BR112012011332B1 - Agentes direcionados para gadd45beta - Google Patents

Abstract

AGENTES DIRECIONADOS PARA GADD45BETA Compostos à base de grupos tetrapeptídicos, tripeptídicos e dipeptídicos e grupos peptóides correspondentes. Metódos correlatos e composições farmacêuticas para uso no tratamento de câncer, doenças inflamatórias e de outros transtornos.

Description

Campo da Invenção

A invenção refere-se ao câncer e a doenças e distúrbios, por e- xemplo, doenças e distúrbios inflamatórios e a sua modulação terapêutica. Especificamente, a invenção refere-se a compostos que tenham como base peptídeos curtos capazes de modular a morte celular programada (PCD) e a proliferação de células cancerosas e de células pró- inflamatórias/autoimunes.

Antecedentes da Invenção

Há tempos a indução de apoptose tem sido considerada um método de direcionamento a células cancerosas, bem como a células pró- inflamatórias, autoimunes e a outras doentes. Algumas vias celulares estão envolvidas em desencadear a morte celular, entre estas a via da c-Jun N- terminal quinase (JNK). JNKs respondem à presença de citocinas e a estímulos provocados pelo estresse como irradiação ultravioleta, choque térmico e choque osmótico. Na resposta a citocinas e ao estresse celular, a via da NF-KB é ativada também. A via da NF-KB é capaz de inibir a via da JNK por crosstalk (interferência cruzada) mediada por Gadd45β e a JNK quinase, proteína quinase quinase 7 ativada por mitógeno (MKK7/JNKK2). A atividade da MKK7 é inibida pela Gadd45β, membro da família Gadd45 de fatores in- duzíveis e alvo transcricional direto da NF-KB. A sinalização de JNK é, portanto, suprimida por NF-KB pela mediação de Gadd45β, que se liga à proteína MKK7 e inib a sua atividade. Papa, et al. 2004, Nature Cell Biology 6(2):1462153.

O uso de inibidores de NF-KB foi proposto no tratamento do câncer e de doenças inflamatórias. Contudo, em vista de algumas das atividades de NF-KB, incluindo participações em PCD, imunidade, inflamação e em desenvolvimento de tecidos, é preferido inibir funções específicas de NF-kB, em vez de o próprio NF-kB.

A presente invenção refere-se à inibição de Gadd45β, a qual é conhecida por ser regulada positivamente em alguns tipos de câncer e também em distúrbios inflamatórios crônicos e em hereditários.

O mieloma múltiplo (MM), conhecido também como mieloma de células plasmáticas ou doença de Kahler, é um câncer de células plasmáti- cas. Atualmente, o mieloma múltiplo é incurável, embora remissões temporárias possam ser induzidas pelo uso de esteroides, quimioterapia, talidomida, inibidores de proteassoma (Pis), por exemplo, bortezomib, melfalano e transplantes de células-tronco. De acordo com a American Cancer Society, existem aproximadamente 45.000 pessoas nos Estados Unidos vivendo com mieloma múltiplo, com aproximadamente 15.000 novos casos diagnósticos por ano nos Estados Unidos O tempo médio de sobrevida a partir do diagnóstico é de aproximadamente três anos. O mieloma múltiplo é o segundo tipo mais prevalente de câncer hematológico, depois do linfoma não Hodgkin, e representa aproximadamente 1% de todos os tipos de câncer e aproximadamente 2% de todos os óbitos causados por câncer. A incidência de mieloma múltiplo parece estar aumentando, havendo também alguma evidência de que a idade no aparecimento da doença esteja caindo. Por con-seguinte, existe necessidade evidente para melhorar os tratamentos destinados ao mieloma múltiplo.

Quase todos os tumores primários de mieloma múltiplo e suas linhagens celulares exibem atividade constitutiva de NF-KB. O bloqueio da atividade de NF-KB causa a morte de células do mieloma múltiplo. Uma grande barreira para obter resultados do tratamento do câncer por prazo prolongado com estratégias direcionadas ao NF-kB é a falta de especificidade e, portanto, baixa tolerância ao tratamento. Isso se deve às funções pleiotró- picas do NF-KB e do proteassoma. Existe necessidade de uma abordagem terapêutica radicalmente nova que seja mais específica, mais segura e, por conseguinte, mais eficaz.

