BR112020025624A2 - uso de cromatografia de interação hidrofóbica múltipla para preparar um polipeptídeo a partir de uma mistura - Google Patents

Abstract

A presente divulgação é direcionada a um método para extrair um polipeptídeo alvo, de preferência um anticorpo, a partir de uma mistura. Isso inclui contatar a mistura com um aparelho de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) que consiste em múltiplas zonas de cromatografia. Um tempo de residência para a mistura incluindo o polipeptídeo alvo em uma primeira zona pode ser aproximadamente o mesmo que um tempo de residência de uma ou mais fases móveis na segunda zona.

Description

“USO DE CROMATOGRAFIA DE INTERAÇÃO HIDROFÓBICA MÚLTIPLA PARA PREPARAR UM POLIPEPTÍDEO A PARTIR DE UMA MISTURA” REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos EUA nº 62/693,024, depositado em 2 de julho de 2018, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[0002] Esta divulgação geralmente se refere a métodos para preparar um polipeptídeo. Mais especificamente, esta divulgação se refere a métodos para preparar um polipeptídeo a partir de uma mistura usando um método cromatográfico.

ANTECEDENTES

[0003] A cromatografia, tal como cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de afinidade, e semelhantes, pode ser realizada como parte dos processos de preparação de medicamentos. Em alguns casos, a cromatografia pode ser particularmente útil na preparação de medicamentos que incluem polipeptídeos. No entanto, o equipamento, os materiais, o tempo de preparação e o tempo de execução para as etapas de HIC em batelada padrão ou outras etapas de cromatografia em batelada podem resultar em custos adicionais ou eficiência reduzida nos processos de preparação de medicamentos. Especificamente, o tempo necessário para executar cada estágio em uma HIC ou outro processo de separação por cromatografia, a quantidade de tampão e/ou meio de separação usado, e quaisquer aspectos não automatizados do processo podem reduzir a eficiência da preparação do medicamento.

[0004] Os métodos e sistemas divulgados aqui podem melhorar a eficiência e/ou produtividade dos métodos de preparação de polipeptídeos. Os métodos e sistemas divulgados aqui também podem melhorar a eficiência e/ou produtividade dos métodos de preparação de medicamentos e podem abordar um ou mais problemas identificados acima.

SUMÁRIO

[0005] As modalidades da presente divulgação podem ser direcionadas a um método para preparar um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura incluindo o polipeptídeo alvo. O método pode incluir contatar a mistura incluindo o polipeptídeo alvo com uma primeira zona de um aparelho de HIC, contatar fases móveis com uma segunda zona do aparelho de HIC, e passar o polipeptídeo alvo através das saídas da primeira e segunda zonas do aparelho de HIC, onde cada uma da primeira zona e da segunda zona pode ter uma ou mais colunas cromatográficas e uma saída. Em algumas modalidades, um tempo de residência para a mistura incluindo o polipeptídeo alvo na primeira zona pode ser configurado para ser aproximadamente o mesmo que um tempo de residência das fases móveis na segunda zona.

[0006] Em algumas modalidades, o polipeptídeo alvo pode ser um anticorpo monoclonal. O polipeptídeo alvo pode ser preparado com uma produtividade maior ou igual a 50 g/L·h. Alternativamente, ou adicionalmente, as fases móveis podem incluir um tampão de equilíbrio e um tampão de lavagem. Em algumas modalidades, os métodos da presente divulgação podem incluir ainda passar um efluente que inclui o polipeptídeo alvo da primeira zona do aparelho de HIC para a segunda zona do aparelho de HIC. Em algumas modalidades, contatar as fases móveis com a segunda zona do aparelho de HIC pode incluir contatar um tampão de lavagem com a segunda do aparelho de HIC e, após contatar o tampão de lavagem com a segunda zona do aparelho de HIC, regenerar a segunda zona. Em algumas modalidades, a regeneração da segunda zona pode incluir contatar água com a segunda zona do aparelho de HIC, contatar uma solução alcalina com a segunda zona do aparelho de HIC, contatar uma solução de álcool com a segunda zona do aparelho de HIC, e contatar um tampão de equilíbrio com a segunda zona do aparelho de HIC. O polipeptídeo alvo pode ser passado através da saída da segunda zona do aparelho de HIC após um tampão de lavagem ser contatado com a segunda zona do aparelho de HIC. Em algumas modalidades, um ou mais de uma absorção ultravioleta, condutividade elétrica ou pH de uma solução residente podem ser medidos na saída da primeira zona ou da segunda zona. A primeira zona ou a segunda zona pode incluir mais de uma coluna cromatográfica. Em algumas modalidades, o aparelho de HIC pode incluir ainda uma terceira zona tendo uma coluna cromatográfica e uma saída.

Em algumas modalidades, o método pode incluir ainda realizar um ciclo de regeneração na terceira zona, em que a realização do ciclo de regeneração inclui contatar fases móveis com a terceira zona, onde uma duração para o ciclo de regeneração é configurada para ser aproximadamente o mesmo que o tempo de residência para a mistura incluindo o polipeptídeo alvo na primeira zona.

[0007] Em algumas modalidades da presente divulgação, um método para preparar um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura incluindo o polipeptídeo alvo pode incluir passar a mistura incluindo o polipeptídeo alvo para uma primeira coluna de uma pluralidade de colunas cromatográficas em um aparelho de HIC, passar um efluente incluindo o polipeptídeo alvo da primeira coluna para uma segunda coluna da pluralidade de colunas, passar uma ou mais fases móveis para uma terceira coluna de uma pluralidade de colunas, e passar o polipeptídeo alvo através das saídas de cada uma da pluralidade de colunas, onde cada uma da pluralidade de colunas inclui uma saída conectável a outra coluna da pluralidade de colunas e uma soma dos tempos de residência para a mistura incluindo o polipeptídeo alvo na primeira coluna e na segunda coluna é substancialmente a mesma que a soma dos tempos de residência de uma ou mais fases móveis na terceira coluna.

[0008] Em algumas modalidades, o método pode incluir ainda passar uma ou mais fases móveis para cada uma da pluralidade de colunas. Em algumas modalidades, passar uma ou mais fases móveis para uma coluna pode incluir passar um tampão de lavagem para a coluna e, após a passagem de um tampão de lavagem para a coluna, regenerar a coluna, onde regenerar a coluna inclui passar água, uma solução alcalina, solução de álcool ou um tampão de equilíbrio para a coluna. Em algumas modalidades, a etapa de passar um polipeptídeo alvo através da saída de uma coluna pode ocorrer após um tampão de lavagem ter sido passado para a coluna. Em algumas modalidades, um ou mais de uma absorção ultravioleta, condutividade elétrica ou pH de uma solução residente são medidos na saída da primeira coluna ou da segunda coluna. Em algumas modalidades, o método pode incluir preparar o polipeptídeo alvo com uma produtividade maior ou igual a 50 g/L·h. Em outras modalidades, o aparelho de HIC pode incluir quatro colunas e a soma dos tempos de residência para a mistura incluindo o polipeptídeo alvo na primeira coluna e na segunda coluna pode ser substancialmente o mesmo que a soma dos tempos de regeneração da terceira coluna e da quarta coluna.

[0009] Outras modalidades da presente divulgação podem incluir um método para preparar um anticorpo usando uma pluralidade de colunas cromatográficas, em que cada uma da pluralidade de colunas cromatográficas inclui um meio de interação hidrofóbica. O método pode incluir, em um primeiro estágio, carregar uma quantidade de uma mistura incluindo o anticorpo em uma primeira coluna da pluralidade de colunas, carregar uma quantidade da mistura em uma segunda coluna da pluralidade de colunas através da primeira coluna, e realizar uma etapa de não carregamento incluindo pelo menos um dos processos de lavagem, separação e equilíbrio em uma terceira coluna da pluralidade de colunas; em um segundo estágio, carregar uma quantidade da mistura incluindo o anticorpo na segunda coluna, carregar uma quantidade da mistura na terceira coluna através da segunda coluna e realizar a etapa de não carregamento incluindo pelo menos um de lavagem, separação, e processos de equilíbrio na primeira coluna; e em um terceiro estágio, carregar uma quantidade da mistura incluindo o anticorpo na terceira coluna, carregar uma quantidade da mistura na terceira coluna através da segunda coluna e realizar a etapa de não carregamento incluindo pelo menos um de lavagem, separação e processos de equilíbrio na segunda coluna.

[0010] Em algumas modalidades, o método pode ainda incluir repetir continuamente o primeiro, segundo e terceiro estágios em um ciclo, em que cada estágio inclui realizar as etapas de carregamento e não carregamento simultaneamente. Em algumas modalidades, a duração de uma das etapas de carregamento é configurada para ser aproximadamente a mesma que a duração da etapa de não carregamento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem uma parte deste relatório descritivo, ilustram várias modalidades exemplares e, juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios das modalidades divulgadas. Quaisquer características de uma modalidade ou exemplo aqui descrito (por exemplo, composição, formulação, método, etc.) podem ser combinadas com qualquer outra modalidade ou exemplo, e todas essas combinações são abrangidas pela presente divulgação. Além disso, os sistemas e métodos descritos não são limitados a qualquer aspecto ou modalidade dos mesmos, nem a quaisquer combinações ou permutações de tais aspectos e modalidades. Por uma questão de brevidade, certas permutações e combinações não são discutidas e/ou ilustradas separadamente aqui.

[0012] A FIG. 1 é uma ilustração esquemática que descreve parte de uma zona de um aparelho de cromatografia, de acordo com algumas modalidades da presente divulgação.

[0013] A FIG. 2 é uma representação esquemática de um aparelho de cromatografia, de acordo com algumas modalidades da presente divulgação.

[0014] A FIG. 3A é uma representação gráfica de um método exemplar para preparar um polipeptídeo alvo de acordo com algumas modalidades da presente divulgação; e

[0015] As FIGs. 3B-3D são ilustrações simplificadas que representam um método para a preparação de um polipeptídeo alvo, como mostrado na FIG. 3A.

[0016] A FIG. 4 é uma representação esquemática de um aparelho de cromatografia de acordo com algumas modalidades da presente divulgação.

[0017] A FIG. 5A é uma representação gráfica de um método exemplar para preparar um polipeptídeo alvo de acordo com algumas modalidades da presente divulgação; e

[0018] As FIGs. 5B-5E são ilustrações simplificadas que representam um método para a preparação de um polipeptídeo alvo, como mostrado na FIG. 5A.

[0019] A FIG. 6 é um fluxograma de um método para preparar um polipeptídeo alvo de acordo com algumas modalidades da presente divulgação.

[0020] A FIG. 7A é um gráfico de porcentagens de alto peso molecular em função do carregamento, de acordo com um aspecto da presente divulgação.

[0021] A FIG. 7B é um gráfico da quantidade de proteína da célula hospedeira em função do carregamento, de acordo com um aspecto da presente divulgação.

[0022] A FIG. 7C é um gráfico de porcentagens de alto peso molecular em função da concentração de carregamento, de acordo com um aspecto da presente divulgação.

[0023] A FIG. 8A é um gráfico da produtividade em função de uma série de colunas cromatográficas, de acordo com um aspecto da presente divulgação.

[0024] A FIG. 8B é um gráfico de produtividade em função de uma série de colunas cromatográficas, de acordo com um aspecto da presente divulgação.

[0025] Tal como aqui utilizado, os termos "compreende", "compreendendo" ou qualquer outra variação dos mesmos, destinam-se a cobrir uma inclusão não exclusiva, de modo que um processo, método, artigo ou aparelho que compreende uma lista de elementos não inclui apenas esses elementos, mas pode incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tal processo, método, artigo ou aparelho. O termo "exemplar" é usado no sentido de "exemplo", em vez de "ideal". Para os termos "por exemplo" e "tal como", e equivalências gramaticais dos mesmos, a frase "e sem limitação" é entendida como a seguir, a menos que explicitamente declarado de outra forma.

[0026] Tal como aqui utilizado, o termo "cerca de" se destina a contabilizar as variações devido a erro experimental. Quando aplicado a valores numéricos, o termo "cerca de" pode indicar uma variação de +/- 10% (a menos que uma variação diferente seja especificada) do valor numérico divulgado. Conforme usado aqui, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[0027] Deve-se notar que todos os valores numéricos divulgados aqui (incluindo todos os valores, limites e intervalos divulgados) podem ter uma variação de +/- 10% (a menos que uma variação diferente seja especificada) do valor numérico divulgado. Além disso, nas reivindicações, valores, limites e/ou intervalos significa o valor, limite e/ou intervalo +/- 10%. Da mesma forma, a frase "aproximadamente o mesmo", conforme usada aqui, pode significar equivalente dentro de uma variação de +/- 10%. Além disso, todos os intervalos são entendidos como inclusivos de pontos finais, por exemplo, de 1 centímetro (cm) a 5 cm incluiria comprimentos de 1 cm, 5 cm e todas as distâncias entre 1 cm e 5 cm.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0028] Esta divulgação não está limitada às composições, formulações, fabricante de material, produtos de medicamentos, dispositivos, sistemas, condições experimentais ou métodos específicos aqui divulgados, visto que muitas variações são possíveis dentro do alcance de um versado na técnica. A terminologia usada aqui tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitante.

[0029] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que é comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta divulgação pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente divulgação, métodos particulares são agora descritos. Todas as publicações mencionadas são aqui incorporadas por referência.

[0030] O termo "contatar", conforme usado aqui, refere-se à reunião, união, interface ou outra interação física de duas ou mais superfícies, soluções ou compostos. Embora fluidos específicos possam ser descritos aqui como sendo passados em uma região, passados a partir de uma região, passados para uma região, ou passados através de uma região, entende-se que o fluido necessariamente contataria qualquer região para a qual ele é passado em, a partir de, para, ou através. Da mesma forma, introduzir um fluido ou componente em uma região constituiria o fluido ou componente contatar a região.

