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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Modifikation und Alterung
von Proteinen durch Umsetzung mit Glucose und anderen reduzierenden
Zuckern wie Fructose oder Ribose, und insbesondere die Hemmung der
nicht-enzymatischen Glykosilierung von Proteinen, die häufig zur
Bildung von fortgeschrittenen Glykosilierungsendprodukten und Quervernetzungen
führt.
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Eine
erhöhte
Konzentration reduzierender Zucker im Blut und in der intrazellulären Umgebung
resultiert in der nicht-enzymatischen Bildung von Glykosilierungs-
und Dehydrierungs-Kondensations-Komplexen, die als fortgeschrittene
Glykosilierungsendprodukte (AGEs) bekannt sind. Diese Komplexprodukte
bilden sich an freien Aminogruppen von Proteinen, an Lipiden und
an DNA (Bucala und Cerami, 1992; Bucala et al., 1993; Bucala et
al., 1984). Dieses Phänomen
wird als "Bräunungs-" oder "Maillard"-Reaktion bezeichnet
und wurde früh
in diesem Jahrhundert in der Nahrungsmittelindustrie (Maillard,
1916) entdeckt. Die Bedeutung ähnlicher Prozesse
in der Biologie wurde erst nach der Entdeckung glykosilierten Hämoglobins
und dessen erhöhter Präsenz bei
Diabetikern (Rahbar, 1968, Rahbar et al., 1969) offensichtlich.
Bei menschlichen Diabetikern und in Diabetes-Tiermodellen sind diese
nicht-enzymatischen Reaktionen beschleunigt und verursachen erhöhte AGE-Bildung
und erhöhte
Glykosilierung langlebiger Proteine wie Kollagen, Fibronektin, Tubulin,
Proteine der Augenlinse, Myelin, Laminin und Aktin zusätzlich zu
Hämoglobin
und Albumin und auch LDL assoziierter Lipide und Apoproteine. Darüber hinaus
wurden braune Pigmente mit zu den Maillard-Produkten später Stadien ähnlichen
Spektral- und Fluoreszenz-Eigenschaften in vivo in Verbindung mit
mehreren langlebigen Proteinen wie den Proteinen der Augenlinse
und dem Kollagen älterer
Personen gefunden. Eine altersbezogene lineare Zunahme an Pigmenten
zwischen dem Alter von 20 bis 90 Jahren wurde beim menschlichen
Durakollagen beobachtet. AGE modifizierte Proteine nehmen während des
Alterns langsam zu und es wird von ihnen angenommen, dass sie zum
normalen Gewebeumbau betragen. Ihr Spiegel nimmt bei Diabetikern
als Ergebnis anhaltend hoher Blutzuckerspiegel zu und führt durch
verschiedene Mechanismen einschließlich Veränderung der Funktion und Struktur
von Gewebeproteinen, Stimulation der zellulären Antworten durch AGE-spezifische Rezeptoren
oder der Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen
species = ROS) (vgl. Boel et al., 1995 wegen eines neueren Übersichtsartikels)
zu Gewebeschäden.
Die strukturelle und funktionelle Unversehrtheit der betroffenen
Moleküle,
die oft bedeutende Rollen bei zellulären Funktionen spielen, wird
durch diese Modifikationen mit schwerwiegenden Folgen für betroffene
Organe wie Niere, Auge, Nerven oder mikrovaskuläre Funktionen (Silbiger et
al., 1993; Brownlee et al., 1985) gestört.
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Es
ist bekannt, dass strukturelle Änderungen
an Makromolelülen
durch AGEs unter normalen Umständen
mit zunehmendem Alter gehäuft
auftreten. Dieses zunehmende Auftreten wird bei Diabetes massiv
beschleunigt und ist stark mit Hyperglykämie assoziiert. Die Bildung
von AGE an einem Protein in der subendothelialen Basalmembran führt beispielsweise
zur extensiven Ausbildung von Quervernetzungen, was zu schweren
strukturellen und funktionellen Veränderungen in der Protein/Protein-
und Protein/Zell-Interaktion in der Gefäßwand führt (Haitoglou et al., 1992;
Airaksinen et al., 1993).
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Es
ist zur Diskussion gestellt worden, dass die vermehrte Bildung und
die Akkumulation fortgeschrittener Glykosylierungsendprodukte (AGEs)
bei der Pathogenese diabetischer Komplikationen und beim Altern eine
bedeutende Rolle spielen und zu progressiver und irreversibler intermolekularer
Proteinquervernetzung führen
(Monnier et al., 1986). Dieser Prozess wird durch Diabetes beschleunigt
und es wurde postuliert, dass er zur Entwicklung einer Bandbreite
diabetischer Komplikationen einschließlich Nephropathie (Nicholls
und Mandel, 1989), Retinopathie (Hammes et al., 1991) und Neuropathie
(Cameron et al., 1992) beiträgt.
Insbesondere führt
die Gewebeschädigung
der Nieren durch AGEs zu einer progressiven Abnahme der renalen Funktion
und zu terminaler Niereninsuffizienz (end-stage renal disease =
ESRD) (Makita et al., 1994) und zur Anhäufung niedermolekularer AGE-Peptide (Glykotoxine)
(Koschinsky et al., 1997) im Serum von Patienten mit ESRD (Makita
et al., 1991). Diese niedermolekularen AGEs können leicht neue Quervernetzungen
mit Plasma- oder Gewebekomponenten, z. B. mit Lipoproteinen niederer
Dichte (LDL) (Bucala et al., 1994) oder Kollagen (Miyata et al.,
1993) ausbilden und das Fortschreiten der Gewebeschädigung und
die Morbidität
bei Diabetikern beschleunigen.
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Unlängst wurde über direkte,
auf den Beitrag der AGEs beim Fortschreiten der diabetischen Nephropathie
(Vlassara et al., 1994) deutende Hinweise berichtet. Tatsächlich induziert
die Infusion bereits gebildeter AGEs bei gesunden Ratten glomeruläre Hypertrophie
und mesangiale Sklerose, Expression der Gene für Matrixproteine und die Produktion
von Wachstumsfaktoren (Brownlee et al., 1991; Vlassara et al., 1995).
Weitere Studien haben gezeigt, dass Aminoguanidin (AG), ein Inhibitor
der AGE-Bildung, die Gewebeschädigung
der Glomeruli verbessert und die Albuminurie bei induzierten diabetischen
Ratten verbessert (Soulis-Liparota et al., 1991, Itakura et al.,
1991). Beim Menschen haben erniedrigte Hämoglobin(Hb)-AGE-Spiegel (Makita et
al., 1992) einhergehend mit einer Verbesserung der Nierenfunktion
als Ergebnis einer Aminoguanidin-Behandlung bei Diabetikern weitere
Hinweise für
die Bedeutung der AGEs bei der Pathogenese diabetischer Komplikationen
geliefert (Bucala und Vlassara, 1997).
