BR112015016977B1 - Uso in vitro ou ex vivo de mirna e método in vitro ou ex vivo para avaliar uma infecção viral - Google Patents

Abstract

MIRNA-124 COMO UM BIOMARCADOR. Um uso de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, como um biomarcador, em particular de uma infecção viral, ou de uma eficácia de um tratamento terapêutico da dita infecção viral.

Description

[0001] A presente invenção diz respeito ao campo de biomarcadores, em particular em conexão com infecções virais.

[0002] Mais particularmente, a invenção diz respeito a um novo biomarcador útil como um marcador de diagnóstico para infecções virais. As infecções virais mais particularmente consideradas são infecções virais que requerem a união de RNA, e em particular infecções retrovirais tais como as condições relacionadas com HIV e AIDS. A invenção também diz respeito a um marcador de acompanhamento para os tratamentos das ditas infecções, e em particular condições relacionadas com HIV e AIDS.

[0003] Nos eucariotas superiores, os RNAs mensageiros não são diretamente transcritos na sua forma funcional mas como RNAs pré-mensageiros que têm que passar através de muitos eventos de processamento de modo a serem legíveis pelo mecanismo de tradução celular. O Splicing é o processo que permite eliminar as sequências indesejáveis (íntrons) e juntar aquelas significativas (éxons). O evento de união altamente coordenado ocorre em um complexo grande chamado de Spliceossoma. A formação deste megacomplexo funcional é uma montagem orquestrada de proteínas e RNA que requer a identificação dos limites de éxon- íntron. Os éxons são de modo regularmente alternativo unidos, significando que eles são incluídos ou excluídos do transcrito de mRNA maduro final. Um estudo de sequenciamento compreensivo recente observou que mais do que 90 % dos genes que passam pela união alternativa. A produção de mRNAs alternativamente unidos é regulada por um sistema de proteínas de ação trans que se ligam aos sítios de ação cis no próprio pré-mRNA. Tais proteínas incluem ativadores de união que promovem o uso de um sítio de união particular, e repressores de união que reduzem o uso de um sítio particular, ligando nos sítios realçadores de união (realçadores de união intrônica, ISE e realçadores de união exônica, ESE) e nos sítios silenciadores de união (silenciadores de união intrônica, ISS e silenciadores de união exônica, ISS) respectivamente.

[0004] Os vírus, em particular da família retroviral, são uma das causas principais de doenças em todo o mundo. Três subfamílias podem ser distinguidas dentro da família retroviral: os oncovírus, os lentivírus e os espumavírus.

[0005] Os oncovírus são assim chamados porque eles podem ser associados com cânceres e infecções malignas. Podem ser mencionados, por exemplo, vírus leucemogênicos (tais como o vírus da leucemia aviária (ALV), o vírus da leucemia de murino (MULV), também chamado de vírus Moloney, o vírus da leucemia felina (FELV), os vírus da leucemia humana tais como HTLV1 e HTLV2, o vírus da leucemia símia ou STLV, o vírus da leucemia bovina ou BLV, os oncovírus tipo D de primata, os oncovírus tipo B que são indutores de tumores mamários, ou oncovírus que causam um câncer rápido (tais como o vírus do sarcoma de Rous ou RSV).

[0006] Os espumavírus manifestam especificidade muito baixa para um dado tipo de célula ou uma dada espécie, e eles são algumas vezes associados com os fenômenos imunossupressivos; este é o caso, por exemplo, para o vírus espumoso dos símios (ou SFV).

[0007] Os lentivírus, tais como HIV, são assim denominados porque eles são responsáveis pelas condições patológicas de progressão lenta que muito frequentemente envolve os fenômenos imunossupressivos, incluindo a AIDS.

[0008] Os vírus, e em particular os retrovírus tais como o HIV, são conhecidos por contar com a união de RNA e regulagem de união de modo a se espalhar e disseminar dentro das células e tecidos de um indivíduo infectado.

[0009] Recentemente, o fato de que o HIV seja um retrovírus que requer a união de RNA para expressar proteínas virais chave foi explorado para desenvolver uma nova estratégia com base na inibição de união para combater infecções virais, e em particular AIDS (WO 2010/143169). De fato, o genoma do HIV-1 expressa um transcrito primário de 9 kb que não apenas serve como um RNA genômico para o vírus descendente, mas que também gera 40 mRNAs diferentes. O HIV-1 usa quatro sítios de junção 5’ alternativos múltiplos e oito sítios de junção 3’ alternativos múltiplos para gerar espécies de mRNA unidas. Estes mRNAs unidos podem ser divididos em duas classes: RNAs unidos múltiplos (2 kb) e unidos isoladamente (4 kb). A regulagem da união alternativa do HIV-1 ocorre primariamente por causa da presença de sítios de união subóptimos que diminuem o reconhecimento pelo mecanismo da união celular dos sinais de junção. A união nos sítios de junção viral é regulada ainda pela presença de ESEs, ESSs e ISSs.

[0010] Neste contexto, derivados de quinolina foram desenvolvidos, em particular 8-cloro-N-[4-(trifluorometóxi)fenil]quinolin-2-amina, que foi mostrado inibir a replicação em Células Mononucleares do Sague Periférico (PBMC) de cepas de laboratório trópicas de célula T do HIV-1 e HIV-2 assim como isolados clínicos de subtipos diferentes na faixa de concentrações nM (WO 2010/143169).

[0011] Os microRNAs (miRNA), o grupo não codificador mais compreensivo, são uma classe de RNAs não codificadores de cerca de 22 nt que inibem a expressão de gene através da ligação à Região Não Traduzida (UTR) dos transcritos de mRNA alvo (Lai et al., Nature Genetics, vol. 30, no. 4, pp. 363-364, 2002; Bartel et al., Cell, vol. 136, no. 2, pp. 215-233, 2009). Os genes de miRNA representam cerca de 1 a 2 % dos genomas eucarióticos conhecidos. Os prognósticos sugerem que cada miRNA pode alvejar mais do que 200 transcritos e que um único mRNA pode ser regulado pelos miRNAs múltiplos (LINDOW, DNA Cell Biol., vol. 26(5), p. 339-351, 2007). Os miRNAs são gerados a partir de transcritos na forma de grampo de cabelo endógenos e atuam pelo emparelhamento de base com mRNAs alvos, que levam à clivagem ou repressão traducional do mRNA, dependendo do grau de emparelhamento de base. Dois eventos de processamento levam à formação de miRNA maduro: primeiro, os transcritos de miRNA nascentes (pri-miRNA) são processados em precursores de 70 nucleotídeos (pré-miRNA) que são exportados do núcleo e são clivados no citoplasma para gerar miRNAs maduros curtos (de cerca de 22 nucleotídeos de comprimento) (LEE, EMBO J., vol. 21, p; 4663-4670, 2002). Os miRNAs podem estar localizados inter- ou intragenicamente. Quando intergênicos, a sua expressão é coordenada com outros miRNAs como um grupo (Altuvia et al., Nucleic Acids Research, vol. 33, no. 8, pp. 2697-2706, 2005, Ozsolak et al., Genes and Development, vol. 22, no. 22, pp. 3172-3183, 2008). Quando intragênicos, a saber, posicionados dentro de um gene que codifica a proteína (quase exclusivamente em íntrons), Eles são frequentemente expressados a partir do mesmo filamento como seu gene hospedeiro (Liu et al., Cell Research, vol. 18, no. 10, pp. 985-996, 2008, Kim et al., EMBO Journal, vol. 26, no. 3, pp. 775-783, 2007) e em níveis correlacionados (Baskerville et al., RNA, vol. 11, no. 3, pp. 241247, 2005).

[0012] Os miRNAs foram recentemente implicados na conversa cruzada intrincada entre o hospedeiro e o patógeno nas infecções virais e é considerado desempenhar um papel principal na patogênese viral (NAIR, Trends in Microbiol., vol. 14, p. 169-175, 2006). De fato, os vírus são parasitas intracelulares forçados que usam o mecanismo celular para a sua sobrevivência e replicação, assim esta dependência os tornam susceptíveis aos mecanismos reguladores de gene do hospedeiro. O miRNA celular pode tomar parte em um mecanismo de defesa antiviral, mas, em alguns casos, também pode ser regulador viral positivo. Por outro lado, os próprios vírus também podem produzir miRNAs para regular processos celulares ou genes virais. Os miRNAs envolvidos na infecção pelo HIV-1 poderiam ser definidos como codificados pelo HIV-1 ou codificados pelo hospedeiro de acordo com a sua fonte de biogênese; Eles também poderiam ser definidos como supressores ou ativadores de infecção de acordo com a sua função. Eles podem ser divididos ainda de acordo com se eles alvejam diretamente transcritos do HIV-1 ou indiretamente afetam o HIV-1 pelo alvejamento de fatores hospedeiros que estão envolvidos no ciclo de vida viral, ou alvejamento tanto do genoma do RNA do HIV-1 quanto dos fatores hospedeiros essenciais para a infecção pelo HIV-1. Vários dados atestam que a infecção pelo HIV-1 afeta os caminhos do miRNA globalmente devido à perturbação da biogênese do miRNA mas também individualmente pela modificação dos perfis de expressão do miRNA (Houzet et al., Biochim Biophys Acta. 2011 Nov-Dez; 1809(11-12): 686-693)). Além disso, os miRNAs hospedeiros foram descritos regular o HIV-1.

[0013] Um fator chave para o sucesso do desenvolvimento de um dado medicamento ou vacina é a possibilidade para avaliar eficiente e rapidamente a sua eficácia. Na verdade, é importante para um dado medicamento ou vacina serem administrados na sua janela terapêutica de modo a evitar efeitos indesejados que se originam de uma dosagem muito alta ou para evitar uma falta de eficiência devido a uma dosagem muito baixa. Também, deve-se garantir que o medicamento ou vacina apropriados sejam administrados ao paciente certo, e que este paciente seja de fato responsivo ao medicamento ou vacina. Portanto, simplesmente ligar juntos um dado paciente e um dado medicamento ou vacina nem sempre é o bastante para se obter um efeito terapêutico benéfico. É portanto crítico ter ferramentas apropriadas, tais como biomarcadores específicos, que se possa confiar para avaliar a eficácia de um medicamento ou vacina.

[0014] Portanto, existe uma necessidade quanto a uma ferramenta nova e sensível para avaliar uma infecção viral, e em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana), assim como a eficácia de um tratamento de tais condições.

[0015] Existe necessidade quanto a um novo biomarcador para avaliar a eficácia de um tratamento de uma infecção viral, e em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV.

[0016] Existe uma necessidade quanto a uma ferramenta nova e sensível para avaliar a eficiência de derivados de quinolina que são inibidores de vírus, em particular retrovírus tais como o HIV, e mais particularmente HIV-1 e HIV-2.

[0017] Existe uma necessidade quanto a um novo biomarcador para avaliar a responsividade de um paciente aos derivados de quinolina para prevenir ou tratar uma infecção viral, e em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV.

[0018] Existe uma necessidade quanto a um novo biomarcador para avaliar a eficácia terapêutica de derivados de quinolina para prevenir ou tratar uma infecção viral, e em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV.

[0019] Existe também uma necessidade quanto a um novo biomarcador para triar candidatos a medicamento ou vacina eficazes para prevenir e/ou tratar uma infecção viral, e em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV.

[0020] A presente invenção tem por meta atingir estas necessidades.

[0021] De acordo com um de seus objetivos, a invenção diz respeito a um uso de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, como um biomarcador de uma infecção viral, ou de uma eficácia de um tratamento terapêutico da dita infecção viral.

