BR112015027699B1 - Uso de robenidina ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma, composição farmacêutica antibacteriana e dispositivo médico - Google Patents

Abstract

uso de robenidina ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma, composição farmacêutica antibacteriana e dispositivo médico a invenção compreende métodos para o tratamento e prevenção de uma infecção bacteriana num sujeito, métodos para a preparação de um medicamento para utilização no tratamento e prevenção de uma infecção bacteriana num sujeito, e composições farmacêuticas e veterinárias antibacterianas quando utilizados neste documento.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] Esta invenção refere-se aos métodos de tratamento e prevenção de uma infecção bacteriana num sujeito, métodos para a preparação de um medicamento para utilização no tratamento e prevenção de uma infecção bacteriana num sujeito, e composições farmacêuticas e veterinárias antibacterianas quando utilizado neste documento.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[0002] Um aumento significativo na prevalência de resistência a múltiplas drogas em patógenos Gram-positivos (G+ve) (Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. e Streptococcus pneumoniae) e Gram-negativos (G-ve) (Escherichia coli/, Enterobacter spp., Salmonella spp., Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa) causadores de doença, coincidiu com um declínio global sem precendentes dos investimentos em novos medicamentos anti-infecciosos. Há poucas alternativas atualmente registradas para infecções bacterianas multidroga resistentes (MDR), forçando os médicos a considerar medicamentos de geração anterior, tais como colistina com espectro estreito e um potencial considerável para efeitos colaterais tóxicos. Além disso, existem menos novas classes de agentes terapêuticos anti-infecciosos que se deslocam através do canal de desenvolvimento de drogas.

[0003] Desde o ano de 2000, um período de quase 15 anos, apenas 5 novos modos de ação (MOA) para agentes antibacterianos foram aprovados pelo FDA dos EUA - linezolida (uma oxazolidinona), em 2000, daptomicina (um lipopéptido) em 2003, retapamulina (uma pleuromutilina) em 2007, fidaxomicina (uma tiacumicina de macrólido) em 2011, e bedaquilina (uma diarilquinolina) em 2012. Notavelmente, nenhum destes agentes tem atividade significativa contra bactérias gram-negativas. Não há novas MOA agentes antibacterianos foram aprovados em 2013 e até à data em 2014 tedizolid única e dalbavancin, ambos os análogos de classes existentes, têm sido recomendadas para aprovação em os EUA. Embora existam mais de 300 medicamentos anti-infecciosos em vários estágios de desenvolvimento, a grande maioria destes medicamentos são previamente aprovados compostos antibacterianos ou seus derivados que estão submetidos a estudos para novas indicações.

[0004] Além disso, a prevalência de multidroga resistência em patógenos de animais específicos, juntamente com uma maior regulamentação do registro e uso de antimicrobianos em animais, fez com que os veterinários se tornassem cada vez mais dependentes das classes tradicionais de agentes antimicrobianos. O risco de transferência de organismos zoonóticos MDR a partir de animais para seres humanos também levou a pedidos de novas restrições sobre o uso de algumas drogas antibacterianas recentemente registradas, como as fluoroquinolonas e a terceira e quarta geração de cefalosporinas.Epidemiologia do desenvolvimento de resistência antibacteriana em agentes patogênicos de seres humanos e animais

[0005] Grande parte da evolução no desenvolvimento de resistência é impulsionada por mudanças na epidemiologia de organismos-chave MDR. Uma vez que se restringe apenas a hospitais de seres humanos e instalações de cuidados a idosos, as cepas resistentes à meticilina Staphylococcus aureus (MRSA) estão agora sendo isoladas da comunidade em proporções alarmantes. Além disso, cepas de MRSA adquiridas na comunidade são mais propensas a portar a toxina de leucocidina Panton-Valentine (PVL), um fator de virulência ligado a lesões dos tecidos cutâneos, bem como uma pneumonia necrotizante, fulminante, rápida, com mortalidade associada significativa. Recentemente as cepas de MRSA tornaram-se adaptados aos hospedeiros em várias espécies de animais principais incluindo pecuária, cavalos e animais de estimação e casos regulares de transferência de humano para animal e de animal para humano, estão sendo documentados. Isto tem consequências importantes para a transmissão de cepa e de saúde pública. Uma pesquisa recente de 751 veterinários australianos para o transporte nasal MRSA descobriu que um notável 21,4% dos veterinários eqüinos foram MRSA-positivos em comparação com 4,9% dos veterinários de pequenos animais e 0,9% de veterinários com pouco contato animal. Essas mudanças ecológicas de MRSA em conjunto com o surgimento de resistência aos novos medicamentos desenvolvidos especificamente para MRSA, como linezolida confirma que a novos anti-infecciosos MRSA são urgentemente necessários. Além disso, os hospitais que utilizam a vancomicina para o tratamento de MRSA em seguida, têm de lidar com surtos de infecções de enterococos resistentes à vancomicina (VRE) em seus pacientes, mais uma vez com escolhas entre antimicrobianos alternativos limitados.

[0006] A emergência global e propagação dentro da comunidade de bactérias Gram-negativas (G-ve) MDR altamente virulentas como E. coli O25b: ST131 confirma que agentes patogênicos bacterianos podem evoluir simultaneamente determinantes de virulência e de resistência. Ecoando a epidemiologia MRSA recente, E. coli O25b: ST131, uma causa importante de infecções do trato urinário e na corrente sanguínea em seres humanos, ela foi isolada das infecções extra-intestinais em animais de estimação, e aves domésticas. A importância cada vez maior de E. coli O25b: ST131 e outros MDR de Enterobacteriaceae com resistência combinada às fluoroquinolonas e espectro estendido de beta-lactâmicos e carbapenens é outra tendência preocupante, especialmente considerando houve poucos avanços recentes no desenvolvimento dos anti-infecciosos do espectro G-ve além de avanços incrementais na família carbapenem.

[0007] A Organização Mundial de Saúde identificou a resistência aos antibióticos como uma das três principais ameaças futuras para a saúde global. Um relatório recente do Centro Norte-Americano para Controle e Prevenção de Doenças (CDC) estimou que "nos Estados Unidos, mais de dois milhões de pessoas adoecem todos os anos com infecções resistentes aos antibióticos, com pelo menos 23 mil mortes como resultado." Os custos médicos extras, só nos EUA, associados ao tratamento e gestão de um único caso de infecção resistente a antibióticos são estimados entre US $ 18.588 e US $ 29.069 por ano, resultando em um custo direto global para o sistema de saúde norte-americano de mais de US $ 20 bilhões anualmente. Além disso, o custo para as famílias norte- americanas em termos de perda de produtividade é estimado em mais de US $ 35 bilhões por ano. Vinte e cinco mil pacientes na União Europeia (UE) ainda morrem anualmente da infecção com a bactéria MDR apesar de muitos países da União Europeia possuírem as melhores práticas de estratégias de vigilância hospitalar e controle de infecção do mundo. Os custos da UE a partir de despesas de saúde e perda de produtividade associada às infecções MDR são estimados em pelo menos € 1,5 bilhão por ano.

[0008] Há uma necessidade clínica não satisfeita de agentes antibacterianos com novos mecanismos de ação para complementar e substituir agentes antibacterianos disponíveis atualmente, cuja eficácia é cada vez mais posta em causa por mecanismos de resistência anti-bacterianos. Continua a existir uma necessidade de antibacterianos alternativos no tratamento de infecção por bactérias multirresistentes. No entanto, conforme relatado pelo Infectious Diseases Society of America e o European Centre for Disease Control and Prevention, alguns novos medicamentos estão sendo desenvolvidos que oferecem resultados promissores em relação aos tratamentos existentes (Infectious Diseases Society of America 2010, Clinical Infectious Diseases, 50 (8): 1.081-1083).

[0009] É um objetivo da presente invenção de ultrapassar pelo menos uma das deficiências do estado da técnica.

[0010] A discussão da técnica de fundamento estabelecida acima destina- se apenas à facilitar a compreensão da presente invenção. A discussão não é um reconhecimento ou admissão que qualquer material referido é ou era parte do conhecimento geral comum como na data de prioridade do pedido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] De acordo com um aspecto da invenção, é proporcionado um método para tratamento ou prevenção de uma colonização ou infecção bacteriana num indivíduo, o método caracterizado pelo fato de compreender a etapa de: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de robenidina ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma no indivíduo. Neste aspecto, a colonização bacteriana ou infecção é causada por um agente bacteriano.

[0012] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionada a utilização de robenidina, ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma, caracterizado por ser na fabricação de medicamento para o tratamento de uma infecção ou colonização bacteriana num indivíduo. Neste aspecto, a colonização bacteriana ou infecção é causada por um agente bacteriano.

[0013] O indivíduo pode ser qualquer indivíduo capaz de colonização ou infecção por bactérias. O indivíduo pode ser um mamífero, ou pode ser písceo ou aviário. De preferência, o indivíduo é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, seres humanos, caninos, felinos, bovinos, ovinos, caprinos, outras espécies de ruminantes, porcina, equina, avícola, ou písceo.

[0014] Conforme aqui utilizado, o termo robenidina, (também conhecido como 1,2-bis[(E)-(4-clorofenil)metilideneamino]guanidina, ou, conforme descrito por este relatório descritivo, NCL812) refere-se a um composto possuindo a seguinte estrutura química:

[0015] A robenidina pode ser administrada ao indivíduo numa dose selecionada a partir do grupo que compreende de 0,1 mg/kg a 250 mg/kg de peso corporal, de preferência 1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal, e mais preferivelmente 5 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal. A robenidina pode ser administrada ao indivíduo utilizando um esquema de dosagem selecionado a partir do grupo que consiste em: a cada hora, 3 vezes por dia; duas vezes por dia; diária; a cada dois dias; duas vezes por semana; uma vez por semana; uma vez quinzenalmente; uma vez por mês; uma vez a cada dois meses ou por taxa constante ou infusão de taxa variável. De preferência, a robenidina é administrada até a colonização ou os sinais e sintomas de infecção serem pelo menos parcialmente tratados ou atenuados.

[0016] Numa modalidade, a concentração de robenidina (ou um metabolito de robenidina) no sangue do indivíduo após o tratamento está dentro de uma gama selecionada de entre o grupo que compreende, mas não se limitando a: entre 0,1 e 10 ug/ml em 2 horas, 1 e 200 ug/mL após 12 horas; entre 0,1 e 5 ug/ml após 24 horas; entre 0,01 e 2 ug/ml após 48 horas; entre 0,0001 e 1 ug/ml após 72 horas. De preferência, a concentração é selecionada a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a: menos do que 200 ug/ml após 12 horas; menos do que 5 ug/ml após 24 horas; menos do que 1 ug/L após 48 horas e menos de 0,5 ug/mL após 72 horas.

[0017] O agente causador da infecção bacteriana é um agente bacteriano. Numa modalidade preferida, o agente não é uma espécie de protozoário. Numa modalidade preferida, o agente não é um protozoário de coccídios. Mais preferencialmente, o agente não é Clostridium perfringens nem uma espécie de bactérias heterotróficas presentes em amostras de solo coletadas por Hansen et al de Jyndevad, Dinamarca como discutido nos seguintes documentos: Hansen et al. 2012, Chemosphere, 86:212-215; e Hansen et al. 2009, Environmental Pollution 157:474-480.

[0018] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-negativo. Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo. Numa outra modalidade, o agente bacteriano não tem parede celular. Numa outra modalidade, a infecção bacteriana é causada por uma mistura de pelo menos dois agentes selecionados a partir do grupo que consiste em: bactérias gram negativas, gram positivas e agentes bacterianos sem parede celular.

[0019] O agente bacteriano causando a infecção bacteriana pode ser um agente bacteriano gram-positivo selecionado a partir do grupo que inclui, mas não se limitando a, Staphylococcus spp., Streptococci, Enterococcus spp., Leuconostoc spp, Corynebacterium spp, Arcanobacteria spp, Trueperella spp, Rhodococcus spp, Bacillus spp, Cocci Anaeróbios, Bacilos de não esporulação Gram-positivos anaeróbios, Actinomyces spp, Clostridium spp, Nocardia spp, Erysipelothrix spp, Listeria spp, Kytococcus spp, Mycoplasma sppUreaplasma spp, e Mycobacterium spp.

[0020] Numa modalidade, o agente bacteriano é gram positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a Staphylococcus spp. Exemplos de Staphylococcus spp incluem Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus hominis, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus pettenkoferi, Staphylococcus pulvereri, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus simulans, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus arlettae, Staphylococcus caseolyticus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus condimenti, Staphylococcus delphini, Staphylococcus equorum, Staphylococcus felis, Staphylococcus fleurettii, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lutrae, Staphylococcus muscae, Staphylococcus nepalensis, Staphylococcus piscifermentans, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simiae, Staphylococcus succinus, e Staphylococcus vitulinus.

[0021] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Streptococcus spp. Exemplos de Streptococcus spp incluem Streptococcus agalactiae, Streptococcus alactolyticus, Streptococcus anginosus, Streptococcus canis, Streptococcus constellatus, Streptococcus cricetus, Streptococcus cristatus, Streptococcus downei, Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae, Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis, Streptococcus equi subsp. equi, Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, Streptococcus ferus, Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus (anteriormente Streptococcus bovis biotipo i), Streptococcus gallolyticus subsp. pasteurianus (anteriormente Streptococcus bovis biotipo ii/2), Streptococcus gordonii, Streptococcus hyointestinalis, Streptococcus hyovaginalis, Streptococcus infantarius, Streptococcus infantarius subsp infantarius, Streptococcus infantis, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus lutetiensis (anteriormente Streptococcus bovis biotipo ii.1), Streptococcus macaccae, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus orisratti, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus peroris, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus porcinus, Streptococcus pseudintermedius, Streptococcus pyogenes, Streptococcus ratti, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus vestibularis, e Streptococci Nutricionalmente Variante (Deficiente) (Abiotrophia defectiva, Granulicatella adiacens, Granulicatella elegans, e Granulicatella para-adiacens) eespécies relacionadas tais como Rothia mucilaginosa (anteriormente Stomatococcus mucilaginosus) e Pediococcus.

[0022] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Enterococcusspp. Exemplos de Enterococcus spp incluem Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus durans,Enterococcus avium, Enterococcus raffinosus, Enterococcus pallens,Enterococcus gilvus, Enterococcus cecorum, Enterococcus malodoratus, Enterococcus italicus, Enterococcus sanguinicola, Enterococcus mundtii, Enterococcus casseliflavus/flavescens, Enterococcus dispar, Enterococcus hirae, Enterococcus pseudoavium, e Enterococcus bovis.

[0023] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Leuconostocspp. Exemplos de Leuconostoc spp incluem Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostocparamesenteroides, Leuconostoc citreum, e Leuconostoc lactis.

[0024] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Corynebacteriumspp. Exemplos de Corynebacterium spp incluemCorynebacterium não lipofílico, fermentativo spp tais como Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium striatum, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium argentoratense, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium confusum, Corynebacterium cystidis, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium simulans, Corynebacterium sundvallense, Corynebacterium thomssensii, Corynebacterium freneyi, e Corynebacterium aurimucosum, não lipofílico, não fermentativo Corynebacterium spp tais como Corynebacterium afermentans afermentans, Corynebacterium auris, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, e Corynebacterium propinquum e Corynebacterium lipofílicospp tais como Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium afermentans lipophilum, Corynebacterium accolens, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium tuberculostearum, Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium bovis, CDC coryneform grupos F-1 e G, e Corynebacterium lipophiloflavum, e outros Corynebacterium spp tais como Turicella, Arthrobacter, Brevibacterium, Dermabacter, Rothia, Oerskovia, Microbacterium, e Leifsonia aquatica.

[0025] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Arcanobacteriaspp. Exemplos de Arcanobacteria spp incluem A. haemolyticum, A. pyogenes (agora conhecido como Trueperella pyogenes, originalmente conhecido como Actinomyces pyogenes), e A. bernardiae.

[0026] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Rhodococcusspp. Exemplos de Rhodococcus spp incluem Rhodococcus equi, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus fasciens, e Rhodococcus rhodochrous.

[0027] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Gordoniaspp.

[0028] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Tsukamurellaspp.

[0029] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Acholeplasma spp.

[0030] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Actinobacteria tal como Crossiella equi.

[0031] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Bacillus spp. Exemplos de Bacillus spp incluem Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Brevibacillus brevis, Brevibacillus laterosporus, e Paenibacillus alvei.

[0032] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Anaerobic Cocci. Exemplos de Anaerobic Cocci incluem Anaerococcus murdochii, Anaerococcus prevotii, Anaerococcus tetradius, Anaerococcus octavius, Anaerococcus hydrogenalis, Anaerococcus lactolyticus, Anaerococcus vaginalis, Atopobium parvulum, Finegoldia magna, Gallicola barnesae, Gemella asaccharolytica, Gemella bergeri, Gemella cuniculi, Gemella haemolysans, Gemella morbillorum, Gemella palaticanis, Gemella sanguinis; Parvimonas micra, Peptococcus niger, Peptoniphilus asaccharolyticus, Peptoniphilus gorbachii, Peptoniphilus indolicus, Peptoniphilus harei, Peptoniphilus ivorii, Peptoniphilus lacrimalis, Peptoniphilus olsenii, Peptostreptococcus stomatis, Peptostreptococcus anaerobius, Ruminococcus productus, Slackia heliotrinireducens, e Staphylococcus saccharolyticus.

[0033] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Bacilli Não Esporulação Gram-Positivo Anaeróbico . Exemplos de Bacilli Não Esporulação Gram-Positivo Anaeróbico incluem Alloscardovia omnicolens, espécies de Atopobium (tais como Atopobium minutum, Atopobium rimae, Atopobium parvulum, e Atopobium vaginae), Bifidobacteria (tais como Bifidobacteria adolescentis, Bifidobacteria dentium, Bifidobacteria scardovii), Catabacter hongkongensis, Collinsella aerofaciens, Eggerthella (tais como Eggerthella lenta, Eggerthella hongkongensis e Eggerthella sinensis), Eubacterium e espécies relacionadas (tais como Eubacterium nodatum, Eubacterium tenue, Eubacterium brachy, Eubacterium infirmum, Eubacterium minutum, Eubacterium nodatum, Eubacterium saphenum, Eubacterium sulci, Filifactor alocis, Mogibacterium timidum, Mogibacterium vescum, Pseudoramibacter alactolyticus, Bulleidia extructa, e Solobacterium moorei), espécies de Lactobacillus (tais como Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus iners e Lactobacillus ultunensis), espécies de Mobiluncus (tais como Mobiluncus curtisii, Mobiluncus mulieris), Moryella indoligenes, espécies orais de Olsenella (tais como Olsenella uli e Olsenella profuse), Oribacterium sinus, Propionibacterium (tais como Propionibacterium acnes e Propionibacterium propionicum), Slackia exigua, e Turicibacter sanguine.

[0034] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Actinomyces spp. Exemplos de Actinomyces spp incluem Actinomyces israelii, Actinomyces naeslundii, Actinomyces viscosus, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces meyeri, e Actinomyces gerencseriae (anteriormente Actinomyces israelii sorotipo II), Actinomyces europaeus, Actinomyces neuii, Actinomyces radingae, Actinomyces graevenitzii, Actinomyces hordeovulneris, Actinomyces turicensis, Actinomyces georgiae, Arcanobacterium (Actinomyces) pyogenes, Arcanobacterium (Actinomyces) bernardiae, Actinomyces funkei, Actinomyces lingnae, Actinomyces houstonensis, e Actinomyces cardiffensis.

[0035] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Clostridium spp. Exemplos de Clostridium spp incluem Clostridium baratii, Clostridium bifermentans, Clostridium botulinum, Clostridium botulinum (tipos A, B, C, D, E, F, G), Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium histolyticum, Clostridium novyi (tipo A), Clostridium novyi (tipo B), Clostridium perfringens, Clostridium perfringens (tipos A-E), Clostridium ramosum, Clostridium septicum, Clostridium sordelli, Clostridium sphenoides, Clostridium tertium, e Clostridium tetani.

[0036] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Nocardiaspp. Exemplos de Nocardia spp incluem Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis, Nocardia farcinica, Nocardia nova, Nocardia otitidiscaviarum, e Nocardia transvalensis.

[0037] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Erysipelothrix spp, tal como Erysipelothrix rhusiopathiae.

[0038] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Listeria spp, tal como Listeria monocytogenes.

[0039] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Kytococcus spp, tal como Kytococcus schroeteri.

[0040] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Mycobacterium spp. Exemplos de Mycobacterium spp incluem Mycobacterium abscessus, Mycobacterium arupense, Mycobacterium asiaticum, Mycobacterium aubagnense, Mycobacterium avium complex, Mycobacterium bolletii, Mycobacterium bolletii, Mycobacterium branderi, Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium celatum, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium chimaera, Mycobacterium colombiense, Mycobacterium conceptionense, Mycobacterium conspicuum, Mycobacterium elephantis, Mycobacterium farcinogenes, Mycobacterium florentinum, Mycobacterium fortuitum group, Mycobacterium genavense, Mycobacterium goodii, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium heckeshornense, Mycobacterium heidelbergense, Mycobacterium houstonense, Mycobacterium immunogenum, Mycobacterium interjectum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium senegalense, Mycobacterium africanum, Mycobacterium avium subsp paratuberculosis, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium lacus, Mycobacterium lentiflavum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium mageritense, Mycobacterium malmoense, Mycobacterium marinum,Mycobacterium massiliense, Mycobacterium microti, Mycobacteriummontefiorense (enguias), Mycobacterium moracense, Mycobacterium mucogenicum, Mycobacterium nebraskense, Mycobacterium neoaurum,Mycobacterium novocastrense, Mycobacterium palustre, Mycobacteriumparmense, Mycobacterium phlei, Mycobacterium phocaicum, Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium porcinum, Mycobacterium pseudoshottsii (peixes), Mycobacterium pseudotuberculosis, Mycobacterium saskatchewanense, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium senuense, Mycobacterium septicum, Mycobacterium simiae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium terrae/chromogenicum complex, Mycobacterium triplex, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tusciae, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium wolinskyi, e Mycobacterium xenopi.

[0041] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Trueperellaspp. Exemplos de Trueperella spp incluem Trueperella abortisuis, Trueperella bernardiae, Trueperella bialowiezensis, Trueperella bonasi, Trueperella pyogenes (Arcanobacterium pyogenes).

[0042] Numa outra modalidades, o agente bacteriano é gram-positivo, gram-negativo ou não tem uma parede celular e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, agentes patogênicos de pecuária. Exemplos de patógenos de pecuária incluem Actinobaculum suis, Actinomyces bovis, Arcanobacterium pyogenes, Bacillus anthracis, cereus, licheniformis, pumilus, melaninogenicus, subtilis, Clostridium botulinum, chauvoei, haemolyticum, novyi, perfringens, septicum, sordellii, tetani, colinum, Corynebacterium pseudotuberculosis, renale, Dermatophilus congolensis, Enterococcus spp (tais como E. faecalis, E. faecium, E. durans, E. avium, E. hirae), Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeria ivanovii, grayi, innocua, seeligeri, welshimeri, monocytogenes, Mycobacterium avium, bovis, paratuberculosis (Doença de Johne), Mycoplasma (tais como capricolum subsp. capripneumoniae, subsp. capricolum, M. mycoides subsp mycoides, M. agalactiae, M. ovipneumoniae, M. conjunctivae, M. arginini, M. bovis, e M. putrefaciens) Mycoplasma bovis, dispar, mycoides subsp. mycoides (tais como Contagious bovine pleuropneumonia CBPP) Mycoplasma gallisepticum (MG), iowae meleagridis (MM), synoviae (MS) Mycoplasma haemosuis (anteriormente Eperythrozoon suis), alkalescens, bovigenitalum, bovirhinis, bovoculi, californicum, canadense, cynos, equigenitalium, gateae, haemocanis, haemofelis, hyopneumoniae, hyorhinis, hyosynoviae, iowae, leachii, meleagridis, mycoides subsp capri, wenyonii, suis, Rhodococcus equi, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus felis, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus warneri, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus cohnii subsp. cohnii, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, Staphylococcus capitis subsp. capitis, Staphylococcus capitis subsp. urealyticus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus delphini, Staphylococcus schleiferi subsp. coagulans, Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, Streptococcus uberis, Streptococcus canis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus bovis, Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus, Streptococcus equinus, Streptococcus equi (Streptococcus equi subsp equi), Streptococcus equisimilis (Streptococcus dysgalactiae subsp equisimilis), porcinus, suis, zooepidemicus, Streptococcus zooepidemicus (Streptococcus equi subsp zooepidemicus), Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis, Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum, Eubacterium, Peptococcus indolicus, e Peptostreptococcus anaerobius; e várias espécies dos seguintes gêneros gram negativos: Actinobacillus, Aeromonas, Anaplasma, Arcobacter, Avibacterium, Bacteroides, Bartonella, Bordetella, Borrelia, Brachyspira, Brucella, Campylobacter, Capnocytophaga, Chlamydia, Chlamydophila, Chryseobacterium, Coxiella, Cytophaga, Dichelobacter, Edwardsiella, Ehrlichia, Escherichia, Flavobacterium, Francisella, Fusobacterium, Gallibacterium, Haemophilus, Histophilus, Klebsiella, Lawsonia, Leptospira, Mannheimia, Megasphaera, Moraxella, Neorickettsia, Nicoletella, Ornithobacterium, Pasteurella, Photobacterium, Piscichlamydia, Piscirickettsia, Porphyromonas, Prevotella, Proteus, Pseudomonas, Rickettsia, Riemerella, Salmonella, Streptobacillus, Tenacibaculum, Vibrio, e Yersinia.

[0043] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, agentes patogênicos das espécies de animais de estimação tais como gatos, cães e cavalos. Exemplos de tais agentes patogênicos incluem patógenos equídeos como Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Corynebacterium pseudotuberculosis, Clostridium piliforme, Actinomyces bovis, Staphylococcus aureus, beta haemolytic Steptococcus spp, Dermatophilus congolense, Clostridiium tetani, e Clostridium botulinum. Exemplosadicionais incluem patógenos de cães e gatos como Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Clostridium spp, Actinomyces spp, Enterococcus spp, Nocardia spp, Mycoplasma spp, e Mycobacterium spp.