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Die
weltweite, insbesondere in den USA auftretende Verbreitung von Diabetes
mellitus, die in diesem Land Millionen von Patienten mit einer bedeutenden
Zunahme von Morbidität
und Mortalität
zusammen mit der hohen finanziellen Belastung für die Behandlung diabetischer
Komplikation heimsucht, sind bedeutende Anreize für die Suche
nach und die Entwicklung von Arzneimitteln mit einem Potential zur
Verhütung
und Behandlung der Komplikationen dieser Erkrankung. Bisher sind
die Mechanismen der durch Hyperglykämie verursachten Gewebeschädigung bei
Diabetikern nicht gut verstanden. Jedoch sind vier pathogene Mechanismen einschließlich erhöhter Polyolstoffwechselaktivität, Aktivierung
von bestimmten Proteinkinase C- (PKC)-Isoformen,
Bildung und Akkumulation fortgeschrittener Glykosilierungsendprodukte
und erhöhte
Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) (Kennedy und Lyons,
1997) diskutiert worden. Jüngste
immunhistochemische Untersuchungen an verschiedenen, von ESRD-Patienten
erhaltenen Nierengeweben (Horie et al., 1997) und an Linsen diabetischer
Ratten (Matsumoto et al., 1997) unter Verwendung spezifischer Antikörper gegen
Carboxymethyllysin (CML), Pentosidin, den beiden bekannten Glykosilierungsprodukten,
und Pyrralin haben diese AGE-Komponenten in verschiedenen Läsionen der
Nieren und der Rattenlinsen lokalisieren können und weitere Hinweise zugunsten
der AGE-Bildung in enger Verbindung mit der Erzeugung von ROS als
hauptsächliche
Faktoren bei der Verursachung dauerhafter und irreversibler Modifikation
der Gewebeproteine bereitgestellt. Deshalb sind Inhibitoren der
AGE-Bildung und Antioxidantien vielversprechend als wirksame Mittel
zur Verhütung
und Behandlung diabetischer Komplikationen.
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Zusätzlich zu
Alterung und Diabetes ist die Bildung von AGEs mit verschiedenen
pathologischen Zuständen
verbunden. IgM-Anti-IgG-AGE erscheint in klinischen Messungen mit
der Aktivität
rheumatoider Arthritis (Lucey et al., 2000) assoziiert zu sein.
Eine Korrelation zwischen AGEs und rheumatoider Arthritis wurde auch
bei nordamerikanischen Indianern (Newkirk et al., 1998) festgestellt.
AGEs sind in den Gehirnplaques bei der Alzheimer-Erkrankung zugegen
und ihre Gegenwart kann helfen, die Entwicklung der Alzheimer-Erkrankung
zu fördern
(Durany et al., 1999; Munch et al., 1998; Munch et al., 1997). Urämische Patienten
haben im Vergleich zu altersangeglichenen Kontrollen erhöhte Spiegel
von Serum-AGEs (Odani et al., 1999; Dawnay und Millar, 1998). AGEs
sind auch mit Neurotoxität
in Verbindung gebracht worden (Kikuchi et al., 1999). AGE-Proteine
sind bei Mäusen
(Sano et al., 1999) und Dialyse-Patienten (Takayama et al., 1998)
mit Arteriosklerose in Verbindung gebracht worden. Eine Studie an
mit Aminoguanidin gefütterten
Kaninchen zeigte, dass erhöhte
Mengen von Aminoguanidin zu reduzierter Plaquebildung in der Aorta
führen
und legt damit nahe, dass fortgeschrittene Glykosilierung an der
Atherogenese beteiligt sein könnte,
und zeigt die Möglichkeit
auf, dass Inhibitoren der fortgeschrittenen Glykosilierung den Prozess
verzögern
können
(Panagiotopoulos et al., 1998). Erhebliche Ablagerung von N(epsilon)carboxymethyllysin
(CML), einem fortgeschrittenen Glykosilierungsendprodukt wird bei
Hyalineinschlüssen
in Astrocyten bei Personen mit familiärer amyotropher Lateralsklerose
gesehen, nicht aber in gesunden Kontrollen (Kato et al., 1999; Shibata
et al., 1999). Zigarettenrauchen ist auch mit erhöhter Akkumulation
von AGEs im Plasma-LDL, in den Strukturproteinen in den Gefäßwänden und
in den Proteinen der Augenlinse in Verbindung gebracht worden, wobei
einige dieser Wirkungen zur Pathogenese der Arteriosklerose und
zu anderen mit Tabakgebrauch verbundenen Erkrankungen führen (Nicholl
und Bucala, 1998). Schließlich
hat eine Studie, bei der Ratten Aminoguanidin gefüttert wurde,
gezeigt, dass die Behandlung vor progressiver cardiovaskulärer und
renaler Verschlechterung schützte
(Li et al., 1996).
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Der
Mechanismus der Hemmwirkungen von Aminoguanidin in der Kaskade der
Glykosilierungsereignisse ist untersucht worden. Gegenwärtig ist
der genaue Mechanismus der AG-vermittelten Inhibierung der AGE-Bildung
nicht vollständig
bekannt. Mehrere in vitro Versuchsreihen führten zu gegensätzlichen
Folgerungen. Um es kurz zu machen, verursachen erhöhte Konzentrationen
reduzierender Zucker spontane Reaktionen zwischen der Carbonylgruppe
bei Kohlenhydraten und der Aminogruppe bei Proteinen, was zum Folgenden
führt:
- 1. Reversible Bildung von Schiffschen Basen
gefolgt von
- 2. Amadori-Kondensations/Dehydrierungs-Produkten wie 3-Deoxyglucason
(3-DG), einer hoch
reaktiven Dicarbonylverbindung (Kato et al., 1990).
- 3. Irreversible und hochreaktive fortgeschrittene Glykosilierungsendprodukte.
Beispiele für
frühe Amadori-Produkte
sind Ketoamine, die zur Bildung später AGEs weitere Kondensationsreaktionen
durchlaufen. Eine Anzahl von AGE-Produkten
wurde gereinigt und unlängst
charakterisiert, wobei jede nur eine geringe Fraktion der in vivo
erzeugten AGEs darstellt. Beispiele sind Pyrralin, Pentosidin, Carboxymethyllysin (CML),
Carboxyethyllysin (CEL), Crossline, Pyrrolopyridin, Methylglyoxallysin-Dimer
(MOLD), Arg-Lys-Imidazol, Argininpyridin, Cypentodin, Piperidindinonenol
und -alkyl, Formyl, Diglycosylpyrrol (Vlassara, 1994).
