KR20230124659A - 올리고당의 생산을 위해 감소된 락토오스 내재화를갖는 미생물 세포 - Google Patents
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Abstract
개시된 것은 목적 올리고당을 생산하기 위한 유전자 조작된 미생물 세포(여기서, 상기 미생물 세포는 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 나타내는 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체를 갖고 있다), 및 상기 유전자 조작된 미생물 세포를 사용하여 올리고당을 생산하는 방법이다.
Description
본 발명은 미생물 세포에 의한 락토오스의 내재화(internalizing)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 락토오스 사멸 현상에 관한 것이고, 미생물 세포의 락토오스 사멸을 감소 또는 완화하는 수단 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 올리고당 및 당접합체의 생산에서 락토오스 사멸에 내성을 갖는 미생물 세포를 사용하는 이점에 관한 것이다.
탄수화물(당류라고도 함)은 단당류, 이당류, 올리고당류 및 다당류의 4개의 화학 그룹으로 분류되는 생체분자이다. 탄수화물은 유리 형태로 존재하거나 단백질 또는 폴리펩티드(당단백질이라고 함) 또는 지질(당지질이라고 함)과 결합한 당접합체의 형태로 존재할 수 있다. 탄수화물의 또 다른 분류는 이의 생리적 효과에 기초한다. 인체에 단당류 탄수화물을 제공하는 탄수화물은 "소화가능한" 탄수화물로 정의되고, "난소화성(non-digestible)" 탄수화물은 인간의 소장에서 소화되지 않는다.
올리고당은 탄수화물 중에서도 다양한 분자 그룹을 구성한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "올리고당"이라는 용어는 전형적으로, 글리코사이드 결합에 의해 서로 결합되어 있는, 적어도 3개의 단당류 모이어티(moiety)로 이루어지지만, 12개 이하, 바람직하게는 10개 이하의 단당류 모이어티로 이루어진 고분자 당 분자를 지칭한다. 올리고당은 단당류 모이어티의 직쇄로 이루어지거나, 적어도 하나의 단당류 모이어티가 글리코사이드 결합에 의해 이에 결합된 적어도 3개의 단당류 모이어티를 갖는 분지된 분자일 수 있다. 올리고당의 단당류 모이어티는 알도스(예: 아라비노스, 자일로스, 리보스, 데스옥시리보스, 릭소스, 글루코오스, 이도스, 갈락토오스, 탈로스, 알로오스, 알트로스, 만노스), 케토스(예: 리불로스, 자일룰로스, 프럭토오스, 소르보오스, 타가토스), 데옥시당(예: 람노스, 푸코스, 퀴노보스), 데옥시-아미노당(예. N-아세틸글루코사민, N-아세틸-만노사민, N-아세틸-갈락토사민), 우론산(예: 갈락투론산, 글루쿠론산) 및 케토알돈산(예: N-아세틸뉴라민산)으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
비피도박테리아(bifidobacteria) 및/또는 락토바실리(lactobacilli)에 의해 선택적으로 대사되는 능력을 갖는 난소화성 올리고당은 프레바이오틱으로서 지정되어 있다. 프레바이오틱 올리고당의 섭취의 이점에는 변비 완화, 대장암의 위험 감소, 위장관내 병원균의 억제, 미네랄 흡수의 증가, 면역계의 조절, 단쇄 지방산 및 비타민의 생성, 혈중 콜레스테롤 및 지질 수준의 감소, 장내 미생물의 균형 개선 등이 포함된다. 프레바이오틱 올리고당의 특정 그룹은 소위 "인간 모유 올리고당"(HMO)이다.
인간 모유 올리고당은 인간 모유에 존재하는 난소화성 올리고당의 복잡한 혼합물을 구성한다. 인간 모유는 이의 올리고당 함량 및 조성과 관련하여 독특하다. 현재까지, 150개 이상의 구조적으로 상이한 HMO가 확인되었다. 대부분의 HMO는 이의 환원 말단(reducing end)에 락토오스 모이어티를 갖는 것을 특징으로 한다. 다수의 HMO는 비환원 말단에 푸코스 모이어티 및/또는 시알산 모이어티를 함유한다. 보다 일반적으로 말하자면, HMO가 유도되는 단당류는 D-글루코오스, D-갈락토오스, N-아세틸글루코사민, L-푸코스 및 N-아세틸뉴라민산이다.
프레바이오틱 올리고당은 치커리 및 아티초크(artichoke)와 같은 천연 원료로부터 수득할 수도 있고, 화학 합성 또는 시험관내에서 효소 합성에 의해 생산할 수도 있다. 올리고당, 특히 일부 HMO의 공업적 규모의 생산을 위해, 목적 올리고당(oligosaccharide of interest)이 유전자 조작된 미생물 세포에 의해 생산되는 발효 방법이 개발되었고, 이는 HMO가 이들의 천연 공급원으로부터 거의 수득할 수 없기 때문이다. 개별 HMO의 공업적 규모의 발효 생산은 HMO가 유아용 조제분유에 대한 보충제로 사용될 수 있도록 이러한 프레바이오틱 화합물을 식품 산업용으로 이용할 수 있게 하였다.
올리고당의 발효 생산, 즉 목적 올리고당, 특히 HMO의 생산에서, 유전자 조작된 박테리아는 전형적으로 (i) 외인성 탄소 공급원 및 (ii) 외인성 락토오스의 존재하에서 배양된다. 본 명세서에서 사용되는 "외인성"이라는 용어는 목적 올리고당을 생산하기 위해 유전자 조작된 박테리아의 배양 전 및/또는 배양 동안 유전자 조작된 박테리아의 배양 배지에 존재하고/하거나 배양 배지에 첨가되는 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 이러한 화합물은 배양 배지에 첨가되지만, 다른 실시형태에서, 화합물은 또한 배양 배지에 존재하고/하거나 배양 배지에 첨가된 미생물 세포에 의해 생성될 수 있다. 락토오스는 HMO의 환원 말단에서 이당류 모이어티를 구성하고, 전형적으로 유전자 조작된 박테리아에 의해 세포내에서 개별 HMO를 합성하도록 하는 개시 분자이다.
락토오스(β-D-갈락토피라노실-(1→4)-D-글루코오스)는 낙농 동물의 우유에서 발견되는 자연 발생 당이다. 락토오스는 글루코오스 모이어티와 갈락토오스 모이어티로 구성된 이당류이다. 유아 포유류는 락토오스가 농후한 우유를 마시기 위해 모친에게 수유한다. 유아의 장에서, 효소 락타제(β-D-갈락토시다제)는 락토오스를 이의 구성성분, 단당류 글루코오스 및 갈락토오스로 가수분해하고, 이는 흡수될 수 있다. 이. 콜라이를 포함한 다수의 장내 세균은 탄소원으로서 글루코오스를 선호하고, 글루코오스가 사용될 수 없는 경우에 락토오스를 효과적으로 소화할 수 있다.
미생물 세포에 의해 이의 환원 말단에 락토오스 모이어티를 갖는 목적 올리고당의 세포내 생합성을 위해, 락토오스가 이의 단당으로 분해되지 않거나 과도하게 분해되지 않지만 상기 올리고당 생합성에 사용할 수 있도록 세포내 락토오스 풀을 확립하는 것이 바람직하다. 세포내 락토오스 풀을 제공하는 한 가지 옵션은 락토오스를 분해 또는 전환하는 효소를 코딩하는(encoding) 박테리아의 내인성 유전자의 결실 또는 기능 불활성화이다. 예시적 유전자는 이. 콜라이의 lacZ 및/또는 lacA이다. lacZ 유전자는 락토오스를 가수분해하는 β-갈락토시다제(LacZ)를 코딩하는 반면, lacA는, 아세틸-CoA로부터 β-갈락토사이드로 아세틸 그룹을 전달하는 효소인 β-갈락토사이드 트랜스아세틸라제(LacA)를 코딩한다.
그러나, 미생물 세포의 세포내 락토오스 풀을 증가시키는 것은 결점을 수반한다. 이러한 결점 중 하나는 락토오스 사멸이라고 하는 현상이다. 락토오스 사멸은 이. 콜라이가 락토오스-제한 성장 배지로부터 락토오스-함유 성장 배지로 전이되는 경우에 박테리아 세포막을 통한 락토오스의 신속한 내재화에 기인하여 이의 대부분의 이. 콜라이가 사멸하는 특이한 현상이다. 락토오스 사멸 현상은 미생물 발효 도식을 사용하여 HMO와 같은 이들의 환원 말단에 락토오스 모이어티를 갖는 올리고당의 발효적 생산에서 특히 중요하고, 여기서 외인성 락토오스는, 미생물 세포가 상기 발효 배지에 접종될 때에 발효 배지가 락토오스를 함유하는지 여부에 관계 없이, 발효 배지에 다량으로 공급되고/되거나, 락토오스는 연속적 또는 적어도 1회의 볼루스로 발효 과정에서 발효 배지에 첨가된다. 락토오스가 발효 배지에 공급될 때에 락토오스 사멸은 적어도 발효기에서 미생물 세포 배양의 성장 및 생산성을 지연시키기 때문에, 목적 올리고당 또는 당접합체의 발효 생산을 위해 락토오스 사멸에 내성을 갖는 미생물 세포를 사용하는 것이 바람직하다.
