BR112020007532A2 - produção fermentativa de ácido n-acetilneuramínico - Google Patents

Abstract

São revelados microrganismos de ocorrência não natural para a produção de ácido N-acetilneuramínico, um método para a produção de ácido N-acetilneuramínico por fermentação dos microrganismos de ocorrência não natural e composições nutricionais contendo ácido N-acetilneuramínico que foi produzido por fermentação dos microrganismos de ocorrência não natural.

Description

PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE ÁCIDO N-ACETILNEURAMÍNICO

[001] A presente invenção refere-se a microrganismos de ocorrência não natural que têm a capacidade de produzir ácido N-acetilneuramínico, a métodos para a produção de ácido N-acetilneuramínico por fermentação com o uso dos referidos microrganismos de ocorrência não natural, ao uso de ácido N- acetilneuramínico produzido por fermentação, bem como a produtos contendo ácido N-acetilneuramínico produzido desse modo.

ANTECEDENTES

[002] Os ácidos siálicos (Sia) são uma família de monossacarídeos carregados negativamente com uma cadeia principal de nove carbonos. Mais de 50 formas desses a-cetoácidos foram encontradas na natureza. O ácido siálico mais abundante parece ser ácido N-acetilneuramínico (NANA, NeuNAc, Neu5Ac).

[003] Os ácidos siálicos estão presentes como os sacarídeos terminais dos glicanos presentes em glico-conjugados (glicoproteínas e glicolipídeos) na superfície de células de vertebrados e invertebrados superiores. Os ácidos siálicos são componentes dos lipopolissacarídeos e polissacarídeos capsulares de bactérias patogênicas incluindo Escherichia coli K1, Haemofilus influenzae, Haemofilus ducreyi, Pateurella multocida, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni e Streptococcus agalactiae.

[004] Os ácidos siálicos desempenham funções importantes em muitos processos fisiológicos e fisiopatológicos incluindo o desenvolvimento do sistema nervoso embriônico, metástase, a regulação de respostas imunológicas e infecções por bactérias ou vírus. Os ácidos siálicos são um componente essencial de gangliosídeos cerebrais e das cadeias de ácido polisiálico que modificam moléculas de adesão celular neuronal (NCAMs) que facilitam interações célula a célula, crescimento neuronal, a modificação de conectividade sinática e formação de memória. Em leitões, uma dieta rica em ácidos siálicos aumenta o nível de ácidos siálicos no cérebro e a expressão de dois genes relacionados ao aprendizado. Consequentemente, a dieta também aprimora o aprendizado e a memória.

[005] Bebês, em particular, bebês prematuros, têm uma alta demanda por nutrientes incluindo ácidos siálicos devido ao rápido crescimento cerebral e desenvolvimento do sistema imunológico nesse estágio de desenvolvimento. Os níveis de ácidos siálicos, particularmente ácido N-acetilneuramínico, são altos em leite produzido por ser humano (aproximadamente 0,5 g-L?). Em contraste, fórmulas infantis contêm uma quantidade baixa ou até mesmo insignificante de ácido N-acetilneuramínico.

[006] É, portanto, necessário fornecer ácidos siálicos, em particular, Neu5Ac, de uma qualidade e quantidade suficientes para a suplementação de fórmulas infantis e outras composições nutricionais. Nesse aspecto, várias abordagens foram publicadas no passado.

[007] O documento EP 1 484 406 A1 descreve um processo para produzir ácido N-acetilneuramínico com o uso de um microrganismo que tem a capacidade de produzir Neu5Ac, mas tem capacidade limitada ou mesmo nenhuma para decompor Neu5Ac quando comparado a uma cepa do tipo selvagem, de modo que Neu5Ac se acumule no meio de cultura e possa ser recuperado a partir do mesmo. Para possibilitar a produção de Neu5Ac, o microrganismo possui forte atividade de ácido N-acetilneuramínico sintase e/ou atividade de N-acetilglicosamina 2-epimerase. Mais especificamente, células de E. coli foram submetidas a mutagênese aleatória e uma linhagem celular que se desenvolveu de modo favorável em meio contendo glicose, mas mostrou desenvolvimento limitado ou nulo em meio contendo ácido N-acetilneuramínico foi transformada com um plasmídeo de expressão que codifica ácido N-

acetilneuramínico sintase e N-acetilglicosamina 2-epimerase. Após um período de cultivo, as células foram peletizadas por centrifugação, armazenadas a - 20ºC como células denominadas "células úmidas" e usadas conforme necessário após descongelamento. Para a produção de ácido N-acetilneuramínico, uma mistura de reação (30 ml) foi fornecida compreendendo 90 g-L*? de N-acetilglucosamina, 50 g-L*? de glicose, 10 mI-L* de xileno e 200 g-L* das referidas células úmidas sendo permeabilizadas pela presença de 4 g-L* de detergente. Após a conclusão da reação in vitro, a formação de Neu5Ac foi avaliada por HPLC.

[008] O Documento WO 94/29476 A1 revela um método in vitro para a preparação de ácido N-acetil-D-neuramínico a partir de N-acetil-D-glicosamina (NAG, GIcNAc). Na preparação, NAG é convertida em N-acetil-D-manosamina (NAM, ManNAc) por epimerização catalisada por base. Subsequentemente, NAM reage com piruvato em uma Neu5Ac-aldolase catalisada por reação para render Neu5Ac. A Neu5Ac-aldolase foi preparada a partir de células de E. coli recombinantes que expressam a referida NeuSAc-aldolase. A enzima aldolase foi imobilizada misturando-se microesferas de Eupergit-C* com um extrato cru das referidas células de E. coli recombinantes. A conversão de NAM em Neu5Ac foi iniciada adicionando-se as referidas microesferas de enzima imobilizadas a uma mistura de NAM e piruvato. Ao final da reação, Neu5Ac foi isolado da mistura de reação.

[009] Em uma alternativa ao processo anterior, o documento EP O 578 825 A1 revela um processo in vitro para a produção de ácido N-acetilneuramínico tratando-se uma mistura de N-acetilglicosamina e ácido pirúvico com uma ácido N-acetilneuramínico liase sob condições alcalinas.

[0010] A Patente nº US 7.579.175 revela um processo para a produção de ácido N-acetilneuramínico que utiliza microrganismos permeabilizados. O método compreende a preparação de uma mistura contendo (i) uma cultura de um microrganismo que tem atividade de ácido N-acetilneuramínico aldolase ou atividade de ácido N-acetilneuramínico sintetase, ou uma matéria tratada da cultura, (ii) uma cultura de um microrganismo com a capacidade de produzir ácido pirúvico ou uma matéria tratada da cultura, ou uma cultura de um microrganismo com capacidade de produzir ácido fosfoenolpirúvico ou uma matéria tratada da cultura, (iii) N-acetilmanosamina e (iv) uma fonte de energia que é necessária para a formação de ácido pirúvico ou ácido fosfoenolpirúvico. A mistura é preparada em um meio aquoso que compreende um agente quelante ou surfactante que permite a formação e acúmulo de ácido N- acetilneuramínico no meio aquoso, seguido pela recuperação de ácido N- acetilneuramínico a partir do meio aquoso.

[0011] As desvantagens dos processos supramencionados são (i) que apenas produção em pequena escala é possível e (ii) um excesso de piruvato é necessário para levar o equilíbrio de reação para Neu5Ac. Além disso, N- acetilglicosamina, N-acetilmanosamina e fosfoenolpiruvato são substratos dispendiosos para essas reações.

[0012] A publicação internacional WO 2008/040717 A2 revela um método para a produção de ácido siálico que compreende o cultivo de um microrganismo em um meio, em que o referido microrganismo porta genes heterólogos que codificam uma ácido siálico sintase (NeuB) e uma UDP-GICcNAc epimerase (NeuC), em que o referido microrganismo é desprovido de um gene que codifica CMP-Neu5Ac sintase (NeuA) ou em que quaisquer genes que codificam CMP- Neu5Ac sintase (NeuA) foram inativados ou deletados, e em que genes endógenos que codificam ácido siálico aldolase (NanA), para o transportador de ácido siálico (NanT) e, opcionalmente, para ManNAc quinase (NanK) foram deletados ou inativados. Neu5Ac foi purificado a partir do sobrenadante (2 litros) de uma cultura por precipitação com o uso de ácido acético glacial.

[0013] A publicação internacional nº WO 2008/097366 A2 se refere a células de E. coli metabolicamente modificadas que produzem ácido siálico. Nas referidas células, os genes nanT (transportador de ácido siálico) e nanA (ácido siálico aldolase) são inativados, e os genes neuC e neuB que facilitam a biossíntese de ácido siálico em Neisseria meningitidis grupo B são introduzidos e superexpressos com o uso de plasmídeos de expressão nas referidas células nanT' nanA' de E. coli. Além disso, o gene glicosamina sintase (glmS) de E. coli é cosuperexpresso com neuB e neuC.

[0014] A publicação internacional nº WO 2012/083329 A1 revela métodos e agentes para a produção de Neu5SAc em células fúngicas do gênero Trichoderma, que expressam, de modo constitutivo, N-acetilglucosamina 2- epimerase e ácido N-acetilneuramínico sintase. Tais células de Trichoderma foram cultivadas na presença de GIcNAc, e micélios foram analisados pela presença de Neu5Ac por HPLC-MS.

[0015] O Pedido de Patente nº CN 106 929 461 A revela um processo para a produção de ácido N-acetilneuramínico com o uso de células de Bacillus subtilis que expressam genes que codificam uma glicosamina-frutose-6-fosfato transaminase, uma glicosamina-6-fosfato Nr-acetiltransferase, uma N- acetilglicosamina isomerase e uma ácido N-acetilneuramínico sintase. As células têm, adicionalmente, o gene ptsG deletado, que codifica um componente específico de glicose do sistema de fosfotransferase EIICBA. Um rendimento de 0,66 g L* de Neu5Ac foi obtido cultivando-se essas células em um meio contendo glicose.

[0016] Zhu, D. e colaboradores (Zhu, D. et al. (2017) Biotechnol. Lett. 39: 227-234) relatam que o uso de um vetor de coexpressão de alto número de cópias para superexpressão de genes relacionados a síntese de PEP, pck e ppsA em E. coli aprimora a produção de Neu5Ac.

[0017] Era, portanto, um objetivo fornecer organismos microbianos que têm a capacidade de produzir ácido siálico de modo mais eficiente em uma escala industrial, e com o uso de uma fonte de carbono não dispendiosa como uma única fonte de carbono.

[0018] O objetivo é alcançado fornecendo-se um microrganismo de ocorrência não natural que porta uma via de síntese de ácido siálico que compreende pelo menos uma enzima heteróloga, que tem a via catabólica de ácido siálico de ocorrência natural desativada, que é aperfeiçoado em relação à disponibilidade de ácido fosfoenolpirúvico para a biossíntese de Neu5Ac, e com capacidade de utilizar uma única fonte de carbono exógena não dispendiosa presente no caldo de fermentação sem o uso de um sistema de ácido fosfoenolpirúvico:fosfotransferase para a aquisição da referida fonte de carbono exógena.

SUMÁRIO

[0019] Em um primeiro aspecto, é fornecido um microrganismo de ocorrência não natural para a produção de Neu5Ac, em que o microrganismo de ocorrência não natural tem uma via de síntese de ácido siálico que compreende pelo menos uma enzima heteróloga, em que a via catabólica de ácido siálico de ocorrência natural foi desativada, em que pelo menos um sistema de fosfotransferase para a importação de um sacarídeo que não é usado como uma fonte de carbono durante a produção fermentativa de Neu5Ac foi desativado, e em que o referido microrganismo de ocorrência não natural pode utilizar uma fonte de carbono exógena presente no caldo de fermentação sem o uso de um sistema fosfotransferase para a aquisição da referida fonte de carbono exógena.

[0020] Em um segundo aspecto, é fornecido o uso dos microrganismos de ocorrência não natural, de acordo com o primeiro aspecto para a produção de Neu5Ac.

[0021] Em um terceiro aspecto, é fornecido um método para a produção de Neu5Ac por fermentação com o uso de um microrganismo de ocorrência não natural, de acordo com o primeiro aspecto.

[0022] Em um quarto aspecto, é fornecido Neu5Ac produzido por meio de um método, de acordo com o segundo aspecto.

[0023] Em um quinto aspecto, é fornecido o uso de Neu5Ac, de acordo com o quarto aspecto para a fabricação de uma composição nutricional.

[0024] Em um sexto aspecto, é fornecida uma composição nutricional que compreende Neu5Ac que foi produzido pelo método do terceiro aspecto.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] A Figura 1 mostra uma representação esquemática que ilustra vias metabólicas para a produção de Neu5Ac.

[0026] A Figura 2 mostra uma representação esquemática que ilustra vias metabólicas adicionais e/ou alternativas para a produção de Neu5Ac.

[0027] A Figura 3 exibe um gráfico de colunas que ilustra os níveis de produção de Neu5Ac por diferentes cepas de E coli de ocorrência não natural.

[0028] A Figura 4 exibe um gráfico de coluna que ilustra os níveis de produção de Neu5Ac por diferentes cepas de E coli de ocorrência não natural.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0029] De acordo com o primeiro aspecto, é fornecido um microrganismo de ocorrência não natural que tem a capacidade de produzir Neu5Ac. O referido microrganismo de ocorrência não natural possui uma via de biossíntese de ácido siálico que compreende pelo menos uma enzima heteróloga que é expressa a partir de uma sequência nucleotídica heteróloga em um modo suficiente para produzir ácido siálico. A via catabólica de ácido siálico de ocorrência natural dos referidos microrganismos foi desativada. Pelo menos um sistema de fosfoenolpiruvato:açúcar — fosfotransferase também foi desativado. O microrganismo de ocorrência não natural pode utilizar uma fonte de carbono fornecida de maneira exógena como uma única fonte de carbono sem exigir um sistema de fosfoenolpiruvato:açúcar fosfotransferase para a aquisição da referida fonte de carbono.