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Die
Analyse der in vitro an einem synthetischen Peptid gebildeten Glykosilierungsprodukte
hat gezeigt, dass Aminoguanidin die Bildung der frühen Amadori-Produkte
nicht hemmt (Edelstein and Brownlee, 1992). Ähnliche Schlüsse wurden
durch Analyse der an BSA gebildeten Glykosilierungsprodukte erzielt
(Requena et al., 1993). In beiden Experimenten wurde die Bildung
von AGE durch AG stark inhibiert wie durch Fluoreszenzmessungen
und Massenspektralanalyse analysiert. Durch Massenspektralanalyse
konnten keine Peptidkomplexe mit molekularen Massen detektiert werden,
die dem Einbau von AG in den Komplex entsprochen hätten. Detaillierte
mechanistische Studien unter Verwendung von NMR, Massenspektroskopie
und Röntgendiffraktion
haben gezeigt, dass Aminoguanidin mit dem AGE-Vorläufer 3-DG
zur Bildung von 3-Amino-5- und 3-Amino-6-substitutierten Triazinen
(Hirsch et al., 1992) reagiert. Im Gegensatz dazu haben andere Experimente
unter Verwendung markierten 14C-AGs mit
Linsenproteinen nahe gelegt, dass AG an die Proteine gebunden wird
und auch mit der aktiven Aldoseform freier Zucker reagiert (Harding,
1990).
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Über einige
andere potentielle Arzneimittelkandidaten als AGE-Inhibitoren ist
unlängst
berichtet worden. Diese Studien haben die Fähigkeit der Mittel zur Hemmung
der AGE-Bildung und AGE-Proteinquervernetzung im Vergleich zu Aminoguanidin
(AG) durch in vitro- und in vivo-Evaluation ausgewertet (Nakamura
et al., 1997; Kochakian et al., 1996). Ein kürzlicher Durchbruch auf diesem
Gebiet ist die Entdeckung einer Verbindung, N-Phenacylthiazoliumbromid
(PTB), die selektiv von AGE stammende Proteinquervernetzungen in
vitro und in vivo (Vasan et al., 1996; Ulrich und Zhang, 1997) spaltet.
Die pharmakologische Fähigkeit
zur Spaltung irreversibler AGE-vermittelter Proteinquervernetzungen
bietet eine potentielle therapeutische Nutzung.
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Es
ist gut dokumentiert, dass frühes
pharmazeutisches Eingreifen gegen die langfristigen Folgen der Hyperglykämie-induzierten
Quervernetzung die Entwicklung später Diabetes-Komplikationen
verhindert. Die Entwicklung von nicht-toxischen und hoch wirksamen
Arzneimitteln, die die Glucose-vermittelte Quervernetzung in den Geweben
und Körperflüssigkeiten
vollständig
unterbindet ist ein äußerst erstrebenswertes
Ziel. Der Prototyp der zur Intervention bei der Bildung von AGEs
an Proteinen sowohl in vitro als auch in vivo untersuchten pharmazeutischen
Verbindungen ist Aminoguanidin (AG), eine kleine Hydrazin-ähnliche
Verbindung (Browniee et al., 1986). Jedoch wurde für eine Anzahl
weiterer Verbindung eine solche Hemmwirkung auf die AGE-Bildung
gefunden. Beispiele dafür
sind D-Lysin (Sensi et al., 1993), Desferrioxamin (Takagi et al., 1995),
D-Penicillamin (McPherson et al., 1988), Thiaminpyrophosphat und
Pyridoxamin (Booth et al., 1997), die keine strukturellen Ähnlichkeiten
mit Aminoguanidin haben.
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Es
werden derzeit klinische Versuche mit AG als erstem zur Hemmung
der AGE-Bildung
vorgesehenem Arzneimittel durchgeführt (Corbett et al:, 1992).
Eine Reihe von hydrazinähnlichen
Verbindungen und Nichthydrazinverbindungen wurden untersucht. Bisher
hat sich AG als die nützlichste
Verbindung mit weniger Nebenwirkungen als die anderen im Stand der
Technik getesteten Verbindungen erwiesen. Jedoch ist AG ein gut
bekannter selektiver Inhibitor von Stickoxid (NO) und kann auch
antioxidative Effekte haben (Tilton et al., 1993).
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Eine
Anzahl weiterer potentieller als AGE-Inhibitoren zu verwendender
Arzneimittelkandidaten ist unlängst
entdeckt und sowohl in vitro als auch in vivo (Nakamura et al.,
1997; Soulis et al., 1997) untersucht worden. Trotz des vielversprechenden
Erfolges in Untersuchungen mit Aminoguanidin und ähnlichen
Verbindungen besteht weiterhin Bedarf, zusätzlich AGE-Hemmer zu entwickeln,
und die Verfügbarkeit
und die Bandbreite der Aktivität
und des therapeutischen Nutzens zu erhöhen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Für Derivate
von aryl- und heterocyclischem Ureido- und aryl- und heterocyclischen
Garboxamidphenoxyisobuttersäuren
und von Benzoesäure
wurde gefunden, dass sie die nicht-enzymatische Glykosilierung von
Proteinen inhibieren, die häufig
zur Bildung von fortgeschrittenen Glykosilierungsendprodukten und
Quervernetzungen führt.
Für viele
weitere Phenoxybuttersäurederivate
sowie auch für
gewisse andere, unten aufgeführte
Verbindungen wurde auch gefunden, dass sie die nichtenzymatische
Glykosilierung von Proteinen hemmen. Die nicht-enzymatische Glykosilierung
und Quervernetzung von Proteinen ist Teil des Alterungsprozesses
mit Glykosilierungsendprodukten und der mit dem Lebensalter zunehmenden
Quervernetzung langlebiger Proteine. Dieser Prozess wird durch erhöhte Konzentrationen
reduzierender Zucker im Blut und in der intrazellulären Umgebung
verstärkt
wie er bei Diabetes auftritt. Die strukturelle und funktionelle
Integrität
der betroffenen Moleküle
wird durch diese Modifikationen beeinträchtigt und dies kann zu schwerwiegenden
Folgen führen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen
können
zur Hemmung dieses Prozesses nicht-enzymatischer Glykosilierung
und Quervernetzungen und damit zur Hemmung einiger der schädlichen,
durch Diabetes oder durch Alterung verursachten Auswirkungen verwendet
werden. Die Verbindungen sind auch nützlich zur Verhütung von
vorzeitiger Alterung, rheumatoider Arthritis, Morbus Alzheimer,
Urämie,
Neurotoxizität,
Arteriosklerose, Nephropathie, Retinopathie, Neuropathie und des
Verderbens von Proteinen in Nahrungsmitteln und können die
Verfärbung
von Zähnen
verhindern.