특수 제품의 미생물 생산에 대한 락토오스 사멸의 결점을 극복하기 위해, WO 2016/075243 A1은 미생물 내에서 락토오스 수송체의 발현을, 당해 락토오스 수송체의 발현 수준이 락토오스 챌린지에 견디고 당해 락토오스 수송체의 야생형 발현 카세트로 수득된 락토오스 유입의 적어도 50%를 유지하는 미생물을 유도하도록 변화시킴으로써 미생물이 락토오스 사멸에 내성을 갖도록 하는 방법을 시사한다.
그러나, 박테리아 세포에서 LacY와 같은 락토오스 퍼미아제의 발현 수준의 감소는 락토오스 퍼미아제 및 포스포에놀피루베이트:탄수화물 포스포르트랜스퍼라제 시스템의 효소 IIIGlc(이는 또한 bgl 오페론 및 기타 비-PTS 당 퍼미아제 발현의 조절에 관여한다)가 상호작용한다는 것이 공지되어 있기 때문에, 미생물 세포의 성장에 영향을 미칠 수 있다.
이러한 관점에서, 락토오스 사멸에 내성이 있지만 락토오스 퍼미아제의 감소된 발현 수준에 기인하여 부작용에 영향을 받지 않는 미생물 균주를 개발하는 것이 바람직하다.
놀랍게도, 미생물 세포에서 야생형 LacY 대신에 LacY 락토오스 퍼미아제의 특정 변이체(variant)의 발현은, LacY와 이의 변이체의 발현 수준은 변화하지 않았지만 락토오스 사멸에 대한 미생물 세포의 내성을 증가시키고, 이러한 LacY 변이체를 갖는 미생물 세포는 올리고당의 발효 생산에 유용하다는 것이 밝혀졌다.
제1 측면에서, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 락토오스 퍼미아제의 변이체가 제공된다.
제2 측면에서, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다.
제3 측면에서, 유전자 조작된 박테리아 세포가 제공되고, 상기 박테리아 세포는 락토오스를 내재화할 수 있고, 야생형 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체를 갖는다.
제4 측면에서, 목적 올리고당의 생산을 위한, 야생형 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체를 갖는 유전자 조작된 박테리아 세포의 용도가 제공된다.
제5 측면에서, 목적 올리고당을 생산하는 방법이 제공되고, 상기 목적 올리고당은 야생형 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체를 갖는 유전자 조작된 박테리아 세포에서 합성된다.
제6 측면에서, 박테리아 세포에서 락토오스 사멸 효과를 완화하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 박테리아 세포의 내인성 락토오스 퍼미아제를, 야생형 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체로 치환하는 것을 포함한다.
제7 측면에서, 내재화된 락토오스로부터 세포내 올리고당 생합성의 효능을 개선시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 이의 내인성 락토오스 퍼미아제를, 야생형 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체로 치환한 유전자 조작된 박테리아 세포의 사용을 포함한다.
제8 측면에서, 박테리아 세포에서 목적 올리고당을 생산하는 신뢰성을 향상시키는 방법이 제공되고, 이 방법은 목적 올리고당의 세포내 생합성을 위한 숙주 세포로서 유전자 조작된 박테리아 세포의 사용을 포함하며, 상기 박테리아 숙주 세포는, 야생형 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체로 치환된 이의 내인성 락토오스 퍼미아제를 갖는다.
도 1은, UniProt 지식베이스 데이터베이스(엔트리 번호 P02920, 엔트리 버전 180, 2020년 10월 7일의 UniProt 릴리스 2020_05)에 존재하고 또한 첨부된 서열 목록에 서열번호 1로 제공되는, 이. 콜라이 균주 K12 락토오스 퍼미아제 LacY의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는, 문헌[참조: Sondej, M. and Seok, Y.-J., Phosphotransferase System by Cysteine Scanning Mutagenesis of E. coli Lactose Permease; Proc. Natl. Acad. Sci. (1999) 96:7, 3525-3530]으로부터 인용된 이. 콜라이 세포의 세포질막 내의 이. 콜라이 균주 K12 락토오스 퍼미아제 LacY의 토폴로지의 개략도이다.
도 3은 이. 콜라이 야생형 LacY와, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 LacY의 변이체의 상대적 발현 수준을 나타내는 컬럼 챠트이다.
도 4는, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여, 상이한 양의 락토오스의 존재하에 이. 콜라이 세포의 성장에 대한 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 LacY 변이체의 영향을 나타내는 컬럼 그래프이다.
도 5는, 시험관내 검정에서, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY 및 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이의 변이체의 수송 활성을 나타내는 컬럼 그래프를 나타낸다.
도 6은, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY 또는 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이의 변이체를 발현하는 박테리아 균주의 LNT 생산성을 나타내는 그래프이다.
도 7은, LNT 생산 동안 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY, 또는 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이의 변이체를 발현하는 박테리아 세포의 성장 동태를 나타내는 그래프이다.
도 8은, 상이한 락토오스 퍼미아제 변이체의 소수성 및 예측된 막관통 도메인을 나타낸다.
도 9는, 상이한 락토오스 퍼미아제 변이체의 소수성 및 예측된 막관통 도메인을 나타낸다.
도 10은, 락토오스 퍼미아제 변이체의 소수성 및 예측된 막관통 도메인을 나타낸다.
도 2는, 문헌[참조: Sondej, M. and Seok, Y.-J., Phosphotransferase System by Cysteine Scanning Mutagenesis of E. coli Lactose Permease; Proc. Natl. Acad. Sci. (1999) 96:7, 3525-3530]으로부터 인용된 이. 콜라이 세포의 세포질막 내의 이. 콜라이 균주 K12 락토오스 퍼미아제 LacY의 토폴로지의 개략도이다.
도 3은 이. 콜라이 야생형 LacY와, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 LacY의 변이체의 상대적 발현 수준을 나타내는 컬럼 챠트이다.
도 4는, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여, 상이한 양의 락토오스의 존재하에 이. 콜라이 세포의 성장에 대한 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 LacY 변이체의 영향을 나타내는 컬럼 그래프이다.
도 5는, 시험관내 검정에서, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY 및 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이의 변이체의 수송 활성을 나타내는 컬럼 그래프를 나타낸다.
도 6은, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY 또는 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이의 변이체를 발현하는 박테리아 균주의 LNT 생산성을 나타내는 그래프이다.
도 7은, LNT 생산 동안 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY, 또는 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이의 변이체를 발현하는 박테리아 세포의 성장 동태를 나타내는 그래프이다.
도 8은, 상이한 락토오스 퍼미아제 변이체의 소수성 및 예측된 막관통 도메인을 나타낸다.
도 9는, 상이한 락토오스 퍼미아제 변이체의 소수성 및 예측된 막관통 도메인을 나타낸다.
도 10은, 락토오스 퍼미아제 변이체의 소수성 및 예측된 막관통 도메인을 나타낸다.
본 발명자들은, 놀랍게도, 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY의 특정 변이체가 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 나타내고, 이. 콜라이 LacY의 이러한 변이체를 갖는 이. 콜라이 세포는 락토오스 사멸에 덜 감수성이기 때문에, 이러한 변이체가 배양 배지에 대한 외인성 락토오스의 첨가를 필요로 하는 올리고당의 발효 생산에서 유리하게 사용될 수 있다는 사실을 발견했다.
제1 측면에 따르면, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체가 제공되고, 이 변이체는 야생형 이. 콜라이 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는다. 변이체의 수송 활성의 감소는 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY 대신에 이러한 변이체를 갖는 이. 콜라이 세포에 의한 락토오스 내재화 수준의 감소를 유발한다.
이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY는 소위 주요 촉진제 슈퍼패밀리(E.C. 2.A.1.5.1)에 속하는 막 단백질이다. LacY는 세포막을 가로지르는 양성자 구배를 활용하여 β-갈락토사이드와 양성자를 세포 내로 공-수송하는 촉진제이다. 따라서, LacY는 락토오스, 멜리비오스, 락툴로스 및 유사체 메틸-1-티오-β,D-갈락토피라노사이드(TMG)를 수송할 수 있지만, 수크로오스 또는 프럭토오스는 수송할 수 없다. 이. 콜라이 야생형 LacY의 β-갈락토사이드 수송 활성의 동태는 표 1에 제공되어 있다.
