BR112017023199B1 - Peptídeo com atividade antiobesidade, antidiabetes e uso do mesmo - Google Patents

Abstract

um peptídeo e um complexo peptídico da presente invenção exibem um efeito anti-obesidade, inibindo o acúmulo de gordura e a decompondo a gordura já acumulada, e exibem um excelente efeito em relação ao diabetes reduzindo efetivamente o açúcar no sangue. o peptídeo e o complexo peptídico da presente invenção diminuem a expressão de ppar¿, acc e ap2, que são marcadores adipogênicos, aumentam a expressão de phsl, ampk-a1, cgi-58 e atgl, que são fatores lipolíticos e reduzem o tamanho das células de gordura e os valores de colesterol no sangue. o peptídeo e o complexo peptídico da presente invenção, que têm excelente atividade e segurança, podem ser vantajosamente aplicados a fármacos e quase-fármacos.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] Este pedido reivindica a prioridade em relação ao Pedido de Patente Coreano número 10-2015-0059648, arquivado em 28 de abril de 2015 no KIPO. O conteúdo do pedido citado é incorporado ao presente documento como referência acima em sua totalidade.

[0002] A presente invenção se refere a um peptídeo com atividade antiobesidade, antidiabetes e uso do mesmo.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[0003] Na Coréia, a ingestão de gordura na dieta aumentou recentemente com o crescimento da economia e ocidentalização da dieta, além do aparecimento de doenças metabólicas como obesidade, diabetes, hiperlipidemia, hipertensão, arteriosclerose e fígado gorduroso que aumentaram devido à falta de exercícios. Além disso, a obesidade é um problema estético para as pessoas que geralmente tendem a preferir corpos delineados a serem associados a vários transtornos.

[0004] Até à data, os agentes terapêuticos para a obesidade podem ser amplamente divididos em fármacos que atuam no sistema nervoso central para afetar o apetite e medicamentos que atuam no trato gastrointestinal para inibir a absorção. Os fármacos que atuam no sistema nervoso central foram colocados no mercado como fármacos antiobesidade que funcionam na serotonina (5-HT) no sistema nervoso central, como fenfluramina, dexfenfluramina e similares, no sistema nervoso da noradrenalina, como efedrina e cafeína, e no sistema nervoso tanto na serotonina quanto na noradrenalina, tal como a sibutramina desenvolvida recentemente, conforme classificada por mecanismos de atuação. O representante dos fármacos antiobesidade que atuam no trato gastrointestinal é o orlistat, aprovado como agente terapêutico para a obesidade, que inibe a lipase intestinal de modo a reduzir a absorção de gordura. Existem alguns problemas pré- existentes com alguns dos fármacos. Por exemplo, a fenfluramina e similares tiveram sua comercialização proibida devido ao efeito colateral de incorrer em hipertensão pulmonar primária ou doença cardíaca valvular, e outros fármacos não podem ser aplicadas a pacientes com insuficiência cardíaca ou insuficiência renal devido à ocorrência de redução da pressão arterial ou acidose láctica.

[0005] O diabetes representa um grupo de distúrbios metabólicos causados quando a insulina é secretada ou não habilita a função normal (DeFronzo, 1988) sendo caracterizada por hiperglicemia, isto é, níveis elevados de açúcar no sangue durante um período prolongado, o que causa vários sintomas e síndromes, com glicose na urina. Nos últimos anos, a prevalência de obesidade, em particular, a obesidade abdominal aumentou, levando à explosão da prevalência de diabetes.

[0006] A partir de 2000, os pacientes com diabetes foram estimados em 170 milhões em todo o mundo e esperavam aumentar para 370 milhões de pessoas em 2030. No entanto, um relatório de análise de 2008 mostrou que o número de pacientes com diabetes já pode ter atingido 350 milhões em todo o mundo (Danaei e outros, 2011), com agregação muito mais significativa do que a expectativa. Foi relatado que mais de cerca de 80% dos pacientes com diabetes tipo 1 são obesos, enquanto que apenas menos de 10% dos pacientes (não) obesos têm diabetes (Harris e outros, 1987). A correlação entre diabetes e obesidade é atribuída ao fato de que as adipocinas e os ácidos graxos livres são secretamente segregados para induzir ácidos graxos a se acumularem em tecidos sensíveis à insulina, como células beta, rins, fígado, coração, etc., resultando em lipotoxicidade. Se for deixada sem tratamento adequado, a hiperglicemia crônica pode ser propensa a apresentar vários sintomas patológicos, incluindo retinopatia, disfunção renal, neuropatia e distúrbios vasculares. Indispensável para prevenir tais complicações é o controle efetivo do açúcar no sangue.

[0007] Hoje em dia, o controle dos níveis de açúcar no sangue é realizado pela melhoria do estilo de vida (terapia de dieta, terapia de exercícios) e medicamentos. No entanto, a terapia de dieta ou a terapia de exercícios é difícil de ser gerenciada e praticada rigorosamente, com limitações dos seus efeitos. Assim, a maioria dos pacientes com diabetes depende do controle dos níveis de açúcar no sangue por meio de medicamentos como insulina, secretagogos de insulina, sensibilizadores de insulina e agentes hipoglicemiantes, bem como a melhoria do estilo de vida.

[0008] A insulina produzida usando um método recombinante é usada como um medicamento indispensável para pacientes com diabetes tipo 1 e pacientes com diabetes tipo 2 que não conseguem controlar os níveis de açúcar no sangue e é vantajoso no controle do açúcar no sangue. No entanto, sofre da desvantagem de repulsão para agulhas de seringas, dificuldade na administração, risco de hipoglicemia e ganho de peso.

[0009] As meglitinidas, tipos de secretagogos de insulina, são agentes de ação curta e são ingeridos antes das refeições. Entre eles estão NovoNorm (repaglinida), Fastic (nateglinida) e Glufast (mitiglinida). Os sensibilizadores de insulina são caracterizados por quase nenhuma ocorrência hiperglicêmica quando ingeridos sozinhos e podem ser exemplificados por fármacos de biguanida, tais como metformina e fármacos de tiazolidinediona, como Avanida (rosiglitazona) e Actos (pioglitazona).