[0044] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-negativo e selecionado a partir do grupo consistindo nas seguintes espécies e famílias representativas: Acetobacteraceae: - Roseomonas cervicalis; Roseomonas fauriae; Roseomonas gilardii. -- Aeromonadaceae: - Aeromonas allosaccharophila; Aeromonas aquariorum; Aeromonas caviae; Aeromonas hydrophila (e subespécies); Aeromonas salmonicida; Aeromonas shubertii; Aeromonas veronii biovar sobria (Aeromonas sobria). -- Alcaligenaceae:- Achromobacter xylosoxidans; Alcaligenes faecalis; Bordetella ansorpii; Bordetella avium; Bordetella bronchiseptica; Bordetella hinzii; Bordetella holmesii; Bordetella parapertussis; Bordetella pertussis; Bordetella petrii; Bordetella trematum; Oligella ureolytica; Oligella urethralis. -- Anaplasmataceae:- Anaplasma phagocytophilum; Anaplasma platys; Anaplasma bovis; Anaplasma centrale; Anaplasma marginale; Anaplasma odocoilei; Anaplasma ovis; Ehrlichia canis; Ehrlichia chaffeensis; Ehrlichia ewingii; Ehrlichia muris; Ehrlichia ovina; Ehrlichia ruminantium; Neoehrlichia lotoris; Neoehrlichia mikurensis; Neorickettsia helminthoeca; Neorickettsia risticii; Neorickettsia sennetsu; Wolbachia pipientis. -- Armatimonadaceae:- Armatimonas rosea. -- Bacteroidaceae:- Bacteroides forsythus; Bacteroides fragilis; Bacteroides melaninogenicus; Bacteroides ruber; Bacteroides urealtyicus. -- Bartonellaceae:- Bartonella alsatica; Bartonella australis; Bartonella bacilliformis; Bartonella birtlesii; Bartonella bovis; Bartonella capreoli; Bartonella chomelii; Bartonella clarridgeiae; Bartonella doshiae; Bartonella elizabethae; Bartonella grahamii; Bartonella henselae; Bartonella koehlerae; Bartonella peromysci; Bartonella phoceensis; Bartonella quintana; Bartonella rattimassiliensis; Bartonella rochalimae; Bartonella schoenbuchensis; Bartonella talpae; Bartonella tamiae; Bartonella taylorii; Bartonella tribocorum; Bartonella vinsonii subsp berkhoffii; Bartonella vinsonii subsp. arupensis; Bartonella vinsonii subsp. vinsonii. -- Bdellovibrionaceae:- Bdellovibrio spp. -- Brachyspiraceae:- Brachyspira spp inclusive Brachyspira hampsonii, Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira murdochii, Brachyspira pilosicoli. -- Brucellaceae:- Brucella abortus; Brucella canis; Brucella ceti; Brucella melitensis; Brucella ovis; Brucella pinnipedialis; Brucella suis; Ochrobactrum anthropi; Ochrobactrum intermedium. -- Burkholderiaceae:- Burkholderia aboris; Burkholderia ambifaria (genomovar VII); Burkholderia anthina (genomovar VIII); Burkholderia cenocepacia (genomovar III); Burkholderia cepacia (genomovar I); Burkholderia diffusa; Burkholderia dolosa (genomovar VI); Burkholderia latens; Burkholderia mallei; Burkholderia metallica; Burkholderia multivorans (genomovar II); Burkholderia pseudomallei; Burkholderia pyrrocinia (genomovar IX); Burkholderia seminalis; Burkholderia stabilis (genomovar IV); Burkholderia ubonensis (genomovar X); Burkholderia vietnamiensis (genomovar V); Cupriavidus pauculus; Cupriavidus gilardii; Ralstonia pickettii; Ralstonia mannitolilytica; Sphaerotilus hippei; Sphaerotilus montanus; Sphaerotilus natans. -- Campylobacteraceae:- Arcobacter spp includng Arcobacter skirrowii; Campylobacter coli; Campylobacter concisus; Campylobacter curvus; Campylobacter fetus; Campylobacter gracilis; Campylobacter helveticus; Campylobacter hominis; Campylobacter hyointestinalis; Campylobacter insulaenigrae; Campylobacter jejuni; Campylobacter lanienae; Campylobacter lari; Campylobacter laridis; Campylobacter mucosalis; Campylobacter rectus; Campylobacter showae; Campylobacter sputorum; Campylobacter upsaliensis. -- Candidatus:- Piscichlamydia salmonis. -- Cardiobacteriaceae:- Cardiobacterium hominis; Cardiobacterium valvarum; Dichelobacter nodosus. -- Chlamydiaceae:- Chlamydia spp including Chlamydia avium, Chlamydia gallinacea, Chlamydia muridarum, Chlamydia suis, Chlamydia trachomatis; Chlamydophila spp including Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila caviae, e Chlamydophila felis. -- Chthonomonadaceae:- Chthonomonas calidirosea. -- Comamonadaceae:- Comamonas testosteroni; Verminephrobacter spp. -- Coxiellaceae:- Coxiella burnetii. -- Cytophagaceae:- Cytophaga columnaris; Cytophaga hutchinsonii; Flexibacter echinicida; Flexibacter elegans; Flexibacter flexilis; Flexibacter litoralis; Flexibacter polymorphus; Flexibacter roseolus; Flexibacter ruber. -- Desulfovibrionaceae:- Bilophila wadsworthia; Lawsonia intracellularis. -- Enterobacteriaceae:- Cedecea davisae; Cedecea lapagei; Cedecea neteri; amalonaticus; Citrobacter diversus; Citrobacter freundii; Citrobacter koseri; Cronobacter condimenti; Cronobacter dublinensis; Cronobacter helveticus; Cronobacter malonaticus; Cronobacter muytjensii; Cronobacter pulveris; Cronobacter sakazakii; Cronobacter turicensis; Cronobacter universalis; Cronobacter zurichensis; Edwardsiella ictaluri; Edwardsiella tarda; Enterobacter aerogenes; Enterobacter agglomerans; Enterobacter cloacae; Enterobacter cowanii; Escherichia albertii; Escherichia coli, inclusive AIEC = E. coli aderente invasiva, EaggEC = E. coli enteroagregativa; EHEC = E. coli enterohemorrágica; EIEC = E. coli enteroinvasiva; EPEC = E. coli enteropatogênica; ETEC = E. coli enterotoxigênica; ExPEC = E. coli patogênica extraintestinal, NMEC = E. coli de meningite neonatal, NTEC = E. coli necrotoxigênica, UPEC = E. coli uropatogênica.; Escherichia fergusonii; Ewingella americana; Hafnia alvei; Hafnia paralvei; Klebsiella granulomatis; Klebsiella oxytoca; Klebsiella pneumoniae; Kluyvera ascorbata; Kluyvera cryocrescens; Morganella morganii; Pantoea (anteriormente Enterobacter) agglomerans; Photorhabdus asymbiotica; Plesiomonas shigelloides; Proteus mirabilis; Proteus penneri; Proteus vulgaris; Providencia alcalifaciens; Providencia rettgeri; Providencia stuartii; Raoultella electrica; Raoultella ornithinolytica; Raoultella planticola; Raoultella terrigena; Salmonella bongori, Salmonella enterica sub- espécies enterica (muitos sorotipos); Serratia liquifaciens; Serratia marcesans; Shigella boydii; Shigella dysenteriae; Shigella flexneri; Shigella sonnei; Yersinia enterocolitica; Yersinia pestis; Yersinia pseudotuberculosis; Yersinia ruckeri. -- Fimbriimonadaceae:- Fimbriimonas ginsengisoli. -- Flavobacteriaceae:- Bergeyella zoohelcum; Capnocytophaga canimorsus; Capnocytophaga cynodegmi; Capnocytophaga gingivalis; Capnocytophaga granulosa; Capnocytophaga haemolytica; Capnocytophaga leadbetteri; Capnocytophaga ochracea; Capnocytophaga sputigena; Chryseobacterium indologenes; Chryseobacterium piscicola; Elizabethkingia meningoseptica; Flavobacterium branchiophilum; Flavobacterium columnare; Flavobacterium oncorhynchi; Flavobacterium piscicida; Flavobacterium psychrophilum; Myroides odoratus; Myroides odoratimimus; Ornithobacterium rhinotracheale; Riemerella anatipestifer; Riemerella columbina; Riemerella columbipharyngis; Tenacibaculum dicentrarchi; Tenacibaculum discolour; Tenacibaculum gallaicum; Tenacibaculum maritimum; Tenacibaculum soleae; Weeksella virosa. -- Francisellaceae:- Francisella tularensis sub-espécie tularensis; Francisella tularensis sub-espécie holarctica; Francisella tularensis subespécie novicida; Francisella philomiragia; Francisella noatunensis; Francisella noatunensis sub-espécie orientalis (também denominado Francisella asiatica). -- Fusobacteriaceae:- Fusobacterium spp. incluindo Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium nucleatum, Fuso-bacterium polymorphum. -- Helicobacteraceae:- Helicobacter cinaedi; Helicobacter fennelliae; Helicobacter pylori. -- Legionellaceae:- Legionella pneumophila e outras espécies incluindo; Legionella anisa; Legionella birminghamensis; Legionella bozemannii; Legionella cincinnatiensis; Legionella dumoffii; Legionella feeleii; Legionella gormanii; Legionella hackeliae; Legionella jordanis; Legionella lansingensis; Legionella longbeachae; Legionella maceachernii; Legionella micdadei; Legionella oakridgensis; Legionella parisiensis; Legionella sainthelens; Legionella tusconensis; Legionella wadsworthii; Legionella waltersii. -- Leptospiraceae:- Leptospira alexanderi (inclusive Leptospira alexanderi serovar Hebdomadis, Leptospira alexanderi serovar Manhao 3); Leptospira alstoni (inclusive Leptospira alstoni serovar Pingchang, Leptospira alstoni serovar Sichuan); Leptospira biflexa (inclusive Leptospira biflexa serovar Ancona, Leptospira biflexa serovar Canela); Leptospira borgpetersenii (inclusive Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo, Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii serovar Pomona, Leptospira borgpetersenii serovar Tarassovi); Leptospira broomii (inclusive Leptospira broomii serovar Hurstbridge); Leptospira fainei (inclusive Leptospira fainei serovar Hurstbridge); Leptospira idonii; Leptospira inadai (inclusive Leptospira inadai serovar Lyme, Leptospira inadai serovar Malaya); Leptospira interrogans (inclusive Leptospira interrogans serovar Australis, Leptospira interrogans serovar Autumnalis, Leptospira interrogans serovar Bratislava, Leptospira interrogans serovar Canicola, Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa, Leptospira interrogans serovar Hardjo, Leptospira interrogans serovar Hardjo-bovis, Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, Leptospira interrogans serovar Pomona, Leptospira interrogans serovar Pyrogenes, Leptospira interrogans serovar Tarassovi); Leptospira kirschneri (inclusive Leptospira kirschneri serovar Bulgarica, Leptospira kirschneri serovar Cynopteri, Leptospira kirschneri serovar Grippotyphosa); Leptospira kmetyi; Leptospira licerasiae; Leptospira meyeri (inclusive Leptospira meyeri serovar Sofia); Leptospira noguchii (inclusive Leptospira noguchii serovar Panama, Leptospira noguchii serovar Pomona); Leptospira santarosai; Leptospira terpstrae; Leptospira vanthielii; Leptospira weilii (inclusive Leptospira weilii serovar Celledoni, Leptospira weilii serovar Sarmin); Leptospira wolbachii; Leptospira wolffii; Leptospira yanagawae. -- Leptotrichiaceae:- Leptotrichia buccalis; Streptobacillus moniliformis. -- Methylobacteriaceae:- grupo Methylobacterium extorquens; Methylobacterium fujisawaense; Methylobacterium mesophilicum; Methylobacterium zatmanii. -- Moraxellaceae:- Acinetobacter baumannii (espécie genómica 2); Acinetobacter baylyi; Acinetobacter bouvetii; Acinetobacter calcoaceticus (espécie genómica 1); Acinetobacter gerneri; Acinetobacter grimontii; Acinetobacter haemolyticus (espécie genómica 4); Acinetobacter johnsonii (espécie genómica 7); Acinetobacter junii (espécie genómica 5); Acinetobacter lwoffi (espécie genómica 8/9); Acinetobacter parvus; Acinetobacter radioresistens (espécie genómica 12); Acinetobacter schindleri; Acinetobacter tandoii; Acinetobacter tjernbergiae; Acinetobacter towneri; Acinetobacter ursingii; Acinetobacter venetianus; Moraxella atlantae; Moraxella boevrei; Moraxella bovis; Moraxella bovoculi; Moraxella canis; Moraxella caprae; Moraxella catarrhalis; Moraxella caviae; Moraxella cuniculi; Moraxella equi; Moraxella lacunata; Moraxella lincolnii; Moraxella macacae; Moraxella nonliquefaciens; Moraxella oblonga; Moraxella osloensis; Moraxella ovis; Moraxella phenylpyruvica; Moraxella pluranimalium; Moraxella porci. -- Moritellaceae:- Moritella abyssi; Moritella dasanensis; Moritella japonica; Moritella marina; Moritella pro-funda; Moritella viscosa; Moritella yayanosii. -- Neisseriaceae:- Chromobacterium violaceum; Eikenella corrodens; Kingella denitrificans, Kingella kingae, Kingella oralis, Kingella potus; Neisseria cinerea; Neisseria elongata; Neisseria flavescens; Neisseria gonorrhoeae; Neisseria lactamica; Neisseria meningitidis; Neisseria mucosa; Neisseria polysaccharea; Neisseria sicca; Neisseria subflava; Neisseria weaver; Vitreoscilla spp. -- Nitrosomonadaceae:- Nitrosomonas eutropha; Nitrosomonas halophila; Nitrosomonas oligotropha. -- Pasteurellaceae:- Actinobacillus actinomycetemcomitans; Actinobacillus equuli; Actinobacillus lignieresii; Actinobacillus pleuropneumoniae; Actinobacillus seminis; Actinobacillus succinogenes; Actinobacillus ureae; Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aggregatibacter segnis, Aggregatibacter aphrophilus; Avibacterium avium; Avibacterium endocarditidis; Avibacterium gallinarum; Avibacterium paragallinarum; Avibacterium volantium; Bibersteinia trehalose; Gallibacterium anatis; Gallibacterium genomospecies 1; Gallibacterium genomospecies 2; Gallibacterium genomospecies 3; Gallibacterium grupo V; Gallibacterium melopsittaci; Gallibacterium salpingitidis; Gallibacterium trehalosifermentans; Haemophilus aegyptius; Haemophilus avium; Haemophilus ducreyi; Haemophilus haemolyticus; Haemophilus influenzae; Haemophilus parahaemolyticus; Haemophilus parainfluenzae; Haemophilus parasuis; Histophilus somni; Mannheimia caviae; Mannheimia glucosida; Mannheimia granulomatis; Mannheimia haemolytica; Mannheimia ruminalis; Mannheimia varigena; Nicoletella semolina; Pasteurella aerogenes; Pasteurella bettyae; Pasteurella caballi; Pasteurella canis; Pasteurella dagmatis; Pasteurella multocida (subspecies multocida, septicum, gallicida); Pasteurella pneumotropica; Pasteurella stomatis; Pasteurella trehalosi. -- Piscirickettsiaceae:- Piscirickettsia salmonis. -- Plesiomonadaceae:- Plesiomonas shigelloides. -- Polyangiaceae:- Sorangium cellulosum. -- Porphyromonadaceae:- Dysgonomonas capnocytophagoides; Dysgonomonas gadei; Dysgonomonas hofstadii; Dysgonomonas mossii; Dysgonomonas oryzarvi; Dysgonomonas wimpennyi; Porphyromonas gingivalis. -- Prevotellaceae:- Prevotella spp. incluindo Prevotella intermedia,Prevotella melaninogenica. -- Pseudomonadaceae:- Chryseomonas luteola; Pseudomonas aeruginosa; Pseudomonas luteola; Pseudomonas fluorescens; Pseudomonas putida; Pseudomonas stutzeri; Pseudomonas oryzihabitans. -- Rhizobiaceae:- Agrobacterium tumefaciens; Rhizobium radiobacter. -- Rickettsiaceae:- Orientia chuto; Orientia tsutsugamushi; Rickettsia aeschlimannii; Rickettsia africae; Rickettsia akari; Rickettsia argasii; Rickettsia asiatica; Rickettsia australis; Rickettsia bellii; Rickettsia canadensis; Rickettsia conorii; Rickettsia cooleyi; Rickettsia felis; Rickettsia heilongjiangensis; Rickettsia helvetica; Rickettsia honei; Rickettsia hoogstraalii; Rickettsia hulinensis; Rickettsia hulinii; Rickettsia japonica; Rickettsia marmionii; Rickettsia martinet; Rickettsia massiliae; Rickettsia monacensis; Rickettsia montanensis; Rickettsia monteiroi; Rickettsia moreli; Rickettsia parkeri; Rickettsia peacockii; Rickettsia philipii; Rickettsia prowazekii; Rickettsia raoultii; Rickettsia rhipicephali; Rickettsia rickettsii; subgrupo Rickettsia sibirica; Rickettsia slovaca; Rickettsia tamurae; Rickettsia typhi. -- Shewanellaceae:- Shewanella putrefaciens. -- Sphingomonadaceae:- Sphingobacterium multivorum; Sphingobacterium spiritivorum; Sphingomonas paucimobilis. -- Spirillaceae:- Spirillum minus; Spirillum volutans; Spirillum winogradskyi. -- Spirochaetaceae:- Borrelia afzelii; Borrelia anserina; Borrelia bissettii; Borrelia burgdorferi; Borrelia coriaceae; Borrelia duttonii; Borrelia garinii; Borrelia hermsii; Borrelia hispanica; Borrelia japonica; Borrelia lonestari; Borrelia lusitaniae; Borrelia miyamotoi; Borrelia parkeri; Borrelia persica; Borrelia recurrentis; Borrelia spielmanii; Borrelia turicatae; Borrelia turicatae; Borrelia valaisiana; Treponema carateum; Treponema pallidum ssp. endemicum; Treponema pallidum ssp. pallidum; Treponema pallidum ssp. pertenue. -- Succinivibrionaceae:- Anaerobiospirillum spp. -- Sutterellaceae:- Sutterella spp inclusive Sutterella wadsworthia. -- Thermaceae:- Meiothermus spp. -- Thermotogaceae:- Thermotoga neapolitana. -- Veillonellaceae:- Dialister spp; Megamonas spp; Megasphaera spp; Pectinatus spp; Pelosinus spp; Propionispora spp; Sporomusa spp; Veillonella spp.; Zymophilus spp. -- Vibrionaceae:- Photobacterium damselae; Vibrio adaptatus; Vibrio alginolyticus; Vibrio azasii; Vibrio campbellii; Vibrio cholera; Vibrio damsel; Vibrio fluvialis; Vibrio furnisii; Vibrio hollisae; Vibrio metchnikovii; Vibrio mimicus; Vibrio parahaemolyticus; Vibrio vulnificus. -- Wolbachieae:- Wolbachia spp. -- Xanthomonadaceae:- Luteimonas aestuarii; Luteimonas aquatica; Luteimonas composti; Luteimonas lutimaris; Luteimonas marina; Luteimonas mephitis; Luteimonas vadosa; Pseudoxanthomonas broegbernensis; Pseudoxanthomonas japonensis; Stenotrophomonas maltophilia; Stenotrophomonas nitritireducens.

[0045] Mais preferencialmente, o agente bacteriano causador da infecção bacteriana é gram-negativo e é selecionado a partir do grupo que compreende: espéciesAcinetobacter, espécies Aeromonas hydrophila, Citrobacter, espécies Enterobacter, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, e Stenotrophomonas maltophilia.

[0046] Numa outra modalidade preferida, o agente bacteriano causador da infecção ou colonização bacteriana é resistente a um antibiótico convencional utilizado para tratar a colonização ou infecção. Em uma modalidade preferencial, o agente bacteriano é resistente a um composto selecionado a partir do grupo que compreende: um ou mais dos aminoglicosídeos (por exemplo gentamicina, tobramicina, amicacina ou netilmicina); cefalosporinas de anti-MRSA (por exemplo ceftarolina); penicilinas anti-pseudomonais + inibidores de β-lactamases (por exemplo ácido clavulânico ticarcilina ou piperacilina-tazobactama); carbapenemas (por exemplo ertapenema, imipenema, meropenema ou doripenema); cefalosporinas de espectro não estendido; cefalosporinas de 1ae 2ageração (por exemplo, cefazolina ou cefuroxima); cefalosporinas de espectro estendido; cefalosporinas de 3a e 4a geração (por exemplo, cefotaxima ou ceftriaxona); cefalosporinas (por exemplo cefoxitina ou cefotetan); fluoroquinolonas (por exemplo ciprofloxacina); inibidores de caminho de folato (por exemplo trimetoprima-sulfametoxazol); glicilciclinas (por exemplo tigeciclina); monobactamas (por exemplo aztreonam); penicilinas (por exemplo, ampicilina); penicilinas + inibidores de β-lactamases (por exemplo ácido clavulânico amoxicilina ou ampicilina-sulbactam); fenicóis (por exemplo cloranfenicol); ácidos fosfônicos (por exemplo fosfomicina); e polimixinas (por exemplo colistina); tetraciclinas (por exemplo, tetraciclina, doxiciclina ou minociclina). De preferência, o agente bacteriano resistente a estes compostos é gram negativo.

[0047] De preferência, o agente bacteriano é resistente a um ou mais compostos selecionados dentre o grupo compreendendo: penicilinas, cefalosporinas, carbapenemas, monobactamas e outro antibióticos e-lactâmicos, fusidanos, aminoglicosídeo, fluoroquinolonas, estreptograminas, tetraciclinas, glicilciclinas, cloranfenicol e outros fenicóis, macrolídeos e cetolídeos, lincosamidas, oxazolidinonas, aminociclitóis, polimixinas, glicopeptídeos, lipopeptídeos, bacitracina, mupirocina, pleuromutilinas, rifamicinas, sulfonamidas e trimetoprima. Mais preferivelmente, o composto é selecionado a partir do grupo que compreende: β-lactamas, glicopéptidos, lipopéptidos, macrolidos, tetraciclinas e oxazolidinonas. De preferência, o agente bacteriano é resistente ao composto quando o composto é numa gama de concentração selecionada a partir do seguinte: 0,001 μg/mL - 10.000 μg/mL; 0,01 μg/mL - 1000 μg/mL; 0,10 μg/mL - 100 μg/mL; e 1 μg/mL - 50 μg/mL

[0048] Mais preferencialmente, o agente bacteriano causador da infecção bacteriana é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, bactérias gram positivas. O agente bacteriano é mais preferivelmente um agente bacteriano Gram-positivo selecionado a partir do grupo que compreende Staphylococcus aureus, Staphylococcus pseudintermedius, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, e Clostridium difficile.

[0049] Numa modalidade preferida, o agente bacteriano não tem parede celular. De preferência, o agente bacteriano é selecionado a partir do grupo que compreende: Mycoplasma spp, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma amphoriforme, Mycoplasma arginini, Mycoplasma bovigenitalum, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovoculi, Mycoplasma buccale, Mycoplasma californicum, Mycoplasma canadense, Mycoplasma capricolum subsp. capricolum, Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae, Mycoplasma conjunctivae, Mycoplasma cynos, Mycoplasma dispar, Mycoplasma equigenitalium, Mycoplasma faucium, Mycoplasma felis, Mycoplasma fermentans (incognitus str.), Mycoplasma gallisepticum (MG), Mycoplasma gateae, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma haemocanis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemosuis (anteriormente Eperythrozoon suis), Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma iowae meleagridis (MM), Mycoplasma iowae, Mycoplasma leachii, Mycoplasma lipophilum, Mycoplasma meleagridis, Mycoplasma mycoides subsp capri, Mycoplasma mycoides subsp mycoides, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (tail como Pleuroneumonia contagiosa bovina CBPP), Mycoplasma orale, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma ovis, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma pirum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma primatum, Mycoplasma putrefaciens, Mycoplasma salivarium, Mycoplasma spermatophilum, Mycoplasma suis, Mycoplasma synoviae (MS), Mycoplasma wenyonii, Mycoplasma, Ureaplasma spp, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma, e Ureoplasma diversum.

[0050] Numa outra modalidade mais preferida, o agente bacteriano é Staphylococcus aureus.

[0051] Em outra modalidade preferencial, o agente bacteriano é resistente a um composto selecionado a partir do grupo que compreende: um ou mais dos aminoglicosídeos (por exemplo, gentamicina); ansamicinas (por exemplo, rifampicina); cefalosporinas de anti-MRSA (por exemplo, ceftarolina); β-lactamas de anti-estafilocócicas (ou cefalosporinas) (por exemplo oxacilina ou cefoxitina); carbapenemas (por exemplo ertapenema, imipenema, meropenema ou doripenema); cefalosporinas de espectro não estendido; cefalosporinas de 1ae 2a geração (por exemplo, cefazolina ou cefuroxima); cefalosporinas de espectro estendido; cefalosporinas de 3a e 4a geração (por exemplo, cefotaxima ou ceftriaxona); cefamicinas (por exemplo cefoxitina ou cefotetan); fluoroquinolonas (por exemplo, ciprofloxacina ou moxifloxacina); inibidores de caminho de folato (por exemplo trimetoprima-sulfametoxazol); fucidinas (por exemplo ácido fusídico); glicopeptídeos (por exemplo, vancomicina, teicoplanina ou telavancina); glicilciclinas (por exemplo tigeciclina); lincosamidas (por exemplo clindamicina); lipopeptídeos (por exemplo daptomicina); macrólidos (por exemplo, eritromicina); oxazolidinonas (por exemplo, linezolida ou tedizolida; fenicóis (por exemplo cloranfenicol); ácidos fosfônicos (por exemplo fosfomicina); estreptograminas (por exemplo quinupristina-dalfopristina); e tetraciclinas (por exemplo, tetraciclina, doxiciclina ou minociclina). De preferência, o agente bacteriano resistente a estes compostos é gram positivo.

[0052] Numa outra modalidade mais preferida, o agente bacteriano é Streptococcus pneumoniae. O Streptococcus pneumoniae pode ser uma cepa que é resistente a um ou mais de β-lactamas e macrolídeos.

[0053] Numa outra modalidade mais preferida, o agente bacteriano é Streptococcus pyogenes.

[0054] Numa outra modalidade mais preferida, o agente bacteriano é Streptococcus agalactiae.

[0055] Numa outra modalidade mais preferida, o agente bacteriano é ou Enterococcus faecium ou Enterococcus faecalis. O Enterococcus faecium ou Enterococcus faecalis pode ser uma cepa que é resistente a um ou mais dos aminoglicósidos (por exemplo, gentamicina (nível elevado) ou estreptomicina (por exemplo, estreptomicina (nível elevado)); carbapenemos (por exemplo, imipenema, meropenema ou doripenema); fluoroquinolonas (por exemplo ciprofloxacina, levofloxacina ou moxifloxacina); glicopéptidos (por exemplo vancomicina ou teicoplanina); glicilciclinas (por exemplo tigeciclina); lipopeptídeos (por exemplo daptomicina); oxazolidinonas (por exemplo linezolida); penicilinas (por exemplo ampicilina); estreptograminas (por exemplo quinupristina- dalfopristina); tetraciclina (por exemplo doxiciclina ou minociclina ).

[0056] Numa outra modalidade mais preferida, o agente bacteriano é Clostridium difficile.

[0057] A infecção bacteriana no indivíduo pode causar uma doença selecionada a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, pneumonia nosocomial causada por Staphylococcus aureus (MDR, XDR, PDR ou cepas suscetíveis ou resistentes a meticilina), ou doenças invasivas pneumocócicas tais como pneumonia, bronquite, sinusite aguda, inflamação na orelha, conjuntivite, meningite, bacteremia, sepsia, osteomielite, artrite séptica, endocardite, peritonite, pericardite, celulite, e abscesso cerebral causado por Streptococcus pneumoniae (inclusive cepas multi-droga resistentes [MDRSP] tais como aquelas resistentes a β-lactamas e macrolídeos), infecções complicadas da pele e da estrutura cutânea, inclusive infecções do pé diabético, com ou sem osteomielite concomitante, causado por Staphylococcus aureus (cepas suscetíveis ou resistentes a meticilina), Streptococcus pyogenes, ou Streptococcus agalactiae, infecções não complicadas da pele e da estrutura cutânea causadas por Staphylococcus aureus (cepas suscetíveis ou resistentes a meticilina) ou Streptococcus pyogenes, pneumonia adquirida na comunidade causada por Streptococcus pneumoniae (inclusive cepas multi-droga resistentes [MDRSP], inclusive casos com bacteriemia concomitante, ou Staphylococcus aureus (cepas suscetíveis ou resistentes a meticilina) e Staphylococcus aureus infecções da corrente sanguínea (bacteraemia), inclusive aquelas com endocardite infecciosa do lado direito, causado por isolados suscetíveis a meticilina ou resistentes a meticilina, infecções de Enterococcus resistentes à vancomicina, inclusive casos com bacteriemia concomitante, e tratamento de diarréia associada a Clostridium difficile-(CDAD).