[0031] O termo "polipeptídeo", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer polímero de aminoácido com mais de cerca de 20 aminoácidos covalentemente ligados por meio de ligações amida. As proteínas contêm uma ou mais cadeias de polímero de aminoácidos (por exemplo, polipeptídeos). Assim, um polipeptídeo pode ser uma proteína, e uma proteína pode conter vários polipeptídeos para formar uma única biomolécula funcional.

[0032] Modificações pós-tradução podem ainda modificar ou alterar a estrutura de um polipeptídeo. Por exemplo, pontes dissulfeto (por exemplo, ligações S–S entre resíduos de cisteína) podem estar presentes em algumas proteínas. Algumas pontes dissulfeto são essenciais para a estrutura, função e interação adequadas de polipeptídeos, imunoglobulinas, proteínas, cofatores, substratos e semelhantes. Além da formação da ligação dissulfeto, as proteínas podem estar sujeitas a outras modificações pós-tradução. Essas modificações incluem lipidação (por exemplo, miristoilação, palmitoilação, farnesoilação, geranilgeranilação e formação de âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI)), alquilação (por exemplo, metilação), acilação, amidação, glicosilação (por exemplo, adição de grupos glicosil em arginina, asparagina, hidroxilisina, serina, treonina, tirosina e/ou triptofano) e fosforilação (isto é, a adição de um grupo fosfato à serina, treonina, tirosina e/ou histidina). Modificações pós-tradução podem afetar a hidrofobicidade, propriedades eletrostáticas de superfície ou outras propriedades que determinam as interações superfície a superfície das quais participa o polipeptídeo.

[0033] Tal como aqui utilizado, o termo "proteína" inclui proteínas bioterapêuticas, proteínas recombinantes usadas em pesquisa ou terapia, proteínas de armadilha e outras proteínas de fusão Fc, proteínas quiméricas, anticorpos, anticorpos monoclonais, anticorpos humanos, anticorpos biespecíficos, fragmentos de anticorpos, moléculas semelhantes a anticorpos, nanocorpos, quimeras de anticorpos recombinantes, citocinas, quimiocinas, hormônios peptídicos e semelhantes. Uma proteína de interesse (POI) pode incluir qualquer polipeptídeo ou proteína que se deseja ser isolada, purificada ou preparada de outra forma. Os POIs podem incluir polipeptídeos alvo ou outros polipeptídeos produzidos por uma célula, incluindo anticorpos.

[0034] O termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, inclui imunoglobulinas compostas por quatro cadeias polipeptídicas: duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto. Normalmente, os anticorpos têm um peso molecular de mais de 100 kDa, como entre 130 kDa e 200 kDa, como cerca de 140 kDa, 145 kDa, 150 kDa, 155 kDa ou 160 kDa. Cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composto por três CDRs e quatro FRs, arranjados do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDRs de cadeia pesada podem ser abreviados como HCDR1, HCDR2 e HCDR3; CDRs de cadeia leve podem ser abreviados como LCDR1, LCDR2 e LCDR3.

[0035] Uma classe de imunoglobulinas denominada Imunoglobulina G (IgG), por exemplo, é comum no soro humano e compreende quatro cadeias polipeptídicas – duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por meio de uma ligação dissulfeto de cistina e as duas cadeias pesadas estão ligadas entre si por meio de duas ligações dissulfeto de cistina. Outras classes de imunoglobulinas humanas incluem IgA, IgM, IgD e IgE. No caso de IgG, existem quatro subclasses: IgG 1, IgG 2, IgG 3 e IgG 4. Cada subclasse difere em suas regiões constantes e, como resultado, pode ter funções efetoras diferentes. Em algumas modalidades aqui descritas, um POI pode compreender um polipeptídeo alvo incluindo IgG. Em pelo menos uma modalidade, o polipeptídeo alvo compreende IgG

4.

[0036] O termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, também inclui fragmentos de ligação ao antígeno de moléculas de anticorpo completas. Os termos "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo e semelhantes, tal como aqui utilizados, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, obtido por enzima, sintético ou geneticamente modificado que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Os fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo completas usando quaisquer técnicas padrão adequadas, tais como digestão proteolítica ou técnicas de engenharia genética recombinante envolvendo a manipulação e expressão de DNA que codifica o anticorpo variável e opcionalmente domínios constantes. Tal DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível a partir de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fago-anticorpo), ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou usando técnicas de biologia molecular, por exemplo, para organizar um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou excluir aminoácidos etc.

[0037] Os polipeptídeos alvo podem ser produzidos usando sistemas de produção baseados em células recombinantes, tais como o sistema de bacculovírus de inseto, sistemas de levedura (por exemplo, Pichia sp.), sistemas de mamíferos (por exemplo, células CHO e derivadas de CHO como células CHO-K1). O termo "célula" inclui qualquer célula que seja adequada para expressar uma sequência de ácido nucleico recombinante. As células incluem aquelas de procariotos e eucariotos (célula única ou células múltiplas), células bacterianas (por exemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobactérias, células de fungos, células de levedura (por exemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetais, células de inseto (por exemplo, SF-9, SF-21, células de inseto infectadas com bacculovírus, Trichoplusiani, etc.), células de animais não-humanos, células humanas ou fusões de células, como, por exemplo, hibridomas ou quadromas. Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana, de macaco, símio, hamster, rato ou camundongo. Em algumas modalidades, a célula é eucariótica e é selecionada a partir das seguintes células: CHO (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie- CHO), COS (por exemplo, COS-7), célula retinal, Vero, CV1, rim (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por exemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmico), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral e uma linha celular derivada de uma célula acima mencionada. Em algumas modalidades, a célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo, uma célula retinal que expressa um gene viral (por exemplo, uma célula PER.C6™). Uma proteína ou polipeptídeo diferente do polipeptídeo alvo ou POIs produzidos pela célula pode ser referido como uma proteína da célula hospedeira (HCP). Quando um POI é fabricado em e/ou purificado a partir de células hospedeiras, os HCPs podem ser caracterizados como contaminantes ou impurezas relacionados ao produto e ao processo.

[0038] Alguns HCPs (por exemplo, enzimas) podem copurificar com POIs (por exemplo, polipeptídeos alvo) e podem afetar componentes das misturas, formulações ou medicamentos, incluindo os POIs. Por exemplo, a presença de alguns HCPs pode afetar a estabilidade do produto, reduzir a vida útil de um medicamento ou mesmo resultar na falha do produto em atender às especificações compendiais ou regulatórias de matéria particulada (por exemplo, especificações da Food & Drug Administration dos EUA). Como outro exemplo, alguns HCPs podem causar efeitos clínicos, como uma reação imunogênica após a administração. Embora HIC ou outra cromatografia, sozinha ou em combinação, possa ser usada para purificar e/ou separar um POI e remover HCPs de uma mistura, formulação ou medicamento, reduzindo assim os efeitos potenciais dos HCPs em um medicamento, a adição de uma etapa de cromatografia de afinidade ou HIC requer a adição de equipamentos, materiais (por exemplo, meio de interação hidrofóbica), e preparação. Isso significa tempo, recursos, experimentação e custos adicionais. Portanto, é desejável ter um método eficiente de conduzir um processo de cromatografia para separar um POI (por exemplo, polipeptídeo alvo) de um ou mais HCPs copurificados ou outras impurezas.

[0039] O termo "cromatografia", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer processo que separa os componentes de uma mistura passando a mistura através de um meio de modo que os componentes da mistura passem através do meio em taxas diferentes, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia em coluna, cromatografia plana, cromatografia em camada fina, cromatografia de deslocamento, cromatografia gasosa, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de fase reversa, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia líquida de proteína rápida, cromatografia líquida de alto desempenho, cromatografia em contracorrente, cromatografia em contracorrente periódica, ou cromatografia quiral. Embora as modalidades aqui possam ser divulgadas com respeito a um tipo exemplar de processo de cromatografia (por exemplo, HIC) ou aparelho, as modalidades aqui divulgadas podem ser aplicáveis a qualquer tipo de cromatografia.

[0040] Tal como aqui utilizado, o termo "água" pode se referir a qualquer tipo adequado de água de grau de laboratório, como água deionizada ou água para injeção. Em algumas modalidades, por exemplo, os aparelhos de cromatografia podem ser colocados em contato com água deionizada ou água para injeção. Qualquer referência ao uso de "água" aqui pode referir-se a água deionizada, água para injeção ou outro tipo de água de grau laboratorial.

[0041] Tal como utilizado na presente divulgação, o termo "fase móvel" pode se referir a qualquer fluido adequado para contatar uma zona ou coluna de cromatografia como parte de um processo de separação ou purificação. Uma fase móvel pode incluir, por exemplo, água, uma solução tampão, uma solução ácida, uma solução alcalina e/ou uma solução compreendendo álcool. Os termos "tampão de lavagem", "tampão de separação" e "tampão de equilíbrio" podem ser usados para descrever fases móveis com características particulares, conforme descrito mais adiante aqui.

[0042] Em algumas modalidades, um método para preparar um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura incluindo o polipeptídeo alvo pode compreender contatar a mistura com um aparelho de cromatografia. O aparelho de cromatografia pode compreender uma pluralidade de zonas onde cada zona inclui uma ou mais colunas cromatográficas, onde uma ou mais colunas cromatográficas compreendem meios de interação hidrofóbica. Esses aparelhos de cromatografia podem incluir aparelhos pré- fabricados (por exemplo, Cadence™ BioSMB (Pall Biosciences), BioSC® (novasep), Varicol® (novasep) ou Octave (Semba® Biosciences)), aparelhos montados à mão, ou apenas dois ou mais aparelhos de cromatografia em batelada padrão usados em conjunto.

[0043] Aspectos da presente divulgação podem fornecer vários benefícios ao processo de preparação de um polipeptídeo alvo ou outra molécula. Por exemplo, o uso simultâneo de zonas múltiplas em um aparelho de cromatografia pode permitir um carregamento mais eficiente e completo de colunas individuais e/ou o desempenho de processos de separação com o uso de menos meios cromatográficos do que em um processo de cromatografia padrão. Benefícios e vantagens adicionais de aspectos da presente divulgação serão evidentes para aqueles versados na técnica.

[0044] Agora será feita referência aos desenhos da presente divulgação.

[0045] A FIG. 1 representa uma seção 100 de uma coluna cromatográfica de um aparelho de HIC, de acordo com algumas modalidades da presente divulgação. A coluna cromatográfica compreende meios de interação hidrofóbica. Os meios de interação hidrofóbica compreendem uma estrutura de suporte 110 e uma fração hidrofóbica 120, em que a fração hidrofóbica 120 é afixada à estrutura de suporte 110. O meio pode estar na forma de meio de cromatografia, por exemplo, grânulos ou outras partículas mantidas em um formato de coluna de leito empacotado, na forma de uma membrana, ou em qualquer formato que possa acomodar uma mistura ou outro líquido compreendendo um polipeptídeo alvo (ou outro POI) e contaminantes (por exemplo, HCPs). Assim, os meios de interação hidrofóbica de exemplo podem incluir grânulos de agarose (por exemplo, sepharose), grânulos de sílica, membranas celulósicas, grânulos celulósicos, grânulos de polímero hidrofílico e semelhantes.

[0046] Uma coluna cromatográfica de um aparelho de HIC da presente divulgação pode ser configurada de modo que o meio de interação hidrofóbica tenha uma profundidade (por exemplo, altura de leito) de cerca de 0,5 centímetros (cm) a cerca de 40 cm. Em algumas modalidades, por exemplo, a coluna cromatográfica de um aparelho de HIC pode ter uma altura de leito de cerca de 0,5 cm a cerca de 30 cm, de cerca de 0,5 cm a cerca de 20 cm, de cerca de 0,5 cm a cerca de 10 cm, de cerca de 0,5 cm a cerca de 5 cm, de cerca de 1 cm a 20 cm, de cerca de 1 cm a cerca de 10 cm, ou de cerca de 1 cm a cerca de 5 cm. Em algumas modalidades, uma coluna cromatográfica pode ser configurada de modo que o diâmetro interno da coluna cromatográfica seja de cerca de 0,5 cm a cerca de 150 cm. Em algumas modalidades, por exemplo, o diâmetro interno da coluna cromatográfica é de cerca de 0,5 cm a cerca de 140 cm, cerca de 0,5 cm a cerca de 120 cm, cerca de 0,5 cm a cerca de 100 cm, cerca de 0,5 cm a cerca de 80 cm, cerca de 0,5 cm a cerca de 60 cm, cerca de

0,5 cm a cerca de 40 cm, cerca de 0,5 cm a cerca de 20 cm, cerca de 0,5 cm a cerca de 10 cm, cerca de 0,75 cm a cerca de 8 cm, cerca de 1 cm a cerca de 6 cm, cerca de 1 cm a cerca de 5 cm, cerca de 1 cm a cerca de 3 cm, cerca de 1,5 cm a cerca de 5 cm, cerca de 1,5 cm a cerca de 3 cm, ou cerca de 1 cm a cerca de 2 cm. Por exemplo, em algumas modalidades, o diâmetro interno da coluna cromatográfica é de cerca de 0,5 cm, cerca de 1 cm, cerca de 5 cm, cerca de 8 cm, cerca de 10 cm, cerca de 15 cm, cerca de 20 cm, cerca de 30 cm, cerca de 40 cm, cerca de 50 cm, cerca de 60 cm, cerca de 80 cm, cerca de 100 cm, cerca de 125 cm ou cerca de 150 cm. Em algumas modalidades, uma coluna cromatográfica de um aparelho de HIC de acordo com a presente divulgação tem um volume total (por exemplo, capacidade total para reter uma mistura, fase móvel ou outra substância) de cerca de 0,4 mililitros (mL) a cerca de 175 L. Em algumas modalidades, por exemplo, uma coluna cromatográfica de um aparelho de HIC de acordo com a presente divulgação tem um volume total de cerca de 0,5 mL a cerca de 150 L, de cerca de 0,5 mL a cerca de 130 L, de cerca de 0,5 mL a cerca de 115 L, de cerca de 0,5 mL a cerca de 100 L, de cerca de 0,5 mL a cerca de 80 L, de cerca de 0,5 mL a cerca de 60 L, de cerca de 0,5 mL a cerca de 40 L, de cerca de 0,5 mL a cerca de 20 L, de cerca de 0,5 mL a cerca de 15 L, de cerca de 0,5 mL a cerca de 10 L, de cerca de 0,5 mL a cerca de 5 L, de cerca de 0,5 mL a cerca de 1 L, de cerca de 1 mL a cerca de 750 mL, de cerca de 1 mL a cerca de 600 mL, de cerca de 1 mL a cerca de 500 mL, de cerca de 1 mL a cerca de 300 mL, de cerca de 1 mL a cerca de 250 mL, de cerca de 1 mL a cerca de 200 mL ou de cerca de 1 mL a cerca de 150 mL. Por exemplo, em algumas modalidades, uma coluna cromatográfica de acordo com a presente divulgação pode ter um volume total de cerca de 0,5 mL, cerca de 1 mL, cerca de 5 mL, cerca de 10 mL, cerca de 50 mL, cerca de 100 mL, cerca de 150 mL, cerca de 300 mL, cerca de 400 mL, cerca de 500 mL, cerca de 1 L, cerca de 5 L, cerca de 10 L, cerca de 50 L, cerca de 80 L, cerca de 100 L, cerca de 120 L, ou cerca de 150 L.