[0010] Recentemente, os agonistas de GLP-1 foram desenvolvidos usando a ação do peptídeo-1 do tipo glucagon, que é um hormônio estimulador da secreção de insulina, e inclui exenatida e Victoza (liraglutida). Além disso, os inibidores de DDP-4, que inibem a ação da DPP (dipeptidil peptidase-4), uma enzima responsável pela inativação rápida de GLP-1, são fármacos recentemente desenvolvidas e são representativamente exemplificados por Januvia (nome do ingrediente: sitagliptina). No entanto, esses medicamentos têm efeitos colaterais de hepatotoxicidade, distúrbios gastrointestinais, distúrbios cardiovasculares e carcinogenicidade. Outro problema com os fármacos é um alto custo de tratamento anual, que é uma barreira para o tratamento da diabetes. De fato, os custos de cuidados com a saúde do pré-diabetes e do diabetes se aproximaram de cerca de 200 trilhões de ganho nos USA a partir de 2007 (Dall e outros, 2010) e os custos de cuidados com a saúde da obesidade também são cerca de 150 trilhões apenas nos USA a partir de 2008 (Finkelstein e outros, 2009). Portanto, há uma necessidade urgente para o desenvolvimento de um fármaco que possa reduzir efetivamente os níveis de glicose no sangue e possa ser aplicado tanto ao diabetes quanto ao diabetes induzido por obesidade, com menos efeitos colaterais.

[0011] Para isso, os presentes inventores recentemente prestaram atenção aos mecanismos de regulação do metabolismo energético para encontrar um método melhorado para o tratamento da obesidade e criaram pesquisas de sinais responsáveis pelo acúmulo de lipídeos e proteínas que afetam o acúmulo de lipídeos após a ingestão de dietas ricas em gordura em seres humanos, com a premissa de que o composto a ser desenvolvido deve ser de maior segurança (menor toxicidade). Como resultado da pesquisa de sinais para a supressão da expressão de proteínas responsáveis pelo acúmulo de gordura e pela degradação da gordura acumulada e nas proteínas envolvidas na sinalização, os presentes inventores conseguiram desenvolver peptídeos que promovem a lipólise. Além disso, os peptídeos da presente invenção exibem excelente eficácia terapêutica em diabetes e diabetes induzido por obesidade. O acúmulo de gordura induzido por dietas com alto teor de gordura, a supressão da sinalização de insulina atribuída ao acúmulo de gordura no fígado ou músculo, e a tolerância à insulina resultante são causas de diabetes. Cada um e complexos de peptídeos de acordo com a presente invenção são terapeuticamente eficazes para o diabetes e diabetes induzido por obesidade.

[0012] Ao longo deste relatório descritivo, é feita referência a muitos documentos e documentos de patentes, com suas citações indicadas. As revelações dos documentos citados e documentos de patente são inteiramente incorporados ao presente documento como referência e, portanto, o nível do campo técnico ao qual a presente invenção se refere e os conteúdo da presente invenção são explicados de forma mais definitiva.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Problema técnico

[0013] Pesquisas intensas e aprofundadas sobre o desenvolvimento de peptídeos excepcionais plurais com atividade biologicamente eficaz que culminaram na presente invenção, conduzidas pelos presentes inventores, levaram à descoberta de que os peptídeos que possuem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 1 a 7 exibem não apenas efeitos antiobesidade, suprimindo o acúmulo de gordura induzida por dieta rica em gordura e gorduras acumuladas já degradadas, mas também altos efeitos terapêuticos sobre diabetes e diabetes induzido por obesidade e complicações do diabetes.

[0014] Consequentemente, um objetivo da presente invenção é proporcionar peptídeos possuindo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 1 a 7.

[0015] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um peptídeo com atividade antiobesidade ou antidiabetes.

[0016] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um complexo peptídico com atividade antiobesidade ou antidiabetes.

[0017] Outro objetivo adicional da presente invenção é proporcionar uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento da obesidade.

[0018] Ainda outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de diabetes.

[0019] Outros propósitos e vantagens da presente invenção serão clarificados pela descrição detalhada que se segue da invenção, reivindicações e desenhos.

Solução Técnica

[0020] Uma forma de realização da presente invenção proporciona um peptídeo apresentando uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 1 a 7.

[0021] Outra forma de realização da presente invenção proporciona um peptídeo de atividade antiobesidade e antidiabetes apresentando uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 1 a 7.

[0022] Um complexo peptídico de atividade antiobesidade e antidiabetes é fornecido de acordo com outra forma de realização da presente invenção sendo constituído pela seguinte combinação peptídica: (a) um peptídeo possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; (b) um peptídeo possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 3; e (c) um peptídeo possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou 7.

[0023] Como resultado do esforço dos presentes inventores para o desenvolvimento de peptídeos excepcionais plurais com atividade biologicamente eficaz, verificou-se que os peptídeos que possuem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 1 a 7 suprimem o acúmulo de gordura induzido por dieta rica em gordura e degradam a gordura já acumulada, exibindo assim um efeito antiobesidade e um efeito terapêutico sobre diabetes e diabetes induzido por obesidade, ou complicações do diabetes.

[0024] Tal como empregado no presente documento, o termo "peptídeo" se refere a uma molécula linear de resíduos de aminoácidos unida por ligações peptídicas. Os peptídeos da presente invenção podem ser preparados utilizando métodos de síntese química conhecidos na técnica, especialmente técnicas de síntese em fase sólida (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54 (1963); Stewart e outros, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) or a liquid-phase synthesis method (Patente US 5.516.891).

[0025] A fim de selecionar regiões das suas sequências de aminoácidos e aumentar a sua atividade, os peptídeos da presente invenção podem ser modificados nos términos N ou C dos mesmos. Através de tal modificação, os peptídeos da presente invenção podem apresentar uma semivida prolongada após a administração in vivo.

[0026] Além disso, os términos C dos peptídeos da presente invenção podem ser modificados com um grupo hidróxido (-OH), um grupo amino (-NH2), um grupo azida (-NHNH2), etc., enquanto os términos N podem ser acoplados com um radical protetor que consiste no grupo constituído por acetila, fluorenil metoxicarbonila, formila, palmitoíla, miristila, estearila e polietileno glicol (PEG).

[0027] Através da modificação de aminoácidos acima mencionada, os peptídeos da presente invenção podem aumentar grandemente a estabilidade. Tal como empregado no presente documento, o termo "estabilidade" pretende referir-se tanto à estabilidade in vivo quanto à estabilidade de armazenamento (por exemplo, estabilidade durante o armazenamento à temperatura ambiente). O grupo protetor atua para proteger os peptídeos da presente invenção contra o ataque de proteinases in vivo.

[0028] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, os peptídeos da presente invenção exibem o efeito de supressão de acúmulo de gordura induzida por dieta rica em gordura e degradação de gorduras já acumuladas, diminuem a expressão dos marcadores adipogênicos PPARY, ACC e aP2, aumentam a expressão dos fatores lipolíticos pHSL, AMPK-α1, CGI-58 e ATGL, reduzem o tamanho das células adiposas e baixam os níveis de colesterol no sangue. Estes resultados indicam que os peptídeos da presente invenção têm excelentes efeitos terapêuticos sobre os obesos.

[0029] Não apenas os peptídeos individuais das SEQ ID NOS: 1 a 7, mas também um seu complexo exibem excelente atividade antiobesidade e antidiabética.