[표 1]
이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY는 막 수송의 분자적 상세를 이해하는 데 있어서 프로토타입이 되었다. 이의 아미노산 서열, 즉 "야생형" 이. 콜라이 LacY의 아미노산 서열은 도 1에 도시된 바와 같이 및 서열번호 1에 나타낸 바와 같이 이. 콜라이 균주 K12의 LacY의 아미노산 서열(UniProtKB - P02920, 1986년 7월 21일에 UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스에 통합, 2020년 6월 17일에 최종 수정)이다. 이. 콜라이 LacY는 길이 417개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 쇄로 이루어진 단백질이고, 계산된 질량은 46,503Da이다. 이. 콜라이 야생형 LacY는 막 단백질 2차 구조 예측 서버 SPLIT 4.0(splitbioinf.pmfst.hr/split/4/)에 의해 예측된 바와 같이 12개의 막관통 도메인을 포함하고, 막관통 헬릭스 우선순위 및 그래프 하부 박스 중의 예측된 막관통 헬릭스 위치를 나타내는 도 9A 및 도 10A로부터 추론할 수 있다. 이. 콜라이 야생형 LacY의 더 상세한 토폴로지는 표 2에 제공되고 도 2에 제시되어 있다.
이. 콜라이 LacY의 돌연변이유발 분석은 일부 아미노산 잔기가 락토오스 수송의 기능을 유지하기 위해 치환불가능한 것으로 밝혀졌다. 이러한 아미노산 잔기와 락토오스 수송에서 이의 기능은 표 3에 제시되어 있다.
[표 2]
[표 3]
이. 콜라이 LacY의 돌연변이유발 분석은 특정 아미노산 잔기가 락토오스 수송에 필수적이지 않은 것으로 밝혀졌다. 이러한 비필수 아미노산 잔기는 표 4에서 확인된다.
[표 4]
이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제의 변이체는 본질적으로 동일한 수준에서 동일한 이. 콜라이 균주에서 발현되는 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스의 내재화의 감소를 나타낸다. 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제의 변이체에 의한 락토오스의 내재화 수준은 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제에 의해 제공되는 락토오스 내재화 수준과 비교하여 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 감소된다. 일부 실시형태에서, 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체에 의한 락토오스의 내재화 수준은 이. 콜라이 야생형 LacY와 비교하여 5mM의 외인성 락토오스 농도에서 약 30% 감소된다. "약 30%"라는 용어는 하한에서 26%, 27%, 28% 또는 29%, 및 상한에서 34%, 33%, 32% 또는 31%의 사이로 이해된다.
락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 LacY의 변이체는 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열과 비교하여 이. 콜라이 야생형 LacY에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 락토오스의 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 LacY의 변이체는 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY의 막관통 헬릭스 IX에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, LacY의 막관통 헬릭스 IX의 아미노산 치환은 막관통 헬릭스 IX 내의 하나 이상의 중성 아미노산 잔기 각각을 염기성 아미노산 잔기로 치환하는 것이다.
특정 실시형태에서, 막관통 헬릭스 IX의 아미노산 치환은 류신 잔기(Leu, L)의 적어도 하나를 염기성 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함하거나 이들로 이루어진다. 막관통 헬릭스 IX의 상기 류신 잔기는 도 1 및 서열번호 1에 도시된 바와 같이 이. 콜라이 야생형 LacY와 관련하여 위치 292, 293 및 294의 류신 잔기이다. 염기성 아미노산 잔기는 아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K) 및 히스티딘(His, H)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산이다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 이. 콜라이 야생형 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 LacY의 변이체는 LacY(L292R), LacY(L292K), LacY(L292H), LacY(L293R), LacY(L293K), LacY(L293H), LacY(L294R), LacY(L294K), LacY(L294H) 및 본 명세서에 이전에 개시된 이들의 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 단 이러한 변이체는 이. 콜라이 야생형 LacY와 비교하여 위치 292, 293 및 294 중 적어도 하나에 염기성 아미노산 잔기를 갖는다. 따라서, 이. 콜라이 야생형 LacY의 변이체는 이. 콜라이 야생형 LacY에 대해 괄호 안에 표시된 위치에서 아미노산 치환을 갖는다.
바람직한 실시형태에서, 이. 콜라이 야생형 LacY와 비교하여 락토오스의 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 LacY의 변이체는 (이. 콜라이 야생형 LacY와 관련하여) 위치 293의 류신 잔기를 아르기닌 잔기로 치환하는 것을 포함한다(LacY(L293R)로 명명).
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 이. 콜라이 야생형 LacY와 비교하여 락토오스의 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 LacY의 변이체는, SPLIT 4.0 서버(splitinfo.pmfst.hr/split/4/)를 사용하여 분석하는 경우, 이. 콜라이 야생형 LacY의 막 토폴로지와 비교하여 변화된 막 토폴로지를 나타내고, 그 점에서 이. 콜라이 야생형 LacY에서 막관통 도메인 IX와 X를 서로 분리하는 주변세포질 루프 P9를 나타내는 아미노산 서열은 막관통 도메인 IX와 X를 서로 분리하는 아미노산의 스트레치로 더 이상 동정되지 않아, 변이체의 예측된 토폴로지가 단일 막관통 도메인에 대한 막관통 도메인 IX와 X의 융합을 나타낸다. 따라서, 이러한 변이체는 비-막관통 루프에 의해 서로 분리된 총 11개의 막관통 도메인을 나타낸다.
이. 콜라이 야생형 LacY와 비교하여 감소된 락토오스 내재화 수준을 갖는 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체는 또한 상기 변이체의 기능적 단편, 즉 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열과 비교하는 경우, N-말단 및/또는 C-말단에서 절단되고/되거나 아미노산 서열 내에서 결실을 나타내지만, 락토오스 수송 활성을 나타내는 락토오스 퍼미아제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단된 버전은 서열번호 1의 L292, L293 및 L294에 상응하는 류신 잔기 중 적어도 하나를 염기성 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 염기성 아미노산 잔기는 아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K) 및 히스티딘(His, H)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산이다.
놀랍게도, 막관통 헬릭스 IX의 아미노산 서열에서 3개의 류신 잔기 중 각각 하나 이상을 염기성 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함하는 이. 콜라이 LacY의 변이체는 이. 콜라이 야생형 LacY를 발현하는 이. 콜라이 세포와 비교하여 상기 변이체를 발현하는 이. 콜라이 세포에 의한 락토오스 내재화 수준의 감소를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 락토오스 내재화는 본 명세서에 기재된 이. 콜라이 LacY의 변이체 중 하나를 발현하는 박테리아 세포에서 폐지되지 않는다.
제2 측면에서, 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공되고, 상기 변이체는 이. 콜라이 야생형 LacY와 비교하여 감소된 수준의 락토오스 수송 활성을 갖는다. 이. 콜라이 야생형 LacY를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2로 표시된다. 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본 명세서에서 상기 설명한 LacY 변이체 중 어느 하나를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시형태에서, 이. 콜라이 LacY의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 관련하여 아미노산 위치 292, 293 및 294 중 하나 이상에 대해 류신 잔기를 코딩하는 코돈(즉, CT(A/C/G/T) 또는 TT(A/T)) 대신에 CGA, CGC, CGG, CGT, AGA, AGG, AAA, AAG, CAC 및 CAT로 이루어진 그룹으로부터 선택된 코돈을 포함한다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 핵산 분자는 이. 콜라이 야생형 LacY와 비교하여 감소된 수송 활성을 갖는 락토오스 퍼미아제를 코딩하고, 서열번호 2 및/또는 서열번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열의 변이체로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자와 엄격한 조건(stringent condition)하에 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 관련하여 위치 292, 293 및 294 중 하나 이상에서 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈은 염기성 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈으로 치환되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 "하이브리드화"라는 용어는 문헌[참조: Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition, 1989)]에 기재된 바와 같이 종래의 조건, 바람직하게는 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 것을 의미한다. 엄격한 하이브리드화 조건은, 예를 들면, 65℃에서 4 × SSC에서 하이브리드화하고, 이어서 65℃에서 0.1 × SSC에서 합계 1시간 동안 복수회 세척하는 것이다. 덜 엄격한 하이브리드화 조건은, 예를 들면, 37℃에서 4 × SSC에서 하이브리드화하고, 이어서 실온에서 1 × SSC에서 복수회 세척하는 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "엄격한 하이브리드화 조건"이라는 용어는 68℃에서 0.25M 인산나트륨, pH 7.2, 7% SDS, 1mM EDTA 및 1% BSA에서 16시간 동안 하이브리드화하고, 이어서 68℃에서 2 × SSC 및 0.1% SDS로 2회 세척하는 것을 의미할 수도 있다.