[0030] O termo "microrganismo de ocorrência não natural", conforme usado na presente invenção, se refere a um microrganismo que foi geneticamente modificado para introduzir pelo menos uma sequência nucleotídica heteróloga e/ou em que uma sequência nucleotídica que ocorre naturalmente no microrganismo foi modificada, isto é, alterada, substituída, inserida ou deletada.

[0031] O termo "heterólogo", conforme usado na presente invenção, se refere a um composto, um polipeptídeo, proteína, enzima, molécula de ácido nucleico ou sequência nucleotídica - como parte de uma molécula de ácido nucleico - em um organismo hospedeiro que não tem, de forma natural, esse composto, polipeptídeo, proteína, enzima ou sequência nucleotídica. Uma “sequência nucleotídica heteróloga” pode ser um gene ou fragmento de gene. O termo “expressão heteróloga" se refere à expressão de um gene heterólogo ou fragmento de gene em um organismo hospedeiro que não tem, de forma natural, esse gene ou fragmento de gene. A expressão de gene heteróloga leva à presença de uma proteína, enzima ou polipeptídeo heterólogo no organismo hospedeiro.

[0032] O microrganismo de ocorrência não natural tem a capacidade de produzir Neu5Ac. O termo "produzir", conforme usado na presente invenção, se refere à produção de Neu5Ac por fermentação microbiana. “Fermentação microbiana" deve ser entendida como um processo industrial, - geralmente em larga escala - em que o produto desejado, por exemplo, Neu5Ac, é produzido cultivando-se um microrganismo em um caldo de fermentação contendo nutrientes, de modo que o microrganismo possa converter compostos em outros compostos. Os termos "larga escala” e "industrial" indicam que a produção pode ocorrer por fermentação microbiana em um volume de caldo de fermentação que excede 100 |, 500 |, 1.000 |, 5.000 |, 10.000 |, 50.000 |, 100.000 | ou até mesmo 200.000 |.

[0033] O termo "capaz de produzir" ou "capacidade para produzir", conforme usado na presente invenção, se refere à capacidade do microrganismo produzir Neu5Ac desde que seja cultivado em um meio ou caldo e sob condições que são permissivas para que o microrganismo sintetize Neu5Ac.

Via de biossíntese de ácido siálico

[0034] O microrganismo de ocorrência não natural é um microrganismo para a produção de Neu5Ac. Portanto, o referido microrganismo de ocorrência não natural tem a capacidade de produzir Neu5Ac. O microrganismo de ocorrência não natural é um microrganismo que foi geneticamente modificado para ter uma via de biossíntese de ácido siálico.

[0035] Em uma modalidade, a via de biossíntese de ácido siálico do microrganismo de ocorrência não natural compreende pelo menos uma enzima heteróloga selecionada a partir do grupo que consiste em glutamina-frutose-6- fosfato — aminotransferase, glicosamina-6-fosfato N-acetiltransferase, N- acetilglicosamina 2-epimerase, ácido N-acetilneuramínico sintase e uma açúcar fosfatase da superfamília similar a haloácido desidrogenase (HAD). De modo preferencial, o microrganismo de ocorrência não natural é um microrganismo que foi geneticamente modificado para conter um ou mais dos genes que codificam as referidas enzimas. Deve-se entender que um microrganismo hospedeiro que já porta um ou mais genes que codificam as referidas enzimas, e expressa referidos genes de um modo suficiente para produzir Neu5Ac, não precisa ser geneticamente modificado para concluir a via de biossíntese de ácido siálico, mas pode ser, contudo, geneticamente modificado para alterar o nível de expressão de um ou mais dentre os referidos genes para aumentar a quantidade de glutamina-frutose-6-fosfato aminotransferase, glicosamina-6-fosfato N- acetiltransferase, N-acetilglicosamina 2-epimerase, ácido N-acetilneuramínico sintase e/ou açúcar fosfatase da superfamília similar a HAD, aumentando, desse modo, a taxa de biossíntese de Neu5Ac no microrganismo de ocorrência não natural.

[0036] A enzima glutamina-frutose-6-fosfato aminotransferase (EC 2.6.1 .16) catalisa a conversão de frutose 6-fosfato em glicosamina-6-fosfato com o uso de glutamina. Essa reação enzimática é tipicamente considerada ser a primeira etapa na via de biossíntese de hexosamina. Nomes alternativos da glutamina-frutose-6-fosfato — aminotransferase — são — D-frutose-6-fosfato amidotransferase, GFAT, glicosamina-6-fosfato sintase, hexosefosfato aminotransferase e L-glutamina-D-frutose-6-fosfato amidotransferase.

[0037] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural tem uma glutamina-frutose-6-fosfato aminotransferase (GIMS), de modo preferencial, uma glutamina-frutose-6-fosfato aminotransferase heteróloga, de modo mais preferencial, uma glutamina- frutose-6-fosfato aminotransferase que é derivada de E. coli, ou uma variante funcional da GImS de E. coli. De modo mais preferencial, a variante funcional é uma versão da GImS de E. coli que mostra sensibilidade significativamente reduzida à inibição de glicosamina-6-fosfato em comparação à enzima do tipo selvagem, por exemplo, conforme codificado pelo gene mutante glmS (glmS'54 ou glmS' (consulte SEQ ID NO: 6).

[0038] O termo "variante funcional", conforme usado na presente invenção, em relação a uma enzima, se refere à variantes de polipeptídeo das enzimas designadas sem perda de atividade, e que compartilham pelo menos

70%, de modo preferencial, pelo menos 80%, de modo mais preferencial, pelo menos 90% e, de modo ainda mais preferencial, pelo menos 95% da identidade com a sequência aminoácido da enzima designada. Isso leva em consideração a possibilidade de alguma variabilidade nos dados de sequência genômica a partir dos quais esses polipeptídeos são derivados, e também a possibilidade de que alguns dentre os aminoácidos presentes nesses polipeptídeos possam ser substituídos sem afetar, de maneira significativa, a atividade catalítica de enzima.

[0039] O termo "variantes funcionais" também inclui variantes de polipeptídeo das enzimas designadas que representam variantes truncadas da enzima sem perda significativa da atividade catalítica. Desse modo, a sequência de aminoácido das variantes truncadas pode diferir das sequências de aminoácido da enzima designada em que um, dois ou um trecho de mais de dois aminoácidos consecutivos estão ausentes. O truncamento pode ser no terminal amino (N-terminal), no terminal carboxila (C-terminal) e/ou dentro da sequência de aminoácido da enzima designada.

[0040] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural contém uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma glutamina-frutose-6- fosfato aminotransferase. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência — nucleotídica “que codifia a glutamina-frutose-6-fosfato aminotransferase é uma sequência nucleotídica heteróloga. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a glutamina-frutose-6-fosfato aminotransferase codifica a glutamina-frutose-6- fosfato aminotransferase de E. coli ou uma variante funcional da mesma. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para conter uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência nucleotídica que codifica uma glutamina- frutose-6-fosfato aminotransferase ou variante funcional da mesma e/ou para compreender a glutamina-frutose-6-fosfato aminotransferase ou variante funcional da mesma.

[0041] A glutamina-frutose-6-fosfato —aminotransferase de E coli (UniProtKB - P17169; SEQ ID NO:11) é codificada pelo gene glmS de E. coli (SEQ ID NO: 10). Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural contém uma molécula de ácido nucleico que compreende e expressa uma sequência nucleotídica que codifica GImS de E. coli ou uma variante funcional da mesma, de modo preferencial, a sequência nucleotídica que codifica GIMS' (SEQ ID NO: 12 e SEQID NO: 13).

[0042] EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a GImMS de E. coli ou uma das variantes funcionais da GImS de E. coli tem uma identidade de sequência para glmS de E. coli de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.

[0043] A enzima glicosamina-6-fosfato Nr-acetiltransferase (Gnal, EC

2.3.1.4) converte glicosamina-6-fosfato em N-acetilglucosamina-6-fosfato com o uso de acetil-CoA. Essa reação enzimática é considerada ser a primeira etapa da subvia que sintetiza N-acetil-alfa-D-glicosamina 1-fosfato a partir de alfa-D- glicosamina 6-fosfato em Saccharomyces cerevisiae. Gna1l também é conhecida como fosfoglucosamina acetilase ou fosfoglucosamina transacetilase.

[0044] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural compreende uma glicosamina-6-fosfato —N- acetiltransferase (Gnal), de modo preferencial, uma glicosamina-6-fosfato N- acetiltransferase heteróloga, de modo mais preferencial, uma glicosamina-6- fosfato N-acetiltransferase que é derivada a partir de S. cerevisiae (UniProtKB -

P43577, SEQ ID NO: 15), ou uma variante funcional da Gnal1 de S. cerevisiae.

[0045] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural contém uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma glicosamina-6- fosfato N-acetiltransferase. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a glicosamina-6-fosfato N-acetiltransferase é uma sequência nucleotídica heteróloga. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a glicosamina-6-fosfato N- acetiltransferase codifica a glicosamina-6-fosfato N-acetiltransferase de S. cerevisiae ou um fragmento funcional da mesma. Entretanto, glicosamina-6- fosfato N-acetiltransferases, suas sequências de aminoácido deduzidas e as sequências nucleotídicas que codificam essas glicosamina-6-fosfato N- acetiltransferases são conhecidas a partir de uma variedade de diferentes espécies, e também podem ser usadas como glicosamina-6-fosfato N- acetiltransferases adequadas. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para conter uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma glicosamina-6-fosfato N-acetil-transferase ou variante funcional da mesma e/ou para compreender um glicosamina-6-fosfato N-acetiltransferase ou variante funcional da mesma.

[0046] A glicosamina-6-fosfato N-acetiltransferase de S. cerevisiae (UniProtKB-P43577; SEQ ID NO: 15) é codificada pelo gene gna1 de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 14). Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural compreende molécula de ácido nucleico que compreende e expressa uma sequência nucleotídica que codifica Gnal de S. cereviside ou uma variante funcional da mesma, de modo preferencial, a sequência nucleotídica que codifica Gna1 de 5. cerevisiae (SEQ ID

NO: 14).

[0047] EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a Gna1 de S. cerevisiae ou uma das variantes funcionais da Gnal de S. cerevisiae tem uma identidade de sequência para gnal de S. cerevisiae de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.

[0048] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural expressa uma açúcar fosfatase da superfamília similar a HAD que catalisa a conversão de N-acetilglucosamina-6-fosfato (GICNAc6P) em N-acetilglucosamina (GICNAc). A superfamília similar a HAD é nomeada após a enzima bacteriana haloácido desidrogenase e inclui fosfatases. Uma fosfatase adequada da superfamília similar a HAD que catalisa a conversão de GICNAc6P em GlcNAc pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em frutose-1- fosfato fosfatase (YgaB, UniProtKB - P77475) e alfa-D-glicose 1-fosfato fosfatase (YihX, UniProtKB - POA8Y3). As enzimas YgaB de E. coli e YihX de E. coli são consideradas também atuar em GICcNAC6P (Lee, S.-W. e Oh, M.-K. (2015) Metabolic Engineering 28: 143 a 150). Em uma modalidade, a açúcar fosfatase da superfamília similar a HAD que catalisa a conversão de GIcNAc-6-fosfato em GIcNAc é uma enzima heteróloga no microrganismo de ocorrência não natural. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a açúcar fosfatase da superfamília similar a HAD que catalisa a conversão de GICNAc6P em GlcNAc é selecionada a partir do grupo que consiste em YgqaB de E. coli, YihX de E. coli, e variantes funcionais das mesmas.

[0049] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural contém uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma açúcar fosfatase da superfamília similar a HAD que catalisa a conversão de GICNAcC6P em GIcNAc. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a açúcar fosfatase da superfamília similar a HAD que catalisa a conversão de GICNAC6P em GIlcNAc é uma sequência nucleotídica heteróloga. EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a açúcar fosfatase da superfamília similar a HAD que catalisa a conversão de GICcNAC6P em GIcNAc codifica a frutose-1-fosfato fosfatase de E coli ou a alfa-D- glicose 1-fosfato fosfatase de E coli ou um fragmento funcional de uma dentre essas duas enzimas.

[0050] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para conter uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma açúcar fosfatase da superfamília similar a HAD que catalisa a conversão de GICcNAC6P em GIcNAc ou um fragmento funcional da referida HAD fosfatase e/ou para compreender uma açúcar fosfatase da superfamília similar a HAD que catalisa a conversão de GICNAC6P em GIcNAc ou variante funcional da mesma.

[0051] As sequências nucleotídicas que codificam uma açúcar fosfatase adequada da superfamília similar a HAD que catalisa a conversão de GICNAc6P em GlcNAc podem ser selecionadas a partir do grupo de sequências nucleotídicas que codificam YqaB de E coli, YihX de E coli e variantes funcionais das mesmas.

[0052] YgaB de E coli (SEQ ID NO: 17) e YihX de E coli (SEQ ID NO: 19) são codificadas por genes de E coli ygaB (SEQ ID NO: 16) e yihX (SEQ ID NO: 18), respectivamente. Desse modo, em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural contém uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica YgaB de E coli, YihX de E coli ou um fragmento funcional de uma dentre essas duas enzimas.

[0053] EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica YgaB de E coli ou variante funcional da mesma tem uma identidade de sequência para ygaB de E. coli de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.

[0054] EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica YihX de E coli ou variante funcional da mesma tem uma identidade de sequência para yihX de E colide pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.

[0055] N-acetilglucosamina 2-epimerase (EC 5.1.3.8) é uma enzima que catalisa a conversão de N-acetilglucosamina (GICNAc) em N-acetilmanosamina (ManNAc). A enzima é uma racemase que atua em carboidratos e seus derivados. O nome sistemático dessa classe de enzima é N-acil-D-glicosamina 2- epimerase. Essa enzima participa do metabolismo de amino-açúcar e metabolismo de nucleotídeo-açúcar.