[0030] De acordo com a presente invenção, os peptídeos das SEQ ID NOS: 3, 5 e 7 correspondem respectivamente às das SEQ ID NOS: 2, 4 e 6, com a exceção de que o resíduo Cys é substituído com o resíduo Ser. Os peptídeos emparelhados correspondentes são quase idênticos em termos de atividade antiobesidade e antidiabética.

[0031] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, o complexo peptídico que apresenta atividade antiobesidade ou antidiabetes é composto por um peptídeo com o aminoácido sequência da SEQ ID NO: 1; um peptídeo possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 3; e um peptídeo possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou 7.

[0032] De acordo com outra forma de realização da presente invenção, o complexo peptídico da presente invenção é composto de peptídeos possuindo respectivamente as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOS: 1, 3 e 7.

[0033] De acordo com outro aspecto da presente invenção é contemplada uma composição farmacêutica compreendendo o peptídeo ou o complexo peptídico da presente invenção como um ingrediente eficaz para preparar ou tratar a obesidade.

[0034] O peptídeo ou o complexo peptídico da presente invenção pode encontrar aplicações na profilaxia ou terapia do diabetes funcionando para efetivamente diminuir um nível de açúcar aumentado no sangue nos modelos de animais com diabetes.

[0035] De acordo com algumas concretizações particulares da presente invenção, a composição da presente invenção é uma composição farmacêutica compreendendo: (a) uma quantidade farmaceuticamente eficaz do peptídeo ou complexo peptídico da presente invenção; e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0036] O termo "quantidade farmaceuticamente eficaz", tal como empregado no presente documento, significa uma quantidade suficiente para atingir a eficácia ou atividade acima referida do peptídeo.

[0037] O transportador farmaceuticamente aceitável contido na composição farmacêutica da presente invenção pode ser aquele comumente usado em formulações de fármaco e inclui, mas não está limitado à lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, goma de acácia, carbonato de cálcio, alginato, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, xarope, metilcelulose, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila, talco, estearato de magnésio e óleo mineral. Além desses ingredientes, a composição farmacêutica da presente invenção pode ainda compreender um lubrificante, um umectante, um edulcorante, um aromatizante, um emulsionante, um agente de suspensão e um conservante. No que diz respeito aos veículos e agentes farmaceuticamente aceitáveis adequados para utilização, pode ser feita referência Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995).

[0038] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada oral ou parentericamente. Para administração parentérica, podem ser utilizadas rotas intramusculares, intravenosas, subcutâneas, intraperitoneais, tópicas ou transcutâneas.

[0039] A dosagem da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode variar dependendo de vários fatores, incluindo a forma de dosagem, a modalidade de administração, a idade, peso, sexo, estado de saúde, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção, sensibilidade, etc. Por exemplo, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada numa dose diária na gama de 0,0001 a 1.000 μg.

[0040] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser preparada na forma de dose única ou em pacotes de doses múltiplas utilizando um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável de acordo com um método que pode ser facilmente realizado pelos versados na técnica. No presente documento, a formulação da composição farmacêutica pode ser uma solução, suspensão ou emulsão da composição farmacêutica em óleo ou meio aquoso, ou um extrato, pó, grânulo, comprimido ou cápsula contendo a composição farmacêutica e pode ainda compreender um agente dispersante ou um estabilizador.

Efeitos vantajosos

[0041] As características e vantagens da presente invenção são resumidas da seguinte maneira:

[0042] (i) os peptídeos e o complexo peptídico da presente invenção exibem não apenas um efeito antiobesidade por supressão do acúmulo de gordura e degradação de gorduras já acumuladas, mas também um efeito terapêutico excepcional sobre o diabetes reduzindo efetivamente os níveis de açúcar no sangue.

[0043] (ii) os peptídeos e o complexo peptídico da presente invenção diminuem a expressão dos marcadores adipogênicos PPARy, ACC e aP2, aumentam a expressão dos fatores lipolíticos pHSL, AMPK-α1, CGI-58 e ATGL, reduzindo assim o tamanho dos adipócitos e níveis de colesterol no sangue.

[0044] (iii) os peptídeos e o complexo peptídico da presente invenção têm excelente atividade e segurança e, portanto, podem ser vantajosamente aplicados aos fármacos e quase fármacos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0045] A figura 1 mostra os lipídeos acumulados após o tratamento com os peptídeos da presente invenção, conforme analisado por coloração Vermelho-óleo O: (a) peptídeo da SEQ ID NO: 1, (b) peptídeo da SEQ ID NO: 3 e (c) peptídeo da SEQ ID NO: 5.

[0046] A figura 2 mostra os resultados do acúmulo de lipídeos após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção, conforme analisado por coloração com Óleo vermelho O.

[0047] A figura 3 mostra resultados de medição dos níveis de expressão do gene aP2, que está envolvido na adipogênese, após o tratamento com os peptídeos da presente invenção: (a) peptídeo da SEQ ID NO: 1, (b) peptídeo da SEQ ID NO: 3, e (c) peptídeo da SEQ ID NO: 5.

[0048] A figura 4 mostra os resultados de medição dos níveis de expressão dos genes PPARY, ACC e aP2, que desempenham um papel importante na adipogênese, após o tratamento com várias concentrações do complexo peptídico da presente invenção.

[0049] A figura 5 mostra os resultados de medição dos níveis de expressão de PPARY e fósforo-HSL, que desempenham um papel importante na adipogênese, após várias concentrações do complexo peptídico da presente invenção.

[0050] A figura 6 mostra resultados de medição dos níveis de expressão dos genes AMPK-α1 e CGI58, que estão envolvidos na degradação de gorduras acumuladas, após o tratamento com os peptídeos e o complexo peptídico da presente invenção: (a) peptídeo da SEQ ID NO: 1, (b) peptídeo da SEQ ID NO: 3, (c) peptídeo da SEQ ID NO: 5, e (d) um complexo peptídicos da SEQ ID NOS: 1, 3 e 7. A figura 7 mostra os resultados de medição de ATGL, uma proteína envolvida na degradação de gorduras acumuladas, após tratamento com várias concentrações do complexo peptídico da presente invenção.

[0051] A figura 8 mostra os resultados dos níveis de expressão da proteína Fósforo-HSL envolvida na degradação de gorduras acumuladas, após o tratamento com os peptídeos da presente invenção: (a) peptídeo da SEQ ID NO: 1, (b) peptídeo da SEQ ID NO: 3, (c) peptídeo da SEQ ID NO: 5, e (d) um complexo peptídicos da SEQ ID NOS: 1, 3 e 7, medido por imunocoloração.

[0052] A figura 9 mostra os resultados de medição do glicerol produzido após o tratamento com várias concentrações do complexo peptídicos da presente invenção.

[0053] A figura 10a mostra os tecidos adiposos degradados em modelos de experiências de ratos obesos após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção. A figura 10b mostra teor e números dos tecidos adiposos degradados em modelos de experimentos de ratos obesos após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção.