핵산 분자는 재조합 또는 합성 핵산 분자이다. 핵산 분자는, 예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 리가제 연쇄 반응(LCR)에 의해 수득된 앰플리콘과 같은 선형 핵산 분자, 효모 인공 염색체와 같은 염색체로서 존재할 수 있거나, 또는 플라스미드, 코스미드 또는 박테리아 인공 염색체와 같은 환상 핵산 분자로 존재할 수 있다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 LacY의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 핵산 분자를 함유하는 유전자 조작된 미생물 세포에서 락토오스 퍼미아제를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역에 영향을 미치는 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된다.
본 명세서에서 사용되는 "작동적으로 연결된"이라는 용어는 락토오스 퍼미아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열, 핵산 발현 조절 서열(프로모터, 오퍼레이터, 인핸서, 조절인자, 전사 인자 결합 부위의 어레이, 전사 터미네이터, 리보솜 결합 부위 등) 사이의 기능적 연결을 지칭하고, 여기서 발현 조절 서열은 락토오스 퍼미아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상응하는 핵산 서열의 전사 및/또는 번역에 영향을 미친다. 따라서, "프로모터"라는 용어는 통상 DNA 폴리머에서 유전자에 "선행"하고, mRNA로의 전사를 개시하는 부위를 제공하는 DNA 서열을 의미한다. "조절인자" DNA 서열, 또한 통상 특정 DNA 폴리머에서 유전자의 "상류"(즉, 선행)는 전사 개시의 빈도(또는 속도)를 결정하는 단백질과 결합한다. "프로모터/조절인자" 또는 "조절" DNA 서열로 총칭되는 이러한 서열은 기능적 DNA 폴리머에서 선택된 유전자(또는 일련의 유전자)에 선행하고, 유전자의 전사(및 최종적 발현)가 발생하는지 여부를 결정하기 위해 협력한다. DNA 폴리머에서 유전자를 "따라다니고(follow)" mRNA로의 전사를 종결시키는 신호를 제공하는 DNA 서열을 전사 "터미네이터" 서열이라고 한다.
제3 측면에 따르면, 유전자 조작된 미생물 세포, 바람직하게는 목적 올리고당을 제조하기 위한 유전자 조작된 미생물 세포가 제공되고, 상기 미생물 세포는 락토오스를 내재화할 수 있으며, 즉 미생물 세포의 환경에 락토오스가 존재하는 경우 미생물 세포가 락토오스를 내재화한다. 유전자 조작된 미생물 세포는 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 락토오스의 내재화를 위한 락토오스 퍼미아제의 변이체를 갖는다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는 본 명세서에서 전술한 바와 같이 락토오스 퍼미아제를 갖는다. 바람직하게는, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 락토오스 퍼미아제는 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체이고, 여기서 막관통 도메인 IX의 류신 잔기 중 적어도 하나는 염기성 아미노산으로 치환되어 있다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 미생물 세포는 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 감소된 수송 활성을 갖는 락토오스 퍼미아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 함유한다. 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 감소된 수송 활성을 갖는 락토오스 퍼미아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 락토오스 퍼미아제의 발현을 위한 것이다. 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 감소된 수송 활성을 갖는 락토오스 퍼미아제의 발현을 위해, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 감소된 수송 활성을 갖는 락토오스 퍼미아제 이외의 임의의 기타 락토오스 퍼미아제를 갖지 않는다.
일부 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는 뉴클레오티드 활성화 당의 세포내 생합성을 위한 적어도 하나의 대사 경로를 포함한다. 뉴클레오티드 활성화 당은 GDP-푸코오스, CMP-NeuNAc, UDP-갈락토오스, UDP-글루코오스, GDP-만노스, UDP-글루코사민 또는 UDP-갈락토사민, UDP-N-아세틸갈락토사민, UDP-N-아세틸글루코사민일 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는 공여체 기질(donor substrate)로서 뉴클레오티드 활성화 단당류로부터 수용체 분자로 단당류 모이어티를 전달하기 위한 적어도 하나의 글리코실트랜스퍼라제를 포함한다. 글리코실트랜스퍼라제는 푸코실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 만노실트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제, 갈락토실트랜스퍼라제로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 수용체 분자는 락토오스, 및 이들의 환원 말단에 락토오스 모이어티를 갖는 올리고당으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
제4 측면에 따르면, 목적 올리고당의 생산을 위해 본 명세서에서 전술한 바와 같은 유전자 조작된 미생물 세포의 용도가 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 "목적 올리고당"이라는 용어는 생산하고자 하는 올리고당을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "올리고당"이라는 용어는 3개 내지 20개의 단당류 잔기로 이루어진 당 분자를 지칭하고, 상기 단당류 잔기 각각은 글리코사이드 결합에 의해 상기 단당류 단위의 적어도 하나의 다른 것과 결합되어 있다. 올리고당은 단당류 잔기의 직쇄 또는 단당류 잔기의 분지쇄일 수 있다.
일부 실시형태에서, 목적 올리고당은 이의 환원 말단에 락토오스 모이어티를 포함하는 올리고당이다. 추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 목적 올리고당은 인간 모유 올리고당(HMO)이다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 목적 올리고당은 2'-푸코실락토오스(2'-FL), 3-푸코실락토오스(3-FL), 2',3-디푸코실락토오스(DFL), 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스(LNT), 락토-N-네오-테트라오스(LNnT), 락토-N-푸코펜타오스 I(LNFP-I), 락토-N-네오푸코펜타오스 I(LNnFP-I), 락토-N-푸코펜타오스 II(LNFP-II), 락토-N-푸코펜타오스 III(LNFP-III), 락토-N-푸코펜타오스 V(LNFP-V), 락토-N-네오푸코펜타오스 V(LNnFP-V), 락토-N-헥사오스(LNH), 락토-N-네오헥사오스(LNnH), 파라-락토-N-헥사오스(paraLNH), 파라-락토-N-네오헥사오스(paraLNnH), 디푸코실-락토-N-네오헥사오스(DF-LNnH), 락토-N-디푸코실헥사오스 I, 락토-N-디푸코실헥사오스 II, 파라-락토-N-푸코실헥사오스(paraLNH), 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 a(F-LST-a), 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 b(F-LST-b), 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 c(F-LST-c), 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 c, 디시알릴-락토-N-푸코펜타오스, 3-푸코실-3'-시알릴락토오스(3F-3'-SL), 3-푸코실-6'-시알릴락토오스(3F-6'-SL), 락토-N-네오디푸코헥사오스 I, 3'-시알릴락토오스(3-SL), 6'-시알릴락토오스(6-SL), 시알릴락토-N-테트라오스 a(LST-a), 시알릴락토-N-테트라오스 b(LST-b), 시알릴락토-N-테트라오스 c(LST-c), 디시알릴락토-N-테트라오스(DS-LNT), 디시알릴락토-N-푸코펜타오스(DS-LNFP V), 락토-N-네오디푸코헥사오스 I(LNnDFH I), 3'-갈락토실락토오스(3'-GL), 6'-갈락토실락토오스(6'-GL)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HMO 및/또는 올리고당이다.
유전자 조작된 미생물 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 적합한 미생물 숙주 세포에는 효모 세포, 박테리아 세포, 고세균 세포 및 진균 세포가 포함된다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 원핵 세포는 박테리아 세포이며, 바람직하게는 바실러스속(Bacillus), 비피도박테리움속(Bifidobacterium), 클로스트리디움속(Clostridium), 코리네박테리움속(Corynebacterium), 엔테로콕쿠스속(Enterococcus), 락토바실러스속(Lactobacillus), 락토콕쿠스속(Lactococcus), 마이크로콕쿠스속(Micrococcus), 마이크로모노스포라속(Micromonospora), 슈도모나스속(Pseudomonas), 로도콕쿠스속(Rhodococcus) 및 스포로락토바실러스속(Sporolactobacillus)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속의 박테리아로부터 선택된 박테리아 세포이다. 적합한 박테리아 종은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비. 리헤니포르미스(B. licheniformis), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비. 써모필루스(B. thermophilus), 비. 라테로스포루스(B. laterosporus), 비. 베가테리움(B. megaterium), 비. 마이코이데스(B. mycoides), 비. 푸밀루스(B. pumilus), 비. 렌투스(B. lentus), 비. 세레우스(B. cereus), 비. 시르쿨란스(B. circulans), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비. 인판티스(B. infantis), 비. 비피둠(B. bifidum), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰(Clostridium cellulolyticum), 씨. 준달리(C. ljungdahlii), 씨. 오토에타노게눔(C. autoethanogenum), 씨. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 엔테로콕쿠스 파에시움(Enterococcus faecium), 이. 써모필레스(E. thermophiles), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 에르위니아 허비콜라(Erwinia herbicola)(판토에아 아글로머란스(Pantoea agglomerans)), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 엘. 살리바리우스(L. salivarius), 엘. 플란타룸(L. plantarum), 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus), 엘. 델브루엑키(L. delbrueckii), 엘. 람노수스(L. rhamnosus), 엘. 불가리쿠스(L. bulgaricus), 엘. 크리스파투스(L. crispatus), 엘. 가쎄리(L. gasseri), 엘. 가세이(L. casei), 엘. 루테리(L. reuteri), 엘. 젠세니(L. jensenii), 엘. 락티스(L. lactis), 판토에아 시트레아(Pantoea citrea), 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum), 프로프리오니박테리움 프레우덴레이치(Proprionibacterium freudenreichii), 슈도모나스 플루레센스(Pseudomonas fluorescens), 피. 에루기노사(P. aeruginosa), 스트렙토콕쿠스 써모필레스(Streptococcus thermophiles) 및 산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)이다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 진핵 세포는 효모 세포, 바람직하게는 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp.), 특히 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이콥시스 종(Saccharomycopsis sp.), 피키아 종(Pichia sp.), 특히 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 종(Hansenula sp.), 클루베로마이세스 종(Kluyveromyces sp.), 야로위아 종(Yarrowia sp.), 로도토룰라 종(Rhodotorula sp.) 및 스키조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces sp.)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효모 세포이다.
