BR112019021000A2

BR112019021000A2 - anticorpo anti-ilt4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, composição farmacêutica, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, métodos para produção e para detecção do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e uso dos mesmos

Info

Publication number: BR112019021000A2
Application number: BR112019021000A
Authority: BR
Inventors: Claudia Schuster Andrea; Joyce-Shaikh Barbara; Schultze Kornelia; A Zuniga Luis; Blanusa Milan
Original assignee: Agenus Inc; Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2017-04-07
Filing date: 2018-04-05
Publication date: 2020-05-05
Also published as: US11897956B2; NI201900103A; GEP20227440B; KR102357823B1; TW201839014A; CR20190459A; US11897957B2; US20180298096A1; CA3057378A1; US20220033496A1; AU2018248294B2; DOP2019000253A; AR111362A1; CL2019002855A1; MX2019011927A; CN110719917A; IL269593A; PH12019502275A1; KR20190136064A; CO2019011155A2

Abstract

a presente invenção fornece anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo que se ligam a ilt4 (receptor semelhante à imunoglobulina 4) e combinações dos mesmos, por exemplo, com um anticorpo anti-pd1. também são fornecidos métodos de uso dos mesmos, por exemplo, para tratamento ou prevenção de câncer em um indivíduo; e métodos para produzir esses anticorpos e fragmentos.

Description

ANTICORPOS ANTI-ILT4 E FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados [001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade ao Pedido Provisório dos EUA. NO 62/483.019, depositado em 7 de abril de 2017, cuja divulgação está incorporada na presente invenção na sua totalidade.

Campo da Invenção [002] A presente invenção refere-se a anticorpos e a fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, que se ligam ao epítopo do receptor semelhante a imunoglobulina humana 4 (ILT4), bem como a métodos de produção e uso de anticorpos e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, para tratar doenças como câncer.

Antecedentes da Invenção [003] Uma estratégia comum usada pelas células tumorais para escapar da resposta imune inata e adaptativa está associada à expressão aberrante de antígeno leucocitário humano (HLA)-G (Curigliano et al. Clin Cancer Res. 2013 e Gonzalez et al. Crit Rev Clin Lab Sei. 2012). O HLA-G pode inibir diretamente a função de célula imune através da ligação ao receptor e/ou da trogocitose e comprometimento da quimiotaxia (Morandi et al. Cytokine Growth Factor Review. 2014 e Lin et al. Mol Med. 2015). Sua alta expressão em múltiplos tipos de tumores, incluindo, por exemplo, câncer colorretal, pancreático, endometrial, pulmão, mama, ovário e gástrico, está associada a estágio avançado da doença, invasão tumoral, potencial metastático e prognóstico desfavorável (Lin etal. Mol Med. 2015. e Loumange et al. Int J Cancer. 2014). Bloqueio mediado por anticorpos de função HLA-G em modelos de camundongos transgênicos demonstrou inibir desenvolvimento de tumores e bloquear expansão de células supressoras de origem mielóide (MDSC) (Loumange et al. Int J Cancer. 2014., Lin et al. Hum Immunol. 2013., e Agaugue et al. Blood. 2011). HLA-G de ligação ao

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ILT4 pode inibir diretamente a função de monócitos, células dendríticas e neutrófilos, prejudicando assim a resposta antitumoral imune inata. A interação entre HLA-G e monócitos devido a ILT4 inibe a maturação de células apresentadoras de antígenos derivadas de monócitos humanos (APCs), resultando em uma expressão reduzida de antígenos MHC classe II e moléculas co-estimuladoras através de ativação de Stat3n (Colonna et al. J Immunol. 1998; Allan etal. J Exp Med. 1999, e Liang etal. Proc Natl Sci USA. 2008). Usando células dendríticas derivadas de monócitos humanos (DCs) e de camundongos transgênicos para ILT4, HLA-G demonstrou induzir o desenvolvimento de APCs tolerogênicas com parada de maturação/ativação de DCs mielóides, e a indução de DCs tolerogênicas por HLA-G foi através de interrupção da via de apresentação por MHC classe II (Ristich et al. Eur J Immunol. 2005).

[004] Existe uma necessidade médica não atendida para pacientes que não respondem à terapia com células T, mas podem se beneficiar do alívio da tolerância tumoral mediada por macrófagos tecido-associados /MDSC (por exemplo, tumores ricos em células mielóides ). O bloqueio de ILT4 preenchería essa necessidade e se diferenciaria dos atuais anticorpos direcionados a células T (por exemplo, anti-PDl, anti-TIGIT), aliviando a supressão de células mielóides tolerogênicas no microambiente tumoral.

Sumário da Invenção [005] A presente invenção fornece anticorpos e a fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se ligam à ILT4 humana. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos em um epítopo de ILT4 humana selecionado a partir do grupo que consiste em LYREKKSASW (SEQ ID NO:59), TRIRPEL (SEQ ID NQ:60), NGQF (SEQ ID NO:61), e HTGRYGCQ (SEQ ID NO:62). Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo protege o epítopo da

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3/146 troca de deutério com uma fonte de deutério, como D₂O. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos no epítopo de LYREKKSASW (SEQ ID NO:59). Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos no epítopo de TRIRPEL (SEQ ID NQ:60). Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos no epítopo de NGQF (SEQ ID NO:61). Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos no epítopo de HTGRYGCQ (SEQ ID NO:62). Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos em dois, três ou quatro epitopos de ILT4 selecionados a partir do grupo que consiste em LYREKKSASW (SEQ ID NO:59), TRIRPEL (SEQ ID NQ:60), NGQF (SEQ ID NO:61), e HTGRYGCQ (SEQ ID NO:62). Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos no epítopo de LYREKKSASW (SEQ ID NO: 59) e protege o epítopo da troca de deutério com uma fonte de deutério, como D2O. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos no epítopo de TRIRPEL (SEQ ID NO: 60) e protege o epítopo da troca de deutério com uma fonte de deutério, como D2O. Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos no epítopo de NGQF (SEQ ID NO: 61) e protege o epítopo da troca de deutério com uma fonte de deutério, como D2O. Em ainda outra modalidade , o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos no epítopo de HTGRYGCQ (SEQ ID NO: 62) e protege o epítopo da troca de deutério com uma fonte de deutério, como D2O. Em ainda outra modalidade , o anticorpo ou

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4/146 fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos em dois, três ou quatro epitopos de ILT4 selecionados a partir do grupo que consiste em LYREKKSASW (SEQ ID NO: 59), TRIRPEL (SEQ ID NO: 60), NGQF (SEQ ID NO: 61) e HTGRYGCQ (SEQ ID NO: 62) e protege os epitopos da troca de deutério com uma fonte de deutério, como D2O.

[006] A presente invenção também fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao mesmo epítopo de ILT4 humana como qualquer anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado na presente invenção. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao mesmo epítopo de ILT4 humana como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo as sequências de aminoácidos de cadeia pesada e de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1 e 3; 2 e 4; 2 e 5; 2 e 6; 2 e 7; 2 e 3; 8 e 11; 9 e 11; 10 e 11; 12 e 13; 14 e 15; 79 e 3; 80 e 4; 80 e 5; 80 e 6; 80 e 7; 80 e 3; 82 e 11; 83 e 11; 84 e 11; 85 e 13; e 86 e 15; respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao mesmo epítopo de ILT4 humana como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo o domínio variável de cadeia pesada e as sequências de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 63 e 70; 57 e 71; 57 e 72; 57 e 73; 57 e 58; 57 e 70; 64 e 74; 65 e 74; 66 e 74; 67 e 75; 68 e 76; respectivamente.

[007] A presente invenção fornece ainda um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compete para ligação a ILT4 humana com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado na presente invenção. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compete para ligação a ILT4 humana com um anticorpo ou fragmento compreendendo as sequências de aminoácidos de cadeia pesada e de

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5/146 cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1 e 3; 2 e 4; 2 e 5; 2 e 6; 2 e 7; 2 e 3; 8 e 11; 9 e 11; 10 e 11; 12 e 13; 14 e 15; 79 e 3; 80 e 4; 80 e 5; 80 e 6; 80 e 7; 80 e 3; 82 e 11; 83 e 11; 84 e 11; 85 e 13; e 86 e 15; respectivamente. Em algumas modalidades , o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compete para ligação a ILT4 humana com um anticorpo ou fragmento compreendendo sequências de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada e as sequências de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 63 e 70; 57 e 71; 57 e 72; 57 e 73; 57 e 58; 57 e 70; 64 e 74; 65 e 74; 66 e 74; 67 e 75; 68 e 76; respectivamente.

[008] Além disso, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à ILT4 humana, compreendendo: (a) região determinante de complementaridade-Ll (CDR-L1), região determinante de complementaridade-L2 (CDR-L2) e região determinante de complementaridade-L3 (CDR-L3) de um domínio variável de cadeia leve (Vl) de uma cadeia de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3-7, 11, 13, 15 ou 45; e/ou (b) a região determinante de complementaridade-Hl (CDR-H1), a região determinante de complementaridade-H2 (CDR-H2) e a região determinante de complementaridade-H3 (CDR-H3) de um domínio variável de cadeia pesada (Vh) de uma cadeia de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1, 2, 8-10, 12, 14, 44, ou 79-86.

[009] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (1) um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHXGSTNYNPSLKS em que X é S ou A (SEQ ID NO: 17); e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_L compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDRL2: GX1X2NRPS; em que Xi é S ou A e X₂ é N, Q, E ou D (SEQ ID NO: 20); e CDR-L3:

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QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21); (2) um domínio V_H compreendendo: CDR-H1: SYAIS (SEQ ID NO: 22); CDR-H2: GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 23); e CDR-H3: YFX1X2SGWYKGGAFDI; em que Xi é D ou S e X₂ é S ou A (SEQ ID NO: 24); e/ou, um domínio V_Lcompreendendo: CDR-L1: TLRSGINVDTYRIH (SEQ ID NO: 25); CDRL2: YKSDSDKHQGS (SEQ ID NO: 26); e CDR-L3: AIWYSSTWV (SEQ ID NO: 27); (3) um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: SYAMH (SEQ ID NO: 28); CDR-H2: VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 29); e CDR-H3: VGEWIQLWSPFDY (SEQ ID NO:

30) ; e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: RASQGISSWLA (SEQ ID NO:

31) ; CDR-L2: AASSLQS (SEQ ID NO: 32); e CDR-L3: QQYNSYPPT (SEQ ID NO: 33); e/ou (4) um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: ELSMH (SEQ ID NO: 34); CORFU: GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID NO: 35); e CDR-H3: AGPLYTIFGVVIIPDNWFDP (SEQ ID NO: 36); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 37); CDR-L2: GNSNRPS (SEQ ID NO: 38); e CDRL3: QSYDSSLSGSGVV (SEQ ID NO: 39).

[010] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDRLl: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNSNRPS(SEQ ID NO: 49), e CDRL3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[Oil] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDRLl: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQSNRPS(SEQ ID NO: 50), e CDRL3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[012] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao

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7/146 antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GESNRPS(SEQ ID NO: 51), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[013] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDSNRPS(SEQ ID NO: 52), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[014] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNANRPS(SEQ ID NO: 53), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[015] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQANRPS(SEQ ID NO: 54), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[016] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo:

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CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GEANRPS(SEQ ID NO: 55), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[017] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDANRPS(SEQ ID NO: 56), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[018] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNSNRPS(SEQ ID NO: 49), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[019] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQSNRPS(SEQ ID NO: 50), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[020] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GESNRPS(SEQ ID NO: 51), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[021] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao

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9/146 antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDSNRPS(SEQ ID NO: 52), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[022] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNANRPS(SEQ ID NO: 53), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[023] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQANRPS(SEQ ID NO: 54), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[024] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GEANRPS(SEQ ID NO: 55), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[025] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo:

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CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDANRPS(SEQ ID NO: 56), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[026] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma imunoglobulina de cadeia leve, uma imunoglobulina de cadeia pesada ou uma imunoglobulina de cadeia leve e de cadeia pesada, em que a imunoglobulina de cadeia leve tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 11, 13, 15 ou 45 e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1, 2, 8, 9, 10, 12, 14, 44, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 ou 86.

[027] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma imunoglobulina de cadeia leve, uma imunoglobulina de cadeia pesada ou uma imunoglobulina de cadeia leve e de cadeia pesada, em que a imunoglobulina de cadeia leve compreende um domínio variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70, 71, 72, 73, 58, 74, 75, 76 ou 77 e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada compreende um domínio variável de cadeia pesada com pelo menos 90 % de identidade de sequência de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63, 57, 64, 65, 66, 67, 68 ou 69.

[028] Em ainda outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma imunoglobulina de cadeia leve, uma imunoglobulina de cadeia pesada ou uma imunoglobulina de cadeia leve e de cadeia pesada, em que a imunoglobulina de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 11, 13, 15 ou 45; e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos

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11/146 estabelecida na SEQ ID NO: 1, 2, 8, 9, 10, 12, 14, 44, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, ou 86.

[029] Em ainda outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma imunoglobulina de cadeia leve, uma imunoglobulina de cadeia pesada ou uma imunoglobulina de cadeia leve e de cadeia pesada, em que o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70, 71, 72, 73, 58, 74, 75, 76 ou 77, e/ou o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63, 57, 64, 65, 66,67, 68 ou 69.

[030] É ainda fornecido um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende qualquer um dos seguintes conjuntos de imunoglobulinas de cadeia pesada e de imunoglobulinas de cadeia leve: (1) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; (2) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4; (3) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 5; (4) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 6; (5) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7; (6)

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12/146 uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; (7) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (8) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 9; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (9) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (10) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 12; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 13; (11) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 14; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 15; (12) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 79; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; (13) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4; (14) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 5; (15)

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13/146 uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 6; (16) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7; (17) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; (18) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 82; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (19) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 83; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (20) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 84; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (21) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 85; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 13; ou (22) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 86; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 15.

[031] Além disso, é fornecido na presente invenção um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende qualquer um dos seguintes conjuntos de domínio variável de cadeia pesada e de domínio variável

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14/146 de cadeia leve: (1) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70; (2) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 71; (3) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 72; (4) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 73; (5) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58; (6) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70; (7) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 64; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74; (8) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 65; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74; (9) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 66; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ

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ID NO: 74; (10) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 67; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 75; ou (11) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 76.

[032] Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio Vh compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio Vl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58.

[033] Em outra modalidade preferida, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7.

[034] Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7.

[035] Em uma modalidade, o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cade cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58 e cade cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57.

[036] Em outra modalidade, o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende a sequência de

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16/146 aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58 e cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57, em que a cadeia leve compreende ainda a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 90.

[037] Em ainda outra modalidade, o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58 e cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57, em que a cadeia pesada compreende ainda a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 89.

[038] Em ainda outra modalidade, o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58 e cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57, em que a cadeia leve compreende ainda a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 90 e a cadeia pesada compreende ainda a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 89.

[039] Em uma modalidade, o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7 e cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2.

[040] Em outra modalidade, o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7 e cada cadeia pesada consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO : 2.

[041] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado, por exemplo, com glicanos ligados a N de levedura modificada ou glicanos ligados a N de célula de ovário de hamster

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17/146 chinês (CHO). Em uma modalidade da invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo.

[042] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado na presente invenção. Em certas modalidades, a composição compreende ainda um agente terapêutico (por exemplo, pembrolizumab). Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outras modalidades, a composição compreende ainda um agente terapêutico (por exemplo, pembrolizumab) e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[043] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende: (i) um anticorpo que consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7 e cada cadeia pesada consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO : 2 e (ii) pembrolizumab.

[044] A presente invenção fornece ainda um polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo isolado) que inclui a cadeia leve de imunoglobulina e/ou cadeia pesada de imunoglobulina ou um domínio variável das mesmas de qualquer anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno divulgado na presente invenção. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-39, 44, 45, 47-58, 63 a 77, e 79 a 86. Também é fornecido pela presente invenção qualquer polinucleotídeo (por exemplo, DNA ou RNA) que codifique qualquer polipeptídeo na presente invenção. Em outro aspecto, é fornecido um vetor compreendendo o polinucleotídeo divulgado neste documento. A presente invenção também fornece uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula CHO) compreendendo o polinucleotídeo ou o vetor divulgado na presente invenção.

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18/146 [045] A presente invenção fornece um método para bloquear a ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F, por exemplo, in vitro ou in vivo, por exemplo, no corpo de um indivíduo (por exemplo,, um indivíduo humano) que precisa do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado neste documento. Em certas modalidades, o método para bloquear ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F compreende ainda a realização de um procedimento terapêutico (por exemplo, terapia de radiação anticâncer ou tumorectomia cirúrgica) ao indivíduo. Em algumas modalidades, o método para bloquear a ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F compreende ainda a administração de um agente terapêutico (por exemplo, pembrolizumab) ao indivíduo. Em outras modalidades, o método para bloquear a ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F compreende ainda executar um procedimento terapêutico (por exemplo, terapia de radiação anticâncer ou tumorectomia cirúrgica) e administrar um agente terapêutico (por exemplo, pembrolizumab) ao indivíduo.

[046] A presente invenção também fornece um método de tratamento de um câncer em um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano), compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado na presente invenção. Em certas modalidades, o método de tratamento de um câncer compreende ainda a realização de um procedimento terapêutico (por exemplo, terapia de radiação anticâncer ou tumorectomia cirúrgica) ao indivíduo. Em algumas modalidades, o método de tratamento de um câncer compreende ainda a administração de um agente terapêutico (por exemplo, pembrolizumab) ao indivíduo. Em outras modalidades, o método de tratamento de um câncer compreende ainda a realização de um procedimento terapêutico (por exemplo,

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19/146 terapia de radiação anticâncer ou tumorectomia cirúrgica) e administração de um agente terapêutico (por exemplo, pembrolizumab) ao indivíduo.

[047] A presente invenção também fornece um método para produção do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção ou uma cadeia de imunoglobulina do mesmo (por exemplo, uma Vh e/ou Vl), compreendendo a cultura de uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula de CHO) compreendendo um polinucleotídeo (por exemplo, em que o polinucleotídeo está em um vetor e/ou está integrado em um ou mais cromossomos da célula hospedeira) que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou uma cadeia de imunoglobulina para expressar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou uma cadeia de imunoglobulina do mesmo.

[048] Também é fornecido um método de produção do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção ou uma cadeia de imunoglobulina do mesmo (por exemplo, um Vh e/ou Vl do mesmo), compreendendo: expressão de um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou uma cadeia de imunoglobulina do mesmo.

[049] Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à ILT4 humana ou sua cadeia de imunoglobulina que é um produto de dito método, também faz parte da presente invenção.

[050] Um método para detecção da presença de um peptídeo ILT4 ou um fragmento do mesmo em uma amostra também faz parte da presente invenção. O método compreende a colocação em contato da amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção e a detecção da presença de um complexo entre o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno e o peptídeo ILT4 ou fragmento do mesmo, em que a detecção do complexo

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20/146 indica a presença do peptídeo ILT4 ou fragmento deste. Em uma modalidade da invenção, o método é realizado in vitro, por exemplo, em uma amostra biológica, por exemplo, secção cirúrgica ou amostra de sangue, de um indivíduo. Em outra modalidade, o método é realizado in vivo, por exemplo, no corpo de um indivíduo. Em ainda outra modalidade , o indivíduo é um ser humano.

Breve descrição das figuras [051] A figura 1 mostra Mapa de calor de marcação com deutério de ligação plEl(Gl) a ILT4-His.

[052] As figuras 2A e 2B mostram a estrutura cristalina de ILT4 humana. A figura 2A descreve os níveis de marcação com deutério mapeados na estrutura de ILT4 humana A figura 2B mostra a estrutura cristalina de domínios 1 e 2 de ILT4 humana complexada com HLA-G. ILT4, cadeia pesada de HLA-G e beta-2microglobulina são indicadas, Os epítopos de ILT4 humanas, tendo os resíduos LYREKKSASW (SEQ ID NO: 59), TRIRPEL (SEQ ID NO: 60), NGQF (SEQ ID NO: 61) e HTGRYGCQ (SEQ ID NO: 62), são indicados.

[053] As figuras 3A e 3B mostram ligação ILT4 HLA-G e bloqueio 1E1 (G4) Células T 3A9 de rato transfectadas com ILT4 humana foram bloqueadas com bloco Fc, depois incubadas com concentrações tituladas de 1E1 (G4) (a partir de 27 pg/mL, diluições 1: 3) ou com o controle do isotipo hlgG4 (27 pg/mL). A figura 3A mostra que 1E1 (G4) ou hlgG4 foi detectado com F (ab')2 anti-humano de cabra marcado com fluorocromo e detectado por citometria de fluxo. A figura 3B mostra que após o pré-tratamento com 1E1 (G4), as células foram incubadas com 2 pg/mL de HLA-Fc biotinilado ou Fc de controle (mVISTA-Fc). A ligação ao Fc foi detectada com estreptavidina conjugada com PE e detectada por citometria de fluxo. Os gráficos apresentados são representativos de 3 testes independentes. Os valores de IC50 e EC50 mostrados são a média desses testes +/- desvio padrão.

[054] A figura 4 mostra que ligante não-HLA-G MHC classe I de ligação a

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21/146 bloqueio de ILT4 e plEl (Gl). As células T 3A9 de rato transfectadas com ILT4 humana foram pré-tratadas com concentrações tituladas de plEl (Gl) (a partir de 10 pg /mL, diluições 1: 3) ou com controle de isotipo hlgGl (10 pg/mL) antes da incubação com tetrâmeros marcados com fluorocromo de HLA-F ou CDld, ou dexâmeros marcados com fluorocromo de HLA*A2: 01 ou HLA*B7: 02. A ligação tetrâmero/dexâmero foi determinada por citometria de fluxo e a intensidade média de fluorescência de cada uma que foi plotada. As diluições/concentrações utilizadas para cada dexâmero/tetrâmero são as seguintes: HLA*A2:01-dex PE: 1:25; HLA*B7:02-dex FITC: 1:25; CDld-tet PE: 1:50; HLA-F-tet PE: lug/mL.

[055] As figuras 5A-5C mostram Ligação de ANGPTL a bloqueio de ILT4 e plEl(Gl). A figura 5A mostra que as proteínas ANGPTL biotiniladas foram préincubadas por 20 minutos com plEl (Gl) ou IgGl humana, a concentração final de cada um foi de 20 pg/mL. Soluções foram então adicionadas às células T 3A9 de rato transfectadas com ILT4 humana e foram incubadas por mais 30 minutos. A ligação de ANGPTL foi detectada com estreptavidina conjugada com PE e analisada por citometria de fluxo. O tetrâmero HLA-G marcado com PE também foi adicionado como um controle positivo de ligação/bloqueio de ILT4. Proteínas ANGPTLforam adquiridas da R&D SYSTEMS e biotiniladas; a figura 5B mostra que as células T 3A9 de rato transfectadas com ILT4 humana foram bloqueadas com o bloco Fc e incubadas com 20 pg/mL de controle de isotipo plEl (Gl) ou hlgGl. Após a incubação, o plEl (Gl) ou o hlgGl foi detectado com F(ab')2 anti-humano de cabra marcado com fluorocromo e analisado por citometria de fluxo; a figura 5C mostra que as células T 3A9 de controle vetorial foram usadas como controle negativo para a ligação de ANGPTL. As células foram tratadas como descrito em (A), exceto que nenhum tratamento com anticorpo foi realizado.

[056] As figuras 6A e 6B mostram especificidade de ligação 1E1 (G4) da família ILT. As células T 3A9 de rato transfectadas com membros da família ILT

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22/146 humana derivados de sequências de consenso publicadas no banco de dados Uniprot foram usadas para testar a ligação do anticorpo de controle do isotipo hlgG4 ou 1E1 (G4) em uma dose fixa de 10 pg/mL. Células T 3A9 de controle vetorial foram usadas como controle negativo adicional. Também é mostrada a ligação de anticorpos reativos à ILT comercialmente disponíveis, em comparação com seu respectivo controle de isotipo, para demonstrar a expressão do membro da família ILT. Os dados mostrados são representativos de dois testes com resultados semelhantes. Veja a legenda incorporada na figura.

[057] A figura 7 mostra resgate de liberação de IL-2 dos transfectantes de células T ILT4 3A9 com 1E1 (G4). As células T 3A9 de rato transfectadas com ILT4 humana foram tratadas com anticorpo anti-CD3 ligado à placa na presença de 1E1 (G4) solúvel ou controle de isotipo (hulgG4), a partir de 27ug/mL e diluídos em série 3 vezes para 0,3 pg/mL. Após 24 horas de incubação, os sobrenadantes são removidos e a IL-2 de rato é medido por ELISA. O gráfico mostrado é representativo de 5 testes independentes. O valor de EC50 mostrado é a média desses testes +/- desvio padrão.