[0054] A figura 11 mostra os resultados dos níveis de expressão da proteína Fósforo-HSL que está envolvida na degradação de gorduras acumuladas após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção, medido por imunocoloração.

[0055] A figura 12 mostra mudanças no peso corporal (g) e ingestão dietética de camundongos obesos após tratamento com o complexo peptídico da presente invenção.

[0056] A figura 13 mostra imagens de camundongos obesos após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção.

[0057] A figura 14 mostra os resultados da distribuição de gordura em modelos de camundongos obesos induzidos por alimentação com uma dieta rica em gordura para o modelo animal experimental C57BL/6, conforme analisado por micro-TC.

[0058] A figura 15 mostra imagens dos tecidos adipócitos extraídos de modelos de camundongos obesos induzidos por alimentação com uma dieta rica em gordura para o modelo animal experimental C57BL/6, após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção.

[0059] A figura 16a mostra imagens morfológicas dos adipócitos em tecidos adiposos obtidos a partir de modelos de camundongos obesos induzidos por alimentação de uma dieta rica em gordura para o modelo animal experimental C57BL/6, após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção. A figura 16b mostra os resultados de tamanho dos adipócitos nos tecidos adiposos obtidos a partir de modelos de camundongos obesos induzidos por alimentação com uma dieta rica em gordura para o modelo animal experimental C57BL/6, após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção.

[0060] A figura 17 mostra os resultados de medição dos níveis de expressão da proteína fósforo-HSL, que está envolvida na lipólise, em adipócitos de tecidos adiposos obtidos a partir de modelos de camundongos obesos induzidos por alimentação de uma dieta rica em gordura para o modelo animal experimental C57BL/6, após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção.

[0061] A figura 18 mostra os resultados da medição dos níveis de colesterol em amostras de sangue retiradas de modelos de camundongos obesos induzidos por alimentação de uma dieta rica em gordura para o modelo animal experimental C57BL/6, após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção.

[0062] A figura 19 mostra os resultados da medição de níveis de glicose em amostras de sangue retiradas de modelos de camundongos obesos induzidos por alimentação com uma dieta rica em gordura para o modelo animal experimental C57BL/6, após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção.

[0063] A figura 20 mostra mudanças no nível de açúcar no sangue em modelos de camundongo DB/DB induzidos por obesidade após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção.

[0064] A figura 21 mostra mudanças no nível de colesterol no sangue em modelos de camundongos DB/DB induzidos por obesidade após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção.

[0065] A figura 22 mostra alterações no nível de açúcar no sangue em modelos de camundongos DB/DB induzidos por obesidade após o tratamento com os peptídeos da presente invenção: (a) peptídeo da SEQ ID NO: 1, (b) peptídeo da SEQ ID NO: 3 e (c) peptídeo da SEQ ID NO: 5.

[0066] A figura 23 mostra os resultados de medição dos níveis de expressão de IGF-1 e insulina após o tratamento com o lucose da SEQ ID NO: 7.

[0067] A figura 24 mostra mudanças no nível de açúcar no sangue no modelo de camundongo DB/Db induzido por obesidade após o tratamento com o lucose da SEQ ID NO: 7.

[0068] As figuras 25a-25d mostram mudanças nos níveis de açúcar no sangue em pacientes com diabetes com níveis elevados de lucose no sangue após o tratamento com o complexo peptídico da presente invenção.

MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[0069] Daqui em diante, a presente invenção será descrita com mais detalhes com referência aos exemplos. Será óbvio para um versado na técnica comum que estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitando o escopo da presente invenção. Assim, o escopo substancial da presente invenção será definido pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.

EXEMPLOS EXEMPLO DE SÍNTESE 1: Síntese de Peptídeo

[0070] Em um reator, adicionou-se 700 mg de resinas de cloreto de clorotritila (resinas CTL, Nova bioquimica Cat No. 01-64-0021) com 10 mL de cloreto de metileno (MC) e agitou-se durante 3 min. Após a remoção do solvente, foram adicionados 10 mL de dimetilformamida (DMF). A solução foi novamente agitada durante 3 minutos, e depois o solvente foi removido. Ao reator foram adicionados 10 mL de uma solução de diclorometano, seguindo-se 200 mmol de Fmoc-Asn (Trt)-OH (Bachem, Suiça) e 400 mmol de diisopropil etilamina (DIEA). Os reagentes foram bem dissolvidos e reagiram enquanto agitando durante 1 hora. Posteriormente, a solução foi lavada e reagiu com uma solução de metanol e DIEA (2: 1) em DCM (diclorometano) durante 10 min. Subsequentemente à lavagem com um excesso de DCM/DMF (1: 1), o solvente foi removido. Em seguida, foram adicionados 10 mL de dimetilformamida (DMF), seguindo-se a agitação durante 3 min. Após a remoção do solvente, foram adicionados ao reator 10 mL de uma solução de desproteção (20% de piperidina/DMF). A agitação à temperatura ambiente durante 10 minutos precedeu a remoção do solvente. A solução de desproteção foi adicionada na mesma quantidade e depois removida após 10 minutos de reação. A lavagem foi realizada duas vezes com DMF, uma vez com MC, e uma vez com DMG durante 3 minutos cada uma para fornecer resinas Asn-CTL. Em outro reator, foram adicionados 200 mmol de Fmoc-Arg (Pbf)-OH (Bachem, Suiça), 200 mmol de HoBt e 200 mmol de Bop a 10 mL de uma solução de DMF e bem dissolvidos por agitação. Ao reator, foram adicionados 400 mmol de DIEA em duas alíquotas, seguindo-se por agitação durante pelo menos 5 minutos para a dissolução completa do sólido. A solução de mistura de aminoácido dissolvido foi introduzida no reator em que as resinas desprotegidas foram colocadas, seguido por agitação durante 1 hora a temperatura ambiente para a reação. Após o líquido de reação ser removido, a agitação foi transportada três vezes durante 3 minutos cada vez, juntamente com uma solução de DMF que foi então removida. Uma pequena quantidade das resinas de reação foi retirada e usada em um teste de Kaiser (teste de ninidrina) para examinar uma extensão da reação. A mesma reação de desproteção foi realizada duas vezes com a solução de desproteção para fornecer resinas Arg-Asn-CTL. As resinas foram suficientemente lavadas com DMF e MC antes de um teste Kaiser adicional. Os seguintes experimentos de ligação aos aminoácidos foram realizados do mesmo modo que descrito acima. De acordo com sequências de aminoácidos selecionadas, as reações foram induzidas sequencialmente com Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH e Fmoc-Leu-OH nessa ordem. O grupo protetor de Fmoc foi removido por reação duas vezes com uma solução de desproteção durante 10 minutos para cada reação e depois lavagem. Anidrido acético, DIEA e HoBt foram adicionados e submetidos à acetilação durante 1 hora. As resinas de peptidila assim obtidas foram lavadas com DMF, MC e metanol três vezes cada. As resinas foram secas com gás nitrogênio lentamente e depois foram completamente secas ao vácuo sob uma atmosfera de P2O5. As resinas foram reagidas durante 2 horas à temperatura ambiente com 30 mL de uma solução abandonadora (ácido trifluoracético 81,5%, água destilada 5%, tioanisol 5%, fenol 5%, EDT 2,5% e TIS 1%) enquanto agitava intermitentemente. As resinas foram filtradas e lavadas com um pequeno volume de solução de TFA, após o que o filtrado foi combinado com o líquido mãe. Após a destilação a uma pressão reduzida para reduzir o volume total em dois, utilizaram-se 50 mL de éter frio para induzir a precipitação, e os precipitados assim formados foram recolhidos por centrifugação e lavados duas vezes com éter frio. Após a remoção do líquido mãe, o restante foi suficientemente seco sob uma atmosfera de nitrogênio para proporcionar 0,85 g do peptídeo não purificado da SEQ ID NO: 1 NH2-Leu-Lys-Thr-Arg-Asn-COOH (rendimento: 92%). A síntese foi obtida de NH2-Lys-Gly-Ala-Cys(Ser)-Thr-Gly-Trp- Met-Ala-COOH em uma quantidade de 0,78 g como peptídeos da SEQ ID NOS: 2 e 3 (rendimento: 82%), NH2-Ala-Cys (Ser) Thr- Leu-Pro-His-Pro-Trp-Phe-Cys (Ser) -COOH numa quantidade de 0,92 g como peptídeos da SEQ ID NOS: 4 e 5 (rendimento: 85% ) e NH2-Cys (Ser)-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys (Ser) -COOH numa quantidade de 0,76 g como peptídeos das SEQ ID NOS: 6 e 7 (rendimento : 88%). Os peptídeos das SEQ ID NOS: 1, 2, 4 e 6 encontraram pesos moleculares de 630,7 (calculado: 630,7), 924,5 (calculado: 924,1), 1236 (calculado: 1.236,5) e 1.301,5 (calculado: 1.301,5), respectivamente, medido por espectrometria de massa. TABELA 1