또 다른 측면에 따르면, 목적 올리고당의 생산 방법이 제공되고, 여기서 목적 올리고당은 유전자 조작된 미생물 세포에서/세포에 의해 합성된다. 이어서, 이 방법은 목적 올리고당의 합성을 위한 유전자 조작된 미생물 세포를 제공하는 것을 포함하고, 여기서 유전자 조작된 미생물 세포는 본 명세서에서 전술한 바와 같이 유전자 조작된 미생물 세포이다. 유전자 조작된 미생물 세포는 배양 배지에서, 유전자 조작된 미생물 세포가 목적 올리고당을 합성하기에 적합한 조건하에서 배양된다. 목적 올리고당의 생합성을 위해, 유전자 조작된 미생물 세포는 외인성 락토오스의 존재하에서 배양된다. 이 방법은 추가로 유전자 조작된 미생물 세포에 의해 합성된 목적 올리고당을 회수하는 단계를 포함한다. 목적 올리고당은 유전자 조작된 미생물 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수된다.
또 다른 측면에 따르면, 미생물 세포의 락토오스 사멸 효과를 완화하는 방법이 제공되고, 이 방법은 미생물 세포의 내인성 락토오스 퍼미아제를, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 락토오스 퍼미아제로 치환하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 락토오스 퍼미아제는 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖고, 본 명세서에서 전술한 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제의 변이체이다.
일부 실시형태에서, 내인성 락토오스 퍼미아제를 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 락토오스 퍼미아제로 치환하는 것은 미생물 세포의 내인성 락토오스 퍼미아제 유전자(들)를, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 락토오스 퍼미아제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자로 치환함으로써 발생한다.
미생물 세포의 내인성 락토오스 퍼미아제를, 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY와 비교하여 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 락토오스 퍼미아제로 치환하는 것은, 외인성 락토오스에 노출되는 경우, 특히 고농도의 외인성 락토오스에 노출되는 경우에 미생물 세포의 사멸을 감소 또는 방지할 수 있다. 락토오스 사멸에 대한 미생물 세포의 내성을 평가하기 위해 사용되는 "고농도의 락토오스"라는 용어는 미생물 세포를 배양하기 위한 배양 배지 중의 락토오스 농도가 적어도 5mM, 바람직하게는 약 10mM, 더 바람직하게는 약 20mM, 및 가장 바람직하게는 약 25mM인 것을 의미한다.
또 다른 측면에 따르면, 미생물 세포에서 또는 미생물 세포에 의해 목적 올리고당을 생산하는 효능 및/또는 신뢰성을 향상시키는 방법이 제공되고, 여기서 유전자 조작된 미생물 세포는 목적 올리고당의 생합성을 위해 외인성 락토오스의 존재하에서 배양되어야 한다. 이 방법은 목적 올리고당의 생산을 위해 본 명세서에서 전술한 바와 같이 미생물 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 미생물 세포는 락토오스에 대한 감소된 수송 활성을 갖는 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체를 갖는다. 미생물 세포는 외인성 락토오스를 내재화함으로써 목적 올리고당을 합성할 수 있다. 미생물 세포는 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY를 갖는 미생물 세포와 비교하여 미생물 세포에 의한 락토오스 내재화의 감소된 수준에 기인하여 외인성 락토오스의 첨가/존재에 덜 감수성이다. 따라서, 미생물 세포의 배양 및/또는 미생물 세포에 의한 올리고당 생산은 외인성 락토오스의 존재 및/또는 첨가에 덜 감수성이다.
미생물 세포 내에서 또는 미생물 세포에 의한 올리고당 생산을 보다 효율적 및/또는 보다 신뢰성이도록 하는 것은 대규모/공업적 생산 프로세스에서 특히 중요하다. "대규모" 및 "공업적"이라는 용어는 목적 올리고당의 생산이 100L, 500L, 1000L, 5000L, 10,000L, 50,000L, 100,000L 또는 심지어 200,000L를 초과하는 용적의 발효 브로쓰에서 미생물 발효에 의해 발생한다는 것을 나타낸다.
본 발명은 특정 실시형태와 관련하여 및 도면을 참조하여 설명될 것이지만, 본 발명은 이들로 한정되지 않고 특허청구범위에 의해서만 한정된다. 추가로, 본 명세서 및 특허청구범위에서 제1, 제2 등의 용어는 유사한 요소들을 구별하기 위해 사용되는 것이며, 반드시 시간적, 공간적, 순위로 또는 임의의 기타 방식으로 순서를 기재하기 위해 사용되는 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어들은 적절한 상황에서 교환 가능하며, 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태는 본 명세서에 기재 또는 예시된 것과 다른 순서로 동작할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
특허청구범위에 사용된 "포함하는(comprising)"이라는 용어는 그 후에 열거된 수단으로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 다른 요소 또는 단계를 배제하는 것이 아니라는 것에 유의해야 한다. 따라서, 이는 언급된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소의 존재를 특정하는 것으로 해석되어야 하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계 또는 구성요소, 또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, "수단 A 및 B를 포함하는 장치"라는 표현의 범위는 구성요소 A 및 B로만 이루어진 장치로 한정되어서는 안 된다. 본 발명과 관련하여, 장치의 유일한 관련 구성요소는 A 및 B라는 것을 의미한다.
본 명세서 전체를 통해 "일 실시형태" 또는 "실시형태"에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 복수의 개소에서 "일 실시형태에서" 또는 "실시형태에서"라는 문구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시형태를 지칭하는 것은 아니며, 그 가능성이 있다. 추가로, 특정 특징, 구조 또는 특성은, 하나 이상의 실시형태에서 본 개시로부터 당업자에게 명백한 바와 같이, 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다.
유사하게는, 본 발명의 예시적 실시형태의 설명에서, 본 발명의 다양한 특징들은 때때로 본 개시를 합리화하고 다양한 발명 측면의 하나 이상의 이해를 돕기 위한 목적으로 단일 실시형태, 도면 또는 이의 설명에 함께 그룹화되어 있다는 것을 인식해야 한다. 그러나, 이러한 개시 방법은 청구된 발명이 각 청구항에 명시적으로 기재된 것보다 더 많은 특징을 필요로 한다는 의도를 반영하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 오히려, 하기 특허청구범위가 반영하는 바와 같이, 발명적 측면은 단일의 상기 개시된 실시형태의 모든 특징보다 적은 것에 있다. 따라서, 상세한 설명에 따르는 특허청구범위는 본 명세서에 명시적으로 포함되지 않으며, 각 청구항은 그 자체로 본 발명의 개별적 실시형태로서 존재한다.
추가로, 본 명세서에 기재된 일부 실시형태는 다른 실시형태에 포함된 일부 특징을 포함하지만 다른 특징을 포함하지 않는 반면, 상이한 실시형태의 특징의 조합은 본 발명의 범위 내에 있는 것을 의미하고, 당업자에게 이해될 수 있는 바와 같이 상이한 실시형태를 형성한다. 예를 들면, 하기 특허청구범위에서 특허청구된 실시형태 중 어느 것이든 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
추가로, 일부 실시형태는 컴퓨터 시스템의 프로세서 또는 기능을 수행하는 기타 수단에 의해 실시가능한 방법 또는 방법 요소의 조합으로서 본 명세서에 기재되어 있다. 따라서, 이러한 방법 또는 방법의 요소를 실행하기 위해 필요한 명령어를 갖는 프로세서는 방법 또는 방법의 요소를 실행하기 위한 수단을 형성한다. 추가로, 본 명세서에 설명된 장치 실시형태의 요소는 본 발명을 수행할 목적으로 그 요소에 의해 수행되는 기능을 수행하기 위한 수단의 일례이다.
