WO2016175362A1 - 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to peptides having anti-obesity and anti-diabetic efficacy and their use.
  • Drugs that act on the central nervous system include drugs such as fenfluramine texfenfluramine that inhibit the serotonin (5-HT) nervous system according to the respective mechanisms, drugs such as ephedrine and caffeine through the noradrenaline nervous system, and recently serotonin and noradrenaline Drugs such as sibutramine, which simultaneously act on the nervous system and inhibit obesity, are commercially available.
  • orlistat which is approved as an obesity treatment agent that inhibits intestinal lipase and reduces fat absorption by acting on the stomach / intestinal tract and inhibiting obesity, is used as a typical drug.
  • drugs such as fenfluramine have been banned recently because of side effects such as primary pulmonary hypertension or heart valve disease.
  • Other drugs such as blood pressure reduction or lactic acidosis, There is a problem that can not be used in patients with heart failure and kidney disease.
  • Diabetes mellitus is a metabolic disease, such as a lack of insulin secretion or normal function (DeFronzo, 1988), which is characterized by high blood sugar levels that increase the concentration of glucose in the blood. It is a disease to be discharged. Recently, the incidence of diabetes has exploded due to the increase in obesity, especially abdominal obesity.
  • the number of diabetics was estimated at 170 million worldwide in 2000, and was expected to reach 370 million in 2030, but according to a recent analysis, it has already reached around 350 million worldwide in 2008. It is reported (Danaei et al. 2011), much worse than expected. Less than 10% of obesity has been reported as diabetes (Harr i s et al. 1987), compared to about 80% of patients with dysplastic diabetes. This association between diabetes and obesity is due to the irregular secretion of adipokine and free fatty acid, which causes fatty acids to accumulate in insulin-sensitive tissues such as beta cells, kidneys, liver, and heart. ty).
  • Insulin produced by the recombinant method is an essential drug for patients with type 1 diabetes and heterogeneous patients who do not control blood sugar, but has advantages in controlling blood glucose, but has disadvantages such as resistance to needles, difficulty in administration, low blood sugar risk, and weight gain.
  • Have Meglitinide a type of insulin secretagogue, is a fast-acting drug that is taken before meals, and includes nobonum (lepaglinide) and plastic (nateglinide) glutfast (mitiglinide).
  • Insulin sensitivity improvers are rarely hypoglycemic when taken alone, and are avenues of metformin and thiazolidinedione class of biguanide-based drugs (logiglitazone), actose (pioglitazone), etc. There is this.
  • DPP-4 inhibitor which inhibits the action of DPP-4 (Dipeptidyl peptidase-4), an enzyme that rapidly inactivates GLP-1, is a recently developed new drug. to be.
  • DPP-4 Dipeptidyl peptidase-4
  • these drugs have been reported side effects such as hepatotoxicity, gastrointestinal disorders, cardiovascular diseases and carcinogenicity, and the annual treatment cost is also high, which is an obstacle in the treatment of diabetes.
  • the present inventors have tried to develop a number of excellent peptides having biologically effective activity, and as a result, peptides having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 sequences inhibit fat accumulation induced by high fat diet,
  • the present invention has been completed by not only degrading the already accumulated fat to show an anti-obesity effect, but also showing excellent effects on diabetes and obesity diabetes, or diabetic complications.
  • an object of the present invention is to provide a peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7.
  • Another object of the present invention is to provide a peptide having anti-obesity or anti-diabetic activity.
  • Another object of the present invention is to provide a peptide complex having anti-obesity or anti-diabetic activity.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes.
  • the present invention provides a peptide consisting of one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 sequence.
  • the invention provides a peptide having anti-obesity and anti-diabetic activity consisting of one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 sequence .
  • the present invention provides a tempide complex having anti-obesity or antidiabetic activity composed of the following peptide combinations:
  • peptide refers to a linear molecule formed by binding amino acid residues to each other by peptide bonds.
  • the peptides of the present invention can be prepared by chemical synthesis methods known in the art, in particular sol id ⁇ phase synthesis techniques; Merr i f ield, J. Amer. Chem. Soc.
  • the peptides of the present invention can induce modifications at the N-terminus or C-terminus to select some sites of the amino acid sequence and increase their activity. Through such modifications, the peptides of the present invention may have a high half-life which increases the half-life when administered in vivo.
  • the C-terminus of the peptide of the present invention is modified with a hydroxyl group (-0H), an amino group (-NH2), azide (-NHNH2), etc.
  • the N-terminus of the peptide is an acetyl group, a fluorenyl methoxy carbonyl group, and the like. , Formyl group ;
  • a protecting group selected from the group consisting of palmitoyl group, myristyl group, stearyl group and polyethylene glycol (PEG).
  • Modification of the above-mentioned amino acid serves to greatly improve the stability of the peptide of the present invention.
  • stability herein means not only in vivo stability but also storage stability (eg, room temperature storage stability).
  • the above protecting groups serve to protect the peptides of the present invention from the attack of protein cleavage enzymes in vivo.
  • the peptide of the present invention inhibits fat accumulation when induced by high fat diet, and shows the effect of decomposing the already accumulated fat, PPAR Y, ACC, lipid markers And decrease the expression of aP2, increase the expression of lipolysis factors pHSL, AMPK- ⁇ 1, CGI-58 and ATGL, and reduce the size of adipocytes and blood cholesterol levels.
  • the peptide of the present invention effectively reduces blood sugar.
  • the peptides of the present invention exhibit excellent anti-obesity and anti-diabetic activity, as well as their respective peptides represented by amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 sequences.
  • the peptide consisting of the sequence listing 3rd sequence, the sequence listing 5th sequence and the sequence listing 7th sequence is Cys of the peptide consisting of the sequence listing 2nd sequence, the sequence listing 4th sequence and the sequence listing 6th sequence, respectively.
  • Peptides substituted with Ser are almost identical in anti-obesity and anti-diabetic activity of these two peptides.
  • the peptide complex having anti-obesity or anti-diabetic activity of the present invention is a peptide consisting of the first sequence of the sequence listing; A peptide consisting of SEQ ID NO: 2 sequence or SEQ ID NO: 3 sequence; And And a combination of peptides consisting of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7.
  • the peptide complex of the present invention consists of a combination of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 7 sequence.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity comprising the peptide or pipide complex of the present invention as an active ingredient.
  • Peptides or peptide complexes of the present invention can be used for the prevention or treatment of obesity because it has an excellent function of inhibiting lipoogenesis and degrading lipids.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes comprising the peptide or 3 ⁇ 4 tide complex of the present invention as an active ingredient.
  • Peptides or peptide complexes of the present invention can be used in the prevention or treatment of diabetes by exhibiting the effect of effectively reducing the increased blood sugar in a diabetic animal model.
  • the composition of the present invention comprises (a) a pharmaceutically effective amount of the above-described peptide or peptide complex of the present invention; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the above-mentioned peptide.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation of lactose, textose, sucrose, sorbetle, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, Gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil Including, but not limited to.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony,
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity of the patient, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response sensitivity. It may be prescribed. On the other hand, the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-1000 per day.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of axate powder, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the peptides and peptide complexes of the present invention inhibit fat accumulation, decompose the already accumulated fats to show anti-obesity effect, and effectively reduce blood sugar, thus showing an excellent effect on diabetes.
  • the peptides and peptide complexes of the present invention reduce the expression of the lipid-forming markers PPARy, ACC and aP2, increase the expression of lipolytic factors pHSL, AMLH- ⁇ , CGI-58 and ATGL, Reduces the size and blood cholesterol levels.
  • [Brief Description of Drawings] 1 is a result of confirming the fat accumulated when the peptide of the present invention was treated through Oi l red 0 staining.
  • Figure 2 shows the results confirmed by Oi l red 0 staining to confirm the fat accumulated when the peptide complex of the present invention treated by concentration.
  • Figure 3 is the result of measuring the expression level of aP2 gene involved in fat production when the peptide of the present invention is treated.
  • Figure 4 is the result of measuring the expression amount of PPAR Y, ACC, aP2 genes that are important genes for lipid synthesis when the peptide complex of the present invention is treated by concentration.
  • Figure 5 is the result of measuring the expression level of PPAR y, phospho-HSL protein, which is an important protein in the synthesis of lipids when the peptide complex of the present invention is treated by concentration.
  • Figure 6 is the result of measuring the expression levels of the genes involved in the process of digesting fat accumulated when the peptide and the peptide complex of the present invention A ⁇ - ⁇ ⁇ and CGI 58.
  • Figure 7 is the result of measuring the expression level of ATGL, a protein involved in the process of digesting fat accumulated when the peptide complex of the present invention is processed by degree.
  • Figure 10a is a result of measuring the decomposed adipose tissue after treating the peptide complex of the present invention by the concentration in the obese mouse experimental model.
  • Figure 10b is a result of measuring the size and value of the adipose tissue that is decomposed after treatment of the peptide complex of the present invention in an obese mouse experimental model.
  • Phospho-HSL which is a protein involved in the process of decomposing fat accumulated when the peptide complex of the present invention is processed using immunostaining.
  • Figure 12 shows the changes in weight (a) and feed intake (b) in obese mice when treated with tide complexes . :
  • Figure 13 is the result of measuring the appearance of obese mice when treated with the peptide complex of the present invention.