Uma das principais funções do NF-KB no mieloma múltiplo é promover a sobrevida. Foi demonstrado (De Smaele, et ai. (2001) Nature 414:306-313) que o NF-KB confere citoproteção ao suprimir a cascata JNK MAPK por meio da Gadd45β, um membro da família Gadd45 de fatores in- duzíveis. Gadd45β é regulada positivamente por NF-KB em respostas a vários estímulos e promove a sobrevida ao se direcionar diretamente à JNK quinase MKK7 (Papa, et al. 2004 Nature Cell Biology 6:146-153, Papa, et al. 2007) J. Biol. Chem. 282:19029-19041, Papa, et al. (2008) J. Clin. Invest. 118:191-1923).

Inibidores de proteassoma (Pls) e inibidores diretos do NF-KB provocam a morte de células do mieloma múltiplo ao ativarem a via JNK, mas não são adequados para terapia curativa do mieloma múltiplo por exercerem efeitos indiscriminados sobre NF-KB e/ou efeitos indiscriminados sobre o proteassoma, impedindo que sejam utilizados em doses curativas totalmente inibitórias.

Além de no mieloma múltiplo, a proteína Gadd45β é expressa em altos níveis em outros tumores, incluindo linfoma difuso de grandes células B, Linfoma de Burkitt, leucemia pró-monocítica e outras leucemias, bem como alguns tumores sólidos, inclusive carcinoma hepatocelular, câncer de bexiga, câncer cerebral e do sistema nervoso central, câncer de mama, câncer da cabeça e pescoço, câncer de pulmão e câncer de próstata. Por conseguinte, a inibição de Gadd45β nestes tumores pode induzir a morte de células cancerosas e desse modo pode ter efeitos terapêuticos benéficos. Muitas neoplasias hematológicas (incluindo mieloma múltiplo, linfoma de células do manto, Linfoma MALT, linfoma difuso de grandes células B, Linfoma de Hodgkin, síndrome mielodisplásica, leucemia de células T do adulto (HTLV-1), leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, leucemia mielogênica aguda e leucemia linfocítica aguda) e tumores sólidos (incluindo câncer de mama, câncer cervical, câncer renal, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de laringe, câncer de tireoide, câncer de paratireoide, câncer de bexiga, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas e muitos outros tipos de câncer) são conhecidos também por exibirem ativação de NF-KB constitutivo fornecendo sinais pró-sobrevida às células à custa de PCD, o que poderia de contrário aumentar a morte das células tumorais (V. Baud and M. Karin 2009, Nat. Rev. Drug Disc. 8: 33-40). A atividade constitutiva do NF-KB é encontrada também no melanoma, cilindroma, carcinoma de células escamosas (da pele e da cabeça e pescoço), carcinoma oral, carcinoma de en- dométrio, retinoblastoma, astrocitoma e glioblastoma (V. Baud and M. Karin 2009, Nat. Rev. Drug Disc. 8: 33-40). A inibição de Gadd45β nestes tumores apresentando atividade constitutiva anormalmente alta do NF-KB poderia também produzir efeitos terapêuticos benéficos ao induzir a morte celular programada nas células cancerosas. A presente invenção é fundamentada na constatação de que o direcionamento às funções distintas pró-sobrevida do NF-kB no sentido de sobrevida celular por intermédio de Gadd45β proporciona uma terapia mais segura e mais eficaz do que direcionar diretamente o NF-KB para uma variedade de doenças e distúrbios incluindo câncer e também outras doenças caracterizadas por sobrevida celular anormal ou doenças que poderiam ser tratadas pela indução de PCD aumentada (tais como doenças autoimunes, doenças inflamatórias crônicas, doenças degenerativas and doenças isquêmicas e vasculares).