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KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 stellt die allgemeine
Formel dar, die viele, aber nicht alle der aryl- und heterocyclischen
Ureido- und aryl- und heterocyclischen Carboxamidophenoxyisobuttersäuren der
Erfindung umfasst. R1, R2,
R3 und R4 können gleich
oder verschieden sein und sind unabhängig voneinander aus der aus
Wasserstoff, Halogen, unverzweigtem oder verzweigtkettigem Alkyl
von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Aryl, Cycloalkyl von 3 bis 7 Kohlenstoffatomen
und Alkoxy von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe ausgewählt, R5 und R6 können gleich
oder verschieden sein und sind aus der aus Wasserstoff, Halogen,
unverzweigten oder verzweigtkettigen Alkylgruppen von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
Aralkyl, worin der Alkylanteil von 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat,
Cycloalkyl von 3 bis 7 Kohlenstoffatomen und Aryl bestehenden Gruppe
ausgewählt
und R7 ist Wasserstoff oder eine unverzweigte
oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
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Die 2A–B zeigen
die Wirkungen der verschiedenen Inhibitorverbindungen auf Vollblut,
das während
5 h (2A) oder 16 h (2B) mit δ-Glu inkubiert wurde. Die Balken
der Graphik stellen die erhaltenen HbA1c-Spiegel
dar. Die Inhibitoren wurden mit 1 mM Endkonzentrationen verwendet,
außer
Aminoguanidin, dessen Konzentration bei 50 mM lag. Bei 2A bedeuten die Balken der
Graphik: A: Grundlinienkontrolle, die Blut und PBS, aber kein δ-Glu enthält; B: enthält δ-Glu behandeltes
Blut, ohne das ein Inhibitor zugegen ist; C: enthält Blut
plus δ-Glu
plus Aminoguanin; D-L: diese enthalten Blut plus δ-Glu plus
LR26, bzw. LR28, LR29, LR33, LR36, LR41, LR45, LR49 und LR62. Bei 2B bedeuten die Balken der
Graphik: A: Grundlinienkontrolle, die Blut und PBS, aber kein δ-Glu enthält, B: enthält δ-Glu behandeltes
Blut ohne Inhibitor, C: enthält
Blut plus δ-Glu
plus Aminoguanidin, D-L: diese enthalten Blut plus δ-Glu plus
LR66 bzw. LR67, LR71, LR79, LR80, LR81, LR85, LR88 und LR92. Alle
Proben enthalten dieselbe Konzentration an Blut und δ-Glu.
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3A–B veranschaulichen
die Daten aus einem BSA-Glucose-Assay und zeigen die Prozenthemmung
der AGE-Bildung durch 1 mM der Inhibitoren im Vergleich zu 50 mM
Aminoguanidin. Bei 3A bedeuten
die Balken der Graphik: A: Aminoguanidin, B: LR26, C: LR28, D: LR29,
E: LR33, F: LR36, G: LR41, H: LR45, I: LR49 und J: LR62. Bei 3B bedeuten die Balken der
Graphik: A: Amininoguanidin, B: LR66, C: LR67, D: LR71, E: LR79,
F: LR80, G: LR81, N: LR85, I: LR88 und J: LR92.
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4A–B stellen
Daten eines G.K.-Ribose-Assay dar und zeigen die Prozenthemmung
der AGE-Bildung durch 1 mM der Inhibitoren im Vergleich zu 50 mM
Aminoguanidin. Bei 4A bedeuten
die Balken der Graphik: A: Aminoguanidin, B: LR26, C: LR28, D: LR29,
E: LR33, F: LR36, G: LR41, H: LR45, I: LR49 und J: LR62.
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Bei 4B bedeuten die Balken der
Graphik: A: Aminoguanidin, B: LR66, C: LR67, D: LR71, E: LR79, F:
LR80, G: LR81, H: LR85, I: LR88 and J: LR92.
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5 zeigt die Strukturformeln
von LR1-LR-14.
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6 zeigt die Strukturformeln
von LR15-LR28.
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7 zeigt die Strukturformeln
von LR29-LR42.
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8 zeigt die Strukturformeln
von LR43-LR56.
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9 zeigt die Strukturformeln
von LR57-LR73.
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10 zeigt die Strukturformeln
von LR74-LR92.
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Die 11A–B zeigen
die Ergebnisse immunchemischer Studien über die Hemmwirkungen repräsentativer
Verbindungen unter Verwendung eines spezifischen ELISA-Assays, bei
dem die Hemmung der Quervernetzung von Kollagen mit AGE-BSA gemessen wird.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Im
Zuge des Screenens verschiedener Klassen organischer Verbindungen
zur Untersuchung ihrer möglichen
Hemmwirkungen auf fortgeschrittene Glykosilierungsendprodukte (AGEs)
wurde gefunden, dass die meisten der Phenylureido-substituierten
Phenoxylpropionsäurederivative
inhibitorische Wirkungen hatten und mehrere dieser Verbindungen
in einer niedrigeren als der gleichstark hemmenden Aminoguanidin-Konzentration wirksame
Inhibitoren der AGE-Bildung waren.
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Diese
Verbindungen und deren nützliche,
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zusammensetzungen enthalten
Agentien, die zur Reaktion mit der hochaktiven Carbonylzwischenstufe
eines frühen
Glykosilierungsproduktes in der Lage sind und dadurch diese frühen Produkte
an der späteren
Bildung der fortgeschrittenen Glykosilierungsendprodukte hindern,
die zu Proteinquervernetzung und zu Proteinalterung führen.
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Andere
für die
vorliegende Erfindung vorstellbare Anwendungen sind: Verhütung vorzeitigen
Alterns und des Verderbens der Proteine in Nahrungsmitteln. Die
vorliegenden Agentien sind auch im Bereich der Mundhygiene nützlich,
da sie das Verfärben
der Zähne
verhüten.
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Verbindungen
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind zusammengefasst als
Derivate von aryl- und heterocyclischen Ureido- und aryl- und heterocyclischen
Carboxamidophenoxyisobuttersäuren
definiert (Rahbar et al., 1999). Eine allgemeine Formel, die mehrere
erfindungsgemäße Verbindungen
umfasst, ist in 1 gezeigt.
Diese Verbindungen sind Teil einer ursprünglich wegen ihrer Wirkungen
auf die Modifikation der Sauerstoffaffinität von Hämoglobin durch Absenken der
Affinität
des Hämoglobins
gegenüber
Sauerstoff entwickelten Serie und sie verschieben die Hämoglobin-Sauerstoff-Dissoziationskurve
nach rechts (Rahbar et al., 1987; Lalezari et al., 1988; Lalezari
und Lalezari, 1989; US-Patent 5 268 500, US-Patent 5 292 935, US-Patent 5 093 367,
US-Patent 4 921 997).
