KR20140134083A

KR20140134083A - 비만세포―특이적 아팝토시스-유도용 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140134083A
Application number: KR1020130053779A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미; 이응지; 이태훈; 이영민
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2013-05-13
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2014-11-21
Also published as: BR112015028499A2; US9637519B2; JP2016520587A; US20160075739A1; CN105308064A; EP2998313A4; JP6117993B2; WO2014185604A1; EP2998313B1; ES2704859T3; EP2998313A1; KR101510742B1; CN105308064B

Abstract

본 발명은 천연의 세마포린 3A의 기능과 동일하거나 또는 유사한 기능을 할 수 있을 뿐 아니라 작은 크기에 따라 피부 투과도가 매우 우수한 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 비만세포-특이적 아팝토시스(apoptosis)를 유도할 뿐 아니라, 비만세포 활성을 억제(예컨대, 히스타민의 분비양 감소 및 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) 활성 억제)한다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 FcεRI 시그널링, 보다 구체적으로는 FcεRI 수용체의 복합체 형성을 억제시키고, 이는 ERK1/2, p38 또는 Lyn의 인산화 저해로 나타난다. 따라서, 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은, 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

Description

비만세포―특이적 아팝토시스-유도용 펩타이드 및 이의 용도{Peptides for Inducing Mast Cell-Spepcific Apoptosis and Uses Thereof}

본 발명은 비만세포-특이적 아팝토시스-유도용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

일반적으로 알러지라고 알려진 과민반응은 항원에 대한 비정상적 면역 반응을 일컫는다. Gell & Coombs 분류법에 의해 크게 4가지로 나뉘는데 IgE에 의해 매개된 과민반응이 I형, 항체에 의해 매개된 과민반응이 II형, 면역 복합체에 의해 매개된 과민반응이 III형, 그리고 항원제시세포와 T 세포간의 상호작용에 의해 매개된 과민반응이 IV형이다. 주위에서 흔히 볼 수 있는 알러지 질환들은 대개 I형 과민반응에 의해 발생하는 질환들로 알러지성 비염, 천식, 알러지성 피부염 등이 이에 속한다. 많이 알려진 알러젠(allergen; 항원)으로는 견과류, 난류와 같은 식품 및 꽃가루, 집먼지 진드기, 또한 일부 의약품 등이 있다. 이러한 알러젠 유입 시 IgE와 결합 후 비만 세포의 IgE 수용체인 FceRI의 α-서브유니트에 붙게 되고 β- 및 γ-서브유니트와 복합체를 형성하여 수용체의 신호 전달이 이루어진다. 이 과정을 통해 비만세포의 탈과립이 유도되어 가려움증이나 염증 반응을 유발하는 매개 인자인 히스타민(histamine), 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase), 프로스타글란딘(prostaglandin), 류코트리엔(leukotriene), IL(interleukin)-4, IL-5, IL-6, TNF-α 등의 분비가 활성화된다. 이러한 인자들의 작용은 B 세포의 IgE 생산을 활성화시켜 알러지 반응을 악화 시키는 요인이 되기도 한다. 실제로, 알러지 환자의 경우 혈중 IgE 수치가 높게 관찰되는 특징이 있어 알러젠의 유입에 쉽게 과민반응을 일으키는 것으로 알려져 있다(Allergy Asthma Immunol Res., 5(3): 170-174(2013)).

I형 과민반응이 관찰되는 영역에 따라 질환이 분류되는데, 비강의 점막에서 발생할 경우 알러지성 비염으로 나타나며 기도 점막이나 기관지에서 발생할 경우 천식으로 나타나고 피부에서 발생한 과민반응은 아토피성 피부염으로 관찰된다.

2010년 보고된 국민 건강 영양 조사 결과(국민건강영양조사, 보건복지부)에 따르면, 국내 1세 이상 아토피성 피부염의 유병률은 6.1%이고, 2011년 청소년 건강 행태 온라인 조사(청소년 건강행태 온라인조사, 보건복지부)에서는 13-18세 청소년의 아토피성 피부염 유병률이 23.1%로 집계되었다. 일반적인 알러젠, IgE 자극에 의해 병변이 나타나기 시작하고 비만세포의 탈과립에 의해 분비된 히스타민의 자극으로 나타나는 가려움증에 의해 환자가 환부를 긁게 되면서 피부 상재균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(S. epidermidis) 등의 유입이 2차로 이루어지게 된다. 이러한 외부 항원들의 유입으로 환부에 추가적인 염증반응이 나타나 병세를 악화시키기도 하는 것으로 알려져 있다(Allergy Asthma Proc., May-Jun;33(2012))

아토피성 피부염의 치료제로는 면역 억제 효과를 통해 소염작용을 나타내는 스테로이드제와 비만세포로부터 히스타민의 유리를 막는 항히스타민제, 그리고 항생제 등이 있다. 하지만, 스테로이드 제제의 경우 장기간 사용 시 바른 부위에 털이 나거나 피부가 얇아지고 세균 감염이 생기는 부작용이 나타나기도 하며 사용 중지 시 급속히 증상이 악화된다는 단점이 있다. 항히스타민제의 경우에도 장기간 사용 시 불면, 불안, 식욕 감퇴 등의 부작용이 보고된 바 있으며 항생제 장기 사용 시에도 항생제 내성과 같은 부작용이 발생하기도 한다. 따라서, 보다 효과적이면서도 부작용을 최소화 할 수 있는 치료제 개발이 요구되고 있는 추세이다.