[058] A figura 8 mostra que plEl (G4) e 1E1 (G4) resgataram a ILT4: supressão induzida por HLA-G de degranulação de mastócitos. Mastócitos WTMC de rato foram transfectados com ILT4 humana e pré-tratados com concentrações tituladas de controle de isotipo 1E1 (G4), plEl (G4) ou hlgG4 (a partir de 10 pg/mL, diluições 1: 3) antes de serem estimulados com anti-CD200Rla ligado à placa ( Clone DX89; 1 pg/mL) e tetrâmero HLA-G ligado à placa (0,625 pg/mL). Após estimulação por 1 hora, a degranulação foi avaliada através da coleta de sobrenadantes dos mastócitos para medir a liberação de β-hexoseaminidase usando um ensaio enzimático colorimétrico. Os dados mostrados são representativos de 2 testes independentes com 3 repetições técnicas por ponto de dados.

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23/146 [059] As figuras 9A e 9B mostram que 1E1 (G4) melhorou a expressão induzida por LPS de citocinas mielóides pró-inflamatórias. PBMCs inteiras de pacientes saudáveis foram isoladas das câmaras de leucorredução e tratadas com 0,25 pg/mL de LPS na presença de hlgG4 (30 pg/mL; círculos abertos) ou 1E1 (G4) (marcado como 1E1 nA figura) (entre 30 ug/mL e 3 pg/mL; círculos fechados) por 3 dias. Após a estimulação, sobrenadantes foram analisados quanto à expressão de citocinas (figura 9A) GM-CSF e (Figura 9B) TNFa) usando um kit de ensaio de múltiplas citocinas Meso Scale Discovery. Cada cor representa dados de um paciente individual. Condições sem qualquer estímulo também são mostradas (triângulos fechados).

[060] As figuras 10A e 10B mostram que 1E1 (G4) melhorou expressão induzida por anti-CD3 de citocinas mielóides pró-inflamatórias. (A-B) PBMCs inteiras de pacientes saudáveis foram isoladas de câmaras de leucorredução e tratadas com 0,01 pg/mL de anti-CD3 (HIT3a) na presença de hlgG4 (30 pg/mL; círculos abertos) ou 1E1 (G4) (marcado como 1E1 nA figura) (entre 30 pg/mL e 3 pg/mL; círculos fechados) por 3 dias. Após a estimulação, sobrenadantes foram analisados quanto à expressão de citocinas (figura 10A) GM-CSF e (Figura 10B) TNFa) usando um kit de ensaio de múltiplas citocinas Meso Scale Discovery. Cada cor representa dados de um paciente individual. Condições sem qualquer estímulo também são mostradas (triângulos fechados).

[061] As Figuras 11A-11E mostram tratamento com plEl (G4) leva à inibição do crescimento tumoral em um modelo de tumor SKMEL5 de rato humanizado. Camundongos NSG humanizados, enxertados com sangue de cordão umbilical CD34 +, de 2 doadores de sangue de cordão umbilical diferentes, foram inoculados subcutaneamente com lxlO⁶ células tumorais SKMEL5 em seus flancos esquerdos. Após a inoculação, os tumores foram deixados crescer e aqueles que atingiram um tamanho médio de 150 mm³ foram

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24/146 randomizados em grupos de 6 (3 de cada doador de células-tronco, n=6 por grupo total). Os camundongos foram então interpelados ou com o controle do isotipo hlgG4 ou com o plEl (G4) (20 mg/kg cada) a cada 5 dias, com tumores e pesos medidos semanalmente, até o final do estudo. O crescimento do tumor no controle do isotipo e nos camundongos tratados com plEl (G4) foram rastreados ao longo do tempo. A figura 11A mostra o volume médio do tumor (mm³) +/- SD ao longo do tempo para ambos os grupos, e A figuras 11B e 11C mostram os volumes individuais do tumor de rato (mm³) ao longo do tempo para o isotipo tratado e plEl (G4), respectivamente. A figura 11D mostra o peso do tumor em camundongos individuais tratados com controle de isotipo ou plEl (G4) conforme seguido ao longo do tempo; A figura 11E mostra que a perda de peso de cada grupo de tratamento também foi medida ao longo do tempo. Após a conclusão do estudo, os camundongos foram sacrificados e os tumores foram colhidos e pesados.

[062] As Figuras 12A-12D demonstram que o tratamento 1E1 (G4) levou à inibição do crescimento do tumor em um modelo de tumor SK-MEL-5 de rato humanizado. A figura 12A mostra o volume médio do tumor (mm³) +/- DP ao longo do tempo, tanto para camundongos tratados com 1E1 (G4) quanto para camundongos tratados com controle de isotipo lgG4. A figura 12B mostra a alteração do peso corporal ao longo do tempo para ambos os grupos. A figura 12C mostra o peso final do tumor em camundongos individuais tratados com controle de isotipo ou 1E1 (G4). A figura 12D mostra o peso final do baço em camundongos individuais tratados com controle de isotipo ou 1E1 (G4).

[063] Afigura 13 mostra Ligação ao haplótipo ILT4. As célulasT3A9 de rato transfectadas com variantes alélicas humanas de ILT4 foram usadas para testar a ligação de anticorpo de controle do isotipo hlgG4 ou 1E1 (G4) a uma dose fixa de 10 pg/mL. Células T 3A9 de controle vetorial foram usadas como controle

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25/146 negativo adicional. Os haplótipos são explicados na Tabela 2. Os dados mostrados são representativos de dois testes com resultados semelhantes.

[064] As figuras 14A e 14B mostram Expressão do RNA ILT4 em diferentes tipos de tumores ou células, de acordo com bancos de dados públicos. A figura 14A representa a expressão de RNA ILT4 em vários tipos de tumor, de acordo com o banco de dados TCGA. A figura 14B representa a expressão de RNA ILT4 em vários tipos de células, de acordo com o banco de dados Blueprint.

[065] As Figuras 15A e 15B mostram a ligação de 1E1 (G4) a células mielóides de carcinoma de células renais (RCC) (Figura 15A) e amostras de histocultura tumorais de câncer colorretal (CRC) (Figura 15B).

[066] A figura 16 mostra glicanos ligados a N predominantes para anticorpos monoclonais produzidos em células de ovário de hamster chinês (glicanos ligados a N de CHO) e em células de levedura projetada (glicanos ligados a N de levedura projetada): quadrados: N-acetilglucosamina (GlcNac); círculos: manose (homem); diamantes: galactose (Gal); triângulos: fucose (Fuc).

[067] A figura 17 mostra a eficácia antitumoral de vários anticorpos antiILT4 em um modelo de tumor SK-MEL-5 de rato humanizado.

Descrição detalhada da invenção [068] Para que a invenção seja mais facilmente compreendida, certos termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. A menos que especificamente definido em outra parte deste documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados neste documento têm o significado comumente entendido por um versado na técnica ao qual esta invenção pertence.

[069] Conforme usado na presente invenção, incluindo as reivindicações anexas, as formas singulares de palavras como um, uma e o/a incluem suas referências plurais correspondentes, a menos que o contexto indique claramente

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26/146 o contrário.

[070] Afinidade refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu par de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo indicação em contrário, conforme usado na presente invenção, afinidade de ligação referese à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para seu par Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos no estado da técnica, incluindo KinExA e Biacore.

[071] Como utilizado na presente invenção, o termo anticorpo inclui, mas não está limitado a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos totalmente humanos e anticorpos quiméricos.

[072] Conforme utilizado na presente invenção, salvo indicação em contrário, fragmento de ligação ao antígeno refere-se a fragmento de ligação ao antígeno de anticorpos, isto é, fragmento de anticorpo que retêm a capacidade de se ligar ao antígeno ligado pelo anticorpo de comprimento total, por exemplo fragmento que retêm uma ou mais regiões CDR. Exemplos de fragmento de ligação a anticorpos incluem, mas não estão limitados a fragmentos Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv e cadeias pesadas ou cadeias leves de anticorpos individuais e regiões variáveis individuais de cadeias pesadas ou cadeias leves.

[073] Um fragmento Fab é composto por uma cadeia leve e o CHI e regiões variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada. Um fragmento Fab pode ser o produto da divagem de papaína de um

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27/146 anticorpo.

[074] Uma região Fc contém dois fragmentos de cadeia pesada compreendendo os domínios CHI e CH2 de um anticorpo. Os dois fragmentos de cadeia pesada são mantidos juntos por duas ou mais ligações dissulfeto e por interações hidrofóbicas dos domínios CH3.

[075] Um fragmento Fab contém uma cadeia leve e uma porção ou fragmento de uma cadeia pesada que contém o domínio Vh e o domínio CHI e também a região entre os domínios CHI e CH2, de modo que uma ligação dissulfeto inter-cadeia possa ser formada entre as duas cadeias pesadas de dois fragmentos Fab' para formar uma molécula F (ab')z.

[076] Um fragmento F (ab ')z contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que contêm uma porção da região constante entre os domínios CHI e CH2, de modo que uma ligação dissulfeto entre cadeias é formada entre as duas cadeias pesadas. Assim, um fragmento F (ab ')z é composto por dois fragmentos Fab' que são mantidos juntos por uma ligação dissulfeto entre as duas cadeias pesadas. Um fragmento F (ab ')z pode ser o produto de divagem de pepsina de um anticorpo.

[077] A região Fv compreende as regiões variáveis de cadeias pesadas e de cadeias leves, mas não possui as regiões constantes.

[078] Anticorpo isolado refere-se ao estado de purificação e, nesse contexto, significa que a molécula está substancialmente livre de outras moléculas biológicas, como ácidos nucleicos, proteínas, lipídios, carboidratos ou outro material, como detritos celulares e meios de crescimento. Geralmente, o termo isolado não é concebido para se referir a uma ausência completa desse material ou a uma ausência de água, tampões ou sais, a menos que estejam presentes em quantidades que interfiram substancialmente no uso experimental ou terapêutico do composto de ligação como descrito na presente invenção.

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28/146 [079] O termo anticorpo monoclonal, como utilizado na presente invenção, refere-se a uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, as moléculas de anticorpo que compreendem a população são idênticas na sequência de aminoácidos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Por outro lado, preparações convencionais de anticorpos (policlonais) incluem tipicamente uma infinidade de anticorpos diferentes com sequências de aminoácidos diferentes em seus domínios variáveis que geralmente são específicos para diferentes epítopos. O modificador monoclonal indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al. (1975) Nature 256: 495,ou pode ser produzido por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, patente americana No. 4,816,567). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos fágicos usando as técnicas descritas em Clackson etal. (1991) Nature 352: 624-628 and Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597, por exemplo. Vide também Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731.

[080] O termo anticorpo totalmente humano refere-se a um anticorpo que compreende apenas sequências de proteínas de imunoglobulina humana. Um anticorpo totalmente humano pode conter cadeias de carboidratos murinas se produzido em um rato, ou em uma célula de rato ou em um hibridoma derivado de uma célula de rato. Da mesma forma, anticorpo de rato refere-se a um anticorpo que compreende apenas sequências de imunoglobulina de rato. Alternativamente, um anticorpo totalmente humano pode conter cadeias de

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29/146 carboidratos de rato se produzido em um rato, em uma célula de rato ou em um hibridoma derivado de uma célula de rato. Da mesma forma, anticorpo de rato refere-se a um anticorpo que compreende apenas sequências de imunoglobulina de rato.

[081] Em geral, a unidade estrutural básica de anticorpo compreende um tetrâmero. Em um anticorpo monoespecífico, cada tetrâmero inclui dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia leve (cerca de 25 kDa) e uma cadeia pesada (cerca de 50-70 kDa). A porção aminoterminal de cada cadeia inclui uma região variável ou domínio variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos responsáveis principalmente pelo reconhecimento do antígeno. A porção carboxi-terminal de cadeia pesada pode definir uma região constante primariamente responsável pela função efetora.

[082] Normalmente, as cadeias leves constantes humanas são classificadas como cadeias leves kappa e lambda. Além disso, as cadeias pesadas constantes humanas são tipicamente classificadas como mu, delta, gama, alfa ou epsilon e definem o isotipo de anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Os subtipos desse IgG incluem, por exemplo, IgGl e lgG4. A presente invenção inclui anticorpos anti-ILT4 e fragmentos de ligação ao antígeno compreendendo qualquer uma dessas cadeias constantes leves e/ou pesadas.

[083] Região variável, domínio variável, região V ou cadeia V, conforme utilizado na presente invenção, significa o segmento de cadeias de IgG que é variável em sequência entre diferentes anticorpos. Uma região variável de um anticorpo refere-se à região variável de cadeia leve de anticorpo ou à região variável de cadeia pesada de anticorpo, isoladamente ou em combinação. A região variável de cadeia pesada pode ser referida como Vh. A região variável de cadeia leve pode ser referida como Vl. Normalmente, as regiões variáveis tanto de cadeia pesada como d cadeia leve compreendem três regiões

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30/146 hipervariáveis, também chamadas de regiões determinantes de complementaridade (CDRs), localizadas dentro de regiões estruturais relativamente conservadas (FR). As CDRs geralmente são alinhadas pelas regiões estruturais, permitindo a ligação a um epitopo específico. Em geral, do terminal N ao terminal C, os domínios variáveis de cadeias leve e pesada compreendem FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio está, geralmente, de acordo com as definições de Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico, Kabat, et al .; National Institutes of Health, Bethesda, Md .; ed .; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 ou Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883.

[084] Uma CDR refere-se a uma das três regiões hipervariáveis (Hl, H2 ou H3) dentro da região não-estrutural da estrutura de folha 0-de anticorpo Vh, ou uma das três regiões hipervariáveis (LI, L2 ou L3) na região não estrutural da estrutura de folha- 0-de anticorpo Vl. Consequentemente, CDRs são sequências de região variável intercaladas nas sequências de região de estrutura. Regiões CDR são bem conhecidas dos versados na técnica e foram definidas por, por exemplo, Kabat como as regiões de maior hipervariabilidade dentro dos domínios variáveis de anticorpos. Sequências da região CDR também foram definidas estruturalmente por Chothia como aqueles resíduos que não fazem parte da estrutura de folha 0-conservada,e, portanto, são capazes de se adaptar a diferentes conformações. Ambas as terminologias são bem reconhecidas no estado da técnica. Sequências da região CDR também foram definidas por AbM, Contact e IMGT. As posições das CDRs dentro de uma região variável de anticorpo canônico foram determinadas pela comparação de numerosas estruturas (AlLazikani et al., 1997, J. Mol. Biol. 273:927-48; Morea et al., 2000, Methods 20:267-79). Como o número de resíduos dentro de uma região hipervariável

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31/146 varia em anticorpos diferentes, os resíduos adicionais relativos às posições canônicas são convencionalmente numerados com a, b, c e assim por diante ao número de resíduos no esquema de numeração da região variável canônica (AlLazikani et al., supra). Tal nomenclatura é semelhantemente bem conhecida dos versados na técnica. Correspondência entre o sistema de numeração, incluindo, por exemplo, a numeração Kabat e o sistema de numeração exclusivo IMGT, é bem conhecida por um versado na técnica e mostrada abaixo na Tabela 1. Em algumas modalidades, as CDRs são como definidas pelo sistema de numeração Kabat. Em outras modalidades, as CDRs são como definidas pelo sistema de numeração IMGT. Em ainda outras modalidades, as CDRs são como definidas pelo sistema de numeração AbM. Ainda em outras modalidades, as CDRs são como definidas pelo sistema de numeração Chothia. Em ainda outras modalidades , as CDRs são como definidas pelo sistema de numeração de contatos.

Tabela 1. Correspondência entre os sistemas de numeração CDR

	Kabat + Chothia	IMGT	Kabat	AbM	Chothia	Contato
V_H CDR1	26-35	27-38	31-35	26-35	26-32	30-35
V_H CDR2	50-65	56-65	50-65	50-58	52-56	47-58
V_H CDR3	95-102	105-117	95-102	95-102	95-102	93-101
VlCDRI	24-34	27-38	24-34	24-34	24-34	30-36
V_lCDR2	50-56	56-65	50-56	50-56	50-56	46-55
V_lCDR3	89-97	105-117	89-97	89-97	89-97	89-96

[085] Identidade de sequência refere-se ao grau em que os aminoácidos de dois polipeptídeos são iguais nas mesmas posições quando as duas sequências estão alinhadas de maneira ideal.

[086] A similaridade de sequência inclui resíduos idênticos e aminoácidos bioquimicamente relacionados não idênticos. Aminoácidos bioquimicamente relacionados que compartilham propriedades semelhantes e podem ser intercambiáveis são discutidos acima.

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32/146 [087] Variantes modificadas conservativamente ou substituição conservadora refere-se a substituições de aminoácidos em uma proteína com outros aminoácidos com características semelhantes (por exemplo, carga, tamanho de cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação de cadeia principal e rigidez, etc.), de modo que as alterações podem ser feitas frequentemente sem alterar a atividade biológica da proteína. Os versados na técnica reconhecem que, em geral, substituições únicas de aminoácidos em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)). Além disso, substituições de aminoácidos estrutural ou funcionalmente semelhantes têm menos probabilidade de interromper a atividade biológica. Substituições conservativas exemplificativas são apresentadas na Tabela 2.

Tabela 2. Substituições Conservativas de Aminoácidos Exemplificativas

Resíduo Original	Substituição Conservativa
Ala (A)	Gly; Ser
Arg (R)	Lys; His
Asn (N)	Gin; His
Asp (D)	Glu; Asn
Cys(C)	Ser; Ala
Gin (Q)	Asn
Glu (E)	Asp; Gin
Gly (G)	Ala
His (H)	Asn; Gin
lie (1)	Leu; Vai
Leu (L)	He; Vai
Lys (K)	Arg; His
Met(M)	Leu; He; Tyr
Phe (F)	Tyr; Met; Leu
Pro (P)	Ala
Ser (S)	Thr

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Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe
Tyr (Y)	Trp; Phe
Vai (V)	He; Leu

[088] O termo epítopo, como utilizado na presente invenção, refere-se a uma área ou região em um antígeno ao qual um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga. A ligação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado na presente invenção a um epítopo significa que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro do epítopo.

[089] Molécula ou polinucleotídeo isolado de ácido nucleico significa um DNA ou RNA, por exemplo, de origem genômica, mRNA, cDNA ou sintética ou alguma combinação dos mesmos que não está associada a todo ou uma porção de um polinucleotídeo no qual o polinucleotídeo isolado é encontrado por natureza ou está ligado a um polinucleotídeo ao qual ele não está ligado por natureza. Para os fins desta divulgação, deve ser entendido que um polinucleotídeo compreendendo (ou semelhante) uma sequência nucleotídica específica não abrange cromossomos intactos. Polinucleotídeos isolados compreendendo sequências de ácidos nucleicos especificadas podem incluir, além das sequências especificadas, sequências de codificação para até dez ou até vinte ou mais outras proteínas ou porções ou fragmentos das mesmas, ou podem incluir sequências reguladoras ligadas operacionalmente que controlam a expressão da região de codificação das sequências de ácidos nucleicos indicadas e/ou pode incluir sequências de vetores.

[090] A frase sequências de controle refere-se a sequências polinucleotídicas necessárias ou úteis para a expressão de uma sequência de codificação operacionalmente ligada em um organismo hospedeiro específico. As sequências de controle que são adequadas para procariotos, por exemplo,

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34/146 incluem um promotor, opcionalmente uma sequência de operador e um local de ligação ao ribossomo. Sabe-se que as células eucarióticas usam promotores, sinais de poliadenilação e intensificadores. Em uma modalidade da invenção, o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um promotor como um promotor viral, um promotor CMV, um promotor SV40 ou um promotor não viral ou um promotor do fator de alongamento (EF) -1; e/ou um intron.

[091] Um ácido nucleico é operacionalmente ligado quando é colocado em uma relação funcional com outro polinucleotídeo. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder secretor está operacionalmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se for expresso como uma pré-proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se isso afetar a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossomo está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a facilitar a translação. Geralmente, mas nem sempre, operacionalmente ligado significa que as sequências polinucleotídicas que estão sendo vinculadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguas e na fase de leitura. No entanto, os intensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é realizada por ligação em locais de restrição convenientes. Se esses locais não existirem, os adaptadores ou ligantes de oligo nucleotídeos sintéticos serão utilizados de acordo com a prática convencional.

[092] Conforme usado neste documento, as expressões célula, linhagem celular e cultura celular são usadas de forma intercambiável e todas essas designações incluem progênie. Assim, as palavras transformantes e células transformadas incluem a célula primária de indivíduo e culturas dela derivadas, sem levar em consideração o número de transferências. Entende-se também que nem todas as progênies terão conteúdo de DNA precisamente

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35/146 idêntico, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica, conforme rastreada na célula originalmente transformada é incluída. Onde designações distintas são concebidas, ficará claro a partir do contexto.

[093] Células hospedeiras incluem células hospedeiras eucarióticas e procarióticas, incluindo células de mamíferos. Células hospedeiras podem ser usadas como hospedeiras para expressão dos anticorpos anti-ILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Células hospedeiras incluem, entre outras, células de ovário de hamster chinês (CHO), células NSO, SP2, células HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humana (por exemplo, Hep G2), A549 células 3T3 e células HEK-293. Células hospedeiras de mamíferos incluem células humanas, camundongos, ratos, cães, macacos, porcos, cabras, bovinos, cavalos e hamster. Outras linhagens celulares que podem ser usadas são linhagens celulares de insetos(por exemplo, Spodoptera frugiperda or Trichoplusia ni), células anfíbias, células bacterianas, células vegetais e células fúngicas. Células fúngicas incluem células de leveduras e de fungos filamentosos, incluindo, por exemplo, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hanse nu Ia polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens eNeurospora crassa. Pichia sp., qualquer Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, qualquer Kluyveromyces sp., Candida albicans, qualquer Aspergillus sp., Trichoderma

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36/146 reesei, Chrysosporium lucknowense, qualquer Fusarium sp., Yarrowia lipolytica, e Neurospora crassa. A presente invenção inclui qualquer célula hospedeira (por exemplo, uma célula CHO ou célula Pichia, por exemplo, Pichia pastoris) contendo um anticorpo anti-ILT4 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou contendo um polinucleotídeo que codifica tal anticorpo ou fragmento ou contém um vetor que contém o polinucleotídeo.

[094] Tratar ou tratamento significa administrar anticorpos anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção, a um indivíduo com um ou mais sintomas de uma doença para a qual os anticorpos anti-ILT4 e os fragmentos de ligação ao antígeno são eficazes , por exemplo, no tratamento de um indivíduo com câncer ou doença infecciosa ou com suspeita de câncer ou doença infecciosa, para a qual o agente tem atividade terapêutica. Normalmente, o anticorpo ou fragmento é administrado em uma quantidade efetiva ou dose efetiva que aliviará um ou mais sintomas (por exemplo, de câncer ou doença infecciosa) no indivíduo ou na população tratada, induzindo a regressão ou eliminação de tais sintomas ou inibindo a progressão de tais sintomas, por exemplo, sintomas de câncer como crescimento de tumores ou metástases, por qualquer grau clinicamente mensurável. A quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento pode variar de acordo com fatores, tais como o estágio da doença, idade e peso do paciente, e a capacidade do medicamento de provocar uma resposta desejada no indivíduo.

[095] Conforme usado na presente invenção, um anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo refere-se a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à ILT4 humana.

[096] A presente invenção inclui anticorpos e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo estabelecidos na presente invenção que se ligam especificamente a ILT4. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se

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37/146 liga especificamente a um polipeptídeo compreendendo uma determinada sequência (por exemplo, ILT4 humana) se ele se ligar a polipeptídeos compreendendo a sequência com um Kd de cerca de 20 nM ou uma afinidade mais alta (por exemplo, cerca de 17 nM, 10 nM, 5 nM, lnM, 100 pM ou 1 pM), mas não se ligar a proteínas sem a sequência. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um polipeptídeo compreendendo ILT4 humana pode se ligar a uma forma marcada com FLAG® de ILT4 humana, mas não se ligar a outras proteínas marcadas com FLAG® que não possuem sequências de ILT4.