[0056] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural tem uma N-acetilglucosamina 2-epimerase, de modo preferencial, uma N-acetilglucosamina 2-epimerase heteróloga.

[00577 EM uma modalidade adicional e/ou alternativay a N- acetilglucosamina 2-epimerase é derivada de Anabena variabilis, Acaryochloris sp., Nostoc sp., Nostoc punctiforme, Bacteroides ovatus ou Synechocystis sp. ou é uma variante funcional das mesmas. A N-acetilglucosamina 2-epimerase de B. ovatus ATCC 8483 (UniProtKB - A7LVG6, SEQ ID NO: 21) é codificada por gene BACOVA 01816 (SEQ ID NO: 20). A Synechocystis sp. (cepa PCC 6803) N- acetilglucosamina 2-epimerase (UniProtKB - P74124; SEQ ID NO: 23) também é conhecida como proteína que se liga à renina e é codificada pelo gene s/r1975 (SEQ ID NO: 22).

[0058] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural contém uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica a N-acetilglucosamina 2- epimerase ou variante funcional da mesma. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a N-acetilglucosamina 2- epimerase é selecionada a partir do grupo que consiste em sequências nucleotídicas que codificam a N-acetilglucosamina 2-epimerase de Anabena variabilis, Acaryochloris sp., Nostoc sp., Nostoc punctiforme, Bacteroides ovatus ou Synechocystis sp., e variantes funcionais das mesmas. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a N- acetilglucosamina 2-epimerase é uma sequência nucleotídica heteróloga.

[0059] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para conter uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência nucleotídica que codifica uma N- acetilglucosamina 2-epimerase ou variante funcional da mesma e/ou para compreender a N-acetilglucosamina 2-epimerase ou variante funcional da mesma.

[0060] EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica uma das variantes funcionais da N-acetilglucosamina 2-epimerase tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% para o gene deSynechocystis sp. sIr1975.

[0061] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural tem atividade de GIcNAc-6-fosfato epimerase e atividade de ManNAc-6-fosfato fosfatase.

[0062] GIcNAc-6-fosfatase epimerase converte GlcNAc-6-fosfato em ManNAc-6-fosfato, enquanto ManNAc-6-fosfato fosfatase desfosforila ManNAc- 6-fosfato para gerar ManNAc. Possuir atividade de GICcNAc-6-fosfato epimerase e atividade de ManNAc-6-fosfato fosfatase fornece um modo adicional ou alternativo na produção de Neu5Ac para converter GlcNAc-6-fosfato em ManNAc, conforme mostrado na Figura 2.

[0063] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para possuir um gene que codifica GICcNAc-6-fosfato epimerase ou variante funcional da mesma. De modo preferencial, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para conter uma molécula de ácido nucleico que compreende e expressa uma sequência nucleotídica que codifica GICNAc-6-fosfato epimerase.

[0064] De modo preferencial, a GIcNAc-6-fosfato epimerase é derivada de Enterobacter cloacae subsp. cloacae (SEQ ID NO: 25) ou uma variante funcional da mesma. A sequência nucleotídica que codifica GICcNAc-6-fosfato epimerase de E. cloacae subsp. cloacae é a região de codificação de proteína do gene nanE de Enterobacter cloacae subsp. cloacae ATCC 13047 (SEQ ID NO: 24).

[0065] EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica uma dentre as variantes funcionais de GIcNAc-6- fosfato epimerase tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% para o gene nanE de E. cloacae subsp. cloacae.

[0066] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para possuir um gene que codifica ManNAc-6-fosfato fosfatase ou uma variante funcional da mesma.

[0067] A ácido N-acetilneuramínico sintase (EC 2.5.1 .56) é uma enzima que catalisa a conversão de N-acetilmanosamina (ManNAc) em Neu5Ac com o uso de fosfoenol-piruvato (PEP). A enzima ácido N-acetilneuramínico sintase (NeuB) é codificada pelo gene neuB.

[0068] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural compreende uma enzima ácido N-acetilneuramínico sintase ou uma variante funcional da mesma, de modo preferencial, uma ácido N-acetilneuramínico sintase heteróloga. Em uma modalidade adicional, a ácido N-acetilneuramínico sintase é derivada a partir de Campylobacter jejuni SEQ ID NO: 29), Streptococcus agalactiae, Butyrivibrio —proteoclasticus, Methanobrevibacter ruminatium, Acetobacterium woodii, Desulfobacula toluolica, Escherichia coli, Prevotella nigescens, Halorhabdus tiamatea, Desulfotignum fosfitoxidans, ou Candidatus Scalindua sp., Idomarina loihiensis, Fusobacterium nucleatum ou Neisseria meningitidis.

[0069] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural contém uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma enzima ácido N- acetilneuramínico sintase ou uma variante funcional da mesma. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a ácido N-acetilneuramínico sintase é uma sequência nucleotídica heteróloga. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a ácido N-acetilneuramínico sintase é selecionada a partir do grupo que consiste em sequências nucleotídicas que codificam C. jejuni NeuB (SEQ ID NO: 28), S. agalactiae NeuB, B. proteoclasticus NeuB, M. ruminatium NeuB, A. woodii NeuB, D. toluolica NeuB, E. coli NeuB, P. nigescens NeuB, H. tiamatea NeuB, D. Ffosfitoxidans NeuB, Ca. scalindua sp. NeuB, /. loihiensis NeuB, F. nucleatum NeuB, N. meningitidis NeuB e variantes funcionais das mesmas.

[0070] EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a ácido N-acetilneuramínico sintase ou uma das variantes funcionais da ácido N-acetilneuramínico sintase tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% para uma dentre as sequências nucleotídicas que codificam C. jejuni NeuB, S. agalactiae NeuB, B. proteoclasticus

NeuB, M. ruminatium NeuB, A. woodii NeuB, D. toluolica NeuB, E. coli NeuB, P. nigescens NeuB, H. tiamatea NeuB, D. fosfitoxidans NeuB, Ca. Scalindua sp. NeuB, /. loihiensis NeuB, F. nucleatum NeuB, N. meningitidis NeuB Via catabólica de ácido siálico

[0071] O microrganismo de ocorrência não natural para a produção de Neu5Ac não pode utilizar Neu5sAc. Em uma modalidade adicional, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado de modo que não utilizasse ácido siálico. Desse modo, o Neu5Ac que foi sintetizado pelo microrganismo de ocorrência não natural não é nem degradado em vias catabólicas de ocorrência natural, nem incorporado em lipopolissacarídeos e/ou em ácidos polisiálicos. Em vez disso, o microrganismo de ocorrência não natural tem a capacidade de secretar o Neu5SAc que o mesmo sintetizou no meio de cultura ou caldo de fermentação.

[0072] O microrganismo de ocorrência não natural tem a capacidade de produzir Neu5Ac. Para ter a capacidade de produzir Neu5Ac, a via catabólica de ácido siálico de ocorrência natural foi desativada. A interrupção da via catabólica de ácido siálico no microrganismo impede que qualquer ácido siálico sintetizado por aquele microrganismo seja metabolizado de modo adicional e, desse modo, aumenta o rendimento de ácido siálico que pode ser produzido pelo microrganismo de ocorrência não natural.

[0073] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a via catabólica de ácido siálico de ocorrência natural é desativada modificando-se geneticamente o microrganismo.

[0074] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a via catabólica de ácido siálico de ocorrência natural foi interrompida deletando-se ou mutando- se, de outro modo, um ou mais dos genes que codificam enzimas necessárias para o catabolismo de ácido siálico. A(s) enzima(s) necessária(s) para o catabolismo de ácido siálico, portanto, não são mais produzida, ou são produzidas em nível muito menor do que o normal, por exemplo, no microrganismo do tipo selvagem.

Por exemplo, um ou mais genes que codificam enzimas necessárias para o catabolismo de ácido siálico podem ser deletados do genoma, de modo que as enzimas correspondentes não sejam produzidas de modo algum.

Alternativamente, as sequências regulatórias que controlam expressão de gene podem ser substituídas ou mutadas de modo que o gene não possa ser transcrito ou traduzido.

Esse enfraquecimento de transcrição ou tradução inclui enfraquecimento permanente de transcrição ou tradução bem como enfraquecimento transiente de transcrição ou tradução. sto é, a transcrição ou tradução do respectivo gene pode ser regulada induzindo-se ou reprimindo-se a transcrição ou tradução.

Desse modo, a expressão de um respectivo gene pode ser induzida em qualquer ponto no tempo desejado durante o cultivo do microrganismo, de modo preferencial, adicionando-se uma expressão de indução de composto do respectivo gene (indutor) ao meio de cultura.

Em outra modalidade, a expressão de um respectivo gene pode ser reprimida em qualquer ponto no tempo desejado durante o cultivo do microrganismo, de modo preferencial, adicionando-se um composto que reprime a expressão do respectivo gene (repressor) ao meio de cultura ou esgotando-se o meio de cultura de qualquer composto que atua como um indutor.

Em uma abordagem diferente, a sequência nucleotídica que codifica uma enzima necessária para o catabolismo de ácido siálico pode ser alterada de tal modo que a atividade da enzima seja abolida.

Isso pode ser alcançado alterando-se a sequência nucleotídica para substituir um códon com sentido (que especifica um aminoácido) na sequência nucleotídica original por um códon de parada de modo que um polipeptídeo truncado seja gerado que carece da atividade da enzima necessária para o catabolismo de ácido siálico, ou substituindo-se um códon com sentido por outro códon que especifica um aminoácido diferente, que produz uma variante não funcional da enzima necessária para o catabolismo de ácido siálico.

[0075] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, os genes alvejados para interrupção ou alteração para abolir o catabolismo de ácido siálico no microrganismo de ocorrência não natural codificam uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em N-acetilmanosamina quinase, N- acetilmanosamina-6-fosfato epimerase, ácido N-acetilneuramínico aldolase e ácido siálico permease.

[0076] N-acetilmanosamina quinase (EC 2.7.1 .60) é uma enzima que fosforila N-acetilmanosamina para render N-acetilmanosamina-6-fosfato. A N- acetilmanosamina quinase é codificada pelo gene nankK. A sequência nucleotídica da região de codificação de proteína de nanK de E. coli é representada por SEQ ID NO: 30.

[0077] N-acetilmanosamina-6-fosfato epimerase é uma enzima que converte N-acetil-manosamina-6-fosfato (ManNAc-6-P) em N- acetilglucosamina-6-fosfato (GICNAc-6-P). Essa reação enzimática é uma etapa da subvia que sintetiza D-frutose 6-fosfato a partir de N-acetilneuraminato. A N- acetilmanosamina-6-fosfato epimerase é codificada pelo gene nanE. A sequência nucleotídica da região de codificação de proteína de nanE de E. coli é representada por SEQ ID NO: 32.

[0078] A ácido N-acetilneuramínico aldolase, também denominada N- acetilneuraminato liase, catalisa a clivagem de aldol reversível de ácido N- acetilneuramínico para formar piruvato e N-acetilmanosamina (ManNAc). À ácido N-acetilneuramínico aldolase é codificada pelo gene nanA. A sequência nucleotídica da região de codificação de proteína de nanA de E. coli é representada por SEQ ID NO: 34.

[0079] A ácido siálico permease catalisa o transporte dependente de próton de ácido siálico através da membrana celular. A ácido siálico permease pode transportar ácido N-acetilneuramínico. Variantes de ácido siálico permease também podem transportar os ácidos siálicos ácido N-glicolilheuramínico (NeusGc) e ácido 3-ceto-3-deoxi-D-glicero-D-galactononônico (KDN) relacionados. Embora ácido siálico permease seja conhecida por agir como um transportador bidirecional in vitro, a mesma é responsável pela importação celular de Neu5Ac extracelular in vivo. A ácido siálico permease é codificada pelo gene nanT. A sequência nucleotídica da região de codificação de proteína de nanT de E. coli é representada por SEQ ID NO: 36. A interrupção de nanT evita reimportação de Neu5Ac que foi produzido e secretado no meio de cultura pelo microrganismo de ocorrência não natural.

[0080] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural reduziu ou aboliu a atividade de pelo menos uma dentre as enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em N-acetilmanosamina quinase, N-acetilmanosamina-6-fosfato epimerase, ácido N-acetilneuramínico aldolase e ácido siálico permease, quando comparado ao microrganismo do tipo selvagem. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo foi geneticamente modificado para reduzir ou abolir a atividade de pelo menos uma dentre essas enzimas. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para deletar completamente um ou mais dos genes que codifiam N- acetilmanosamina quinase, N-acetilmanosamina-6-fosfato epimerase, ácido N- acetilneuramínico aldolase e ácido siálico permease, para enfraquecer a expressão de um ou mais dentre esses genes, ou abolir a atividade de uma ou mais dentre as enzimas correspondentes introduzindo-se mutações na região de codificação de proteína do(s) gene(s) de modo que o polipeptídeo codificado pela sequência nucleotídica alterada não possua a atividade enzimática da enzima codificada pela sequência nucleotídica não alterada.

[0081] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural não possui uma atividade enzimática fornecida por pelo menos uma dentre as enzimas N-acetilglucosamina-6-fosfato deacetilase e N- acetil-glicosamina-6-fosfato deaminase.

[0082] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, pelo menos uma dentre as enzimas MN-acetilglucosamina-6-fosfato deacetilase e N- acetilglucosamina-6-fosfato deaminase foi desativada no microrganismo de ocorrência não natural.

[0083] N-acetilglucosamina-6-fosfato deacetilase (EC 3.5.1.25) é a enzima envolvida na primeira etapa na biossíntese de amino-açúcar-nucleotídeos. A mesma catalisa a hidrólise do grupo N-acetila de N-acetilglucosamina-6-fosfato (GICNAcC-6-P) para render glicosamina G6-fosfato e acetato. A N- acetilglucosamina-6-fosfato deacetilase é codificada pelo gene nagA. A sequência nucleotídica da região de codificação de proteína de nagA de E. coli é representada por SEQ ID NO: 38.