체내 단백질의 경우 생체 친화성이 높아 부작용을 최소화 할 수 있는 장점이 있다. 하지만 단백질 자체를 치료제에 사용하기에는 낮은 안정성과 높은 생산 단가가 단점으로 작용하기도 한다. 이러한 체내 단백질 내의 특정 유효 부위만을 이용하는 펩타이드 제제의 경우 그 효능은 동일하면서 안정성과 생산 단가에 대한 문제점을 개선할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 본 연구자들은 비만세포의 활성화를 억제할 수 있는 체 내 단백질 유래 펩타이드의 항알러지 효과를 활용한 연구를 수행하였다.

세마포린 3A(Semaphorin 3A)는 세마 도메인(sema domain)이라고 불리는 공통된 시스테인-풍부 도메인(cysteine-rich domain)을 가지는 세마포린 계열의 단백질이다. 세마포린 단백질은 신경계 발달 과정에서 반발성 축삭 돌기 유도 인자로 처음 알려졌다. 클래스 3에 속하는 세마포린은 분비 단백질(secreted protein)로 Sema3A부터 Sema3F까지의 6가지 종류가 존재하며 플렉신 A(Plexin A) 수용체 및 뉴로필린(Neurophilin) 수용체와 수용체 복합체를 형성하여 신호를 전달한다. 초기에 알려진 바와 같이, 세마포린 3A는 NGF(nerve growth factor)-민감성 뉴론(neuron)의 수축을 유도하거나, 활성화된 T 세포 및 수지상세포로부터 발현되어 T 세포 성장이나 사이토카인의 분비를 조절하는 역할을 한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 세마포린 3A(Semaphorin 3A)와 동일한 기능 또는 유사한 기능 유지하면서도 천연의 세마포린 3A 단백질보다 활성 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 생리 활성(예컨대, 비만세포-특이적 아팝토시스 유도, 비만세포 활성 억제, FcεRI 단백질의 시그널 억제 효과, 등)이 우수한 세마포린 3A-유래된 펩타이드를 선별함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열목록 제1서열로 이루어진 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 Th2-매개 면역 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 비만세포-유발 염증 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 비만세포-유발 염증 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 세마포린 3A와 동일한 기능 또는 유사한 기능 유지하면서도 천연의 세마포린 3A 단백질보다 활성 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 생리 활성(예컨대, 비만세포-특이적 아팝토시스 유도, 비만세포 활성 억제, FcεRI 단백질의 시그널 억제 효과, 등)이 우수한 세마포린 3A-유래된 펩타이드를 선별하였다.

세마포린(semaphorins)은 500개의 아미노산 잔기로 구성된 세마포린 도메인을 함유하는 세포외 도메인을 특징으로 하는 분비 및 막-결합 단백질을 포함하는 거대한 단백질 패밀리이다. 이들 중, 세마포린 3A는 클래스 3 세마포린 패밀리에 속하는 분비 단백질로, 신경의 축색돌기 안내 역할 뿐만 아니라 뉴로필린(neuropilins) 및 플렉신(plexins, PLXNs) 수용체를 통해 세포-기피 지시(cell-repelling cues)를 매개함으로써 세포 이동, 형태발생(morphogenesis) 및 조직 재형성(remodeling)을 포함하는 발생 과정을 조절하는 등 다양한 세포 내 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 구조적으로, 세마포린 내에 존재하는 세마 도메인(Sema domain)은 단백질 상호작용 모듈로서 축색 유도(axon guidance) 과정 동안 기능하는 데 중요하며, 간세포 성장 인자 수용체, 성 단백질 및 바이러스 단백질에도 존재한다. 상기 세마 도메인은 보존성 높은 일련의 시스테인 잔기들로 특징화되고, 이들 간(4개)의 다이설파이드 결합을 통해 구조적으로 단백질을 안정화시킨다.

한편, 세마포린 3A 유전자의 넉-아웃(knockout)은 비정상적인 뼈 및 연골 발달을 유도하며, 세마포린 3A-관련 시그널링 분자들(signaling molecules)[세마포린 3A, 뉴로필린-1 및 플렉신 PLXNA1 및 PLXNA2]의 발현이 내연골성 골화에서 보고되었는데, 이는 골격 발달 및 신경분포에서 이들의 잠재적인 역할을 의미한다.

본 발명자들은 인간 세마포린 3A의 기능과 관련 있는 부위를 기초하여 상술한 특성을 나타내는 다수의 세마포린 3A-유래된 펩타이드를 합성하였다. 좀더 자세히 살펴보면, 세마포린 3A 단백질의 여러 부위를 임의적으로 부분 합성하여 수용체 단백질에 대한 결합가능 부위를 1차 탐색한 뒤, 이 예측된 부위의 아미노산 서열을 최적화하여 본 발명의 펩타이드를 선별적으로 제조하였으며 이들 후보 펩타이드들 중에서 가장 활성이 우수한 펩타이드를 스크리닝 함으로써, 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드를 제조하였다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드는 인간 세마포린 3A(GenBank Accession Number, NP_006071; 서열목록 제2서열)에서 유래하였으며, 이는 표 1에 예시되어 있다.