  • 15 is a result of observing the fat cell tissue after treating the peptide complex of the present invention by preparing a fat mouse model by ingesting a greasy feed to the experimental animal model C57BL / 6 mouse model.
  • Figure 16a is a result of observing the shape of fat cells by ingesting a fat diet by ingesting an oily feed to the C57BL / 6 mouse model of the experimental animal model after treating the peptide complex of the present invention.
  • Figure 16b is a result of observing the fat cell size by ingesting a fat diet in the model of the animal model C57BL / 6 mice ingested fat fat and treated the peptide complex of the present invention and then collecting the adipose tissue.
  • FIG. 17 is a phospho protein which acts on the lipolysis of adipocytes by ingesting adipose tissue after treating the peptide complex of the present invention by preparing an obese mouse model by ingesting a greasy feed into a C57BL / 6 mouse model, which is an experimental animal model.
  • -Expression of HSL expression observed 18 is a result of measuring the amount of cholesterol by collecting blood after ingesting a greasy feed to the experimental animal model C57BL / 6 mouse model to prepare the obese mouse model treated with the peptide complex of the present invention.
  • 19 is a result of measuring the blood glucose by collecting blood after the obese mouse model was prepared by ingesting an oily feed to a C57BL / 6 mouse model, which is an experimental animal model, after treating the peptide complex of the present invention.
  • 20 is a result of measuring the change in blood glucose by collecting blood after treating the peptide complex of the present invention in the DBDB mouse model of diabetes.
  • 21 is a result of measuring the change in cholesterol by collecting blood after treating the peptide complex of the present invention in the DBDB mouse model of diabetes-induced.
  • 22 is a result of measuring the change in blood glucose by collecting blood after treatment of the peptide of the present invention in the DBDB mouse model of diabetes-induced.
  • Figure 25a-d is a result of measuring the change in blood glucose by taking blood after treating the peptide complex of the present invention in a diabetic patient with high blood sugar.
  • Arg-Asn-CTL resin was prepared by deprotection reaction twice in the same manner as above with the deprotection solution. After sufficient washing with DMF and MC, once again Kaiser test was performed, and the following amino acid attachment experiments were performed as above. Based on the selected amino acid sequence, chain reaction was carried out in the order of f1 ⁇ 2oc-Thr (tBu) -0H, Fmoc-Lys (Boc) -0H, and Fmoc-Leu- (3H.
  • the resin was filtered off and the resin was washed with a small amount of TFA solution and combined with the mother liquor. Distillation was carried out to reduce the total volume by half using reduced pressure, and 50 ml of cold ether was added to induce precipitation, and then the precipitate was collected by centrifugation and washed twice with cold ether.
  • 3T3-L1 cells which are pre-adipocytes, to a confluent state, they were exchanged with differentiation media containing 10 yg / ml insulin, 0.1 ⁇ texamethasone and 0.5 ⁇ ⁇ , and the peptides were treated by concentration.
  • the cells were incubated for one day, and then replaced with a medium containing 10 yg / ml insulin every 2 days. Oil Red 0 staining was performed to confirm intracellular droplet formation after inducing differentiation for 10 days.
  • the prepared 3T3-L1 adipocytes were washed with PBS, fixed with 3.7% formalin for 1 hour, washed with 60% isopropanol, and stained with Oil Red 0 solution for 20 minutes at room temperature. After staining, the Oil Red 0 solution was removed, washed three times with distilled water, and the stained cells were observed using a phase contrast microscope. In addition, for quantitative analysis, 10 isopropanol was used to extract fat, and then 200 ⁇ 1 was transferred to a 96 well plate and the absorbance was measured at 500 nm with an ELISA reader. As a result of the experiment, when the peptides of the first sequence, the third sequence, and the fifth sequence of the sequence list, the amount of intracellular fat accumulation was reduced by Oil Red 0 staining (Fig. La-c).
  • 3T3-L1 fat progenitors were seeded in 6-well plates at a cell density of 3 ⁇ 10 5 cells / well. After incubation for 24 hours, peptides were treated by concentration (0.1, 1, 10 yg / ml) and incubated in 37 ° C incubator for 14 days. After the cultured cells were recovered, RNA was prepared by treating RNA extraction solution (Easy Blue, intron), and cDNA was synthesized using RT premix (Intron). PCR was performed using primers for each labeling factor (PPARY, ACC, aP2) and PCR premix (Intron).
  • the target-specific primer sequences used for lipogenic marker PCR are as follows: PPARY forward primer sequence, 5′-TTTTCAAGGGTGCCAGTTTC-3 ′ and PPARy reverse primer, 5′-AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3 ′ (annealing temperature, 60 ° C.) ); ACC forward primer sequence, 5′-ACCTTACTGCCATCCCATGTGCTA-3 ′ and ACC reverse primer, 5′-GTGCCTGATGATCGCACGAACAAA-3 ′ (annealing temperature, 60 ° C.); aP2 forward primer sequence, 5′-CATCAGCGTAAATGGGGATT-3 ′ and aP2 reverse primer, 5 ′ — ACACATTCCACCACCAGCTT-3 ′ (annealing temperature, 60 ° C.).
  • PCR products were loaded on 5 nl of PCR products in 1% agarose gel, followed by electrophoresis, and the bends were confirmed in Gel-Doc.
  • the mouse osteoblast line 3T3-L1 was treated with peptide complexes of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: V at a concentration of 0.1 ug / ml, 1 ug / ml, 10 g / ml, and 3 days After culturing, the lipid production marker The expression of PPARy, ACC and aP2 can be observed to be decreased in both the positive control TNF ⁇ 100 ng / ral treated group and the peptide complex treated group ; ( Figure 4).
  • 3T3-L1 fat progenitors were seeded in 6 well plates at a cell density of 3 ⁇ 10 5 cells / well. After culturing for 24 hours, peptide complexes were treated by concentration (0.1, 1, 10 yg / ml) and incubated in a 37 ° C incubator for 14 days. After lysing the lysate by treating the cell lysis buffer, the protein was quantified, and Western blot was prepared using the anti-PPARY antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) and the lipolytic factor anti-pHSL antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA). Lotting was performed.
  • 3T3-L1 fat progenitors were seeded in 6 well plates at a cell density of 3 ⁇ 10 5 cells / well. After incubation for 24 hours, peptides were treated by concentration (0.1, 1, 10 yg / ml) and incubated in 37 ° C incubator for 14 days (positive control: 100 ng / ml TNF ⁇ (SIGMA)). After the cultured cells were recovered, RNA was prepared by treating RNA extraction solution (Easy Blue, Intron), and cDNA was synthesized using RT premix (Intron). PCR was performed using primers for each labeling factor ( ⁇ - ⁇ , CGI58) and PCR premix (Intron).
  • the target-specific primer sequences used for the lipogenic marker PCR are as follows: AMPK— ⁇ forward primer sequence, 5′-
  • TGACCGGACATAAAGTGGCTGTGA-3 ′ and AMPK- ⁇ 1 reverse primer 5′-TGATGATGTGAGGGTGCCTGAACA-3 ′ (annealing temperature, 60 ° C.);
  • PCR products were loaded on 5 ⁇ of PCR products in 1% agarose gel, followed by electrophoresis, and the bands were identified in Gel-Doc.
  • 3T3-LK adipocytes were seeded in 6-well plates at a cell density of 3 ⁇ 10 5 cells / well. After incubation for 24 hours, peptides were treated by concentration (0.1, 1, 10 ng / ml) and incubated in a 37 ° C incubator for 14 days (positive control: 100 ng / ml TNF a (SIGMA)). After lysing the lysate by treating the cell lysis buffer, protein quantification was performed and Western blotting was performed using an anti-ATGL antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA).
  • 3T3-L1 fat progenitor cells
  • 3T3-L1 fat progenitor cells
  • a cell density 3 ⁇ 10 5 cells / well ⁇ 24 hours of incubation followed by treatment of each peptide or peptide complex (1 pg / ml) and 37 ° C incubator for 14 days (Positive control: 100 ng / ml TNF ⁇ (SIGMA)).
  • SIGMA 100 ng / ml TNF ⁇
  • the cells were fixed with 70% ethanol, and then intracellular expression of phospho-HSL, a lipolysis-inducing factor, was observed through cellular immunostaining using an anti-phospho-HSL antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA). It was.
  • adipose tissue was collected from the abdomen-induced mouse animal, 100 mg / well of adipose tissue was added to a 24-well culture poolate and culture medium (1 ml Krebs- Ringer buffer containing 25 mM HEPES, 5.5 mM glucose, and 2% (w) / v) in bovine serum albumin). Peptide complexes were treated at concentrations of 0.1 yg / ml, 1 ug / ml, and 10 ug / ml, and treated with TNF ⁇ 100 ng / ml as a positive control group. The amount of lysel was measured.
  • Adipose tissue is divided into white fat and brown fat according to color, and divided into subcutaneous fat, peritoneal fat, mesenteric fat (visceral fat), and epididymal fat by region. After dissection, each fat was extracted to separate white fat, and then treated with a compound concentration in a 24-well plate at a weight of 100 mg / well, followed by culture medium (1 ml Krebs-Ringer buffer containing 25 mM HEPES ⁇ 5.5 mM glucose, and 2% After 72 hours of incubation in (w / v) bovine serum albumin), the tissues were sectioned and stained with hematoxylin and eosin, and the size of fat cells was compared by microscopic observation (TS100, Nicon) at 200 times.