ILT4 [097] Em uma modalidade da invenção, a sequência de aminoácidos de

ILT4 humana compreende a sequência de aminoácidos:

MTPIVTVLIC LGLSLGPRTH VQTGTIPKPT LWAEPDSVIT QGSPVTLSCQ GSLEAQEYRL 60

YREKKSASWI TRIRPELVKN GQFHIPSITW EHTGRYGCQY YSRARWSELS DPLVLVMTGA 120 YPKPTLSAQP SPVVTSGGRV TLQCESQVAF GGFILCKEGE EEHPQCLNSQ PHARGSSRAI 180 FSVGPVSPNR RWSHRCYGYD LNSPYVWSSP SDLLELLVPG VSKKPSLSVQ PGPVVAPGES 240 LTLQCVSDVG YDRFVLYKEG ERDLRQLPGR QPQAGLSQAN FTLGPVSRSY GGQYRCYGAH 300 NLSSECSAPS DPLDILITGQ IRGTPFISVQ PGPTVASGEN VTLLCQSWRQ FHTFLLTKAG 360 AADAPLRLRS IHEYPKYQAE FPMSPVTSAH AGTYRCYGSL NSDPYLLSHP SEPLELVVSG 420 PSMGSSPPPT GPISTPAGPE DQPLTPTGSD PQSGLGRHLG VVIGILVAVV LLLLLLLLLF 480 LILRHRRQGK HWTSTQRKAD FQHPAGAVGP EPTDRGLQWR SSPAADAQEE NLYAAVKDTQ 540 PEDGVEMDTR AAASEAPQDV TYAQLHSLTL RRKATEPPPS QEREPPAEPS IYATLAIH 598 (SEQ ID NO:40; sequência de sinal sublinhada). Vide No. Acesso Uniprot Q8N423.

[098] Em outra modalidade da invenção, a sequência de aminoácidos de

ILT4 humana compreende a seguinte sequência de aminoácidos sem a sequência de sinal:

QTGTIPKPT LWAEPDSVIT QGSPVTLSCQ GSLEAQEYRL 39 YREKKSASWI TRIRPELVKN GQFHIPSITW EHTGRYGCQY YSRARWSELS DPLVLVMTGA99

YPKPTLSAQP SPVVTSGGRV TLQCESQVAF GGFILCKEGE EEHPQCLNSQ PHARGSSRAI159

FSVGPVSPNR RWSHRCYGYD LNSPYVWSSP SDLLELLVPG VSKKPSLSVQ PGPVVAPGES219

LTLQCVSDVG YDRFVLYKEG ERDLRQLPGR QPQAGLSQAN FTLGPVSRSY GGQYRCYGAH279

NLSSECSAPS DPLDILITGQ IRGTPFISVQ PGPTVASGEN VTLLCQSWRQ FHTFLLTKAG339

AADAPLRLRS IHEYPKYQAE FPMSPVTSAH AGTYRCYGSL NSDPYLLSHP SEPLELVVSG399

PSMGSSPPPT GPISTPAGPE DQPLTPTGSD PQSGLGRHLG VVIGILVAVV LLLLLLLLLF459

LILRHRRQGK HWTSTQRKAD FQHPAGAVGP EPTDRGLQWR SSPAADAQEE NLYAAVKDTQ 519

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PEDGVEMDTR AAASEAPQDV TYAQLHSLTL RRKATEPPPS QEREPPAEPS IYATLAIH577 (SEQ ID NO:78).

[099] Em uma modalidade da invenção, a sequência de aminoácidos de ILT4 de macaco cynomolgus compreende a sequência de aminoácidos: MTPILMVLIC LGLSLGPRTH VQAGILPKPT LWAEPGSVIS EGSPVTLRCQ GSLQVQEYHL60

YREKNPASWV RQIRQELVKK GYFAIGFITW EHTGQYRCQY YSHSWWSEPS DPLELWTGA120

YSKPTLSALP SPWASGGNV TLQCDSQVAF DSFTLCKEGE DEHPQRLNCQ SHARGWSWAV180

FSVGPVSPSR RWSYRCYGYI SSAPNVWSLP SDLLELLVPG VSKKPSLSVQ PGPWAPGDK240

LTLQCGSDAG YDRFALYKEG EGDFLQRPVR QPQAGLSQAN FLLGPVSRSH GGQYRCSGAH300

NLSSEWSAPS DPLDILIAGQ. IRGRPFLSVQ PGPKWSGEN VTLLCQSSWQ FHAFLLTQAG360

AADAHLHLRS MYKYPKYQAE FPMSPVTSAH AGTYRCYGSR SSNPYLLSVP SDPLELWSG420

PSGGPSSPTT GPTSTCGPED QPLTPTGSAP QSGLGRHLGV VTGVLVAFVL LLFLLLLLFL480

VLRYRRQGKR WTSAQRKADF QHPAGAVEPE PRDRGLQRRS SPAADTQEEN LYAAVKDTQP540

EDGVELDSRA AASEDPQDVT YAQLQSLTLR REATEPPPSQ. ERAPPVESSI YATLTIH597 (SEQ ID NO:43; sequência de sinal sublinhada). Ver NCBI seq.ref. XP 005590753.

[100] Em uma modalidade da invenção, a sequência de sinal para expressão de ILT4 ou qualquer outro polipeptídeo apresentado na presente invenção é MTPILMVLICLGLSLGPRTHV (aminoácidos 1-21 da SEQ ID NO: 40) ou MTPIVTVLICLGLSLGPRTHV (aminoácidos 1-21 da SEQ ID NO: 43) ou MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 46).

[101] Em uma modalidade da invenção, um anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção se liga ao domínio extracelular de ILT4:

QTGTIPKPTLWAEPDSVITQGSPVTLSCQGSLEAQEYRLYREKKSASWITRIRPELVKN GQFHIPSITWEHTGRYGCQYYSRARWSELSDPLVLVMTGAYPKPTLSAQPSPVVTSGGRV TLQCESQVAFGGFILCKEGEEEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPNRRWSHRCYGYD LNSPYVWSSPSDLLELLVPGVSKKPSLSVQPGPVVAPGESLTLQCVSDVGYDRFVLYKEGER DLRQLPG RQPQAG LSQAN FTLG PVSRSYGGQYRCYGAH N LSSECSAPSDP LDILITGQIRG TPFISVQPGPTVASGENVTLLCQSWRQFHTFLLTKAGAADAPLRLRSIHEYPKYQAEFPMS PVTSAHAGTYRCYGSLNSDPYLLSHPSEPLELVVSGPSMGSSPPPTGPISTPAGPEDQPLTP

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TGSDPQSGLGRHLGV (aminoácidos 22-461 da SEQ ID NO: 40) ou uma fusão de imunoglobulina (por exemplo, IgGl ou lgG4) ou uma forma transmembrana da superfície celular (TM) que é expressa na superfície de uma célula:

QTGTIPKPTLWAEPDSVITQGSPVTLSCQGSLEAQEYRLYREKKSASWITRIRPELVKN GQFHIPSITWEHTGRYGCQYYSRARWSELSDPLVLVMTGAYPKPTLSAQPSPVVTSGGRV TLQCESQVAFGGFILCKEGEEEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPNRRWSHRCYGYD LNSPYVWSSPSDLLELLVPGVSKKPSLSVQPGPVVAPGESLTLQCVSDVGYDRFVLYKEGER DLRQLPG RQPQAG LSQAN FTLG PVSRSYGGQYRCYGAH N LSSECSAPSDP LDILITGQIRG TPFISVQPGPTVASGENVTLLCQSWRQFHTFLLTKAGAADAPLRLRSIHEYPKYQAEFPMS PVTSAHAGTYRCYGSLNSDPYLLSHPSEPLELVVSGPSMGSSPPPTGPISTPAGPEDQPLTP TGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVVLLLLLLLLLFLILRHRRQGKH (aminoácidos 22-491 da SEQ ID NO: 40).

Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno [102] A presente invenção fornece anticorpos e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, anticorpos totalmente humanos) que se ligam ao ILT4 (referido como anti-ILT4 na presente invenção) e métodos de uso dos anticorpos e a fragmentos de ligação ao antígeno deste no tratamento ou prevenção de doenças. Em uma modalidade, a invenção fornece anticorpos antiILT4 antagonistas e métodos de uso dos anticorpos e a fragmentos de ligação ao antígeno deste no tratamento ou prevenção de doenças.

[103] Em um aspecto, o presente pedido inclui anticorpos anti-ILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme estabelecido na presente invenção, tendo uma ou mais das propriedades estabelecidas abaixo:

• se liga a ILT4 humana em um ou mais resíduos de aminoácidos em LYREKKSASW (SEQ ID NO: 59), TRIRPEL (SEQ ID NO: 60), NGQF (SEQ ID NO: 61) e/ou HTGRYGCQ (SEQ ID NO: 62), e/ou protege

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LYREKKSASW (SEQ ID NO: 59), TRIRPEL (SEQ ID NO: 60), NGQF (SEQ ID NO: 61) e/ou HTGRYGCQ (SEQ ID NO: 62) da troca de deutério (por exemplo, D2O) , por exemplo, conforme determinado por espectrometria de massa de troca hidrogênio-deutério e/ou se liga a ILT4 com um mapa de calor essencialmente conforme mostrado na figura 1;

• Se liga à ILT4 humana no domínio 1 (vide Wilcox etal. BMC Structural Biology 2:6 (2002));

• Se liga ao domínio extracelular de ILT4 humana ou a forma TM de ILT4 expressa na superfície celular, por exemplo, uma célula pré-B, célula de ovário de hamster chinês, célula U937 ou célula Jurkat JE6.

• calculado pl ~7.29 (por exemplo, 7.29 ou 7.30);

• pl ~ 7.2 calculado experimentalmente;

• é caracterizado por um termograma com início Tm> 60 ° C, Tml ~ 65,2 ° C e Tm2 ~ 78,8 ° C;

• se liga a ILT4 humana com um Kd de cerca de 1,7 x IO'⁸ M (por exemplo, conforme determinado por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, ligação de anti-ILT4 a ILT4 humana marcado com poli histidina);

• Ka=5.5 X 10⁵ M¹ s¹ (por exemplo, conforme determinado por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, ligação de antiILT4 à ILT4 humana marcado com poli-histidina);

• Kd=9X10'³ s¹ (por exemplo, conforme determinado por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, ligação de anti-ILT4 à ILT4 humana marcada com poli-histidina);

• bloqueia a ligação de HLA-G (por exemplo, HLA-G fundido com Fc) a ILT4 humana (por exemplo, ILT4 em células T 3A9 de rato

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41/146 transfectadas e expressando ILT4), por exemplo, com um IC50 de cerca de 0,25 microgramas/mL (+0,06 microgramas/mL), por exemplo, conforme determinado pela ressonância plasmônica de superfície;

• bloqueia a ligação de HLA-A, HLA-B (por exemplo, dexâmeros marcados com fluorocromo de HLA-A, tal como HLA * A2: 01 ou HLAB, tal como HLA * B7: 02) e/ou HLA-F (por exemplo, tetrâmeros marcados com fluorocromo de HLA-F) a ILT4 (por exemplo, ILT4 em células T 3A9 de ratos transfectadas e expressando ILT4), por exemplo, conforme determinado por ressonância plasmônica de superfície;

• bloqueia ILT4 (por exemplo, ILT4 em células T 3A9 de rato transfectadas e expressando ILT4), ligando-se a ANGPTL1, ANGPTL4 e/ou ANGPTL7 (por exemplo, proteínas ANGPTL biotiniladas), por exemplo, conforme determinado por ressonância plasmônica de superfície;

• não se liga a ILT2, ILT3, ILT5, LILRB5, LILRA1, LILRA2, ILT7, ILT8, e/ou ILT11;

• reverte supressão de IL2 mediada por ILT4 em células 3A9 transfectadas com ILT4, por exemplo, com um EC50 de 0,43 microgramas/mL (+0.14 microgramas/mL);

• resgata ILT4: supressão induzida por HLA-G de degranulação de mastócitos (por exemplo, na presença de tetrâmero HLA-G ligado a placa), por exemplo, em que os mastócitos expressam ILT4 e CD200RLa e são estimulados, por exemplo, com ligação cruzada mediada com anticorpo de CD200RLa;

• melhora a expressão induzida por lipopolissacarídeo (LPS) de citocinas mielóides pró-inflamatórias, por exemplo, GM-CSF e/ou

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TNFalpha, a partir de uma célula mononuclear do sangue periférico (PBMC);

• melhora a expressão induzida por anti-CD3 de citocinas mielóides pró-inflamatórias, por exemplo, GM-CSF e/ou TNFalpha, a partir de uma célula mononuclear do sangue periférico (PBMC);

• inibe o crescimento de tumores em humanos ou, por exemplo, em outros mamíferos, como camundongos (por exemplo, camundongos NSG imunodeficientes) que foram reconstituídos com células-tronco hematopoiéticas humanas, por exemplo, que abrigam células imunes CD45 + humanas periféricas, por exemplo, em que o tumor é um tumor de melanoma da pele humana, tal como a partir da linhagem celular SKMEL5;

• alivia tolerância ao tumor mediada por macrófagos/células supressoras derivadas de linhagem mielóide (MDSC) no corpo de um indivíduo (por exemplo, indivíduo humano) com um tumor;

• não se liga a ILT4 de macaco cynomolgus e/ou pirB de camundongo; e/ou • marca monócitos humanos CD14 + e/ou granulócitos humanos CD11B + • se liga a um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou todos os 10) dos haplótipos de ILT4 humana apresentados na Tabela 7.

Cadeia pesada (lgG4) de anticorpo 1E1 (Q1E)

Cadeia pesada [104] EVQLQQWGAG LLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KG LEWIGE INHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLWG RGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFL

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GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSLG K (SEQ ID NO: 1; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia pesada [105] EVQLQQWGAG LLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQP PG KG LEWIG E INHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLWG RGTLVTVSS (SEQ ID NO:63) [106] Cadeia pesada (lgG4) do anticorpo 1E1 (Q1E, S54A)

Cadeia pesada [107] EVQLQQWGAG LLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQPPG KG LEWIG E INHAGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLW GRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSLG K (SEQ ID NO: 2; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia pesada [108] EVQLQQWGAG LLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQP PG KG LEWIG E INHAGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLW G RGTLVTVSS (SEQ ID NO:57)

Cadeia pesada (IgGl) do anticorpo 1E1

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Cadeia pesada [109] QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE INHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLWG RGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSPG K (SEQ ID NO: 44; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia pesada [110] QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE INHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLWG RGTLVTVSS [111] (SEQIDNO:69)

CDRs de Cadeia Pesada 1E1

CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO:16)

CDR-H2: EINHXGSTNYNPSLKS em que X é S ou A (por exemplo,

EINHSGSTNYNPSLKS ou EINHAGSTNYNPSLKS) (SEQ ID NO:17)

CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO:18)

Cadeia leve (lambda) do anticorpo 1E1 (Q1E)

Cadeia Leve [112] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG NSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVLGQ PKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSN NKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 3; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

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Domínio variável de cadeia leve [113] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG

NSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVL (SEQ ID NO:70)

Cadeia leve (lambda) do anticorpo 1E1 (Q1E, S54A)

Cadeia Leve [114] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG

NANRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVLGQ PKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSN NKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 4; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia leve [115] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG

NANRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVL (SEQ ID NO:71)

Cadeia leve (lambda) do anticorpo 1E1 (Q1E, N53Q)

Cadeia Leve [116] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG QSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVLGQ PKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSN NKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 5; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia leve [117] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG

QSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVL (SEQ ID NO:72)

Cadeia leve (lambda) do anticorpo 1E1 (Q1E, N53E)

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Cadeia Leve [118] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG ESNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVLGQ PKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSN N KYAASSYLSLTPEQWKSH RSYSCQVTH EGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 6; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia leve [119] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG

ESNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVL (SEQ ID NO:73)

Cadeia leve (lambda) do anticorpo 1E1 (Q1E, N53D)

Cadeia Leve [120] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG

DSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVLGQ PKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSN N KYAASSYLSLTPEQWKSH RSYSCQVTH EGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 7; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia leve [121] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG

DSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVL (SEQ ID NO:58)

Cadeia leve (lambda) do anticorpo 1E1

Cadeia Leve [122] QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIY GNSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVLG QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQS NNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

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47/146 (SEQ ID NO: 45; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia leve [123] QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIY GNSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVL (SEQ ID NO:77)

CPR s de cadeia leve 1E1

CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19)

CDR-L2: GX1X2NRPS; em que Xi é N,Q,E ou D e X2 é S ou A (por exemplo, GNSNRPS, GNANRPS, GQSNRPS, GESNRPS ou GDSNRPS) (SEQ ID NO: 20)

CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21) [124] Anticorpos e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, incluindo CDRs de cadeia pesada e de cadeia leve 1E1 ou o Vh e Vl de 1E1 ou cadeia pesada e cadeia leve de 1E1 (ou uma variante da mesma, por exemplo, conforme estabelecido na presente invenção) podem ser referidos como 1E1.

Cadeia pesada (lgG4) de anticorpo 2A6 (Q1E)

Cadeia pesada [125] EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYFDSSGWYKGGAF DIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLT VDKSRWQEG N VFSCSVM H EALH N HYTQKSLSLSLG K (SEQ ID NO: 8; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia pesada [126] EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG

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GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYFDSSGWYKGGAF DIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:64)

Cadeia pesada (lgG4) do anticorpo 2A6 (Q1E, S102A, M119L)

Cadeia pesada [127] EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYFDASGWYKGGAF DIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSLG K (SEQ ID NO: 9; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia pesada [128] EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYFDASGWYKGGAF DIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:65)

Cadeia pesada (lgG4) do anticorpo 2A6 (Q1E, D101S, M119L)

Cadeia pesada [129] EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYFSSSGWYKGGAFD IWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAP EFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLP

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PSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSLG K (SEQ ID NO: 10; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia pesada [130] EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYFSSSGWYKGGAFD IWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:66) [131] A presente invenção inclui anticorpos e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o resíduo 1 da SEQ ID NO: 8, 9, 10, 64, 65 ou 66 é Q em vez de E.

CDRs de Cadeia Pesada 2A6

CDR-H1: SYAIS (SEQ ID NO:22)

CDR-H2: GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:23)

CDR-H3: YFX1X2SGWYKGGAFDI; em que Xi é D ou S e X₂ é S ou A (por exemplo, YFDSSGWYKGGAFDI, YFDASGWYKGGAFDI ou YFSSSGWYKGGAFDI) (SEQ ID NO:24)

Cadeia leve (lambda) do anticorpo 2A6

Cadeia Leve [132] QSVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGINVDTYRIHWYQQKPGSPPQYLLRY KSDSDKHQGSGVPSRFSGSKDPSANAGILLISGLQSEDEADYYCAIWYSSTWVFGGGTQLT VLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSK QSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 11; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia leve [133] QSVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGINVDTYRIHWYQQKPGSPPQYLLRY KSDSDKHQGSGVPSRFSGSKDPSANAGILLISGLQSEDEADYYCAIWYSSTWVFGGGTQLT

Petição 870190099901, de 04/10/2019, pág. 467/761

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VL (SEQ ID NO:74) [134] A presente invenção inclui anticorpos e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o resíduo 1 da SEQ ID NO: 11 ou 74 é E em vez de Q.

CDR s de cadeia leve 2A6

CDR-L1: TLRSGINVDTYRIH (SEQ ID NO:25)

CDR-L2: YKSDSDKHQGS (SEQ ID NO:26)

CDR-L3: AIWYSSTWV (SEQ ID NO:27)

Anticorpos e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, incluindo CDRs de cadeia pesada e de cadeia leve 2A6 ou o Vh e Vl de 2A6 ou cadeia pesada e cadeia leve de 2A6 (ou uma variante da mesma, por exemplo, conforme estabelecido na presente invenção) podem ser referidos como 2A6.

Cadeia pesada (lgG4) de anticorpo 3G7 (Q1E)

Cadeia pesada [135] EVQLVESGGGVVQPG RSLRLSCAASG FTFSSYAM H WVRQAPG KG LEWVA VISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGEWIQLWSPFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSLG K (SEQ ID NO: 12; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado).

Domínio variável de cadeia pesada [136] EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGEWIQLWSPFD

Petição 870190099901, de 04/10/2019, pág. 468/761

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YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:67) [137] A presente invenção inclui anticorpos e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o resíduo 1 da SEQ ID NO: 12 ou 67 é Q em vez de E.

CDRs de Cadeia Pesada 3G7

CDR-H1: SYAMH (SEQ ID NO:28)

CDR-H2: VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO:29)

CDR-H3: VGEWIQLWSPFDY (SEQ ID NQ:30)

Cadeia leve (kappa) de anticorpo 3G7

Cadeia Leve [138] DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKFLIYAA SSLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIKRtVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYE KH KVYACEVTHQG LSSPVTKSFN RG EC (SEQ ID NO: 13; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia leve [139] DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKFLIYAA SSLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:75)

CDR s de cadeia leve 3G7

CDR-L1: RASQGISSWLA (SEQ ID NO:31)

CDR-L2: AASSLQS (SEQ ID NO:32)

CDR-L3: QQYNSYPPT (SEQ ID NO:33) [140] Anticorpos e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, incluindo CDRs de cadeia pesada e de cadeia leve 3G7 ou o Vh e Vide 3G7 ou cadeia pesada e cadeia leve de 3G7 (ou uma variante da mesma, por exemplo, conforme

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52/146 estabelecido na presente invenção) podem ser referidos como 3G7.

Cadeia pesada (lgG4) de anticorpo 2C1 (Q1E)

Cadeia pesada [141] EVQLVQSG AEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTE LSM H WVRQAPG KG LEWM GGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAGPLYTIFGVVI IPDNWFDPWGQGTLVTVSSASTKG PSVF P LAPCS RSTS ESTAALG C LVKDY F P E P VTVS W NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG PPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSRLTVDKSRWQEG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSLG K (SEQ ID NO: 14; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado) Domínio variável de cadeia pesada [142] EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWM GGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAGPLYTIFGVVI IPDNWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:68) [143] A presente invenção inclui anticorpos e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o resíduo 1 da SEQ ID NO: 14 ou 68 é Q em vez de E.

CDRs de Cadeia Pesada 2C1

CDR-H1: ELSMH (SEQ ID NO:34)

CDR-H2: GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID NO:35)

CDR-H3: AGPLYTIFGVVIIPDNWFDP (SEQ ID NO:36)

Cadeia leve (lambda) do anticorpo 2C1 (Q1E)

Cadeia Leve [144] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG

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53/146

NSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGSGVVFGGGTQLIILG QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQS N N KYAASSYLSLTPEQWKSH RSYSCQVTH EGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 15; domínio variável sublinhado; CDRs duplo sublinhado)

Domínio variável de cadeia leve [145] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG NSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGSGVVFGGGTQLIIL (SEQ ID NO:76) [146] A presente invenção inclui anticorpos e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o resíduo 1 da SEQ ID NO: 15 ou 76 é Q em vez de E.

CDR s de cadeia leve 2C1

CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:37)

CDR-L2: GNSNRPS (SEQ ID NO:38)

CDR-L3: QSYDSSLSGSGVV (SEQ ID NO:39) [147] Anticorpos e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, incluindo CDRs de cadeia pesada e de cadeia leve 2C1 ou o Vh e Vl de 2C1 ou cadeia pesada e cadeia leve de 2C1 (ou uma variante da mesma, por exemplo, conforme estabelecido na presente invenção) podem ser referidos como 2C1.

[148] Em várias modalidades do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, está ausente uma lisina C-terminal de uma imunoglobulina de cadeia pesada.

[149] Assim, em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma imunoglobulina de cadeia leve, uma imunoglobulina de cadeia pesada ou uma imunoglobulina de cadeia leve e de cadeia pesada, em que a imunoglobulina de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO : 3, 4, 5, 6, 7, 11, 13, 15 ou

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45; e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1, 2, 8, 9, 10, 12, 14, 44, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 ou 86.

[150] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 79; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3.

[151] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4.

[152] Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 5.

[153] Em ainda outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 6.

[154] Em ainda outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de

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55/146 aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7.

[155] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3.

[156] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8 ou 82; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11.

[157] Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 9 ou 83; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11.

[158] Em ainda outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10 ou 84; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11.

[159] Em ainda outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 12 ou 85; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 13.

[160] Em ainda outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação

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56/146 ao antígeno do mesmo compreende: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 14 ou 86; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 15.

[161] Em certas outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma imunoglobulina de cadeia leve, uma imunoglobulina de cadeia pesada ou uma imunoglobulina de cadeia leve e de cadeia pesada, em que o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO : 70, 71, 72, 73, 58, 74, 75, 76 ou 77, e/ou o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63, 57, 64, 65, 66, 67, 68 ou 69.

[162] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70.

[163] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende:

[164] um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 71.

[165] Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 72.

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57/146 [166] Em ainda outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 73.

[167] Em ainda outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58.

[168] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70.

[169] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 64; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74.

[170] Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 65; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74.

[171] Em ainda outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio variável de cadeia pesada

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58/146 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 66; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74.

[172] Em ainda outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 67; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 75.

[173] Em ainda outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 76.