본 발명의 펩타이드는 천연 인간 세마포린 3A의 기능(예컨대, 항알러지 활성)을 가질 뿐 아니라, 비만세포-특이적 아팝토시스 유도 및 비만세포 활성 억제를 효과적으로 나타냈다(참고: 도 2a-2c 및 도 3a-3b). 또한, 본 발명의 펩타이드는 FcεRI 수용체의 복합체 형성을 억제시켰다(참고: 도 4a 내지 도 4c).

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 비만 세포(mast cells)-특이적 아팝토시스(apoptosis)를 유도한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 비만세포에 의해 분비되는 히스타민의 양을 감소시키고, 세포 내 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) 활성을 억제한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 FcεRI 시그널링을 억제한다. 상기 FcεRI 시그널링의 억제는 FcεRI 수용체의 복합체 형성 억제를 통해 이루어지며, FcεRI 수용체의 복합체 형성 억제는 ERK1/2, p38 또는 Lyn의 인산화 저해를 통해 확인할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당 업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 천연의 세마포린 3A 단백질보다 안정성이 우수하지만 아미노산의 변형에 의해 안정성이 더욱 향상될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 천연의 세마포린 3A 단백질에 비해 매우 뛰어난 열안정성을 가진다. 천연 세마포린 3A 단백질은 제조의 어려움 및 높은 생산 비용 뿐만 아니라, 온도 및 장기 보관 시에 낮은 안정성을 가진다. 하지만, 본 발명의 펩타이드는 매우 저렴하게 대량 합성이 가능하고 고온 등에서 물리화학적인 안정하기 때문에, 생리활성의 저하를 최대한으로 방지할 수 있으며 체내 외에서의 잔존 기간을 증가시킴으로 좀 더 향상된 치료 효과를 갖는다(참고: 도 5). 따라서, 본 발명의 펩타이드는 의약품, 의약외품 및 화장품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH₂), 아자이드(-NHNH₂) 등으로 변형될 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 "안정성"은 '인 비보' 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 Th2-매개된 면역 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 세마포린 3A-유래된 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 Th2-매개된 면역 질환은 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 기관지 천식(bronchial asthma), 아토피성 피부염(atopy dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 알레르기성 결막염(allergic conjuntivitis), 두드러기(urticaria), 혈관부종(vascular edema), 식품 알레르기, 물리적 알레르기, 과민성 폐장염, 직업성 알레르기 질환 및 약물 알레르기를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 자가면역질환은 Lyn 키나제-매개된 경로의 활성화를 통해 유발되고, 상기 Lyn 키나제-매개된 경로의 활성화는 Lyn 키나제의 인산화 증가를 통해 촉발된다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 자가면역질환은 비만, 고지혈증, 당뇨병, 죽상동맥경화증 및 대사 증후군을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만세포-유발 염증 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 비만 세포-특이적 아팝토시스(apoptosis)를 유발한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 비만세포-유발 염증 질환은 천식, 아토피성 피부염, 건선, 간질성 방광염(interstitial cystitis), 비만, 다발성 경화증, 관상동맥질환(coronary artery disease, CAD), 관절염 및 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 조성물들은 (a) 상술한 세마포린 3A 단백질의 활성을 나타내는 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 세마포린 3A 관련 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 0.0005-1,000 mg/kg이다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 세마포린 3A 관련 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "화장품학적 유효량"은 상술한 본 발명의 조성물의 화장품학적 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드류와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 비만세포-유발 염증 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 세마포린 3A(semaphorin 3A)-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 세포 내 세마포린 3A 단백질의 발현 또는 활성을 분석하는 단계로, 상기 시험물질이 상기 세마포린 3A 단백질을 과다발현시키거나 또는 상기 세마포린 3A 단백질의 활성을 증가시켜 FcεRI 수용체의 복합체 형성을 억제시키면 비만세포-유발 염증 질환 치료제로 판단된다.

본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 세마포린 3A-유래된 펩타이드를 포함하는 세마포린 3A 단백질을 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 세마포린 3A-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시킨다. 본 발명의 타겟의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포는 특별하게 제한되지 않지만, 세마포린 3A 단백질의 과다발현은 비만 세포의 아팝토시스를 유도할 수 있으므로 제외시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 세마포린 3A 유전자 또는 단백질의 활성에 영향을 미치는 지 여부를 또는 세마포린 3A 단백질에 의한 FcεRI 수용체의 복합체 형성 억제 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화학물질, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시험물질은 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 세포 또는 조직 배양물)이다. 시험물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시험물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, '1-비드 1-화합물' 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