[0071] Enquanto isso, os peptídeos das SEQ ID NOS: 1, 3 e 7 foram misturados em quantidades iguais para fornecer um complexo peptídico que foi avaliado quanto à eficácia.

EXEMPLO 1: Ensaio para atividade inibidora contra a adipogênese 1-1. Ensaio para supressão do acúmulo de lipídeos pelo uso de pré-adipócitos (coloração vermelho-óleo O)

[0072] As células pré-adipócitos 3T3-L1 foram cultivadas até confluência e depois incubadas durante dois dias com várias concentrações dos peptídeos em um meio de diferenciação contendo 10 μg/mL de insulina, dexametasona 0,1 μM e IBMX 0,5 μM. O meio foi trocado a cada dois dias com um meio contendo 10 μg/mL de insulina. Após a indução da diferenciação durante 10 dias, a geração de gotícula nas células foi examinada por coloração com óleo vermelho O. Os adipócitos 3T3-L1 preparados foram lavados com PBS, fixados com 3,7% de formalina durante uma hora e lavados com 60% de isopropanol. As células resultantes foram tingidas com reagente Vermelho-óleo O à temperatura ambiente durante 20 minutos. Após a remoção do reagente Vermelho-óleo O, as células foram lavadas três vezes com água destilada e observadas sob um microscópio de contraste de fase. Para análise quantitativa, as matérias graxas foram extraídas das células usando 100% de isopropanol e as células foram transferidas em uma quantidade de 200 μL/poço para placas de 96 poços e medidas quanto à densidade óptica a 500 nm usando um leitor de ELISA.

[0073] Dados experimentais mostraram que o tratamento com peptídeos das SEQ ID NOS: 1, 3 e 5 diminuiu as extensões de acúmulo de gordura nas células, conforme medido por coloração com Óleo vermelho O (Figuras 1a-c).

[0074] Uma extensão do acúmulo de lipídeos nas células também foi reduzida quando um complexo peptídicos das SEQ ID NOS: 1, 3 e 7 foi aplicado por concentrações (Figura 2).

1-2. Supressão da expressão de genes envolvidos na adipogênese

[0075] As células 3T3-L1 (pré-adipócitos) foram semeadas a uma densidade de 3 x 105 células/poço em placas de 6 poços. Após 24 horas de cultura, as células foram incubadas com concentrações predeterminadas (0,1, 1 e 10 μg/mL) dos peptídeos durante 14 dias numa incubadora a 37°C. Posteriormente, as células foram colhidas e tratadas com uma solução de extração de RNA (Easy Blue, Intron) para preparar RNA a partir do qual o DNAc foi então sintetizado usando uma pré-mistura RT (Intron). A PCR foi realizada utilizando iniciadores para marcadores antigênicos (PPARY, ACC e aP2) e uma pré-mistura de PCR (Intron).

[0076] As sequências específicas de iniciadores para o alvo para PCR de marcadores adipogênicos foram as seguintes: sequência de iniciador à frente PPARy, 5'- TTTTAGAGGGTGCCAGTTTC-3' e iniciador reverso PPARy, 5'- AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3' (temperatura de recombinação, 60°C); sequencia ACC de iniciador direta, 5'- ACCTTACTGCCATCCCATGTGCTA-3' e iniciador reverso ACC, 5'- GTGCCTGATGATCGCACGAACAAA-3' (temperatura de recombinação, 60°C); sequência de iniciador aP2 à frente, 5'- CATCAGCGTAAATGGGGATT-3' e iniciador reverso aP2, 5'- ACACATTCCACCACCAGCTT-3' (temperatura de recombinação, 60°C).

[0077] Os produtos de PCR foram carregados num volume de 5 μL para um gel de agarose a 1%, e submetidos à eletroforese, seguindo-se a identificação de bandas em um Gel-Doc.

[0078] Na linhagem de células de osteoblasto de camundongo 3T3-L1 que foi incubada com o peptídeo da SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 durante três dias, observaram-se níveis de expressão diminuídos do marcador adipogênico aP2 (Figuras 3a-c).

[0079] Além disso, quando incubados durante três dias com concentrações de 0,1 μg/mL, 1 μg/mL e 10 μg/mL de um complexo peptídicos das SEQ ID NOs: 1, 3 e 7, observou- se que a linhagem celular de osteoblastos de murino diminui na expressão dos marcadores adipogênicos PPAR, ACC e aP2, como as células de controle positivo tratadas com 100 ng/mL de TNFa (figura 4).