[0022] Inesperadamente, os inventores observaram, como detalhado nos exemplos abaixo, que, nas PBMCs infectadas com uma cepa do HIV, em particular com uma cepa ADA-M R5 do HIV, o nível de expressão de miR-124 foi diminuído em relação às PBMCs não infectadas.

[0023] Além disto, os inventores inesperadamente observaram que um tratamento com derivados de quinolina, tais como os derivados de quinolina da fórmula (I) ou (II), e em particular com a 8-cloro-N-[4-(trifluorometóxi)fenil]quinolin-2- amina, de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) infectadas com uma cepa do HIV, em particular com a ADA-M R5 do HIV, resultou na remoção dos vírus e em um aumento dramático (13 vezes em relação ao controle) da expressão de miR-124. Os derivados de quinolina podem ser escolhidos entre os compostos descritos na WO 2010/143169 e como ainda descrito abaixo. Consequentemente, um tratamento terapêutico da dita infecção viral pode ser um tratamento com derivados de quinolina.

[0024] Consequentemente, o miR-124 revelou-se por si só como ferramenta poderosa, de outro modo dito como um biomarcador, para monitorar uma infecção viral, em particular uma infecção retroviral, tal como uma infecção pelo HIV, em particular em indivíduos que sofrem de uma tal infecção, assim como para monitorar indivíduos infectados com um vírus, em particular um retrovírus, tal como uma infecção com HIV, e para monitorar tais indivíduos tratados com um medicamento antiviral, em particular com derivados de quinolina da fórmula (I) ou (II) como detalhado abaixo, e em particular com 8-cloro-N-[4-(trifluorometóxi)fenil]quinolin-2- amina.

[0025] Assim, monitorando-se o nível da expressão de miR-124, é possível rastrear ou realizar o controle de qualidade em testes de pesquisa humana ou para monitorar a submissão do paciente a um regime de medicamento ou vacina pelo fornecimento de um meio para confirmar que o paciente está recebendo tratamentos apropriados com medicamento ou vacina, isto é, em termos da dose e tempo. O biomarcador de miR-124 também pode ser usado para otimizar regimes de dosagem. Assim, o biomarcador de miR-124 pode ser usado em conexão com, por exemplo, o controle de tratamento de paciente, testes clínicos, e pesquisa com base em célula.

[0026] De acordo com um outro de seus objetivos, a invenção diz respeito a um uso de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, como um biomarcador de uma infecção viral, preferivelmente com um retrovírus, e mais preferivelmente com um Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV).

[0027] De acordo com um outro de seus objetivos, a invenção diz respeito a um uso de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, como um biomarcador para triar um candidato a medicamento ou candidato a vacina presumidos serem eficazes na prevenção e/ou tratamento de uma infecção viral, em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV.

[0028] De acordo com um outro de seus objetivos, a invenção diz respeito ao uso de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo mi RNA-124, como um biomarcador, para avaliar o efeito biológico, em particular o potencial farmacológico, de um composto candidato, para alterar a atividade fisiológica de uma célula ou uma proteína.

[0029] A este respeito, foi aqui mostrado que o nível de expressão de miR-124 varia na administração de vários compostos que são conhecidos possuir uma atividade farmacológica. Assim, os inventores mostraram que miR-124 consiste de um biomarcador relevante da atividade farmacológica potencial de um composto candidato.

[0030] Em particular, o candidato a medicamento ou candidato a vacina presumidos serem eficazes na prevenção e/ou tratamento de uma infecção viral podem ser um derivado de quinolina.

[0031] Em particular, o candidato a medicamento ou candidato a vacina presumidos serem eficazes na prevenção e/ou tratamento de uma infecção viral podem ser um derivado de quinolina da fórmula (I):

em que • n é 1 ou 2 e R, independentemente, representa um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C3); um grupo -NR1R2 em que R1 e R2 são independentemente um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C3); um grupo fluoroalcóxi (C1-C3); um grupo -NO2; um grupo fenóxi; e um grupo alcóxi (C1-C4), • R’ é um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C4) e um grupo alcóxi (C1-C4), • R” é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C4), ou um de seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

[0032] O candidato a medicamento ou candidato a vacina presumidos serem eficazes na prevenção e/ou tratamento de uma infecção viral também podem ser um derivado de quinolina da fórmula (II):

em que: • n é 1 ou 2 e R, independentemente, representa um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C3); um grupo -CN; um grupo hidroxila; um grupo -COOR1; um grupo fluoroalquila (C1-C3); um grupo -NO2; um grupo -NR1R2 com R1 e R2 sendo um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C3); e um grupo alcóxi (C1-C4), • R’ é um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C4) e um grupo alcóxi (C1-C4), • R” é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C4), ou um de seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

[0033] Dentro da invenção, o termo “prevenir” intenciona significar reduzir a probabilidade de ocorrência de um dado evento, a saber, no contexto da invenção, uma infecção viral.

[0034] De acordo com um outro de seus objetivos, a invenção diz respeito a um uso de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, como um biomarcador de uma atividade de um derivado de quinolina, ou um de seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em uma infecção viral, em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV.

[0035] De acordo com um outro de seus objetivos, a invenção diz respeito a um uso de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, como um biomarcador de uma atividade de um derivado de quinolina da fórmula (I):

• n é 1 ou 2 e R, independentemente, representa um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C3); um grupo -NR1R2 em que R1 e R2 são independentemente um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C3); um grupo fluoroalcóxi (C1-C3); um grupo -NO2; um grupo fenóxi; e um grupo alcóxi (C1-C4), • R’ é um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C4) e um grupo alcóxi (C1-C4), • R” é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C4), ou um de seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em uma infecção viral, e em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV.

[0036] De acordo com um outro de seus objetivos, a invenção diz respeito a um uso de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, como um biomarcador de uma atividade de um derivado de quinolina da fórmula (II):

em que • n é 1 ou 2 e R, independentemente, representa um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C3); um grupo -CN; um grupo hidroxila; um grupo -COOR1; um grupo fluoroalquila (C1-C3); um grupo -NO2; um grupo -NR1R2 com R1 e R2 sendo um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C3); e um grupo alcóxi (C1-C4), • R’ é um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C4) e um grupo alcóxi (C1-C4), • R” é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C4), ou um de seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em uma infecção viral, em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV.

[0037] De acordo com uma forma de realização particular, um derivado de quinolina da invenção pode ser 8-cloro-N-[4-(trifluorometóxi)fenil]quinolin-2-amina ou 8-cloro-N-[4-(trifluorometil)piridin-2-il]quinolin-2-amina.

[0038] Assim, de acordo com um outro de seus objetivos, a invenção diz respeito a um uso de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, como um biomarcador de uma atividade de um derivado de quinolina selecionado de:

[0039] Dentro da invenção, as expressões “infecção viral” e “infecção com um vírus” referem-se a qualquer infecção viral, e em particular a qualquer infecção retroviral, que pode ocorrer em uma célula, um tecido, um órgão ou um indivíduo suscetíveis para expressar um biomarcador da invenção. Preferivelmente, uma infecção viral retroviral pode ser uma infecção lentiviral, e mais preferivelmente uma infecção pelo HIV. Um indivíduo dentro da invenção pode ser um mamífero, e preferivelmente um ser humano suscetível para expressar um biomarcador da invenção. Dentro da invenção, indivíduo e paciente são usados intercambiavelmente.

[0040] Dentro da invenção, o termo “vírus” refere-se a qualquer vírus, em particular um retrovírus e preferivelmente um lentivírus tal como um vírus do HIV, mais preferivelmente HIV-1 ou HIV-2.

[0041] De acordo com um outro de seus objetivos, a invenção diz respeito a um método para avaliar uma infecção viral, e em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV, em um paciente presumido estar infectado com um vírus, compreendendo pelo menos as etapas de:

[0042] a - medir uma presença ou um nível de expressão de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, em uma amostra biológica previamente obtida do dito paciente; e

[0043] b - comparar a dita presença ou nível de expressão com um valor de referência de controle,

[0044] em que uma presença ou nível modulados de expressão do dito miRNA em relação ao dito valor de referência de controle são indicativos de uma infecção viral.

[0045] De acordo com um outro de seus objetivos, a invenção diz respeito a um método de avaliar uma atividade de um derivado de quinolina da fórmula (I) para prevenir e/ou tratar uma infecção viral, em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV, em um paciente tratado com o dito derivado de quinolina, compreendendo pelo menos as etapas de:

[0046] a - medir uma presença ou um nível de expressão de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, em uma primeira amostra biológica previamente obtida do dito paciente antes da administração do dito derivado de quinolina e em uma segunda amostra biológica previamente obtida do dito paciente depois da administração do dito derivado de quinolina; e

[0047] b - determinar se a dita presença ou nível de expressão são modulados na segunda amostra biológica obtida depois do tratamento quando comparada com a segunda amostra biológica obtida antes do tratamento;

[0048] em que uma presença ou nível modulados de expressão do dito miRNA são indicativos de uma atividade do dito derivado de quinolina.

[0049] “Amostra biológica,” como aqui usado, no geral refere-se a uma amostra obtida de um objeto biológico, incluindo amostra de origem biológica d tecido ou fluido, obtida, atingida, ou coletada in vivo ou in situ. Tais amostras podem ser, mas não são limitadas a, órgãos, tecidos, frações e células isoladas de um mamífero. As amostras biológicas exemplares incluem mas não são limitadas ao lisado de célula, uma cultura de célula, uma linhagem de célula, um tecido, tecido oral, tecido gastrointestinal, um órgão, uma organela, um fluido biológico, uma amostra de sangue, uma amostra de soro, uma amostra de urina, uma amostra de pele, e os semelhantes. As amostras biológicas preferidas incluem mas não são limitadas a uma amostra de sangue, uma de plasma, uma de soro, uma de PBMC, uma de biópsia de tecido, uma de mucosa oral, uma de saliva, um fluido intersticial, ou uma amostra de urina, e os semelhantes.

[0050] Em uma forma de realização, uma amostra biológica adequada para a invenção pode ser selecionada em um grupo consistindo de uma amostra de tecido biológico, uma amostra de sangue integral, uma amostra de esfregaço, uma amostra de plasma, uma amostra de soro, uma amostra de saliva, uma amostra de fluido vaginal, uma amostra de esperma, uma amostra de fluido faríngeo, uma amostra de fluido brônquico, uma amostra de fluido fecal, uma amostra de fluido cerebrospinal, uma amostra de fluido lacrimal e uma amostra de sobrenadante de cultura de tecido.

[0051] A invenção diz respeito ainda a uma amostra biológica isolada compreendendo um biomarcador, em que a dita amostra biológica é selecionada em um grupo compreendendo, e preferivelmente consistindo em uma amostra de tecido, sangue integral, amostra de esfregaço, plasma, soro, saliva, fluido vaginal, esperma, fluido faríngeo, fluido brônquico, fluido fecal, fluido cerebrospinal, fluido lacrimal e sobrenadantes de cultura de tecido; em que o dito biomarcador é um biomarcador de miRNA, e preferivelmente miR-124.

[0052] De acordo com um outro de seus objetivos, a invenção diz respeito a um método para avaliar o efeito biológico de um composto candidato e em particular para triar um candidato a medicamento ou candidato a vacina, presumidos serem eficazes na prevenção e/ou tratamento de uma infecção viral, e em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV, compreendendo pelo menos as etapas de: a. tratar pelo menos uma célula isolada capaz de expressar pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, com o dito candidato, a dita célula estando sob condições adequadas para expressar o dito pelo menos um miRNA, b. medir uma presença ou nível de expressão do dito pelo menos um miRNA, c. comparar a dita presença ou nível de expressão medidos com uma medida ou nível de expressão do dito pelo menos um miRNA em uma célula isolada não tratada,

[0053] em que uma presença ou nível modulados de expressão do dito miRNA é indicativo de um efeito biológico de um composto candidato e em particular da eficácia do dito candidato a medicamento ou candidato a vacina em uma infecção viral.