이어, 시험물질이 처리된 세포에서 본 발명의 타겟(예컨대, 세마포린 3A)의 발현량 및 활성을 측정한다. 발현량 및 활성의 측정은 하기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과, 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 또는 활성이 증가되는 경우 또는 다발현된 세마포린 3A에 의한 FcεRI 수용체의 복합체 형성을 억제하는 경우에는 상기 시험물질은 비만세포-유발 염증 질환의 개선 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 상술한 단계 (b)에서 세마포린 3A의 활성 분석은 과다발현된 세마포린 3A에 의한 FcεRI 수용체의 복합체 형성을 측정하여 실시하며, 보다 구체적으로는 상기 FcεRI 수용체의 복합체 억제는 ERK1/2, p38 또는 Lyn의 인산화 저해를 통해 확인할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법은 다양한 방식으로 실시할 수 있으며, 특히 당업계에 공지된 다양한 결합 분석(binding assay)에 따라 고속(high throughput) 방식으로 실시할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 시험물질 또는 세마포린 3A 유전자 또는 단백질은 검출가능한 표지(detectable label)로 레이블링될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지(detectable label)는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵), 형광 표지[예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM], 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 또는 은)이다.

검출가능한 표지가 레이블링된 세마포린 3A 유전자, 단백질 또는 시험물질을 이용하는 경우, 세마포린 3A 유전자 또는 단백질과 시험물질 사이의 결합 발생 여부는 표지로부터 나오는 시그널을 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌와 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명의 펩타이드는 천연의 세마포린 3A의 기능과 동일하거나 또는 유사한 기능을 할 수 있을 뿐 아니라 작은 크기에 따라 피부 투과도가 매우 우수하다.

(ii) 본 발명의 펩타이드는 비만세포-특이적 아팝토시스(apoptosis)를 유도할 뿐 아니라, 비만세포 활성을 억제(예컨대, 히스타민의 분비양 감소 및 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) 활성 억제)한다.

(iii) 또한, 본 발명의 펩타이드는 FcεRI 시그널링, 보다 구체적으로는 FcεRI 수용체의 복합체 형성을 억제시키고, 이는 ERK1/2, p38 또는 Lyn의 인산화 저해로 나타난다.

(iv) 따라서, 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은, 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드를 처리한 비만세포의 사멸 촉진 효과를 나타낸 유세포 분석(Flow cytometry) 결과이다.
도 2b는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드를 처리한 비만세포의 사멸 촉진 효과를 나타낸 Bcl2 웨스턴 블롯팅 결과이다.
도 2c는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드를 처리하였을 때 나타나는 비만세포의 사멸 촉진 효과가 세포 특이적인 반응이라는 것을 보여주는 각질세포 및 섬유아세포에 대한 세포 독성 실험 결과이다.
도 3a는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드를 처리하였을 때 비만세포로부터의 감소된 히스타민 분비를 보여주는 ELISA 결과이다.
도 3b는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 비만세포로부터의 감소된 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) 분비를 보여주는 활성 실험 결과이다.
도 4a는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드를 처리하였을 때 비만 세포의 IgE 수용체 시그널 저해를 보여주는 ERK, p38 MAPK의 인산화 수준 확인 실험 결과로, 밀도계측기(densitometry)를 통해 밴드 강도를 수치화한 그래프 결과가 제시된다.
도 4b는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드를 처리하였을 때 비만 세포의 IgE 수용체 시그널 저해를 보여주는 수용체 연관 단백질 Lyn의 인산화 수준 확인 실험 결과이다.
도 4c는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드를 처리하였을 때 나타나는 비만 세포의 IgE 수용체 시그널 저해가 수용체 복합체 형성 억제에 의한 것임을 보여주는 면역 침강법 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드의 열안정성 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: Trp-Val-Pro-Tyr-Gln-Ala-Arg-Val-Pro-Tyr-Pro-Arg(서열목록 제1서열)의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분 동안 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분 동안 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄(DCM) 용액을 넣고 Fmoc-Arg(pbf)-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM에 녹여 10분 동안 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 DMF를 10 ml 넣어 3분동안 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분 동안 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분 동안 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Arg(pbf)-CTL 레진을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Pro-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA(N,N-Diisopropylethylamine)를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소 5분 동안 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Pro-Arg(pbf)-CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Pro, Fmoc-Val, Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Pro, Fmoc-Val 및 Fmoc-Trp(Boc) 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt(Hydroxybenzotriazole)를 넣어 1시간 동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, 오산화인(Phosphorus pentoxide, P₂O₅) 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[TFA(Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 NH₂-Trp-Val-Pro-Tyr-Gln-Ala-Arg-Val-Pro-Tyr-Pro-Arg-OH 펩타이드 1을 0.85 g 합성하였다(수율: 89.9%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1531.8(이론값 : 1531.795)를 얻을 수 있었다.

번호	아미노산 서열	분석값(질량분석기)
		분석치	이론치
서열 1	WVPYQARVPYPR	1531.8	1531.795

시험예 1: 합성 펩타이드를 활용한 활성화된 비만 세포 사멸 효과의 확인

합성예 1에 따라 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드의 항알러지 효과를 확인하기 위해, 활성화된 비만 세포(mast cell)에 대한 펩타이드의 세포 사멸 효과를 실험하였다.