1-3. Observação de expressão de adipogênese e proteínas induzindo lipólise pelo uso de pré-adipócitos

[0080] As células 3T3-L1 (pré-adipócitos) foram semeadas a uma densidade de 3 x 105 células/poço em placas de 6 poços. Após 24 horas de cultura, as células foram incubadas durante 14 dias com concentrações predeterminadas (0,1, 1 e 10 μg/mL) do complexo peptídico numa incubadora a 37°C. Os lisados celulares obtidos por tratamento com um tampão de lise celular foram utilizados para a quantificação de proteínas, seguido de Western Blot com um anticorpo anti-PPARy (Santa Cruz Biotechnology, USA), que é um anticorpo contra um marcador adipogênico e um anticorpo anti-pHSL (Santa Cruz Biotechnology, USA), que é um anticorpo contra um marcador lipolítico.

[0081] Quando tratados com o complexo peptídico por concentração, verificou-se que as células diminuíram na expressão do marcador adipogênico PPARY de uma maneira dependente da dose enquanto todos aumentavam na expressão do marcador de lipólise pHSL (Figura 5).

EXEMPLO 2: Ensaio para atividade lipolítica 2-1. Aumento da expressão de genes envolvidos na lipólise

[0082] As células 3T3-L1 (pré-adipócitos) foram semeadas a uma densidade de 3 x 105 células/poço em placas de 6 poços. Após 24 horas de cultura, as células foram incubadas durante 14 dias com concentrações predeterminadas (0,1, 1 e 10 μg/mL) dos peptídeos numa incubadora a 37°C (controle positivo: 100 ng/mL de TNFa (SIGMA)). As células foram colhidas e tratadas com uma solução de extração de ARN (Easy Blue, Intron) para preparar RNA a partir do qual o ADNc foi então sintetizado usando uma pré-mistura RT (Intron). A PCR foi realizada utilizando iniciadores para marcadores (AMPK-α1 e CGI58) e uma pré-mistura de PCR (Intron). As sequências de iniciadores específicas para a PCR de marcadores lipolíticos foram as seguintes: sequência de iniciador a frente AMPK-α1, 5'-TGACCGGACATAAAGTGGCTGTGA- 3' e iniciador reverso AMPK-α1, 5'- TGATGATGTGAGGGTGCCTGAACA-3' (temperatura de recombinação, 60°C); Sequência de iniciador a frente CGI58, iniciador reverso 5'-TGTGCAGGACTCTTACTTGGCAGT-3' e CGI58, 5'- GTTTCTTTGGGCAGACCGGTTTCT-3' (temperatura de recombinação, 60°C). Os produtos de PCR foram carregados cada um num volume de 5 μL para um gel de agarose a 1% e submetidos a eletroforese, seguindo-se a identificação de bandas em um Gel-Doc. Em todos os pré-adipócitos (3T3-L1) que foram incubados com os peptídeos foram detectados níveis de expressão aumentados dos marcadores lipolíticos AMPK-α1 e CGI-58 (Figuras 6a-c). Além disso, observou-se que o tratamento com o complexo peptídico aumentou a expressão de AMPK-α1 e CGI-58 em maneiras dependentes da dose e níveis mais elevados em comparação com o tratamento com TNFα 100 ng/mL de controle positivo (Figura 6d).

2-2. Observação de expressão de proteínas indutoras de lipólise pelo uso de células pré-adipócito

[0083] Células 3T3-L1 (pré-adipócitos) foram semeadas a uma densidade de 3x105 células/poço em placas de 6 poços. Após 24 horas de cultura, as células foram incubadas durante 14 dias com concentrações predeterminadas (0,1, 1 e 10 μg/mL) do complexo peptídico numa incubadora a 37°C (controle positivo: 100 ng/mL de TNFa (SIGMA)). Os lisados celulares obtidos por tratamento com um tampão de lise celular foram utilizados para a quantificação de proteínas, seguido de Western Blot com um anticorpo anti- ATGL (Santa Cruz Biotechnology, USA), que é um anticorpo contra um marcador lipolítico. A expressão do marcador lipolítico ATGL foi aumentada por tratamento com o complexo peptídico (Figura 7).

2-3. Observação microscópica de fluorescência da expressão da proteína indutora de lipólise por emprego de células pré-adipócito

[0084] Células 3T3-L1 (pré-adipócitos) foram semeadas a uma densidade de 3x105 células/poço em placas de 6 poços. Após 24 horas de cultura, as células foram incubadas durante 14 dias com os peptídeos individuais ou o complexo peptídico (1 ug/mL) numa incubadora a 37°C (controle positivo: 100 ng/mL de TNFa (SIGMA)). Posteriormente, as células foram fixadas com etanol a 70% e depois submetidas a imunocoloração com um anticorpo anti- fósforo-HSL (Santa Cruz Biotechnology, USA) para observar a expressão celular de fósforo-HSL, um marcador lipolítico.

[0085] A partir dos dados experimentais, foi observado que os peptídeos sozinhos (Figuras 8a-c) e o complexo peptídico (Figura 8d) aumentam a expressão do marcador lipolítico fósforo-HSL.

2-4. Quantificação do produto de lipólise glicerol

[0086] Depois de serem retirados do abdômen de camundongos induzidos por obesidade, os tecidos adiposos foram plaqueados a uma densidade de 100 mg/poço em placas de cultura de 24 poços e cultivados num meio de cultura (1 mL de tampão Krebs-Ringer contendo HEPES 25 mM, 5,5 mM glicose e albumina de soro bovino a 2% (p/v). A este respeito, os tecidos foram incubados durante 48 horas com 0,1 μg/mL, 1 μg/mL e 10 μg/mL do complexo peptídico, enquanto foram utilizados 100 ng/mL de TNFα como controle positivo. O glicerol produzido durante a lipólise foi analisado quantitativamente.

[0087] Como é entendido, a partir dos dados experimentais, a quantidade de glicerol resultante da lipólise por tratamento com o complexo peptídico foi aumentada de maneira dependente da dose e mais do que a produzida após o tratamento com o TNFα de controle positivo (Figura 9).

2-5. Efeito de lise no tecido adiposo isolado de camundongo obeso

[0088] Os tecidos adiposos são divididos em gordura branca e gordura marrom por cor e gordura subcutânea, gordura abdominal, gordura mesentérica (gordura visceral) e gordura do epidídimo por tecido. Após a anatomização corporal, a lipoectomia foi realizada nos tecidos. As gorduras brancas foram isoladas, banhadas em uma quantidade de 100 mg/poço em placas de 24 poços e depois incubadas durante 72 horas com concentrações do complexo peptídico num meio de cultura (1 mL de tampão Krebs-Ringer contendo 25 mM de HEPES, 5,5 mM glicose e albumina de soro bovino a 2% (p/v). As gorduras foram divididas em fatias que foram tingidas com hematoxilina e eosina. Os teor de adipócitos foram comparados sob um microscópio (TS100 Nikon) com ampliação de 100x.