본 명세서에서 제공되는 설명 및 도면에서, 다수의 구체적 상세가 기재되어 있다. 그러나, 본 발명의 실시형태는 이러한 특정 상세 없이도 실시될 수 있는 것으로 이해된다. 다른 경우에, 본 명세서의 이해를 방해하지 않기 위해 주지의 방법, 구조 및 기술은 상세하게 제시되지 않았다.
이제, 본 발명은 본 발명의 몇몇 실시형태에 대한 상세한 설명에 의해 설명될 것이다. 본 발명의 다른 실시형태는 본 발명의 진정한 정신 또는 기술적 교시로부터 벗어나지 않고 당업자의 지식에 따라 구성될 수 있으며, 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정된다는 것이 명백하다.
실시예
실시예 1: LC/MS 분석
생성되는 락토-N-테트라오스의 동정은 LC 트리플 사중극 MS 검출 시스템(Shimadzu LCMS-8050)을 사용한 다중 반응 모니터링(MRM)에 의해 결정되었다. 전구체 이온은 4중극 1에서 선택 및 분석되고, 이어서 4중극 3에서 아르곤과의 충돌-유도 단편화(CID) 및 단편 이온의 선택이 수행되었다. 중간체 및 최종 생성물 대사산물에 대해 선택된 전이 및 충돌 에너지는 표 5에 제시되어 있다.
[표 5]
입자-비함유 배양 상청액 또는 세포질 분획 중의 올리고당 LNT를, 중성 또는 산성 당 모두에 대해 워터스(Waters) XBridge 아미드 HPLC 컬럼(3.5μm, 2.1Å 50mm)을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분리했다. 중성 당은 0.1%(v/v) 수산화암모늄과 함께 H2O의 등방성 유동으로 용출했다. HPLC 시스템은 8℃에서 작동하는 시마즈 넥세라(Shimadzu Nexera) X2 SIL-30ACMP 오토샘플러, 시마즈(Shimadzu) LC-20AD 펌프, 시마즈(Shimadzu) CTO-20AC 컬럼 오븐을 포함하고, 중성 당 용출에는 35℃에서 작동하고 산성 당 용출에는 50℃로 조정되었다. LNT 분석을 위해, 1μl를 장치에 주입했다. 유속은 5분의 실행 시간에 상응하는 0.3mL/min으로 설정되었다. LNT는 음이온 모드에서 분석했다. 질량 분석기는 단위 분해능으로 작동했다. 충돌 에너지, Q1 및 Q3 사전-바이어스는 각 분석물에 대해 최적화되었다. 정량화 방법은 상업적으로 이용가능한 표준물질(Carbosynth 및 Elicityl)을 사용하여 확립되었다.
실시예
2: 최소
배양 배지
목적 올리고당 생산을 위한 세포의 성장에 사용되는 배양 배지는 3g/L KH2PO4, 12g/L K2HPO4, 5g/L (NH4)SO4, 0.3g/L 시트르산, 0.1g/L NaCl, 2g/L MgSO4 × 7H2O 및 0.015g/L CaCl2 × 6H2O을 함유하고, 1ml/L 미량 원소 용액(54.4g/L 암모늄 제2철 시트레이트, 9.8g/L MnCl2 × 4H2O, 1.6g/L CoCl2 × 6H2O, 1g/L CuCl2 × 2H2O, 1.9g/L MnCl2 × 4H2O, 1.1g/L Na2MoO4 × 2H2O, 1.5g/L Na2SeO3, 1.5g/L NiSO4 × 6H2O)으로 보충했다. 배지의 pH를 7.0으로 조정했다. 세포에 의한 목적 올리고당의 합성 및 락토오스에 대한 세포 감수성을 시험하기 위해 락토오스를 10mM 내지 25mM 농도로 배지에 첨가했다.
실시예
3:
감소된
락토오스 감수성을 갖는
락토
-N-
테트라오스
생산 이
.
콜
라이
균주의 생성
유전자 조작에 의해, 락토-N-테트라오스(LNT)를 생산할 수 있는 이. 콜라이 BL21(DE3)의 대사 공학적 유도체를 수득했다. 락토오스에 대한 상기 박테리아 LNT 생산 균주의 감수성을 감소시키기 위해, 부정합 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 균주의 내인성 lacY 유전자를 변형시켜, 락토오스 퍼미아제 LacY(L293R)를 코딩하는 lacY 변이체 lacY(L293R)를 생성했다.
발현 분석을 위해, 상기 돌연변이유발 접근법으로부터 수득된 개별 클론을 진탕 플라스크 중의 25ml 미네랄 염 배지에 접종했다. 각 클론의 발현 분석은 3회 반복으로 수행되었다. 박테리아 세포는 30℃ 및 상대 습도 80%에서 120rpm으로 일정하게 교반하면서 배양했다. 20시간 배양 후, 이러한 사전-배양물의 광학 밀도를 측정하고, 25ml의 미네랄 염 배지에 0.05의 OD600로 되도록 주요 배양물을 시딩했다. 주요 배양물은 사전-배양물과 동일한 조건에서 20시간 동안 배양했다. 이어서, 원심분리에 의해 박테리아 세포를 채취하고, RNA 추출 및 qPCR에 의한 후속 발현 분석에 사용했다. 발현 수준의 상대적 정량화는 비교 △ 사이클 임계치 방법을 사용하여 수행되었고, 계산된 상대적 발현 값을 gapA로 정규화하여 대조군으로 사용된 모 균주의 발현 수준과 비교했다. 결과는 도 3에 제시되어 있다. LacY의 상대적 발현(도 3, 컬럼 A)은 LacY(L293R)의 상대적 발현(도 3, 컬럼 B)과 동일한 수준이었다. 따라서, 락토오스 퍼미아제 변이체 LacY(L293R)를 유도하는 락토오스 퍼미아제 유전자에 돌연변이의 도입은 각각의 락토오스 퍼미아제 유전자의 발현을 변경시키지 않았다.
LacY(L293R)를 보유한 박테리아 LNT 생산 균주의 락토오스 감수성을 시험하기 위해, 상기 균주의 개별 클론을 진탕 플라스크 중의 25ml 미네랄 염 배지에 접종했다. 박테리아 세포는 30℃ 및 80% 상대 습도에서 120rpm으로 일정하게 교반하면서 배양했다. 20시간 배양 후, 사전-배양물의 광학 밀도를 측정하고, 25ml의 미네랄 염 배지에 OD600 0.3으로 되도록 주요 배양물을 접종했다. 락토오스는, 배양물 접종 2시간 후에 최종 농도가 10 또는 25mM로 되도록 배양 배지에 첨가했다. 주요 배양물의 광학 밀도(OD600)는 락토오스의 첨가 20시간 후에 측정했다.
광학 밀도는 도 4에 제시되어 있다. 이 도면은, LacY를 갖는 박테리아 균주(흑색 컬럼)는 배양 배지에 락토오스의 부재(컬럼 서브세트 I)하에 락토오스 퍼미아제 변이체 LacY(L293R)를 갖는 박테리아 균주(백색 컬럼)와 유사한 성장을 나타내는 것을 보여준다. 10mM 락토오스(컬럼 서브세트 II) 또는 25mM 락토오스(컬럼 서브세트 III)의 존재하에, LacY를 갖는 박테리아 세포의 성장은 락토오스 부재하의 성장과 비교하여 현저히 감소한 반면, 락토오스 퍼미아제 변이체 LacY(L293R)를 갖는 박테리아 세포의 성장은 이들의 배양 배지에 10mM 또는 25mM 락토오스의 존재하에 감소되지 않았다.
실시예
4:
14
C
-표지된
락토오스를 사용한
락토오스 유입의 정량화
락토오스 수송을 측정하기 위해, 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY의 상이한 변이체를 발현하는 이. 콜라이 균주를 3ml LB 배지에 접종하고, 진탕기에서 37℃에서 20시간 동안 배양했다. 이러한 배양물로부터의 박테리아 세포 펠렛을 사용하여 진탕 플라스크에서 100ml 최소 배지를 접종했다. 이 배양물을 진탕기에서 37℃에서 16시간 동안 인큐베이팅했다. 이어서, 원심분리에 의해 박테리아 세포를 침전시키고, 수득된 펠렛을 신선한 차가운(4℃) 배양 배지로 2회 세척하고, 최후로 차가운 배지에 재현탁했다. 세포 현탁액의 광학 밀도(OD600)는 차가운 배지로 5로 설정하고, 세포 현탁액은 내재화 검정에 사용할 때까지 아이스 상에 보관했다.