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Repräsentative
erfindungsgemäße Verbindungen
sind in den 5–10 von LR1 bis LR92 gezeigt
und wurden auf ihre Hemmwirkungen auf Proteinglykosilierung und
AGE-Bildung gescreent. Für
diese Veröffentlichung
wurden den Strukturen die folgenden Namen zugeordnet:
LR1:
4-[3-(6-Chlor-2,4-(1H,3H)chinazolinmedion)]phenoxyisobuttersäure, MW
= 374,5
LR2: 4-(2-Furoylcarboxamido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 289
LR3: (8G5)* 4-(3,5-Dichlorphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 383
LR4: (8p) 4(4-Ethylcarbamatphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 401
LR5: (8G4) 4-(3,4-Dichlorphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 383
LR6: 4-Cyclohexylureidophenoxyisobuttersäure, MW
= 318
LR7: 4-(2,3-Dichlorphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 383
LR8: (8nf) 4-(4-Carboxaldehydphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 328
LR9: 4-(2-Naphthylcarboxamido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 341
LR10: (8c1) 4-(4-Methoxyphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 344
LR11: (8c2) 4-(3,4-Dimethoxyphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 374
LR12: (8k) 4-(4-Chlor-3-nitrophenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 393,5
LR13: (8b1) 4-(4-Methylphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 328
LR14: (8c3) 4-(3,4,5-Trimethoxyphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 404
LR15: 4-(3-Chlorphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 348,5
LR16: N-4-(Nitrophthalimido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 378
LR17: 4-(2-Thienylcarboxamido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 305
LR18: 4-(4-Pyridylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 300
LR19: 4-(3,4,5-Trichlorphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 417,5
LR20: L-Bis-[4-(4-chlorbenzamidophenoxyisobutyryl)cystin],
MW = 871
LR21: 4-(3,5-Dichlorphenylureido)phenoxyisobutyrylamidomethylcyclohexyl-4-carbonsäure, MW
= 522
LR22: DL-N-4[(3,5-Dichlorphenylureido)phenoxyisobutyryl]pipecolinsäure, MW
= 494
LR23: 4-(3,5-Dichlorphenylureido)phenoxyisobutyryl-1-amidocyclohexan-1-carbonsäure, MW
= 508
LR24: 4-(4-Iodphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 440
LR25: 4-(4-Dimethylaminophenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 345
LR26: 4-(2,4,6-Trichlorphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 417,5
LR27: 4-(2,4,6-Trimethylphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 356
LR28: 4-(4-Chlorphenoxyacetamido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 363,5
LR29: 4-(4-Chlor-3-nitrobenzoylcarboxamido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 406,5
LR30: 4-Chlordiphenylharnstoff-4'-carbonsäure, MW = 290,5
LR31:
4-(3,4-Dichlorphenylacetamido)phenoxyisobuttersäure, MW = 382
LR32: Diphenylurea-4-carbonsäure, MW
= 240
LR33: 4-(2-Chlor-4-nitrophenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 393,5
LR34: 4-(Nicotinylamido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 300
LR35: 4-Chlorphenoxyisobuttersäure, MW = 208,5
LR36:
4-(Benzylsulfonamido)phenoxyisobuttersäure, MW = 349
LR37: 4-(2,5-Dichlorbenzoylcarboxamido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 396
LR38: L-4-Chlorbenzoylphenylalanin, MW = 303,5
LR39:
2-Isopropyl-5-methylphenoxyisobuttersäure, MW = 236
LR40: 4-(3,4-Dimethoxyphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 374
LR41: 4-(3-Chlor-4-fluorphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 393,5
LR42: 4-(3,5-Dichlorbenzamidoethyl)phenoxyisobuttersäure, MW
= 384
LR43: 4-(Phenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 314
LR44: 4-(Phenylureido-2-chlor)phenoxyisobuttersäure, MW
= 348,5
LR45: 4-(2,6-Dichlor-4-nitrobenzoylcarboxamido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 406,5
LR46: 4-(3,5-Difluorphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 350
LR47: 4-(N-Methyl-4-chlorbenzamido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 347,5
LR48: 4-(4-Nitrophenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 359
LR49: 4-(Phenylureido)phenoxyessigsäure, MW = 286
LR50: 4-(4-Chlorbenzoylcarboxamido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 351,5
LR51: 4-(2-Hydroxy-4-chlorbenzoylcarboxamido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 377,5
LR52: 4-(2-Hydroxy-3,5-dichlorbenzoylcarboxamido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 412
LR53: 4-(2-Chlor-5-nitrophenylureido)phenoxyisobuttesäure, MW
= 393,5
LR54: 4-Carboxyphenoxyisobuttersäure, MW = 224
LR55: 4-(4-Carboxyphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 358
LR56: 4-Ureidophenoxyisobuttersäure, MW = 236
LR57: Harnstoff-1,3-bis-4-phenoxyisobuttersäure, MW
= 416
LR58: 4-(4-Morpholinosulfonylphenylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 463
LR59: 4-[(3,4-Dichlorphenylmethyl)2-chlorphenylureido]phenoxyisobuttersäure, MW
= 507,5
LR60: 4-(3-Pyridylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 315
LR61: 4-[(3,5-Dichlorbenzoylamino)methyl]phenoxyisobuttersäure, MW
= 382
LR62: 4-(2,4-Dichlorphenacylamino)phenoxyisobuttersäure, MW
= 382
LR63: 4-(Benzylureido)phenoxyisobuttersäure, MW
= 328
LR64: 4-Acetamidobenzoesäure
LR65: 2-Chlor-4-acetamidobenzoesäure
LR66:
4-Aminophenoxyisobuttersäure
LR67:
4-Acetoxybenzoesäure
LR68:
4-Hydroxybenzoesäure
LR69:
2-Acetamidoterephthalsäure
LR70:
5-Chlor-2-acetoxybenzoesäure
LR71:
2-Acetamido-5-acetoxybenzoesäure
LR72:
2-Acetoxy-5-hydroxybenzoesäure
LR73:
2-Amino-5-hydroxybenzoesäure
LR74:
2-(8-Chinolinoxy)propionsäure
LR75:
4-Aminobenzoylglycin
LR76: N-Guanylguanidino-N'-4-phenoxyessigsäure
LR77:
2-(2,5-Cichlorphenoxy)propionsäure
LR78:
4-Dimethylaminobenzoesäure
LR79:
2-Amino-4,5-dimethoxybenzoesäure
LR80:
4-Sulfonamidobenzoesäure
LR81:
2-Amino-4-chlorbenzoesäure
LR82:
4-Hydroxyphenylbuttersäure
LR83:
2-Methyl-4-chinolincarbonsäure
LR84:
2-Methyl-3,4-chinolindicarbonsäure
LR85:
6-Brom-2-methyl-3,4-chinolindicarbonsäure
LR86: 4-Acetamidophenoxyessigsäure
LR87:
1-(4-Chlorphenoxybutyrylamido)-1-cyclohexancarbonsäure
LR88:
4-Chlorphenylaminocarbonyliminodiessigsäure
LR89: 3-Chlor-4-nitrophenylureidophenoxyisobuttersäure
LR90:
Methylenbis[4,4'-(2-chlorphenylureidophenoxyisobuttersäure)]
LR91:
N,N'-Bis(2-chlor-4-carboxyphenyl)formamidin
LR92:
N,N'-Bis(2-carboxyphenyl)formamidin
*
Die Zeichen in Klammern sind Lalezari und Lalezari (1989) entnommen.