  • TS100, Nicon microscopic observation
  • the peptide complex was treated by concentration, the size of the fat cells was compared with that of the control group, and it was confirmed that the size of the fat cells was reduced (FIG. 10A).
  • the peptide complex was measured by measuring the size of fat cells using a program to measure the size of fat cells after staining. Reduction of cell size in adipose tissue with distinct cell membrane compartments was observed in the treated group (FIG. 10B).
  • Adipose tissue was collected from the abdomen of obese mice, and 100 mg / well of adipose tissue was added to a 24-well culture plate, followed by culture medium (1 ml Krebs- Ringer buffer containing 25 mM HEPES, 5.5 mM glucose, and 2% (w / v) bovine serum albumin). Peptide complexes were treated at the time of treatment, TNFa 100 ng / ml was treated as a positive control, and cultured for 48 hours, and then the expression of HSL (green fluorescent substance) as phospholipid factor was confirmed.
  • HSL green fluorescent substance
  • Anti-obesity efficacy experiments were performed using a diet-induced obesity model DI0 (Diets induced obesity) induced in normal C57BL / 6 mice, and TNFa 5 g / ml was used as a positive control drug.
  • the control group proceeded to the normal diet, not the high fat diet, and the experiment was carried out for 12 weeks while the high fat diet, the peptide complex treatment and the positive control group was confirmed the weight loss.
  • TNFQ and anti-obesity compounds were forcibly intraperitoneally injected for 12 days at 3 pm -4 pm for 84 days.
  • Body weight and diet were measured immediately before the first drug administration, and then body weight and diet were measured at weekly intervals.
  • Blood glucose was measured using Accu-Check Active Roche after blood collection in the tail vein after the end of the drug administration experiment.
  • Cholesterol was also analyzed using the Cholesterol calculation Kit (BioVision).
  • Adipose tissue is divided into white fat and brown fat according to color, and subcutaneous fat, peritoneal fat, mesenteric fat (visceral fat) and epididymal fat depending on the area.
  • mice fed the normal diet for 12 weeks ranged from 20.9 g at the beginning of the experiment to 28.74 g after 12 weeks, and the mice fed the high-fat diet had an initial body weight of 20.99 g at 49.5 g after 12 weeks. It was confirmed. However, in the peptide complex group treated in parallel with the high fat diet, high weight loss (174.2%) occurred from the initial 21. 1 g to 36.76 g after 12 weeks. (Table 2 and Figure 12).
  • mice that were experimented for 12 weeks micro-CT was used to confirm the distribution of fat throughout the body.
  • the amount of fat distributed in the whole body was rapidly increased in the mice of the control group fed the high-fat diet compared to the control group fed the normal diet.
  • the group treated with the high-fat dietary peptide complex it was confirmed that the amount of fat distributed throughout the body was sharply reduced (FIG. 14).
  • mice were dissected and the adipose tissue distributed throughout the body was observed. The results showed that the amount of adipose tissue was observed. It was confirmed that the amount of fat was large, the amount of fat was sharply reduced in the group treated with the peptide complex with a high fat diet (Fig. 15).
  • the amount of cholesterol in the general formula was 2.52 g / ml, It was confirmed that the amount of cholesterol was 3.5 yg / ml, and the amount of 2.86 ii g / ml of cholester was detected in the group treated with peptidu complex with the high-fat diet. Peptide complex treatment group was able to confirm that lowering the level of cholesterol rising in obesity (Fig. 18).
  • C57BL / 6 normal rats
  • C57BLKS / JLepr diabetic mouse, db / db mouse
  • / or a combination agent was used as an anti-obesity potent and si tagliptin (si tagl ipt in) was used as a positive control drug.
  • acute antimicrobial activity against normal mouse models and genetically probable models Diabetic efficacy (single dose) was evaluated for antidiabetic and / or antiobesity efficacy combinations using the Glucose Tolerance Test (GTT) method, a representative diabetes diagnostic test method.
  • GTT Glucose Tolerance Test
  • mice The breeding environmental conditions of the mice were set at 22-24 ° C, relative humidity 50-30%, and four per breeding box. From 8 am to 8 pm, the lights were illuminated at 150-300 Lux, 12 hours a day, 12 hours off.
  • the diet was freely ingested using a regular diet (18% protein, manufactured by Har lan Laborator ies Inc, USA), fasted for at least 4 hours before the ITT experiment, and fasted for 12 hours before the GTT experiment.
  • a regular diet (18% protein, manufactured by Har lan Laborator ies Inc, USA
  • fasted for at least 4 hours before the ITT experiment and fasted for 12 hours before the GTT experiment.
  • the combination was forced orally administered using a disposable syringe for oral administration, respectively, and the high-fat diet was fed free for 40 minutes at the 0 hour experiment for the GTT experiment.
  • the blood glucose level increased by high fat diet was observed by the peptide complex treatment.
  • Diabetes-induced mouse model was confirmed to reduce the high blood sugar of diabetes (Fig. 20a-b).
  • the amount of cholesterol is lowered in the amount of cholesterol in the peptide complex treatment group with the high fat diet compared to the control of the high fat diet (Fig. 21).
  • mice fed DB / DB diabetes-induced fasting for 16 hours, followed by diet for 30 minutes, ingested peptides, and blood glucose levels were measured by time.
  • 3T3-L1 fat progenitors
  • 3T3-L1 fat progenitors
  • peptides were treated by concentration (10 ng-1 yg / ml) and incubated in a 37 ° C incubator for 14 days.
  • the protein was quantified and observed by Western blotting using an anti-IGF-1, an insulin antibody (Santa Cruz Biotechnol ogy, USA).

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Abstract

본 발명의 펩타이드 및 펩타이드 복합체는 지방 축적을 억제하고, 이미 축적된 지방을 분해하여 항비만 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 혈당을 효과적으로 감소시켜 당뇨병에 대하여 우수한 효과를 나타낸다. 본 발명의 펩타이드 및 펩타이드 복합체는 지질생성 표지인자인 PPARγ, ACC 및 aP2의 발현의 감소시키고, 지방분해 인자인 pHSL, AMPK-α1, CGI-58 및 ATGL의 발현을 증가시키며 지방세포의 크기 및 혈중 콜레스테롤 수치를 감소시킨다. 본 발명의 펩타이드 및 펩타이드 복합체의 우수한 활성 및 안정성은 의약 및 의약외품에 매우 유리하게 적용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
【기술분야】
본 특허출원은 2015 년 4 월 28 일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2015—0059648 호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
【발명의 배경이 되는 기술】
최근 우리나라에서는 경제 성장과 식생활의 서구화로 인하여 음식물에서 얻는 지방분의 섭취량에 증가하였으며 운동부족 등으로 인해 비만， 당뇨병 , 고지혈증， 고혈압， 동맥경화증 및 지방간과 같은 대사성 질환이 증가되고 있는 추세이다. 또한， 비만은 젊은이들에게 있어서 마른 체형을 좋아하는 미용적인 모습을 해칠 뿐만 아니라 비만이 지속됨으로씨 여러 가지 질환들이 취급되고 있다.
현재 비만을 치료하는 치료제로는 크게 중추 신경계에 작용하여 식욕에 영향을 주는 약제와 위장관에 작용하여 흡수를ᅳ저해하는 약물로 나누어 볼 수 있다. 중추 신경계에 작용하는 약물로는 각각의 기전에 따라 세로토닌 (5-HT) 신경계를 저해하는 펜풀루라민 텍스펜플루라민 등의 약물, 노르아드레날린 신경계를 통한 에페드린 및 카페인 등의 약물 및 최근에는 세로토닌 및 노르아드레날린 신경계에 동시 작용하여 비만을 저해하는 시부트라민 등의 약물들이 시판되고 있다. 이외에도， 위 /장관에 작용하여 비만을 저해하는 약물로 장관 리파제를 저해하여 지방의 흡수를 줄여 주는 비만 치료제로 허가된 오를리스타트 등이 대표적인 약물로 사용되고 있다. 그러나 기존에 사용되어온 약물 중 펜플루라민 등의 약물은 부작용으로 원발성 폐고혈압이나 심장 판막병변을 일으켜 최근에 사용이 금지 되었으며, 다른 약물들도 혈압감소나 유산산혈증 등의 문제점이 발생하여 심부전， 신장질환 둥의 환자에는 사용하지 못하는 문제점이 있다.
당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환와 일종으로 (DeFronzo, 1988) , 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며， 고혈당으로 인하여 여러 중상 및 징후를 일으키고 소변에서 포도당을 배출하게 되는 질환이다. 최근 비만를， 특히 복부 비만의 증가로 인하여 당뇨의 발생률이 폭발적으로 증가하고 있는 추세이다.
