CN110719917A - 抗ilt4抗体和抗原结合片段 - Google Patents

抗ilt4抗体和抗原结合片段 Download PDF

Info

Publication number
CN110719917A
CN110719917A CN201880038297.7A CN201880038297A CN110719917A CN 110719917 A CN110719917 A CN 110719917A CN 201880038297 A CN201880038297 A CN 201880038297A CN 110719917 A CN110719917 A CN 110719917A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
cdr
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880038297.7A
Other languages
English (en)
Inventor
L·A·祖尼加
B·乔伊斯-谢赫
M·布拉努萨
A·C·舒斯特
K·舒尔策
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Sharp and Dohme BV
Agenus Inc
Original Assignee
Eiji Nath Co
Schering Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eiji Nath Co, Schering Corp filed Critical Eiji Nath Co
Publication of CN110719917A publication Critical patent/CN110719917A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了结合ILT4(免疫球蛋白样转录物4)的抗体及其抗原结合片段，以及其与例如抗PD1抗体的组合。还提供了使用其例如用于治疗或预防受试者的癌症的方法；以及制备这样的抗体和片段的方法。

Description

抗ILT4抗体和抗原结合片段
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年04月07日提交的美国临时申请号62/483,019的优先权的权益，该临时申请的公开内容全文通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及与免疫球蛋白样转录物4(ILT4)结合的抗体及其抗原结合片段，以及制备和使用这样的抗体和抗原结合片段(例如治疗疾病如癌症)的方法。
背景技术
肿瘤细胞逃避先天和获得性免疫应答的常用策略与人白细胞抗原(HLA)-G的异常表达相关(Curigliano等，Clin Cancer Res.2013和Gonzalez等，Crit Rev Clin LabSci.2012)。HLA-G可以通过受体结合和/或通过胞啃作用(trogocytosis)和趋化性的削弱而直接抑制免疫细胞功能(Morandi等，Cytokine Growth Factor Review.2014和Lin等，Mol Med.2015)。其在多种肿瘤类型(包括例如结直肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胃癌)中的高表达与晚期疾病阶段、肿瘤侵袭、转移潜能和不良预后相关(Lin等，Mol Med.2015.和Loumange等，Int J Cancer.2014)。转基因小鼠模型中抗体介导的HLA-G功能的阻断已显示抑制肿瘤进展并阻断髓源性抑制细胞(MDSC)的扩增(Loumange等，Int J Cancer.2014.,Lin等，Hum Immunol.2013.和Agaugue等，Blood.2011)。HLA-G与ILT4的结合可以直接抑制单核细胞、树突状细胞和中性粒细胞的功能，从而削弱先天免疫抗肿瘤应答。由ILT4引起的HLA-G与单核细胞之间的相互作用抑制了人单核细胞来源的抗原提呈细胞(APC)的成熟，从而通过Stat3活化降低了MHC II类抗原和共刺激分子的表达(Colonna等，J Immunol.1998；Allan等，J Exp Med.1999和Liang等，Proc Natl SciUSA.2008)。使用人单核细胞来源的树突状细胞(DC)和ILT4转基因小鼠，显示出HLA-G诱导致耐受性APC的发展，髓样DC的成熟/活化中止，而HLA-G对致耐受性DC的诱导是通过破坏MHC II类提呈途径(Ristich等，Eur J Immunol.2005)。
对于不响应T细胞疗法，但可以从组织相关巨噬细胞/MDSC介导的肿瘤耐受(例如，髓样“富”肿瘤)的减轻获益的患者，存在未满足的医疗需求。ILT4阻断将通过在肿瘤微环境中减轻对致耐受性髓样细胞的抑制而满足这一需求，并且与目前的T细胞靶向抗体(例如，抗PD1、抗TIGIT)区分。
发明内容
本发明提供了结合人ILT4的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与选自以下的人ILT4表位中的一个或多个氨基酸残基结合：LYREKKSASW(SEQ ID NO:59)、TRIRPEL(SEQ ID NO:60)、NGQF(SEQ ID NO:61)和HTGRYGCQ(SEQ ID NO:62)。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段保护表位免于与氘源(如D2O)进行氘交换。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段与表位LYREKKSASW(SEQ ID NO:59)中的一个或多个氨基酸残基结合。在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段与表位TRIRPEL(SEQID NO:60)中的一个或多个氨基酸残基结合。在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段与表位NGQF(SEQ ID NO:61)中的一个或多个氨基酸残基结合。在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段与表位HTGRYGCQ(SEQ ID NO:62)中的一个或多个氨基酸残基结合。在另外又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段与选自以下的2、3或4个ILT4表位中的一个或多个氨基酸残基结合：LYREKKSASW(SEQ ID NO:59)、TRIRPEL(SEQ ID NO:60)、NGQF(SEQ IDNO:61)和HTGRYGCQ(SEQ ID NO:62)。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段与表位LYREKKSASW(SEQ ID NO:59)中的一个或多个氨基酸残基结合，并且保护表位免于与氘源(如D2O)进行氘交换。在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段与表位TRIRPEL(SEQ IDNO:60)中的一个或多个氨基酸残基结合，并且保护表位免于与氘源(如D2O)进行氘交换。在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段与表位NGQF(SEQ ID NO:61)中的一个或多个氨基酸残基结合，并且保护表位免于与氘源(如D2O)进行氘交换。在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段与表位HTGRYGCQ(SEQ ID NO:62)中的一个或多个氨基酸残基结合，并且保护表位免于与氘源(如D2O)进行氘交换。在另外又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段与选自以下的2、3或4个ILT4表位中的一个或多个氨基酸残基结合：LYREKKSASW(SEQ IDNO:59)、TRIRPEL(SEQ ID NO:60)、NGQF(SEQ ID NO:61)和HTGRYGCQ(SEQ ID NO:62)，并且保护表位免于与氘源(如D2O)进行氘交换。
本发明还涉及一种抗体或其抗原结合片段，其与本申请公开的任何抗体或其抗原结合片段结合相同的人ILT4表位。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与分别包含如下述所示的重链和轻链氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段结合相同的人ILT4表位：SEQ ID NO:1和3；2和4；2和5；2和6；2和7；2和3；8和11；9和11；10和11；12和13；14和15；79和3；80和4；80和5；80和6；80和7；80和3；82和11；83和11；84和11；85和13；以及86和15。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与分别包含如下述所示的重链可变结构域和轻链可变结构域氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段结合相同的人ILT4表位：SEQ ID NO:63和70；57和71；57和72；57和73；57和58；57和70；64和74；65和74；66和74；67和75；68和76。
本发明还提供了一种抗体或其抗原结合片段，其与本公开内容的抗体或其抗原结合片段竞争结合人ILT4。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与分别包含如下所示的重链和轻链氨基酸序列的抗体或片段竞争结合人ILT4：SEQ ID NO:1和3；2和4；2和5；2和6；2和7；2和3；8和11；9和11；10和11；12和13；14和15；79和3；80和4；80和5；80和6；80和7；80和3；82和11；83和11；84和11；85和13；以及86和15。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与分别包含如下述所示的重链可变结构域和轻链可变结构域氨基酸序列的抗体或片段竞争结合人ILT4：SEQ ID NO:63和70；57和71；57和72；57和73；57和58；57和70；64和74；65和74；66和74；67和75；68和76。
此外，本发明提供了一种结合人ILT4的抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)免疫球蛋白链轻链可变(VL)结构域的互补性决定区-L1(CDR-L1)、互补性决定区-L2(CDR-L2)和互补性决定区-L3(CDR-L3)，其包含SEQ ID NO:3-7、11、13、15或45所示的氨基酸序列；和/或(b)免疫球蛋白链重链可变(VH)结构域的互补性决定区-H1(CDR-H1)、互补性决定区-H2(CDR-H2)和互补性决定区-H3(CDR-H3)，其包含SEQ ID NO:1、2、8-10、12、14、44或79-86所示的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：(1)VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHXGSTNYNPSLKS，其中X是S或A(SEQ ID NO:17)；和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或；VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)，CDR-L2：GX1X2NRPS；其中X1是S或A和X2是N、Q、E或D(SEQID NO:20)；和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)；(2)VH结构域，其包含：CDR-H1：SYAIS(SEQ ID NO:22)；CDR-H2：GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:23)；和CDR-H3：YFX1X2SGWYKGGAFDI；其中X1是D或S和X2是S或A(SEQ ID NO:24)；和/或VL结构域，其包含：CDR-L1：TLRSGINVDTYRIH(SEQ ID NO:25)；CDR-L2：YKSDSDKHQGS(SEQ ID NO:26)；和CDR-L3：AIWYSSTWV(SEQ ID NO:27)；(3)VH结构域，其包含：CDR-H1：SYAMH(SEQ ID NO:28)；CDR-H2：VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:29)；和CDR-H3：VGEWIQLWSPFDY(SEQ ID NO:30)；和/或VL结构域，其包含：CDR-L1：RASQGISSWLA(SEQ ID NO:31)；CDR-L2：AASSLQS(SEQ ID NO:32)；和CDR-L3：QQYNSYPPT(SEQ ID NO:33)；和/或；(4)VH结构域，其包含：CDR-H1：ELSMH(SEQ ID NO:34)；CDR-H2：GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQ ID NO:35)；和CDR-H3：AGPLYTIFGVVIIPDNWFDP(SEQ ID NO:36)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:37)；CDR-L2：GNSNRPS(SEQ ID NO:38)；和CDR-L3：QSYDSSLSGSGVV(SEQ ID NO:39)。
在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)，CDR-L2：GNSNRPS(SEQ ID NO:49)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ IDNO:19)，CDR-L2：GQSNRPS(SEQ ID NO:50)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GESNRPS(SEQ ID NO:51)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GDSNRPS(SEQ ID NO:52)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GNANRPS(SEQ ID NO:53)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GQANRPS(SEQ ID NO:54)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GEANRPS(SEQ ID NO:55)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GDANRPS(SEQ ID NO:56)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GNSNRPS(SEQ ID NO:49)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GQSNRPS(SEQ ID NO:50)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GESNRPS(SEQ ID NO:51)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GDSNRPS(SEQ ID NO:52)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GNANRPS(SEQ ID NO:53)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GQANRPS(SEQ ID NO:54)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GEANRPS(SEQ ID NO:55)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GDANRPS(SEQ ID NO:56)，和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白、或轻链和重链免疫球蛋白两者，其中轻链免疫球蛋白与SEQ ID NO:3、4、5、6、7、11、13、15或45所示的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性，和/或重链免疫球蛋白与SEQID NO:1、2、8、9、10、12、14、44、79、80、81、82、83、84、85或86所示的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白、或轻链和重链免疫球蛋白两者，其中轻链免疫球蛋白包含与SEQ ID NO:70、71、72、73、58、74、75、76或77所示的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的轻链可变结构域，和/或重链免疫球蛋白包含与SEQ ID NO:63、57、64、65、66、67、68或69所示的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的重链可变结构域。
在另外其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白、或轻链和重链免疫球蛋白两者，其中轻链免疫球蛋白包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7、11、13、15或45所示的氨基酸序列；和/或重链免疫球蛋白包含SEQ ID NO:1、2、8、9、10、12、14、44、79、80、81、82、83、84、85或86所示的氨基酸序列。
在仍就另外其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白、或轻链和重链免疫球蛋白两者，其中轻链可变结构域包含SEQ ID NO:70、71、72、73、58、74、75、76或77所示的氨基酸序列，和/或重链可变结构域包含SEQ ID NO:63、57、64、65、66、67、68或69所示的氨基酸序列。
还提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含下组的重链免疫球蛋白和轻链免疫球蛋白中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ IDNO:3所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(2)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(3)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(4)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(5)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(6)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(7)包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(8)(2)包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(9)包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ IDNO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(10)包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(11)包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(12)包含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(13)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(14)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(15)包含SEQID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(16)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(17)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(18)包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(19)包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(20)包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ IDNO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(21)包含SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；或(22)包含SEQ IDNO:86所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
此外，本申请提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含下组的重链可变结构域和轻链可变结构域中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的重链可变结构域；包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(2)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(3)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；包含SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(4)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(5)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(6)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(7)包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的重链可变结构域；包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(8)包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的重链可变结构域；包含SEQ IDNO:74所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(9)包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的重链可变结构域；包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(10)包含SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的重链可变结构域；包含SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的轻链可变结构域；或(11)包含SEQ ID NO:68所示氨基酸序列的重链可变结构域；包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一个优选的实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的VH结构域；和含有SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的VL结构域。
在另一个优选的实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在另外又一个优选的实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在一个实施方式中，抗体由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链含有SEQ IDNO:58所示的氨基酸序列和每条重链含有SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，抗体由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链含有SEQID NO:58所示的氨基酸序列和每条重链含有SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，其中轻链还含有SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列。
在又一个实施方式中，抗体由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链含有SEQID NO:58所示的氨基酸序列和每条重链含有SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，其中重链还含有SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。
在又一个实施方式中，抗体由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链含有SEQID NO:58所示的氨基酸序列和每条重链含有SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，其中轻链还含有SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列和重链还含有SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链含有SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列和每条重链含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，抗体由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链由SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列组成和每条重链由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。
在本发明的一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段是糖基化的，例如用工程化的酵母N-连接聚糖或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞N-连接聚糖糖基化的。在本发明的一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段是抗体。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含本申请公开的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，组合物还包含治疗剂(例如，帕博利珠单抗)。在一些实施方式中，组合物还包含药学上可接受的载体。在其他实施方式中，组合物还包含治疗剂(例如，帕博利珠单抗)和药学上可接受的载体。
在一个实施方式中，药物组合物包含：(i)由两条重链和两条轻链组成的抗体，其中每条轻链由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成和每条重链由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，和(ii)帕博利珠单抗。
本发明还提供了一种多肽(例如，一种分离的多肽)，其包含本申请公开的任意抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链或其可变结构域。例如，在本发明的一个实施方式中，多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-39、44、45、47-58、63-77和79-86。本发明还提供了编码本申请所述的任何多肽的任何多核苷酸(例如，DNA或RNA)。在另一个方面中，提供了一种载体，所述载体包含本申请公开的多核苷酸。本发明还涉及一种宿主细胞(例如，CHO细胞)，所述宿主细胞包含本申请公开的多核苷酸或载体。
本发明提供了一种阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法，例如体外或体内，例如在有需要的受试者(例如，人类受试者)的身体中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本申请公开的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，用于阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法还包括对所述受试者进行治疗程序(例如，抗癌放疗或外科肿瘤切除术)。在一些实施方式中，用于阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法还包括向所述受试者施用治疗剂(例如，帕博利珠单抗)。在其他实施方式中，用于阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法还包括对所述受试者进行治疗程序(例如，抗癌放疗或外科肿瘤切除术)和向所述受试者施用治疗剂(例如，帕博利珠单抗)。
本发明还涉及一种在受试者(例如，人类受试者)中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本申请公开的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，治疗癌症的方法还包括向所述受试者施用治疗程序(例如，抗癌放疗或外科肿瘤切除术)。在一些实施方式中，治疗癌症的方法还包括向所述受试者施用治疗剂(例如，帕博利珠单抗)。在其他实施方式中，治疗癌症的方法还包括对所述受试者进行治疗程序(例如，抗癌放疗或外科肿瘤切除术)和向所述受试者施用治疗剂(例如，帕博利珠单抗)。
本发明还涉及一种生产本发明的抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链(例如，其VH和/或VL)的方法，所述方法包括培养包含编码所述抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的多核苷酸(例如，其中所述多核苷酸在载体中和/或整合至宿主细胞的一条或多条染色体)的宿主细胞(例如，CHO细胞)，以表达所述抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链。
还提供了一种生产本发明的抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链(例如，其VH和/或VL)的方法，所述方法包括：表达编码所述抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的多核苷酸。
一种由所述方法生产的结合人ILT4或其免疫球蛋白链的抗体或其抗原结合片段也是本发明的一部分。
一种用于检测样品中的ILT4肽或其片段的存在的方法也形成了本发明的一部分。所述方法包括将所述样品与本发明的抗体或抗原结合片段接触，并检测所述抗体或抗原结合片段与ILT4肽或其片段之间的复合物的存在，其中检测到所述复合物表明存在所述ILT4肽或其片段。在本发明的一个实施方式中，所述方法在体外进行，例如在受试者的生物样品中，例如手术切片或血样。在另一个实施方式中，所述方法在体内(例如，受试者的身体内)进行。在又一个实施方式中，所述受试者是人。
附图说明
图1。p1E1(G1)与ILT4-His结合的氘标记热图。
图2A和2B显示了人ILT4的晶体结构。图2A描述了在人ILT4的结构上映射的氘标记水平。图2B显示了与HLA-G复合的人ILT4的结构域1和2的晶体结构。显示了ILT4、HLA-G重链和β-2-微球蛋白。显示了人ILT4表位，其具有残基LYREKKSASW(SEQ ID NO:59)、TRIRPEL(SEQ ID NO:60)、NGQF(SEQ ID NO:61)和HTGRYGCQ(SEQ ID NO:62)。
图3A和3B显示了ILT4 HLA-G结合和1E1(G4)阻断。用人ILT4转染的小鼠3A9 T细胞被用Fc阻断来阻断，然后与滴定浓度的1E1(G4)(从27ug/mL开始，1:3稀释)或hIgG4同种型对照(27ug/mL)一起孵育。图3A。使用荧光染料标记的山羊抗人F(ab’)2检测1E1(G4)或hIgG4，并通过流式细胞术进行检测。图3B。在使用1E1(G4)预处理后，细胞与2ug/mL生物素化HLA-Fc或对照Fc(mVISTA-Fc)一起孵育。使用PE缀合的链霉抗生物素蛋白检测Fc结合，并通过流式细胞术进行检测。显示的图代表3次独立实验。IC50和EC50值以这些实验的平均值+/-标准偏差显示。
图4。非-HLA-G MHC I类配体与ILT4的结合和p1E1(G1)阻断。使用滴定浓度的p1E1(G1)(开始于10ug/mL，1:3稀释)或使用hIgG1同种型对照(10ug/mL)预处理使用人ILT4转染的小鼠3A9 T细胞，随后与HLA-F或CD1d的荧光染料标记的四聚体或者HLA*A2:01或HLA*B7:02的荧光染料标记的dexamer一起孵育。通过流式细胞术测定四聚体/dexamer结合，并绘制每一个的平均荧光强度。每个dexamer/四聚体所使用的稀释度/浓度如下：HLA*A2:01-dexPE：1:25；HLA*B7:02-dex FITC：1:25；CD1d-tet PE：1:50；HLA-F-tet PE：1ug/mL。
图5A-5C。ANGPTL结合ILT4和p1E1(G1)阻断。图5A。将生物素化的ANGPTL蛋白与p1E1(G1)或人IgG1一起预孵育20min，每个的终浓度均为20ug/mL。然后，将溶液添加到用人ILT4转染的小鼠3A9 T细胞，然后再孵育30分钟。使用PE缀合的链霉抗生物素蛋白检测ANGPTL结合，并通过流式细胞术进行分析。还加入PE标记的HLA-G四聚体作为阳性ILT4结合/阻断对照。ANGPTL蛋白购自R&D SYSTEMS并生物素化；图5B。用人ILT4转染的小鼠3A9T细胞被用Fc阻断来阻断，然后与20ug/mL p1E1(G1)或hIgG1同种型对照一起孵育。孵育后，使用荧光染料标记的山羊抗人F(ab’)2检测p1E1(G1)或hIgG1，并通过流式细胞术进行分析；图5C。将载体对照3A9 T-细胞作为ANGPTL结合的阴性对照。如(A)中所述处理细胞，除了不使用抗体处理以外。
