicam que a GAT também funciona como uma aciltransferase.

Exemplo 15: Estudos de Milho T1 Resistente ao Glifosato Expressando Transgenes de Gat:

Plantas de milho expressando variantes de transgenes de GAT 18-28D9b (SEQ ID NO: 814) e 17-15H3 (SEQ ID NO: 549) foram produzidas usando os métodos descritos no Exemplo 13. Plantas T1 foram usadas para a geração de dados de tolerância ao glifosato no campo. As plantas T1 foram tratadas no campo com quatro tratamentos diferentes com pulverização de glifosato (0X, 4X, 8X e 4X + 4X) para cada evento. As plantas foram pulverizadas a V3 e V8. As plantas foram classidicadas10 dias após tratamento para comparações de descoloração da folha e altura das plantas, conforme descrito no Exemplo 13. Os dados de pulverização de T1 no campo se correlacionam bem com os resultados previamente obtidos na estufa, conforme reportado no Exemplo 13. Sementes T2 foram coletadas para outros estudos.

Exemplo 16: Termoestabilidade de Polipeptídeos de Gat:

A. Efeito da Variação de Temperatura sobre a Tolerância ao Glifosato de Milho Resistente ao Glifosato Expressando Transgenes de GAT:

Plantas de milho expressando variantes de transgenes de GAT 10_4F2 (SEQ ID NO:203), 17-15H3 (SEQ ID NO: 549) e 18-28D9b (SEQ ID NO: 814) foram produzidas usando os métodos descritos no Exemplo 13. O efeito da temperatura sobre a tolerância ao glifosato foi avaliada em plantas T1.

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As plantas T1 foram crescidas em condições frias (14° C ao

dia, 8° C à	noite),	amenas	(28°	C ao dia,	20° C à	noite) e
quentes (37°	C	ao	dia, 20	° C	à noite).	Plantas	T1 foram
pulverizadas	a	V2	com quatro	tratamentos diferentes de
pulverização	de	glifosato	(0X,	4X, 6X e	8X). As	plantas

foram classificadas a 5 e 14 dias após tratamento para comparações de descoloração da folha e altura das plantas, conforme descrito no Exemplo 13. Observações visuais indicaram que a tolerância ao glifosato não é adversamente afetada pela faixa de temperaturas testadas.

B. Efeito da Variação de Temperatura Sobre a Atividade de GAT In Vitro:

A termoestabilidade in vitro de vários polipeptídeos de GAT (DS3 (um polipeptídeo de GAT nativo correspondendo à SEQ ID NO: 8), 6_6D5 (SEQ ID NO: 410), 17-15H3 (SEQ ID NO: 601), 20-8H12 (SEQ ID NO: 739), 22-13B12 (SEQ ID NO: 781) e 401 (um polipeptídeo de GAT nativo correspondendo à SEQ ID NO: 6)) foi avaliada de acordo com o seguinte método. As enzimas foram distribuídas a tubos de PCR de 200 ql (VWR, San Francisco, CA) e incubadas em um termociclizador com gradiente (IML Research, Watertown, MA) durante 15 minutos em várias temperaturas entre 30°C e 60°C, conforme indicado na Figura 17. A proteína precipitada foi removida através de centrifugação e a atividade enzimática sobrevivente da proteína solúvel restante foi medida a 22°C através do ensaio espectrofotométrico contínuo, conforme descrito no Exemplo 7. Concentrações saturantes de glifosato (10 mM para DS3 (SEQ ID NO: 8), 401 (SEQ ID NO: 6) e 6_6D5 (SEQ ID NO: 410); 5 mM para 17-15H3 (SEQ ID NO: 601), 20-8H12 (SEQ ID NO: 739) e 22-13B12 (SEQ ID NO: 781) e AcCoA (167 uM)

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288/314 foram usadas.

Os dados são representados na Figura 17. Polipeptídeos de GAT nativos (isto é, do tipo silvestre) DS3 (SEQ ID NO: 8) e 401 (SEQ ID NO: 6) pareciam estáveis com relação à atividade em temperaturas até cerca de 42 a cerca de 44°C. Polipeptídeos de GAT que não são nativos a qualquer organismo (isto é, não são do tipo silvestre) pareciam estáveis em temperaturas na faixa de cerca de 47°C a cerca de 54°C.

As meias vidas de vários polipeptídeos de GAT foram também medidas a 37,5°C de acordo com o seguinte procedimento. Os polipeptídeos de GAT 401 (SEQ ID NO: 6), 17-15H3 (SEQ ID NO: 601), 20-8H12 (SEQ ID NO: 739), 2213B12 (SEQ ID NO: 781), 22-15B4 (SEQ ID NO: 946) e 22-18C5 (SEQ ID NO: 795) foram incubados em uma matriz de Hepes a 25 mM, pH de 7,2, KCl a 10 mM e 10% de metanol (HKM). Em vários pontos de tempo, alíquotas foram retiradas e analisadas três vezes a 22°C usando o ensaio espectrofotométrico contínuo descrito no Exemplo 7 usando concentrações saturantes de glifosato (20 mM para 401, 5 mM para o restante) e AcCoA (167 uM) . A média de erro padrão em cada ponto de tempo era cerca de 2,9%. A atividade de GAT foi plotada como uma função do tempo de incubação e os dados foram adaptados a uma curva para declínio exponencial (y = e ^-x), onde y é a atividade enzimática e x é o tempo em horas, a partir da qual a meia vida foi calculada. Os dados são mostrados abaixo na Tabela 9.

Tabela 9: Meias vidas de polipeptídeos de GAT a 37,5 C

Enzima Meia-vida, horas

401 14

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(SEQ ID NO: 6)
17-15H3 (SEQ ID NO: 601)	45
20-8H12 (SEQ ID NO: 739)	54
22-13B12 (SEQ ID NO: 781)	67
22-15B4 (SEQ ID NO: 946)	26
22-18C5 (SEQ ID NO: 795)	43

Exemplo 17: Produção de Soja Resistente ao Glifosato Expressando Transgenes de GAT:

Plantas de soja expressando variantes de transgenes de GAT foram produzidas usando o método de bombardeamento de partículas (veja Klein e colaboradores (1987) Nature 327: 70-73) usando um instrumento DuPont Biolistic PDS1000/He. O agente de seleção usado durante o processo de transformação era higromicina. O gene marcador selecionável higromicina permaneceu nos eventos transgênicos ou o gene de higromicina foi excisado através de métodos conhecidos na técnica. Fragmentos de DNA foram preparados com um promotor constitutivo sintético, uma variante de GAT e o terminador PinII. O gene marcador selecionável, compreendendo o promotor 35S CaMV, o gene HPT o terminador NOS, foi cobombardeado com a variante do gene GAT, descrito acima. Tecido embriogênico de soja bombardeado em suspensão foi cultivado durante uma semana na ausência de agente de seleção. Tecido embriogênico em suspensão foi colocado em meio de seleção líquido durante 6 semanas. Tecido transgênico em suspensão putativo foi coletado para amostra para análise por PCR para determinar a presença do gene de

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GAT. Tecido transgênico em cultura em suspensão putativo foi mantido em meio de seleção durante 3 semanas para se obter tecido suficiente para regeneração da planta. Tecido em suspensão foi maturado durante 4 semanas usando-se procedimentos padrões; embriões somáticos maduros foram dessecados durante 4-7 dias e então, colocados sobre meio de indução de germinação durante 2-4 semanas. Mudas germinadas foram transferidas para o solo em bandejas de acondicionamento de células durante 3 semanas para aclimatização. As mudas foram plantadas em vasos de 10 polegadas (= 25,4 cm) na estufa para avaliação de resistência ao glifosato.