[0084] A glicosamina-6-fosfato deaminase (EC 3.5.99.6) catalisa a isomerização-desaminação reversível de glicosamina 6-fosfato (GICN6P) para formar frutose 6-fosfato (Fru6P). A glicosamina-6-fosfato deaminase é codificada pelo gene nagB. A sequência nucleotídica da região de codificação de proteína de nagB de E. coli é representada por SEQ ID NO: 40.

[0085] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para desabilitar N- acetilglucosamina-6-fosfato deacetilase e/ou glicosamina-6-fosfato deaminase. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para deletar completamente um ou mais dos genes que codificam N-acetilglucosamina-6-fosfato deacetilase e glicosamina-6-fosfato deaminase, para enfraquecer a expressão de um ou mais dentre esses genes, ou abolir a atividade de uma ou mais dentre as enzimas correspondentes introduzindo-se mutações na região de codificação de proteína de pelo menos um dentre esses genes de modo que o polipeptídeo codificado pela sequência nucleotídica alterada não possua a atividade enzimática da enzima codificada pela sequência nucleotídica não alterada.

Sistema de transporte de carboidrato fosfotransferase

[0086] A produção intracelular de ácido siálico exige fosfoenolpiruvato (PEP). PEP é um intermediário metabólico muito importante porque está envolvido em glicólise e gliconeogênese. Para aperfeiçoar a produção de Neu5Ac, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para fornecer um melhor suprimento de PEP para biossíntese de ácido siálico. Para essa finalidade, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado em que pelo menos um sistema de fosfotransferase de transporte de açúcar (PTS) dependente de PEP foi desativado, isto é, o gene correspondente foi deletado ou interrompido, ou a expressão do gene foi enfraquecida.

[0087] UM sistema de fosfotransferase de transporte de açúcar dependente de PEP adequado para interrupção é GIcNAc permease, também conhecida como proteína-Npi-fosfo-L-histidina:N-acetil-D-glicosamina Npi- fosfotransferase (EC 2.7.1.193), que é codificada pelo gene nagE. NagE (conhecida como enzima ||) é um componente de um sistema de fosfotransferase de transporte de açúcar dependente de PEP. O sistema transporta, simultaneamente, seu substrato do periplaama ou espaço extracelular para o citoplasma e fosforila o mesmo. A deleção ou interrupção de nagE ou o enfraquecimento de sua expressão é vantajosa, visto que isso evita a importação de GIcNAc às custas de PEP, que pode reduzir, de outro modo, a quantidade de PEP disponível para a produção de ácido siálico. Portanto, a deleção ou interrupção de nagE ou o enfraquecimento de sua expressão aumenta o pool intracelular de PEP que pode ser utilizado pelo microrganismo de ocorrência não natural para produzir Neu5Ac, aumentando, desse modo, o rendimento de Neu5Ac no microrganismo de ocorrência não natural quando comparado a um microrganismo de ocorrência não natural que pode produzir ácido siálico, mas que porta um gene nagE intacto e funcional. A sequência nucleotídica da região de codificação de proteína de nagE de E. coli é representada por SEQ ID NO: 42.

[0088] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para abolir a atividade de proteína-Npi-fosfo-L-histidina:N-acetil-D-glicosamina Npi-fosfotransferase.

[0089] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para deletar completamente o gene nagE, para enfraquecer sua expressão, ou abolir a atividade da enzima NagE introduzindo-se mutações na região de codificação de proteína do gene nagE de modo que o polipeptídeo codificado pela sequência nucleotídica alterada não possua a atividade enzimática da enzima codificada pela sequência nucleotídica não alterada.

[0090] Outro sistema ou sistema adicional de fosfotransferase de transporte de açúcar dependente de PEP para importação de um carboidrato que é adequado para interrupção é a manose permease.

[0091] ManXYZ, o complexo de Enzima IIMY*" (manose PTS permease, proteína-Npi-fosfohistidina-D-manose fosfotransferase) importa hexoses exógenas (manose, glicose, glicosamina, frutose, 2-desoxiglicose, manosamina, N-acetilglucosamina, etc.) e libera os ésteres de fosfato no citoplasma celular.

Essa enzima também é um componente de um sistema de fosfotransferase de transporte de açúcar dependente de PEP. ManXYZ possui quatro domínios em três cadeias de polipeptídeo, ManX=IIABYº", ManY=IICY*" e ManZ=IIDY*", Os mesmos são membros da família de manose PTS permease, o grupo splinter, que não é homólogo à maioria das outras PTS permeases. As sequências nucleotídicas das regiões de codificação de proteína de manX, manY e manzZ de E. coli são representadas por SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 48, respectivamente.

[0092] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para abolir a atividade de proteína-Npi-fosfo-L-histidina:manose Npi-fosfotransferase.

[0093] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para deletar completamente um ou mais dos genes que codificam ManX, ManY e ManZ, para enfraquecer a expressão de um ou mais dentre esses genes, ou abolir a atividade de uma ou mais dentre as enzimas correspondentes introduzindo-se mutações na região de codificação de proteína(s) do(s) gene(s) de modo que o polipeptídeo codificado pela sequência nucleotídica alterada não possua a atividade enzimática da enzima codificada pela sequência nucleotídica não alterada.

[0094] Outro sistema ou sistema adicional de fosfotransferase de transporte de açúcar dependente de PEP adequado para interrupção é o transportador de glicose.

[0095] O transportador PTS específico de glicose (PtsG/Crr) absorve glicose exógena, liberando o éster de fosfato no citoplasma. O complexo de enzima 118 possui dois domínios em uma única cadeia de polipeptídeo com a ordem de domínio IIC-IIB (PtsG), e funciona com uma cadeia polipeptídica adicional, a proteína Crr ou IIAº'.

[0096] A deleção ou interrupção de ptsG e/ou crr ou o enfraquecimento de sua expressão é vantajosa, visto que isso evita a importação de glicose às custas de PEP, que reduziria, de outro modo, a quantidade de PEP disponível para a produção de ácido siálico. Portanto, a deleção ou interrupção do gene ptsG e/ou do gene crr ou enfraquecimento de sua expressão aumenta o pool intracelular de PEP que pode ser utilizado pelo microrganismo de ocorrência não natural para produzir Neu5Ac, aumentando, desse modo, o rendimento de Neu5Ac no microrganismo de ocorrência não natural que pode produzir Neu5Ac quando comparado a um microrganismo de ocorrência não natural que pode produzir ácido siálico, mas que porta um gene ptsG e/ou crr intacto e funcional.

[0097] As sequências nucleotídicas das regiões de codificação de proteína de ptsG e crr de E. coli são representadas por SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 52, respectivamente.

[0098] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para abolir a atividade de PtsG/Crr.

[0099] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para deletar completamente o gene ptsG e/ou o gene crr, enfraquecer a expressão do gene ptsG e/ou do crr, ou abolir a atividade de PtsG/Crr introduzindo-se mutações na região de codificação de proteína do gene ptsG e/ou do gene crr de modo que o polipeptídeo codificado pela sequência nucleotídica(s) alterada não possua a atividade enzimática da enzima(s) codificada pela sequência nucleotídica não alterada.

Aquisição de fonte de carbono

[00100] O microrganismo de ocorrência não natural exige uma fonte de carbono para desenvolvimento, proliferação e produção de Neu5Ac. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural pode se desenvolver em uma única fonte de carbono não dispendiosa, tal como - por exemplo - glicose ou sacarose. A referida única fonte de carbono fornece um eduto para biossíntese de ácido siálico no microrganismo de ocorrência não natural. Portanto, para a produção de Neu5Ac, não é necessário cultivar o microrganismo de ocorrência não natural na presença de ManNAc, GIcNAc ou glicosamina (GIcN). Além disso, o microrganismo de ocorrência não natural não exige um sistema de fosfotransferase de transporte de açúcar dependente de PEP para importação da única fonte de carbono e, portanto, não precisa utilizar PEP para a aquisição da única fonte de carbono.

[00101] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para utilizar sacarose como a única fonte de carbono.

[00102] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural tem um sistema de utilização de sacarose funcional. O referido sistema de utilização de sacarose funcional possibilita a importação celular de sacarose fornecida de maneira exógena e sua hidrólise de modo que os monossacarídeos resultantes glicose e frutose possam ser metabolicamente utilizados pelo metabolismo de microrganismo de ocorrência não natural e para a produção desejada de Neu5Ac.

[00103] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para possuir um sistema de utilização de sacarose funcional. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o sistema de utilização de sacarose do microrganismo de ocorrência não natural compreende um sistema de transporte simporte de sacarose próton, uma frutoquinase, uma invertase e um repressor de operon de sacarose.

[00104] Um sistema de transporte simporte de sacarose próton adequado é CscB, codificado pelo gene cscB, por exemplo, CscB de E. coli (SEQ ID NO: 55) conforme codificado pelo gene cscB de E. coli (SEQ ID NO: 54).

[00105] Uma frutoquinase adequada (EC 2.7.1.4) é CscK, codificada pelo gene cscK, por exemplo, CscK de E. coli (SEQID NO: 57) conforme codificado pelo gene cscK de E. coli (SEQID NO: 56).

[00106] Uma invertase adequada (EC 3.2.1.26) que hidrolisa resíduos de beta-D-frutofuranosídeo não redutor terminal em beta-D-frutofuranosídeos é CscA, por exemplo, cscA de E. coli (SEQ ID NO: 59), conforme codificado pelo gene cscA de E. coli (SEQ ID NO: 58).

[00107] Um repressor de operon de sacarose adequado é CscR, conforme codificado pelo gene cscR, por exemplo, o CscR de E. coli (SEQ ID NO: 61), conforme codificado pelo gene cscR de E. coli (SEQ ID NO: 60).

[00108] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para possuir um sistema de transporte simporte de sacarose próton, uma frutoquinase, uma invertase e um repressor de operon de sacarose ou variantes funcionais de qualquer uma dessas proteínas.

[00109] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para possuir uma molécula de ácido nucleico que compreende sequências nucleotídicas que codificam um sistema de transporte simporte de sacarose próton, uma frutoquinase, uma invertase e um repressor sacarose operon para a expressão do referido sistema de transporte simporte de sacarose próton, frutoquinase, invertase e repressor sacarose operon. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para expressar os genes cscB, cscK, cscA, de modo preferencial, os genes de E. coli cscB, cscK, cscA e cscR.

[00110] EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica uma variante funcional de CscB, CscK, CscA ou CscR tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% para E. coli cscB, cscK, cscA ou cscR, respectivamente.

[00111] O microrganismo de ocorrência não natural que pode produzir Neu5Ac e porta um sistema de utilização de sacarose funcional pode ser cultivado na presença de sacarose como uma única fonte de carbono para o metabolismo de microrganismo, bem como biossíntese de Neu5Ac. A sacarose é um açúcar não dispendioso e sua utilização como única fonte de carbono para a produção de Neu5Ac por fermentação é mais economicamente rentável do que outros precursores de ácido siálico, tais como GIcNAc.

[00112] Outro sistema de utilização de sacarídeo adequado permite que o microrganismo de ocorrência não natural se desenvolva em uma única fonte de carbono sem um sistema de fosfotransferase de transporte de açúcar dependente de PEP é LacY, codificada pelo gene lacY do operon lac. LacY é uma B-galactosídeo permease que importa lactose através de membranas celulares com o uso de um gradiente de próton na mesma direção. A lactose intracelular pode ser hidrolisada por uma B-galactosidase (LacZ) para fornecer glicose e galactose dentro da célula. O gene lacZ também é parte do operon lac.

[00113] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural expressa uma enzima B-galactosídeo permease e uma B-galactosidase.

[00114] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para expressar B- galactosídeo permease, de modo preferencial, a lactose permease LacY de E. coli (SEQID NO: 63) ou uma variante funcional da mesma e B-galactosidase, de modo preferencial, LacZ de E. coli (SEQID NO: 65) ou uma variante funcional da mesma. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para portar uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma enzima B-galactosídeo permease, de modo preferencial, uma sequência nucleotídica que codifica a LacY de E. coli (SEQ ID NO: 62) ou uma variante funcional da mesma, e/ou uma sequência nucleotídica que codifica uma B-galactosidase, de modo preferencial, uma sequência nucleotídica que codifica LacZ de E. coli (SEQ ID NO: 64) ou uma variante funcional da mesma.

[00115] EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica LacY de E. coli ou uma variante funcional da mesma tem uma identidade de sequência para lacY de E. coli de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.

[00116] EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica que codifica LacZ de E. coli ou uma variante funcional da mesma tem uma identidade de sequência para lacZ de E. coli de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.

[00117] Um microrganismo de ocorrência não natural que pode produzir Neu5Ac, e que expressa uma enzima B-galactosídeo permease funcional e uma B-galactosidase funcional permite o cultivo do referido microrganismo de ocorrência não natural em lactose como uma única fonte de carbono.

[00118] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural expressa um simportador de glicose/H*. De modo preferencial, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para portar uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica e permite a expressão de um simportador de glicose/H* no referido microrganismo de ocorrência não natural.

[00119] Um simportador de glicose/H* adequado é selecionado a partir do grupo que consiste no simportador de glicose/H* de Stafylococcus epidermis (UniProtKB - ADAOUSQDMS; SEQ ID NO: 67), no simportador de glicose/H* de Lactobacillus brevis (UniProtKB -AOAOC1 PU75, SEQ ID NO: 69) e variantes funcionais dos mesmos.

[00120] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para portar uma molécula de ácido nucleico que codifica o simportador de glicose/H* de S. epidermis ou o simportador de glicose/H* de L. brevis. De modo preferencial, o microrganismo de ocorrência não natural porta uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, e sequências nucleotídicas que têm uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% para SEQ ID NO: 66 ou SEQ ID NO: 68.