당뇨 환자의 수는 2000 년 전세계적으로 1 억 7 천만명으로 평가 되었고, 2030 년에 3 억 7천만명에 이를 것으로 예상되었으나, 최근 분석에 의하면 2008 년에 이미 전 세계적으로 약 3 억 5 천만명에 이르렀다고 보고되어 (Danaei et al . . 2011) , 예상보다 훨씬 심각한 수준이다. 이형 당뇨 환자의 약 80% 이상이 비만인 것에 비해 비만 의 단지 10% 미만이 당뇨로 보고되어 (Harr i s et al . . 1987) 있다. 이런 당뇨와 비만의 연관성은 아디포카인들 (adipokine)과 유리지방산 ( free fatty acid)의 불규칙적인 분비로 인하여 지방산이 베타세포나 신장， 간， 심장 등 인슐린 민감성 조직 내에 쌓여 지방 독성 ( l ipotoxi ci ty)을 나타내기 때문이다. 만성적인 고혈당 상태에 적절한 치료가 되지 않으면, 신체에서 여러 병적 증상이 수반되는데， 대표적인 것이 망막병증， 신기능장애， 신경병증， 혈관 장애로 인한 합병증을 예방하기 위해서는 효과적인 혈당 관리가 필수적이다. 현재 혈당을 조절하는 방법으로는 생활습관 고정 (식이요법 , 운동요법 ) 및 약물 요법 등이 사용되고 있다. 하지만 식이 요법이나 운동 요법은 엄격한 관리 및 실시가 곤란하며, 그 효과에 있어서도 한계가 있다. 따라서 대부분의 당뇨 환자들은 생활 습관의 교정과 더불어 인슐린， 인슐린 분비 촉진제， 인슐린 감수성 개선제, 그리고 혈당 강하제 등의 약물에 혈당조절에 의존하고 있다.
재조합 방법에 의해 생산되고 있는 인슐린은 일형 당뇨환자 및 혈당조절이 되지 않는 이형 환자에 필수적인 약물로 혈당 조절에 있어서 유리하지만， 주사침에 대한 거부감， 투여 방법의 어려움， 저혈당위험， 그리고 체중증가 등의 단점을 가지고 있다. 인슐린 분비 촉진제의 일종인 메글리티나이드계는 약효가 매우 빠른 제제로 식전에 복용하며 , 노보넘 (레파글리나이드)， 파스틱 (나테글리나이드) 글루패스트 (미티글리나이드) 등이 있다. 인슐린 감수성 개선제는 단독으로 복용 시 저혈당 ο 거의 없는 것이 특징이며， 바이구아나이드 (biguanide)계열 약물인 메트포르민 (metformin)과 치아졸리딘다이온 (thiazolidinedione) 계열의 아반이다 (로지글리타존), 액토스 (피오글리타존) 등이 있다.
최근 개발되고 있는 약물로는 인슐린 분비를 촉진시키는 호르몬인 글루카곤 유사 펩타이드 -l(Glucagon-like peptide-1)의 작용을 이용하여 개발된 GLP-1 아고니스트 (agonist)가 있으며, 엑센나타이드 (exenatide)와 빅토자 (liraglutide)가 여기에 해당된다. 또한 GLP-1 올 신속하게 불활성화시키는 효소인 DPP-4(Dipeptidyl peptidase-4)의 작용을 억제하는 DPP-4 억제제 (Inhibitor)도 최근 개발된 신약이며， 자누비아 (성분명: 시타글립틴 sitagliptin)가 대표적이다. 그러나 이들 약제는 간독성， 위장장애， 심혈관계 질환 및 발암성 등의 부작용들이 보고되고 있으며, 연간 치료 비용 또한 높아 당뇨병의 치료에 있어서 장애가 되고 있다. 실제로 전 당뇨병 (pre-diabetes) 및 당뇨병 관련 비용은 2007 년을 기준으로 미국에서만 약 200 조원에 육박하며 (Dal 1 et al . , 2010), 비만 관련 비용 또한 2008 년 기준으로 미국에서만 150 조원에 육박한다 (Finkelstein et al. , 2009) . 따라서 체중을 감소시키고， 혈당을 효과적으로 낮추어서 당뇨병 및 비만성 당뇨병의 치료에 동시에 사용할 수 있으면서 부작용이 적은 약제의 개발은 시급한 실정이다.
우선, 비만 치료를 위한 보다 개선된 방법을 찾기 위해여 최근 에너지 대사를 조절하는 기전에 관심을 갖게 되고, 이쪽 계열의 화합물이 보다 높은 안전성 (낮은 독성 )을 가져야 한다는 전제하에 인간이 고지방식이를 섭취하였을 때 지방으로 축적되는 시그널과 지방축적에 영향을 끼치는 단백질들의 연구를 진행하였으며， 이런 지방 축적의 단백질의 발현을 억제하고, 이미 축적된 지방을 분해시키기 위한 시그널 연구 및 관여 단백질의 연구를 통해 지방분해를 촉진하는 연구 및 펩타이드를 개발하게 되었다. 또한 본 발명의 펩타이드들은 당뇨병 및 비만으로 유도되는 당뇨병에 탁월한 효능을 보인다. 고지방식이로 인해 유발되는 지방 축적， 간이나, 근육 등의 지방 축적으로 인해 나타나는 인슐린의 시그널 억제, 이로 인해 유발되는 인슐린의 내성이 당뇨병의 원인이 되는데， 본 발명의 펩타이드 각각， 그리고 복합체는 이런 당뇨병 및 비만성 당뇨병 치료에 효과를 보인다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
[발명의 내용】
【해결하고자 하는 과제】
본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 다수의 우수한 펩타이드를 개발하고자 노력한 결과, 서열목록 제 1 서열 내지 서열목록 제 7 서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 고지방식이에 의해 유도된 지방 축적을 억제하고, 이미 축적된 지방의 분해하여 항비만 효과를 나타낼 뿐만 아니라， 당뇨병 및 비만성 당뇨병, 또는 당뇨 합병증에 대하여 우수한 효과를 나타낸다는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서， 본 발명의 목적은 서열목록 제 1 서열 내지 서열목록 제 7서열에 기재된 아미노산서열로 이루어진 펩타이드를 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 항비만 또는 항당뇨 활성을 갖는 펩타이드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항비만 또는 항당뇨 활성을 갖는 펩타이드 복합체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 비만의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 당뇨의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 서열목록 제 1 서열 내지 서열목톡 제 7 서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열 내지 서열목톡 제 7 서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종의 아미노산 서열로 이루어진 항비만 및 항당뇨 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 펩타이드 조합으로 구성된 항비만 또는 항당뇨 활성을 갖는 템타이드 복합체를 제공한다:
(a) 서열목톡 제 1서열로 이루어진 펩타이드;
(b) 서열목록 제 2서열 또는 서열목록 제 3서열로 이루어진 펩타이드; (c) 서열목록 제 6서열 또는 서열목록 제 7서열로 이루어진 펩타이드. 본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 다수의 우수한 펩타이드를 개발하고자 노력한 결과， 서열목록 제 1 서열 내지 서열목록 제 7 서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 고지방식이에 의해 유도된 지방 축적을 억제하고， 이미 축적된 지방을 분해하여 항비만 효과를 나타낼 뿐만 아니라， 당뇨병 및 비만성 당뇨병， 또는 당뇨 합병증에 대하여 우수한 효과를 나타낸다는 것을 규명하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩타이드" 는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법ᅳ 특히 고상 합성 기술 (sol idᅳ phase synthesis techniques； Merr i f ield, J. Amer . Chem. Soc.
85:2149-54(1963)； Stewart, et al . ' Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed. , Pierce Chem. Co.： Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술 (US 등록특허 제 5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 또는 C-말단에 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체내 투여시의 반감기를 증가시킨 높은 반감기를 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드의 C-말단은 히드록시기 (-0H) , 아미노기 (- NH2 ) , 아자이드 (-NHNH2) 등으로 변형되어 있으며, 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기， 포르밀기 ;， 팔미토일기, 미리스틸기， 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.
상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 "안정성" 은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대， 상온 저장 안정 )도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 고지방식이에 의해 유도된 유도하였을 때 지방 축적을 억제하고, 이미 축적된 지방의 분해하는 효과를 나타내며, 지질생성 표지인자인 PPAR Y , ACC 및 aP2 의 발현의 감소시키고， 지방분해 인자인 pHSL , AMPK- α 1 , CGI— 58 및 ATGL 의 발현을 증가시키며 지방세포의 크기 및 혈중 콜레스테를 수치를 감소시킨다. 또한， 본 발명의 펩타이드는 혈당을 효과적으로 감소시킨다. 이러한 결과는 본 발명의 펩타이드가 비만， 당뇨병 및 비만성 당뇨병 치료에 매우 우수한 효능을 가진다는 것을 의미한다.
본 발명의 펩타이드는 서열목록 제 1 서열 내지 서열목록 제 7서열의 아미노산 서열로 표시되는 각 펩타이드 뿐 만 아니라 이들의 복합체도 우수한 항비만 및 항당뇨 활성을 나타낸다.