Para determinar o nível de resistência ao glifosato de sojas transgênicas expressando as variantes de transgenes de GAT, plantas T0 foram pulverizadas com glifosato (Roundup ULTRA MAX™) na estufa. Os níveis de resistência da planta foram avaliados através de escores de descoloração das plantas e medições da altura das plantas.

Escore de descoloração a 2 semanas após pulverização com glifosato = sem descoloração da folha/caule = descoloração mínima da folha/caule = descoloração grave da folha/caule = planta gravemente descolorida ou planta morrendo = planta morta

Uma de quatro plantas foi enviada para a estufa de cada evento transgênico independente. 1-2 plantas adicionais por evento foram crescidas em câmaras de crescimento com ambiente controlado para a produção de sementes e não foram pulverizadas com glifosato. As plantas

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291/314 na estufa foram pulverizadas a 1X, 2X ou 4X glifosato (1X glifosato = 26 onças/acre = 0,1821 g/m² de RoundUp ULTRA MAX^TM) 3-4 semanas após transferência para o solo. Os escores de descoloração de plantas T0 com taxas de pulverização de 2X e 4X são mostrados na Tabela 10 e Tabela 11, respectivamente.

Esses resultados mostram que sojas são eficazmente transformada com variantes do gene de GAT, conforme confirmado através de análise por PCR. Sojas transgênicas expressando variantes do gene GAT são resistentes ao glifosato em taxas de pulverização de 2X e 4X. Os eventos que sobreviveram à taxa de pulverização de 4X glifosato mostram menor descoloração da folha, contudo, dentro de 2 semanas do teste de pulverização, as plantas se recuperaram e demonstram morfologia normal da folha.

Tabela 10. Escores de Resistência a 10 dias após tratamento com 2X glifosato.

	# eventos Testados com 2X	% eventos a 7-8	% eventos a 3-6
SEQ ID NO:193	27	15% (4)	11% (3)
SEQ ID NO: 824	38	8% (3)	74% (23)

Tabela 11. Escores de Resistência a 10 dias após tratamento com 4X glifosato.

	# eventos Testados com 4X	% eventos a 7-8	% eventos a 3-6
SEQ ID NO: 824	23	8% (2)	43% (10)

Exemplo 18: Efeito do Sal Sobre A Cinética de GAT:

Para melhor se aproximar das condições fisiológicas sob as quais as enzimas GAT da invenção se destinam a serem

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292/314 usadas (por exemplo, células de planta), as atividades de algumas enzimas GAT da invenção foram re-avaliadas na presença de sal adicionado. As Figuras 15A e 15B proporciona uma comparação dos parâmetros cinéticos Km e kcat/Km, respectivamente, para enzimas GAT nativas GAT401 (SEQ ID NO: 6), B6 (SEQ ID NO: 7) e DS3 (SEQ ID NO: 8) e enzimas GAT produzidas 0_6D10 (SEQ ID NO:448), 10_4F2 (SEQ ID NO:454), 18-28D9 (SEQ ID NO: 618), 17-15H3 (SEQ ID NO: 601), 17-10B3 (SEQ ID NO: 592), 20-8H12 (SEQ ID NO: 739), 20-16A3 (SEQ ID NO: 639) e 20-30C6 (SEQ ID NO: 683), analisadas na ausência de KCl adicionado (barras não sombreadas) ou na presença de KCl a 20 mM (barras sombreadas). As concentrações de proteína foram determinadas usando o ensaio de Bradford, conforme descrito no Exemplo 7. A despeito de suas Kms extremamente baixas para o glifosato na ausência de KCl, os parâmetros cinéticos para as enzimas produzidas GAT 0_6D10, 18-28D9 e 20-8H12 foram determinadas na ausência de KCl usando o ensaio de espectrometria de massa, conforme descrito no Exemplo 3, embora todos os outros parâmetros cinéticos (quer na ausência ou presença de KCl) fossem determinados usando o ensaio espectrofotométrico contínuo conforme descrito no Exemplo 7. As barras de erro representam o desvio padrão de ensaios múltiplos, onde disponível. A Figura 15A mostra que a adição de sal (KCl a 20 mM) ao tampão de ensaio aumenta significativamente o valor de Km para o glifosato. O valor de kcat continua relativamente inalterado ou aumenta ligeiramente, o resultado líquido sendo um menor valor de kcat/Km para enzimas GAT analisadas na presença de KCl a 20 mM do que na ausência de KCl

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293/314 adicionado (Figura 15B).

Exemplo 19: Genes GAT Adicionalmente Produzidos que Codificam Enzimas GAT com Atividade Extremamente Elevada:

Interações adicionais de evolução molecular dirigida proporcionaram outros genes GAT produzidos que codificam enzimas GAT exibindo atividade de GAT extremamente elevada, por exemplo, exibindo uma ou mais propriedades aperfeiçoadas, tais como Km reduzida para o glifosato, kcat aumentada ou kcat/Km aumentada, comparado às enzimas GAT previamente descritas.

Os genes GAT adicionalmente produzidos foram primeiro selecionados com relação ao crescimento em E. coli em meio mínimo M9, conforme descrito no Exemplo 8, exceto que glifosato a 5 mM, ao invés de a 1 mM, foi usado na seleção. As proteínas foram purificadas conforme descrito no Exemplo 6 acima.

As concentrações de proteína foram determinadas através de absorbância de UV a 205 nm. O coeficiente de excitação foi determinado através do método descrito por Scopes (1994; Protein Purification, Principles e Practice, Springer, New York) de acordo com a fórmula E (mg ml^-1 cm^-1) = 27 + 120(A280/A205) = 30,5. Antes de quantificação através de absorbância de UV, o tampão da solução de proteína foi trocado para Na2SO4 a 50 mM usando uma coluna NAP-5 (Amersham-Pharmacia Biotech).

Seqüências de codificação de GAT exemplificativas adicionalmente produzidas compreendem seqüências de ácidos nucleicos identificadas aqui como SEQ ID NOs: 832,

834,

836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858,

860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882,

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884,	886,	888,	890, 892, 894,	896, 898,	900,	902, 904,	906,
908,	910,	912,	914, 916, 91	8, 920, 922, 924, 926,	928 e
930,	as	quais	codificam outras enzimas GAT produzidas
compreendendo	as seqüências	de aminoácidos	identificadas
aqui	como	SEQ	ID NOs: 833,	835, 837,	839,	841, 843,	845,
847,	849,	851,	853, 855, 857,	859, 861,	863,	865, 867,	869,
871,	873,	875,	877, 879, 881,	883, 885,	887,	889, 891,	893,
895,	897,	899,	901, 903, 905,	907, 909,	911,	913, 915,	917,
919,	921	, 923	, 925, 927,	929 e 93	1, respectivamente.