[0047] Em algumas modalidades, a fração hidrofóbica 120 se liga a regiões hidrofóbicas e superfícies hidrofóbicas de polipeptídeos. As superfícies hidrofóbicas podem fazer parte da estrutura dos aminoácidos que compõem os peptídeos, uma modificação acima mencionada ou outra modificação pós-tradução, ou uma combinação das mesmas. O grau de hidrofobicidade do meio de interação hidrofóbica pode ser controlado selecionando uma fração hidrofóbica apropriada 120. A fração hidrofóbica 120 pode ser selecionada para se ligar a um polipeptídeo alvo particular ou POI, e pode ser qualquer fração hidrofóbica agora conhecida ou desenvolvida no futuro. Em algumas modalidades, a porção hidrofóbica 120 pode incluir um grupo metil, propil, isopropil, butil, hexil, octil, e/ou fenil. Os versados na técnica apreciarão que a hidrofobicidade da fração hidrofóbica selecionada 120 pode variar com base nos polipeptídeos alvo e/ou HCPs/outras impurezas da aplicação dada, bem como o tipo e grau de separação ou purificação desejada a partir do processo de cromatografia.

[0048] O meio de interação hidrofóbica pode ser empregado para separar polipeptídeos alvo ou outros POIs de contaminantes e impurezas relacionadas ao produto e processo (por exemplo, HCPs). Ainda com referência à FIG. 1, em algumas modalidades, uma mistura contendo polipeptídeo alvo 140 e outros componentes, tais como contaminantes 130 (por exemplo, impurezas, HCPs ou semelhantes) são carregados em um aparelho de HIC. A mistura pode incluir uma solução (por exemplo, um tampão) projetada para promover a ligação de grupos hidrofóbicos no polipeptídeo alvo 140 à fração hidrofóbica 120 do meio de interação hidrofóbica. Algum polipeptídeo alvo 140 adere ao meio ligando-se por meio de força intramolecular à fração hidrofóbica 120, enquanto outro polipeptídeo alvo 140 pode passar através da coluna cromatográfica. Adicionalmente ou alternativamente, enquanto a mistura passa através de uma coluna, alguns contaminantes 130 da mistura podem aderir ao meio de interação hidrofóbica ligando-se por meio de força intramolecular à porção hidrofóbica 120, enquanto outros contaminantes 130 não conseguem se ligar à porção hidrofóbica 120. Em algumas modalidades, o polipeptídeo alvo 140 contém certas regiões hidrofóbicas dos aminoácidos constituintes, modificações pós-tradução, ou combinação dos mesmos que permitem que ele se afixe à fração hidrofóbica 120 com uma afinidade maior do que certos contaminantes ou impurezas (por exemplo, HCPs). Conforme descrito em mais detalhes posteriormente, fases móveis adicionais podem então ser introduzidas na coluna para diminuir a afinidade entre o polipeptídeo alvo 140 e a fração hidrofóbica 120, permitindo que o polipeptídeo alvo 140 passe através da coluna cromatográfica do aparelho de HIC.

[0049] Em outras modalidades, os contaminantes 130 podem afixar à fração hidrofóbica 120 com uma afinidade maior do que o polipeptídeo alvo 140. Fases móveis adicionais podem então ser introduzidas na coluna para diminuir a afinidade entre os contaminantes 130 e a fração hidrofóbica 120, permitindo que os contaminantes 130 passem através da coluna cromatográfica do aparelho de HIC.

[0050] A composição da mistura incluindo o polipeptídeo alvo 140 pode ser alterada pela adição de um aditivo incluindo um sal tal como, por exemplo, sódio, potássio, fosfato, tris(hidroxmetil)aminometano (Tris), citrato ou acetato. Outros aditivos podem ser adicionados para alterar as interações hidrofóbicas ou outras interações intramoleculares do polipeptídeo alvo 140, Contaminantes 130, fração hidrofóbica 120, ou combinações dos mesmos.

[0051] Um aparelho de HIC exemplar 200 é esquematicamente representado na FIG. 2, de acordo com algumas modalidades aqui descritas. O aparelho de HIC 200 pode compreender uma primeira zona 210, uma segunda zona 220 e uma terceira zona 230. Cada uma da primeira zona 210, segunda zona 220 e terceira zona 230 pode incluir uma ou mais colunas cromatográficas, como as colunas cromatográficas descritas em relação à FIG. 1. A primeira zona 210 pode ter uma primeira entrada 212 configurada de modo que uma mistura incluindo um polipeptídeo alvo, uma ou mais fases móveis ou outros líquidos podem ser passados para a primeira zona 210. A primeira zona 210 também pode ter uma primeira saída 214 através da qual o efluente (por exemplo, fluido que passou através da primeira zona 210) pode ser passado do aparelho de HIC 200 para ser coletado ou descartado. O efluente também pode ser passado da primeira zona 210 para a segunda zona 220 através de uma primeira interconexão 216. A primeira zona 210 também pode receber efluente da terceira zona 230 através de uma terceira interconexão 236.

[0052] A segunda zona 220 pode receber efluente da primeira zona 210 através da primeira interconexão 216. A segunda zona 220 também pode ter uma segunda entrada 222 configurada de modo que uma mistura incluindo um polipeptídeo alvo, uma ou mais fases móveis ou outros líquidos podem ser passados para a segunda zona 220. A segunda zona 220 também pode ter uma segunda saída 224 através da qual o efluente (por exemplo, fluido que passou através da segunda zona 220) pode ser passado do aparelho de HIC 200 para ser coletado ou descartado. O efluente também pode ser passado da segunda zona 220 para a terceira zona 230 através de uma segunda interconexão 226.

[0053] A terceira zona 230 pode receber efluente da segunda zona 220 por meio da segunda interconexão 226. A terceira zona 230 pode ter uma terceira entrada 232 configurada de modo que uma mistura incluindo um polipeptídeo alvo, uma ou mais fases móveis ou outros líquidos podem ser passados para a terceira zona 230. A terceira zona 230 também pode ter uma saída 234 através da qual efluente (por exemplo, fluido que passou através da terceira zona 230) pode ser passado do aparelho de HIC 200 para ser coletado ou descartado. O efluente também pode ser passado da terceira zona 230 para a primeira zona 220 através de uma terceira interconexão 236.

[0054] Como aqueles versados na técnica entenderiam, vários componentes conhecidos por serem usados em aparelhos cromatográficos (por exemplo, filtros, sensores, medidores, termômetros) podem ser incorporados ao aparelho de HIC 200, embora não sejam mostrados no esquema simplificado da FIG. 2. Em algumas modalidades, um ou mais de uma absorção de UV, condutividade elétrica ou pH de uma solução residente podem ser medidos em um ou mais pontos no aparelho de HIC

200. Os pontos adequados para medir a absorção de UV, condutividade elétrica ou pH incluem uma entrada 212, 222, 232, dentro de uma zona 210, 220, 230, uma interconexão 216, 226, 236 ou uma saída 214, 224, 234. Entradas 212, 222, 232, interconexões 216, 226, 236, e as saídas 214, 224, 234 podem ser operáveis para se mover de uma configuração aberta para uma configuração fechada: uma configuração aberta que permite que um fluido passe através da entrada 212, 222, 232, interconexão 216, 226, 236 ou saída 214, 224, 234 e uma configuração fechada impedindo um fluido de passar através da entrada 212, 222, 232, interconexão 216,

226, 236 ou saída 214, 224, 234. Um aparelho de HIC 200 pode incluir uma ou mais bombas que fornecem pressão para transmitir fluido entre as zonas 210, 220, 230, entradas 212, 222, 232, interconexões 216, 226, 236 e saídas 214, 22 4, 234. Em algumas modalidades, uma ou mais interconexões 216, 226, 236 podem ser movidas para unir diferentes zonas 210, 220, 230. Por exemplo, durante um processo usando o aparelho de HIC 200 pode ser desejável reorganizar onde a interconexão 226 passa efluente a partir da zona 220. Nessas situações, a interconexão 226 pode ser reconfigurada, sem interromper o processo cromatográfico, para passar o efluente a partir da zona 220 para a zona 210. Este é apenas um exemplo; em geral, qualquer interconexão 216, 226, 236 pode ser reconfigurada para conectar diferentes zonas sem interromper um processo cromatográfico em andamento.

[0055] A FIG. 3A é uma representação gráfica de um método de acordo com algumas modalidades da presente divulgação. No eixo esquerdo do gráfico, três linhas separadas são definidas pelos rótulos C1, C2 e C3, representando uma primeira coluna, uma segunda coluna e uma terceira coluna de um aparelho de HIC. O eixo superior representa o tempo, estendendo-se indefinidamente à esquerda e à direita. A ocupação contínua de cada coluna é um exemplo das modalidades aqui descritas; este arranjo reduz ou elimina o tempo ocioso para colunas (por exemplo, "tempo morto") em comparação com métodos convencionais de HIC. O segmento de tempo mostrado na totalidade na FIG. 3A representa um ciclo exemplar de um padrão de repetição, que pode se repetir antes e/ou depois do segmento de tempo mostrado na FIG. 3A. Quatro tempos são rotulados como T1, T2, T3 e T4 e são exemplos de qualquer linha T0 que pode ser desenhada verticalmente através do gráfico. Em algumas modalidades, o intervalo entre T1 e T2 é substancialmente o mesmo que o intervalo entre T2 e T3 que, em algumas modalidades, é substancialmente o mesmo que o intervalo entre T3 e T4. Em algumas modalidades, o intervalo entre tempos marcados adjacentes (por exemplo, entre T1 e T2 ou entre T3 e T4) pode ser maior ou igual a 30 segundos (s), menor ou igual a 90 minutos (min), 30 s a 60 min, 30 s a 30 min, 30 s a 15 min, 30 s a 10 min, 30 s a 8 min, 30 s a 7 min, 30 s a 6 min, 30 s a 5 min, 30 s a 4 min, 30 s a 3 min, 1 min a 5 min ou 2 min a 5 min. As caixas 410, 412,

414, 415, 417, 419, 424, 420, 422, 424, 425, 427, 429, 430, 432, 434, 435, 437 e 439 representam um evento que ocorre dentro de cada coluna, C1, C2 e C3 no intervalo de tempo em que cada caixa aparece. Por exemplo, cada caixa pode representar a presença de uma mistura, uma fase móvel ou outro líquido residente na linha da coluna em que aparece.

[0056] Movendo-se através da FIG. 3A da esquerda para a direita, progredindo "para a frente" no tempo, de T1 a T2, uma carga secundária da mistura pode estar na primeira coluna C1 (caixa 410). De T2 a T3, uma carga primária da mistura pode estar na primeira coluna C1 (caixa 412), e de T3 a T4, uma ou mais fases móveis podem estar na primeira coluna C1 (caixa 414). Em algumas modalidades, uma coluna pode receber uma carga primária da mistura ou uma carga secundária da mistura. Uma "carga primária" da mistura refere-se a uma carga da mistura passada por uma coluna do aparelho de HIC sem ter passado primeiro por outra coluna do aparelho de HIC anteriormente. Uma "carga secundária" da mistura se refere a uma carga da mistura passada por outra coluna do aparelho de HIC antes de ser introduzida em uma determinada coluna (por exemplo, um efluente de uma carga primária da mistura é introduzido em outra coluna como um carga secundária da mistura). A passagem de um efluente de uma coluna para outra com o efluente incluindo o peptídeo alvo pode permitir que uma coluna seja totalmente carregada sem a preocupação de desperdício de transbordamento e pode aumentar a eficiência do uso de cada coluna e pode reduzir o volume de meio de interação hidrofóbica consumido. Ao passar o transbordamento sobre o meio de interação hidrofóbica que pode ter recebido ou pode receber uma carga primária de mistura incluindo o polipeptídeo alvo, o volume do meio de interação hidrofóbica consumido em relação à quantidade de mistura de carga processada pode ser reduzido.

[0057] Em algumas modalidades, o contato de uma ou mais fases móveis com uma coluna pode incluir o contato de um tampão de lavagem com a coluna, o contato de um tampão de separação com a coluna e/ou o contato de um tampão de equilíbrio com a coluna. Em algumas modalidades, um tampão de lavagem pode compreender um ou mais sais, como, por exemplo, sódio, potássio, magnésio, cálcio, citrato,

acetato, fosfato, sulfato, Tris, ou outro sal.