[174] Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a ILT4 compreende um domínio variável de cadeia leve (Vl) de imunoglobulina compreendendo um CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de 1E1 (por exemplo, SEQ ID NOs: 19-21); e um domínio variável de cadeia pesada (VH) de imunoglobulina compreendendo um CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de 1E1 (por exemplo, SEQ ID NOs: 16-18).

[175] Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a ILT4 compreende um domínio variável de cadeia leve (Vl) de imunoglobulina compreendendo um CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de 2A6 (por exemplo, SEQ ID NOs: 25-27); e um domínio variável de cadeia pesada (VH) de imunoglobulina compreendendo um CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de 2A6 (por exemplo, SEQ ID NOs: 22-24).

[176] Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a ILT4 compreende um domínio variável de cadeia

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59/146 leve (Vl) de imunoglobulina compreendendo um CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de 3G7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 31-33); e um domínio variável de cadeia pesada (VH) de imunoglobulina compreendendo um CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de 3G7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 28-30).

[177] Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a ILT4 compreende um domínio variável de cadeia leve (Vl) de imunoglobulina compreendendo um CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de 2C1 (por exemplo, SEQ ID NOs: 37-39); e um domínio variável de cadeia pesada (VH) de imunoglobulina compreendendo um CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de 2C1 (por exemplo, SEQ ID NOs: 34-36).

[178] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDRLl: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNSNRPS(SEQ ID NO: 49), e CDRL3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[179] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDRLl: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQSNRPS(SEQ ID NO: 50), e CDRL3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[180] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GESNRPS(SEQ ID NO: 51), e

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CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[181] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDSNRPS(SEQ ID NO: 52), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[182] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNANRPS(SEQ ID NO: 53), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[183] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQANRPS(SEQ ID NO: 54), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[184] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GEANRPS(SEQ ID NO: 55), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[185] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1:

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GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDANRPS(SEQ ID NO: 56), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[186] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNSNRPS(SEQ ID NO: 49), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[187] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQSNRPS(SEQ ID NO: 50), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[188] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GESNRPS(SEQ ID NO: 51), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[189] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDSNRPS(SEQ ID NO: 52), e

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CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[190] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNANRPS(SEQ ID NO: 53), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[191] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQANRPS(SEQ ID NO: 54), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[192] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GEANRPS(SEQ ID NO: 55), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[193] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio Vh compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDRH3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDANRPS(SEQ ID NO: 56), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[194] A presente invenção fornece ainda um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a ILT4 e compreende o domínio Vl do

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63/146 anticorpo 1E1 (por exemplo, SEQ ID NO: 70, 71, 72, 73, 58 ou 77) e/ou o domínio Vh de anticorpo 1E1 (por exemplo, SEQ ID NO: 63, 57 ou 69).

[195] A presente invenção fornece ainda um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a ILT4 e compreende o domínio Vl do anticorpo 2A6 (por exemplo, SEQ ID NO: 74) e/ou o domínio Vh de anticorpo 2A6 (por exemplo, SEQ ID NO: 64,65 ou 66).

[196] A presente invenção fornece ainda um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a ILT4 e compreende o domínio Vl do anticorpo 3G7 (por exemplo, SEQ ID NO: 75) e/ou o domínio Vh do anticorpo 3G7 (por exemplo, SEQ ID NO: 67 ).

[197] A presente invenção fornece ainda um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a ILT4 e compreende o domínio Vl do anticorpo 2C1 (por exemplo, SEQ ID NO: 76) e/ou o domínio Vh do anticorpo 2C1 (por exemplo, SEQ ID NO: 68 ).

[198] A presente invenção fornece ainda um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a ILT4 e compreende a imunoglobulina de cadeia leve do anticorpo 1E1 (por exemplo, SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 ou 45) e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada de anticorpo 1E1 (por exemplo, SEQ ID NO: 1, 2, 44, 79, 80 ou 81).

[199] A presente invenção fornece ainda um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a ILT4 e compreende a imunoglobulina de cadeia leve de anticorpo 2A6 (por exemplo, SEQ ID NO: 11) e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada de anticorpo 2A6 (por exemplo, SEQ ID NO : 8, 9, 10, 82, 83 ou 84).

[200] A presente invenção fornece ainda um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a ILT4 e compreende a imunoglobulina de cadeia leve do anticorpo 3G7 (por exemplo, SEQ ID NO: 13) e/ou a

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64/146 imunoglobulina de cadeia pesada do anticorpo 3G7 (por exemplo, SEQ ID NO : 12 ou 85).

[201] A presente invenção fornece ainda um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a ILT4 e compreende a imunoglobulina de cadeia leve do anticorpo 2C1 (por exemplo, SEQ ID NO: 15) e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada do anticorpo 2C1 (por exemplo, SEQ ID NO : 14 ou 86).

[202] A presente invenção fornece ainda um anticorpo que consiste em duas cadeias pesadas e em duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende o domínio Vl ou imunoglobulina de cadeia leve de anticorpo 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1, e cada cadeia pesada compreende o domínio Vh ou imunoglobulina de cadeia pesada de anticorpo 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1.

[203] Em uma modalidade, o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58 e cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57.

[204] Em outra modalidade, o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58 e cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57, em que a cadeia leve compreende ainda a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 90.

[205] Em ainda outra modalidade, o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58 e cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57, em que a cadeia pesada compreende ainda a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 89.

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65/146 [206] Em ainda outra modalidade, o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58 e cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57, em que a cadeia leve compreende ainda a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 90 e a cadeia pesada compreende ainda a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 89.

[207] Em uma modalidade, o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7 e cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2.

[208] Em outra modalidade, o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7 e cada cadeia pesada consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO : 2.

[209] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção compreende um Vl (com ou sem sequência de sinal), por exemplo, um Vl em qualquer uma das SEQ ID NO: 58 ou 70-77, com até 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições de aminoácidos conservativas ou não conservativas; e/ou um Vh (com ou sem sequência de sinal), por exemplo, o Vh em qualquer uma das SEQ ID NO: 57 ou 63-69, com até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10 ou mais substituições de aminoácidos conservativas ou não conservativas, enquanto ainda se liga a ILT4.

[210] A presente invenção também inclui polipeptídios compreendendo as sequências de aminoácidos divulgadas na presente invenção, p. SEQ ID NOs: 1-39, 44, 45, 47-58, 63-77 ou 79-86, bem como polipeptídios compreendendo essas sequências de aminoácidos com até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 12, 15, 20

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66/146 ou mais substituições de aminoácidos conservativas ou não conservativas.

[211] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma imunoglobulina de cadeia leve, uma imunoglobulina de cadeia pesada ou uma imunoglobulina de cadeia leve e de cadeia pesada, em que a imunoglobulina de cadeia leve tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 11, 13, 15 ou 45 e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1, 2, 8, 9, 10, 12, 14, 44, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 ou 86.

[212] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma imunoglobulina de cadeia leve, uma imunoglobulina de cadeia pesada ou uma imunoglobulina de cadeia leve e de cadeia pesada, em que a imunoglobulina de cadeia leve compreende um domínio variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70, 71, 72, 73, 58, 74, 75, 76 ou 77 e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada compreende um domínio variável de cadeia pesada com pelo menos 90 % de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63, 57, 64, 65, 66, 67, 68 ou 69.

[213] Em uma modalidade da invenção, uma cadeia pesada de imunoglobulina de um anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção está operacionalmente ligada a uma sequência de sinal, por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácidos MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (SEQ ID NO: 41) e/ou uma cadeia leve de imunoglobulina de um anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção está operacionalmente ligada a uma sequência de sinal,

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67/146 por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácidos MSVPTQVLGLLLLWLTDARC (SEQ ID NO: 42).

[214] Em uma modalidade da invenção, uma glutamina N-terminal (Q) de uma cadeia de imunoglobulina estabelecida na presente invenção (por exemplo, pesada e/ou leve) é substituída por um ácido piroglutâmico. Em uma modalidade, um Q N-terminal de uma imunoglobulina de cadeia pesada é substituído por um ácido piroglutâmico. Em outra modalidade, um Q-N-terminal de uma imunoglobulina de cadeia leve é substituído por um ácido piroglutâmico. Em ainda outra modalidade, um Q N-terminal de uma imunoglobulina de cadeia pesada e um Q N-terminal de uma imunoglobulina de cadeia pesada são substituídos por um ácido piroglutâmico.

[215] São ainda fornecidos na presente invenção anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam ao mesmo epítopo de ILT4 (por exemplo, ILT4 humana) que qualquer anticorpo anti-ILT4 ou seu fragmento de ligação ao antígeno divulgados na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1). Em uma modalidade, o epítopo é LYREKKSASW (SEQ ID NO: 59). Em outra modalidade, o epítopo é TRIRPEL (SEQ ID NO: 60). Em ainda outra modalidade, o epítopo é NGQF (SEQ ID NO: 61). Em ainda outra modalidade, o epítopo é HTGRYGCQ (SEQ ID NO: 62). Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao mesmo epítopo de ILT4 humana como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo as sequências de aminoácidos de cadeia pesada e de cadeia leve estabelecidas em SEQ ID NOs: 1 e 3; 2 e 4; 2 e 5; 2 e 6; 2 e 7; 2 e 3; 8 e 11; 9 e 11; 10 e 11; 12 e 13; 14 e 15; 79 e 3; 80 e 4; 80 e 5; 80 e 6; 80 e 7; 80 e 3; 82 e 11; 83 e 11; 84 e 11; 85 e 13; e 86 e 15; respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao mesmo epítopo do ILT4 humana como um anticorpo ou fragmento de ligação

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68/146 ao antígeno do mesmo, compreendendo o domínio variável de cadeia pesada e as sequências de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 63 e 70; 57 e 71; 57 e 72; 57 e 73; 57 e 58; 57 e 70; 64 e 74; 65 e 74; 66 e 74; 67 e 75; 68 e 76; respectivamente.

[216] A presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno bloqueiam de maneira cruzada a ligação de qualquer anticorpo antiILT4 ou seu fragmento de ligação ao antígeno divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1) a ILT4 (por exemplo, ILT4 humana) ou competem com qualquer anticorpo anti-ILT4 ou seu fragmento de ligação ao antígeno divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1) a ILT4 (por exemplo, ILT4 humana). Os anticorpos de bloqueio cruzado e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo discutidos na presente invenção podem ser identificados com base em sua capacidade de bloquear qualquer um dos anticorpos ou fragmentos especificamente estabelecidos na presente invenção em relação à ligação a ILT4, em ensaios de ligação (por exemplo, interferometria de camada biológica (BLI; por exemplo, ensaio de ligação ForteBio Octet; Pall ForteBio Corp; Menlo Park, CA), ressonância plasmônica de superfície (SPR), BIACore, ELISA, citometria de fluxo). Por exemplo, em uma modalidade da invenção, ao usar BLI, a ponta de uma sonda de fibra óptica é revestida com ligante (por exemplo, ILT4) e atua como o biossensor em que a ligação do anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno a O ILT4 altera o padrão de interferência da luz branca refletida da camada da sonda ligada a ILT4 e uma camada de referência interna. O deslocamento é indicativo de ligação a ILT4/antiILT4. Em uma modalidade da invenção, a ponta revestida de ILT4 é imersa em uma solução de anticorpo contendo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, por exemplo, na cavidade de uma placa de 96 ou 384 cavidades. Em uma modalidade da invenção, a placa é agitada durante a leitura para criar fluxo

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69/146 orbital. Para ler o ensaio, a luz branca é direcionada ao longo do comprimento da fibra. Como mencionado acima, a interferência entre a luz refletida na camada de referência e as superfícies imobilizadas contendo ILT4 da ponta cria um padrão distinto de luz retornando a fibra. À medida que as moléculas se ligam à superfície do sensor imobilizado, esse padrão muda proporcionalmente à extensão da ligação. Por exemplo, os ensaios podem ser usados nos quais uma proteína ILT4 (por exemplo, ILT4 humana) é imobilizada em uma sonda ou placa BLI, um anticorpo ou fragmento anti-ILT4 de referência se liga a ILT4 (por exemplo, na concentração de saturação) e um teste de anticorpo ou fragmento ILT4 é adicionado. A capacidade do anticorpo em teste para competir com o anticorpo de referência para a ligação a ILT4 é então determinada. No formato BLI, a interferência de luz do complexo ILT4 é monitorada para determinar se o anticorpo de teste compete efetivamente com o anticorpo de referência, por exemplo, são monitorados nanômetros de desvio do comprimento de onda da luz ao longo do tempo, em que um desvio indica ligação adicional do anticorpo de teste e uma falta de bloqueio cruzado. Em uma modalidade da invenção, no formato BLI, o bloqueio cruzado é considerado qualitativamente como tendo ocorrido entre os anticorpos se nenhuma ligação adicional do anticorpo de teste for observada. Em uma modalidade da invenção, como controle, é confirmado o bloqueio cruzado do anticorpo de referência consigo mesmo; em que o ensaio está determinado para operar corretamente se o anticorpo de referência puder bloquear de maneira cruzada a ligação a ILT4. A capacidade de um anticorpo em teste para inibir a ligação do anticorpo anti-ILT4 ou fragmento 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1 a ILT4 (por exemplo, ILT4 humana) demonstra que o anticorpo em teste pode bloquear o anticorpo ou fragmento de ligação a ILT4 (por exemplo, ILT4 humana) e, portanto, pode, em alguns casos, se ligar ao mesmo epítopo em ILT4 (por exemplo, ILT4 humana) que 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1. Como mencionado acima,

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70/146 os anticorpos e fragmentos que se ligam ao mesmo epitopo que qualquer um dos anticorpos ou fragmentos anti-ILT4 da presente invenção também fazem parte da presente invenção. Em uma modalidade da invenção, o BLI é conduzido em um formato sanduíche em que um anticorpo anti-ILT4 de referência ou fragmento de ligação ao antígeno é imobilizado na sonda e depois ligado ao ILT4. O anticorpo anti-ILT4 de teste ou fragmento de ligação ao antígeno é então testado quanto à capacidade de bloquear a ligação do anticorpo ou fragmento de referência.

[217] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compete para ligação a ILT4 humana com um anticorpo ou fragmento compreendendo as sequências de aminoácidos de cadeia pesada e de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1 e 3; 2 e 4; 2 e 5; 2 e 6; 2 e 7; 2 e 3; 8 e 11; 9 e 11; 10 e 11; 12 e 13; 14 e 15; 79 e 3; 80 e 4; 80 e 5; 80 e 6; 80 e 7; 80 e 3; 82 e 11; 83 e 11; 84 e 11; 85 e 13; e 86 e 15; respectivamente. Em algumas modalidades , o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compete para ligação a ILT4 humana com um anticorpo ou fragmento compreendendo sequências de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada e as sequências de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 63 e 70; 57 e 71; 57 e 72; 57 e 73; 57 e 58; 57 e 70; 64 e 74; 65 e 74; 66 e 74; 67 e 75; 68 e 76; respectivamente.

[218] A presente invenção inclui anticorpos anti-ILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo glicanos ligados a N que são tipicamente adicionados a imunoglobulinas produzidas em células de ovário de hamster chinês (glicanos ligados a N de CHO) ou a células de levedura projetadas (glicanos ligados a N de levedura projetada), como por exemplo, Pichia pastoris. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-ILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendem um ou mais dos

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71/146 glicanos ligados a N de levedura projetada ou glicanos ligados a N de CHO que são apresentados na figura 16 (por exemplo, GO e/ou GO-F e/ou G1 e/ou GlF e/ou e/ou G2-F e/ou Man5). Em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-ILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendem os glicanos ligados a N de levedura projetada, isto é, GO e/ou G1 e/ou G2, opcionalmente, incluindo ainda Man5. Em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-ILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendem os glicanos ligados a N de CHO, ou seja, GO-F, Gl-F e G2-F, opcionalmente, incluindo ainda GO e/ou G1 e/ou G2 e/ou Man5. Em uma modalidade da invenção, cerca de 80% a cerca de 95% (por exemplo, cerca de 8090%, cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95%) de todos os glicanos ligados a N nos anticorpos anti-ILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo são glicanos ligados a N de levedura projetada ou glicanos ligados a N de CHO. Vide Nett et al. Yeast. 28(3): 237-252 (2011); Hamilton et al. Science. 313(5792): 14411443 (2006); Hamilton et al. Curr Opin Biotechnol. 18(5): 387-392 (2007). Por exemplo, em uma modalidade da invenção, uma célula de levedura projetada é GFI5.0 ou YGLY8316 ou cepas indicadas no documento de patente americana 7,795,002 ou Zha et al. Methods Mol Biol. 988:31-43 (2013). Veja também publicação internacional de pedido de patente no. WO2013/066765.

Polinucleotídeos [219] A presente invenção compreende polinucleotídeos (por exemplo, DNA ou RNA) que codificam as cadeias de imunoglobulina de anticorpos antiILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado na presente invenção. Por exemplo, a presente invenção inclui os ácidos nucleicos que codificam cadeias pesadas e/ou cadeias leves de imunoglobulina dos anticorpos 1E1, 2A6, 3G7 e 2C1 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1-15, 44 e 45 ou um domínio variável do mesmo) como descrito na presente invenção, bem como ácidos

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72/146 nucleicos que hibridam com os mesmos.

[220] A presente invenção inclui polinucleotídeos que codificam um domínio variável de cadeia leve (Vl) de anticorpo compreendendo um CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de 1E1 (por exemplo, compreendendo os aminoácidos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 19-21); e/ou um domínio variável de cadeia pesada (Vh) de anticorpo compreendendo um CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de 1E1 (por exemplo, compreendendo os aminoácidos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 16-18).

[221] A presente invenção inclui polinucleotídeos que codificam um domínio variável de cadeia leve (Vl) de anticorpo compreendendo um CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de 2A6 (por exemplo, compreendendo os aminoácidos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 25-27); e/ou um domínio variável de cadeia pesada (Vh) de anticorpo compreendendo um CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de 2A6 (por exemplo, compreendendo os aminoácidos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 22-24).

[222] A presente invenção inclui polinucleotídeos que codificam um domínio variável de cadeia leve (Vl) de anticorpo compreendendo um CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de 3G7 (por exemplo, compreendendo os aminoácidos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 31-33); e/ou um domínio variável de cadeia pesada (Vh) de anticorpo compreendendo um CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de 3G7 (por exemplo, compreendendo os aminoácidos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 28-30).

[223] A presente invenção inclui polinucleotídeos que codificam um domínio variável de cadeia leve (Vl) de anticorpo compreendendo um CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de 2C1 (por exemplo, compreendendo os aminoácidos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 37-39); e/ou um domínio variável de cadeia pesada (Vh) de anticorpo compreendendo um CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de 2C1

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73/146 (por exemplo, compreendendo os aminoácidos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 34-36).

[224] A presente invenção inclui polinucleotídeos que codificam o domínio Vl do anticorpo 1E1 (por exemplo, SEQ ID NO: 70, 71, 72, 73, 58 ou 77) e/ou o domínio Vh de anticorpo 1E1 (por exemplo, SEQ ID NO: 63, 57 ou 69).

[225] A presente invenção inclui polinucleotídeos que codificam o domínio Vl de anticorpo 2A6 (por exemplo, SEQ ID NO: 74) e/ou o domínio Vh de anticorpo 2A6 (por exemplo, SEQ ID NO: 64, 65 ou 66).

[226] A presente invenção inclui polinucleotídeos que codificam o domínio Vl de anticorpo 3G7 (por exemplo, SEQ ID NO: 75) e/ou o domínio Vh de anticorpo 3G7 (por exemplo, SEQ ID NO: 67).

[227] A presente invenção inclui polinucleotídeos que codificam o domínio Vl de anticorpo 2C1 (por exemplo, SEQ ID NO: 76) e/ou o domínio Vh de anticorpo 2C1 (por exemplo, SEQ ID NO: 68).

[228] A presente invenção inclui polinucleotídeos que codificam a imunoglobulina de cadeia leve de anticorpo 1E1 (por exemplo, SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 ou 45) e/ou imunoglobulina de cadeia pesada de anticorpo 1E1 (por exemplo, SEQ ID NO: 1, 2 ou 44).

[229] A presente invenção inclui polinucleotídeos que codificam a imunoglobulina de cadeia leve de anticorpo 2A6 (por exemplo, SEQ ID NO: 11) e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada de anticorpo 2A6 (por exemplo, SEQ ID NO: 8, 9 ou 10).

[230] A presente invenção inclui polinucleotídeos que codificam a imunoglobulina de cadeia leve de anticorpo 3G7 (por exemplo, SEQ ID NO: 13) e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada de anticorpo 3G7 (por exemplo, SEQ ID NO: 12).

[231] A presente invenção inclui polinucleotídeos que codificam a

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74/146 imunoglobulina de cadeia leve de anticorpo 2C1 (por exemplo, SEQ ID NO: 15) e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada de anticorpo 2C1 (por exemplo, SEQ ID NO: 14).

[232] Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 87. Em outra modalidade específica, o polinucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 88. Em ainda outra modalidade, o polinucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 87 e a sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 88.

[233] A presente invenção também fornece vetores de expressão compreendendo os ácidos nucleicos isolados da invenção, em que o ácido nucleico está operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle, por exemplo, que são reconhecidas por uma célula hospedeira quando a célula hospedeira é transfectada com o vetor. Também são fornecidas células hospedeiras compreendendo um vetor de expressão da presente invenção. Em certas modalidades, as células hospedeiras são células de CHO.

Métodos para produzir anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno [234] Os anticorpos anti-ILT4 e fragmentos de ligação ao antígeno divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) podem ser produzidos de forma recombinante. Nesta modalidade, ácidos nucleicos que codificam uma ou mais das cadeias de imunoglobulina dos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno da invenção (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-15, 44, 45 ou 79-86, ou compreendendo um Vh ou Vl de 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1, conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID Nos: 57, 58, 63-77) podem ser inseridos em um vetor e/ou em um cromossomo da célula hospedeira e expressos em uma célula hospedeira recombinante . Existem vários métodos para produzir anticorpos recombinantes conhecidos no estado da

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75/146 técnica.

[235] Anticorpos (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1) podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos padrão de purificação de proteínas. Além disso, a expressão de cadeias de imunoglobulina da invenção a partir de linhagens celulares de produção pode ser aprimorada usando várias técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema de expressão gênica de glutamina sintetase (o sistema GS) é uma abordagem comum para melhorar a expressão sob certas condições. A presente invenção inclui vetores compreendendo um ou mais polinucleotídeos que codificam uma ou mais das referidas cadeias de imunoglobulina e um gene de glutamina sintetase (GS). Em uma modalidade da invenção, o vetor está em uma célula hospedeira que não possui glutamina sintetase funcional. Em uma modalidade da invenção, a célula hospedeira está em um meio de cultura substancialmente sem glutamina. Os métodos para produzir uma ou mais dessas cadeias de imunoglobulina ou um anticorpo antiILT4 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo a cultura de uma tal célula hospedeira em meio de cultura substancialmente sem glutamina, estão dentro do escopo da presente invenção, bem como essas cadeias, anticorpos e fragmentos produzidos por esse método.

[236] Em geral, glicoproteínas produzidas em uma linhagem celular específica ou animal transgênico terão um padrão de glicosilação que é característico das glicoproteínas produzidas na linhagem celular ou animal transgênico. Portanto, o padrão de glicosilação particular de uma cadeia de imunoglobulina ou anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno contendo uma cadeia de imunoglobulina dependerá da linhagem celular específica ou animal transgênico usado para produzir o anticorpo. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno com um padrão de glicosilação que compreende apenas N-glicanos não-fucosilados podem ser vantajosos, porque esses anticorpos e fragmentos de

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76/146 ligação ao antígeno demonstraram tipicamente exibir uma eficácia mais potente do que suas contrapartes fucosiladas in vitro e in vivo ( Veja, por exemplo, Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); patentes americanas Nos. 6,946,292 e 7,214,775). Esses anticorpos anti-ILT4 e fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1) com N-glicanos não fucosilados fazem parte da presente invenção.

[237] A presente invenção inclui ainda fragmentos de anticorpos dos anticorpos anti-ILT4 divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1). Os fragmentos de anticorpo incluem fragmentos F(ab)2, que podem ser produzidos por divagem enzimática de um IgG por, por exemplo, pepsina. Os fragmentos Fab podem ser produzidos por, por exemplo, redução de F(ab)z com ditiotreitol ou mercaptoetilamina. Um fragmento Fab é uma cadeia Vl-CL anexada a uma cadeia Vh-CH1 por uma ponte dissulfeto. Um fragmento F(ab)z é dois fragmentos Fab que, por sua vez, são anexados por duas pontes dissulfeto. A porção Fab de uma molécula F(ab)z inclui uma porção da região Fc entre a qual estão localizadas pontes dissulfeto. Um fragmento FV é uma região Vl ou Vh .