-
Obwohl
in der obigen Liste 92 Verbindungen aufgeführt sind, sind viele dieser
Verbindungen einander recht ähnlich
und können
zusammen in eine Gruppe eingeordnet werden. Zum Beispiel sind die
Verbindungen LR1 und LR16 beide cyclische Ureidophenoxyisobuttersäuren, die
Verbindungen LR2, LR9, LR17, LR20, LR28, LR29, LR31, LR34, LR37,
LR38, LR42, LR47, LR50, LR51, LR52, LR61 und LR62 sind Amidophenoxyisobuttersäuren, die
Verbindungen LR3-LR8, LR10-LR15, LR19, LR21-LR27, LR30, LR32, LR33, LR40, LR41,
LR43, LR44, LR46, LR48, LR49, LR53, LR55, LR58-LR60, LR63, LR89
und LR90 sind Arylureidophenoxyisobuttersäuren, die Verbindungen LR35,
LR39, LR54, LR56, LR57, LR66, LR74, LR76, LR77, LR82, LR86 und LR87
sind Clofibrinsäure-Derivate,
die Verbindungen LR91 und LR92 sind Formimid-Derivate und die Verbindungen
LR64, LR65, LR67-LR75, LR78 und LR83-LR85 sind Arylcarbonsäure-Derivate.
-
Die
obigen Verbindungen sind in der Lage, die Bildung der fortgeschrittenen
Glykosilierungsprodukte an Zielproteinen und die resultierende Proteinquervernetzung
zu hemmen. Das grundlegende Prinzip der vorliegenden Erfindung ist
die Verwendung von Agentien, die den Post-Glykosilierungsschritt,
d.h. die Bildung fluoreszierender Chromophore blockieren, wobei
die Gegenwart dieser Chromophore mit den schädlichen Folgen von Diabetes
und Alterung verbunden ist und zu diesen führt. Ein ideales Agens würde die
Bildung des Chromophors und seine assoziierten Quervernetzungen
von Proteinen und das Einfangen von Proteinen auf anderen Proteinen,
wie sie in den Arterien und den Nieren auftreten, verhüten. Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
Säugern
einschließlich
dem Menschen zur Verhütung
oder Verringerung der Proteinglykosilierung und Quervernetzung (Proteinalterung)
verabreicht werden. Die Verbindungen können oral und in Abhängigkeit
von der Aktivität
der einzelnen Mittel in Einzel- oder individuell unterschiedlichen
Dosierungen verabreicht werden. Zusätzlich können die Verbindungen parenteral
oder rektal verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen
und das den verschiedenen erfindungsgemäßen Assayverfahren zugrunde
liegende Prinzip und deren Verwendung werden in den folgenden Beispielen
veranschaulicht.
-
BEISPIEL 1
-
Hämoglobin-δ-Gluconolacton (δ-Glu)-Assay
-
Die
Untersuchung der Bildung früher
Glykosilierungsprodukte (Amadori) an Hämoglobin (HbA1c)
wird durch Inkubation von Erythrozyten mit einer oxidierten Form
von Glucose in Gegenwart und in Abwesenheit der Inhibitorverbindung
durchgeführt,
gefolgt von der Bestimmung von (HbA1c) im
Test im Vergleich zur Kontrolle (Rahbar und Nadler, 1999). Dieser
Test beruht auf einem neueren Bericht von Lindsay et al. (1997). δ-Glu, ein
oxidiertes Analogon von Glucose, kann innerhalb der Erythrozyten
schnell mit Hämoglobin
reagieren und die HbA1c-Spiegel innerhalb
von Stunden nach der Inkubation beträchtlich erhöhen. Im Gegensatz dazu benötigt Glucose
für das
Auftreten einer gleichwertigen Reaktion Wochen. Dieser Befund wurde
verwendet, um ein Assay-Verfahren zur Messung der Glykosilierung
von Hämoglobin
im Frühstadium
(Amadori-Produkte) und einen Assay zur Bewertung der Fähigkeit
eines Inhibitors zur Hemmung der HbA1c-Bildung
auszuarbeiten. Um es kurz zu beschreiben, wurde frisch abgenommenes
Blut in Kalium-EDTA gegeben und zur Inkubation innerhalb von 30
min nach Entnahme durch Mischen von 200 μl Blut entweder mit 40 μl PBS (phophate
buffered saline), pH 7,4, allein oder mit 50 mMol/l δ-Glu (Sigma) enthaltendem
PBS oder mit 50 mMol/l δ-Glu
plus 1 mMol/l Inhibitor enthaltendem PBS vorbereitet. Nach Inkubation
während
5 h bei 37°C
wurde der Prozentsatz des vorliegenden glykosilierten Hämoglobins
bestimmt. Der Prozentsatz glykosilierten Hämoglobins (HbA1c) wurde
unter Verwendung eines geeigneten Ionenaustauscher-Systems bestimmt
(BIORAD DIAMAT) bestimmt. Die Blutproben wurden dreifach analysiert.
Die %-Hemmung der (HbA1c)-Bildung durch
die Verbindung wurde gemäß der folgenden
Formel berechnet: ((B-C)/(B-A)) × 100,
worin A die Grundlinien-HbA1c-Konzentration
im Kontrollröhrchen,
das nicht mit δ-Glu
behandelt wurde, B die HbA1c-Konzentration
im mit δ-Glu
inkubierten Blut, C der HbA1c-Gehalt im
sowohl mit δ-Glu
als auch mit der Inhibitorverbindung behandelten Teströhrchen sind.