Uma ampla gama de doenças e distúrbios depende da atividade de NF-KB. De fato, é considerado atualmente que a patogênese de virtualmente toda doença ou distúrbio humano conhecido depende de inflamação e, portanto, envolve o NF-KB. Este atua como uma chave-mestre da resposta inflamatória, coordenando a expressão de um conjunto de mais de 200 genes codificadores de citocinas, receptores, fatores de transcrição, quimio- cinas, enzimas pró-inflamatórias e outros fatores, inclusive fatores pró- sobrevida, os quais iniciam e sustentam a inflamação. Os compostos da invenção inibem a atividade distinta de sobrevida do NF-KB na inflamação. Por conseguinte, doenças e distúrbios passíveis de tratamento com estes compostos incluem, à parte doenças inflamatórias crônicas convencionais (tais como doença intestinal inflamatória, artrite reumatoide e psoríase), outras doenças e distúrbios que dependem de componente inflamatório significativo. Exemplos destas doenças e distúrbios, as quais são tratadas com agentes anti-inflamatórios ou agentes inibidores de NF-KB OU para quais tenha sido proposto serem adequadas ao tratamento com inibidores de NF-KB e que poderiam também ser tratadas com um composto da invenção, incluem:

1. trato respiratório: doenças obstrutivas das vias aéreas incluindo: asma, inclusive brônquica, alérgica, intrínseca, extrínseca, induzida por exercício, induzida por fármacos (incluindo induzida por aspirina e NSAID) e asma induzida por poeira, tanto intermitente como persistente e de todas as gravidades, e outras causas de hiperresponsividade das vias aéreas; doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD); bronquite, inclusive bronquite infecciosa e eosinofílica; enfisema; bronquiectasia; fibrose cística; sarcoidose; doença do pulmão do fazendeiro e correlatas; pneumonite por hipersensibilidade; fibrose pulmonar, incluindo alveolite fibrosante criptogenética, pneumonias intersticiais idiopáticas, fibrose complicada por terapia antineoplásica e in-fecção crônica, inclusive tuberculose e aspergilose e outras infecções por fungos; complicações do transplante pulmonar; síndromes vasculíticas e trombóticas da vasculatura pulmonar e hipertensão pulmonar; atividade anti- tussígena, incluindo tratamento de tosse crônica associada a condições inflamatórias e secretórias das vias aéreas, e rinite aguda e crônica incluindo rinite medicamentosa e rinite vasomotora; rinite alérgica perene e sazonal, incluindo rinite nervosa (febre do feno); polipose nasal; infecção virai aguda incluindo o resfriado comum e infecção causada pelo vírus sincicial respiratório, Influenza, coronavirus (incluindo SARS) ou adenovirus; ou esofagite eosinofílica;

2. osso e articulações: artrites associadas ou incluindo osteoar- trite/osteoartrose, tanto primárias como secundárias a, por exemplo, displasia congênita do quadril; espondilite cervical e lombar e dor lombar e do pescoço; osteoporose; artrite reumatoide e doença de Still; espondiloartropatias soronegativas, incluindo espondilite anquilosante, artrite psoriática, artrite reativa e espondoartropatia indiferenciada; artrite séptica e outras artropatias e distúrbios ósseos relacionados à infecção, tais como tuberculose, incluindo doença de Potts e síndrome de Poncet; sinovite aguda e crônica induzida por depósito de cristais, incluindo gota úrica, doença do depósito de pirofos- fato de cálcio e inflamação bursal e sinovial e de tendões relacionada à apa- tita de cálcio; doença de Behcet; síndrome de Sjogren primária e secundária; esclerose sistêmica e esclerodermia limitada; lúpus sistêmico eritematoso, doença mista do tecido conjuntivo e doença indiferenciada do tecido conjuntivo; miopatias inflamatórias incluindo dermatomiosite e polimiosite; polimial- gia reumática; artrite juvenil incluindo artrites inflamatórias idiopáticas independentemente de sua distribuição articular e de síndromes associadas, e febre reumática e suas complicações sistêmicas; vasculites incluindo arterite de células gigantes, arterite de Takayasu, síndrome de Churg-Strauss, poli- arterite nodosa, poliarterite microscópica e vasculites associadas à infecção virai, reações de hipersensibilidade, crioglobulinas, e paraproteínas; dor lombar; febre familiar do Mediterrâneo, síndrome de Muckle-Wells e febre familiar da Hibérnia, doença de Kikuchi; artralgias, tendinites e miopatias induzidas porfármacos;