[238] A presente invenção inclui anticorpos anti-ILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1) que são da classificação IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Em uma modalidade, o anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma Vh conforme estabelecido na presente invenção e uma região constante de cadeia pesada, por exemplo, uma região constante humana, como região constante de cadeia pesada humana 01, 02, 03, ou 04 ou uma variante da mesma. Em uma modalidade da invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma Vh como estabelecido na presente invenção e uma região constante de cadeia leve, por exemplo, uma região constante de cadeia leve humana, como a região de cadeia leve humana lambda ou kappa ou sua variante. A título de exemplo, e não como

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77/146 limitação, a região constante de cadeia pesada humana pode ser 01 ou 00 e a região constante de cadeia leve humana pode ser kappa. A título de exemplo, e não como limitação, a região constante de cadeia pesada humana pode ser 01 ou 00 e a região constante de cadeia leve humana pode ser lambda. Em uma modalidade da invenção, a região Fc do anticorpo é 04 com uma mutação Ser228Pro (Schuurman, J et a!., Mol. Immunol. 38: 1-8, 2001).

[239] Em algumas modalidades da invenção, diferentes domínios constantes podem ser anexados às regiões Vl e Vh derivadas das CDRs na presente invenção fornecidas. Por exemplo, se um uso pretendido específico de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção exigir funções efetoras alteradas, um domínio constante de cadeia pesada que não seja uma IgGl humana pode ser usado, ou pode ser utilizado a IgGl/lgG4 híbrida. Tais anticorpos anti-ILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1) e seus híbridos compreendendo domínios constantes de IgGl e lgG4 fazem parte da presente invenção.

[240] Em uma modalidade, o domínio constante lgG4 difere do domínio constante lgG4 humano nativo (No. de acesso Swiss-Prot. P01861.1) em uma posição correspondente à posição 228 no sistema da EU e à posição 241 no sistema KABAT, onde o Serl08 nativo é substituído por Pro, a fim de evitar uma potencial ligação dissulfeto inter-cadeia entre Cysl06 e Cysl09 (correspondente a posições Cys 226 e Cys 229 no sistema EU e posições Cys 239 e Cys 242 no sistema KABAT) que podem interferir na formação adequada de ligação dissulfeto intra-cadeia. vide Angal et al. (1993) Mol. Imunol. 30:105. Em outros casos, um domínio constante de IgGl modificado que foi modificado para aumentar a meia-vida ou reduzir a função efetora pode ser usado. Tais anticorpos anti-ILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1), compreendendo um domínio constante de lgG4 modificado, fazem

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78/146 parte da presente invenção.

[241] A presente invenção inclui métodos recombinantes para a produção de um anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 ou 2C1, ou uma cadeia de imunoglobulina da mesma, compreendendo (i) introdução de um polinucleotídeo que codifica uma ou mais cadeias de imunoglobulina do anticorpo ou fragmento (por exemplo, compreendendo uma sequência de aminoácidos que inclui qualquer uma ou mais das sequências estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1-15, 44 e/ou 45), por exemplo, em que o polinucleotídeo está em um vetor e/ou está operacionalmente ligado a um promotor (por exemplo, um promotor viral, um promotor de CMV ou promotor de SV40); (ii) cultivo da célula hospedeira (por exemplo, uma célula hospedeira de mamífero, uma célula hospedeira fúngica, uma célula hospedeira bacteriana, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula NSO, uma célula SP2, uma célula HeLa, uma célula de rim de hamster bebê (BHK), uma célula renal de macaco (COS), uma célula de carcinoma hepatocelular humana (por exemplo, Hep G2), uma célula A549, uma célula 3T3, uma célula HEK-293, uma célula Pichia ou uma célula Pichia pastoris) favorável à expressão do (s) polinucleotídeo (s) e, (iii) opcionalmente, isolamento do anticorpo ou fragmento ou cadeia de célula hospedeira e/ou meio no qual a célula hospedeira se desenvolveu. Ao fazer com que um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreenda mais de uma cadeia de imunoglobulina, por exemplo, um anticorpo que compreende duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina, a co-expressão das cadeias em uma única célula hospedeira leva à associação das cadeias, por exemplo, na célula ou na superfície celular ou fora da célula, se essas cadeias são secretadas, de modo a formar o anticorpo ou a molécula de fragmento de ligação ao antígeno. Os métodos da presente invenção incluem aqueles, em que apenas

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79/146 uma cadeia pesada de imunoglobulina ou apenas uma cadeia leve de imunoglobulina (por exemplo, qualquer uma das discutidas na presente invenção, incluindo fragmentos maduros e/ou domínios variáveis dos mesmos) é expressa. Tais cadeias são úteis, por exemplo, como intermediárias na expressão de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que inclui essa cadeia.

Engenharia de Anticorpos da região Fc [242] Os anticorpos anti-ILT4 e fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) também podem ser modificados para incluir modificações na região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como meia-vida sérica, fixação do complemento, ligação ao receptor Fc e/ou função efetora (por exemplo, citotoxicidade celular dependente de antígeno). Além disso, os anticorpos e fragmentos divulgado na presente invenção podem ser quimicamente modificados (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou modificados para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma dessas modalidades é descrita em mais detalhes abaixo. A numeração de resíduos na região Fc é a do índice da EU de Kabat.

[243] Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) também incluem anticorpos com regiões Fc modificadas (ou bloqueadas) para fornecer funções efetoras alteradas, vide, por exemplo, U.S. Pat. No. 5,624,821; W02003/086310; W02005/120571; W02006/0057702. Essa modificação pode ser usada para melhorar ou suprimir várias reações do sistema imunológico, com possíveis efeitos benéficos no diagnóstico e terapia. Alterações da região Fc incluem alterações de aminoácidos (substituições, deleções e/ou inserções), glicosilação

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80/146 ou desglicosilação e adição de vários domínios Fc. Alterações no Fc também podem alterar a meia-vida de anticorpos em anticorpos terapêuticos, permitindo doses menos frequentes e, portanto, maior conveniência e menor uso de material, vide Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734-35.

[244] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) é um anticorpo isotipo lgG4 ou fragmento que compreende uma mutação serina para prolina em uma posição correspondente à posição 228 (S228P; índice EU) na região dobradiça da região constante de cadeia pesada. Foi relatado que esta mutação aboliu a heterogeneidade de pontes dissulfeto de cadeia inter-pesada na região dobradiça (Angal et al. supra; posição 241 é baseada no sistema de numeração de Kabat).

[245] Em uma modalidade da invenção, a região dobradiça de CHI de um anticorpo anti-ILT4 ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) é modificada de modo que o número de resíduos de cisteína na região dobradiça é aumentado ou diminuído (por exemplo, +1, 2 ou 3). Esta abordagem é descrita mais detalhadamente na patente americana No. 5,677,425. O número de resíduos de cisteína na região dobradiça de CHI é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leve e pesada ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[246] Em uma outra modalidade, a região dobradiça Fc de um anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) é mutata para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de dobradiça Fc, de modo que o anticorpo tenha prejudicado a ligação da proteína Staphylococcyl A (SpA) em relação à ligação de SpA de domínio de dobradiça Fc nativo. Esta abordagem

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81/146 é descrita em mais detalhes na Patente Americana No. 6,165,745.

[247] Em outra modalidade, o anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. São possíveis várias abordagens. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, conforme descrito na patente americana No. 6,277,375. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CHI ou CL para conter um epítopo de ligação ao receptor de resgate retirado de dois laços de um domínio CH2 de uma região Fc de um IgG, conforme descrito nas Patentes Americanas Nos. 5,869,046 e 6,121,022.

[248] Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada substituindo pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar a (s) função (s) efetora (s) do anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1). Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente, de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligante efetor, mas mantém a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo progenitor. O ligante efetor para o qual a afinidade é alterada, pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente Cl do complemento. Esta abordagem é descrita em mais detalhes na patente americana Nos. 5,624,821 e 5,648,260.

[249] Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos 329, 331 e 322 podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente, de modo que o anticorpo anti-ILT4 ou o fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) alterou a ligação de Clq e/ou reduziu ou aboliu a citotoxicidade dependente do

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82/146 complemento (CDC). Esta abordagem é descrita em mais detalhes na Patente Americana No. 6,194,551.

[250] Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos nas posições de aminoácidos 231 e 239 são alterados para alterar a capacidade do anticorpo de fixar o complemento. Essa abordagem é descrita mais adiante na publicação PCT WO 94/29351.

[251] Em ainda outro exemplo, a região Fc é modificada para aumentar ou diminuir a capacidade do anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar ou diminuir a afinidade do anticorpo ou fragmento para um receptor Fcy modificando um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 238, 239, 243, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289,

290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322,

324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378,

382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Essa abordagem é descrita mais adiante na publicação PCT WO 00/42072. Além disso, os locais de ligação na IgGl humana para FcyRl, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados e variantes com melhor ligação foram descritas (consulte Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 demonstraram melhorar a ligação a FcyRlII. Além disso, os seguintes mutantes combinados demonstraram melhorar ligação FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.

[252] Em uma modalidade, a região Fc é modificada para diminuir a capacidade do anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) para mediar a função efetora e/ou aumentar as propriedades anti-inflamatórias modificando os resíduos 243 e 264. Em uma

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83/146 modalidade, a região Fc do anticorpo é modificada alterando os resíduos nas posições 243 e 264 para alanina. Em uma modalidade, a região Fc é modificada para diminuir a capacidade do anticorpo de mediar a função efetora e/ou aumentar as propriedades anti-inflamatórias modificando os resíduos 243, 264, 267 e 328.

Modificações pós-tradicionais [253] Em ainda outra modalidade, o anticorpo compreende um padrão de glicosilação particular. Por exemplo, um anticorpo anti-ILT4 aglicosilado ou seu fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1), que não possui glicosilação, faz parte da presente invenção. O padrão de glicosilação de um anticorpo ou fragmento pode ser alterado para, por exemplo, aumentar a afinidade ou avidez do anticorpo para um antígeno. Tais modificações podem ser realizadas, por exemplo, alterando um ou mais dos locais de glicosilação na sequência de anticorpo ou fragmento. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas que resultem na remoção de um ou mais dos locais de glicosilação da estrutura da região variável para eliminar assim a glicosilação nesse local. Essa aglicosilação pode aumentar a afinidade ou avidez do anticorpo ou fragmento para o antígeno. Vide, por exemplo, Patentes Americanas Nos. 5,714,350 e 6,350,861.

[254] Um anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) da invenção também pode ser feito no qual o padrão de glicosilação inclui glicanos hipofucosilados ou afucosilados, como anticorpos hipofucosilados e fragmentos de ligação ao antígeno ou anticorpos e fragmentos afucosilados que possuem quantidades reduzidas de resíduos de fucosil no glicano. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno também pode incluir glicanos com uma quantidade aumentada de estruturas de GlcNac de bissecção. Esses padrões alterados de glicosilação foram demonstrados para

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84/146 aumentar a capacidade ADCC de anticorpos. Tais modificações podem ser realizadas, por exemplo, expressando o anticorpo ou fragmento em uma célula hospedeira na qual a via de glicosilação foi geneticamente modificada para produzir glicoproteínas com padrões particulares de glicosilação. Essas células foram descritas no estado da técnica e podem ser usadas como células hospedeiras, nas quais para expressar anticorpos recombinantes da invenção para assim produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, as linhagens celulares Ms704, Ms705 e Ms709 não possuem o gene fucosiltransferase, FUT8 (a (1,6) -fucosiltransferase), de modo que os anticorpos expressos nas linhagens celulares Ms704, Ms705 e Ms709 não possuem fucose em seus carboidratos. A presente invenção inclui anticorpos anti-ILT4 e fragmentos de ligação ao antígeno sem fucose ou produzidos por uma célula hospedeira que não possui FUT8. As linhagens celulares Ms704, Ms705 e Ms709 FUT8 foram criadas pela interrupção direcionada do gene FUT8 nas células CHO/DG44 usando dois vetores de substituição (consulte a Publicação de Patente dos EUA No. 20040110704 e Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como outro exemplo, o documento de patente EP 1176195 descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 funcionalmente interrompido, que codifica uma fucosil transferase, de modo que os anticorpos expressos nessa linhagem celular exibem hipofucosilação reduzindo ou eliminando a enzima relacionada à ligação ot-1,6. O documento EP 1.176.195 também descreve linhagens celulares que apresentam baixa atividade enzimática para adicionar fucose à N-acetilglucosamina que se liga à região Fc do anticorpo ou que não possui atividade enzimática, por exemplo, a linhagem celular YB2/0 de mieloma de rato (LCR ATCC 1662). A publicação do documento de patente PCT WO 03/035835 descreve uma linhagem celular CHO variante, células Lecl3, com capacidade reduzida de ficar fucose a carboidratos ligados a

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Asn (297), resultando também em hipofucosilação de anticorpos expressos nessa célula hospedeira (ver também Shields et al. ( 2002) J. Biol. Chem. 277:2673326740). Anticorpos com um perfil de glicosilação modificado também podem ser produzidos em ovos de galinha, como descrito na Publicação PCT WO 06/089231. Alternativamente, anticorpos com um perfil de glicosilação modificado podem ser produzidos em células vegetais, como Lemna (Patente americana US 7,632,983). Métodos para produção de anticorpos em um sistema de planta são divulgados nas Patentes dos EUA 6,998,267 e 7,388,081. A publicação PCT WO 99/54342 descreve linhagens celulares projetadas para expressar glicosil transferases modificadoras de glicoproteínas (por exemplo, β (1,4) -N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIH)) de modo que os anticorpos expressos nas linhagens celulares projetadas exibam estruturas GlcNac de bissecção aumentadas que resulta em aumento da atividade ADCC dos anticorpos (ver também Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Anticorpos anti-ILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção que são produzidos por essas células hospedeiras fazem parte da presente invenção.

[255] Alternativamente, os resíduos de fucose do anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) podem ser clivados usando uma enzima fucosidase; por exemplo, a fucosidase ot-Lfucosidase remove resíduos fucosil dos anticorpos (Tarentino et al. (1975) Biochem. 14:5516-23). A presente invenção inclui anticorpos e fragmentos que foram tratados com uma enzima fucosidase.

[256] O anticorpo anti-ILT4 ou fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) divulgados na presente invenção incluem ainda aqueles produzidos em células hospedeiras de eucariotos inferiores, em particular células hospedeiras de fungos, como leveduras e fungos filamentosos,

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86/146 foram geneticamente modificados para produzir glicoproteínas com padrões de glicosilação semelhantes a mamíferos ou humanos (veja, por exemplo, Choi etal, (2003) Proc. Natl. Acad. Sei. 100: 5022-5027; Hamilton etal., (2003) Science 301: 1244-1246; Hamilton et al., (2006) Science 313: 1441-1443). Uma vantagem particular dessas células hospedeiras geneticamente modificadas sobre as linhagens celulares de mamíferos atualmente usadas é a capacidade de controlar o perfil de glicosilação das glicoproteínas que são produzidas nas células, de modo que as composições de glicoproteínas possam ser produzidas, nas quais predomina uma estrutura específica de N-glicano (ver, por exemplo, Patente dos EUA. 7,029,872 e Patente dos EUA No. 7,449,308). Essas células hospedeiras geneticamente modificadas têm sido usadas para produzir anticorpos que possuem estruturas predominantemente particulares de N-glicano (vide por exemplo, Li et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24: 210-215).

Conjugados de Anticorpos [257] Os anticorpos anti-ILT4 e fragmentos de ligação ao antígeno divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) também podem ser conjugados a um peptídeo ou porção química. A porção química pode ser, entre outros, um polímero, um radionuclídeo ou um agente terapêutico ou citotóxico. Em modalidades particulares da invenção, a porção química é um polímero que aumenta a meia-vida da molécula de anticorpo no corpo de um indivíduo. Polímeros incluem, mas não estão limitados a polímeros hidrofílicos que incluem, mas não estão limitados a polietilenoglicol (PEG) (por exemplo, PEG com um peso molecular de 2kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12kDa, 20 kDa, 30kDa ou 40kDa), dextrano e monometoxipolietileno glicol (mPEG). Lee, et al., (1999) (Bioconj. Chem. 10: 973-981) divulga anticorpos de cadeia única conjugados com PEG. Wen, et al., (2001) (Bioconj. Chem. 12: 545-553) divulgam anticorpos de conjugação com PEG, os quais estão ligados a um quelante radiometal (ácido

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87/146 dietilenotriaminpentaacético (DTPA)).

[258] Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) também podem ser conjugados com marcadores, como radiomarcadores. Os marcadores incluem, entre outros, Tc,⁹⁰Y, ⁱⁿln, ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵l, ³H, ¹³¹l, ⁿC, ¹⁵O, ¹³N, ¹⁸F, ³⁵S, ⁵¹Cr, ⁵⁷To, ²²⁶Ra, ⁶⁰Co, ⁵⁹Fe, ⁵⁷Se, ¹⁵²Eu, ⁶⁷CU, ²¹⁷Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd, ²³⁴Th, e ⁴⁰K, ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ⁵²Tr, e ⁵⁶Fe.

[259] Os anticorpos anti-ILT4 e fragmentos de anticorpo divulgado na presente invenção (por exemp\o, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) também podem ser PEGuilados (por exemplo, com 1 PEG ou uma molécula de polímero de 3 kDa, 12 kDa ou 40 kDa de PEG), por exemplo aumentar sua meia-vida biológica (por exemplo, soro). Para PEGilar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo ou fragmento geralmente é reagido com uma forma reativa de polietilenoglicol (PEG), como um éster reativo ou derivado de aldeído do PEG, sob condições nas quais um ou mais grupos PEG se tornam ligados ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Em modalidades particulares, a PEGilação é realizada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Como utilizado na presente invenção, o termo polietileno glicol visa abranger qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivar outras proteínas, como mono (Ci-Cio) alcóxi ou ariloxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser PEGuilado é um anticorpo aglicosilado. Os métodos para PEGilação de proteínas são conhecidos não estado da técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Vide, por exemplo, EP 0 154 316 e EP 0 401 384.

[260] Os anticorpos anti-ILT4 e os fragmentos de ligação ao antígeno divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) também

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88/146 podem ser conjugados com marcadores, tais como marcadores fluorescentes ou quimioluminescentes, incluindo fluoróforos, como quelatos de terras raras, fluoresceína e seus derivados , rodamina e seus derivados, isotiocianato, ficoceritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaladeído, fluorescamina, 152Eu, dansil, umbelliferona, luciferina, marcador luminal, marcador isoluminal, marcador de éster de acridínio aromático, marcador de imidazol, marcador de sal acridínio, marcador de éster de oxalato, marcador de aequorina, 2,3-dihidroftalazinodionas, biotina/avidina, marcadores de spin e radicais livres estáveis.

[261] Os anticorpos anti-ILT4 e os fragmentos de ligação ao antígeno divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) também podem ser conjugados com um fator citotóxico, como toxina da difteria, cadeia da exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, cadeia da ricina A, cadeia da abrina A, cadeia da modeccina A, alfa-sarcino, proteínas e compostos de Aleurites fordii (por exemplo, ácidos graxos), proteínas diantiina, proteínas de Phytoiacca americana PAPI, PAPII e PAP-S, inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de saponaria officinalis, mitogelina, restrinocina, fenomicina e enomicina.

[262] Qualquer método conhecido no estado da técnica para conjugar os anticorpos e a ligação ao antígeno às várias porções pode ser empregado, incluindo os métodos descritos por Hunter, et al., (1962) Nature 144: 945; David et ai., (1974) Biochemistry 13: 1014; Pain et ai., (1981) J. Immunol Meth. 40:219; e Nygren, J., (1982) Histochem. e Cytochem. 30:407. Os métodos para conjugar anticorpos são convencionais e muito bem conhecidos no estado da técnica.

Composições Farmacêuticas e Administração [263] As composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos antiILT4 (por exemplo, anticorpos totalmente humanos, como anticorpos

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89/146 antagonistas totalmente humanos (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem ser preparados para armazenamento misturando os anticorpos e a fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, com o grau de pureza desejado, com transportadores, excipientes ou estabilizadores opcionalmente fisiologicamente aceitáveis (vide, por exemplo, Remington, Remington's Pharmaceutical Sciences (18^a ed. 1980)) na forma de soluções aquosas ou liofilizadas ou outras formas secas.

[264] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende um anticorpo que consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7 e cada cadeia pesada consiste no conjunto de sequências de aminoácidos adiante na SEQ ID NO: 2.

[265] Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende: (i) um anticorpo que consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7 e cada cadeia pesada consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO : 2 e (ii) pembrolizumab.

[266] Formulações de agentes terapêuticos e de diagnóstico podem ser preparadas misturando-se com veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis na forma de, por exemplo, pós liofilizados, pastas, soluções ou suspensões aquosas (ver, por exemplo, Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, e Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems,

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Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity e Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY).

[267] Toxicidade e eficácia terapêutica das composições de anticorpo antiILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1), administradas isoladamente ou em combinação com outro agente terapêutico, podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar o LD50 (a dose letal para 50% da população) e o ED50 (a dose efetiva em 50% da população). A razão de dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico (LD50/ ED50). Em aspectos particulares, os anticorpos que exibem altos índices terapêuticos são desejáveis. Os dados obtidos com estes ensaios de cultura de células e estudos com animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em seres humanos A dosagem de tais compostos encontrase preferivelmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração.

[268] Em uma modalidade adicional, um agente terapêutico adicional que é administrado a um indivíduo em associação com um anticorpo anti-ILT4 (por exemplo, anticorpo totalmente humano como anticorpos antagonistas totalmente humanos) ou seu fragmento de ligação ao antígeno divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6,3G7 e/ou 2C1) são administrados ao indivíduo de acordo com o Physicians 'Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57^ edição (1 de novembro de 2002)).

[269] O modo de administração pode variar. As vias de administração incluem oral, retal, transmucosa, intestinal, parentérica; intramuscular, subcutânea, intradérmica, intramedular, intratecal, intraventricular direta,

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91/146 intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular, por inalação, insuflação, tópica, cutânea, transdérmica ou intra-arterial.

[270] A presente invenção forneceu métodos para administrar um anticorpo anti-ILT4 ou seu fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) compreendendo a introdução do anticorpo ou fragmento no corpo de um indivíduo. Por exemplo, o método compreende perfuração do corpo do indivíduo com uma agulha de uma seringa e injeção do anticorpo ou fragmento no corpo do indivíduo, por exemplo, na veia, artéria, tumor, tecido muscular ou subcutâneo do indivíduo.

[271] A presente invenção fornece um recipiente (por exemplo, um frasco de plástico ou de vidro, por exemplo, com uma tampa ou uma coluna de cromatografia, agulha de orifício oco ou um cilindro de seringa) compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-ILT4 ou fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1 , 2A6, 3G7 e/ou 2C1) estabelecidos neste documento ou uma composição farmacêutica do mesmo compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.

[272] A presente invenção também fornece um dispositivo de injeção compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-ILT4 ou fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) estabelecidos na presente invenção ou uma composição farmacêutica dos mesmos. Um dispositivo de injeção é um dispositivo que introduz uma substância no corpo de um indivíduo por uma via parenteral, por exemplo, intramuscular, subcutânea ou intravenosa. Por exemplo, um dispositivo de injeção pode ser uma seringa (por exemplo, previamente preenchida com a composição farmacêutica, como um autoinjetor) que, por exemplo, inclui um cilindro ou tambor para reter o fluido a ser injetado (por exemplo, compreendendo o anticorpo ou fragmento ou uma sua composição farmacêutica), uma agulha para perfurar a pele e/ou vasos

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92/146 sanguíneos para injeção do fluido; e um êmbolo para empurrar o fluido para fora do cilindro e através do orifício da agulha. Em uma modalidade da invenção, um dispositivo de injeção que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção ou uma composição farmacêutica do mesmo é um dispositivo de injeção intravenosa (IV). Esse dispositivo inclui o anticorpo ou fragmento ou uma composição farmacêutica do mesmo em uma cânula ou trocarte/agulha que pode ser fixada a um tubo que pode ser fixado a uma bolsa ou reservatório para reter fluido (por exemplo, solução salina; ou solução de ringer lactado compreendendo NaCI, lactato de sódio, KCI, CaCb e opcionalmente incluindo glicose) introduzida no corpo do indivíduo através da cânula ou trocarte/agulha.

