KR20210027296A - 혼합물로부터 폴리펩타이드를 제조하기 위한 다중 소수성 상호작용 크로마토그래피의 용도 - Google Patents

혼합물로부터 폴리펩타이드를 제조하기 위한 다중 소수성 상호작용 크로마토그래피의 용도 Download PDF

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이사벨 리비니
스테파니 맥더모트
제임스 라일리
존 마틸라
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

본 발명의 개시내용은 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드, 바람직하게는 항체를 추출하는 방법을 지시한다. 상기 방법은 혼합물을 다중 크로마토그래피 영역으로 이루어진 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 장치에 접촉시킴을 포함한다. 1번째 영역에서 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물에 대한 체류 시간은 상기 2번째 영역에서 하나 이상의 이동상의 체류 시간과 대략적으로 동일할 수 있다.

Description

혼합물로부터 폴리펩타이드를 제조하기 위한 다중 소수성 상호작용 크로마토그래피의 용도
기술 분야
관련 출원
본 출원은 2018년 7월 2일에 출원된 미국 가특허출원 번호 62/693,024에 대한 우선권을 주장하고, 이의 개시내용 전부는 이의 전문이 본원에 참조로서 도입된다.
본원 개시내용은 일반적으로 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본원 개시내용은 크로마토그래피 방법을 사용하여 혼합물로부터 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
배경
크로마토그래피, 예를 들면, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC; hydrophobic interaction chromatography), 친화성 크로마토그래피 등은 약물 제품 제조 방법의 부분으로서 수행될 수 있다. 일부 경우에, 크로마토그래피는 폴리펩타이드를 포함하는 약물 제품의 제조에 특히 유용할 수 있다. 그러나, 표준 뱃치(batch) HIC 단계 또는 다른 뱃치 크로마토그래피 단계를 위한 장비, 물질, 제조 시간, 및 작동 시간은 약물 제품 제조 방법에서 추가된 비용 또는 감소된 효율을 야기할 수 있다. 특히, HIC 또는 다른 크로마토그래피 분리 프로세스에서 각 스테이지(stage)를 수행하는데 필요한 시간은, 사용되는 완충액 및/또는 분리 매질의 양, 및 임의의 비-자동화 양상의 프로세스는 약물 제품 제조의 효율을 감소시킬 수 있다.
본원에 개시된 방법 및 시스템은 폴리펩타이드 제조 방법의 효율 및/또는 생산성을 개선시킬 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 시스템은 또한 약물 제품 제조 방법의 효율 및/또는 생산성을 개선시킬 수 있고, 상기 확인된 하나 이상의 문제점을 해결할 수 있다.
요약
본 발명의 개시내용의 실시형태는 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 지시한다. 상기 방법은 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물을 HIC 장치의 1번째 영역에 접촉시키고, 이동상을 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시키고, 표적 폴리펩타이드를 HIC 장치의 1번째 및 2번째 영역의 출구를 통해서 통과시킴을 포함할 수 있고, 여기서, 1번째 영역 및 2번째 영역 각각은 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼 및 출구를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 1번째 영역에서 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물의 체류 시간(residence time)은 2번째 영역에서 이동상의 체류 시간과 대략적으로 동일하게 구성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 폴리펩타이드는 단클론성 항체일 수 있다. 표적 폴리펩타이드는 50 g/Lㆍhr 이상의 생산성으로 제조될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 이동상은 평형화 완충액 및 세척 완충액을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 개시내용의 방법은 표적 폴리펩타이드를 포함하는 유출물을 HIC 장치의 1번째 영역에서 HIC 장치의 2번째 영역으로 통과시킴을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이동상을 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시키는 것은 세척 완충액을 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시키고, 세척 완충액을 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시킨 후, 2번째 영역을 재생시킴을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2번째 영역을 재생시키는 것은 물을 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시키고, 알칼리성 용액을 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시키고, 알콜 용액을 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시키고, 평형화 완충액을 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시킴을 포함할 수 있다. 표적 폴리펩타이드는, 세척 완충액을 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시킨 후, HIC 장치의 2번째 영역의 출구를 통해 통과될 수 있다. 일부 실시형태에서, 자외선 흡수, 전기 전도도, 또는 체류 용액의 pH 중 하나 이상을 1번째 영역 또는 2번째 영역 중 어느 하나의 출구에서 측정할 수 있다. 1번째 영역 또는 2번째 영역은 하나 초과의 크로마토그래피 컬럼을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, HIC 장치는 크로마토그래피 컬럼 및 출구를 갖는 3번째 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 재생 주기를 3번째 영역에서 수행함을 추가로 포함할 수 있고, 여기서, 재생 주기를 수행하는 것은 이동상을 3번째 영역에 접촉시킴을 포함하고, 여기서, 재생 주기의 기간은 1번째 영역에서 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물의 체류 시간과 대략적으로 동일하게 구성된다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물을 HIC 장치에서 복수의 크로마토그래피 컬럼의 1번째 컬럼으로 통과시키고, 표적 폴리펩타이드를 포함하는 유출물을 상기 복수의 컬럼의 1번째 컬럼에서 2번째 컬럼으로 통과시키고, 하나 이상의 이동상을 복수의 컬럼의 3번째 컬럼으로 통과시키고, 표적 폴리펩타이드를 상기 복수의 컬럼 각각의 출구를 통해서 통과시킴을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 복수의 컬럼 각각은 상기 복수의 컬럼의 또 다른 컬럼에 연결가능한 출구를 포함하고, 1번째 컬럼 및 2번째 컬럼에서 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물의 체류 시간의 합계는 3번째 컬럼에서 하나 이상의 이동상의 체류 시간의 합계와 실질적으로 동일하다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 이동상을 상기 복수의 컬럼 각각으로 통과시킴을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 이동상을 컬럼으로 통과시키는 것은, 세척 완충액을 컬럼으로 통과시키고, 세척 완충액을 컬럼으로 통과시킨 후, 컬럼을 재생함을 포함할 수 있고, 여기서, 컬럼을 재생하는 것은 물, 알칼리성 용액, 알콜 용액, 또는 평형화 완충액을 컬럼으로 통과시킴을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 폴리펩타이드를 컬럼의 출구를 통해서 통과시키는 단계는 세척 완충액이 상기 컬럼으로 통과된 후에 일어날 수 있다. 일부 실시형태에서, 자외선 흡수, 전기 전도도, 또는 체류 용액의 pH 중 하나 이상은 1번째 컬럼 또는 2번째 컬럼 중 어느 하나의 출구에서 측정된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 50 g/Lㆍhr 이상의 생산성으로 표적 폴리펩타이드를 제조함을 포함할 수 있다. 추가 실시형태에서, HIC 장치는 4개의 컬럼을 포함할 수 있고, 1번째 컬럼 및 2번째 컬럼에서 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물의 체류 시간의 합계는 3번째 컬럼 및 4번째 컬럼의 재생 시간의 합계와 실질적으로 동일할 수 있다.
본 발명의 개시내용의 추가 실시형태는 복수의 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 항체를 제조하는 방법을 포함할 수 있고, 여기서, 복수의 크로마토그래피 컬럼 각각은 소수성 상호작용 매질을 포함한다. 상기 방법은, 1번째 스테이지에서, 항체를 포함하는 일정량의 혼합물을 상기 복수의 컬럼의 1번째 컬럼 내로 로딩(loading)하고, 상기 일정량의 혼합물을 상기 복수의 컬럼의 2번째 컬럼 내로 1번째 컬럼을 경유하여 로딩하고, 복수의 컬럼의 3번째 컬럼에서 세척, 스트리핑(stripping), 및 평형화 프로세스 중 적어도 하나를 포함하는 비-로딩 단계를 수행하고; 2번째 스테이지에서, 항체를 포함하는 일정량의 혼합물을 2번째 컬럼 내로 로딩하고, 상기 일정량의 혼합물을 3번째 컬럼 내로 2번째 컬럼을 경유하여 로딩하고, 1번째 컬럼에서 세척, 스트리핑, 및 평형화 프로세스 중 적어도 하나를 포함하는 비-로딩 단계를 수행하고; 3번째 스테이지에서, 항체를 포함하는 일정량의 혼합물을 3번째 컬럼 내로 로딩하고, 상기 일정량의 혼합물을 3번째 컬럼 내로 2번째 컬럼을 경유하여 로딩하고, 2번째 컬럼에서 세척, 스트리핑, 및 평형화 프로세스 중 적어도 하나를 포함하는 비-로딩 단계를 수행함을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 1번째, 2번째, 및 3번째 스테이지를 주기적으로 연속 반복함을 추가로 포함할 수 있고, 여기서, 각 스테이지는 로딩 및 비-로딩 단계를 동시에 수행함을 포함한다. 일부 실시형태에서, 로딩 단계 중 하나의 기간은 비-로딩 단계의 기간과 대략적으로 동일하게 구성된다.
본 명세서의 부분으로서 도입되고 구성되는 첨부된 도면은, 다양한 예시적인 실시형태를 나타내고, 상세한 설명과 함께 개시된 실시형태의 원리를 설명하는 역할을 한다. 본원에 기재된 실시형태 또는 실시예 (예를 들면, 조성물, 제형, 방법 등)의 임의의 특징은 임의의 다른 실시형태 또는 실시예와 함께 조합될 수 있고, 모든 이러한 조합은 본 발명의 개시내용에 포함된다. 또한, 개시된 시스템 및 방법은 모든 단일 양상 또는 실시형태를 제한하지 않고, 이러한 양상 및 실시형태의 모든 조합 또는 순열을 제한하지 않는다. 간결함을 목적으로, 특정 순열 및 조합은 본원에 개별적으로 논의 및/또는 예시되지 않는다.
도 1은 본 발명의 개시내용의 일부 실시형태에 따른 크로마토그래피 장치의 영역 일부를 도시하는 개략도이다.
도 2는 본 발명의 개시내용의 일부 실시형태에 따른 크로마토그래피 장치의 도식이다.
도 3a는 본 발명의 개시내용의 일부 실시형태에 따른 표적 폴리펩타이드의 예시적인 제조 방법에 대한 그래프 도식이다;
도 3b-3d는 도 3a에 나타낸 표적 폴리펩타이드의 제조 방법에 대한 방법을 도시하는 간략한 예시이다.
도 4는 본 발명의 개시내용의 일부 실시형태에 따른 크로마토그래피 장치의 도식이다.
도 5a는 본 발명의 개시내용의 일부 실시형태에 따른 표적 폴리펩타이드의 예시적인 제조 방법에 대한 그래프 도식이다;
도 5b-5e는 도 5a에 나타낸 표적 폴리펩타이드의 제조 방법을 도시하는 간략한 예시이다.
도 6은 본 발명의 개시내용의 일부 실시형태에 따른 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법의 흐름도이다.
도 7a는 본 발명의 개시내용의 양상에 따른 로딩의 함수로서 높은 분자량 퍼센트의 플롯이다.
도 7b는 본 발명의 개시내용의 양상에 따른 로딩의 함수로서 숙주 세포 단백질 양의 플롯이다.
도 7c는 본 발명의 개시내용의 양상에 따른 로딩 농도의 함수로서 높은 분자량 퍼센트의 플롯이다.
본원에 사용된 용어 "포함한다(comprises)", "포함하는(comprising)", 또는 임의의 다른 이의 변형은, 비-독점적 포함을 포함하기 위한 의도이고, 이에 따라 열거된 요소를 포함하는 프로세스, 방법, 제품, 또는 장치가 단지 이들 요소만을 포함하는 것이 아니고 이러한 프로세스, 방법, 제품, 또는 장치에 명시적으로 열거되거나 내재되지 않는 다른 요소를 포함할 수 있다. 용어 "예시적인"은 "이상적"인 것 보다는 "예시"의 의미로 사용된다. 용어 "예를 들면(for example)" 및 "와 같은(such as)", 및 문법적 등가물, 구절 "그리고 이에 제한되지 않고(and without limitation)"는 달리 명시적으로 언급하지 않는 한, 다음과 같이 이해된다.
본원에 사용된 용어 "약"은 실험 오차로 인한 변동을 설명하기 위한 것이다. 수치 값에 적용되는 경우, 용어 "약"은 개시된 수치 값으로부터 +/- 10%의 변동을 나타낼 수 있다 (다른 변형이 명시되지 않는 한). 본원에 사용된 단수 형태 하나 ("a", "an"), 및 상기 ("the")는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 복수 대상을 포함한다.
본원에 개시된 모든 수치 값 (모든 개시된 값, 한계, 및 범위를 포함함)이 개시된 수치 값에서 +/- 10%의 변동을 가질 수 있다 (다른 변형이 명시되지 않는 한)는 것을 유의하여야 한다. 또한, 청구범위에서, 값, 한계, 및/또는 범위는 값, 한계, 및/또는 범위 +/- 10%을 의미한다. 유사하게는, 본원에 사용된 구절 "대략적으로 동일한"은, +/- 10%의 변동 이내에서 동일함을 의미할 수 있다. 추가로, 모든 범위는 종점을 포함하는 것으로 이해되고, 예를 들면, 1 센티미터 (cm) 내지 5 cm는 1 cm, 5 cm, 및 1 cm 내지 5 cm 사이의 모든 거리의 길이를 포함할 것이다.