[00121] O microrganismo de ocorrência não natural que pode produzir Neu5Ac, e que expressa tanto o simportador de glicose/H* de S. epidermis ou o simportador de glicose/H* de L. brevis pode ser cultivado na presença de glicose como uma única fonte de carbono sem precisa de PEP para a aquisição da glicose suprida de maneira exógena.

Modificações genéticas adicionais

[00122] O microrganismo de ocorrência não natural que pode produzir Neu5Ac pode incluir, opcionalmente, recursos adicionais, e pode ser geneticamente modificado para possuir esses recursos adicionais. Esses recursos adicionais são considerados para aperfeiçoar a produtividade do microrganismo de ocorrência não natural levando a rendimentos mais elevados de Neu5Ac.

[00123] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural sintetiza mais PEP do que o tipo selvagem do microrganismo. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, oO microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para possuir uma via de biossíntese de PEP aprimorada. De modo preferencial, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para possuir uma atividade de fosfoenolpiruvato sintase aumentada, por exemplo, em que o gene ppsA que codifica gene de fosfoenolpiruvato sintase é superexpresso e/ou em que os microrganismos de ocorrência não natural contêm pelo menos uma cópia adicional de uma sequência nucleotídica que permite a expressão de uma fosfoenolpiruvato sintase ou uma variante funcional da mesma. A superexpressão de ppsA aprimora a síntese de PEP intracelular de modo que mais PEP esteja disponível para a produção de ácido siálico. Por exemplo, uma fosfoenolpiruvato sintase adequada é PpsA de E coli (SEQID NO: 71).

[00124] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural contém uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica PpsA de E coli ou uma variante funcional da mesma. A referida sequência nucleotídica que codifica PpsA de E coli ou uma variante funcional da mesma tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% para o gene ppsA de E coli (SEQID NO: 70).

[00125] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para superexpressar fosfoenolpiruvato carboxiquinase. Uma enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase adequada é E coli Pck (SEQ ID NO: 73).

[00126] A enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase (EC 4.1.1.49) é codificada pelo gene pck e catalisa a seguinte reação: oxaloacetato + ATP fosfoenolpiruvato + ADP + CO. A fosfoenolpiruvato carboxiquinase é envolvida em gliconeogênese.

[00127] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para superexpressar uma fosfoenol-piruvato carboxiquinase e/ou para conter pelo menos uma sequência nucleotídica adicional que permite a expressão de uma fosfoenolpiruvato carboxiquinase ou uma variante funcional da mesma. À superexpressão de uma fosfoenolpiruvato carboxiquinase aumenta o nível intracelular de PEP de modo que mais PEP esteja disponível para a produção de ácido siálico.

[00128] A sequência nucleotídica que codifica a sequência nucleotídica adicional que codifica fosfoenolpiruvato quinase ou uma variante funcional da mesma pode ser SEQ ID NO: 72 ou uma sequência nucleotídica que tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% para o gene pck de E coli (SEQ ID NO: 72).

[00129] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural não possui uma fosfoenolpiruvato carboxilase funcional (EC 4.1.1.31). A fosfoenolpiruvato carboxilase forma oxaloacetato, uma fonte de ácido dicarboxílico de quatro carbonos para o ciclo de ácido tricarboxílico. A fosfoenolpiruvato carboxilase é codificada pelo gene ppc. Em E coli, a fosfoenolpiruvato carboxilase (SEQID NO: 27) é codificada pelo gene pepC (SEQ ID NO: 26).

[00130] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para abolir a atividade de PEP carboxilase.

[00131] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para deletar o gene ppc ou o gene pepC, enfraquecer sua expressão, ou abolir atividade de PEP carboxilase introduzindo-se mutações na região de codificação de proteína do gene ppc/pepc de modo que o polipeptídeo codificado pela sequência nucleotídica alterada não possua atividade de PEP carboxilase.

[00132] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para ter atividade de piruvato quinase diminuída ou abolida.

[00133] A enzima piruvato quinase gera adenosina trifosfato (ATP) a partir de adenosina difosfato (ADP) e PEP. A geração de ATP a partir de ADPe PEPé a última etapa em glicólise, uma etapa que é irreversível sob condições fisiológicas. Muitos Enterobacteriaceae, incluindo E coli, têm duas isoformas de piruvato quinase, PykA (SEQ ID NO: 75) e PykF (SEQ IC NO: 77), que são 37% idênticas em E coli.

[00134] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para deletar um ou mais genes que codificam piruvato quinase, de modo preferencial, o gene pykA (SEQ ID NO: 74) e/ou o gene pykF (SEQ ID NO: 76), para enfraquecer a expressão de um ou mais desses genes que codificam piruvato quinase, ou abolir a atividade de pelo menos uma piruvato quinase introduzindo-se uma ou mais mutações na sequência nucleotídica da região de codificação de proteína de um ou mais dentre esses genes que codificam piruvato quinase de modo que o polipeptídeo codificado pela sequência nucleotídica alterada não possua atividade de piruvato quinase.

[00135] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural sintetiza mais glutamina quando comparado ao tipo selvagem. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para possuir uma via de biossíntese de glutamina aprimorada.

[00136] A glutamina sintetase (GInA) converte glutamato em glutamina pela seguinte reação: ATP + L-glutamato + NH3 = ADP + fosfato + L-glutamina. Em E. coli, glutamina sintetase (SEQ ID NO: 79) é codificada pelo gene glnA (SEQ ID NO: 78).

[00137] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para superexpressar uma glutamina sintase e/ou para conter pelo menos uma sequência nucleotídica adicional que permite a expressão de uma glutamina sintase ou uma variante funcional da mesma. A superexpressão de uma glutamina sintase aumenta o nível intracelular de glutamina que, por sua vez, aperfeiçoa a conversão intracelular de frutose-6-fosfato (Frc-6P) em glicosamina-6-fosfato (GICN-6P). De modo preferencial, a sequência nucleotídica que codifica a sequência nucleotídica adicional que codifica uma glutamina sintase ou variante funcional da mesma pode ser SEQ ID NO: 78 ou uma sequência nucleotídica que tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% para o gene glnA de E coli (SEQ ID NO: 78).

[00138] Modelagem metabólica em E. coli confirmou que o aprimoramento da síntese de glutamina aumenta a produção de Neu5Ac. Além disso, a análise de transcriptomas em uma cepa de produção de Neu5Ac de E. coli (f! NANA1) que não foi geneticamente modificada para aprimorar a síntese de glutamina revelou que glutamina sintase foi expressa em um nível superior quando comparado a uma cepa de E coli relacionada que não tem a capacidade de produzir Neu5Ac.

[00139] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural não porta uma glutamato sintase funcional ou tem menos atividade de glutamato sintase quando comparado a um microrganismo do tipo selvagem. A glutamato sintase de E coli consiste em duas subunidades, GItB (SEQ ID NO: 81) e GItD (SEQ ID NO: 83), e sintetiza glutamato às custas de glutamina. GItB é codificada pelo gene g/tB (SEQ ID NO: 80), e GItD é codificada pelo gene gltD (SEQ ID NO: 82).

[00140] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para deletar o gene g/tB e/ou o gene gltD, enfraquecer a expressão de pelo menos um dentre esses genes, ou para reduzir ou abolir atividade de glutamato sintase introduzindo-se uma ou mais mutações na região de codificação de proteína do gene gltB e/ou do gene gltD de modo que o(s) polipeptídeo(s) codificado(s) pela(s) sequência(s) nucleotídica(s) alterada(s) forneça(m) uma variante não funcional da glutamato sintase.

[00141] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural não possui atividade de glutaminase.

[00142] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para deletar pelo menos um dos genes de glutaminase asnB, ybaS e yneH, enfraquecer a expressão de pelo menos um dentre esses genes, ou abolir a atividade de glutaminase introduzindo-se uma ou mais mutações na região de codificação de proteína de asnB, ybaS e/ou yneH de modo que o polipeptídeo codificado por uma dentre as sequências nucleotídicas alteradas não possua atividade de glutaminase.

[00143] AsnB é uma asparagina sintetase e catalisa a conversão dependente de ATP de aspartato em asparagina, com o uso de glutamina. À asparagina sintetase AsnB de E. coli (SEQID NO: 85) é codificada pelo gene asnB de E. coli (SEQID NO: 84).

[00144] YbaS, também conhecida como GISA1 ou Gls1, é glutaminase 1, uma glutaminase que é altamente seletiva para L-glutamina. YbaS converte L- glutamina em L-glutamato. A glutaminase YbaS de E. coli (SEQ ID NO: 87) é codificada pelo gene ybaS de E. coli (SEQID NO: 86).

[00145] YneH, também conhecida como GIsA2, GIsB ou glutaminase 2, catalisa a seguinte reação: L-glutamina + HO = L-glutamato + NH3. A glutaminase YneH de E. coli (SEQ ID NO: 89) é codificada pelo gene yneH de E. coli (SEQ ID NO: 88).

[00146] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural tem uma atividade de desidrogenase de glutamato aumentada quando comparado ao microrganismo do tipo selvagem. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para superexpressar uma enzima glutamato desidrogenase e/ou contém pelo menos uma sequência nucleotídica adicional que permite a expressão de uma enzima glutamato desidrogenase ou uma variante funcional da mesma.

[00147] A enzima glutamato desidrogenase converte glutamato em a- cetoglutarato. A superexpressão de glutamato desidrogenase aumenta a formação de a-cetoglutarato, que, por sua vez, pode ser convertido em glutamato por glutamato sintase, por exemplo, por glutamato sintase, conforme codificado por gltD de E. coli ou uma variante funcional do mesmo. O glutamato pode ser, então, convertido em glutamina por glutamina sintetase (GInA) ou uma variante funcional da mesma.

[00148] EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência nucleotídica adicional que permite a expressão de uma enzima glutamato desidrogenase ou variante funcional da mesma inclui a região de codificação de proteína da glutamato desidrogenase GdhA de E. coli (SEQ ID NO: 91). À sequência nucleotídica que codifica a enzima glutamato desidrogenase ou variante funcional da mesma pode ser SEQ ID NO: 90 ou uma sequência nucleotídica que tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% para o gene gdhA de E. coli (SEQ ID NO: 90).

[00149] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural é incapaz de sintetizar lipopolissacarídeos (LPS) e/ou ácido colânico. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para abolir a síntese de LPS e/ou ácido colônico.

[00150] Em uma modalidade, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para deletar o gene wzxC, enfraquecer a expressão do gene wzxC ou abolir a atividade da enzima WzxC introduzindo-se em eor mais mutações na região de codificação de proteína do gene de modo que o polipeptídeo sendo codificado pela referida sequência nucleotídica alterada não possua a atividade enzimática de WzxC. WzxC é necessária para biossíntese de LPS e codifica uma proteína de exportação putativa. A sequência nucleotídica wzxC de E. coli é representada por SEQ ID NO: 92, e a sequência de aminoácido deduzida por SEQ ID NO: 93.

[00151] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural não possui atividade UDP-glicose:undecaprenilfosfato glicose-1-fosfato transferase.

[00152] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para abolir a atividade de UDP-glicose:undeca-prenilfosfato —glicose-1-fosfato transferase, de modo preferencial, deletando-se o gene wcaJ ou uma variante funcional do mesmo, enfraquecendo-se a expressão do gene wcal ou uma variante funcional do mesmo, ou abolindo-se a atividade da enzima WocaJ introduzindo-se mutações na região de codificação de proteína do de modo que o polipeptídeo codificado pela sequência nucleotídica alterada não possua a atividade enzimática de Wocal. Wocal codifia uma UDP-glicose:undecaprenilfosfato —glicose-1-fosfato transferase. A referida UDP-glicose:undecaprenilfosfato glicose-1-fosfato transferase é a primeira enzima em biossíntese de ácido colânico. A sequência nucleotídica de wcaJ de E. coli é representada por SEQ ID NO: 94, e a sequência de aminoácido deduzida por SEQ ID NO: 95.

[00153] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural pode não compreender uma B-galactosídeo permease funcional (LacY) e/ou uma B-galactosidase funcional (LacZ) desde que o microrganismo de ocorrência não natural possa ser cultivado em outra fonte de carbono única além de lactose, por exemplo, em sacarose ou glicose como fonte de carbono única.

[00154] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado em que o gene de B- galactosídeo permease (lacY) e/ou o gene de B-galactosidase (lacZ) foi deletado, em que a expressão do gene de B-galactosídeo permease e/ou do gene de B- galactosidase é enfraquecida ou em que a sequência nucleotídica da região de codificação de proteína do gene de B-galactosídeo permease e/ou do gene de B- galactosidase é alterada de modo que o polipeptídeo sendo codificado pela referida sequência nucleotídica(s) alterada não possua a atividade enzimática da B-galactosídeo permease e/ou da B-galactosidase.

[00155] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural não possui uma YjhC funcional. YjhC é uma oxidorredutase codificada pelo gene yjhC ou uma variante funcional da mesma.

[00156] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para abolir a atividade de oxidorredutase YjhC, de modo preferencial, deletando-se o gene yjhC, enfraquecendo-se a expressão do gene yjhC, ou introduzindo-se uma ou mais mutações na região de codificação de proteína do gene yjhnC de modo que o polipeptídeo sendo codificado pela sequência nucleotídica alterada não possua atividade de oxidorredutase YjhC.

[00157] A sequência nucleotídica yjhC de E. coli é representada por SEQ ID NO: 96, e a sequência de aminoácido deduzida por SEQ ID NO: 97.

[00158] EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, então, o microrganismo de ocorrência não natural não possui uma ou mais dentre as seguintes atividades enzimáticas: fucose isomerase, fuculoquinase e N- acetilglutamina aminoacilase. Em uma modalidade, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para abolir a atividade de uma ou mais dentre essas atividades enzimáticas.