[0058] Em algumas modalidades, um tampão de separação pode compreender água, uma solução alcalina ou uma solução que compreende álcool. Água deionizada, por exemplo, pode ter menos de 5 por cento em volume (% em volume) de íons dissolvidos, menos de 1% em volume de íons dissolvidos, menos de 0,1% em volume de íons dissolvidos ou mesmo menos de 0,01% em volume de íons dissolvidos. De acordo com algumas modalidades, uma solução alcalina pode compreender um ou mais compostos iônicos alcalinos, como LiOH, NaOH, KOH, Ca(OH)2, NH4OH ou outro composto alcalino. A concentração de composto alcalino no tampão de separação pode variar, por exemplo, de cerca de 0,1 N a cerca de 1,5 N, de cerca de 0,1 N a cerca de 1 N, de cerca de 0,1 N a cerca de 1,5 N, de cerca de 0,5 N a cerca de 1,5 N, de cerca de 0,1 N a cerca de 0,8 N, de cerca de 0,1 N a cerca de 0,6 N, de cerca de 0,1 N a cerca de 0,5 N, de cerca de 0,1 N a cerca de 0,4 N, ou de cerca de 0,1 N a cerca de 0,3 N. Por exemplo, a concentração do composto alcalino no tampão de separação pode ser cerca de 0,1 N, cerca de 0,2 N, cerca de 0,3 N, cerca de 0,4 N, cerca de 0,5 N, cerca de 0,6 N, cerca de 0,7 N, cerca de 0,8 N, cerca de 0,9 N, cerca de 1 N, cerca de 1,1 N, cerca de 1,2 N, cerca de 1,3 N, cerca de 1,4 N, ou cerca de 1,5 N. Um tampão de separação compreendendo álcool pode incluir metanol, etanol, propanol, álcool benzílico ou outro álcool. A concentração de álcool no tampão de separação pode variar de cerca de 0,1% em volume a cerca de 30% em volume, tal como de cerca de 0,5% em volume a cerca de 30% em volume, de cerca de 0,5% em volume a cerca de 25% em volume, de cerca de 0,5% em volume a cerca de 25% em volume, de cerca de 0,5% em volume a cerca de 25% em volume, de cerca de 1% em volume a cerca de 20% em volume, de cerca de 1% em volume cerca de 15% em volume, de cerca de 1% em volume a cerca de 10% em volume, de cerca de 10% em volume a cerca de 50% em volume, de cerca de 10% em volume a cerca de 40% em volume, de cerca de 10% em volume a cerca de 30% em volume, de cerca de 10% em volume a cerca de 25% em volume, de cerca de 15% em volume a cerca de 25% em volume, ou de cerca de 20% em volume a cerca de 25% em volume, com base no peso total do tampão de separação. Por exemplo, a concentração de álcool no tampão de separação pode ser de cerca de 0,1% em volume, cerca de 0,5% em volume, cerca de 1% em volume, cerca de 2% em volume, cerca de 3% em volume, cerca de 5% em volume, cerca de 10% em volume, cerca de 15% em volume, cerca de 20% em volume, ou cerca de 25% em volume.

[0059] Em algumas modalidades, um tampão de equilíbrio pode ser semelhante ou idêntico em composição ao tampão de lavagem. Em outras modalidades, o tampão de equilíbrio pode variar em composição em comparação com o tampão de lavagem. Em algumas modalidades, o tampão de equilíbrio pode compreender um ou mais sais, como, por exemplo, sódio, potássio, magnésio, cálcio, citrato, acetato, fosfato, sulfato, Tris, ou outro sal.

[0060] Com referência à FIG. 3A, contatar uma ou mais fases móveis na primeira coluna 414 pode ser dividido em fases separadas, incluindo um tampão de lavagem na primeira coluna (caixa 415), um tampão de separação na primeira coluna (caixa 417) e um tampão de equilíbrio na primeira coluna (caixa 419). Na próxima linha (representando C2), de T1 a T2, uma ou mais fases móveis podem estar na segunda coluna (caixa 424). Isso também pode ser dividido em fases separadas, incluindo um tampão de lavagem na segunda coluna (caixa 425), um tampão de separação na segunda coluna (caixa 427) e um tampão de equilíbrio na segunda coluna (caixa 429). Movendo para a direita, de T2 a T3 uma carga secundária de uma mistura pode estar na segunda coluna (caixa 420), e de T3 a T4 uma carga primária da mistura pode estar na segunda coluna (caixa 422).

[0061] Na próxima linha, de T1 a T2 uma carga primária da mistura pode estar na terceira coluna (caixa 432). Em seguida, de T2 a T3, uma ou mais fases móveis podem estar na terceira coluna (caixa 434), e de T3 a T4 uma carga secundária da mistura pode estar na terceira coluna (caixa 430). As uma ou mais fases móveis na terceira coluna (caixa 434) podem ser divididas em fases separadas, incluindo um tampão de lavagem na terceira coluna (caixa 435), um tampão de separação na terceira coluna (caixa 437) e um tampão de equilíbrio na terceira coluna (caixa 439).

[0062] Em um determinado momento T0, uma linha vertical pode ser desenhada através do gráfico de modo que cada caixa numerada contatada pela linha vertical de

T0 represente uma solução em uma coluna naquele momento. Assim, por exemplo, no tempo T1, a mistura de carga secundária está sendo introduzida na primeira coluna C1 (caixa 410), uma ou mais fases móveis estão sendo passadas para a segunda coluna C2 (caixa 424), tal como um tampão de lavagem sendo passado para C2 (caixa 425), e uma mistura de carga primária está sendo passada para a terceira coluna C3 (caixa 432). Embora subdivisões de fases mais amplas, como, por exemplo, subdivisões 425, 427 e 429, pareçam ocupar porções iguais de uma ou mais fases móveis na segunda coluna 424, em algumas modalidades, as subdivisões podem ocupar porções desiguais da fase mais ampla. Também deve ser entendido que o método representado na FIG. 3A é apenas uma progressão exemplar de acordo com modalidades da presente divulgação. Outras ordens, configurações e etapas são contempladas e consideradas dentro do escopo da presente divulgação.

[0063] As FIGs. 3B-3D ilustram um ciclo exemplar para um método para preparar um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura incluindo o polipeptídeo alvo como descrito anteriormente. A FIG. 3B representa uma série de eventos que podem ocorrer durante o intervalo de tempo T1 a T2 da FIG. 3A. Assim, a FIG. 3B mostra um aparelho de HIC em um primeiro estágio 301, onde uma primeira zona 310 está recebendo uma carga secundária de uma mistura 306 incluindo um polipeptídeo alvo e eluindo um efluente da carga secundária 307 que pode ser coletado ou descartado. Uma segunda zona 320 está recebendo uma ou mais fases móveis 315 e eluindo um efluente de uma ou mais fases móveis 316 que pode ser coletado ou descartado. Uma terceira zona 330 está recebendo uma carga primária de uma mistura 305 e passando uma carga secundária de uma mistura 306 para outra coluna.

[0064] A FIG. 3C mostra um aparelho de HIC em um segundo estágio 302 (ao longo de um intervalo T2 a T3, como mostrado na FIG. 3A), onde uma primeira zona 310 está recebendo uma carga primária de uma mistura 305 e passando uma carga secundária de uma mistura 306 para outra coluna. Uma segunda zona 320 está recebendo uma carga secundária de uma mistura 306 e eluindo um efluente da carga secundária 307 que pode ser coletado ou descartado. Uma terceira zona 330 está recebendo uma ou mais fases móveis 315 e eluindo um efluente de uma ou mais fases móveis 316 que pode ser coletado ou descartado.

[0065] A FIG. 3D mostra um aparelho de HIC em um terceiro estágio 303 (ao longo de um intervalo T3 a T4, como mostrado na FIG. 3A), onde uma primeira zona 310 está recebendo uma ou mais fases móveis 315 e eluindo um efluente de uma ou mais fases móveis 316 que podem ser coletados ou descartados. Uma segunda zona 320 está recebendo uma carga primária de uma mistura 305 e passando uma segunda carga de uma mistura 306 para outra coluna. Uma terceira zona 330 está recebendo uma ou mais fases móveis 315 e eluindo um efluente de uma ou mais fases móveis 316 que pode ser coletado ou descartado.

[0066] Outro aparelho de HIC exemplar 500 é esquematicamente representado na FIG. 4, de acordo com algumas modalidades aqui descritas. O aparelho de HIC 500 pode incluir uma primeira zona 510, uma segunda zona 520, uma terceira zona 530 e uma quarta zona 540. A primeira zona 510 pode ter uma primeira entrada 512 configurada de modo que uma mistura incluindo um polipeptídeo alvo, uma ou mais fases móveis ou outros líquidos podem ser passados para a primeira zona 510. A primeira zona 510 também pode ter uma primeira saída 514 através da qual o efluente (por exemplo, fluido que passou através da primeira zona 510) pode ser passado do aparelho de HIC 500 a ser coletado ou descartado. O efluente também pode ser passado da primeira zona 510 para a segunda zona 520 através de uma primeira interconexão 516. A primeira zona 510 pode também receber efluente da quarta zona 540 através de uma quarta interconexão 546.

[0067] A segunda zona 520 pode receber efluente da primeira zona 510 através da primeira interconexão 516. A segunda zona 520 também pode ter uma segunda entrada 522 configurada de modo que uma mistura incluindo um polipeptídeo alvo, uma ou mais fases móveis ou outros líquidos podem ser passados para a segunda zona 520. A segunda zona 520 também pode ter uma segunda saída 524 através da qual efluente (por exemplo, fluido que passou através da segunda zona 520) pode ser passado do aparelho de HIC 500 para ser coletado ou descartado. O efluente também pode ser passado da segunda zona 520 para a terceira zona 530 através de uma segunda interconexão 526.

[0068] A terceira zona 530 pode receber efluente da segunda zona 520 através da segunda interconexão 526. A terceira zona 530 pode ter uma terceira entrada 532 configurada de modo que uma mistura incluindo um polipeptídeo alvo, uma ou mais fases móveis ou outros líquidos podem ser passados para a terceira zona 530. A terceira zona 530 também pode ter uma saída 534 através da qual efluente (por exemplo, fluido que passou através da terceira zona 530) pode ser passado do aparelho de HIC 500 para ser coletado ou descartado. O efluente também pode ser passado da terceira zona 530 para a quarta zona 520 por meio de uma terceira interconexão 536.

[0069] A quarta zona 540 pode receber efluente da terceira zona 530 através da terceira interconexão 536. A quarta zona 540 pode ter uma quarta entrada 542 configurada de modo que uma mistura incluindo um polipeptídeo alvo, uma ou mais fases móveis ou outros líquidos podem ser passados para a quarta zona 540. A quarta zona 540 também pode ter uma saída 544 através da qual efluente (por exemplo, fluido que passou através da quarta zona 540) pode ser passado do aparelho de HIC 500 para ser coletado ou descartado. O efluente também pode ser passado da quarta zona 540 para a primeira zona 510 através de uma quarta interconexão 546.

[0070] Vários componentes conhecidos por serem usados em aparelhos cromatográficos (por exemplo, filtros, sensores, medidores, termômetros) podem ser incorporados em um aparelho de HIC 500, embora não seja mostrado no esquema simplificado da FIG. 4. Em algumas modalidades, um ou mais de uma absorção de UV, condutividade elétrica ou pH de uma solução residente podem ser medidos em um ou mais pontos no aparelho de HIC 500. Os pontos adequados para medir a absorção de UV, condutividade elétrica ou pH incluem uma entrada 512, 522, 532, 542 dentro de uma zona 510, 520, 530, 540, uma interconexão 516, 526, 536, 546 ou uma saída 514, 524, 534, 544. As entradas 512, 522, 532, 542 as interconexões 516, 526, 536, 546 e as saídas 514, 524, 534, 544 podem ser operáveis para se mover de uma configuração aberta para uma configuração fechada: uma configuração aberta que permite que um fluido passe através da entrada 512, 522, 532, 542, interconexão 516, 526, 536, 546 ou saída 514, 524, 534, 544, e uma configuração fechada que não permite que um fluido passe através da entrada 512, 522, 532, 542, interconexão 516, 526, 536, 546 ou saída 514, 524, 534, 544. Um aparelho de HIC 500 pode incluir uma ou mais bombas que fornecem pressão para transmitir fluido entre as zonas 510, 520, 530, 540, entradas 512, 522, 532, 542, interconexões 516, 526, 536, 546 e saídas 514, 524, 534, 544. Em algumas modalidades, uma ou mais interconexões 516, 526, 536, 546 podem ser movidas para unir diferentes zonas 510, 520, 530, 540. Por exemplo, durante um ou mais processos cromatográficos usando o aparelho de HIC 500, pode ser desejável reorganizar onde a interconexão 536 passa efluente a partir da zona 530. Nessas situações, a interconexão 536 pode ser reconfigurada, sem interromper o processo cromatográfico, para passar o efluente da zona 530 para a zona 520. Este é apenas um exemplo e, em geral, qualquer interconexão 516, 526, 536, 546 pode ser reconfigurada para conectar diferentes zonas 510, 520, 530, 540 sem interromper um processo cromatográfico em andamento.