[0058] Organismos gram negativos são as causas importantes de muitas doenças infecciosas em seres humanos e outras espécies de animais. Infecções ósseas e articulares (organismos gram-negativos ou bactéria mista, são uma causa importante de osteomielite vertebral e artrite séptica), infecções do sistema cardiovascular (inclusive endocardite causada pelo grupo HACEK - Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus aphrophilus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, Kingella kingae), infecções do sistema nervoso central (as causas mais comuns da meningite bacteriana são Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e, em crianças jovens não vacinadas, Haemophilus influenzae tipo b (Hib), em neonatos e crianças com menos de 3 meses de idade, Streptococcus agalactiae (grupo B streptococcus), Escherichia coli e bastões Gram-negativos aeróbicos são patógenos importantes, abscesso cerebral ou empiema subdural, o(s) organismo(s) infectante(s) varia(iam) com a causa predisponente subjacente mas onde o local provável de origem é o ouvido, bacilos entéricos Gram-negativos são comumente envolvidos), infecções oculares (patógenos comuns incluem Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae ou Chlamydia trachomatis), infecções do trato gastrointestinal (uma vasta gama de agentes patogénicos estão implicados, inclusive Escherichia colienterotoxigênica (ETEC), Salmonella, Campylobacter, Shigella, Vibrio cholera e Yersinia enterocolitica), infecções genitais (vaginose bacteriana é uma síndrome clínica polimicrobiana com altas concentrações de bactéria anaeróbica (por exemplo, espécies Mobiluncus) e outras bactérias fastidiosas (inclusiveGardnerella vaginalis eAtopobium vaginae), eMycoplasma hominis; doença inflamatória pélvica não-adquirida sexualmente (PID) é geralmente causada por flora vaginal mista, inclusive anaeróbios, bactérias gram-negativas facultativas eMycoplasma hominis, enquanto PID sexualmente adquirida é geralmente iniciada por C. trachomatis ou N. gonorrhoeae com crescente evidência de que a infecção de M. genitaliumestá envolvido em uma minoria significativa de casos), infecções intra-abdominais (peritonite devido a víscera perfurada geralmente é uma infecção polimicrobiana com flora intestinal de aeróbias e anaeróbias enquanto peritonite bacteriana espontânea (SBP) é geralmente causada por bacilos entéricos Gram-negativos, tais como espécies Escherichia coli e Klebsiella, Klebsiella pneumoniaeé uma causa cada vez mais identificada de abscesso hepático), pneumonia adquirida na comunidade (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae, Chlamydophila (Chlamydia) psittaci, Haemophilus influenza, bacilos aeróbicos Gram-negativos inclusive Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Burkholderia pseudomallei), otitis externa (inclusive aguda difusa) (culturas de bactérias comumente geram Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, e espécies Proteus e Klebsiella ), otitis media (inclusive aguda) (agentes patogénicos bacterianos comuns incluem Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae eMoraxella catarrhalis), sepsia (inclusive grave) (inclusive Acinetobacter baumannii, sepse gonocócica disseminada, Bactérias gram-negativas entéricas, Neisseria meningitidis (sepsia meningocócica) ePseudomonas aeruginosa), infecções sistêmicas (febres manchadas (Rickettsia) e tifo rural (Orientia), brucelose, Doença da arranhadura do gato e outras bartoneloses, leptospirose, doença de Lyme, melioidose, febre Q, tifóide e febre paratifóide (febres entéricas), infecções do trato urinário (cistite aguda, pielonefrite aguda, infecções urinárias recorrentes e bacteriúria associada a ateter e infecções do trato urinário).

[0059] Nos seres humanos, bactérias gram negativas são causas comuns de infecções intra-abdominais (IAIS), infecções do trato urinário (ITU), pneumonia adquirida no hospital, e bacteremia. Escherichia coli (E. coli), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), e Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)são importantes patógenos no ambiente hospitalar, sendo responsável por 27% de todos os patógenos e 70% de todos os agentes patogênicos Gram-negativos causadores de infecções associadas aos cuidados de saúde [Sievert DM, Ricks P, Edwards Jr, et al. Patógenos resistentes aos antimicrobianos associados a infecções associadas aos cuidados de saúde: resumo dos dados notificados à Rede Nacional de Segurança de Saúde nos Centros de Controle e Prevenção de Doenças, 2009-2010. Infect Control Hosp Epidemiol. 2013;34:1-14.].

[0060] Bactérias gram-negativas estão mostrando as crescentes taxas de resistência a terapias atuais. A produção de enzimas de β-lactamase de espectro estendido (ESBL) é um mecanismo comum da resistência. As taxas de E.coli e K. pneumoniae produtoras de ESBL aumentaram substancialmente, com o resultado de que estas bactérias são cada vez mais resistentes a agentes antimicrobianos amplamente utilizados.

[0061] P. aeruginosaé a causa Gram-negativa mais comum de pneumonia nosocomial e a segunda causa mais comum de infecções do trato urinário relacionadas ao cateter nos EUA.

[0062] E. colié a causa mais comum de infecções do trato urinário. Casos de ITU causadas por cada vez mais E. coli e K. pneumonia produtoras de ESBL assim como P. aeruginosa, inclusive cepas de MDR, estão aumentando. E. coli e K. pneumoniae produtoras de ESBL são também frequentemente isoladas em pacientes com IAI complicada (cIAI).

[0063] P. aeruginosaé um agente patogênico clinicamente desafiador e virulento que pode ser uma causa de infecções comuns em seres humanos, como a pneumonia nosocomial, UTI, IAI, e infecções da corrente sanguínea. P. aeruginosaé o organismo Gram-negativo mais comum causando pneumonia associada à ventilação e a segunda causa mais comum de infecções do trato urinário associadas a cateter.

[0064] O aumento do número de infecções causadas por bactérias Gram- negativas é acompanhado por aumento das taxas de resistência. As opções de tratamento para enfrentar este desafio são cada vez mais limitadas. Existe uma necessidade crucial para novos antibióticos para atender as necessidades dos pacientes, agora e no futuro.

[0065] Numa outra modalidade preferida, robenidina, ou um sal terapeuticamente aceitável disso, é administrado conjuntamente com um composto ou agente que remove ou elimina ou reduz substancialmente a integridade da parede celular bacteriana do agente. Como um exemplo, o composto é selecionado a partir do grupo consistindo em: β-lactamas, fosfomicina, lisozima, polimixinas e agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA). Como exemplo, o agente é um agente imunológico (tal como um anticorpo ou vacina) que reduz a integridade da parede celular. Numa modalidade preferida, robenidina, ou um sal terapeuticamente aceitável disso, é administrado conjuntamente com um composto que elimina ou remove substancialmente ou enfraquece a integridade da parede celular externa de um agente bacteriano gram negativo ou positivo.

[0066] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica antibacteriana que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de robenidina, ou um sal terapeuticamente aceitável disso.

[0067] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionada uma composição veterinária antibacteriana que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de robenidina, ou um sal terapeuticamente aceitável disso.

[0068] O método de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana ou colonização num indivíduo, pode também compreender a administração das composições farmacêuticas ou veterinárias da invenção.

[0069] A composição farmacêutica pode incluir, opcionalmente, um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável. A composição veterinária pode incluir, opcionalmente, um excipiente ou veículo veterinariamente aceitável.

[0070] A composição farmacêutica ou veterinária da presente invenção contém de preferência robenidina, ou um sal farmaceuticamente aceitável disso, a uma concentração selecionada a partir do grupo que consiste em: 1mg/g a 500mg/g; 5mg a 400mg/g; 10mg/g a 200mg/g; 20mg/g a 100mg/g; 30mg/g a 70mg/g; e 40mg/g a 60mg/g.

[0071] Em outra modalidade, a composição farmacêutica ou veterinária compreende impurezas, em que a quantidade de impurezas, tal como uma percentagem do peso total da composição é selecionada a partir do grupo constituído por: menos de 20% de impurezas (por peso total da composição); menos de 15% de impurezas; menos de 10% de impurezas; menos de 8% de impurezas; menos de 5% de impurezas; menos de 4% de impurezas; menos de 3% de impurezas; menos de 2% de impurezas; menos de 1% de impurezas: menos de 0,5% de impurezas; menos de 0,1% de impurezas. Numa modalidade, a composição farmacêutica ou veterinária compreende impurezas microbianas ou metabolitos secundários, em que a quantidade de impurezas microbianas como uma percentagem do peso total da composição é selecionada a partir do grupo que consiste em: menos de 5%; menos de 4%; menos de 3%; menos de 2%; menos de 1%; menos de 0,5%; menos de 0,1%; menos de 0,01%; menos de 0,001%. Numa modalidade, a composição farmacêutica ou veterinária é estéril e armazenada em um recipiente selado e esterilizado. Numa modalidade, a composição farmacêutica ou veterinária contém nenhum nível detectável de contaminação microbiana.

[0072] De preferência, a robenidina é da classe farmacêutica ou veterinária. Métodos para sintetizar quantidades comerciais de robenidina são amplamente disponíveis na técnica. Quantidades comerciais de robenidina da classe farmacêutica ou veterinária estão disponíveis da Zhejiang Esigma Animal Health Co., Ltd, Haining City, República Popular da China.

[0073] A composição farmacêutica ou veterinária da presente invenção pode compreender ainda um agente antimicrobiano. O outro agente antimicrobiano pode ser um agente antifúngico ou um agente antibacteriano. O método de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana ou colonização num indivíduo, pode também compreender a administração de robenidina com um outro agente antimicrobiano.

[0074] Numa modalidade, o agente antifúngico é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, agentes que ocorrem naturalmente, incluindo Equinocandinas (Anidulafungina, Caspofungina, Micafungina), Polienos (Anfotericina B, Candicidina, Filipina, Fungicromina (Pentamicina), Haquimicina, Hamicina, Lucensomicina, Mepartricina, Natamicina, Nistatina, Pecilocina, Perimicina), e outros agentes antifúngicos que ocorrem naturalmente incluindo Griseofulvina, Oligomicinas, Pirrolnitrina, Sicanina, e Viridina. O agente antifúngico pode ser um composto sintético, selecionado a partir do grupo que inclui, mas não limitado a, Alilaminas (Butenafina, Naftifina, Terbinafina) Imidazóis (Bifonazol, Butoconazol, Clormidazol, Climbazol, Croconazol (Cloconazol), Clotrimazol, Eberconazol, Econazol, Enilconazol, Fenticonazol, Flutrimazol, Fosfluconazol, Isoconazol, Quetoconazol, Lanoconazol, Luliconazol, Miconazol, Neticonazol, Omoconazol, Nitrato de Oxiconazol, Parconazol, Sertaconazol, Sulconazol, Tioconazol), Tiocarbamatos (Liranaftato, Tolciclato, Tolindato, Tolnaftato), Triazóis (Fluconazol, Isavuconazol, Itraconazol, Posaconazol, Ravuconazol, Saperconazol, Terconazol, Voriconazol), e outros agentes sintéticos tais como Acrisorcina, Amorolfina, Bromosalicilcloranilida (Bromoclorosalicilanilida), Buclosamida, Propionato de Cálcio, Clorfenesina, Ciclopirox, Cloxiquino (Cloxiquina), Coparafinato, Exalamida, Flucitosina, Haloprogina, Hexetidina, Loflucarbano, Nifuratel, Nifuroxima, Piroctona, Iodeto de Potássio, Ácido Propiónico, Piritiona, Salicilanilida, Paraclorobenzoato de Sódio, Propionato de Sódio, Sulbentina, Tenonitrozol, Triacetina, Trimetrexato, Ácido Undecilênico (Ácido Undecenóico), e Propionato de Zinco.

[0075] A composição da invenção pode compreender um adjuvante de antibiótico selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Inibidores de β-lactamase (Avibactam, Clavulanato, Sulbactam, Sultamicilina, Tazobactam), Inibidores de Dipeptidase Renal (Cilastatina), e Protetor Renal (Betamipron).

[0076] Numa modalidade, a composição da invenção compreende um antibiótico adicional selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, 2,4-DIAMINOPIRIMIDINAS, incluindo Baquiloprima, Brodimoprima, Iclaprima, Ormetoprima, Pirimetamina, Tetroxoprima, Trimetoprima; AMINOCUMARINAS, incluindo Novobiocina; AMINOCICLITÓIS, incluindo Espectinomicina,; AMINOGLICOSÍDEOS, incluindo Amicacina, Apramicina, Arbecacina, Becanamicina, Butirosina, Dibecacina, Dihidrostreptomicina, Etimicina, Fortimicinas (Astromicina), Framicetina, Gentamicina, Higromicina B, Isepamicina, Canamicina, Micronomicina, Neomicina, Netilmicina, Paromomicina, Plazomicina, Ribostamicina, Sisomicina, Estreptomicina, Tobramicina, Verdamicina; AMINOMETILCICLINAS, incluindo Omadaciclina; AMFENICÓIS, incluindo Azidamfenicol, Cloramfenicol, Florfenicol, Tiamfenicol; ANSAMICINAS, incluindo Rifabutina, Rifamida, Rifampina (Rifampicina), Rifamicina, Rifapentina, Rifaximina; AGENTES ANTI-SÉPTICOS, incluindo derivados de Acridina (incluindo acriflavina, aminoacridina, etacridina, proflavina), Bispiridinas (incluindo octenidina dihidrocloreto), Salicilanilidas bromadas (incluindo bromsalanos), Clorexidina, derivados de Fenol (incluindo timol e triclosano), Compostos de amônio quaternário (incluindo Cloreto de Amônio de Alquildimetiletilbenzil, cloreto de benzalcônio, cloreto de cetilpiridínio, cloreto de benzetônio, cetrimônio); AGENTES ANTITUBERCULOSOS, incluindo Cicloserina, Delamanida, Etambutol, Etionamida, Isoniazida (Fitivazida), Morinamida, Ácido p-Aminossalicílico (PAS), Protionamida, Pirazinamida, Terizidona, Tioacetazona, Tiocarlida; ARSENICAIS, including Ácido Arsanílico, Roxarsona; BACTERIOCINAS, incluindo Nisina, Brilacidina (PMX-30063); CARBACEFEMAS e—LACTÂMICOS, incluindo Loracarbefa; CARBAPENEMAS B-LACTÂMICOS, incluindo Biapenem, Doripenem, Ertapenem, Faropenem, Imipenem, Meropenem, Panipenem, Razupenem, Ritipenem, Sulopenem, Tebipenem, Tomopenem; CEFALOSPORINAS B-LACTÂMICAS, incluindo Cefacetrilea, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexina, Cefaloglicina, Cefalônio, Cefaloridina, Cefalotina, Cefamandol, Cefapirina, Cefatrizina, Cefazaflur, Cefazedona, Cefazolina, Cefcapena, Cefdinir, Cefditorena, Cefepima, Cefetameto, Cefixima, Cefmenoxima, Cefodizima, Cefonicida, Cefoperazona, Ceforanida, Cefoselis, Cefotaxima, Cefotiam, Cefovecina, Cefozoprano, Cefpimizol, Cefpiramida, Cefpiroma, Cefpodoxima, Cefprozil, Cefquinoma, Cefradina, Cefroxadina, Cefsulodina, Ceftarolina, Ceftazidima, Cefteram, Ceftezol, Ceftibuteno, Ceftiofur, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftolozano, Ceftradina, Ceftrezol, Ceftriaxona, Ceftroxadina, Cefuroxima, Cefuzonam, Pivcefalexina; CEFAMICINAS B-LACTÂMICAS, incluindo Cefbuperazona, Cefmetazol, Cefminox, Cefotetano, Cefoxitina; MONOBACTÂMICOS B-LACTÂMICOS, incluindo Aztreonam, Carumonam, Tigemonam; OXACEFENS B-LACTÂMICOS, incluindo Flomoxef, Latamoxef, Moxalactam; PENICILINAS B-LACTÂMICAS, incluindo Amdinocilina (Mecilinam), Amoxicilina, Ampicilina, Apalcilina, Aspoxicilina, Azidocilina, Azlocilina, Bacampicilalina, Carbenicilina, Carindacilina, Ciclacilina, Penicilina de Clemizol, Clometocilina, Cloxacilina, Ciclacilina, Dicloxacilina, Epicilina, Fenbenicilina, Floxacilina (Flucloxacilina), Hetacilina, Lenampicilina, Mecilinama, Metampicilina, Sódio de Meticilina, Mezlocilina, Nafcilina, Oxacilina, Penamecilina, Iodidrato de Penetamato, Penicilina G, Penicilina G Benzatina, Procaína de Penicilina G, Penicilina N, Penicilina O, Penicilina V, Potássio de Feneticilina, Piperacilina, Pivampicilina, Pivmecilinam, Propicilina, Quinacilina, Sulbenicilina, Sultamicilina, Talampicilina, Temocilin, Ticarcilina; BICICLOMICINAS, incluindo Bicozamicina; AGENTES ANTIBACTERIANOS QUE CONTÊM BORO, incluindo AN3365 (aminometilbenzoxaboróis), GSK2251052 (inibidores de leucil-tRNA sintetase); ÉTERES CICLÍCOS, incluindo Fosfomicina; INIBIDORES DA SÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS (FabI), AFN-1252, MUT056399, FAB-001;FLUOROQUINOLONAS, incluindo Avarofloxacina, Balofloxacina, Besifloxacina, Chinfloxacina, Cinoxacina, Ciprofloxacina, Clinafloxacina, Danofloxacina, Delafloxacina, Difloxacina, Enoxacina, Enrofloxacina, Finafloxacina, Fleroxacina, Flumequina, Garenoxacina, Gatifloxacina, Gemifloxacina, Grepafloxacina, Ibafloxacina, Levofloxacina, Lomefloxacina, Marbofloxacina, Miloxacina,Moxifloxacina, Nadifloxacina, Norfloxacina, Ofloxacina, Orbifloxacina, Pazufloxacina, Pefloxacina, Pradofloxacina, Prulifloxacina, Rosoxacina,Rufloxacina, Sarafloxacina, Sitafloxacina, Sparfloxacina, Temafloxacina,Tosufloxacina, Trovafloxacina, Zabofloxacina; FUSIDANAS, incluindo ÁcisdoFusídico; GLICOLIPODEPSIPEPTÍDEO, incluindo Ramoplanina; GLICOPEPTÍDEOS, incluindo Avoparcina, Dalbavancina, Norvancomicina, Oritavancina, Teicoplanina, Telavancina, Vancomicina,; GLICOFOSFOLIPÍDIOS, incluindo Bambermicinas (bambermicina, moenomicinas, flavofosfolipol); GLICILCICLINAS, incluindo Tigeciclina; HÍBRIDOS, Cadazolídio (Oxazolidinona- quinolona), TD-1792 (glicopeptídeo-cefalosporina); LINCOSAMIDAS, incluindo Clindamicina, Lincomicina, Pirlimicina; LIPOPEPTÍDEOS, incluindo Daptomicina, Surotomicina; MACROLÍDEOS, incluindo Azitromicina, Carbomicina, Cetromicina, Claritromicina, Diritromicina, Eritromicina, Fidaxomicina, Fluritromicina, Gamitromicina, Josamicina, Quitasamicina, Leucomicina, Meleumicina, Midecamicinas, Miocamicina, Mirosamicina, Oleandomicina, Primicina, Roquitamicina, Rosaramicina, Roxitromicina, Sedecamicina, Solitromicina, Espiramicina, Telitromicina, Terdecamicina, Tildipirosina, Tilmicosina, Troleandomicina, Tulatromicina, Tilosina, Tilvalosina; NITROFURANOS, incluindo Furaltadona, Furazidina, Furazolidona, Cloreto de Furazólio, Nifuratel, Nifurfolina, Nifuroxazida, Nifurpirinol, Nifurtoinol, Nifurzida, Nitrofural, Nitrofurantoína, Nitrofurazona; NITROIMIDAZÓIS, incluindo Dimetridazol, Metronidazol, Ornidazol, Ronidazol, Secnidazol, Tinidazol; OLIGOSSACARÍDEOS, incluindo Avilamicina, Everninomicina; OUTROS AGENTES ANTIBACTERIANOS, incluindo Auriclosena, Cloroxina, Clorquinaldol, Clioquinol, Clofoctol, Halquinol, Lotilibcina, Ácido Mandélico, Metenamina (hexamina), Nitazol, Nitroxolina, Perclozona, Taurolidina, Ácido Tenóico, Xibornol; OXAZOLIDINONAS, incluindo Eperezolida, Linezolida, Posizolida, Radezolida, Sutezolida, Tedizolida (Torezolida); INIBIDORES DE DEFORMILASE DE PEPTÍDEO, incluindo GSK1322322; PEPTÍDEOS, incluindo Omiganano, Pexiganano; PLEUROMUTILINAS, incluindo Retapamulina, Tiamulina, Valnemulina; IONÓFOROS DE POLIÉTER, incluindo Laidlomicina, Lasalocida, Maduramicina, Monensina, Narasina, Salinomicina, Semduramicina; POLIMIXINAS, incluindo Colistina, Polimixina B; POLIPEPTÍDEOS, incluindo Amfomicina, Bacitracina, Capreomicina, Enduracidina, Enramicina, Enviomicina, Fusafungina, Gramicidina(s), Iseganano, Magaíninas, Nosiheptídeo, Ristocetina, Tiostreptona, Tuberactinomicina, Tirocidina, Tirotricina, Viomicina; ÁCIDOS PSEUDOMÔNICOS, incluindo Mupirocina; QUINOLONAS, incluindo Ácido Nalidíxico, Nemonoxacina, Ácido Oxolínico, Ozenoxacina, Ácido Pipemídico, Ácido Piromídico; QUINOXALINAS, incluindo Carbadox, Olaquindox; RIMINOFENAZINAS, incluindo Clofazimina; ESTATINAS, incluindo Atorvastatina, Fluvastatina, Lovastatina, Mevastatina, Pitavastatina, Pravastatina, Rosuvastatina, Simvastatina; ESTREPTOGRAMINAS, incluindo Dalfopristina, Flopristina, Linopristina, Pristinamicina, Quinupristina, Virginiamicina; ESTREPTOTRICINAS, incluindo Nurseotricina; SULFONAMIDAS, incluindo Acetil Sulfametoxipirazina, Cloramina-B, Cloramina-T, Dicloramina T, Formosulfatiazol, Mafenida, N4-Sulfanililsulfanilamida, Noprilsulfamida, N- Sulfanilil-3,4-xilamida, Ormaosulfatiazol, Fitalilsulfacetamida, Fitalilsulfatiazol, Salazosulfadimidina, Sucinilsulfatiazol, Sulfabenzamida, Sulfacarbamida, Sulfacetamida, Sulfaclorpiridazina, Sulfacrisoidina, Sulfaclozina, Sulfacitina, Sulfadiazina, Sulfadicramida, Sulfadimetoxina, Sulfadimidina, Sulfadoxina, Sulfaetidol, Sulfaguanidina, Sulfaguanol, Sulfalena, Ácido Sulfalóxico, Sulfamerazina, Sulfaméter, Sulfametazina, Sulfametizol, Sulfametomidina, Sulfametoxazol, Sulfametoxipiridazina, Sulfametiltiazol, Sulfametopirazina, Sulfametrol, Sulfamidocrisoidina, Sulfamonometoxina, Sulfamoxol, Sulfanilamida, Sulfanililureia, Sulfaperina, Sulfafenazol, Sulfaproxilina, Sulfapirazina, Sulfapiridina, Sulfaquinoxalina, Sulfatiazol, Sulfatioureia, Sulfatroxazol, Sulfisomidina, Sulfisoxazol (Sulfafurazol); SULFONAS, incluindo Acediasulfona, Dapsona, Sódio de Glicosulfona, p-Sulfanililbenzilamina, Sucisulfona, Ácido Sulfanílico, Sódio de Sulfoxona, Tiazolsulfona; TETRACICLINAS, incluindo Clortetraciclina, Clomociclina, Demeclociclina, Doxiciclina, Eravaciclina, Guameciclina, Limeciclina, Meclociclina, Metaciclina, Minociclina, Oxitetraciclina, Penimepiciclina, Pipaciclina, Rolitetraciclina, Sareciclina, Tetraciclina.

[0077] A composição da invenção pode compreender ainda um excipiente selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, aglutinantes e adjuvantes de compressão, revestimentos e filmes, diluentes de agentes corantes e veículos desintegrantes, agentes emulsionantes e agentes de solubilização, sabores e adoçantes, repelentes, agentes de deslizamento e lubrificantes, plastificantes, conservantes, propulsores, solventes, estabilizantes, agentes de suspensão e intensificadores da viscosidade.

[0078] De acordo com um outro aspecto da invenção, é proporcionado um dispositivo médico quando utilizado em um método de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana no indivíduo.

[0079] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionado um dispositivo médico que compreende a composição da invenção. A composição da invenção pode ser qualquer forma de libertação lenta, e / ou sob a forma de um revestimento do dispositivo médico.

[0080] O dispositivo médico pode estar numa forma selecionada a partir do grupo que compreende: um implante, um emplastro, um curativo, e outras preparações aplicadas a uma infecção bacteriana num indivíduo.

[0081] De acordo com outro aspecto da invenção, proporciona-se um método de matar bactérias, o método inclui a etapa de contato das bactérias com robenidina, ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma.

[0082] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionada a utilização de robenidina, ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma, para matar as bactérias, o referido uso compreende a etapa de contato das bactérias com robenidina, ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma.