[00159] A fucose isomerase converte aldose L-fucose na cetose L-fuculose correspondente. A fucose isomerase é a primeira enzima na subvia que sintetiza L-lactaldeído e fosfato de glicerona a partir de L-fucose. A fucose isomerase Fucl de E. coli (SEQID NO: 99) é codificada pelo gene fucl de E. coli (SEQID NO: 98).

[00160] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para abolir a atividade de fucose isomerase, de modo preferencial, deletando-se o gene fuel, enfraquecendo-se a expressão do gene fucl, ou modificando-se a região de codificação de proteína do gene fucl de modo que o polipeptídeo sendo codificado pela referida sequência nucleotídica alterada não possua atividade de fucose isomerase.

[00161] Fuculoquinase catalisa a fosforilação de fucose. Fuculoquinase é a segunda enzima na subvia que sintetiza L-lactaldeído e glicerona fosfato de L- fucose. A fuculoquinase FucK de £. coli (SEQ ID NO: 101) é codificada pelo gene fucK de E. coli (SEQ ID NO: 100). A fuculoquinase de E. coli também pode fosforilar, com menos eficiência, D-ribulose, D-xilulose e D-frutose.

[00162] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para abolir a atividade de fucose isomerase, de modo preferencial, deletando-se o gene fucK ou, enfraquecendo-se a expressão do gene fuck, ou introduzindo-se mutações na região de codificação de proteína do gene fucK de modo que o polipeptídeo sendo codificado pela referida sequência nucleotídica alterada não possua atividade de fucose isomerase.

[00163] N-acetilgalactosamina-6-fosfato deacetilase catalisa a seguinte reação: N-acetil-D-galactosamina 6-fosfato + H>yO> D-galactosamina 6-fosfato + acetato. N-acetilgalactosamina-6-fosfato deacetilase é codificada pelo gene agaA. Em contraste a cepas de E.coli C e EC3132, as cepas K-12 não podem se desenvolver em N-acetilgalactosamina e D-galactosamina, visto que as mesmas portam uma deleção e, desse modo, carecem de um sistema PTS ativo específico para esses compostos. Portanto, em cepas K-12, AgaA não é envolvido na degradação desses compostos. O AgaA de E. coli (SEQ ID NO: 103) é codificado pelo gene agaaA de E. coli (SEQ ID NO: 102).

[00164] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para abolir a atividade N-acetilgalactosamina-6-fosfato deacetilase, de modo preferencial, deletando- se o gene agaA, enfraquecendo-se a expressão do gene agaA ou introduzindo-

se mutações na região de codificação de proteína do gene agaA de modo que o polipeptídeo sendo codificado pela referida sequência nucleotídica alterada não possua atividade N-acetilgalactosamina-6-fosfato deacetilase.

[00165] O microrganismo de ocorrência não natural é selecionado a partir do grupo que consiste em leveduras, fungos e bactérias. De modo preferencial, o microrganismo de ocorrência não natural é um organismo que é geralmente reconhecido como seguro (GRAS), por exemplo, conforme confirmado pela Administração Federal de Medicamentos (FDA) ou determinado de maneira independente por especialistas qualificados, de modo mais preferencial, um microrganismo procariótico, de modo mais preferencial, um microrganismo bacteriano. Bactérias adequadas para a produção de Neu5Ac podem ser selecionadas a partir dos seguintes gêneros: Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Bifidobacterium, Sporolactobacillus, Micromomospora, Micrococcus, Rhodococcus e Pseudomonas. Espécies de bactéria adequadas incluem Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus thermofilus, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus — pumilus, Bacillus lentus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Citrobacter freundii, Clostridium cellulolyticum, Clostridium ljungdahiii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Coryne-bacterium glutamicum, Enterococcus faecium, Enterococcus thermofiles, Escherichia coli, Erwinia herbicola (Pantoea agglomerans), Lactobacillus acidofilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus jensenii, Lactococcus lactis, Pantoea citrea, Pectobacterium carotovorum, Proprionibacterium freudenreichii, Pseudomonas fluorescens,

Pseudomonas — aeruginosa, Streptococcus thermofiles e Xanthomonas campestris.

[00166] De acordo com o segundo aspecto, é fornecido o uso de um microrganismo de ocorrência não natural, conforme descrito anteriormente na presente invenção, para a produção de Neu5Ac. O microrganismo de ocorrência não natural tem a capacidade de produzir Neu5Ac em uma escala industrial. Os termos "capacidade" e "capaz" em relação à produção de Neu5Ac, conforme usado na presente invenção, se refere à capacidade de o microrganismo de ocorrência não natural sintetizar Neu5Ac e secretar o referido Neu5Ac no caldo de fermentação, desde que o referido microrganismo de ocorrência não natural seja cultivado sob condições permissivas para a produção de Neu5Ac. Isso inclui a capacidade de o referido microrganismo de ocorrência não natural proliferar a altas densidades celulares e ser cultivado em grandes volumes, por exemplo, volumes que excedem 1.000 |, de modo preferencial, 10.000 |, de modo mais preferencial, 80.000 | e, de modo mais preferencial, 200.000 |.

[00167] De acordo com o terceiro aspecto, é fornecido um método para a produção de Neu5Ac por fermentação microbiana. O método compreende as etapas de - fornecer um microrganismo de ocorrência não natural que tem a capacidade de produzir Neu5Ac, de modo preferencial, um microrganismo de ocorrência não natural, conforme descrito anteriormente na presente invenção; - cultivar o referido microrganismo de ocorrência não natural em um caldo de fermentação sob condições permissivas para a produção de Neu5Ac pelo referido microrganismo; e - opcionalmente - - recuperar Neu5Ac do caldo de fermentação.

[00168] O caldo de fermentação contém pelo menos uma fonte de carbono para o microrganismo de ocorrência não natural. Essa fonte de carbono é selecionada, de modo preferencial, a partir do grupo que consiste em glicose, xilose, frutose, sacarose, lactose, glicerol, gás de síntese e combinações dos mesmos.

[00169] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo de ocorrência não natural é cultivado na ausência e/ou sem a adição de um ou mais selecionados a partir do grupo que consiste em piruvato, glicosamina, N- acetilglucosamina no caldo de fermentação.

[00170] O método inclui uma etapa opcional de recuperar Neu5Ac produzido pelo microrganismo de ocorrência não natural durante seu cultivo no caldo de fermentação. O Neu5Ac pode ser recuperado do caldo de fermentação após os microrganismos de ocorrência não natural terem sido removidos do caldo de fermentação, por exemplo, por meio de centrifugação. Subsequentemente, o Neu5Ac pode ser purificado adicionalmente a partir do caldo de fermentação clarificado desse modo por técnicas adequadas, tais como microfiltração, ultrafiltração, diafiltração, cromatografia do tipo em leito móvel simulado, eletrodiálise, osmose reversa, filtração em gel, cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica e similares.

[00171] O método é adequado para a produção em larga escala e economicamente sustentável de Neu5Ac por fermentação microbiana.

[00172] De acordo com o quarto aspecto, é fornecido Neu5Ac, produzido por fermentação microbiana, conforme descrito na presente invenção.

[00173] De acordo com o quinto aspecto, é fornecido o uso de Neu5Ac produzido conforme descrito na presente invenção, para a fabricação de uma composição nutricional.

[00174] De acordo com o sexto aspecto, é fornecida uma composição nutricional contendo Neu5Ac que foi produzido pelo método do terceiro aspecto.

[00175] EM uma modalidade adicional e/ou alternativa, a composição nutricional contém, adicionalmente, pelo menos um oligossacarídeo de leite humano (HMO), de modo preferencial, pelo menos um HMO neutro e/ou pelo menos um HMO ácido.

[00176] O HMO(s) neutro pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em 2'-fucosilactose (2' -FL), 3-fucosilactose (3-FL), lacto-N-tetraose (LNT), lacto-N-neotetraose (LNnT) e lacto-N-fucopentaose | (LNPFI).

[00177] O um HMO(s) ácido pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em HMOs sialilado, de modo preferencial, a partir do grupo que consiste em 3'-sialilactose (3-SL), 6'-sialilactose (6-SL), sialilacto-N-tetraose a (LST-a), sialilacto-N-tetraose b (LST-b), sialilacto-N-tetraose c (LST-c) e disialilacto-N- tetraose (DSLNT).

[00178] EM uma modalidade adicional, a composição nutricional é selecionada a partir do grupo que consiste em formulações medicinais, fórmula infantil e suplementos dietéticos.

[00179] A composição nutricional pode estar presente em forma líquida ou em forma sólida incluindo, mas sem limitação, pós, grânulos, flocos e péletes.

[00180] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a composição nutricional também inclui microrganismos, preferencialmente, microrganismos probióticos. Para aplicações em alimento infantil, microrganismos preferenciais são derivados de ou podem ser encontrados no microbioma de um ser humano saudável. De modo preferencial, os microrganismos são selecionados a partir dos gêneros Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Stafylococcus, Peptostreptococcus, Leuconostoc, Clostridium, Eubacterium, Veilonella, Fusobacterium, Bacterioides, Prevotella, Escherichia, Propionibacterium ou Saccharomyces, mas outros também podem ser apropriados. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo é selecionado a partir do grupo que consiste em Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium aldolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus fermentum, Leuconostoc mesenteroides; Escherichia coli, Enterococcus faecium e Streptococcus thermophilus (VSLH3).

[00181] Além da combinação de Neu5Ac com organismos vivos, NeuSAc também pode ser usado em combinação com culturas exterminadas que são usadas, por vezes, no campo de probióticos (por exemplo, bactéria tindalizada). Tais culturas exterminadas podem fornecer proteínas, peptídeos, oligossacarídeos, fragmentos de parede celular e produtos naturais que causam um estímulo de curto prazo do sistema imunológico.

[00182] A combinação de Neu5Ac e microrganismos probióticos na composição nutricional é particularmente vantajosa para estabelecer ou restabelecer um microbioma apropriado no intestino, e os benefícios para a saúde associados ao mesmo são facilitados.

[00183] Ainda mais vantajosa é a combinação de ácido siálico com prebióticos estabelecidos, tais como galactooligossacarídeos (GOS) e/ou frutooligossacarídeos (FOS) incluindo inulina.

[00184] A presente invenção será descrita em relação às modalidades particulares e com referência aos desenhos, mas a invenção não é limitada aos mesmos, mas apenas pelas reivindicações. Além disso, os termos primeiro, segundo e similares, na descrição e nas reivindicações, são usados para distinguir entre elementos similares e não, necessariamente, para descrever uma sequência, tanto de modo temporal, espacial, em ordenação ou em qualquer outro modo. Deve-se entender que os termos usados desse modo são alternáveis sob circunstâncias apropriadas e que as modalidades da invenção descritas na presente invenção têm a capacidade de operação em outras sequências além daquelas descritas ou ilustradas na presente invenção.

[00185] Deve-se observar que o termo "que compreende", usado nas reivindicações, não deve ser interpretado como sendo restrito aos meios listados posteriormente; o mesmo não exclui outros elementos ou etapas. O mesmo deve ser interpretado, desse modo, como especificando a presença dos recursos, números inteiros, etapas ou componentes estabelecidos conforme mencionados, mas não exclui a presença ou adição de um ou mais outros recursos, números inteiros, etapas ou componentes, ou grupos dos mesmos. Desse modo, o escopo da expressão "um dispositivo que compreende meios A e B" não deve ser limitado a dispositivos que consistem apenas em componentes A e B. Significa, em relação à presente invenção, que os únicos componentes relevantes do dispositivo são A e B.

[00186] Referência ao longo deste relatório descritivo a "uma modalidade" significa que um recurso, estrutura ou característica particular, descrita em conjunto com a modalidade, é incluída em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Desse modo, ocorrências das expressões "em uma (1) modalidade" ou "em uma modalidade", em vários locais ao longo deste relatório descritivo, não estão se referindo, necessariamente, à mesma modalidade, mas podem se referir a muitas e/ou diferentes modalidades. Além disso, os recursos, estruturas ou características particulares podem ser combinadas em qualquer modo adequado, conforme será evidente a um técnico no assunto a partir desta revelação, em uma ou mais modalidades.

[00187] De modo similar, deve-se verificar que, na descrição de modalidades representativas da invenção, vários recursos da invenção são, por vezes, agrupados em conjunto em uma única modalidade, figura ou descrição da mesma com a finalidade de simplificar a revelação e facilitar o entendimento de um ou mais dentre os vários aspectos da invenção. Este método de revelação, entretanto, não deve ser interpretado como refletindo uma intenção de que a invenção reivindicada exige mais recursos do que são expressamente estabelecidos em cada reivindicação. Em vez disso, conforme as reivindicações a seguir refletem, aspectos da invenção situam-se em menos do que a totalidade dos recursos de uma única modalidade revelada anteriormente. Desse modo, as reivindicações que sucedem a descrição detalhada são expressamente incorporadas nesta descrição detalhada, sendo que cada reivindicação é autossuficiente como uma modalidade separada desta invenção.

[00188] Além disso, embora algumas modalidades descritas na presente invenção incluam alguns, mas não outros recursos incluídos em outras modalidades, combinações de recursos de diferentes modalidades se destinam a estar no escopo da invenção, e formam diferentes modalidades, conforme será entendido pelo técnico no assunto. Por exemplo, nas reivindicações a seguir, qualquer uma das modalidades reivindicadas pode ser usada em qualquer combinação.

[00189] Além disso, algumas das modalidades são descritas na presente invenção como um método ou combinação de elementos de um método que pode ser implantado por um processador de um sistema de computador ou por outros meios de executar a função. Desse modo, um processador com as instruções necessárias para executar tal método ou elemento de um método forma um meio para executar o método ou elemento de um método.