Algumas de tais enzimas GAT adicionalmente produzidas exibem atividade de GAT extremamente elevada, pelo fato de que elas exibem uma ou mais propriedades aperfeiçoadas, tais como Km reduzida para o glifosato, kcat aumentada ou kcat/Km aumentada, comparado às enzimas GAT previamente descritas analisadas sob as mesmas condições.

As Figuras 16A, 16B e 16C proporcionam uma comparação dos parâmetros cinéticos Km, kcat e kcat/Km, respectivamente, de várias enzimas GAT previamente descritas (barras não sombreadas) com relação aos parâmetros cinéticos de algumas enzimas GAT adicionalmente produzidas da invenção (barras sombreadas), analisadas usando o ensaio espectrofotométrico contínuo na presença de KCl a 20 mM com a proteína quantificada via absorbância de UV, conforme descrito acima. As barras de erro representam o desvio padrão de ensaios múltiplos, onde disponível. Sob essas condições de ensaio, a enzima GAT nativa GAT401 (SEQ ID NO: 6) exibiu uma Km para o glifosato de cerca de 4 mM, uma kcat de cerca de 5,4 min-¹ e uma kcat/Km de cerca de 1,35 mM-¹ min-¹. Quando analisadas sob essas condições, algumas enzimas GAT adicionalmente produzidas da invenção (barras sombreadas)

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295/314 exibem uma faixa de valores de Km para o glifosato of menos do que cerca de 0,4 mM (tais como, entre cerca de 0,4 mM e 0,1 mM), valores de kcat de pelo menos cerca de 1000 min^-1(tais como, entre cerca de 1000 min^-1 e cerca de 2500 min^-1) e valores de kcat/Km de pelo menos cerca de 4800 mM^-1 min^-1(tais como, entre cerca de 4800 mM^-1 min^{-1 e} cerca de 8000 mM^-1 min^-1) . Por exemplo, algumas enzimas GAT adicionalmente produzidas da invenção exibem um aumento de pelo menos cerca de 7000 vezes na kcat/Km com relação à enzima GAT nativa GAT401 sob essas condições de ensaio.

Algumas enzimas GAT adicionalmente produzidas da invenção compreendem uma ou mais posições de resíduos de aminoácidos não observadas em polipeptídeos de GAT e enzimas GAT previamente descritos, tais como, na posição 27, um resíduo de aminoácido B1, Z1 ou A; na posição 33, um resíduo de aminoácido N ou G; na posição 46, um resíduo de aminoácido B2, Z4 ou H; e na posição 93, um resíduo de aminoácido R; onde B1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M, F, W, Y e V; B2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, N, D, C, Q, E, G, H, K, P, S e T; Z1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de A, I, L, M e V; e Z4 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo de R, H e K. Por exemplo, algumas enzimas GAT adicionalmente produzidas da invenção compreendem uma ou mais de: uma Ala na posição 27 (isto é, Ala27); uma Asn ou uma Gly na posição 33 (isto é, Asn33 ou Gly33); uma His na posição 46 (isto é, His46); e uma Arg na posição 93 (isto é, Arg93), com a numeração de seqüência correspondendo àquela de, por exemplo, SEQ ID NO: 907.

Análises de seqüência/atividade foram realizadas para

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296/314 identificar resíduos de aminoácidos os quais se correlacionam positivamente com uma elevada kcat/Km (conforme manifestado por uma elevada kcat, uma baixa Km ou ambos). Resíduos de aminoácidos os quais parecem se correlacionar positivamente com uma elevada kcat/Km incluem Glu14, Asp32, Asn33, Gly38 e Thr62 (numeração de seqüência correspondendo àquela de SEQ ID NO: 907) . Enzimas GAT adicionais podem ser construídos através de substituição de códons por um ou mais desses resíduos na(s) posição(ões) apropriada(s) da seqüência de codificação de um polipeptídeo de GAT modelo. Por exemplo, enzimas GAT adicionais foram geradas através de substituição de um ou mais dos códons que codificam Glu na posição 14 do códon, Asp na posição 32, Asn na posição 33, Gly na posição 38 e Thr na posição 62, em uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo modelo, tal como GAT 24-5H5 (SEQ ID NO: 845) ou GAT 25-8H7 (SEQ ID NO: 907), duas das enzimas GAT adicionais produzidas exibindo atividade extremamente elevada, conforme descrito acima. Outras enzimas GAT exemplificativas ainda produzidas geradas dessa maneira, identificadas aqui como R12G1 (SEQ ID NO: 917), R12G2 (SEQ ID NO: 919), R12G3 (SEQ ID NO: 921), R12G4 (SEQ ID NO: 923), R12G5 (SEQ ID NO: 925), R12G6 (SEQ ID NO: 927), R12G7 (SEQ ID NO: 929) e R12G8 (SEQ ID NO: 931), codificadas pelos ácidos nucleicos identificados como SEQ ID NOs: 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928 e 930, respectivamente, exibiram atividades de GAT extremamente elevadas, comparáveis àquelas dos polipeptídeos modelo.

Exemplo 20:___Aminoácidos que se Correlacionam com Elevada Atividade de Gat:

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Os aminoácidos ácido aspártico (Asp, D) , histidina (His, H) e cisteína (Cys, C) são conhecidos por estarem associados a sítios ativos de várias enzimas acetiltransferase. Para determinar se qualquer resíduo exerce um papel na atividade de GAT, todos os resíduos de D, Ce H de GAT20-30C6 (SEQ ID NO: 683) sofreram, individualmente, mutação para alanina (Ala, A) e as enzimas com mutação analisadas com relação à atividade de Nacetilglifosato. Variantes contendo as substituições D34A e H41A retiveram apenas cerca de 2%-3% da atividade da enzima não modificada, embora a variante contendo a substituição H138A não exibisse, essencialmente, atividade mensurável de GAT. Por outro lado, variantes contendo as substituições H138R e H138S retiveram atividade de GAT baixa, mas mensurável (particularmente em pHs maiores do que 6,8), sugerindo que a His (e nominalmente Arg e Ser) na posição 138 podem servir como uma base sítio-ativa.