상세한 설명
본원 개시내용은, 다수의 변형이 당해 기술분야의 숙련가의 이해의 범위 내에서 가능하기 때문에, 본원에 개시된 특정 조성물, 제형, 물질 제조자, 약물 제품, 장치, 시스템, 실험 조건, 또는 특정 방법에 한정되지 않는다. 본원에 사용된 용어는 특정 실시형태 만을 기재하기 위한 목적이고, 제한되는 것을 의도하지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본원 개시내용이 속하는 당해 기술분야의 숙련가에게 통상 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 모든 방법 및 물질이 본 발명의 개시내용의 실시 또는 시험을 위해 사용될 수 있지만, 특정 방법이 지금부터 기술된다. 언급된 모든 공보는 참조로서 본원에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "접촉함(contacting)"은 2개 이상의 표면, 용액, 또는 화합물의 교차(meeting), 결합(joinder), 인터페이스(interface), 또는 다른 물리적 상호작용을 언급한다. 특정 유체는 본원에서 영역 내로 통과되고, 영역에서부터 통과되거나, 영역으로 통과되거나, 또는 영역을 통해 통과되는 것으로 기재되지만, 유체가 반드시 임의의 영역을 접촉할 것이라는 것이 이해되고, 상기 유체는 상기 영역 내로, 상기 영역에서부터, 상기 영역으로, 또는 상기 영역을 통해 통과된다. 유사하게는, 유체 또는 성분을 영역에 도입하는 것은 영역을 접촉하는 유체 또는 성분을 구성한다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩타이드"는 아미드 결합을 통해 공유 결합된 약 20개 초과의 아미노 산을 갖는 임의의 아미노 산 중합체를 언급한다. 단백질은 하나 이상의 아미노 산 중합체 쇄 (예를 들면, 폴리펩타이드)를 포함한다. 따라서, 폴리펩타이드는 단백질일 수 있고, 단백질은 다중 폴리펩타이드를 포함하여 단일 기능 생물분자를 형성할 수 있다.
번역후 변형은 추가로 폴리펩타이드의 구조를 변형 또는 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 디설파이드 브릿지 (예를 들면, 시스테인 잔기 사이의 S-S 결합)는 일부 단백질에 존재할 수 있다. 일부 디설파이드 브릿지는 폴리펩타이드, 면역글로불린, 단백질, 공동-인자, 기질 등의 적합한 구조, 기능, 및 상호작용에 본질적이다. 디설파이드 결합 형성에 추가하여, 단백질은 다른 번역후 변형에 적용될 수 있다. 이러한 변형은 지질화 (예를 들면, 미리스토일화, 팔미토일화, 파르네소일화, 게라닐게라닐화, 및 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커(anchor) 형성), 알킬화 (예를 들면, 메틸화), 아실화, 아미드화, 글리코실화 (예를 들면, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 하이드록시리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 및/또는 트립토판에 글리코실 그룹의 첨가), 및 인산화 (즉, 포스페이트 그룹의 세린, 트레오닌, 티로신, 및/또는 히스티딘으로의 첨가)을 포함한다. 번역후 변형은 폴리펩타이드에 의해 참여되는 표면-대-표면 상호작용을 결정하는 소수성, 정전기 표면 성질, 또는 다른 성질에 영향을 줄 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단백질"은 생물치료 단백질, 연구 또는 요법에 사용되는 재조합 단백질, 트랩 단백질 및 다른 Fc-융합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 단클론성 항체, 사람 항체, 이중특정 항체, 항체 단편, 항체-유사 분자, 나노바디, 재조합 항체 키메라, 사이토킨, 케모킨, 펩타이드 호르몬 등을 포함한다. 관심 대상 단백질 (protein-of-interest)(POI)은, 단리, 정제되는 것이 바람직하지만 그렇지 않으면 제조되는 모든 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. POI는 항체를 포함하는 세포에 의해 제조되는 표적 폴리펩타이드 또는 다른 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는, 4개의 폴리펩타이드 쇄로 구성된 면역글로불린을 포함한다: 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중(H) 쇄 및 2개의 경(L) 쇄. 통상적으로, 항체는 100 kDa을 넘는 분자량, 예를 들면, 130 kDa 내지 200 kDa, 예를 들면, 약 140 kDa, 145 kDa, 150 kDa, 155 kDa, 또는 160 kDa의 분자량을 갖는다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 더 보전된 영역과 함께 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 지칭되는 과변이(hypervariability) 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되고, 하기 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3로서 약칭되고; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로서 약칭될 수 있다).
예를 들면, 면역글로불린 G (IgG)로 불리는 면역글로불린 부류는 사람 혈청에서 흔하고, 4개의 폴리펩타이드 쇄 - 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함한다. 각각의 경쇄는 하나의 중쇄에 시스틴 디설파이드 결합을 통해 결합되고, 2개의 중쇄는 2개의 시스틴 디설파이드 결합을 통해 서로에게 결합된다. 다른 부류의 사람 면역글로불린은 IgA, IgM, IgD, 및 IgE를 포함한다. IgG의 경우, 4개의 하위부류가 존재한다: IgG 1, IgG 2, IgG 3, 및 IgG 4. 각각의 하위부류는 이들의 불변 영역이 상이하고, 결과적으로, 상이한 이펙터 기능을 가질 수 있다. 본원에 기재된 일부 실시형태에서, POI는 IgG를 포함하는 표적 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 실시형태에서, 표적 폴리펩타이드는 IgG 4를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는, 또한 완전 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은, 임의의 천연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성, 또는 유전자 조작 폴리펩타이드 또는 특히 항원에 결합하여 복합물을 형성하는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들면, 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는, 단백질분해 소화 또는 재조합 유전공학 기술과 같은, 임의의 적합한 표준 기술을 사용하여, 완전 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되고/되거나, 예를 들면, 상업적 공급원 DNA 라이브러리 (예를 들면, 파지-항체 라이브러리를 포함함)으로부터 용이하게 이용가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용하여 시퀀싱 또는 조작되어, 예를 들면, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 배치로 배열하거나, 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노 산 등을 변형, 추가 삭제할 수 있다.
표적 폴리펩타이드는 재조합 세포-기반 제조 시스템, 예를 들면, 곤충 바큘로바이러스 시스템, 효모 시스템 (예를 들면, 피치아(Pichia) 종), 포유류 시스템 (예를 들면, CHO 세포 및 CHO-K1 세포와 같은 CHO 유도체)을 사용하여 제조할 수 있다. 용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 표현하는데 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 것 (단일-세포 또는 다중-세포), 박테리아 세포 (예를 들면, 이. 콜리(E. coli), 바실루스(Bacillus) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 등의 균주), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포 (예를 들면, 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae), 에스 폼베(S. pombe), 피. 파스토리스(P. pastoris), 피. 메탄올리카(P. methanolica)), 식물 세포, 곤충 세포 (예를 들면, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리초플루시아니(Trichoplusiani) 등), 비-사람 동물 세포, 사람 세포, 또는 세포 융합, 예를 들면, 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 사람, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트, 또는 마우스 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 진행생물이고, 하기 세포로부터 선택된다: CHO (예를 들면, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예를 들면, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (예를 들면, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들면, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (상피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 상기 언급한 세포로부터 유래된 세포주. 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스성 유전자, 예를 들면, 바이러스성 유전자를 발현하는 망막 세포 (예를 들면, PER.C6™ 세포)를 포함한다. 세포에 의해 생산된 표적 폴리펩타이드 또는 POI 이외의 단백질 또는 폴리펩타이드는 숙주-세포 단백질 (host-cell protein; HCP)로서 언급될 수 있다. POI가 숙주 세포에서 제조되고/되거나 숙주 세포로부터 정제되는 경우, HCP는 제품- 및 프로세스-관련 오염물 또는 불순물로서 특성화될 수 있다.
일부 HCP (예를 들면, 효소)는 POI (예를 들면, 표적 폴리펩타이드)와 공동 정제될 수 있고, POI를 포함하여 혼합물, 제형, 또는 약물 제품의 성분에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 일부 HCP의 존재는 제품 안정성에 영향을 주거나, 약물 제품의 저장 수명을 감소시키거나, 또는 심지어 제품이 개요 또는 규제 입자상 물질 사양(compendial or regulatory particulate matter specifications)(예를 들면, 미국 식약청 사양)을 충족시키지 못할 수 있다. 추가의 예로서, 일부 HCP는 임상적 효과, 예를 들면, 투여시 면역원성 반응을 야기할 수 있다. HIC 또는 다른 크로마토그래피는, 단독으로 또는 조합하여, POI를 정제 및/또는 분리하고, HCP를 혼합물, 제형, 또는 약물 제품으로부터 제거하는데 사용할 수 있고, 이에 따라, 약물 제품에 미치는 HCP의 잠재적 효과를 감소시킬 수 있는 반면, HIC 또는 친화성 크로마토그래피 단계의 추가는 장비, 물질 (예를 들면, 소수성 상호작용 매질), 및 준비를 추가할 것을 요구한다. 이는 추가된 시간, 자원, 실험, 및 비용과 같다. 따라서, POI (예를 들면, 표적 폴리펩타이드)를 하나 이상의 공동 정제된 HCP 또는 다른 불순물로부터 분리하기 위해 크로마토그래피 프로세스를 수행하는 효율적인 방법을 수행하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "크로마토그래피"는, 혼합물의 성분이 상이한 속도로 매질을 통하여 통과되도록 혼합물을 매질을 통하여 통과시켜 혼합물의 성분을 분리하는 임의의 프로세스를 언급하고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 컬럼 크로마토그래피, 플래너(planar) 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 치환 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 신속 단백질 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 향류 크로마토그래피, 주기적인 향류 크로마토그래피, 또는 키랄 크로마토그래피를 포함한다. 본원의 실시형태가 예시적인 타입의 크로마토그래피 프로세스 (예를 들면, HIC) 또는 장치에 대해 개시될 수 있지만, 본원에 개시된 실시형태는 모든 타입의 크로마토그래피에 적용가능하다.
본원에 사용된 용어 "물"은 모든 적합한 타입의 실험실 등급 물, 예를 들면, 탈이온수 또는 주입용수를 언급할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들면, 크로마토그래피 장치는 탈이온수 또는 주입용수 중 어느 하나와 접촉될 수 있다. 본원에서 "물"의 사용에 대한 모든 언급은 탈이온수, 주입용수, 또는 실험실 등급 물의 또 다른 타입을 언급할 수 있다.
본 발명의 개시내용에 사용된 용어 "이동상"은 분리 또는 정제 프로세스의 일부로서 크로마토그래피 영역 또는 컬럼을 접촉시키기 위한 적합한 모든 유체를 언급할 수 있다. 이동상은, 예를 들면, 물, 완충액 용액, 산성 용액, 알칼리성 용액, 및/또는 알콜을 포함하는 용액을 포함할 수 있다. 용어 "세척 완충액", "스트리핑 완충액" 및 "평형화 완충액"은 추가로 본원에 기재된 특정한 특성을 갖는 이동상을 기술하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 혼합물을 크로마토그래피 장치에 접촉시킴을 포함할 수 있다. 크로마토그래피 장치는 복수의 영역을 포함할 수 있고, 여기서, 각각의 영역은 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼은 소수성 상호작용 매질을 포함한다. 이러한 크로마토그래피 장치는 미리-제작된 장치 (예를 들면, Cadence™ BioSMB (Pall Biosciences), BioSC® (novasep), Varicol® (novasep), 또는 Octave (Semba® Biosciences)), 수동-조립 장치 (hand-assembled apparatuses), 또는 탄뎀(tandem)에서 사용되는 단지 2개 이상의 표준 뱃치 크로마토그래피 장치를 포함할 수 있다.
본 발명의 개시내용의 양상은 표적 폴리펩타이드 또는 다른 분자의 제조 방법에 대한 다양한 이점을 제공할 수 있다. 예를 들면, 크로마토그래피 장치에서 다중 영역의 동시 사용은 개별 컬럼의 더 효율적이고 더 충만한(fuller) 로딩, 및/또는 표준 크로마토그래피 프로세스에서보다 더 적은 크로마토그래피 매질을 사용한 분리 프로세스의 성능을 가능하게 한다. 본 발명의 개시내용의 양상의 추가 이점 및 이득은 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
이제부터 본 발명의 개시내용의 도면을 참조할 것이다.