[0089] Comparadas ao controle, as gorduras tratadas com várias concentrações dos peptídeos diminuíram seu teor (figura 10a). Além disso, quando tratados com o complexo peptídico, os tecidos adiposos com compartimentos distintos da membrana celular foram observados no tamanho da célula, conforme medido por um programa (Figura 10b).

2-6. Observação de marcador lipolítico em tecido adiposo.

[0090] Um tecido adiposo retirado do abdome de um camundongo induzido por obesidade foi plaqueado em uma quantidade de 100 mg por poço em placas de cultura de 24 poços e incubado durante 48 horas com o complexo peptídico enquanto TNFa 100 ng/mL foi usado como um controle positivo. Foi detectado o marcador lipolítico marcado fósforo-HSL (fluorescente verde). Tratou-se o tratamento com o complexo peptídico para aumentar o nível de expressão do marcador lipolítico fósforo-HSL em tecidos adiposos (Figura 11). EXEMPLO 3: Adipogênese-Supressiva e Lipólise - Efeito promocional em animais experimentais A perda de peso experimental de animais e supressão de adipogênese em animais alimentados com dieta com alto teor de gordura Os modelos DIO (obesidade induzida por dietas), que se tornaram obesos ao alimentar-se de dietas com alto teor de gordura, foram utilizados para experimentos antiobesidade em que TNFα 5 μg/mL foi empregado como um controle positivo. Para um controle, uma dieta geral e não uma dieta rica em gorduras foi ingerida. No experimento, uma dieta rica em gorduras foi ingerida por 12 semanas, enquanto o complexo peptídico ou o controle positivo foram aplicados. Durante o experimento, o peso foi monitorado.

[0091] O TNFα e os compostos antiobesidade foram injetados intraperitonealmente em PM 3 a 4 horas todas as semanas durante 12 semanas. Os pesos e o teor das refeições foram medidos imediatamente antes da injeção inicial e, em seguida, regularmente em intervalos de uma semana. As amostras de sangue foram retiradas das veias da cauda após os experimentos de injeção de fármacos e medidas quanto aos níveis de açúcar no sangue, utilizando o Accu-Check Ative (Roche) e analisados quanto ao nível de colesterol, utilizando o kit de cálculo do colesterol (BioVision). Os tecidos adiposos são divididos em gordura branca e gordura marrom por cor e gordura subcutânea, gordura abdominal, gordura mesentérica (gordura visceral) e gordura do epidídimo por tecido. Após a lipoectomia, observaram-se as gorduras assim obtidas dos tecidos. Para o exame histológico, as gorduras foram fixadas com 10% de formalina tamponada neutra, embutidas em blocos de parafina, cortadas em seções de 5 μm de espessura e tingidas com hematoxilina e eosina. Para analisar a fosforilação do HSL lipolítico, a coloração fluorescente foi realizada com um anticorpo anti- pHSL. Uma amostra de tecido foi feita, montada em meio de montagem de glicerina e coberta com uma tampa de vidro. Os tecidos foram observados sob um microscópio (Nikon, TS100), com uma câmera digital incorporada e realizando suas imagens.

[0092] Ao longo de 12 semanas do estágio inicial até o estágio final da experiência, os camundongos foram medidos para aumentar de peso de 20,9 g para 28,74 g quando alimentados com uma dieta geral e de 20,99 g a 49,5 g quando alimentados com uma dieta rica em gordura. Nos camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura com o complexo peptídico injetado, o ganho de peso foi atingido apenas para 36,76 g após 12 semanas do peso inicial de 21,1 g, indicando uma redução significativa do ganho de peso (174,2%), em comparação com o controle alimentado com dieta com alto teor de gordura (235,8%) (Tabela 2 e Figura 12). TABELA 2 Peso do modelo de camundongo obeso após o tratamento com o complexo peptídico

[0093] Após a conclusão do experimento de 12 semanas e além disso, observou-se que os camundongos tratados com o complexo peptídico mantêm seus tamanhos de corpo em padrões similares aos dos camundongos normais (dieta geral), mas não aos camundongos alimentados com dieta de alto teor de gordura, conforme analisado nas imagens (Figura 13).

[0094] Após 12 semanas do experimento, os camundongos foram submetidos à micro-CT para examinar a distribuição de gordura em todo o corpo. Como resultado dos dados de micro-CT de gorduras (amarelas) no corpo, a gordura distribuída em todo o corpo aumentou notavelmente nos ratos alimentados com dieta rica em gordura, em comparação com o controle alimentado por dieta geral enquanto um nível significativamente reduzido de gorduras distribuídas em todo o corpo foi observado no grupo que foi tratado com o complexo peptídico com a dieta rica em gorduras (Figura 14).

[0095] Os camundongos que completaram imagens de micro-CT foram anatomizados para extrair os tecidos adiposos distribuídos por todo o corpo. Os volumes dos tecidos adiposos foram comparados. Como resultado, a gordura extraída dos ratos alimentados com dieta rica em gordura foi maior que a dos ratos alimentados com dieta, com uma redução significativa no volume de gordura nos camundongos tratados com o complexo peptídico mais a dieta rica em gordura (Figura 15).

[0096] As gorduras foram isoladas e tingidas com H & E para visualizar os teores das mesmas. Foram observados teores menores de gorduras nos camundongos tratados tanto com a dieta rica em gordura quanto com o complexo peptídico em relação ao controle alimentado com dieta com alto teor de gordura (Figura 16a). A análise de teor de gordura através de um programa mostrou que, quando o teor de gordura do controle alimentado com dieta geral era de 100%, um teor de gordura aumentou para 127% no grupo alimentado com dieta com alto teor de gorduras, mas diminuiu para 97% no grupo tratado com a dieta rica em gorduras e o complexo peptídico (figura 16b).

[0097] As gorduras foram isoladas e examinadas quanto ao nível de expressão do marcador lipolítico fósforo-HSL em tecidos adiposos. Os camundongos tratados com a dieta com alto teor de gordura e o complexo peptídico foram observados com um elevado nível de expressão de fósforo-HSL (Figura 17).

[0098] Os níveis de colesterol no sangue nos camundongos após o experimento foram medidos. Como resultado, o nível de colesterol no sangue foi de 2,52 μg/mL nos camundongos alimentados com dieta, 3,5 μg/mL nos camundongos alimentados com dieta rica em gordura e 2,86 μg/mL nos camundongos tratados com dieta de alto teor de gordura e complexo peptídico, indicando que o complexo peptídico reduziu o nível de colesterol que se elevou com a obesidade (Figura 18).

[0099] Os níveis de açúcar no sangue após a conclusão do experimento foram de 174 mg/dL nos camundongos alimentados com dieta geral e aumentaram para 235 mg/dL nos ratos alimentados com dieta rica em gordura. No entanto, um nível de açúcar no sangue de 183 mg/dL foi medido nos camundongos tratados tanto com a dieta com alto teor de gordura quanto com o complexo peptídico, com uma redução significativa no mesmo (Figura 19).

