CN105612261B - 作为生物标记物的miRNA-124 - Google Patents
作为生物标记物的miRNA-124 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105612261B CN105612261B CN201480011638.3A CN201480011638A CN105612261B CN 105612261 B CN105612261 B CN 105612261B CN 201480011638 A CN201480011638 A CN 201480011638A CN 105612261 B CN105612261 B CN 105612261B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mirna
- quinoline
- sample
- mir
- hydrogen atom
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
至少一种miRNA作为特别是病毒感染或所述病毒感染的治疗性处理功效的生物标记物的用途,所述至少一种miRNA是miR‑124。
Description
本发明涉及特别是与病毒感染结合的生物标记物领域。
更具体而言,本发明涉及用作病毒感染的诊断标记物的新型生物标 记物。更具体而言考虑的病毒感染是需要RNA剪接的病毒感染,且特别 是逆转录病毒感染例如HIV和AID相关状况。本发明还涉及关于所述感 染且特别是HIV和AIDS相关状况的治疗的随访标记物。
在高等真核生物中,信使RNA不以其功能形式直接转录,而是作为 前信使RNA转录,所述前信使RNA必须经历许多加工事件,以便可由细 胞翻译机制阅读。剪接是允许消除不需要的序列(内含子),并连接有 意义的序列(外显子)的过程。高度协调的剪接事件在称为剪接体的大 复合物中发生。该功能大复合物(megacomplex)是蛋白质和RNA的精 心装配,其需要鉴定外显子-内含子边界。外显子规律地可变剪接,意 指它们或包括在最终成熟mRNA转录物中或从最终成熟mRNA转录物中排 除。近期的广泛测序研究观察到:超过90%的基因经历可变剪接。可变 剪接的mRNA的产生被反式作用蛋白质系统调节,所述反式作用蛋白质 与前mRNA自身上的顺式作用位点结合。此类蛋白质包括促进特定剪接 位点的使用的剪接激活物,和降低特定位点的使用的剪接阻遏物,分别 结合在剪接增强子位点上(内含子剪接增强子,ISE和外显子剪接增强 子,ESE)和剪接沉默子位点上(内含子剪接沉默子,ISS和外显子剪接 沉默子,ISS)。
特别是来自逆转录病毒科的病毒是全世界疾病的主因之一。可以在 逆转录病毒科中区分出三个亚科:肿瘤病毒、慢病毒和泡沫病毒。
因为肿瘤病毒可以与癌症和恶性感染相关,所以它们被这样命名。 可以提及例如致白血病病毒(例如禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病病 毒(MULV)也称为莫洛尼病毒、猫白血病病毒(FELV)、人白血病病毒 例如HTLV1和HTLV2、猿猴白血病病毒或STLV、牛白血病病毒或BLV、 灵长类动物D型肿瘤病毒、其为乳腺肿瘤的诱导剂的B型肿瘤病毒、或 引起快速癌症的肿瘤病毒(例如劳斯肉瘤病毒或RSV)。
泡沫病毒对于给定细胞类型或给定物种表现相当低的特异性,并且 它们有时与免疫抑制现象相关;这是例如对于猿猴泡沫病毒(或SFV) 的情况。
因为慢病毒例如HIV负责缓慢进展的病理状况,所以它们被这样命 名,所述病理状况非常频繁地涉及免疫抑制现象,包括AIDS。
已知病毒且特别是逆转录病毒例如HIV依赖RNA剪接和剪接调节, 以便在受感染个体的细胞和组织内传播和散布。
近来,已利用HIV是需要RNA剪接以表达关键病毒蛋白质的逆转录 病毒的这一事实来开发基于剪接抑制的新型策略,以对抗病毒感染且特 别是AIDS(WO 2010/143169)。事实上,HIV-1基因组表达9kb的初 级转录物,其不仅充当子代病毒的基因组RNA,还生成40种不同的mRNA。 HIV-1使用四个多重可变5’剪接位点和八个多重可变3’剪接位点,以 生成剪接的mRNA种类。这些剪接的mRNA可以分成两类:多重剪接的(2 kb)和单一剪接的(4kb)RNA。HIV-1可变剪接的调节主要由于亚最佳 剪接位点的存在而发生,所述亚最佳剪接位点减少通过剪接信号的细胞 剪接机制的识别。在病毒剪接位点处的剪接进一步通过ESE、ESS和ISS 的存在得到调节。
在这个背景下,已开发了喹啉衍生物,特别是8-氯-N-[4-(三氟甲 氧基)苯基]喹啉-2-胺,其已显示在nM浓度范围下抑制HIV-1和HIV-2 T细胞向性实验室株的外周血单核细胞(PBMC)以及不同亚型的临床分 离物中的复制(WO 2010/143169)。
微小RNA(miRNA),最广泛的非编码组,是一类约22nt非编码 RNA,其通过与靶mRNA转录物的非编码区(UTR)结合来抑制基因表达 (Lai等人,Nature Genetics,第30卷,no.4,第363–364页,2002; Bartel等人,Cell,第136卷,no.2,第215–233页,2009)。miRNA 基因代表约1-2%的已知真核生物基因组。预测提出每种miRNA可以靶向 超过200种转录物,并且单一mRNA可以通过多重miRNA得到调节 (LINDOW,DNA Cell Biol.,第26卷(5),第339-351页,2007)。 miRNA由内源发夹形转录物生成且通过与靶mRNA的碱基配对而起作用, 这导致mRNA切割或翻译阻遏,取决于碱基配对的程度。两个加工事件 导致成熟的miRNA形成:首先,将初生miRNA转录物(pri-miRNA)加 工成70个核苷酸的前体(pre-miRNA),其从核中输出且在细胞质中被 切割,以生成短的(长约22个核苷酸)成熟miRNA(LEE,EMBO J.,第 21卷,第4663-4670页,2002)。miRNA可以位于基因间或基因内。当 基因间时,它们的表达与其他miRNA作为簇进行协调(Altuvia等人, Nucleic Acids Research,第33卷,no.8,第2697–2706页,2005, Ozsolak等人,Genes and Development,第22卷,no.22,第3172– 3183页,2008)。当基因内时,即置于蛋白质编码基因内(几乎唯一地 在内含子内),它们通常从与它们的宿主基因相同的链(Liu等人,Cell Research,第18卷,no.10,第985–996页,2008,Kim等人,EMBO Journal,第26卷,no.3,第775–783页,2007)且以相关联水平 (Baskerville等人,RNA,第11卷,no.3,第241–247页,2005) 表达。
miRNA近期已涉及病毒感染中的宿主和病原体的复杂串扰,并且被 认为在病毒发病机理中起主要作用(NAIR,Trends in Microbiol.,第 14卷,第169-175页,2006)。事实上,病毒是使用细胞机制用于其存 活和复制的专性细胞内寄生物,因此这种依赖性使得它们对宿主基因调 节机制敏感。细胞miRNA可以参与抗病毒防御机制,但在一些情况下, 还可以是病毒正调节物。另一方面,病毒自身也可以产生miRNA以调节 细胞过程或病毒基因。涉及HIV-1感染的miRNA可以根据其生物发生起 源定义为HIV-1编码的或宿主编码的;它们还可以根据其功能定义为感 染的阻遏物或激活物。它们可以进一步根据它们是直接靶向HIV-1转录 物还是间接影响HIV-1进行分类,通过靶向涉及病毒生命周期的宿主因 子,或靶向HIV-1RNA基因组和HIV-1感染必需的宿主因子两者。几个 数据证明HIV-1感染由于miRNA生物发生干扰而总体影响miRNA途径, 以及通过miRNA表达概况修饰而个别影响miRNA途径(Houzet等人, Biochim Biophys Acta.2011 Nov-Dec;1809(11-12):686–693))。 此外,宿主miRNA已描述为调节HIV-1。
给定药物或疫苗成功开发的一个关键因素是有效和快速评价其功 效的可能性。事实上,给定药物或疫苗在其治疗窗内进行施用是重要的, 以便避免不需要的来自太高剂量的效应,或避免由于太低剂量的功效缺 乏。另外,必须确保将适当药物或疫苗施用于适当患者,并且该患者事 实上响应药物或疫苗。因此,仅仅将给定患者和给定药物或疫苗联系在 一起不一定足以获得有利的疗效。因此关键是有适当的工具,例如特异 性生物标记物以依靠,用于评价药物或疫苗的功效。
因此,存在对新型和灵敏的工具的需要,所述工具用于评价病毒感 染,并且特别是逆转录病毒感染,并且更特别是HIV(人免疫缺陷病毒) 感染,以及此类状况的治疗功效。
存在对新型生物标记物的需要,所述生物标记物用于评价对病毒感 染,并且特别是逆转录病毒感染,并且更特别是HIV感染的治疗功效。
存在对用于评价喹啉衍生物功效的新型和灵敏的工具的需要,所述 喹啉衍生物是病毒特别是逆转录病毒例如HIV,并且更特别是HIV-1和 HIV-2的抑制剂。
存在对用于评价患者对喹啉衍生物的应答性的新型生物标记物的 需要,所述喹啉衍生物用于预防或治疗病毒感染,并且特别是逆转录病 毒感染,并且更特别是HIV感染。
存在对用于评价喹啉衍生物的治疗功效的新型生物标记物的需要, 所述喹啉衍生物用于预防或治疗病毒感染,并且特别是逆转录病毒感 染,并且更特别是HIV感染。
还存在对用于筛选药物候选物或疫苗的新型生物标记物的需要,所 述药物候选物或疫苗有效预防和/或治疗病毒感染,并且特别是逆转录 病毒感染,并且更特别是HIV感染。
本发明有意满足这些需要。
根据其目的之一,本发明涉及至少一种miRNA作为病毒感染或所述 病毒感染的治疗性处理功效的生物标记物的用途,所述至少一种miRNA 是miR-124。
出乎意料的是,如下文实施例中详述的,本发明人已观察到:在由 HIV毒株特别是ADA-M R5 HIV毒株感染的PBMC中,miR-124的表达水 平相对于未受感染的PBMC是减少的。
更重要的是,本发明人已出乎意料地观察到:用喹啉衍生物例如式 (I)或(II)的喹啉衍生物,且特别是8-氯-N-[4-(三氟甲氧基)苯 基]喹啉-2-胺处理外周血单核细胞(PBMC),所述PBMC由HIV毒株特 别是ADA-M R5 HIV感染,导致病毒的去除和miR-124表达的急剧增加 (相对于对照13倍)。喹啉衍生物可以在WO 2010/143169中所述的化 合物中选择且如下文进一步描述。相应地,所述病毒感染的治疗性处理 可以是用喹啉衍生物的处理。
相应地,miR-124自身展现为有力工具,换言之展现为生物标记物, 用于监控患如下感染的个体内的病毒感染,特别是逆转录病毒感染例如 HIV感染,以及用于监控由病毒特别逆转录病毒感染例如由HIV感染的 个体,并且用于监控用抗病毒药物治疗的此类个体,所述抗病毒药物特 别是如下详述的式(I)或(II)的喹啉衍生物,并且特别是8-氯-N-[4- (三氟甲氧基)苯基]喹啉-2-胺。
因此,通过提供确认患者接受适当药物或疫苗治疗的工具,即就剂 量和时间而言,通过监控miR-124的表达水平,能够跟踪人研究试验或 对人研究实验执行质量控制,或者监控对药物方案或疫苗的患者顺应 性。miR-124生物标记物还可以用于优化给药方案。因此,miR-124生 物标记物可以与例如患者治疗的管理、临床试验和基于细胞的研究结合使用。
根据其另一个目的,本发明涉及至少一种miRNA作为病毒感染的生 物标记物的用途,所述至少一种miRNA是miR-124,所述病毒优选逆转 录病毒,并且更优选人免疫缺陷病毒(HIV)。
根据其另一个目的,本发明涉及至少一种miRNA作为用于筛选药物 候选物或疫苗候选物的生物标记物的用途,所述至少一种miRNA是 miR-124,所述药物候选物或疫苗候选物推测有效预防和/或治疗病毒感 染,特别是逆转录病毒感染,并且更特别是HIV感染。
根据其另一个目的,本发明涉及至少一种miRNA作为用于评价候选 化合物改变细胞或蛋白质的生理活性的生物效应,特别是药理学潜力的 生物标记物的用途,所述至少一种miRNA是miRNA-124。
在这方面,本文已显示miR-124的表达水平在多种化合物的施用后 改变,已知所述多种化合物具有药理活性。因此,本发明人已显示 miR-124构成了候选化合物的潜在药理活性的有关生物标记物。
特别地,推测有效预防和/或治疗病毒感染的药物候选物或疫苗候 选物可以是喹啉衍生物。
特别地,推测有效预防和/或治疗病毒感染的药物候选物或疫苗候 选物可以是式(I)的喹啉衍生物或其药学可接受的盐之一:
其中
-n是1或2并且R独立地代表氢原子、卤素原子或选自下述的基 团:(C1-C3)烷基;-NR1R2基团,其中R1和R2独立地是氢原子或(C1-C3) 烷基;(C1-C3)氟烷氧基;-NO2基团;苯氧基;和(C1-C4)烷氧基,
-R’是氢原子、卤素原子或选自(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基 的基团,
-R"是氢原子或(C1-C4)烷基。
推测有效预防和/或治疗病毒感染的药物候选物或疫苗候选物还可 以是下式(II)的喹啉衍生物或其药学可接受的盐之一:
其中:
-n是1或2并且R独立地代表氢原子、卤素原子或选自下述的基 团:(C1-C3)烷基;–CN基团;羟基;–COOR1基团;(C1-C3)氟烷基; –NO2基团;–NR1R2基团,其中R1和R2是氢原子或(C1-C3)烷基;和(C1-C4) 烷氧基,
-R’是氢原子、卤素原子或选自(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基 的基团,
-R"是氢原子或(C1-C4)烷基。
在本发明内,术语“预防”意指降低给定事件(即,在本发明的背 景下,病毒感染)的发生可能性。