본 발명에 따르면， 서열목톡 제 3 서열， 서열목록 제 5 서열 및 서열목록 제 7 서열로 이루어진 펩타이드는 각각 서열목록 제 2 서열， 서열목록 제 4 서열 및 서열목록 제 6 서열로 이루어진 펩타이드의 Cys 가 Ser으로 치환된 펩타이드로서 이들 두 펩타이드의 항비만 및 항당뇨 활성의 거의 동일하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 항비만 또는 항당뇨 활성을 갖는 펩타이드 복합체는 서열목록 제 1 서열로 이루어진 펩타이드; 서열목록 제 2 서열 또는 서열목록 제 3 서열로 이루어진 펩타이드; 및 서열목록 제 6 서열 또는 서열목록 제 7 서열로 이루어진 펩타이드의 조합으로 구성된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면， 본 발명의 펩타이드 복합체는 서열목록 제 1 서열， 서열목록 제 3서열 및 서열목특 제 7서열의 조합으로 구성된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 본 발명의 펩타이드 또는 핍타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 지방생성을 억제하고， 지질을 분해하는 기능이 탁월하여 비만의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 또는 ¾타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 당뇨의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 당뇨병 동물 모델에서 증가된 혈당을 효과적으로 감소시키는 효능을 나타내어 당뇨의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량" 은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스, 텍스트로스， 수크로스， 솔비틀， 만니를， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피를리돈, 샐를로스， 물， 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제， 감미제, 향미제, 유화제 , 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington' s Pharmaceut i cal Sci ences ( 19th ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고， 비경구 투여인 경우에는 근육 주입， 정맥내 주입, 피하주입， 복강 주입， 국소 투여， 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식， 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태ᅳ 음식， 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반응 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한투여량은 1 일 당 0.0001-1000 이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형태이거나 액스제 분말제， 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할수 있다. 【효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
( i ) 본 발명의 펩타이드 및 펩타이드 복합체는 지방 축적을 억제하고， 이미 축적된 지방을 분해하여 항비만 효과를 나타낼 뿐만 아니라， 혈당을 효과적으로 감소시켜 당뇨병에 대하여 우수한 효과를 나타낸다.
( ii ) 본 발명의 펩타이드 및 펩타이드 복합체는 지질생성 표지인자인 PPARy , ACC 및 aP2의 발현의 감소시키고, 지방분해 인자인 pHSL, ΑΜΡΚ- α Ι, CGI-58 및 ATGL 의 발현을 증가시키며 지방세포의 크기 및 혈중 콜레스테롤 수치를 감소시킨다.
( iii ) 본 발명의 펩타이드 및 펩타이드 복합체의 우수한 활성 및 안정성은 의약 및 의약외품에 매우 유리하게 적용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】 도 1 은 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 축적된 지방을 Oi l red 0 염색을 통해 확인한 결과이다. ( a) 서열목록 제 1서열의 펩타이드, (b) 서열목록 제 3서열의 펩타이드， ( c) 서열목록 제 5서열의 펩타이드.
도 2는 본 발명의 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 축적된 지방을 확인하기 위해 Oi l red 0 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 3 은 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 지방생성에 관여하는 유전자인 aP2 의 발현양을 측정한 결과이다. ( a) 서열목록 제 1 서열의 펩타이드， (b) 서열목록 제 3 서열의 펩타이드， ( c) 서열목록 제 5 서열의 펩타이드.
도 4 는 본 발명의 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 지질 합성 시 중요한 유전자인 PPAR Y , ACC , aP2 유전자의 발현양을 측정한 결과이다.
도 5 는 본 발명의 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 지질 합성 시 중요한 단백질인 PPAR y , phospho-HSL 단백질의 발현양을 측정한 결과이다.
도 6 은 본 발명의 펩타이드 및 펩타이드 복합체를 처리하였을 때 축적된 지방을 분해하는 과정에 관여하는 유전자인 ΑΜΡΚ- α Ι 과 CGI 58 의 발현양을 측정한 결과이다. (a) 서열목록 제 1 서열의 펩타이드， (b) 서열목록 제 3 서열의 펩타이드, ( c ) 서열목특 제 5 서열의 펩타이드， (d) 서열목록 제 1서열， 서열목록 제 3서열 및 서열목록 제 7서열의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드의 복합체.
도 7은 본 발명의 펩타이드 복합체를 도별로 처리하였을 때 축적된 지방을 분해하는 과정에 관여하는 단백질인 ATGL 의 발현양을 측정한 결과이다.
도 8 은 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 축적된 지방을 분해하는 과정에 관여하는 단백질인 Phospho-HSL 의 발현양을 면역염색을 이용하여 측정한 결과이다. ( a) 서열목록 제 1 서열의 펩타이드, (b) 서열목록 제 3 서열의 펩타이드, (c ) 서열목록 제 5 서열의 펩타이드， (d) 서열목톡 제 1 서열, 서열목록 제 3 서열 및 서열목록 제 7서열의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드의 복합체. 도 9 는 본 발명의 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 글라이세를의 생성양을 측정한 결과이다.
도 10a 는 본 발명의 펩타이드 복합체를 비만생쥐 실험모델에 농도별로 처리한 후 분해되는 지방조직을 측정한 결과이다. 도 10b는 본 발명의 펩타이드 복합체를 비만생쥐 실험모델에 처리한 후 분해되는 지방 조직의 크기 및 수치를 측정한 결과이다.
도 11 은 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리하였을 때 축적된 지방을 분해하는 과정에 관여하는 단백질인 Phospho-HSL 의 발현양을 면역염색을 이용하여 측정한 결과이다.
도ᅳ 12—든 본—발명와—펩ᅵ타이드 복—합체를 처리하였을 때 비만생쥐에서 몸무게 변화 (a) 및 사료 섭취 변화 (b)를 측정한 결과이다. ：
도 13 은 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리하였을 때 비만생쥐의 모습을 측정한 결과이다.
도 14는 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 마이크로시티 촬영을 통해 지방의 분포를 측정한 결과이다.
도 15는 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 지방세포조직을 채취하여 관찰한 결과이다.
도 16a 는 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 지방세포조직을 채취하여 지방세포 모양을 관찰한 결과이다. 도 16b 는 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 지방세포조직을 채취하여 지방세포 크기를 관찰한 결과이다
도 17은 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 지방세포조직을 채취하여 지방세포 내의 지방 분해에 작용하는 단백질인 phospho-HSL의 발현양올 관찰한 결과이다 도 18은 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 혈액을 채취하여 콜레스테를의 양을 측정한 결과이다.
도 19 는 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 혈액을 채취하여 혈당을 측정한 결과이다.
도 20 은 당뇨가 유발된 DBDB 생쥐 모델에 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 혈액을 채취하여 혈당의 변화를 측정한 결과이다.
도 21 은 당뇨가 유발된 DBDB 생쥐 모델에 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 혈액을 채취하여 콜레스테를의 변화를 측정한 결과이다. 도 22 는 당뇨가 유발된 DBDB 생쥐 모델에 본 발명의 펩타이드를 처리한 후 혈액을 채취하여 혈당의 변화를 측정한 결과이다. (a) 서열목록 제 1 서열의 펩타이드, (b) 서열목록 제 3 서열의 펩타이드， (c) 서열목톡 제 5서열의 펩타이드.
도 23 은 본 발명의 서열목록 제 7 서열의 펩타이드를 처리하였을 때
IGF-1과 인슐린의 발현양을 측정한 결과이다.
도 24 는 당뇨가 유발된 DBDB 생쥐 모델에 본 발명의 서열목록 제 7 서열의 펩타이드를 처리한 후 혈액올 채취하여 혈당의 변화를 측정한 결과이다.
도 25a-d 는 혈당이 높은 당뇨병 환자에 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 혈액을 채취하여 혈당의 변화를 측정한 결과이다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
합성예 1 : 펩타이드 합성 클로로 트리틸 클로라이드 레진 (Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg 을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드 (MC) 10 ml 를 가하여 3 분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드 (DMF) 10 ml 를 넣어 3 분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반웅기에 10 ml 의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc- Asn(Trt)-0H(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민 (DIEA) 400 mmole 을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반웅 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를
DCM(dichloromethane)에 녹여 10 분간 반응시키고 과량의 DCM/DMFC1: 1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드 (DMF)를 10 ml 넣어 3 분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액 (20%의 피페리딘 (Piperidine)/DMF) 10 ml 를 반응용기에 넣고 10 분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10 분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3 분씩 DMF 로 2 회, MC 로 1 회, DMF 로 1 회 세척하여 Asn-CTL 레진 (Resin)을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml 의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Arg(Pbf )-0H(Bachem, Swiss) 200 隱 ole, HoBt 200 隱 ole 및 Bop 200 mmole 을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA 를 분획으로 2 번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5 분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반웅용기에 넣고 1 시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3 회 5 분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트 (Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2 번 탈보호 반웅시켜 Arg-Asn-CTL 레진을 제조하였다. DMF 와 MC 로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 f½oc-Thr(tBu)-0H, Fmoc-Lys(Boc)-0H, 및 Fmoc-Leu-(3H 순으로 연쇄반웅을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10 분씩 2 번 반웅시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt 를 넣어 한시간 동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3 번을 세척하고， 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후， P205 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액 [트리플로로화 초산(1 £11^0^61：^ acid) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸 (Thioanisole) 5% 페놀 (Phenol) 5%， EDT 2.5% 및 TIS 1%] 30 ml 을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고， 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml 의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후， 원심분리하여 침전을 모으고, 2 번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 층분히 건조하여 정제 전 NH2_Leu-Lys-Thr-Arg-Asn-C00H 펩타이드 1 을 0.85 g 합성 (수율 : 92%)하였다, 서열목록 2및 3은 NH2-Lys-Gly-Ala-Cys(Ser)-Thr-Gly-Trp-Met- Ala-COOH로 0.78 g합성하였으며 (수율: 82¾)， 서열목록 4 및 5는 N¾-Ala- Cys(Ser)Thr-Leu-Pro— His-Pro-Trp— Phe-Cys(Ser)-C00H 을 0.92 g 합성하였다 (수율: 85%). 서열목록 6및 7은 NH2-Cys(Ser)-Asp-Leu-Arg— Arg- Leu-G 1 u-Me t -Tyr -Cys ( Ser ) -C00H 을 0.76 g 합성하였다 (수율: 88%) 분자량 측정기를 이용하여 측정시 서열목록 1 펩타이드의 분자량 630.7 (이론값 ： 630.7)， 서열목톡 2 펩타이드의 분자량 924.5(이론값 ： 924.1)， 서열목록 4 펩타이드의 분자량 1236 (이론값 ： 1236.5)， 서열목록 6 펩타이드의 분자량 1301.5(이론값 ： 1301.5를 얻을 수 있었다.