[0083] Os termos aqui utilizados terão os respectivos significados habituais na técnica, a menos que especificado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0084] Outras características da presente invenção são mais completamente descritas na seguinte descrição de várias modalidades não limitativas da mesma. Esta descrição está incluído apenas para efeitos de exemplificação da presente invenção. Ela não deve ser entendida como uma restrição no âmbito do resumo amplo, divulgação ou descrição da invenção tal como definido acima. A descrição será feita com referência aos desenhos anexos, nos quais: A Figura 1 mostra uma tabela dos concentrações inibitórias mínimas para o indivíduo Staphylococcus aureus isolados de acordo com o exemplo 1; A Figura 2 mostra uma tabela com as concentrações inibitórias mínimas para o indivíduo Enterococcus isolados de acordo com o exemplo 1; A Figura 3 mostra uma tabela com as concentrações inibitórias mínimas para o indivíduo Streptococcus pneumoniae isolados de acordo com o exemplo 1; A Figura 4 mostra uma tabela do NCL812 MIC50, MIC90, o modo de MIC e gama de MIC para isolados australianos de MRSA, VRE e Str. pneumoniae de acordo com o exemplo 1. Os valores comparativos de MIC para ampicilina são mostrados entre parênteses; A Figura 5 mostra uma tabela dos valores de Concentração Inibitória Mínima para NCL812 (robenidina) e linezolida contra Staphylococcus aureus ATCC29213 de acordo com o exemplo 2; A Figura 6 mostra um gráfico do efeito de NCL812 sobre a síntese de DNA em macromolecular Staphylococcus aureus de acordo com o exemplo 2; A Figura 7 mostra um gráfico do efeito de NCL812 na síntese de RNA em macromolecular Staphylococcus aureus de acordo com o exemplo 2; A Figura 8 mostra um gráfico do efeito de NCL812 na síntese de proteínas em macromolecular Staphylococcus aureus (ATCC29213) de acordo com o exemplo 2; A Figura 9 mostra um gráfico do efeito de NCL812 sobre a síntese de parede celular em macromolecular Staphylococcus aureus de acordo com o exemplo 2; A Figura 10 mostra um gráfico do efeito de NCL812 na síntese de lipídio em macromolecular Staphylococcus aureus (ATCC29213) de acordo com o exemplo 2; A Figura 11 mostra um gráfico resumindo o efeito de NCL812 sobre a síntese macromolecular em Staphylococcus aureus (ATCC29213) de acordo com o exemplo 2; A Figura 12 mostra um gráfico do efeito de NCL812 sobre a libertação de ATP a partir de Staphylococcus aureus (ATCC29213) de acordo com o exemplo 3; A Figura 13 mostra uma tabela de Staphylococcus aureus nome de clone/isolado, tipo, origem, antibiograma, estado de resistência à clindamicina, tipo de seqüência multi-locus (MLST), tipo de cromossomo de cassete estafilocócica (SCCmec), complexo clonal, estado leucocidina Panton-Valentine (PVL), e tipo de spa para os isolados usados de acordo com o exemplo 4. MSSA; sensível à meticilina S. aureus. HA-MRSA; resistente à meticilina adquirida de hospital S. aureus. CA-MRSA; resistente à meticilina associado à comunidade S. aureus. M.B; M. Barton (University of South Australia). G; Patologia Gribbles (Sul da Austrália). J.P.; J. Perry (University of Adelaide). VIMP; Nares de estudantes de Imunologia Veterinária, Microbiologia, &Saúde Pública (University of Adelaide). S.P.; S. Polyak (University of Adelaide). G.C.; Geoff Coombs (PathWest Laboratory Medicine, Western Australia). Em; Eritromicina. Ci; Ciprofloxacina. Gn; Gentamicina. Tm; Trimetoprima. Te; Tetraciclina. FA; Ácido Fusídico. Rf; Rifampicina. Mp; Mupirocina; A Figura 14 mostra uma tabela dapercentagem de presuntivamente identificado S. aureusrelatórios isolados positivos para fenotípico selecionado e ensaios genotípicos de acordo com o Exemplo 4. HA-MRSA; adquirida em hospital S. aureus. CA-MRSA; associado à comunidade S. aureus. S. aureus isolados foram identificados como testes positivos para a proteína A aglutinação do látex (proteína A), deslize coagulase, Voges-Proskauer e testes de resistência à polimixina B, bem como um teste positivo para a reacção em cadeia da polimerase (PCR) e em tempo real da amplificação por PCR estância termal gene. Resistente à meticilina S. aureus os isolados foram identificados como isolados de teste positivo com os critérios descritos acima, bem como positivo para PCR e PCR em tempo real do mecA gene; A Figura 15 mostra uma tabela da resistência de S. aureus isolados para agentes antibacterianos, utilizando o método de difusão em disco de Kirby-Bauer de acordo com o Exemplo 4. HA-MRSA; resistente à meticilina adquirida de hospital S. aureus. CA-MRSA; resistente à meticilina associado à comunidade S. aureus; A Figura 16 mostra uma tabela com o número e a porcentagem de identificação mec complexos de genes em 20 S. aureus amostras classificadas como resistentes à meticilina de acordo com o Exemplo 4. Cromossoma respectiva da cassete estafilocócica (SCCmec) complexos e tipos que expressam resistência fenotípica à oxacilina e cefotetano são indicados, bem como em tempo real o status de mecA, e o pico negativo médio de dF / dT obtidos a partir de análise de ponto de fusão de PCR em tempo real do gene mecA. Os números em parênteses indicam percentagens; A Figura 17 mostra um gráfico que mostra os picos médios de ponto de fusão para a trama derivada negativa -dF / dT depois de PCR quantitativo em tempo real do gene mecA em S. aureus resistente à meticilina, isolados agrupados por mec complexos de genes, um grupo A (n = 4), B (n = 10), C2 (n = 4) e não classificada (n = 2). Grupos indicados com diferentes expoentes são significativamente diferentes (P <0,05), de acordo com o Exemplo 4; A Figura 18 mostra uma tabela dascaracterísticas de antibacteriano NCL812 e o β-lactama ampicilina antibacteriano de acordo com o Exemplo 4, detalhando a solubilidade antibacteriana em dimetil-sulfóxido (DMSO), a solubilidade em caldo de Mueller-Hinton II ajustado para catiões (CAMHB), e as concentrações inibitórias mínimas médias (CIM) (ug / ml a 24-H) contra resistentes à meticilina S. aureus (MRSA) determinada a partir de estudos preliminares e os valores determinados durante este estudo. ATCC 49775; sensível à meticilina S. aureus isolado e cepa de controle ATCC. MRSA580; resistente à meticilina S. aureusisolado n° 580. MRSA698; resistente à meticilina S. aureusisolar n° 698; A Figura 19 mostra uma tabela em vitro das atividades do novo NCL812 antibacteriano e a ampicilina antibacteriana contra β-lactama S. aureus isolados clínicos de acordo com o exemplo 4. HA-MRSA; resistente à meticilina adquirida de hospital S. aureus. CA-MRSA; resistente à meticilina associado à comunidade S. aureus. MIC; concentração inibitória mínima (μg/ml). MBC; concentração bactericida mínima (μg/ml). gama MIC/MBC; mínimo e máximo de MIC/MBC para todos os isolados. MIC/MBC50; MIC/MBC em que 50% dos isolados são inibidos. MIC/MBC90; MIC/MBC em que 90% dos isolados são inibidos; A Figura 20 mostra um gráfico das densidades ópticas do controle de crescimento não suplementado, ampicilina e diferentes concentrações de agente antibacteriano contra NCL812 sensível à meticilina S. aureusATCC 49775 utilizando a metodologia de microdiluição de caldo de acordo com o exemplo 4. As concentrações de NCL812 testadas foram no MIC e quatro vezes o MIC determinado sob condições de teste, até 24 h de incubação. Ampicilina foi testada no MIC. A atividade bactericida foi testada em 0-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12-, e 24 h para antibacterianos; A Figura 21 mostra um gráfico de curvas cinéticas de matança sensível à meticilina S. aureusATCC 49775 demonstrando atividade bactericida de NCL812 utilizando a metodologia de macrodiluição do Clinical and Laboratory Standards Institute em um frasco de 10 ml de acordo com o exemplo 4. As concentrações de agentes antibacterianos foram testadas em 1x e 4x do MIC determinado sob condições de ensaio. A atividade bactericida foi determinada a 0-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12- e 24-h após a adição antibacteriana. A atividade bactericida foi definida como uma redução de 3-log10 (99,9%) no número de bactérias viáveis a partir do tamanho inicial de inoculo; A Figura 22 mostra uma tabela da susceptibilidade antibacteriana de 20 S. pneumoniae isolados para seis antibacterianos diferentes de acordo com o exemplo 5; A Figura 23 mostra um gráfico que indica a alteração de pH durante ensaio de diluição em caldo de macro- S. pneumoniaecepa D39 expostos a 4 μg / ml em NCL812 e 0,0023 μg / ml de ampicilina de acordo com o exemplo 5; A Figura 24 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 48 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL812 de acordo com o exemplo 5; A Figura 25 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 14 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL812 de acordo com o exemplo 5; A Figura 26 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 14 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com ampicilina de acordo com o exemplo 5; A Figura 27 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 12 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL812, adotado a partir da Figura 40 de acordo com o exemplo 5; A Figura 28 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 48 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com ampicilina de acordo com o exemplo 5; A Figura 29 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 48 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com eritromicina de acordo com o exemplo 5; A Figura 30 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 48 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL812 e 5% de cloreto de colina de acordo com o exemplo 5; A Figura 31 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 12 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL812 e 5% de cloreto de colina de acordo com o exemplo 5; A Figura 32 mostra um gráfico que ilustra a concentração relativa bactericida mínima (MBC) de S. pneumoniae cepa D39 tratada com ampicilina durante um período de tempo de 48 horas de acordo com o exemplo 5; A Figura 33 mostra um gráfico que ilustra a relação de MBC para S. pneumoniae cepa D39 tratada com eritromicina ao longo de um período de tempo de 48 horas de acordo com o exemplo 5; A Figura 34 mostra um gráfico que ilustra a contagem de viáveis (log10CFU/ml) de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL812 a partir de uma macro-diluição de caldo de tempo de matança de mais de 24 horas de acordo com o exemplo 5; A Figura 35 mostra um gráfico que ilustra a contagem de viáveis (log10CFU/ml) de S. pneumoniae cepa D39 tratada com ampicilina a partir de uma macro-diluição de caldo de tempo de matança de mais de 24 horas de acordo com o exemplo 5; A Figura 36 é um gráfico de barras que ilustra a espessura da membrana de célula média de tratados e não tratados D39 de acordo com o exemplo 5; A Figura 37 é um gráfico de barras que ilustra a média da largura do espaço periplasmático tratado (16 μg/ml NCL812) e as amostras não tratadas D39 de acordo com o exemplo 5; A Figura 38 é uma tabela que mostra Staphylococcus pseudintermedius isolados testados de acordo com o exemplo 6; A Figura 39 é uma tabela que mostra o perfil de resistência aos antibióticos de Staphylococcus pseudintermedius isolados testados de acordo com o exemplo 6. A Figura 40 é um gráfico que ilustra a eficácia de NCL812 contra E. coli gram-negativa esferoplastos de acordo com o exemplo 7; A Figura 41 é um gráfico que ilustra a libertação cumulativa de NCL812 da Formulação B de acordo com o exemplo 9; A Figura 42 mostra o ensaio da matança cinética de Staphylococcus aureus KC01 em diferentes concentrações de NCL812, até 24 h de incubação de acordo com o exemplo 11; e A Figura 43 mostra o ensaio de matança cinética de Enterococcus faecalis USA01 em diferentes concentrações de NCL812, até 24 h de incubação de acordo com o exemplo 11.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES Geral

[0085] Antes de descrever a presente invenção em detalhe, é para ser entendido que a invenção não é limitada a métodos exemplificados particulares ou composições aqui divulgados. Também deve ser compreendido que a terminologia empregada neste documento é usada com a finalidade de descrever modalidades particulares da invenção apenas e não se destina a ser limitante.

[0086] Todas as publicações aqui referidas, incluindo patentes ou pedidos de patente, são incorporadas por referência na sua totalidade. No entanto, as aplicações que são aqui mencionadas são referidas simplesmente com a finalidade de descrever e revelar os procedimentos, protocolos e reagentes referidos na publicação que podem ter sidos usados em ligação com a invenção. A citação de qualquer publicação aqui referida não é para ser interpretada como uma admissão de que a invenção não está autorizada a antecipar esta revelação por virtude de invenção anterior.

[0087] Além disso, a realização da presente invenção faz uso de, a menos que indicado de outro modo, técnicas microbiológicas convencionais dentro da técnica. Tais técnicas convencionais são conhecidas pela pessoa versada na técnica.

[0088] Tal como aqui usado, e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "o", "a" incluem o plural a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0089] Salvo indicado em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados como comumente compreendido por um indivíduo versado na técnica à qual pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes, ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados para realizar a presente invenção, os materiais e métodos preferidos são aqui descritos.

[0090] A invenção aqui descrita pode incluir uma ou mais gamas de valores (por exemplo, tamanho, concentração, etc.) de dose. Uma gama de valores será entendida como incluindo todos os valores dentro da gama, incluindo os valores que definem a gama de valores, e adjacentes à gama que conduzam à mesma ou substancialmente o mesmo resultado que os valores imediatamente adjacentes a esse valor que definem o limite da gama.

[0091] O produto farmacêutico para as composições veterinárias da presente invenção pode ser administrado numa variedade de dosagens unitárias dependendo do método de administração, local alvo, estado fisiológico do paciente, e outros medicamentos administrados. Por exemplo, a forma de dosagem unitária adequada para administração oral inclui formas sólidas de dosagem, tais como pós, comprimidos, pílulas e cápsulas, e formas de dosagem líquidas, tais como elixires, xaropes, soluções e suspensões. Os ingredientes ativos podem também ser administrados parentericamente em formas de dosagem líquidas estéreis. As cápsulas de gelatina podem conter o ingrediente ativo e ingredientes inativos, tais como portadores em pó, glicose, lactose, sacarose, manitol, amido, celulose ou derivados de celulose, estearato de magnésio, ácido esteárico, sacarina de sódio, talco, carbonato de magnésio, e semelhantes.

[0092] A frase "quantidade terapeuticamente eficaz" como aqui utilizado refere-se a uma quantidade suficiente para inibir o crescimento bacteriano associado a uma infecção bacteriana ou colonização. Isto é, a referência à administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de robenidina de acordo com os métodos ou composições da presente invenção refere-se a um efeito terapêutico em que a atividade bactericida ou bacteriostática substancial provoca uma inibição substancial de infecção bacteriana. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", tal como aqui utilizado, refere-se a uma quantidade suficiente da composição para fornecer o resultado biológico, terapêutico e/ou profiláctico desejado. Os resultados desejados incluem a eliminação da infecção bacteriana ou colonização ou redução e/ou alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doença, ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Uma quantidade eficaz, em qualquer caso individual pode ser determinada por um versado na técnica utilizando a experimentação de rotina. Em relação a uma composição farmacêutica ou veterinária, as quantidades eficazes podem ser dosagens que são recomendadas na modulação de um estado de doença ou dos seus sintomas ou sinais. As quantidades eficazes variam dependendo da composição usada e da via de administração utilizada. As quantidades eficazes são rotineiramente otimizadas em consideração das características farmacocinéticas e farmacodinâmicas, bem como vários fatores de um determinado paciente, como idade, peso, sexo, etc e da área afetada pela doença ou doença causando micróbios.

[0093] Como aqui referido, os termos "tratamento" ou "tratar" referem-se à remoção total ou parcial dos sintomas e sinais da doença. Por exemplo, no tratamento de uma infecção bacteriana ou da colonização, o tratamento remove completamente ou parcialmente os sinais da infecção. De preferência, no tratamento de infecção, o tratamento reduz ou elimina o agente patogênico bacteriano infectante levando a cura microbiana.

[0094] Como aqui referido, o termo "bactérias"refere-se a membros de um grande domínio de microrganismos procarióticos. Normalmente alguns micrômetros de comprimento, as bactérias têm um número de formas, variando de esferas de hastes e espirais e podem estar presentes como células individuais ou presente em cadeias lineares ou grupos de números e forma variáveis. De preferência, os termos "bactérias"e seu adjetivo "bacteriano" referem-se às bactérias como Staphylococcus spp, Streptocccus spp, Bacilo spp, Enterococcus spp, Listeria spp, Mycoplasma spp e bactérias anaeróbias Gram positivas; Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp e Pseudomonas spp Gram positivas; e as bactérias livres da parede celular, tais como Mycoplasma spp e Ureaplasma spp. Os termos podem se referir a uma cepa sensível ao antibiótico ou uma cepa resistente aos antibióticos. Numa modalidade preferida, os termos referem-se a MRSA ou MRSP. Numa outra modalidade preferida, os termos referem-se a MDR Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Enterococcus spp, Clostridium difficile, Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp e Pseudomonas spp.

[0095] Aqui referido, o termo "bactérias resistentes a meticilina" (tais como resistentes à meticilina Staphylococcus) refere-se ao isolado de bactéria que demonstra a resistência a qualquer dose para todos os β lactamas, incluindo penicilinas, carbapenemos e em primeiro lugar às cefalosporinas de quarta geração, mas não para as cefalosporinas de quinta geração de anti-MRSA (por exemplo ceftarolina). Multi-resistente (MDR) é definida como não susceptibilidade adquirida para pelo menos um agente em três ou mais categorias antimicrobianas, extensivamente resistentes a drogas (XDR) é definida como não- susceptibilidade a, pelo menos, um agente em todos, mas dois ou menos categorias antimicrobianas (isto é, isolados bacterianos permanecem susceptíveis a apenas uma ou duas categorias) e pandroga-resistente (PDR) é definida como não susceptibilidade a todos os agentes em todas as categorias antimicrobianas atualmente disponíveis.

[0096] Um exemplo de suscetíveis, MDR, XDR e PDR bactérias inclui o seguinte. Tipo selvagem, isolados não impressionados antibacterianos de Staphylococcus aureus que são prováveis de ser suscetível a todas as seguintes categorias antibacterianas (e agentes): aminoglicosídeos (por exemplo, gentamicina); ansamicinas (por exemplo, rifampicina); cefalosporinas de anti- MRSA (por exemplo, ceftarolina); anti-estafilocócicas β-lactamas (ou cefalosporinas) (por exemplo oxacilina ou cefoxitina); carbapenemas (por exemplo ertapenem, imipenem, meropenem ou doripenem); cefalosporinas de espectro não estendido cefalosporinas de 1ae 2ageração (por exemplo, cefazolina ou cefuroxima); cefalosporinas de espectro estendido; cefalosporinas de 3a e 4a geração (por exemplo, cefotaxima ou ceftriaxona); cefalosporinas (por exemplo cefoxitina ou cefotetano); fluoroquinolonas (por exemplo, ciprofloxacina ou moxifloxacina); inibidores de caminho de folato (por exemplo o trimetoprim- sulfametoxazol); fucidanos (por exemplo o ácido fusídico); glicopeptídeos (por exemplo, vancomicina, teicoplanina ou telavancina); glicilciclinas (por exemplo tigeciclina); lincosamidas (clindamicina, por exemplo); lipopeptídeos (por exemplo daptomicina); macrólidos (eritromicina, por exemplo); oxazolidinonas (por exemplo, linezolida ou tedizolida); fenicóis (por exemplo cloranfenicol); ácidos fosfônicos (por exemplo fosfomicina); estreptograminas (por exemplo quinupristina-dalfopristina; e tetraciclinas (por exemplo, tetraciclina, doxiciclina ou minociclina). Os isolados que não são susceptíveis a mais do que um agente em mais de três categorias antimicrobianas são classificadas como MDR (todos os MRSA, por exemplo, satisfazem a definição de MDR). Os isolados que não são suscetíveis a mais de um agente em todos, menos uma ou duas categorias antimicrobianas, são classificados como XDR. Os isolados que não são sensíveis a todos os agentes antibacterianos listados são de PDR.

[0097] Sais farmaceuticamente e veterinariamente aceitáveis incluem sais que retêm a eficácia biológica e as propriedades dos compostos da presente invenção e que não são biologicamente ou de outro modo indesejáveis. Em muitos casos, os compostos aqui descritos são capazes de formar sais ácidos e/ou básicos em virtude da presença de grupos amino e/ou carboxilo ou grupos similares a isso. Sais de adição de base aceitáveis podem ser preparados a partir de bases orgânicas e inorgânicas. Sais derivados de bases inorgânicas incluem, a título de exemplo, sais de sódio, potássio, lítio, amônia, cálcio e magnésio. Sais derivados de bases orgânicas incluem, mas não limitados a, sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, tais como, a título de exemplo apenas, aminas alquil, aminas dialquil, aminas trialquil, aminas alquil substituídas, aminas de di(alquil substituídas), aminas de tri(alquil substituídas), alceno aminas, aminas dialcenil, aminas trialcenil, alceno aminas substituídas, aminas de di(alcenil substituídas), aminas tri(alcenil substituídas) , aminas cicloalquilo, aminas de di(cicloalquilo), aminas de tri(cicloalquilo), aminas de cicloalquilo substituídas, aminas de cicloalquilo disubstituídas, aminas de cicloalquilo trisubstituídas, aminas cicloalcenil, aminas di(cicloalcenil), aminas tri(cicloalcenil), aminas cicloalcenil substituídas, aminas cicloalcenil disubstituídas, aminas cicloalcenil trisubstituídas, aminas aril, aminas diaril, aminas triaril, aminas heteroaril, aminas diheteroaril, aminas triheteroaril, aminas heterocíclicos, aminas diheterocíclicos, aminas triheterocíclicos, misturas de di - e tri-aminas onde pelo menos dois dos substituintes na amina são diferentes e são selecionados a partir do grupo composto de alquil , alquil substituído, alceno, alceno substituído, cicloalquilo, cicloalquilo substituído, cicloalcenil, cicloalcenil substituído, aril, heteroaril, heterocíclicos e afins. Estão também incluídas aminas onde dois ou três substituintes, juntamente com o nitrogênio amino, formam um grupo heterocíclicos ou heteroaril.

[0098] Sais de adição de ácido farmaceuticamente e veterinariamente aceitáveis podem ser preparados a partir de ácidos orgânicos e inorgânicos. Os ácidos inorgânicos que podem ser utilizados incluem, a título de exemplo apenas, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e outros semelhantes. Os ácidos orgânicos que podem ser utilizados incluem, a título de exemplo apenas, o ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, etanossulfónico ácido, ácido p-tolueno-sulfônico, ácido salicílico e afins.

[0099] Os sais farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis ou dos compostos úteis na presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto de origem, que contém uma fração básica ou ácida, por métodos químicos convencionais. Geralmente, tais sais podem ser preparados reagindo as formas livres de ácido ou base destes compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido apropriado em água ou em um solvente orgânico ou uma mistura dos dois; geralmente, meios não aquosos tais como o éter, acetato de etila, etanol, isopropanol ou acetonitrilo são preferidos. Listas de sais adequados são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences. 17a Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985), p. 1418, cuja divulgação é deste modo incorporada por referência. Exemplos de tais sais aceitáveis são o iodeto, acetato, acetato de fenil trifluoroacetato, acrilato, ascorbato, benzoato, clorobenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxbenzoato, metilbenzoato, o-acetoxibenzoato, naftaleno-2-benzoato, brometo, isobutirato, fenilbutirato, Y— hidroxibutirato, β-hidroxibutirato, butino-l,4-dioato, hexine-l,4-dioato, hexine-1,6- dioato, caproato, caprilato, cloreto, cinamato, citrato, decanoato, formiato, fumarato, glicolato, heptanoato, hipurato, lactato, malato, maleato, hidroximaleato, malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, isonicotinato, nitrato, oxalato, fitalato, tereftalato, fosfato, monohidrogenfosfato, dihidrogeniofosfato, metafosfato, pirofosfato, propiolato, propionato, fenilpropionato, salicilato, sebacato, sucinato, suberato, sulfato, bissulfato, pirossulfato, sulfito, bissulfito, sulfonato, benzenossulfonato, p-bromofenilsulfonato, clorobenzenossulfonato, propanossulfonato, etanossulfonato, 2-hidroxi-etanossulfonato, metanossulfonato, naftaleno-I-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, p-toluenossulfonato, xilenossulfonato, tartarato e afins.

[00100] As composições farmacêuticas ou veterinárias da presente invenção podem ser formuladas de um modo convencional, em conjunto com outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis, se desejado, em formas adequadas para administração oral, parentérica, ou tópica. Os modos de administração parentérica podem incluir, por exemplo, injeção intramuscular, administração subcutânea e intravenosa, administração oral, administração tópica e administração direta aos sítios da infeção, tais como intraocular, intra-aural, intrauterina, nasal, intramamária, intraperitoneal e intralesional.

[00101] As composições farmacêuticas ou veterinárias da presente invenção podem ser formuladas para administração oral. Ingredientes inativos tradicionais podem ser adicionados para fornecer a cor desejável, paladar, estabilidade, capacidade de tampão, dispersão ou outras características desejáveis conhecidas. Exemplos incluem óxido de ferro vermelho, gel de sílica, sulfato de laurel de sódio, dióxido de titânio, tinta branca comestível e semelhantes. Diluentes convencionais podem ser utilizados para fazer comprimidos prensados. Tanto os comprimidos quanto as cápsulas podem ser fabricados na forma de composições de libertação prolongada para a libertação contínua de medicação durante um período de tempo. Os comprimidos prensados podem estar na forma de comprimidos revestidos com açúcar ou revestidos com uma película, ou comprimidos com revestimento entérico para desintegração seletiva no trato gastrointestinal. As formas de dosagem líquidas para administração oral podem conter corantes e/ou aromatizantes para aumentar a aceitação do paciente. Como um exemplo, a formulação oral que compreende NCL812 pode ser um comprimido que compreende qualquer um, ou uma combinação dos seguintes excipientes: hidrogenofosfato de cálcio di-hidratado, celulose microcristalina, lactose, celulose metil hidroxipropil, e talco.

[00102] As composições aqui descritas podem estar na forma de uma formulação líquida. Exemplos de composições líquidas preferidas incluem soluções, emulsões, soluções para injeção, soluções contidas em cápsulas. A formulação líquida pode compreender uma solução que inclui um agente terapêutico dissolvido num solvente. De um modo geral, qualquer solvente que tenha o efeito desejado pode ser usado em que o agente terapêutico dissolve-se e que possa ser administrada a um indivíduo. Geralmente, qualquer concentração de agente terapêutico que tem o efeito desejado pode ser usado. A formulação em algumas variações é uma solução que é insaturada, saturada ou uma solução supersaturada. O solvente pode ser um solvente puro ou pode ser uma mistura de componentes de solvente líquido. Em algumas variações a solução formada é uma formulação de gelificação in situ. Os solventes e os tipos de soluções que podem ser utilizadas são bem conhecidas para aqueles versados em tecnologias de administração de drogas.

[00103] A composição aqui descrita pode ser na forma de uma suspensão líquida. As suspensões líquidas podem ser preparadas de acordo com procedimentos padrão conhecidos na técnica. Exemplos de suspensões líquidas incluem micro-emulsões, a formação de compostos complexantes, estabilizadores e suspensões. A suspensão líquida pode estar na forma não diluída ou concentrada. As suspensões líquidas para uso oral podem conter conservantes apropriados, antioxidantes, e outros excipientes conhecidos na técnica funcionamento como um ou mais dos agentes de dispersão, agentes de suspensão, agentes espessantes, agentes emulsionantes, agentes molhantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes aromatizantes e edulcorantes, agentes corantes, e semelhantes. A suspensão líquida pode conter glicerol e água.

[00104] A composição aqui descrita pode ser na forma de uma pasta oral. A pasta oral pode ser preparada de acordo com procedimentos padrão conhecidos na técnica.

[00105] A composição é aqui descrita pode ser na forma de uma formulação líquida injetável, tal como a injeção intra-muscular, e preparada utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a formulação líquida pode conter polivinilpirrolidona K30 e água.

[00106] A composição é aqui descrita pode ser na forma de preparações tópicas. A preparação tópica pode ser na forma de uma loção ou um creme, preparado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma loção pode ser formulada com uma base aquosa ou oleosa e pode incluir um ou mais excipientes conhecidos na técnica, funcionando como intensificadores de viscosidade, agentes emulsionantes, fragrâncias ou perfumes, agentes conservantes, agentes quelantes, modificadores de pH, antioxidantes, e semelhantes. Por exemplo, a formulação tópica compreendendo NCL812 pode ser um gel que compreende qualquer um, ou uma combinação dos seguintes excipientes: PEG 4000, PEG 200, glicerol, propileno glicol. O composto NCL812 pode ainda ser formulado numa dispersão sólida utilizando Soluplus® (BASF, www.soluplys.com) e formulado com qualquer um, ou uma combinação dos seguintes excipientes: PEG 4000, PEG 200, glicerol, propileno glicol.