根据其另一个目的,本发明涉及至少一种miRNA作为喹啉衍生物或 其药学可接受的盐之一对病毒感染的活性的生物标记物的用途,所述至 少一种miRNA是miR-124,所述病毒感染特别是逆转录病毒感染,并且 更特别是HIV感染。
根据其另一个目的,本发明涉及至少一种miRNA作为式(I)的喹 啉衍生物或其药学可接受的盐之一对病毒感染的活性的生物标记物的 用途,所述至少一种miRNA是miR-124,所述病毒感染特别是逆转录病 毒感染,并且更特别是HIV感染:
其中
-n是1或2并且R独立地代表氢原子、卤素原子或选自下述的基 团:(C1-C3)烷基;-NR1R2基团,其中R1和R2独立地是氢原子或(C1-C3) 烷基;(C1-C3)氟烷氧基;-NO2基团;苯氧基;和(C1-C4)烷氧基,
-R’是氢原子、卤素原子或选自(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基 的基团,
-R"是氢原子或(C1-C4)烷基。
根据其另一个目的,本发明涉及至少一种miRNA作为式(II)的喹 啉衍生物或其药学可接受的盐之一对病毒感染的活性的生物标记物的 用途,所述至少一种miRNA是miR-124,所述病毒感染特别是逆转录病 毒感染,并且更特别是HIV感染:
其中
-n是1或2并且R独立地代表氢原子、卤素原子或选自下述的基 团:(C1-C3)烷基;–CN基团;羟基;–COOR1基团;(C1-C3)氟烷基; –NO2基团;–NR1R2基团,其中R1和R2是氢原子或(C1-C3)烷基;和(C1-C4) 烷氧基,
-R’是氢原子、卤素原子或选自(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基 的基团,
-R"是氢原子或(C1-C4)烷基。
根据特定实施方案,本发明的喹啉衍生物可以是8-氯-N-[4-(三氟 甲氧基)苯基]喹啉-2-胺或8-氯-N-[4-(三氟甲基)吡啶-2-基]喹啉-2- 胺。
因此,根据其另一个目的,本发明涉及至少一种miRNA作为选自下 述的喹啉衍生物的活性的生物标记物的用途,所述至少一种miRNA是 miR-124:
在本发明内,表达“病毒感染”和“被病毒感染”指任何病毒感染, 并且特别是任何逆转录病毒感染,其可以在易于表达本发明的生物标记 物的细胞、组织、器官或个体内发生。优选地,逆转录病毒感染可以是 慢病毒感染,并且更优选HIV感染。在本发明内的个体可以是哺乳动物, 并且优选易于表达本发明的生物标记物的人。在本发明内,个体和患者可互换使用。
在本发明内,术语“病毒”指任何病毒,特别是逆转录病毒且优选 慢病毒,例如HIV病毒,更优选HIV-1或HIV-2。
根据其另一个目的,本发明涉及用于评价推测被病毒感染的患者中 的病毒感染,并且特别是逆转录病毒感染,并且更特别是HIV感染的方 法,其包括至少下述步骤:
a-在先前得自所述患者的生物样品中,测量至少一种miRNA的存 在或表达水平,所述至少一种miRNA是miR-124;和
b-比较所述存在或表达水平与对照参考值,
其中相对于所述对照参考值,所述miRNA的被调节的存在或表达水 平指示病毒感染。
根据其另一个目的,本发明涉及在用所述喹啉衍生物治疗的患者 中,评价式(I)的喹啉衍生物用于预防和/或治疗病毒感染的活性的方 法,所述病毒感染特别是逆转录病毒感染,并且更特别是HIV感染,所 述方法包括至少下述步骤:
a-在施用所述喹啉衍生物之前先前得自所述患者的第一生物样品 中,以及在施用所述喹啉衍生物之后先前得自所述患者的第二生物样品 中,测量至少一种miRNA的存在或表达水平,所述至少一种miRNA是 miR-124;和
b-与在治疗前获得的第二生物样品相比较,测定所述存在或表达 水平在治疗后获得的第二生物样品中是否是被调节的;
其中所述miRNA的被调节的存在或表达水平指示所述喹啉衍生物的 活性。
如本文使用的,“生物样品”一般指得自生物受试者的样品,包括 在体内或原位获得、得到或收集的生物组织或流体起源的样品。此类样 品可以是但不限于从哺乳动物中分离的器官、组织、级分和细胞。示例 性生物样品包括但不限于细胞裂解物、细胞培养物、细胞系、组织、口 腔组织、胃肠道组织、器官、细胞器、生物流体、血液样品、血清样品、 尿液样品、皮肤样品等。优选生物样品包括但不限于血液、血浆、血清、 PBMC、组织活检、口腔粘膜、唾液、间隙液或尿液样品等。
在一个实施方案中,适合于本发明的生物样品可以选自生物组织样 品、全血样品、拭子样品、血浆样品、血清样品、唾液样品、阴道流体 样品、精液样品、咽流体样品、支气管流体样品、粪便流体样品、脑脊 髓流体样品、泪腺流体样品和组织培养物上清液样品。
本发明进一步涉及包含生物标记物的经分离的生物样品,其中所述 生物样品选自包含和优选地由如下组成的组:组织样品、全血、拭子样 品、血浆、血清、唾液、阴道流体、精液、咽流体、支气管流体、粪便 流体、脑脊髓流体、泪腺流体和组织培养物上清液;其中所述生物标记 物是miRNA生物标记物,且优选miR-124。
根据其另一个目的,本发明涉及用于评价候选化合物的生物效应, 且特别是用于筛选药物候选物或疫苗候选物的方法,所述药物候选物或 疫苗候选物推测有效预防和/或治疗病毒感染,并且特别是逆转录病毒 感染,并且更特别是HIV感染,所述方法包括至少下述步骤:
a-用所述候选物处理能够表达至少一种miRNA的至少一种经分离 的细胞,所述至少一种miRNA是miR-124,所述细胞处于适合于表达所 述至少一种miRNA的条件下,
b-测量所述至少一种miRNA的存在或表达水平,
c-比较所述测量的存在或表达水平与在未经处理的分离细胞中所 述至少一种miRNA的测量或表达水平,
其中所述miRNA的被调节的存在或表达水平指示候选化合物的生物 效应,且特别是所述药物候选物或疫苗候选物对病毒感染的功效。
在本发明内,术语“调节”或“被调节的存在或表达水平”意指本 发明的生物标记物的存在或表达水平被诱导或增加,或备选地被抑制或 减少。
因此,由本文包含的实验结果可见miR-124且特别是miR-124的表 达水平构成有关生物标记物,所述有关生物标记物指示蛋白质或细胞的 生理变化,包括细胞的代谢变化,所述改变体现有利的药理效应。
因此,如先前所述,本发明还涉及至少一种miRNA用于评价候选化 合物的生物效应,特别是药理效应的用途,所述至少一种miRNA是 miRNA-124。
本发明还涉及至少一种miRNA用于评价候选化合物改变蛋白质或细 胞的生理活性的能力的用途,所述至少一种miRNA是miRNA-124。
通过鉴定细胞的生理参数测量,包括细胞的代谢参数测量中的任何 可检测变化,蛋白质或细胞的生理活性的改变可以由本领域技术人员容 易地测定,所述可检测变化涵盖电生理变化、细胞膜渗透性变化、酶活 性变化、蛋白质表达变化、miRNA表达变化、基因表达变化、细胞内pH 值等。
如本文使用的,术语“测定”、“测量”、“评估”、“评价”和 “测定”,一般指任何形式的测量,并且包括测定元素是否存在。这些 术语包括定量和/或定性测定两者。评价可以是相对的或绝对的。短语 “评价存在”可以包括测定存在的某物的量,以及测定它是否存在。
根据一个优选实施方案,当评价病毒感染时,相对于对照参考值, 观察到所述miRNA的降低或抑制的存在或者减少的表达水平可以指示病 毒感染。
根据一个优选实施方案,当评价式(I)的喹啉衍生物用于治疗病 毒感染的活性时,或当筛选推测有效预防和/或治疗病毒感染的药物候 选物或疫苗候选物时,相对于对照参考值,观察到所述miRNA的诱导或 增加的存在或者增加的表达水平可以指示所述式(I)的喹啉衍生物的 活性或者所述药物候选物或疫苗候选物的功效。
根据一个优选实施方案,本发明的用途和方法在体外或离体进行。
根据其另一个目的,本发明涉及能够与miR-124特异性杂交的经分 离的核酸探针,作为用于测量miR-124的存在或表达水平的诊断试剂, 用于诊断病毒感染,特别是逆转录病毒感染,并且更特别是HIV感染, 或者用于评价推测有效预防和/或治疗病毒感染的药物候选物或疫苗候 选物的活性,所述病毒感染特别是逆转录病毒感染,并且更特别是HIV感染。
如本文使用的,术语“探针”一般指针对特异性靶miRNA生物标记 物序列的捕获试剂。相应地,探针组的每个探针具有各自的靶miRNA生 物标记物。探针/靶miRNA双链体是通过使探针与其靶miRNA生物标记 物杂交形成的结构。
适合于本发明的经分离的核酸探针可以优选是由选自SEQ ID NO:6 至SEQ IDNO:87的核酸序列组成的核酸探针。
根据其优点之一,本发明提供了用于被病毒感染的患者随访的有用 且可靠的生物标记物,所述病毒优选逆转录病毒,并且更优选HIV病毒。
根据其优点之一,本发明提供了用于被病毒感染且用式(I)的喹 啉衍生物治疗的患者随访的有用且可靠的生物标记物,所述病毒优选逆 转录病毒,并且更优选HIV病毒。
根据其另一个优点,本发明提供了可以在患者床边容易地使用的合 理和可靠的生物标记物。
用途和方法
根据一个实施方案,根据本发明的用途和方法可以特别允许测定患 者中的病毒感染,且特别用于此类感染的随访。
根据一个实施方案,在经分离的生物样品内测量miR-124的存在或 表达水平,并且随后与对照参考值相比较。
相对于对照参考值,miR-124的存在或表达水平的调节可以指示病 毒感染。特别地,相对于对照参考值,所述miRNA的降低或抑制的存在 或者减少的表达水平可以指示病毒感染。
在一个实施方案中,本发明的用途可以包括获得在经分离的生物样 品内测量的所述miR-124的表达水平,并且比较所述测量的表达水平与 对照参考值。相对于所述对照参考值,观察到所述测量水平的被调节可 以指示病毒感染,或所述病毒感染的治疗性处理功效。
当与对照参考值相比较,来自样品的miR-124在从患者中分离的生 物样品中是“减少的”或“下调的”时,这种减少可以是例如比较对照 参考值(即不含通过喹啉衍生物的处理)的约5%、10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、90%、100%、200%、300%、500%、1,000%、5,000%或更 多。
特别地,相对于所述对照参考值,测量的miR-124表达水平可以是 至少两倍,优选至少四倍,优选至少六倍,优选至少八倍,并且更优选 至少十倍的减少。
根据一个实施方案,使用miR-124作为用于病毒感染,并且特别是 逆转录病毒感染,并且更特别是HIV感染的生物标记物的用途和方法, 可以与来自所述感染的特异性的其他生物标记物的测定,例如来自所述 病毒的特异性的肽、蛋白质或核酸序列的存在或表达水平的测定组合。 来自病毒感染,并且特别是逆转录病毒感染,并且更特别是HIV感染的特异性的其他生物标记物可以是例如编码Tat、gp120或gp41的蛋白质 或核酸序列,或T4淋巴细胞水平。
miR-124生物标记物可以用于监控或管理患有病毒感染,并且特别 是逆转录病毒感染,并且更特别是HIV感染或AIDS(获得性免疫缺陷综 合征)的患者。
根据一个实施方案,相对于在起始所述治疗前从相同患者获取的生 物样品,从患有病毒感染且接受用于该感染的治疗的患者中获取的生物 样品中miR-124的存在或表达水平的增加,可以指示所述治疗的功效。
根据一个实施方案,本发明的用途和方法可以用于评价患者对用所 述式(I)的喹啉衍生物的治疗的应答性。
根据另一个实施方案,本发明的用途和方法可以用于评价用所述式 (I)的喹啉衍生物的治疗的有效性。
根据另一个实施方案,本发明的用途和方法可以用于评价用式(I) 的喹啉衍生物作为用于预防和/或治疗病毒感染的治疗试剂的治疗功 效。
根据一个实施方案,本发明的用途和方法可以用于评价对于用所述 式(I)的喹啉衍生物的治疗的患者顺应性。
miR-124生物标记物可以用于监控或管理在病毒感染,并且特别是 逆转录病毒感染,并且更特别是HIV感染或AIDS(获得性免疫缺陷综合 征)的患者治疗期间,式(I)的喹啉衍生物的活性。
评价或监控用所述喹啉衍生物治疗的患者中式(I)的喹啉衍生物的活性的方法可以涉及在经分离的样品,优选经分离的PBMC(外周血单 核细胞)中,测量miR-124的表达水平,并且比较测量的表达水平与在 治疗前从患者获取的经分离的样品中的miR-124表达水平。通过跟踪 miR-124水平,可以随着时间过去监控喹啉衍生物的活性。
根据一个实施方案,根据本发明的用途或方法可以用于优化患者的 给药方案。患者可以不同地响应式(I)的给定喹啉衍生物,取决于诸 如下述因素:年龄、健康、遗传背景、其他并发症的存在、疾病进展和 其他药物的共施用。利用miR-124生物标记物评价且优化患者中的喹啉 衍生物的剂量方案,例如剂量量和/或剂量时间表,可以是有用的。在 这方面,基于miR-124的生物标记物还可以用于跟踪且调整随着时间过 去的个别患者治疗有效性。生物标记物可以用于收集在患者的治疗中作 出调整所需的信息,根据需要增加或减少试剂的剂量。例如,接受喹啉 衍生物的患者可以使用基于miR-124的生物标记物进行测试,以察看剂 量是否变得有效,或是否需要实施更有攻击性的治疗计划。随后取决于 miR-124生物标记物测量,可以调整施用的药物的量、施用时机、施用 频率、施用持续时间。
miR-124生物标记物还可以用于跟踪在个别治疗方案期间,或在临 床试验期间的患者顺应性。这可以以设定间隔跟踪,以确保在试验中包 括的患者如指示的服用药物。此外,接受喹啉衍生物的患者可以使用 miR-124生物标记物进行测试,以测定患者是否顺应治疗计划的给药方 案。与未经处理的对照样品的那种相比较,生物标记物的表达水平增加指示对方案的顺应性。
本发明的生物标记物可以用于评价且跟踪式(I)的喹啉衍生物的 功效。相应地,可以在得自先前用式(I)的喹啉衍生物治疗的患者的 经分离的生物样品中,测量miR-124的存在或表达水平。随后,在经分 离的生物样品中测量的miR-124的存在或表达水平可以与对照参考值相 比较。