【표 1】
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한편， 서열목록 제 1 서열， 서열목록 제 3 서열 및 서열목록 제 7 서열의 펩타이드를 동량 섞어 펩타이드 복합체를 만들고 이에 대한 효능을 평가하였다. 실시예 1: 지질생성 억제 활성 평가
1-1. 지방전구세포를 이용한 지질 축적 억제 (Oil red 0 staining)
지방전구세포 (pre-adipocyte)인 3T3-L1 세포를 Confluent 상태까지 배양한 후 10 yg/ml 인슐린， 0.1 μΜ 텍사메타손 및 0.5 μΜ ΙΒΜΧ 가 포함된 분화배지로 교환 및 펩타이드를 농도별로 처리 하여 2 일간 배양하였으며, 그 후 매 2 일마다 10 yg/ml 인슐린이 포함된 배지로 교환하였으며， 10 일간 분화를 유도한 후 세포 내 방울 (droplet) 생성을 확인하기 위하여 Oil Red 0 염색을 실시하였다. 준비된 3T3-L1 지방전구세포를 PBS 로 세척한 후 3.7% 포르말린으로 1 시간 동안 고정하고 60% 이소프로파놀을 이용하여 세척한 다음 Oil Red 0 용액을 처리하여 실온에서 20 분간 염색하였다. 염색 후 Oil Red 0 용액을 제거하고 증류수로 3 회 세척한 다음 염색된 세포를 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 또한 정량적 분석을 위하여 10 이소프로파놀을 이용하여 지방을 추출한 후 96 웰 플레이트에 200 μ 1 씩 옮겨서 ELISA 리더로 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과， 서열목록 제 1서열, 제 3서열 및 제 5서열의 펩타이드를 처리하였을 때 세포내 지방 축적 정도가 감소하는 것을 Oil Red 0 염색을 통해 확인할수 있었다 (도 la— c).
또한， 서열목록 계 1 서열, 제 3 서열 및 제 7 서열의 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 세포내 지방 축적 정도가 감소하는 것을 확인할수 있었다 (도 2).
1-2. 지질생성에 관여하는 유전자들의 발현억제
3X105 세포 /웰의 세포 밀도로 6 웰 플레이트에 3T3— L1 (지방 전구세포)를 시딩하였다. 24 시간 배양한 후 펩타이드를 농도별 (0.1, 1, 10 yg/ml)로 처리하고 14일간 37°C 배양기에서 배양하였다 . 배양 완료된 세포를 회수한 후 RNA 추출 용액 (Easy Blue, intron)을 처리하여 RNA 를 준비한 후 RT 프리믹스 (Intron)를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 각 표지 인자 (PPARY , ACC, aP2)에 대한 프라이머와 PCR 프리믹스 (Intron)를 사용하여 PCR진행하였다.
지질생성 표지인자 PCR 에 이용된 타겟-특이적 프라이머 서열은 다음과 같다: PPARY 정방향 프라이머 서열， 5' -TTTTCAAGGGTGCCAGTTTC-3 ' 및 PPARy 역방향 프라이머, 5' -AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3 ' (어닐링 온도， 60 °C); ACC 정방향 프라이머 서열， 5' -ACCTTACTGCCATCCCATGTGCTA-3 ' 및 ACC 역방향 프라이머, 5' -GTGCCTGATGATCGCACGAACAAA-3 ' (어닐링 온도, 60 °C); aP2 정방향 프라이머 서열， 5' -CATCAGCGTAAATGGGGATT-3 ' 및 aP2 역방향 프라이머, 5 ' — ACACATTCCACCACCAGCTT-3 ' (어닐링 온도， 60°C ) .
1% 아가로오스 겔에 PCR 산물을 5 nl 씩 로딩하여 전기영동한 후 Gel-Doc에서 벤드를 확인하였다.
마우스 골모세포주 3T3-L1 에 서열목록 제 1 서열， 제 3 서열 또는 제 5서열의 펩타이드를 처리하고 3일간 배양한 결과， 지질생성 표지 인자인 aP2의 발현이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 3a-c).
마우스 골모세포주 3T3-L1에 서열목록 제 1서열， 서열목록 제 3서열 및 서열목록 제 Ί 서열의 펩타이드 복합체를 0.1 ug/ml , 1 ug/ml , 10 g/ml 의 농도로 처리하고 3 일간 배양한 결과， 지질생성 표지 인자인 PPARy , ACC, aP2 의 발현이 양성 대조군 TNF α 100 ng/ral 처리군과 펩타이드 복합체 처리군에서 모두 감소되는 것을 관찰할 수;있었다 (도 4).
1- 3. 지방전구세포를 이용한 지질생성 및 분해 유도 단백질 발현 관찰
3X105 세포 /웰의 세포 밀도로 6 웰 플레이트에 3T3-L1 (지방 전구세포)를 시딩하였다. 24 시간 배양한 후 펩타이드 복합체를 농도별 (0.1, 1， 10 yg/ml)로 처리하고 14일간 37°C 배양기에서 배양하였다. 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해물을 확보 후 단백질 정량하고 지방생성 인자인 항 -PPARY 항체 (Santa Cruz Biotechnology, USA)와 지방분해 인자인 항 -pHSL 항체 (Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
지방 생성 표지 인자인 PPARY 단백질의 발현이 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 농도 의존적으로 모두 감소되는 것을 관찰할 수 있었으며, 지방 분해 표지 인자인 pHSL 단백질의 발현양을 관찰하였을 때 펩타이드 복합체 처리군에서 모두 증가되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 5). 실시예 2: 지질분해 활성 평가
2- 1. 지질분해에 관여하는 유전자들의 발현증가
3X105 세포 /웰의 세포 밀도로 6 웰 플레이트에 3T3-L1 (지방 전구세포)을 시딩하였다. 24 시간 배양한 후 펩타이드를 농도별 (0.1， 1, 10 yg/ml)로 처리하고 14 일간 37°C 배양기에서 배양하였다 (양성 대조군 : 100 ng/ml TNF α (SIGMA)) . 배양 완료된 세포를 회수한 후 RNA 추출 용액 (Easy Blue, Intron)을 처리하여 RNA 를 준비한 후 RT 프리믹스 (Intron)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 각 표지 인자 (ΑΜΡΚ-αΙ, CGI58)에 대한 프라이머와 PCR 프리믹스 (Intron)를 사용하여 PCR 진행하였다.
지질생성 표지인자 PCR 에 이용된 타켓-특이적 프라이머 서열은 다음과 같다: AMPK— αΐ 정방향 프라이머 서열， 5' -
TGACCGGACATAAAGTGGCTGTGA-3 ' 및 AMPK- α 1 역방향 프라이머， 5' - TGATGATGTGAGGGTGCCTGAACA-3 ' (어닐링 온도， 60°C); CGI 58 정방향 프라이머 서열， 5' -TGTGCAGGACTCTTACTTGGCAGT-3' 및 CGI58 역방향 프라이머, 5' - GTTTCTTTGGGCAGACCGGTTTCT-3' (어닐링 온도, 60°C).
1% 아가로오스 겔에 PCR 산물을 5 μ ΐ 씩 로딩하여 전기영동한 후 Gel-Doc에서 밴드를 확인하였다.
지방전구세포 (3T3-L1)에 펩타이드를 처리하고 배양한 결과， 지질분해 표지 인자인 ΑΜΡΚ-αΙ 과 CGI-58 의 발현이 각 펩타이드 처리군에서 모두 증가되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 6a-c). 또한， 펩타이드 복합체를 처리한 경우, AMPK- α 1 과 CGI-58의 발현이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었고 양성 대조군인 TNFa 100 ng/ml 처리군과 비교하였을 때에도 지방 분해 인자들의 발현증가가 높게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다 (도 6d).
2-2. 지방전구세포를 이용한지질분해 유도 단백질 발현 관찰
3X105 세포 /웰의 세포 밀도로 6 웰 플레이트에 3T3-LK지방 전구세포)를 시딩하였다. 24 시간 배양한 후 펩타이드를 농도별 (0.1， 1， 10 ng/ml)로 처리하고 14 일간 37°C 배양기에서 배양하였다 (양성 대조군: 100 ng/ml TNF a (SIGMA)) . 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해물을 확보 후 단백질 정량하고 지방분해 인자인 항 -ATGL 항체 (Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다ᅳ
지방 분해 인자인 ATGL 의 발현이 펩타이드 복합체에 의해 증가하는 것을 확인 할 수 있었다 (도 7).