[273] As composições farmacêuticas divulgadas na presente invenção também podem ser administradas com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha; como os dispositivos divulgados nas patentes americanas 6,620,135; 6,096,002; 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 ou 4,596,556. Tais dispositivos sem agulha compreendendo a composição farmacêutica também fazem parte da presente invenção. As composições farmacêuticas divulgadas na presente invenção também podem ser administradas por infusão. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos para administrar as composições farmacêuticas incluem os divulgados em: Patente americana No. 4,487,603,que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar medicação a uma taxa controlada; Patente americana 4,447,233,que divulga uma bomba de infusão de medicamentos para administrar medicamentos a uma taxa de infusão precisa; patente americana 4,447,224, que divulga um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para administração contínua de drogas; Patente americana No. 4,439,196, que divulga um sistema osmótico de administração de medicamentos com compartimentos

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93/146 de várias câmaras. Muitos outros implantes, sistemas de administração e módulos são bem conhecidos dos versados na técnica e aqueles que compreendem as composições farmacêuticas da presente invenção estão dentro do escopo da presente invenção.

[274] Anticorpos (por exemplo, anticorpos totalmente humanos, como anticorpos antagonistas totalmente humanos) ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) podem ser fornecidos por infusão contínua ou por doses administradas, por exemplo, diariamente, 1-7 vezes por semana, semanalmente, quinzenalmente, mensalmente, bimestralmente, trimestralmente, semestralmente, anualmente etc. As doses podem ser fornecidas, por exemplo, por via intravenosa, subcutânea, tópica, oral, nasal, retal, intramuscular, intracerebral, intra-espinhal, ou por inalação. Uma dose eficaz de um anticorpo anti-ILT4 ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é de cerca de 0,05 mg/kg (peso corporal) a cerca de 30 mg/kg (peso corporal), por exemplo, para tratamento ou prevenção de câncer ou doenças infecciosas.

[275] Determinação da dose apropriada é feita pelo clínico, por exemplo, usando parâmetros ou fatores conhecidos ou suspeitos no estado da técnica em afetar o tratamento. Geralmente, na determinação da dose, a dose começa com uma quantidade um pouco menor do que a dose ideal e é aumentada em pequenos incrementos a partir de então até que o efeito desejado ou ótimo seja alcançado em relação a quaisquer efeitos colaterais negativos. Medidas diagnosticas importantes incluem sintomas de, por exemplo, inflamação ou nível de citocinas inflamatórias produzidas. Em geral, é desejável que um produto biológico a ser utilizado seja derivado da mesma espécie que o animal alvo do tratamento, minimizando assim qualquer resposta imune ao reagente. No caso de indivíduos humanos, por exemplo, podem ser desejáveis anticorpos

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94/146 quiméricos e totalmente humanos. Está disponível orientação na seleção de doses apropriadas de anticorpos ou fragmentos anti-ILT4 (ver, por exemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:15941602).

[276] Se um sintoma da doença foi atenuado ou não, isso poderá ser avaliado por qualquer medida clínica normalmente usada por médicos ou outros profissionais de saúde especializados para avaliar a gravidade ou o status de progressão desse sintoma. Embora uma modalidade da presente invenção (por exemplo, um método de tratamento ou artigo de fabricação) possa não ser eficaz para aliviar os sintomas da doença alvo em todos os indivíduos, deve aliviar os sintomas da doença alvo em um número estatisticamente significativo de indivíduos, conforme determinado por qualquer teste estatístico conhecido no estado da técnica, como o teste t de Student, o teste chi2, o teste U de acordo com Mann e Whitney, o teste Kruskal-Wallis (teste H), Jonckheere-Terpstra teste e teste de Wilcoxon.

Usos terapêuticos de anticorpos anti-ILT4 [277] A presente invenção também fornece métodos para tratar ou prevenir o câncer em indivíduos, como seres humanos, que necessitam desse tratamento, administrando uma quantidade eficaz dos anticorpos anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção, que são

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95/146 divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) que podem ser eficazes para esse tratamento ou prevenção.

[278] Em certas modalidades, o câncer é um tumor sólido. Em outras modalidades, o câncer é câncer hematológico. Em certas modalidades, o câncer é metastático. Em algumas modalidades, o câncer é recidivado. Em outras modalidades, o câncer é refratário. Em ainda outras modalidades, o câncer é recidivante e refratário.

[279] Em algumas modalidades, o câncer é astrocitoma anaplásico, astrocitoma, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama (por exemplo, caracterizado por uma mutação no BRCA1 e/ou BRCA2), câncer carcinóide, câncer cervical, condrosarcoma, papiloma do plexo coróide, câncer colorretal, câncer endometrial, ependimoma, câncer de esôfago, sarcoma de Ewing, câncer de vesícula biliar, câncer gástrico, glioblastoma, câncer de cabeça e pescoço, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, melfibrose idiopática, câncer renal, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não-pequenas), linfoma, meduloblastoma, melanoma, meningioma, câncer de células de Merkel, mesotelioma, mieloma múltiplo, neuroblastoma, oligodendroglioma, osteossarcoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, policitemia vera, câncer de células neuroectodérmicas primárias, câncer de próstata, câncer de células renais, câncer de células transicionais renais, retinoblastoma, tumor rabdóide do rim, rabdomiossarcoma, câncer de glândula salivar, sarcoma, câncer de intestino delgado , sarcoma de tecidos moles, carcinoma de células escamosas (por exemplo, carcinoma de células escamosas cutâneas), sarcoma sinovial, trombocitemia, câncer de tireóide, câncer uterino, schwannoma vestibular ou tumor de Wilm. Em uma modalidade da invenção, o câncer é um câncer metastático, por exemplo, das variedades descritas acima.

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96/146 [280] Em uma modalidade da invenção, o câncer é um tumor rico em mielóides (por exemplo, mesotelioma, câncer renal, linfoma, sarcoma, melanoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer de ovário ou câncer de tireóide; ver por exemplo, Burt et al., Câncer. 117 (22):5234-44 (2011); Dannenmann et al. Oncoimmunology 2(3):e23562 (2013); Steidl et al. N. Engl. J. Med. 362:875-885 (2010); Fujiwara et al., Am. J. Pathol.. 179(3):1157-70 (2011); Bronkhorst et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52(2):643-50 (2011); Balermpas et al. Br. J. Cancer 111(8):1509-18 (2014); and Zhang et al. PLoS One 7(12):e50946 (2012)). Como o ILT4 é expresso principalmente por células e granulócitos mielóides, a infiltração de células mielóides em tumores geralmente está associada a um mau prognóstico devido aos efeitos imunossupressores dessas células que podem antagonizar as respostas antitumorais das células T, tratamento com um anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção beneficiará indivíduos com alta infiltração de células mielóides ou imunossupressoras.

[281] Assim, são fornecidos na presente invenção métodos de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que necessita dele, compreendendo a administração ao indivíduo humano de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo (a) o CDR-L1, CDRL2 e CDR-L3 de um domínio variável de cadeia leve (Vl) de uma cadeia de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3-7, 11, 13, 15 ou 45; e/ou (b) CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de um domínio variável de cadeia pesada (Vh) de uma cadeia de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1, 2, 8-10, 12, 14, 44, ou 79-86.

[282] Em uma modalidade da invenção, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo

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97/146 administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: (1) um domínio Vh compreendendo: região determinante de complementaridade-Hl (CDR-H1): GYYWS (SEQ ID NO: 16), região determinante de complementaridade -H2 (CDRH2): EINHXGSTNYNPSLKS em que X é S ou A (SEQ ID NO: 17); e região determinante de complementaridade-H3 (CDR-H3): LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: região determinante de complementaridade-Ll (CDR-L1): TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), região determinante de complementaridade -L2 (CDR-L2): GX1X2NRPS; em que Xi é S ou A e X2 é N, Q, E ou D (SEQ ID NO: 20); e região determinante de complementaridade-L3 (CDR-L3): QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21); (2) um domínio V_H compreendendo: CDR-H1: SYAIS (SEQ ID NO: 22); CDR-H2: GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 23); e CDR-H3: YFX1X2SGWYKGGAFDI; em que Xi é D ou S e X2 é S ou A (SEQ ID NO: 24); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TLRSGINVDTYRIH (SEQ ID NO: 25); CDR-L2: YKSDSDKHQGS (SEQ ID NO: 26); e CDR-L3: AIWYSSTWV (SEQ ID NO: 27); (3) um domínio V_H compreendendo: CDR-H1: SYAMH (SEQ ID NO: 28); CDR-H2: VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 29); e CDR-H3: VGEWIQLWSPFDY (SEQ ID NO: 30); e/ou, um domínio V_Lcompreendendo: CDR-L1: RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 31); CDR-L2: AASSLQS (SEQ ID NO: 32); e CDR-L3: QQYNSYPPT (SEQ ID NO: 33); e/ou (4) um domínio V_Hcompreendendo: CDR-H1: ELSMH (SEQ ID NO: 34); CDR-H2: GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID NO: 35); e CDR-H3: AGPLYTIFGVVIIPDNWFDP (SEQ ID NO: 36); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 37); CDR-L2: GNSNRPS (SEQ ID NO: 38); e CDRL3: QSYDSSLSGSGVV (SEQ ID NO: 39).

[283] Em uma modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo

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98/146 humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNSNRPS(SEQ ID NO: 49), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[284] Em outra modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDRH2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQSNRPS(SEQ ID NO: 50), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[285] Em ainda outra modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GESNRPS(SEQ ID NO: 51), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[286] Em ainda outra modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDRH2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID

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NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDSNRPS(SEQ ID NO: 52), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[287] Em uma modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNANRPS(SEQ ID NO: 53), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[288] Em outra modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDRH2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQANRPS(SEQ ID NO: 54), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[289] Em ainda outra modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDRH2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GEANRPS(SEQ ID NO: 55), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

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100/146 [290] Em ainda outra modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDRH2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDANRPS(SEQ ID NO: 56), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[291] Em uma modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNSNRPS(SEQ ID NO: 49), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[292] Em outra modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDRH2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQSNRPS(SEQ ID NO: 50), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[293] Em ainda outra modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação

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101/146 ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDRH2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GESNRPS(SEQ ID NO: 51), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[294] Em ainda outra modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDRH2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDSNRPS(SEQ ID NO: 52), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[295] Em uma modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNANRPS(SEQ ID NO: 53), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[296] Em outra modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDRH2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ

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ID NO: 19), CDR-L2: GQANRPS(SEQ ID NO: 54), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[297] Em ainda outra modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDRH2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GEANRPS(SEQ ID NO: 55), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[298] Em ainda outra modalidade, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDRH2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDANRPS(SEQ ID NO: 56), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[299] Em ainda outras modalidades, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: uma imunoglobulina de cadeia leve, uma imunoglobulina de cadeia pesada ou uma imunoglobulina de cadeia leve e pesada, em que a imunoglobulina de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 11, 13, 15 ou 45; e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1, 2, 8, 9, 10, 12, 14, 44,

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79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, ou 86.

[300] Em ainda outras modalidades, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: uma imunoglobulina de cadeia leve, uma imunoglobulina de cadeia pesada, ou uma imunoglobulina de cadeia leve e pesada, em que o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70, 71, 72, 73, 58, 74, 75, 76 ou 77 e/ou a o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63, 57, 64, 65, 66, 67, 68 ou 69.

[301] Em mais modalidades , o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: qualquer um dos seguintes conjuntos de imunoglobulinas de cadeia pesada e cadeia leve imunoglobulinas: (1) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; (2) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4; (3) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 5; (4) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve

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104/146 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 6; (5) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7; (6) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; (7) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (8) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 9; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (9) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (10) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 12; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 13; (11) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 14; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 15; (12) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 79; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; (13) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve

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105/146 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4; (14) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 5; (15) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 6; (16) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7; (17) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; (18) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 82; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (19) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 83; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (20) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 84; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (21) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 85; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 13; ou (22) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 86; uma imunoglobulina de cadeia leve

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106/146 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 15.

[302] Em ainda mais modalidades, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: qualquer um dos seguintes conjuntos de domínio variável de cadeia pesada e domínio variável de cadeia leve: (1) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70; (2) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 71; (3) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 72; (4) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 73; (5) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58; (6) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70; (7) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 64; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:

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74; (8) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 65; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74; (9) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 66; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74; (10) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 67; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 75; ou (11) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 76.

[303] Em uma modalidade preferida, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: um domínio Vh compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio Vl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58.

[304] Em outra modalidade preferida, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7.

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108/146 [305] Em ainda outra modalidade preferida, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo o conjunto de sequências de aminoácidos estabelecido na SEQ ID NO: 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7.

[306] São ainda na presente invenção fornecidos métodos para bloquear a ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que necessita do tratamento, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo (a) a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um domínio variável de cadeia leve (Vl) de uma cadeia de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3-7,11,13,15 ou 45; e/ou (b) CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de um domínio variável de cadeia pesada (Vh) de uma cadeia de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO : 1, 2, 8-10, 12, 14, 44, ou 79-86.

[307] Em uma modalidade da invenção, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita , compreendendo a administração ao indivíduo humano de uma quantidade eficaz de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: (1) um domínio Vh compreendendo: região determinante de complementaridade-Hl (CDR-H1): GYYWS (SEQ ID NO: 16), região determinante de complementaridade -H2 (CDRH2): EINHXGSTNYNPSLKS em que X é S ou A (SEQ ID NO: 17); e região determinante de complementaridade-H3 (CDR-H3): LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio Vl compreendendo: região determinante de

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109/146 complementaridade-Ll (CDR-L1): TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), região determinante de complementaridade -L2 (CDR-L2): GX1X2NRPS; em que Xi é S ou A e X2 é N, Q, E ou D (SEQ ID NO: 20); e região determinante de complementaridade-L3 (CDR-L3): QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21); (2) um domínio V_H compreendendo: CDR-H1: SYAIS (SEQ ID NO: 22); CDR-H2: GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 23); e CDR-H3: YFX1X2SGWYKGGAFDI; em que Xi é D ou S e X2 é S ou A (SEQ ID NO: 24); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TLRSGINVDTYRIH (SEQ ID NO: 25); CDR-L2: YKSDSDKHQGS (SEQ ID NO: 26); e CDR-L3: AIWYSSTWV (SEQ ID NO: 27); (3) um domínio V_H compreendendo: CDR-H1: SYAMH (SEQ ID NO: 28); CDR-H2: VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 29); e CDR-H3: VGEWIQLWSPFDY (SEQ ID NO: 30); e/ou, um domínio V_Lcompreendendo: CDR-L1: RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 31); CDR-L2: AASSLQS (SEQ ID NO: 32); e CDR-L3: QQYNSYPPT (SEQ ID NO: 33); e/ou (4) um domínio V_Hcompreendendo: CDR-H1: ELSMH (SEQ ID NO: 34); CDR-H2: GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID NO: 35); e CDR-H3: AGPLYTIFGVVIIPDNWFDP (SEQ ID NO: 36); e/ou, um domínio Vl compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 37); CDR-L2: GNSNRPS (SEQ ID NO: 38); e CDRL3: QSYDSSLSGSGVV (SEQ ID NO: 39).

[308] Em uma modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano em necessidade que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_L compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNSNRPS(SEQ ID NO: 49), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[309] Em outra modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a

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HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_Lcompreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQSNRPS(SEQ ID NO: 50), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[310] Em ainda outra modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_Lcompreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GESNRPS(SEQ ID NO: 51), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[311] Em ainda outra modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo a administração ao indivíduo humano de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_L compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDSNRPS(SEQ ID NO: 52), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[312] Em uma modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano em necessidade que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo,

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111/146 compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_L compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNANRPS(SEQ ID NO: 53), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[313] Em outra modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_Lcompreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQANRPS(SEQ ID NO: 54), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[314] Em ainda outra modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_L compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GEANRPS(SEQ ID NO: 55), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[315] Em ainda outra modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo a administração ao indivíduo humano de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 47), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_L compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2:

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GDANRPS(SEQ ID NO: 56), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[316] Em uma modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano em necessidade que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_L compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNSNRPS(SEQ ID NO: 49), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[317] Em outra modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_Lcompreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQSNRPS(SEQ ID NO: 50), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[318] Em ainda outra modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_L compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GESNRPS(SEQ ID NO: 51), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[319] Em ainda outra modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele

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113/146 necessita, compreendendo a administração ao indivíduo humano de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_L compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDSNRPS(SEQ ID NO: 52), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[320] Em uma modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano em necessidade que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_L compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GNANRPS(SEQ ID NO: 53), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[321] Em outra modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_Lcompreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GQANRPS(SEQ ID NO: 54), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[322] Em ainda outra modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS

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114/146 (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_L compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GEANRPS(SEQ ID NO: 55), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[323] Em ainda outra modalidade, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo a administração ao indivíduo humano de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16), CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e/ou, um domínio V_L compreendendo: CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19), CDR-L2: GDANRPS(SEQ ID NO: 56), e CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21).

[324] Em ainda outras modalidades, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo a administração ao indivíduo humano de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: uma imunoglobulina de cadeia leve, uma imunoglobulina de cadeia pesada ou uma imunoglobulina de cadeia leve e pesada, em que a imunoglobulina de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 11, 13, 15 ou 45; e/ou a imunoglobulina de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1, 2, 8, 9, 10, 12, 14, 44, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, ou 86.

[325] Em ainda outras modalidades, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende: uma imunoglobulina de cadeia leve, uma imunoglobulina de cadeia pesada ou uma imunoglobulina de cadeia leve e pesada, em que o

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115/146 domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70, 71, 72, 73, 58, 74, 75, 76 ou 77, e/ou o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63, 57, 64, 65, 66, 67, 68 ou 69.

[326] Em mais modalidades, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessite, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende: qualquer um dos seguintes conjuntos de imunoglobulinas de cadeia pesada e imunoglobulinas de cadeia leve: (1) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; (2) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4; (3) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 5; (4) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 6; (5) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7; (6) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos

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116/146 estabelecida na SEQ ID NO: 3; (7) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (8) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 9; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (9) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (10) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 12; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 13; (11) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 14; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 15; (12) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 79; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; (13) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4; (14) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 5; (15) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de

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117/146 aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 6; (16) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7; (17) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; (18) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 82; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (19) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 83; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (20) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 84; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11; (21) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 85; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 13; ou (22) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 86; uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 15.

[327] Em ainda outras modalidades, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo a administração ao indivíduo humano de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: qualquer um dos seguintes conjuntos de domínio variável de

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118/146 cadeia pesada e domínio variável de cadeia leve: (1) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70; (2) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 71; (3) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 72; (4) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 73; (5) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58; (6) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70; (7) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 64; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74; (8) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 65; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74; (9) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 66; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de

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119/146 aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74; (10) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 67; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 75; ou (11) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 76.

[328] Em uma modalidade preferida, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: um domínio Vh compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio Vl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58.

[329] Em outra modalidade preferida, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7.

[330] Em ainda outra modalidade preferida, o método de bloqueio da ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um indivíduo humano que dele necessita, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a

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120/146 sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7.

[331] A presente invenção também fornece métodos para tratar ou prevenir uma doença infecciosa em um indivíduo, administrando uma quantidade eficaz de anticorpos anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) ao indivíduo que pode ser eficaz para esse tratamento ou prevenção. Em uma modalidade da invenção, a doença infecciosa é infecção viral. Em uma modalidade da invenção, a doença infecciosa é infecção bacteriana. Em uma modalidade da invenção, a doença infecciosa é infecção parasitária. Em uma modalidade da invenção, a doença infecciosa é infecção por fungos.

[332] A presente invenção inclui métodos de tratamento de qualquer um dos cânceres ou doenças infecciosas discutidos na presente invenção, administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo antiILT4 ou seu fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) opcionalmente em associação com qualquer um dos outros agentes quimioterápicos ou procedimentos terapêuticos discutidos na presente invenção, bem como composições que incluem esse anticorpo ou fragmento em associação com esse agente quimioterápico adicional (por exemplo, anticorpo ou fragmento co-formulado e agente quimioterápico adicional).

[333] Um indivíduo é um mamífero como, por exemplo, um humano, cachorro, gato, cavalo, vaca, rato, camundongo, macaco (por exemplo, macaco cynomolgus, por exemplo, Macaca fascicularis ou Macaca mulatto) ou coelho.

[334] Em uma modalidade da invenção, um anticorpo anti-ILT4 (por exemplo, anticorpo totalmente humano, como anticorpos antagonistas totalmente humanos) ou um fragmento de ligação ao antígeno da presente

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121/146 invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) está em associação com um agente quimioterápico adicional, como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma modalidade da invenção, o agente quimioterápico adicional é um antiemético, eritropoietina, GM-CSF, uma vacina, um anticorpo anti-PD-Ll ou seu fragmento de ligação ao antígeno, um anticorpo anti-PD-L2 ou fragmento de ligação ao antígeno , um anticorpo anti-PDl ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, pembrolizumab ou nivolumabe), 5fluorouracil (5-FU), um composto de platina, bevacizumabe, daunorrubicina, doxorrubicina, temozolomida topotecana, irinotecano, paclitaxel, docetaxel, docetaxel ou rituximabe.

[335] O termo em associação com indica que os componentes, um anticorpo anti-ILT4 (por exemplo, anticorpo totalmente humano, como antagonistas de anticorpos totalmente humanos) ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) junto com outro agente, como pembrolizumab ou nivolumabe, podem ser formulados em uma única composição, por exemplo, para administração simultânea, ou formulados separadamente em duas ou mais composições (por exemplo, um kit). Cada componente pode ser administrado a um indivíduo em um momento diferente do que quando o outro componente é administrado; por exemplo, cada administração pode ser administrada não simultaneamente (por exemplo, separadamente ou sequencialmente) em intervalos durante um determinado período de tempo. Além disso, os componentes separados podem ser administrados a um indivíduo pela mesma via ou por uma via diferente (por exemplo, em que um anticorpo anti-ILT4 (por exemplo, anticorpo totalmente humano como anticorpos antagonistas totalmente humanos) ou um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1 são administrados por via parenteral e paclitaxel é administrado por via oral).

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Ensaios e usos experimentais e de diagnóstico [336] A presente invenção inclui qualquer método para formar um complexo entre um anticorpo anti-ILT4 ou um fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção e ILT4 ou um fragmento do mesmo compreendendo o contato do polipeptídeo ou fragmento de ILT4 com o anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno sob condições adequadas para ligação e formação de complexos.

[337] Os anticorpos anti-ILT4 (por exemplo, anticorpos totalmente humanos, como anticorpos antagonistas totalmente humanos) e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) podem ser usados como agentes de purificação por afinidade. Nesse processo, os anticorpos anti-ILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo são imobilizados em uma fase sólida, tal como resina sephadex, vidro ou agarose ou papel de filtro, usando métodos bem conhecidos no estado da técnica. O anticorpo ou fragmento imobilizado é contatado com uma amostra contendo a proteína ILT4 (ou um fragmento da mesma) para ser purificada e, posteriormente, o suporte é lavado com um solvente adequado que remove o material da amostra, exceto a proteína ILT4, que é ligada ao anticorpo ou fragmento imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com um solvente que elui o ILT4 ligado (por exemplo, proteína A). Tais anticorpos e fragmentos imobilizados fazem parte da presente invenção.

[338] A presente invenção inclui métodos ELISA baseados em células usando os anticorpos anti-ILT4 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1). Em uma modalidade da invenção, o método é para determinar se as células contêm ILT4 e o método inclui as etapas: (i) colocação em contato com as referidas células imobilizadas em uma superfície sólida (por exemplo, uma microplaca), a ser testada quanto à

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123/146 presença de ILT4, com um anticorpo anti-ILT4 ou um fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção, (ii) opcionalmente , lavagem da mistura para remover o anticorpo ou fragmento anti-ILT4 não ligado, (iii) colocação em contato com o anticorpo ou fragmento anti-ILT4 com um anticorpo secundário marcado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao anticorpo ou fragmento anti-ILT4, (iv) lavagem opcionalmente do complexo para remover anticorpos ou fragmentos não ligados e (v) detecção da presença do marcador no anticorpo ou fragmento secundário; em que a detecção do marcador indica que as células que contêm ILT4 estão imobilizadas na superfície sólida.