当观察到相对于对照参考值的测量水平的增加时,则测量指示所述 式(I)的喹啉衍生物的活性。
在另一个实施方案中,当观察到相对于对照参考值的测量水平的增 加时,则测量可以指示患者对用所述式(I)的喹啉衍生物的治疗的应 答性。
在另一个实施方案中,当观察到相对于对照参考值的测量水平的增 加时,则测量可以指示用所述式(I)的喹啉衍生物的治疗的有效性。
在另一个实施方案中,当观察到相对于对照参考值的测量表达水平 的增加时,则测量可以指示所述式(I)的喹啉衍生物作为用于预防和/ 或治疗病毒感染的治疗试剂的治疗功效。
当与未经处理的对照参考值相比较,在用喹啉衍生物治疗后来自样 品的miR-124“增加的”或“上调的”时,这种增加可以是例如比较对 照参考值(即不含通过喹啉衍生物的处理)的约5%、10%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、90%、100%、200%、300%、500%、1,000%、5,000% 或更多。
特别地,相对于所述对照参考值,测量的miR-124表达水平可以是 至少两倍,优选至少四倍,优选至少六倍,优选至少八倍,并且更优选 至少十倍的增加。
根据本发明的另一个实施方案,当监控病毒感染或评价特别是用式 (I)的喹啉衍生物的病毒感染治疗的功效时,患者可以用本发明的方 法或用途以选自下述的时间间隔进行测试:每小时一次、每天两次、每 天一次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次、每年两次、每年 一次和每隔一年一次。随后收集的样品可以立即进行测试,或可以贮存 用于以后测试。
根据另一个实施方案,根据本发明的用途和方法可以特别允许筛 选、鉴定或评估作为药物候选物的潜在活性试剂。
特别地,根据本发明的用途和方法对于筛选、鉴定或评估潜在活性 试剂,例如推测针对病毒感染有效的药物候选物或疫苗是特别有利的。
根据本发明的另一个实施方案,miR-124生物标记物可以用于筛选 推测有效用于预防和/或治疗病毒感染的药物候选物或疫苗候选物。在 此类实施方案,可以在先前与待筛选的药物或疫苗接触的经分离的生物 样品或经分离的细胞中,测量miR-124的存在或表达水平。随后,所获 得的测量可以与对照参考值相比较。
当相对于对照参考值,观察到在先前与待筛选的化合物、药物或疫 苗候选物接触的经分离的生物样品或经分离的细胞中测量水平的增加 时,则测量可以指示所述候选物具有生物效应且特别是有效用于改变细 胞的生理活性。
特别地,药物候选物或疫苗候选物可以表征为有效预防和/或治疗 病毒感染,并且特别是逆转录病毒感染,并且更特别是HIV感染。
当与未经处理的对照参考值相比较,在用药物候选物或疫苗治疗后 来自样品的miR-124“增加的”或“上调的”时,这种增加可以是例如 比较对照参考值(即不含通过喹啉衍生物的处理)的约5%、10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、90%、100%、200%、300%、500%、1,000%、 5,000%或更多。
特别地,相对于所述对照参考值,测量的miR-124表达水平可以是 至少两倍,优选至少四倍,优选至少六倍,优选至少八倍,并且更优选 至少十倍的增加。
本发明的用途和方法可以包括在经分离的生物样品中测量miR-124 的表达水平。任何合适的样品可以用于评价miR-124生物标记物。
特别地,适合于本发明的生物样品可以是生物学流体,例如血液、 血浆或血清、唾液、间质液或尿液样品;细胞样品例如细胞培养物、细 胞系或PBMC样品,组织活检例如口腔组织、胃肠组织、皮肤、口腔粘 膜样品或来自临床试验的多个样品。样品可以是粗样品,或可以在贮存、 加工或测量前纯化至不同程度。
收集生物样品用于本发明的用途和方法的步骤在进行本发明之前 执行,并且不是依照本发明的用途或方法的步骤。
用于miRNA评价的样品可以在任何所需间隔期间获取。例如,样品 可以每小时一次、每天两次、每天一次、每周一次、每月一次、每隔月 一次、每年一次等获取。样品可以立即进行测试,或可以贮存用于以后 测试。
样品可以在测试前进行纯化。在一些实施方案中,miR-124可以在 测试前从剩余细胞含量中分离。进一步地,需要时,miR-124分子可以 与样品中的mRNA的剩余部分分开。例如,miR-124可以在测试前基于尺 寸差异与mRNA分开。
待用于比较测试的生物样品中的miR-124的测量表达水平的对照参 考值从对照样品获得。
对照样品可以取自不同来源。在一些实施方案中,对照样品在治疗 前或在疾病存在前取自患者(例如存档血液样品)。在其他实施方案中, 对照样品取自一组正常、不患病的群体成员。在另一个实施方案中,可 以对于对照细胞培养物执行细胞测定,例如,所述对照细胞培养物未用 测试化合物进行处理,或已用参考化合物例如8-氯-N-[4-(三氟甲氧基) 苯基]喹啉-2-胺进行处理。
根据一个实施方案,对于患者中的病毒感染的测定或监控,对照参 考值可以得自对已知未患有此类状况的个体或个体组获得的经分离的 生物样品。
根据另一个实施方案,对于患者内的病毒感染的治疗功效的测定或 监控,对照参考值可以得自从个体或个体组获得的经分离的生物样品, 所述个体或个体组已知未患有此类状况,并且未接受待测定或监控其功 效的治疗。备选地,对照参考值可以得自从患者获得的经分离的生物样 品,所述患者患有此类状况,并且接受待测定或监控其功效的治疗,所 述经分离的生物样品在治疗施用前从患者中获取。
测量miR-124生物标记物的存在或表达水平的众多方法对于技术人 员是可获得的。
例如,核酸测定或阵列可以用于评价样品中miR-124的存在和/或 表达水平。
miR-124的序列可以用于制备充当用于不同核酸测定中的互补探针 或引物的相应核苷酸,所述核酸测定用于检测样品中的miR-124生物标 记物的表达或存在,例如但不限于RNA印迹和基于PCR的方法(例如实 时逆转录-PCR或qRT-PCR)。方法例如qRT-PCR可以用于精确地定量样 品中的miRNA的量。
根据本发明的有义和反义探针或引物可以使用本领域技术人员已 知的每一种过程来获得,特别是在Sambrook等人(Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第3版,2001,Cold Spring Harbour,N.Y.) 中描述的那些过程。
与RNA或DNA的检测和定量相关的方法是本领域众所周知的。本领 域技术人员可以例如参考Wang等人(1989,Proc Natl Acad Sci USA, 第86卷:917-921)、Wong等人(2005,Bio Techniques,第39卷(1): 75-85)、Nolan等人(2006,Nat Protoc,第1卷(3):1559-1582)、 Klinck等人(2008,Cancer Research,第68卷:657-663),或者由 Bustin(2000,Journal of Molecular Endocrinology,第25卷: 169-193)公开的一般综述。
在一个实施方案中,用于检测和定量核酸的方法可以是基于荧光染 料的方法,其中核酸浓度通过测量配体例如染料的荧光强度进行评价, 所述配体与所述核酸结合。荧光染料是本领域众所周知的。
备选地,所述核酸可以使用分光光度法进行定量。
在另一个实施方案中,用于检测和定量核酸的方法可以是基于杂交 的方法。所述基于杂交的方法可以包括PCR和定量PCR(qRT-PCR或 q-PCR)技术或基于逆转录酶/聚合酶的技术。有利地,所述方法可以包 括测序步骤或进一步与测序步骤组合。
这些方法可以包括(i)细胞mRNA的提取步骤,(ii)使用逆转录 酶将mRNA逆转录为DNA的步骤,和(iii)由先前步骤获得的DNA的DNA 扩增步骤。通常,从相同样品起始,扩增下述核酸:(a)在靶mRNA的 逆转录步骤后获得的DNA,和(b)在mRNA逆转录后获得的DNA或多种DNA,所述mRNA由细胞组成性且恒定表达(《看家基因》),例如由基 因MRPL19、PUM1和GADPH编码的RNA。
在通过电泳分离和DNA条带测量后,可以对扩增的DNA进行定量。 与一种或多种靶mRNA相关的结果表示为与由《看家》基因编码的mRNA 相比较的相对单位。在一些实施方案中,在琼脂糖凝胶电泳并且随后用 溴化乙啶使DNA条带着色之后,实现扩增的DNA的分离步骤,随后用光 密度法定量那些迁移条带中含有的DNA。在其他实施方案中,可以使用 微通道装置,其中在使用激光束定量发射的信号之前,通过毛细管电泳 分开扩增的DNA。此类装置可以是例如由公司Caliper LifeSciences (Hopkinton,MA,USA)商品化的,来自《GX》系列的装置。
通过qRT-PCR获得的定量结果有时可以比定性数据有更多信息,并 且可以简化测定标准化和质量管理。因此,在一些实施方案中,基于 qRT-PCR的测定可以用于测量在基于细胞的测定期间的miRNA水平。 qRT-PCR方法也可以用于监控患者疗法。商购可得的基于qRT-PCR的方 法{例如TaqmanR ArrayTM)
任何合适的测定平台均可用于测定样品中的miRNA的表达或存在。 例如,测定可以采取浸渍片、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球体、 载玻片、多孔板或光导纤维的形式。测定系统可以具有对应于miRNA的 寡核苷酸附着至其上的固体支持物。固体支持物可以包含例如塑料、硅、 金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、片层、球体、 多糖、毛细管、膜、板或载玻片。可以制备测定组分且作为用于检测miRNA 的试剂盒包装在一起。
在一些实施方案中,可以制备或购买用于测试生物样品中的喹啉衍 生物或药物候选物活性的寡核苷酸阵列。阵列通常含有固体支持物和接 触支持物的至少一种寡核苷酸,其中所述寡核苷酸对应于miR-124生物 标记物的至少一部分。在一些实施方案中,miR-124生物标记物的一部 分包含至少5、10、15、20个或更多个碱基。
根据一个实施方案,miR-124的存在或表达可以与同样用作生物标 记物的其他miRNA组合进行测定。在此类实施方案中,阵列可以用于评 价样品中的多种miRNA包括miRNA-124的表达或存在。一般而言,该方 法包括下述步骤:a)在足以使特异性结合发生的条件下,使样品与包 含探针组的阵列接触,和b)检查阵列以检测任何可检测标记物的存在, 从而评估样品中的各自靶miRNA的量。表达阵列的使用允许获得关于给 出样品的miRNA表达概况。
制备用于测定miRNA的测定或阵列的方法是本领域众所周知的,并 且无需在此处进一步详述。
核酸阵列可以用于检测生物样品中的miRNA的存在或差异表达。多 核苷酸阵列(例如DNA或RNA阵列)通常包括在支持物上以预定配置排 列的,通常不同的序列多核苷酸(“捕获试剂”)的区域。阵列是“可 寻址的”,因为这些区域(有时称为“阵列特点”)在阵列支持物上具 有不同的预定位置(“地址”)。在阵列上的特定预定位置(即,“地 址”)处的区域(即,阵列的“特点”或“点”)将检测特定miRNA靶。 通过将先前获得的多核苷酸以位点特异性方式沉积到支持物上,或通过 在支持物上位点特异性原位合成多核苷酸,通常在平面支持物上制造多 核苷酸阵列。通过沉积(例如通过基于接触或喷射的方法或者光刻法) 前体单位(例如核苷酸或氨基酸单体)或预合成的捕获试剂,可以制造 检测miRNA表达的阵列。在将多核苷酸捕获试剂沉积到支持物上之后, 支持物通常在使用前进行加工(例如洗涤且阻断)且贮存。
检测miRNA表达的阵列具有至少两种、三种、四种或五种不同的目 标探针。然而,在某些实施方案中,目标阵列可以包括具有至少10、至 少20、至少50、至少100、至少200、至少500或至少1,000种或更多 种探针的探针组,所述探针可以检测相应数目的miRNA。在一些实施方 案中,目标阵列可以包括用于检测生物体的所鉴定miRNA的至少一部分 或全部的探针,或可以包括来自多重生物体的直向同源探针。
在促进样品中的miRNA与阵列上存在的一种或多种捕获试剂的特异 性结合的条件下,核酸阵列可以与含有miRNA分析物的样品或标记的样 品接触,以显示出观察到的结合模式。这种结合模式可以在查询阵列后 进行检测。例如,样品中的靶miRNA可以用合适标记物(例如荧光化合 物)进行标记,并且在阵列暴露于样品后,标记物随后可以在阵列上精确地观察(例如通过观察荧光模式)。所观察到的结合模式可以指示样 品的一种或多种miRNA组分的存在和/或浓度。
duimiRNA进行标记可以使用本领域众所周知的方法进行,例如使用 DNA连接酶、末端转移酶或通过对RNA主链进行标记等。在一些实施方 案中,miRNA可以用荧光标记物进行标记。示例性荧光染料包括但不限 于呫吨染料、荧光染料、罗丹明染料、异硫氰酸荧光素(FITC)、6羧 基荧光素(FAM)、6羧基-21,41,7',4,7-六氯荧光素(HEX)、6羧基 -4',5'二氯2',7'二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N',N'四甲基6羧 基罗丹明(TAMRA或T)、6羧基X罗丹明(ROX或R)、5羧基罗丹明 6G(R6G5或G5)、6羧基罗丹明6G(R6G6或G6)中、和罗丹明110; 花青染料,例如Cy3、Cy5和Cy7染料;Alexa染料,例如Alexa-氟-555; 香豆素、二乙氨基香豆素、伞形花内酯;苯甲亚胺染料,例如Hoechst 33258;菲啶染料,例如德克萨斯红;乙啶染料;吖啶染料;咔唑染料; 吩噁嗪染料;卟啉染料;聚甲炔染料、BODIPY染料、喹啉染料、芘、氯 三嗪荧光素、Rl 10、曙红、JOE、R6G、四甲基罗丹明、丽丝胺、ROX、 萘并荧光素等。