[0071] A FIG. 5A é uma representação gráfica de um ou mais métodos de acordo com a presente divulgação. No eixo esquerdo do gráfico, quatro linhas separadas são definidas pelos rótulos C1, C2, C3 e C4 representando uma primeira coluna, uma segunda coluna, uma terceira coluna e uma quarta coluna de um aparelho de HIC. O eixo superior representa o tempo, estendendo-se indefinidamente à esquerda e à direita. A ocupação contínua de cada coluna é um exemplo de modalidades aqui descritas, este arranjo reduz ou elimina o tempo ocioso para colunas (por exemplo, "tempo morto") em comparação com os métodos convencionais de HIC. O segmento de tempo mostrado representa um ciclo de um padrão de repetição, compreendendo- se que o padrão de caixas numeradas, descrito abaixo, pode se repetir em ambos os lados do segmento mostrado na FIG. 5A. Cinco tempos são rotulados como T1, T2, T3, T4 e T5 e são exemplos de qualquer linha T0 que pode ser desenhada verticalmente através do gráfico. Em algumas modalidades, o intervalo entre T1 e T2 pode ser substancialmente o mesmo que o intervalo entre T2 e T3 que, em algumas modalidades, pode ser substancialmente o mesmo que o intervalo entre T3 e T4 que, em algumas modalidades, pode ser substancialmente o mesmo que o intervalo entre T4 e T5. Em algumas modalidades, os intervalos entre cada um desses tempos podem ser diferentes. Em algumas modalidades, o intervalo entre os tempos marcados adjacentes (por exemplo, entre T1 e T2 ou entre T4 e T5) pode ser maior ou igual a 30 s, menor ou igual a 90 min, 30 s a 60 min, 30 s a 30 min, 30 s a 15 min, 30 s a 10 min, 30 s a 8 min, 30 s a 7 min, 30 s a 6 min, 30 s a 5 min, 30 s a 4 min, 30 s a 3 min, 1 min a 5 min, ou 2 min a 5 min. As caixas 710, 712, 714, 724, 720, 722, 734, 730, 732, 742, 744 e 740 representam uma mistura, um tampão ou outro líquido residente em cada coluna, C1, C2, C3 e C4.

[0072] Movendo-se através da FIG. 5A da esquerda para a direita, na primeira linha (representando a primeira coluna C1), de T1 a T2, uma carga secundária da mistura pode estar na primeira coluna (caixa 710). De T2 a T3, uma carga primária da mistura pode estar na primeira coluna (caixa 712) e de T3 a T5 uma ou mais fases móveis podem estar na primeira coluna (caixa 714).

[0073] Ainda com referência à FIG. 5A, uma ou mais fases móveis na primeira coluna 714 podem ser divididas em fases separadas, incluindo um tampão de lavagem na primeira coluna (caixa 715), um tampão de separação na primeira coluna (caixa 717) e um tampão de equilíbrio na primeira coluna (caixa 719). Na próxima linha (representando a segunda coluna C2), de T1 a T2, uma ou mais fases móveis podem estar na segunda coluna (caixa 724), continuando de T4 a T5 do ciclo anterior. Isso também pode ser dividido em fases separadas, incluindo um tampão de lavagem na segunda coluna (caixa 725), um tampão de separação na segunda coluna (caixa 727) e um tampão de equilíbrio na segunda coluna (caixa 729). Movendo para a direita, de T2 para T3, uma carga secundária de uma mistura pode estar na segunda coluna (caixa 720), e de T3 para T4, uma carga primária da mistura pode estar na segunda coluna (caixa 722).

[0074] Na próxima linha (representando a coluna C3), de T1 a T3 uma ou mais fases móveis podem estar na terceira coluna (caixa 734). As uma ou mais fases móveis na terceira coluna 734 podem ser divididas em fases separadas, incluindo um tampão de lavagem na terceira coluna (caixa 735), um tampão de separação na terceira coluna (caixa 737) e um tampão de equilíbrio na terceira coluna (caixa 739). Em seguida, de T3 a T4, uma carga secundária pode estar na terceira coluna (caixa

730), e de T4 a T5 uma carga primária da mistura pode estar na terceira coluna (caixa 732).

[0075] Na próxima linha (representando a coluna C4), de T1 a T2 uma carga primária da mistura pode estar na quarta coluna (caixa 742). Em seguida, de T2 a T4, uma ou mais fases móveis podem estar na quarta coluna (caixa 744), e de T4 a T5 uma carga secundária da mistura pode estar na terceira coluna (caixa 740). As uma ou mais fases móveis na quarta coluna 744 podem ser divididas em fases separadas, incluindo um tampão de lavagem na terceira coluna (caixa 745), um tampão de separação na terceira coluna (caixa 747) e um tampão de equilíbrio na terceira coluna (caixa 749).

[0076] Em um determinado momento T0, uma linha vertical pode ser desenhada através do gráfico de modo que cada caixa numerada contatada pela linha vertical de T0 represente uma solução em uma coluna naquele momento. Assim, por exemplo, no tempo T1, a mistura de carga secundária está sendo introduzida na primeira coluna 710, uma ou mais fases móveis estão na segunda coluna 724, como um tampão de separação 727, e uma mistura de carga primária está sendo passada para a terceira coluna 732. Deve-se notar que embora as subdivisões de fases mais amplas, como, por exemplo, as subdivisões 725, 727 e 729 pareçam ocupar porções iguais de uma ou mais fases móveis na segunda coluna 724, em algumas modalidades, as subdivisões podem ocupar porções desiguais da fase mais ampla. Também deve ser entendido que o método representado na FIG. 5A é apenas um exemplo dos métodos da modalidade. Outras ordens, configurações e etapas são contempladas e consideradas dentro do escopo da presente divulgação.

[0077] As FIGs. 5B-5E ilustram um ciclo exemplar para um método para preparar um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura incluindo o polipeptídeo alvo como descrito anteriormente. A FIG. 5B representa uma série de eventos que ocorrem em um intervalo T1 a T2 da FIG. 5A. A FIG. 5B mostra um aparelho de HIC em um primeiro estágio 601, onde uma primeira zona 610 está recebendo uma carga secundária de uma mistura 606 incluindo um polipeptídeo alvo e eluindo um efluente da carga secundária 607 que pode ser coletado ou descartado. Uma segunda zona 620 está recebendo uma ou mais fases móveis 615 e eluindo um efluente de uma ou mais fases móveis 616 que pode ser coletado ou descartado. Uma terceira zona 630 está recebendo uma ou mais fases móveis 615 e eluindo um efluente de uma ou mais fases móveis 616 que pode ser coletado ou descartado. Uma quarta zona 640 está recebendo uma carga primária de uma mistura 605 e passando uma carga secundária de uma mistura 606 para outra coluna.

[0078] A FIG. 5C mostra um aparelho de HIC em um segundo estágio 602 (ao longo de um intervalo T2 a T3, como mostrado na FIG. 5A), onde uma primeira zona 610 está recebendo uma carga primária de uma mistura 605 e passando uma carga secundária de uma mistura 606 para outra coluna incluindo um polipeptídeo alvo que pode ser coletado ou descartado. Uma segunda zona 620 está recebendo uma carga secundária de uma mistura 606 incluindo um polipeptídeo alvo e eluindo um efluente da carga secundária 607 que pode ser coletado ou descartado. Uma terceira zona 630 está recebendo uma ou mais fases móveis 615 e eluindo um efluente de uma ou mais fases móveis 616 que pode ser coletado ou descartado. Uma quarta zona 640 está recebendo uma ou mais fases móveis 615 e eluindo um efluente de uma ou mais fases móveis 616 que pode ser coletado ou descartado.

[0079] A FIG. 5D mostra um aparelho de HIC em um terceiro estágio 603 (ao longo de um intervalo T2 a T3, como mostrado na FIG. 5A), onde uma primeira zona 610 está recebendo uma ou mais fases móveis 615 e eluindo um efluente de uma ou mais fases móveis 616 que pode ser coletado ou descartado. Uma segunda zona 620 está recebendo uma carga primária de uma mistura 605 e passando uma carga secundária de uma mistura 606 para outra coluna incluindo um polipeptídeo alvo que pode ser coletado ou descartado. Uma terceira zona 630 está recebendo uma carga secundária de uma mistura 606 incluindo um polipeptídeo alvo e eluindo um efluente da carga secundária 607 que pode ser coletado ou descartado. Uma quarta zona 640 está recebendo uma ou mais fases móveis 615 e eluindo um efluente de uma ou mais fases móveis 616 que pode ser coletado ou descartado.

[0080] A FIG. 5E mostra um aparelho de HIC em um quarto estágio 604 (ao longo de um intervalo T2 a T3, como mostrado na FIG. 5A), onde uma primeira zona 610 está recebendo uma ou mais fases móveis 615 e eluindo um efluente de uma ou mais fases móveis 616 que pode ser coletado ou descartado. Uma segunda zona 620 está recebendo uma ou mais fases móveis 615 e eluindo um efluente de uma ou mais fases móveis 616 que pode ser coletado ou descartado. Uma terceira zona 630 está recebendo uma carga primária de uma mistura 605 e passando uma carga secundária de uma mistura 606 para outra coluna incluindo um polipeptídeo alvo que pode ser coletado ou descartado. Uma quarta zona 640 está recebendo uma carga secundária de uma mistura 606 incluindo um polipeptídeo alvo e eluindo um efluente da carga secundária 607 que pode ser coletado ou descartado.

[0081] A FIG. 6 representa um fluxograma de um método exemplar 800 de preparação de um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura incluindo um polipeptídeo alvo. O método pode incluir passar uma mistura incluindo um polipeptídeo alvo para uma primeira coluna de uma pluralidade de colunas (por exemplo, caixa 410 da FIG. 3A) (etapa 810). O método pode incluir ainda passar um efluente incluindo o polipeptídeo alvo da primeira coluna para uma segunda coluna da pluralidade de colunas (por exemplo, uma segunda carga de uma mistura 306, como mostrado na FIG. 3B) (etapa 820). O método pode compreender ainda passar uma ou mais fases móveis para a primeira coluna (por exemplo, caixa 414) (etapa 830). Em algumas modalidades, o método pode incluir ainda passar o polipeptídeo alvo através das saídas de cada uma da pluralidade de colunas (por exemplo, efluente de uma ou mais fases móveis 316, como mostrado nas FIGs. 3B-3D) (etapa 840). Enquanto comparação está sendo feita com as FIGs. 3A-3D, será evidente para um versado na técnica que as comparações também podem ser feitas com as FIGs. 5A-5E.

[0082] Em modalidades da presente divulgação, uma mistura contendo um polipeptídeo alvo também pode compreender um ou mais HCPs. Após um polipeptídeo alvo ser preparado a partir da mistura usando um ou mais métodos de modalidade, várias amostras de efluentes podem ser obtidas. As amostras podem ser coletadas do efluente de uma ou mais cargas da mistura e/ou do efluente de uma ou mais fases móveis. Por exemplo, as amostras podem ser coletadas do efluente de uma carga primária da mistura ou de uma carga secundária da mistura (ou qualquer outra carga da mistura). Em algumas modalidades, as amostras podem ser coletadas apenas do efluente de um ou mais tampões de lavagem. Em outras modalidades, as amostras podem ser coletadas do efluente de outras fases móveis e/ou da carga primária ou secundária da mistura. A coleção agregada de todas as amostras coletadas que contêm o polipeptídeo alvo é denominada pool.

[0083] Em algumas modalidades, uma ou mais medições podem ser feitas para determinar uma eficiência do método empregado de preparação de um polipeptídeo alvo. Tal como utilizado nesta divulgação, a eficiência se refere a uma combinação de três fatores diferentes: fator de eliminação de moléculas de alto peso molecular (HMW CF), rendimento e produtividade. Em algumas modalidades, um método mais eficiente tem um HMW CF mais alto, um rendimento mais alto e uma produtividade mais alta do que o método menos eficiente. Em outras modalidades, um método mais eficiente tem uma produtividade maior do que o método menos eficiente, enquanto mantém um HMW CF maior ou igual a 1,3 e mantém um rendimento maior ou igual a 80%. Em outras modalidades, um método mais eficiente tem uma produtividade maior do que o método menos eficiente, enquanto mantém um HMW CF maior ou igual a 1,5 e mantém um rendimento maior ou igual a 90%.

[0084] O fator de eliminação de moléculas de alto peso molecular (HMW CF) é uma aproximação do teor relativo de proteína em um pool coletado em comparação com a mistura carregada. Em algumas modalidades, a cromatografia de exclusão de tamanho analítica pode ser realizada para determinar a porcentagem de uma amostra atribuível a moléculas de alto peso molecular (por exemplo, proteínas) (HMW%). Em outras modalidades, uma técnica de centrifugação pode ser usada - conforme uma amostra é centrifugada ela se separa em estratos com base na massa dos componentes constituintes da amostra, o estrato mais pesado, o infranatante, geralmente contém as moléculas mais pesadas, incluindo proteínas. O HMW% pode ser calculado pela massa do infranatante de uma amostra centrifugada e dividindo pela massa total da amostra. Usando qualquer um dos métodos, o HMW CF pode ser calculado de acordo com a Equação 1, conforme mostrado abaixo. % HMW CF = Eq. (1) %

[0085] Conforme mostrado na Eq. (1), um HMW CF pode ser calculado dividindo o HMW% da mistura carregada pelo HMW% do pool. Em algumas modalidades, um método de preparação de um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura tem um HMW CF maior ou igual a 1,3. Em outras modalidades, um método de preparação de um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura tem um HMW CF maior ou igual a 1,4, maior ou igual a 1,5, maior ou igual a 1,6, maior ou igual a 1,8, ou maior que ou igual a 2,0.

[0086] O rendimento é uma medição da quantidade de polipeptídeo alvo coletado no pool em comparação com quanto polipeptídeo alvo estava na mistura de carga. A quantidade de um polipeptídeo alvo em uma amostra pode ser quantificada por absorção de UV, condutividade elétrica ou imunoensaio enzimático (por exemplo, ELISA). O rendimento pode ser calculado de acordo com a Equação 2, conforme mostrado abaixo. $%&'( )$*&+ ) Rendimento % = x 100 = $%&'( )$*&+ ) x 100 Eq. (2)

[0087] Conforme mostrado na Eq. 2, o rendimento pode ser calculado dividindo a massa do polipeptídeo alvo carregado no aparelho de HIC pela massa do polipeptídeo alvo coletado no pool. Como a massa do polipeptídeo alvo em uma amostra não pode ser medida diretamente, uma concentração (calculada por absorção de UV, condutividade elétrica ou imunoensaio enzimático) pode ser multiplicada por um volume para determinar uma massa. Em algumas modalidades, um método de preparação de um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura tem um rendimento maior ou igual a 55%. Em outras modalidades, um método de preparação de um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura tem um rendimento maior ou igual a 60%, maior ou igual a 65%, maior ou igual a 70%, maior ou igual a 75%, maior ou igual a 80%, maior ou igual a 85%, maior ou igual a 90%, ou maior ou igual a 95%.