도 1은 본 발명의 개시내용의 일부 실시형태에 따른 HIC 장치의 크로마토그래피 컬럼의 섹션 (100)을 도시한다. 크로마토그래피 컬럼은 소수성 상호작용 매질을 포함한다. 소수성 상호작용 매질은 지지체 구조 (110) 및 소수성 모이어티(moiety) (120)를 포함하고, 여기서, 소수성 모이어티 (120)는 지지체 구조 (110)에 부착된다. 매질은 충전 베드 컬럼 구성으로, 막의 형태로, 또는 표적 폴리펩타이드 (또는 다른 POI) 및 오염물 (예를 들면, HCP)을 포함하는 혼합물 또는 다른 액체를 수용할 수 있는 임의의 구성으로 유지되는 크로마토그래피 매질, 예를 들면, 비드 또는 다른 입자의 형태로 존재할 수 있다. 따라서, 예시적인 소수성 상호작용 매질은 아가로스 비드 (예를 들면, 세파로스), 실리카 비드, 셀룰로스 막, 셀룰로스 비드, 친수성 중합체 비드 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 개시내용의 HIC 장치의 크로마토그래피 컬럼은, 소수성 상호작용 매질이 약 0.5 센티미터 (cm) 내지 약 40 cm의 깊이 (예를 들면, 베드 높이)를 갖도록 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들면, HIC 장치의 크로마토그래피 컬럼은 약 0.5 cm 내지 약 30 cm, 약 0.5 cm 내지 약 20 cm, 약 0.5 cm 내지 약 10 cm, 약 0.5 cm 내지 약 5 cm, 약 1 cm 내지 20 cm, 약 1 cm 내지 약 10 cm, 또는 약 1 cm 내지 약 5 cm의 베드 높이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 크로마토그래피 컬럼은 크로마토그래피 컬럼의 내부 직경이 약 0.5 cm 내지 약 150 cm이 되도록 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들면, 크로마토그래피 컬럼의 내부 직경은 약 0.5 cm 내지 약 140 cm, 약 0.5 cm 내지 약 120 cm, 약 0.5 cm 내지 약 100 cm, 약 0.5 cm 내지 약 80 cm, 약 0.5 cm 내지 약 60 cm, 약 0.5 cm 내지 약 40 cm, 약 0.5 cm 내지 약 20 cm, 약 0.5 cm 내지 약 10 cm, 약 0.75 cm 내지 약 8 cm, 약 1 cm 내지 약 6 cm, 약 1 cm 내지 약 5 cm, 약 1 cm 내지 약 3 cm, 약 1.5 cm 내지 약 5 cm, 약 1.5 cm 내지 약 3 cm, 또는 약 1 cm 내지 약 2 cm이다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 크로마토그래피 컬럼의 내부 직경은 약 0.5 cm, 약 1 cm, 약 5 cm, 약 8 cm, 약 10 cm, 약 15 cm, 약 20 cm, 약 30 cm, 약 40 cm, 약 50 cm, 약 60 cm, 약 80 cm, 약 100 cm, 약 125 cm, 또는 약 150 cm이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 HIC 장치의 크로마토그래피 컬럼은 약 0.4 밀리리터 (mL) 내지 약 175 L의 총 용적 (예를 들면, 보유하는 혼합물, 이동상, 또는 다른 물질을 위한 총 수용력(capacity))을 갖는다. 일부 실시형태에서, 예를 들면, 본 개시내용에 따른 HIC 장치의 크로마토그래피 컬럼은 약 0.5 mL 내지 약 150 L, 약 0.5 mL 내지 약 130 L, 약 0.5 mL 내지 약 115 L, 약 0.5 mL 내지 약 100 L, 약 0.5 mL 내지 약 80 L, 약 0.5 mL 내지 약 60 L, 약 0.5 mL 내지 약 40 L, 약 0.5 mL 내지 약 20 L, 약 0.5 mL 내지 약 15 L, 약 0.5 mL 내지 약 10 L, 약 0.5 mL 내지 약 5 L, 약 0.5 mL 내지 약 1 L, 약 1 mL 내지 약 750 mL, 약 1 mL 내지 약 600 mL, 약 1 mL 내지 약 500 mL, 약 1 mL 내지 약 300 mL, 약 1 mL 내지 약 250 mL, 약 1 mL 내지 약 200 mL, 또는 약 1 mL 내지 약 150 mL의 총 용적을 갖는다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 크로마토그래피 컬럼은 약 0.5 mL, 약 1 mL, 약 5 mL, 약 10 mL, 약 50 mL, 약 100 mL, 약 150 mL, 약 300 mL, 약 400 mL, 약 500 mL, 약 1 L, 약 5 L, 약 10 L, 약 50 L, 약 80 L, 약 100 L, 약 120 L, 또는 약 150 L의 총 용적을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 소수성 모이어티 (120)는 폴리펩타이드의 소수성 영역 및 소수성 표면에 결합한다. 소수성 표면은 펩타이드를 포함하는 아미노 산 구조의 일부, 상기한 또는 다른 번역-후 변형, 또는 이의 조합일 수 있다. 소수성 상호작용 매질의 소수성 정도는 적합한 소수성 모이어티 (120)를 선택하여 제어될 수 있다. 소수성 모이어티 (120)를 선택하여 특정한 표적 폴리펩타이드 또는 POI에 결합시키고, 임의의 현재-공지되거나 향후-개발될 소수성 모이어티일 수 있다. 일부 실시형태에서 소수성 모이어티 (120)는 메틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 헥실, 옥틸, 및/또는 페닐 그룹을 포함할 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가는 선택된 소수성 모이어티 (120)의 소수성이 제공된 적용의 표적 폴리펩타이드 및/또는 HCP/다른 불순물, 뿐만 아니라 크로마토그래피 프로세스에서 바람직한 분리 또는 정제의 타입 및 정도에 기초하여 가변적일 수 있다는 것을 인식할 것이다.
소수성 상호작용 매질을 이용하여 생성물 및 프로세스 관련 오염물 및 불순물 (예를 들면, HCP)로부터 표적 폴리펩타이드 또는 다른 POI을 분리할 수 있다. 또한 도 1를 참조하면, 일부 실시형태에서, 표적 폴리펩타이드 (140) 및 다른 성분, 예를 들면, 오염물 (130) (예를 들면, 불순물, HCP 등)을 포함하는 혼합물을 HIC 장치 내로 로딩한다. 혼합물을 표적 폴리펩타이드 (140) 중 소수성 그룹을 소수성 상호작용 매질의 소수성 모이어티 (120)에 결합시키는 것을 촉진시키기 위해 설계된 용액 (예를 들면, 완충액)을 포함할 수 있다. 일부 표적 폴리펩타이드 (140)는 분자내 힘을 통해 소수성 모이어티 (120)에 결합하여 매질에 부착되지만, 다른 표적 폴리펩타이드 (140)는 크로마토그래피 컬럼을 통해 통과할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 혼합물이 컬럼을 통해 통과하는 동안, 혼합물로부터의 일부 오염물 (130)은 분자내 힘을 통해 소수성 모이어티 (120)에 결합하여 소수성 상호작용 매질에 부착될 수 있지만, 다른 오염물 (130)은 소수성 모이어티 (120)에 결합하는데 실패한다. 일부 실시형태에서, 표적 폴리펩타이드 (140)은 특정 오염물 또는 불순물 (예를 들면, HCP)보다 더 높은 친화성을 갖는 소수성 모이어티 (120)에 부착될 수 있는 구성성분 아미노 산, 번역-후 변형, 또는 이의 조합을 포함하는 특정 소수성 영역을 포함한다. 이후에 상세하게 기재된 바와 같이, 이어서 추가의 이동상은 컬럼 내로 도입되어 표적 폴리펩타이드 (140) 및 소수성 모이어티 (120) 사이의 친화성을 감소시킬 수 있고, 표적 폴리펩타이드 (140)를 HIC 장치의 크로마토그래피 컬럼을 통해서 통과시킬 수 있다.
추가 실시형태에서, 오염물 (130)은 표적 폴리펩타이드 (140)보다 더 높은 친화성을 갖는 소수성 모이어티 (120)에 부착될 수 있다. 이어서, 추가 이동상은 컬럼에 도입되어 오염물 (130) 및 소수성 모이어티 (120) 사이의 친화성을 낮출 수 있고, 이는 오염물 (130)을 HIC 장치의 크로마토그래피 컬럼을 통해 통과되도록 할 수 있다.
표적 폴리펩타이드 (140)를 포함하는 혼합물의 조성은 나트륨, 칼륨, 포스페이트, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (트리스), 시트레이트, 또는 아세테이트와 같은 염을 포함하는 첨가제의 첨가로 변경될 수 있다. 다른 첨가제를 첨가하여 표적 폴리펩타이드 (140), 오염물 (130), 소수성 모이어티 (120), 또는 이의 조합의 소수성 또는 다른 분자내 상호작용을 변경할 수 있다.
예시적인 HIC 장치 (200)는 본원에 기재된 일부 실시형태에 따라서 도 2에 개략적으로 도시된다. HIC 장치 (200)는 1번째 영역 (210), 2번째 영역 (220), 및 3번째 영역 (230)을 포함할 수 있다. 1번째 영역 (210), 2번째 영역 (220), 및 3번째 영역 (230) 각각은 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼, 예를 들면, 도 1에 대해 기재된 크로마토그래피 컬럼을 포함할 수 있다. 1번째 영역 (210)은, 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물, 하나 이상의 이동상, 또는 다른 액체가 1번째 영역 (210)으로 통과될 수 있도록 구성된 1번째 입구 (212)를 가질 수 있다. 1번째 영역 (210)은 또한 1번째 출구 (214)를 가질 수 있고, 이를 통해 유출물 (예를 들면, 1번째 영역 (210)을 통해 통과된 유체)은 HIC 장치 (200)로부터 통과되어 수집 또는 폐기될 수 있다. 유출물은 또한 1번째 영역 (210)에서 2번째 영역 (220)으로 1번째 인터커넥트(interconnect) (216)를 경유하여 통과될 수 있다. 1번째 영역 (210)은 또한 유출물을 3번째 영역 (230)으로부터 3번째 인터커넥트 (236)를 경유하여 수용할 수 있다.
2번째 영역 (220)은 1번째 영역 (210)으로부터의 유출물을 1번째 인터커넥트 (216)를 경유하여 수용할 수 있다. 2번째 영역 (220)은 또한, 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물, 하나 이상의 이동상, 또는 다른 액체가 2번째 영역 (220)으로 통과될 수 있도록 구성된 2번째 입구 (222)를 가질 수 있다. 2번째 영역 (220)은 또한 2번째 출구 (224)를 가질 수 있고, 이를 통해 유출물 (예를 들면, 2번째 영역 (220)을 통해 통과된 유체)은 HIC 장치 (200)로부터 통과되어 수집 또는 폐기될 수 있다. 유출물은 또한 2번째 영역 (220)에서 3번째 영역 (230)으로 2번째 인터커넥트 (226)를 경유하여 통과될 수 있다.
3번째 영역 (230)은 2번째 영역 (220)으로부터의 유출물 2번째 인터커넥트 (226)를 경유하여 수용할 수 있다. 3번째 영역 (230)은, 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물, 하나 이상의 이동상, 또는 다른 액체가 3번째 영역 (230)으로 통과될 수 있도록 구성된 3번째 입구 (232)를 가질 수 있다. 3번째 영역 (230)은 또한 출구 (234)을 가질 수 있고, 이를 통해 유출물 (예를 들면, 3번째 영역 (230)을 통해 통과된 유체)은 HIC 장치 (200)로부터 통과되어 수집 또는 폐기될 수 있다. 유출물은 또한 3번째 영역 (230)에서 1번째 영역 (220)으로 3번째 인터커넥트 (236)를 경유하여 통과될 수 있다.
당해 기술 분야의 숙련가가 이해할 수 있는 바와 같이, 크로마토그래피 장치에서 사용되는 것으로 공지된 다양한 콤포넌트 (예를 들면, 필터, 센서, 게이지, 온도계)는 HIC 장치 (200) 내로 도입될 수 있지만, 이를 도 2의 간략한 개략도에 나타내지 않았다. 일부 실시형태에서, UV 흡수, 전기 전도도, 또는 체류 용액의 pH 중 하나 이상은 HIC 장치 (200) 내의 하나 이상의 포인트에서 측정될 수 있다. UV 흡수, 전기 전도도, 또는 pH를 측정하기 위한 적합한 포인트는 입구 (212, 222, 232)에서, 영역 (210, 220, 230) 내에, 인터커넥트 (216, 226, 236)에서, 또는 출구 (214, 224, 234)에서를 포함한다. 입구 (212, 222, 232), 인터커넥트 (216, 226, 236), 및 출구 (214, 224, 234)는 개방 배치에서 폐쇄된 배치로 이동하도록 조작될 수 있고; 개방 배치는 유체가 입구 (212, 222, 232), 인터커넥트 (216, 226, 236), 또는 출구 (214, 224, 234)를 통해 통과할 수 있게 하고, 폐쇄된 배치는 유체가 입구 (212, 222, 232), 인터커넥트 (216, 226, 236), 또는 출구 (214, 224, 234)를 통해 통과하는 것을 방지한다. HIC 장치 (200)는 영역 (210, 220, 230), 출구 (212, 222, 232), 커넥트 (216, 226, 236), 및 출구 (214, 224, 234) 사이에 유체가 이송되도록 압력을 제공하는 하나 이상의 펌프를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 인터커넥트 (216, 226, 236)를 이동시켜 상이한 영역 (210, 220, 230)을 연결할 수 있다. 예를 들면, HIC 장치 (200)를 사용하는 프로세스 동안, 재배열하는 것이 바람직할 수 있고, 여기서, 인터커넥트 (226)는 영역 (220)으로부터의 유출물을 통과시킨다. 이러한 상황에서, 인터커넥트 (226)는 크로마토그래피 프로세스를 방해하지 않고, 유출물을 영역 (220)에서 영역 (210)으로 통과되도록 재구성될 수 있다. 이는 단지 하나의 예이고; 일반적으로, 임의의 인터커넥트 (216, 226, 236)는 진행중인 크로마토그래피 프로세스를 간섭하지 않고 상이한 영역을 연결하도록 재구성될 수 있다.