在一些实施方案中,可以制备或例如从Affymetrix购买用于评价 免疫调节剂活性的寡核苷酸阵列。阵列可以含有固体支持物和接触支持 物的多种寡核苷酸。寡核苷酸可以存在于固体支持物上的特异性可寻址 位置中;各自对应于miRNA序列的至少一部分,其可以在细胞或患者中 的喹啉衍生物或药物候选物处理后差异表达。miRNA序列包含至少一种 miR-124序列。
当阵列用于评价miRNA时,典型的方法可以包含下述步骤:1)获 得含有表面结合的目标探针的阵列;2)在足以提供特异性结合的条件 下,使miRNA群体与表面结合的探针杂交,(3)杂交后洗涤以去除在 杂交中未结合的核酸;和(4)检测杂交的miRNA。在这些步骤各自中使 用的试剂及其使用条件可以取决于特定应用而改变。
杂交可以在合适的杂交条件下进行,所述杂交条件可以根据需要在 严格性中改变。典型的条件足以在阵列表面上在互补结合成员之间产生 探针/靶复合物,即在表面结合的目标探针和样品中的互补miRNA之间。 在某些实施方案中,可以采用严格杂交条件。杂交通常在严格杂交条件 下执行。本领域众所周知的标准杂交技术(例如在足以提供样品中的靶 miRNA与阵列上的探针特异性结合的条件下)用于使样品与核酸阵列杂 交。适当条件的选择,包括温度、盐浓度、多核苷酸浓度、杂交时间、 洗涤条件的严格性等,取决于实验设计,包括样品来源、捕获剂的身份、 预期的互补程度等,并且对于本领域普通技术人员可以作为常规实验事 项而确定。一般而言,在核酸杂交背景下的“严格杂交”和“严格杂交 洗涤条件”通常是序列依赖性的,并且在不同实验条件下是不同的。杂 交可以在约12至约24小时的时期上完成。洗涤条件的严格性可以影响 miRNA序列与互补捕获试剂特异性杂交的程度。普通技术人员容易认识 到:备选但相当的杂交和洗涤条件可以用于提供相似严格性的条件。
作为举例说明,在一个实施方案中,使用Affymetrix Genechip miRNA Array2.0,并且遵循指导手册中所述的方案,可以进行miRNA 表达概况分析实验。
在一个特定实施方案中,所述杂交可以使用杂交、洗 涤和染色试剂盒(Affymetrix参考#900720)执行。有利地,所述杂交 通过遵循制造商的方案来执行。
在miRNA杂交操作后,通常洗涤阵列表面结合的多核苷酸,以去除 未结合的核酸。洗涤可以使用任何方便的洗涤方案来执行,其中所述洗 涤条件通常是严格的,如上所述。例如,洗涤步骤可以使用由Affymetrix 公司(参考#900721和#900722)销售的洗涤缓冲液来执行。随后使用阅 读阵列的标准技术来检测靶miRNA与探针的杂交。例如通过照射阵列且 阅读在阵列的每个特点处所得的荧光的位置和强度,可以完成所得的杂 交阵列的阅读,以检测miRNA/探针结合复合物。
miRNA-124
微小RNA(miRNA)是小的单链非编码RNA,其可以在细胞的细胞质 中起作用,以引起其同源靶信使RNA的表达或mRNA的蛋白质产物的翻 译中的减少。成熟miRNA通常长度为约19-23个核苷酸。miRNA抑制其 靶蛋白质产生的这种能力导致许多类型的细胞活性的调节,所述细胞活 性例如细胞命运决定、细胞凋亡、分化和癌发生。
miR-124最初在小鼠中得到克隆。人miR-124前体(或miRN-124 或miRNA-124或微小RNA 124)从胚胎干细胞中克隆。迄今为止已鉴定 了miR-124前体的9个单元型(Guo等人,PLoS ONE,2009,4(11):e7944), 其中3个存在于人中:hsa-miR-124-1、hsa-miR-124-2和hsa-miR-124-3。(SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3)。
miR-124微小RNA前体是小的非编码RNA分子。成熟的~21核苷酸 微小mRNA通过Dicer酶从发夹前体序列进行加工。成熟序列对于 miR-124-3'为SEQ ID NO:4,UAAGGCACGCGGUGAAUGCC,并且对于 miR-124-5'为SEQ ID NO:5,CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU。
miRNA-124在脑中优先表达,并且可以通过下调SCP1表达来促成神 经发生。在小鼠神经元细胞中的miR124表达通过直接靶向PTBP1的 mRNA,诱导从一般到神经元特异性的可变剪接的转换。通过阻止PTBP1 依赖性外显子跳跃,miR-124增加神经元特异性PTBP2和Gabbr1mRNA 的丰度,所述外显子跳跃导致无义密码子介导的这些mRNA的衰变。
在脊椎动物神经系统内的有丝分裂退出的点上,当细胞丧失多潜能 性并且开始发展终生持续的稳定连接时,发生ATP依赖性染色体重建机 制中的转换。这种转变可以通过经由miR9*(由miR9茎环前体的相对臂 加工的miRNA)和miR-124阻遏BAF53A进行介导。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化的啮齿类动物模 型,其特征在于与CNS或小神经胶质细胞中的驻留巨噬细胞的活化以及 外周免疫细胞浸润至CNS相关的中枢神经系统(CNS)炎症。已发现 miR-124在小神经胶质细胞和神经元中是高度表达的。miR-124的表达 在EAE发作期间的活化的小神经胶质细胞和培养中的活化小神经胶质细 胞中是降低的。miR-124的转染使骨髓衍生的巨噬细胞失活,并且 miR-124的静脉内施用抑制损伤的发展且在3个EAE小鼠模型中降低CNS 炎症。已发现miR-124通过经由CEBPA-PU.1途径使巨噬细胞失活,来 促进小神经胶质细胞静止。
还已证实在人成纤维细胞中表达miR-124诱导其转换成神经元。神 经源性转录因子ASCL1和MYT1L的进一步添加增强转换的神经元的转换 和成熟的比率,而如果没有上述微小RNA,则这些转录因子的表达是无 效的。
适合于测量miR-124的存在或表达水平的经分离的核酸探针是能够 与miR-124,例如前体或成熟miR-124特异性杂交的核酸探针。
此类核酸探针可以包含18-30个核苷酸,特别是20-27,优选 20-25,优选20、22或25,且更优选约25个核苷酸。如前所述,此 类核酸探针可以根据本领域的任何已知方法进行制备。
预测给定探针和给定靶的最佳杂交温度是方法和制剂是本领域众 所周知的。
因此,基于探针组、给定靶序列和特定杂交条件,本领域技术人员 可以容易地计算最佳杂交温度。
有利地,所述探针的最佳杂交温度为40℃至60℃,并且更特别为 45℃至55℃,且优选为约48℃。
作为用于使本发明的核酸探针与本发明的生物标记物杂交的缓冲 液的例子,可以提及包含100mM MES、1M[Na+]、20mM EDTA、0.01% Tween-20的缓冲液作为杂交缓冲液,包含6X SSPE、0.01%Tween-20 的缓冲液作为非严格洗涤缓冲液,以及包含100mM MES、0.1M[Na+]、 0.01%Tween-20的缓冲液作为严格洗涤缓冲液。
适合于测量miR-124的存在或表达水平的核酸探针可以例如是由选 自SEQ IDNO:6至SEQ ID NO:87的核酸序列组成的核酸探针。
适合于测量miR-124-1前体的存在或表达水平的核酸探针可以例如 是由选自SEQID NO:6至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO: 87的核酸序列组成的核酸探针。
适合于测量miR-124-2前体的存在或表达水平的核酸探针可以例如 是由选自SEQID NO:35至SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO: 87的核酸序列组成的核酸探针。
适合于测量miR-124-3前体的存在或表达水平的核酸探针可以例如 是由选自SEQID NO:66至SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO: 87的核酸序列组成的核酸探针。
适合于测量成熟miR-124的存在或表达水平的核酸探针可以例如是 由选自SEQID NO:86和SEQ ID NO:87的核酸序列组成的核酸探针。
喹啉衍生物
可用于本发明的喹啉衍生物可以是有效治疗病毒感染的喹啉衍生 物,例如WO2010/143169中所述的那些。
特别地,可用于本发明的喹啉衍生物是可以由下述式(I)表示的 喹啉衍生物或其药学可接受的盐之一:
其中
-n是1或2并且R独立地代表氢原子、卤素原子或选自下述的基 团:(C1-C3)烷基;-NR1R2基团,其中R1和R2独立地是氢原子或(C1-C3) 烷基;(C1-C3)氟烷氧基;-NO2基团;苯氧基;和(C1-C4)烷氧基,
-R’是氢原子、卤素原子或选自(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基 的基团,
-R"是氢原子或(C1-C4)烷基。
根据一个实施方案,R'和R"优选为氢原子。
根据另一个实施方案,适合于本发明的喹啉衍生物可以具有式(I), 其中R独立地代表卤素原子或选自下述的基团:(C1-C3)烷基;-NR1R2基团,其中R1和R2独立地是氢原子或(C1-C3)烷基;(C1-C3)氟烷氧基; 和(C1-C4)烷氧基。
根据另一个实施方案,R独立地代表氟或氯原子或者选自下述的基 团:甲基或乙基、-NH2基团、甲氧基或乙氧基和(C1-C3)氟烷氧基。
根据另一个实施方案,n优选为1。
根据优选实施方案,适合于本发明的喹啉衍生物可以具有式(I), 其中n是1,R是(C1-C3)氟烷氧基,并且R'和R"各自是氢原子。
根据优选实施方案,R是由至少一个氟原子取代的甲氧基、乙氧基 或丙氧基。优选地,R是单、二或三氟甲氧基。
备选地,可用于本发明的喹啉衍生物是可以由式(II)的喹啉衍生 物表示的喹啉衍生物或其药学可接受的盐之一:
其中:
-n是1或2并且R独立地代表氢原子、卤素原子或选自下述的基 团:(C1-C3)烷基;–CN基团;羟基;–COOR1基团;(C1-C3)氟烷基; –NO2基团;–NR1R2基团,其中R1和R2是氢原子或(C1-C3)烷基;和(C1-C4) 烷氧基,
-R’是氢原子、卤素原子或选自(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基 的基团,
-R"是氢原子或(C1-C4)烷基。
根据一个实施方案,适合于本发明的喹啉衍生物可以具有式(II), 其中R'和R"优选为氢原子。
根据另一个实施方案,适合于本发明的喹啉衍生物可以具有式 (II),其中R独立地代表氢原子、卤素原子或选自下述的基团:(C1-C3) 烷基、(C1-C3)氟烷基、羟基、–CN基团、-COOH基团和(C1-C3)烷氧 基。
根据另一个实施方案,适合于本发明的喹啉衍生物可以具有式 (II),其中R独立地代表氢原子、卤素原子、-CN基团、(C1-C3)烷 基、(C1-C3)氟烷基和羟基。根据另一个实施方案,适合于本发明的喹 啉衍生物可以具有式(II),其中R独立地代表(C1-C3)氟烷基。
根据另一个实施方案,n优选为1。
根据优选实施方案,适合于本发明的喹啉衍生物可以具有式(II), 其中n是1,R是(C1-C3)氟烷基,并且R'和R"各自是氢原子。
因此,根据所述实施方案,喹啉衍生物可以由下式表示:
根据一个实施方案,可用于本发明的喹啉衍生物或其盐可以选自:
本发明的喹啉衍生物,且更特别地具有根据本发明的式(I)或(II) 的化合物的药学可接受的盐,可以是具有式(I)或(II)的化合物的 盐,以及碱金属盐、碱土金属盐或铵盐,包含用有机铵碱获得的盐,或 具有式(I)或(II)的化合物的盐以及有机酸或无机酸的盐。
更特别地适合于本发明的盐可以是钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、季铵 盐例如四甲基铵或四乙基铵、以及氨和药学可接受的有机胺的加成盐, 所述有机胺例如甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、三乙胺、乙醇胺和三(2- 羟乙基)胺。
本发明的喹啉衍生物的盐,且更特别地适合于本发明具有式(I) 或(II)的化合物的盐和无机酸的盐,可以用盐酸、氢溴酸、硫酸、硝 酸或磷酸获得。
本发明的喹啉衍生物的盐,且更特别地适合于本发明具有式(I) 或(II)的化合物的盐和无机酸的盐,可以用羧酸和磺酸获得,所述羧 酸和磺酸例如甲酸、乙酸、草酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸、丙 二酸、苯甲酸、马来酸、富马酸、酒石酸、甲磺酸、苯磺酸或对甲苯磺 酸。
根据优选实施方案,可用于本发明的喹啉衍生物是8-氯-N-[4-(三 氟甲氧基)苯基]喹啉-2-胺,其可以由下式表示:
适合于本发明的喹啉衍生物可以如WO 2010/143169中所述进行制 备。
治疗可以是喹啉衍生物的经口或肠胃外施用。合适的施用模式和方 案在WO2010/143169中描述。
可以使用任何施用途径。例如,喹啉衍生物可以通过口服、肠胃外、 静脉内、经皮、肌内、直肠、舌下、粘膜、鼻或其他方式进行施用。另 外,喹啉衍生物可以以药物组合物和/或单位剂型的形式施用。
合适的剂型包括但不限于胶囊剂、片剂(包括快速溶解和延迟释放 片剂)、粉末、糖浆剂、用于肠胃外施用的经口悬浮液和溶液。
本文提供的例子预期仅是示例性的,并且本领域技术人员将认识 到,或将能够使用不超过例行实验确定具体化合物、材料和操作的众多 等价物。所有此类等价物均视为在本发明的范围内,并且由所附权利要 求涵盖。
实施例
实施例1
用8-氯-N-[4-(三氟甲氧基)苯基]喹啉-2-胺调节miRNA表达
材料与方法
在通过喹啉衍生物,8-氯-N-[4-(三氟甲氧基)苯基]喹啉-2-胺对 HIV-1抑制的背景下,已研究该处理是否可以调节宿主miRNA表达。