Tabela 12:

Enzima	Ensaio de proteína de Bradford com KCl
kcat (min^-1)	Km (mM)	kcat/Km (mM^-1 min^-1)	% k_Cat/Km de 2 0- 30C6
20-30C6 (SEQ ID NO: 683)	386	0,182	2122	100
20-30C6 H41A	208	4, 80	43	2,0
20-30C6 D34A	127	2,33	54	2, 6
20-30C6 H138A	< 0, 02	Nd	nd	< 0,005
20-30C6 H138R	44,3	17, 8	2,49	0, 12
20-30C6 H138S	5, 35	7, 1	0,75	0, 03

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Exemplo 21: Melhora da Expressão de Gat Em Plantas

Plantas, animais e micróbios são conhecidos por ter preferências específicas de códons que afetam a eficácia de incorporação de aminoácidos durante tradução de transcritos de gene. Códons ratos poderiam causar problemas com recrutamento de tRNA durante tradução, o que poderia, então, levar ao menor acúmulo da proteína codificada. Os genes GAT originais eram de bactérias, tal como Bacillus licheniformis e, como tal, podem não ter uma distribuição ótima de códon para expressão em plantas. Os genes de GAT produzidos da invenção foram expressos com sucesso em plantas (veja, por exemplo, Exemplos 9, 11, 13 e 17, acima), ainda assim existe uma oportunidade para melhorar a produção de proteína através de aumento da eficácia de tradução em plantas. Uma forma para realizar isso é através de substituição de um ou mais códons na seqüência de codificação de GAT os quais não são usados com freqüência em plantas por códons para o(s) mesmo(s) aminoácido(s) os quais são mais freqüentemente usados em plantas, desse modo, gerando mutações silenciosas na seqüência de codificação de GAT com uma seqüência inalterada da proteína codificada.

Tabelas mostrando a freqüência de uso de códon em milho, algodão e sojas (disponível, por exemplo, do website mantido pelo Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japão) foram comparadas para gerar a seguinte tabela (Tabela 13) mostrando códons os quais são, em geral, mais freqüentemente ou menos freqüentemente utilizados em plantas monocot ou dicot.

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Tabela 13:

Aminoácido	Códons util	mais freqüentemente	Códons menos freqüentemente
Lizados	em plantas	utilizados plantas	em
Alanina	Ala	A	GCA	GCC	GCT		GCG
Cisteína	Cys	C	TGC	TGT
Ácido aspártico	Asp	D	GAC	GAT
Ácido glutâmico	Glu	E	GAA	GAG
Fenilalanina	Phe	F	TTC	TTT
Glicina	Gly	G	GGA	GGT			GGC	GGG
Histidina	His	H	CAC	CAT
Isoleucina	Ile	I	ATC	ATT			ATA
Lisina	Lys	K	AAA	AAG
Leucina	Leu	L	TTG	CTC	CTG	CTT	CTA	TTA
Metionina	Met	M	ATG
Asparagina	Asn	N	AAC	AAT
Asparagina	Asn	N	AAC	AAT
Prolina	Pro	P	CCA	CCT			CCC	CCG
Glutamina	Gln	Q	CAA	CAG
Arginina	Arg	R	AGA	AGG			CGA	CGC	CGG	CGT
Serina	Ser	S	AGT	TCA	TCC	TCT	AGC	TCG
Treonina	Thr	T	ACA	ACC	ACT		ACG
Valina	Val	V	GTG	GTT			GTA	GTC
Triptofano	Trp	W	TGG
Tirosina	Tyr	Y	TAC	TAT

Uma segunda forma para aumentar a expressão em plantas de genes microbianos é aumentar o teor de G+C próximo do resíduo inicial de metionina. Seqüências de codificação que 5 ocorrem naturalmente em plantas tendem a conter dois ou três resíduos de G e/ou C imediatamente a jusante do códon inicial ATG (Joshi e colaboradores (1997) Plant Mol. Biol.

35: 993-1001). A introdução na seqüência de codificação de GAT de um ou dois códons ricos em CG imediatamente a 10 jusante do códon ATG inicial pode criar uma seqüência de codificação mais semelhante à planta e, assim, pode intensificar sua expressão em plantas. A substituição do

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300/314 segundo códon (isoleucina, ATA) por um códon de alanina (GCG) resultou em uma variante Ile2Ala com kcat reduzido, comparado à enzima não modificada. Por outro lado, a inserção de um códon de alanina (GCG ou GCT) entre os códons para Met na posição 1 do códon e Ile na posição 2 do códon resultou em uma seqüência de codificação de GAT que codifica uma enzima GAT contendo um resíduo de Ala inserido entre a Met na posição 1 e a Ile na posição 2. Uma enzima variante de GAT exemplificativa contendo duas alaninas inseridas entre Met1 e Ile2, identificada como 22-15B4 M1MAA (para significar a inserção de dois resíduos de Ala imediatamente após a Met na posição 1) e tendo a seqüência de proteínas SEQ ID NO: 948, exibiu uma kcat reduzida comparado à enzima não modificada 22-15B4 (SEQ ID NO: 789). Uma enzima GAT exemplificativo contendo uma alanina inserida entre Met1 e Ile2, denotada 22-15B4 M1MA (para significar a inserção de um resíduo de Ala imediatamente após a Met na posição 1), tendo a seqüência de proteínas SEQ ID NO: 946, exibiu cinética essencialmente inalterada comparado à enzima não modificada enzima 22-15B4.

Uma estratégia geral para melhorar a expressão de GAT em plantas foi reproduzida. Seqüências de codificação de GAT produzidas podem ser alteradas através de substituição de códons menos freqüentemente utilizados em plantas por códons mais freqüentemente utilizados em plantas, por exemplo, de acordo com a tabela acima. Códons menos freqüentemente utilizados em plantas (por exemplo, de acordo com a tabela acima) deverão, geralmente, ser evitados. Dessa maneira, pelo menos um códon (tal como pelo menos três códons, pelo menos cinco códons ou pelo menos

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301/314 dez códons) pode ser alterado na seqüência de codificação de GAT, com relação ao(s) códon(s) menos freqüentemente utilizado(s) em plantas, por códon(s) mais freqüentemente utilizado(s) em plantas. Os códons os quais são substituídos podem estar localizados na extremidade 5' da seqüência de codificação (por exemplo, dentro dos 10 primeiros códons, dentro dos 20 primeiros códons, dentro dos 50 primeiros códons ou dentro dos 100 primeiros códons) da seqüência de codificação de GAT. Alternativamente, os códons os quais são substituídos podem estar localizados no decorrer da seqüência de codificação de GAT. Os códons mais freqüentemente utilizados, além disso, podem ser escolhidos para evitar mais do que cerca de 5-10 (tais como, por exemplo, mais do que cerca de 5, mais do que cerca de 6, mais do que cerca de 7, mais do que cerca de 8, mais do que cerca de 9 ou mais do que cerca de 10) ocorrências consecutivas de G+C ou de A+T dentro da seqüência de codificação. A seqüência de codificação pode também ser alterada para conter um ou dois códons ricos em CG imediatamente a jusante do códon inicial ATG, tais como, por exemplo, através de inserção um códon Ala (por exemplo, um códon Ala freqüentemente utilizado) imediatamente a jusante de e adjacente ao códon inicial Met da seqüência de codificação de GAT.

A Tabela 14 proporciona seqüências de codificação de GAT exemplificativas alteradas conforme descrito acima.