图6A和6B。ILT家族1E1(G4)结合特异性。将使用来源于Uniprot数据库中公开的共有序列的人ILT家族成员转染的小鼠3A9T细胞用于测试固定剂量10ug/mL下hIgG4同种型对照抗体或1E1(G4)的结合。将载体对照3A9 T细胞作为额外的阴性对照。还显示了与其各自的同种型对照相比可商购ILT-反应性抗体的结合，以展示ILT家族成员的表达。显示的数据代表具有相似结果的两次实验。参见图中嵌入的图例。
图7。使用1E1(G4)从ILT4 3A9 T细胞转染体挽救IL-2释放。在存在开始于27ug/mL并且连续稀释3倍至0.3ug/mL的可溶性1E1(G4)或同种型对照(huIgG4)的情况下，使用与板结合的抗CD3抗体处理用人ILT4转染的小鼠3A9 T细胞。孵育24hr后，移除上清液并通过ELISA对小鼠IL-2进行检测。显示的图代表5次独立实验。EC50值以这些实验的平均值+/-标准偏差显示。
图8。p1E1(G4)和1E1(G4)挽救了ILT4:HLA-G诱导的肥大细胞脱颗粒的抑制。使用人ILT4转染小鼠WTMC肥大细胞，并使用滴定浓度的1E1(G4)、p1E1(G4)或hIgG4同种型对照(开始于10ug/mL，1:3稀释)预处理，随后使用与板结合的抗CD200Rla(克隆DX89；1ug/mL)和与板结合的HLA-G四聚体(0.625ug/mL)刺激。刺激1小时后，通过从肥大细胞收集上清液以使用比色酶法测定β-己糖胺酶(β-hexoseaminidase)的释放来评估脱颗粒。显示的数据代表两次独立的实验，每个数据点有3个技术重复。
图9A和9B。1E1(G4)增强的LPS诱导的促炎性髓性细胞因子的表达。从白细胞减少小室中分离出来自健康患者的全PBMC，并且在存在hIgG4(30ug/mL；空心圈)或1E1(G4)(在图中以“1E1”表示)(30ug/mL至3pg/mL之间；实心圈)的情况下，使用0.25ug/mL LPS处理3天。刺激后，使用Meso Scale Discovery多细胞因子测定试剂盒对上清液中细胞因子的表达((图9A)GM-CSF和(图9B)TNFa)进行测定。每种颜色代表来自个体患者的数据。还显示了没有任何刺激的情况(实心三角)。
图10A和10B。1E1(G4)增强的抗CD3诱导的促炎性髓样细胞因子的表达。(A-B)从白细胞减少小室中分离出来自健康患者的全PBMC，并且在存在hIgG4(30ug/mL；空心圈)或1E1(G4)(在图中以“1E1”表示)(30ug/mL至3pg/mL之间；实心圈)的情况下使用0.01ug/mL抗CD3(HIT3a)处理3天。刺激后，使用Meso Scale Discovery多细胞因子测定试剂盒对上清液中细胞因子的表达((图10A)GM-CSF和(图10B)TNFa)进行测定。每种颜色代表来自个体患者的数据。还显示了没有任何刺激的情况(实心三角)。
图11A-11E。p1E1(G4)处理在人源化小鼠SKMEL5肿瘤模型中导致肿瘤生长抑制。向来自2只不同脐带血供体的CD34+脐带血移植人源化NSG小鼠的左侧肋腹部皮下接种1×106个SKMEL5肿瘤细胞。接种后，使肿瘤生长，将达到平均尺寸150mm3的那些随机分成6组(每只干细胞供体3只，每组共计n＝6)。然后，每5天使用hIgG4同种型对照或p1E1(G4)(均为20mg/kg)攻击小鼠，每周测量肿瘤和体重，直至研究结束。绘制同种型对照和p1E1(G4)处理的小鼠随时间的肿瘤生长。图11A显示两组的平均肿瘤体积(mm3)+/-SD随时间，图11B和11C分别显示同种型对照和p1E1(G4)处理的个体小鼠随时间的肿瘤体积(mm3)。图11D显示了同种型对照或p1E1(G4)处理的个体小鼠随时间的肿瘤重量；图11E显示了还测量了每个治疗组随时间的体重减轻。研究完成后，处死小鼠，收获肿瘤并称重。
图12A-12D表明1E1(G4)处理导致人源化小鼠SK-MEL-5肿瘤模型中的肿瘤生长抑制。图12A显示了1E1(G4)处理的小鼠和IgG4同种型对照处理的小鼠两者随时间的平均肿瘤体积(mm3)+/-SD。图12B显示了两组随时间的体重。图12C显示了同种型对照或1E1(G4)处理的个体小鼠的终点肿瘤重量。图12D显示了同种型对照或1E1(G4)处理的个体小鼠的终点脾脏重量。
图13。ILT4单倍型结合。将用人ILT4等位基因变体转染的小鼠3A9 T细胞用于测试固定剂量10ug/mL下hIgG4同种型对照抗体或1E1(G4)的结合。将载体对照3A9 T细胞作为额外的阴性对照。在表2中解释了单倍型。显示的数据代表具有相似结果的两次实验。
图14A和14B。根据公共数据库的在不同肿瘤类型或细胞类型中的ILT4 RNA表达。图14A描述了根据TCGA数据库在各种肿瘤类型中的ILT4 RNA表达。图14B描述了根据Blueprint数据库在各种细胞类型中的ILT4 RNA表达。
图15A和15B显示了1E1(G4)与来自肾细胞癌(RCC)(图15A)和结直肠癌(CRC)(图15B)肿瘤组织培养样品的髓样细胞的结合。
图16。在中国仓鼠卵巢细胞(CHO N-连接聚糖)和在工程化的酵母细胞(工程化酵母N-连接聚糖)中生产的单克隆抗体的占主导地位的N-连接聚糖。方块：N-乙酰葡糖胺(GlcNac)；圆圈：甘露糖(Man)；菱形：半乳糖(Gal)；三角：岩藻糖(Fuc)。
图17显示了各种抗ILT4抗体在人源化小鼠SK-MEL-5肿瘤模型中的抗肿瘤效力。
具体实施方式
为了让本发明更易于理解，下文中特别地定义了某些技术和科学数据。除非在本文件的其他部分特别地定义，否则本申请中使用的所有其他技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。
如在本申请中所使用的，包括所附的权利要求，除非上下文中另有明示，否则单数形式的单词如“一个/种(a/an)”和“所述/该(the)”包括其相应的复数指代。
“亲和性”指在分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间非共价相互作用总和的强度。如在本申请中所使用的，除非另有明示，否则“结合亲和性”指固有结合亲和性，其反映了结合对(例如，抗体和抗原)成员之间1:1的相互作用。分子X与其伴侣Y的亲和性通常可以由解离常数(KD)表示。亲和性可以由本领域公知的常规方法测量，包括KinExA和Biacore。
如在本申请中所使用的，术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全人抗体和嵌合抗体。
如在本申请中所使用的，除非另有明示，否则“抗原结合部分”指抗体的抗原结合部分，即保留与与全长抗体结合的抗原结合的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗体结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段和个体抗体重链或轻链，以及个体重链或轻链可变区。
“Fab片段”由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。“Fab片段”可以是抗体经木瓜蛋白酶裂解产生的。
“Fc”区含有抗体的两个重链片段，其包含CH1和CH2结构域。两个重链片段通过两个或多个二硫键以及通过疏水性相互作用与CH3结构域结合在一起。
“Fab’片段”含有一条轻链以及一条重链的一部分或片段，其含有VH结构域和CH1结构域，还含有CH1和CH2结构域之间的区域，以使得在两个Fab'片段的两条重链之间可以形成链间二硫键，以形成F(ab')2分子。
“F(ab')2片段”含有两条轻链和两条重链，其含有CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由两个Fab'片段组成，其通过两条重链之间的二硫键连接在一起。“F(ab')2片段”可以是抗体经胃蛋白酶裂解产生的。
“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但是缺乏恒定区。
“分离的抗体”指纯化状态并且在这样的背景下指基本上不含其他生物分子(如核酸、蛋白、脂质、碳水化合物)或其他物质(如细胞碎片和生长培养基)的分子。在通常情况下，术语“分离的”并非旨在指完全不含这样的物质或不含水、缓冲剂或盐，除非其存在的量实质上干扰了如本申请所述结合化合物的实验或治疗用途。
如在本申请中所使用的，术语“单克隆抗体”指基本上均质的抗体的群，即在该群中包含的抗体分子的氨基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突变以外。相比之下，常规(多克隆)抗体制剂通常包含在其可变结构域具有不同氨基酸序列的多种不同抗体，其通常特异性针对不同表位。修饰语“单克隆”表示从基本上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以由首先由Kohler等(1975)Nature 256:495描述的杂交瘤方法制备，或者可以由重组DNA方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。例如，还可以使用Clackson等，(1991)Nature 352:624-628和Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。亦参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731。
术语“全人抗体”指仅包含人免疫球蛋白序列的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞或来源于小鼠细胞的杂交瘤中生产，则全人抗体可以含有小鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。或者，如果在大鼠、大鼠细胞或来源于大鼠细胞的杂交瘤中生产，则全人抗体可以含有大鼠碳水化合物链。类似地，“大鼠抗体”指仅含有大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
在通常情况下，基本“抗体”结构单元包含四聚体。在单特异性抗体中，每个四聚体包含两对相同的多肽链，每对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基末端包含约100至110个或者更多个氨基酸的“可变区”或“可变结构域”，其主要负责抗原识别。重链的羧基末端部分可以限定主要负责效应功能的恒定区。
通常地，将人恒定轻链分类为κ链和λ链。而且，通常将人恒定重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。这些IgG的亚型包括例如IgG1和IgG4。本发明包括包含任何这些恒定轻链和/或重链的抗ILT4抗体和抗原结合片段。
如在本申请中所使用的“可变区”、“可变结构域”、“V区”或“V链”指IgG链的区段，其在不同抗体之间的序列是可变的。抗体的“可变区”指单独或组合的抗体轻链可变区或抗体重链可变区。可以将重链可变区称为“VH”。可以将轻链可变区称为“VL”。通常地，重链和轻链可变区包含三个高变区，亦称为互补性决定区(CDR)，其位于相对恒定的框架区(FR)内。CDR通常通过框架区对齐，从而能够与特定表位结合。在通常情况下，从N端至C端，轻链和重链可变结构域包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常，根据免疫学目的的蛋白序列定义分配每个结构域的氨基酸，Kabat等；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；5th ed.；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat等，(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616；Chothia等，(1987)J Mol.Biol.196:901-917或Chothia等，(1989)Nature 342:878-883。
“CDR”指在抗体VHβ片层框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或者在抗体VLβ片层框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。因此，CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。CDR区是本领域技术人员所熟知的，并且已被例如Kabat定义为抗体可变结构域内最高变的区域。Chothia还将CDR区序列在结构上定义为不是保守的β片层框架部分的那些残基，并且因此能够适于不同构象。这两种术语均是本领域所熟知的。AbM、Contact和IMGT也对CDR区序列进行了定义。还通过对大量结构进行比较确定了标准(canonical)抗体可变区内CDR的位置(Al-Lazikani等，1997,J.Mol.Biol.273:927-48；Morea等，2000,Methods 20:267-79)。由于不同抗体之间高变区内残基的数量是不同的，因而相对于标准位置的其他残基通常在标准可变区编号方案中的残基编号旁边用a、b、c等编号(Al-Lazikani等，同上)。类似地，这种命名法是本领域技术人员熟知的。包括例如Kabat编号和IMGT独特编号系统在内的编号系统之间的关系是本领域技术人员熟知的，并且如下表1中所示。在一些实施方式中，CDR是由Kabat编号系统所定义的。在其他实施方式中，CDR是由IMGT编号系统所定义的。在另外其他的实施方式中，CDR是由AbM编号系统所定义的。在另外其他实施方式中，CDR是由Chothia编号系统所定义的。在另外其他的实施方式中，CDR是由Contact编号系统所定义的。
表1：CDR编号系统之间的关系
Figure BDA0002309705890000221
序列同一性指当对两条序列进行最佳比对时，两条多肽的氨基酸在等价位置相同的程度。
序列相似性包括相同的残基和不相同的生物化学上相关的氨基酸。共有相似性质和可以互换的生物化学上相关的氨基酸在上文讨论。
“保守修饰的变体”或“保守性置换”指使用具有相似特征(例如，电荷、侧链尺寸、亲水性/疏水性、骨架构型和刚性等)的其他氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得通常可以做出这样的变化而不改变蛋白的生物活性。本领域技术人员认识到，在通常情况下，在多肽的非必需区域中的单氨基酸置换基本上不改变生物活性(参见例如，Watson等，(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(4th Ed.))。此外，结构或功能上类似的氨基酸的置换不太可能破坏生物活性。示例性的保守性置换如表2中所示。
表2：示例性的保守性氨基酸置换
原始残基 保守性置换
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys；His
Asn(N) Gln；His
Asp(D) Glu；Asn
Cys(C) Ser；Ala
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp；Gln
Gly(G) Ala
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；His
Met(M) Leu；Ile；Tyr
Phe(F) Tyr；Met；Leu
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr；Phe
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu
如在本申请中所使用的，术语“表位”指抗体或抗原结合片段与之结合的抗原上的区域(area)或区域(region)。本申请公开的抗体或其抗原结合片段与表位的结合指抗体或其抗原结合片段与表位内的一个或多个氨基酸残基结合。
“分离的”核酸分子或多核苷酸指DNA或RNA(例如，基因组的)、mRNA、cDNA、或合成来源或其某种组合，其不与其中分离的多核苷酸见于自然界中的多核苷酸的全部或一部分结合，或者与其在自然界中不连接的多核苷酸连接。出于本公开内容的目的，应当理解的是，“包含(或类似用语)”特定核苷酸序列的“多核苷酸”不包括完整的染色体。除了特定序列以外，“包含”特定核酸序列的分离的多核苷酸可以包含多达十个或甚至多达二十个或更多个其他蛋白或者其部分或片段的编码序列，或者可以包含控制所述核酸序列的编码区表达的可操作地连接的调控序列，和/或可以包含载体序列。
短语“控制序列”指在特定宿主生物中可操作地连接的编码序列的表达所必需的或辅助其表达的多核苷酸序列。适于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。在本发明的一个实施方式中，多核苷酸可操作地连接至启动子，如病毒启动子、CMV启动子、SV40启动子或非病毒启动子或延伸因子(EF)-1启动子；和/或内含子。
当其与另一多核苷酸处于功能关系时，核酸是“可操作地连接的”。例如，如果其表达为参与多肽分泌的前蛋白，则前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接；如果其影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者如果其被定位以便于翻译，则核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。在通常情况下，但并非总是如此，“可操作地连接”指所连接的多核苷酸序列是连续的，并且对于分泌前导序列而言，其是连续的并且在阅读阶段。然而，增强子不必是连续的。连接(linking)是通过在方便的限制性位点进行连接(ligation)来完成。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适配体或接头。
如在本申请中所使用的，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用，并且所有这样的名称均包括子代。因而，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和来源于其的培养物，而与转移的次数无关。还应理解的是，由于有意或无意的突变，使得并非所有子代均具有完全相同的DNA内容物。包括与筛选出其的原始转化细胞具有相同功能或生物活性的突变子代。如果旨在使用不同的名称，则应从上下文中可以清楚地看出。
宿主细胞包括原核和真核宿主细胞，包括哺乳动物细胞。可以将宿主细胞用作表达抗ILT4抗体及其抗原结合片段的宿主。除了其他以外，宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞和HEK-293细胞。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、犬、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系(例如，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、海藻毕赤酵母(Pichia trehalophila)、科克拉马毕赤酵母(Pichia koclamae)、膜状毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、小毕赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、仙人掌毕赤酵母(Pichiaopuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、具柄毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酿酒酵母属、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、勒克氏菌(Chrysosporium lucknowense)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、禾谷镰刀菌(Fusarium gramineum)、菜镰刀菌(Fusarium venenatum)、小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。毕赤酵母属、任何酿酒酵母属、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、任何克鲁维酵母属、白色念珠菌(Candida albicans)、任何曲霉属、里氏木霉(Trichoderma reesei)、勒克霉菌(Chrysosporium lucknowense)、任何镰刀菌属、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。本发明包括任何宿主细胞(例如，CHO细胞或毕赤酵母细胞，例如巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris))，其含有抗ILT4抗体或其抗原结合片段，或含有编码这样的抗体或片段的多核苷酸或含有包含所述多核苷酸的载体。
“治疗”或“治疗”指向具有疾病的一种或多种症状的受试者给予本发明的抗ILT4抗体或其抗原结合片段，抗LIT4抗体和抗原结合片段对其是有效的，例如在治疗患有癌症或感染性疾病的受试者中，或治疗疑似患有癌症或感染性疾病的受试者中，所述药剂对其具有治疗活性。通常地，以“有效量”或“有效剂量”给予抗体或片段，其将在所治疗的受试者或人群中缓解一种或多种症状(例如，癌症或感染性疾病的)，无论是通过诱导减退或消除这样的症状，还是通过抑制这样的症状的进展(例如，以任何临床可测量的程度抑制癌症症状，如肿瘤生长或转移)。可以根据诸如疾病阶段、年龄和患者体重，以及药物在受试者中激发所需应答的能力的因素改变抗体或片段的有效量。
如在本申请中所使用的，“抗ILT4抗体或其抗原结合片段”指结合ILT4的抗体或其抗原结合片段。
本发明包括特异性结合ILT4的本申请所述的抗体及其抗原结合片段。抗体或抗原结合片段与包含给定序列(例如，人ILT4)的多肽“特异性”结合，如果其与包含所述序列的多肽以KD约20nM或更高的亲和性(例如，约17nM、10nM、5nM、1nM、100pM或1pM)结合，但不与缺乏所述序列的蛋白结合的话。例如，与包含人ILT4的多肽特异性结合的抗体或抗原结合片段可以与人ILT4的
Figure BDA0002309705890000261
标记形式结合，但将不与缺乏ILT4序列的其他
Figure BDA0002309705890000262
标记的蛋白结合。
ILT4
在本发明的一个实施方式中，人ILT4的氨基酸序列包含下述氨基酸序列：
Figure BDA0002309705890000271
(SEQ ID NO:40；信号序列用下划线表示)。参见Uniprot登录号Q8N423。
在本发明的另一个实施方式中，人ILT4的氨基酸序列包含下述氨基酸序列，但不含信号序列：
(SEQ ID NO:78)。
在本发明的一个实施方式中，食蟹猴ILT4的氨基酸序列包含下述氨基酸序列：
(SEQ ID NO:43；信号序列用下划线表示)。参见NCBI refseq XP_005590753。
在本发明的一个实施方式中，用于表达ILT4或本申请所示任意其他多肽的信号序列是MTPILMVLICLGLSLGPRTHV(SEQ ID NO:40的氨基酸序列1-21)或MTPIVTVLICLGLSLGPRTHV(SEQ ID NO:43的氨基酸序列1-21)或MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ IDNO:46)。
在本发明的一个实施方式中，本发明的抗ILT4抗体或其抗原结合片段结合ILT4的胞外结构域：
QTGTIPKPTLWAEPDSVITQGSPVTLSCQGSLEAQEYRLYREKKSASWITRIRPELVKNGQFHIPSITWEHTGRYGCQYYSRARWSELSDPLVLVMTGAYPKPTLSAQPSPVVTSGGRVTLQCESQVAFGGFILCKEGEEEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPNRRWSHRCYGYDLNSPYVWSSPSDLLELLVPGVSKKPSLSVQPGPVVAPGESLTLQCVSDVGYDRFVLYKEGERDLRQLPGRQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSECSAPSDPLDILITGQIRGTPFISVQPGPTVASGENVTLLCQSWRQFHTFLLTKAGAADAPLRLRSIHEYPKYQAEFPMSPVTSAHAGTYRCYGSLNSDPYLLSHPSEPLELVVSGPSMGSSPPPTGPISTPAGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGV
(SEQ ID NO:40的氨基酸序列22-461)或其免疫球蛋白融合(例如，IgG1或IgG4)或者在细胞表面上表达的细胞表面跨膜(TM)：QTGTIPKPTLWAEPDSVITQGSPVTLSCQGSLEAQEYRLYREKKSASWITRIRPELVKNGQFHIPSITWEHTGRYGCQYYSRARWSELSDPLVLVMTGAYPKPTLSAQPSPVVTSGGRVTLQCESQVAFGGFILCKEGEEEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPNRRWSHRCYGYDLNSPYVWSSPSDLLELLVPGVSKKPSLSVQPGPVVAPGESLTLQCVSDVGYDRFVLYKEGERDLRQLPGRQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSECSAPSDPLDILITGQIRGTPFISVQPGPTVASGENVTLLCQSWRQFHTFLLTKAGAADAPLRLRSIHEYPKYQAEFPMSPVTSAHAGTYRCYGSLNSDPYLLSHPSEPLELVVSGPSMGSSPPPTGPISTPAGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVVLLLLLLLLLFLILRHRRQGKH
(SEQ ID NO:40的氨基酸序列22-491)。
抗体和抗原结合片段
本发明提供了结合ILT4(在本申请中称为“抗ILT4”)的抗体及其抗原结合片段(例如，全人抗体)，以及所述抗体或其抗原结合片段在治疗或预防疾病中的使用的方法。在一个实施方式中，本发明提供了拮抗性抗LIT4抗体以及所述抗体或其抗原结合片段在治疗或预防疾病中的使用的方法。
在一个方面中，本申请包括本文所述的具有以下一种或多种性质的抗ILT4抗体及其抗原结合片段：
·在LYREKKSASW(SEQ ID NO:59)、TRIRPEL(SEQ ID NO:60)、NGQF(SEQ ID NO:61)和/或HTGRYGCQ(SEQ ID NO:62)中的一个或多个氨基酸残基处结合人ILT4，和/或保护LYREKKSASW(SEQ ID NO:59)、TRIRPEL(SEQ ID NO:60)、NGQF(SEQ ID NO:61)和/或HTGRYGCQ(SEQ ID NO:62)免受氘(例如，D2O)交换，例如通过氢-氘交换质谱所确定的，和/或以基本上如图1所示的热图结合ILT4；
·在结构域1处结合人ILT4(参见，Wilcox等，BMC Structural Biology 2:6(2002))；
·结合人ILT4胞外结构域或在细胞表面上表达的ILT4的TM形式，例如前B细胞、中国仓鼠卵巢细胞、U937细胞或Jurkat JE6细胞。
·计算的pI～7.29(例如，7.29或7.30)；
·实验确定的pI～7.2；
·通过热谱表征，Tm起始>60℃，Tm1～65.2℃和Tm2～78.8℃；
·以约1.7×10-8M的KD结合人ILT4(例如，如通过表面等离子体共振测定的，例如，抗ILT4与多组氨酸标记的人ILT4的结合)；
·Ka＝5.5×105M-1s-1(例如，如通过表面等离子体共振测定的，例如，抗ILT4与多组氨酸标记的人ILT4的结合)；
·Kd＝9×10-3s-1(例如，如通过表面等离子体共振测定的，例如，抗ILT4与多组氨酸标记的人ILT4的结合)；
·阻断HLA-G(例如，Fc融合的HLA-G)与人ILT4(例如，使用ILT4转染并表达ILT4的小鼠3A9 T细胞上的ILT4)的结合，例如，以约0.25毫克/ml(±0.06毫克/ml)的IC50，例如如通过表面等离子体共振测定的；
·阻断HLA-A、HLA-B(例如，HLA-A如HLA*A2:01或HLA-B如HLA*B7:02的荧光染料标记的dexamer)和/或HLA-F(例如，HLA-F的荧光染料标记的四聚体)与ILT4(例如，使用ILT4转染并表达ILT4的小鼠3A9 T细胞上的ILT4)的结合，例如如通过表面等离子体共振测定的；
·阻断ILT4(例如，使用ILT4转染并表达ILT4的小鼠3A9 T细胞上的ILT4)与ANGPTL1、ANGPTL4和/或ANGPTL7(例如，生物素化的ANGPTL蛋白)的结合，例如如通过表面等离子体共振测定的；
·不结合ILT2、ILT3、ILT5、LILRB5、LILRA1、LILRA2、ILT7、ILT8和/或ILT11；
·在ILT4转染的3A9细胞中逆转IL2的ILT4介导的抑制，例如，以0.43毫克/ml(±0.14毫克/ml)的EC50；
·挽救肥大细胞脱颗粒的ILT4:HLA-G诱导的抑制(例如，在存在板结合的HLA-G四聚体的情况下)，例如，其中肥大细胞表达ILT4和CD200RLa，并且被例如用CD200RLa的抗体介导的交联来刺激；
·增强外周血单核细胞(PBMC)的促炎性髓样细胞因子(例如，GM-CSF和/或TNFα)的脂多糖(LPS)诱导表达；
·增强外周血单核细胞(PBMC)的促炎性髓样细胞因子(例如，GM-CSF和/或TNFα)的抗CD3诱导表达；
·在人类或例如在其他哺乳动物如小鼠(例如，免疫缺陷NSG小鼠)中抑制肿瘤生长，所述小鼠是使用人造血干细胞重构，例如其携带外周人CD45+免疫细胞，例如其中所述肿瘤是人皮肤黑色素肿瘤，如来自SKMEL5细胞系；
·在患有肿瘤的受试者(例如，人类受试者)体内减轻巨噬细胞/髓样来源抑制细胞(MDSC)介导的肿瘤耐受性；
·不与食蟹猴ILT4和/或小鼠pirB结合；和/或
·将CD14+人单核细胞和/或CD11B+人粒细胞染色
·与表7中所示的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或全部10种)人ILT4单倍型结合。
抗体1E1(Q1E)重链(IgG4)
重链
Figure BDA0002309705890000311
(SEQ ID NO:1；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)
重链可变结构域
EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLWGRGTLVTVSS
(SEQ ID NO:63)
抗体1E1(Q1E，S54A)重链(IgG4)
重链
Figure BDA0002309705890000312
(SEQ ID NO:2；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)
重链可变结构域
EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHAGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLWGRGTLVTVSS
(SEQ ID NO:57)
抗体1E1重链(IgG1)
重链
Figure BDA0002309705890000313
(SEQ ID NO:44；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)
重链可变结构域
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLWGRGTLVTVSS
(SEQ ID NO:69)
1E1重链CDR
CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)
CDR-H2：EINHXGSTNYNPSLKS其中X是S或A(例如，EINHSGSTNYNPSLKS
或EINHAGSTNYNPSLKS)(SEQ ID NO:17)
CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)
抗体1E1(Q1E)轻链(λ)
轻链
Figure BDA0002309705890000321
(SEQ ID NO:3；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)
轻链可变结构域
ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVL
(SEQ ID NO:70)
抗体1E1(Q1E，S54A)轻链(λ)
轻链
Figure BDA0002309705890000322
(SEQ ID NO:4；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)
轻链可变结构域
ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNANRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVL
(SEQ ID NO:71)
抗体1E1(Q1E，N53Q)轻链(λ)
轻链
Figure BDA0002309705890000331
(SEQ ID NO:5；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)轻
链可变结构域
ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGQSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVL
(SEQ ID NO:72)
抗体1E1(Q1E，N53E)轻链(λ)
轻链
Figure BDA0002309705890000332
(SEQ ID NO:6；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)轻
链可变结构域
ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGESNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVL
(SEQ ID NO:73)
抗体1E1(Q1E，N53D)轻链(λ)
轻链
Figure BDA0002309705890000333
(SEQ ID NO:7；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)轻
链可变结构域
ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGDSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVL
(SEQ ID NO:58)
抗体1E1轻链(λ)
轻链
Figure BDA0002309705890000341
(SEQ ID NO:45；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)
轻链可变结构域
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVL
(SEQ ID NO:77)
1E1轻链CDR
CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)
CDR-L2：GX1X2NRPS；其中X1是N、Q、E或D和X2是S或A(例如，GNSNRPS、GNANRPS、GQSNRPS、GESNRPS或GDSNRPS)(SEQ ID NO:20)
CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)