[0088] A produtividade é uma quantificação do tempo e custo necessários para preparar uma quantidade de polipeptídeo alvo. A produtividade pode ser calculada de acordo com a Equação 3, conforme mostrado abaixo.

Produtividade = *&+ Eq. (3) 123 × 5678& 96 %:(+& × ;º 96 %:(+&

[0089] Conforme mostrado na Eq. 3, a produtividade pode ser calculada dividindo a massa do polipeptídeo alvo coletado no pool pelo produto do volume do meio de interação hidrofóbico usado e o tempo decorrido para preparar a massa do polipeptídeo coletado no pool (por exemplo, tempo de ciclo). Em algumas modalidades, um método de preparação de um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura tem uma produtividade maior ou igual a cerca de 35 g/L·h. Em outras modalidades, um método de preparação de um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura tem uma produtividade maior ou igual a cerca de 40 g/L·h, maior ou igual a cerca de 50 g/L·h, maior ou igual a cerca de 75 g/L·h, maior ou igual a cerca de 100 g/L·h, maior ou igual a cerca de 125 g/L·h, maior ou igual a cerca de 150 g/L·h, maior ou igual a cerca de 175 g/L·h, maior ou igual a cerca de 200 g/L·h, ou maior ou igual a cerca de 220 g/L·h.

EXEMPLOS

[0090] Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar a presente divulgação sem serem limitantes por natureza. Entende-se que a presente divulgação abrange aspectos e modalidades adicionais consistentes com a descrição anterior e os exemplos a seguir.

[0091] Em alguns dos exemplos a seguir, é feita referência a "cromatografia contínua" ou "HIC contínua". Estes termos referem-se a protocolos e / ou aparelhos incluindo duas ou mais colunas de cromatografia (por exemplo, colunas HIC), cada uma das quais pode estar em uma porção diferente de um ciclo de cromatografia de repetição passando por todas as colunas. As modalidades da presente divulgação (por exemplo, representadas nas FIGS. 2-5E) são exemplos de cromatografia contínua e / ou HIC contínua. Os protocolos de cromatografia contínua (por exemplo, HIC contínua) podem ser caracterizados por um objetivo de reduzir ou eliminar o tempo ocioso da coluna (também referido como "tempo morto") em comparação com a cromatografia em batelada convencional.

[0092] Nos exemplos a seguir, os polipeptídeos alvo foram preparados a partir de uma mistura incluindo o polipeptídeo alvo e HCP, usando vários métodos diferentes de acordo com modalidades da presente divulgação. Vários conjuntos de polipeptídeos alvo também foram preparados usando um método de processamento em batelada convencional como exemplos comparativos. Exemplo 1

[0093] Em um primeiro exemplo, um anticorpo alvo foi preparado. 300 mL de uma mistura de 12,2 g/L incluindo um anticorpo alvo foram carregados em um aparelho de HIC de três colunas a uma vazão de carga de 1,67 mL/min, onde cada coluna tinha uma altura de leito de 2,5 cm, um diâmetro interno de 1,6 cm e um volume de coluna de 5 mL. O tampão/mistura de carga incluiu uma solução 30 milimolar (mM) de citrato de sódio e foi ajustado a um pH de 6,0 com uma solução de ácido acético 2M. O tampão/mistura de carga foi carregado em uma primeira e segunda coluna das três colunas. A segunda coluna foi carregada através da primeira coluna (ou seja, uma saída da primeira coluna permitiu que o tampão de carga passasse para a segunda coluna). Depois que a mistura foi carregada na primeira e segunda colunas do aparelho de HIC, a mistura foi carregada na segunda e terceira das três colunas, com a terceira coluna sendo carregada por meio da segunda coluna (ou seja, uma saída da segunda coluna permitiu que o tampão de carga passasse para a terceira coluna).

[0094] Enquanto o tampão/mistura de carga estava carregando na segunda e terceira colunas, uma série de fases móveis foi passada para a primeira coluna do aparelho de HIC para separar o anticorpo alvo de outros componentes da mistura na primeira coluna e coletar o anticorpo alvo, seguido por uma série de tampões de separação passados para a primeira coluna para regenerar a coluna. O carregamento da segunda e terceira colunas ocorreu simultaneamente com a lavagem e separação da primeira coluna. Após esta etapa, o tampão/mistura de carga foi carregado na terceira e primeira colunas, com a primeira coluna sendo carregada através da terceira coluna (ou seja, uma saída da terceira coluna permitiu que o tampão de carga passasse para a primeira coluna), durante o qual os tampões foram passados para a segunda coluna para separar e coletar o anticorpo alvo da mistura carregada na segunda coluna, após o que a série de tampões de separação foi passada para a segunda coluna para regenerar a segunda coluna. O carregamento da terceira e da primeira coluna ocorreu simultaneamente com a lavagem e a separação da segunda coluna. Finalmente, o tampão/mistura de carga foi carregado na primeira e segunda colunas novamente, com a segunda coluna sendo carregada através da primeira coluna como descrito anteriormente, durante o qual os tampões foram passados para a terceira coluna para separar e coletar o anticorpo alvo da mistura carregada na terceira coluna, após o qual a série de tampões de separação foi passada para a terceira coluna para regenerar a terceira coluna. O carregamento da primeira e da segunda colunas ocorreu simultaneamente com a lavagem e a separação da terceira coluna. Este processo foi repetido ciclicamente duas vezes.

[0095] A série de fases móveis incluiu um tampão de lavagem, uma série de tampões de separação e um tampão de equilíbrio. O tampão de lavagem incluiu Tris 40 mM e citrato de sódio 30 mM e foi ajustado a um pH de 6,0. Para lavar cada coluna, quatro volumes de coluna de tampão de lavagem foram adicionados à coluna.

[0096] Depois que o tampão de lavagem foi aplicado e o efluente incluindo o anticorpo alvo foi coletado de uma coluna como parte do pool, uma série de tampões de separação foi passada para a coluna como parte do processo de regeneração da coluna. O primeiro tampão de separação incluiu água deionizada, dois volumes de colunas deste tampão foram adicionados a cada coluna. Como usado aqui, um volume de coluna se refere ao volume de líquido que a coluna pode reter. O próximo tampão de separação inclui NaOH 1 N, dois volumes de coluna deste tampão foram adicionados a cada coluna após o primeiro tampão de separação. O próximo tampão de separação compreendia água deionizada, dois volumes de coluna deste tampão foram adicionados a cada coluna após o tampão de separação alcalino anterior. O próximo tampão de separação incluiu 20% em volume de etanol e dois volumes de coluna deste tampão foram adicionados a cada coluna após o tampão de separação com água deionizada anterior. Um tampão de separação final, incluindo água deionizada, foi adicionado à coluna (em uma quantidade igual a dois volumes de coluna). Após a aplicação dos tampões de separação, quatro volumes de coluna de um tampão de equilíbrio foram adicionados à coluna. O tampão de equilíbrio incluiu Tris 40 mM e citrato de sódio 30 mM e foi ajustado a um pH de 6,0.

[0097] Depois que o pool foi coletado a partir do método executado no Exemplo 1, o HMW CF, o rendimento e a produtividade do método foram medidos e calculados conforme descrito anteriormente aqui. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabela 1. Exemplo 2

[0098] Em um segundo exemplo, um anticorpo alvo foi preparado. 729 mL de uma mistura de 12,4 g/L incluindo um polipeptídeo alvo foram carregados em um aparelho de HIC de três colunas a uma vazão de carga de 1,67 mL/min, onde cada coluna tinha uma altura de leito de 2,5 cm, um diâmetro interno de 1,6 cm e um volume de coluna de 5 mL. O tampão/mistura de carga incluiu uma solução 30 milimolar (mM) de citrato de sódio e foi ajustado a um pH de 6,0 com uma solução de ácido acético 2M. O tampão/mistura de carga foi carregado em uma primeira e segunda coluna das três colunas. A segunda coluna foi carregada através da primeira coluna (ou seja, uma saída da primeira coluna permitiu que o tampão de carga passasse para a segunda coluna). Depois que a mistura foi carregada na primeira e segunda colunas do aparelho de HIC, a mistura foi carregada na segunda e terceira das três colunas, com a terceira coluna sendo carregada por meio da segunda coluna (ou seja, uma saída da segunda coluna permitiu que o tampão de carga passasse para a terceira coluna).

[0099] Enquanto o tampão/mistura de carga estava carregando na segunda e terceira colunas, uma série de fases móveis foi passada para a primeira coluna do aparelho de HIC para separar o anticorpo alvo de outros componentes da mistura na primeira coluna e coletar o anticorpo alvo, seguido por uma série de tampões de separação passados para a primeira coluna para regenerar a coluna. O carregamento da segunda e terceira colunas ocorreu simultaneamente com a lavagem e separação da primeira coluna. Após esta etapa, o tampão/mistura de carga foi carregado na terceira e primeira colunas, com a primeira coluna sendo carregada através da terceira coluna (ou seja, uma saída da terceira coluna permitiu que o tampão de carga passasse para a primeira coluna), durante o qual os tampões foram passados para a segunda coluna para separar e coletar o anticorpo alvo da mistura carregada na segunda coluna, após o que a série de tampões de separação foi passada para a segunda coluna para regenerar a segunda coluna. O carregamento da terceira e da primeira coluna ocorreu simultaneamente com a lavagem e a separação da segunda coluna. Finalmente, o tampão/mistura de carga foi carregado na primeira e segunda colunas novamente, com a segunda coluna sendo carregada através da primeira coluna como descrito anteriormente, durante o qual os tampões foram passados para a terceira coluna para separar e coletar o anticorpo alvo da mistura carregada na terceira coluna, após o qual a série de tampões de separação foi passada para a terceira coluna para regenerar a terceira coluna. O carregamento da primeira e da segunda colunas ocorreu simultaneamente com a lavagem e a separação da terceira coluna. Este processo foi repetido ciclicamente quatro vezes.

[0100] A série de fases móveis incluiu um tampão de lavagem, uma série de tampões de separação e um tampão de equilíbrio. O tampão de lavagem incluiu Tris 40 mM e citrato de sódio 30 mM e foi ajustado a um pH de 6,0. Para lavar cada coluna, quatro volumes de coluna de tampão de lavagem foram adicionados à coluna.

[0101] Depois que o tampão de lavagem foi aplicado e o efluente incluindo o anticorpo alvo foi coletado de uma coluna como parte do pool, uma série de tampões de separação foi passada para a coluna como parte do processo de regeneração da coluna. O primeiro tampão de separação incluiu água deionizada, dois volumes de colunas deste tampão foram adicionados a cada coluna. Como usado aqui, um volume de coluna se refere ao volume de líquido que a coluna pode reter. O próximo tampão de separação inclui NaOH 1 N, dois volumes de coluna deste tampão foram adicionados a cada coluna após o primeiro tampão de separação. O próximo tampão de separação compreendia água deionizada, dois volumes de coluna deste tampão foram adicionados a cada coluna após o tampão de separação alcalino anterior. O próximo tampão de separação incluiu 20% em volume de etanol e dois volumes de coluna deste tampão foram adicionados a cada coluna após o tampão de separação com água deionizada anterior. Um tampão de separação final, incluindo água deionizada, foi adicionado à coluna (em uma quantidade igual a dois volumes de coluna). Após a aplicação dos tampões de separação, quatro volumes de coluna de um tampão de equilíbrio foram adicionados à coluna. O tampão de equilíbrio incluiu Tris 40 mM e citrato de sódio 30 mM e foi ajustado a um pH de 6,0.

[0102] Depois que o pool foi coletado a partir do método executado no Exemplo 2,

o HMW CF, o rendimento e a produtividade foram medidos e calculados conforme descrito anteriormente aqui. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabela 1. Exemplo 3

[0103] Em um terceiro exemplo, um polipeptídeo alvo foi preparado. 726 mL de uma mistura de 12,4 g/L incluindo um polipeptídeo alvo foram carregados em um aparelho de HIC de três colunas a uma vazão de carga de 6,70 mL/min, onde cada coluna tinha uma altura de leito de 2,5 cm, um diâmetro interno de 1,6 cm e um volume de coluna de 5 mL. O tampão/mistura de carga incluiu uma solução 30 milimolar (mM) de citrato de sódio e foi ajustado a um pH de 6,0 com uma solução de ácido acético 2M. O tampão/mistura de carga foi carregado em uma primeira e segunda coluna das três colunas. A segunda coluna foi carregada através da primeira coluna (ou seja, uma saída da primeira coluna permitiu que o tampão de carga passasse para a segunda coluna). Depois que a mistura foi carregada na primeira e segunda colunas do aparelho de HIC, a mistura foi carregada na segunda e terceira das três colunas, com a terceira coluna sendo carregada por meio da segunda coluna (ou seja, uma saída da segunda coluna permitiu que o tampão de carga passasse para a terceira coluna).