2-3. 지방전구세포를 이용한지질분해 휴도 단백질 발현 형광 현미경 관찰
3X105 세포 /웰의 세포 밀도로 6 웰 플레이트에 3T3-L1 (지방 전구세포)를 시딩하였다ᅳ 24 시간 배양한 후 각 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 (1 pg/ml)를 처리하고 14 일간 37°C 배양기에서 배양하였다 (양성 대조군: 100 ng/ml TNF α (SIGMA)) . 배양이 완료된 세포를 70% 에탄올을 이용하여 세포를 고정한 후 항 -phospho-HSL 항체 (Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 세포 면역 염색법을 통해 지방 분해 유도 인자인 phospho- HSL의 세포내 발현을 관찰하였다. 실험 결과， 각 펩타이드 (도 8a-c) 및 펩타이드 복합체 (도 8d)에 의해 지방 분해 유도 인자인 phospho-HSL 의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 2-4. 지방분해 산물인 글라이세롤의 양 측정
비만유도 생쥐 동물의 복부에서 지방 조직을 채취 후 24 웰 배양 풀레이트에 웰당 100 mg 씩 지방 조직을 넣은 후 배양 배지 (1 ml Krebs- Ringer buffer containing 25 mM HEPES , 5.5 mM glucose, and 2 % (w/v) bovine serum albumin)에 배양하였다. 배양시 펩타이드 복합체를 0.1 yg/ml, 1 ug/ml, 10 ug/ml 의 농도로 처리하였고， 양성대조군으로 TNF α 100 ng/ml 을 처리하여， 48 시간동안 배양한 후 지방이 분해되면서 나온 글라이세를의 양을 측정하였다.
실험 결과， 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 지방이 분해되면서 나은 글라이세를의 양이 펩타이드 복합체 처리농도 의존적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 양성 대조군인 TNFa 처리군에 비해 많은 양의 글라이세를양이 검출되는 것을 확인하였다 (도 9).
2-5. 비만 마우스 분리 지방조직에 대한 분해효과 확인 .
지방 조직은 색깔에 따라 백색지방 (White Fat), 갈색지방 (Brown Fat)으로 나뉘고， 부위에 따라 피하 지방， 복막 지방, 장간막 지방 (내장지방) 및 부고환 지방으로 나¾다. 해부 후 각 지방을 적출하여 백색지방을 분리 후 각 100 mg/웰의 무게로 24웰 플레이트에 복합제 농도별 처리 후 배양 배지 (1 ml Krebs-Ringer buffer containing 25 mM HEPESᅳ 5.5 mM glucose, and 2 % (w/v) bovine serum albumin)에서 72 시간 배양 후 조직을 절편하여 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고 200 배에서 현미경 (TS100, Nicon) 관찰을 하여 지방 세포의 크기를 비교하였다.
실험결과, 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 대조군에 비해 지방 세포의 크기를 비교한 결과, 지방세포의 크기가 작아지는 것을 확인하였다 (도 10a). 또한 염색 후 지방세포의 크기를 측정하기 위해 프로그램을 사용하여 지방 세포의 크기를 측정한 결과 펩타이드 복합체 처리군에서 뚜렷한 세포막 구획을 가지는 지방조직 내의 세포크기의 감소가 관찰되었다 (도 10b).
2-6. 지방조직에 대한 지방분해 인자 관찰
비만유도 생쥐 동물의 복부에서 지방 조직을 채취 후 24 웰 배양 플레이트에 웰당 100 mg 씩 지방 조직을 넣은 후 배양 배지 (1 ml Krebs- Ringer buffer containing 25 mM HEPES , 5.5 mM glucose, and 2 % (w/v) bovine serum albumin)에 배양하였다. 배양시 펩타이드 복합체를 처리하였고, 양성대조군으로 TNFa 100 ng/ml 을 처리하여， 48 시간동안 배양한 후 지방분해인자인 phosph으 HSL (녹색형광물질)의 발현을 확인하였다. 실험 결과, 지방조직에서의 지방 분해 인자인 phospho-HSL 의 발현을 확인한 결과， 펩타이드 복합체를 처리하였을 때 지방 분해 인자인 phospho- HSL의 발현이 증가되는 것을 확인할수 있었다 (도 11). 실시예 3: 실험동물을 통한지방 생성억제 및 지방분해 촉진 효과
고지방식이에 의한 체중 감소 및 지방 생성 억제
정상 C57BL/6 마우스에 고지방식이를 하여 유도한 비만유도모델 DI0(Diets induced obesity)를 이용하여 항비만 효능 실험을 수행하였고， 양성 대조군 약물로서 TNFa 5 g/ml 를 사용하였다. 대조군은 고지방식이가 아닌 일반식이로 진행하였고， 실험은 고지방식이를 12주 동안 진행하면서， 펩타이드 복합체를 처리하고 양성대조군을 처리하여 체중의 감소를 확인하였다.
TNFQ 및 항비만 효능 화합물은 12 주간 매주 오후 3 시 -4 시에 84 일간 강제로 복강주사하였고 체중과 식이량은 처음 약물 투여 직전에 측정하였으며， 이후에 일주일 간격으로 체중과 식이량을 측정하였다. 혈당은 약물투약 실험 종료 후 꼬리 정맥에서 채혈 후 아큐책 액티브 (Accu- Check Active Roche)를 이용하여 측정하였고 Cholesterol 또한 꼬리 정맥에서 채혈된 혈청을 Cholesterol calculation Kit(BioVision)을 이용하여 분석을 수행하였다. 지방 조직은 색깔에 따라 백색지방 (White Fat), 갈색지방 (Brown Fat)으로 나뉘고, 부위에 따라 피하지방， 복막 지방, 장간막 지방 (내장지방) 및 부고환 지방으로 나뉜다. 해부 후 각 지방을 적출하여 관찰 하였으며， 조직학적 검사를 위하여 지방을 10% 중성 완층 포르말린에 고정한 후 파라핀 블록에 심어서 5 로 섹션하여 헤마톡실린 (Hematoxyl in)과 에오신 (eos in) 염색을 하였다. 지질분해 인자인 HSL 의 인산화 정도를 Ant i-pHSL 항체를 이용한 형광 염색을 진행하였다. 조직 샘폴 제작 후 글리세린 젤 마운팅 미디어 (glycer ine Jel l mount ing Medi a)로 마운팅하였고 커버 글라스를 덮어 현미경 (Ni con, TS100)으로 관찰하였으며 현미경에 내장되어 있는 디지털 카메라로 조직을 촬영하였다.
일반식이를 12주 동안 한 생쥐의 체중은 실험 초기 20.9 g에서 12주 후 28.74 g 의 체중을 보였고, 고지방식이를 한 생쥐는 초기 20.99 g 의 체중이 12 주 후 49.5 g 까지 체중의 증가가 있는 것을 확인하였다. 그러나 고지방식이와 병행하면서 처리한 펩타이드 복합체 군에서는 초기 21. 1 g 에서 12 주 후 36.76 g 으로 고지방식이만 진행된 대조군 (235.8%)에 비해 높은 체중 감소 ( 174.2%)가 일어나는 것을 확인할 수 있었다 (표 2 및 도 12) .
【표 2】
비만생쥐모델에 펩타이드 복합체를 처리한후 몸무게 측정
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
또한 12주 동안 실험이 완료된 동물의 사진을 측정한 결과, 펩타이드 복합체 처리군이 고지방식이만을 한 군에 비해 생쥐의 몸이 정상 생쥐 (일반식 )와 유사한 몸의 크기로 유지되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 13) .
12 주 동안 실험을 진행한 생쥐에， 마이크로 -CT 촬영을 하여 몸 전체의 지방의 분포를 확인하였다. 몸 전체에 분포 되어 있는 지방 (노란색을 띄고 있음)을 확인한 결과， 일반식이를 진행한 대조군에 비해 고지방식이를 한 대조군의 생쥐에서 몸 전체에 분포된 지방의 양이 급격히 증가되어 있음을 확인할 수 있었으며， 펩타이드 복합체를 고지방식이와 함께 처리한 군에서는 몸전체에 분포되어 있는 지방의 양이 급격히 감소되어 있음을 확인 할수 있었다 (도 14) .
위의 마이크로 -CT 촬영이 끝낸 생쥐를 해부하여 몸 전체에 분포되어 있는 지방조직을 채취하여 지방조직의 양을 관찰하였다ᅳ 결과, 일반식이를 진행한 대조군에 비해 고지방식이를 한 대조군의 생쥐에서 지방의 양이 많은 것을 확인할 수 있었고， 고지방식이와 함께 펩타이드 복합체를 처리한 군에서 지방의양이 급격히 감소되어 있는 것을 확인하였다 (도 15) .