可以将包含1E1重链和轻链CDR或1E1 VH和VL或1E1重链和轻链(或其变体，例如如本申请所述的)的抗体及其抗原结合片段称为“1E1”。
抗体2A6(Q1E)重链(IgG4)
重链
Figure BDA0002309705890000342
(SEQ ID NO:8；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)重
链可变结构域
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYFDSSGWYKGGAFDIWGQGTMVTVSS
(SEQ ID NO:64)
抗体2A6(Q1E、S102A、M119L)重链(IgG4)
重链
(SEQ ID NO:9；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)
重链可变结构域
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYFDASGWYKGGAFDIWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:65)
抗体2A6(Q1E、D101S、M119L)重链(IgG4)
重链
Figure BDA0002309705890000352
(SEQ ID NO:10；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)
重链可变结构域
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYFSSSGWYKGGAFDIWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:66)
本发明包含抗体及其抗原结合片段，其中SEQ ID NO:8、9、10、64、65或66的残基1是Q而不是E。
2A6重链CDR
CDR-H1：SYAIS(SEQ ID NO:22)
CDR-H2：GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:23)
CDR-H3：YFX1X2SGWYKGGAFDI；其中X1是D或S和X2是S或A(例如，YFDSSGWYKGGAFDI、YFDASGWYKGGAFDI或YFSSSGWYKGGAFDI)(SEQ ID NO:24)
抗体2A6轻链(λ)
轻链
Figure BDA0002309705890000361
(SEQ ID NO:11；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)
轻链可变结构域
QSVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGINVDTYRIHWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKHQGSGVPSRFSGSKDPSANAGILLISGLQSEDEADYYCAIWYSSTWVFGGGTQLTVL
(SEQ ID NO:74)
本发明包含抗体及其抗原结合片段，其中SEQ ID NO:11或74的残基1是E而不是Q。
2A6轻链CDR
CDR-L1：TLRSGINVDTYRIH(SEQ ID NO:25)
CDR-L2：YKSDSDKHQGS(SEQ ID NO:26)
CDR-L3：AIWYSSTWV(SEQ ID NO:27)
可以将包含2A6重链和轻链CDR或2A6 VH和VL或2A6重链和轻链(或其变体，例如如本申请所述的)的抗体及其抗原结合片段称为“2A6”。
抗体3G7(Q1E)重链(IgG4)
重链
Figure BDA0002309705890000362
(SEQ ID NO:12；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)
重链可变结构域
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGEWIQLWSPFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:67)
本发明包含抗体及其抗原结合片段，其中SEQ ID NO:12或67的残基1是Q而不是E。
3G7重链CDR
CDR-H1：SYAMH(SEQ ID NO:28)
CDR-H2：VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:29)
CDR-H3：VGEWIQLWSPFDY(SEQ ID NO:30)
抗体3G7轻链(κ)
轻链
Figure BDA0002309705890000372
(SEQ ID NO:13；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)
轻链可变结构域
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKFLIYAASSLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:75)
3G7轻链CDR
CDR-L1：RASQGISSWLA(SEQ ID NO:31)
CDR-L2：AASSLQS(SEQ ID NO:32)
CDR-L3：QQYNSYPPT(SEQ ID NO:33)
可以将包含3G7重链和轻链CDR或3G7 VH和VL或3G7重链和轻链(或其变体，例如如本申请所述的)的抗体及其抗原结合片段称为“3G7”。
抗体2C1(Q1E)重链(IgG4)
重链
Figure BDA0002309705890000381
(SEQ ID NO:14；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)
重链可变结构域
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAGPLYTIFGVVIIPDNWFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:68)
本发明包含抗体及其抗原结合片段，其中SEQ ID NO:14或68的残基1是用Q代替E。
2C1重链CDR
CDR-H1：ELSMH(SEQ ID NO:34)
CDR-H2：GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQ ID NO:35)
CDR-H3：AGPLYTIFGVVIIPDNWFDP(SEQ ID NO:36)
抗体2C1轻链(Q1E)(λ)
轻链
Figure BDA0002309705890000382
(SEQ ID NO:15；可变结构域用下划线表示；CDR用双下划线表示)
轻链可变结构域
ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGSGVVFGGGTQLIIL
(SEQ ID NO:76)
本发明包含抗体及其抗原结合片段，其中SEQ ID NO:15或76的残基1是Q而不是E。
2C1轻链CDR
CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:37)
CDR-L2：GNSNRPS(SEQ ID NO:38)
CDR-L3：QSYDSSLSGSGVV(SEQ ID NO:39)
可以将包含2C1重链和轻链CDR或2C1 VH和VL或2C1重链和轻链(或其变体，例如如本申请所述的)的抗体及其抗原结合片段称为“2C1”。
在抗体或其抗原结合片段的各种实施方式中，不存在重链免疫球蛋白的C-末端赖氨酸。
因而，在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白，或者轻链和重链免疫球蛋白两者，其中轻链免疫球蛋白包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7、11、13、15或45中所示的轻链免疫球蛋白；和/或重链免疫球蛋白包含SEQ ID NO:1、2、8、9、10、12、14、44、79、80、81、82、83、84、85或86中所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:1或79中所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:2或80中所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:2或80中所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在另外其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:2或80中所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在另外其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:2或80中所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:2或80中所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:8或82中所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:9或83中所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在另外其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:10或84中所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在另外其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:12或85中所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在另外其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:14或86中所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:15中所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在某些其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白，或者轻链和重链免疫球蛋白两者，其中轻链可变结构域包含SEQ ID NO:70、71、72、73、58、74、75、76或77中所示的氨基酸序列，和/或重链可变结构域包含SEQ ID NO:63、57、64、65、66、67、68或69中所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的重链可变结构域；和含有SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和含有SEQ ID NO:71所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和含有SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在另外其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和含有SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在另外其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和含有SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和含有SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的重链可变结构域；和含有SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的重链可变结构域；和含有SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在另外其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的重链可变结构域；和含有SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在另外其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQID NO:67所示氨基酸序列的重链可变结构域；和含有SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在仍就另外其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:68所示氨基酸序列的重链可变结构域；和含有SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一个进一步的实施方式中，结合ILT4的抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白轻链可变(VL)结构域，其含有1E1的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3(例如，SEQ ID NO:19-21)；和免疫球蛋白重链可变(VH)结构域，其含有1E1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3(例如，SEQ ID NO:16-18)。
在一个进一步的实施方式中，结合ILT4的抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白轻链可变(VL)结构域，其含有2A6的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3(例如，SEQ ID NO:25-27)；和免疫球蛋白重链可变(VH)结构域，其含有2A6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3(例如，SEQ ID NO:22-24)。
在一个进一步的实施方式中，结合ILT4的抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白轻链可变(VL)结构域，其含有3G7的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3(例如，SEQ ID NO:31-33)；和免疫球蛋白重链可变(VH)结构域，其含有3G7的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3(例如，SEQ ID NO:28-30)。
在一个进一步的实施方式中，结合ILT4的抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白轻链可变(VL)结构域，其含有2C1的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3(例如，SEQ ID NO:37-39)；和免疫球蛋白重链可变(VH)结构域，其含有2C1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3(例如，SEQ ID NO:34-36)。
在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GNSNRPS(SEQ ID NO:49)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GQSNRPS(SEQ ID NO:50)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GESNRPS(SEQ ID NO:51)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GDSNRPS(SEQ ID NO:52)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GNANRPS(SEQ ID NO:53)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GQANRPS(SEQ ID NO:54)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GEANRPS(SEQ ID NO:55)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GDANRPS(SEQ ID NO:56)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GNSNRPS(SEQ ID NO:49)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GQSNRPS(SEQ ID NO:50)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GESNRPS(SEQ ID NO:51)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GDSNRPS(SEQ ID NO:52)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GNANRPS(SEQ ID NO:53)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GQANRPS(SEQ ID NO:54)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GEANRPS(SEQ ID NO:55)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，其含有：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其含有：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)、CDR-L2：GDANRPS(SEQ ID NO:56)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
本发明还提供了一种抗体或其抗原结合片段，其结合LIT4并且包含抗体1E1的VL结构域(例如，SEQ ID NO:70、71、72、73、58或77)和/或抗体1E1的VH结构域(例如，SEQ IDNO:63、57或69)。
本发明还提供了一种抗体或其抗原结合片段，其结合LIT4并且包含抗体2A6的VL结构域(例如，SEQ ID NO:74)和/或抗体2A6的VH结构域(例如，SEQ ID NO:64、65或66)。
本发明还提供了一种抗体或其抗原结合片段，其结合LIT4并且包含抗体3G7的VL结构域(例如，SEQ ID NO:75)和/或抗体3G7的VH结构域(例如，SEQ ID NO:67)。
本发明还提供了一种抗体或其抗原结合片段，其结合LIT4并且包含抗体2C1的VL结构域(例如，SEQ ID NO:76)和/或抗体2C1的VH结构域(例如，SEQ ID NO:68)。
本发明还提供了一种抗体或其抗原结合片段，其结合LIT4并且包含抗体1E1的轻链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:3、4、5、6、7或45)和/或抗体1E1的重链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:1、2、44、79、80或81)。
本发明还提供了一种抗体或其抗原结合片段，其结合LIT4并且包含抗体2A6的轻链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:11)和/或抗体2A6的重链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:8、9、10、82、83或84)。
本发明还提供了一种抗体或其抗原结合片段，其结合LIT4并且包含抗体3G7的轻链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:13)和/或抗体3G7的重链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:12或85)。
本发明还提供了一种抗体或其抗原结合片段，其结合LIT4并且包含抗体2C1的轻链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:15)和/或抗体2C1的重链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:14或86)。
本发明还提供了一种由两条重链和两条轻链组成的抗体，其中每条轻链含有抗体1E1、2A6、3G7或2C1的VL或轻链免疫球蛋白，和每条重链含有抗体1E1、2A6、3G7或2C1的VH或重链免疫球蛋白。
在一个实施方式中，抗体由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链含有SEQ IDNO:58所示的氨基酸序列和每条重链含有SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，抗体由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链含有SEQID NO:58所示的氨基酸序列和每条重链含有SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，其中轻链还含有SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列。
在又一个实施方式中，抗体由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链含有SEQID NO:58所示的氨基酸序列和每条重链含有SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，其中重链还含有SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。
在又一个实施方式中，抗体由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链含有SEQID NO:58所示的氨基酸序列和每条重链含有SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，其中轻链还含有SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列和重链还含有SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链含有SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列和每条重链含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，抗体由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链由SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列组成和每条重链由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。
在本发明的一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含VL(具有或不具有信号序列)，例如，在SEQ ID NO:58或70-77的任何一个中的VL，其具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保守的或非保守的氨基酸置换；和/或VH(具有或不具有信号序列)，例如，在SEQ ID NO:57或63-69的任何一个中的VH，其具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保守的或非保守的氨基酸置换，同时仍结合ILT4。
本发明还包含多肽，其含有本申请公开的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1-39、44、45、47-58、63-77或79-86，以及多肽，其含有其中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或更多个保守的或非保守的氨基酸置换的这样的氨基酸。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白，或者轻链和重链免疫球蛋白两者，其中轻链免疫球蛋白与SEQ ID NO:3、4、5、6、7、11、13、15或45所示的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性，和/或重链免疫球蛋白与SEQ ID NO:1、2、8、9、10、12、14、44、79、80、81、82、83、84、85或86所示的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白，或者轻链和重链免疫球蛋白两者，其中轻链免疫球蛋白包含轻链可变结构域，其与SEQID NO:70、71、72、73、58、74、75、76或77所示的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性，和/或重链免疫球蛋白包含重链可变结构域，其与SEQ ID NO:63、57、64、65、66、67、68或69所示的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。
在本发明的一个实施方式中，本发明抗ILT4抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白重链与信号序列可操作地连接，例如包含氨基酸序列MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO:41)和/或本发明抗ILT4抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白轻链与信号序列可操作地连接，例如包含氨基酸序列MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(SEQ ID NO:42)。
在本发明的一个实施方式中，本申请所示免疫球蛋白链(例如，重链和/或轻链)的N-末端谷氨酰胺(Q)被焦谷氨酸置换。在一个实施方式中，重链免疫球蛋白的N-末端Q被焦谷氨酸置换。在另一个实施方式中，轻链免疫球蛋白的N-末端Q被焦谷氨酸置换。在又一个实施方式中，重链免疫球蛋白的N-末端Q和轻链免疫球蛋白的N-末端Q被焦谷氨酸置换。
本申请还提供了与本申请公开的任何抗ILT4抗体或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7或2C1)结合相同的ILT4(例如，人ILT4)表位的抗体或抗原结合片段。在一个实施方式中，表位是LYREKKSASW(SEQ ID NO:59)。在另一个实施方式中，表位是TRIRPEL(SEQ IDNO:60)。在又一个实施方式中，表位是NGQF(SEQ ID NO:61)。在又一个实施方式中，表位是HTGRYGCQ(SEQ ID NO:62)。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段与分别包含下述SEQ ID NO所示的重链和轻链氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段结合相同的人ILT4表位：1和3；2和4；2和5；2和6；2和7；2和3；8和11；9和11；10和11；12和13；14和15；79和3；80和4；80和5；80和6；80和7；80和3；82和11；83和11；84和11；85和13；和86和15。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段与包含下述SEQ ID NO所示的重链可变结构域和轻链可变结构域氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段结合相同的人ILT4表位：63和70；57和71；57和72；57和73；57和58；57和70；64和74；65和74；66和74；67和75；68和76。
本发明包括交叉阻断本申请公开的任何抗LIT4抗体或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7或2C1)与ILT4(例如，人ILT4)的结合或者与本申请公开的任何抗LIT4抗体或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7或2C1)竞争结合ILT4(例如，人ILT4)的抗体和抗原结合片段。可以基于在结合测定(例如，生物层干涉法(BLI；例如ForteBio Octet结合测定；Pall ForteBio Corp；Menlo Park,CA)、表面等离子体共振(SPR)、BIACore、ELISA、流式细胞术)中其特异性阻断本申请所示的任何抗体或片段的能力鉴定本申请讨论的交叉阻断抗体及其抗原结合片段。例如，在本发明的一个实施方式中，当使用BLI时，光纤探针的尖端涂有配体(例如，ILT4)并充当生物传感器，其中抗LIT4抗体或抗原结合片段与ILT4的结合改变了从与ILT4和内参层结合的探针层反射的白光干涉图样。该变化指示ILT4/抗ILT4结合。在本发明的一个实施方式中，将ILT4涂覆的尖端浸入例如在96孔板或384孔板的孔中含有抗体或其抗原结合片段分析物的溶液中。在本发明的一个实施方式中，在读取过程中摇动板以产生轨道流。为了读取测定，将白光引导到光纤的长度上。如上所示，尖端的参照层和含有LIT4的固化表面光反射之间的干涉产生独特的光返回到光纤的图样。当分子与固化的传感器表面结合时，图案随结合程度成比例地变化。例如，可以使用下述测定：将ILT4(例如，人ILT4)蛋白固化在BLI探针或板上，使参照抗ILT4抗体或片段结合ILT4(例如，在饱和浓度下)并加入测试抗ILT4抗体或片段。然后，确定测试抗体同参照抗体竞争结合ILT4的能力。在BLI形式中，监测ILT4复合物的光干涉以确定是否测试抗体与参照抗体有效地竞争，例如监测纳米光波长移动随时间的变化情况，其中移动表明测试抗体有附加结合并且缺乏交叉阻断。在本发明的一个实施方式中，在BLI形式中，如果未观察到测试抗体的额外结合，则定性地认为在抗体之间发生了交叉阻断。在本发明的一个实施方式中，作为对照，证实了参照抗体与其自身的交叉阻断；其中如果参照抗体可以交叉阻断其自身与ILT4的结合，则可确定该测定操作正确。测试抗体抑制抗ILT4抗体或片段1E1、2A6、3G7或2C1与ILT4(例如，人ILT4)结合的能力表明，测试抗体能够交叉阻断抗体或片段与ILT4(例如，人ILT4)的结合，并且因此在一些情况下可与1E1、2A6、3G7和/或2C1结合ILT4(例如，人ILT4)上的相同表位。如上文所述，与本发明的任何抗ILT4抗体或片段结合相同表位的抗体和片段也是本发明的一部分。在本发明的一个实施方式中，BLI以双夹心形式进行，其中将参照抗ILT4抗体或抗原结合片段固化在探针上，然后结合ILT4。随后，检测测试抗LIT4抗体或抗原结合片段阻断参照抗体或片段结合的能力。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与分别包含下述SEQ ID NO所示的重链和轻链氨基酸序列的抗体或片段竞争结合人ILT4：1和3；2和4；2和5；2和6；2和7；2和3；8和11；9和11；10和11；12和13；14和15；79和3；80和4；80和5；80和6；80和7；80和3；82和11；83和11；84和11；85和13；和86和15。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与分别包含下述SEQ ID NO所示的重链可变结构域和轻链可变结构域氨基酸序列的抗体或片段竞争结合人ILT4：63和70；57和71；57和72；57和73；57和58；57和70；64和74；65和74；66和74；67和75；68和76。
本发明包括含有N-连接聚糖的抗ILT4抗体及其抗原结合片段，所述N-连接聚糖通常被添加到在中国仓鼠卵巢细胞(CHO N-连接聚糖)或工程化酵母细胞(工程化酵母N-连接聚糖)(例如，毕赤酵母)中生产的免疫球蛋白。例如，在本发明的一个实施方式中，抗ILT4抗体及其抗原结合片段包含图16中所示的一种或多种“工程化酵母N-连接聚糖”或“CHO N-连接聚糖”(例如，G0和/或G0-F和/或G1和/或G1-F和/或和/或G2-F和/或Man5)。在本发明的一个实施方式中，包含工程化酵母N-连接聚糖(即，G0和/或G1和/或G2)的抗ILT4抗体及其抗原结合片段任选地还包含Man5。在本发明的一个实施方式中，包含CHO N-连接聚糖(即，G0-F、G1-F和G2-F)的抗ILT4抗体及其抗原结合片段任选地还包含G0和/或G1和/或G2和/或Man5。在本发明的一个实施方式中，抗ILT4抗体及其抗原结合片段上全部N-连接聚糖的约80％至约95％(例如，约80-90％、约85％、约90％或约95％)是工程化酵母N-连接聚糖或CHON-连接聚糖。参见Nett等，Yeast.28(3):237-252(2011)；Hamilton等，Science.313(5792):1441-1443(2006)；Hamilton等，CurrOpin Biotechnol.18(5):387-392(2007)。例如，在本发明的一个实施方式中，工程化酵母细胞是GFI5.0或YGLY8316或者美国专利号7,795,002或Zha等，Methods Mol Biol.988:31-43(2013)中所示的细胞株。亦参见国际专利申请公开号WO2013/066765。
多核苷酸
本发明包括编码本申请公开的抗ILT4抗体及其抗原结合片段的多核苷酸(例如，DNA或RNA)。例如，本发明包括编码如本申请所公开的抗体1E1、2A6、3G7和2C1的免疫球蛋白重链和/或轻链(例如，SEQ ID NO:1-15、44和45或其可变结构域)的核酸以及与之杂交的核酸。
本发明包括多核苷酸，其编码包含1E1的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗体轻链可变(VL)结构域(例如，包含SEQ ID NO:19-21中所示的氨基酸)；和/或包含1E1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的抗体重链可变(VH)结构域(例如，包含SEQ ID NO:16-18中所示的氨基酸)。
本发明包括多核苷酸，其编码包含2A6的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗体轻链可变(VL)结构域(例如，包含SEQ ID NO:25-27中所示的氨基酸)；和/或包含2A6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的抗体重链可变(VH)结构域(例如，包含SEQ ID NO:22-24中所示的氨基酸)。
本发明包括多核苷酸，其编码包含3G7的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗体轻链可变(VL)结构域(例如，包含SEQ ID NO:31-33中所示的氨基酸)；和/或包含3G7的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的抗体重链可变(VH)结构域(例如，包含SEQ ID NO:28-30中所示的氨基酸)。