Tabela 14:

Seqüência de codificação de GAT original

Seqüência de codificação de GAT alterada

Alterações de códon feitas

Proteína codificada

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GAT20-8H12 /4604 (SEQ ID NO: 738)	GAT4604SR (SEQ ID NO: 932)	Ser 62 TCG - > TCT Arg 111 CGG - > AGG	20-8H12 (SEQ ID NO: 739)
GAT2218C5/4609 (SEQ ID NO: 794)	GAT4609SR (SEQ ID NO: 933)	Ser 62 TCG - > TCT Arg 111 CGG - > AGG	22-18C5 (SEQ ID NO: 795)
GAT2216D8/4610 (SEQ ID NO: 792)	GAT4610R (SEQ ID NO: 934)	Arg 111 CGG > AGG	22-16D8 (SEQ ID NO: 793)
GAT2215B4/4611 (SEQ ID NO: 788)	GAT4611R (SEQ ID NO: 935)	Arg 111 CGG > AGG	22-15B4 (SEQ ID NO: 789)
GAT245H5/4614 (SEQ ID NO: 848)	GAT4614SR (SEQ ID NO: 936)	Ser 62 TCG - > TCT Arg 111 CGG - > AGG	24-5H5 (SEQ ID NO: 849)
GAT245H5/4614 (SEQ ID NO: 848)	GAT4614VSR (SEQ ID NO: 937)	Val 4 GTG - > GTA Ser 62 TCG - > TCT Arg 111 CGG - > AGG	24-5H5 (SEQ ID NO: 849)
GAT232H11/4615 (SEQ ID NO: 836)	GAT4615R (SEQ ID NO: 938)	Arg 111 CGG > AGG	23-2H11 (SEQ ID NO: 837)
GAT2415C3/4616 (SEQ ID NO: 862)	GAT4616R (SEQ ID NO: 939)	Arg 111 CGG > AGG	24-15C3 (SEQ ID NO: 863)
GAT236H10/4617 (SEQ ID NO: 844)	GAT4617R (SEQ ID NO: 940)	Arg 111 CGG > AGG	23-6H10 (SEQ ID NO: 845)
GAT258H7/4618 (SEQ ID NO: 906)	GAT4618SR (SEQ ID NO: 941)	Ser 62 TCG - > TCT Arg 111 CGG - > AGG	25-8H7 (SEQ ID NO: 907, 957)
GAT258H7/4618 (SEQ ID NO: 906)	GAT4618VSR (SEQ ID NO: 942)	Val 4 GTG - > GTA Ser 62 TCG - > TCT Arg 111 CGG - > AGG	25-8H7 (SEQ ID NO: 907)
GAT2519C8/4619 (SEQ ID NO: 912)	GAT4619SR (SEQ ID NO: 943)	Ser 62 TCG - > TCT Arg 111 CGG - > AGG	25-19C8 (SEQ ID NO: 913)

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GAT2519C8/4619 (SEQ ID NC: 912)	GAT4619VSR (SEQ ID NC: 944)	Val 4 GTG - > GTA Ser 62 TCG - > TCT Arg 111 CGG -> AGG	25-19C8 (SEQ ID NC: 913)
GAT2215B4/4611 (SEQ ID NC: 788)	GAT4611A (SEQ ID NC: 945)	Códon Ala inserido entre Met1 e Ile2	22-15B4 M1MA (SEQ ID NC: 946)
GAT2215B4/4611 (SEQ ID NC: 788)	GAT4611AA (SEQ ID NC: 947)	2 códons Ala inseridos entre Met1 e Ile2	22-15B4 M1MAA (SEQ ID NC: 948)
GAT258H7/4618 (SEQ ID NC: 906)	GAT4618A (SEQ ID NC: 949)	Códon Ala inserido entre Met1 e Ile2	25-8H7 M1MA (SEQ ID NC: 950)
GAT258H7/4618 (SEQ ID NC: 906)	GAT4620 (SEQ ID NC: 951)	Códon Ala inserido entre Met1 e Ile2 e 7 primeiros códons = códons mais freqüentemente utilizados; mais Ser 62 TCG - > TCT Arg 111 CGG -> AGG	25-8H7 M1MA (SEQ ID NC: 950)
GAT258H7/4618 (SEQ ID NC: 906)	GAT4621 (SEQ ID NC: 952)	Códon Ala inserido entre Met1 e Ile2 e códons mais freqüentemente	25-8H7 M1MA (SEQ ID NC: 950)

Um vetor binário com um cassete dMMV-GAT-UBQ3 no T-DNA foi transformado em células competentes do gênero de Agrobacterium tumefaciens C58 através de eletroporação (McCormac e colaboradores, Mol Biotechnol. 9: 155-159,

1998) . Após crescimento sobre lâminas com LB + 40 ug/ml de canamicina durante 2 dias a 28°C, as colônias foram inoculadas em meio líquido LB + 40 ug/ml de canamicina e agitadas durante a noite a 28°C. As células de

Agrobacterium foram coletadas através de centrifugação a 10 4000 g durante 10 minutos e, então, resuspensas em um volume de MgSCt a 10 mM equivalente ao volume inicial de

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304/314 cultura. Essa suspensão bacteriana foi forçada ou infiltrada nos espaços intercelulares de folhas de Nicotiana benthamiana usando uma seringa de plástico de 1 ml (sem agulha) . Através de infiltração de 200-300 μl de suspensão bacteriana em cada ponto (tipicamente 3-4 cm² em área infiltrada), 4 ou mais pontos poderiam ser dispostos sobre uma única folha ainda presa à planta. Em alguns casos, o gênero de Agrobacterium contendo GAT foi diluído a 5:1 ou 10:1 com um segundo gênero de Agrobacterium carecendo de GAT antes de infiltração. Essa etapa de diluição tem o efeito de reduzir a expressão global do gene GAT nas células de uma planta, desse modo, impedindo saturação e permitindo visualização mais fácil de diferenças de expressão entre variantes e construtos. Após 3 dias, o material de folha foi triturado, extraído em tampão aquoso e centrifugado. O sobrenadante, contendo as proteína solúveis, foi submetido a SDS-PAGE e o gel foi corado e submetido à prova com um anticorpo policlonal antiGAT.

O nível de proteína GAT acumulada em folhas de tabaco infiltradas com o gene GAT4620 era comparável ao nível de proteína acumulada em folhas transformadas com o gene GAT25-8H7/4618 não modificado. Folhas de tabaco abrigando o gene GAT4621, por outro lado, exibiram um acúmulo de proteína GAT cerca de duas vezes maior, como um percentual de proteína total, comparado a folhas expressando o gene GAT25-8H7/4618 não modificado.