[00107] Para administração em aerossol, a composição é da invenção, e que seja fornecida em forma finamente dividida juntamente com um tensioactivo não tóxico e um propulsor. O agente tensioactivo é de preferência solúvel no propulsor. Tais agentes tensioactivos podem incluir ésteres ou ésteres parciais de ácidos graxos.

[00108] As composições da invenção podem, alternativamente, ser formuladas usando técnicas de administração de fármacos de nanotecnologia, tais como aqueles conhecidos na técnica. Sistemas de administração de fármacos à base de nanotecnologia tem a vantagem de melhorar a biodisponibilidade, a adesão do paciente e reduzindo os efeitos colaterais.

[00109] A formulação da composição da invenção inclui a preparação de nanopartículas sob a forma de nanossuspensões ou nano-emulsões, com base na solubilidade do composto. Nanossuspensões são dispersões de partículas de droga nanométricos preparados pela tecnologia de bottom-up ou top-down e estabilizados com excipientes adequados. Esta abordagem pode ser aplicada a robenidina que tem uma fraca solubilidade aquosa e lipídica, a fim de melhorar a saturação de solubilidade e melhorar as características de dissolução. Um exemplo desta técnica é estabelecido no Sharma e Garg (2010) (fármaco puro e nanotecnologia à base de polímero para a melhor solubilidade, estabilidade, biodisponibilidade e direcionamento de drogas anti-HIV. Advanced Drug Delivery Reviews, 62: p. 491-502). Saturação solubilidade será entendido como sendo uma constante de composto específico que depende da temperatura, das propriedades do meio de dissolução, e de tamanho de partícula (<1-2 μm).

[00110] A composição da invenção pode ser fornecida sob a forma de uma nanossuspensão. Para nanossuspensões, o aumento da área da superfície pode conduzir a um aumento na solubilidade de saturação. Nanossuspensões são sistemas de administração de fármacos coloidais, que consiste em partículas inferior a 1 μm. As composições da invenção podem estar na forma de suspensões, incluindo nanossuspensões nanocristalinas, nanopartículas de lípidos sólidos (SLNs), nanopartículas poliméricas, nanocápsulas, micelas poliméricas e dendrímeros. Nanossuspensões podem ser preparadas usando uma abordagem de top-down, onde as partículas maiores podem ser reduzidas a dimensões nanométricas por uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo moagem úmida e homogeneização de alta pressão. Alternativamente, nanossuspensões podem ser preparadas utilizando uma técnica de bottom-up, quando a precipitação controlada de partículas pode ser realizada a partir da solução.

[00111] A composição da invenção pode ser fornecida sob a forma de uma nano-emulsão. Nano-emulsões são tipicamente sistemas bifásicos claros de óleo- em-água ou água-em-óleo, com um tamanho de gotícula na gama de 100-500 nm, e com compostos de interesse presente na fase hidrófoba. A preparação de nano-emulsões pode melhorar a solubilidade de robenidina aqui descrito, que conduz a uma melhor biodisponibilidade. Suspensões nanométricas podem incluir agentes de estabilização estérica ou eletrostática, tais como polímeros e surfactantes. As composições sob a forma de SLNs podem compreender lípidos biodegradáveis, tais como os triglicéridos, os esteróides, as ceras e emulsionantes, tais como lecitina de soja, lecitina de ovo, e poloxâmeros. A preparação de uma preparação SLN pode envolver a dissolução/dispersão de drogas em lípidos derretidos seguido de homogeneização quente ou frio. Se homogeneização quente for usada, a fase lipídica fundida pode ser dispersa numa fase aquosa e uma emulsão preparada. Isto pode ser solidificado por arrefecimento para conseguir SLNs. Se homogeneização fria for usada, a fase lipídica pode ser solidificada em nitrogênio líquido e moído para o tamanho mícron. O pó resultante pode ser submetido à homogeneização de alta pressão numa solução aquosa de surfactante.

[00112] Robenidina como aqui descrita pode ser dissolvida em óleos/lípidos líquidos e estabilizada numa formulação de emulsão. Nano- emulsões podem ser preparadas usando técnicas de redução de gotícula de alta e baixa energia. Métodos de alta energia podem incluir homogeneização de alta pressão, ultra-som e microfluidização. Se o método de baixa energia for usado, a difusão de solvente e de inversão de fase irá gerar uma nano-emulsão espontânea. Os lípidos utilizados nas nano-emulsões podem ser selecionados a partir do grupo compreendendo triglicéridos, óleo de soja, óleo de açafroa, e óleo de sésamo. Outros componentes, tais como emulsionantes, antioxidantes, modificadores de pH e conservantes podem também ser adicionados.

[00113] A composição pode estar na forma de uma formulação de libertação controlada, pode incluir um polímero degradável ou não-degradável, hidrogel, organogel, ou outra construção física que modifica a libertação do ionóforo de poliéter. Entende-se que tais formulações podem incluir ingredientes inativos adicionais que são adicionados para fornecer a cor desejável, estabilidade, capacidade de tampão, dispersão ou outras características desejáveis conhecidas. Tais formulações podem ainda incluir lipossomas, tais como emulsões, espumas, micelas, monocamadas insolúveis, cristais líquidos, dispersões fosfolipídicas, camadas lamelares e semelhantes. Os lipossomas para utilização na invenção podem ser formados a partir de lípidos que formam vesículas padrão, incluindo geralmente fosfolípidos neutros e negativamente carregados e um esterol, tal como colesterol.

[00114] As formulações da invenção podem ter a vantagem de solubilidade aumentada e/ou a estabilidade de NCL812, particularmente para as formulações preparadas utilizando técnicas de nanotecnologia. Este aumento da estabilidade e/ou a estabilidade de NCL812 pode melhorar a biodisponibilidade da droga e aumentar a exposição para formas de dosagem oral e/ou parentérica.

[00115] Em toda esta especificação, salvo indicação em contrário, a palavra "compreende", ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo"serão entendidas para implicar a inclusão de um número inteiro declarado ou grupos de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.EXEMPLOSEXEMPLO 1: As concentrações inibitórias mínimas (MIC) para NCL812 em Staphylococcus aureus (MRSA)resistente à meticilina, Enterococcus spp. resistente à vancomicina. (VRE) e Streptococcus pneumoniae.

[00116] Neste exemplo e nos outros exemplos da especificação, o termo NCL812 é usado para indicar robenidina.

[00117] Este estudo foi realizado para determinar as concentrações inibitórias mínimas (MIC) para um novo agente antibacteriano, NCL812. O agente antibacteriano representa um potencial de nova classe de drogas, com um espectro estreito percebido de atividade contra bactérias e um novo mecanismo de ação. Este estudo incidiu sobre os isolados recentes de três principais patógenos oportunistas de seres humanos onde o desenvolvimento da resistência antibacteriana a classes antibacterianas existentes é problemática: Staphylococcus aureus (MRSA)resistente à meticilina, Enterococcus spp. resistente à vancomicina. (VRE) e Streptococcus pneumoniae.

Materiais e Métodos Coleta e Identificação do Isolado Bacteriano

[00118] Sessenta e um isolados de teste foram provenientes de laboratórios de microbiologia de diagnóstico clínico. Os isolados de MRSA foram originalmente cultivados em Brilliance MRSA Chromogenic Agar (Oxoid) seletivo. Colônias suspeitas foram selecionadas com base na sua aparência de colônias em agar e esta identificação quanto Staphylococcus aureus foi determinada utilizando características de colônias em ágar de sangue de carneiro não seletivo e características fenotípicas, como a coloração de Gram, teste de catalase positiva, teste de coagulase positiva (teste da coagulase em tubo utilizando plasma de coelho) e fator de aglutinação (aglutinação com o teste de látex de Oxoid Staphytect), teste de Voges Proskauer positivo, e a capacidade de produzir ácido a partir de trealose. Uma tela de resistência à cefoxitina positiva confirmou os isolados como MRSA. Todos os isolados de Enterococcus foram submetidos a um padrão de identificação bioquímica. A perfilagem bioquímica provisoriamente identificou quatro dos isolados de VRE como Enterococcus faecalis e o restante na forma de Enterococcus faecium, no entanto isto não é 100% de confiança para seres humanos, cepas de Enterococcus e a perfilagem bioquímica completa usando a perfilagem de API-ZYM serão realizados para confirmar a identidade de 100%. Todos os isolados de Str. pneumoniae foram identificados com base nos perfis bioquímicos padrão.

Preparação de Agentes Antimicrobianos

[00119] Grau analítico de NCL812 (lote 20081214), com uma potência definida de 1000 mg/g (isto é, 100%) foi obtida. O pó foi armazenado a uma temperatura de -20°C no local do estudo, num congelador trancado. Alíquotas (1 ml) da solução de caldo (25,6 mg/ml) foram preparadas em DMSO e armazenadas a -80°C e descongeladas imediatamente antes da utilização.

Ensaio de Concentração Inibitória Mínima

[00120] Testes de concentração inibitória mínima foram realizados de acordo com as Normas CLSI (CLSI 2008). 90 μL de uma das soluções de composto de teste, ou a ampicilina, foi adicionado à coluna final de uma placa de 96 poços que continha 90 μL de CAMHB em cada poço. As soluções foram então diluídas em série ao longo da linha, deixando 2 colunas para controles positivos e negativos. A suspensão bacteriana foi preparada pela adição de colônias frescas obtidas a partir de uma cultura durante a noite em Agar de Sangue de Ovelha (SBA) para uma solução salina de 9,1 g/L. Essa suspensão foi ajustada a uma concentração dentre 4 x 108 e 5 x 108 CFU/mL. A concentração da suspensão foi determinada medindo a densidade óptica (OD) usando um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 600 nm, em que a concentração correta foi determinada para ter uma densidade óptica de entre 1,00 e 1,20. Um mililitro dessa suspensão foi adicionado a 9 ml de solução salina antes de ser adicionado a todos os poços, exceto os poços de controle negativo, em 10 μL de volume rendendo uma concentração final entre 4 x 105 e 5 x 105 CFU/mL em cada poço. Os testes foram, então, incubados durante 24 horas a 37 °C e, em seguida, avaliados tanto visualmente e com uso de leituras de OD a partir de um leitor de microplaca em um comprimento de onda de 600 nm. Esses testes foram realizados em duplicata, mas repetido caso fossem observadas discrepâncias.

[00121] A concentração inibitória mínima (MIC) foi determinada como sendo a concentração mais baixa de antibiótico que impediu o crescimento de bactérias, tanto visualmente e com uso de leituras de OD. As comparações estatísticas diretas entre os compostos de teste e ampicilina não podem ser realizada à luz das restrições de informações confidenciais, tais como restrições na divulgação de informações relacionadas à estrutura do composto, tais como peso molecular. Em vez disso, os valores de MIC foram sintetizados e usados para determinar a menor concentração de cada composto que foi eficaz contra 50% e 90% dos isolados, referidos como MIC50 e MIC90, respectivamente. Esses valores, assim como a faixa de valores de MIC, em seguida, foram utilizados para comparações diretas entre os compostos de ensaio e para as comparações gerais com ampicilina.

Resultados

[00122] Os valores de MIC de ampicilina obtidos para as cepas de controle de ATCC estavam dentro da faixa normal esperada na base das recomendações do CLSI. Os valores de NCL812 e MIC de ampicilina para cada isolado são indicados na Figura 1 (isolados de MRSA), Figura 2 (isolados de VRE) e Figura 3 (isolados de Str. pneumoniae).

[00123] A moda de MIC50, MIC90, MIC em pool e a faixa de MIC para NCL812 para cada uma das espécies de bactérias testadas são apresentados na Figura 4.

[00124] Os valores de MIC de NCL812 foram notavelmente consistentes dentro e entre cada uma das três espécies. Os valores de CIM50 e CIM90 foram ambos iguais (4 μg/ml) para os isolados de MRSA, VRE e Str. pneumoniae, com menos de 10% dos isolados demonstrando valores de MIC tanto de 1-2 diluições abaixo ou apenas uma diluição acima desse valor.EXEMPLO 2: Efeito de NCL812 em Síntese Macromolecular de Staphylococcus aureus

Materiais e Métodos Composto de Teste

[00125] O composto de teste NCL812 foi transportado para a instalação experimental sob condições de temperatura ambiente e, em seguida, armazenado de 2 - 8 °C até serem ensaiados. As soluções stock foram preparadas por dissolução de pó seco NCL812 em 100% de DMSO a uma concentração de 6.400 μg/ml.

Teste de Concentração Inibitória Mínima

[00126] O método de ensaio de MIC seguido pelo procedimento descrito através de Clinical and Laboratory Standards Institute ou CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard—Eighth Edition. Documento CLSI M07-A8 [ISBN 1-56238-689-1]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Estrada, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19.087-19898, EUA, 2009), e empregou manipuladores de líquido automatizados para realizar diluições em série e transferências líquidas. O meio empregado para o ensaio de MIC foi Mueller Hinton II Broth (MHB II- Becton Dickinson, Sparks, MD; n°Cat 212322; Lot 9044411). S. aureus ATCC 29213 serviu como cepas de controle de qualidade, e linezolida foi utilizada como antibiótico de controle de qualidade para validar o ensaio. NCL812 e linezolida foram ambos dissolvidos em 100% de DMSO antes da adição ao meio de crescimento.

Ensaios de Síntese Macromolecular As condições de bactéria e de crescimento

[00127] O efeito de NCL812 em DNA de célula total, RNA, parede celular, proteína e síntese de lipídio foi investigada usando S. aureus ATCC 29213. As células foram cultivadas a 35 °C durante a noite em ágar de soja tripticase. Uma colônia da placa foi usada para inocular 10 ml de Mueller Hinton II (MHBII), e a cultura foi cultivada para o fase de crescimento exponencial prematuramente (OD600 = 0,2 a 0,3) enquanto incubada num agitador a 35 °C e 200 rpm.

DNA, RNA e a síntese de proteína

[00128] Quando as células atingiram fase exponencial precocemente, a 100 μl da cultura foi adicionada a poços em triplicado contendo várias concentrações do composto de teste ou dos antibióticos controle (5 μl) a 20X a concentração final em 100% de DMSO. Uma cultura tratada com 5% de DMSO tratada serviu como controle "sem fármaco" para todas as experiências. As células foram adicionadas em MHBII a 105% para compensar o volume de fármaco adicionado a cada reação ou em meio mínimo M9 para reações de síntese de proteína. Após 15 min de incubação à temperatura ambiente, ou [3H] timidina (síntese de DNA), [3H] uridina (síntese do RNA) ou [3H] leucina (síntese de proteína) foi adicionada a 0,5-1,0 μCi por reação, dependendo da experiência. As reações foram deixadas prosseguir à temperatura ambiente durante 15-30 minutos e em seguida interrompidas pela adição de 12 μl de 5% de ácido tricloroacético frio (TCA) ou 5% de ácidos TCA/2% de ácidos de casamino (síntese de proteína única). As reações foram incubadas em gelo durante 30 min e o material precipitado de TCA foi coletado em um filtro de 25 mm GF/A. Depois de se lavar três vezes com 5 ml de 5% de TCA a frio, os filtros foram lavados duas vezes com 5 ml de 100% de etanol, deixados secar, e, em seguida, contados utilizando um contador de cintilação líquida Beckman LS3801.

Síntese da parede celular

[00129] As células bacterianas em fase de crescimento exponencial precocemente foram transferidas para meio mínimo M9 e adicionadas a tubos de 1,5 ml de Eppendorf (100 μl/tubo) contendo várias concentrações do composto de teste ou dos antibióticos controle (5 μl) em 20X a concentração final em 100% de DMSO conforme acima. Seguindo uma incubação de 5 min a 37 °C, [14C]N- acetilglucosamina (0,4 μCi/reação) foi adicionada a cada tubo e incubada durante 45 min num bloco de aquecimento de 37 °C. As reações foram interrompidas através da adição de 100 μl de 8% de SDS a cada tubo. As reações foram, então, aquecidas a 95 °C durante 30 min num bloco de aquecimento, resfriadas, centrifugadas brevemente, e manchadas em filtros de HA pré-umedecidos (0,45 μM). Depois de se lavar três vezes com 5 ml de 0,1% de SDS, os filtros foram lavados duas vezes com 5 ml de água deionizada, deixados secar, e, em seguida, contados utilizando um contador de cintilação líquida Beckman LS3801.

Síntese de lipídeo

[00130] Bacterial células foram cultivadas até à fase de crescimento exponencial precoce em caldo MHBII e adicionou-se 1,5 mL (Eppendorf tubos em triplicado) contendo várias concentrações de antibióticos do composto de teste ou de controlo, conforme descrito acima. Após a 5 min. de incubação à temperatura ambiente, [3H]glicerol foi adicionado a 0,5 μCi por reação.

[00131] As reações foram deixadas prosseguir à temperatura ambiente durante 15 min e, em seguida, interrompida pela adição de 375 μl de clorofórmio/metanol (1:2), seguido pela rotação durante 20 segundos após cada adição. Clorofórmio (125 μl) foi, então, adicionado a cada reação, submetido a vórtice, seguido pela adição de 125 μl de dH2O e agitação em vórtice. As reações foram centrifugadas a 13.000 rpm durante 10 min e, em seguida, 150 μl da fase orgânica foi transferida para um frasco de cintilação e deixada secar numa coifa por, pelo menos, 1 h. As amostras foram, então, contadas através de contagem de cintilação líquida.

Resultados

[00132] Teste de sensibilidade foi realizado com NCL812 e S. aureus ATCC 29213 para determinar a concentração de fármaco necessária nos ensaios de síntese macromolecular.

[00133] Figura 5 mostra que a MIC para NCL812 era 4 μg/mL, enquanto o agente de controle de qualidade linezolida dentro do alcance do controle de qualidade estabelecido pela CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Nineteenth Informational Supplement. Documento CLSI M100-S20 [ISBN 1-56238-716-2]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, EUA, 2010). Precipitação de NCL812 foi observada a >8 μg/mL em placas que foram preparados de um modo idêntico, mas não receberam um inoculo de S. aureus. Estudos de inibição de síntese macromolecular foram realizadas utilizando concentrações de NCL812 que foram equivalentes a 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 ou 8 vezes o valor de MIC (4 μg/ml) para S. aureus ATCC 29213 (Figuras 6-11).

[00134] Figura 6 mostra o efeito da NCL812 na síntese do DNA. NCL812 não demonstrou nenhuma inibição em 0,25 vezes MIC, 40% de inibição em 0,5 vezes, e aproximadamente 95% de inibição em MIC. Isso é comparado à ciprofloxacina de controle que mostrou aproximadamente 51% em 8 vezes MIC (0,5 μg/mL).

[00135] Os resultados para a inibição de NCL812 da síntese de RNA foram muito semelhantes ao estudo de síntese de DNA, com rifampicina servindo como o controle positivo (Figura 7). Deve se observar que a precipitação foi observada em 4 a 8 vezes MIC no caldo de Mueller Hinton II utilizado nos ensaios de síntese DNA e RNA.

[00136] A síntese da proteína foi inibida de uma maneira dependente da dose em 0,25, 0,5, e 1 vezes o valor de MIC de NCL812 mostrando até 97% de inibição na MIC (Figura 8). A linezolida demonstraram cerca de 61% de inibição da síntese de proteínas em 8 vezes o MIC (2 μg/mL). Precipitação de NCL812 ocorreu em 4 e 8 vezes o MIC no ensaio de síntese de proteína.

[00137] Na Figura 9, NCL812 também mostrou uma certa inibição dependente da dose da síntese da parede celular, embora houvesse um grande aumento na inibição de 1 a 2 vezes a MIC. No entanto, a inibição caiu para aproximadamente 68% e 52% em quatro vezes e oito vezes a MIC, respectivamente. A precipitação de NCL812 ocorreu em 2, 4, e 8-vezes a MIC no meio mínimo M9 utilizado para o ensaio de síntese da parede celular, e que é a causa mais provável da diminuição da inibição. Em comparação, a vancomicina de controle positivo mostrou 96% de inibição em 8 vezes a MIC (2 μg/ml).

[00138] NCL812 demonstrou um perfil de inibição similar contra a síntese lipídica conforme mostrado para a síntese de DNA e RNA, chegando aproximadamente a 90% de inibição a MIC (Figura 10). A cerulenina inibidora de controle positivo demonstrou 72% de inibição em 8 vezes a MIC (32 μg/ml).

[00139] Figura 11 representa um composto de todas as cinco reações de síntese macromolecular. Pode ser observado que as curvas de inibição foram similares para cada uma das vias, o que sugere uma inibição global das diversas vias simultaneamente por NCL812. É possível que NCL812 alveje a membrana celular, causando fuga de íons essenciais e/ou metabolitos, conduzindo, desse modo, a um desligamento global das vias de síntese celular.

[00140] Em resumo, NCL812 inibiu DNA, RNA, proteínas, parede celular, e vias de lipídios numa cultura em crescimento de S. aureus. Embora algumas instâncias da inibição dependente de dose das vias tenham sido observadas, todas as cinco reações de síntese macromoleculares foram similarmente sensíveis à NCL812.EXEMPLO 3:Efeito do NCL812 na Liberação de ATP a partir de Staphylococcus aureus

Materiais e Métodos Composto de Teste

[00141] O composto de teste NCL812 foi transportado sob condições de temperatura ambiente e, em seguida, armazenado de 2 - 8 °C até serem ensaiados. As soluções stock foram preparadas por dissolução de pó seco NCL812 em 100% de DMSO a uma concentração de 1.600 μg/ml. O agente comparador foi polimixina B (Sigma, P-4932 (Lot 044K11905)).

Organismo de teste

[00142] S. aureus ATCC 29213 foi originalmente adquirido junto à American Type Culture Collection (Manassas, VA).

Ensaio de Liberação de ATP

[00143] O ensaio CellTiter-Glo Luminescent Cell Viabilidade Assay (Promega) foi utilizado para medir o fuga de ATP das bactérias. As culturas foram cultivadas até à fase exponencial precocemente (0,2 - 0,3 unidades de densidade óptica em 600 nm) de Mueller-Hinton II e, em seguida, tratadas com sete concentrações diferentes de qualquer NCL812 ou polimixina B (controle positivo), utilizando MIC para cada composto conforme uma guia (0, 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, ou 8 vezes MIC). O controle negativo recebeu 2% de DMSO, o que representou a concentração final de DMSO em cada ensaio. Após uma exposição de 30 min ao fármaco, as células foram sedimentadas através de centrifugação e o sobrenadante foi analisado para a presença de ATP. Os resultados foram expressos como a concentração de ATP liberada para o meio (μM).

Resultados

[00144] Determinou-se, anteriormente, a MIC para NCL812 como sendo de 4 μg/ml. O ensaio de liberação de ATP é realizado por meio de crescimento de S. aureus até a fase exponencial e, então, adicionando o antibiótico em múltiplos da MIC numa tentativa de detectar uma resposta dependente da dose.

[00145] Conforme mostrado na Figura 12, a ATP liberada de polimixina B de controle positivo a partir das células de S. aureus de uma forma dependente da dose com liberação máxima de aproximadamente 0,34 μM de ATP em 8 vezes MIC (256 μg/ml). Liberação de ATP na presença de NCL812 foi dependente da dose em 0,5-1 vezes MIC, resultando na liberação máxima (0,33 μM) observada em MIC (4 μg/ml). A liberação de ATP na verdade diminuiu depois de 2 a 8 vezes a MIC. Deve ser observado que em estudos anteriores, a precipitação de NCL812 foi observada em 4 a 8 vezes MIC em Mueller Hinton broth II.

[00146] Em resumo, NCL812 demonstrou liberação dependente da dose de ATP a partir as células de S. aureus crescendo ativamente. A liberação de ATP a partir das células para o meio de crescimento chegou a níveis máximos no valor de MIC, e isso foi seguido por uma diminuição na liberação de ATP em doses mais elevadas. Os dados indicaram que NCL812 podem interagir com a membrana celular de S. aureus, provocando fugas de metabolitos vitais, tais como ATP.EXEMPLO 4:Atividade antibacteriana in vitro de NCL812 contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina e suscetível à meticilina

Materiais e Métodos Agentes antimicrobianos

[00147] As alíquotas da solução stock de NCL812 (25,6 mg/ml) foram preparadas em dimetilsulfóxido, armazenadas a -80 °C e descongeladas imediatamente antes do uso. Stock ampicilina foi obtida a partir de Sigma-Aldrich (Austrália). Discos antimicrobianos foram obtidos junto à Thermo Fisher Scientific (Austrália).

Microrganismos

[00148] Vinte e nove isolados clínicos da MRSA foram obtidos (Figura 13), juntamente com organismo de controle S. aureus ATCC 49775. A identificação de isolado foi confirmada por metodologias fenotípicas convencionais, incluindo o teste de coagulase em lâmina, teste de Vogues-Proskauer, sensibilidade a polimixina B (300 unidades), e aglutinação em lâmina de látex Staphytect Plus Protein A (Thermo Fisher Scientific Australia). As bactérias foram armazenadas a -80 °C em 40% de caldo de glicerol e rotineiramente cultivadas a partir de estoque em ágar de sangue de ovelha (SBA) incubadas a 37 °C. Em experiências subsequentes, apenas culturas frescas <24 h foram usadas.

Resistotipagem de isolado

[00149] A criação de perfil de susceptibilidade a antibiótico da coleta de isolado foi realizado utilizando-se difusão em disco de Kirby-Bauer, conforme recomendado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) em agar de Mueller-Hinton. Os isolados foram cultivados durante a noite em SBA a 37 °C. As colónias foram suspensas em solução salina fisiológica. A turbidez foi ajustado para um padrão McFarland de 0,5 e as suspensões foram espalhados sobre o meio. Os discos de antibiótico foram transferidos para o meio inoculado e analisados após 24 h de incubação a 37 °C. Os isolados rotulado como MRSA que não foram resistentes a β-lactama na base do teste de Kirby-Bauer foram cultivados a partir de estoque em contagem de placa suplementada com ágar com 5 μg/ml de ampicilina e submetidos ao tese de repetição, conforme a expressão de Protein2a de Ligação de Penicilina pode ser induzida por exposição a agentes antimicrobianos β-lactama.

Detecção molecular da proteína A e genes mecA para confirmar o estado de MRSA

[00150] As identidades de isolado foram confirmadas de maneira genotípica usando um teste de reação em cadeia da polimerase convencional duplex inovadora (PCR) alvejando os genes estância termal(proteína A) e mecA (resistência à meticilina). Além disso, os isolados foram testados em um PCR em tempo real com Sybr green de mecA e spa. Aproximadamente dez colônias de cada subcultura bacteriana durante a noite foram suspensas em 1 x solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) e submetidas a vórtices. Os isolados foram sujeitos a extração de DNA usando o QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen, Austrália) seguindo os protocolos de fabricante. O modelo de DNA foi eluído em 50 μl de tampão de eluição e ou usado diretamente em PCR, ou armazenado a - 20 °C antes da amplificação de DNA que usa os iniciadores spa diretos (5’- TGATACAGTAAATGACATTG-3’) reversos (5’-TTCTTATCAACAACAAGTTC-3’) e iniciadores mecA diretos (5’-TTCGTGTCTTTTAATAAGTGAGG-3’) e reversos (5’- ATGAAGTGGTAAATGGTAATATCG-3’) (Invitrogen, Austrália). A amplificação de PCR convencional foi realizada em um volume de 20 μl contendo 10 μl HotStarTaq Plus Master Mix (Qiagen, Austrália), 0,5 μM de cada iniciador spa, 0,2 μM de cada iniciador mecA, e 3 μl de DNA extraído. Um termociclador automatizado (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad) foi usado para amplificação por PCR dos genes spa e mecA.Tabela 1: condições reacionais PCR e PCR RT

[00151] Os produtos amplificados de mecA e spa de 325- e 120 bp, respectivamente, foram detectados por coloração com GelRed seguido por eletroforese em géis de 2% de agarose.

