脆弱拟杆菌在制备防治副溶血弧菌感染的组合物中的应用
技术领域
本发明涉及脆弱拟杆菌的应用技术领域,特别是涉及脆弱拟杆菌在制备防治副溶血弧菌感染的组合物中的应用。
背景技术
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)为革兰氏阴性菌,广泛分布在鱼类、贝类等海产品中,是海水养殖中的一种重要嗜盐食源性致病菌。副溶血弧菌广泛存在于海水、海底沉积物以及鱼贝虾蟹等海产品中,能引起鱼、虾、蟹和贝类等多种养殖动物的疾病,不仅给水产殖业造成严重的经济损失,而且食用受该菌污染或者加工不当的海产品,可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐等典型胃肠炎反应,对人类健康造成严重危害。由该菌引起的食物中毒案例在世界各地均有报道,受害最严重的国家和地区主要包括日本、韩国、香港、中国台湾和中国大陆。污染了大量该菌而又未经良好加工处理的海产品被人类食用后会引起急性胃肠炎或食物中毒。2010年爆发的对虾“偷死病”就是由副溶血弧菌引起的。我国食源性疾病监控网络数据显示,近年来由副溶血弧菌引起的食物中毒已经成为我国沿海地区细菌性食物中毒之首。另外,美国疾病预防控制中心网站(http://www.cdc.gov/foodborneburden/trends-in-foodborne-illness.html)最新数据也显示,自2005年起,副溶血弧菌引起的食物中毒呈全球性显著上升趋势。
该菌分布极广,主要分布在海水和水产品中,我国华东地区沿岸的海水的副溶血弧菌检出率为47.5%-66.5%,海产鱼虾的平均带菌率为45.6%-48.7%,夏季可高达90%以上。除了海产品以外,畜禽肉、咸菜、咸蛋、淡水鱼等都发现有副溶血弧菌的存在。海水是本菌的污染源,主要传播途径是通过食物传播,比如海产品、海盐、盐腌渍品等,常见者为蟹类、小龙虾、牡蛎、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等,其次为蛋品、肉类或蔬菜。另外有肠道病史的患者、沿海带菌人员也是传染源之一。
如果处理加工食物的工具(如操作台、刀墩、容器、贮藏室等)生熟不分, 生食品中的副溶血弧菌可通过上述工具污染其他食物,特别是熟食制品。在中国,部分牡蛎产品的污染量可达24000MPN/100g,牡蛎带菌的海产品极易通过操作台、砧板、餐具、容器,冰箱等各种途径使其它食品受到该菌的污染。受到副溶血弧菌污染的食物,在较高温度下存放,食用前不加热,或加热不彻底,即可引起食物中毒。另外,沿岸海水及海底沉积物中副溶血弧菌也会对水产食品造成污染,并且还有可能造成海域附近的河流、池塘和井水的污染,从而使该区域的淡水产品也受到副溶血弧菌的污染。
目前已发现其毒力因子包括耐热溶血素、耐热相关溶血素、粘附素、尿素酶、脂多糖、Ⅲ型分泌系统、粘液素酶和摄铁系统等,但副溶血弧菌引起食物中毒的确切致病机制尚未完全阐明。正因为副溶血弧菌是人鱼共患病原之一,所以防治副溶血弧菌感染引起的胃肠炎等疾病引起研究者的广泛关注。
脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis,B.f)作为拟杆菌的模式种,它常见于哺乳动物的下消化道,是人和动物肠道中的共生菌。它属于革兰氏阴性菌、杆状、两端钝圆而浓染,有荚膜、无芽胞、无动力的专性厌氧细菌。近年来许多研究发现脆弱拟杆菌在作为潜在的益生菌菌株方面可能具有良好的开发前景。而关于脆弱拟杆菌在治疗副溶血弧菌的感染还尚未见报道。
发明内容
基于此,本发明提供了一种脆弱拟杆菌的新应用。
具体技术方案如下:
脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)在制备防治副溶血弧菌感染的药物或食品中的应用。
在其中一些实施例中,所述脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)ZY-312。
在其中一些实施例中,所述脆弱拟杆菌包括脆弱拟杆菌活菌、脆弱拟杆菌灭活菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。
在其中一些实施例中,所述药物的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、气雾剂或管饲制剂。所述药物可用于人或动物。
在其中一些实施例中,所述食品为奶粉、冰激凌、奶基发酵食品或谷类发酵食品。所述食品还可以是动物食品,比如饲料等。
本发明还提供了一种防治副溶血弧菌感染的药物。
具体技术方案如下:
一种防治副溶血弧菌感染的药物,其活性成分包括有脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis),所述脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)ZY-312。