Exemplo 22: Estudos de Soja T1 Resistente ao Glifosato

Expressando Transgenes de GAT:

Plantas de soja expressando o transgene de GAT 18

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28D9c (SEQ ID NO: 824) foram produzidas usando os métodos descritos no Exemplo 17. Sementes T1 foram coletadas de plantas T0 pulverizadas com glifosato. Sementes T1 foram germinadas sob condições em uma estufa em meio RediEspiGATh^R360, disponível da Scotts, Marysville, OH e pulverizadas no estágio V2-V3 com 2X ou 4X Glifosato (RoundUp ULTRA MAX^TM, disponível da Monsanto, St. Louise, MO) conforme os métodos descritos no Exemplo 17. As plantas foram classificadas após 10 dias e escores de descoloração das folhas tomados conforme descrito no Exemplo 17. Os dados de pulverização de T1 na estuga se correlacionavam bem com os resultados anteriores na estufa no estágio T0 das plantas. Sementes T2 foram coletadas para outros estudos.

Exemplo 23: Produção de Glifosato e Sojas Resistente a Sulfonamida Expressando GAT E HRA Transgenes:

Plantas de soja expressando GAT & HRA, alelo com genes de sintase de acetolactato de elevada resistência (Patentes (U.S. Nos. 5.605.011, 5.378.824, 5.141.870 e 5.013.659), foram produzidas usando os métodos descritos no Exemplo 17. O gene HRA foi usado como gene marcador selecionável para transformação. O agente de seleção foi chlorsulfuron em uma concentração de 100 ng/ml. O gene marcador selecionável era compreendido do promotor de sintetase de S-adenosil-Lmetionina (SAMS) de Glycine max (U.S. 2003/226166), a seqüência de codificação de HRA de Glycine max e o terminador sintase de acetolactato de Glycine max. O gene marcador selecionável foi ligado a ou co-bombardeado com um construto de GAT consistindo de um promotor constitutivo sintético (Patentes U.S. Nos. 6.072.050 e 6.555.673) ou o

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306/314 promotor 2B de Histona de milho (Patente U.S. No. 6.177.611), uma variante de GAT (18-28D9c (SEQ ID NO: 824)) e o terminador Pin II (Gyheungan e colaboradores, Plant Cell 1: 115-122 (1989)). Plantas transgênicas foram geradas conforme descrito no Exemplo 17. Os níveis de resistência ao glifosato foram determinados conforme descrito no Exemplo 17 usando escores de descoloração das plantas após taxas de aplicação de 2X ou 4X glifosato. Os resultados mostrados na Tabela 15 demonstram que diferentes promotores constitutivos que acionam variantes de GAT (1828D9c (SEQ ID NO: 824)) conferem resistência ao glifosato em plantas T0.

Tabela 15: Escores de Resistência a 10 dias após tratamento com 4X glifosato.

	# EVENTOS TESTADOS COM 4x	% EVENTOS ESCORE DE 7-8	% EVENTOS ESCORE DE 3-6
PHP20163a (45) (SEQ ID NO: 824) (PROMOTOR SCP1)	58	15,5 % (9)	77,6%
PHP20558a (11) (SEQ ID NO: 824) (PROMOTOR H2B)	26	34,6% (9)	42,3%

Exemplo 24: Estudos Pré-Emergência de Sojas T1

Expressando Transgenes de GAT E HRA:

T1 sementes geradas a partir de experimentos conforme descrito no Exemplo 17, foram plantadas em vasos Tama Silt

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307/314 na estufa. Os vasos foram imediatamente pulverizados com uma aplicação pré-emergência de chlorimuron, rimsulfuron ou tribenuron em uma taxa de 70 gms a.i./hectare. As plantas em germinação foram avaliadas 10 dias pós-aplicação de pulverização baseado em escores de descoloração das plantas descritos no Exemplo 17. Todos os eventos de HRA e GAT sobreviveram a todas as aplicações de pulverização préemergência com uma classificação de 9 (não danificado) . Esses resultados demonstram a resistência pré-emergência a produtos químicos de sulfonamida em sojas.

Exemplo 25: Estudos Pós-Emergência de Sojas T1 Expressando os Transgenes de GAT E HRA:

Sementes T1 geradas a partir de experimentos conforme descrito no Exemplo 17 foram germinadas em meio RediEspiGATh^R 360 na estufa. As plantas foram pulverizadas no estágio V2-V3 (14 dias após plantio) com thifensulfuron, chlorimuron, rimsulfuron ou tribenuron (70, 70, 35, 35 gm a.i./hectare, respectivamente). As plantas foram avaliadas 10 dias após aplicação baseado em escores de descoloração das plantas descritos no Exemplo 17. Os resultados são mostrados na Tabela 16.

Tabela 16: Escores de Resistência a 10 dias Após

Tratamento Pós-Emergência Com Produtos Químicos de

Sulfonamida

	Escores médios de Resistência de eventos de GAT (SEQ ID NO: 824)/SAMS promotor-HRA
Controle não pulverizado	9
Chlorimuron (70gm a.i./ha)	7,75
Rimsulfuron (35gm a.i./ha)	2,21

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308/314

Tribenuron (35 gm a.i./ha)	3, 83
Thifensulfuron (70 gm a.i./ha)	7, 81

Eventos tendo uma classificação de descoloração da planta de 7 ou 8 após pulverização de thifensulfuron foram pulverizadas com uma aplicação 2X ou 4X glifosato após 10 dias conforme os métodos descritos no Exemplo 17. Os eventos foram avaliados baseado nos escores de descoloração descritos no Exemplo 17. Todos os eventos tolerantes ao thifensulfuron sobreviveram à pulverização de glifosato com um escore de 7 ou 8 (resultados não mostrados) . Esses resultados demonstram 100% de correlação de tolerância ao thifensulfuron com a tolerância ao glifosato sob condições em uma estufa conferida pelos genes HRA e GAT, respectivamente, a 70 gm a.i./hectare de thifensulfuron e 2X glifosato, respectivamente.

Exemplo 26: Estudos de Plantas de Milho T3 Resistentes ao Glifosato Expressando Transgenes de GAT:

Plantas de milho expressando os transgenes de GAT 20H812 (SEQ ID NO: 738) e 20-16A3 (SEQ ID NO: 638) foram produzidas usando os métodos descritos no Exemplo 13. As plantas foram classificadas após 10 dias e escores de descoloração da folha tomados conforme descrito no Exemplo

13. Especificamente, as plantas foram pulverizadas no estágio de folhas V4. As plantas foram podada para espaçamento igual e contagens das plantas de pé após aplicação de tratamentos de pulverização. NK603 comercialmente disponível (Monsanto, St. Louis, MO) foi usado como um controle. Escores de resistência são mostrados na Tabela 18. Medições da altura das plantas

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309/314 foram tomadas também 10 dias após tratamento e são mostradas na Tabela 18.