우선, RBL-2H3 래트 비만세포주(한국세포주은행, 한국)를 조직 배양용 플라스크(SPL, Korea)를 이용하여 10% 우태아혈청(FBS; fetal bovine serum, Sigma)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modied Eagle's medium; Gibco, USA)에서 배양하였다. 배양된 세포주들을 1% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 DMEM 배양액에 다시 현탁한 후, 6-웰 조직 배양용 플레이트(SPL, Korea)에 각 웰 당 1 X 10⁵ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 활성 조건 실험의 경우 IgE 및 HSA를 처리하고 표준을 잡기위한 공 시료와 본 발명의 펩타이드를 10% 증류수에 멸균상태로 녹인 뒤 1 μg/ml 및 10 μg/ml의 농도로 72시간 동안 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 배양된 세포주들을 1% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 아넥신V-PI 염색 키트(Annexin V-PI staining kit; BD pharmigen)을 이용하여 세포를 염색시킨 후, 유세포 측정기인 FACS를 이용하여 FL1 및 FL2 강도를 측정하였다. 세포 사멸 중인 아넥신 V-양성 세포의 수를 카운팅하였다(참고: 도 2a). 세포 사멸 효과를 추가 확인하기 위해 위의 실험과 동일한 조건으로 처리한 세포를 얻어 프로아팝토틱 단백질(pro-apoptotic protein)인 Bcl2의 발현량을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다(참고: 도 2b).

한편, 세포 사멸 효과가 비만세포-특이적 반응인지 확인하기 위해, 인간 각질 세포주인 HaCaT 세포와 마우스 섬유아세포주인 NIH3T3 세포를 이용하여 세포 독성 실험을 실시하였다. 96-웰 조직 배양용 플레이트에 각 웰 당 5 X 10³ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 표준을 잡기위한 공 시료와 합성 펩타이드를 10% 증류수에 멸균상태로 녹인 뒤 1 μg/ml 및 10 μg/ml의 농도로 72시간 동안 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 1/10 부피(volume)로 MTT 시약(5 mg/ml; SIGMA, USA)을 처리하고 4시간 동안 추가적으로 배양시켜 생성된 포르마잔(formazan)을 DMSO로 녹여 540 nm에서 분광광도계(spectrophotometer; Molecular devices, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다(참고: 도 2c).

도 2a는 펩타이드 처리 후의 사멸 진행 중인 비만세포의 수를 측정한 FACS 결과를 나타낸다. 도 2a에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드는 비활성화 상태나 활성화 상태의 비만세포 모두(10 μg/ml 처리군)에서 아넥신 V-양성 세포의 수를 증가시켜 세포 사멸을 효과적으로 유도하는 것을 확인할 수 있었다.

도 2b는 펩타이드 처리 후의 세포 내 프로아팝토틱 단백질인 Bcl2의 발현량을 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다. 도 2b에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드는 비활성화 상태나 활성화 상태의 비만세포 모두에서 세포 사멸을 유도시켜 Bcl2의 발현량을 저해시키는 것을 확인할 수 있었다.

도 2c는 펩타이드 처리 후의 인간 각질세포주인 HaCaT 세포 및 마우스 섬유아세포주인 NIH3T3 세포에 대한 세포 독성 실험 결과를 보여준다. 도 2c에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드는 비만 세포 이외의 다른 피부 세포들에 대해서는 세포 독성을 나타내지 않았다.

상술한 시험예 1의 결과를 종합해 보면, 본 발명의 펩타이드는 비만 세포-특이적 세포 사멸을 유도하는 활성을 가지며, 상기 활성은 비활성화 상태와 IgE(SIGMA, USA) 및 HSA(알러젠; SIGMA, USA) 처리에 의한 활성화 상태 모두에서 확인되지만 활성화된 상태의 비만 세포에서 보다 현저하다는 것을 알 수 있다.

시험예 2: 합성 펩타이드의 비만 세포 활성 억제 효능 확인

16 시간 동안 IgE 처리(1 μg/ml)에 의해 민감화된 RBL-2H3 세포 배양에서 종래의 배양 배지를 제거하고 타이로드 완충액(tyrode buffer)로 교환 후 합성예 1에서 합성한 펩타이드(1 및 10 μg/ml), 그리고 양성 대조군인 퀘르세틴(quercetin, 40 μM; SIGMA, USA)을 처리하고 20분 동안 배양하였다. 이후, 알러젠으로 사용한 HSA를 1 μg/ml 농도로 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 그 결과, 비만 세포에서 분비되는 히스타민의 양을 측정하기 위해, 세포 배양액을 회수하고 히스타민 ELISA 키트(IBL international)로 확인하였다(참고: 도 3a). 또한, 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase)의 활성을 측정하기 위해, 기질인 p-NAG(N-acetyl-glucosamine; SIGMA, USA)와 반응시킨 후 발색의 정도를 405 nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정하였다(참고: 도 3b).

도 3a는 펩타이드 처리 후 비만 세포에서 분비되는 히스타민의 양을 측정한 결과이다. 도 3a에서 볼 수 있듯이, IgE와 HSA 자극에 의해 증가된 히스타민의 분비 양을 감소시키는 양성 대조군인 퀘르세틴의 활성을 확인할 수 있으며, 본 발명의 펩타이드 처리군의 경우도 농도-의존적으로 히스타민의 분비 양을 감소시키는 활성을 가졌다. 상술한 억제 활성(또는 경향)은 베타-헥소사미니다제 활성 테스트에서도 동일하게 확인할 수 있었다(참고: 도 3b).