为此,已通过在FICOLL梯度上离心,来分离五个健康供体的外周 血单核细胞(PBMC)。细胞随后已在37℃、5%CO2下在RPMI Glutamax 培养基(Life Technologies Ref61870-010)中培养至1x106细胞/mL 的密度,所述培养基补充有10%胎牛血清(FCS)(Thermo Fischer Ref SV30160.03)、1000U/mL IL2(Peprotech Ref 200-02)和5μg/mLPHA (Roche ref 1249738)。三天后,将细胞合并且在RPMI Glutamax培 养基中重悬浮至1x106细胞/mL的密度,所述培养基补充有10%胎牛血清 (FCS)、1000U/mL IL-2,并且以1.2mL/孔(4个孔/条件)分配在 12孔板(Falcon Ref 353043)中。
HIV-1感染已用1ng Ada-M R5 HIV毒株/孔执行。细胞用1.2mL/ 孔的60μM 8-氯-N-[4-(三氟甲氧基)苯基]喹啉-2-胺溶液或0.12%DMSO (Sigma Ref D4818作为阴性对照)处理6天。
细胞随后按条件合并,离心,并且将团块重悬浮于700μL Qiazol 裂解缓冲液(Qiagen Ref 217004)中,用于来自Qiagen的miRNeasy 试剂盒提取(Qiagen Ref 217004)。RNA根据制造商的说明书进行提取。 使用Agilent Bioanalyzer 2100和Nanodrop分光光度计ND-1000控制 提取的RNA的质量和量。平均RIN值为8.84(从7.2到9.7)。使用 FlashTagTMBiotin HSR RNA Labeling Kit(901911)标记90ng/样品 的总RNA量,并且与AffymetrixGenechip miRNA Array 2.0.(901753) 杂交过夜。使用标准Affymetrix方案将阵列洗涤且染色,并且使用 Affymetrix扫描仪进行扫描。使用来自Affymetrix的Expression Consolemetrics(版本1.2)执行质量控制。
使用Expression Console“RMA+DABG”标准化方法将数据标准化, 并且如果相应的DABG P-值小于或等于0.05,则miRNA视为被表达。如 果miRNA在一种条件的至少75%的PBMC供体中表达,则miRNA视为在这 种条件下被表达。将配对斯氏t检验应用于所表达的miRNA,如果倍数 变化大于或等于1.5,并且T检验P值小于或等于0.05,则所述miRNA 视为在两种条件之间是差异表达的。
结果
受感染和未受感染的细胞之间的miRNA表达的比较突出显示了起因 于HIV-1感染的多重修饰(上调或下调)。特别地,观察到miRNA-124 在受HIV感染的PBMC是下调的。
相比之下,在8-氯-N-[4-(三氟甲氧基)苯基]喹啉-2-胺处理或未 处理的受HIV感染的PBMC之间的比较突出显示了仅一种miRNA, miR-124,其表达在处理下确实增加(约13倍)。
相应地,miR-124验证为有关生物标记物,以监控根据本发明的喹 啉衍生物,且特别是8-氯-N-[4-(三氟甲氧基)苯基]喹啉-2-胺作为 AIDS患者中的抗病毒药物的功效。
实施例2
喹啉衍生物对miR-124 3p表达的效率的评估。
除提供在HIV-1感染背景下的miRNA表达的评价的实施例1之外, 实施例2评价在不存在HIV-1的情况下的miR-124表达的验证。测试筛 选方法以评估一组喹啉衍生物和已知的抗逆转录病毒药物,例如马拉韦 罗、依非韦伦、地瑞那韦和叠氮胸苷(AZT)。
材料与方法
使用FICOLLTM梯度的PBMC提取
为此,已通过根据标准方案在FICOLLTM梯度上离心,来分离四个健 康供体的外周血单核细胞(PBMC)。
简言之,将60-70mL血沉棕黄层倾入175cm2的烧瓶中,并且使用 PBS将体积调整至300mL,以便获得约5倍的血沉棕黄层稀释。随后在 环境温度下,将38mL稀释的血沉棕黄层加入包含12mL FICOLLTM (Histopack-1077)的50mL FalconTM管中。将沉淀物在环境温度下以 1600rpm(=515rcf)离心30分钟。用移液管从Falcon TM管中回收淋巴细胞环,并且随后使用在1200rpm(=290rcf)和环境 温度下的10分钟离心用PBS洗涤,直至上清液变得澄清。
细胞随后在37℃下在RPMI Glutamax培养基(Life Technologies Ref 61870-010)中重悬浮至1,5x106细胞/mL的密度且无需活化,所述 培养基补充有10%胎牛血清(FCS)(Thermo Fischer Ref SV30160.03)。 细胞在37℃下在5%CO2下温育48小时。
用筛选的分子处理细胞
六孔板用于筛选。在包含补充有10%胎牛血清和40U/mL IL-2 (Peprotech Ref200-02)的3.106细胞/4ml RPMI的每个孔内,加入 筛选的分子。将100%DMSO(0,8μL)加入孔中,并且作为阴性对照进 行测试。
每种测试条件如下所述设置,并且相应地调整孔中的最终对应体 积:
1)喹啉衍生物:在100%DMSO中的(8-氯-N-[4-(三氟甲氧基) 苯基]喹啉-2-胺和8-氯-N-[4-(三氟甲基)吡啶-2-基]喹啉-2-胺—— 分别为化合物1和8)–(5μM和最终体积0,4μL):
《化合物1》(5μM)
《化合物8》(5μM)
2)其他抗逆转录病毒药物:马拉韦罗、依非韦伦、地瑞那韦和AZT (均为10μM-最终体积0,8μL)。
孔在37℃下在5%CO2下温育三天。根据标准方案更换培养基(第3 天)。简言之,将板以1200rpm离心5分钟,并且去除3mL上清液。 随后加入3mL补充有10%胎牛血清和40U/mLIL-2的RPMI,连同在100% DMSO中以50mM的0,6μL(对于10μM最终浓度)或0,3μL(对于5μM最终浓度)的筛选分子原液,或者作为阴性对照的0,6μL 100%DMSO。
miRNA的提取(第6天)
细胞在15mL FalconTM管内回收,以1200rpm离心5分钟,并且随 后在10mL PBS中洗涤,并且进一步以1200rpm离心5分钟。随后将 细胞重悬浮于1mL PBS中且计数。
将6x106细胞回收且以1200rpm离心5分钟。细胞团块在来自 Macherey NagelmiRNA提取试剂盒(Macherey Nagel Ref 740971)的300μL的ML裂解缓冲液中进行裂解,并且进一步贮存于 -20℃下。
对于每种样品加入5μL的2x108拷贝/μL掺料对照(来自的Ce_miR-39——参考219610,序列5’UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG 3’)。 使用对于RNA 50μL的洗脱体积和对于miRNA 30μL的洗脱体积,使用 来自Macherey NagelmiRNA提取试剂盒的方案,来实现 miRNA提取,并且进一步贮存于-20℃下。
miRNA的逆转录(第6天)
使用miScript HiSpec缓冲液,使用来自的miScript RT II 逆转录(RT)试剂盒,对于12μL miRNA进行逆转录步骤,并且进一步 贮存于-20℃下。
miRNA的定量PCR(第6天)
根据制造商的方案,使用miScriptGreen PCR试 剂盒和miScript Primer Assays,来实现定量PCR步骤。
用于384孔板的miScript反应混合物的组成
(*)cDNA使用miScript II RT试剂盒进行制备
在380 Roche Real-Time PCR系统上,根据制造商 的方案,在384孔板中一式三份重复反应。循环条件也根据制造商的方 案进行设置:
qPCR的相对和绝对定量是本领域的已知技术,并且可以如下文进一 步详述的来实现。
1)相对定量
使用miScript Primer Assays(Hs_miR-124a、Hs_miR-26a和 Hs_miR-191),对于miR-124 qPCR,从在H2O中稀释至十分之一开始 (Hs_miR-124a),或对于参考/看家基因qPCR,从在H2O中稀释至一百 分之一开始(Hs_miR-26a和Hs_miR-191。
使用来自miR-124的一式三份的交叉点(Cp)值的平均值,以及 miR-26a和miR-191的一式三份的平均值的平均值,使用不含效率校正 (2-ΔΔCp)的相对定量模型来实现分析。
2)绝对定量
对于miR-124 qPCR和miScript Primer Assays,从在H2O中稀释 至十分之一开始(Hs_miR-124a et Ce_miR-39)。根据标准方案来实 现校准曲线。通过用miR-39一式三份的平均值标准化miR-124一式三 份的平均值,并且用细胞数目进一步标准化,来实现分析。
结果
结果显示对于所有分子在相对和绝对定量之间的良好一致。DMSO 对照样品具有倍数变化为1,意指在miR-124a表达中无变化。所有测试 的喹啉衍生物均显示对应于miR-124表达的十倍增加的miR-124调节。
相比之下,其他抗逆转录病毒药物不诱导miR-124表达的显著调节。
因此,本实施例显示miR-124是用于筛选药物候选物或疫苗候选物 的合适生物标记物,所述药物候选物或疫苗候选物推测有效预防和/或 治疗病毒感染。它还可特别用于评价本发明的喹啉衍生物的活性。
Claims (13)
1.至少一种miRNA作为用于筛选药物候选物或疫苗候选物的生物标记物的体外或离体用途,所述至少一种miRNA是miR-124,所述药物候选物或疫苗候选物推测有效预防和/或治疗HIV感染。
2.根据权利要求1的用途,其中所述药物候选物或疫苗候选物是喹啉衍生物。
3.根据权利要求1或2的用途,其中将在所述候选物的存在下在经分离的生物样品中测量的所述miR-124的表达水平与对照参考值相比较,并且相对于所述对照参考值,所述测量的水平的调节指示所述候选物的生物效应,其中所述对照参考值得自对已知未患有HIV感染的个体或个体组获得的经分离的生物样品。
4.根据权利要求3的用途,其中所述生物样品选自生物组织样品、全血样品、拭子样品、血浆样品、血清样品、唾液样品、阴道流体样品、精液样品、咽流体样品、支气管流体样品、粪便流体样品、脑脊髓流体样品、泪腺流体样品和组织培养物上清液样品。
5.根据权利要求1或2的用途,其中所述药物候选物或疫苗候选物是式(I)的喹啉衍生物或其药学可接受的盐之一:
其中
-n是1或2并且R独立地代表氢原子、卤素原子或选自下述的基团:(C1-C3)烷基;-NR1R2基团,其中R1和R2独立地是氢原子或(C1-C3)烷基;(C1-C3)氟烷氧基;-NO2基团;苯氧基;和(C1-C4)烷氧基,
-R'是氢原子、卤素原子或选自(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基的基团,
-R"是氢原子或(C1-C4)烷基。
6.根据权利要求1或2的用途,其中所述药物候选物或疫苗候选物是式(II)的喹啉衍生物或其药学可接受的盐之一:
其中:
-n是1或2并且R独立地代表氢原子、卤素原子或选自下述的基团:(C1-C3)烷基;-CN基团;羟基;-COOR1基团;(C1-C3)氟烷基;-NO2基团;-NR1R2基团,其中R1和R2是氢原子或(C1-C3)烷基;和(C1-C4)烷氧基,
-R'是氢原子、卤素原子或选自(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基的基团,
-R"是氢原子或(C1-C4)烷基。
7.根据权利要求5的用途,其中所述喹啉衍生物具有式(I)或为其药学可接受的盐之一,其中n是1,R是(C1-C3)氟烷氧基,并且R'和R"各自是氢原子。
8.根据权利要求6的用途,其中所述喹啉衍生物具有式(I I)或为其药学可接受的盐之一,其中n是1,R是(C1-C3)氟烷氧基,并且R'和R"各自是氢原子。
9.根据权利要求1或2的用途,其中所述候选物是8-氯-N-[4-(三氟甲氧基)苯基]喹啉-2-胺或其药学可接受的盐之一。
10.根据权利要求1或2的用途,其中所述候选物是8-氯-N-[4-(三氟甲基)吡啶-2-基]喹啉-2-胺或其药学可接受的盐之一。
11.能够与miR-124特异性杂交的经分离的核酸探针在制备诊断试剂中的用途,所述诊断试剂用于诊断HIV感染,或者用于评价用于预防和/或治疗HIV感染的药物候选物或疫苗候选物的活性。
12.根据权利要求11的用途,其中所述用途为用于评价用于预防和/或治疗HIV感染的药物候选物或疫苗候选物的活性。
13.根据权利要求11或12的用途,其中所述核酸探针由选自SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:87的核酸序列组成。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13305053.4A EP2757161A1 (en) | 2013-01-17 | 2013-01-17 | miRNA-124 as a biomarker of viral infection |
EP13305053.4 | 2013-01-17 | ||
PCT/IB2014/058359 WO2014111892A1 (en) | 2013-01-17 | 2014-01-17 | miRNA-124 AS A BIOMARKER |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105612261A CN105612261A (zh) | 2016-05-25 |
CN105612261B true CN105612261B (zh) | 2019-06-18 |