本发明包括多核苷酸，其编码包含2C1的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗体轻链可变(VL)结构域(例如，包含SEQ ID NO:37-39中所示的氨基酸)；和/或包含2C1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的抗体重链可变(VH)结构域(例如，包含SEQ ID NO:34-36中所示的氨基酸)。
本发明包括多核苷酸，其编码抗体1E1的VL结构域(例如，SEQ ID NO:70、71、72、73、58或77)和/或抗体1E1的VH结构域(例如，SEQ ID NO:63、57或69)。
本发明包括多核苷酸，其编码抗体2A6的VL结构域(例如，SEQ ID NO:74)和/或抗体2A6的VH结构域(例如，SEQ ID NO:64、65或66)。
本发明包括多核苷酸，其编码抗体3G7的VL结构域(例如，SEQ ID NO:75)和/或抗体3G7的VH结构域(例如，SEQ ID NO:67)。
本发明包括多核苷酸，其编码抗体2C1的VL结构域(例如，SEQ ID NO:76)和/或抗体2C1的VH结构域(例如，SEQ ID NO:68)。
本发明包括多核苷酸，其编码抗体1E1的轻链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:3、4、5、6、7或45)和/或抗体1E1的重链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:1、2或44)。
本发明包括多核苷酸，其编码抗体2A6的轻链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:11)和/或抗体2A6的重链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:8、9或10)。
本发明包括多核苷酸，其编码抗体3G7的轻链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:13)和/或抗体3G7的重链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:12)。
本发明包括多核苷酸，其编码抗体2C1的轻链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:15)和/或抗体2C1的重链免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO:14)。
在一个特定的实施方式中，多核苷酸包含SEQ ID NO:87中所示的核苷酸序列。在另一个特定的实施方式中，多核苷酸包含SEQ ID NO:88中所示的核苷酸序列。在又一个实施方式中，多核苷酸包含SEQ ID NO:87中所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:88中所示的核苷酸序列。
本发明还提供了表达载体，其包含本发明的分离的核酸，其中所述核酸与一个或多个调控序列可操作地连接，例如当宿主细胞被所述载体转染时，其被所述细胞所识别。还提供了宿主细胞，其包含本发明的表达载体。在某些实施方式中，所述宿主细胞是CHO细胞。
制备抗体及其抗原结合片段的方法
可以重组生产本申请公开的抗ILT4抗体和抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)。在该实施方式中，可以将编码一种或多种本发明的抗体和抗原结合片段的免疫球蛋白链(例如，SEQ ID NO:1-15、44、45或79-86的任意一个，或者包含如SEQ ID NO:57、58、63-77的任意一个所示的1E1、2A6、3G7或2C1的VH或VL)的核酸插入载体和/或插入宿主细胞染色体中并在重组宿主细胞中表达。生产重组抗体的多种方法是本领域公知的。
可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体(例如，1E1、2A6、3G7或2C1)。此外，可以使用多种已知技术来增强来从生产细胞系表达本发明的免疫球蛋白链。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下增强表达的常用方法。本发明包括载体，其包含编码一种或多种所述免疫球蛋白链和谷氨酰胺合成酶(GS)基因的一种或多种多核苷酸。在本发明的一个实施方式中，所述载体是在缺乏功能性谷氨酰胺合成酶的宿主细胞中。在本发明的一个实施方式中，宿主细胞是在基本上缺乏谷氨酰胺的培养基中。用于制备一种或多种这样的免疫球蛋白链或抗LIT4抗体或其抗原结合片段的包括在基本上缺乏谷氨酰胺的培养基中培养这样的宿主细胞的方法以及通过这样的方法生产的这样的链、抗体和片段均在本发明的范围内。
在通常情况下，在特定细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有糖基化模式，该模式是在所述细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白的特征。因而，免疫球蛋白链或者含有免疫球蛋白链的抗体或抗原结合片段的特定糖基化模式将取决于用于生产所述抗体的特定细胞系或转基因动物。具有仅包含非岩藻糖基化N-聚糖糖基化模式的抗体和抗原结合片段可以是有利的，因为已发现这些抗体和抗原结合片段通常在体外和体内比其岩藻糖基化对应物显示出更高的有效性(参见例如，Shinkawa等，J.Biol.Chem.278:3466-3473(2003)；美国专利号6,946,292和7,214,775)。具有非岩藻糖基化N-聚糖的这些抗ILT4抗体和抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7或2C1)是本发明的一部分。
本发明还包括本申请公开的抗LIT4抗体的抗体片段(例如，1E1、2A6、3G7或2C1)。抗体片段包括F(ab)2片段，其可以通过例如胃蛋白酶酶切IgG而产生。Fab片段可以通过例如用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab)2产生。Fab片段是通过二硫键连接至VH-CH1链的VL-CL链。F(ab)2片段是两个Fab片段，其依次通过两个二硫键桥连接。F(ab)2分子的Fab部分包括二硫键桥位于其中的Fc区部分。FV片段是VL或VH区。
本发明还包括抗ILT4抗体及其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7或2C1)，其是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别的。在一个实施方式中，抗LIT4抗体或抗原结合片段包含如本申请所示的VH和重链恒定区，例如人恒定区，如γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变体。在本发明的一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含如本申请所示的VH和轻链恒定区，例如人轻链恒定区，如λ或κ人轻链恒定区或其变体。举例来说，并且不限于此，人重链恒定区可以是γ1或γ4以及人轻链恒定区可以是κ。举例来说，并且不限于此，人重链恒定区可以是γ1或γ4以及人轻链恒定区可以是λ。在本发明的一个实施方式中，抗体的Fc区是具有Ser228Pro突变的γ4(Schuurman,J等，Mol.Immunol.38:1-8,2001)。
在本发明的一些实施方式中，可以将不同的恒定结构域附接到来源于本申请提供的CDR的VL和VH区。例如，如果本发明的抗体或抗原结合片段的特定预期用途要求改变效应功能，则可以使用除人IgG1以外的重链恒定域，或者可以使用杂合IgG1/IgG4。这样的抗ILT4抗体及其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7或2C1)以及含有IgG1和IgG4恒定结构域的其杂合物是本发明的一部分。
在一个实施方式中，IgG4恒定结构域与天然人IgG4恒定结构域(Swiss-Prot登录号P01861.1)在EU系统中的位置228和KABAT系统中的位置241对应的位置不同，其中天然Ser108被Pro置换，以阻止Cys 106和Cys 109之间潜在的链间二硫键(对应于EU系统中的位置Cys 226和Cys 229以及KABAT系统中的位置Cys 239和Cys 242)，其能够干扰正确的链内二硫键形成。参见Angal等，(1993)Mol.Imunol.30:105。在其他情况下，可以使用经修饰的IgG1恒定结构域，已对其进行修饰以增加半衰期或降低效应功能。含有经修饰的IgG4恒定结构域的这样的抗ILT4抗体及其抗原结合片段(IgG1和IgG4)是本发明的一部分。
本发明包括用于制备本发明的抗LIT4抗体或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7或2C1)或者其免疫球蛋白链的重组方法，包括(i)引入编码一种或多种抗体或片段的免疫球蛋白链(例如，包含含有SEQ ID NO:1-15、44和/或45中所示的任意一条或多条序列的氨基酸序列)的多核苷酸，例如，其中所述多核苷酸是在载体中和/或与启动子(例如，病毒启动子、CMV启动子或SV40启动子)可操作地连接；(ii)在适于表达所述多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞、真菌宿主细胞、细菌宿主细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞、毕赤酵母细胞或巴氏毕赤酵母细胞)和(iii)任选地，从宿主细胞和/或其中生长宿主细胞的培养基中分离抗体或片段或链。当制备包含一条以上免疫球蛋白链(例如，包含两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链)的抗体或抗原结合片段时，在单一宿主细胞中链的共表达(例如，在细胞内或在细胞表面上或如果这样的链是分泌的在细胞外部)导致链的结合，从而形成抗体或抗原结合片段分子。本发明的方法包括其中仅表达免疫球蛋白重链或仅表达免疫球蛋白轻链(例如，本申请讨论的那些中的任意一个，包括成熟片段和/或其可变结构域)的那些。这样的链是有用的，例如作为包含这样的链的抗体或抗原结合片段表达的中间体。
Fc区的抗体工程化
还可以对本发明的抗ILT4抗体和抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)进行工程化以在Fc区内包含修饰，通常以改变抗体的一种或多种功能性质，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或效应功能(例如，抗原依赖的细胞毒性)。而且，可以对本申请公开的抗体和片段进行化学修饰(例如，可以将一个或多个化学部分附接到抗体上)或者对其进行修饰以改变其糖基化，再次地以改变抗体的一种或多种功能性质。在下文中对这些实施方式的每一个进行进一步的详细描述。Fc区中的残基编号是Kabat的EU索引编号。
本申请公开的抗体和抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)还包含经修饰(或阻断)的Fc区以提供改变的效应功能。参见例如，美国专利号5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。这样的修饰可用于增强或抑制免疫系统的各种应答，具有在诊断和治疗中的可能的有益作用。Fc区的改变包括氨基酸改变(置换、缺失和/或插入)、糖基化或去糖基化以及添加多个Fc结构域。Fc的改变还可以改变治疗性抗体中抗体的半衰期，以降低给药频率，从而增加便利性并减少材料的使用。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731,734-35。
在本发明的一个实施方式中，抗LIT4抗体或抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)是IgG4同种型抗体或片段，其在对应于重链恒定区铰链区中的位置228(S228P；EU索引)的位置包含丝氨酸至脯氨酸的突变。据报道，这种突变消除了铰链区中重链间二硫键的异质性(Angal等，同上；位置241基于Kabat编号系统)。
在本发明的一个实施方式中，本发明抗LIT4抗体或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)CH1的铰链区是经修饰的，使得铰链区中半胱氨酸残基的数量增加或减少(例如，±1、2或3)。在美国专利号5,677,425中进一步描述了这种方法。例如，改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数量以便于轻链和重链组装或者增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方式中，将抗LIT4抗体或抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)的Fc铰链区突变以降低抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，使得相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合，抗体具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。在美国专利号6,165,745中进一步详细描述了这种方法。
在另一个实施方式中，对抗LIT4抗体或抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)进行修饰以增加其生物半衰期。各种方法都是可以的。例如，可以引入一个或多个下述突变：T252L、T254S、T256F，如在美国专利号6,277,375中所描述的。或者，为增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体，以含有获自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的清道夫受体结合表位，如在美国专利号5,869,046和6,121,022中所描述的。
在另外其他实施方式中，通过使用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗LIT4抗体或抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)的效应功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以被不同氨基酸残基置换，使得抗体对效应配体具有改变的亲和性，但保留母体抗体的抗原结合能力。与其的亲和性被改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1部分。在美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步描述了这种方法。
在另一个实例中，可以使用不同氨基酸残基置换选自氨基酸残基329、331和322的一种或多种氨基酸，使得抗LIT4抗体或抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)具有改变的C1q结合和/或降低或消除补体依赖性细胞毒性(CDC)。在美国专利号6,194,551中进一步描述了这种方法。
在另一个实例中，在氨基酸位置231和239中的一个或多个氨基酸残基被置换，从而改变了抗体固定补体的能力。在PCT公开号WO 94/29351中进一步描述了这种方法。
在又一个实例中，通过修饰在下述位置的一个或多个氨基酸，对Fc区进行修饰以提高或降低抗LIT4抗体或抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增强或减弱抗体或片段针对Fcγ受体的亲和性：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。在PCT公开号WO 00/42072中进一步描述了这种方法。而且，已展示了在人IgG1上针对FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点以及已描述了具有改善的结合的变体(参见Shields等，(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。在位置256、290、298、333、334和339的特定突变已显示出与FcγRIII改善的结合。此外，下述组合突变已显示出改善的FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在一个实施方式中，通过修饰残基243和264而对Fc区进行修饰以降低抗LIT4抗体或抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)介导效应功能的能力和/或以增强抗炎性质。在一个实施方式中，通过将位置243和264的残基变为丙氨酸而对抗体的Fc区进行修饰。在一个实施方式中，通过修饰残基243、264、267和328而对Fc区进行修饰以降低抗体介导效应功能的能力和/或增强抗炎性质。
翻译后修饰
在又一个实施方式中，抗体包含特定的糖基化模式。例如，缺乏糖基化的无糖基化抗LIT4抗体或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)是本发明的一部分。例如，可以改变抗体或片段的糖基化模式以增加抗体对抗原的亲和性或亲合力。例如，可以通过改变抗体或片段序列中的一个或多个糖基化位点实现这种修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，以除去一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除在该位点的糖基化。这种无糖基化可以增强抗体或片段对抗原的亲和性或亲合力。参见例如美国专利号5,714,350和6,350,861。
还可以制备本发明的抗LIT4抗体或抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)，其中糖基化模式包括低岩藻糖基化或无岩藻糖基化聚糖，如在聚糖上岩藻糖基残基的量减少的低岩藻糖基化抗体和抗原结合片段或无岩藻糖基化的抗体和片段。抗体或抗原结合片段也可以包含具有增加的量的二等分GlcNac结构。已证明这种改变的糖基化模式增强抗体的ADCC能力。可以通过例如在宿主细胞中表达抗体或片段实现这种修饰，在所述宿主细胞中已对糖基化途径进行基因工程化以产生具有特定糖基化模式的糖蛋白。在现有技术中已对这些细胞进行了描述，并且可以将其用作宿主细胞，在其中表达本发明的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)-岩藻糖基转移酶)，因此在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物中缺乏岩藻糖。本发明包括缺乏岩藻糖或由缺乏FUT8的宿主细胞生产的抗ILT4抗体和抗原结合片段。通过使用两个替代载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因建立了Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系(参见美国专利公开号20040110704和Yamane-Ohnuki等，(2004)Biotechnol Bioeng 87:614-22)。作为另一个实例，EP 1176195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1,6键相关的酶显示出低岩藻糖基化。EP 1,176,195还描述了针对将岩藻糖加入与抗体的Fc结合的N-乙酰氨基葡糖具有较低酶活性或不具有酶活性的细胞系，例如大鼠黑色素瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公开号WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lec13细胞，其将岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化物的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体低岩藻糖基化(也参见Shields等，(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。也可以在鸡蛋中生产具有改善的糖基化性质的抗体，如在PCT公开号WO 06/089231中所描述的。或者，可以在植物细胞中生产具有改善的糖基化性质的抗体，如Lemna(美国专利号7,632,983)。在美国专利号6,998,267和7,388,081中公开了在植物系统中生产抗体的方法。PCT公开号WO 99/54342描述了经工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰氨基葡糖基转移酶III(GnTIII))的细胞系，以使得在经工程化的细胞系中表达的抗体显示出增加的二等分GlcNac结构，其导致抗体的ADCC活性增强(亦参见，Umana等，(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。通过这样的宿主细胞生产的本发明的抗ILT4抗体及其抗原结合片段是本发明的一部分。
或者，可以使用岩藻糖苷酶切割掉抗LIT4抗体或抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)的岩藻糖残基；例如可以使用岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖基残基(Tarentino等，(1975)Biochem.14:5516-23)。本发明包括已使用岩藻糖苷酶处理的抗体和片段。
本申请公开的抗ILT4抗体或抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)还包括在低等真核生物宿主细胞中生产的那些，特别是真菌宿主细胞，如经基因工程化的酵母和丝状真菌，以生产具有哺乳动物或人样糖基化模式的糖蛋白(参见例如，Choi等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100:5022-5027；Hamilton等，(2003)Science 301:1244-1246；Hamilton等，(2006)Science 313:1441-1443)。这些经基因修饰的宿主细胞相对于当前使用的哺乳动物细胞系的特别的优点是能够控制在细胞中生产的糖蛋白的糖基化模式，使得能够生产其中特定N-聚糖结构占主导的糖蛋白组分(参见例如，美国专利号7,029,872和美国专利号7,449,308)。已将这些经基因修饰的宿主细胞用于生产主要具有特定N-聚糖结构的抗体(参见例如，Li等，(2006)Nat.Biotechnol.24:210-215)。
抗体缀合物
也可以将本申请公开的抗ILT4抗体和抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)与肽或化学部分缀合。化学部分尤其可以是聚合物、放射性核素或者治疗或细胞毒剂。在本发明特定的实施方式中，化学部分是聚合物，其增加抗体分子在受试者机体中的半衰期。聚合物包括但不限于亲水性聚合物，其包括但不限于聚乙二醇(PEG)(例如，分子量为2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa的PEG)、葡聚糖和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等(1999)(Bioconj.Chem.10:973-981)公开了与PEG缀合的单链抗体。Wen等(2001)(Bioconj.Chem.12:545-553)公开了具有PEG的缀合抗体，PEG结合至放射性金属螯合剂(二亚乙基三胺五乙酸(DTPA))。
本申请公开的抗体和抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)还可以与标记缀合，如放射性标记。标记包括但不限于99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th和40K、157Gd、55Mn、52Tr和56Fe。
本申请公开的抗ILT4抗体和抗体片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)还可以是例如PEG化的(例如，使用1PEG或3kDa、12kDa或40kDa PEG聚合物分子)，以增加其生物(例如，血清)半衰期。为了使抗体或其抗原结合片段PEG化，在一个或多个PEG基团与抗体或抗原结合片段连接的条件下，通常将抗体或片段与反应性形式的聚乙二醇(PEG)反应，如PEG的反应性酯或醛衍生物。在特定的实施方式中，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。如在本申请中所使用的，术语“聚乙二醇”旨在包括已用于衍生化其他蛋白的任何形式的PEG，如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，待PEG化的抗体是无糖基化的抗体。用于PEG化蛋白的方法是本领域公知的，并且可以应用于本发明的抗体。参见例如，EP 0 154 316和EP0 401 384。
本申请公开的抗ILT4抗体和抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)也可以与标记缀合，如荧光或化学发光标记，包括荧光团如稀土螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、152Eu、丹磺酰基、伞形酮、萤光素、鲁米那标记、异鲁米那标记、芳香吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、水母发光蛋白标记、2,3-二氢酞嗪二酮、生物素/亲和素、自旋标记和稳定的自由基。
本申请公开的抗ILT4抗体和抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)也可以与细胞毒性因子缀合，如白喉毒素、铜绿假单胞菌外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白和化合物(例如，脂肪酸)、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(Sapaonariaofficinalis)抑制剂、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素和依诺霉素。
可以使用用于将抗体和抗原结合片段与各种部分连接的本领域公知的任何方法，包括Hunter等，(1962)Nature 144:945；David等，(1974)Biochemistry 13:1014；Pain等，(1981)J.Immunol.Meth.40:219；和Nygren,J.,(1982)Histochem.and Cytochem.30:407描述的那些方法。用于缀合抗体的方法是常规的并且在本领域中是众所周知的。
药物组合物和施用
可以通过将具有所需纯度的抗体或其抗原结合片段与任选地生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(参见例如，Remington,Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版，1980))混合制备用于贮存的水溶液或者冻干或其他干燥形式的包含抗ILT4抗体(例如，全人抗体如拮抗性全人抗体(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)及其抗原结合片段)的药物组合物。
在一个实施方式中，药物组合物包含由两条重链和两条轻链组成的抗体，其中每条轻链由SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列组成和每条重链由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。
在另一个实施方式中，药物组合物包含包含：(i)由两条重链和两条轻链组成的抗体，其中每条轻链由SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列组成和每条重链由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，和(ii)帕博利珠单抗。
可以通过与例如冻干粉剂、浆剂、水溶液或混悬液形式的可接受的载体、赋形剂或稳定剂(参见例如，Hardman等，(2001)Goodman and Gilman’s The PharmacologicalBasis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等，(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,MarcelDekker,NY；Lieberman等，(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,MarcelDekker,NY；Lieberman等，(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:DisperseSystems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity andSafety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)混合制备治疗剂和诊断剂的制剂。
可以通过在细胞培养物或实验动物中进行的例如用于确定LD50(使50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体有效的剂量)的标准药学程序确定单独施用或与其他治疗剂联用的抗LIT4抗体或抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)组合物的毒性和治疗有效性。毒性和治疗作用之间的剂量比是治疗指数(LD50/ED50)。在特定方面中，表现出较高治疗指数的抗体是期望的。从这些细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。这样的化合物的剂量优选在包括几乎不具有或不具有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以根据所使用的剂型和施用途径在该范围内变化。
在一个进一步的实施方式中，根据Physicians'Desk Reference 2003(ThomsonHealthcare；第57版(2001年11月1日))向受试者施用与本申请公开的抗ILT4抗体(例如，全人抗体，如拮抗性全人抗体)或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)一起向受试者施用的另外的治疗剂。
施用模式可以改变。施用途径包括口服、直肠、透粘膜、肠、肠胃外；肌内、皮下、真皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、透皮或动脉内。
本发明提供了用于施用抗LIT4抗体或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)的方法，所述方法包括将所述抗体或片段引入受试者的机体。例如，所述方法包括使用注射器的针刺穿受试者的机体，并且将所述抗体或片段注射进入受试者的机体，例如注射到受试者的静脉、动脉、肿瘤、肌肉组织或皮下组织。
本发明提供了一种容器(例如，塑料或玻璃药瓶，例如具有盖或色谱柱、空心针或注射器筒)，其含有本申请所示的任何抗ILT4抗体或抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)或者包含药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明还涉及一种注射装置，所述注射装置含有本申请所示的任何抗ILT4抗体或抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)或其药物组合物。注射装置是通过胃肠外途径(例如，肌内、皮下或静脉内)将物质引入受试者机体的装置。例如，注射装置可以是注射器(例如，预充药物组合物的，如自动注射器)，例如，其包含用于容纳要注射的流体(例如，包含抗体或片段或者其药物组合物)的针筒或桶，用于刺穿皮肤和/或血管以注射所述流体的针头；以及用于将所述流体从圆柱体推出并穿过针孔的柱塞。在本发明的一个实施方式中，含有本发明的抗体或其抗原结合片段或者其药物组合物的注射装置是静脉内(IV)注射装置。这样的装置包括在插管或套管针/针中的抗体或片段或者其药物组合物，所述插管或套管/针可以与用于容纳通过所述套管或套管针/针引入所述受试者机体的流体(例如，生理盐水；或含有NaCl、乳酸钠、KCl、CaCl2以及任选地含有葡萄糖的乳酸林格氏溶液)的袋子或储库连接。
还可以使用无针皮下注射装置施用本申请公开的药物组合物；如在美国专利号6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。包含药物组合物的这样的无针装置也是本发明的一部分。还可以通过输注施用本申请公开的药物组合物。用于施用药物组合物的众所周知的植入物和模块的实例包括在下述中公开的那些：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入微输液泵；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流量可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多个腔室的渗透药物递送系统。很多其他这样的植入物、递送系统和模块是本领域的那些技术人员所熟知的，并且包含本发明的药物组合物的那些在本发明的范围内。
可以通过连续输注或通过例如每天、每周1-7次、每周1次、每2周1次、每月1次、每2个月1次、每季度1次、每半年1次、每年1次等施用的剂量来提供本申请公开的抗体(例如，全人抗体，如拮抗性全人抗体)或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)。可以通过例如静脉内、皮下、局部、口服、鼻内、直肠、肌内、脑内、脊髓内或通过吸入提供剂量。本发明抗LIT4抗体或其抗原结合片段的有效剂量是从0.05mg/kg(体重)至约30mg/kg(体重)，例如用于治疗或预防癌症或感染性疾病。
临床医师例如使用本领域中已知或疑似影响治疗的参数或因素来确定适宜的剂量。在通常情况下，在确定剂量时，剂量开始时比最佳剂量要小一些，并且此后以较小的增量增加，直至相对于任何负面的副作用达到期望的或最佳的效果。重要的诊断指标包括例如炎症的症状或所产生的炎症细胞因子的水平。在通常情况下，期望的是将要使用的生物制剂是来自于与治疗针对的动物相同的物种，从而使针对该试剂的任何免疫应答最小化。例如，嵌合和全人抗体可以是期望的。选择抗ILT4抗体或片段的指导原则是可以获得的(参见例如，Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(ed.)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,MarcelDekker,New York,NY；Bach(ed.)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapyin Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等，(2003)NewEngl.J.Med.348:601-608；Milgrom等，(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等，(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等，(2000)New Engl.J.Med.342:613-619Ghosh等，(2003)New Engl.J.Med.348:24-32；Lipsky等。(2000)NewEngl.J.Med.343:1594-1602)。