3. dor e remodelamento do tecido conjuntivo em distúrbios mus- culoesqueléticos causados por lesão [por exemplo, lesão esportiva] ou doença: artrites (por exemplo, artrite reumatoide, osteoartrite, gota ou artropatia por depósito de cristais), outra doença articular (tais como degeneração do disco intervertebral ou degeneração da articulação temporomandibular), doença do remodelamento ósseo (tal como osteoporose, doença de Paget ou osteonecrose), policondrite, esclerodermia, doença mista do tecido conjuntivo, espondiloartropatias ou doença periodontal (tal como periodontite);

4. pele: psoríase, dermatite atópica, dermatite de contato ou outras dermatoses eczematosas e reações de hipersensibilidade do tipo tardio; fito e fotodermatite; dermatite seborreica, dermatite herpetiforme, líquen plano, líquen esclerose e atrófico, piodermia gangrenosa, sarcoide de pele, lúpus eritematoso discoide, pênfigo, penfigoide, epidermólise bolhosa, urticá- ria, angioedema, vasculites, eritemas tóxicos, eosinofilias cutâneas, alopecia areata, calvície de padrão masculino, síndrome de Sweet, síndrome de We- ber-Christian, eritema multiforme; celulite, infecciosa e não infecciosa; pani- culite; linfomas cutâneos, câncer de pele não melanoma e outras lesões dis- plásicas; distúrbios induzidos por fármaco, incluindo erupções fixas medicamentosas;

5. olhos: blefarite; conjuntivite, incluindo conjuntivite alérgica pe-rene e vernal; irite; uveite anterior e posterior; coroidite; distúrbios autoimu- nes, degenerativos ou inflamatórios afetando a retina; oftalmite incluindo of- talmite simpática; sarcoidose; infecções incluindo virais, fúngicas e bacteria- nas;

6. trato gastrointestinal: glossite, gengivite, periodontite; esofagi-te, incluindo de refluxo; gastroenterite eosinofílica, mastocitose, doença de Crohn, colite incluindo colite ulcerativa, proctite, prurido anal; doença celíaca, síndrome do intestino irritável e alergias alimentares, cujos efeitos podem ser distantes do intestino (por exemplo, enxaqueca, rinite ou eczema);

7. abdominal: hepatite, incluindo autoimune, alcoólica e viral; fibrose e cirrose hepática; colecistite; pancreatite, tanto aguda como crônica;

8. genitourinário: nefrite incluindo intersticial e glomerulonefrite; síndrome nefrótica; cistite incluindo cistite aguda e crônica (intersticial) e úlcera de Hunner; uretrite, prostatite, epididimite, ooforite e salpingite agudas e crônicas; vulvovaginite; doença de Peyronie; disfunção erétil (masculina e feminina);

9. rejeição ao aloenxerto: aguda e crônica após, por exemplo, transplante do rim, do coração, do fígado, do pulmão, da medula óssea, de pele ou da córnea ou após transfusão sanguínea; ou doença crônica do enxerto contra hospedeiro;

10. Sistema nervoso central: doença de Alzheimer e outras doenças que levam à demência, incluindo a doença de Creutzfeld-Jakob (CJD) e a nova variante da CJD (nvCJD); amiloidose; esclerose múltipla e outras síndromes desmielinizantes; aterosclerose cerebral e vasculite; arterite temporal; miastenia grave; dor aguda e crônica (aguda, intermitente ou persistente, seja de origem central ou de periférica) incluindo dor visceral, cefaleia, enxaqueca, neuralgia do trigêmeo, dor facial atípica, dor articular ou óssea, dor decorrente do câncer e da invasão tumoral, síndromes da dor neuropáti- ca incluindo neuropatias diabéticas, pós-herpéticas e associadas ao HIV; neurosarcoidose; complicações no sistema nervoso central e periférico de central de processos malignos, infecciosos ou autoimunes;

11. outros distúrbios autoimunes e alérgicos, incluindo tiroidite de Hashimoto, doença de Graves, doença de Addison, diabetes mellitus, púrpura trombocitopênica idiopática, fascite eosinofílica, síndrome de hiper- IgE, síndrome antifosfolipídica;

12. outros distúrbios com componente inflamatório ou imunológi-co; incluindo síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), hanseníase, Síndrome de Sezary e síndromes paraneoplásicas;