EXEMPLO 4: Controle de açúcar no sangue Efeito no controle do açúcar no sangue

[00100] Neste experimento animal, foram empregados C57BL/6 (camundongo normal) (adquirido a partir de Samtako Inc.) e fêmeas C57BLKS/JLepr (camundongo do modelo de diabetes, db/db) (comprados na Central Lab. Animal Inc.), juntamente com o complexo peptídico como material antidiabetes e/ou antiobesidade efetiva, e sitagliptina como um medicamento de controle positivo. Neste exemplo, o complexo antidiabetes e/ou antiobesidade efetivo foi avaliado quanto à eficácia aguda antidiabetes (administração única) em um modelo de camundongo normal e um modelo diabético potencialmente diabético, usando GTT (teste de tolerância à glicose), que é um método de diagnóstico representativo para diabetes. Os camundongos foram criados em gaiola a uma temperatura de 22-24°C e uma umidade relativa de 50-30%, com quatro por gaiola. Os camundongos estavam embaixo de luzes de 150-300 Lux das 8 horas até as 20 horas com ciclos de 12 horas de luz/12 horas de escuro. Eles receberam acesso a vontade a uma dieta geral (18% de proteína, fabricada em 2017, Harlan Labocamundongories Inc, USA). Para começar, os camundongos ficaram com fome durante 4 horas ou mais antes do experimento ITT e durante 12 horas antes do experimento GTT. O complexo foi administrado por via oral com a ajuda de uma seringa descartável de administração oral uma hora antes do experimento GTT. Para o experimento GTT, os camundongos puderam acessar livremente uma dieta rica em gordura a 0 (zero) hora após o início do experimento. Após 40 minutos de acesso livre a uma dieta rica em gordura, amostras de sangue para uso no exame de níveis de glucose no sangue foram retiradas da veia da cauda em intervalos de 0, 30, 60, 90, 120 e 180 min. Os níveis de glicose no sangue foram medidos utilizando Accu-Chek ativo (Roche). A sitagliptina, utilizada como agente terapêutico para diabetes foi selecionada como um medicamento de controle positivo e administrada a uma dose de 100 mg/kg. O complexo selecionado como candidato eficaz antidiabetes e/ou antiobesidade foi administrado em uma dose de 100 mg/kg a grupos experimentais de quatro camundongos.

[00101] Como resultado, o complexo peptídico exibiu um efeito redutor sobre os níveis de açúcar no sangue em que o nível de açúcar no sangue aumentado pela dieta com alto teor de gordura foi reduzido pelo tratamento com o complexo peptídico. Nos modelos de camundongos induzidos por diabetes, o nível elevado de açúcar no sangue diminuiu pelo complexo (Figuras 20a e 20b). Além disso, níveis mais baixos de colesterol no sangue foram detectados no grupo tratado com a dieta com alto teor de gorduras e o complexo peptídico, em relação ao controle alimentado com dieta com alto teor de gorduras (Figura 21).

[00102] Além disso, após JEJUM por 16 horas, os camundongos induzidos por diabetes DB/DB foram alimentados durante 30 minutos e depois foram administrados com os peptídeos. Os níveis de açúcar no sangue foram medidos ao longo do tempo.

[00103] Verificou-se que os níveis de açúcar no sangue nos grupos tratados respectivamente com os peptídeos das SEQ ID NOS: 1, 3 e 5 diminuíram de um modo dependente do tempo (Figuras 22a-22c). EXEMPLO 5: Promoção da expressão de insulina e fator de crescimento semelhante a insulina Promoção da expressão de insulina e fator de crescimento semelhante a insulina As células 3T3-L1 (pré-adipócitos) foram semeadas a uma densidade de 3 x 105 células/poço em placas de 6 poços e desenvolvidas durante 24 horas. Posteriormente, as células foram incubadas com várias concentrações (10 ng - 1 μg/mL) dos peptídeos durante 14 dias em uma incubadora a 37°C. As proteínas foram extraídas de lisados celulares que foram obtidos por tratamento com tampão de lise celular, analisados quantitativamente e submetidos a transferência de Western usando um anticorpo anti-IGF-1, que é um anticorpo contra o marcador lipolítico e um anticorpo de insulina (Santa Cruz Biotechnology, USA). A partir dos dados, observou-se que o peptídeo da SEQ ID NO: 7 aumentou a expressão de IGF-1 e insulina de modos dependentes da dose (Figura 23).

EXEMPLO 6: Observação do efeito de redução do nível de açúcar no sangue no experimento clínico Redução do nível de açúcar no sangue por ingestão do complexo

[00104] Um breve teste clínico foi realizado em pessoas de 45 a 65 anos com nível de glicemia em jejum de 170 mg/dL ou superior. Eles ingeriram uma formulação complexa 30 minutos após as refeições. Foram colhidas amostras de sangue das pessoas em intervalos de 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos, e medidas quanto ao nível de glicose, utilizando Accu-Chek ativo (Roche).

[00105] Foi observada uma redução do nível de açúcar no sangue pela formulação complexa em todas as pessoas testadas (Figuras 25a - 25d).

[00106] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhes com referência às características específicas, será evidente aos versados na técnica que esta descrição é apenas para uma concretização preferida e não limita o âmbito da presente invenção. Assim, o alcance substancial da presente invenção será definido pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.

Claims (11)

1. Peptídeo caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para o uso na prevenção ou tratamento de obesidade ou diabetes.

3. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo suprime a adipogênese.

4. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo reduz a expressão de PPARY (Receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama), ACC (acetil-CoA carboxilase) ou aP2 (proteína 2 de ligação a ácido graxo adipose-específica).

5. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo promove a lipólise.

6. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo aumenta a expressão de pHSL (fosfolipase hormônio sensível), AMPK-α1 (proteína quinase α1 ativada por AMP), CGI-58 (identificação comparativa de gene-58) ou ATGL (lipase triglicerídica adiposa).

7. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo reduz um nível de açúcar no sangue.

8. Complexo peptídico caracterizado por incluir a seguinte combinação de peptídios: (a) um peptídeo de SEQ ID NO: 1; (b) um peptídeo da SEQ ID NO: 3; e (c) um peptídeo de SEQ ID NO: 6 ou 7; e por ser para uso na prevenção ou tratamento de obesidade ou diabetes.

9. Complexo peptídico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o complexo peptídico reduz tamanhos de adipócitos.

10. Complexo peptídico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o complexo peptídico reduz um nível de colesterol no sangue.

11. Composição farmacêutica caracterizada por compreender: o peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 7, ou o complexo peptídico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 10, como um ingrediente eficaz, e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que a composição é para prevenção ou tratamento de obesidade ou diabetes.