Teste de concentração inibitória mínima

[00152] As atividades in vitro de NCL812, e ampicilina como um controle positivo, foram determinadas por microdiluição de caldo como recomendado pelo CLSI em caldo de Mueller-Hinton II ajustado por cátion. As placas de microtitulação contendo duas vezes de diluições de cada agente antimicrobiano foram inoculados com ~105CFU/ml de cada isolado, em um volume final de 100 μl. As placas foram incubadas durante 24 h a 37 °C. A turbidez (absorbância a OD600) foi medida utilizando um espectrofotômetro de microplaca Bio-Rad Benchmark Plus em Microplate Manager® versão 5.2.1 (Bio-Rad). Os pontos de viragem de concentração inibidora mínima (MIC) foram definidos conforme a concentração mais baixa antimicrobiana avaliada pelo espectrofotômetro que inibiu o crescimento bacteriano. ATCC 49775 foi incluído na coleta de isolado como um organismo de controle usando pontos de interrupção definidos pelo CLSI. MIC50, MIC90 (concentrações que inibiram o crescimento de menos de 50% e 90% dos organismos totais, respectivamente) e a faixa de MIC (mínimo e máximo) foram calculadas para o perfil de susceptibilidade antimicrobiana da coleta de isolado.

Atividade bactericida

[00153] A atividade bactericida NCL812 foi estabelecida através da determinação da concentração bactericida mínima (MBC) e análises de tempo de eliminação usando as diretrizes do CLSI. A MBC foi definida como a concentração mais baixa do fármaco na qual 99,95% do inoculo original foi eliminado.

[00154] Os ensaios de tempo de eliminação para ATCC 49775 foram realizados em caldo de Mueller-Hinton II ajustado para cátion em placas de microtitulação e, novamente, em 10 ml de volumes para os ensaios de macrodiluição em concentrações antimicrobianas equivalentes a 1x e 4x da MIC. A atividade bactericida nos ensaios de macrodiluição foi identificada como uma redução de 3 log10 do tamanho do inoculo inicial. As bactérias foram cultivadas durante a noite a 37 °C em SBA. As colônias foram suspensas em caldo e a turbidez foi ajustada a um padrão McFarland de 0,5 para obter uma suspensão bacteriana de ~105 CFU/ml. As suspensões bacterianas foram incubadas a 37 °C com agitação. As alíquotas foram removidas 0, 1, 2, 4, 8, 12, e 24 h após a adição antimicrobiana, diluídas, plaqueadas em SBA e incubadas durante 48 h a 37 °C para determinação da contagem viável. As curvas de crescimento de turbidimétricas para S. aureus foram obtidas para os ensaios de placa de microtitulação através de monitorização das alterações da densidade óptica utilizando um espectrofotômetro de microplaca de Bio-Rad Benchmark Plus a 600 nm. As densidades ópticas foram medidas 0, 1, 2, 4, 8, 12, e 24 h após a adição antimicrobiana.

Metodologia estatística

[00155] Os dados microbiológicos foram interpretados usando as diretrizes do CLSI. Os dados foram examinados usando o teste t de Student, teste exato de Fisher, análise de variância e um modelo linear generalizado para os testes de efeitos entre indivíduos onde apropriado. As diferenças foram consideradas significativas ao nível de 0,05 no IBM SPSS® versão 19.0 (University of Adelaide).

Resultados Confirmação da identidade de Staphylococcus aureus e Estado de mecA

[00156] Testes de aglutinação de látex confirmaram que todos os 30 isolados eram proteína A positiva. Os isolados testaram positivo para a atividade coagulase usando aglutinação. Os testes de resistência de Voges-Proskauer e polimixina B confirmaram que todos os isolados eram S. aureus exceto para um único isolado sensível à meticilina; MSSA DE-25 (Figura 14). Com base na amplificação de PCR de gene spa, esse isolado não foi identificado como um isolado de S. aureus apesar de testar positivo na aglutinação em látex de proteína A e testes de coagulase em lâmina. Esse Staphylococcus spp. de origem canina foi identificado como Staphylococcus pseudintermedius com base nas características bioquímicas. Os resultados de PCR em tempo real e convencionais de mecA confirmaram que 66,66% dos isolados foram classificados como resistentes à meticilina com base na possessão do gene mecA . Não houve diferenças significativas entre a capacidade de PCR convencional e em tempo real para detectar o gene mecA (P> 0,05).

Perfis de susceptibilidade antimicrobiana de Staphylococcus aureus

[00157] Os ensaios de susceptibilidade antimicrobiana revelou que isolados de HA-MRSA teve a maior prevalência média da resistência a múltiplas classes de antimicrobianos (P<0,000). Os isolados de CA-MRSA eram os mais resistentes em seguida (P <0,007), seguido por staphylococci sensível à meticilina (P <0,037) (Figura 15). A resistência à oxacilina foi expressa em apenas 80,00% e 10,00% dos isolados de HA-MRSA e CA-MRSA, respectivamente. A resistência ao cefotetano foi expressa em 80,00% e 20,00% dos isolados de HA-MRSA e CA- MRSA, respectivamente. Embora oxacilina e cefotetano não diferiram de forma significativa na sua capacidade de detectar MRSA (P> 0,05), a detecção foi significativamente melhorada quando se usa PCR de mecA quando comparado com a difusão em disco (P<0,013). A maioria dos isolados de HA-MRSA expressaram resistência ao ácido amoxicilina-clavulânico, cefotetano, cefalexina, clindamicina, eritromicina, oxacilina, e penicilina-G, ao passo que a maioria dos CA-MRSA isolados eram resistentes a clindamicina, eritromicina, e penicilina-G . Nenhum dos isolados testados foram resistentes à vancomicina. No geral, os fenótipos de resistência mais prevalentes foram penicilina-G (83,33%), eritromicina (73,33%) e clindamicina (43,33%), enquanto apenas isolados sozinhos (3,33%) foram resistentes ao sulfametoxazol-trimetoprim e rifampicina.

Interações complexas de gene mec

[00158] Todos os isolados de MRSA pertencentes ao complexo A de gene mec expressaram resistência ambos oxacilina e cefotetan (Figura 16). No entanto, apenas 20% de isolados de MRSA de complexo B de gene mec foram fenotipicamente resistentes a esses antimicrobianos. Dentre os isolados de MRSA pertencentes ao complexo C2 de gente mec, apenas um único isolado de resistência à meticilina expressa a oxacilina e apenas dois isolados expressaram resistência ao cefotetano. Isolados de MRSA não classificada expressaram plena resistência à oxacilina e cefotetan.

[00159] Os picos de ponto de fusão para plot derivado de PCR em tempo real de mecA dF/dT diferiram entre complexo de gene mec (P <0,003) (Figura 17). Em média, os isolados de complexo B de gene mec e os isolados não classificados demonstraram picos de ponto de fusão mais elevados que outros tipos de SCCmec (P<0,012).

Propriedades físicas e MIC de NCL812

[00160] Testes iniciais de NCL812 mostraram que o mesmo era solúvel em DMSO, mas produziu uma solução turva quando dissolvido em caldo de Mueller- Hinton II ajustado para cátion (CAMHB) (Figura 18). Em testes iniciais, contatou- se que NCL812 tem valores de MIC consistentes (Figura 18).

Atividade antibacteriana in vitro: concentrações inibitórias mínimas

[00161] Os valores MIC50e MIC90 para o composto NCL812 (4 e 4-8 μg/ml) estão mostrados na Figura 19. Os valores de MIC diferiram através da classificação de S. aureus(suscetível, HA ou CA-MRSA) (P<0,005). Em muitos casos, NCL812 aumentou significativamente a atividade contra CA-MRSA e staphylococci suscetíveis a meticilina através de uma diluição quando comparado a HA-MRSA (P<0,002 e P<0,020, respectivamente), porém, não houve diferenças significativas entre os valores de MIC para staphylococci suscetíveis a meticilina e CA-MRSA (P> 0,05). Os valores de MIC estavam dentro da faixa normal esperada na base nas orientações do CLSI.

Atividade antibacteriana in vitro: concentrações bactericidas mínimas

[00162] Os MBCs determinados a partir de NCL812 foram equivalentes ao MIC para 93,33% e 83,33% de isolados S. aureus, respectivamente (Figura 19). Em todos os casos restantes, MBCs foram uma diluição mais elevada. Para NCL812, MBCs variou de 2-8 μg/ml e 4-16 μg/ml, respectivamente.

Estudos de tempo de eliminação

[00163] Em comparação com a curva de crescimento turbidimétrico de ATCC 49775, nenhum crescimento bacteriano visível foi observado quando ATCC 49775 foi inoculado em caldo de Mueller Hinton II ajustado para cátion suplementado com NCL812 em 1x e 4x de MIC em ensaios de microdiluição (P<0,033 e P<0,038, respectivamente) (Figura 20).

[00164] Quando analisados em ensaios de macrodiluição de 10 ml, o caldo suplementado com antibióticos a 1x e 4x de MIC e inoculado com ATCC 49775 exibiu contagens viáveis significativamente reduzidas para ambos NCL812 quando em comparação ao controle de crescimento (0,000<P<0,008) (Figura 21). Além disso, os perfis de tempo de eliminiação de NCL812 não diferiram significativamente (P> 0,05). Ambos os agentes antimicrobianos permaneceram bactericidas até aproximadamente 8-12 h após a adição de agente antimicrobiano, em que foi observado o recrescimento bacteriano. Uma variação considerável na atividade de eliminação de NCL812 foi observada a partir de 8-24 h. Embora NCL812 não fosse mais bactericida por 24 h, as contagens viáveis observadas em 1x de MIC permaneceram significativamente mais baixas do que os obtidos do caldo não suplementado (P <0,046).

[00165] Em resumo, o exemplo apresentado acima demonstrou atividade bactericida através de NCL812 tanto contra staphylococci suscetíveis a meticilina como contra MRSA. Os valores de MIC e MBC foram consistentemente baixas em toda a seleção dos isolados (MICaicance 2-8 μg/ml). NCL812 manteve boa atividade antimicrobiana in vitro contra isolados de MRSA multirresistentes a fármacos comuns, incluindo a epidemia UK EMRSA-15, EMRSA-16, e EMRSA- 17, EMRSA-1 irlandês, AUS EMRSA-3, NY/JAPAN HA-MRSA epidêmico, e clones de CA-MRSA predominantes. NCL812 também foi ativo contra um isolado de S. pseudintermedius que foi originalmente identificado como uma cepa de S. aureus.

[00166] Os testes preliminares sugerem que NCL812 alveja a membrana celular de S. aureus, causando liberação dependente da dose dos metabolitos vitais, como, por exemplo, adenosina-5'-trifosfato. O rompimento da proteínas ou bicamada de membrana bacteriana que são essenciais para a função da membrana na bactérias é um alvo para vários agentes antimicrobianos grandes que são ubíquos na natureza; incluindo glicolipídios, lipopeptídeos, lipoproteínas, ácidos gordos, lipídios neutros, fosfolipídios e biossurfactantes. Embora NCL812 seja um composto sintético de massa molecular baixa (<500-DA), parece exercer uma atividade bactericida de um modo semelhante a outros agentes antimicrobianos que têm como alvo a membrana da célula Gram-positiva, incluindo o daptomicina de agente antimicrobiano cíclico de lipodepsipeptídeo de alto peso molecular, ou o HT61 derivado das quinolonas de baixa massa molecular, cuja estrutura química não está disponível. Muitos desses agentes antibacterianos lipofílicos não são eficazes contra microrganismos Gram- negativos devido à presença da membrana bicamada de lipídio externa, que contém os canais porina estreitas que reduzem a penetração de líquido de alguns compostos dentro da célula.

[00167] A insolubilidade do NCL812 até mesmo em baixas concentrações em meios microbiológicos pode refletir a natureza anfipática e oligomérica do presente agente antimicrobiano e sugere que a verdadeira MIC pode ser muito menor do que o observado, uma vez que é provável que se trata apenas de NCL812 na solução que é biologicamente ativo. Em estudos tempo de eliminação, NCL812 exerceu atividade bactericida in vitrorápida contra ATCC 49775.

[00168] É importante salientar, a aparente meia-vida in vitro curta desse agente antimicrobiano resultou no recrescimento bacteriano observado 12 h após a adição de agente antimicrobiano. Isso sugere que, se uma população bacteriana viável sobrevive à exposição inicial ao NCL812 antes da inativação do agente antimicrobiano, o recrescimento bacteriano irá ocorrer. O desenvolvimento de resistência a NCL812 nesses estudos foi excluída como bactérias de teste restante susceptíveis a NCL812 seguinte a coleta, lavagem e testes de MIC. Embora a meia-vida aparentemente curta in vitro de NCL812 possa ser uma característica desejável para futura aplicação in vivo, ela sugere que NCL812 pode precisar ser administrado a cada 8 h em experiências de segurança e eficácia in vivo futuras para manter a concentração sistêmica adequada, embora fosse aparecer a partir do perfil de tempo de eliminação que a série de compostos de NCL são antimicrobianos dependentes da concentração em vez de dependente do tempo.

[00169] Para superar o fenótipo de MRSA sensível à meticilina, estendendo o tempo de incubação de difusão em disco de 24 a 48 h compensa a desrepressão lenta do gene mecR. Embora os efeitos da incubação mais longa não foram examinadas, e o tamanho pequeno de amostra dos isolados de MRSA impediu uma investigação mais aprofundada nas interações complexas de mec; técnicas genéticas foram de sensibilidade significativamente maior quando em comparação aos fenotípicos para a confirmação do estado de mecA dos isolados nesse estudo. Embora as técnicas genéticas não sejam sempre empregadas como um método de rotina para a detecção de MRSA, identificação de PCR em tempo real da presença do gene mecA em uma isolado de Staphylococcus spp. permanece o padrão ouro de diagnóstico.EXEMPLO 5:Farmacodinâmica in vitro de um novo agente antimicrobiano para Streptococcus pneumoniae.Materiais e MétodosSusceptibilidade aos antimicrobianos pneumocócicaCepas pneumocócica e condições de crescimento

[00170] Vinte isolados pneumocócicos compreendidos de oito cepas laboratoriais caracterizadas e 12 isolados clínicos foram obtidos.Tabela 2: Caracterização dos Isolados Testados

[00171] A cepa de controle D39 de National Collection of Type Cultures (NCTC) foi usada como controle de crescimento para todos os ensaios MIC e MBC. Posteriormente, D39 foi designado para cinética de eliminação, ensaios de ponto de resistência e estudos de microscopia eletrônica de transmissão (TEM), visto que é uma cepa de laboratório bem documentado com uma patogênese in vivo definida que exibiu MICs e MBCs de NCL812 consistentes.

[00172] Para todos ensaios in vitro, os isolados de pneumococos frescos foram cultivados durante a noite (O/N) em placas de agar de sangue de cavalo (HBA) (39 g/L de base de agar de sangue Columbia [Oxoid] 5% de [v/v] sangue desfibrinado de cavalo [Oxoid] a 37 °C com 5% de CO2 suplementado. O ágar de sangue Mueller-Hinton com 5% de sangue de carneiro desfibrinado (MHSBA Roseworthy Mídia and Blood Service) foi usado para análise de difusão em disco conforme dirigido pelas normas Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Os pneumococos foram rotineiramente cultivadas em calda que consiste em 4% de sangue de cavalo lisado (LHB) com Cation Adjusted Mueller Hinton Broth (CAHMB, [Difco]) a 37 °C, com 5% de CO2 suplementado. O caldo de soro de cavalo (HSB, 10% (v/v) de soro de cavalo dador em caldo nutriente [10 g/L de peptona, 10 g/L Lab Lemco (Oxiod) e 5g/L de NaCl]) foi usado também em alguns ensaios de MIC. Os isolados foram armazenados em HSB a -80 °C.

Estoque de antibióticos e reagentes

[00173] NCL812 foi fornecido na forma de pó seco por Neoculi. Um total de 256 mg foi dispensado em 10 ml de 100% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) para fazer um stock estoque de 25,6 mg/ml, que foi, então, diluída 1:100 em CAHMB para produzir um estoque de trabalho final de 256 μg/ml. Pó seco de ampicilina foi de Sigma A0166. O estoque de 25,6 mg/ml original foi diluído em solução salina 1:100, 1:4, 1:20 e finalmente 01:16 em CAMHB para produzir um estoque de trabalho final de 0,18 μg/ml. A eritromicina foi da Sigma E077 e cloreto de colina foi de Roche Diagnostics. Vinte microlitros de 0,05 μg/ml de eritromicina foram diluídos 1:25 em 4,980 mL de CAMHB para render um estoque de trabalho final de 0,2 μg/ml. O cloreto de colina (0,5%) foi adicionado a 4% de LHB:CAMHB para ensaios cinéticos de eliminação específicos.

Definindo susceptibilidade antimicrobiano dos isolados de pneumocócica

[00174] A susceptibilidade de isolado para 12 antimicrobianos diferentes (Figura 22) foram determinados pelos métodos de CLSI e European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Os agentes antimicrobianos foram selecionados com base nas orientações de CLSI e EUCAST. Os diâmetros de zona para outros agentes antimicrobianos além de Ciprofloxacina para S. pneumoniae foram determinados através das normas do CLSI; enquanto os diâmetros de zona para susceptibilidade antimicrobiana de Ciprofloxacina para S. pneumoniae foram determinadas por EUCAST.Tabela 3: Normas Interpretativas para Diâmetros de Zona

[00175] As suspensões bacterianas normalizadas foram espalhadas em MHSBA usando um cotonete estéril. [Suspensões bacterianas de Streptococcus pneumoniae foram normalizadas para um OD600 nm entre 0,08 e 0,1 usando um espectrofotômetro e, então, diluída 1:20. As colônias bacterianas foram tomadas a partir de uma placa de ágar de sangue de cavalo O/N. Para assegurar a pureza da suspensão bacteriana 1:20, 50 μL foram semeados de maneira espalhada no ágar de sangue de cavalo e incubados O/N a 37 °C com 5% de CO2. A CFU foi calculada e comparada às contagens iniciais.] Discos de antibióticos (Sigma) foram colocados usando um dispensador em disco (Oxoid) de acordo com as normas CLSI. As placas de MHSBA foram incubadas durante 16 horas - 24 horas a 37 °C em 5% de CO2. As zonas de inibição total foram medidas em triplicado ao milímetro mais próximo utilizando uma régua no crescimento refletido em luz natural, e a moda foi representada como o diâmetro para cada isolado. Os isolados de pneumocócica foram classificados como sensível, intermediário (I) ou resistente (R) através das normas de CLSI e das faixas de controle de qualidade (QC) (Figura 22).

Determinação da faixa de MIC50, MIC90 e MIC e faixa de MBC50, MBC90 e MBC de NCL812

[00176] MICs para NCL812 para todos os isolados listados na Tabela 2 foram determinadas através da medição da densidade óptica em 600 nm (OD600nm) (espectrofotômetro Spectramax, Molecular Devices Corporation) como um indicador de crescimento bacteriano usando bandejas de microtítulo de 96 poços após a incubação durante 24 horas a 37 °C em 5% de CO2. [Diluições de Micro-caldo e bandejas de 96 poços são preparadas pelo seguinte método: 90μL de 4% de LHB:CAMHB é aliquotado em todas as cavidades usando uma pipeta multicanal. 90 μl de estoques antimicrobianos funcionais não foram diluídos em série através da bandeja por meio de uma diluição de 1:2. Os controles de caldo negativos e controle de diluição foram tomados em conta ao dispor de uma bandeja de 96 poços.] 10 μL de suspensão bacteriana foi, então, adicionada aos poços apropriados na bandeja de 96 poços. Os controles positivos (sem agente antimicrobiano), negativos (sem agente antimicrobiano ou bactérias) e de diluição negativa (um controle de diluição em série de agente antimicrobianos e de caldo) foram incluídos em cada ensaio. MBC e contagens de placas para ensaios cinéticos de eliminação foram determinadas por aliquotagem de 20 μL de cada poço da bandeja de microtitulação de 96 poços em HBA, e incubando a 37 °C com 5% de CO2. A MBC foi determinada por uma inibição de 99,95% de S. pneumoniae, levando em conta o fator de diluição. MICs e MBCs foram determinadas em quadruplicado e a moda foi tomado como o valor representativo. A faixa de MIC50, MIC90 e MIC e faixa de MBC50, MBC90 e MBC foram determinadas de acordo com as normas de CLSI. MIC50 e MIC90, ou MBC50 e MBC90, são definidos pelas concentrações mais baixas que, quando todas as MICs e MBCs dos isolados estão dispostas do menor para o maior, inibiram 50 e 90 percentil da quantidade total dos isolados, respectivamente.

Estudos de tempo de eliminação de diluição de microcaldo com NCL812 usando cepa D39

[00177] As suspensões bacterianas foram adicionados em triplicado a uma bandeja de microtitulação de 96 poços contendo NCL812 com uma concentração inicial de 128 μg/ml e diluídas em série em 1:2, sequencialmente a uma concentração de 0,25 μg/ml. Os controles de diluição negativos foram subtraídos do valor médio de crescimento para se obter um indicador adequado da produção bacteriana geral. A placa de 96 poços foi incubada a 37 °C em 5% de CO2 e lida a cada 2 horas durante as primeiras 12 horas seguido pela última leitura em 24 e 48 horas em 600 nm. Para suplementar ainda mais os dados, uma experiência separada na qual uma bandeja de 96 poços foi lida automaticamente em intervalos de meia hora usando um espectrofotômetro (espectrofotômetro Spectramax, Molecular Devices Corporation) durante 14 horas foi realizado para confirmar as tendências das curvas de crescimento observadas a partir dos estudos de diluição de micro-caldo originais.

Estudos de tempo de eliminação de MBC com NCL812 usando cepa D39

[00178] Os ensaios cinéticos de eliminação de MBC envolveram a preparação de três bandejas de 96 poços de microtítulo. Em pontos de tempo específicos, as aliquotas obtidas a partir dessas bandejas forneceram contagens viáveis após a incubação a 37 °C em 5% de CO2 em HBA, e a MBC foi determinada após 24 horas de crescimento.

Estudos de tempo de eliminação de diluição de macrocaldo do D39 com NCL812

[00179] As suspensões bacterianas e estoques antibióticos funcionais foram preparados conforme descrito acima. [Para a preparação das diluições macro-caldo, tubos de 20 ml foram enchidos, cada um, com 9mls de 4% de LHB:CAMHB. 9mls de um estoque antimicrobiana funcional foi diluído por 1:2 quando adicionado a um dos tubos e, em seguida, diluído em série a partir de uma concentração decrescente do agente antimicrobiano. 1 ml de suspensão bacteriana S. pneumoniae foi adicionada aos tubos adequados, incluindo o controle positivo. Os tubos foram incubados a 37 °C com 5% de CO2 com a inclinação manual suave dos tubos tratados com NCL812 a cada 10 minutos durante as primeiras 12 horas. A cada 2-3 horas durante as primeiras 12 horas de crescimento e, então, em 24 horas e 48 horas, 50 μL de cada suspensão bacteriana foi plaqueada de forma espalhada em HBA e incubada a 37 °C com 5% de CO2 durante 16-24 horas.]Tabela 4: Concentração de agentes antimicrobianos

[00180] As culturas foram incubadas a 37 °C em 5% de CO2 com a inclinação manual suave a cada 10 minutos para as primeiras 12 horas. As contagens viáveis a partir das alíquotas de 50 μL de cada concentração foram lidas após incubação a 37 °C em 5% de CO2 durante 24 horas. O pH de cada amostra foi medida em pontos do tempo específicos usando as tiras indicadoras de pH. Crescimento confluente foi definido quando mais de 1000 colônias foram contadas por placa. Um efeito bactericida foi definido como uma redução de 3- log10 por unidade (99,9%) da suspensão de células original determinada 24 horas para cada concentração.

Ponto do ensaio de resistência para NCL812

[00181] As diluições de macrocaldo foram preparadas tal como acima. As culturas de caldo da cepa D39 (10 ml) foram incubadas na presença de 2 μg/ml e 4 μg/ml de NCL812, e 0,022 μg/ml da Ampicilina durante 6 horas a 37 °C em 5% de CO2. As amostras foram centrifugadas a uma força centrífuga relativa (RCF) de 101,45 x g durante 10 minutos e lavada em 50 ml de salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes para remover qualquer agente antimicrobiano residual e/ou produtos finais bacterianos e o meio. Bactérias lavadas foram ressuspensas e MICs foram realizados.

Efeito de NCL812 na ultra-estrutura de membrana de célula D39 Microscopia Eletrônica de Transmissão

[00182] A aparência morfológica e a análise morfométrica da membrana celular foi determinada usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). As suspensões bacterianas e 10 ml de culturas do D39 foram preparados conforme anteriormente. As amostras foram incubadas a 37 °C em 5% de CO2 com a inclinação manual suave das culturas a cada 10 minutos. As culturas foram expostas a ambos 1 μg/ml, 4 μg/ml ou 16 μg/ml de NCL812 e colhidas em 6 ou 12 horas por centrifugação a 101,45 xg durante 20 minutos e lavadas duas vezes em 50 mls de PBS. Os pontos de tempo críticos para o trabalho de TEM foram determinados mediante análise das tendências nas curvas de crescimento produzidas a partir dos estudos de cinéticas de eliminação. As amostras foram ressuspensas em PBS contendo 20% de glicerol e armazenadas a -80 °C até serem necessárias. Antes de fixação, 20% de glicerol foi removido por centrifugação e lavado em gelo três vezes em 50 mls de PBS.

[00183] As amostras foram fixadas usando protocolos modificados definidos por um estudo anterior que examinam a ultraestrutura da parede celular de S. pneumoniae (Hammerschmidt, S. et al. 2005. Infect Immun 73:4653-4667). Um processo de fixação de vermelho de ósmio de formaldeído com glutaraldeido rutênio com base em lisina-acetato envolvido na fixação dos péletes bacterianos com uma solução de tampão de cacodilato contendo 2% de formaldeído, 2,5% de glutaraldeido, 0,075% de vermelho de rutênio e 0,075 M de acetato de lisina durante 1 hora. Após a lavagem com tampão cacodilato contendo 0,075% de vermelho de rutênio três vezes, uma segunda fixação em solução tampão de cacodilato contendo 2% de formaldeído, 2,5% de glutaraldeido e 0,075% de vermelho de rutênio foi realizada durante 1,5 horas. As células foram subsequentemente lavadas três vezes com tampão de cacodilato contendo 0,075% de vermelho de rutênio e foram submetidas a uma fixação final em 1% de tetróxido de ósmio em cacodilato contendo 0,075% de vermelho de rutênio durante 1 h. As amostras foram, então, lavadas três vezes em tampão de cacodilato contendo apenas 0,075% de vermelho de rutênio.

[00184] As amostras foram lavadas e desidratadas utilizando uma série graduada de etanol (70, 90, 95 e 100%) por 10-20min, duas vezes a cada etapa. As amostras foram infiltradas usando 50:50 de resina de LR White em etanol a 100% durante 1 hora, e subsequentemente lavada com 100% de resina de LR White durante 1 hora e deixou O/N em uma terceira mudança de 100% LR branco para assegurar a infiltração adequada de resina. As amostras foram em seguida embutidas na resina LR White fresca e incubadas a 50 °C durante 48 horas. As seções foram cortadas a 1 μm usando uma faca de vidro, coradas com azul de toluideno e visualizadas sob um microscópio de luz a 400x para identificar a presença de pneumococos coloridos. Pelo menos quatro seções ultrafinas foram, então, cortadas a 90 nm usando uma faca de diamante e colocadas em grades de matriz, uma seção por grade. As seções ultra-finas foram, então, coloridas com acetato de uranil e citrato de chumbo alternativamente em intervalos de 5 min, seguido de três lavagens com água destilada entre cada exposição. As seções coloridas foram depois colocadas em grades e visualizadas entre 25000x e 130000x em um Philips CM100 Transmission Electron Microscope. As imagens foram obtidas com uma ampliação de 130000 vezes e analisadas usando analySIS [Olympus Soft Imaging Systems].

Análise estatística

[00185] As análises estatísticas foram realizadas utilizando programa de estatísticas GraphPad Prism (5aed, GraphPad Software Inc.) para Windows. Para curvas de crescimento, os dados apresentados foram a média e o erro padrão da média (SEM) (representada como barras de erro) para cada ponto dos dados exceto para os estudos de diluição macrocaldo onde várias repetições não poderiam ser obtidas, devido aos altos custos envolvidos nesse ensaio. Testes t desemparelhados de calda dupla foram realizados.ResultadosFarmacodinâmica do NCL812 em S. pneumoniaeA análise de difusão em disco de controle de qualidade para 20 isolados de S. pneumoniae

[00186] Apesar de nove dos 12 antimicrobianos utilizados para análise de difusão em disco tenham faixas de QC estabelecidas através de EUCAST, as faixas de QC não foram definidas para amoxicilina-clavulanato, claritromicina e clindamicina (Tabela 3).

[00187] WCH16 e WCH184 foram resistentes a pelo menos dois antimicrobianos, enquanto que EF3030 e WCH137 foram intermediários e resistentes ao trimetoprim-sulfametoxazol, respectivamente (Figura 22). Os outros 16 isolados restantes foram sensíveis a todos os 12 antimicrobianos. A sensibilidade à ampicilina foi confirmada para cada isolado, permitindo o uso de ampicilina como um controle positivo em ensaios de diluição de micro-caldo posteriores (Figura 22).

Solubilidade e atividade de NCL812 em diferentes mídias

[00188] NCL812 foi apresentado em 100% de DMSO, mas desenvolveu turbidez quando foi adicionalmente diluído em CAMHB ou PBS.Tabela 5: A análise visual de NCL812 e solubilidade de ampicilina

[00189] Crescimento da cepa D39 de S. pneumoniae em um ensaio MIC para NCL812 usando 10% de HSB (220 mls de soro de cavalo é filtrado a 10% em 180 mls de caldo nutriente de Lemco), resultou em um aumento de três vezes na MIC para D39 tratada com NCL812 com um aumento de duas vezes para a ampicilina positiva controle.Tabela 6: Diferença na atividade de NCL812 em diferentes mídias.

[00190] Não houve alteração na MIC para D39 com diferentes condições de armazenamento das bandejas de microtitulação de 96 poços pré-preparadas.Tabela 7: Condições de armazenamento das bandejas de microtitulação preparadas para a diluição de micro-caldo.

[00191] Durante as diluições de macro-caldo, o pH do meio não se alterou em comparação aos controles apropriados (Figura 23).Determinação de sensibilidade de S. pneumoniae in vitroao NCL812Determinação da faixa MIC de MIC50, MIC90 NCL812

[00192] NCL812 exibiu uma MIC50 e MIC90 de 8 μg/ml e faixa de MIC de 4-8 μg/ml, quando testado contra todas as 20 cepas. A MIC para ampicilina foi comparável com os resultados publicados recentes usando diluição de micro- caldo como um ponto de viragem para a resistência antimicrobiana em isolados pneumocócicos, confirmando, dessa forma, a precisão das MICs obtidas para NCL812.Tabela 8: Valores de MIC e MBC para isolados tratados com NCL812 e ampicilina

Determinação da faixa de MBC50, MBC90 e MBC de NCL812

[00193] As concentrações bactericidas mínimas (faixas de MBC50, MBC90 e MBC respectivamente) foram determinadas para NCL812 e ampicilina para todos os vinte isolados.Tabela 9: Valores de MIC e MBC para NCL812 e ampicilina para cada isolado pneumocócico

Estudos de tempo de eliminação de diluição de micro-caldo do D39 tratados com NCL812

[00194] D39 exposto a concentrações sub-inibitórias (< 2 μg/ml) de NCL812 cresceram de forma similar à dos controles não expostos durante um período de 48 horas (Figura 24). Concentrações mais elevadas de NCL812 (> 16 μg/ml) resultaram em nenhum crescimento bacteriano durante 48 horas (Figura 24). Estas características de crescimento foram validadas por um estudo cinético de eliminação de micro-caldo utilizando um espectrofotômetro Spectramax, que mediu o crescimento (representada como OD600) em intervalos de meia-hora por 14 horas para NCL812 e ampicilina (Figuras 25 e 26). O início do crescimento exponencial para D39 tratado com NCL812 é mostrado na Figura 27.

[00195] O crescimento de D39 tratado com NCL812 foi comparado com D39 tratado com ampicilina ou eritromicina ao longo de 48 horas (Figuras 28 e 29). D39 tratado com ampicilina apresentaram crescimento semelhante a D39 exposto a NCL812 através de 48 horas (Figura 28). D39 tratado com eritromicina produziu muitas curvas de crescimento diferentes de NCL812 em que foi observada uma diferença maior no crescimento entre as concentrações (Figura 29). A adição de 5% de cloreto de colina ao mio ao longo de um período de 48 horas não resultou em diferença significativa no crescimento para NCL812 em comparação com os controles positivos e de crescimento (Figura 30 e 31).

Ponto de testes de resistência

[00196] D39 tratado com < 4 μg/ml de NCL812 entrou em uma fase de log de crescimento em 6 horas (Figura 24), conforme mostrado em quatro experiências independentes. A possibilidade da resistência antimicrobiana a NLC812 entre 5 e 6 horas foi investigada mediante determinação adicional dos MICs em D39 expostas a 2 μg/ml de NCL812, 4 μg/ml de NCL812 e 0,0225 μg/ml de ampicilina durante 6 horas. Os resultados mostraram um aumento significativo na MIC para todas as amostras de D39 expostas a NCL812 em comparação aos controles de crescimento e ampicilina Tabela 10: valores de MIC e MBC de D39 exposto a 2 ug/ml ou 4 ug/ml de NCL812 durante 6 horas

*Controle d e crescimento d e D39: Cepa de D39 de S. pneumoniaecresceudurante 6 horas em 4% de LHB:CAMHB.** Controle de Crescimento2 de D39: Cepa de D39 deS. pneumoniae em HBA O/N, ressuspensa em solução salina (0,1 OD600) e diluída em 1/20 em solução salina estéril.

Diluições de micro-caldo mediante medição de MBC relativa em pontos específicos do tempo

[00197] MBCs relativas foram determinadas em intervalos de tempo específicos a partir do uso de ensaios de diluição de caldo incubados durante 48 horas para NCL812 e ampicilina e eritromicina antimicrobianas de controle (Figuras 32 e 33). MICs de ampicilina (0,023 μg/ml) e eritromicina (0,00275 μg/ml) para D39 foram semelhantes na faixa aos resultados publicados para outros isolados de pneumocócicos. A diferença comparativa no crescimento entre NCL812, ampicilina, eritromicina e foi observada (Figuras 32 e 33). Ampicilina e eritromicina demonstraram uma redução dependente do tempo em bactérias. NCL812 exibiu ação bactericida rápido, evidenciada por uma redução de aproximadamente 3 vezes em MBC dentro de 5 horas. A concentração bactericida consistente (8 μg/ml) foi mantida durante um total de 48 horas para NCL812.

Estudos de tempo de eliminação de diluição de macro-caldo do D39 com NCL812

[00198] As contagens viáveis para cada ponto de tempo foram representados como um log 10 CFU/ml de redução para NCL812 (Figura 34) e ampicilina (Figura 35). O crescimento confluente consistente (determinado por um limite de 2x104CFU) foi observado para os controles não expostos e 2 μg/ml de NCL812. Atividade bactericida completa (definida por uma redução de 3log em CFU) por 128 μg/ml de NCL812 foi observada através de uma redução de 4log das unidades formadoras de colónias (CFU) em 3 horas e concentrações entre 16 μg/ml e 64 μg/ml de NCL812 foram eficazes em eliminar o crescimento bacteriano dentro das 8 horas (Figura 34). NCL812 em 4 μg/ml e 8 μg/ml parece estar inativado em 11 horas pós-exposição, visto que crescimento acentuado da cepa D39 após esse ponto de tempo foi observado (Figura 34).

Microscopia eletrônica de transmissão

[00199] A análise morfométrica revelou alterações significantes na celular membrana na cepa D39 exposta a 16 μg/mL de NCL812 por 6 horas em comparação aos controles de crescimento. As amostras tratadas com 4 μg/ml assim como culturas de 12 h não foram consideradas para análise morfométrica devido à falta de células bacterianas disponíveis em cada secção. As amostras tratadas possuíam membranas celulares significativamente mais espessa (6,43 ± 0,29 nm) em comparação às amostras não tratadas (4,35 ± 0,24 nm) (p<0,0001) (Figura 36). O espaço periplásmico (entre o espaço intracelular da membrana celular e da parede celular) de D39 tratado com 16 μg/ml de NCL812 foi significativamente mais largo (4,54 ± 0,096 nm) em comparação às amostras não tratadas (3,91 ± 0,14 nm) (p<0,001) (Figura 37). Tabela 11: Espessura de membrana celular média e espaço periplasmático

[00200] Em resumo, NCL812 produziu MICs altamente consistentes e MBCs equivalentes para a coleta de cepas de S. pneumoniae, confirmando que este é bactericida contra este organismo. Em experimentos cinéticos de eliminação, que mediu a MBC relativa ao longo de um período de 48 horas, um efeito bactericida consistente foi provocado em D39 após 6 horas de exposição inicial ao NCL812.

[00201] Essa demonstração de atividade bactericida é o primeiro a ser observado em S. pneumoniae. Isso demonstra que NCL812 é eficaz contra o pneumococo in vitro.

[00202] Ligação competitiva entre os componentes no sangue, no soro ou no caldo diminuiu a atividade antimicrobiana do NCL812. Isso se refletiu no aumento de MIC observado entre diferentes tipos de caldo e diluentes. Após a conclusão desses estudos, pesquisa independente recente confirmou a precipitação de NCL812 em PBS e relatou completa solubilidade em água contendo 4% de DMSO, após a diluição inicial em 100% de DMSO. Um NCL812 solúvel em água melhoraria significativamente a biodisponibilidade in vivo e a interação negativa entre as proteínas do sangue ou do soro.

[00203] Com base nas conclusões desse estudo, NCL812 exibe um mecanismo de ação contra S. pneumoniae que é diferente das classes de β- lactama ou de macrolido, visto que aparenta exibir atividade bactericida dependente da concentração em oposição às qualidades dependentes do tempo. A identificar a concentração sérica farmacocinético máxima do NCL812 in vivo auxiliará a confirmação de sua atividade farmacodinâmica dependente da concentração. Além disso, a adição de cloreto de colina ao meio confirmou que o mecanismo de ação para NCL812 não está associado à afinidade em relação a proteínas de ligação de colina de parede celular e, portanto, não pode se associar à parede celular.

[00204] A análise morfométrica da membrana celular e do espaço periplasmático de D39 tratado com 16 μg/ml de NCL812 durante 6 horas mostrou que a membrana celular e o espaço periplasmático foi maior em amostras tratadas, em comparação às amostras de controle. O aumento aparente no tamanho de membrana de tamanho pode ser devido a uma acumulação do material intracelular denso de elétrons abaixo da membrana celular. O aumento do tamanho do espaço periplasmático pode ser ter sido devido a uma ruptura da membrana celular, potencialmente através de despolarização ou inibição de ATP. O mecanismo de ação de NCL812 pode não ser dependente de cálcio, visto parecer que nenhuma ligação competitiva entre NCL812 e vermelho de rutênio, um inibidor de canais de cálcio das bicamadas lipídicas, foi observada em micrografias eletrônicas.

[00205] Em conclusão, esse estudo in vitro demonstrou que NCL812 tem muitas características desejáveis como, por exemplo, um agente antimicrobiano bactericida dependente da concentração de ação rápida que parece atingir a membrana celular de S. pneumoniae. Essas características são desejáveis para o tratamento de infecções por pneumococos agudas. Como NCL812 pode possuir um mecanismo de ação que tem como alvo a membrana celular, atuando muito mais rapidamente do que os agentes antimicrobianos dependentes do tempo como β-lactamas e os macrolidos e, potencialmente, poderiam ser mais eficazes do que outros agentes antimicrobianos dependentes da concentração bactericidas tais como fluoroquinolonas que têm alvos intracelulares.EXEMPLO 6:Caracterização dos isolados resistentes à meticilina e sensíveus à meticilina de Staphylococcus pseudintermedius da Austrália e eficácia preliminar in vitro de um novo composto anti-estafilocócicaMateriais e MétodosColeta e identificação de amostra de Staphylococcus pseudintermedius sensível a meticilina (MSSP) e Staphylococcus pseudintermedius resistente a meticilina (RMSP)

[00206] Um total de 23 isolados de Staphylococcus pseudintermedius foram obtidos a partir de cães (Figura 38).

[00207] Foram coletadas para estudo 10 Staphylococcus pseudintermediussensíveis à meticilina e 13 resistente à meticilina. Os isolados foram classificados fenotipicamente resistente como resistente à meticilina com base na resistência in vitroà oxacilina e geneticamente para a presença dos genes mecA de acordo com o procedimentos padrão.

[00208] Teste de susceptibilidade de oxacilina e cefoxitina com uso da técnica de difusão em disco e Teste epsilométrico foram realizados. A identificação do gene mecA foi realizada utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR)

[00209] Teste de suscetibilidade de difusão em disco de CLSI foi realizado em 23 isolados de Staphylococcus pseudintermedius para os seguintes agentes antimicrobianos: penicilina, amoxicilina, eritromicina, gentamicina, clindamicina, ciprofloxacina, cefalexina, cloranfenicol, tetraciclina, oxitetraciclina, vancomicina, cefotetano, moxifloxacina e rifampicina (Figura 39).

[00210] O teste de Concentração Inibitória Mínima (MIC) e de Concentração Bactericida Mínima (MBC) foi realizado utilizando uma metodologia CLSI para NCL812 e incluiu ampicilina como um controle. Então, os compostos anti-estafilococos foram testados contra todos os 23 isolados e as concentrações inibitórias mínimas (MIC) foram determinadas de acordo com protocolos padrão. Após as MICs serem determinadas, as concentrações mínimas bactericidas foram realizadas para determinar se esses compostos são bacteriostáticos ou bactericidas.

Resultados

[00211] O gene mecA estava presente em 13 isolados de MRSP e negativo em 10 MSSP. Todos os isolados de MRSP eram resistentes a oxacilina com base na difusão em disco (<=17 mm) e teste E de MIC (>=0,5 mg/L).

[00212] Quando o ponto de ruptura de resistência a cefoxitina foi fixado em <= 24 mm, 3/13 (23%) e 5/13 (38%) do MRSP testado foram susceptíveis a cefoxitina. Quando o ponto de ruptura de resistência a cefoxitina foi fixado em <= 30 mm, apenas 13 (7,7%) do MRSP testado em Veterinary Diagnostic Laboratory foi suscetível.

[00213] Os isolados de MRSP foram resistentes à múltiplas classes de antibióticos. Dentre os 13 isolados de RMSP, todos os 13 foram sensíveis à rifampicina. 3/13 (23%) foram sensíveis ao cloranfenicol; 10/13 (77%) foram sensíveis à vancomicina.

[00214] Curiosamente, 3/13 (23%) dos isolados de MRSP foram suscetíveis à amoxicilina; 8/13 (62%) foram susceptíveis à cefalotina; 12/13 (92%) susceptíveis a cefotetano e 12/13 (92%) susceptíveis a moxifloxacina,

[00215] Todos os 23 isolados foram suscetíveis a NCL812 com base em MICs. Além disso, o NCL812 foi mostrado para ser bactericida com base nas concentrações bactericidas mínimas (MBC).

[00216] Constatou-se que a faixa de MIC do NCL812 contra isolados de Staphylococcus pseudintermediusestá entre 1 μg/mL e 4 μg/mL. Tabela 12: faixa de MIC do NCL812 contra isolados de Staphylococcus pseudintermedius

[00217] O MIC 50 e o MIC 90 do NCL812 contra o isolado deStaphylococcus pseudintermediusfoi verificado como sendo de 2 μg/mL e 4 μg/mL, respectivamente. A moda de MIC e o intervalo de MIC do NCL812 contra o isolado de Staphylococcus pseudintermedius foi verificado como sendo de 2 μg/ml e 1-4 μg/ml, respectivamente.Tabela 13: Valores de MIC combinados do NCL812 contra isolados de Staphylococcus pseudintermedius .

[00218] Os Staphylococcus pseudintermedius resistentes à meticilina (MRSP) são um problema emergente em cães, gatos e cavalos. Duas grandes linhagens clonais de MRSP foram encontradas em cães na Europa (ST 71) e na América do Norte (ST 68). Houve também relatos de MRSP afetando cães no Japão e um único caso de MRSP afetando um funcionário de veterinária em Hong Kong.

[00219] Neste estudo, os isolados de MRSP foram determinados utilizando uma combinação da presença do gene mecA e da resistência in vitroà oxacilina. A susceptibilidade à cefoxitina tem sido utilizada como um substituto para a oxacilina em Staphylococcus aureus resistente à meticilina. No entanto, os testes de difusão em disco de cefoxitina usando diretrizes interpretativas recomendadas para isolados humanos do Staphylococcus aureus resistente à meticilina e estafilococos de coagulase negativa não são confiáveis na identificação MRSP. A resistência do ponto de ruptura cefoxitina de <= 30 mm = resistente e >= 31 = suscetível foi proposto por Bemis et al, 2012. Esse estudo está em concordância que esse ponto de ruptura pode ser mais confiáveis na previsão de Staphylococcus pseudintermedius resistente à meticilina. Os isolados RMSP são geralmente resistentes a múltiplas classes de antibióticos. Cultura bacteriana e susceptibilidades aos antibióticos são, portanto, recomendadas para todas as infecções MRSP suspeitas para permitir a seleção apropriada dos antibióticos. Uma limitação observada nesse estudo é a aparente susceptibilidade in vitro dos isolados de RMSP à amoxicilina e às cefalosporinas (cefalotina e cefotetana). NCL812 foi eficaz contra todos os 23 isolados de ambos MSSP e MRSP. Um estudo em maior escala tem garantia para confirmar a eficácia de NCL812 contra Staphylococcus pseudintermedius, visto que pode fornecer uma opção antibiótica alternativa segura para infecções de MRSP emergentes em animais domésticos.

EXEMPLO 7:Atividade de NCL812 contra organismos gram-negativos.

[00220] O objetivo deste estudo foi o de determinar se um alvo da atividade antibacteriana de NCL812 está presente dentro das células gram-negativas. Para determinar se um alvo de NCL812 está dentro da célula gram-negativa, a membrana exterior, e a maior parte da parede celular, foi removida usando ampicilina, em seguida, as células modificadas (conhecidas como esferoplastos) foram tratadas com NCL812 em várias concentrações.

Indução de estado esferoplasto

[00221] E. coli ATCC 25922 foi cultivada durante a noite em agar a 37 °C. Duas colônias de uma incubação durante a noite foram usadas para inocular ~20 ml de caldo de Mueller Hinton de cátion ajustado. O caldo inoculado foi incubado durante 18 horas a 37 °C. Seis ml de cultura de caldo durante a noite foram adicionados a 20 ml do caldo Mueller Hinton ajustado para cátion suplementado (suplementado com 50 mg/ml de ampicilina, 0,4 M de sacarose, 8 mM de MgSO4) e incubados durante a noite a 37 °C. A formação de esferoplastos foi verificada usando um microscópio de contraste de fase.

Atividade de NCL812

[00222] Três ml de cultura de esferoplastos foram adicionados a cada tubo de ensaio e 50 μl de DMSO contendo a concentração apropriada de NCL812 foi adicionado a cada tubo de ensaio. Cinquenta microlitros de apenas DMSO foi adicionado ao tubo de ensaio de controle. Os esferoplastos foram incubados durante 24 horas com 20 μl de amostras tomadas em 0, 2, 4, 6, 8 e 24 horas. Vinte microlitros de amostras foram diluídas em série de 1:10 e 10 μl de amostras de diluições apropriadas foram observadas em triplicado em ágar de infusão de cérebro e coração. O ágar de infusão de cérebro e coração foi incubado a 37 °C durante 48 horas e as colônias foram contadas em 24 e 48 horas para determinar o número de unidades formadoras de colônias.

Imagem de esferoplastos tratados com NCL812

[00223] As amostras foram coletadas após 24 horas de exposição ao composto de NCL812, coradas com azul de Tripano e imageadas.

Resultados

[00224] A taxa de indução de esferoplasto acima de 99% foi observada de forma consistente. Um alvo de NCL812 foi encontrado presente dentro de células de E. coli com uma diminuição significativa no número de unidades formadoras de colônias observadas ao longo do tempo conforme a concentração de NCL812 aumentou >32 μg/ml (Figura 40). A experiência foi repetida em triplicado com um representante mostrado na Figura 40. Imagens dos esferoplastos feitas após 24 horas de exposição ao composto de NCL812 mostrou o desenvolvimento de células pleomórficas aumentado em frequência conforme a concentração de NCL812 aumentou (dados não apresentados). Estes resultados mostram a eficácia de NCL812 como um agente antibacteriano contra bactérias gram- negativas.

EXEMPLO 8:Formulações de NCL812.

[00225] As seguintes formulações foram preparadas utilizando métodos padrão na técnica. Formulação A - Formulação Tópica - Gel com base em PEG com NCL812 4,0 g de PEG 4000; 3,5 g de PEG 200; 0,6 de propileno glicol; 1,9 g de água; e 0,204 g de NCL812.

[00226] PEG 4000, PEG 200 e propileno glicol foram misturados e aquecidos a 150 °C e até que todos os cristais sólidos fossem dissolvidos. NCL812 foi adicionado a água e sonicado durante 30 minutos até estar completamente suspenso. A solução de NCL812 e soluções de gel foram misturadas e esfriadas e solidificadas. A formulação A demonstrou uma viscosidade aceitável, facilidade de aplicação na pele, suspensão e consistência uniforme e textura fina. Formulação B - Formulação Tópica - Gel com base em PEG com NCL812 3,0 g de PEG 4000; 1,0 g de PEG 8000; 3,0 g de PEG 200; 1,0 g de propileno glicol; 1,9 g de água; e 0,202 g de NCL812.

[00227] PEG 4000, PEG 8000, PEG 200 e propileno glicol foram misturados e aquecidos a 150 °C e até que todos os cristais sólidos fossem dissolvidos. NCL812 foi adicionado a água e sonicado durante 30 minutos até estar completamente suspenso. A solução de NCL812 e soluções de gel foram misturadas e esfriadas e solidificadas. A formulação B demonstrou uma viscosidade aceitável, facilidade de aplicação na pele, suspensão e consistência uniforme e textura fina. Formulação C - Formulação Tópica - Gel com base em PEG com NCL812- Soluplus 2,5 g de PEG 4000; 4,0 g de PEG 200; 2,5 g de propileno glicol; 1,0 g de água; e 1,8 g de dispersão sólida de NCL812-SoluPlus.

[00228] Soluplus é comercializado pela BASF (www.soluplus.com). NCL812-Soluplus foi preparado utilizando métodos padrão na técnica.

[00229] PEG 4000, PEG 200, NCL812-SoluPlus e propilenoglicol foram misturados e aquecidos a 150 °C e até todos os cristais sólidos fossem dissolvidos. Foi adicionada água e, em seguida, a solução foi sonicada. A solução foi deixada para esfriar e solidificar. A formulação C demonstrou uma viscosidade aceitável, facilidade de aplicação na pele, suspensão e consistência uniforme e textura fina. Formulação D - Formulação para Comprimido 30 mg de hidrogenofosfato de cálcio dihidratado; 80 mg de Celulose Microcristalina 50mg de Lactose; 8 mg de Hidroxipropilmetilcelulose 1,5 mg de Talco 10mg de NCL812

[00230] Os excipientes foram pesados e misturados durante 5 minutos. A mistura foi alimentada a um funil de alimentação de uma máquina de prensa de comprimidos e a máquina foi operada de acordo com procedimentos padrão na técnica.

[00231] Formulação D demonstrou uma dureza, desintegração e friabilidade aceitável do comprimido. Formulação E - Suspensão Oral 2,0 ml de Glicerol; 1,5 ml de Etanol absoluto; 600mg de NCL812; e Para 60ml de Veículo (Ora Sweet e Ora Plus, 1:1).

[00232] NCL 812 em pó foi peneirado através de um peneira de 75μm. 600mg de NCL 812 peneirada foi misturada com 2,0 ml de glicerol e 1,5 ml de etanol absoluto. A mistura foi colocada em um almofariz e moída manualmente até que todo NCL 812 foi suspenso uniformemente. A suspensão foi sonicada durante 30 minutos. Veículo (55 ml de mistura de Ora Sweet e Ora Plus) foi então adicionado à suspensão e moído durante mais 10 minutos. O volume de 60 ml foi feito com a mistura de Ora Plus e Ora Sweet, transferindo para uma proveta graduada

[00233] A Formulação E demonstrou suspensão aceitável e demonstrou estabilidade a curto prazo aceitável. Formulação F - Injeção Intramuscular 20 mg/ml de Polivinilpirrolidona K30 (PVPK30); 0,09 mg/ml de NCL812; e 50 ml de água.

[00234] Dois por cento de solução w/v de PVP K30 foi preparada pela adição de 1,0 g de PVP K30 a 50 ml de água MilliQ. A solução foi então colocada em um sonicador durante 30 minutos para equilibrar e 4,5 mg de NCL 812 foi adicionado à solução de PVP e colocada em uma estufa com agitação a uma velocidade máxima de 10 rpm durante um período de 24 horas, com a temperatura controlada de 25±1oC. A solução foi transferida para frascos de 5 ml e teve sua clareza, sua aparência, seu pH e sua estabilidade a curto prazo verificados. O pH da solução era de 7,25.

[00235] A Formulação F demonstrou uma transparência e estabilidade a curto prazo aceitáveis.EXEMPLO 9:Liberação de NCL812 da Formulação B.