[339] A presente invenção inclui ensaios ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima) que incorporam o uso de um anticorpo anti-ILT4 (por exemplo, anticorpos totalmente humanos, como anticorpos totalmente humanos antagonistas) ou seu fragmento de ligação ao antígeno divulgado (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1). Por exemplo, esse método, para determinar se uma amostra contém ILT4 ou um fragmento, compreende as seguintes etapas:

(a) revestimento de um substrato (por exemplo, superfície de uma cavidade de placa de microtitulação, por exemplo, uma placa de plástico) com anticorpo anti-ILT4 (por exemplo, anticorpos totalmente humanos, como anticorpos totalmente humanos antagonistas) ou seu fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, 1E1,2A6, 3G7 e/ou 2C1);

(b) aplicação de uma amostra a ser testada quanto à presença de ILT4 no substrato;

(c) lavagem do substrato, para remover o material não ligado da amostra;

(d) aplicação de anticorpos marcados de forma detectável (por exemplo, anticorpos ligados a enzimas) que também são específicos para o antígeno ILT4;

(e) lavagem do substrato, de modo que os anticorpos marcados não ligados sejam removidos;

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124/146 (f) detecção do marcador nos anticorpos; se os anticorpos marcados estiverem ligados a enzimas, aplicação de um produto químico que é convertido pela enzima em um sinal detectável, por exemplo, fluorescente; e [340] Detecção do marcador, por exemplo, associada ao substrato, indica a presença da proteína ILT4.

[341] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo marcado ou seu fragmento de ligação ao antígeno é marcado com peroxidase que reage com ABTS (por exemplo, ácido 2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenztiazolina-6-sulfônico)) ou 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina para produzir uma mudança de cor detectável. Alternativamente, o anticorpo ou fragmento marcado é marcado com um radioisótopo detectável (por exemplo, 3H) que pode ser detectado pelo contador de cintilação na presença de um cintilante.

[342] Um anticorpo anti-ILT4 (por exemplo, anticorpos totalmente humanos, como anticorpos antagonistas totalmente humanos) ou um fragmento de ligação ao antígeno da invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) pode ser usado em um procedimento de transferência Western ou imunotransferência de proteínas. Tal procedimento faz parte da presente invenção e inclui, por exemplo:

(1) fornecimento de uma membrana ou outro substrato sólido compreendendo uma amostra a ser testada quanto à presença de ILT4 ou fragmento da mesma, por exemplo, incluindo opcionalmente a etapa de transferência de proteínas de uma amostra a ser testada quanto à presença de ILT4 (por exemplo, de uma separação eletroforética PAGE ou SDS-PAGE das proteínas na amostra) em uma membrana ou outro substrato sólido (por exemplo, usando métodos conhecidos no estado da técnica (por exemplo, transferência semisseca ou transferência de tanque)); e colocação em contato com a membrana ou outro substrato sólido a ser testado quanto à presença de

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ILT4 ligado ou um fragmento do mesmo com um anticorpo anti-ILT4 ou um fragmento de ligação ao antígeno da invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1);

(2) lavagem da membrana uma ou mais vezes para remover o anticorpo ou fragmento anti-ILT4 não ligado e outras substâncias não ligadas; e (3) detecção do anticorpo ou fragmento anti-ILT4 ligado.

[343] Essa membrana pode assumir a forma, por exemplo, de uma membrana à base de nitrocelulose ou vinil (por exemplo, fluoreto de polivinilideno (PVDF)) na qual as proteínas a serem testadas quanto à presença de ILT4 em uma PAGE não desnaturante (eletroforese em gel de poliacrilamida)) gel ou gel de SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio) foram transferidas (por exemplo, após a separação eletroforética no gel). Antes da colocação em contato da membrana com o anticorpo ou fragmento anti-ILT4, a membrana é opcionalmente bloqueada, por exemplo, com leite seco não gordo ou semelhante, de modo a ligar sítios de ligação a proteínas não específicos na membrana.

[344] A detecção do anticorpo ou fragmento anti-ILT4 ligado indica que a proteína ILT4 está presente na membrana ou substrato e na amostra. A detecção do anticorpo ou fragmento ligado pode ser por ligação do anticorpo ou fragmento a um anticorpo secundário (um anticorpo anti-imunoglobulina) que é marcado de forma detectável e, em seguida, detecção da presença do marcador do anticorpo secundário.

[345] Os anticorpos anti-ILT4 (por exemplo, anticorpos totalmente humanos, como anticorpos antagonistas totalmente humanos) e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado na presente invenção (por exemplo, 1E1, 2A6, 3G7 e/ou 2C1) também podem ser utilizados para imuno-histoquímica. Tal método faz parte da presente invenção e compreende, por exemplo,

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126/146 (1) colocação em contato de células (por exemplo, células de linhagem mielóide, como monócitos, macrófagos ou células dendtríticas) a serem testadas quanto à presença de proteína ILT4 com um anticorpo anti-ILT4 ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção (por exemplo, 1E1, 2A6,3G7 e/ou 2C1); e (2) detecção do anticorpo ou fragmento sobre ou nas células.

[346] Se o próprio anticorpo ou fragmento for marcado de forma detectável, ele poderá ser detectado diretamente. Alternativamente, o anticorpo ou fragmento pode ser ligado por um anticorpo secundário marcado de forma detectável, em que o marcador é então detectado.

Exemplos [347] Estes exemplos destinam-se a exemplificar a presente invenção e não são uma limitação da mesma. As composições e métodos estabelecidos nos exemplos fazem parte da presente invenção.

[348] Conforme utilizado na presente invenção, o termo plEl (Gl) refere-se a um anti-ILT4 1E1 mAb totalmente humano que é derivado dos genes da linhagem germinativa V, IGHV4-34 * 0 e IGLV1-40 * 01, respectivamente; tendo os domínios constantes IgG 1 humanos e lambda humanos.

> Cadeia pesada [349] QVQLQQWGAG LLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KG LEWIG E INHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLWG RGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSPG K (SEQ ID NO:44)

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127/146 > Cadeia leve [350] QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIY GNSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVLG QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQS N N KYAASSYLSLTPEQWKSH RSYSCQVTH EGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO:45) [351] Conforme usado na presente invenção, plEl (G4) refere-se a um anti-ILT4 1E1 mAb totalmente humano (com as mutações Q1E na cadeia pesada e Q1E na cadeia leve) que é derivado dos genes da linhagem germinativa V, IGHV4-34 * 0 e IGLV1- 40 * 01, respectivamente; tendo os domínios constantes de lgG4 humanos (S228P) e lambda humanos.

> cadeia pesada [352] EVQLQQWGAG LLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQP PG KG LEWIG E INHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLWG RGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSLG K (SEQ ID NO:1) > domínio constante lgG4 (S228P) humano [353] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSLG K

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128/146 (SEQ ID NO:89) > cadeia leve [354] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG NSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVLGQ PKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSN NKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID N0:3) > domínio constante lambda humano [355] GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKA GVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NQ:90) [356] Conforme usado na presente invenção, 1E1 (G4) refere-se a um anti-ILT4 1E1 totalmente humano (com as mutações Q1E e N53D na cadeia leve e Q1E e S54A na cadeia pesada) que é derivado dos genes da linhagem germinativa V, IGHV4-34 * 0 e IGLV1-40 * 01, respectivamente; com domínios constantes de lgG4 humanos (S228P) e lambda humanos.

> cadeia pesada [357] EVQLQQWGAG LLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQP PG KG LEWIG E INHAGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLW GRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSLG K (SEQ ID NO: 2) > cadeia leve [358] ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG

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DSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVLGQ PKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSN N KYAASSYLSLTPEQWKSH RSYSCQVTH EGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 7)

Exemplo 1: Identificação e caracterização de anticorpos anti-ILT4

Geração e identificação de anticorpos [359] O mAb 1E1 humano parental anti-ILT4 foi identificado usando a plataforma RETROCYTE DISPLAY (Breous-Nystroma et al., Methods 65 (1): 57-67 (2014)). A plataforma RETROCYTE DISPLAY utiliza transferência de genes retrovirais de anticorpos humanos para células pré-B de mamíferos para gerar bibliotecas estáveis de exibição de anticorpos de alta diversidade. O sangue do cordão umbilical humano contendo células B virgens foi utilizado como material de origem para cadeias pesadas e leves de anticorpos. As bibliotecas de anticorpos celulares tipicamente expressavam> 10⁸ diferentes anticorpos humanos monoclonais de comprimento total (isotipos hlgGl-4) na superfície celular da célula pré-B.

[360] Os pré-painéis de anticorpos foram compilados a partir de ocorrências de anticorpos identificadas em 3 campanhas separadas de rastreamento RETROCYTE DISPLAY. Os candidatos foram enriquecidos com base na detecção por FACS da ligação de antígeno ILT4 humana recombinante de ligação a clones de células B. Os clones putativos de células B foram separados e suas sequências de anticorpos determinadas. Essas seqüências foram usadas para produzir candidatos anticorpos e ligação a ILT4 foi confirmada usando ensaios de ligação a células transfectantes ILT4 CHO, com células CHO parentais servindo como controle negativo. Os candidatos também foram contrarastreados quanto à especificidade de ILT4 contra membros da família ILT intimamente relacionados (ILT2 humano, LILRA1 e LILRA2 CHO transfectantes

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FACS) e contra membros da família ILT pela avaliação citométrica de fluxo (LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA5, LILRA6, ILT2, ILT5 e ILT3).

[361] Os anticorpos monoclonais foram ainda testados quanto à sua capacidade de se ligar a transfectantes CHO de ILT4 de macaco cynomolgus (sequência prevista de NCBI) via FACS. Os mAbs candidatos também foram rastreados quanto à sua capacidade de bloquear ligante HLA-G Fc recombinante de ligação à proteína ILT4 recombinante em ensaios à base de Luminex ou às células CHO que expressam ILT4 em ensaios à base de FACS. A atividade funcional de anticorpo candidato foi avaliada por três métodos: 1) resgate de supressão espontânea de IL2 em células T 3A9 de camundongo transfectadas com ILT4; 2) recuperação daesupressão dependente de HLA-G de degranulação de mastócitos estimulada por CD200RLa em transfectantes WTMC ILT4 de camundongo; e 3) modulação de citocinas em todas reações linfocitárias mistas de PBMC.

[362] Com base nos critérios de rastreamento acima, oito anticorpos antiILT4 (1E1,1G2, 2A6, 2D5, 3E6, 3G7, 2C1 e 5A6) foram selecionados com base em suas propriedades funcionais e biofísicas. Os anticorpos foram analisados e reavaliados em um conjunto de ensaios biofuncionais, biofísicos e físicoquímicos. Os ensaios funcionais avaliaram o resgate dependente da dose mediado por anticorpos de supressão de IL-2 de células 3A9 e a desgranulação de mastócitos descrita acima. Os ensaios de Luminex e bloqueio de ligantes baseados em células e competição de ligantes foram realizados e as propriedades e afinidades de ligação ao antígeno alvo ILT4, antígenos fora do alvo e subconjuntos PBMC foram determinados usando ensaios baseados em Biacore e citometria de fluxo, respectivamente. Os ensaios biofísicos avaliaram a estabilidade do anticorpo (temperatura, pH) e o comportamento de degradação e agregação. As susceptibilidades de sequência e potenciais padrões de

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131/146 modificação pós-translacional foram abordados para excluir possíveis riscos de produção de anticorpos. Finalmente, os candidatos foram testados em um estudo de regressão tumoral in vivo usando camundongos humanizados desafiados com melanoma SKMEL5.

Propriedades biofísicas [363] Foram realizados estudos sobre a sequência 1E1 humana (cadeia principal de lgG4 humana com mutação S228P) expressa transitoriamente em células CHO. 1E1 apresentou as seguintes características físico-químicas: pontos isoelétricos (PI) calculados e determinados experimentalmente foram, respectivamente, ~ 7,29 e ~ 7,2; o nível de agregação (espécies HMW) foi <5%; por pelo menos 5 ciclos de congelamento/descongelamento. Asequência de 1E1 originalmente tinha um sítio de N-glicosilação em Vh-CDR2 que foi corrigido com sucesso com a mutação S54A sem impacto negativo na ligação por BIACORE e em ensaio funcional. Estudos de estresse mostraram desamidação do resíduo N53 em Vl-CDR3 (> 13% em condições de PH alto). N53 foi corrigido com sucesso (N53D) sem um impacto negativo na ligação e em um ensaio funcional (resgate da liberação de IL-2 dos transfectantes de células T ILT4 3A9 com 1E1). Ambos os resíduos Q N-terminais nos Vh e Vl de 1E1 foram mutados para E (Vh-Q1E e Vl Q1E) para reduzir o risco de heterogeneidade devido à desamidação. Estudos de estresse realizados na sequência 1E1 mutada (1E1 Vh Q1E, S54A/Vl Q1E, N53D) lgG4 S228P/Lambda) mostraram ~ 17% de oxidação do resíduo W102 em VhCDR3 sob oxidação forçada com AAPH (2,2'-Azobis (2-amidinopropano) dicloridrato) às 6 horas com impacto mínimo na ligação e na função. O AAPH é usado para forçar a oxidação dos resíduos Trp e Met. O AAPH é usado para forçar a oxidação de resíduos Trp e Met. Cerca de 8% de anticorpo afucosilado foram detectados pelo mapeamento de peptídeos. Esse resultado pode estar associado à expressão da molécula em células CHO transientemente transfectadas.

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Mapeamento de epítopos [364] O epítopo de ILT4 do clone de anticorpo, plEl (Gl), foi identificado por Espectrometria de Massa por Troca de Hidrogênio-Deutério. O anticorpo plEl (Gl) foi pré-misturado com o domínio extracelular recombinante de ILT4 marcado com histidina e, em seguida, o complexo foi incubado em tampão de deutério. A quantidade de incorporação de deutério foi medida por espectrometria de massa. Resíduos de ILT4 LYREKKSASW (39 - 48 de ILT4 sem sequência de sinal) (SEQ ID NO: 59) e TRIRPEL (50 - 56 de ILT4 sem sequência de sinal) (SEQ ID NO: 60) e, em menor extensão, NGQF (59-62 de ILT4 sem sequência de sinal) (SEQ ID NO: 61) e HTGRYGCQ (71-78 de ILT4 sem sequência de sinal) (SEQ ID NO: 62) foram identificados como mostrando a maior diferença na marcação de deutério em comparação com uma amostra somente de antígeno, indicando que é provável que os resíduos interajam com plEl (Gl) (Figura 1). Esses peptídeos estão no domínio 1 do ILT4. Outros peptídeos no domínio 1 e 2 que mostraram menos diferenças na marcação do deutério provavelmente estão protegidos devido à estabilidade conformacional após a ligação do anticorpo. Não foram observadas diferenças significativas na marcação em domínios 3 e 4.

[365] Quando mapeados na estrutura cristalina do ILT4 humana, os resíduos protegidos por plEl (G4) estão formando epítopo conformacional não linear, compreendendo três fitas beta e um laço (Figura 2A).

[366] O ILT4 usa duas interfaces de ligação para envolver seu ligante HLAG (Shiroishi et al, 2006): sítio 1 para ligação de beta-2-microglobulina, localizado no domínio 2 de ILT4, e sítio 2 para ligação de cadeia pesada de HLA-G, localizado em domínio 1 de ILT4 (Figura 2B). O sítio 1 inclui os resíduos de ILT4 Trp-67, Asp177, Asn-179 e Val-183 (numeração de acordo com Shiroishi et al, 2006). O sítio 2 inclui os resíduos de ILT4 Arg-36, Tyr-38, Lys-42, lle-47 e Thr-48 (numeração de acordo com Shiroishi et al, 2006). Os dados HDX-MS deste pedido mostram que

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Tyr-38, Lys-42 e Thr-48 (numeração de acordo com Shiroishi et al, 2006) fazem parte do epítopo plEl (Gl) no domínio ILT4 1 como resíduos Tyr-40 , Lys-44 e Thr-50 de ILT4 humana (Figura 2A). Isso indica que o epítopo de ILT4 humana ligado por sobreposições plEl (Gl) ao epítopo de sítio 2 ligado pelo ligante HLAG.

Exemplo 2: Propriedades de afinidade, ligação e bloqueio de anti-ILT4 mAb 1E1

Afinidades de ligação de 1E1 (G4) e HLA-G1 a ILT4 humana determinadas por ressonância plasmática de superfície (SPR) [367] Ligação de 1E1 (G4) e HLA-G1 Fc (domínio extracelular recombinante do HLA-G (isoforma 1) fundido ao domínio IgGl Fc humano para produzir proteína HLA-G1 solúvel) a ILT4-His (domínio extracelular recombinante de ILT4 humana fundido a um marcador poli-histidina para produzir a proteína ILT4 solúvel) foi avaliada via Biacore. 1E1 (G4) ou HLA-G1 Fc foi capturado em um chip Biacore via captura Fc. O ILT4-His monomérico foi então testado quanto à ligação e os dados indicaram ILT4-His ligado a 1E1 (G4) com uma afinidade maior que 600 vezes maior que o HLA-G1 Fc (Tabela 3).

Tabela 3. O ILT4-His se liga a 1E1 (G4) com uma afinidade maior que 600 vezes maior que o HLA-G1 Fc. Cinética de ligação 1: 1 e análises em estado estacionário indicam diferenças de 630 e 670 vezes.

n	Ligante	ka (l/MV)	kd (1/s)	Kd(M)	Razão K_D
2	1E1 (G4)	5.5E+05	9.0E-03	1.7E-08	1
2	HLA-G 1 Fc (cinética)	1.1E+05	1.1E+00	1.1E-05	630
HLA-G 1 Fc (SSA)	-	-	1.1E-05	670

[368] Um ensaio de ressonância plasmônica de superfície (SPR) em um instrumento Biacore T200 (GE HEALTHCARE) foi usado para determinar as afinidades monovalentes de ILT4 lgG4 mAb anti-humano (1E1 (G4)) e fusão HLAPetição 870190099901, de 04/10/2019, pág. 551/761

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G1 Fc (HLA-Gl-Fc) contra ILT4 humana marcado com poli-histidina (ILT4-His). A proteína de fusão mAb ou Fc foi capturada em um chip sensor CM5 preparado usando um kit Human Fc Capture (GE HEATHCARE) e uma série de concentrações de titulação de ILT4-His foi injetada nessa superfície. O software de avaliação Biacore T200 foi usado para ajustar cada série de titulação a um modelo de ligação 1: 1. As taxas de associação (ka, M ¹ s¹) e dissociação (kd, s¹) foram determinadas para cada conjunto de titulações e usadas para calcular a constante de dissociação, KD (M) = koff/kon, para cada titulação. Como mostrado na Tabela 1, as afinidades monovalentes (Kd) de 1E1 (G4)mAb e HLA-Gl-Fc contra ILT4-His humano foram 17 nM e 11 uM, respectivamente, com uma diferença de 630 vezes indicada pela razão Kd. Devido às constantes cinéticas rápidas ka e kd, a aproximação em estado estacionário (SSA) também foi usada para confirmar a baixa afinidade do HLA-Gl-Fc para ILT4-His.

Bloqueio de ligação de HLA-G aos transfectantes de células T ILT4 3A9 com 1E1 (G4) [369] Os transfectantes de células T de ILT4 3A9 foram pré-tratados com 1E1 (G4) ou controle de isotipo em várias doses, seguidos pela detecção secundária de 1E1 (G4) (Figura 3A) ou por tratamento com uma concentração fixa de quimera biotinilada HLA-G1 Fc para avaliar a capacidade de 1E1 (G4) para bloquear o ligante cognato (Figura 3B). 1E1 (G4) e HLA-G Fc foram detectados por citometria de fluxo. Os dados mostram que 1E1 (G4) bloqueou a ligação de HLA-G1 Fc de maneira dependente da dose.

Ensaios Luminex e de bloqueio de ligante baseado em células e de competição [370] Os anticorpos 1E1, 2A6, 2C1 e 3G7 foram testados em ensaios de bloqueio de ligante baseado em células e Luminex e de competição de ligante quanto ao potencial deste de inibir a interação do HLA-G dimérico recombinante

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135/146 com o antígeno ILT4 acoplado a esferas ou expresso por células CHO/ILT4 +.

[371] Os ensaios de bloqueio de ligante baseado em Luminex e de competição usaram antígeno ILT4 humana recombinante acoplado quimicamente às esferas Luminex. No ensaio de bloqueio, as esferas foram préincubadas com uma faixa de doses (0,5-9.000 ng/mL em diluições em série 1: 3) de variantes de hlgG4 do anticorpo anti-ILT4 1E1, 2A6, 2C1 ou 3G7. O antígeno ILT4 ligado às esferas foi então testado quanto à ligação à proteína de fusão solúvel biotinilada HLA-G/Fc a uma concentração de 50 nM. No ensaio de competição de ligante por Luminex, as esferas Luminex acopladas ao antígeno foram pré-incubadas com proteína de fusão solúvel biotinilada HLA-G/Fc a uma concentração de 50 nM antes da titulação da dose (0,5-9.000 ng/mL em diluições seriadas 1: 3) das variantes de hlgG4 do anticorpo anti-ILT4 1E1, 2A6, 2C1 ou 3G7. Em ambas as configurações de ensaio, a interação ILT4: HLA-G foi detectada com um anticorpo anti-estreptavidina-PE e os valores de IC50 foram determinados. Todos os anticorpos testados mostraram bloqueio dependente da dose da ligação do HLA-G aos valores de ILT4/Fc e IC50 acoplados às esferas de Luminex estão resumidos na Tabela 4. Todos os anticorpos testados também mostraram competição dependente da dose com o HLA-G quanto à ligação ao ILT4/Fc acoplado por esfera Luminex (dados não mostrados).

Tabela 4 Ensaio de bloqueio de ligante Luminex

Anticorpo	IC50 (ng/mL)
1E1	19.2
2A6	17.7
2C1	10.2
3G7	40.0

[372] Os ensaios de bloqueio e competição de ligantes baseados em células seguiram um princípio semelhante ao descrito para os ensaios baseados em Luminex e usaram uma linhagem celular CHO/ILT4 para expressão da

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136/146 superfície do antígeno. No ensaio de bloqueio, as células foram pré-incubadas com o anticorpo testado usando uma faixa de doses de 1-20.000 ng/mL em diluições seriadas 1: 3. Os antígenos de ILT4 foram então testados quanto à ligação à proteína de fusão solúvel biotinilada HLA-G/Fc a uma concentração de 5 pg/mL. O ensaio de competição usou uma configuração reversa. As células foram pré-incubadas com proteína de fusão biotinilada solúvel HLA-G/Fc a uma concentração de 5 pg/mL antes da adição de titulações de dose do anticorpo testado em uma faixa de 1-20.000 ng/mL em diluições seriadas 1: 3. ILT4: A interação HLA-G foi detectada com um anticorpo anti-estreptavidina-PE. Todos os anticorpos testados mostraram bloqueio dependente da dose de ligação a HLA-G a ILT4 expresso em CHO e valores IC50 estão resumidos na Tabela 5. Todos os anticorpos testados também mostraram competição dose-dependente com HLA-G para ligação ao ILT4 expresso por CHO (dados não mostrados).

Tabela 5 Ensaio de bloqueio de ligantes baseados em células

Anticorpo	IC50 (ng/mL)
1E1	98.4
2A6	232.6
2C1	56.1
3G7	374.3

Bloqueio de ligantes não-HLA-G MHC classe 1 de ligação a transfectantes de células T ILT4 3A9 com plEl (Gl) [373] Transfectantes de células T ILT4 3A9 foram pré-tratados com controle do isotipo plEl (Gl) ou hlgGl em várias doses, seguidos de tratamento com uma concentração fixa de tetrâmeros HLA-F ou CDld marcados com fluorocromo ou HLA-A02: 01 ou HLA * B7: 02 dexâmeros para avaliar a capacidade de plEl (Gl) em bloquear ligantes não-HLA-G MHC classe I. A ligação de HLA-A, HLA-B e HLA-F a ILT4 foi inibida por plEl (Gl) de forma titulável por dose (Figura 4), indicando a capacidade de plEl (Gl) bloquear outros ligantes

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MHC de classe I relatados.

Bloqueio de ligação de ANGPTL aos transfectantes de células T ILT4 3A9 com P1E1 (Gl) [374] Recentemente, foi relatado que proteínas do tipo angiopoietina (ANGPTL) se ligam a ILT4 expresso por células-tronco hematopoiéticas humanas (Zheng et al., Nature. 2012 May 30;485(7400):656-60 e Deng et al. Blood. 2014 Aug 7;124(6):924-35). Para testar se o plEl (Gl) poderia bloquear a ligação do membro da família ANGPTL ao ILT4, as proteínas ou fragmentos de proteínas disponíveis no mercado foram adquiridos e testados quanto à ligação a transfectantes de células T ILT4 3A9 que foram pré-tratados com plEl (Gl). Os dados de ligação indicam que ANGPTL1, 4 e potencialmente 7 podem se ligar ao ILT4 e não às células de controle de vetores na concentração de proteína testada. O plEl (Gl) foi capaz de bloquear completamente a ligação da proteína ANGPTL em uma dose saturante (Figura 5).

Ligação por Especificidade da Família ILT de 1E1 (G4) a Transfectantes de Células T ILT 3A9 Humanas [375] A ligação por especificidade da família ILT de 1E1 (G4) a membros da família ILT humana foi avaliada por citometria de fluxo com base em células, usando linhagens de células T 3A9 transfectadas para expressar ILT4 humana, ILT2, ILT3 (duas variantes), ILT5, LILRB5, LILRA1, LILRA2, ILT7 , ILT8 ou ILT11. 1E1 (G4) ligou especificamente ILT4 humana e não teve reatividade cruzada com nenhum outro membro da família ILT testado (Figuras 6A e 6B).

Exemplo 3: Bioatividade de anti-ILT4 mAb 1E1 em células primárias e manipuladas

Ensaios baseados na capacidade de 1E1 (G4), 2A6, 2C1 e 3G7 para reverter a supressão de interleucina 2 em células ILT4 3A9 projetadas- [376] Um anticorpo anti-CD3 foi usado para estimular as células T 3A9 de

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138/146 rato de controle, resultando em um aumento da liberação de IL-2. Por outro lado, os transfectantes de células T ILT4 3A9 não conseguiram expressar IL-2 na presença de estimulação de CD3, possivelmente devido à reatividade cruzada com ILT4 com moléculas de MHC classe I de camundongo ou através de um xenoligante desconhecido. Essa interação parece levar à multimerização/ativação espontânea do receptor ILT4, resultando na supressão da liberação de IL-2 mediada por anti-CD3. Consequentemente, os anticorpos que funcionalmente se ligam à ILT4 e bloqueiam a interação da ILT4 com o xeno-ligante (s) e/ou inibem a multimerização do receptor devem restaurar a liberação da IL.

[377] 1E1 (G4), 2A6, 2C1 e 3G7 foram testados quanto à mediação de liberação de IL-2 de transfectantes de células T 3A9 de rato ILT4. 1E1 (G4), 2A6, 2C1 ou 3G7 foi adicionado aos transfectantes de células T 3A9 de rato ILT4 + e a liberação de IL-2 foi medida fotometricamente por ELISA após 24 horas de estimulação celular mediada por anti-CD3. A curva de resposta à dose representativa de 1E1 (G4) é mostrada na figura 7. Os valores de ECso dos anticorpos testados foram determinados a partir das curvas de resposta à dose e mostradas na Tabela 6.

Tabela 6 Ensaio de repressão da IL-2

Anticorpo	EC50 (gg/mL)
1E1	0.43
2A6	1.2
2C1	0.24
3G7	0.26

Ensaio de degranulação de células de camundongo WTMC (mastócito do tipo selvagem) (somente qualitativo) [378] plEl (G4) e 1E1 (G4) foram testados quanto ao resgate de degranulação de mastócitos dependente de ILT4: HLA-G. Os mastócitos WTMC de camundongo foram transfectados com ILT4 humana e estimulados com anticorpo ligado à placa criado contra CD200RLa. A reticulação mediada por

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139/146 anticorpos de CD200RLa levou à degranulação de mastócitos pela ativação de padrões ITAM encontrados no domínio intracelular de CD220RLa. A desgranulação pode ser medida colorimetricamente analisando a liberação do conteúdo de grânulos nos sobrenadantes do ensaio. Na presença de tetrâmero HLA-G ligado à placa, a degranulação de mastócitos mediada por CD200RLa foi inibida em transfectantes de ILT4. O pré-tratamento de transfectantes de ILT4 WTMC com plEl (G4) ou 1E1 (G4) antes da estimulação com anti-CD200RLa ligado à placa e tetrâmero HLA-G reverteu a inibição da degranulação de maneira titulável por dose (Figura 8).

Efeito de 1E1 (G4) na secreção de citocinas derivadas de mielóides por células mononucleares primárias de sangue periférico humano (PBMC)

Avaliação de 1E1 (G4) em ensaios de estimulação primária PBMC LPS humana [379] Foi relatada a expressão de TNFot, uma citocina pró-inflamatória derivada de protótipo mielóide, expressa por monócitos que expressam baixos níveis de ILT4 quando estimulados com LPS. Monócitos com alta expressão de ILT4 não expressaram tanto TNFot, e a falta de expressão de ILT4 foi considerada uma marca de monócitos isolados de pacientes com artrite psoriática (Bergamini et al., PLoS One. 2014 Mar 27;9(3):e92018). A expressão de ILT4 em monócitos pode inibir a atividade efetora de células mielóides e antagonizar a indução de citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, TNFot) na presença de estímulos próinflamatórios (por exemplo, LPS). Como tal, PBMCs inteiros isolados de doadores humanos saudáveis foram tratados com LPS e a capacidade do antagonismo de ILT4 para aumentar a expressão de citocinas mielóides pró-inflamatórias foi avaliada com 1E1 (G4). As figuras 9A e 9B mostram dados de um dos três experimentos, com 3 doadores cada, demonstrando que 1E1 (G4) melhorou a expressão dependente de LPS de GM-CSF e TNFot (ambas citocinas derivadas de

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140/146 mielóides) de uma forma titulável por dose.

[380] Avaliação de 1E1 (G4) em ensaios de estimulação com PBMC antiCD3 humano primário [381] Para avaliar se o tratamento 1E1 (G4) poderia melhorar a expressão de citocinas efetoras de células T ou mielóides na presença de um estímulo subótimo de células T, PBMCs inteiras isoladas de doadores humanos saudáveis foram tratadas com anti-CD3 para induzir a proliferação de células T, e a capacidade do antagonismo de ILT4 para modificar a expressão de citocinas foi avaliada com 1E1 (G4). As Figuras 10A e 10B mostram dados de um dos três experimentos , com 3 doadores cada, demonstrando que 1E1 (G4) melhorou a expressão dependente de anti-CD3 de GM-CSF e TNFot de maneira titulável por dose.

Exemplo 4: Eficácia antitumoral de anticorpos anti-ILT4 no modelo de tumor SK-MEL-5 de camundongo humanizado

Eficácia antitumoral de 1E1, 2A6, 2C1 e 2D5 no modelo de tumor humanizado em ratos [382] Os anticorpos 1E1, 2A6, 2C1 e 2D5 foram testados em um ensaio de regressão tumoral in vivo. Camundongos humanizados (camundongos NSG reconstituídos com células-tronco hematopoíticas humanas para estabelecer a constituição de células imunes humanas) foram inoculados com 1x106 células de melanoma SKMEL5 (HLA classe A * 02: 01) e o crescimento do tumor foi monitorado até um tamanho médio de 150 mm³ após aproximadamente 35 dias foi observado. Sete grupos aleatórios de camundongos, cada um contendo seis animais, receberam por via subcutânea a administração de anticorpo de controle de isotipo (hlgGl + hlgG4, 20 mg/kg de cada) ou 20 mg/kg de um dos seguintes anticorpos anti-ILT4: lEl-lgGl, lEl-lgGl (N297Q) (Mutante nulo de Fc), 1E1lgG4, 2A6-lgG4, 2Cl-lgG4, e 2D5-lgG4. Os ratos receberam doses a cada sete dias

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141/146 (dias 35, 42 e 49; total de três doses) e o tamanho do tumor foi medido até o dia 63. Os resultados indicaram comprometimento do crescimento tumoral em camundongos tratados com 1E1 (IgGl, IgGl- (N297Q), lgG4), 2A6-lgG4 e 2D5lgG4 em comparação com animais dosados com o controle de isotipo (Figura 17). Por outro lado, camundongos tratados com controle de isotipo ou candidato anti-ILT4 2C1 falharam em demonstrar crescimento prejudicial do tumor.

Eficácia antitumoral de plEl (G4) no modelo de tumor humanizado em camundongo [383] Um modelo de tumor humanizado em camundongo foi desenvolvido para testar a eficácia in vivo de plEl (G4) na inibição do crescimento tumoral. Camundongos NSG imunodeficientes foram reconstituídos com células-tronco hematopoiéticas humanas. Depois que os camundongos foram confirmados como portadores de células imunes CD45 + humanas periféricas (> 25% das PBMCs), eles foram inoculados com células tumorais SKMEL-5, uma linhagem tumoral derivada de melanoma da pele humana. Essas células foram selecionadas por sua expressão genética de HLA-G. Após a inoculação, os tumores foram deixados crescer para um tamanho aproximado de 150 mm³. Os camundongos foram randomizados em grupos e desafiados com o controle do isotipo hlgG4 ou com o plEl (G4).

[384] Os ratos tratados com plEl (G4) apresentaram inibição do crescimento de tumores ao longo do estudo (Figura 11A). Uma regressão completa e uma regressão parcial foram observadas com plEl (G4) (Figura 11C).

Eficácia antitumoral de 1E1 (G4) no modelo de tumor humanizado em camundongo [385] A atividade antitumoral de 1E1 (G4) foi testada no modelo de tumor humanizado SK-MEL-5 de camundongo. Neste modelo, os camundongos NSG imunodeficientes (NOD.Cg-Prkdcscid H2rgtmlWjl/SzJ) são irradiados e injetados com células-tronco CD34 + hematopoiéticas humanas isoladas de sangue do

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142/146 cordão umbilical. Após vários meses de enxerto, as células imunes humanas podem ser detectadas no sangue de ratos. Os camundongos foram então implantados por via subcutânea (SC) com a linhagem celular SK-MEL-5 derivada de melanoma humano.

[386] Para este estudo, camundongos NSG transplantados às 3 a 4 semanas de idade com células CD34 + derivadas de sangue do cordão umbilical humano de 3 doadores separados foram injetados SC com 1 x 106 células SKMEL-5 com aproximadamente 20 semanas de idade. Camundongos NSG humanizados portadores de tumores SK-MEL-5 foram divididos em 2 grupos de tratamento com 6 camundongos por grupo (3 camundongos de cada coorte de doadores CD34 + humanos por grupo de tratamento) quando o tamanho médio do tumor foi de aproximadamente 100 mm³, 21 dias após a inoculação do tumor (randomização de tumor DO ). Camundongos portadores de tumor foram injetados SC com 20 mg/kg de 1E1 (G4) ou um mAb de controle de isotipo hlgG4 a cada 7 dias por 4 doses. Os volumes tumorais foram monitorados a cada 7 dias após o início do tratamento.

[387] A eficácia antitumoral no grupo de tratamento 1E1 (G4) foi significativamente maior que o grupo controle de isotipo (p < 0,001 do dia 28 ao dia 49) (Figuras 12A). O peso final do tumor em camundongos tratados com 1E1 (G4) foi menor do que em camundongos tratados com isotipo (Figura 12C). No geral, os resultados revelaram eficácia antitumoral significativa de 1E1 (G4) a 20 mg/kg no modelo de tumor humanizado SK-MEL-5 de camundongo. Não foi observado efeito no peso corporal (Figura 12B) e no peso esplênico (Figura 12D) com o tratamento 1E1 (G4).

Exemplo 5: Ligação do haplótipo ILT4 de 1E1 (G4) a transfectantes de células T ILT 3A9 humanas [388] Dados de polimorfismo de nucleotídeo único de fontes

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143/146 publicamente disponíveis (Fase 3 de Projeto Genômico 1K) foram usados para determinar frequências alélicas de ILT4 para populações africanas, européias, asiáticas e do sul da Ásia. Sequências para haplótipos que foram expressas com uma prevalência de 5% ou mais em qualquer população (haplótipos 1, 2, 5, 7, 9 e 10 na Tabela 7) foram determinadas e expressas em células T 3A9. 1E1 (G4) ligou todos os haplótipos testados usando doses saturantes do anticorpo (Figura 13). O haplótipo 2 correspondeu à sequência de consenso relatada em Uniprot. O haplótipo 5 foi utilizado em ensaios funcionais e baseados em ligantes. Os dados de ligação entre haplótipos indicam que 1E1 (G4) liga todas as principais variantes alélicas testadas.

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Tabela 7. Frequências de haplótipos para ILT4 em populações humanas

	rs373032	rs386056	rs7247538	rs7247451	rsll28646
p.Glul61Asp	p.Val235Met	p.His300Tyr	p.Cys306Trp	p.Arg322His	Frequências de haplótipos por etnia
Haplótipo		c.483A>T	c.703G>A	C.898OT	C.918OG	c.965G>A	TOTAL	AFRICANA	EUROPÉIA	ASIÁTICA	SUL DA ÁSIA
1	ATGGC	D	M	H	C	II·	0.23	0.09	0.15	0.60	0.15
2	TCGGC	E	V	H	II·	II·	0.14	0.04	0.22	0.08	0.28
3	ATAGC	D	M	Y	c	R		0.03
4	TCGCC	E	M	H	w	R			0.02
5	ACACT	D	V		w	II·	0.30	0.17	0.58	0.08	0.37
6	ACACC	D	V	Y	w	R	0.02	0.04			0.02
7	ACGCT	II·	II·	IIIIIIIIMSiSiSi	w	H	0.02	0.06
8	ACGGT	II·	II·	II·	c	H		0.02
9	ACGCC		\|J·	II·	w	R	0.02			0.01	0.11
10	ACGGC	II·	II·	II·	c	II·	0.23	0,54		0.20	0.06
f(SNP)		0.80	0.24	0.45	0.46	0.46

[389] *0s haplótipos para cada população foram baseados nos dados da fase 3 do projeto do genoma 1000 e foram determinados usando o PLINK para analisar SNPs não-sinônimos, listados no banco de dados EXAC.

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Exemplo 6: Expressão de RNA de ILT4 em tipos de tumores e células com base em bancos de dados TCGA e Blueprint [390] A expressão de ILT4 entre tipos de tumores e populações de células foi determinada usando conjuntos de dados RNAseq disponíveis ao público, através da Omicsoft (Qiagen, Cary, NC). O conjunto de dados TCGA (TCGA_B38_20171002_v4, https://gdc-portal.nci.nih.gov/) é composto por 11.292 amostras com dados de sequência de RNA. 0 conjunto de dados do Blueprint (Blueprint_B38_20170216_v2, http://www.blueprint-epigenome.eu/) é composto por 258 amostras de sangue normal de 55 tipos de células com dados de RNA. Os tipos de tumor com maior expressão de ILT4, no nível do RNA, incluem LAML (isto é, AML), DLBC (isto é, DLBCL), TGCT, MESO, KIRC (Figura 14A). Os tipos de células com maior expressão de ILT4, no nível do RNA, incluem neutrófilos, monócitos, osteoclastos, eosinófilos, macrófagos e células dendríticas (Figura 14B). Os linfócitos apresentaram baixa ou nenhuma expressão de ILT4, neste conjunto de dados. FPKM de 1 (ou L0G2 (FPKM + 0,1) de 0) é o limiar fixo heurístico mais amplamente aceito, embora valores mais baixos de FPKM possam relatar genes de baixa expressão em uma amostra.

Exemplo 7: Ligação de 1E1 (G4) a células mielóides de amostras de histocultura de tumor [391] As histoculturas foram preparadas a partir de amostras de tumor humano fresco (ressecções cirúrgicas) e foram tratadas com anti-RSV (controle de isotipo) ou 1E1 (G4) a 20 pg/mL por 18-24horas a 37²C. Após o tratamento, as fatias do tumor foram digeridas em suspensões de células únicas e coradas para FACS. Gráficos de pontos e gráficos de contorno representam dados FACS de suspensões de célula única de histocultura de tumor RCC (Figura 15A) ou CRC (Figura 15B). O total de células mielóides pode ser subdividido em quatro subconjuntos, com base na expressão de CD66b e/ou CD14. Esses quatro

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146/146 subconjuntos mieloides foram analisados simultaneamente quanto à expressão de ILT4, usando um anti-ILT4-PE comercial não de competição (BioLegend, cat # 338706, San Diego, CA) e 1E1 (G4) ligado à superfície celular, usando um anticorpo anti-lgG4 secundário. Foi observada boa correlação entre as células ILT4 + e as células 1E1 (G4) + nas histoculturas tratadas com 1E1 (G4). Observouse linfócitos infiltrantes de tumor como ILT4- e 1E1 (G4) - nessas amostras.

[392] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas na presente invenção. De fato, o escopo da presente invenção inclui modalidades especificamente estabelecidas na presente invenção e outras modalidades não especificamente estabelecidas na presente invenção; as modalidades especificamente estabelecidas neste documento não se destinam necessariamente a ser exaustivas. Várias modalidades da invenção, além das descritas , se tornarão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição anterior Tais modificações devem se enquadrar no escopo das reivindicações.

[393] Patentes, pedidos de patente, publicações, descrições de produtos e protocolos são citados ao longo deste pedido, cujas divulgações são incorporadas na presente invenção por referência em sua totalidade para todos os fins.

Listagem de Sequências [394] A presente especificação está sendo depositada com uma cópia em formato legível por computador (CRF) da Listagem de Sequências. O CRF intitulado 24443_PCT_SEQLIST.txt, que foi criado em 22 de março de 2018 e tem 128.042 bytes de tamanho, é incorporado na presente invenção por referência em sua totalidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

(1) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo:

CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16),

CDR-H2: EINHXGSTNYNPSLKS em que X é S ou A (SEQ ID NO: 17), e

CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e, um domínio variável de cadeia leve compreendendo:

CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19),

CDR-L2: GX1X2NRPS, em que Xi é N, Q, E ou D e X₂ é S ou A (SEQ ID NO: 20), e

CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21);

1. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos em um epítopo do receptor semelhante à imunoglobulina 4 (ILT4) humana selecionado do grupo que consiste em LYREKKSASW (SEQ ID NO: 59), TRIRPEL (SEQ ID NO: 60 ), NGQF (SEQ ID NO: 61) e HTGRYGCQ (SEQ ID NO: 62) e protege o epítopo da troca de deutério na presença de uma fonte de deutério.
(2) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 71;

(2) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4;

(2) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo:

CDR-H1: SYAIS (SEQ ID NO: 22),

CDR-H2: GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 23), e

CDR-H3: YFX1X2SGWYKGGAFDI, em que Xi é D ou S e X₂ é S ou A (SEQ ID NO: 24); e, um domínio variável de cadeia leve compreendendo:

CDR-L1: TLRSGINVDTYRIH (SEQ ID NO: 25),

CDR-L2: YKSDSDKHQGS (SEQ ID NO: 26), e

CDR-L3: AIWYSSTWV (SEQ ID NO: 27);

2/12

2. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 1, em que o epítopo de ILT4 é LYREKKSASW (SEQ ID NO: 59).
(3) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 72;

(3) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 5;

3/12

CDR-H3: VGEWIQLWSPFDY (SEQ ID NO: 30); e, um domínio variável de cadeia leve compreendendo:

CDR-L1: RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 31),

CDR-L2: AASSLQS (SEQ ID NO: 32), e

CDR-L3: QQYNSYPPT (SEQ ID NO: 33); ou (4) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo:

CDR-H1: ELSMH (SEQ ID NO: 34),

CDR-H2: GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID NO: 35), e

CDR-H3: AGPLYTIFGVVIIPDNWFDP (SEQ ID NO: 36); e, um domínio variável de cadeia leve compreendendo:

CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 37),

CDR-L2: GNSNRPS (SEQ ID NO: 38), e

CDR-L3: QSYDSSLSGSGVV (SEQ ID NO: 39).

(3) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo:

CDR-H1: SYAMH (SEQ ID NO: 28),

CDR-H2: VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 29), e

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3. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 1, em que o epítopo de ILT4 é TRIRPEL (SEQ ID NO: 60).
(4) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 73;

(4) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 6;

4/12

ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 11, 13, 15 ou 45 e/ou uma imunoglobulina de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1, 2, 8, 9, 10, 12, 14, 44, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 ou 86.

4. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 1, em que o epítopo de ILT4 é NGQF (SEQ ID NO: 61).
(5) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de

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(5) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7;

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5/12

5. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 1, em que o epítopo de ILT4 é HTGRYGCQ (SEQ ID NO: 62).
(6) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70;

6/12 (6) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3;

6. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compete com um anticorpo de referência para ligação a um epítopo de ILT4 humana selecionado do grupo que consiste em LYREKKSASW (SEQ ID NO: 59), TRIRPEL (SEQ ID NO: 60), NGQF (SEQ ID NO : 61) e HTGRYGCQ (SEQ ID NO: 62), em que o anticorpo de referência compreende uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7.
(7) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 64; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74;

(7) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8 ou 82; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11;

7. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 6, em que o epítopo de ILT4 é LYREKKSASW (SEQ ID NO: 59).
(8) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 65; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74;

8/12 aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58;

(8) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 9 ou 83; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11;

8. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 6, em que o epítopo de ILT4 é TRIRPEL (SEQ ID NO: 60).

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9/12 aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 75; ou (11) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 76.

(9) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 66; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74;

(9) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10 ou 84; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 11;

9. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 6, em que o epítopo de ILT4 é NGQF (SEQ ID NO: 61).
10/12 modificada ou glicanos ligados a N de CHO.

(10) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 67; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de

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(10) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 12 ou 85; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 13; ou (11) uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de

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10. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 6, em que o epítopo de ILT4 é HTGRYGCQ (SEQ ID NO: 62).
11/12 ao sujeito humano.

11. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à ILT4 humano, compreendendo:
12/12 pesada compreende ainda a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 89.

12. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 11, compreendendo:

um domínio variável de cadeia pesada compreendendo:

CDR-H1: GYYWS (SEQ ID NO: 16),

CDR-H2: EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), e

CDR-H3: LPTRWVTTRYFDL (SEQ ID NO: 18); e, um domínio variável de cadeia leve compreendendo:

CDR-L1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 19),

CDR-L2: GDSNRPS (SEQ ID NO: 52), e

CDR-L3: QSFDNSLSAYV (SEQ ID NO: 21)
13. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 11, compreendendo:

uma imunoglobulina de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ

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14. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 11, compreendendo:

uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo um domínio variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70, 71, 72, 73, 58, 74, 75, 76 ou 77, e/ou uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo um domínio variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63, 57, 64, 65, 66, 67, 68 ou 69.
15. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 11, compreendendo:

uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 11, 13, 15 ou 45; e/ou uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1, 2, 8, 9, 10, 12, 14, 44, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, ou 86.
16. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 11, compreendendo:

um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70, 71, 72, 73, 58, 74, 75, 76 ou 77 e/ou um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63, 57, 64, 65, 66, 67, 68 ou 69.

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17. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 11, compreendendo:

(D uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 79; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3;
18. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 11, compreendendo:

(D um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 70;
19. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 11, compreendendo:

um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58.
20. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 11, compreendendo:

uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7.
21. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da reivindicação 11, compreendendo:

uma imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 80; e uma imunoglobulina de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7.
22. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado com glicanos ligados a N de levedura

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23. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer das reivindicações 1 a 22.
24. A composição farmacêutica da reivindicação 23, compreende ainda um agente terapêutico.
25. A composição farmacêutica da reivindicação 23 ou 24, compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
26. Um polinucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica um VH, um VL, ambos um VH e um VL, uma imunoglobulina de cadeia pesada, uma imunoglobulina de cadeia leve, ou ambos uma imunoglobulina de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21.
27. Um vetor, compreendendo o polinucleotídeo da reivindicação 26.
28. Uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo da reivindicação 26 ou o vetor da reivindicação 27.
29. Um método para bloquear a ligação de ILT4 a HLA-G, HLA-A, HLA-B e/ou HLA-F em um sujeito humano em necessidade do mesmo, compreendendo administração ao sujeito humano de uma quantidade eficaz do anticorpo ou de fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 22.
30. Um método para tratamento de câncer em um sujeito humano em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito humano de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 22.
31. O método da reivindicação 29 ou 30, compreendendo ainda a realização de um procedimento terapêutico e/ou a administração de um agente terapêutico

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32. Um método para produção do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 22, compreendendo cultivar a célula hospedeira da reivindicação 28 para expressar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
33. Um método para produção do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 22, compreendendo expressar o polinucleotídeo da reivindicação 26.
34. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à ILT4 humano, que é um produto do método da reivindicação 32 ou 33.
35. Um método para detecção de um peptídeo de ILT4 ou fragmento do mesmo em uma amostra, compreendendo colocar em contato a amostra com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 22, e a detecção da presença de um complexo entre o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e o peptídeo ILT4 ou fragmento do mesmo; em que a detecção do complexo indica a presença do peptídeo ILT4 ou fragmento do mesmo.
36. Uso do anticorpo ou de fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 22, para o tratamento de câncer.
37. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 22, para uso no tratamento de câncer.
38. Um anticorpo que consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58 e cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57.
39. O anticorpo da reivindicação 38, em que a cadeia leve compreende ainda a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 90 e/ou a cadeia

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40. Um anticorpo que consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7 e cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2.
41. Um anticorpo que consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7 e cada cadeia pesada consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2.
42. Uma composição farmacêutica compreendendo: (i) um anticorpo que consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7 e cada cadeia pesada consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 e (ii) pembrolizumab.