Family
ID=47628077
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480011638.3A Active CN105612261B (zh) | 2013-01-17 | 2014-01-17 | 作为生物标记物的miRNA-124 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11441181B2 (zh) |
EP (2) | EP2757161A1 (zh) |
JP (1) | JP6607568B2 (zh) |
KR (2) | KR102575595B1 (zh) |
CN (1) | CN105612261B (zh) |
AU (2) | AU2014206553B2 (zh) |
BR (1) | BR112015016977B1 (zh) |
CA (1) | CA2897563C (zh) |
DK (1) | DK2946022T3 (zh) |
ES (1) | ES2716104T3 (zh) |
HK (1) | HK1218766A1 (zh) |
HR (1) | HRP20190436T1 (zh) |
MX (1) | MX363726B (zh) |
PL (1) | PL2946022T3 (zh) |
PT (1) | PT2946022T (zh) |
RU (1) | RU2687366C2 (zh) |
TR (1) | TR201903401T4 (zh) |
WO (1) | WO2014111892A1 (zh) |
ZA (1) | ZA201504984B (zh) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106928194B (zh) | 2009-06-12 | 2019-11-12 | Abivax公司 | 用于治疗过早衰老和尤其是早衰的化合物 |
US10253020B2 (en) | 2009-06-12 | 2019-04-09 | Abivax | Compounds for preventing, inhibiting, or treating cancer, AIDS and/or premature aging |
EP2757161A1 (en) | 2013-01-17 | 2014-07-23 | Splicos | miRNA-124 as a biomarker of viral infection |
RU2681943C9 (ru) * | 2013-07-05 | 2019-05-16 | Абивакс | Соединения, полезные для лечения заболеваний, вызванных ретровирусами |
EP2974729A1 (en) | 2014-07-17 | 2016-01-20 | Abivax | Quinoline derivatives for use in the treatment of inflammatory diseases |
EP3058940A1 (en) * | 2015-02-23 | 2016-08-24 | Abivax | Quinoline derivatives for use in the treatment or prevention of viral infection |
EP3669874A1 (en) * | 2018-12-20 | 2020-06-24 | Abivax | Quinoline derivatives for use in the treatment or prevention of cancer |
EP3669873A1 (en) | 2018-12-20 | 2020-06-24 | Abivax | Quinoline derivatives for use ine the traeatment of inflammation diseases |
WO2020161206A1 (en) * | 2019-02-05 | 2020-08-13 | Universidade De Santiago De Compostela | In vitro method for the diagnosis of viral infections |
EP3884946A1 (en) | 2020-03-25 | 2021-09-29 | Abivax | Compounds for treating or preventing a coronaviridae infection & methods and uses for assessing the occurrence of a coronaviridae infection |
WO2021186053A1 (en) | 2020-03-20 | 2021-09-23 | Abivax | Compounds for treating or preventing a coronaviridae infection & methods and uses for assessing the occurrence of a coronaviridae infection |
EP3881844A1 (en) | 2020-03-20 | 2021-09-22 | Abivax | Compounds for treating or preventing a coronaviridae infection & methods and uses for assessing the occurrence of a coronaviridae infection |
WO2023126951A1 (en) * | 2022-01-03 | 2023-07-06 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Inhibitors of autophagy-related protein-protein interactions |
EP4212156A1 (en) | 2022-01-13 | 2023-07-19 | Abivax | Combination of 8-chloro-n-(4-(trifluoromethoxy)phenyl)quinolin-2-amine and its derivatives with a s1p receptor modulator |
EP4215196A1 (en) | 2022-01-24 | 2023-07-26 | Abivax | Combination of 8-chloro-n-(4-(trifluoromethoxy)phenyl)quinolin-2-amine and its derivatives with a jak inhibitor |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007042899A2 (en) * | 2005-10-10 | 2007-04-19 | Council Of Scientific And Industrial Research | Human microrna targets in hiv genome and a method of identification thereof |
WO2009085234A3 (en) * | 2007-12-20 | 2009-08-27 | Signal Pharmaceuticals, Inc. | Use of micro-rna as a biomarker of immunomodulatory drug activity |
WO2009132273A3 (en) * | 2008-04-25 | 2010-01-21 | Merck & Co., Inc. | Microrna biomarkers of tissue injury |
WO2010143169A3 (en) * | 2009-06-12 | 2011-11-10 | Société Splicos | Compounds useful for treating aids |
Family Cites Families (62)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB585362A (en) | 1944-08-31 | 1947-02-05 | Francis Henry Swinden Curd | New heterocyclic compounds |
BE486034A (zh) | 1947-11-28 | |||
DE958647C (de) | 1952-12-28 | 1957-02-21 | Hoechst Ag | Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-2-oxy-4-methyl-chinolinen |
FR2387229A1 (fr) | 1977-04-13 | 1978-11-10 | Anvar | Dipyrido (4,3-b) (3,4-f) indoles, procede d'obtention, application therapeutique et compositions pharmaceutiques les contenant |
FR2436786A1 (fr) | 1978-09-21 | 1980-04-18 | Anvar | Nouveaux derives des pyrido (4,3-b) carbazoles (ellipticines), substitues en position 1 par une chaine polyaminee, leur obtention et leur application a titre de medicaments |
US4738710A (en) | 1979-11-19 | 1988-04-19 | Ici Australia Limited | Herbicidal alkane carboxylic acid derivatives |
FR2627493B1 (fr) | 1988-02-23 | 1991-10-31 | Sanofi Sa | Procede de preparation de derives d'isoquinoleine |
FR2645861A1 (fr) | 1989-04-17 | 1990-10-19 | Inst Nat Sante Rech Med | Utilisation de dipyrido (4,3-b) (3,4-f) indoles pour la preparation de medicaments utiles pour le traitement du sida |
US6177401B1 (en) | 1992-11-13 | 2001-01-23 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften | Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis |
US6180632B1 (en) | 1997-05-28 | 2001-01-30 | Aventis Pharmaceuticals Products Inc. | Quinoline and quinoxaline compounds which inhibit platelet-derived growth factor and/or p56lck tyrosine kinases |
WO2000059875A2 (en) | 1999-04-05 | 2000-10-12 | City Of Hope | Novel inhibitors of formation of advanced glycation endproducts (age's) |
UA75055C2 (uk) | 1999-11-30 | 2006-03-15 | Пфайзер Продактс Інк. | Похідні бензоімідазолу, що використовуються як антипроліферативний засіб, фармацевтична композиція на їх основі |
DE10013318A1 (de) | 2000-03-17 | 2001-09-20 | Merck Patent Gmbh | Formulierung enthaltend Chinoxalinderivate |
AU2002303078B2 (en) | 2001-01-22 | 2007-08-30 | Memory Pharmaceuticals Corporation | Aniline derivatives useful as phosphodiesterase 4 inhibitors |
US6498254B1 (en) | 2001-10-29 | 2002-12-24 | Uniroyal Chemical Company, Inc. | Antiretroviral compounds and compositions |
ES2355472T3 (es) | 2002-05-22 | 2011-03-28 | Amgen Inc. | Derivados de aminopirimidina para su uso como ligandos del receptor vaniloide para el tratamiento del dolor. |