도 3a는 본 발명의 개시내용의 일부 실시형태에 따른 방법의 그래프 도식이다. 그래프의 왼쪽 축에서, 3개의 개별적인 열은 표지 C1, C2, 및 C3으로 정의되고, 이는 HIC 장치의 1번째 컬럼, 2번째 컬럼, 및 3번째 컬럼을 나타낸다. 상부 축은 시간을 나타내고, 왼쪽 및 오른쪽으로 무한 확장된다. 각 컬럼의 연속 점령(continuous occupation)은 본원에 기재된 실시형태의 예시이고; 이러한 배열은 종래의 HIC 방법과 비교하여 컬럼에 대한 유휴 시간(idle time) (예를 들면, "부동 시간(dead time)")을 감소 또는 제거한다. 도 3a의 전체에 나타나는 시간의 세그먼트(segment)는 반복되는 패턴의 하나의 예시적인 주기를 나타내고, 이는 도 3a에 나타낸 시간 세그먼트 전 및/또는 후에 반복될 수 있다. 4개의 시간은 T1, T2, T3, 및 T4로 표지되고, 그래프를 통해 수직으로 도시될 수 있는 임의의 선 T0의 예이다. 일부 실시형태에서, T1 내지 T2 사이의 인터벌(interval)은 T2 내지 T3 사이의 인터벌과 실질적으로 동일하고, 일부 실시형태에서, T3 내지 T4 사이의 인터벌과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 인접한 표지된 시간 사이의 인터벌 (예를 들면, T1 내지 T2 또는 T3 내지 T4)은 30 초(s) 이상, 90 분(min) 이하, 30 s 내지 60 min, 30 s 내지 30 min, 30 s 내지 15 min, 30 s 내지 10 min, 30 s 내지 8 min, 30 s 내지 7 min, 30 s 내지 6 min, 30 s 내지 5 min, 30 s 내지 4 min, 30 s 내지 3 min, 1 min 내지 5 min, 또는 2 min 내지 5 min일 수 있다. 박스 (410, 412, 414, 415, 417, 419, 424, 420, 422, 424, 425, 427, 429, 430, 432, 434, 435, 437, 및 439)는 각 박스가 나타나는 시간 인터벌 내에 각 컬럼, C1, C2, 및 C3 내에 발생하는 사건을 나타낸다. 예를 들면, 각각의 박스는 박스가 나타나는 컬럼의 열 내에 혼합물, 이동상, 또는 다른 체류(resident) 액체의 존재를 나타낼 수 있다.
도 3a를 가로질러 왼쪽에서 오른쪽으로 이동하면, 시간으로 "앞으로(forward)" 진행하면서, T1에서 T2까지, 혼합물의 이차적인 로드는 1번째 컬럼 C1에 존재할 수 있다 (박스 (410)). T2에서 T3까지, 혼합물의 일차적인 로드는 1번째 컬럼 C1에 존재할 수 있고 (박스 (412)), T3에서 T4까지, 하나 이상의 이동상은 1번째 컬럼 C1에 존재할 수 있다 (박스 (414)). 일부 실시형태에서, 컬럼은 혼합물의 일차적인 로드 또는 혼합물의 이차적인 로드 중 어느 하나를 수용할 수 있다. 혼합물의 "일차적인 로드(primary load)"는, 이전에 HIC 장치의 또 다른 컬럼을 통해 먼저 통과하지 않고, HIC 장치의 컬럼으로 통과하는 혼합물의 로드를 언급한다. 혼합물의 "이차적인 로드(secondary load)"는 제공된 컬럼에 도입되기 전에 HIC 장치의 또 다른 컬럼을 통해 통과된 혼합물의 로드를 언급한다 (예를 들면, 혼합물의 일차적인 로드로부터 유출물은 또 다른 컬럼으로 혼합물의 이차적인 로드로서 도입된다). 유출물을 표적 펩타이드를 포함하는 유출물을 갖는 하나의 컬럼에서 또 다른 컬럼으로 통과시키는 것은, 폐기되는 오버플로우(overflow)에 대한 염려 없이, 컬럼이 충만하게 로딩되게 할 수 있고, 각 컬럼의 사용 효율을 증가시킬 수 있고, 소모되는 소수성 상호작용 매질의 용적을 감소시킬 수 있다. 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물의 일차적인 로드를 수용할 수 있었거나 수용할 수 있는 소수성 상호작용 매질 상 오버플로우를 통과시켜, 처리된 로드 혼합물의 양에 비하여 소모된 소수성 상호작용 매질의 용적이 감소될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 이동상을 컬럼에 접촉시키는 것은 세척 완충액을 컬럼에 접촉시키고, 스트리핑 완충액을 컬럼에 접촉시키고, 및/또는 평형화 완충액을 컬럼에 접촉시킴을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세척 완충액은 하나 이상의 염, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 설페이트, 트리스, 또는 다른 염을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 스트리핑 완충액은 물, 알칼리성 용액, 또는 알콜을 포함하는 용액을 포함할 수 있다. 탈이온수는, 예를 들면, 5 용적 퍼센트 (vol.%) 미만 용해된 이온, 1 vol.% 미만 용해된 이온, 0.1 vol.% 미만 용해된 이온, 또는 심지어 0.01 vol.% 미만 용해된 이온을 가질 수 있다. 일부 실시형태에 따라서, 알칼리성 용액은 하나 이상의 알칼리성 이온성 화합물, 예를 들면, LiOH, NaOH, KOH, Ca(OH)2, NH4OH 또는 다른 알칼리성 화합물을 포함할 수 있다. 스트리핑 완충액 중 알칼리성 화합물의 농도는, 예를 들면, 약 0.1 N 내지 약 1.5 N, 약 0.1 N 내지 약 1 N, 약 0.1 N 내지 약 1.5 N, 약 0.5 N 내지 약 1.5 N, 약 0.1 N 내지 약 0.8 N, 약 0.1 N 내지 약 0.6 N, 약 0.1 N 내지 약 0.5 N, 약 0.1 N 내지 약 0.4 N, 또는 약 0.1 N 내지 약 0.3 N의 범위일 수 있다. 예를 들면, 스트리핑 완충액 중 알칼리성 화합물의 농도는 약 0.1 N, 약 0.2 N, 약 0.3 N, 약 0.4 N, 약 0.5 N, 약 0.6 N, 약 0.7 N, 약 0.8 N, 약 0.9 N, 약 1 N, 약 1.1 N, 약 1.2 N, 약 1.3 N, 약 1.4 N, 또는 약 1.5 N일 수 있다. 알콜을 포함하는 스트리핑 완충액은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 벤질 알콜, 또는 다른 알콜을 포함할 수 있다. 스트리핑 완충액 중 알콜의 농도는, 스트리핑 완충액의 총중량을 기준으로 하여, 약 0.1 vol.% 내지 약 30 vol.%, 예를 들면, 약 0.5 vol.% 내지 약 30 vol.%, 약 0.5 vol.% 내지 약 25 vol.%, 약 0.5 vol.% 내지 약 25 vol.%., 약 0.5 vol.% 내지 약 25 vol.%, 약 1 vol.% 내지 약 20 vol.%, 약 1 vol.% 내지 약 15 vol.%, 약 1 vol.% 내지 약 10 vol.%, 약 10 vol.% 내지 약 50 vol.%, 약 10 vol.% 내지 약 40 vol.%, 약 10 vol.% 내지 약 30 vol.%, 약 10 vol.% 내지 약 25 vol.%, 약 15 vol.% 내지 약 25 vol.%, 또는 약 20 vol.% 내지 약 25 vol.%의 범위일 수 있다. 예를 들면, 스트리핑 완충액 중 알콜의 농도는 약 0.1 vol.%, 약 0.5 vol.%, 약 1 vol.%, 약 2 vol.%, 약 3 vol.%, 약 5 vol.%, 약 10 vol.%, 약 15 vol.%, 약 20 vol.%, 또는 약 25 vol.%일 수 있다.
일부 실시형태에서, 평형화 완충액은 세척 완충액과 유사하거나 동일한 조성일 수 있다. 다른 실시형태에서, 평형화 완충액은 세척 완충액과 비교하여 조성이 가변적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 평형화 완충액은 하나 이상의 염, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 설페이트, 트리스, 또는 다른 염을 포함할 수 있다.
도 3a를 참조하면, 1번째 컬럼에서 하나 이상의 이동상 접촉시키는 것(414)은, 1번째 컬럼에서 세척 완충액 (박스 (415)), 1번째 컬럼에서 스트리핑 완충액 (박스 (417)), 및 1번째 컬럼에서 평형화 완충액 (박스 (419))을 포함하는 개별적인 상으로 나누어질 수 있다. 다음 열 (C2를 나타냄)에서, T1에서 T2까지, 하나 이상의 이동상은 2번째 컬럼에 존재할 수 있다 (박스 (424)). 이것도 2번째 컬럼에서 세척 완충액 (박스 (425)), 2번째 컬럼에서 스트리핑 완충액 (박스 (427)), 및 2번째 컬럼에서 평형화 완충액 (박스 (429))을 포함하는 개별적인 상으로 나누어질 수 있다. 오른쪽으로 이동하면, T2에서 T3까지 혼합물의 이차적인 로드는 2번째 컬럼에 존재할 수 있고 (박스 (420)), T3에서 T4까지 혼합물의 일차적인 로드는 2번째 컬럼에 존재할 수 있다 (박스 (422)).
다음 열에서, T1에서 T2까지 혼합물의 일차적인 로드는 3번째 컬럼에 존재할 수 있다 (박스 (432)). 이어서, T2에서 T3까지, 하나 이상의 이동상은 3번째 컬럼에 존재할 수 있고 (박스 (434)), T3에서 T4까지 혼합물의 이차적인 로드는 3번째 컬럼에 존재할 수 있다 (박스 (430)). 3번째 컬럼에서 하나 이상의 이동상 (박스 (434))은 3번째 컬럼에서 세척 완충액 (박스 (435)), 3번째 컬럼에서 스트리핑 완충액 (박스 (437)), 및 3번째 컬럼에서 평형화 완충액 (박스 (439))을 포함하는 개별적인 상으로 나누어질 수 있다.
제공된 시간 T0에, 수직선은, T0으로부터의 수직선에 의해 접촉되는 각각의 번호매김된 박스는 그때의 컬럼 중 용액을 나타내도록 그래프를 통해 도시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 시간 T1에서, 이차적인 로드 혼합물은 1번째 컬럼 C1 (박스 (410))로 도입되고, 하나 이상의 이동상은 2번째 컬럼 C2 (박스 (424))으로 통과되고, 예를 들면, 세척 완충액 C2 (박스 (425))로 통과되고, 일차적인 로드 혼합물은 3번째 컬럼 C3 (박스 (432))으로 통과된다. 더 광범위한 상의 세부분할(subdivisions), 예를 들면, 세부분할 (425, 427, 및 429)이 2번째 컬럼 (424)에서 하나 이상의 이동상의 동일 부분을 점령하는 것으로 나타나지만, 일부 실시형태에서, 세부분할은 더 광범위한 상의 동일하지 않은 부분을 점령할 수 있다. 도 3a에 도시된 방법이 본 발명의 개시내용의 실시형태에 따른 단지 하나의 예시적인 진행인 것을 또한 이해하여야 한다. 다른 순서, 배치, 및 단계는 본 발명의 개시내용의 범위 내인 것으로 생각되고 고려된다.
도 3b-3d는 이전에 기술된 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 위한 예시적인 주기를 나타낸다. 도 3b는 도 3a의 시간 인터벌 T1 내지 T2 동안 발생할 수 있는 일련의 사건을 도시한다. 따라서, 도 3b는 1번째 스테이지(301)에서 HIC 장치를 나타내고, 여기서, 1번째 영역 (310)은 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물의 이차적인 로드 (306)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 이차적인 로드의 유출물 (307)을 용리한다. 2번째 영역 (320)은 하나 이상의 이동상 (315)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 하나 이상의 이동상의 유출물 (316)을 용리한다. 3번째 영역 (330)은 혼합물의 일차적인 로드 (305)를 수용하고, 혼합물의 이차적인 로드 (306)를 또 다른 컬럼으로 통과시킨다.
도 3c는 2번째 스테이지(302)에서 HIC 장치를 나타내고 (인터벌 T2 내지 T3에 걸쳐서, 도 3a에 나타낸 바와 같음), 여기서, 1번째 영역 (310)은 혼합물의 일차적인 로드 (305)를 수용하고, 혼합물의 이차적인 로드 (306)를 또 다른 컬럼으로 통과시킨다. 2번째 영역 (320)은 혼합물의 이차적인 로드 (306)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 이차적인 로드의 유출물 (307)을 용리한다. 3번째 영역 (330)은 하나 이상의 이동상 (315)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 하나 이상의 이동상의 유출물 (316)을 용리한다.
도 3d는 3번째 스테이지(303)에서 HIC 장치를 나타내고 (인터벌 T3 내지 T4에 걸쳐서, 도 3a에 나타낸 바와 같음), 여기서, 1번째 영역 (310)은 하나 이상의 이동상 (315)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 하나 이상의 이동상의 유출물 (316)을 용리한다. 2번째 영역 (320)은 혼합물의 일차적인 로드 (305)를 수용하고, 혼합물의 2번째 로드 (306)를 또 다른 컬럼으로 통과시킨다. 3번째 영역 (330)은 하나 이상의 이동상 (315)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 하나 이상의 이동상의 유출물 (316)을 용리한다.
또 다른 예시적인 HIC 장치 (500)는 본원에 기재된 일부 실시형태에 따라서 도 4에 개략적으로 도시한다. HIC 장치 (500)는 1번째 영역 (510), 2번째 영역 (520), 3번째 영역 (530), 및 4번째 영역 (540)을 포함할 수 있다. 1번째 영역 (510)은, 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물, 하나 이상의 이동상, 또는 다른 액체가 1번째 영역 (510)으로 통과할 수 있도록 구성되는, 1번째 입구 (512)를 가질 수 있다. 1번째 영역 (510)은 또한 1번째 출구 (514)를 가질 수 있고, 이를 통해 유출물 (예를 들면, 1번째 영역 (510)을 통해 통과하는 유체)이 HIC 장치 (500)로부터 통과되어 수집 또는 폐기될 수 있다. 유출물은 또한 1번째 영역 (510)에서 2번째 영역 (520)으로 1번째 인터커넥트 (516)를 경유하여 통과될 수 있다. 1번째 영역 (510)은 또한 4번째 영역 (540)으로부터의 유출물을 4번째 인터커넥트 (546)를 경유하여 수용할 수 있다.
2번째 영역 (520)은 1번째 영역 (510)으로부터 1번째 인터커넥트 (516)를 경유하여 유출물을 수용할 수 있다. 2번째 영역 (520)은 또한, 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물, 하나 이상의 이동상, 또는 다른 액체가 2번째 영역 (520)으로 통과할 수 있도록 구성되는, 2번째 입구 (522)를 가질 수 있다. 2번째 영역 (520)은 또한 2번째 출구 (524)를 가질 수 있고, 이를 통해 유출물 (예를 들면, 2번째 영역 (520)을 통해 통과하는 유체)이 HIC 장치 (500)로부터 통과되어 수집 또는 폐기될 수 있다. 유출물은 또한 2번째 영역 (520)에서 3번째 영역 (530)으로 2번째 인터커넥트 (526)를 경유하여 통과될 수 있다.
3번째 영역 (530)은 2번째 영역 (520)으로부터 2번째 인터커넥트 (526)를 경유하여 유출물을 수용할 수 있다. 3번째 영역 (530)은, 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물, 하나 이상의 이동상, 또는 다른 액체가 3번째 영역 (530)으로 통과될 수 있도록 구성된, 3번째 입구 (532)를 가질 수 있다. 3번째 영역 (530)은 또한 출구 (534)를 가질 수 있고, 이를 통해 유출물 (예를 들면, 3번째 영역 (530)을 통해 통과하는 유체)이 HIC 장치 (500)로부터 통과되어 수집 또는 폐기될 수 있다. 유출물은 또한 3번째 영역 (530)에서 4번째 영역 (520)으로 3번째 인터커넥트 (536)를 경유하여 통과될 수 있다.
4번째 영역 (540)은 3번째 영역 (530)으로부터 3번째 인터커넥트 (536)를 경유하여 유출물을 수용할 수 있다. 4번째 영역 (540)은 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물, 하나 이상의 이동상, 또는 다른 액체가 4번째 영역 (540)으로 통과될 수 있도록 구성된 4번째 입구 (542)를 가질 수 있다. 4번째 영역 (540)은 또한 출구 (544)를 가질 수 있고, 이를 통해 유출물 (예를 들면, 4번째 영역 (540)을 통해 통과하는 유체)이 HIC 장치 (500)로부터 통과되어 수집 또는 폐기될 수 있다. 유출물은 또한 4번째 영역 (540)에서 1번째 영역 (510)으로 4번째 인터커넥트 (546)를 경유하여 통과될 수 있다.
크로마토그래피 장치에서 사용되는 공지된 다양한 콤포넌트 (예를 들면, 필터, 센서, 게이지, 온도계)는 도 4의 간략한 개략도에 나타내지 않았지만 HIC 장치 (500)로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, UV 흡수, 전기 전도도, 또는 체류 용액의 pH 중 하나 이상은 HIC 장치 (500) 중 하나 이상의 포인트에서 측정할 수 있다. UV 흡수, 전기 전도도, 또는 pH를 측정하는 적합한 포인트는 입구 (512, 522, 532, 542)에서 영역 (510, 520, 530, 540) 내에, 인터커넥트 (516, 526, 536, 546)에서 또는 출구 (514, 524, 534, 544)에서를 포함한다. 입구 (512, 522, 532, 542), 인터커넥트 (516, 526, 536, 546) 및 출구 (514, 524, 534, 544)는 개방 배치에서 폐쇄된 배치로 이동하도록 조작될 수 있고; 개방 배치는 유체가 입구 (512, 522, 532, 542), 인터커넥트 (516, 526, 536, 546), 또는 출구 (514, 524, 534, 544)를 통해 통과할 수 있게 하고, 폐쇄된 배치는 유체가 입구 (512, 522, 532, 542), 인터커넥트 (516, 526, 536, 546) 또는 출구 (514, 524, 534, 544)를 통해 통과하는 것을 방지한다. HIC 장치 (500)는 영역 (510, 520, 530, 540), 입구 (512, 522, 532, 542), 인터커넥트 (516, 526, 536, 546) 및 출구 (514, 524, 534, 544) 사이에 유체가 이송되도록 압력을 제공하는 하나 이상의 펌프를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 인터커넥트 (516, 526, 536, 546)를 이동시켜 상이한 영역 (510, 520, 530, 540)을 연결할 수 있다. 예를 들면, HIC 장치 (500)를 사용하는 하나 이상의 크로마토그래피 프로세스 동안, 재배열되는 것이 바람직할 수 있고, 여기서, 인터커넥트 (536)는 영역 (530)으로부터의 유출물을 통과시킨다. 이러한 상황에서, 이러한 상황에서, 인터커넥트 (536)는 크로마토그래피 프로세스를 방해하지 않고, 유출물을 영역 (530)에서 영역 (520)으로 통과되도록 재구성될 수 있다. 이는 단지 하나의 예이고; 일반적으로, 임의의 인터커넥트 (516, 526, 536, 546)는 진행중인 크로마토그래피 프로세스를 간섭하지 않고 상이한 영역 (510, 520, 530, 540)을 연결하도록 재구성될 수 있다.
도 5a는 본 개시내용에 따른 하나 이상의 방법의 그래프 도식이다. 그래프의 왼쪽 축에서, 4개의 개별적인 열은 HIC 장치의 1번째 컬럼, 2번째 컬럼, 3번째 컬럼, 및 4번째 컬럼을 나타내는 라벨 C1, C2, C3, 및 C4로 정의된다. 상부 축은 시간을 나타내고, 왼쪽 및 오른쪽으로 무한 확장된다. 각 컬럼의 연속 점령은 본원에 기재된 실시형태의 예시이고, 이러한 배열은 종래 HIC 방법과 비교하여 컬럼에 대한 유휴 시간 (예를 들면, "부동 시간")을 감소 또는 제거한다. 나타낸 시간의 세그먼트는 반복되는 패턴의 하나의 주기를 나타내고, 하기와 같은 숫자매김된 박스의 패턴이 도 5a에 나타낸 세그먼트의 두 양상 상에 반복될 수 있음이 이해된다. 5개 시간이 T1, T2, T3, T4, 및 T5로 표지되고, 그래프를 통해 수직으로 도시될 수 있는 임의의 선 T0의 예이다. 일부 실시형태에서, T1 내지 T2 사이의 인터벌은 T2 내지 T3 사이의 인터벌과 실질적으로 동일할 수 있고, 일부 실시형태에서, T3 내지 T4 사이의 인터벌과 실질적으로 동일할 수 있고, 일부 실시형태에서 T4 내지 T5 사이의 인터벌과 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 이들 시간 사이의 인터벌은 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서 인접하는 표지된 시간 사이의 인터벌 (예를 들면, T1 내지 T2 또는 T4 내지 T5)은 30 s 이상, 90 min 이하, 30 s 내지 60 min, 30 s 내지 30 min, 30 s 내지 15 min, 30 s 내지 10 min, 30 s 내지 8 min, 30 s 내지 7 min, 30 s 내지 6 min, 30 s 내지 5 min, 30 s 내지 4 min, 30 s 내지 3 min, 1 min 내지 5 min, 또는 2 min 내지 5 min일 수 있다. 박스 (710, 712, 714, 724, 720, 722, 734, 730, 732, 742, 744, 및 740)은 각 컬럼, C1, C2, C3, 및 C4 내에서 혼합물, 완충액, 또는 다른 체류 액체를 나타낸다.
도 5a를 가로질러 왼쪽에서 오른쪽으로 이동하면, 1번째 열 (1번째 컬럼 C1을 나타냄)에서, T1에서 T2까지, 혼합물의 이차적인 로드는 1번째 컬럼에 존재할 수 있다 (박스 (710)). T2에서 T3까지, 혼합물의 일차적인 로드는 1번째 컬럼에 존재할 수 있고 (박스 (712)), T3에서 T5까지 하나 이상의 이동상은 1번째 컬럼에 존재할 수 있다 (박스 (714)).
또한 도 5a를 참조하면, 1번째 컬럼에서 하나 이상의 이동상 (714)은 1번째 컬럼에서 세척 완충액 (박스 (715)), 1번째 컬럼에서 스트리핑 완충액 (박스 (717)), 및 1번째 컬럼에서 평형화 완충액 (박스 (719))을 포함하는 개별적인 상으로 나누어질 수 있다. 다음 열 (2번째 컬럼 C2를 나타냄)에서, T1에서 T2까지, 하나 이상의 이동상은 2번째 컬럼에 존재할 수 있고 (박스 (724)), 이전 주기의 T4에서 T5까지 연속된다. 이것도 2번째 컬럼에서 세척 완충액 (박스 (725)), 2번째 컬럼에서 스트리핑 완충액 (박스 (727)), 및 2번째 컬럼에서 평형화 완충액 (박스 (729))을 포함하는 개별적인 상으로 나누어질 수 있다. 오른쪽으로 이동하면, T2에서 T3까지 혼합물의 이차적인 로드는 2번째 컬럼에 존재할 수 있고 (박스 (720)), T3에서 T4까지 혼합물의 일차적인 로드는 2번째 컬럼에 존재할 수 있다 (박스 (722)).
다음 열 (컬럼 C3을 나타냄)에서, T1에서 T3까지 하나 이상의 이동상은 3번째 컬럼에 존재할 수 있다 (박스 (734)). 3번째 컬럼에서 하나 이상의 이동상 (734)은 3번째 컬럼에서 세척 완충액 (박스 (735)), 3번째 컬럼에서 스트리핑 완충액 (박스 (737)), 및 3번째 컬럼에서 평형화 완충액 (박스 (739))을 포함하는 개별적인 상으로 나누어질 수 있다. 이어서, T3에서 T4까지, 이차적인 로드는 3번째 컬럼에 존재할 수 있고 (박스 (730)), T4에서 T5까지 혼합물의 일차적인 로드는 3번째 컬럼에 존재할 수 있다 (박스 (732)).
다음 열 (컬럼 C4를 나타냄)에서, T1에서 T2까지 혼합물의 일차적인 로드는 4번째 컬럼에 존재할 수 있다 (박스 (742)). 이어서, T2에서 T4까지, 하나 이상의 이동상은 4번째 컬럼에 존재할 수 있고 (박스 (744)), T4에서 T5까지 혼합물의 이차적인 로드는 3번째 컬럼에 존재할 수 있다 (박스 (740)). 4번째 컬럼에서 하나 이상의 이동상 (744)은 3번째 컬럼에서 세척 완충액 (박스 (745)), 3번째 컬럼에서 스트리핑 완충액 (박스 (747)), 및 3번째 컬럼에서 평형화 완충액 (박스 (749))을 포함하는 개별적인 상으로 나누어질 수 있다.