지방을 분리하여 H&E 염색을 통해 지방의 크기를 관찰한 결과， 고지방식이 대조군에 비해 고지방식이와 함께 펩타이드 복합체 처리군에서 지방의 크기가 작아지는 것을 확인할 수 있었다 (도 16a) . 지방의 크기를 프로그램을 통해 분석한 결과， 일반식의 대조군 지방의 크기를 10W로 계산하였을 때， 고지방식이의 대조군의 지방의 크기는 127%로 지방의 크기가 커져 있는 것을 확인하였으며， 고지방식이에 펩타이드 복합체를 같이 처리한 군의 지방의 크기는 97%로 감소한 것을 확인하였다 (도 16b) . 지방을 분리하여 지방 조직내에 발현되어 있는 지방 분해 인자인 Phospho-HSL 의 발현양을 확인한 결과， 고지방식이와 함께 펩타이드 복합체를 처리한 군에서 phospho-HSL 의 발현이 증가되어 있는 것을 확인하였다 (도 17) .
실험이 끝난 생쥐의 혈액속의 콜레스테롤의 양을 확인 한 결과， 일반식의 콜레스테를 양은 2.52 g/ml , 고지방식이의 대조군의 콜레스테롤의 양은 3.5 y g/ml， 고지방식이와 함께 펩타이두 복합체 처리한 군에서는 2.86 ii g/ml 의 콜레스테를의 양이 검출 되는 ；것을 확인할 수 있었다. 펩타이드 복합체 처리군에서 비만시 올라가는 콜레스테롤의 수치를 낮춰 주는 것을 확인 할수 있었다 (도 18) .
실험이 끝난 생쥐의 혈액속의 혈당의 수치를 확인한 결과, 일반식을 진행한 대조군의 생쥐의 혈당은 174 mg/dL , 고지방식이의 대조군의 혈당은 235 mg/dL로 혈당 수치가 올라가는 것을 확인할수 있었으며, 고지방식이와 함께 펩타이드 복합체를 처리한 군에서의 혈당의 수치는 183 mg/dL 로 일반식 대조군과 유사한 혈당의 수치가 감소되어 있는 것을 확인하였다 (도 19) . 실시예 4: 혈당조절
혈당조절 효과
본 동물실험에는 C57BL/6(정상 쥐 ) ( (주)샘타코)와 C57BLKS/JLepr (당뇨모델 마우스， db/db 마우스 ) ((주)중앙실험동물에서 구입) 수컷을 사용하였고, 항당뇨 및 /또는 항비만 효능 물질로는 복합제를 사용하였고 양성대조군 약물로는 시타클립틴 (si tagl ipt in)을 사용하였다ᅳ 본 실시예에서는 정상 마우스 모델과 유전적으로 당뇨의 가능성이 있는 모델에 대한 급성 항당뇨 효능 (단회 투여)을 대표적인 당뇨병 진단 검사 방법인 GTT(Glucose Tolerance Test ) 방법을 사용하여 항당뇨 및 /또는 항비만 효능 복합제에 대해 평가하였다. 마우스의 사육 환경 조건은 22- 24 °C , 상대습도 50-30%로 설정하였고， 사육상자당 4 마리씩 사육하였다. 오전 8 시 -오후 8 시까지 150-300 룩스 (Lux)의 조명을 주었고， 하루에 12 시간 점등, 12 시간 소등하였다. 사료는 일반식이 (18% 단백질， 2018 , Har lan Laborator ies Inc , USA 제조)를 사용하여 자유섭취시켰고， ITT 실험 진행 전 4시간 이상 절식시켰고， GTT실험 진행 12시간 전부터 절식시켰다. CTT 실험 1 시간 전에 복합제를 각각 경구투여용 일회용 주사기를 이용하여 강제 경구투여하였고， GTT 실험을 위하여 실험 0 시간째에 고지방식이를 40 분간 자유식이 하였다. 고지방 자유식이 40 분 후에 각각 혈액 내 글루코스 레벨 검사를 위하여 0분, 30분, 60 분， 90 분, 120분 및 180 분 간격으로 꼬리 정맥에서 채혈하였고 아큐책 액티브 (Accu-Chek act ive) (Roche)를 이용하여 혈당 수준을 측정하였다. 한편， 양성대조군 약물로는 현재 당뇨 치료제로 사용되고 있는 시타클립틴 (si tagl ipt in)으로 선정하였으몌 100 mg/kg 의 투여량으로 투여하였다. 항당뇨 및 /또는 항비만 효능 후보물질로 선정한 복합제를 100 mg/kg 의 투여량 별로 실험군을 나누었고， 각 실험군당 4수의 마우스를 사용하였다.
실험결과 고지방식이에 의해 증가된 혈당의 수치가 펩타이드 복합체 처리에 의해 혈당감소 효과를 관찰하였다. 당뇨병 유발 생쥐모델에서 당뇨병의 높은 혈당이 감소되는 것을 확인하였다 (도 20a-b) . 또한 콜레스테를의 양이 고지방식이의 대조군에 비해 고지방식이와 함께 펩타이드 복합체 처리군에서 콜레스테롤의 양이 낮아지는 것을 확인 하였다 (도 21) .
또한， DB/DB 당뇨병이 유도된 생쥐에 16 시간 공복을 준 후 30 분간 식이를 준 후, 펩타이드를 섭취하도록 하고 시간 별로 혈당의 수치를 측정하였다.
실험 결과， 서열목록 제 1서열, 제 3서열 및 제 5서열의 펩타이드를 처리한 군에서 고혈당의 수치가 시간 의존적으로 낮아지는 것을 관찰하였다 (도 22a-c) . 실시예 5 : 인슐린과 인슐린 유사성장인자의 발현 촉진
인슐린 과 인슐린 유사 성장인자의 발현 촉진
3X105 세포 /웰의 세포 밀도로 6 웰 플레이트에 3T3-L1 (지방 전구세포)를 시딩하였다. 24시간 배양한 후 펩타이드를 농도별 ( 10 ng - 1 y g/ml )로 처리하고 14 일간 37°C 배양기에서 배양하였다. 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해물을 확보 후 단백질 정량하고 지질 분해 인자인 항- IGF-1 , 인슐린 항체 (Santa Cruz Biotechnol ogy, USA)를 이용하여 웨스턴블롯팅을 실시하여 관찰하였다.
실험 결과， 서열목록 제 7서열의 펩타이드에 의해 IGF-1과 인슐린의 발현이 농도 의존적으로 증가하는 것을 관찰하였다 (도 23) . 실시예 6: 임상실험을통한 혈당 감소 효과관찰
복합제 복용에 의한 혈당 감소 공복혈당 170 mg/dL 아상 45-65 세 대상으로 간이 임상 실험 진행 공복 혈당 기준으로 식후 30분 복합제제를 섭취하여 30， 60 , 90 , 120 , 150, 180 분 간격으로 채혈하였고 아큐책 액티브 (Accu-Chek act ive) (Roche)를 이용하여 혈당 수준올 측정하였다.
실험결과 복합제제에 의한 혈당 감소가 각각의 실험자에서 모두 관찰되었다 (도 25a-d) . 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
서열목록 제 1 서열 내지 서열목록 제 7 서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
【청구항 2】
서열목록 제 1 서열 내지 서열목록 제 7 서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종의 아미노산 서열로 이루어진 항비만 또는 항당뇨 활성을 갖는 펩타이드.
【청구항 3】
제 2 항에 있어서, 상기 펩타이드는 지질 생성을 억제시키는 것을 톡징으로 하는 펩타이드.
【청구항 4】
제 2 항에 있어서， 상기 펩타이드는 PPARy (Peroxisome prol i f erator-act ivated receptor gamma) , ACC(Acetyl~CoA carboxylase) 또는 aP2( adiposeᅳ speci f ic fatty acid-binding protein 2)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 ¾타이드ᅳ
[청구항 5】
제 2 항에 있어서， 상기 펩타이드는 지방 분해를 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
【청구항 6】
제 2 항에 있어서, 상기 펩타이드는 pHSL(phospho— hormone-sensitive lipase), AMP - a l(AMP-act ivated protein kinase α 1) , CGI- 58(Comparative Gene Identificationᅳ 58) 또는 ATGLCAdipose triglyceride lipase)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
【청구항 7】
제 2 항에 있어서， 상기 펩타이드는 혈당을 감소시키는 것을 징으로 하는 펩타이드.
[청구항 8】
다음의 템타이드 조합으로 구성된 항비만 또는 항당뇨 활성을 갖는 펩타이드 복합체:
( a) 서열목톡 제 1서열로 이루어진 펩타이드;
(b) 서열목록 제 2서열 또는 서열목록 제 3서열로 이루어진 펩타이드; 및
( c) 서열목록 제 6서열 또는 서열목록 제 7서열로 이루어진 펩타이드.
【청구항 9】
제 8 항에 있어서, 상기 펩타이드 복합체는 지방세포의 크기를 감소시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드 복합체.
【청구항 10】
제 8 항에 있어서, 상기 펩타이드 복합체는 혈중 콜레스테를을 감소시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드 복합체 .
【청구항 11】
제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 12】
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 13]
제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 당뇨의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 14】
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 당뇨의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 15]
제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 펩타이드의 약제학적 유효량을 대상 (subj ect )에 투여하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨의 예방 또는 치료 방법 .
【청구항 16】
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 펩타이드 복합체의 약제학적 유효량을 대상 (subj ect )에 투여하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨의 예방 또는 치료 방법 .
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