-
Die
Menge der HbA1c-Bildung unter Verwendung
von δ-Glu-behandeltem
Vollblut gesunder, freiwilliger Probanden unter Verwendung von 1
mMol/l der Verbindungen ist in den A–B für
ausgewählte
Verbindungen gezeigt. Die als Prozenthemmung der HbA1c-Bildung
für alle
92 LR-Verbindungen berechneten Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Die 2A–B zeigen die Ergebnisse eines Einzelassays,
wohingegen die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse Durchschnittswerte
aus 3 Bestimmungen sind.
-
Der
obige Versuch legt nahe, dass diese Art der Arzneimittelbehandlung
zur Verminderung der mit der Bildung früher Glykosilierungsprodukte – eine Vorstufe
bei der Bildung fortgeschrittener Glykosilierungsendprodukte – verbundenen
Krankheitssymptomatik von Nutzen ist.
-
BEISPIEL 2
-
BSA-Glucose-Assay
-
Dieser
Test wird zur Bewertung der Fähigkeit
der Inhibitoren zur Hemmung der Glucose-vermittelten Fluoreszenzentwicklung
von BSA (Ikeda et al., 1996) verwendet. BSA (Fraktion V) von Sigma
(50 mg/ml) und 800 mM Glucose (144 mg/ml) wurden in 0,2 g/l NaN3 enthaltendem 1,5 M Phosphatpuffer, pH 7,4,
unter aseptischen Bedingungen bei 37°C während 7 Tagen in Gegenwart
oder Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen der Verbindungen
inkubiert. Nach 7-tägiger
Inkubation wurde jede Probe auf die Entwicklung der spezifischen
Fluoreszenz untersucht (Anregung 370 nm; Emission 440 nm). Die %-Hemmung
der AGE-Bildung in der Testprobe wurde für jede Inhibitorverbindung
gegenüber
der Kontrolle berechnet. Aminoguanidin (50 mM) wurde als Positivkontrolle
verwendet.
-
Die
3A–
B zeigen
für eine
Auswahl der getesteten Verbindungen die Hemmwirkungen von 1 mM/l des
neuen Inhibitors gegenüber
50 mM/l Aminoguanidin. Die in den
3A–
B dargestellten Ergebnisse stammen aus
1 Bestimmung. Aus 3 Bestimmungen stammende Durchschnittswerte sind
für jede
der 92 Verbindungen in Tabelle 1 tabellarisch aufgeführt. Tabelle
1
-
BEISPIEL 3
-
N-Acetylglycyllysinmethylester
(G.K.-Peptid) – Ribose-Assay
-
Die
Untersuchung der späten
Glykosilierungsprodukte (AGEs) und der AGE-Inhibition durch die
neuen Inhibitorverbindungen wurde durch Inkubation von G.K.-Peptid
in Ribose in Gegenwart oder Abwesenheit einer der Verbindungen,
gefolgt von der Bestimmung der im Verlauf der Glykosilierung und
AGE-Bildung erzeugten Chromophore durch Bestimmung ihrer spezifischen
Fluoreszenz getestet. Das zur Untersuchung der Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen
zur Hemmung der Quervernetzung von N-Acetylglycyllysinmethylester
in Gegenwart von Ribose verwendete Verfahren nach Nagaraj et al
(1996) war wie nachfolgend beschrieben:
Stammlösungen:
0,5
M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,4, enthaltend NaN3 0,2
g/l
GK-Peptid (Sigma) 80 mg/ml in 0,5 M Natriumphosphat-Puffer,
pH 7,4
Ribose 800 mM (120 mg/ml) in 0,5 M Phosphat-Puffer
-
Gleiche
Volumina (0,1 ml) der 3 Stammlösungen
wurden miteinander vermischt, durch ein 0,2 Mikrometer-Filter (Corning)
filtriert und unter aseptischen Bedingungen während 24 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die Inhibitorverbindungen wurden in einer Endkonzentration von 1
mMol/l zugegeben. Am Ende des Inkubationszeitraums wurden die Proben
hinsichtlich ihrer spezifischen Fluoreszenz analysiert (Anregung
340 nm; Emission 420 nm). Die %-Hemmung durch verschiedene Inhibitorkonzentrationen
wurde wie oben beschrieben berechnet. Aminoguanidin mit 50 mM wurde
als Positivkontrolle verwendet.
-
Die 4A–B zeigen
die Hemmwirkungen einer Auswahl von Verbindungen zum Abblocken der
spezifischen Fluoreszenz von Protein-AGE in diesen Einzeluntersuchungen
unter Verwendung des G.K.-Peptid-Ribose-Assays. Die Ergebnisse für alle 92
Verbindungen sind in Tabelle 1 gezeigt. Die 4A–B zeigen die Ergebnisse eines Einzelassays,
wohingegen die Daten in Tabelle 1 Durchschnittsergebnisse aus 3
Assays jeder Verbindung sind. Die aus den beiden obigen Versuchen
erhaltenen Ergebnisse (Beispiele 2 und 3) legen nahe, dass diese
Art der Arzneimitteltherapie zur Verminderung der mit der Bildung
später
Glykosilierungsprodukte und Proteinquervernetzung assoziierten Krankheitssymptome
von Nutzen ist.
-
BEISPIEL 4
-
Lysozymglucose- oder -fructose-Quervernetzungs-Assay
-
Lysozymglucose-
oder -fructose-Quervernetzungs-Assays nach Taneda und Monnier (1994)
sind in vitro-Assays, die zur Untersuchung der Hemmwirkung der Verbindungen
auf von AGE abgeleiteten Quervernetzung und AGE-Protein-Komplexbildung
durchgeführt
werden. Lysozym aus Hühnereiweiß (Sigma)
und Glucose oder Fructose in 0,2 g/L NaN3 enthaltendem
0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, wurden mit verschiedenen Testverbindungen
gemischt, um eine Endkonzentration von 1 mMol/l Testverbindung,
100 mg/ml Lysozym aus Hühnereiweiß und 200
mM Glucose oder 100 mM Fructose zu ergeben. Alle Proben wurden unter
aseptischen Bedingungen bei 37°C
während
7 Tagen inkubiert. Nach 7 Tagen wurde jede Probe zur Bestimmung der
von AGE abgeleiteten Quervernetzung und AGE-Bildung analysiert.
Aliquots wurden auf 20% SDS-PAGE-Gelen unter reduzierenden Bedingungen
aufgetragen, einer Elektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau
gefärbt.
-
BEISPIEL 5
-
ELISA-Assay
-
Ein
spezielles ELISA-Verfahren (Al-abed et al., 1999) wurde zur Untersuchung
der Fähigkeit
der Testverbindungen zur Hemmung der Quervernetzung von glykosiliertem
BSA (AGE-BSA) bezüglich
einer mit Kollagen aus Rattenschwanzsehnen beschichteten Platte
mit 96 Cavitäten
(Biocoat Microtiter-Platten von Collaborative Research) verwendet.