상술한 시험예 2의 결과를 종합해 보면, 본 발명의 펩타이드는 비만 세포 활성화에 따라 분비되는 히스타민 및 베타-헥소사미니다제에 대한 저해 효과를 가졌으며, 이는 이후의 염증 반응 및 가려움증에 대한 억제 효과로 이어질 수 있다는 것을 의미한다.

시험예 3: 합성 펩타이드의 IgE 수용체인 FcεRI 시그널링 억제 효과 확인

합성예 1에 따라 제조된 펩타이드의 비만 세포 활성 억제 기작을 확인하기 위해, 비만 세포 자극원인 IgE가 결합하는 수용체인 FcεRI 단백질의 시그널 억제 효과를 조사하였다. 60-mm 크기의 배양용 플레이트(SPL, Korea)에 1.5 X 10⁶ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 이후, 세포에 IgE(1 g/ml)을 24시간 동안 처리하여 민감화시키고, 표준을 잡기위한 공 시료와 합성 펩타이드를 10% 증류수에 멸균상태로 녹인 뒤 10 μg/ml의 농도로 20분 동안 처리하고 알러젠인 HSA를 1 μg/ml의 농도로 5분 또는 30분 동안 처리하여 세포를 자극하였다. 모든 처리가 끝난 세포를 트립신 처리로 수득한 후, FcεRI 시그널링에 관여하는 분자들인 ERK1/2, p38 및 Lyn의 인산화 정도를 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다(참고: 도 4a 및 도 4b).

또한, 본 발명의 펩타이드에 의한 FcεRI 시그널링 억제 효과가 IgE 수용체인 FceRI의 서브체인 결합 억제를 통해 일어나는 지를 확인하기 위해, 동일한 실험 조건에서 HSA 자극을 10분 동안 처리한 후 얻어진 세포에서 IgE 항체를 이용한 면역침강법(immunoprecipitation)을 실시하였다. 면역 침강법을 이용하여 일차적으로 분리한 후, FcεRI 감마 서브체인(gamma subchain) 항체로 웨스턴 블랏팅을 실시하여 IgE에 결합된 감마 서브체인의 단백질 양을 확인하였다(참고: 도 4c).

도 4a는 펩타이드 처리 후 비만 세포 표면에 발현되는 IgE 수용체 FcεRI의 시그널 단백질의 인산화 수준을 관찰한 결과이다. 도 4a에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드는 FcεRI 시그널 단백질인 ERK1/2 및 p38의 인산화 수준을 저해하는 효능을 나타냈다. 또한, 다른 시그널 단백질인 Lyn의 인산화 수준도 펩타이드 처리군에서 농도-의존적으로 현저하게 저해되어 있음을 확인하였다(참고: 도 4b).

도 4c는 펩타이드 처리 후 IgE 수용체(FcεRI)의 서브체인들 간의 결합을 관찰한 결과이다. IgE 수용체는 알파, 베타, 감마 서브체인으로 구성된 복합체로 구성되어 있는데, 이 중 IgE의 결합이 알파 서브체인에서 이루어지면 베타, 감마 서브체인이 모여드는 형태로 복합체가 형성되는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명의 펩타이드에 의한 FcεRI 수용체의 복합체 형성 억제 활성을 확인하기 위해, IgE 항체를 사용한 면역침강법을 실시한 후 감마 서브체인에 대한 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 그 결과, 본 발명의 펩타이드는 FcεRI 수용체의 복합체 형성을 현저하게 억제하는 활성을 가진다는 것을 확인하였다.

상술한 시험예 3의 결과를 종합해 보면, 본 발명의 펩타이드는 비만 세포 표면에 존재하여 세포 활성에 관여하는 FcεRI 수용체의 복합체 형성을 억제함으로써, FcεRI 시그널링을 차단하는 효능을 나타낸다.

시험예 4 : 제조된 펩타이드의 열 안정성

합성예 1를 통해 제조된 펩타이드와 NIBSC(UK)에서 구입한 표준폼 성장인자(Semaphorin 3A)를 0.1 mg/ml의 농도의 인산완충용액으로 제조하였다. 준비된 용액을 1 ml씩 유리 바이알에 넣은 후 37℃에서 정치하였다. 37℃에 정치된 용액을 0, 5, 10, 20, 30, 50, 그리고 70일째에 샘플링하여 날자별로 원심 분리하여 변성된 펩타이드나 단백질을 제거하고 상층액을 취해 HPLC를 이용해 정량을 하였다(참고: 도 5).

실시예 1: 나노화 펩타이드의 제조

상기 합성예에서 얻은 펩타이드 50 mg을 정확히 칭량한 뒤 증류수 500 ml로 충분히 교반하여 용해하였다. 배합체 용액을 레시틴 5 g, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 0.3 ml, 에탄올 50 ml 그리고 약간의 유상과 함께 혼합한 후, 총량이 1 L가 되도록 증류수로 양을 맞추고 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100 nm 정도의 나노좀을 제조하였다. 제조된 나노좀은 최종 농도가 약 50 ppm으로 단독 혹은 복합적으로 화장품 제조용으로 사용되었다.