在其中一些实施例中,所述脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)包括脆弱拟杆菌活菌、脆弱拟杆菌灭活菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。
本发明还提供了一种防治副溶血弧菌感染的食品。
具体技术方案如下:
一种防治副溶血弧菌感染的食品,包括有脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis),所述脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)ZY-312。
在其中一些实施例中,所述脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)包括脆弱拟杆菌活菌、脆弱拟杆菌灭活菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。
本发明的脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)ZY-312,已于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),其保藏编号为CGMCC No.10685,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的发明人经过长期经验积累以及大量创造性实验研究发掘了脆弱拟杆菌新的用途,开拓了脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)的一个新的应用领域。本发明通过实验证明,脆弱拟杆菌活菌液、脆弱拟杆菌灭活菌体、脆弱拟杆菌裂解物溶液和脆弱拟杆菌培养上清液均对副溶血弧菌的感染具有很好的防治效果,从而预示了脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)具有很好的食用和药用前景。脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)作为一种肠道菌,其活菌液、灭活菌体、裂解物溶液以及培养上清液均可用于制备防治副溶血弧菌感染的药物或食品。
附图说明
图1为本发明的脆弱拟杆菌厌氧培养后菌落形态;
图2为本发明的脆弱拟杆菌革兰氏染色镜检图(1000×);
图3为实施例2的脆弱拟杆菌抑制副溶血弧菌感染细胞的结果图。
具体实施方式
以下结合具休实施例对本发明作进一步详细的说明,这些实施例仅用来说明本发明,并不限制本发明的范围。
以下实施例所述脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)ZY-312,于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),其保藏编号为CGMCC No.10685,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1脆弱拟杆菌的分离及样品的制备
(1)脆弱拟杆菌的增菌培养及样品制备
将菌种划线接种于血平皿,37℃、厌氧培养48h。
菌落特征:脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上培养48h后,呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血,菌落直径在1-3mm,参见图1。
显微镜下形态:脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色镜检,为革兰阴性细菌,呈现典型的杆状,两端钝圆而浓染,菌体中间不着色部分形如空泡,参见图2。
(2)样品的制备
1)增菌:选取单个菌落接种于TSB(胰蛋白胨大豆肉汤,含5%胎牛血清)中进行增菌培养,所得菌液保存备用。
2)脆弱拟杆菌活菌液:将步骤1)制备的菌液,用麦氏比浊管做菌数测定,用生理盐水稀释至106CFU/ml,108CFU/ml,1010CFU/ml,将样品分别标记为样品A、样品B和样品C,保存备用。
3)脆弱拟杆菌灭活菌液:采用高温或紫外照射的方法制备脆弱拟杆菌灭活菌液。具体步骤:分别取步骤2)制备的106CFU/mL,108CFU/mL,1010CFU /mL的脆弱拟杆菌活菌液5mL置于烧杯中,并将盛有菌液的烧杯置于100℃的恒温水浴锅中20~30min或置于紫外线环境30~60min,便可制备脆弱拟杆菌灭活菌液,并将样品分别标记为样品D、样品E和样品F。
4)脆弱拟杆菌裂解液:通过超声破碎的方法制备脆弱拟杆菌裂解液。具体步骤:分别采用步骤2)制备的106CFU/mL,108CFU/mL,1010CFU/mL的脆弱拟杆菌活菌液5mL,经超声仪裂解30分钟,On 10秒,Off 10秒,该体系裂解菌体效率>99%,裂解后经6000rpm、10min、4℃离心,0.22μm滤头过滤后备用,并分别标记为样品G、样品H和样品I。
5)脆弱拟杆菌培养上清液:将步骤1)制备的菌液用麦氏比浊管做菌数测定,用生理盐水稀释至106CFU/ml,108CFU/ml,1010CFU/ml,将上述菌液3000rpm,10min离心,收集上清,并将上清通过0.22μm微孔膜过滤,过滤后的上清4℃保存备用。将样品分别标记为样品J、样品K和样品L,保存备用。
表1样品的制备方法
实施例2脆弱拟杆菌对副溶血弧菌感染细胞的影响
本实施例采用实施例1制备的脆弱拟杆菌活菌液、灭活菌液、裂解物溶液、培养上清液进行实验。本实施例采用实时细胞分析技术(Real Time Cell Analysis,RTCA)对贴壁细胞生长的情况和贴壁细胞对外界刺激的反应状态进行实时的动态观察。本实施例设置5组实验,以LoVo细胞和RAW264.7细胞为例,具体实验步骤如下:
1、细胞的预处理
将培养良好的人结肠癌来源的LoVo细胞(或RAW264.7细胞)弃培养上清液,用2.5mL胰酶液37℃消化细胞1~3分钟,显微镜下观察细胞略变圆,松动,则倒弃胰酶液,无菌吸管吸5mL细胞培养基(DMEM/F12(1:1)+10%胎牛血清,下同)吹下消化好的细胞,制成细胞悬液。上述悬液经1000rpm、室温离心5min,弃上清。无菌吸管吸5mL培养基重悬细胞,充分混匀后,血球计数板计数。计数后,将细胞悬液浓度调至2×105个/mL。
2、RTCA检测仪检测细胞活率
1)基线测定:于RTCA细胞培养板每孔中加入100μL细胞培养液,将RTCA细胞培养板放入RTCA检测仪中测量基线;
2)在上述板中每孔再加入300μL上述浓度为2×105个/mL的LoVo细胞(或RAW264.7细胞)悬液。再将RTCA细胞培养板放入RTCA检测仪中,设置RTCA检测仪为每3分钟捡测一次,置入37℃、5%CO2孵箱孵育14小时。
3)将RTCA检测仪暂停,取出RTCA细胞培养板,每孔弃去300μl细胞培养液,分别在试验组1~5加入300μl步骤1制备的LoVo细胞(或RAW264.7细胞)悬液。将RTCA培养板重新放入RTCA检测仪,置入37℃、5%CO2孵箱孵育3小时。
4)将副溶血弧菌野生株J5421接种于5ml高压灭菌的3.5%氯化钠的LB液体培 养基中,放置于37℃孵箱中震荡培养8小时。按1:50转接传代2次后,取对数晚期菌液经4000rpm、10min室温离心后,弃上清,PBS洗涤两次,分别用PBS重悬菌体并调整菌液OD600=1.0,此时菌浓度均约为1×109CFU/mL。用细胞培养基将上述副溶血弧菌野生株J5421稀释10倍,此时的菌浓度约为1×108CFU/mL。
5)将RTCA检测仪暂停,取出RTCA细胞培养板,分别在5组实验的RTCA细胞培养板中每孔加入上述步骤4)中制备的1×108CFU/mL的溶血弧菌野生株J542125μl。然后在实验组1的RTCA细胞培养板中每孔加入25μl实施例1制备的样品B(脆弱拟杆菌活菌液);在实验组2的RTCA细胞培养板中每孔加入25μl实施例1制备的样品E(脆弱拟杆菌灭活菌液);在实验组3的RTCA细胞培养板中每孔加入25μl实施例1制备的样品H(脆弱拟杆菌裂解物溶液);在实验组4的RTCA细胞培养板中每孔加入25μl实施例1制备的样品K(脆弱拟杆菌培养上清液);在实验组5(对照组)的RTCA细胞培养板中每孔加入25μl的PBS。将RTCA培养板重新放入RTCA检测仪,置入37℃、5%CO2孵箱孵育,并对LoVo细胞(或RAW264.7细胞)贴壁生长的情况和贴壁细胞对外界刺激的反应状态进行实时的动态观察。
3、实验结果与分析
LoVo细胞的结果如图3所示,由图3可以看出,加入本发明实施例1制备的样品B(实验组1)、样品E(试验组2)、样本H(试验组3)以及样品K(试验组4)后,虽标准化的细胞指数(normalized cell index,NCI)曲线呈下降趋势,但下降幅度远小于实验组5(对照组)。实验组5的实验结果显示当加入副溶血弧菌和PBS后,标准化的细胞指数曲线即开始逐渐下降,说明LoVo细胞无法正常粘附于RTCA细胞培养板底部的电极处,提示LoVo细胞受到副溶血弧菌毒力伤害后开始松动脱落。上述结果说明,副溶血弧菌对于正常生长的LoVo细胞存在较强毒性作用,而加入脆弱拟杆菌活菌液、脆弱拟杆菌灭活菌液、脆弱拟杆菌裂解物溶液以及培养上清液均对于LoVo细胞存在保护作用,能够抑制副溶血弧菌感染细胞,减轻副溶血弧菌对于LoVo细胞的损害。
RAW264.7细胞的结果与LoVo细胞相似,脆弱拟杆菌同样能够减轻副溶血弧菌对RAW264.7细胞的感染损害。
本发明实施例1表1中提供的其他样品,同样能够抑制副溶血弧菌感染细 胞,对LOVO细胞和RAW264.7细胞具有本实施例类似的保护作用,具体结果省略。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。