수송 검정 3분 전에, 박테리아 세포를 37℃ 열 블록에 넣었다. 수송 검정은 14C-표지된 락토오스와 비-방사성 표지된 락토오스의 혼합물을 최종 농도 0.5mM 락토오스 및 50,000dpm으로 되도록 첨가하여 개시했다. 30초의 인큐베이팅 시간 후, 니트로셀룰로오스 필터(0.22μM 기공 크기; Millipore, Eschborn, DE)를 포함하는 필터 시스템을 사용하여 박테리아 세포를 이들의 배지로부터 분리함으로써 수송 검정을 중지했다. 필터 상의 박테리아 세포를 100mM LiCl로 2회 세척하고, 이어서 필터를 사용하여 Tricarb 2800 신틸레이션 계수기(Perkin Elmar, Waltham, MA)에서 잔류 방사능을 정량화했다. 이를 위해, 필터를 신틸레이션 튜브로 옮기고, 6ml 로티진트 에코 플러스(Rotiszint eco plus)(Roth, Karlsruhe, DE)로 덮었다.
제2 실험 세트에서, 14C-표지된 락토오스와 비-방사성 표지된 락토오스의 혼합물을 최종 농도 5mM 락토오스 및 550,000dpm까지 첨가하여 수송 검정을 개시했다. 박테리아 세포를 60초 인큐베이팅 후에 여과하여 수집하고, 5mM 비표지된 락토오스를 함유한 3ml 배지로 2회 세척했다.
도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, LacY를 갖는 박테리아 세포(흑색 컬럼)는 락토오스 퍼미아제 변이체 LacY(L293R)를 갖는 박테리아 세포(백색 컬럼)보다 훨씬 더 많은 방사능이 도입되었고, 여기서 도 5A는 0.5mM의 외인성 락토오스 농도에서 락토오스 내재화를 나타내는 반면, 도 5B는 5mM의 외인성 락토오스 농도에서 락토오스 내재화를 나타낸다. 따라서, 락토오스 퍼미아제 변이체 LacY(L293R)는 LacY와 비교하여 박테리아 세포로의 감소된, 그러나 검출가능한 락토오스 유입을 유도한다.
실시예
5: 실험실 규모의 발효에서
대사적으로
조작된 이.
콜라이에
의한 락토-N-테트라오스 생산
박테리아 균주에 의한 락토오스 유입 감소 및 락토오스 감수성 감소가 이의 올리고당 생산에 미치는 영향을 소규모 발효에서 분석했다. 따라서, LacY를 갖는 이. 콜라이 균주와 LacY(L293R)를 갖는 이. 콜라이 균주에 의한 LNT의 발효 생산을 3리터 규모에서 비교했다.
제1 발효 세트에서, 각 박테리아 균주를, 20mM 락토오스를 함유한 발효 브로쓰에서 사전-배양으로부터 접종했다. LacY(L293R)를 갖는 이. 콜라이 균주는 성장에 어떠한 문제도 나타내지 않았지만, 야생형 LacY를 갖는 이. 콜라이 균주는 성장의 현저한 지연을 나타내어(데이터는 제시되지 않음), 이 실험적 접근법을 LNT 생산의 비교에 부적합하게 했다. 추가로, 락토오스 수준은, LacY(L293R)을 갖는 이. 콜라이 균주의 배양물에서, OD600의 임의의 후퇴를 유발하지 않고 및 명백한 락토오스-유발 세포 용해 없이 연속 락토오스 공급(3.2ml/L/h)을 적용함으로써 높게 유지할 수 있다.
락토오스의 존재하에 LacY를 갖는 박테리아의 현전한 성장 지연에도 불구하고 상이한 LNT 생산 균주의 LNT 생산을 비교하기 위해, 락토오스를 결여하는 배양 배지에 균주를 접종했다. 이 배양물에서, 락토오스 공급(2.5ml/L/h)은 배치 단계의 말기에 개시했다. 그러나, 더 낮은 락토오스 공급을 사용했음에도 불구하고, LacY를 갖는 이. 콜라이에서 40시간 후에 OD600의 감소가 관찰되었다.
소규모 발효의 결과는 도 6 및 7에 제시되어 있다. 도 6은 LacY 대신에 LacY(L293R)(x)을 갖는 박테리아 균주와 비교하여 LacY(●)을 갖는 박테리아 균주의 LNT 생산의 상대적 양을 나타내는 반면, 이들의 배양 배지에서 양 균주의 성장은 도 7에 제시되어 있다.
LacY(●)를 갖는 LNT-생산 균주의 성장은 약 25시간 후에 현저하게 손상되는 반면, LacY(L293R)(x)를 갖는 LNT-생산 균주는 발효 전반에 걸쳐 규칙적 성장 속도를 나타내어 배양 중의 더 높은 광학 밀도에 도달했다(도 7).
놀랍게도, 도 6으로부터 추론할 수 있는 바와 같이, LacY(L293R)(x)를 갖는 균주로부터 수득된 LNT의 수율은 LacY(●)를 갖는 LNT-생산 균주로부터 수득된 것보다 높았다. LacY를 갖는 LNT-생산 균주를 사용한 발효에서 120시간에서 LNT의 양은 100%로 설정되었다.
배치 배지에서 락토오스에 대응하는 LacY(L293R)를 갖는 이. 콜라이 균주의 능력으로 인해, 이 균주는 LNT 생산을 더 조기에 개시할 수 있고, 따라서 야생형 LacY를 갖는 대조군 균주보다 더 많은 LNT를 생산할 수 있다. 그러나, 락토오스 감수성 감소의 가장 큰 이점은 올리고당 생산을 위해 락토오스를 공급할 때에 세포 용해의 위험성 및 발효의 완전한 손실 가능성을 회피할 수 있다는 것이다.
실시예
6: 이.
콜라이
LacY
변이체의
막
토폴로지의
결정
이. 콜라이 야생형 LacY의 다양한 변이체에 대한 아미노산 서열을 SPLIT 4.0 서버(http://splitbioinf.pmfst.hr/split/4/) 및 하기 문헌에 기재된 것을 사용하여 이들의 막관통 2차 구조의 예측에 적용했다:
Juretic, D., Zoranic, L., Zucic, D. "Basic charge clusters and predictions of membrane protein topology" J. Chem. Inf. Comput. Sci. Vol. 42, pp. 620-632, 2002.
Juretic, D., Lee, B. K., Trinajstic, N., and Williams, R. W. "Conformational preference functions for predicting helices in membrane proteins." Biopolymers 33, 255-273 (1993).
Juretic, D., Lucic, B., Zucic, D. and Trinajstic, N. "Protein transmembrane structure: recognition and prediction by using hydrophobicity scales through preference functions." Theoretical and Computational Chemistry, Vol.5. Theoretical Organic Chemistry, pp. 405-445. Editor: Parkanyi, C., Elsevier Science, Amsterdam, 1998. (SPLIT 3.1 results are described in that paper)
Juretic, D., Zucic, D., Lucic, B. and Trinajstic, N. "Preference functions for prediction of membrane-buried helices in integral membrane proteins." Computers Chem. Vol. 22, No. 4, pp. 279-294, 1998. (SPLIT 3.1 results are described in that paper as well)
Juretic, D. and Lucin A. "The preference functions method for predicting protein helical turns with membrane propensity." J. Chem. Inf. Comput. Sci. Vol. 38, No. 4, pp. 575-585, 1998. (SPLIT 3.5 results are described in that paper)
Juretic, D., Jeroncic, A. and Zucic, D. "Sequence analysis of membrane proteins with the web server SPLIT." Croatica Chemica Acta Vol. 72, No. 4, pp. 975-997, 1999.
Juretic, D., Jeroncic, A. and Zucic, D. "Prediction of initiation sites for protein folding." Periodicum Biologorum 101, No 4, 339-347, 1999.
이. 콜라이 야생형 LacY의 소수성은 도 8A 및 도 9A에 제시되어 있고, 소수성의 평가는 곡선하의 박스 I 내지 XII에 제시된 바와 같이 락토오스 퍼미아제 내에 12개의 막관통 도메인의 존재를 나타냈다. 변이체 LacY(L293H)의 소수성 평가는 막관통 도메인의 수에 변화가 없는 것을 나타냈지만(도 9B), 이. 콜라이 LacY 변이체 LacY(L293R)(도 9C) 및 LacY(L293K)(도 9D), 및 이. 콜라이 LacY 변이체 LacY(L292R)(도 8B), LacY(L294R) 및 LacY(L292R), LacY(L293R), LacY(L294R)(도 10)은 변경된 소수성을 나타내고, 이는 (이. 콜라이 야생형 LacY와 관련하여) 단일 막관통 도메인에 대한 막관통 도메인 IX 및 X의 융합을 유도하여, 주변세포질 루프 P9(도 2)가 막관통 도메인의 예측에서 설명되지 않도록 한다. 그러나, 이. 콜라이 야생형 LacY의 막 토폴로지와 비교하여, LacY 변이체의 막 토폴로지의 예측된 변화는 LacY 변이체에 의한 락토오스의 막관통 수송을 완전히 폐지하지 않는다.