AU2002950217A0 (en) | 2002-07-16 | 2002-09-12 | Prana Biotechnology Limited | 8- Hydroxy Quinoline Derivatives |
BR0312999A (pt) | 2002-07-19 | 2005-06-07 | Memory Pharm Corp | Compostos, composições farmacêticas, método para aumentar a cognição, de tratamento, de inibição da atividade de enzima pde4 em um paciente |
WO2006081444A2 (en) | 2005-01-28 | 2006-08-03 | The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health And Human Services | Farnesyltransferase inhibitors for treatment of laminopathies, cellular aging and atherosclerosis |
FR2849474B3 (fr) | 2002-12-27 | 2004-12-03 | Olivier Jean Noel Juin | Installation de transformation de l'energie cinetique d'un fluide en energie electrique |
WO2004078731A1 (fr) | 2003-03-06 | 2004-09-16 | 'chemical Diversity Research Institute', Ltd. | Acides quinoline-carboxyliques et leurs derives et bibliotheque focalisee |
CA2518398A1 (en) | 2003-03-10 | 2004-09-23 | Schering Corporation | Heterocyclic kinase inhibitors: methods of use and synthesis |
FR2859475A1 (fr) | 2003-09-04 | 2005-03-11 | Centre Nat Rech Scient | Utilisation de composes derives d'ellipticine et d'aza-ellipticine pour la preparation d'un medicament utile pour le traitement de maladies genetiques resultant de l'alteration des processus d'epissage |
FR2859474B1 (fr) | 2003-09-04 | 2006-01-13 | Centre Nat Rech Scient | Utilisation de composes derives d'indole pour la preparation d'un medicament utile pour le traitement de maladies genetiques resultant de l'alteration des processus d'epissage |
CN1882345A (zh) | 2003-10-16 | 2006-12-20 | 希龙公司 | 作为raf激酶抑制剂以治疗癌症的2,6-二取代的喹唑啉、喹喔啉、喹啉和异喹啉 |
EP1689387B1 (en) | 2003-11-19 | 2011-09-14 | Array Biopharma, Inc. | Bicyclic inhibitors of mek and methods of synthesis thereof |
EP2229945A1 (en) | 2004-05-21 | 2010-09-22 | Japan Tobacco, Inc. | Combinations comprising a 4-isoquinolone derivative and anti-HIV agents |
CA2585490A1 (en) | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Galapagos Nv | Nitrogen heteroaromatic compounds which bind to the active site of protein kinase enzymes |
CA2600869A1 (en) | 2005-03-18 | 2006-09-28 | The Regents Of The University Of California | Compounds having activity in correcting mutant-cftr processing and uses thereof |
CN101213260A (zh) | 2005-06-29 | 2008-07-02 | 株式会社Adeka | 树脂添加剂组合物和其树脂组合物 |
RU2350650C2 (ru) * | 2006-04-17 | 2009-03-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Биосинтез" (ООО "Биосинтез") | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pVar15-HIV-LTR, НЕСУЩАЯ КЛОНИРОВАННЫЙ ФРАГМЕНТ ГЕНОМА ВИЧ-1 ТИПА ИЗ КОНСЕРВАТИВНОГО УЧАСТКА 5'-LTR ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBluKSM-HIV-LTR mod, НЕСУЩАЯ КЛОНИРОВАННЫЙ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ФРАГМЕНТ ЭТОГО ЖЕ УЧАСТКА ГЕНОМА ВИЧ-1 ТИПА, ТЕСТ-НАБОР ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ЭКСПРЕСС-ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОМА ВИЧ-1 ЛЮБОГО ТИПА В ПРОБЕ И СПОСОБ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ |
CN101589026B (zh) | 2006-06-22 | 2013-10-16 | 普拉纳生物技术有限公司 | 治疗脑神经胶质瘤的方法 |
FR2903312B1 (fr) | 2006-07-05 | 2008-09-26 | Univ Aix Marseille Ii | Utilisation d'inhibiteurs d'hmg-coa reductase et de farnesyl-pyrophosphate synthase dans la preparation d'un medicament |
WO2008008234A1 (en) | 2006-07-07 | 2008-01-17 | Targegen, Inc. | 2-amino-5-substituted pyrimidine inhibitors |
AU2008206045A1 (en) | 2007-01-19 | 2008-07-24 | Ardea Biosciences, Inc. | Inhibitors of MEK |
FR2912745A1 (fr) | 2007-02-19 | 2008-08-22 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes derives d'indole et compositions pharmaceutiques les contenant |
US20100249184A1 (en) | 2007-03-16 | 2010-09-30 | Mount Sinai School Of Medicine | Induction and/or maintenance of tumor dormancy by disruption of urokinase plasminogen activator receptor-integrin interaction |
JP5603233B2 (ja) | 2007-05-17 | 2014-10-08 | エルジー・ケム・リミテッド | 新規なアントラセン誘導体およびそれを用いた有機電子素子 |
WO2008153692A2 (en) * | 2007-05-22 | 2008-12-18 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Microrna expression profiling of cerebrospinal fluid |
UY31272A1 (es) | 2007-08-10 | 2009-01-30 | Almirall Lab | Nuevos derivados de ácido azabifenilaminobenzoico |
MX2010001576A (es) | 2007-08-15 | 2010-09-14 | Memory Pharm Corp | Compuestos 3´sustituidos que tienen afinidad con el receptor 5-hidroxitriptamina 6 (5-ht6). |
WO2009029617A1 (en) | 2007-08-27 | 2009-03-05 | Kalypsys, Inc. | Diarylamine-substituted quinolones useful as inducible nitric oxide synthase inhibitors |
KR100974562B1 (ko) | 2007-12-31 | 2010-08-06 | 다우어드밴스드디스플레이머티리얼 유한회사 | 신규한 유기 발광 화합물 및 이를 발광재료로서 채용하고있는 유기 발광 소자 |
FR2926297B1 (fr) | 2008-01-10 | 2013-03-08 | Centre Nat Rech Scient | Molecules chimiques inhibitrices du mecanisme d'epissage pour traiter des maladies resultant d'anomalies d'epissage. |
JP2009174368A (ja) | 2008-01-23 | 2009-08-06 | Toyota Motor Corp | 内燃機関の排気浄化装置 |
US20160041153A1 (en) * | 2008-11-12 | 2016-02-11 | Kirk Brown | Biomarker compositions and markers |
CA2753657A1 (en) * | 2009-03-19 | 2010-09-23 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Process for preparing sulfonyl quinolines |
EP2427434B1 (en) * | 2009-05-05 | 2017-05-31 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Process for preparing bromo-substituted quinolines |
EP2266972A1 (en) | 2009-06-12 | 2010-12-29 | Splicos | New chemical molecules that inhibit the splicing mechanism for treating diseases resulting from splicing anomalies |
MX2019008390A (es) | 2009-06-12 | 2019-09-09 | Abivax | Compuestos utiles para tratar cancer. |
US10253020B2 (en) | 2009-06-12 | 2019-04-09 | Abivax | Compounds for preventing, inhibiting, or treating cancer, AIDS and/or premature aging |
US8962583B2 (en) | 2009-06-25 | 2015-02-24 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Treatment of inflammatory diseases using miR-124 |