可以由医师或其他熟练的医疗保健提供者通过通常使用的能够评估疾病症状是否得到缓解的任何临床测量来评估症状的严重程度或进展状态。尽管本发明的实施方式(例如，治疗方法或制品)可以不有效地减轻每个受试者的一个或多个目标疾病症状，但是其应当减轻统计学显著的数量的受试者的一个或多个目标疾病症状，如通过本领域公知的任何统计学检验所确定的，如Student t-检验、卡方检验、根据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H-检验)、Jonckheere-Terpstra-检验和Wilcoxon-检验。
抗ILT4抗体的治疗用途
本发明还提供了通过施用可对这样的治疗或预防有效的有效量的本申请公开的抗ILT4抗体或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)用于在受试者(如需要这样的治疗的人类受试者)中治疗或预防癌症的方法。
在某些实施方式中，癌症是实体瘤。在其他实施方式中，癌症是血液系统癌症。在某些实施方式中，癌症是转移性的。在一些实施方式中，癌症是复发的。在其他实施方式中，癌症是难治性的。在另外其他实施方式中，癌症是复发和难治性的。
在一些实施方式中，癌症是间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌，乳腺癌(例如，以BRCA1和/或BRCA2突变为特征的)、类癌，宫颈癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤、结直肠癌、子宫内膜癌癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、胆囊癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝母细胞瘤、肝细胞癌、特发性骨髓纤维化、肾癌、白血病、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、淋巴瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、真性红细胞增多症、原发性神经外胚层肿瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肾移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、肾横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌(例如，皮肤鳞状细胞癌)、滑膜肉瘤、血小板增多症、甲状腺癌、子宫癌、前庭神经鞘瘤或维尔姆斯肿瘤。在本发明的一个实施方式中，癌症是例如上文所述变种的转移性癌症。
在本发明的一个实施方式中，癌症是“富”髓样肿瘤(例如，间皮瘤、肾癌、淋巴瘤、肉瘤、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌或甲状腺癌；参见例如，Burt等，Cancer.117(22):5234-44(2011)；Dannenmann等，Oncoimmunology 2(3):e23562(2013)；Steidl等，N.Engl.J.Med.362:875-885(2010)；Fujiwara等，Am.J.Pathol..179(3):1157-70(2011)；Bronkhorst等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.52(2):643-50(2011)；Balermpas等，Br.J.Cancer 111(8):1509-18(2014)；和Zhang等，PLoS One 7(12):e50946(2012))。由于ILT4主要由髓样细胞和粒细胞表达，并且髓样细胞浸润到肿瘤中因为这些细胞可以拮抗T细胞的抗肿瘤应答的免疫抑制作用而通常与不良预后相关，因而使用本发明的抗LIT4抗体或抗原结合片段进行治疗将使具有高髓样或免疫抑制性髓样细胞浸润的受试者获益。
因而，本申请提供了在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含(a)免疫球蛋白链轻链可变(VL)结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其含有SEQ ID NO:3-7、11、13、15或45中所示的氨基酸序列；和/或(b)免疫球蛋白重链可变(VH)结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其含有SEQ ID NO:1、2、8-10、12、14、44或79-86中所示的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括：向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：(1)VH结构域，其包含：互补性决定区-H1(CDR-H1)：GYYWS(SEQ ID NO:16)，互补性决定区-H2(CDR-H2)：EINHXGSTNYNPSLKS，其中X是S或A(SEQ ID NO:17)；和互补性决定区-H3(CDR-H3)：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：互补性决定区-L1(CDR-L1)：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)，互补性决定区-L2(CDR-L2)：GX1X2NRPS；其中X1是S或A和X2是N、Q、E或D(SEQ ID NO:20)；和互补性决定区-L3(CDR-L3)：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)；(2)VH结构域，其包含：CDR-H1：SYAIS(SEQ ID NO:22)；CDR-H2：GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:23)；和CDR-H3：YFX1X2SGWYKGGAFDI；其中X1是D或S和X2是S或A(SEQ ID NO:24)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TLRSGINVDTYRIH(SEQ ID NO:25)；CDR-L2：YKSDSDKHQGS(SEQ ID NO:26)；和CDR-L3：AIWYSSTWV(SEQ ID NO:27)；(3)VH结构域，其包含：CDR-H1：SYAMH(SEQ ID NO:28)；CDR-H2：VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:29)；和CDR-H3：VGEWIQLWSPFDY(SEQ ID NO:30)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：RASQGISSWLA(SEQID NO:31)；CDR-L2：AASSLQS(SEQ ID NO:32)；和CDR-L3：QQYNSYPPT(SEQ ID NO:33)；和/或(4)VH结构域，其包含：CDR-H1：ELSMH(SEQ ID NO:34)；CDR-H2：GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQ IDNO:35)；和CDR-H3：AGPLYTIFGVVIIPDNWFDP(SEQ ID NO:36)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:37)；CDR-L2：GNSNRPS(SEQ ID NO:38)；和CDR-L3：QSYDSSLSGSGVV(SEQ ID NO:39)。
在一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GNSNRPS(SEQ ID NO:49)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GQSNRPS(SEQ ID NO:50)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GESNRPS(SEQ ID NO:51)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GDSNRPS(SEQ ID NO:52)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GNANRPS(SEQ ID NO:53)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GQANRPS(SEQ ID NO:54)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GEANRPS(SEQ ID NO:55)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GDANRPS(SEQ ID NO:56)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GNSNRPS(SEQ ID NO:49)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GQSNRPS(SEQ ID NO:50)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GESNRPS(SEQ ID NO:51)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GDSNRPS(SEQ ID NO:52)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GNANRPS(SEQ ID NO:53)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GQANRPS(SEQ ID NO:54)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GEANRPS(SEQ ID NO:55)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)、CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)、CDR-L2：GDANRPS(SEQ ID NO:56)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另外其他实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白，或者轻链和重链免疫球蛋白两者，其中所述轻链免疫球蛋白包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7、11、13、15或45中所示的氨基酸序列；和/或所述重链免疫球蛋白包含SEQ ID NO:1、2、8、9、10、12、14、44、79、80、81、82、83、84、85或86中所示的氨基酸序列。
在仍就另外其他实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白，或者轻链和重链免疫球蛋白两者，其中所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:70、71、72、73、58、74、75、76或77中所示的氨基酸序列，和/或所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:63、57、64、65、66、67、68或69中所示的氨基酸序列。
在更多实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：任一下组重链免疫球蛋白和轻链免疫球蛋白：(1)包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(2)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(3)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(4)包含SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(5)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(6)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(7)包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(8)包含SEQ IDNO:9所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(9)包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(10)包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(11)包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(12)包含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(13)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ IDNO:4所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(14)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(15)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(16)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(17)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(18)包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(19)包含SEQID NO:83所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(20)包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(21)包含SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；或者(22)包含SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在甚至更多实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：任一下组重链可变结构域何轻链可变结构域：(1)包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(2)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(3)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(4)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(5)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(6)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(7)包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(8)包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ IDNO:74所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(9)包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(10)包含SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的轻链可变结构域；或者(11)包含SEQ ID NO:68所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一个优选的实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：含有SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的VH结构域；和含有SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的VL结构域。
在另一个优选的实施方式中，在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：含有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在另外又一个优选的实施方式中，有需要的人类受试者中治疗癌症的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：含有SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
本申请还提供了在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)免疫球蛋白链轻链可变(VL)结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其含有SEQ IDNO:3-7、11、13、15或45中所示的氨基酸序列；和/或(b)免疫球蛋白重链可变(VH)结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其含有SEQ ID NO:1、2、8-10、12、14、44或79-86中所示的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：(1)VH结构域，其包含：互补性决定区-H1(CDR-H1)：GYYWS(SEQ ID NO:16)，互补性决定区-H2(CDR-H2)：EINHXGSTNYNPSLKS，其中X是S或A(SEQ ID NO:17)；和互补性决定区-H3(CDR-H3)：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：互补性决定区-L1(CDR-L1)：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)，互补性决定区-L2(CDR-L2)：GX1X2NRPS；其中X1是S或A和X2是N、Q、E或D(SEQ ID NO:20)；和互补性决定区-L3(CDR-L3)：QSFDNSLSAYV(SEQID NO:21)；(2)VH结构域，其包含：CDR-H1：SYAIS(SEQ ID NO:22)；CDR-H2：GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:23)；和CDR-H3：YFX1X2SGWYKGGAFDI；其中X1是D或S和X2是S或A(SEQ ID NO:24)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TLRSGINVDTYRIH(SEQ ID NO:25)；CDR-L2：YKSDSDKHQGS(SEQ ID NO:26)；和CDR-L3：AIWYSSTWV(SEQ ID NO:27)；(3)VH结构域，其包含：CDR-H1：SYAMH(SEQ ID NO:28)；CDR-H2：VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:29)；和CDR-H3：VGEWIQLWSPFDY(SEQ ID NO:30)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：RASQGISSWLA(SEQ ID NO:31)；CDR-L2：AASSLQS(SEQ ID NO:32)；和CDR-L3：QQYNSYPPT(SEQ ID NO:33)；和/或(4)VH结构域，其包含：CDR-H1：ELSMH(SEQ ID NO:34)；CDR-H2：GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQ ID NO:35)；和CDR-H3：AGPLYTIFGVVIIPDNWFDP(SEQ ID NO:36)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:37)；CDR-L2：GNSNRPS(SEQ ID NO:38)；和CDR-L3：QSYDSSLSGSGVV(SEQ ID NO:39)。
在一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GNSNRPS(SEQ ID NO:49)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GQSNRPS(SEQ ID NO:50)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GESNRPS(SEQ ID NO:51)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GDSNRPS(SEQ ID NO:52)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GNANRPS(SEQ ID NO:53)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GQANRPS(SEQ ID NO:54)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GEANRPS(SEQ ID NO:55)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:47)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GDANRPS(SEQ ID NO:56)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GNSNRPS(SEQ ID NO:49)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GQSNRPS(SEQ ID NO:50)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GESNRPS(SEQ ID NO:51)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GDSNRPS(SEQ ID NO:52)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方式中在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GNANRPS(SEQ ID NO:53)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GQANRPS(SEQ ID NO:54)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GEANRPS(SEQ ID NO:55)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在又一个实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)和CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和/或，VL结构域，其包含：CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQID NO:19)，CDR-L2：GDANRPS(SEQ ID NO:56)和CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
在另外其他实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白，或者轻链和重链免疫球蛋白两者，其中所述轻链免疫球蛋白包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7、11、13、15或45中所示的氨基酸序列；和/或所述重链免疫球蛋白包含SEQ ID NO:1、2、8、9、10、12、14、44、79、80、81、82、83、84、85或86中所示的氨基酸序列。
在仍就另外其他实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白，或者轻链和重链免疫球蛋白两者，其中所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:70、71、72、73、58、74、75、76或77中所示的氨基酸序列，和/或所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:63、57、64、65、66、67、68或69中所示的氨基酸序列。
在更多实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：任一下组重链免疫球蛋白和轻链免疫球蛋白：(1)包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(2)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(3)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(4)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQID NO:6所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(5)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(6)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(7)包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(8)包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(9)包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(10)包含SEQ IDNO:12所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(11)包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(12)包含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(13)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(14)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(15)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ IDNO:6所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(16)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(17)包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(18)包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(19)包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(20)包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；(21)包含SEQID NO:85所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；或者(22)包含SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；包含SEQ IDNO:15所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在甚至更多实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：任一下组重链可变结构域何轻链可变结构域：(1)包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(2)包含SEQID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(3)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(4)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(5)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(6)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(7)包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(8)包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(9)包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变结构域；(10)包含SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQID NO:75所示氨基酸序列的轻链可变结构域；或者(11)包含SEQ ID NO:68所示氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一个优选的实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：含有SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的VH结构域；和含有SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的VL结构域。
在另一个优选的实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：含有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
在另外又一个优选的实施方式中，在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法包括向所述人类受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含：含有SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
本发明还涉及用于通过向受试者施用针对这样的治疗或预防可以有效的有效量的本申请公开的抗ILT4抗体或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)在所述受试者中治疗或预防感染性疾病的方法。在本发明的一个实施方式中，所述感染性疾病是病毒感染。在本发明的一个实施方式中，所述感染性疾病是细菌感染。在本发明的一个实施方式中，所述感染性疾病是寄生虫感染。在本发明的一个实施方式中，所述感染性疾病是真菌感染。
本发明包括治疗本申请中讨论的任何癌症或感染性疾病的方法，其通过施用任选地与本申请中讨论的任何另外的化疗剂或治疗程序结合的治疗有效量的抗LIT4抗体或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)以及包含这样的抗体或片段以及这样的另外的化疗剂的组合物(例如，共同制剂的抗体或片段以及另外的化疗剂)。
“受试者”是哺乳动物，比如例如人、犬、猫、马、奶牛、小鼠、大鼠、猴(例如，食蟹猴，例如食蟹猴(Macaca fascicularis)或恒河猴(Macaca mulatta))或者家兔。
在本发明的一个实施方式中，本发明的抗ILT4抗体(例如，全人抗体，如拮抗性全人抗体)或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)是与另外的化疗剂如抗体或其抗原结合片段结合的。在本发明的一个实施方式中，另外的化疗剂是止吐剂、促红细胞生成素、GM-CSF、疫苗、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L2抗体或其抗原结合片段、抗PD1抗体或其抗原结合片段(例如，帕博利珠单抗或纳武单抗)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、铂化合物、贝伐单抗、柔红霉素、阿霉素、替莫唑胺、拓扑替康、伊立替康、紫杉醇、多西他赛、伊马替尼或利妥昔单抗。
术语“与……结合(in association with)”表示组分——本发明的抗ILT4抗体(例如，全人抗体，如拮抗性全人抗体)或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)——与另外的试剂(如帕博利珠单抗或纳武单抗)一起可以配制成单一组合物(例如，用于同时递送)，也可以分别配制成两种或更多种组合物(例如，试剂盒)。可以在与施用其他组分不同的时间点向受试者施用每种组分；例如，可以在给定时间段内间隔地不同时(例如，分别地或顺序地)进行每次施用。而且，可以通过相同或通过不同途径向受试者施用分开的组分(例如，胃肠外施用全人抗体如拮抗性全人抗体)或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)和口服施用紫杉醇)。
测定以及实验和诊断用途
本发明包括用于在本发明的抗LIT4抗体或其抗原结合片段与ILT4或其片段之间形成复合物的任何方法，包括在适于结合和复合物形成的条件下将ILT4多肽或片段与抗LIT4抗体或抗原结合片段接触。