[0104] Enquanto o tampão/mistura de carga estava carregando na segunda e terceira colunas, uma série de fases móveis foi passada para a primeira coluna do aparelho de HIC para separar o anticorpo alvo de outros componentes da mistura na primeira coluna e coletar o anticorpo alvo, seguido por uma série de tampões de separação passados para a primeira coluna para regenerar a coluna. O carregamento da segunda e terceira colunas ocorreu simultaneamente com a lavagem e a separação da primeira coluna. Após esta etapa, o tampão/mistura de carga foi carregado na terceira e primeira colunas, com a primeira coluna sendo carregada através da terceira coluna (ou seja, uma saída da terceira coluna permitiu que o tampão de carga passasse para a primeira coluna), durante o qual os tampões foram passados para a segunda coluna para separar e coletar o anticorpo alvo da mistura carregada na segunda coluna, após o que a série de tampões de separação foi passada para a segunda coluna para regenerar a segunda coluna. O carregamento da terceira e da primeira coluna ocorreu simultaneamente com a lavagem e a separação da segunda coluna. Finalmente, o tampão/mistura de carga foi carregado na primeira e segunda colunas novamente, com a segunda coluna sendo carregada através da primeira coluna como descrito anteriormente, durante o qual os tampões foram passados para a terceira coluna para separar e coletar o anticorpo alvo da mistura carregada na terceira coluna, após o qual a série de tampões de separação foi passada para a terceira coluna para regenerar a terceira coluna. O carregamento da primeira e da segunda colunas ocorreu simultaneamente com a lavagem e a separação da terceira coluna. Este processo foi repetido ciclicamente quatro vezes.

[0105] A série de fases móveis incluiu um tampão de lavagem, uma série de tampões de separação e um tampão de equilíbrio. O tampão de lavagem incluiu Tris 40 mM e citrato de sódio 30 mM e foi ajustado a um pH de 6,0. Para lavar cada coluna, quatro volumes de coluna de tampão de lavagem foram adicionados à coluna.

[0106] Depois que o tampão de lavagem foi aplicado e o efluente incluindo o anticorpo alvo foi coletado de uma coluna como parte do pool, uma série de tampões de separação foi passada para a coluna como parte do processo de regeneração da coluna. O primeiro tampão de separação incluiu água deionizada, dois volumes de colunas deste tampão foram adicionados a cada coluna. Como usado aqui, um volume de coluna se refere ao volume de líquido que a coluna pode reter. O próximo tampão de separação inclui NaOH 1 N, dois volumes de coluna deste tampão foram adicionados a cada coluna após o primeiro tampão de separação. O próximo tampão de separação compreendia água deionizada, dois volumes de coluna deste tampão foram adicionados a cada coluna após o tampão de separação alcalino anterior. O próximo tampão de separação incluiu 20% em volume de etanol e dois volumes de coluna deste tampão foram adicionados a cada coluna após o tampão de separação com água deionizada anterior. Um tampão de separação final, incluindo água deionizada, foi adicionado à coluna (em uma quantidade igual a dois volumes de coluna). Após a aplicação dos tampões de separação, quatro volumes de coluna de um tampão de equilíbrio foram adicionados à coluna. O tampão de equilíbrio incluiu Tris 40 mM e citrato de sódio 30 mM e foi ajustado a um pH de 6,0.

[0107] Depois que o pool foi coletado a partir do método executado no Exemplo 3,

o HMW CF, o rendimento e a produtividade foram medidos e calculados conforme descrito anteriormente aqui. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabela 1. Exemplo Comparativo A

[0108] Um polipeptídeo alvo foi preparado a partir de uma mistura usando um processo em batelada convencional, conforme descrito aqui, como uma comparação com os métodos dos Exemplos 1-3. Os aditivos de carga, tampão de lavagem, tampões de separação e tampões de equilíbrio eram idênticos aos usados nos métodos de Exemplo, mas foi empregada uma metodologia de batelada convencional. 590 g de uma mistura de carga de 13,1 g/L foram adicionados a uma coluna cromatográfica. Depois que a mistura passou pela coluna, 4 volumes de coluna de tampão de lavagem foram adicionados à coluna e o efluente foi coletado. Depois que um pool foi coletado a partir do método de exemplo comparativo, o HMW CF, o rendimento e a produtividade foram caracterizados. Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1 Exemplo Valor Exemplo 1 Exemplo 2 Exemplo 3 Comparativo

A Volume de meio de interação 15 mL 15 mL 15 mL 6,53 L hidrofóbica usado Taxa de 1,67 mL/min 1,67 mL/min 6,70 mL/min 1,05 L/min carregamento Tempo de Ciclo 3,01 h 2,44 h 0,61 h 2,26 h Concentração de 12,2 g/L 12,4 g/L 12,4 g/L 13,1 g/L carregamento Volume de 300 mL 726 mL 726 mL 45,0 L carregamento Massa de 3,66 g 9,00 g 9,00 g 590 g carregamento

HMW% de 2,05 % 2,01 % 2,29 % 1,71 % carregamento HMW% de pool 1,10 % 1,10 % 1,46 % 0,68 % Concentração de 8,07 g/L 9,06 g/L 9,69 g/L 9,75 g/L pool Volume de pool 359 mL 687 mL 844 mL 58,5 L Massa de pool 2,90 g 6,22 g 8,18 g 570,4 g HMW CF 1,9 1,8 1,6 2,5 Rendimento 79,2 % 68,7 % 90,9 % 96,7 % Produtividade 32,1 g/L·h 42,5 g/L·h 223,5 g/L·h 38,7 g/L·h

[0109] Como pode ser visto a partir dos dados na tabela 1, os Exemplos 2 e 3 têm uma produtividade mais alta do que o método de batelada de exemplo comparativo. Além disso, o Exemplo 3 foi capaz de atingir uma produtividade mais alta do que os outros exemplos, embora mantendo um HMW CF maior ou igual a 1,5 e mantendo um rendimento maior ou igual a 90%. Exemplo 4

[0110] Um anticorpo alvo foi preparado usando HIC com três velocidades de carregamento diferentes para comparar rompimentos de impurezas em velocidades variáveis. Uma coluna foi preparada conforme descrito na Tabela 2: Tabela 2 Material de Carga Citrato 30 mM; pH 6,0 +/- 0,1 Altura do leito da 20 cm coluna Diâmetro interno da 1 cm coluna Volume Empacotado 15,7 mL da Coluna Concentração de 400 g/L no total; após 100 g/L, fracionado a cada 25 g/L carga

Limpeza Água deionizada por osmose reversa; NaOH 1N; Água deionizada por osmose reversa; 20% de EtOH

[0111] As velocidades de carregamento, na ordem de execução, foram 300 cm/h (3,93 mL/min, ou um tempo de residência de 4,0 min na coluna), 200 cm/h (2,62 mL/min, ou tempo de residência de 6,0 min na coluna) e 400 cm/h (5,24 mL/min, ou um tempo de residência de 3,0 min na coluna). Todas as execuções foram realizadas na mesma coluna. Uma imersão durante a noite foi realizada antes da execução de 400 cm/h em 0,5 N NaOH.

[0112] Porcentagens de alto peso molecular (HMW%) foram representadas graficamente como uma função de carregamento, como representado na FIG. 7A. O HMW% do material de carga foi de 1,78%. O HMW% de pool cumulativo a 200 g/L- resina e 400 g/L-resina são mostrados abaixo na Tabela 3: Tabela 3 200 g/L-resina 400 g/L-resina 200 cm/h 1,10 % 1,34 % 300 cm/h 1,06 % 1,28 % 400 cm/h 1,07 % 1,28 %

[0113] As proteínas da célula hospedeira foram quantificadas em partes por milhão para cada velocidade de carregamento usando um kit F665 CHO HCP ELISA (Cygnus Technologies). As quantidades resultantes foram plotadas em função do carregamento, conforme representado na FIG. 7B. Como comparação, as proteínas da célula hospedeira foram quantificadas a partir de um pool de cromatografia de troca aniônica do mesmo material de carga e foram encontradas em 549,61 ppm. Exemplo 5

[0114] Um anticorpo alvo foi preparado usando HIC em duas colunas com diferentes alturas de leito (20 cm, como usado no Exemplo 4, e 2,5 cm). Ambas as execuções foram realizadas de modo que o tempo de residência em cada coluna fosse de 3 minutos (isto é, uma velocidade linear de 400 cm/h na coluna de altura do leito de 20 cm). O HMW% para o material de carga foi de 2,2%. O HMW% para cada pool da coluna foi plotado em função da concentração de carregamento, como mostrado na FIG. 7C. Exemplo 6

[0115] Um anticorpo alvo IgG1 foi preparado usando um aparelho HIC com três colunas, configurado para implementar um protocolo HIC contínuo. Cada coluna HIC no aparelho HIC tinha uma altura de leito de 10 cm e um diâmetro interno de 0,77 cm. Foi implementado um protocolo HIC contínuo que se repetiu ciclicamente quatro vezes. O anticorpo alvo foi carregado em colunas submetidas a uma etapa de carregamento do protocolo como parte de uma mistura incluindo citrato de sódio 30 mM, balanceado para um pH de 6,0. O anticorpo alvo foi eluído de colunas submetidas a uma etapa de eluição do protocolo com um tampão incluindo tris 40 mM e citrato de sódio 30 mM, balanceado para um pH de 6,0 ± 0,1. As colunas foram regeneradas durante uma etapa de regeneração do protocolo usando um protocolo de solução única com uma única solução alcalina. Os parâmetros e resultados do protocolo estão resumidos na Tabela 4, juntamente com os parâmetros e resultados do Exemplo Comparativo B. Exemplo Comparativo B

[0116] Um polipeptídeo alvo de IgG1 foi preparado a partir de uma mistura usando um processo de batelada convencional, como uma comparação com os métodos do Exemplo 6. Os aditivos de carga, tampão de lavagem, tampões de separação e tampões de equilíbrio eram idênticos aos usados no método de Exemplo 6, mas foi utilizada uma metodologia de batelada convencional. Como no Exemplo 6, o polipeptídeo alvo foi carregado como parte de uma mistura incluindo citrato de sódio 30 mM, balanceado a um pH de 6,0. O polipeptídeo alvo foi eluído com um tampão incluindo tris 40 mM e citrato de sódio 30 mM, balanceado para um pH de 6,0 ± 0,1. Um protocolo de solução única com uma solução alcalina foi usado durante uma etapa de regeneração. Os parâmetros e resultados estão resumidos na Tabela 4, juntamente com os parâmetros e resultados do Exemplo 6. Como pode ser visto a partir dos dados na Tabela 4, o método HIC contínuo do Exemplo 6 foi aproximadamente 3,4 vezes mais produtivo do que o exemplo de processo em batelada comparativo. Tabela 4 Valor Exemplo 6 Exemplo Comparativo B Volume de meio de 14.1 mL 6.53 L interação hidrofóbica usado Taxa de carregamento 4.7 mL/min 1.05 L/min Tempo de Ciclo 0.75 hr 2.48 hr Concentração de 11.5 g/L 10.8 g/L carregamento Volume de carregamento 846 mL 79.6 L Massa de carregamento 97.3 g 860 g HMW% de carregamento 1.69 % 0.59 % HMW% de pool 0.89 % 0.26 % Concentração de pool 7.23 g/L 7.92 g/L Volume de pool 1309 mL 106.4 L Massa de pool 9.46 g 843 g HMW CF 1.90 2.48 Rendimento 97.3 % 98.1 % Produtividade 179 g/L·hr 52.1 g/L·hr Exemplo 7

[0117] Um polipeptídeo alvo de IgG1 foi preparado usando um aparelho HIC com três colunas, configurado para implementar um protocolo HIC contínuo. Cada coluna HIC no aparelho HIC tinha uma altura de leito de 10 cm e um diâmetro interno de 0,77 cm. Foi implementado um protocolo HIC contínuo que se repetiu ciclicamente quatro vezes. O polipeptídeo alvo foi carregado em colunas submetidas a uma etapa de carregamento do protocolo como parte de uma mistura incluindo citrato de sódio 30 mM, balanceado a um pH de 5,5. O polipeptídeo alvo foi eluído de colunas submetidas a uma etapa de eluição do protocolo com um tampão incluindo tris 40 mM e citrato de sódio 30 mM, balanceado a um pH de 5,5 ± 0,1. As colunas foram regeneradas durante uma etapa de regeneração, usando um protocolo de solução única com uma única solução alcalina. Os parâmetros e resultados do protocolo estão resumidos na Tabela 5, juntamente com os parâmetros e resultados do Exemplo Comparativo C. Exemplo Comparativo C

[0118] Um polipeptídeo alvo de IgG1 foi preparado a partir de uma mistura usando um processo de batelada convencional, como uma comparação com os métodos do Exemplo 7. Os aditivos de carga, tampão de lavagem, tampões de separação e tampões de equilíbrio eram idênticos aos usados no método de Exemplo 7, mas foi utilizada uma metodologia de baletada convencional. Como no Exemplo 7, o polipeptídeo alvo foi carregado como parte de uma mistura incluindo citrato de sódio 30 mM, equilibrado para um pH de 5,5. O polipeptídeo alvo foi eluído com um tampão incluindo tris 40 mM e citrato de sódio 30 mM, equilibrado para um pH de 5,5 ± 0,1. Um protocolo de solução única com uma solução alcalina foi usado durante uma etapa de regeneração. Os resultados estão resumidos na Tabela 5, juntamente com os parâmetros e resultados do Exemplo 7. Como pode ser visto a partir dos dados na Tabela 5, o método HIC contínuo do Exemplo 7 foi aproximadamente 2,1 vezes mais produtivo do que o exemplo de processo em batelada comparativo.