제형예 1: 유연화장수

상기 합성예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 유연화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.001
1,3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
PEG 1500	1.0
소듐히알루로네이트	1.0
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	8.0
방부제, 색소	적량
벤조페논-9	0.05
향	미량
정제수	잔량
합계	100

제형예 2: 보습크림

상기 합성예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 보습크림 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.001
메도우폼오일	3.0
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트	1.5
유동 파라핀	10.0
밀납	2.0
폴리솔베이트60	0.6
솔비탄 세스퀴올레이트	2.5
스쿠알란	3.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
글리세린	5.0
트리에탄올아민	0.5
토코페릴아세테이트	0.5
방부제, 색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 3: 보습화장수

상기 합성예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.002
1,3-부틸렌글리콜	4.0
글리세린	4.0
세테아릴알콜	0.8
글리세릴스테아레이트	1.0
트리에탄올아민	0.13
토코페릴아세테이트	0.3
유동파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다미아너트오일	2.0
폴리솔베이트60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
카르복시비닐폴리머	1.0
방부제,색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 4: 에센스

상기 합성예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 에센스를 일반적인 에센스 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.005
글리세린	10.0
1,3-부틸렌글리콜	5.0
PEG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐히알루로네이트	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데세스-16	0.4
에탄올	6.0
향, 방부제, 색소	적량
정제수	잔량
합계	100

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Caregen Co. Ltd. <120> Peptides for inducing mast cell-specific apoptosis and Uses Thereof <130> PN130281 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sema3A peptide 1 <400> 1 Trp Val Pro Tyr Gln Ala Arg Val Pro Tyr Pro Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 771 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Trp Leu Thr Arg Ile Val Cys Leu Phe Trp Gly Val Leu Leu 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ala Asn Tyr Gln Asn Gly Lys Asn Asn Val Pro Arg Leu 20 25 30 Lys Leu Ser Tyr Lys Glu Met Leu Glu Ser Asn Asn Val Ile Thr Phe 35 40 45 Asn Gly Leu Ala Asn Ser Ser Ser Tyr His Thr Phe Leu Leu Asp Glu 50 55 60 Glu Arg Ser Arg Leu Tyr Val Gly Ala Lys Asp His Ile Phe Ser Phe 65 70 75 80 Asp Leu Val Asn Ile Lys Asp Phe Gln Lys Ile Val Trp Pro Val Ser 85 90 95 Tyr Thr Arg Arg Asp Glu Cys Lys Trp Ala Gly Lys Asp Ile Leu Lys 100 105 110 Glu Cys Ala Asn Phe Ile Lys Val Leu Lys Ala Tyr Asn Gln Thr His 115 120 125 Leu Tyr Ala Cys Gly Thr Gly Ala Phe His Pro Ile Cys Thr Tyr Ile 130 135 140 Glu Ile Gly His His Pro Glu Asp Asn Ile Phe Lys Leu Glu Asn Ser 145 150 155 160 His Phe Glu Asn Gly Arg Gly Lys Ser Pro Tyr Asp Pro Lys Leu Leu 165 170 175 Thr Ala Ser Leu Leu Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Ser Gly Thr Ala Ala 180 185 190 Asp Phe Met Gly Arg Asp Phe Ala Ile Phe Arg Thr Leu Gly His His 195 200 205 His Pro Ile Arg Thr Glu Gln His Asp Ser Arg Trp Leu Asn Asp Pro 210 215 220 Lys Phe Ile Ser Ala His Leu Ile Ser Glu Ser Asp Asn Pro Glu Asp 225 230 235 240 Asp Lys Val Tyr Phe Phe Phe Arg Glu Asn Ala Ile Asp Gly Glu His 245 250 255 Ser Gly Lys Ala Thr His Ala Arg Ile Gly Gln Ile Cys Lys Asn Asp 260 265 270 Phe Gly Gly His Arg Ser Leu Val Asn Lys Trp Thr Thr Phe Leu Lys 275 280 285 Ala Arg Leu Ile Cys Ser Val Pro Gly Pro Asn Gly Ile Asp Thr His 290 295 300 Phe Asp Glu Leu Gln Asp Val Phe Leu Met Asn Phe Lys Asp Pro Lys 305 310 315 320 Asn Pro Val Val Tyr Gly Val Phe Thr Thr Ser Ser Asn Ile Phe Lys 325 330 335 Gly Ser Ala Val Cys Met Tyr Ser Met Ser Asp Val Arg Arg Val Phe 340 345 350 Leu Gly Pro Tyr Ala His Arg Asp Gly Pro Asn Tyr Gln Trp Val Pro 355 360 365 Tyr Gln Gly Arg Val Pro Tyr Pro Arg Pro Gly Thr Cys Pro Ser Lys 370 375 380 Thr Phe Gly Gly Phe Asp Ser Thr Lys Asp Leu Pro Asp Asp Val Ile 385 390 395 400 Thr Phe Ala Arg Ser His Pro Ala Met Tyr Asn Pro Val Phe Pro Met 405 410 415 Asn Asn Arg Pro Ile Val Ile Lys Thr Asp Val Asn Tyr Gln Phe Thr 420 425 430 Gln Ile Val Val Asp Arg Val Asp Ala Glu Asp Gly Gln Tyr Asp Val 435 440 445 Met Phe Ile Gly Thr Asp Val Gly Thr Val Leu Lys Val Val Ser Ile 450 455 460 Pro Lys Glu Thr Trp Tyr Asp Leu Glu Glu Val Leu Leu Glu Glu Met 465 470 475 480 Thr Val Phe Arg Glu Pro Thr Ala Ile Ser Ala Met Glu Leu Ser Thr 485 490 495 Lys Gln Gln Gln Leu Tyr Ile Gly Ser Thr Ala Gly Val Ala Gln Leu 500 505 510 Pro Leu His Arg Cys Asp Ile Tyr Gly Lys Ala Cys Ala Glu Cys Cys 515 520 525 Leu Ala Arg Asp Pro Tyr Cys Ala Trp Asp Gly Ser Ala Cys Ser Arg 530 535 540 Tyr Phe Pro Thr Ala Lys Arg Arg Thr Arg Arg Gln Asp Ile Arg Asn 545 550 555 560 Gly Asp Pro Leu Thr His Cys Ser Asp Leu His His Asp Asn His His 565 570 575 Gly His Ser Pro Glu Glu Arg Ile Ile Tyr Gly Val Glu Asn Ser Ser 580 585 590 Thr Phe Leu Glu Cys Ser Pro Lys Ser Gln Arg Ala Leu Val Tyr Trp 595 600 605 Gln Phe Gln Arg Arg Asn Glu Glu Arg Lys Glu Glu Ile Arg Val Asp 610 615 620 Asp His Ile Ile Arg Thr Asp Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ser Leu Gln 625 630 635 640 Gln Lys Asp Ser Gly Asn Tyr Leu Cys His Ala Val Glu His Gly Phe 645 650 655 Ile Gln Thr Leu Leu Lys Val Thr Leu Glu Val Ile Asp Thr Glu His 660 665 670 Leu Glu Glu Leu Leu His Lys Asp Asp Asp Gly Asp Gly Ser Lys Thr 675 680 685 Lys Glu Met Ser Asn Ser Met Thr Pro Ser Gln Lys Val Trp Tyr Arg 690 695 700 Asp Phe Met Gln Leu Ile Asn His Pro Asn Leu Asn Thr Met Asp Glu 705 710 715 720 Phe Cys Glu Gln Val Trp Lys Arg Asp Arg Lys Gln Arg Arg Gln Arg 725 730 735 Pro Gly His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu Gln Glu 740 745 750 Asn Lys Lys Gly Arg Asn Arg Arg Thr His Glu Phe Glu Arg Ala Pro 755 760 765 Arg Ser Val 770