제공된 시간 T0에, 수직선은, T0으로부터의 수직선에 의해 접촉되는 각각의 번호매김된 박스는 그때의 컬럼 중 용액을 나타내도록 그래프를 통해 도시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 시간 T1에서, 이차적인 로드 혼합물은 1번째 컬럼 (710)으로 도입되고, 하나 이상의 이동상은 2번째 컬럼(724), 예를 들면, 스트리핑 완충액 (727)에 존재하고, 일차적인 로드 혼합물은 3번째 컬럼 (732)으로 통과된다. 더 광범위한 상의 세부분할, 예를 들면, 세부분할 (725, 727, 및 729)이 2번째 컬럼(724)에서 하나 이상의 이동상의 동일 부분을 점령하는 것으로 나타나지만, 일부 실시형태에서, 세부분할은 더 광범위한 상의 동일하지 않은 부분을 점령할 수 있다는 것을 주의하여야 한다. 도 5a에 도시된 방법이 실시형태 방법의 단지 하나의 예인 것을 또한 이해하여야 한다. 다른 순서, 배치, 및 단계는 본 발명의 개시내용의 범위 내인 것으로 생각되고 고려된다.
도 5b-5e는 이전에 기재된 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 위한 예시적인 주기를 나타낸다. 도 5b는 도 5a의 T1 내지 T2 사이의 인터벌에서 발생하는 일련의 사건을 도시한다. 도 5b는 1번째 스테이지 (601)에서 HIC 장치를 나타내고, 여기서, 1번째 영역 (610)은 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물의 이차적인 로드 (606)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 이차적인 로드의 유출물 (607)을 용리한다. 2번째 영역 (620)은 하나 이상의 이동상 (615)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 하나 이상의 이동상의 유출물 (616)을 용리한다. 3번째 영역 (630)은 하나 이상의 이동상 (615)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 하나 이상의 이동상의 유출물 (616)을 용리한다. 4번째 영역 (640)은 혼합물의 일차적인 로드 (605)를 수용하고, 혼합물의 이차적인 로드 (606)를 또 다른 컬럼으로 통과시킨다.
도 5c는 2번째 스테이지 (602)에서 HIC 장치를 나타내고 (인터벌 T2 내지 T3에 걸쳐서, 도 5a에 나타낸 바와 같음), 여기서, 1번째 영역 (610)은 혼합물의 일차적인 로드 (605)를 수용하고, 혼합물의 이차적인 로드 (606)를 수집 또는 폐기될 수 있는 표적 폴리펩타이드를 포함하는 또 다른 컬럼으로 통과시킨다. 2번째 영역 (620)은 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물의 이차적인 로드 (606)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 이차적인 로드의 유출물 (607)을 용리한다. 3번째 영역 (630)은 하나 이상의 이동상 (615)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 하나 이상의 이동상의 유출물 (616)을 용리한다. 4번째 영역 (640)은 하나 이상의 이동상 (615)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 하나 이상의 이동상의 유출물 (616)을 용리한다.
도 5d는 3번째 스테이지 (603)에서 HIC 장치 (인터벌 T2 내지 T3에 걸쳐서, 도 5a에 나타낸 바와 같음)를 나타내고, 여기서, 1번째 영역 (610)은 하나 이상의 이동상 (615)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 하나 이상의 이동상의 유출물 (616)을 용리한다. 2번째 영역 (620)은 혼합물의 일차적인 로드 (605)를 수용하고, 혼합물의 이차적인 로드 (606)를 수집 또는 폐기될 수 있는 표적 폴리펩타이드를 포함하는 또 다른 컬럼으로 통과시킨다. 3번째 영역 (630)은 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물의 이차적인 로드 (606)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 이차적인 로드의 유출물 (607)을 용리한다. 4번째 영역 (640)은 하나 이상의 이동상 (615)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 하나 이상의 이동상의 유출물 (616)을 용리한다.
도 5e는 4번째 스테이지 (604)에서 HIC 장치를 나타내고 (인터벌 T2 내지 T3에 걸쳐서, 도 5a에 나타낸 바와 같음), 여기서, 1번째 영역 (610)은 하나 이상의 이동상 (615)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 하나 이상의 이동상의 유출물 (616)을 용리한다. 2번째 영역 (620)은 하나 이상의 이동상 (615)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 하나 이상의 이동상의 유출물 (616)을 용리한다. 3번째 영역 (630)은 혼합물의 일차적인 로드 (605)를 수용하고, 혼합물의 이차적인 로드 (606)를 수집 또는 폐기될 수 있는 표적 폴리펩타이드를 포함하는 또 다른 컬럼으로 통과시킨다. 4번째 영역 (640)은 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물의 이차적인 로드 (606)를 수용하고, 수집 또는 폐기될 수 있는 이차적인 로드의 유출물 (607)을 용리한다.
도 6은 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 예시적인 방법 (800)의 흐름도를 도시한다. 상기 방법은 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물을 복수의 컬럼의 1번째 컬럼으로 통과시킴을 포함할 수 있다 (예를 들면, 도 3a의 박스 (410)) (단계 810). 상기 방법은 추가로 표적 폴리펩타이드를 포함하는 유출물을 상기 복수의 컬럼의 1번째 컬럼에서 2번째 컬럼으로 통과시킴을 포함할 수 있다 (예를 들면, 혼합물의 2번째 로드 (306), 도 3b에 나타낸 바와 같음) (단계 820). 상기 방법은 추가로 하나 이상의 이동상을 1번째 컬럼으로 통과시킴을 포함할 수 있다(예를 들면, 박스 (414)) (단계 830). 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 표적 폴리펩타이드를 상기 복수의 컬럼 각각의 출구를 통해서 통과시킴을 포함할 수 있다 (예를 들면, 하나 이상의 이동상의 유출물 (316), 도 3b-3d에 나타낸 바와 같음) (단계 840). 도 3a-3d와 비교하면서, 도 5a-5e와 또한 비교할 수 있는 것이 당해 기술분야의 숙련가에게 명백하다.
본 발명의 개시내용의 실시형태에서, 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물은 또한 하나 이상의 HCP를 포함할 수 있다. 표적 폴리펩타이드를 하나 이상의 실시형태 방법을 사용하는 혼합물로부터 제조한 후, 수개의 유출물 샘플을 수득할 수 있다. 샘플을 혼합물의 하나 이상의 로드의 유출물로부터 및/또는 하나 이상의 이동상의 유출물로부터 수집할 수 있다. 예를 들면, 샘플을 혼합물의 일차적인 로드 또는 혼합물의 이차적인 로드 (또는 혼합물의 임의의 다른 로드)의 유출물로부터 수집할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플을 단지 하나 이상의 세척 완충액의 유출물로부터 수집할 수 있다. 다른 실시형태에서, 샘플을 다른 이동상의 유출물 및/또는 혼합물의 일차적인 또는 이차적인 로드로부터 수집할 수 있다. 표적 폴리펩타이드를 포함하는 수집된 샘플 모두의 응집 수집물(aggregate collection)을 풀(pool)로서 언급한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 측정치를 수집하여 표적 폴리펩타이드를 제조하는데 이용되는 방법의 효율을 확인할 수 있다. 본원 개시내용에 사용된 바와 같이, 효율은 다음 3가지 상이한 인자의 조합을 언급한다: 높은 분자량 분자 클리어런스 인자 (HMW CF), 수율, 및 생산성. 일부 실시형태에서, 더 효율적인 방법은 덜 효율적인 방법보다 더 높은 HMW CF, 더 높은 수율, 및 더 높은 생산성을 갖는다. 다른 실시형태에서, 더 효율적인 방법은 덜 효율적인 방법보다 더 높은 생산성을 갖고, 동시에 1.3 이상의 HMW CF를 유지하고 80% 이상의 수율을 유지한다. 추가 실시형태에서, 더 효율적인 방법은 덜 효율적인 방법보다 더 높은 생산성을 갖고, 동시에 1.5 이상의 HMW CF를 유지하고, 90% 이상의 수율을 유지한다.
고분자량 분자 클리어런스 인자 (High molecular weight molecule clearance factor; HMW CF)는 로딩된 혼합물과 비교하여 수집된 풀 중 상대적 단백질 함량의 근사치이다. 일부 실시형태에서, 분석용 크기 배제 크로마토그래피를 높은 분자량 분자를 야기하는 샘플 (예를 들면, 단백질)의 백분율을 측정하기 위해 수행할 수 있다 (HMW%). 다른 실시형태에서, 원심분리 기술을 사용할 수 있다 -- 샘플이 원심분리되면, 샘플의 구성 성분의 질량을 기준으로 하여, 층(strata)으로 분리되고, 가장 무거운 층(stratum), 침전물(infranatant)은 일반적으로 단백질을 포함하는 가장 무거운 분자를 포함한다. HMW%를 원심분리된 샘플의 침전물의 질량을 재고, 샘플의 총 질량으로 나누어 계산할 수 있다. 어느 하나의 방법을 사용하여, HMW CF를 하기에 나타낸 수학식 1에 따라서 계산할 수 있다.
수학식 (1)
Figure pct00001
수학식 (1)에 나타낸 바와 같이, HMW CF를 로딩된 혼합물의 HMW%를 풀의 HMW%로 나누어 계산할 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 1.3 이상의 HMW CF를 갖는다. 다른 실시형태에서, 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 1.4 이상, 1.5 이상, 1.6 이상, 1.8 이상, 또는 2.0 이상의 HMW CF를 갖는다.
수율은 얼마나 많은 표적 폴리펩타이드가 로딩 혼합물 중에 존재하는지를 비교한 풀에서 수집된 표적 폴리펩타이드의 양의 측정치이다. 샘플 중 표적 폴리펩타이드의 양이 UV 흡수, 전기 전도도, 또는 효소 면역분석 (예를 들면, ELISA)로 정량화될 수 있다. 수율은 하기에 나타낸 수학식 2에 따라 계산할 수 있다.
수학식 (2)
Figure pct00002
수학식 2에 나타낸 바와 같이, 수율은 HIC 장치 내로 로딩된 표적 폴리펩타이드의 질량을 풀에 수집된 표적 폴리펩타이드의 질량으로 나누어 계산할 수 있다. 샘플 중 표적 폴리펩타이드의 질량을 직접적으로 측정할 수 없기 때문에, 농도 (UV 흡수, 전기 전도도, 또는 효소 면역분석으로 계산됨)를 용적을 곱하여 질량을 측정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 수율 55% 이상의 수율을 갖는다. 다른 실시형태에서, 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 수율을 갖는다.
생산성은 표적 폴리펩타이드의 양을 제조하는데 필요한 시간 및 비용의 정량화이다. 생산성은 하기 나타낸 바와 같이 수학식 3에 따라서 계산할 수 있다.
수학식 (3)
Figure pct00003
수학식 3에서 나타낸 바와 같이, 생산성은 풀에서 수집된 표적 폴리펩타이드의 질량을, 사용된 소수성 상호작용 매질의 용적과 풀에 수집된 폴리펩타이드의 질량을 제조하는데 경과된 시간 (예를 들면, 주기 시간)의 곱으로 나누어 계산할 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 약 35 g/Lㆍhr 이상의 생산성을 갖는다. 다른 실시형태에서, 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 약 40 g/Lㆍhr 이상, 약 50 g/Lㆍhr 이상, 약 75 g/Lㆍhr 이상, 약 100 g/Lㆍhr 이상, 약 125 g/Lㆍhr 이상, 약 150 g/Lㆍhr 이상, 약 175 g/Lㆍhr 이상, 약 200 g/Lㆍhr 이상, 또는 약 220 g/Lㆍhr 이상의 생산성을 갖는다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 개시내용을 사실상 제한하지 않고 설명하는 것을 의도한다. 본 발명의 개시내용은 상기 상세한 설명 및 하기 실시예와 일치하는 추가의 양상 또는 실시형태를 포함함을 이해하여야 한다.
하기 실시예에서, 표적 폴리펩타이드를 표적 폴리펩타이드 및 HCP를 포함하는 혼합물로부터 제조하였다. 표적 폴리펩타이드를 본 발명의 개시내용의 실시형태에 따라서 3가지 상이한 방법을 사용하여 제조하였다. 표적 폴리펩타이드를 또한 비교 실시예로서 종래의 뱃치 프로세싱 방법을 사용하여 제조하였다.
실시예 1
1번째 실시예에서, 표적 항체를 제조하였다. 300 mL의 12.2 g/L 표적 항체를 포함하는 혼합물을 3개의-컬럼 HIC 장치로 1.67 mL/min의 로딩 유속에서 로딩하고, 여기서, 각 컬럼은 2.5 cm 베드 높이, 1.6 cm 내부 직경, 및 5 mL의 컬럼 용적을 가졌다. 로딩 완충액/혼합물은 나트륨 시트레이트의 30 밀리몰 (mM) 용액을 포함하고, 2M 아세트산 용액으로 6.0의 pH로 조정하였다. 로딩 완충액/혼합물을 3개 컬럼 중 1번째 및 2번째 컬럼 내로 로딩하였다. 2번째 컬럼을 1번째 컬럼을 경유하여 로딩하였다 (즉, 1번째 컬럼으로부터의 출구는 로딩 완충액을 2번째 컬럼으로 통과되게 함). 혼합물을 HIC 장치의 1번째 및 2번째 컬럼 내로 로딩한 후, 혼합물을 3개의 컬럼의 2번째 및 3번째 내로 로딩하고, 3번째 컬럼을 2번째 컬럼을 경유하여 로딩하였다(즉, 2번째 컬럼으로부터의 출구는 로딩 완충액을 3번째 컬럼으로 통과되게 함).
로딩 완충액/혼합물을 2번째 및 3번째 컬럼 내로 로딩하는 동안, 일련의 이동상을 HIC 장치의 1번째 컬럼으로 통과시켜 1번째 컬럼에서 혼합물의 다른 성분으로부터 표적 항체를 분리하고, 표적 항체를 수집하고, 이어서, 일련의 스트리핑 완충액을 1번째 컬럼에 통과시켜 컬럼을 재생하였다. 2번째 및 3번째 컬럼의 로딩에서 1번째 컬럼의 세척 및 스트리핑이 동시에 발생하였다. 이 단계 이후에, 로딩 완충액/혼합물을 3번째 및 1번째 컬럼 내로 로딩하고, 1번째 컬럼을 3번째 컬럼을 경유하여 로딩하고 (즉, 3번째 컬럼으로부터의 출구는 로딩 완충액을 1번째 컬럼으로 통과되게 함), 그 동안 완충액을 2번째 컬럼으로 통과시켜 2번째 컬럼에서 로딩된 혼합물로부터 표적 항체를 분리하고 수집하고, 이후에, 일련의 스트리핑 완충액을 2번째 컬럼으로 통과시켜 2번째 컬럼을 재생하였다. 3번째 및 1번째 컬럼의 로딩에서 2번째 컬럼의 세척 및 스트리핑이 동시에 발생하였다. 최종적으로, 로딩 완충액/혼합물을 1번째 및 2번째 컬럼으로 다시 로딩하고, 2번째 컬럼을 1번째 컬럼을 경유하여 이전에 기술한 바와 같이 로딩하고, 그 동안 완충액을 3번째 컬럼으로 통과시켜 3번째 컬럼에서 로딩된 혼합물로부터 표적 항체를 분리하고 수집하고, 이후에, 일련의 스트리핑 완충액을 3번째 컬럼으로 통과시켜 3번째 컬럼을 재생하였다. 1번째 및 2번째 컬럼의 로딩에서 3번째 컬럼의 세척 및 스트리핑이 동시에 발생하였다. 이러한 공정을 2회 주기적으로 반복하였다.
일련의 이동상은 세척 완충액, 일련의 스트리핑 완충액, 및 평형화 완충액을 포함하였다. 세척 완충액은 40 mM 트리스 및 30 mM 나트륨 시트레이트를 포함하고, 6.0의 pH로 조절하였다. 각 컬럼을 세척하기 위해, 4개의 컬럼 용적의 세척 완충액을 컬럼에 첨가하였다.
세척 완충액을 적용하고, 표적 항체를 포함하는 유출물을 컬럼으로부터 풀의 일부로서 수집한 후, 일련의 스트리핑 완충액을 컬럼 재생 프로세스의 부분으로서 컬럼으로 통과시켰다. 1번째 스트리핑 완충액은 탈이온수를 포함하고, 2개의 컬럼 용적의 이러한 완충액을 각 컬럼에 첨가하였다. 본원에 사용된 컬럼 용적은 제공된 컬럼이 보유할 수 있는 액체의 용적을 언급한다. 다음 스트리핑 완충액은 1 N NaOH를 포함하고, 2개의 컬럼 용적의 이러한 완충액을 1번째 스트리핑 완충액 후 각 컬럼에 첨가하였다. 다음 스트리핑 완충액은 탈이온수를 포함하고, 2개의 컬럼 용적의 이러한 완충액을 이전 알칼리성 스트리핑 완충액 후 각 컬럼에 첨가하였다. 다음 스트리핑 완충액은 20 vol.% 에탄올을 포함하고, 2개의 컬럼 용적의 이러한 완충액을 이전 탈이온수 스트리핑 완충액 후 각 컬럼에 첨가하였다. 탈이온수를 포함하는, 최종 스트리핑 완충액을, 컬럼에 첨가하였다 (2개의 컬럼 용적과 동일한 양으로). 스트리핑 완충액을 적용한 후, 4개의 컬럼 용적의 평형화 완충액을 컬럼에 첨가하였다. 평형화 완충액은 40 mM 트리스 및 30 mM 나트륨 시트레이트를 포함하고, 6.0의 pH로 조절하였다.
풀을 실시예 1에서 실시된 방법으로부터 수집한 후, 상기 방법의 HMW CF, 수율, 및 생산성을 본원에 상기된 바와 같이 측정하고 계산하였다. 결과를 하기 표 1에 요약한다.
실시예 2
2번째 실시예에서, 표적 항체를 제조하였다. 729 mL의 12.4 g/L 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물을 3개의 컬럼 HIC 장치로 1.67 mL/min의 로딩 유속에서 로딩하고, 여기서, 각 컬럼은 2.5 cm 베드 높이, 1.6 cm 내부 직경, 및 5 mL의 컬럼 용적을 가졌다. 로딩 완충액/혼합물은 나트륨 시트레이트의 30 밀리몰 (mM) 용액을 포함하고, 2M 아세트산 용액으로 6.0의 pH로 조정하였다. 로딩 완충액/혼합물을 3개 컬럼 중 1번째 및 2번째 컬럼 내로 로딩하였다. 2번째 컬럼을 1번째 컬럼을 경유하여 로딩하였다 (즉, 1번째 컬럼으로부터의 출구는 로딩 완충액을 2번째 컬럼으로 통과되게 함). 혼합물을 HIC 장치의 1번째 및 2번째 컬럼 내로 로딩한 후, 혼합물을 3개의 컬럼의 2번째 및 3번째 내로 로딩하고, 3번째 컬럼을 2번째 컬럼을 경유하여 로딩하였다(즉, 2번째 컬럼으로부터의 출구는 로딩 완충액을 3번째 컬럼으로 통과되게 함).
로딩 완충액/혼합물을 2번째 및 3번째 컬럼 내로 로딩하는 동안, 일련의 이동상을 HIC 장치의 1번째 컬럼으로 통과시켜 1번째 컬럼에서 혼합물의 다른 성분으로부터 표적 항체를 분리하고, 표적 항체를 수집하고, 이어서, 일련의 스트리핑 완충액을 1번째 컬럼에 통과시켜 컬럼을 재생하였다. 2번째 및 3번째 컬럼의 로딩에서 1번째 컬럼의 세척 및 스트리핑이 동시에 발생하였다. 이 단계 이후에, 로딩 완충액/혼합물을 3번째 및 1번째 컬럼 내로 로딩하고, 1번째 컬럼을 3번째 컬럼을 경유하여 로딩하고 (즉, 3번째 컬럼으로부터의 출구는 로딩 완충액을 1번째 컬럼으로 통과되게 함), 그 동안 완충액을 2번째 컬럼으로 통과시켜 2번째 컬럼에서 로딩된 혼합물로부터 표적 항체를 분리하고 수집하고, 이후에, 일련의 스트리핑 완충액을 2번째 컬럼으로 통과시켜 2번째 컬럼을 재생하였다. 3번째 및 1번째 컬럼의 로딩에서 2번째 컬럼의 세척 및 스트리핑이 동시에 발생하였다. 최종적으로, 로딩 완충액/혼합물을 1번째 및 2번째 컬럼으로 다시 로딩하고, 2번째 컬럼을 1번째 컬럼을 경유하여 이전에 기술한 바와 같이 로딩하고, 그 동안 완충액을 3번째 컬럼으로 통과시켜 3번째 컬럼에서 로딩된 혼합물로부터 표적 항체를 분리하고 수집하고, 이후에, 일련의 스트리핑 완충액을 3번째 컬럼으로 통과시켜 3번째 컬럼을 재생하였다. 1번째 및 2번째 컬럼의 로딩에서 3번째 컬럼의 세척 및 스트리핑이 동시에 발생하였다. 이러한 공정을 주기적으로 4회 반복하였다.
일련의 이동상은 세척 완충액, 일련의 스트리핑 완충액, 및 평형화 완충액을 포함하였다. 세척 완충액은 40 mM 트리스 및 30 mM 나트륨 시트레이트를 포함하고, 6.0의 pH로 조절하였다. 각 컬럼을 세척하기 위해, 4개의 컬럼 용적의 세척 완충액을 컬럼에 첨가하였다.
세척 완충액을 적용하고, 표적 항체를 포함하는 유출물을 컬럼으로부터 풀의 일부로서 수집한 후, 일련의 스트리핑 완충액을 컬럼 재생 프로세스의 부분으로서 컬럼으로 통과시켰다. 1번째 스트리핑 완충액은 탈이온수를 포함하고, 2개의 컬럼 용적의 이러한 완충액을 각 컬럼에 첨가하였다. 본원에 사용된 컬럼 용적은 제공된 컬럼이 보유할 수 있는 액체의 용적을 언급한다. 다음 스트리핑 완충액은 1 N NaOH를 포함하고, 2개의 컬럼 용적의 이러한 완충액을 1번째 스트리핑 완충액 후 각 컬럼에 첨가하였다. 다음 스트리핑 완충액은 탈이온수를 포함하고, 2개의 컬럼 용적의 이러한 완충액을 이전 알칼리성 스트리핑 완충액 후 각 컬럼에 첨가하였다. 다음 스트리핑 완충액은 20 vol.% 에탄올을 포함하고, 2개의 컬럼 용적의 이러한 완충액을 이전 탈이온수 스트리핑 완충액 후 각 컬럼에 첨가하였다. 탈이온수를 포함하는, 최종 스트리핑 완충액을, 컬럼에 첨가하였다 (2개의 컬럼 용적과 동일한 양으로). 스트리핑 완충액을 적용한 후, 4개의 컬럼 용적의 평형화 완충액을 컬럼에 첨가하였다. 평형화 완충액은 40 mM 트리스 및 30 mM 나트륨 시트레이트를 포함하고, 6.0의 pH로 조절하였다.
풀을 실시예 2에서 실시된 방법으로부터 수집한 후, HMW CF, 수율, 및 생산성을 본원에 상기된 바와 같이 측정하고 계산하였다. 결과를 하기 표 1에 요약한다.
실시예 3
3번째 실시예에서, 표적 폴리펩타이드를 제조하였다. 726 mL의 12.4 g/L 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물을 3개의 컬럼 HIC 장치로 6.70 mL/min의 로딩 유속으로 로딩하고, 여기서, 각 컬럼은 2.5 cm 베드 높이, 1.6 cm 내부 직경, 및 5 mL의 컬럼 용적을 가졌다. 로딩 완충액/혼합물은 나트륨 시트레이트의 30 밀리몰 (mM) 용액을 포함하고, 2M 아세트산 용액으로 6.0의 pH로 조정하였다. 로딩 완충액/혼합물을 3개 컬럼 중 1번째 및 2번째 컬럼 내로 로딩하였다. 2번째 컬럼을 1번째 컬럼을 경유하여 로딩하였다 (즉, 1번째 컬럼으로부터의 출구는 로딩 완충액을 2번째 컬럼으로 통과되게 함). 혼합물을 HIC 장치의 1번째 및 2번째 컬럼 내로 로딩한 후, 혼합물을 3개의 컬럼의 2번째 및 3번째 내로 로딩하고, 3번째 컬럼을 2번째 컬럼을 경유하여 로딩하였다(즉, 2번째 컬럼으로부터의 출구는 로딩 완충액을 3번째 컬럼으로 통과되게 함).
로딩 완충액/혼합물을 2번째 및 3번째 컬럼 내로 로딩하는 동안, 일련의 이동상을 HIC 장치의 1번째 컬럼으로 통과시켜 1번째 컬럼에서 혼합물의 다른 성분으로부터 표적 항체를 분리하고, 표적 항체를 수집하고, 이어서, 일련의 스트리핑 완충액을 1번째 컬럼에 통과시켜 컬럼을 재생하였다. 2번째 및 3번째 컬럼의 로딩에서 1번째 컬럼의 세척 및 스트리핑이 동시에 발생하였다. 이 단계 이후에, 로딩 완충액/혼합물을 3번째 및 1번째 컬럼 내로 로딩하고, 1번째 컬럼을 3번째 컬럼을 경유하여 로딩하고 (즉, 3번째 컬럼으로부터의 출구는 로딩 완충액을 1번째 컬럼으로 통과되게 함), 그 동안 완충액을 2번째 컬럼으로 통과시켜 2번째 컬럼에서 로딩된 혼합물로부터 표적 항체를 분리하고 수집하고, 이후에, 일련의 스트리핑 완충액을 2번째 컬럼으로 통과시켜 2번째 컬럼을 재생하였다. 3번째 및 1번째 컬럼의 로딩에서 2번째 컬럼의 세척 및 스트리핑이 동시에 발생하였다. 최종적으로, 로딩 완충액/혼합물을 1번째 및 2번째 컬럼으로 다시 로딩하고, 2번째 컬럼을 1번째 컬럼을 경유하여 이전에 기술한 바와 같이 로딩하고, 그 동안 완충액을 3번째 컬럼으로 통과시켜 3번째 컬럼에서 로딩된 혼합물로부터 표적 항체를 분리하고 수집하고, 이후에, 일련의 스트리핑 완충액을 3번째 컬럼으로 통과시켜 3번째 컬럼을 재생하였다. 1번째 및 2번째 컬럼의 로딩에서 3번째 컬럼의 세척 및 스트리핑이 동시에 발생하였다. 이러한 공정을 주기적으로 4회 반복하였다.
일련의 이동상은 세척 완충액, 일련의 스트리핑 완충액, 및 평형화 완충액을 포함하였다. 세척 완충액은 40 mM 트리스 및 30 mM 나트륨 시트레이트를 포함하고, 6.0의 pH로 조절하였다. 각 컬럼을 세척하기 위해, 4개의 컬럼 용적의 세척 완충액을 컬럼에 첨가하였다.
세척 완충액을 적용하고, 표적 항체를 포함하는 유출물을 컬럼으로부터 풀의 일부로서 수집한 후, 일련의 스트리핑 완충액을 컬럼 재생 프로세스의 부분으로서 컬럼으로 통과시켰다. 1번째 스트리핑 완충액은 탈이온수를 포함하고, 2개의 컬럼 용적의 이러한 완충액을 각 컬럼에 첨가하였다. 본원에 사용된 컬럼 용적은 제공된 컬럼이 보유할 수 있는 액체의 용적을 언급한다. 다음 스트리핑 완충액은 1 N NaOH를 포함하고, 2개의 컬럼 용적의 이러한 완충액을 1번째 스트리핑 완충액 후 각 컬럼에 첨가하였다. 다음 스트리핑 완충액은 탈이온수를 포함하고, 2개의 컬럼 용적의 이러한 완충액을 이전 알칼리성 스트리핑 완충액 후 각 컬럼에 첨가하였다. 다음 스트리핑 완충액은 20 vol.% 에탄올을 포함하고, 2개의 컬럼 용적의 이러한 완충액을 이전 탈이온수 스트리핑 완충액 후 각 컬럼에 첨가하였다. 탈이온수를 포함하는, 최종 스트리핑 완충액을, 컬럼에 첨가하였다 (2개의 컬럼 용적과 동일한 양으로). 스트리핑 완충액을 적용한 후, 4개의 컬럼 용적의 평형화 완충액을 컬럼에 첨가하였다. 평형화 완충액은 40 mM 트리스 및 30 mM 나트륨 시트레이트를 포함하고, 6.0의 pH로 조절하였다.
풀을 실시예 3에서 실시된 방법으로부터 수집한 후, 상기 방법의 HMW CF, 수율, 및 생산성을 본원에 상기된 바와 같이 측정하고 계산하였다. 결과를 하기 표 1에 요약한다.
비교 실시예
표적 폴리펩타이드를 실시예 1-3의 방법과 비교하기 위해 본원에 기재된 종래의 뱃치 프로세스를 사용하여 혼합물로부터 제조하였다. 로딩 첨가제, 세척 완충액, 스트리핑 완충액, 및 평형화 완충액은 실시예 방법에서 사용된 것과 동일하지만, 종래의 뱃치 방법론을 사용하였다. 590 g의 13.1 g/L 로드 혼합물을 크로마토그래피 컬럼에 첨가하였다. 혼합물을 컬럼을 통해서 통과시킨 후, 세척 완충액의 4 컬럼 용적을 컬럼에 첨가하고, 유출물을 수집하였다. 풀을 비교 실시예 방법으로부터 수집한 후, HMW CF, 수율, 및 생산성을 특성화하였다. 결과를 표 1에 요약한다.
Figure pct00004
표 1의 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 2 및 3은 비교 실시예 뱃치 방법보다 더 높은 생산성을 갖는다. 추가로, 실시예 3은 다른 실시예보다 더 높은 생산성을 성취할 수 있지만 여전히 1.5 이상의 HMW CF를 유지하고 90% 이상의 수율을 유지할 수 있다.
실시예 4
표적 항체를 가변적인 속도에서 불순물 돌파(impurity breakthroughs)를 비교하기 위해 3가지 상이한 로딩 속도로 HIC를 사용하여 제조할 수 있다. 컬럼을 표 2에 기재된 바와 같이 제조하였다:
Figure pct00005
로딩 속도는, 상기 순서 실행에서, 300 cm/h (3.93 mL/min, 또는 4.0 min 컬럼 중 체류 시간), 200 cm/hr (2.62 mL/min, 또는 6.0 min 컬럼 중 체류 시간), 및 400 cm/hr (5.24 mL/min, 또는 3.0 min 컬럼 중 체류 시간)였다. 모든 실행을 동일한 컬럼에서 수행하였다. 0.5 N NaOH에서 400 cm/hr 작동 전에 침지를 밤새 수행하였다.
고분자량 퍼센트 (HMW%; High molecular weight percentages)를 도 7a에 도시된 바와 같이 로딩의 함수로서 플롯팅하였다. 로드 물질의 HMW%는 1.78%였다. 200 g/L-수지 및 400 g/L-수지에서 누적 풀 HMW%를 하기 표 3에 나타낸다:
Figure pct00006
숙주 세포 단백질을 F665 CHO HCP ELISA 키트 (Cygnus Technologies)를 사용하여 각 로딩 속도에 대해 백만부로 정량화하였다. 수득된 양을 도 7b에 도시된 바와 같이 로딩의 함수로서 플롯팅하였다. 비교로서, 숙주 세포 단백질을 동일한 로드 물질의 음이온 교환 크로마토그래피 풀로부터 정량화하고, 549.61 ppm에 존재하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 5
표적 항체를 상이한 베드 높이 (실시예 4에서 사용되는 바와 같이 20 cm 및 2.5 cm)를 갖는 2개의 컬럼에서 HIC를 사용하여 제조하였다. 둘 다의 작동을 각 컬럼에서 체류 시간이 3 분 (즉, 20 cm 베드 높이 컬럼에서 400 cm/hr 선형 속도)이 되도록 수행하였다. 로드 물질에 대한 HMW%는 2.2%였다. 각 컬럼의 풀에 대한 HMW%를 도 7c에 나타낸 바와 같이 로딩 농도의 함수로서 플롯팅하였다.
당해 기술분야의 숙련가는 본원 개시내용을 기초로 하는 구상이 본 발명의 개시내용의 해결책 및 목적을 수행하기 위한 다른 방법 및 시스템을 설계하기 위한 기준으로서 용이하게 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 청구범위는 상기 상세한 설명에 의해 제한되는 것으로 고려되어서는 안된다.

Claims (20)

  1. 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    상기 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC; hydrophobic interaction chromatography) 장치의 1번째 영역에 접촉시키는 단계로서, 상기 1번째 영역은 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼 및 출구를 갖는, 단계;
    하나 이상의 이동상을 상기 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시키는 단계로서, 상기 2번째 영역은 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼 및 출구를 갖는, 단계; 및
    상기 표적 폴리펩타이드를 상기 HIC 장치의 적어도 1번째 및 2번째 영역의 출구를 통해서 통과시키는 단계
    를 포함하고;
    상기 1번째 영역에서 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물에 대한 체류 시간(residence time)이 상기 2번째 영역에서 하나 이상의 이동상의 체류 시간과 대략적으로 동일하게 구성되는(configured), 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드가 단클론성 항체인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 이동상이 평형화 완충액(equilibration buffer) 및 세척 완충액을 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 HIC 장치의 1번째 영역에서 상기 HIC 장치의 2번째 영역으로 상기 표적 폴리펩타이드를 포함하는 유출물을 통과시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 이동상을 상기 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시키는 단계가:
    세척 완충액을 상기 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시키고;
    상기 세척 완충액을 상기 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시킨 후, 2번째 영역을 재생시킴을 포함하고,
    여기서, 상기 2번째 영역을 재생시키는 것은:
    물을 상기 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시키고,
    알칼리성 용액을 상기 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시키고,
    알콜 용액을 상기 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시키고,
    평형화 완충액을 상기 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시킴
    을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 세척 완충액을 상기 HIC 장치의 2번째 영역에 접촉시키는 것에 이어서, 상기 표적 폴리펩타이드를 상기 HIC 장치의 2번째 영역의 출구를 통해서 통과시키는 것이 후속되는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 자외선 흡수, 전기 전도도, 또는 체류 용액의 pH 중 하나 이상이 상기 1번째 영역 또는 2번째 영역 중 어느 하나의 출구에서 측정되는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드가 50 g/Lㆍhr 이상의 생산성(productivity)으로 제조되는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 1번째 영역 또는 2번째 영역이 하나 초과의 크로마토그래피 컬럼을 포함하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 HIC 장치가 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼 및 출구를 갖는 3번째 영역을 추가로 포함하고, 상기 방법은:
    상기 3번째 영역에서 재생 주기(regeneration cycle)를 수행함을 추가로 포함하고, 상기 재생 주기를 수행하는 것은 하나 이상의 이동상을 상기 3번째 영역에 접촉시킴을 포함하고, 상기 재생 주기의 기간은 상기 1번째 영역에서 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물에 대한 체류 시간과 대략적으로 동일하게 구성되는, 방법.
  11. 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물로부터 표적 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 장치에서 복수의 크로마토그래피 컬럼의 1번째 컬럼으로 상기 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물을 통과시키는 단계로서, 여기서, 상기 복수의 컬럼 각각은 상기 복수의 컬럼의 또 다른 컬럼에 연결가능한 출구를 포함하는, 단계;
    상기 표적 폴리펩타이드를 포함하는 유출물을 상기 복수의 컬럼의 1번째 컬럼에서 2번째 컬럼으로 통과시키는 단계;
    하나 이상의 이동상을 상기 복수의 컬럼의 3번째 컬럼으로 통과시키는 단계;
    상기 표적 폴리펩타이드를 상기 복수의 컬럼 각각의 출구를 통해서 통과시키는 단계로서, 여기서, 상기 1번째 컬럼 및 2번째 컬럼에서 상기 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물의 체류 시간의 합계는 상기 3번째 컬럼에서 하나 이상의 이동상의 체류 시간의 합계와 실질적으로 동일한, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 하나 이상의 이동상을 상기 복수의 컬럼 각각으로 통과시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 하나 이상의 이동상을 컬럼으로 통과시키는 것이:
    세척 완충액을 상기 컬럼으로 통과시키고;
    세척 완충액을 상기 컬럼으로 통과시킨 후, 상기 컬럼을 재생시킴을 포함하고, 여기서, 상기 컬럼을 재생시키는 것이 물, 알칼리성 용액, 알콜 용액, 또는 평형화 완충액을 상기 컬럼으로 통과시킴을 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 표적 폴리펩타이드를 컬럼의 출구를 통해서 통과시키는 상기 단계가, 세척 완충액이 상기 컬럼으로 통과된 후에 일어나는, 방법.
  15. 제11항에 있어서, 자외선 흡수, 전기 전도도, 또는 체류 용액의 pH 중 하나 이상이 상기 1번째 컬럼 또는 2번째 컬럼 중 어느 하나의 출구에서 측정되는, 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드가 50 g/Lㆍhr 이상의 생산성으로 제조되는, 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 HIC 장치가 4개의 컬럼을 포함하고, 상기 1번째 컬럼 및 2번째 컬럼에서 상기 표적 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물의 체류 시간의 합계가 상기 3번째 컬럼 및 4번째 컬럼의 재생 시간의 합계와 실질적으로 동일한, 방법.
  18. 복수의 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 항체를 제조하는 방법으로서, 상기 복수의 크로마토그래피 컬럼 각각은 소수성 상호작용 매질을 포함하고, 상기 방법은:
    1번째 스테이지에서:
    상기 항체를 포함하는 일정량의(a quantity of) 혼합물을 상기 복수의 컬럼의 1번째 컬럼 내로 로딩(loading)하고;
    상기 일정량의 혼합물을 상기 복수의 컬럼의 2번째 컬럼 내로 상기 1번째 컬럼을 경유하여 로딩하고;
    세척, 스트리핑, 및 평형화 프로세스 중 적어도 하나를 포함하는 비-로딩 단계를 상기 복수의 컬럼의 3번째 컬럼에서 수행하고;
    2번째 스테이지에서:
    상기 항체를 포함하는 일정량의 혼합물을 상기 2번째 컬럼 내로 로딩하고;
    상기 일정량의 혼합물을 상기 3번째 컬럼 내로 상기 2번째 컬럼을 경유하여 로딩하고;
    상기 1번째 컬럼에서 세척, 스트리핑, 및 평형화 프로세스 중 적어도 하나를 포함하는 비-로딩 단계를 수행하고;
    3번째 스테이지에서:
    상기 항체를 포함하는 일정량의 혼합물을 상기 3번째 컬럼 내로 로딩하고;
    상기 일정량의 혼합물을 상기 3번째 컬럼 내로 상기 2번째 컬럼을 경유하여 로딩하고;
    세척, 스트리핑, 및 평형화 프로세스 중 적어도 하나를 포함하는 비-로딩 단계를 상기 2번째 컬럼에서 수행함을 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 1번째, 2번째, 및 3번째 스테이지를 주기적으로 연속 반복함을 추가로 포함하고, 각각의 스테이지는 상기 로딩 및 비-로딩 단계를 동시에 수행함을 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 로딩 단계 중 하나의 기간이 상기 비-로딩 단계의 기간과 대략적으로 동일하게 구성되는, 방법.
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