[0054] Dentro da invenção, os termos “modulação” ou “presença ou nível modulados de expressão” são intencionados a significar que a presença ou nível de expressão de um biomarcador da invenção é induzido ou aumentado, ou alternativamente é suprimido ou diminuído.

[0055] Assim, decorre dos resultados experimentais aqui contidos que miR-124, e notavelmente o nível de expressão de miR-124, consiste de um biomarcador relevante que é indicativo de uma mudança fisiológica de uma proteína ou uma célula, incluindo uma mudança metabólica de uma célula, mudança esta que materializa um efeito farmacológico benéfico.

[0056] Então, como previamente estabelecido, a invenção também diz respeito ao uso de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miRNA-124, para avaliar o efeito biológico, em particular o efeito farmacológico, de um composto candidato.

[0057] Esta invenção também diz respeito ao uso de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miRNA-124, para avaliar a capacidade de um composto candidato de alterar a atividade fisiológica de uma proteína ou uma célula.

[0058] A alteração da atividade fisiológica de uma proteína ou uma célula pode ser facilmente determinada por uma pessoa habilitada na técnica pela identificação de qualquer mudança detectável na medição de um parâmetro fisiológico de uma célula, incluindo na medição de um parâmetro metabólico da célula, que abrange mudanças eletrofisiológicas, mudanças na permeabilidade da membrana celular, mudanças na atividade enzimática, mudanças na expressão da proteína, mudanças na expressão de miRNA, mudanças na expressão do gene, valores de pH intracelular, etc.

[0059] Os termos “determinar,” “medir,” “avaliar,” “estimar,” e “ensaiar,” como aqui usados, no geral se referem a qualquer forma de medição, e incluem determinar se um elemento está presente ou não. Estes termos incluem determinações quantitativas e/ou qualitativas. A estimativa pode ser relativa ou absoluta. A frase “estimar a presença de” pode incluir determinar a quantidade de algo presente, assim como determinar se o mesmo está presente ou ausente.

[0060] De acordo com uma forma de realização preferida, quando da estimativa de uma infecção viral, uma observação de uma presença reduzida ou suprimida, ou um nível diminuído de expressão, do dito miRNA em relação a um valor de referência de controle pode ser indicativa de uma infecção viral.

[0061] De acordo com uma forma de realização preferida, quando da estimativa de uma atividade de um derivado de quinolina da fórmula (I) para o tratamento de uma infecção viral ou quando da triagem de um candidato a medicamento ou candidato a vacina presumidos serem eficazes na prevenção e/ou tratamento de uma infecção viral, uma observação de uma presença induzida ou aumentada, ou um nível aumentado de expressão, do dito miRNA em relação a um valor de referência de controle pode ser indicativo de uma atividade do dito derivado de quinolina da fórmula (I) ou de uma eficácia do dito candidato a medicamento ou candidato a vacina.

[0062] De acordo com uma forma de realização preferida, os usos e métodos da invenção são realizados in vitro ou ex vivo.

[0063] De acordo com um outro de seus objetivos, a invenção diz respeito a uma sonda de ácido nucléico isolada capaz de hibridizar especificamente ao miR-124 como um agente de diagnóstico para medir uma presença ou um nível da expressão de miR-124 para diagnosticar uma infecção viral, em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV, ou para avaliar uma atividade de um candidato a medicamento ou candidato a vacina presumidos serem eficazes para prevenir e/ou tratar uma infecção viral, em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV.

[0064] O termo “sonda” como aqui usado, no geral refere-se a um agente de captura que é direcionado a uma sequência de biomarcador de miRNA alvo específica. Consequentemente, cada sonda de um conjunto de sondas tem um respectivo biomarcador de miRNA alvo. Um duplex de sonda/alvo de miRNA é uma estrutura formada pela hibridização de uma sonda ao seu biomarcador de miRNA alvo.

[0065] Uma sonda de ácido nucléico isolada adequada para a invenção pode ser preferivelmente uma sonda de ácido nucléico consistindo em uma sequência de ácido nucléico selecionada do grupo consistindo da SEQ ID NO: 6 à SEQ ID NO: 87.

[0066] De acordo com uma de suas vantagens, a invenção fornece um biomarcador útil e confiável para o acompanhamento de pacientes infectados com um vírus, preferivelmente com um retrovírus, e mais preferivelmente com um vírus do HIV.

[0067] De acordo com uma de suas vantagens, a invenção fornece um biomarcador útil e confiável para o acompanhamento de pacientes infectados com um vírus, preferivelmente com um retrovírus, e mais preferivelmente com um vírus do HIV, e tratado com derivado de quinolina da fórmula (I).

[0068] De acordo com uma outra de suas vantagens, a invenção fornece um biomarcador sensível e confiável que pode ser facilmente usado no leito de um paciente.

USOS E MÉTODOS

[0069] De acordo com uma forma de realização, o uso e métodos de acordo com a invenção podem, em particular, permitir a determinação de uma infecção viral em um paciente, e em particular para o acompanhamento de tal infecção.

[0070] De acordo com uma forma de realização, uma presença ou um nível de expressão de miR-124 são medidos em uma amostra biológica isolada, e depois são comparados a um valor de referência de controle.

[0071] Uma modulação da presença ou nível de expressão de miR-124 em relação ao valor de referência de controle pode ser indicativa de uma infecção viral. Em particular uma presença reduzida ou suprimida, ou um nível de expressão diminuído, do dito miRNA em relação a um valor de referência de controle pode ser indicativo de uma infecção viral.

[0072] Em uma forma de realização, um uso da invenção pode compreender a obtenção de um nível de expressão medido do dito miR-124 em uma amostra biológica isolada e comparando o dito nível de expressão medido com um valor de referência de controle. Uma observação de uma modulação do dito nível medido em relação ao dito valor de referência de controle pode ser indicativa de uma infecção viral, ou de uma eficácia de um tratamento terapêutico da dita infecção viral.

[0073] Quando o miR-124 de uma amostra é “diminuído” ou “infra-regulado” em uma amostra biológica isolada de um paciente, quando comparada a um valor de referência de controle, esta diminuição pode ser, por exemplo, de cerca de 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 500 %, 1.000 %, 5.000 % ou mais do valor de referência de controle comparativo (isto é, sem o tratamento pelo derivado de quinolina).

[0074] Em particular, o nível medido da expressão de miR-124 pode ser uma diminuição de pelo menos duas vezes, preferivelmente pelo menos quatro vezes, preferivelmente pelo menos seis vezes, preferivelmente pelo menos oito vezes, e mais preferivelmente pelo menos dez vezes em relação ao dito valor de referência de controle.

[0075] De acordo com uma forma de realização, os usos e métodos de implementar miR-124 como um biomarcador para uma infecção viral, e em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV, podem ser combinados com a determinação de outros biomarcadores específicos da dita infecção tal como a determinação da presença ou nível de expressão de peptídeos, proteínas ou sequências de ácido nucléico específicos do dito vírus. Outros biomarcadores específicos de uma infecção viral, e em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV, podem ser, por exemplo, as proteínas ou as sequências de ácido nucléico que codificam Tat, gp120 ou gp41, ou um dos linfócitos do nível T4.

[0076] O biomarcador miR-124 pode ser usado para monitorar ou controlar um paciente que sofre de uma infecção viral, e em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV ou AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida).

[0077] De acordo com uma forma de realização, o aumento da presença ou nível de expressão de miR-124 em uma amostra biológica tirada de um paciente que sofre de uma infecção viral e que recebe um tratamento para esta infecção em relação a uma amostra biológica tirada do mesmo paciente antes do início do dito tratamento pode ser indicativo da eficácia do dito tratamento.

[0078] De acordo com uma forma de realização, os usos e métodos da invenção podem ser para avaliar uma responsividade de um paciente a um tratamento com os ditos derivados de quinolina da fórmula (I).

[0079] De acordo com uma outra forma de realização, os usos e métodos da invenção podem ser para avaliar uma eficácia de um tratamento com o dito derivado de quinolina da fórmula (I).

[0080] De acordo com uma outra forma de realização, os usos e métodos da invenção podem ser para avaliar uma eficácia terapêutica de derivados de quinolina da fórmula (I) como um agente terapêutico para prevenir e/ou tratar uma infecção viral.

[0081] De acordo com uma forma de realização, os usos e métodos da invenção podem ser para avaliar uma submissão do paciente com um tratamento com o dito derivado de quinolina da fórmula (I).

[0082] O biomarcador de miR-124 pode ser usado para monitorar ou controlar a atividade de derivados de quinolina da fórmula (I) durante o tratamento de uma infecção viral do paciente, e em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV ou AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida).

[0083] Um método de avaliar ou monitorar a atividade de um derivado de quinolina da fórmula (I) em um paciente tratado com o derivado de quinolina pode envolver medir um nível de expressão de miR-124 em uma amostra isolada, preferivelmente PBMC (Célula Mononuclear de Sangue Periférico) isolada, e comparar o nível medido de expressão com um nível de expressão de miR-124 em uma amostra isolada tirada do paciente antes do tratamento. Seguindo-se o nível de miR-124, a atividade do derivado de quinolina pode ser monitorada com o tempo.

[0084] De acordo com uma forma de realização, um uso ou um método de acordo com a invenção pode ser implementado para otimizar o regime de dosagem de um paciente. Pacientes podem responder diferentemente a um dado derivado de quinolina da fórmula (I), dependendo de fatores tais como idade, saúde, fundo genético, presença de outras complicações, progressão de doença, e a coadministração de outros medicamentos. Pode ser útil utilizar o biomarcador de miR-124 para avaliar e otimizar o regime de dosagem, tal como a quantidade de dose e/ou o programa dose, de um derivado de quinolina em um paciente. A este respeito, o biomarcador com base em miR-124 também pode ser usado para rastrear e ajustar a eficácia do tratamento indivíduo do paciente com o tempo. O biomarcador pode ser usado para se obter a informação necessária para se fazer ajustes em um tratamento do paciente, aumentando ou diminuindo a dose de um agente como necessário. Por exemplo, um paciente que recebe um derivado de quinolina pode ser testado usando o biomarcador com base em miR-124 para observar se a dosagem está sendo eficaz, ou se um plano de tratamento mais agressivo necessita ser implantado. A quantidade de medicamento administrado, a cronometragem da administração, a frequência de administração, a duração da administração podem ser então ajustados dependendo da medição do biomarcador de miR-124.

[0085] O biomarcador de miR-124 também pode ser usado para rastrear a submissão do paciente durante regimes de tratamento individuais, ou durante testes clínicos. Isto pode ser seguido em intervalos fixos para garantir que os pacientes incluídos no teste estão tomando os medicamentos como instruído. Além disso, um paciente que recebe um derivado de quinolina pode ser testado usando o biomarcador de miR-124 para determinar se o paciente cumpre com o regime de dosagem do plano de tratamento. Um nível de expressão aumentado do biomarcador comparado com aquele de uma amostra de controle não tratada é indicativo de obediência com o protocolo.

[0086] Um biomarcador da invenção pode ser implementado para avaliar e seguir a eficácia dos derivados de quinolina da fórmula (I). Consequentemente, uma presença ou nível de expressão de miR-124 podem ser medidos em uma amostra biológica isolada obtida de um paciente previamente tratado com um derivado de quinolina da fórmula (I). Depois, a presença ou nível medidos da expressão de miR- 124 em uma amostra biológica isolada pode ser comparada a um valor de referência de controle.

[0087] Quando um aumento do nível medido em relação ao valor de referência de controle é observado, então a medida é indicativa de uma atividade dos ditos derivados de quinolina da fórmula (I).

[0088] Em uma outra forma de realização, quando um aumento do nível medido em relação ao valor de referência de controle é observado, então a medida pode ser indicativa de uma responsividade de um paciente a um tratamento com os ditos derivados de quinolina da fórmula (I).

[0089] Em uma outra forma de realização, quando um aumento do nível medido em relação ao valor de referência de controle é observado, então a medida pode ser indicativa de uma eficácia de um tratamento com os ditos derivados de quinolina da fórmula (I).

[0090] Em uma outra forma de realização, quando um aumento do nível de expressão medido em relação ao valor de referência de controle é observado, então a medida pode ser indicativa de uma eficácia terapêutica dos ditos derivados de quinolina da fórmula (I) como um agente terapêutico para prevenir e/ou tratar uma infecção viral.

[0091] Quando miR-124 de uma amostra é “aumentado” ou “supra-regulado” depois de um tratamento com um derivado de quinolina, quando comparado com um valor de referência de controle não tratado, este aumento pode ser, por exemplo, de cerca de 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 500 %, 1.000 %, 5.000 % ou mais do valor de referência de controle comparativo (isto é, sem o tratamento pelo derivado de quinolina.

[0092] Em particular, o nível de expressão medido de miR-124 pode ser um aumento de pelo menos duas vezes, preferivelmente pelo menos um de quatro vezes, preferivelmente pelo menos um de seis vezes, preferivelmente pelo menos um de oito vezes, e mais preferivelmente pelo menos um de dez vezes em relação ao dito valor de referência de controle.

[0093] De acordo com uma outra forma de realização da invenção, quando da monitoração de uma infecção viral ou avaliar uma eficácia de um tratamento de infecção viral, em particular com um derivado de quinolina da fórmula (I), um paciente pode ser testado com um método ou um uso da invenção em um intervalo de tempo selecionado do grupo consistindo de hora em hora, duas vezes ao dia, diariamente, duas vezes por semana, semanalmente, duas vezes ao mês, mensalmente, duas vezes ao ano, anualmente, e a cada dois anos. A amostra então coletada pode ser testado imediatamente, ou pode ser armazenada para teste posterior.

[0094] De acordo com uma outra forma de realização, o uso e métodos de acordo com a invenção, em particular, podem permitir a triagem, identificação ou avaliação de agentes ativos potenciais como um candidato a medicamento.

[0095] Em particular, os usos e métodos de acordo com a invenção são particularmente vantajosos para a triagem, identificação ou avaliação de agentes ativos potenciais, tais como um candidato a medicamento ou uma vacina presumidos serem eficazes para uma infecção viral.

[0096] De acordo com uma outra forma de realização da invenção, um biomarcador de miR-124 pode ser implementado para triar um candidato a medicamento ou um candidato a vacina presumidos serem eficazes para prevenir e/ou tratar uma infecção viral. Em tal forma de realização, uma presença ou nível de expressão de miR-124 podem ser medidos em uma amostra biológica isolada ou célula isolada previamente contatada com o medicamento ou vacina a serem triados. Depois, a medida obtida pode ser comparada a um valor de referência de controle.

[0097] Quando um aumento do nível medido em uma amostra biológica isolada ou célula isolada, previamente contatada com o composto, medicamento ou candidato a vacina a ser triado, em relação a um valor de referência de controle é observado, então a medida pode ser indicativa do dito candidate ter um efeito biológico e em particular ser eficiente para alterar a atividade fisiológica de uma célula.

[0098] Em particular, um candidato a medicamento ou candidato a vacina pode ser caracterizado como sendo eficiente na prevenção e/ou tratamento de uma infecção viral, e em particular uma infecção retroviral, e mais particularmente uma infecção pelo HIV.

[0099] Quando miR-124 de uma amostra é “aumentado” ou “supra-regulado” depois do tratamento com um candidato a medicamento ou vacina , quando comparado a um valor de referência de controle não tratado, este aumento pode ser, por exemplo, de cerca de 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 500 %, 1.000 %, 5.000 % ou mais do valor de referência de controle comparativo (isto é, sem o tratamento pelo derivado de quinolina).

[0100] Em particular, o nível de expressão medido de miR-124 pode ser pelo menos um aumento de duas vezes, preferivelmente pelo menos um de quatro vezes, preferivelmente pelo menos um de seis vezes, preferivelmente pelo menos um de oito vezes, e mais preferivelmente pelo menos um de dez vezes em relação ao dito valor de referência de controle.

[0101] Os usos e métodos da invenção podem compreender medir um nível de expressão de miR-124 em uma amostra biológica isolada. Qualquer amostra adequada pode ser usada para avaliar o biomarcador de miR-124.

[0102] Em particular, uma amostra biológica adequada para a invenção pode ser um fluido biológico, tal como uma amostra de sangue, uma de plasma, ou uma de soro, uma de saliva, uma de fluido intersticial, ou uma de urina; uma amostra de célula, tal como uma cultura de célula, uma linhagem de célula, ou uma amostra de PBMC, uma biópsia de tecido, tal como uma amostra de tecido oral, uma de tecido gastrointestinal, uma de pele, uma de mucosa oral, ou uma pluralidade de amostras de um teste clínico. A amostra pode ser uma amostra bruta, ou pode ser purificada em vários graus antes da armazenagem, processamento, ou medição.

[0103] A etapa de coletar as amostras biológicas para os usos e métodos da invenção é realizada antes de realizar a invenção e não é uma etapa de um uso ou um método de acordo com a invenção.

[0104] As amostras para a avaliação do miRNA pode ser tirada durante qualquer um dos intervalos desejados. Por exemplo, amostras podem ser tiradas de hora em hora, duas vezes ao dia, diariamente, semanalmente, mensalmente, a cada dois meses, anualmente, ou os semelhantes. A amostra pode ser testada imediatamente, ou pode ser armazenada para teste posterior.

[0105] As amostras podem ser purificadas antes do teste. Em algumas formas de realização, o miR-124 pode ser isolado dos conteúdos celulares remanescentes antes do teste. Além disso, as moléculas de miR-124 podem ser separadas do resto do mRNA na amostra, se desejado. Por exemplo, o miR-124 pode ser separado do mRNA com base nas diferenças de tamanho antes do teste.

[0106] O valor de referência de controle a ser usado para comparar o nível de expressão medido de miR-124 em uma amostra biológica testada é obtido a partir de uma amostra de controle.

[0107] As amostras de controle podem ser tiradas de várias fontes. Em algumas formas de realização, as amostras de controle são tiradas do paciente antes do tratamento ou antes da presença da doença (tal como uma amostra de sangue arquivada). Em outras formas de realização, as amostras de controle são tiradas de um conjunto de membros normais, não doentes de uma população. Em uma outra forma de realização, um ensaio de célula pode ser realizado em uma cultura de célula de controle, por exemplo, que não foi tratada com o composto de teste ou foi tratado com um composto de referência, tal como o 8-cloro-N-[4- (trifluorometóxi)fenil]quinolin-2-amina.

[0108] De acordo com uma forma de realização, para a determinação ou monitoramento de uma infecção viral em um paciente, um valor de referência de controle pode ser obtido a partir de uma amostra biológica isolada obtida em um indivíduo ou grupo de indivíduos conhecidos por não sofrerem de tal condição.

[0109] De acordo com uma outra forma de realização, para a determinação ou monitoramento de uma eficácia de um tratamento de uma infecção viral em um paciente, um valor de referência de controle pode ser obtido a partir de uma amostra biológica isolada obtida de um indivíduo ou grupo de indivíduos conhecidos por não sofrerem de tal condição, e que não recebem o tratamento a eficácia do qual deva ser determinada ou monitorada. Alternativamente, um valor de referência de controle pode ser obtido a partir de uma amostra biológica isolada obtida de um paciente que sofre de uma infecção viral e que recebe um tratamento a eficácia do qual devendo ser determinada ou monitorada, a amostra biológica isolada sendo tirada do paciente antes da administração do tratamento.

[0110] Numerosos métodos estão disponíveis para a pessoa habilitada para medir uma presença ou nível de expressão do biomarcador de miR-124.

[0111] Por exemplo, ensaios ou arranjos de ácido nucléico podem ser usados para avaliar a presença e/ou nível de expressão de miR-124 em uma amostra.

[0112] A sequência do miR-124 pode ser usada para preparar um nucleotídeo correspondente que atue como sonda ou iniciador complementares a serem usados em diferentes ensaios de ácido nucléico para detectar a expressão ou presença do biomarcador de miR-124 na amostra, tal como, mas não limitado a, Northern blots e métodos com base em PCR (por exemplo, PCR de Transcrição Reversa em Tempo Real ou qRT-PCR). Métodos tais como a qRT-PCR podem ser usados para quantificar acuradamente a quantidade do miRNA em uma amostra.

[0113] As sondas ou iniciadores de sentido e anti-sentido de acordo com a invenção podem ser obtidos usando todos os processos conhecido pela pessoa habilitada na técnica, em particular aqueles que são descritos em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ED., 2001, Cold Spring Harbour, N. Y.).

[0114] Os métodos relacionados com a detecção e quantificação de RNA ou DNA são bem conhecidos na técnica. A pessoa habilitada na técnica por exemplo pode consultar Wang et al. (1989, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 86 : 917-921), Wong et al. (2005, Bio Techniques, Vol. 39 (1): 75-85), Nolan et al. (2006, Nat Protoc, Vol. 1(3) : 1559-1582) e Klinck et al. (2008, Cancer Research, Vol. 68 : 657-663), ou também uma revisão geral publicada por Bustin (2000, Journal of Molecular Endocrinology, Vol. 25: 169-193).

[0115] Em uma forma de realização, um método para a detecção e quantificação de ácidos nucléicos pode ser um método com base em corante fluorescente, em que a concentração de ácido nucléico é avaliada medindo-se a intensidade de fluorescência de ligandos, tais como corantes, que se ligam aos ditos ácidos nucléicos. Os corantes fluorescentes são bem conhecidos na técnica.

[0116] Alternativamente, o dito ácido nucléico pode ser quantificado usando espectrofotometria.

[0117] Em uma outra forma de realização, um método para a detecção e quantificação de ácidos nucléicos pode ser um método com base na hibridização. Os ditos métodos com base na hibridização podem incluir as técnicas de PCR e PCR quantitativa (qRT-PCR ou q-PCR) ou técnicas com base na transcriptase / polimerase reversas. Vantajosamente, o dito método pode compreender, ou ser ainda combinado, com uma etapa de sequenciamento.

[0118] Estes métodos podem compreender (i) uma etapa de extração de mRNAs celulares, (ii) uma etapa de transcrição reversa de mRNA para DNA usando uma transcriptase reversa e (iii) uma etapa de amplificação de DNA do DNA obtido na etapa anterior. Usualmente, partindo da mesma amostra, os seguintes ácidos nucléicos são amplificados: (a) DNA obtido depois de uma etapa de transcrição reversa do mRNA alvo e (b) um DNA ou uma pluralidade de DNAs obtidos depois da transcrição reversa de mRNAs que são constitutiva e constantemente expressados pelas células («genes de manutenção»), tais como RNAs codificados pelos genes MRPL19, PUM1 e GADPH.

[0119] O DNA amplificado pode ser quantificado, depois da separação pela eletroforese, e medida de faixas de DNA. Os resultados relacionados com os mRNA(s) alvo(s) são expressados como unidades relativas em comparação com os mRNAs codificados pelos genes de «manutenção». Em algumas formas de realização, a etapa de separação de DNAs amplificados é obtido depois da eletroforese em gel de agarose, e depois tingimento das faixas de DNA com brometo de etídio, antes da quantificação do DNA contido nestas faixas de migração com densitometria. Em outras formas de realização, pode-se usar um dispositivo de micro-canal em que o DNA amplificado é separado pela eletroforese capilar, antes da quantificação do sinal emitido usando um feixe de laser. Um tal dispositivo pode ser um dispositivo LabChip®, por exemplo da série « GX », comercializado pela companhia Caliper LifeSciences (Hopkinton, MA, USA).

[0120] Os resultados quantitativos obtidos pela qRT-PCR algumas vezes podem ser mais informativos do que os dados qualitativos, e podem simplificar a padronização e controle de qualidade do ensaio. Assim, em algumas formas de realização, os ensaios com base na qRT-PCR podem ser úteis para medir os níveis de miRNA durante os ensaios com base em célula. O método de qRT-PCR também pode ser útil no monitoramento da terapia do paciente. Métodos com base na qRT- PCR comercialmente disponíveis {por exemplo, TaqmanR Array®)

[0121] Qualquer plataforma de ensaio adequada pode ser usada para determinar a expressão ou presença do miRNA em uma amostra. Por exemplo, um ensaio pode estar na forma de uma vareta medidora, uma membrana, um chip, um disco, uma tira de teste, um filtro, uma microesfera, uma lâmina, uma placa de reservatório múltiplo, ou uma fibra óptica. Um sistema de ensaio pode ter um suporte sólido no qual um oligonucleotídeo correspondente ao miRNA é ligado. O suporte sólido pode compreender, por exemplo, um plástico, silicone, um metal, uma resina, vidro, uma membrana, uma partícula, um precipitado, um gel, um polímero, uma folha, uma esfera, um polissacarídeo, um capilar, uma película uma placa, ou uma lâmina. Os componentes de ensaio podem ser preparados e embalados juntos como um kit para detectar um miRNA.

[0122] Em algumas formas de realização, um arranjo de oligonucleotídeo para testar quanto à atividade do derivado de quinolina ou candidato a medicamento em uma amostra biológica pode ser preparado ou adquirido. Um arranjo tipicamente contém um suporte sólido e pelo menos um oligonucleotídeo contatando o suporte, onde o oligonucleotídeo corresponde a pelo menos uma porção do biomarcador de miR-124. Em algumas formas de realização, a porção do biomarcador de miR-124 compreende pelo menos 5, 10, 15, 20 ou mais bases.

[0123] De acordo com uma forma de realização, a presença ou expressão de miR-124 podem ser examinadas em combinação com outros miRNA também usados como biomarcadores. Em uma tal forma de realização, um arranjo pode ser usado para avaliar a expressão ou presença de miRNAs múltiplos em uma amostra, incluindo miRNA-124. No geral, o método compreende as seguintes etapas: a) contatar a amostra com um arranjo compreendendo um conjunto de sonda sob condições suficientes para que a ligação específica ocorra; e b) examinar o arranjo para detectar a presença de qualquer rótulo detectável, avaliando deste modo a quantidade dos respectivos miRNAs alvo na amostra. O uso de um arranjo de expressão permite a obtenção de um perfil de expressão de miRNA para uma dada amostra.

[0124] Métodos de preparar ensaios ou arranjos para ensaiar miRNAs são bem conhecidos na técnica e não é necessário que sejam aqui mais detalhados.

[0125] Os arranjos de ácido nucléico podem ser usados para detectar a presença ou expressão diferencial de miRNAs nas amostras biológicas. Os arranjos de polinucleotídeo (tais como os arranjos de DNA ou RNA) tipicamente incluem regiões de sequências polinucleotídeo usualmente diferentes (“agentes de captura”) dispostos em uma configuração predeterminada em um suporte. Os arranjos são “endereçáveis” em que estas regiões (algumas vezes aludidas como “traços de arranjo”) têm locais predeterminados diferentes (“endereços”) no suporte do arranjo. A região (isto é, um “traço” ou “mancha” do arranjo) em um local predeterminado particular (isto é, um “endereço”) no arranjo detectará um alvo de miRNA particular. Os arranjos de polinucleotídeo tipicamente são fabricados em suportes planares depositando-se previamente os polinucleotídeos obtidos sobre o suporte em uma maneira específica de sítio ou pela síntese in situ específico de sítio dos polinucleotídeos no suporte. Os arranjos para detectar a expressão de miRNA podem ser fabricados depositando-se (por exemplo, pelos métodos com base em contato ou jato ou fotolitografia) unidades precursoras (tais como nucleotídeo ou monômeros de aminoácido) ou agente de captura pré-sintetizado. Depois de depositar os agentes de captura de polinucleotídeo sobre o suporte, o suporte é tipicamente processado (por exemplo, lavado e bloqueado por exemplo) e armazenados antes do uso.

[0126] Um arranjo para detectar a expressão de miRNA tem pelo menos duas, três, quatro, ou cinco sondas objetos diferentes. Entretanto, em certas formas de realização, um arranjo objeto pode incluir um conjunto de sonda tendo pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 500, ou pelo menos 1.000 ou mais sondas que podem detectar um número correspondente de miRNAs. Em algumas formas de realização, os arranjos objetos podem incluir sondas para detectar pelo menos uma porção ou todos os miRNAs identificados de um organismo, ou podem incluir sondas ortólogas de organismos múltiplos.

[0127] Um arranjo de ácido nucléico pode ser contatado com uma amostra ou amostra rotulada contendo análitos de miRNA sob condições que promovam a ligação específica do miRNA na amostra a um ou mais dos agentes de captura presentes no arranjo para exibir um padrão de ligação observado. Este padrão de ligação pode ser detectado na apuração do arranjo. Por exemplo, os miRNAs alvo na amostra podem ser rotulados com um rótulo adequado (tal como um composto fluorescente), e o rótulo depois pode ser acuradamente observado (tal como pela observação do padrão de fluorescência) no arranjo depois da exposição do arranjo à amostra. O padrão de ligação observado pode ser indicativo da presença e/ou concentração de um ou mais componentes de miRNA da amostra.

[0128] A rotulação de miRNAs pode ser realizada usando métodos bem conhecidos na técnica, tal como usando DNA ligase, transferase de terminal, ou pela rotulação da cadeia principal de RNA, etc. Em algumas formas de realização, os miRNAs podem ser rotulados com rótulos fluorescentes. Os corantes fluorescentes exemplares incluem, mas não são limitadas aos corantes de xanteno, corantes de fluoresceína, corantes de rodamina, isotiocianato de fluoresceína (FITC), 6 carboxifluoresceína (FAM), 6 carbóxi-2 1 ,4 1 ,7’,4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 6 carbóxi 4’, 5’ dicloro 2’, 7’ dimetóxi-fluoresceína (JOE ou J), N,N,N’,N’ tetrametil 6 carboxirrodamina (TAMRA ou T), 6 carbóxi X rodamina (ROX ou R), 5 carboxirrodamina 6G (R6G5 ou G5), 6 carboxirrodamina 6G (R6G6 ou G6), e rodamina 110; corantes de cianina, por exemplo, corantes de Cy3, Cy5 e Cy7; corantes Alexa, por exemplo, Alexa-fluor-555; coumarina, Dietilaminocoumarina, umbeliferona; corantes de benzimida, por exemplo, Hoechst 33258; corantes de fenantridina, por exemplo, Vermelho do Texas; corantes de etídio; corantes de acridina; corantes de carbazol; corantes de fenoxazina; corantes de porfirina; corantes de polimetina, corantes de BODIPY, corantes de quinolina, Pireno, Fluoresceína Clorotriazinila, Rl 10, Eosina, JOE, R6G, Tetrametilrrodamina, Lissamina, ROX, Nafto fluoresceína, e os semelhantes.

[0129] Em algumas formas de realização, um arranjo de oligonucleotídeo para avaliar a atividade imunomoduladora pode ser preparado ou adquirido, por exemplo, da Affymetrix. O arranjo pode conter um suporte sólido e uma pluralidade de oligonucleotídeos contatando o suporte. Os oligonucleotídeos podem estar presentes em locais específicos, enderessáveis no suporte sólido; cada um correspondendo a pelo menos uma porção de sequências de miRNA que podem ser diferencialmente expressadas no tratamento de um derivado de quinolina ou um candidato a medicamento em uma célula ou um paciente. As sequências de miRNA compreendem pelo menos uma sequência de miR-124.

[0130] Quando um arranjo é usado para avaliar miRNAs, um método típico pode conter as etapas de 1) obter o arranjo contendo sondas objetos ligadas à superfície; 2) hibridização de uma população de miRNAs às sondas ligadas à superfície sob condições suficientes para fornecer ligação específica (3) lavagens de pós- hibridização para remover ácido nucléicos não ligados na hibridização; e (4) detecção dos miRNAs hibridizados. Os reagentes usados em cada uma destas etapas e suas condições para o uso podem variar dependendo da aplicação particular.

[0131] A hibridização pode ser realizada sob condições de hibridização adequadas, que podem variar em severidade como desejado. As condições típicas são suficientes para produzir complexos de sonda/alvo em uma superfície de arranjo entre membros de ligação complementares, isto é, entre sondas objetos ligadas à superfície e miRNAs complementares em uma amostra. Em certas formas de realização, as condições de hibridização severas podem ser utilizadas. A hibridização é tipicamente realizada sob condições de hibridização severas. As técnicas de hibridização padrão que são bem conhecidas na técnica (por exemplo, sob condições suficientes para fornecer a ligação específica de miRNAs alvos na amostra às sondas no arranjo) são usados para hibridizar uma amostra a um arranjo de ácido nucléico. A seleção de condições apropriadas, incluindo temperatura, concentração salina, concentração de polinucleotídeo, tempo de hibridização, severidade das condições de lavagem, e os semelhantes dependerá do planejamento experimental, incluindo fonte de amostra, identidade de agentes de captura, grau de complementaridade esperado, etc., e pode ser determinada como uma questão de experimentação de rotina para aqueles de habilidade comum na técnica. No geral, uma “hibridização severa” e “condições de lavagem de hibridização severa” no contexto da hibridização de ácido nucléico são tipicamente dependentes da sequência, e são diferentes sob condições experimentais diferentes. A hibridização pode ser feita em um período de cerca de 12 a cerca de 24 horas. A severidade das condições de lavagem pode afetar o grau ao qual as sequências de miRNA são especificamente hibridizadas aos agentes de captura complementares. Aqueles de habilidade comum facilmente reconhecerá que as condições de hibridização e lavagem alternativas, mas comparáveis podem ser utilizadas para fornecer condições de severidade similares.

[0132] Como uma ilustração, em uma forma de realização, os experimentos de formação de perfil da expressão de miRNA podem ser conduzidos usando o miRNA Array 2.0 da Affymetrix Genechip e seguindo os protocolos descritos no manual de instrução.

[0133] Em uma forma de realização particular, a dita hibridização pode ser realizada usando o kit GeneChip® Hybridization, Wash, and Stain (Affymetrix Ref. #900720). Vantajosamente, a dita hibridização é realizada seguindo-se os protocolos do fabricante .

[0134] Depois do procedimento de hibridização de miRNA, os polinucleotídeos ligados na superfície do arranjo são tipicamente lavados para remover ácidos nucléicos não ligados. A lavagem pode ser realizada usando qualquer protocolo de lavagem conveniente, onde as condições de lavagem são tipicamente severas, como descrito acima. Por exemplo, uma etapa de lavagem pode ser realizada usando tampões de lavagem vendidos pela companhia Affymetrix (Ref. #900721 e #900722). A hibridização dos miRNAs alvos às sondas é depois detectada usando técnicas padrão de leitura do arranjo. A leitura do arranjo hibridizado resultante pode ser realizada, por exemplo, pela iluminação do arranjo e leitura do local e intensidade da fluorescência resultante em cada traço do arranjo para detectar complexos de ligação de miRNA/sonda. miRNA-124

[0135] Os microRNAs (miRNAs) são RNAs pequenos, de filamento único não codificadores que podem atuar no citoplasma de uma célula para causar uma diminuição na expressão dos seus RNAs mensageiros alvos cognatos ou tradução do produto de proteína do mRNA. Os miRNAs maduros são tipicamente de cerca de 19 a 23 nucleotídeos no comprimento. Esta capacidade dos miRNAs para inibir a produção de suas proteínas alvos resulta na regulagem de muitos tipos de atividades celulares, tais como determinação do destino celular, apoptose, diferenciação, e oncogênese.

[0136] miR-124 foi inicialmente clonado em camundongos. O precursor de miR- 124 humano (ou miRN-124 ou miRNA-124 ou micro RNA 124) foi clonado a partir de células tronco embrionárias. 9 haplotipos de precursores de miR-124 foram identificados até agora (Guo et al., PLoS A, 2009, 4(11): e7944), dos quais 3 estão presentes no ser humano, hsa-miR-124-1, hsa-miR-124-2 e hsa-miR-124-3. (SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 3).

[0137] O precursor de microRNA miR-124 é uma molécula de RNA não codificadora pequena. Os microRNAs de ~21 nucleotídeos maduros são processados a partir das sequências precursoras de grampo de cabelo pela enzima Dicer. As sequências maduras são SEQ ID NO: 4, UAAGGCACGCGGUGAAUGCC para miR-124-3’ e SEQ ID NO: 5, CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU para miR-1245’.

[0138] miRNA-124 é preferencialmente expressado no cérebro, e poderia contribuir para a neurogênese pela infra-regulagem da expressão de SCP1. A expressão de miR124 em células neuronais de camundongo induz uma mudança de união de geral para específica de neurônio alternativa pelo alvejamento direto do mRNA of PTBP1. O miR-124 aumenta a abundância de mRNAs de PTBP2 e Gabbr1 específicos de neurônio pela prevenção do pulo de éxon dependente de PTBP1 que leva ao decaimento mediado pelo não sentido destes mRNAs.

[0139] No ponto de saída mitótica dentro do sistema nervoso de vertebrado, quando as células perdem a multipotência e começam a desenvolver conexões estáveis que persistirão durante a vida, uma mudança nos mecanismos de remodelação da cromatina dependente de ATP ocorre. Esta transição pode ser mediada pela repressão de BAF53A pelo miR9* (um miRNA processado a partir da ramificação oposta do precursor de haste-alça de miR9) e miR-124.

[0140] A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo de roedor de esclerose múltipla caracterizado pela inflamação do sistema nervoso central (CNS) associada com a ativação de macrófagos residentes no CNS, ou micróglia, e infiltração de células imunes periféricas ao CNS. Foi descoberto que miR-124 é tão altamente expressado na micróglia quanto nos neurônios. A expressão de miR-124 é reduzida na micróglia ativada durante um episódio de EAE e em micróglia ativada em cultura. A transfecção de miR-124 desativa os macrófagos derivados da medula óssea, e a administração intravenosa de miR-124 inibe o desenvolvimento de lesões e inflamação do CNS reduzida em 3 modelos de camundongo de EAE. Foi descoberto que miR-124 promove a quietude da micróglia pela desativação dos macrófagos por intermédio do caminho de CEBPA-PU.1.

[0141] Também foi demonstrado que a expressão de miR-124 em fibroblastos humanos induz a sua conversão em neurônios. Além disso, a adição de fatores de transcrição neurogênica ASCL1 e MYT1L realça a taxa de conversão e maturação dos neurônios convertidos, ao passo que a expressão destes fatores de transcrição sem o microRNA anteriormente mencionado é ineficaz.

[0142] Uma sonda de ácido nucléico isolada adequada para medir uma presença ou nível da expressão de miR-124 é uma sonda de ácido nucléico capaz de hibridizar especificamente a um miR-124, tal como um precursor ou um miR-124 maduro.

[0143] Uma tal sonda de ácido nucléico pode compreender de 18 a 30 nucleotídeos, em particular de 20 a 27, preferivelmente de 20 a 25, preferivelmente de 20, 22, ou 25, e mais preferivelmente de cerca de 25 nucleotídeos. Como previamente indicado, tais sondas de ácido nucléico podem ser preparadas de acordo com qualquer um dos métodos conhecidos na técnica.

[0144] Métodos e fórmulas são bem conhecidas na técnica para prognosticar a temperatura de hibridização ideal para uma dada sonda e um dado alvo.

[0145] Assim, a pessoa habilitada na técnica pode facilmente calcular uma temperatura de hibridização ideal com base em um conjunto de sondas, em uma dada sequência alvo, e com condições particulares de hibridização.

[0146] Vantajosamente, a temperatura de hibridização ideal das ditas sondas está entre 40 °C e 60 °C, e mais particularmente entre 45 °C e 55 °C, e preferivelmente é de cerca de 48 °C.

[0147] Como exemplos de tampões úteis para hibridizar uma sonda de ácido nucléico da invenção a um biomarcador da invenção, pode-se mencionar, como um tampão de hibridização, um tampão compreendendo 100 mM de MES, 1 M de [Na+], 20 mM de EDTA, 0,01 % de Tween-20, como um tampão de lavagem não severa um tampão compreendendo 6X SSPE, 0,01 % de Tween-20, e como um tampão de lavagem severo um tampão compreendendo 100 mM de MES, 0,1 M de [Na+], 0,01 % de Tween-20.

[0148] Uma sonda de ácido nucléico adequada para medir uma presença ou nível de expressão de miR-124, por exemplo, pode ser uma sonda de ácido nucléico consistindo em uma sequência de ácido nucléico selecionado do grupo consistindo da SEQ ID NO: 6 à SEQ ID NO: 87.

[0149] Uma sonda de ácido nucléico adequada para medir uma presença ou nível de expressão do precursor de miR-124-1, por exemplo, pode ser uma sonda de ácido nucléico consistindo em uma sequência de ácido nucléico selecionada do grupo consistindo da SEQ ID NO: 6 à SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO 86 e SEQ ID NO 87.

[0150] Uma sonda de ácido nucléico adequada para medir uma presença ou nível da expressão do precursor de miR-124-2, por exemplo, pode ser uma sonda de ácido nucléico consistindo em uma sequência de ácido nucléico selecionada do grupo consistindo da SEQ ID NO: 35 à SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO 86 e SEQ ID NO 87.

[0151] Uma sonda de ácido nucléico adequada para medir uma presença ou nível da expressão do precursor de miR-124-3, por exemplo, pode ser uma sonda de ácido nucléico consistindo em uma sequência de ácido nucléico selecionada do grupo consistindo da SEQ ID NO: 66 à SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO 86 e SEQ ID NO 87.

[0152] Uma sonda de ácido nucléico adequada para medir uma presença ou nível da expressão de uma miR-124 madura, por exemplo, pode ser uma sonda de ácido nucléico consistindo em uma sequência de ácido nucléico selecionada do grupo consistindo da SEQ ID NO 86 e SEQ ID NO 87.

DERIVADOS DE QUINOLINA

[0153] Os derivados de quinolina úteis para a invenção podem ser derivados de quinolina eficientes para tratar uma infecção viral, tais como aqueles descritos na WO 2010/143169.

[0154] Em particular, os derivados de quinolina úteis para a invenção são derivados de quinolina que podem ser representados pela seguinte fórmula geral (I):

em que • n é 1 ou 2 e R, independentemente, representa um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C3); um grupo -NR1R2 em que R1 e R2 são independentemente um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C3); um grupo fluoroalcóxi (C1-C3); um grupo -NO2; um grupo fenóxi; e um grupo alcóxi (C1-C4), • R’ é um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C4) e um grupo alcóxi (C1-C4), • R” é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C4), ou um de seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

[0155] De acordo com uma forma de realização R’ e R” são preferivelmente um átomo de hidrogênio.

[0156] De acordo com uma outra forma de realização, um derivado de quinolina adequado para a invenção pode ser da fórmula (I), em que R independentemente, representa um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C3); um grupo -NR1R2 em que R1 e R2 são independentemente um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C3); um grupo fluoroalcóxi (C1-C3); e um grupo alcóxi (C1-C4).

[0157] De acordo com uma outra forma de realização, R independentemente, representa um átomo de flúor ou um de cloro ou um grupo escolhido entre grupo metila ou etila, um grupo -NH2, um grupo metóxi ou etóxi, e um grupo fluoroalcóxi (C1-C3).

[0158] De acordo com uma outra forma de realização, n é preferivelmente 1.

[0159] De acordo com uma forma de realização preferida, um derivado de quinolina adequado para a invenção pode ser da fórmula (I), em que n é 1, R é um grupo fluoroalcóxi (C1-C3), e R’ e R” são cada um átomo de hidrogênio.

[0160] De acordo com uma forma de realização preferida, R é um grupo metóxi, um etóxi, ou um propóxi substituído com pelo menos um átomo de flúor. Preferivelmente, R é um grupo mono, bi ou trifluorometóxi.

[0161] Alternativamente, os derivados de quinolina úteis para a invenção são derivados de quinolina que podem ser representados por um derivado de quinolina da fórmula (II):

em que: • n é 1 ou 2 e R, independentemente, representa um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C3); um grupo -CN; um grupo hidroxila; um grupo -COOR1; um grupo fluoroalquila (C1-C3); um grupo -NO2; um grupo -NR1R2 com R1 e R2 sendo um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C3); e um grupo alcóxi (C1-C4), • R’ é um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C4) e um grupo alcóxi (C1-C4), • R” é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C4), ou um de seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

[0162] De acordo com uma forma de realização, um derivado de quinolina adequado para a invenção pode ser da fórmula (II), em que R’ e R” são preferivelmente um átomo de hidrogênio.

[0163] De acordo com uma outra forma de realização, um derivado de quinolina adequado para a invenção pode ser da fórmula (II), em que R, independentemente, representa um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C3), um grupo fluoroalquila (C1-C3), um grupo hidroxila, um grupo -CN, um grupo -COOH e um grupo alcóxi (C1-C3).

[0164] De acordo com uma outra forma de realização, um derivado de quinolina adequado para a invenção pode ser da fórmula (II), em que R, independentemente, representa um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno, um grupo -CN, um grupo alquila (C1-C3), um grupo fluoroalquila (C1-C3), e um grupo hidroxila. De acordo com uma outra forma de realização, um derivado de quinolina adequado para a invenção pode ser da fórmula (II), em que R, independentemente, representa um grupo fluoroalquila (C1-C3).

[0165] De acordo com uma outra forma de realização, n é preferivelmente 1.

[0166] De acordo com uma forma de realização preferida, um derivado de quinolina adequado para a invenção pode ser da fórmula (II), em que n é 1, R é um grupo fluoroalquila (C1-C3), e R’ e R” são cada um átomo de hidrogênio.

[0167] Assim, de acordo com a dita forma de realização, um derivado de quinolina pode ser representado pela seguinte fórmula:

[0168] De acordo com uma forma de realização, um derivado de quinolina útil consistindo de:

[0169] Um sal farmaceuticamente aceitável de um derivado de quinolina da invenção, e mais particularmente de um composto tendo as fórmulas gerais (I) ou (II) de acordo com a invenção pode ser um sal de um composto tendo as fórmulas gerais (I) ou (II) e de um metal alcalino, um metal alcalino terroso, ou um de amônio, compreendendo os sais obtidos com bases de amônio orgânicas, ou sais de um composto tendo as fórmulas gerais (I) ou (II) e de ácido orgânico ou inorgânico.

[0170] Os ais mais particularmente adequados para a invenção podem ser sais de sódio, potássio, cálcio, magnésio, sais de amônio quaternários tais como tetrametilamônio ou tetraetilamônio, e sais de adição com amônia e aminas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis, tais como metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, trietilamina, etanolamina e tris(2-hidroxietil)amina.

[0171] Os sais de um derivado de quinolina da invenção, e mais particularmente de um composto tendo as fórmulas gerais (I) ou (II) e de ácido inorgânico adequado para a invenção podem ser obtidos com ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico ou ácido fosfórico.

[0172] Os sais de um derivado de quinolina da invenção, e mais particularmente de um composto tendo as fórmulas gerais (I) ou (II) e de ácido orgânico adequado para a invenção podem ser obtidos com ácidos carboxílicos e ácidos sulfônicos tais como ácido fórmico, ácido acético, ácido oxálico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido málico, ácido succínico, ácido malônico, ácido benzóico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido metanossulfônico, ácido benzenossulfônico ou ácido p-toluenossulfônico.

[0173] De acordo com uma forma de realização preferida, o derivado de quinolina útil para a invenção é 8-cloro-N-[4-(trifluorometóxi)fenil]quinolin-2-amina, que pode ser representado pela seguinte fórmula:

[0174] Os derivados de quinolina adequados para a invenção podem ser preparados como descrito na WO 2010/143169.

[0175] O tratamento pode ser pela administração oral ou parenteral de um derivado de quinolina. Os modos e regime de administração adequados são descritos na WO 2010/143169.

[0176] Qualquer via de administração pode ser usada. Por exemplo, um derivado de quinolina pode ser administrado pela oral, parenteral, intravenosa, transdérmica, intramuscular, retal, sublingual, mucósica, nasal, ou outros meios. Além disso, um derivado de quinolina pode ser administrado em uma forma de composição farmacêutica e/ou forma de dosagem unitária.

[0177] As formas de dosagem adequadas incluem, mas não são limitadas a, cápsulas, tabletes (incluindo tabletes de dissolução rápida e liberação retardada), pó, xaropes, suspensões orais e soluções para a administração parenteral.

[0178] Os exemplos aqui fornecidos são intencionados a serem meramente exemplares, e aqueles habilitados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de averiguar, usando não mais do que experimentação de rotina, numerosos equivalentes de compostos, materiais, e procedimentos específicos. Todos de tais equivalentes são considerados estar dentro do escopo da invenção e são abrangidos pelas reivindicações anexas.

EXEMPLOS

[0179] Exemplo 1

[0180] Modulação da expressão de miRNAs com 8-cloro-N-[4- (trifluorometóxi)fenil] quinolin-2-amina

[0181] Materiais & Métodos

[0182] No contexto da inibição de HIV-1 pelo derivado de quinolina, 8-cloro-N-[4- (trifluorometóxi)fenil]quinolin-2-amina, foi estudado se o tratamento modularia a expressão de miRNAs hospedeiros.

[0183] Para este propósito, as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de cinco doadores saudáveis foram isoladas pela centrifugação em um gradiente FICOLL. As células foram cultivadas a 37 °C, 5 % de CO2 a uma densidade de 1 x 106 células/ml em meio RPMI Glutamax (Life Technologies Ref 61870-010) suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal (FCS) (Thermo Fischer Ref SV30160,03) 1000 U/ml de IL2 (Peprotech Ref 200-02) e 5 μg/ml de PHA (Roche ref 1249738). Três dias mais tarde, as células foram reunidas e colocadas em suspensão a uma densidade de 1 x 106 células/ml em meio RPMI Glutamax suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal (FCS) 1000 U/ml de IL-2 e distribuídas em placas de 12 reservatórios (Falcon Ref 353043) com 1,2 ml/reservatório (4 reservatórios por condição).

[0184] A infecção pelo HIV-1 foi realizada com 1 ng da cepa do HIV Ada-M R5/reservatório. As células foram tratadas por 6 dias com 1,2 ml/reservatório de solução a 60 μM de 8-cloro-N-[4-(trifluorometóxi)fenil]quinolin-2-amina ou com 0,12 % de DMSO (Sigma Ref D4818 como controle negativo).

[0185] As células foram depois reunidas pelas condições, centrifugadas, e os grânulos foram recolocados em suspensão em 700 μl de tampão de lise Qiazol (Qiagen Ref 217004) para extração pelo kit miRNeasy da Qiagen (Qiagen Ref 217004). Os RNAs foram extraídos de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade e quantidade dos RNAs extraídos foram controladas usando Bioanalyzer 2100 e espectrofotometria Nanodrop ND-1000 da Agilent. O valor de RIN médio foi 8,84 (de 7,2 a 9,7). Uma quantidade de RNA total de 90 ng por amostra foi rotulada usando o Kit de Rotulação de RNA FlashTag® Biotin HSR (901911) e hibridizados durante a noite ao Genechip miRNA Array 2.0 da Affymetrix. (901753) Os arranjos foram lavados e tingidos usando o protocolo Affymetrix padrão e escaneados usando o escaner Affymetrix. Os controles de qualidade foram realizados usando as métricas do Expression Console da Affymetrix (versão 1.2).

[0186] Os dados foram normalizados usando o método de normalização “RMA+DABG” do Expression Console e um miRNA foi considerado expressado se o Valor P de DABG correspondente foi menor ou igual a 0,05. Um miRNA foi considerado expressado em uma condição se o miRNA foi expressado em pelo menos 75 % dos doadores de PBMCs desta condição. Um teste t de Student emparelhado foi aplicado nos miRNAs expressados que foram considerados diferencialmente expressados entre duas condições se a alteração foi melhor ou igual a 1,5 e o Valor P do teste T foi menor ou igual a 0,05.

[0187] Resultados

[0188] A comparação da expressão de miRNA entre células infectadas e não infectadas salientou a modificação múltipla (regulagem para cima e para baixo) resultante da infecção pelo HIV-1. Em particular é observado que o miRNA-124 foi infra-regulado nas PBMCs infectadas com HIV.

[0189] Ao contrário, a comparação entre as PBMCs infectadas com HIV tratadas e não tratadas com 8-cloro-N-[4-(trifluorometóxi)fenil]quinolin-2-amina salientou apenas um miRNA, miR-124, cuja expressão foi confiantemente aumentada (cerca de 13 vezes) sob tratamento.

[0190] Consequentemente, miR-124 é validado como sendo um biomarcador relevante para monitorar a eficácia dos derivados de quinolina de acordo com a invenção como medicamentos antivirais em paciente com AIDS, e em particular a 8- cloro-N-[4-(trifluorometóxi)fenil]quinolin-2-amina.

[0191] Exemplo 2

[0192] Avaliação da eficiência de derivados de quinolina sobre a expressão de miR-124 3p.

[0193] Além do Exemplo 1 que fornece uma avaliação da expressão de mi-RNA no contexto da infecção pelo HIV-1, o Exemplo 2 avalia a variação da expressão de miR-124 na ausência do HIV-1. O método de triagem foi testado para avaliar um conjuntos de derivados de quinolina e medicamentos anti-retrovirais conhecidos tais como Maraviroc, Efavirenz, Darunavir e azidotimidina (AZT).

[0194] Materiais & Métodos

[0195] Extração de PBMC usando um gradiente de FICOLL®

[0196] Para este propósito, as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de quatro doadores saudáveis foram isolados pela centrifugação em um gradiente FICOLL® de acordo com protocolos padrão.

[0197] Em resumo, 60 a 70 ml da camada de células brancas são vertidos em um frasco de 175 cm , e o volume é ajustado a 300 ml usando PBS de modo a obter uma diluição de cerca de 5 vezes da camada de células brancas. 38 ml da camada de células brancas diluída são depois adicionados aos tubos Falcon™ de 50 ml compreendendo 12 ml de FICOLL® (Histopack-1077) na temperatura ambiente. A preparação é centrifugada por 30 minutos a 1600 rpm (= 515 rcf) na temperatura ambiente. O anel de linfócito é recuperado do tubo Falcon® com uma pipeta de transferência (Pastette®) e depois lavada com PBS usando centrifugação por 10 minutos a 1200 rpm (= 290 rcf) e na temperatura ambiente até que o sobrenadante se torne claro.

[0198] As células são depois colocadas em suspensão a 37 °C a uma densidade de 1,5 x 102 células/ml em meio RPMI Glutamax (Life Technologies Ref 61870-010) suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal (FCS) (Thermo Fischer Ref SV30160,03) e sem ativação. As células são incubadas por 48 horas a 37 °C sob 5 % de CO2.

[0199] Tratamento das células com moléculas triadas

[0200] As placas de seis reservatórios são usadas para a triagem. Dentro de cada reservatório compreendendo 3.106 células/4 ml de RPMI suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal e 40 U/ml de IL-2 (Peprotech Ref 200-02) são adicionados às moléculas triadas. DMSO a 100 % (0,8 μl) é adicionado ao reservatório e testado como um controle negativo.

[0201] Cada condição testada é ajustada como descrito abaixo e o volume final correspondente é ajustado consequentemente no reservatório: 1) Derivados de quinolina: (8-cloro-N-[4-(trifluorometóxi)fenil]quinolin-2- amina e 8-cloro-N-[4-(trifluorometil)piridin-2-il]quinolin-2-amina Respectivamente os compostos 1 e 8) em 100 % de DMSO - (5 μM e volume

2) Outros medicamentos anti-retrovirais: Maraviroc, Efavirenz, Darunavir, AZT (10 µM para todos - volume final de 0,8 µl).

[0202] Os reservatórios são incubados por três dias a 37 °C sob 5 % de CO2. O meio é trocado (Dia 3) de acordo com os protocolos padrão. Em resumo, as placas são centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos e 3 ml de sobrenadante são removidos. 3 ml de RPMI suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal e 40 U/ml de IL-2 são depois adicionados com 0,6 µl (para concentração final de 10 µM) ou 0,3 µl (para concentração final de 5 µM) de uma solução de estoque de molécula triadas a 50 mM em DMSO a 100 % ou 0,6 µl de DMSO a 100 % como um controle negativo.

[0203] Extração de miRNAs (Dia 6)

[0204] As células são recuperadas dentro de tubos Falcon® de 15 ml, centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos, e depois lavadas em 10 ml de PBS e centrifugadas ainda a 1200 rpm por 5 minutos. As células são depois recolocadas em suspensão em 1 ml de PBS e contadas.

[0205] 6 x 106 células são recuperadas e centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos. A pelota de célula é lisada em 300 μl de tampão de lise ML do kit de extração de miRNA Nucleospin® da Macherey Nagel (Macherey Nagel Ref 740971), e armazenadas ainda a -20 °C.

[0206] 5 μl de 2 x 108 c0pias/μl de controle reforçado (Ce_miR-39 da QIAGEN® - referência 219610, sequência 5’ UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG 3’) são adicionados a cada amostra. A extração de miRNA é obtida usando o protocolo do kit de extração de miRNA Nucleospin® da Macherey Nagel usando um volume de elução para RNAs de 50 μl e miRNAs de 30 μl, e mais adiante armazenadas a - 20 °C.

[0207] Transcrição reversa de miRNAs (Dia 6)

[0208] A etapa de transcrição reversa é seguida por 12 μl de miRNA usando o kit de transcrição reversa (RT) miScript RT II da QIAGEN© usando o tampão miScript HiSpec, e mais adiante armazenadas a -20 °C.

[0209] PCR Quantitativa de miRNAs (Dia 6)

[0210] A etapa de PCR quantitativa é obtida usando o kit de PCR QIAGEN® miScript SYBR® Green e os Ensaios miScript Primer de acordo com o protocolo do fabricante.

[0211] Composição da mistura de reação miScript para placas de 384 reservatórios: Mistura μl/reação Mistura 2X SYBR® Green 5 10X Iniciador Universal 1 10X Iniciador de Ensaio 1 H2O 2 Volume Total da Mistura: 9 cDNA Padrão em H2O (*) 1 Volume final: 10 (*) cDNA preparado usando o kit de RT miScript II

[0212] A reação é repetida em triplicata em uma placa de 384 reservatórios de acordo com o protocolo do fabricante em um sistema de PCR em Tempo Real LightCicler® 380 Roche. As condições de ciclagem também são ajustadas de acordo com o protocolo do fabricante: Etapa Tempo Temperatura Etapa de ativação inicial 15 min 95 °C Ciclagem de 3 etapas: Desnaturação 15 s 94 °C Recozimento 30 s 55 °C Extensão 30 s 70 °C Número de ciclos 40 ciclos

[0213] A quantificação Relativa e Absoluta de qPCR são técnicas conhecidas na Técnica e pode ser obtida como mais detalhes abaixo.

1) Quantificação relativa

[0214] A partir de uma diluição para o 1/10o em H2O para a qPCR de miR-124 (Hs_miR-124a) ou para o 1/100o para a qPCR do gene de referência/manutenção (Hs_miR-26a e Hs_miR-191, usando os Ensaios miScript Primer (Hs_miR-124a, Hs_miR-26a e Hs_miR-191).

[0215] A análise é obtida usando modelos de quantificação relativa sem correção de eficiência (2-ΔΔCp) usando a média de valores de pontos cruzados (Cp) de triplicatas de miR-124 e a média da média de triplicatas de miR-26a e miR-191.

2) Quantificação absoluta

[0216] A partir de uma diluição para o 1/10o em H2O para a qPCR de miR-124 e Ensaios miScript Primer (Hs_miR-124a e Ce_miR-39). As curvas de calibração são obtidas de acordo com protocolos padrão. A análise é obtida pela normalização da média de triplicatas de miR-124 com a média de triplicatas de miR-39 e normalizando ainda com o número de células.

[0217] Resultados

[0218] Os resultados mostram bom conformidade entre a quantificação Relativa e a Absoluta para todas as moléculas. As amostras de controle de DMSO têm uma alteração de 1, significando nenhuma variação na expressão de miR-124a. Todos os derivados de quinolina testados mostram uma modulação de miR-124 correspondendo a um aumento de dez vezes da expressão de miR-124.

[0219] Em comparação, outros medicamentos anti-retrovirais não induzem modulação significante da expressão de miR-124.

[0220] Assim, este Exemplo mostra que o miR-124 é um biomarcador adequado para triar um candidato a medicamento ou candidato a vacina presumidos serem eficazes na prevenção e/ou tratamento de uma infecção viral. Também é particularmente útil avaliar a atividade de um derivado de quinolina da invenção.

Claims (21)

1. Uso in vitro ou ex vivo de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, caracterizado pelo fato de ser como um biomarcador de uma infecção viral, ou de uma eficácia de um tratamento terapêutico da dita infecção viral.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um nível de expressão medido do dito miR-124 em uma amostra biológica isolada é comparado com um valor de referência de controle, e em que uma modulação do dito nível medido em relação ao dito valor de referência de controle é indicativa de uma infecção viral, ou de uma eficácia de um tratamento terapêutico da dita infecção viral.

3. Uso in vitro ou ex vivo de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, caracterizado pelo fato de ser como um biomarcador para avaliar o efeito biológico, em particular o potencial farmacológico, de um composto candidato, para alterar a atividade fisiológica de uma proteína ou uma célula.

4. Uso in vitro ou ex vivo de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, caracterizado pelo fato de ser como um biomarcador para triar um candidato a medicamento ou candidato a vacina, em particular um derivado de quinolina, presumidos serem eficazes na prevenção e/ou tratamento de uma infecção viral.

5. Uso de acordo com as reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que um nível de expressão medido do dito miR-124 em uma amostra biológica isolada na presença do dito candidato comparada com um valor de referência de controle, e em que uma modulação do dito nível medido em relação ao dito valor de referência de controle é indicativo do efeito biológico do dito candidato, e em particular da eficácia do dito candidato a medicamento ou candidato a vacina na prevenção e/ou tratamento de uma infecção viral.

6. Uso de acordo com as reivindicações 2 ou 5, caracterizado pelo fato de que a dita amostra biológica é selecionada em um grupo consistindo em uma amostra de tecido biológico, uma amostra de sangue integral, uma amostra de esfregaço, uma amostra de plasma, uma amostra de soro, uma amostra de saliva, uma amostra de fluido vaginal, uma amostra de esperma, uma amostra de fluido faríngeo, uma amostra de fluido brônquico, uma amostra de fluido fecal, uma amostra de fluido cerebrospinal, uma amostra de fluido lacrimal e uma amostra de sobrenadante de cultura de tecido.

7. Uso de acordo com as reivindicações de 3 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito candidato a medicamento ou candidato a vacina é um derivado de quinolina da fórmula (I):

em que • n é 1 ou 2 e R, independentemente, representa um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C3); um grupo -NR1R2 em que R1 e R2 são independentemente um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1C3); um grupo fluoroalcóxi (C1-C3); um grupo -NO2; um grupo fenóxi; e um grupo alcóxi (C1-C4), • R’ é um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C4) e um grupo alcóxi (C1-C4), • R” é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C4), ou um de seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

8. Uso de acordo com as reivindicações de 3 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito candidato a medicamento ou candidato a vacina é um derivado de quinolina da fórmula (II):

em que • n é 1 ou 2 e R, independentemente, representa um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C3); um grupo -CN; um grupo hidroxila; um grupo - COOR1; um grupo fluoroalquila (C1-C3); um grupo -NO2; um grupo - NR1R2 com R1 e R2 sendo um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C3); e um grupo alcóxi (C1-C4), • R’ é um átomo de hidrogênio, um átomo de halógeno ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C4) e um grupo alcóxi (C1-C4), • R” é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (C1-C4), ou um de seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

9. Uso in vitro ou ex vivo de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, caracterizado pelo fato de ser como um biomarcador de uma atividade de um derivado de quinolina ou um de seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em uma infecção viral.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito derivado de quinolina é da fórmula (I) de acordo com a reivindicação 7, ou um de seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e em particular em que n é 1, R é um grupo fluoroalcóxi (C1-C3), e R’ e R” são cada um átomo de hidrogênio, por exemplo 8-cloro-N-[4-(trifluorometóxi)-fenil]quinolin-2-amina.

11. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito derivado de quinolina é da fórmula (II) de acordo com a reivindicação 8 ou um de seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e em particular em que n é 1, R é um grupo fluoroalcóxi (C1-C3) e R’ e R’’ são cada um átomo de hidrogênio, por exemplo 8-cloro-N-[4-(trifluorometil)-piridin-2-il]quinolin-2-amina.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 11, caracterizado pelo fato de ser para avaliar uma responsividade de um paciente a um tratamento de uma infecção viral com o dito derivado de quinolina.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 12, caracterizado pelo fato de ser para avaliar uma eficácia de um tratamento de uma infecção viral com o dito derivado de quinolina.

14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 13, caracterizado pelo fato de para avaliar uma eficácia terapêutica do dito derivado de quinolina como um agente terapêutico para prevenir e/ou tratar uma infecção viral.

15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 14, caracterizado pelo fato de ser para avaliar uma submissão do paciente com um tratamento com o dito derivado de quinolina.

16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 15, caracterizado pelo fato de que um nível de expressão medido em uma amostra biológica isolada é comparado com um valor de referência de controle, e em que um aumento do dito nível medido em relação ao dito valor de referência de controle é indicativo de uma atividade do dito derivado de quinolina.

17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dito nível de expressão medido é pelo menos duas vezes, preferivelmente pelo menos quatro vezes, preferivelmente pelo menos seis vezes, preferivelmente pelo menos oito vezes, e mais preferivelmente pelo menos dez vezes aumentado em relação ao dito valor de referência de controle.

18. Método in vitro ou ex vivo para avaliar uma infecção viral em um paciente presumido de estar infectado com um vírus, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos as etapas de: a. medir uma presença ou uma nível de expressão de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, em uma amostra biológica previamente obtida do dito paciente; e b. comparar a dita presença ou nível de expressão com um valor de referência de controle, em que uma presença ou nível de expressão modulados do dito miRNA em relação ao dito valor de referência de controle são indicativos de uma infecção viral.

19. Método in vitro ou ex vivo para avaliar uma atividade de um derivado de quinolina como definido em qualquer uma das reivindicações de 9 a 11 para prevenir e/ou tratar uma infecção viral em um paciente tratado com o dito derivado de quinolina, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos as etapas de: a. medir uma presença ou um nível de expressão de pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, em uma primeira amostra biológica previamente obtida do dito paciente antes da administração do dito derivado de quinolina e em uma segunda amostra biológica previamente obtida do dito paciente depois da administração do dito derivado de quinolina; e b. determinar se a dita presença ou nível de expressão são modulados na segunda amostra biológica obtida depois do tratamento quando comparada com a segunda amostra biológica obtida antes do tratamento; em que uma presença ou nível de expressão modulados do dito miRNA são indicativos de uma atividade do dito derivado de quinolina.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o dito paciente é testado em um intervalo de tempo selecionado do grupo consistindo de hora em hora, duas vezes ao dia, diariamente, duas vezes por semana, semanalmente, duas vezes ao mês, mensalmente, duas vezes ao ano, anualmente, e ano sim ano não.

21. Método in vitro ou ex vivo para avaliar o efeito biológico de um composto candidato e em particular para triar um candidato a medicamento ou candidato a vacina presumidos serem eficazes na prevenção e/ou tratamento de uma infecção viral, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos as etapas de: a. tratar pelo menos uma célula isolada capaz de expressar pelo menos um miRNA, o dito pelo menos um miRNA sendo miR-124, com o dito candidato, a dita célula estando sob condições adequadas para expressar o dito pelo menos um miRNA, b. medir uma presença ou nível de expressão do dito pelo menos um miRNA, c. comparar a dita presença ou nível de expressão medidos com uma medida ou nível de expressão do dito pelo menos um miRNA em uma célula isolada não tratada, em que uma presença ou nível de expressão modulados do dito miRNA são indicativos de um efeito biológico do dito composto candidato e em particular da eficácia do dito candidato a medicamento ou candidato a vacina em uma infecção viral.