Tabela 18: Escores de Resistência a 10 dias após tratamento com glifosato

Escores de Resistência (escala de 1-9)

Construtos	eventos testados	Controle Sem tratamento com Glifosato	1X (26 oz/A) UltraMax	4X (104 oz/A) UltraMax	8X (208 oz/A) UltraMax
19900 (SEQ ID NO: 738)	2	9	8, 8	7,9	5,4
19902 (SEQ ID NO: 638)	4	9	8, 4	8,0	5, 9
NK603	1	9	8, 4	7, 9	5,5

Tabela 19. Altura da planta (em polegadas ( 1 polegada = 2,54 cm)) 10 dias após tratamento com glifosato

Construtos	eventos testados	Controle Nenhum tratamento com Glifosato	1X (26 oz/A) UltraMax	4X (104 oz/A) UltraMax	8X(208 oz/A) UltraMax
19900 (SEQ ID NO: 738)	2	18,5	16,6	16,4	16,2
19902 (SEQ ID NO: 638)	4	19,5	16,7	17,0	16,2
NK603	1	20,1	17,6	17,5	17,3

Exemplo 27: Estudos de Rendimento de Milho T3

Resistente ao Glifosato Expressando Transgenes de GAT:

Sementes T3 do Exemplo

Plantas T3 para a geração glifosato no campo sobre conduzido em Viluco, Chile, usando um modelo de vaso foram usadas para gerar de dados de tolerância ao híbridos. O experimento foi com quatro (4) reproduções dividido. Especificamente, 3

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310/314 entradas foram incluídas. Duas das entradas compreendiam plantas de milho expressando os transgenes variantes de GAT 17-15H3 (SEQ ID NO: 549). O controle resistente ao glifosato NK603, o qual está comercialmente disponível da Monsanto, foi a terceira entrada. Todas as entradas foram tratadas no campo com quatro tratamentos diferentes de pulverização de glifosato (0X, 4X a V4, 8X a V4 e 4X a V4 e 4X a V8) para cada evento. As plantas foram classificadas 10 dias após tratamento para comparações da altura das plantas, conforme descrito no Exemplo 13. Os dados de pulverização de T3 no campo se correlacionaram bem com os resultados previamente obtidos no campo conforme reportado no Exemplo 15. Especificamente, todas as entradas pulverizadas com 1X e 4X glifosato eram similares, quanto a altura, aos controles não pulverizados. Nas maiores taxas de 4X a V4 e 4X a V8, as entradas de GAT foram temporariamente reajustadas entre 12 e 17% de altura e a entrada NK603 foi reajustada a 6%; contudo, posteriormente na estação (durante maturidade reprodutiva), a altura de entradas tratadas com glifosato era a mesma que as entradas não pulverizadas. Além disso, os rendimentos entre entradas tratadas com glifosato não eram numéricas nem estatisticamente reduzidas com relação às entradas não pulverizadas (LSD^ 05 = 11,8 bu./acre (1 acre = 4046, 87 m²), rendimento médio por entrada = 243 bu./acre) . Resultados similares foram observados em experimentos agronômicos preliminares com plantas T2 dos mesmos eventos que foram plantadas em Johnston, IA e York, NE (dados não mostrados).

Exemplo 28: Estudos de Milho T2 Resistente ao

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311/314

Glifosato Expressando Transgenes de GAT:

Experimentos foram conduzidos sobre iso-linhagens GAT positivas e GAT neGATivas. Plantas de milho expressando os transgenes de GAT 18-28D9b (SEQ ID NO: 814), 17-15H3 (SEQ

ID NO: 549), 20-8H12 (SEQ ID NO: 738), 20-16A3 (SEQ ID NO:

638), foram produzidas usando os métodos descritos no

Exemplo 17. Plantas T2 foram examinadas. Plantas T2 GAT positivas foram pulverizadas a V4 com 1X (26 oz/A ULTRA

MAX^TM) . Plantas GAT neGATivas foram coletadas para PCR a 10 V4. Plantas GAT positivas foram removidas da fileira.

Nenhum glifosato foi aplicado às plantas GAT neGATivas. As plantas foram podadas para criar espaçamento igual entre as plantas dentro de cada fileira. Quatro (4) reproduções foram realizadas. Grãos de cinco (5) espigas coletadas do 15 meio de cada fileira foram secos e pesados. Conforme mostrado na Tabela 20, nenhuma redução no rendimento foi detectada para qualquer um dos construtos.

Tabela 20: Dados de Rendimento

Construto	# de eventos	Rendimento positivo de GAT Pulverizadas com 1X (26 oz/A) ULTRA MAX^TM at V4	RENDIMENTO NeGATivo de GAT sem Glifosato Aplicado
PHP19286 (SEQ ID NO: 814)	40	1,65 libras/5 espigas	1,57 libras/5 espigas
PHP19288 (SEQ ID NO: 549)	40	1,64 libras/5 espigas	1,60 libras/5 espigas
PHP19900 (SEQ ID NO: 738)	6	1,20 libras/5 espigas	1,23 libras/5 espigas
PHP19902 (SEQ ID	4	1, 19 libras/5	1,21 libras/5 espigas

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312/314

NO: 638)

espigas

Exemplo 29: Substratos de Aminoácido de Polipeptídeos de GAT

A atividade de GAT de vários polipeptídeos de GAT da presente invenção foi avaliada com relação a uma série de substratos de aminoácido. Os substratos polipeptídeo de GAT, AcCoA e amino foram incubados em Hepes a 25 mM, pH de 6,8, 10% de etileno glicol nas cavidades de uma lâmina de poliestireno com 96 cavidades. Após 30 minutos, as reações foram cessadas através da adição de 30 μl de 5,5'-ditiobis2-nitrobenzoato (DTNB) a 10 mM em Tris a 500 mM, pH de 7,5. Após 2 minutos, a absorbância foi lida a 412 nm em uma leitora para lâmina Spectramax Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Além do glifosato, polipeptídeo de GAT nativo 401 (SEQ ID NO: 6) (ou B6 (SEQ ID NO: 7), no caso de fosfoserina) exibiu atividade detectável com 12 aminoácidos. O polipeptídeo de GAT nativo era tão ativo quanto com Laspartato, cerca de 4,7 vezes mais ativo com L-serina e cerca de 2 vezes mais ativo com fosfo-L-serina do que com glifosato. Quando comparado ao polipeptídeo de GAT nativo, polipeptídeos de GAT não-nativos 17-15H3 (SEQ ID NO: 601) e 25-8H7 (SEQ ID NO: 907), exibiram um aumento de 40 vezes na atividade com aspartato, mas perdem atividade com relação à serina e fosfoserina.

Além disso, para aspartato polipeptídeo de GAT nativo a 3% ao glifosato quando presente a seguintes: histidina (10%), e serina, atividade com um ou mais daquela com relação mM foi observada com os tirosina (18%), treonina (250%), valina (12%), glutamato (51%), asparagina (27%),

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313/314 glutamina (32%), alanina (33%), glicina (21%) e cisteína (50%) . A atividade com os outros aminoácidos de proteína era indetectável ou menor do que 3% da atividade de GAT com relação ao glifosato como o substrato. Nenhuma atividade 5 detectável foi observada com relação ao polipeptídeo de GAT nativo sobre derivados de N-metil L-aspartato (2 mM) , Lalanina (10 mM) e glicina (isto é, sarcosina, 10 mM) . Os percentuais se referem à atividade percentual no que se refere à atividade do polipeptídeo de GAT com relação ao 10 substrato, glifosato. Alguns dos dados são mostrados abaixo na Tabela 21.