SEQUENCE LISTING
<110> Jennewein Biotechnologie GmbH
<120> Microbial cells possessing a reduced lactose internalization for
producing an oligosaccharide
<130> P 2003 WO
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 417
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 1
Met Tyr Tyr Leu Lys Asn Thr Asn Phe Trp Met Phe Gly Leu Phe Phe
1 5 10 15
Phe Phe Tyr Phe Phe Ile Met Gly Ala Tyr Phe Pro Phe Phe Pro Ile
20 25 30
Trp Leu His Asp Ile Asn His Ile Ser Lys Ser Asp Thr Gly Ile Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Leu Phe Gln Pro Leu Phe Gly
50 55 60
Leu Leu Ser Asp Lys Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu Leu Trp Ile Ile
65 70 75 80
Thr Gly Met Leu Val Met Phe Ala Pro Phe Phe Ile Phe Ile Phe Gly
85 90 95
Pro Leu Leu Gln Tyr Asn Ile Leu Val Gly Ser Ile Val Gly Gly Ile
100 105 110
Tyr Leu Gly Phe Cys Phe Asn Ala Gly Ala Pro Ala Val Glu Ala Phe
115 120 125
Ile Glu Lys Val Ser Arg Arg Ser Asn Phe Glu Phe Gly Arg Ala Arg
130 135 140
Met Phe Gly Cys Val Gly Trp Ala Leu Cys Ala Ser Ile Val Gly Ile
145 150 155 160
Met Phe Thr Ile Asn Asn Gln Phe Val Phe Trp Leu Gly Ser Gly Cys
165 170 175
Ala Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu Phe Phe Ala Lys Thr Asp Ala Pro
180 185 190
Ser Ser Ala Thr Val Ala Asn Ala Val Gly Ala Asn His Ser Ala Phe
195 200 205
Ser Leu Lys Leu Ala Leu Glu Leu Phe Arg Gln Pro Lys Leu Trp Phe
210 215 220
Leu Ser Leu Tyr Val Ile Gly Val Ser Cys Thr Tyr Asp Val Phe Asp
225 230 235 240
Gln Gln Phe Ala Asn Phe Phe Thr Ser Phe Phe Ala Thr Gly Glu Gln
245 250 255
Gly Thr Arg Val Phe Gly Tyr Val Thr Thr Met Gly Glu Leu Leu Asn
260 265 270
Ala Ser Ile Met Phe Phe Ala Pro Leu Ile Ile Asn Arg Ile Gly Gly
275 280 285
Lys Asn Ala Leu Leu Leu Ala Gly Thr Ile Met Ser Val Arg Ile Ile
290 295 300
Gly Ser Ser Phe Ala Thr Ser Ala Leu Glu Val Val Ile Leu Lys Thr
305 310 315 320
Leu His Met Phe Glu Val Pro Phe Leu Leu Val Gly Cys Phe Lys Tyr
325 330 335
Ile Thr Ser Gln Phe Glu Val Arg Phe Ser Ala Thr Ile Tyr Leu Val
340 345 350
Cys Phe Cys Phe Phe Lys Gln Leu Ala Met Ile Phe Met Ser Val Leu
355 360 365
Ala Gly Asn Met Tyr Glu Ser Ile Gly Phe Gln Gly Ala Tyr Leu Val
370 375 380
Leu Gly Leu Val Ala Leu Gly Phe Thr Leu Ile Ser Val Phe Thr Leu
385 390 395 400
Ser Gly Pro Gly Pro Leu Ser Leu Leu Arg Arg Gln Val Asn Glu Val
405 410 415
Ala
<210> 2
<211> 1254
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt 60
tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc 120
agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa 180
ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt 240
accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa 300
tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc 360
ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt 420
ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc 480
atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc 540
gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg 600
gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca 660
aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac 720
caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta 780
tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca 840
ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct 900
gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg 960
ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag 1020
tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg 1080
gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc 1140
gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt 1200
agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa 1254
Claims (10)
- 목적 올리고당(oligosaccharide of interest)을 생산하기 위한 유전자 조작된 미생물 세포로서,
상기 미생물 세포는 외인성 락토오스를 내재화(internalizing)하기 위한 락토오스 퍼미아제(permease)를 포함하고, 상기 락토오스 퍼미아제는 이. 콜라이(E. coli) 야생형 LacY와 비교하여 락토오스의 감소된 내재화를 나타내는 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체(variant)인, 유전자 조작된 미생물 세포. - 제1항에 있어서, 상기 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체가 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이. 콜라이 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체가 서열번호 1로 표시되는 락토오스 퍼미아제와 관련하여 아미노산 위치 292, 293 및 293 중 적어도 하나에 염기성 아미노산 잔기를 포함하는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 제3항에 있어서, 상기 염기성 아미노산 잔기가 아르기닌, 히스티딘 및 라이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물 세포가 하기로 이루어진 그룹으로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 유전자 조작된 미생물 세포:
a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체를 코딩하는(encoding) 뉴클레오티드 서열,
b) a)의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열;
c) 엄격한 조건(stringent condition)하에 a) 또는 b)에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열. - 제5항에 있어서, 상기 이. 콜라이 야생형 락토오스 퍼미아제 LacY의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물 세포가
- 뉴클레오티드 활성화된 당의 세포내 생합성을 위한 적어도 하나의 대사 경로; 및
- 공여체 기질(donor substrate)로서의 뉴클레오티드-활성화된 단당류로부터 수용체 분자로서의 락토오스 또는 올리고당류로 단당류 모이어티(moiety)를 세포내 전달하기 위한 적어도 하나의 글리코실트랜스퍼라제
를 추가로 포함하는, 유전자 조작된 미생물 세포. - 목적 올리고당의 생산을 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 유전자 조작된 미생물 세포의 용도로서, 상기 목적 올리고당이 이의 환원 말단(reducing end)에 락토오스 모이어티를 포함하는, 용도.
- 목적 올리고당을 생산하기 위한 방법으로서,
상기 목적 올리고당은 미생물 세포에서 합성되고, 상기 방법은
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 올리고당의 세포내 생합성을 위한 유전자 조작된 미생물 세포를 제공하는 단계;
- 배지에서 외인성 락토오스의 존재하에 및 유전자 조작된 세포가 목적 올리고당을 세포내에서 합성하도록 하는 조건하에서 유전자 조작된 세포를 배양하는 단계; 및
- 배양 배지 또는 세포로부터 목적 올리고당을 회수하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제9항에 있어서, 상기 올리고당이 2'-푸코실락토오스(2'-FL), 3-푸코실락토오스(3-FL), 2',3-디푸코실락토오스(DFL), 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스(LNT), 락토-N-네오-테트라오스(LNnT), 락토-N-푸코펜타오스 I(LNFP-I), 락토-N-네오푸코펜타오스 I(LNnFP-I), 락토-N-푸코펜타오스 II(LNFP-II), 락토-N-푸코펜타오스 III(LNFP-III), 락토-N-푸코펜타오스 V(LNFP-V), 락토-N-네오푸코펜타오스 V(LNnFP-V), 락토-N-헥사오스(LNH), 락토-N-네오헥사오스(LNnH), 파라-락토-N-헥사오스(paraLNH), 파라-락토-N-네오헥사오스(paraLNnH), 디푸코실-락토-N-네오헥사오스(DF-LNnH), 락토-N-디푸코실헥사오스 I, 락토-N-디푸코실헥사오스 II, 파라-락토-N-푸코실헥사오스(paraLNH), 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 a(F-LST-a), 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 b(F-LST-b), 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 c(F-LST-c), 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 c, 디시알릴-락토-N-푸코펜타오스, 3-푸코실-3'-시알릴락토오스(3F-3'-SL), 3-푸코실-6'-시알릴락토오스(3F-6'-SL), 락토-N-네오디푸코헥사오스 I, 3'-시알릴락토오스(3-SL), 6'-시알릴락토오스(6-SL), 시알릴락토-N-테트라오스 a(LST-a), 시알릴락토-N-테트라오스 b(LST-b), 시알릴락토-N-테트라오스 c(LST-c), 디시알릴락토-N-테트라오스(DS-LNT), 디시알릴락토-N-푸코펜타오스(DS-LNFP V), 락토-N-네오디푸코헥사오스 I(LNnDFH I), 3'-갈락토실락토오스(3'-GL), 6'-갈락토실락토오스(6'-GL)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
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