可以将本申请公开的抗ILT4抗体(例如，全人抗体如拮抗性全人抗体)及其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)用作亲和纯化试剂。在该方法中，使用本领域熟知的方法将抗ILT4抗体及其抗原结合片段固化在固相(如葡聚糖凝胶、玻璃或琼脂糖树脂或滤纸)上。将固化的抗体或片段与待纯化的含有ILT4蛋白(或其片段)的样品接触，然后使用适宜的溶剂洗涤支持物，所述溶剂将除去样品中除了与固化的抗体或片段结合的ILT4蛋白以外的物质。最后，使用洗脱结合的ILT4的溶剂(例如，蛋白A)洗涤支持物。这样的固化的抗体和片段形成了本发明的一部分。
本发明包括使用本发明的抗ILT4抗体及其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)的基于细胞的ELISA方法。在本发明的一个实施方式中，所述方法用于确定细胞是否含有ILT4，所述方法包括以下步骤：(i)将固化在固体表面(例如，微量培养板)上的待检测是否存在ILT4的所述细胞与本发明的抗LIT4抗体或其抗原结合片段接触，(ii)任选地，洗涤混合物以除去未结合的抗ILT4抗体或片段，(iii)将所述抗ILT4抗体或片段与与抗ILT4抗体或片段结合的标记的二抗接触，(iv)任选地，洗涤复合物以除去未结合的抗体或片段，和(v)检测二抗或片段上标记的存在；其中检测到标记表明含有ILT4的细胞固化在固体表面上。
本发明包括涉及使用本申请公开的抗ILT4抗体(例如，全人抗体，如拮抗性全人抗体)或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)的ELISA测定(酶联免疫吸附测定)。例如，用于确定是否样品含有ILT4或其片段的方法包括下述步骤：
(a)将基材(例如，微量培养板孔的表面，例如，塑料培养板)与抗ILT4抗体(例如，全人抗体，如拮抗性全人抗体)或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)接触；
(b)将待检测ILT4存在的样品添加到基材；
(c)洗涤基材，以除去样品中未结合的物质；
(d)加入可检测的标记抗体(例如，酶联抗体)，其也对ILT4抗原具有特异性；
(e)洗涤基材，以除去未结合的标记抗体；
(f)检测抗体上的标记；如果标记的抗体是酶联的，则应用将酶转化成可检测(例如，荧光)信号的化学物质；和
检测到标记(例如，与基材结合的)表明存在ILT4蛋白。
在本发明的一个实施方式中，使用过氧化物酶标记标记抗体或其抗原结合片段，所述过氧化物酶与ABST(例如，2,2'-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或3,3',5,5'-四甲基联苯胺反应，以产生可检测的颜色变化。或者，使用可检测的放射性同位素(例如，3H)标记标记抗体或片段，可以在存在闪烁剂的情况下通过闪烁仪对其进行检测。
可以将抗ILT4抗体(例如，全人抗体，如拮抗性全人抗体)或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)用于Western印记或免疫蛋白印记方法中。这样的方法形成了本发明的一部分并且包括例如：
(1)提供含有待检测ILT4或其片段存在的样品的膜或其他固体基材，例如，任选地包括将来自待检测ILT4存在的样品的蛋白(例如，来自通过PAGE或SDS-PAGE电泳分离的样品中的蛋白)转移至膜或其他固体基材的步骤(例如，使用本领域公知的方法(例如，使用半干印记或槽式印记))；并将待检测结合的ILT4或其片段存在的膜或其他固体基材与本发明的抗LIT4抗体或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)接触；
(2)洗涤膜一次或多次，以除去未结合的抗ILT4抗体或片段和其他未结合的物质；和
(3)检测结合的抗ILT4抗体或片段。
这样的膜可以采取例如硝酸纤维素膜或基于乙烯基的膜(例如，聚偏二氟乙烯(PVDF))膜的形式，在膜上转移了在非变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶或SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶中的待检测ILT4存在的蛋白。在将膜与抗ILT4抗体或片段接触之前，任选地使用例如脱脂奶粉等对膜进行封闭，使得抗ILT4抗体或片段不能与膜上的非特异性蛋白结合位点结合。
检测到结合的抗ILT4抗体或片段表明在膜或基材上以及在样品中存在ILT4蛋白。可以通过将抗体或片段与作为可检测标记的二抗(抗免疫球蛋白抗体)结合检测结合的抗体或片段，然后检测所述二抗标记的存在。
还可以将抗ILT4抗体(例如，全人抗体，如拮抗性全人抗体)或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)用于免疫组织化学。这样的方法形成了本发明的一部分并且包括例如：
(1)将待检测ILT4蛋白存在的细胞(例如，髓系细胞，如单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞)与本发明的抗LIT4抗体或其抗原结合片段(例如，1E1、2A6、3G7和/或2C1)接触；和
(2)检测在细胞上或细胞中的抗体或片段。
如果抗体或片段本身是可检测的标记，则可以直接进行检测。或者，可以将抗体或片段与作为可检测标记的二抗结合，然后对所述标记进行检测。
实施例
这些实施例旨在示例本发明，而不是对其的限制。在实施例中示出的组合物和方法形成了本发明的一部分。
如在本申请中所使用的，术语“p1E1(G1)”指全人抗ILT4 1E1 mAb，其分别来源于种系V基因、IGHV4-34*0和IGLV1-40*01；具有人IgG1和人λ恒定结构域。
>重链
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO:44)
>轻链
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
(SEQ ID NO:45)
如在本申请中所使用的，“p1E1(G4)”指全人抗ILT4 1E1(在重链中具有突变Q1E和在轻链中具有突变Q1E)mAb，其分别来源于种系V基因、IGHV4-34*0和IGLV1-40*01；具有人IgG4(S228P)和人λ恒定结构域。
>重链
EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO:1)
>人IgG4(S228P)恒定结构域
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO:89)
>轻链
ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
(SEQ ID NO:3)
>人λ恒定结构域
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
(SEQ ID NO:90)
如在本申请中所使用的，“1E1(G4)”指全人抗ILT4 1E1(在轻链中具有突变Q1E和N53D和在重链中具有突变Q1E和S54A)，其分别来源于种系V基因、IGHV4-34*0和IGLV-40*01；具有人IgG4(S228P)和人λ恒定结构域。
>重链
EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHAGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLPTRWVTTRYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO:2)
>轻链
ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGDSNRPSGVPDRFSVSKSGASASLAITGLQAEDEADYYCQSFDNSLSAYVFGGGTQLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
(SEQ ID NO:7)
实施例1：抗ILT4抗体的鉴定和表征
抗体的产生和鉴定
使用RETROCYTE DISPLAY平台(Breous-Nystroma等，Methods65(1):57–67(2014))鉴定了抗ILT4母体人mAb 1E1。RETROCYTE DISPLAY平台利用人抗体基因通过逆转录病毒基因转移至哺乳动物前B细胞，以产生稳定的高度多样性的抗体展示文库。将含有幼稚B细胞的人脐带血用作抗体重链和轻链的来源物质。细胞抗体文库通常在前B细胞的细胞表面上表达>108种不同全长(hIgG1-4同种型)的单克隆人抗体。
抗体预小组(pre-panel)是从在3次独立的RETROCYTE DISPLAY筛选活动中鉴定的抗体命中汇编的。候选物是基于重组人ILT4抗原与B细胞克隆的结合的FACS检测而富集。分选出假定的B细胞克隆并测定其抗体序列。然后将这些序列用于生产抗体候选物，并使用ILT4 CHO转染细胞结合测定法确认ILT4结合，母体CHO细胞充当阴性对照。还通过流式细胞术评估来反向筛选候选物针对密切相关的ILT家族成员(人ILT2、LILRA1和LILRA2 CHO转染子FACS)和针对ILT家族成员(LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA5、LILRA6、ILT2、ILT5和ILT3)的ILT4特异性。
通过FACS进一步测试单克隆抗体与食蟹猴ILT4(来自NCBI的预测序列)CHO转染子结合的能力。还在基于Luminex的测定中筛选候选mAb阻断重组HLA-G Fc配体与重组ILT4蛋白结合的能力或者在基于FACS的测定中筛选候选mAb阻断重组HLA-G Fc配体与表达ILT4的CHO细胞结合的能力。通过3种方法评估了候选抗体的功能活性：1)在ILT4转染小鼠3A9 T细胞中挽救自发性IL2抑制；2)在小鼠WTMC ILT4转染子中挽救CD200RLa刺激的肥大细胞脱颗粒的HLA-G依赖性抑制；和3)在全PBMC混合淋巴细胞反应中的细胞因子调节。
基于上述筛选标准，基于其功能和生物物理性质选择了8种抗ILT4抗体(1E1、1G2、2A6、2D5、3E6、3G7、2C1和5A6)。在一组生物功能、生物物理和物理化学测定中进一步对抗体进行了分析和重新评价。功能性测定评估了上文所述的3A9细胞的IL-2抑制和肥大细胞脱颗粒的抗体介导的剂量依赖性挽救。进行了基于Luminex和细胞的配体阻断和配体竞争测定，并且分别使用基于Biacore和流式细胞术的测定法测定了对ILT4靶抗原、脱靶抗原和PBMC亚群的结合性质和亲和性。生物物理测定评估了抗体稳定性(温度、pH)以及降解和聚集行为。处理了序列责任和潜在的翻译后修饰基序，以排除潜在的抗体生产风险。最后，使用SKMEL5黑色素瘤攻击的人源化小鼠在体内肿瘤抑制研究中对候选物进行了测试。
生物物理性质
对在CHO细胞中瞬时表达的人1E1序列(具有S228P突变的人IgG4骨架)进行了研究。1E1呈现下述物理化学特征：计算的和实验确定的等电点(PI)分别为～7.29和～7.2，聚集水平(HMW物质)<5％，Tm起始>60℃，Tm1～65.2℃，Tm2～78.8℃，并且在至少5次冻融循环后是稳定的。1E1序列在VH-CDR2中初始地具有N-糖基化位点，已使用S54A突变成功地校正了该位点，而对BIACORE的结合和在功能测定中没有负面影响。应激研究显示了在VL-CDR3中N53残基的脱酰胺(在高pH条件下>13％)。成功校正了N53(N53D)，而对结合和在功能性测定中没有负面影响(使用1E1从ILT4 3A9 T细胞转染子挽救IL-2释放)。在1E1 VH和VL中的N端Q残基两者突变为E(VH-Q1E和VL-Q1E)以减少由脱酰胺导致的异质性的风险。对突变的1E1序列(1E1 VH Q1E，S54A/VL Q1E，N53D)，IgG4 S228P/λ)进行的应激研究显示了在使用AAPH(2,2'-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐)的强制氧化下，在6小时下VH-CDR3中W102残基的～17％氧化，而对结合和功能的影响很小。将AAPH用于Trp和Met残基的强制氧化。在相同条件下，检测到在VH框架中W7的～8％氧化，对结合和功能无影响。通过肽映射(peptidemapping)检测到约8％的非岩藻糖基化抗体。这一发现可能与在瞬时转染的CHO细胞中表达的分子有关。
表位映射(mapping)
通过氢-氘交换质谱鉴定了抗体克隆p1E1(G1)的ILT4上的表位。将抗体p1E1(G1)与ILT4的重组组氨酸标记的胞外结构域预混合，然后将复合物在氘缓冲液中孵育。通过质谱测量氘掺入的量。ILT4残基LYREKKSASW(ILT4的39-48，无信号序列)(SEQ ID NO:59)和TRIRPEL(ILT4的50-56，无信号序列)(SEQ ID NO:60)和在较小程度上NGQF(ILT4的59-62，无信号序列)(SEQ ID NO:61)和HTGRYGCQ(ILT4的71-78，无信号序列)(SEQ ID NO:62)被鉴定出，因为与仅为抗原的样品相比显示氘标记的最大差异，表明它们可能是与p1E1(G1)相互作用的残基(图1)。这些肽在ILT4的结构域1上。由于抗体结合后的构象稳定性，在结构域1和2上显示出较小氘标记差异的其他肽可能受到了保护。在结构域3和4中未见显著的标记差异。
当映射到人ILT4的晶体结构上时，受p1E1(G4)保护的残基形成包含3个β链和1个环的非线性构象表位(图2A)。
ILT4使用两个结合界面来接合其配体HLA-G(Shiroishi等，2006)：位于ILT4的结构域2的用于β-2-微球蛋白结合的位点1，和位于ILT4的结构域1的用于HLA-G重链结合的位点2(图2B)。位点1包含ILT4残基Trp-67、Asp-177、Asn-179和Val-183(根据Shiroishi等，2006编号)。位点2包含ILT4残基Arg-36、Tyr-38、Lys-42、Ile-47和Thr-48(根据Shiroishi等，2006编号)。本申请的HDX-MS数据显示，与人ILT4的残基Tyr-40、Lys-44和Thr-50一样，Tyr-38、Lys-42和Thr-48(根据Shiroishi等，2006编号)是ILT4结构域1上的p1E1(G1)表位的一部分(图2A)。这表明被p1E1(G1)结合的人ILT4表位与被HLA-G配体结合的位点2表位重叠。
实施例2：抗ILT4 mAb 1E1的亲和性、结合和阻断性质
通过表面等离子体共振(SPR)测定的1E1(G4)和HLA-G1与人ILT4的结合亲和性
通过Biacore评价了1E1(G4)和HLA-G1 Fc(HLA-G的重组胞外结构域(亚型1)与人IgG1 Fc结构域融合以制备可溶性HLA-G1蛋白)与ILT4-His(人ILT4的重组胞外结构域与多聚组氨酸标签融合以制备可溶性ILT4蛋白)的结合。通过Fc捕获将1E1(G4)或HLA-G1 Fc捕获在Biacore芯片上。然后，测试单体ILT4-His的结合，数据表明ILT4-His以比HLA-G1 Fc高600倍的亲和性结合1E1(G4)(表3)。
表3：ILT4-His以比HLA-G1 Fc高600倍的亲和性结合1E1(G4)。1:1结合动力学和稳态分析显示了630倍和670倍的差异。
Figure BDA0002309705890000951
将在Biacore T200(GE HEALTHCARE)仪器上进行的表面等离子体共振(SPR)测定法用于测定抗人ILT4 IgG4 mAb(1E1(G4))和HLA-G1 Fc融合(HLA-G1-Fc)对多聚组氨酸标记的人ILT4(ILT4-His)的单价亲和性。在使用人Fc捕获试剂盒(GE HEATHCARE)制备的CM5传感器芯片上捕获mAb或Fc融合蛋白，并将一系列滴定浓度的ILT4-His注射到该表面上。使用Biacore T200评价软件将每个滴定系列拟合到1:1结合模型。针对每组滴定测定结合(ka，M-1s-1)和解离(kd，s-1)速率常数，并用于计算针对每个滴定的解离常数KD(M)＝koff/kon。如表1中所示，1E1(G4)mAb和HLA-G1-Fc针对人ILT4-His的单价亲和性分别为17nM和11uM，通过KD比率指示的630倍差异。由于具有快速的ka和kd动力学常数，稳态近似(SSA)也用于证实HLA-G1-Fc对ILT4-His的低亲和性。
1E1(G4)对HLA-G与ILT4 3A9 T细胞转染子的结合的阻断
使用不同剂量的1E1(G4)或同种型对照预处理ILT4 3A9 T细胞转染子，随后通过二次检测1E1(G4)(图3A)或通过使用固定浓度的生物素化的HLA-G1 Fc嵌合体进行处理以评估1E1(G4)阻断关联配体的能力(图3B)。通过流式细胞术检测1E1(G4)和HLA-G Fc。数据表明1E1(G4)以剂量依赖性方式阻断HLA-G1 Fc结合。
基于Luminex和基于细胞的配体阻断和竞争测定
在基于Luminex和基于细胞的配体阻断和配体竞争测定法中测试抗体1E1、2A6、2C1和3G7抑制重组二聚体HLA-G与偶联至小珠或由CHO/ILT4+细胞表达的ILT4抗原相互作用的可能性。
将基于Luminex的配体阻断和竞争测定法用于与Luminex小珠化学偶联的重组人ILT4抗原。在阻断测定法中，小珠与一定剂量范围(0.5-9,000ng/mL，按照1:3进行系列稀释)的抗ILT4抗体1E1、2A6、2C1或3G7的hIgG4变体一起预孵育。然后，测试与小珠结合的ILT4抗原对浓度为50nM的可溶性生物素化HLA-G/Fc融合蛋白的结合。在Luminex配体竞争测定法中，与抗原偶联的Luminex小珠与浓度为50nM的可溶性生物素化HLA-G/Fc融合蛋白一起预孵育，随后是(0.5-9,000ng/mL，按照1:3进行系列稀释)的抗ILT4抗体1E1、2A6、2C1或3G7的hIgG4变体的剂量-滴定。在这两个测定设置中，使用抗链霉抗生物素蛋白-PE抗体检测ILT4:HLA-G相互作用，测定IC50值。所有测试的抗体均显示出对HLA-G与Luminex小珠偶联的ILT4/Fc的结合的剂量依赖性阻断，并且IC50值汇总在表4中。所有测试的抗体还显示出与HLA-G剂量依赖性地竞争结合Luminex小珠偶联的ILT4/Fc(数据未显示)。
表4：Luminex配体阻断测定
抗体 IC50(ng/mL)
1E1 19.2
2A6 17.7
2C1 10.2
3G7 40.0
基于细胞的配体阻断和配体竞争测定法遵循与如基于Luminex的测定法所述的相似原理，使用CHO/ILT4细胞系进行抗原表面表达。在阻断测定法中，细胞与按照1:3系列稀释的剂量范围为1-20,000ng/mL的测试抗体一起预孵育。然后，测试ILT4抗原与浓度为5μg/ml的可溶性生物素化HLA-G/Fc融合蛋白的结合。竞争测定法使用相反的设置。细胞与浓度为5μg/ml的可溶性生物素化HLA-G/Fc融合蛋白一起预孵育，随后是按照1:3系列稀释的范围为1-20,000ng/mL的测试抗体的剂量滴定。使用抗链霉抗生物素蛋白-PE抗体检测ILT4:HLA-G相互作用。所有测试的抗体均显示出对HLA-G与CHO表达的ILT4的结合的剂量依赖性阻断，并且IC50值汇总在表5中。所有测试的抗体还显示出与HLA-G剂量依赖性地竞争结合CHO表达的ILT4(数据未显示)。
表5：基于细胞的配体阻断测定
抗体 IC50(ng/mL)
1E1 98.4
2A6 232.6
2C1 56.1
3G7 374.3
p1E1(G1)对非HLA-G MHC I类配体与ILT4 3A9 T细胞转染子的结合的阻断
使用不同剂量的p1E1(G1)或hIgG1同种型对照预处理ILT4 3A9T细胞转染子，随后使用固定浓度的荧光染料标记的HLA-F或CD1d四聚体或者HLA-A02:01或HLA*B7:02dexamer进行处理，以评估p1E1(G1)阻断非HLA-G MHC I类配体的能力。p1E1(G1)以剂量可滴定方式抑制HLA-A、HLA-B和HLA-F与ILT4的结合(图4)，指示p1E1(G1)阻断其他已报道的MHC I类配体的能力。
p1E1(G1)对ANGPTL与ILT4 3A9 T细胞转染子的结合的阻断
最近报道了血管生成素样(ANGPTL)蛋白与由人造血干细胞表达的ILT4结合(Zheng等，Nature.2012年05月30日；485(7400):656-60和Deng等，Blood.2014年08月07日；124(6):924-35)。为了测试p1E1(G1)是否可以阻断ANGPTL家族成员与ILT4的结合，购买了可商购ANGPTL蛋白或蛋白片段并测试与用p1E1(G1)预处理的ILT4 3A9 T细胞转染子的结合。结合数据表明，在测试的蛋白的浓度下，ANGPTL1、4和可能地7可以结合ILT4，而不结合载体对照细胞。p1E1(G1)能够完全阻断在饱和剂量下的ANGPTL蛋白结合(图5)。
1E1(G1)与人ILT 3A9 T细胞转染子的ILT家族特异性结合
使用经转染以表达人ILT4、ILT2、ILT3(两个变体)、ILT5、LILRB5、LILRA1、LILRA2、ILT7、ILT8或ILT11的3A9 T细胞系，通过基于细胞的流式细胞术评估1E1(G4)与人ILT家族成员的ILT家族特异性结合。1E1(G4)与人ILT4特异性结合，并且与所测试的任何其他ILT家族成员均不具有交叉反应性(图6A和6B)。
实施例3：在工程化和原代细胞中抗ILT4 mAb 1E1的生物活性
在基于工程化ILT4 3A9细胞的测定法中1E1(G4)、2A6、2C1和3G7逆转白介素2抑制 的能力
将抗CD3抗体用于刺激对照小鼠3A9 T-细胞，导致IL-2释放增加。相比之下，在存在CD3刺激的情况下，ILT4 3A9 T细胞转染子不可以表达IL-2，这可能是由于ILT4与小鼠MHC I类分子或通过未知的外源性配体的交叉反应性。这种相互作用似乎导致了ILT4受体的自发多聚化/激活，从而导致抗CD3介导的IL-2释放的抑制。因此，功能性地结合ILT4并阻断ILT4与外源性配体相互作用和/或抑制受体多聚化的抗体应恢复IL释放。
测试1E1(G4)、2A6、2C1和3G7介导ILT4小鼠3A9 T-细胞转染子的IL-2释放。将1E1(G4)、2A6、2C1或3G7加入ILT4+小鼠3A9 T-细胞转染子中，在抗CD3介导的细胞刺激24小时后，通过ELISA光度法测量IL-2释放。1E1(G4)的代表性剂量应答曲线如图7中所示。根据剂量应答曲线测定测试抗体的EC50值，如表6中所示。
表6：IL-2抑制测定
抗体 EC50(g/mL)
1E1 0.43
2A6 1.2
2C1 0.24
3G7 0.26
WTMC(野生型肥大细胞)小鼠细胞脱颗粒测定(仅定性)
测试p1E1(G4)和1E1(G4)挽救ILT4:HLA-G依赖性肥大细胞脱颗粒。用人ILT4转染小鼠WTMC肥大细胞，并用针对CD200RLa的板结合抗体进行刺激。通过活化见于CD220RLa的胞内结构域中的ITAM基序，CD220RLa的抗体介导的交联导致肥大细胞脱颗粒。可以通过测定在测定上清液中的颗粒内容物释放，比色法测量脱颗粒。在存在板结合的HLA-G四聚体的情况下，CD200RLa介导的肥大细胞脱颗粒在ILT4转染子中被抑制。在使用板结合的抗CD200RLa和HLA-G四聚体进行刺激之前用p1E1(G4)或1E1(G4)预处理ILT4 WTMC转染子，以剂量可滴定方式逆转了脱颗粒抑制(图8)。
1E1(G4)对原代人外周血单核细胞(PBMC)的髓样来源细胞因子分泌的影响
在人原代PBMC LPS刺激测定法中对1E1(G4)的评估
TNFα(原型髓样来源促炎性细胞因子)的表达据报道是当使用LPS刺激时由表达低水平ILT4的单核细胞表达。具有ILT4高表达的单核细胞不表达那么多的TNFα，并且发现ILT4表达的缺乏是从银屑病关节炎患者分离的单核细胞的标志(Bergamini等，PLoSOne.2014年03月27日；9(3):e92018)。在存在促炎性刺激的情况下(例如，LPS)，在单核细胞上的ILT4表达可以抑制髓样细胞效应物活性并拮抗促炎性细胞因子诱导(例如，TNFα)。这样，用LPS处理从健康人供体分离的全PBMC，并用1E1(G4)评价ILT4拮抗作用增强促炎性髓样细胞因子表达的能力。图9A和9B显示了来自3次实验(每次3个供体)之一的数据，从而证明1E1(G4)以剂量可滴定方式增强GM-CSF和TNFα两者(这两者均是髓样来源细胞因子)的LPS依赖性表达。
在人原代PBMC抗CD3刺激测定法中对1E1(G4)的评估
为了评估在存在次优T细胞刺激的情况下，1E1(G4)处理是否可以增强T细胞或髓样效应细胞因子表达，使用抗CD3处理从健康人供体分离的全PBMC以诱导T细胞增殖，并使用1E1(G4)评价ILT4拮抗作用改变细胞因子表达的能力。图10A和10B显示了来自3次实验(每次3个供体)之一的数据，从而证明1E1(G4)以剂量可滴定方式增强GM-CSF和TNFα的抗CD3依赖性表达。
实施例4：抗ILT4抗体在人源化小鼠SK-MEL-5肿瘤模型中的抗肿瘤有效性
1E1、2A6、2C1和2D5在人源化小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤有效性
在体内肿瘤抑制测定中测试抗体1E1、2A6、2C1和2D5。使用1x106个SKMEL5黑色素瘤细胞(HLA A类*02:01)接种人源化小鼠(使用人造血干细胞重建以建立人免疫细胞组成的NSG小鼠)，监视肿瘤生长直至在约35天后观察到平均尺寸为150mm3。皮下给药7组随机分组的小鼠(每组含有6只动物)同种型对照抗体(hIgG1+hIgG4，每种20mg/kg)或者每种20mg/kg的下述抗ILT4抗体：1E1-IgG1、1E1-IgG1(N297Q)(Fc裸突变体)、1E1-IgG4、2A6-IgG4、2C1-IgG4和2D5-IgG4。每7天给药小鼠(第35、42和49天；总共3剂)并且测量肿瘤尺寸直至第63天。结果表明，与给药同种型对照的动物相比，使用1E1(IgG1、IgG1-(N297Q)、IgG4)、2A6-IgG4和2D5-IgG4处理的小鼠中的肿瘤生长受损(图17)。相比之下，使用同种型对照或抗ILT4候选物2C1处理的小鼠无法证明肿瘤生长受损。
p1E1(G4)在人源化小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤有效性
开发了人源化小鼠肿瘤模型以测试p1E1(G4)对于肿瘤生长抑制的体内有效性。使用人造血干细胞重构免疫缺陷NSG小鼠。在确认小鼠具有外周人CD45+免疫细胞(PBMC的>25％)后，使用人皮肤黑色素瘤来源肿瘤细胞系SK-MEL-5肿瘤细胞对其进行接种。选择这些细胞因为其基因表达HLA-G。接种后，使肿瘤生长至尺寸约150mm3。将小鼠随机分组并使用hIgG4同种型对照或p1E1(G4)进行攻击。
用p1E1(G4)处理的小鼠显示出在研究过程中的肿瘤生长抑制(图11A)。使用p1E1(G4)观察到1例完全抑制和1例部分抑制(图11C)。
1E1(G4)在人源化小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤有效性
在人源化小鼠SK-MEL-5肿瘤模型中测试1E1(G4)的抗肿瘤活性。在该模型中，对免疫缺陷NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠进行辐照并注射从脐带血中分离出的人CD34+造血干细胞。植入几个月后，可以在小鼠血液中检测到人免疫细胞。然后将小鼠皮下(SC)植入人黑素瘤来源SK-MEL-5细胞系。
对于该研究，在约20周龄时，对在3至4周龄时移植了来自3名独立供体的人脐带血来源CD34+细胞的NSG小鼠SC注射1×106个SK-MEL-5细胞。当在肿瘤接种(D0肿瘤随机分组)后21天平均肿瘤尺寸为约100mm3时，将携带SK-MEL-5肿瘤的人源化NSG小鼠分配到每组6只小鼠的2个治疗组(每个治疗组有来自每个人CD34+供体队列的3只小鼠)。每7天(共4剂)SC注射荷瘤小鼠20mg/kg 1E1(G4)或hIgG4同种型对照mAb。在开始治疗后，每7天监测肿瘤体积。
在1E1(G4)治疗组中的抗肿瘤有效性显著高于同种型对照组(从第28天至第49天p≤0.001)(图12A)。1E1(G4)治疗的小鼠的终点肿瘤重量低于同种型治疗的小鼠(图12C)。总体而言，结果揭示了在人源化小鼠SK-MEL-5肿瘤模型中20mg/kg 1E1(G4)的显著抗肿瘤有效性。使用1E1(G4)治疗未观察到对体重(图12B)和脾脏重量(图12D)的影响。
实施例5：1E1(G4)与人ILT 3A9 T细胞转染子的ILT4单倍型结合
使用公众可获取来源的单核苷酸多态性数据(千人基因组计划第3阶段)来确定非洲、欧洲、亚洲和南亚人群的ILT4等位基因频率。确定在任何人群中以5％或更高流行率表达的单倍型的序列(表7中的单倍型1、2、5、7、9和10)并在3A9 T细胞中表达。使用饱和剂量的抗体，1E1(G4)结合测试的所有单倍型(图13)。单倍型2对应于在Uniprot中报道的共有序列。将单倍型5用于功能性和基于配体的测定。单倍型结合数据表明1E1(G4)结合所测试的所有主要等位基因变体。
表7：各人群中ILT4的单倍型频率
Figure BDA0002309705890001031
*每个人群的单倍型均基于来自千人基因组计划的第3阶段数据，并使用PLINK测定，以分析EXAC数据库中列出的非同义SNP。
实施例6：在基于TCGA和Blueprint数据库的肿瘤和细胞类型中的ILT4的RNA表达
使用公众可获取的RNAseq数据集通过Omicsoft(Qiagen,Cary,NC)测定ILT4在肿瘤类型和细胞群体中的表达。TCGA数据集(TCGA_B38_20171002_v4,https://gdc-portal.nci.nih.gov/)包括具有RNA-Seq数据的11,292个样品。Blueprint数据集(Blueprint_B38_20170216_v2,http://www.blueprint-epigenome.eu/)包括来自具有RNA-Seq数据的55种细胞类型的258个正常血样。在RNA水平ILT4表达最高的肿瘤类型包括LAML(即，AML)、DLBC(即，DLBCL)、TGCT、MESO、KIRC(图14A)。在RNA水平ILT4表达最高的细胞类型包括中性粒细胞、单核细胞、破骨细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(图14B)。在该数据集中，淋巴细胞具有ILT4的低表达至不表达。FPKM为1(或LOG2(FPKM+0.1)为0)是最广泛接受的探索性固定阈值，虽然更低的FPKM可在样品中的“低表达”基因上报告。
实施例7：1E1(G4)与来自肿瘤组织培养样品中的髓样细胞的结合
从新鲜人肿瘤样品(手术切除)制备组织培养物，并在37℃下使用20μg/mL抗RSVIgG4(同种型对照)或1E1(G4)处理18-24小时。处理后，将肿瘤切片消化成单细胞悬液，并进行FACS染色。点图和轮廓图表示来自RCC(图15A)或CRC(图15B)肿瘤组织培养单细胞悬液的FACS数据。可以根据CD66b和/或CD14的表达情况将总的髓样细胞再分成4个子集。使用非竞争性商业抗ILT4-PE(BioLegend,目录号#338706,San Diego,CA)和细胞表面结合的1E1(G4)，使用抗IgG4二抗，同时分析这4种髓样子集的ILT4表达。在1E1(G4)-处理的组织培养物中观察到ILT4+细胞与1E1(G4)+细胞之间的良好相关性。在这些样品中，观察到肿瘤浸润淋巴细胞为ILT4-和1E1(G4)-。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
本发明的范围不受本申请描述的具体实施方式的限制。实际上，本发明的范围包括本申请具体阐述的实施方式和本申请没有具体阐述的其他实施方式；本申请具体阐述的实施方式并不一定旨在穷举。除了本申请描述的那些以外，根据前面的描述，本发明的各种改变对于本领域技术人员而言将是显而易见的。这样的改变旨在落入权利要求的范围内。
出于所有目的，在本申请全文中引用的专利、专利申请、出版物、产品描述和实验方案，其公开内容通过引用整体并入本申请。
序列表
本说明书与序列表的计算机可读形式(CRF)副本一起提交。文件名为24443_PCT_SEQLIST.txt的CRF于2018年03月22日创建，大小为128,042字节，其全部内容通过引用并入本申请。
Figure IDA0002309705940000011
Figure IDA0002309705940000021
Figure IDA0002309705940000031
Figure IDA0002309705940000041
Figure IDA0002309705940000051
Figure IDA0002309705940000061
Figure IDA0002309705940000071
Figure IDA0002309705940000081
Figure IDA0002309705940000091
Figure IDA0002309705940000101
Figure IDA0002309705940000111
Figure IDA0002309705940000121
Figure IDA0002309705940000131
Figure IDA0002309705940000141
Figure IDA0002309705940000151
Figure IDA0002309705940000161
Figure IDA0002309705940000171
Figure IDA0002309705940000181
Figure IDA0002309705940000191
Figure IDA0002309705940000201
Figure IDA0002309705940000221
Figure IDA0002309705940000231
Figure IDA0002309705940000241
Figure IDA0002309705940000251
Figure IDA0002309705940000271
Figure IDA0002309705940000291
Figure IDA0002309705940000311
Figure IDA0002309705940000321
Figure IDA0002309705940000331
Figure IDA0002309705940000351
Figure IDA0002309705940000361
Figure IDA0002309705940000371
Figure IDA0002309705940000381
Figure IDA0002309705940000391
Figure IDA0002309705940000411
Figure IDA0002309705940000421
Figure IDA0002309705940000431
Figure IDA0002309705940000441
Figure IDA0002309705940000461
Figure IDA0002309705940000481
Figure IDA0002309705940000491
Figure IDA0002309705940000501
Figure IDA0002309705940000511
Figure IDA0002309705940000531
Figure IDA0002309705940000541
Figure IDA0002309705940000551
Figure IDA0002309705940000561
Figure IDA0002309705940000571
Figure IDA0002309705940000591
Figure IDA0002309705940000601
Figure IDA0002309705940000621
Figure IDA0002309705940000641
Figure IDA0002309705940000651
Figure IDA0002309705940000661
Figure IDA0002309705940000671
Figure IDA0002309705940000681
Figure IDA0002309705940000701
Figure IDA0002309705940000711
Figure IDA0002309705940000721
Figure IDA0002309705940000731
Figure IDA0002309705940000741
Figure IDA0002309705940000771
Figure IDA0002309705940000781
Figure IDA0002309705940000791