Tabela 21: Atividade de GAT com Relação ao Glifosato,

Aspartato e Serina

Variante de GAT	Substrato	kcat ± SE, min^-1	Km ± SE MM	kcat/KM min^- 1_mM-1	kcat/ Km
401	Glifosato	5,35 ± 0,043	1,27 ± 0,0144	4,21	Dup, imp,
17-15H3		1150 ± 27, 6	0,251 ± 0,0041	4573	1086
25-8H7		1480 ± 65,4	0,05	29600	7031
					% de glifosato
401	Aspartato	24,1	6,7	3,6	85, 5
17-15H3		435 ± 11,3	2,95 ± 0,162	148	3,24
25-8H7		702 ± 12,4	4,56 ± 0,112	154	0,520
401	Serina	854	43	19,8	471
17-15H3		242 ±15,8	60,1 ± 1,68	4,04	0,0882
25-8H7		388 ± 18,5	154 ± 10,7	2,53	0,00855

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Exemplo 30: Efeito do Ph Sobre a Atividade de GAT:

O pH ótimo de kcat e Km para a enzima do tipo silvestre B6 (SEQ ID NO: 7) e o polipeptídeo de GAT 17-15H3 (SEQ ID NO: 601) foi determinado usando o ensaio espectrofotométrico descrito no Exemplo 7, exceto que o tampão de ensaio era Hepes a 50 mM e 10% de etileno glicol, titulados com relação a uma faixa de valores de pH. As concentrações de proteína foram determinadas por meio do ensaio de absorbância de UV descrito no Exemplo 19. O efeito do pH sobre Km e Kcat é mostrado na Figura 18 para os clones B6 (SEQ ID NO: 7) e 17-15H3 (SEQ ID NO: 601).

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes para fins de clareza e compreensão, será evidente para aqueles habilitados na técnica a partir de uma leitura da presente divulgação que várias alterações na forma e detalhes podem ser feitas sem se desviar do verdadeiro escopo da invenção. Por exemplos, todas as técnicas, métodos, composições, aparelhos e sistemas descritos acima podem ser usados em várias combinações. A invenção se destina a incluir todos os métodos e reagentes descritos aqui, bem como todos os polinucleotídeos, polipeptídeos, células ou organismos, plantas, safras, etc., que são os produtos desses novos métodos e reagentes.

Todas as publicações, patentes, pedidos de patente ou outros documentos citados no presente pedido são incorporados por referência em sua totalidade para todas as finalidades, até o mesmo ponto como se cada publicação, patente, pedido de patente ou outro documento individual fosse individualmente indicado como sendo incorporado por referência para todas as finalidades.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polinucleotídeo isolado ou recombinante, o qual compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, caracteri zado pelo fato de compreender uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 949, 951 e 952, que codifica um polipeptídeo da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 950.
2. Polinucleotídeo isolado ou recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do referido polipeptídeo catalisar a acetilação de glifosato com uma kcat/Km de 10 mM^-1 min^-1 para glifosato, em que a kcat/Km é medida na presença de HEPES a 20 mM em pH de 6,8, 10% de etileno glicol, acetil CoA a 0,2 mM e sem KCl adicional a 23°C.
3. Polinucleotídeo isolado ou recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato do referido polipeptídeo catalisar a acetilação de glifosato com uma kcat/Km de 100 mM^-1 min^-1 para glifosato.
4. Polinucleotídeo isolado ou recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato do referido polipeptídeo catalisar a acetilação de ácido aminometil-fosfônico.
5. Polinucleotídeo isolado ou recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do referido polipeptídeo possuir ainda atividade de N-aciltransferase de glifosato.
6. Construto de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo isolado ou recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

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2/4
7. Construto de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreender ainda um promotor operavelmente ligado ao referido polinucleotídeo, em que o referido promotor é heterólogo com relação ao referido polinucleotídeo e em que a tolerância ao glifosato de uma célula de planta transformada com o referido construto de ácido nucleico é aumentada em comparação com uma célula de planta que não tenha sido transformada com o referido construto de ácido nucleico.
8. Célula bacteriana, caracterizada pelo fato de compreender um polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o referido polinucleotídeo é heterólogo à célula.
9. Polipeptídeo tendo atividade de GAT, caracteri zado pelo fato do referido polipeptídeo consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 950.
10. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato do referido polipeptídeo possuir:

(a) Km para glifosato de menos do que 2,9 mM; e (b) kcat igual a 6 por minuto, em que as referidas kcat e Km são medidas na presença de HEPES a 20 mM em pH de 6,8, 10% de etileno glicol, acetil CoA a 0,2 mM e sem KCl adicional a 23°C.
11. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato do referido polipeptídeo compreender ainda um peptídeo de trânsito de cloroplasto.
12. Método para a produção de uma planta transgênica resistente ao glifosato, caracteri zado pelo fato de compreender:

(a) transformar uma célula de planta com o referido

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3/4 polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5;

(b) selecionar uma célula de planta que é resistente ao glifosato por intermédio do crescimento de células de planta na presença de uma concentração de glifosato que inibe o crescimento de uma célula de planta que não compreende um polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5; e (c) regenerar uma planta transgênica a partir da referida célula de planta.
13. Método para controlar ervas daninhas em um campo contendo uma safra, caracterizado pelo fato de compreender:

(a) plantar o campo com sementes ou plantas de safra tolerantes a herbicida que são tolerantes ao glifosato como um resultado de serem transformadas com o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5; e (b) aplicar a qualquer safra e ervas daninhas no campo uma quantidade suficiente de herbicida para controlar ervas daninhas sem afetar significativamente a safra.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato da etapa (b) ser realizada antes da etapa (a).
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato do referido herbicida compreender glifosato.
16. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato do referido herbicida compreender um herbicida de sulfoniluréia.
17. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato do referido herbicida compreender

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4/4 glifosato e um herbicida de sulfoniluréia.
18. Método para controlar ervas daninhas em um campo contendo uma safra, caracterizado pelo fato de compreender:

(a) plantar o campo com sementes ou plantas de safra que compreendem:

(i) o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5; e (ii) uma segunda sequência de nucleotídeo que codifica uma mutação HRA de sintase de acetolactato; e (b) aplicar a qualquer safra e ervas daninhas no campo uma quantidade suficiente de herbicida para controlar ervas daninhas sem afetar significativamente a safra.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato da etapa (b) ser realizada antes da etapa (a).
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato do referido herbicida compreender glifosato.
21. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato do referido herbicida compreender um herbicida de sulfoniluréia.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato do referido herbicida de sulfoniluréia compreender pelo menos um dentre os seguintes: chlorimuron, chlorsulfuron, rimsulfuron, thifensulfuron ou tribenuron.
23. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato do referido herbicida compreender glifosato e um herbicida de sulfoniluréia.