Tabela 5 Valor Exemplo 7 Exemplo Comparativo C Volume de meio de 14.1 mL 6.53 L interação hidrofóbica usado

Taxa de carregamento 3.80 mL/min 1.05 L/min Tempo de Ciclo 1.16 hr 2.85 hr Concentração de 11.9 g/L 12.1 g/L carregamento Volume de carregamento 803.7 mL 104 L Massa de carregamento 9.56 g 1258 g HMW% de carregamento 1.41 % 1.25 % HMW% de pool 0.64 % 0.42 % Concentração de pool 7.70 g/L 9.45 g/L Volume de pool 1.1658 L 58.5 L Massa de pool 2.90 g 127.7 g HMW CF 2.2 3.0 Rendimento 93.9 % 95.9 % Produtividade 137.3 g/L·hr 64.7 g/L·hr Exemplo 8

[0119] Um anticorpo alvo IgG4 foi preparado usando um aparelho HIC com quatro colunas, configurado para implementar um protocolo HIC contínuo. Cada coluna HIC no aparelho HIC tinha uma altura de leito de 2,5 cm e um diâmetro interno de 1,6 cm. Foi implementado um protocolo HIC contínuo que se repetiu ciclicamente quatro vezes. O anticorpo alvo foi carregado em colunas submetidas a uma etapa de carregamento do protocolo como parte de uma mistura incluindo citrato de sódio 40 mM, equilibrado a um pH de 6,5. O anticorpo alvo foi eluído de colunas submetidas a uma etapa de eluição com um tampão incluindo tris 40 mM e citrato de sódio 40 mM, balanceado a um pH de 6,5 ± 0,1. As colunas foram regeneradas durante uma etapa de regeneração usando um protocolo que incluía uma série de: (1) água, (2) uma solução alcalina, (3) água, (4) uma solução de álcool e (5) água. Os parâmetros e resultados estão resumidos na Tabela 6, juntamente com os parâmetros e resultados do Exemplo Comparativo D. Exemplo Comparativo D

[0120] Um polipeptídeo alvo foi preparado a partir de uma mistura usando um processo de batelada convencional, como uma comparação com os métodos do Exemplo 7. Os aditivos de carga, tampão de lavagem, tampões de separação e tampões de equilíbrio eram idênticos aos usados no método do Exemplo 8, mas foi empregada uma metodologia de batelada convencional. Como no Exemplo 8, o anticorpo alvo foi carregado como parte de uma mistura incluindo citrato de sódio 40 mM, equilibrado a um pH de 6,5. O anticorpo alvo foi eluído com um tampão incluindo tris 40 mM e citrato de sódio 40 mM, equilibrado a um pH de 6,5 ± 0,1. As colunas foram regeneradas usando um protocolo que incluía uma série de: (1) água, (2) uma solução alcalina, (3) água, (4) uma solução de álcool e (5) água. Os parâmetros e resultados estão resumidos na Tabela 6, juntamente com os parâmetros e resultados do Exemplo 8. Como pode ser visto a partir dos dados na Tabela 6, o método HIC contínuo do Exemplo 8 foi aproximadamente 5,7 vezes mais produtivo do que o exemplo de processo em batelada comparativo. Tabela 6 Valor Exemplo 8 Exemplo Comparativo D Volume de meio de 20.0 mL 3.18 L interação hidrofóbica usado Taxa de carregamento 1.67 mL/min 0.257 L/min Tempo de Ciclo 0.69 hr 4.30 hr Concentração de 11.6 g/L 12.2 g/L carregamento Volume de carregamento 300 mL 45.0 L Massa de carregamento 3.66 g 590 g HMW% de carregamento 1.01 % 0.90 %

HMW% de pool 0.45 % 0.25 % Concentração de pool 6.45 g/L 8.31 g/L Volume de pool 1.285 L 34.7 L Massa de pool 8.29 g 288 g HMW CF 2.2 3.6 Rendimento 86.4 % 89.4 % Produtividade 120.6 g/L·hr 21.1 g/L·hr Exemplo 9

[0121] Os dados coletados do Exemplo 6 foram usados para desenvolver um modelo que descreve a relação entre o número de colunas que um aparelho de cromatografia contém e a produtividade de HIC contínua usando o aparelho, em que a produtividade foi considerada uma medida dos gramas de anticorpo alvo purificado por litro de resina por hora (g / L * h). O modelo assumiu o uso de uma única solução de regeneração alcalina e um anticorpo alvo IgG1. O modelo também assumiu um rendimento constante de 97,3%, uma taxa de carga constante de 4,7 mL / min, uma concentração de carga constante e um volume de carga constante de 15 CV (volume da coluna). Ao prever uma produtividade para aparelhos HIC incluindo mais de três colunas, as taxas de fluxo teórico de lavagem, tira e equilíbrio foram ajustadas para manter um modelo com ocupação contínua de todas as colunas durante o HIC contínuo. Além disso, para modelar o aparelho de duas colunas em particular, foi assumido que uma coluna estaria em uma etapa de carregamento e uma coluna estaria em uma etapa de lavagem / remoção / regeneração, omitindo uma etapa de carregamento de duas etapas como em outros protocolos HIC contínuos. A Tabela 7 lista os dados usados para gerar a produtividade prevista para cada aparelho HIC. FIG. 8A mostra um gráfico da relação modelada em comparação com uma produtividade de batelada de 52,1 g / L·hr.

Tabela 7

Numero de colunas 2 3 4 5 Taxa de fluxo de 4.7 4.7 4.7 4.7 carga / loop Taxa de fluxo de 4.7 4.7 2.5 1.9 lavagem / tira / equilíbrio Tempo de ciclo 30 45 60 75 (minutos) Tempo de ciclo 0.5 0.75 1 1.25 (horas) Tempo de 2.5 3.75 5 6.25 processamento (horas) Volume de carga (CV) 15 15 15 15 Volume de carga por 70.5 70.5 70.5 70.5 coluna (mL) Carregar proteína por 810.75 810.75 810.75 810.75 coluna (mg) Proteína Total 6.486 9.729 12.972 16.215 Carregada (g) Eluato de proteína 6.3109 9.4663 12.6218 15.7772 total (g) Volume total de resina 0.0094 0.0141 0.0188 0.0235 (L) Produtividade (g/L*h) 268.548 179.032 134.274 107.4192 Exemplo 10

[0122] Os dados coletados do Exemplo 8 foram usados para desenvolver um modelo que descreve a relação entre o número de colunas que um aparelho de cromatografia contém e a produtividade de HIC contínuo usando o aparelho. O modelo assumiu o uso de um procedimento de regeneração multifluido incluindo água, uma solução alcalina e uma solução de álcool. O modelo também assumiu um rendimento constante de 86,4%, uma taxa de carga constante de 5,0 mL / min, uma concentração de carga constante e um volume de carga constante de 10,3 CV. Ao prever uma produtividade para aparelhos HIC incluindo mais de três colunas, as taxas de fluxo teórico de lavagem, tira e equilíbrio foram ajustadas para manter um modelo com ocupação contínua de todas as colunas durante o HIC contínuo. A Tabela 8 lista os dados usados para gerar a produtividade prevista para cada aparelho HIC. FIG. 8B mostra um gráfico da relação modelada em comparação com uma produtividade de batelada de 21,1 g / L·hr.

Tabela 8 Numero de colunas 3 4 5 6 Taxa de fluxo de 5.0 5.0 5.0 5.0 carga / loop Taxa de fluxo de 7.8 3.9 2.6 1.9 lavagem / tira / equilíbrio Tempo de ciclo 31 42 52 62 (minutos) Tempo de ciclo 0.5167 0.7 0.8667 1.0333 (horas) Tempo de 2.5833 3.5 4.3333 5.1667 processamento (horas) Volume de carga (CV) 10.3 10.3 10.3 10.3 Volume de carga por 51.6 51.6 51.6 51.6 coluna (mL) Carregar proteína por 593.4 593.4 593.4 593.4 coluna (mg) Proteína Total 7.1208 9.4944 11.868 14.2416 Carregada (g)

Eluato de proteína 6.1524 8.2032 10.2540 12.3047 total (g) Volume total de resina 0.015 0.02 0.025 0.03 (L) Produtividade (g/L*h) 158.7709 117.1880 94.6519 79.3854

[0123] Aqueles versados na técnica apreciarão que a concepção na qual esta divulgação é baseada pode ser prontamente usada como uma base para projetar outros métodos e sistemas para realizar as soluções e propósitos da presente divulgação. Consequentemente, as reivindicações não devem ser consideradas como limitadas pela descrição anterior.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para preparar um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura incluindo o polipeptídeo alvo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: contatar a mistura incluindo o polipeptídeo alvo com uma primeira zona de um aparelho de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), a primeira zona tendo uma ou mais colunas cromatográficas e uma saída; contatar uma ou mais fases móveis com uma segunda zona do aparelho de HIC, a segunda zona tendo uma ou mais colunas cromatográficas e uma saída; e passar o polipeptídeo alvo através das saídas de pelo menos a primeira e a segunda zonas do aparelho de HIC; em que um tempo de residência para a mistura incluindo o polipeptídeo alvo na primeira zona é configurado para ser aproximadamente o mesmo que um tempo de residência de uma ou mais fases móveis na segunda zona.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo alvo é um anticorpo monoclonal.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais fases móveis compreendem um tampão de equilíbrio e um tampão de lavagem.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda passar um efluente incluindo o polipeptídeo alvo da primeira zona do aparelho de HIC para a segunda zona do aparelho de HIC.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que contatar uma ou mais fases móveis com a segunda zona do aparelho de HIC inclui: contatar um tampão de lavagem com a segunda zona do aparelho de HIC; e após contatar o tampão de lavagem com a segunda zona do aparelho de HIC, regenerar a segunda zona, em que regenerar a segunda zona compreende: contatar água com a segunda zona do aparelho de HIC,

contatar uma solução alcalina com a segunda zona do aparelho de HIC, contatar uma solução de álcool com a segunda zona do aparelho de HIC, e contatar um tampão de equilíbrio com a segunda zona do aparelho de HIC.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que contatar um tampão de lavagem com a segunda zona do aparelho de HIC é seguido por passar o polipeptídeo alvo através da saída da segunda zona do aparelho de HIC.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dentre uma absorção ultravioleta, condutividade elétrica ou pH de uma solução residente são medidos na saída da primeira zona ou da segunda zona.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo alvo é preparado com uma produtividade maior ou igual a 50 g/L∙h.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira zona ou a segunda zona inclui mais de uma coluna cromatográfica.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aparelho de HIC inclui ainda uma terceira zona tendo uma ou mais colunas cromatográficas e uma saída, e em que o método compreende ainda: realizar um ciclo de regeneração na terceira zona, em que realizar o ciclo de regeneração compreende contatar uma ou mais fases móveis com a terceira zona, em que uma duração para o ciclo de regeneração é configurada para ser aproximadamente o mesmo que o tempo de residência para a mistura incluindo o polipeptídeo alvo na primeira zona.

11. Método para preparar um polipeptídeo alvo a partir de uma mistura incluindo o polipeptídeo alvo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: passar a mistura incluindo o polipeptídeo alvo para uma primeira coluna de uma pluralidade de colunas cromatográficas em um aparelho de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), em que cada uma da pluralidade de colunas compreende uma saída conectável a outra coluna da pluralidade de colunas; passar um efluente incluindo o polipeptídeo alvo da primeira coluna para uma segunda coluna da pluralidade de colunas; passar uma ou mais fases móveis para uma terceira coluna da pluralidade de colunas; e passar o polipeptídeo alvo através das saídas de cada uma da pluralidade de colunas, em que a soma dos tempos de residência para a mistura incluindo o polipeptídeo alvo na primeira coluna e na segunda coluna é substancialmente a mesma que a soma dos tempos de residência de uma ou mais fases móveis na terceira coluna.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda passar uma ou mais fases móveis para cada uma da pluralidade de colunas.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que passar uma ou mais fases móveis para uma coluna inclui: passar um tampão de lavagem para a coluna; e após passar um tampão de lavagem para a coluna, regenerar a coluna, em que regenerar a coluna compreende passar água, uma solução alcalina, uma solução de álcool ou um tampão de equilíbrio para a coluna.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a etapa de passar um polipeptídeo alvo através da saída de uma coluna ocorre após um tampão de lavagem ter sido passado para a coluna.

15. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que um ou mais dentre uma absorção ultravioleta, condutividade elétrica ou pH de uma solução residente são medidos na saída da primeira coluna ou da segunda coluna.

16. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo alvo é preparado com uma produtividade maior ou igual a

50 g/L∙h.

17. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o aparelho de HIC inclui quatro colunas e a soma dos tempos de residência para a mistura, incluindo o polipeptídeo alvo na primeira coluna e na segunda coluna, é substancialmente o mesmo que a soma dos tempos de regeneração da terceira coluna e a quarta colunas.

18. Método para preparar um anticorpo usando uma pluralidade de colunas cromatográficas, em que cada uma da pluralidade de colunas cromatográficas inclui um meio de interação hidrofóbico, o método caracterizado pelo fato de que compreende: em um primeiro estágio: carregar uma quantidade de uma mistura incluindo o anticorpo em uma primeira coluna da pluralidade de colunas; carregar uma quantidade da mistura em uma segunda coluna da pluralidade de colunas através da primeira coluna; e realizar uma etapa de não carregamento incluindo pelo menos um dentre os processos de lavagem, separação e equilíbrio em uma terceira coluna da pluralidade de colunas; em um segundo estágio: carregar uma quantidade da mistura incluindo o anticorpo na segunda coluna; carregar uma quantidade da mistura na terceira coluna por meio da segunda coluna; e realizar a etapa de não carregamento compreendendo pelo menos um dentre os processos de lavagem, separação e equilíbrio na primeira coluna; e em um terceiro estágio: carregar uma quantidade da mistura incluindo o anticorpo na terceira coluna; carregar uma quantidade da mistura na terceira coluna por meio da segunda coluna; e realizar a etapa de não carregamento incluindo pelo menos um dentre os processos de lavagem, separação e equilíbrio na segunda coluna.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda repetir continuamente o primeiro, segundo e terceiro estágios em um ciclo, e em que cada estágio compreende realizar as etapas de carregamento e não carregamento simultaneamente.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a duração de uma das etapas de carregamento é configurada para ser aproximadamente a mesma que a duração da etapa de não carregamento.