Claims (42)

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合选自以下的人免疫球蛋白样转录物4(ILT4)表位中的一个或多个氨基酸残基：LYREKKSASW(SEQ ID NO:59)、TRIRPEL(SEQ ID NO:60)、NGQF(SEQ ID NO:61)和HTGRYGCQ(SEQ ID NO:62)，并且在存在氘源的情况下保护所述表位免受氘交换。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述ILT4表位是LYREKKSASW(SEQ ID NO:59)。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述ILT4表位是TRIRPEL(SEQID NO:60)。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述ILT4表位是NGQF(SEQ IDNO:61)。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述ILT4表位是HTGRYGCQ(SEQID NO:62)。
6.一种抗体或其抗原结合片段，其与参照抗体竞争结合选自以下的人ILT4表位：LYREKKSASW(SEQ ID NO:59)、TRIRPEL(SEQ ID NO:60)、NGQF(SEQ ID NO:61)和HTGRYGCQ(SEQ ID NO:62)，其中所述参照抗体包含含有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链免疫球蛋白和含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链免疫球蛋白。
7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述ILT4表位是LYREKKSASW(SEQ ID NO:59)。
8.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述ILT4表位是TRIRPEL(SEQID NO:60)。
9.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述ILT4表位是NGQF(SEQ IDNO:61)。
10.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述ILT4表位是HTGRYGCQ(SEQID NO:62)。
11.一种结合人ILT4的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链可变结构域，其包含：
CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，
CDR-H2：EINHXGSTNYNPSLKS，其中X是S或A(SEQ ID NO:17)，和
CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和，
轻链可变结构域，其包含：
CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19)，
CDR-L2：GX1X2NRPS，其中X1是N、Q、E或D和X2是S或A(SEQ ID NO:20)，和
CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)；
(2)重链可变结构域，其包含：
CDR-H1：SYAIS(SEQ ID NO:22)，
CDR-H2：GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:23)，和
CDR-H3：YFX1X2SGWYKGGAFDI，其中X1是D或S和X2是S或A(SEQ ID NO:24)；和，
轻链可变结构域，其包含：
CDR-L1：TLRSGINVDTYRIH(SEQ ID NO:25)，
CDR-L2：YKSDSDKHQGS(SEQ ID NO:26)，和
CDR-L3：AIWYSSTWV(SEQ ID NO:27)；
(3)重链可变结构域，其包含：
CDR-H1：SYAMH(SEQ ID NO:28)，
CDR-H2：VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:29)，和
CDR-H3：VGEWIQLWSPFDY(SEQ ID NO:30)；和，
轻链可变结构域，其包含：
CDR-L1：RASQGISSWLA(SEQ ID NO:31)，
CDR-L2：AASSLQS(SEQ ID NO:32)，和
CDR-L3：QQYNSYPPT(SEQ ID NO:33)；或
(4)重链可变结构域，其包含：
CDR-H1：ELSMH(SEQ ID NO:34)，
CDR-H2：GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQ ID NO:35)，和
CDR-H3：AGPLYTIFGVVIIPDNWFDP(SEQ ID NO:36)；和，
轻链可变结构域，其包含：
CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:37)，
CDR-L2：GNSNRPS(SEQ ID NO:38)，和
CDR-L3：QSYDSSLSGSGVV(SEQ ID NO:39)。
12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变结构域，其包含：
CDR-H1：GYYWS(SEQ ID NO:16)，
CDR-H2：EINHAGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:48)，和
CDR-H3：LPTRWVTTRYFDL(SEQ ID NO:18)；和，
轻链可变结构域，其包含：
CDR-L1：TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO:19),
CDR-L2：GDSNRPS(SEQ ID NO:52)，和
CDR-L3：QSFDNSLSAYV(SEQ ID NO:21)。
13.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链免疫球蛋白，其与SEQ ID NO:3、4、5、6、7、11、13、15或45所示的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性，和/或
重链免疫球蛋白，其与SEQ ID NO:1、2、8、9、10、12、14、44、79、80、81、82、83、84、85或86所示的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
14.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链免疫球蛋白，其包含与SEQ ID NO:70、71、72、73、58、74、75、76或77所示的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的轻链可变结构域，和/或
重链免疫球蛋白，其包含与SEQ ID NO:63、57、64、65、66、67、68或69所示的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的重链可变结构域。
15.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7、11、13、15或45所示的氨基酸序列；和/或
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:1、2、8、9、10、12、14、44、79、80、81、82、83、84、85或86所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:70、71、72、73、58、74、75、76或77所示的氨基酸序列，和/或
重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:63、57、64、65、66、67、68或69所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1)
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:1或79所示的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
(2)
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:2或80所示的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
(3)
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:2或80所示的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
(4)
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:2或80所示的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
(5)
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:2或80所示的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
(6)
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:2或80所示的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
(7)
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:8或82所示的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(8)
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:9或83所示的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(9)
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:10或84所示的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(10)
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:12或85所示的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；或者
(11)
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:14或86所示的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1)
重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；和
轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列；
(2)
重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；和
轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列；
(3)
重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；和
轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列；
(4)
重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；和
轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列；
(5)
重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；和
轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；
(6)
重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；和
轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列；
(7)
重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列；和
轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列；
(8)
重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列；和
轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列；
(9)
重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；和
轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列；
(10)
重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；和
轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列；
(11)
重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列；和
轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列。
19.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；和
轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
21.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段被工程化的酵母N-连接聚糖或CHO N-连接聚糖糖基化。
23.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其还包含治疗剂。
25.根据权利要求23或24所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体。
26.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码根据权利要求1-21中任一项所述的抗体或抗原结合片段的VH、VL、VH和VL两者、重链免疫球蛋白、轻链免疫球蛋白、或重链免疫球蛋白和轻链免疫球蛋白两者的核苷酸序列。
27.一种载体，所述载体包含权利要求26所述的多核苷酸。
28.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求26所述的多核苷酸或权利要求27所述的载体。
29.一种在有需要的人类受试者中阻断ILT4与HLA-G、HLA-A、HLA-B和/或HLA-F结合的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用有效量的根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
30.一种在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用有效量的根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其还包括对所述人类受试者进行治疗程序和/或施用治疗剂。
32.一种生产权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养权利要求28所述的宿主细胞以表达所述抗体或其抗原结合片段。
33.一种生产权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括表达权利要求26所述的多核苷酸。
34.一种结合人ILT4的抗体或其抗原结合片段，其由权利要求32或33所述的方法生产。
35.一种用于检测样品中的ILT4肽或其片段的方法，所述方法包括将所述样品与权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触，并检测所述抗体或其抗原结合片段与所述ILT4肽或其片段之间的复合物的存在；其中检测到所述复合物表明存在所述ILT4肽或其片段。
36.权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段用于治疗癌症的用途。
37.根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗癌症。
38.一种抗体，其由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列和每条重链包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
39.根据权利要求38所述的抗体，其中所述轻链还包含SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列和/或所述重链还包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。
40.一种抗体，其由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列和每条重链包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
41.一种抗体，其由两条重链和两条轻链组成，其中每条轻链由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成和每条重链由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。
42.一种药物组合物，所述药物组合物包含：(i)由两条重链和两条轻链组成的抗体，其中每条轻链由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成和每条重链由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，和(ii)帕博利珠单抗。
CN201880038297.7A 2017-04-07 2018-04-05 抗ilt4抗体和抗原结合片段 Pending CN110719917A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762483019P 2017-04-07 2017-04-07
US62/483,019 2017-04-07
PCT/US2018/026160 WO2018187518A1 (en) 2017-04-07 2018-04-05 Anti-ilt4 antibodies and antigen-binding fragments