[00190] Além disso, um elemento descrito na presente invenção de uma modalidade de aparelho é um exemplo de um meio para executar a função realizada pelo elemento com a finalidade de executar a invenção.

[00191] Na descrição e desenhos fornecidos na presente invenção, inúmeros detalhes específicos são estabelecidos. Entretanto, entende-se que as modalidades da invenção podem ser praticadas sem esses detalhes específicos. Em outros casos, métodos, estruturas e técnicas bem conhecidas não foram mostradas em detalhes a fim de simplificar a descrição e facilitar o entendimento.

[00192] A invenção será descrita, a seguir, por meio de uma descrição detalhada de diversas modalidades da invenção. Está claro que outras modalidades da invenção podem ser configuradas de acordo com o conhecimento do técnico no assunto sem se afastar do verdadeiro espírito ou ensinamento técnico da invenção, a invenção é limitada apenas pelos termos das reivindicações anexas.

Exemplos Exemplo 1: Engenharia metabólica de uma cepa de E. coli BL21 (DE3) que produz ácido N-acetilneuramínico

[00193] A engenharia metabólica foi alcançada pela mutagênese e deleções de genes endógenos específicos e a integração genômica de genes heterólogos. Os genes lacZ e araA foram inativados por mutagênese com o uso de oligonucleotídeos incompatíveis, conforme descrito por Ellis et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6.742-6.746 (2001)).

[00194] As deleções genômicas foram geradas de acordo com o método de Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6.640-6.645 (2000)). Para evitar a degradação de N-acetilglucosamina, os seguintes genes foram deletados do genoma de cepa de £. coli BL21 (DE3): enzima Il PTS específico de N- acetilglucosamina (nagE), N-acetilglucosamina-6-fosfato deacetilase (nagA) e glicosamina-6-fosfato deaminase (nagB). Todo o agrupamento de gene catabólico de ácido N-acetilneuramínico que codifica N-acetilmanosamina quinase (nankK), N-acetilmanosamina-6-fosfato epimerase (nanE), ácido N- acetilneuramínico aldolase (nanA) e o ácido siálico permease (nanT) também foi deletado. Os genes manX, manY e manzZ, que codificam um sistema de fosfotransferase dependente de fosfoenolpiruvato que facilita a importação de glicosamina, também foram deletados. Os genes wzxC-wcaJ também foram deletados. O gene wca) codifica uma UDP-glicose:undecaprenil fosfato glicose- 1-fosfato transferase que catalisa a primeira etapa em síntese de ácido colânico (Stevenson et al., J. Bacteriol. 1996, 178:4.885-4.893). Além disso, os genes fucl e fucK e agaA foram deletados, codificando L-fucose isomerase, L-fuculose quinase e N-acetilgalactosamina-6-fosfato deacetilase, respectivamente.

[00195] A integração genômica de genes heterólogos foi alcançada por transposição, com o uso tanto da EZ-Tn5'" transposase (Epicentre, USA) ou do C9-mutante hiperativo da mariner transposase Himar1 (Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, USA 96:11.428-11.433). Para produzir EZ-Tn5 transposons, o gene de interesse em conjunto com um marcador de resistência a antibiótico flanqueado por sítio de FRT (alternativamente, o gene marcador de resistência foi flanqueado por sítios lox66-lox71) foi amplificado. O produto de PCR resultante portava, em ambos os terminais, os sítios de reconhecimento 19-bp Mosaic End para a EZ-Tn5 transposase. Para integração com o uso de Himar1 construtos de expressão de transposase (operons) de interesse foram clonados, de modo similar, em conjunto com um sítio FRT/sítio lox66-lox71 flanqueado por marcadores de resistência a antibiótico e transferidos para o pecomar vetor, que codifica o CI-mutante hiperativo da mariner transposase Himar1 sob o controle do promotor induzível por arabinose Paras. Todos os genes foram otimizados por códon para a expressão em E. coli e preparados sinteticamente por GenScript Corp.

[00196] O fragmento de expressão <Pret-lacY-FRT-aadA-FRT> (SEQID NO: 1) foi integrado usando-se a EZ-Tn5 transposase. Após a integração bem-sucedida do gene para o importador de lactose LacY de E. coli KI2 TG1 (GenBank: ABN72583) o gene de resistência foi eliminado de clones resistentes a estreptomicina pela FLP recombinase codificada em plasmídeo pCP20 (Proc. Natl. Acad. Sci. 2000, USA 97:6.640-6.645). O agrupamento de gene csc (SEQ ID NO: 2) de E. coli W (GenBank: CPOO2185.1), que compreende os genes para sacarose permease, frutoquinase, sacarose hidrolase, e um repressor transcricional (genes cscB, cscK, cscA e cscR, respectivamente), que possibilitam que a cepa se desenvolva em sacarose como uma única fonte de carbono, também foi inserido no genoma. Esse agrupamento foi integrado ao genoma da cepa de E. coli BL21 (DE3) por transposição com o uso de pecomar-cscABKR de plasmídeo.

[00197] A cepa resultante foi modificada adicionalmente para a produção de Neu5Ac pela integração genômica dos seguintes cassetes de expressão: <Pret- slr1975-gna1-lox66-aacC1-lox71> (SEQ ID NO:3), <PretneuB-lox66-kanR-lox71> (SEQ ID NO: 4) <Pret-s/r1975-Prws-neuB-FRT-dhfr-FRT> (SEQ ID NO: 5), <PretglmS*- gnal-lox66-aacC1-lox71> (SEQ ID NO: 6) e <Pret-ppsA-lox66-aacC1-lox71> (SEQ ID NO: 7). Exceto para o cassete de expressão de dhfr da SEQID NO 5, todos os genes marcadores de resistência foram removidos do genoma por etapas (antes do próximo round de integração genética) introduzindo-se pKD-Cre de plasmídeo (SEQ ID NO: 8) seguido de seleção em placas de ágar 2YT contendo 100 ug-ml* de ampicilina e 100 mM de L-arabinose a 30ºC. Os clones resistentes foram subsequentemente transferidos para placas de ágar 2YT carecendo de ampicilina bem como o antibiótico seletivo usado para integração genômica. As placas foram incubadas a 42 C para curar as células do plasmídeo. Os clones que eram sensíveis a ampicilina e o antibiótico seletivo foram usados para experimentos e modificações adicionais.

[00198] O gene s/r1975 (GenBank: BAL35720) codifica Synechocystis sp. PCC6803 N-acetilglucosamina 2-epimerase. O gene gna1 (GenBank: NP 116637) codifica uma glicosamina-6-fosfato acetiltransferase a partir de Saccharomyces cerevisiae. O gene neuB (GenBank: AF305571) codifica uma ácido siálico sintase a partir de Campylobacter jejuni. O gene glmS* é uma versão mutada do gene de E. coli L-glutamina:D-frutose-6-fosfato aminotransferase (Metab Eng. 2005 Maio;7(3):201-214)) O gene ppsAh (GenBank: ACT43527) codifica tenfosfoenolpiruvato sintase de E. coli BL21 (DE3).

[00199] Para a geração de <Pret-s/r1975-gna1-lox66-a0cC1-lox71>, os genes slr1975 e gnal foram subclonados como um operon atrás do promotor constitutivo Pre: e fundidos ao gene de resistência a gentamicina (flanqueado por sítios lox66/lox71) e inseridos no vetor pecomar por ligação de extremidade abrupta. O cassete de expressão resultante foi integrado ao genoma com o uso de vetor pEcomar-slr195-gna1-aacC1 e do C9-mutante hiperativo da mariner transposase Himar1 sob o controle do promotor induzível por arabinose Paras.

[00200] Para a geração de <Pret-neuB-lox66-kanR-lox71 >, neuB foi clonado atrás do promotor constitutivo Pret e fundido ao gene de resistência a canamicina (flanqueado por sítios lox66/lox71). O cassete de expressão resultante foi integrado ao genoma com o uso da EZ-Tn5 transposase. Para a geração de <Pret- sIr1975-P:;5-neuB-FRT-dhfr-FRT>, os genes s/r1975 e neuB foram separadamente subclonados atrás dos promotores constitutivos Pret e Pis, respectivamente, e fundidos ao gene de resistência a trimetoprima (flanqueados por sítios de FRT). O cassete de expressão resultante foi integrado ao genoma usando-se a EZ-Tn5 transposase.

[00201] O cassete de expressão <Pret-glmS*-gnal1-lox66-aacC1-lox71> foi gerado clonando-se glmS'e gnal como um operon atrás do promotor constitutivo Pre. Esse construto foi fundido adicionalmente ao gene de resistência a gentamicina (flanqueado por sítios lox66/lox71). O cassete de expressão resultante foi integrado ao genoma usando-se a EZ-Tn5 transposase.

[00202] Para a geração de <Pret-ppsA-lox66-aacC1-lox71>, o gene ppsA foi clonado atrás do promotor constitutivo Pret e fundido ao gene de resistência a gentamicina (flanqueado por sítios de lox66/lox71). O cassete de expressão resultante foi integrado ao genoma usando-se a EZ-Tn5 transposase.

[00203] No geral, as modificações de genoma cumulativa deram origem à cepa de produção de Neu5Ac E. coli HNANA1.

Exemplo 2: Produção de ácido N-acetilneuramínico durante uma fermentação por batelada alimentada

[00204] A cepa de E. coli BL21 (DE3) HNANA1 foi cultivada a 30ºC em 3 | de fermentadores (New Brunswick, Edison, USA) iniciando com 1.000 ml de meio de sais minerais contendo 7 g-L? de NHaH2PO2, 7 g-L? de K2HPO;,, 2 g-L? de KOH, 0,3 g-L* de ácido cítrico, 2 g-L* de MgSOa x 7-H2O, 5 g-L? de NHaCI7 e 0,015 g-L * de CaCl; x 6-H2O0, suplementado com 1 ml-L? de solução de elemento-traço (54,4 g-L * de citrato férrico de amônio, 9,8 g-L? de MnCl2 x 4-H2O, 1,6 g-L* de CoCl7 x 6-H20, 1 g-L* de CuCl2 x 2-H2O, 1,9 g-L? de H3BO3, 9 g-L? de ZnSO,s x 7- H2O, 1,1 g-L* de Na2MoO, * 2-H2O, 1,5 g-L? de Nas2SeOsz, 1,5 g-L? de NiSO, x 6- H2O) e contendo 2 % (m/v) de sacarose como fonte de carbono bem como o antibiótico zeocina (10 ug-ml?). O cultivo foi iniciado com um 2,5% (v/v) de inóculo de uma pré-cultura desenvolvida no mesmo meio contendo sacarose. O fim da fase de batelada foi caracterizado por um aumento no nível de oxigênio dissolvido. Uma alimentação de sacarose foi aplicada imediatamente após concluir a fase de batelada. A alimentação de sacarose de 50% (m/v) foi suplementada com 2 g-L* de MgSOa x 7-H2O, 0,015 g-L? de CaCl2 x 6-H20 e 1 ml- L? de solução de elemento traço. Uma taxa de alimentação de 9,0 a 11,0 mI-L'

1 foi aplicada, com referência ao volume inicial. Aeração foi mantida a 3 L-min*. O oxigênio dissolvido foi mantido a 20 a 30% de saturação controlando-se a taxa de agitação. O pH foi mantido a 7,0 adicionando-se 25% de solução de amônia.

[00205] A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, Shimadzu) foi usada para detectar Neu5SAc no sobrenadante de cultura. O equipamento compreendeu um detector UV-VIS a A = 210 nm (SPD-10AVP, Shimadzu) e uma coluna analítica de H+ ácido orgânico Rezex ROA (300 x 7,8 mm) com um cartucho de guarda apropriado. A eluição isocrática foi realizada em 5 mM de H25Oa a 50ºC foi executada a uma taxa de fluxo de 0,5 ml-min?. O sobrenadante de cultura foi centrifugado, esterilizado por filtração e aquecido a 95ºC durante min. Após uma centrifugação final, 5 ul da amostra foi aplicado à coluna. À concentração de ácido N-acetilneuramínico foi calculada a partir de uma curva padrão com o uso de um padrão comercialmente disponível (Carbosynth, Compton, UK). Após a incubação por 88 h, a titulação final de NeuSAc no sobrenadante de cultura foi de 68,6 g-L?.

Exemplo 3: Geração e cultivo de únicos mutantes de knockout em cepa de E. coli H”NANA1 que revela capacidade de produção de Neu5Ac aperfeiçoada

[00206] A cepa de E. coli BL21 (DE3) HNANA1 foi modificada, adicionalmente, criando mutantes de deleção que removeram ou interromperam os genes gltB, yjhC e ppC. As cepas tiNANA1, tNANA1AgItB, HNANA1AyjhC e HNANAlAppc foram cultivadas em placas de 96 cavidades. Portanto, únicas colônias das cepas foram transferidas de placas de ágar para placas de microtitulação contendo 200 ul do meio mínimo descrito no Exemplo 2 e foram incubadas por “20 h a 30ºC com agitação vigorosa. Subsequentemente, 50 ul do caldo de cultura foi transferido para placas de 96 cavidades de cavidade profunda (2,0 ml) contendo 400 ul de meio mínimo por cavidade.