Die Quervernetzung von AGE-BSA an eine mit Rattenschwanzsehnen-Kollagen
beschichtete Platte wurde mit und ohne Testverbindung in den gewünschten
Konzentrationen durchgeführt.
Nicht quervernetztes AGE-BSA wurde durch Waschen der Cavitäten entfernt.
Das mit Schwanzsehnen-Kollagen auf der beschichteten Platte quervernetzte
AGE-BSA wurde dann durch polyklonale, gegen AGE-RNase erzeugte Antikörper quantifiziert.
Positive Ergebnisse im Assay zeigen, dass der Inhibitor in der Lage
ist, die Menge an AGE-BSA zu verringern, die mit Kollagen Quervernetzungen
ausbildet. Aminoguanidin wurde als Positivkontrolle verwendet.
-
Die
unter Verwendung von fünf
repräsentativen
Verbindungen erzielten Ergebnisse sind in den 11A–B gezeigt. Die fünf Verbindungen (LR33, LR41,
LR20, LR23 und LR62) gehören
zu einer Anzahl starker Inhibitoren der AGE-Protein-Quervernetzung.
Die Prozenthemmung gegenüber
der Kontrolle wurde für LR33
mit 61 %, für
LR41 mit 27,4% für
1 mMol/l und für
Aminoguanidin bei 50 mM mit 55,5% berechnet.
-
BEISPIEL 6
-
Ribonuklease-Ribose-Fluoreszenz – Inhibitions-
und Quervernetzungs-Inhibitions-Assays
-
Ribonuklease
A aus Rinderpankreas (RNase A) ist als Modellprotein zur Untersuchung
der Proteinglykosilierung und AGE-Bildung sowie zur Kinetik der
AGE-Bildung umfassend
eingesetzt worden (Khalifah et al., 1996). RNase A hat den Vorteil,
während
der Glykosilierungsreaktion nicht auszufallen, wohingegen Lysozym
während
der Glykosilierung mit Ribose und Glucose ausfällt.
-
Beim
RNase-Ribose-Assay wird die als Ergebnis der AGE-Bildung in Gegenwart
oder Abwesenheit des Inhibitors erzeugte Fluoreszenz im Vergleich
zu Aminoguanidin gemessen. Dieser Assay wird auch verwendet, um
die Hemmwirkungen einer Verbindung auf die Protein-Quervernetzung
und die durch SDS-PAGE gezeigte Bildung von Dimeren und Trimeren
festzustellen.
-
Versionen
dieses Assays sind sowohl mit als auch ohne Unterbrechung erfolgreich
durchgeführt
worden (Nagaraj et al., 1996). Bei den vorliegenden Versuchen hat
sich jedoch das Verfahren mit Unterbrechung als besser erwiesen.
In den vorliegenden Assays wurde durchweg Rinder-RNase A Typ 1-A
(Sigma) verwendet.
-
Bei
dem Verfahren ohne Unterbrechung wurde RNase, 1 mg/ml, mit Ribose
(0,2 M) bei 37°C
in 0,02% Natriumazid enthaltendem 0,4 M Natriumphosphat-Puffer,
pH 7,5, während
7 Tagen im Dunkeln inkubiert. Prospektive Hemmstoffe wurden zu Beginn
der Inkubationsphase zur Reaktion gegeben. Alle Lösungen wurden durch
Filtration durch ein 0,2 Micron-Filter (Corning) unter sterilen
Bedingungen hergestellt. Am Ende der Inkubation wurden die Proben
hinsichtlich ihrer Fluoreszenz analysiert. (Anregung 330 nm; Emission
400 nm). Die %-Hemmung der AGE-Bildung wurde für verschiedene Inhibitor-Konzentrationen
wie oben beschrieben berechnet.
-
Die
RNase-Ribose-Assays mit Unterbrechung wurden wie folgt durchgeführt: RNase,
10 mg/ml, wurde mit Ribose (0,5 M) bei 37°C in einem 0,02 % Natriumazid
enthaltenden 0,4 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5, während 24
h in Abwesenheit der Inhibitor-Verbindung inkubiert. Die Glykosilierung
wurde dann durch 1:100 Verdünnung
der Reaktion in 0,4 M Phosphatpuffer und Zugabe des Inhibitors unter
den gewünschten
Bedingungen zu der Reaktion unterbrochen. Das Reaktionsgemisch wurde
durch ein Filter von 0,2 Micron filtriert und während weiterer 4 Tage bei 37°C im Dunkeln
inkubiert. Am Ende der Inkubationsphase wurden die Proben hinsichtlich
ihrer Fluoreszenz wie zuvor beschrieben analysiert und die %-Hemmung
berechnet.
-
Zum
Nachweis der Hemmwirkung der Testverbindung, wobei diese Hemmwirkung
in der Hemmung der RNase-Quervernetzung und -Dimer-Trimer-Bildung
besteht, wurden die Proben durch SDS-PAGE, wie zuvor beschrieben,
analysiert. Bei den Glykosilierungs-Assays mit Unterbrechung wurden
die Proben unter Verwendung von Centricon 10 (Amicon) konzentriert
und dann auf die Gele aufgetragen.
-
Die
obigen Beispiele weisen darauf hin, dass diese Arzneimitteltherapie
zur Verminderung der mit der Bildung von nicht-enzymatischen Glykosilierungsprodukten
(frühe
und späte
Produkte) und Protein-Quervernetzung assoziierten Krankheitssymptome
von Nutzen ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen erwiesen sich
in vitro als 10 bis 40mal stärkere
Inhibitoren der AGE-Bildung im Vergleich zu Aminoguanidin, das sich bereits
in Phase 2-3 der klinischen Studie zur Verhinderung von Diabetes-Komplikationen
befindet. In früheren Studien
haben sich diese Verbindungen als nicht-toxisch erwiesen. Sie können oral
in verschiedenen Dosierungen in Abhängigkeit von der Aktivität des jeweiligen
Agens in einer Einzelmenge oder in individuellen Mengen verabreicht
werden. Zusätzlich
können
die Verbindungen auch parenteral oder rektal verabreicht werden.
-
Es
versteht sich von selbst, dass die in dieser Patentanmeldung offenbarte
Erfindung hinsichtlich der Einzelheiten zwar in der bevorzugten
erfindungsgemäßen Ausführungsform
offenbart wurde, diese Offenbarung aber nur als Veranschaulichung
und nicht als Einschränkung
gedacht ist, wie auch in Betracht gezogen wird, dass Modifikationen
im Sinne der Erfindung und im Rahmen der folgenden Ansprüche dem
Fachmann klar werden.
-
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