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110719917A true CN110719917A (zh) 2020-01-21

Family

ID=62063229

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880038297.7A Pending CN110719917A (zh) 2017-04-07 2018-04-05 抗ilt4抗体和抗原结合片段

Country Status (27)

Country Link
US (3) US11053315B2 (zh)
EP (1) EP3606958A1 (zh)
JP (2) JP7045392B2 (zh)
KR (1) KR102357823B1 (zh)
CN (1) CN110719917A (zh)
AR (1) AR111362A1 (zh)
AU (2) AU2018248294B2 (zh)
BR (1) BR112019021000A2 (zh)
CA (1) CA3057378A1 (zh)
CL (1) CL2019002855A1 (zh)
CO (1) CO2019011155A2 (zh)
CR (1) CR20190459A (zh)
DO (1) DOP2019000253A (zh)
EA (1) EA201992402A1 (zh)
EC (1) ECSP19072235A (zh)
GE (1) GEP20227440B (zh)
IL (1) IL269593A (zh)
JO (1) JOP20190236B1 (zh)
MX (1) MX2019011927A (zh)
NI (1) NI201900103A (zh)
PE (1) PE20191813A1 (zh)
PH (1) PH12019502275A1 (zh)
SG (1) SG11201909081YA (zh)
TN (1) TN2019000272A1 (zh)
TW (1) TWI796329B (zh)
UA (1) UA126865C2 (zh)
WO (1) WO2018187518A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023077521A1 (en) * 2021-11-08 2023-05-11 Celldex Therapeutics, Inc Anti-ilt4 and anti-pd-1 bispecific constructs
WO2024008190A1 (en) * 2022-07-08 2024-01-11 Elpiscience (Suzhou) Biopharma, Ltd. Anti-lilrb2 antibodies and uses thereof
WO2024051804A1 (zh) * 2022-09-08 2024-03-14 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗ilt4抗体及其医药用途

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3222634A1 (en) 2007-06-18 2017-09-27 Merck Sharp & Dohme B.V. Antibodies to human programmed death receptor pd-1
CA3087166A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to lilrb2
AU2019302454A1 (en) * 2018-07-09 2021-02-25 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies binding to ILT4
EP3827020A1 (en) * 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc. Combination of lilrb1/2 pathway inhibitors and pd-1 pathway inhibitors
EP3852805A4 (en) * 2018-09-17 2022-06-15 Icahn School of Medicine at Mount Sinai ANTI-LILRB2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
MX2022001841A (es) 2019-08-12 2022-08-17 Biond Biologics Ltd Anticuerpos contra ilt2 y uso de los mismos.
CN112442527B (zh) * 2019-08-27 2022-11-11 深圳市英马诺生物科技有限公司 孤独症诊断试剂盒、基因芯片、基因靶点筛选方法及应用
CN115087461A (zh) * 2019-12-20 2022-09-20 默沙东有限责任公司 使用pd-1拮抗剂、ilt4拮抗剂和化学治疗剂的组合治疗癌症的方法
US20230058779A1 (en) * 2020-01-02 2023-02-23 Merck Sharp & Dohme Llc Combination cancer treatment using a pd-1 antagonist, an ilt4 antagonist, and lenvatinib or salts thereof
CN116589581A (zh) 2020-05-01 2023-08-15 恩格姆生物制药公司 Ilt结合剂和其使用方法
AU2021345096A1 (en) * 2020-09-17 2023-04-20 Merck Sharp & Dohme Llc Dosing regimens of anti-ILT4 antibody or its combination with anti-PD-1 antibody for treating cancer
IL307519A (en) * 2021-04-09 2023-12-01 Celldex Therapeutics Inc Antibodies against ILT4, anti-ILT4\PD-L1 bispecific antibody and their uses
WO2023012347A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Immunos Therapeutics Ag Pharmaceutical compositions comprising hla fusion proteins
CA3227617A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Osiris MARROQUIN BELAUNZARAN Combination medicaments comprising hla fusion proteins
WO2023114346A2 (en) * 2021-12-16 2023-06-22 Merck Sharp & Dohme Llc Biomarkers for predicting eligibility for an anti-ilt4 and anti-pd-1 combination therapy
WO2023170434A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Macomics Limited Compositions and methods for modulation of macrophage activity
WO2023192798A2 (en) * 2022-03-28 2023-10-05 Coherus Biosciences, Inc. Anti-ilt4 compositions and methods
WO2023211868A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Merck Sharp & Dohme Llc Stable formulations of anti-ilt4 antibodies or antigen-binding fragments thererof in combination with anti-pd-1 antibodies and methods of use thereof
WO2024022462A1 (zh) * 2022-07-29 2024-02-01 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种抗ilt4的单域抗体及其应用
WO2024041315A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 Antengene (Hangzhou) Biologics Co., Ltd. Novel anti-lilrb2 antibodies and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014164519A1 (en) * 2013-03-12 2014-10-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for inhibiting the effects of amyloid beta oligomers
WO2015179633A1 (en) * 2014-05-22 2015-11-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Lilrb2 and notch-mediated expansion of hematopoietic precursor cells
WO2016144728A2 (en) * 2015-03-06 2016-09-15 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Anti-lilrb antibodies and their use in detecting and treating cancer

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6448035B1 (en) 1997-04-24 2002-09-10 Immunex Corporation Family of immunoregulators designated leukocyte immunoglobulin-like receptor (LIR)
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
GB9818110D0 (en) 1998-08-19 1998-10-14 Weston Medical Ltd Needleless injectors and other devices
US6096002A (en) 1998-11-18 2000-08-01 Bioject, Inc. NGAS powered self-resetting needle-less hypodermic jet injection apparatus and method
NZ512185A (en) 1998-12-09 2004-02-27 Dow Chemical Co A method for manufacturing glycoproteins having human- type glycosylation in plant cells
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
PT1914244E (pt) 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
US7795002B2 (en) 2000-06-28 2010-09-14 Glycofi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
DE60139720D1 (de) 2000-06-28 2009-10-08 Glycofi Inc Verfahren für die Herstellung modifizierter Glykoproteine
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US7632983B2 (en) 2000-07-31 2009-12-15 Biolex Therapeutics, Inc. Expression of monoclonal antibodies in duckweed
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
WO2003000199A2 (en) 2001-06-25 2003-01-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Ilt3 and ilt4-related compositions and methods
EP1443961B1 (en) 2001-10-25 2009-05-06 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20050238643A1 (en) 2001-11-14 2005-10-27 Arm Jonathan P Modulation of lir function to treat rheumatoid arthritis
JPWO2003085107A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 ゲノムが改変された細胞
WO2003086310A2 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Prevention of brain inflammation as a result of induced autoimmune response
US7410483B2 (en) 2003-05-23 2008-08-12 Novare Surgical Systems, Inc. Hand-actuated device for remote manipulation of a grasping tool
ES2619171T3 (es) 2003-07-24 2017-06-23 Innate Pharma S.A. Métodos y composiciones para aumentar la eficacia de anticuerpos terapéuticos utilizando compuestos para la potenciación de linfocitos NK
EP3363907A1 (en) 2004-05-27 2018-08-22 The Trustees of the University of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
WO2005120571A2 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Method of passive immunization against disease or disorder characterized by amyloid aggregation with diminished risk of neuroinflammation
DE102004034416A1 (de) 2004-07-15 2006-02-02 "Stiftung Caesar" (Center Of Advanced European Studies And Research) Flüssige, strahlunghärtende Zusammensetzungen
US7875278B2 (en) 2005-02-18 2011-01-25 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies against prostate specific membrane antigen (PSMA) lacking in fucosyl residues
PE20071101A1 (es) 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
MX363905B (es) 2006-06-12 2019-04-08 Aptevo Res & Development Llc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
ES2437110T3 (es) 2006-11-14 2014-01-08 Genentech, Inc. Moduladores de la regeneración neuronal
US8815826B2 (en) 2010-07-23 2014-08-26 Regulus Therapeutics, Inc. Targeting microRNAs for the treatment of fibrosis
TW201247700A (en) 2011-05-05 2012-12-01 Baylor Res Inst Immunoglobulin-like transcript (ILT) receptors as CD8 antagonists
AU2013201121A1 (en) 2011-09-20 2013-04-04 Vical Incorporated Synergistic anti-tumor efficacy using alloantigen combination immunotherapy
WO2013066765A1 (en) 2011-11-01 2013-05-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Mutation of tup1 in glycoengineered yeast
PL3144389T3 (pl) 2011-12-30 2018-10-31 Cellscript, Llc WYTWARZANIE I STOSOWANIE ZSYNTETYZOWANEGO IN VITRO ssRNA DO WPROWADZANIA DO SSACZYCH KOMÓREK W CELU INDUKCJI EFEKTU BIOLOGICZNEGO LUB BIOCHEMICZNEGO
US20150174203A1 (en) 2012-05-30 2015-06-25 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Compositions And Methods For Modulating Pro-Inflammatory Immune Response
EP2866821B1 (en) 2012-07-02 2018-11-14 Medizinische Universität Wien Complement split product c4d for the treatment of inflammatory conditions
EP2730588A1 (en) 2012-11-12 2014-05-14 Intelectys Antibodies and fragments thereof raised against the alpha-3 domain of HLA-G protein, methods and means for their preparation, and uses thereof
US10000554B2 (en) 2012-12-28 2018-06-19 Osaka University Modified laminin containing collagen binding molecule and use thereof
PT3021859T (pt) 2013-10-25 2018-03-09 Psioxus Therapeutics Ltd Adenovírus oncolíticos munidos de genes heterólogos
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
WO2016044022A1 (en) 2014-09-16 2016-03-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Blocking pirb upregulates spines and functional synapses to unlock visual cortical plasticity and facilitate recovery from amblyopia
WO2016111947A2 (en) 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
EP3256163A4 (en) 2015-02-11 2018-10-10 University Health Network Methods and compositions for modulating lilr proteins
WO2017042814A1 (en) 2015-09-10 2017-03-16 Yeda Research And Development Co. Ltd. Use of perforin positive immature dendritic cells in disease treatment
WO2018013534A1 (en) 2016-07-11 2018-01-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating pten deficient epithelial cancers using a combination of anti-pi3kbeta and anti-immune checkpoint agents
CN109790213B (zh) 2016-07-29 2022-10-18 德克萨斯大学体系董事会 用于鉴定lilrb阻断抗体的方法
WO2018027197A1 (en) 2016-08-04 2018-02-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Cancer antigen targets and uses thereof
US20200340012A1 (en) 2016-08-18 2020-10-29 The Regents Of The University Of California Crispr-cas genome engineering via a modular aav delivery system
WO2018035710A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 Akeso Biopharma, Inc. Anti-ctla4 antibodies
CN109996871A (zh) 2016-09-28 2019-07-09 加维什-加利里生物应用有限公司 供靶向癌症的新型抗原标志的car疗法用的通用平台
CA3087166A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to lilrb2
AU2019302454A1 (en) 2018-07-09 2021-02-25 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies binding to ILT4

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014164519A1 (en) * 2013-03-12 2014-10-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for inhibiting the effects of amyloid beta oligomers
WO2015179633A1 (en) * 2014-05-22 2015-11-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Lilrb2 and notch-mediated expansion of hematopoietic precursor cells
WO2016144728A2 (en) * 2015-03-06 2016-09-15 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Anti-lilrb antibodies and their use in detecting and treating cancer

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王春艳等: "抗人ILT-4单克隆抗体制备及初步鉴定", 《细胞与分子免疫学杂志》 *
王春艳等: "抗人ILT-4单克隆抗体制备及初步鉴定", 《细胞与分子免疫学杂志》, vol. 24, no. 03, 15 March 2008 (2008-03-15), pages 238 - 239 *
王琳琳: "ILT4在乳腺癌中的表达及其临床意义", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑 *
许惠惠等: "ILT受体在HLA-G参与免疫耐受机制中的研究进展", 《生命科学》 *
许惠惠等: "ILT受体在HLA-G参与免疫耐受机制中的研究进展", 《生命科学》, vol. 24, no. 07, 15 July 2012 (2012-07-15), pages 640 - 645 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023077521A1 (en) * 2021-11-08 2023-05-11 Celldex Therapeutics, Inc Anti-ilt4 and anti-pd-1 bispecific constructs
WO2024008190A1 (en) * 2022-07-08 2024-01-11 Elpiscience (Suzhou) Biopharma, Ltd. Anti-lilrb2 antibodies and uses thereof
WO2024051804A1 (zh) * 2022-09-08 2024-03-14 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗ilt4抗体及其医药用途

Also Published As

Publication number Publication date
PH12019502275A1 (en) 2020-09-21
US11053315B2 (en) 2021-07-06
AU2018248294B2 (en) 2021-08-05
CA3057378A1 (en) 2018-10-11
DOP2019000253A (es) 2019-12-15
KR102357823B1 (ko) 2022-01-28
EA201992402A1 (ru) 2020-02-19
CL2019002855A1 (es) 2020-02-21
CO2019011155A2 (es) 2019-10-21
UA126865C2 (uk) 2023-02-15
US20220002403A1 (en) 2022-01-06
KR20190136064A (ko) 2019-12-09
JP2022084773A (ja) 2022-06-07
US11897956B2 (en) 2024-02-13
EP3606958A1 (en) 2020-02-12
US20220033496A1 (en) 2022-02-03
IL269593A (en) 2019-11-28
WO2018187518A1 (en) 2018-10-11
BR112019021000A2 (pt) 2020-05-05
AR111362A1 (es) 2019-07-03
ECSP19072235A (es) 2019-12-27
JOP20190236B1 (ar) 2023-09-17
MX2019011927A (es) 2020-02-10
CR20190459A (es) 2020-02-14
JP7045392B2 (ja) 2022-03-31
US11897957B2 (en) 2024-02-13
JP7394160B2 (ja) 2023-12-07
GEP20227440B (en) 2022-11-25
JOP20190236A1 (ar) 2019-10-06
PE20191813A1 (es) 2019-12-26
AU2021225143A1 (en) 2021-09-30
US20180298096A1 (en) 2018-10-18
NI201900103A (es) 2019-10-31
JP2020519235A (ja) 2020-07-02
TW201839014A (zh) 2018-11-01
AU2018248294A1 (en) 2019-10-10
SG11201909081YA (en) 2019-10-30
TWI796329B (zh) 2023-03-21
TN2019000272A1 (en) 2021-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11897957B2 (en) Anti-ILT4 antibodies and antigen-binding fragments
US11958902B2 (en) Anti-TIGIT antibodies
JP7142618B2 (ja) イヌ化抗体
CN107148430B (zh) 抗tigit抗体
EP2125894B1 (en) Binding proteins, including antibodies, antibody derivatives and antibody fragments, that specifically bind cd154 and uses thereof
CA2961987A1 (en) Pd-l1 antibodies binding canine pd-l1
EP2583980A1 (en) Antibodies directed against the alpha chain of IL7 receptor - their use for the preparation of drug candidates
AU2016246152A9 (en) Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
TW202325735A (zh) 特異性結合ｃｄ４７及ｃｄ２０之雙特異性抗體及其用途
WO2022166846A1 (zh) 抗tnfr2抗体及其用途
EA044253B1 (ru) Антитела против ilt4 и антигенсвязывающие фрагменты
JP2023523395A (ja) 抗ｏｘ４０抗体及びその使用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220930

Address after: new jersey

Applicant after: MERCK SHARP & DOHME B.V.

Applicant after: AGENUS Inc.

Address before: new jersey

Applicant before: MERCK SHARP & DOHME Corp.

Applicant before: AGENUS Inc.

TA01 Transfer of patent application right