[00207] Após uma incubação por outras 48 horas, o cultivo foi interrompido e a quantidade de ácido N-acetilneuramínico no sobrenadante foi determinada por espectrometria em massa em modo monitoramento de reações múltiplas (MRM) com o uso de um sistema de detecção de Ms Triplo-Quadrupolo LC. Os íons precursores são selecionados e analisados em quadrupolo 1, fragmentação ocorre na célula de colisão com o uso de argônio como o gás de colisão, e íons de fragmento são selecionados em quadrupolo 3. Uma amostra de 1 ul de ácido N-acetilneuramínico foi injetada no instrumento de HPLC após diluir o sobrenadante de cultura 1:100 com água de grau LC/MS. A amostra foi separada em uma coluna de HPLC XBridge Amide (3,5 um, 2,1 x 50 mm (Waters, USA) com um cartucho de guarda XBridge Amide (3,5 um, 2,1 x 10 mm) (Waters, USA) a 50ºC em acetonitrila:H20 com 10 mM de acetato de amônio a uma taxa de fluxo de 400 ul-min?. Cada separação durou 240 s. O ácido N-acetilneuramínico foi analisado por MRM em modo de ionização positiva de ionização por eletroaspersão (ESI). O espectrômetro em massa foi operado em unidade de resolução. O ácido N-acetilneuramínico forma um íon de m/z 309,2 [M+H]. O fon precursor de ácido N-acetilneuramínico foi fragmentado adicionalmente na célula de colisão nos íons de fragmento m/z 292,20, m/z 274,15 e m/z 121,15. À energia de colisão, Q1 e O3 Pre Bias foram otimizadas para cada analito individualmente. O método de quantificação foi estabelecido com o uso de um padrão comercialmente disponível (Carbosynth, Compton, UK).

[00208] A Figura 3 mostra os rendimentos relativos de Neu5Ac das cepas cultivadas. Em comparação à cepa parental, o valor para cepa HNANA1 foi definido para 100%, e os únicos mutantes de knockout produziram 20% a 25% mais ácido N-acetilneuramínico.

Exemplo 4: Purificação de Neu5Ac a partir de caldo de fermentação

[00209] Após término da fermentação, a biomassa foi separada do meio de fermentação por meio de ultrafiltração seguida de uso sequencial de um filtro de módulo de bobinagem (0,05 um de corte) (CUT membrane technology, Erkrath, Alemanha), e um filtro de fluxo cruzado (150 kDa de corte) (Microdyn- Nadir, Wiesbaden, Alemanha). Um meio de fermentação livre de célula de aproximadamente 1 m? foi obtido que contém mais e 19 g-L* de ácido siálico.

[00210] O líquido livre de célula foi, então, desionizado por meio de cromatografia de troca iônica. Primeiro, contaminantes catiônicos foram removidos em um trocador catiônico forte em um volume de 200 | (Lewatitº S 2568 (Lanxess AG, Cologne, Alemanha) em forma de H*. Com o uso de NaOH, a solução obtida com um pH de cerca de 1,5 foi neutralizada a 7,0. EM uma segunda etapa, íons aniônicos e corantes indesejados foram removidos da solução com o uso do trocador aniônico forte Lewatitº S 6368 A (Lanxess AG, Cologne, Alemanha) na forma de cloreto. O trocador de fon tinha um volume de leito de 200 |. Com o uso de uma segunda etapa de filtração no filtro de fluxo cruzado (150 kDa de corte) (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, Alemanha), precipitados originários de acidificação da solução foram removidos. Para concentração do açúcar, a solução foi nanofiltrada em um Dow Filmtecº NF270- 4040 (INAQUA Vertriebsgesellschaft mbH, Monchengladbach, Alemanha) para cerca de 4 do Volume. A solução concentrada de Neu5Ac foi, então, adicionalmente “concentrada em um evaporador rotativo para uma concentração de cerca de 400 g Lº ou superior. A cristalização específica do produto foi realizada com um excesso de 10 vezes de ácido acético glacial a 5ºC durante 12 a 60 horas. A fração sólida foi filtrada e lavada com etanol e seca a 40ºC. O produto seco cristalizado foi adicionalmente purificado. Portanto, o produto seco foi solvido em 2L H2O por kg, e tratado com carvão ativado (CAS- No: 7440-44-0, Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Alemanha). A solução clarificada, após separação do carvão foi concentrada por evaporação a 50ºC até que se solidificasse. O material sólido foi misturado com 99% de etanol e incubado a 4ºC pelo menos durante 16 h. Posteriormente, a fração sólida foi filtrada e seca a 40ºC. Um produto branco cristalino que tem uma pureza de mais de 95% por média de área sob curva de um cromatograma conforme determinado por HPLC com o uso de uma coluna de H* de ácido orgânico Rezex ROA (fenomenex, Aschaffenburg, Alemanha) foi obtido.

Exemplo 5: Uma via alternativa para a produção de ácido N- acetilneuramínico

[00211] A cepa de E. coli BL21 (DE3), conforme descrito no exemplo 1 (AlacZ, DaraA, AnagABE, AnanATEK, AmanXYZ, Awcal, AfuclK, hagaaA, lacY*, cscABKR*), foi modificada adicionalmente por integração do cassete de expressão <Pret-glmS*-gnal-lox66-aacC1-lox71>, dando origem a uma cepa que tem a capacidade de sintetizar N-acetilglucosamina (cepa A). A cepa A foi modificada para gerar uma cepa para a produção de ácido N-acetilneuramínico. Para essa finalidade, os construtos de expressão <Pret-SIr1975-P;5-neuB-FRT-dhfr- FRT> (SEQ ID NO: 5) ou <PrerEcnanE-Pr's-neuB-FRT-dhfr-FRJ> (SEQ1ID NO: 9) foram individualmente integrados ao genoma da cepa A resultando nas cepas Be C, respectivamente. O gene EcnanE (GenBank: YP 003614592) codifica uma N- acilglucosamina-6-fosfato 2-epimerase a partir de Enterobacter cloacae subsp. cloacae ATCC 13047. Todos os cassetes de expressão foram integrados ao genoma com o uso da EZ-Tn5 transposase.

[00212] Únicas colônias dessas cepas foram transferidas de placas ágar para placas de microtitulação contendo 200 ul do meio mínimo descrito no exemplo 2 e foram cultivadas por “20 h a 30ºC com agitação vigorosa. Subsequentemente, 50 ul do caldo de cultura foi transferido para placas de 96 cavidades de cavidade profunda (2,0 ml) contendo 400 ul de meio mínimo por cavidade. Após a incubação de outras 48 horas, o cultivo foi interrompido e o nível de ácido N-acetilneuramínico nos sobrenadantes foi determinado por espectrometria em massa.

[00213] A produção de Neu5Ac só foi detectável em sobrenadantes de cultura das cepas B e C. Na Figura 4, a produção relativa de Neu5Ac das cepas cultivadas é mostrada. Em comparação, o valor de produção de Neu5Ac da cepa B foi definido para 100%. A cepa C produziu cerca de 7,5% de Neu5Ac quando comparado à cepa B.

Exemplo 6: Composição de uma fórmula infantil contendo Neu5Ac Fórmula infantil: Leite desnatado Óleos vegetais (óleo de palma, óleo de colza, óleo de girassol) Oligossacarídeos de leite humano L-Fucose Ácido N-acetilneuramínico Leite desnatado em pó Óleo de Mortierella alpine Óleo de peixe Carbonato de cálcio Cloreto de potássio Vitamina C Cloreto de sódio Vitamina E Acetato de ferro Sulfato de zinco Niacina D-pantotenato de Cálcio Sulfato de cobre Vitamina A

Vitamina B1 Vitamina B6 Sulfato de magnésio lodato de potássio Ácido fólico Vitamina K Selenito de sódio Vitamina D

Claims (24)

REIVINDICAÇÕES

1. Microrganismo de ocorrência não natural, caracterizado pelo fato de que tem a capacidade de produzir Neu5Ac, em que o referido microrganismo de ocorrência não natural possui uma via de biossíntese de ácido siálico que compreende pelo menos uma enzima heteróloga, em que a via catabólica de ácido siálico de ocorrência natural do microrganismo foi desativada, em que pelo menos um sistema de fosfoenolpiruvato:açúcar fosfotransferase para a importação de um sacarídeo que não é usado como uma fonte de carbono durante a produção fermentativa de Neu5Ac foi desativado, e em que o microrganismo pode utilizar uma fonte de carbono exógena presente no caldo de fermentação como uma única fonte de carbono sem o uso de um sistema de fosfoenolpiruvato:açúcar fosfotransferase para a aquisição da referida fonte de carbono exógena.

2. Microrganismo de ocorrência não natural de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a via de biossíntese de ácido siálico compreende as enzimas glutamina-frutose-6-fosfato aminotransferase, glicosamina-6-fosfato Nr-acetiltransferase, N-acetilglicosamina 2-epimerase, ácido N-acetilneuramínico sintase e uma açúcar fosfatase da superfamília similar a HAD.

3. Microrganismo de ocorrência não natural de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das enzimas da via de biossíntese de ácido siálico é uma enzima heteróloga.

4. Microrganismo de ocorrência não natural de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a via catabólica de ácido siálico de ocorrência natural foi desativada.

5. Microrganismo de ocorrência não natural de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos genes que codificam uma enzima que é envolvida na via catabólica de ácido siálico é deletado do genoma do microrganismo de ocorrência não natural, em que a expressão de um ou mais dos genes que codificam uma enzima que está envolvida na via catabólica de ácido siálico é enfraquecida, ou em que a sequência nucleotídica da região codificadora de proteína de pelo menos um gene que codifica uma enzima que está envolvida na via catabólica de ácido siálico é alterada de modo que o polipeptídeo sendo codificado pela referida sequência nucleotídica de codificação de proteína alterada não possua a atividade enzimática da enzima sendo codificada pela sequência nucleotídica não alterada.

6. Microrganismo de ocorrência não natural de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para deletar um ou mais dos genes selecionados a partir do grupo de genes que codificam N- acetilmanosamina quinase, N-acetilmanosamina-6-fosfato epimerase, ácido N- acetilneuramínico aldolase e ácido siálico permease, em que a expressão de um ou mais desses genes é enfraquecida, ou em que a sequência nucleotídica da região codificadora de proteína de pelo menos um desses genes é alterada de modo que o polipeptídeo codificado pela referida sequência nucleotídica alterada não possua a atividade enzimática da enzima codificada pela sequência nucleotídica não alterada.

7. Microrganismo de ocorrência não natural de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as atividades de uma ou mais das enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em N- acetilglicosamina-6-fosfato — deacetilase e N-acetilglicosamina-6-fosfato deaminase foram abolidas.

8. Microrganismo de ocorrência não natural de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o microrganismo de ocorrência não natural foi geneticamente modificado para abolir a atividade de N-acetilglicosamina-6-fosfato deacetilase e/ou N-acetilglicosamina-6-fosfato deaminase deletando-se um ou ambos os genes que codificam essas enzimas, enfraquecendo-se a expressão de um ou ambos os genes, ou mutando-se a região codificadora de proteína de um ou ambos os genes de modo que o polipeptídeo sendo codificado por cada sequência nucleotídica alterada não possua a atividade enzimática da enzima codificada pela sequência nucleotídica não alterada.

9. Microrganismo de ocorrência não natural de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos um sistema de fosfotransferase que transporta açúcar dependente de fosfoenolpiruvato (PEP) para a importação de um carboidrato foi desativado.

10. Microrganismo de ocorrência não natural de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o microrganismo de ocorrência não natural compreende um simportador de sacarídeo/H", preferencialmente, um simportador de sacarídeo/H* selecionado a partir do grupo que consiste em um simportador de sacarose próton, um simportador de lactose próton e um simportador de glicose próton.

11. Microrganismo de ocorrência não natural de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o microrganismo de ocorrência não natural possui uma biossíntese de PEP aprimorada quando comparado ao microrganismo do tipo selvagem, preferencialmente, devido à superexpressão de PEP sintase.

12. Microrganismo de ocorrência não natural de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o microrganismo de ocorrência não natural carece de um ou mais selecionado(s) a partir do grupo que consiste em uma PEP carboxilase funcional, uma glutamato sintase funcional, uma proteína WzxC funcional, uma UDP-glicose:undecaprenilfosfato glicose-1-fosfato transferase funcional, uma B-galactosídeo permease funcional, uma B-galactosidase funcional, uma proteína YjhC funcional, uma fucose isomerase funcional, uma fuculoquinase funcional e uma N-acetilglutamina aminoacilase funcional.

13. Microrganismo de ocorrência não natural de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o microrganismo de ocorrência não natural possui uma síntese de glutamina aprimorada quando comparado ao microrganismo do tipo selvagem, preferencialmente, devido à superexpressão de glutamina sintase.

14. Uso de um microrganismo de ocorrência não natural definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de ser para a produção de Neu5Ac.

15. Método para produzir Neu5Ac por fermentação usando um microrganismo de ocorrência não natural capaz de produzir Neu5SAc, o método sendo caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) fornecer um microrganismo de ocorrência não natural definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13; b) cultivar o microrganismo de ocorrência não natural em um caldo de fermentação e sob condições permissivas para que o microrganismo de ocorrência não natural produza Neu5Ac; e c) opcionalmente, recuperar o Neu5Ac do caldo de fermentação.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o caldo de fermentação contém uma fonte de carbono para cultivar o microrganismo de ocorrência não natural, a fonte de carbono sendo, preferencialmente, selecionada a partir do grupo que consiste em glicose, xilose,

sacarose, frutose, lactose, glicerol, gás de síntese e combinações dos mesmos.

17. Uso de Neu5Ac produzido pelo método definido na reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição nutricional.

18. Composição nutricional, caracterizada pelo fato de que contém Neu5Ac produzido pelo método definido na reivindicação 15 ou 16.

19. Composição nutricional de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que também contém pelo menos um HMO, preferencialmente, pelo menos um HMO neutro e/ou pelo menos um HMO sialilado.

20. Composição nutricional de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que também contém um microrganismo probiótico.

21. Composição nutricional de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizada pelo fato de ser selecionada a partir do grupo que consiste em formulações medicinais, fórmula infantil e suplementos dietéticos.

22. Composição nutricional de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizada pelo fato de que está presente na forma líquida, preferencialmente, na forma de um concentrado ou bebida pronta, ou em forma sólida, preferencialmente, na forma de um pó, grânulos, flocos ou pellets.

23. Fórmula infantil, caracterizada pelo fato de que contém Neu5Ac produzido pelo método definido na reivindicação 15 ou 16.

24. Invenção de produto, processo, sistema, kit ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no presente pedido de patente.

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