US8648017B2 (en) * | 2009-11-04 | 2014-02-11 | Diamir, Llc | Methods of using small RNA from bodily fluids for diagnosis and monitoring of neurodegenerative diseases |
EP2465502A1 (en) | 2010-12-15 | 2012-06-20 | Société Splicos | Compounds useful for treating AIDS |
WO2012118988A1 (en) * | 2011-03-01 | 2012-09-07 | The Scripps Research Institute | Direct reprogramming of human fibroblasts to functional neurons under defined conditions |
SI2756099T1 (sl) * | 2011-09-15 | 2017-11-30 | Self-Screen B.V. | Postopek za detekcijo HPV-induciranega raka materničnega vratu |
JP2016504268A (ja) | 2012-10-04 | 2016-02-12 | オヤジェン インコーポレイテッドOyaGen, Inc. | Vifの自己会合を撹乱する抗hiv剤としての小分子及びその使用方法 |
EP2757161A1 (en) | 2013-01-17 | 2014-07-23 | Splicos | miRNA-124 as a biomarker of viral infection |
EP2974729A1 (en) | 2014-07-17 | 2016-01-20 | Abivax | Quinoline derivatives for use in the treatment of inflammatory diseases |
EP2975034A1 (en) | 2014-07-17 | 2016-01-20 | Abivax | A quinoline derivative for the treatment of inflammatory diseases and AIDS |
EP3059236A1 (en) | 2015-02-23 | 2016-08-24 | Abivax | A new quinoline derivative for use in the treatment and prevention of viral infections |
ES2899926T3 (es) | 2016-03-18 | 2022-03-15 | Prosynergia S A R L | Procedimiento para preparar derivados de quinolin-2-il-fenilamina y sus sales |
-
2013
- 2013-01-17 EP EP13305053.4A patent/EP2757161A1/en not_active Withdrawn
-
2014
- 2014-01-17 KR KR1020227009514A patent/KR102575595B1/ko active IP Right Grant
- 2014-01-17 EP EP14703438.3A patent/EP2946022B1/en active Active
- 2014-01-17 BR BR112015016977-5A patent/BR112015016977B1/pt active IP Right Grant
- 2014-01-17 RU RU2015133373A patent/RU2687366C2/ru active
- 2014-01-17 DK DK14703438.3T patent/DK2946022T3/en active
- 2014-01-17 CN CN201480011638.3A patent/CN105612261B/zh active Active
- 2014-01-17 WO PCT/IB2014/058359 patent/WO2014111892A1/en active Application Filing
- 2014-01-17 JP JP2015553212A patent/JP6607568B2/ja active Active
- 2014-01-17 TR TR2019/03401T patent/TR201903401T4/tr unknown
- 2014-01-17 ES ES14703438T patent/ES2716104T3/es active Active
- 2014-01-17 PL PL14703438T patent/PL2946022T3/pl unknown
- 2014-01-17 MX MX2015008703A patent/MX363726B/es active IP Right Grant
- 2014-01-17 PT PT14703438T patent/PT2946022T/pt unknown
- 2014-01-17 US US14/761,674 patent/US11441181B2/en active Active
- 2014-01-17 AU AU2014206553A patent/AU2014206553B2/en active Active
- 2014-01-17 CA CA2897563A patent/CA2897563C/en active Active
- 2014-01-17 KR KR1020157022175A patent/KR102412581B1/ko active IP Right Grant
-
2015
- 2015-07-10 ZA ZA2015/04984A patent/ZA201504984B/en unknown
-
2016
- 2016-06-10 HK HK16106678.8A patent/HK1218766A1/zh unknown
-
2019
- 2019-03-04 HR HRP20190436TT patent/HRP20190436T1/hr unknown
- 2019-12-19 AU AU2019283919A patent/AU2019283919A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007042899A2 (en) * | 2005-10-10 | 2007-04-19 | Council Of Scientific And Industrial Research | Human microrna targets in hiv genome and a method of identification thereof |
WO2009085234A3 (en) * | 2007-12-20 | 2009-08-27 | Signal Pharmaceuticals, Inc. | Use of micro-rna as a biomarker of immunomodulatory drug activity |
WO2009132273A3 (en) * | 2008-04-25 | 2010-01-21 | Merck & Co., Inc. | Microrna biomarkers of tissue injury |
WO2010143169A3 (en) * | 2009-06-12 | 2011-11-10 | Société Splicos | Compounds useful for treating aids |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Epigenetic regulation of miR-124 by Hepatitis C Virus core protein promotes migration and invasion of intrahepatic cholangiocarcinoma cells by targeting SMYD3;Bing Zeng et al.;《FEBS Lett.》;20120720;第586卷(第19期);第3271-3278页 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2014206553B2 (en) | 2020-01-16 |
PL2946022T3 (pl) | 2019-06-28 |
KR102575595B1 (ko) | 2023-09-06 |
HK1218766A1 (zh) | 2017-03-10 |
ES2716104T3 (es) | 2019-06-10 |
US20150361491A1 (en) | 2015-12-17 |
WO2014111892A1 (en) | 2014-07-24 |
RU2015133373A (ru) | 2017-02-21 |
EP2757161A1 (en) | 2014-07-23 |
CA2897563A1 (en) | 2014-07-24 |
JP6607568B2 (ja) | 2019-11-20 |
KR20220038551A (ko) | 2022-03-28 |
BR112015016977A2 (zh) | 2017-08-15 |
CN105612261A (zh) | 2016-05-25 |
CA2897563C (en) | 2021-08-31 |
MX363726B (es) | 2019-04-01 |
AU2019283919A1 (en) | 2020-01-16 |
US11441181B2 (en) | 2022-09-13 |
KR102412581B1 (ko) | 2022-06-23 |
BR112015016977B1 (pt) | 2022-11-08 |
EP2946022A1 (en) | 2015-11-25 |
DK2946022T3 (en) | 2019-04-08 |
TR201903401T4 (tr) | 2019-04-22 |
KR20150109407A (ko) | 2015-10-01 |
PT2946022T (pt) | 2019-03-21 |
RU2687366C2 (ru) | 2019-05-13 |
AU2014206553A1 (en) | 2015-07-23 |
MX2015008703A (es) | 2016-04-15 |
ZA201504984B (en) | 2016-09-28 |
JP2016505268A (ja) | 2016-02-25 |
EP2946022B1 (en) | 2019-01-09 |
HRP20190436T1 (hr) | 2019-06-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105612261B (zh) | 作为生物标记物的miRNA-124 | |
US11414705B2 (en) | Salivary biomarkers of brain injury | |
Durrand et al. | Variations in the sequence and expression of the Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (Pfcrt) and their relationship to chloroquine resistance in vitro | |
CN101679971A (zh) | 青光眼恶化风险的判定方法 | |
US20120202214A1 (en) | Method for detecting fusion gene | |
CN108676872A (zh) | 一种与哮喘相关的生物标志物及其应用 | |
AU2014356506A1 (en) | A method for predicting responsiveness to a treatment with an EGFR inhibitor | |
US20120108650A1 (en) | Micro rna markers and methods related thereto | |
CN108034707B (zh) | Spag7基因在制备老年痴呆诊断制剂中的应用 | |
US20160208346A1 (en) | Method and composition for detection of oncogenic hpv | |
JPWO2015137406A1 (ja) | 肺扁平上皮癌と肺腺癌の鑑別評価方法 | |
KR102078500B1 (ko) | 알츠하이머병의 진단용 조성물 | |
JP2010502179A (ja) | 予後診断方法 | |
WO2015168252A1 (en) | Mitochondrial dna copy number as a predictor of frailty, cardiovascular disease, diabetes, and all-cause mortality | |
JP7218887B2 (ja) | 子宮頸がん検査用検体 | |
JP2010029171A (ja) | 統合失調症の診断方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |