CN110964668B - 抗大肠杆菌蜂房芽孢杆菌菌株及其在化妆品中的防腐应用 - Google Patents

抗大肠杆菌蜂房芽孢杆菌菌株及其在化妆品中的防腐应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗大肠杆菌蜂房芽孢杆菌菌株及其在化妆品中的防腐应用。该菌株分类命名为蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)YM37，保藏于中国普通生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.18238。本发明还提供了一种制备该芽孢杆菌培养液及其代谢物的方法。本发明所述蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)及其次级代谢物对化妆品中大肠杆菌的生长能够起到良好抑制作用，适用于多种质地化妆、护肤品，应用前景好、开发潜力强，且具高效节能、环境友好等特点，可应用于化妆品防腐剂的制备。

Description

抗大肠杆菌蜂房芽孢杆菌菌株及其在化妆品中的防腐应用
技术领域
本发明属于新菌种筛选技术及微生物技术领域，特别涉及一种抗大肠杆菌蜂房芽孢杆菌菌株及其在化妆品中的防腐应用。
背景技术
化妆品及护肤品已经成为世界各地女性的必需品之一，然而由于化妆品本身成分、质地适宜微生物生长，因此常添加各种化学合成的防腐剂，而这些防腐剂常导致使用者产生红肿、瘙痒等过敏、异常症状。
目前国内外为了抑制化妆品腐败，常添加尼泊金酯和苯氧乙醇作为防腐剂。根据《化妆品与盥洗用品》(Cosmetics and Toiletries)杂志定期地发表关于化妆品防腐剂使用频率的报告，截至2014年(数据公布于2016年1月)，尼泊金酯仍然是美国化妆品市场上最常用的防腐剂，使用频率超过77％(梁辰宇.化妆品防腐剂及其发展[J].科技创新与应用,2015,22:10-11)。在国内，四川省疾病预防控制中心的蔡伦华等人对2013－2015年在该中心检测的1134份化妆品中防腐剂使用情况、使用种类和使用频率进行研究。结果显示所有化妆品中，使用防腐剂26种(类)，其中使用频率最高的就是苯氧乙醇(蔡伦华,康晓熙,万莉,蔡梅.1134份化妆品中防腐剂使用现状[J].预防医学情报杂志,2016,32(11):1198-1200)。该报告同时显示，苯氧乙醇与尼泊金酯两类防腐剂使用频率之和占总数六成以上。上述的传统防腐剂均有一定的毒性，过量或不当的防腐剂均会严重损害人体皮肤，导致人体过敏反应，故化妆品中不能含有国家限制使用的防腐剂，允许使用的防腐剂其使用浓度不能超过最大使用限量及使用范围。大肠杆菌作为一种常见腐败菌，易经接触传播。化妆品作为手部经常接触的物质，容易滋生、培养大肠杆菌，而现有的防腐剂对大肠杆菌的抑制效果并不理想。基于上述原因，寻找和开发能够代替传统防腐剂且安全无污染的生物源防腐剂方法是生产需求发展的一个必然。
目前已经有学者开始着手研究应用在化妆品领域的生物源防腐剂，但主要集中于植物源、动物源抑菌剂的提取。芽孢杆菌是一种自然界中广泛存在的革兰氏阳性杆状细菌，其特征在于能够产生多种抑菌物质和酶类，具有较强的防腐作用，且分离培养容易，应用前景广。政策规定芽孢杆菌培养物可以作为原料添加于化妆品中，但目前，还未有将芽孢杆菌菌体或代谢产物应用到化妆品防腐的相关领域的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗大肠杆菌蜂房芽孢杆菌菌株及其应用，其菌体、胞内和胞外发酵物均可在化妆品贮存过程中发挥防腐作用，是一种简单易行、高效环保的微生物处理方法，具有广阔的市场前景。
本发明公开了一种抗大肠杆菌蜂房芽孢杆菌菌株，其特征在于所述菌株的分类命名为蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)YM37，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.18238，保藏日期为2019年7月17日。
本发明还公开了一种抗大肠杆菌蜂房芽孢杆菌菌株的筛选方法，具体方法为：选用一次性聚乙烯培养皿，加入肉膏蛋白胨培养基LB，冷却。空白组涂布适宜浓度的大肠杆菌，在培养基上指定区域放置滤纸片，在滤纸片上加入无菌水；实验组涂布适宜浓度的大肠杆菌，在培养基上指定区域放置滤纸片，在滤纸片上加入浓缩一定浓度的芽孢杆菌菌体或者代谢粗提纯物。接种完成、封口膜双层封口后，于37℃培养箱中倒置培养一周，且每隔24h测量各组芽孢杆菌培养物对大肠杆菌的抑菌圈直径，并计算抑菌率；选取抑菌率大于15％的菌株，以抑菌率为指标筛选出所述最佳抗大肠杆菌芽孢杆菌属菌株。本发明的筛选方法具有普适性，能够推广到所有化妆品防腐细菌的筛选，筛选得到的菌的发酵液可释放抑菌物质，该抑菌物质对大肠杆菌抑制效果佳。本发明所述的蜂房芽孢杆菌(Paenibacillusalvei)YM37是该方法筛选得到的其中一种抑制功效最好的菌株。
本发明还公开了一种蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)YM37的发酵液制备方法，其特征在于所述方法为：将活化后的蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)YM37按2％-10％(v/v)接种量接种于装有LB液体培养基的锥形瓶中，37℃、180rpm密闭培养过夜，即得到含有抗菌代谢物的芽孢杆菌发酵液。将其用5000rpm-15000rpm条件进行离心，对离心所得上清液进行过滤得到上清液粗提物，对离心沉淀物进行超声破碎或高温破碎，得到细胞破碎物，实验证明两者皆有抑菌作用。
本发明所述蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)BYJ7可以应用于制备化妆品或护肤品防腐剂，可以在化妆品贮存中抑制大肠杆菌等革兰氏阴性菌的生长繁殖。
所述的化妆品泛指各种品类。
本发明进一步公开了一种化妆品贮存方法：
1)对化妆品贮藏容器进行包装密封前灭菌，放入适量化妆品；
2)使用蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)BYJ7发酵制备的芽孢杆菌发酵液，浓缩发酵液菌浓度为106-109CFU/mL，进行细胞破碎得到细胞破碎物或上清液提纯得到上清液粗提物；
3)将化妆品与步骤2)中的细胞破碎物或上清液粗提物置于同一容器中保存，细胞破碎物或上清液粗提物在化妆品容器中的体积比为不超过1％；置于25-37℃下保藏。
模拟化妆品贮藏实验中，将化妆品经灭菌处理后接种大肠杆菌，同时加入蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)发酵物，根据《中国药典》第5版中抑菌剂效力检测中微生物27天挑战实验标准观察化妆品腐败情况并测定菌落总数。研究发现蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)YM37次级代谢产物对化妆品中的大肠杆菌菌落总数有较明显的抑制作用，抑制率可达94％。
通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，通过DNA凝胶回收试剂盒(gE0101)，pClone007 Vector Kit试剂盒(TSV-007)步骤和PCR方法提取纯化并扩增该菌株的基因组DNA，通过测定16S rDNA的序列来进行菌种鉴定。将该菌种所测得序列在GenBank数据库中进行BLAST对比分析，在比对匹配度最高的结果中发现与蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)DSM 29AJ 320491的16S rDNA序列同源性最高。可确定菌种为蜂房芽孢杆菌，命名为Paenibacillus alveiYM37。该菌株的生物保藏信息为：中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号CGMCC No.18238。
本发明的有益效果：
本发明所述蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)YM37及其次级代谢物具备一定抗菌能力。根据模拟化妆品贮存试验结果，蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)YM37次级代谢产物能够在化妆品贮存过程中抑制大肠杆菌等腐败菌的生长，从而起到防腐作用，保障化妆品品质。
本发明所述芽孢杆菌本身抗逆性强，且抑菌谱广，可被应用于多种化妆品贮存环境中，应用前景好、开发潜力强。
本发明所述芽孢杆菌为天然化妆品防腐剂，可在实际生产中代替大量化学防腐剂被使用，对人体及环境兼具安全性。
附图说明
图1本发明所述菌株YM37菌体破碎物对大肠杆菌抑制效果图(培养7天、14天和28天)。其中左侧为空白对照组，右侧为YM37处理组。
图2本发明所述菌株YM37发酵物对大肠杆菌抑菌效果曲线图。其中横坐标为培养时间，纵坐标为抑菌率。
图3模拟化妆品储存试验中菌落总数变化。其中横坐标为时间，纵坐标为化妆品中的菌落总数。
图4本发明所述菌株YM37的16S rDNA序列Neighbor-Joining系统发育树。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，本发明实施例中所用实验材料、试剂和仪器等均可通过市售获得，若未具体指明，则实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：本发明所述芽孢杆菌菌株及其次级代谢物对大肠杆菌抑菌效果测定
1.实验方法
选用一次性聚乙烯培养皿，加入LB培养基，冷却。空白组涂布适宜浓度的大肠杆菌，在培养基上指定区域放置滤纸片，在滤纸片上加入无菌水；实验组涂布适宜浓度的大肠杆菌，在培养基上指定区域放置滤纸片，在滤纸片上加入浓缩一定浓度的灭菌芽孢杆菌菌体及其上清液粗提纯物。
接种完成、封口膜双层封口后，于37℃培养箱中倒置培养一周，且每隔24h测量各组培养物对大肠杆菌的抑菌圈直径，并计算抑菌率。
选取抑菌率大于15％的菌株，以抑菌率为指标筛选出所述最佳抗大肠杆菌芽孢杆菌属菌株。
抑菌率(％)＝(空白对照组菌斑直径-实验组菌斑直径)/空白对照组菌斑直径×100％
LB培养基配方：10g蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母膏，1.5％-2％琼脂，1L去离子水，于121℃下高压蒸汽灭菌20min。
实验中用到的芽孢杆菌YM37及大肠杆菌菌株均由浙江大学生物系统工程与食品科学学院实验室提供。
2.实验结果及分析
菌体破碎物对大肠杆菌的抑制照片见图1，本发明所述发酵物对大肠杆菌抑菌效果见图2，将发酵物进行胞外代谢物分离和菌体破碎后测试，其抑菌率如表1所示。本发明所述菌株破碎物能够对大肠杆菌达到更高的抑菌率，且抑菌率更为稳定。因此本发明所述芽孢杆菌菌株YM37破碎物及其代谢物对大肠杆菌抑菌效果良好。
表1芽孢杆菌发酵物对大肠杆菌的抑菌率(％)
Figure BDA0002338609650000051
实施例2：模拟化妆品贮存试验
1.实验材料、试剂与仪器
实验材料：无防腐剂添加的保湿护肤水(成分：甘油、维生素C、维生素E、玫瑰纯露：芳樟醇、丁香酚、玫瑰醚)、大肠杆菌、编号为YM37的芽孢杆菌、生理盐水、无菌水、离心管、竹签、蓝盖密封瓶等。
实验试剂：LB液体、固体培养基、卡松。
实验仪器：摇床、烘箱、超净台等。
2.实验方法
(1)芽孢杆菌菌体细胞破碎物制备
在平板上刮取少量芽孢杆菌YM37接种到盛有50mL液体LB培养基的锥形瓶中，放入37℃摇床中过夜培养。从过夜培养后的芽孢杆菌菌悬液中取1mL加入到盛有50mL LB液体培养基的锥形瓶中，将该锥形瓶放入摇床中在37℃下培养24h左右到达其稳定期，将菌悬液高温灭菌后再进行实验用。
(2)大肠杆菌悬液制备
在平板上刮取少量大肠杆菌接种到盛有50mL液体LB培养基的250mL锥形瓶中，放入37℃摇床中过夜培养。从过夜培养后的大肠杆菌菌悬液中取1mL加入到盛有50mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，将该锥形瓶放入摇床中在37℃下培养24h左右到达其稳定期，通过平板计数将菌液浓度稀释至108CFU/mL，装在10mL离心管中备用。
(3)放置化妆水
在超净台内称取20g化妆水置于蓝盖玻璃瓶内，加入200μL大肠杆菌菌悬液。空白对照组加入200μL生理盐水，实验组加入200μL灭菌后的芽孢杆菌细胞。阳性对照组加入0.5％(v/v)卡松。
(4)培养
样品加入完毕将瓶子密封后，放入恒温培养箱中培养(温度：37℃)。之后分别取第7天、第14天、第28天的化妆水样品进行化妆水中大肠杆菌总数的测定。
(5)根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，吸取200μL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做3个平皿。同时，分别吸取200μL空白对照组菌悬液加入无菌平皿内作空白对照。
(6)培养24h后计数。
3实验结果及分析
芽孢杆菌培养物菌体对化妆品中菌落总数的影响如图3所示。
如图3所示，分别取上述培养第7天、第14天、第28天的化妆水样品进行菌落总数的测定。在第7天时，对照组和处理组中的菌落总数分别为2.5×105CFU/mL和1.7×104CFU/mL，抑菌率可达99.8％；在第14天时，对照组和实验组中的菌落总数分别为1×105CFU/mL和5.4×103CFU/mL，抑菌率为99.9％，在第14天时，对照组和实验组中的菌落总数分别为2×104CFU/mL和2×102CFU/mL，抑菌率为99.9％。说明芽孢杆菌培养物菌体对大肠杆菌有显著的抑制作用，在化妆品防腐中有广阔的应用前景。
实施例3：本发明所述芽孢杆菌菌株的种属鉴定
1.实验方法
根据pClone007 Vector Kit试剂盒(TSV-007)步骤提取本发明所述菌株的总DNA，以引物M13F-47和M13R-48扩增该菌的16S rDNA基因，回收扩增产物后进行测序，通过测定16S rDNA的序列来进行菌种鉴定。获得的序列结果在NCBI进行Blast比对，从genBank的数据库中获得与该菌株16S rDNA同源的公认标准序列数据，使用MEGA软件计算序列相似性并采用邻位相连算法(Neighbor-Joining)作系统发育分析。
2.实施结果分析
本发明所述菌株经16S rDNA全序列测定鉴定，其序列结果如SEQ ID NO.1所示。
该菌株的16S rDNA在NCBI使用Blast比对，发现是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)并与其相似菌株16S rDNA序列构建16S rDNA系统发育树如图4所示，与蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)DSM 29AJ 320491的同源性最高，可确定本发明所述菌株为蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)，并命名为Paenibacillus alveiYM37。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行适当改变和修饰，这些改变和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 抗大肠杆菌蜂房芽孢杆菌菌株及其在化妆品中的防腐应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 645
<212> DNA
<213> 蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)
<400> 1
aagccctact ctagacggtc attcagagtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc 60
gaattaaacc acatactcca ctgcttgtgc gggtccccgt caattccttt gagtttcagt 120
cttgcgaccg tactccccag gcggaatgct taatgtgtta acttcggcac caagggtatc 180
gaaaccccta acacctagca ttcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct 240
gtttgctccc cacgctttcg cgcctcagcg tcagttacag cccagaaagt cgccttcgcc 300
actggtgttc ctccacatct ctacgcattt caccgctaca cgtggaattc cactttcctc 360
ttctgtactc aagctatgca gttttggatg cgacccaagg ttgagcccta ggtttaaaca 420
cccaacttac attgccgcct gcgcgcgctt tacgcccaat aattccggac aacgctcgcc 480
ccctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgg ggctttcttc tcaggtaccg 540
tcaccctaag agcagttact ctcctaggcg ttcttccctg gcaacagagc tttacgatcc 600
gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct ccgtcagact ttcgt 645

Claims (6)

1.一种抗大肠杆菌蜂房芽孢杆菌菌株，其特征在于所述菌株的分类命名为蜂房芽孢杆菌（Paenibacillus alvei）YM37，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏编号：CGMCC No. 18238，保藏日期为2019年7月17日。
2.一种制备权利要求1所述抗大肠杆菌蜂房芽孢杆菌菌株的发酵液的方法，其特征在于所述方法为：将活化后的蜂房芽孢杆菌（Paenibacillus alvei）YM37按体积比2%-10%接种量接种于装有LB液体培养基的锥形瓶中，37℃、180 rpm密闭培养过夜，即得到含有抗菌代谢物的芽孢杆菌发酵液。
3.一种芽孢杆菌发酵提取物，其特征在于制备方法为：将权利要求2得到的所述含有抗菌代谢物的芽孢杆菌发酵液，用5000 rpm-15000 rpm条件进行离心；
对离心所得上清液进行过滤得到上清液粗提物；和/或对离心所得沉淀物进行超声破碎或高温破碎，得到细胞破碎物；所述上清液粗提物或细胞破碎物即为芽孢杆菌发酵提取物。
4.权利要求1所述抗大肠杆菌蜂房芽孢杆菌菌株或其发酵液或其发酵提取物在制备化妆品或护肤品防腐剂中的应用。
5.权利要求1所述抗大肠杆菌蜂房芽孢杆菌菌株或其发酵液或其发酵提取物在化妆品或护肤品贮存抑制大肠杆菌中的应用。
6.一种化妆品保藏方法，其特征在于方法如下：
1）对化妆品贮藏容器进行包装密封前灭菌，放入适量化妆品；
2）使用权利要求2所述方法制备的芽孢杆菌发酵液，浓缩发酵液菌浓度为106-109 CFU/mL，进行细胞破碎得到细胞破碎物或上清液提纯得到上清液粗提物；
3）将化妆品与步骤2）中的细胞破碎物或上清液粗提物置于同一容器中保存，细胞破碎物或上清液粗提物在化妆品容器中的体积比为不超过1%；置于25-37 ℃下保藏。
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