[00236] O objetivo deste estudo foi medir a liberação de NCL812 da Formulação B preparada no exemplo

[00237] Células de difusão de Franz foram utilizadas para quantificar a taxa de liberação a partir de NCL 812 a partir de suas formulações tópicas. Cinco mililitros de etanol absoluto, que foi escolhido como o meio de liberação desejado, foi carregado na câmara receptora. A temperatura do fluido receptor foi mantida constante, em 32±1 oC utilizando uma camisa de água. Membranas de acetil celulose, com tamanho de poro de 0,45um (Pall Corporation) foi selecionado e colocado entre a câmara doadora e o receptora. Seguido por isso, uma série de amostras de teste (Formulação B) foram carregadas para dentro da câmara doadora. Um mililitro de fluido receptor foi coletado em intervalos de tempo regulares de 0,25, 0,50, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 24 horas, através da porta de amostragem. Um mililitro de etanol absoluto fresco foi imediatamente devolvido para a câmara receptora. UV-HPLC foi utilizada para analisar o conteúdo dos fluidos do receptor obtidos.

[00238] A Figura 41 apresenta a liberação cumulativa de NCL812 ao longo do tempo. Este estudo demonstra que a Formulação B fornece um perfil de liberação aceitável para NCL812.EXEMPLO 10:Estudos de sinergia com outras classes de agentes antimicrobianos.

Métodos

[00239] O método quadriculado (Gunics et al., 2000 Int. J. Antimicrob. Agents. 14: 239-42) foi utilizado para encontrar as interações (sinergia, antagonismo, sem efeito) de NCL812 em combinação com tetraciclina, cloranfenicol, eritromicina (macrolido), ampicilina (e-lactâmicos de amplo espectro), gentamicina (aminoglicósido), a ciprofloxacina (fluoroquinolona), sulfametoxazol (sulfonamidas), ou penicilina G (e-lactâmicos de espectro reduzido). Para as experiências iniciais, uma cepa de laboratório de Staphylococcus aureus T3-129 foi usada, no entanto esta cepa produziu resultados inconsistentes para alguns dos antimicrobianos e uma nova cepa de Staphylococcus spp. designada MK1 (identificação definitiva das espécies atualmente em andamento) que era sensível a todos os antibióticos testados foi usada em testes subsequentes.

[00240] Em primeiro lugar, o MIC de cada antibiótico sozinho foi determinado de acordo com as diretrizes padrão do CLSI. Em segundo lugar, a combinação de NCL812 com cada um dos antibióticos acima mencionados foi testada em duplicado. Para avaliar o efeito da combinação da concentração inibitória fracionária (FIC) foi calculada para cada antibiótico da seguinte forma: FIC do antibiótico testado = MIC do antibiótico testado em combinação/MIC do antibiótico sozinho; FIC de NCL812 = MIC de NCL812 em combinação/MIC de NCL812 sozinho; e FICI = Índice FIC = FIC de NCL812 + FIC de cada antibiótico testado.

[00241] De acordo com as orientações do quadriculado, Sinergia (S) foi definida como uma FICI<0,5. Sem efeito (NE) foi definido como 0,5 <FICI<4. Antagonismo (A) foi definida como uma 4 <FICI.

[00242] Resultados

[00243] MICs, FICs, FICI e a interação entre NCL812 e oito antibióticos são mostrados na Tabela 14. Nenhum dos oito compostos testados, que representam classes distintas de agente antimicrobiano apresentaram interação positiva (sinergismo) ou interação negativa (antagonismo) com NCL812 consistente com um efeito aditivo quando agentes anti-bacterianos são adicionados ao NCL812. Tabela 14: MICs, FICs, FICI e a interação entre NCL812 e oito antibióticos.

1 S. aureuscepa T3-29 2 Staphylococcus spp. Cepa MK1 FIC1 = MIC de antibiótico em combinação com NCL812/somente MIC de antibiótico FIC2 = MIC de NCL812 em combinação com antibiótico/somente MIC de NCL812 FICI = Índice FIC EXEMPLO 11: Os efeitos de NCL812 sobre isolados de antimicrobianos sensíveis de Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis

Materiais e Métodos Informações da Cepa

[00244] Dois isolados de Staphylococcus aureus foram utilizados nas experiências seguintes; S. aureus MK01 uma cepa de pele humana, e S. aureus KC01 uma cepa de pele equina. Estes isolados foram identificados por métodos de coloração de Gram e bioquímicos, incluindo o kit comercial Remel Staphaurex. Um isolado de Enterococcus faecalis (USA01) não foi identificado como uma cepa VRE. Uma vez que este isolado foi especiado anteriormente, ele não foi submetido a mais testes, exceto para a observação de crescimento puro e característico em agar de sangue.

Investigação de Concentração Bactericida Mínima (MBC) Metodologia CLSI

[00245] Como nas experiências anteriores, 10 μL do conteúdo de cada poço a partir de MIC foram inoculadas sobre uma placa de Columbia SBA e incubado a 37 °C durante 48 h. As placas foram examinadas após 24 e 48 h e a MBC foi registrada como a concentração mais baixa de NCL812 na qual não foram observadas colônias de bactérias na placa (ou inibição significativa do crescimento foi observada em comparação com o controle) (CLSI 2005). Ensaios cinéticos de eliminação para Método de S. aureus KC01 & E. faecalis USA01

[00246] S. aureus KC01 e E. faecalis USA01, não ser determinados paraserem MRSA ou VRE, respectivamente, foram cultivadas durante a noite em SBA Columbia a 37 °C. Algumas colónias de bactérias foram, então, suspensas em CAMHB (caldo de Mueller Hinton ajusatado para cátion) e ajustado para OD600 de 0,08 a 0,10. A suspensão bacteriana foi diluída 1:10. Um mililitro da bactéria foi adicionado a 9 ml de CAMHB contendo várias concentrações (até 4xMlC) de NCL, para alcançar uma concentração bacteriana final de 1 a 3x106 CFU/mL. Os tubos foram incubados a 37 °C, com agitação constante. A fim de determinar a quantidade de bactérias viáveis presentes em vários pontos no tempo, 100 μL de alíquota foi removida de cada tubo e diluída. Em seguida, 100 μL de cada diluição foram espalhados em agar de contagem de colônias, em duplicado, e incubadas durante 48 h a 37 °C. Após 24 horas, as quantidades colônias de presentes em cada placa foram contadas e, portanto, a quantidade de bactérias viáveis presentes na suspensão inicial enumerados. As placas foram re-verificada após 48 horas.

Resultados Concentração Inibitória Mínima (MIC)

[00247] A MIC de NCL812 para isolados de S. aureus MK01 e KC01, e E. faecalis USA01 foi investigada. Os resultados foram: S. aureus MK01 = 4-8 μg/mL, S. aureusKC01 = 2 μg/mL, E. faecalis USA 01 = 4 μg/mL.

[00248] Os isolados de S. aureus MK01 e KC01 e foram investigados e nenhum crescimento, ou somente crescimento em baixas concentrações de NCL812 (2 μg/ml), foi observado, indicando que NCL812 é bactericida contra S. aureus. Para os isolados de E. faecalis testados (USA01), no entanto, o crescimento das bactérias foi observado em todas as concentrações de NCL812 testadas. Houve uma redução óbvia na quantidade de bactérias com o aumento da concentração, mas o crescimento estava presente se comparado ao nenhum crescimento para S. aureus. Um resumo desses resultados pode ser visto na Tabela 15. Tabela 15 mostra os resultados para os testes de MBC de NCL812 em dois isolados de S. aureus não-MRSA e um isolados E. faecalis não-VRE. Cada teste de MBC foi realizado em duplicado. Nenhuma alteração nos resultados foi observada às 48 h. Tabela 16 mostra os valores de MBC de NCL812 (μg/mL) para 20 isolados de MRSA. Cada teste de MBC foi realizado em duplicado começando da concentração de MIC de NCL812 a 16 vezes de MIC. Tabela 17 mostra os valores de MBC de NCL812 (μg/ml) para 10 isolados VRE. Cada teste de MBC foi realizado em duplicado começando da concentração de MIC de NCL812 a 32 vezes de MIC.Tabela 15: Testes de MBC de NCL812 MBC em dois isolados de Staphylococcus aureusnão-MRSA e um isolado de Enterococcus faecalisnão- VRE.

+ = Crescimento em Agar de Sangue de Ovelha; 0 = Nenhum Crescimento em Agar de Sangue de Ovelha; N = Não Cultivado; Números entre Parênteses são o Número de Bactérias que Crescem após 24 horas por ml de amostra (CFU/ml)Tabela 16: valores de MBC de NCL812 (μg/ml) para 20 isolados de MRSA.

GB = Crescimento Bacteriano em Agar de Sangue de Ovelha** N = Não cultivado em Agar de Sangue de OvelhaTabela 17: os valores de MBC de NCL812 (μg/ml) para 10 isolados VRE.

*Número de Bactérias que Crescem após 24 horas por ml de amostra (CFU/ml); M = muitas bactérias crescendo na placa (demais para contar)Ensaios cinéticos de eliminação para Método de S. aureus KC01 & E. faecalis USA01

[00249] Contagens de colónias foram realizadas em t = 0, 120, 240, e 360 minutos, então, novamente em 24 h. No ponto no tempo de 2 h S. aureus KC01 mostrou um mínimo de uma redução de 2,5log10 nos números de bactérias de números iniciais, e mais que uma redução de 3log10 em comparação ao controle no mesmo ponto no tempo. Um mínimo de uma redução de 2log10 ainda foi evidente em 6 h de incubação, no entanto, após 24 h a quantidade de bactérias presentes aumentaram e isso não foi significativamente diferente do controle.

[00250] Resultados semelhantes foram obtidos com E. faecalis USA01, no entanto, a redução na quantidade de bactérias observadas era menor que para S. aureus KC01. Uma redução de 2log10 em CFU/mL foi observada em 2 h, em comparação ao controle de crescimento. No entanto, a redução em CFU/mL em comparação aos números bacterianos originais foi apenas maior que 1log10. Em concentrações de 4-16 μg/mL de NCL812 essa redução nos números de bactérias permaneceu consistente até ao ponto no tempo de 6 h. Em concentrações de 32 e 64 μg/mL, no entanto, houve aproximadamente de uma elevação de 1log10 nos números de bactérias em relação ao mesmo período no tempo. Em 24 h as quantidades de bactérias em todas as concentrações aumentou para quase o mesmo nível que o controle de crescimento.

[00251] Os resultados observados com essas cepas de S. aureus e E. faecalis são consistentes com os resultados observados para o ensaio de cinéticos de eliminação para todos os isolados de MRSA e VRE testados. O ensaio de cinéticos de eliminação de Staphylococcus aureus KC01 em diferentes concentrações de NCL812, até 24 h de incubação é mostrado na Figura 42. O ensaio de cinética de eliminação de Enterococcus faecalis USA01 em diferentes concentrações de NCL812, com até 24 h de incubação são mostrados na Figura 43.EXEMPLO 12:Método de tratamento de infecção bacteriana in vivo pela administração de NCL812.

[00252] O objetivo deste estudo foi determinar a eficácia de um Produto Veterinário Experimental contendo NCL812 no tratamento de uma infecção da pele em camundongos.

Resumo do Modelo

[00253] Um sistema de modelo animal útil deve ser clinicamente relevante, experimentalmente robusto, eticamente aceitável, conveniente para executar e deve fornecer resultados confiáveis e reprodutíveis. Existem diversos modelos animais de infecção tópica pele que têm sido descritos, incluindo o modelo de pele inflamada com óleo de croton (Akiyama, H., H. Kanzaki, Y. Abe, J. Tada e J. Arata (1994). "Staphylococcus aureus infection on experimental croton oil- inflamed skin in mice." Journal of Dermatological Science 8(1): 1-10), o modelo de pele queimada (Stieritz, D. D., A. Bondi, D. McDermott e E. B. Michaels (1982). "A burned mouse model to evaluate anti-pseudomonas activity of topical agents." Journal of Antimicrobial Chemotherapy 9(2): 133-140), o modleo de pele de sutura de ferida (McRipley, R. J. e R. R. Whitney (1976). "Characterization and Quantitation of Experimental Surgical-Wound Infections Used to Evaluate Topical Antibacterial Agents." Antimicrobial Agents and Chemotherapy 10(1): 38-44), o modelo extração de tira de pele (Kugelberg, E., T. Norstrom, T. K. Petersen, T. Duvold, D. I. Andersson e D. Hughes (2005). "Establishment of a Superficial Skin Infection Model in Mice by Using Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes." Antimicrobial Agents and Chemotherapy 49(8): 3435-3441) e o método de corte de escalpe de espessura total linear (Guo, Y., R. I. Ramos, J. S. Cho, N. P. Donegan, A. L. Cheung e L. S. Miller (2013). "In Vivo Bioluminescence Imaging To Evaluate Systemic and Topical Antibiotics against Community- Acquired Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus-Infected Skin Wounds in Mice." Antimicrobial Agents and Chemotherapy 57(2): 855-863).

[00254] Os estudos preliminares antes da realização do estudo atual estabeleceram um novo método de infecção de pele que surgiu de um estudo detalhado dos modelos acima mencionados. Resumidamente, os camundongos de estudo são anestesiados, um pedaço da pele dorsal é removida para revelar a pele e uma área circular de pele é removida com um perfurador de mão, deixando uma ferida no dorso com uma cavidade central. A ferida é infectada com uma quantidade conhecida do organismo do desafio. Aproximadamente de quatro a seis horas após a infecção, a ferida é ou tratada topicamente com uma formulação do veículo ou uma formulação ativa. A ferida na pele infectada é retratada a cada 12 horas para um total de 14 tratamentos. Os camundongos são eutanasiados com humanidade, a área da ferida infectada original é dissecada e removida e o seu conteúdo bacteriano quantificado por meio de ensaios microbiológicos normalizados. Desta forma, a alteração da concentração bacteriana devido ao tratamento com a formulação ativa pode ser prontamente determinada através do exame da redução da carga bacteriana em comparação ao controle de veículo.

Materiais e Métodos Preparação de Inoculo de Infecção

[00255] Culturas frescas de bactéria (Staphylococcus aureus) foram cultivadas em Agar de Sangue de Carneiro a 37 °C durante 16 - 18 horas. Algumas colônias típicas foram selecionadas e suspensas em 10 ml de caldo de soja tríptico e incubadas durante a noite numa incubadora com agitação (240 rpm) a 37 °C. A suspensão foi submetida a vórtice durante a noite e diluída (1:100) em caldo de soja tríptico fresco (100 μl [0,1 mL] em 9,9 ml de caldo). A suspensão fresca foi incubada durante 3 horas numa incubadora com agitação (como acima), a fim de obter bactérias em fase semi-logarítmica. As bactérias foram peletizadas através de centrifugação a 7500 rpm durante 10 minutos. Caldo sobrenadante foi removido e as bactérias suspendidas em 10 mL de Salina Tamponada com Fosfato (PBS). Esses passos foram repetidos mais duas vezes. A densidade da suspensão foi verificada por medição da absorbância em 600 nm, usando espectrofotômetro com solução salina como um branco, para confirmar a densidade alvo a uma leitura de aproximadamente 0,100, consistente com uma densidade bacteriana de 2,5 x 107 CFU/ml. A suspensão foi colocada em um rack colocado em uma caixa de transporte trancável com um bloco de gelo para manter a refrigeração durante o transporte, seguido pelo armazenamento em sala fresca mediante à chegada ao laboratório de infecção de pele de camundongo. A suspensão final foi bem misturada antes de inocular as feridas cutâneas criados nos camundongos.

[00256] A fim de assegurar a pureza e a precisão da suspensão, os passos a seguir foram realizados antes da colocação na caixa de segurança.

[00257] Pureza da suspensão bacteriana assegurada através de espalhamento de 100 μl da suspensão final em uma placa de SBA (ágar de sangue de carneiro) que foi incubada a 37 °C durante 18 horas e examinadas para confirmar crescimento uniforme de um tipo de colônia. As contagens de viáveis foram efetuadas em suspensão final preparando-se solução salina em tubos de Eppendorf (aproximadamente 900 μl por tubo), remover 100 μl de amostra e adicionando ao primeiro tubo de Eppendorf, submetendo à vórtice a mistura e repetindo usando o 2° tubo de Eppendorf contendo solução salina. Esse processo foi continuado durante 5 - 6 tubos. Finalmente, 100 μl da 5° e 6° diluições foram plaqueadas em ágar de contagem em placa, incubadas a 37 °C durante 18 horas e as contagens de colônias realizados para confirmar que CFU/ml foi de aproximadamente 2,5 x 107. Seguinte à inoculação das feridas, esse processo foi repetido para assegurar que não nenhuma contaminação ou diminuição nas contagens viáveis tenham ocorrido durante o tempo de cirurgia.

Procedimento Cirúrgico de Pele Ferida

[00258] Cada camundongo foi colocado dentro da câmara de indução e a anestesia induzida usando 2% de isoflurano. Os olhos de cada camundongo anestesiado foram cobertas com lubrificante ocular veterinário, a fim de evitar a desidratação da córnea. Cada camundongo removido da câmara de indução e colocado na área cirúrgica, na frente do cone de nariz estético individual. Enquanto sob anestesia cada camundongo foi monitorado para a avaliação da profundidade da anestesia (resposta à dor, reflexo de piscar, tônus muscular esquelético) e função respiratória e cardíaca. O pelo da pele dorsal foi raspado da área cirúrgica com aparadores mecânicos. A área rapada foi limpa usando 70% de etanol aplicado a papel toalha seguido por 10% de p/v de solução de iodopovidona. Uma vez que a solução de iodo foi seca, uma injeção subcutânea do agente anti-inflamatório não esteróide meloxicam foi administrada. A pele dorsal foi pinçada suavemente para permitir a criação de uma ferida de espessura total circular usando perfurador de orelha/biópsia. Os camundongos tratados com controle de veículo e NCL812 tinham feridas inoculadas com 10 μl de suspensão bacteriana utilizando uma micropipeta (2,5 x 105 CFU/10 μl). Uma vez que a suspensão bacteriana foi seca, os camundongos foram colocados em caixas individuais de recuperação marcadas com o número do camundongo. O tempo de inoculação foi gravado. Os pesos corporais iniciais de cada camundongo foram registrados na ficha de classificação adequada. Os camundongos recuperaram plena consciência dentro de 5 minutos. Os camundongos recuperados foram devolvidos ao alojamento individual e monitorado de hora em hora para complicações pós-cirúrgicas ou anestésicas.

Cuidados Pós-Cirúrgica (4 horas após a cirurgia)

[00259] Os camundongos foram avaliados para as complicações pós- cirúrgicas e as observações foram registadas na folha de registo clínico. Cada camundongo foi cuidadosamente removido de IVC e colocado dentro de um recipiente de avaliação, evitando manipulação ou toque excessivo do local cirúrgico. Uma vez que o camundongo esteve dentro do recipiente de avaliação, foi avaliado e as observações registradas na folha de registo clínico pós-cirúrgico. Sempre que os pontos de ruptura de bem-estar sugeridos foram alcançados, a analgesia pós-operatória foi administrada e registrada na folha de registo clínico.

Monitoramento Animal e Cuidados Diários

[00260] Administração de antibióticos (07:00 e 18:00 h). A primeira administração de pomada de veículo ou NCL812 ocorreu 4 horas pós-cirurgia. Cada recipiente de pomada foi pesada antes da administração e o peso registado. Cada camundongo foi cuidadosamente contido. A pomada (veículo ou NCL812) foi aplicada à área da lesão e o camundongo foi devolvido à IVC, onde cada rato foi observado para assegurar que a pomada não foi imediatamente removida mediante o trato natural do pelo. O peso do recipiente de pomada pós- administração foi gravado. O veículo e produtos de NCL ativos foram aplicados sobre a pele ferida cada 12 horas após a primeira administração, para um total de 14 tratamentos consecutivos. A pomada NCL812 (Formulação B, conforme apresentada no Exemplo 8) continha robenidina a uma concentração de 20 mg/g. Aproximadamente 0,1-0,2 g de pomada foi aplicada em cada ocasião, proporcionando uma dose tópica total de NCL812 entre 28 e 56 mg aos camundongos com peso entre 18 g e 25 g.

[00261] Acompanhamento Diário: Acompanhamento de cada camundongo teve lugar uma vez por dia em torno de 12:00. Cada camundongo cuidadosamente removido de IVC e colocado dentro de um recipiente de observação, evitando manipulação ou toque excessivo do local cirúrgico. A pelagem, a postura, os olhos, o comportamento, a vocalização e a atividade enquanto no recipiente foram cuidadosamente avaliadas e as observações registradas em ficha de avaliação. As fezes de rato (tanto no piso de gaiola como no recipiente) foram examinadas a consistência e as observações gravadas. O peso de cada camundongo foi determinado enquanto estava no recipiente e as alterações no peso corporal calculadas e registadas. O recipiente de observação foi desinfetado com etanol e separado para secar enquanto um recipiente fresco foi usada para o próximo camundongo. Para cada segundo dia, os camundongos foram novamente anestesiados usado 2% de isoflurano e fotografado com uma régua para o referência de tamanho. Essas fotos foram usadas para avaliar o tamanho da lesão e a progressão da infecção durante o período de teste.

Análise de tecidos e avaliação da eficácia antibacteriana

[00262] No final do período de avaliação da ferida da pele de 7 dias, todos os camundongos de teste foram eutanasiados antes da coleta da ferida para exame post mortem. A ferida na pele foi dissecada do dorso de cada camundongo. A amostra foi colocada num tubo de amostra e pesados antes de 1 ml de PBS e grânulos de homogeneização de tecidos estéreis serem adicionados. As amostras de tecido foram homogeneizadas durante 10 minutos utilizando um homogeneizador de tecidos (Next Advance Bullet Blender) e, em seguida, agitadas em vórtice durante aproximadamente 30 segundos. 100 μl de sobrenadante foi removido e colocado em um tubo Eppendorf contendo 900 μl de PBS. Esse procedimento foi repetido utilizando diluições em série para um total de 8 diluições. Finalmente, 100 μl de cada diluição foi pipetada em um ágar de contagem em placa em duplicado e incubada durante a noite a 37 °C. Dez microlitros da suspensão original foram colocados em ágar de sangue de ovelha para avaliar a pureza da cultura e incubados durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, as contagens viáveis foram realizadas utilizando placas de ágar de contagem em placa incubada e a identidade de Staphylococcus aureus (organismos de desafio) como a cepa colhida foi confirmada.

Resultados

[00263] A contagem média de colônias por grama de tecido observada no grupo tratado com veículo foi 5.888.436 (6,77 log10). A contagem média de colônias por grama de tecido observada no grupo NCL812 foi 141.254 (5,15 log10). As unidades formadoras de colônia por grama de tecido e o % de redução do log10 estão resumidos na tabela a seguir.Tabela 15: Unidades formadoras de colônias por grama de tecido e o percentual de redução do log10 após a administração tópica de veículo e de tratamento

[00264] É evidente a partir desta tabela que o tratamento com NCL812 leva a uma redução em alto nível na quantidade de Staphylococcus aureus infectantes. Estes resultados demonstram o tratamento eficaz para uma colonização bacteriana ou infecção in vivo.

Claims (15)

1. Uso de robenidina, ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma, e um composto ou agente, que remove ou substancialmente remove ou reduz a integridade da parede celular de uma bactéria, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma colonização ou infecção bacteriana em um indivíduo em que o composto ou agente é escolhido da lista que compreende: β-lactamas, fosfomicina, lisozima, polimixinas, agentes quelantes e / ou agentes imunológicos.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é selecionado a partir do grupo que compreende: espécies humana, canina, felina, bovina, ovina, caprina, porcina, aviária, peixes e equina.

3. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a robenidina é administrada ao indivíduo a uma dose na faixa de 0,1 mg/kg a 250 mg/kg de peso corporal.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria é selecionada a partir do grupo que compreende: espécies de Acinetobacter, Aeromonas hydrophila, espécies de Citrobacter, espécies de Enterobacter, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, espécies de Neisseria e Stenotrophomonas maltophilia.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a infecção ou colonização é causada por uma mistura de pelo menos duas bactérias selecionadas a partir do grupo compreendendo: bactérias Gram positivas, Gram negativas e bactérias sem parede celular.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de robenidina, ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma, e um composto ou agente que remove, ou substancialmente remove ou reduz a integridade da parede celular de uma bactéria, é administrada ao indivíduo por via oral, via parenteral ou via tópica.

7. Composição farmacêutica antibacteriana, caracterizada pelo fato de compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de robenidina, ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma, e um composto ou agente que remove, ou substancialmente remove ou reduz a integridade da parede celular de uma bactéria, e opcionalmente um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável em que o composto ou agente é escolhido da lista que compreende: β-lactamas, fosfomicina, lisozima, polimixinas, agentes quelantes e / ou agentes imunológicos

8. Composição farmacêutica antibacteriana, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que é uma composição veterinária antibacteriana.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a composição compreende, adicionalmente, um agente antimicrobiano selecionado a partir do grupo que compreende: agentes antibacterianos e antifúngicos.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a composição é adaptada para administração por via oral, via parenteral ou via tópica.

11. Dispositivo médico quando utilizado em um método de tratamento ou prevenção de uma infecção ou colonização bacteriana no indivíduo, caracterizado pelo fato de que o dispositivo médico compreende a composição conforme as reivindicações de 7 a 9.

12. Dispositivo médico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o dispositivo médico está em uma forma selecionada a partir do grupo que compreende: um emplastro, um curativo, um penso ou implante aplicado a uma colonização ou infecção bacteriana em um indivíduo.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria é:i) Gram-positiva; e / ouii) selecionada a partir do grupo compreendendo: Staphylococcus aureus, Staphylococcus pseudintermedius, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, e Clostridium difficile.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria é:i) Gram-negativa; e / ouii) selecionada a partir do grupo compreendendo: espécies de Acinetobacter, Aeromonas hydrophila, espécies de Citrobacter, espécies de Enterobacter, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, e Stenotrophomonas maltophilia.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria é:i) uma bactéria sem parede celular; e / ouii) selecionada a partir do grupo compreendendo: Mycobacterium abscessus, Mycobacterium arupense, Mycobacterium asiaticum, Mycobacterium aubagnense, Mycobacterium avium complex, Mycobacterium bolletii, Mycobacterium bolletii, Mycobacterium branderi, Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium celatum, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium chimaera, Mycobacterium colombiense, Mycobacterium conceptionense, Mycobacterium conspicuum, Mycobacterium elephantis, Mycobacterium farcinogenes, Mycobacterium florentinum, Mycobacterium fortuitum group, Mycobacterium genavense, Mycobacterium goodii, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium heckeshornense, Mycobacterium heidelbergense, Mycobacterium houstonense, Mycobacterium immunogenum, Mycobacterium interjectum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium senegalense, Mycobacterium africanum, Mycobacterium avium subsp paratuberculosis, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium lacus, Mycobacterium lentiflavum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium mageritense, Mycobacterium malmoense, Mycobacterium marinum, Mycobacterium massiliense, Mycobacterium microti, Mycobacterium montefiorense (enguias), Mycobacterium moracense, Mycobacterium mucogenicum, Mycobacterium nebraskense, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium novocastrense, Mycobacterium palustre, Mycobacterium parmense, Mycobacterium phlei, Mycobacterium phocaicum, Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium porcinum, Mycobacterium pseudoshottsii (peixe), Mycobacterium pseudotuberculosis, Mycobacterium saskatchewanense, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium senuense, Mycobacterium septicum, Mycobacterium simiae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium terrae/chromogenicum complex, Mycobacterium triplex, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tusciae, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium wolinskyi e Mycobacterium xenopi.

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