Claims

서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 인간 Sema3A(Semaphorin 3A) 단백질로부터 유래된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 비만 세포(mast cells)-특이적 아팝토시스(apoptosis)를 유도하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 비만세포에 의해 분비되는 히스타민의 양을 감소시키는 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 세포 내 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 FcεRI 시그널링의 억제를 유발하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 6 항에 있어서, 상기 FcεRI 시그널링의 억제는 FcεRI 수용체의 복합체 형성 억제를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 6 항에 있어서, 상기 FcεRI 시그널링의 억제는 ERK1/2, p38 또는 Lyn의 인산화를 저해하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드의 N- 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 Th2-매개된 면역 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 Th2-매개된 면역 질환은 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 기관지 천식(bronchial asthma), 아토피성 피부염(atopy dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 알레르기성 결막염(allergic conjuntivitis), 두드러기(urticaria), 혈관부종(vascular edema), 식품 알레르기, 물리적 알레르기, 과민성 폐장염, 직업성 알레르기 질환 또는 약물 알레르기인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 자가면역질환은 Lyn 키나제-매개된 경로의 활성화를 통해 유발되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 Lyn 키나제-매개된 경로의 활성화는 Lyn 키나제의 인산화 증가를 통해 촉발되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 자가면역질환은 비만, 고지혈증, 당뇨병, 죽상동맥경화증 또는 대사 증후군인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만세포-유발 염증 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 비만 세포-특이적 아팝토시스(apoptosis)를 유발하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 비만세포-유발 염증 질환은 천식, 아토피성 피부염, 건선, 간질성 방광염(interstitial cystitis), 비만, 다발성 경화증, 관상동맥질환(coronary artery disease, CAD), 관절염 또는 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
다음의 단계를 포함하는 비만세포-유발 염증 질환 치료제의 스크리닝 방법:
(a) 세마포린 3A(semaphorin 3A)-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 세포 내 세마포린 3A 단백질의 발현 또는 활성을 분석하는 단계로,
상기 시험물질이 상기 세마포린 3A 단백질을 과다발현시키거나 또는 상기 세마포린 3A 단백질의 활성을 증가시켜 FcεRI 수용체의 복합체 형성을 억제시키면 비만세포-유발 염증 질환 치료제로 판단된다.
제 19 항에 있어서, 상기 시험물질은 비만 세포(mast cells)-특이적 아팝토시스를 유발하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 비만세포-유발 염증 질환은 천식, 아토피성 피부염, 건선, 간질성 방광염(interstitial cystitis), 비만, 다발성 경화증, 관상동맥질환(coronary artery disease, CAD), 관절염 또는 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.