13. cardiovascular: aterosclerose, afetando a circulação corona-riana e a periférica; pericardite; miocardite, cardiomiopatias inflamatórias e autoimunes incluindo sarcoide miocárdico; lesões de isquemia e reperfusão; endocardite, valvulite e aortite incluindo de origem infecciosa (por exemplo, sifilítica); vasculites; distúrbios das veias proximais e periféricas incluindo flebite e trombose, inclusive trombose venosa profunda and complicações de veias varicosas;

14. trato gastrointestinal: doença celíaca, proctite, gastroenterite eosinofílica, mastocitose, Doença de Crohn, colite ulcerativa, colite microscópica, colite indeterminada, doença intestinal inflamatória, síndrome do intestino irritável, diarreia não inflamatória, alergias alimentares, cujos efeitos são distantes do intestino, por exemplo, enxaqueca, rinite e eczema.

A presente invenção refere-se a novos inibidores do complexo Gadd45β/MKK7 e/ou da sinalização deste complexo que podem ser utilizados para inibir a função pró-sobrevida do NF-KB no câncer, na inflamação, na autoimunidade e em distúrbios degenerativos, isquêmicos e vasculares.

Sumário da invenção

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é provido um composto da Fórmula I: 1: XrA-X2 em que, A é A"" ou A^M-A'-lnM-A"'; A"" é A", A'" ou Z1Y2-Y3-Z4, em que Y2-Y3 é uma porção oligo- peptídica ou uma porção oligopeptoide tendo os resíduos Y2-Y3 e ~L\ está ligado ao nitrogênio do N-terminal de Y2-Y3 e Z4 está ligado ao carbono do C- terminal de Y2-Y3; A" é A' ou YÍ-Y2-Y3-Z4, em que YI-Y2-Y3 é uma porção oligopep- toide ou uma porção oligopeptoide compreendendo os resíduos YrY2-Y3 e Z4 está ligado ao carbono do C-terminal de Y!-Y2-Y3;

A'" é A' ou A' ou Z1-Y2-Y3-Y4, em que Y2-Y3-Y4 é uma porção oligopeptoide ou uma porção oligopeptoide compreendendo os resíduos Y2-Y3- Y4 e Zi está ligado ao nitrogênio do N-terminal de Y2-Y3-Y4; toda ocorrência de A' é independentemente uma porção oligo- peptídica ou uma porção oligopeptoide compreendendo os resíduos YTY2- Y3-Y4; n é um número inteiro de 0 a 18, Yi e Y4 são independentemente resíduos de aminoácidos ou resíduos de derivados de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas; Y2 é um resíduo de aminoácido ou resíduo de um derivado de aminoácido ou está ausente, Y3 é um resíduo de aminoácido ou resíduo de um derivado de aminoácido ou está ausente; Zi é um grupo da Fórmula II:

o qual está ligado ao nitrogênio do N-terminal de Y2,

W está ausente ou é oxigênio, nitrogênio ou um grupo alquileno contendo de um a três carbonos, este grupo alquileno de um a três carbonos sendo opcionalmente substituído por pelo menos um substituinte selecionado a partir de alquila de um a quatro carbonos ou grupo aromático carbocí- clico ou heterocíclico de 5 a 10 membros; J é um grupo aromático carbocíclico ou heterocíclico de 5 a 10 membros, este grupo aromático sendo opcionalmente substituído por pelo menos um substituinte selecionado a partir de hidroxila, halogênio, alquila de um a quatro carbonos ou alcóxi de um a quatro átomos de carbono; ∑4 representa um grupo da Fórmula III:

o qual está ligado ao carbono do C-terminal de Y3, R é hidrogênio ou alquila de um a quatro carbonos;

W está ausente ou é um grupo alquileno de um a três carbonos, este grupo alquileno de um a três carbonos sendo opcionalmente substituído por pelo menos um substituinte selecionado a partir de alquila de um a quatro carbonos ou grupo aromático carboxílico ou heterocíclico de 5 a 10 membros;

J' é um grupo carbocíclico alifático de 3 a 10 membros ou grupo aromático carbocíclico ou heterocíclico de 5 a 10 membros, este grupo alifático ou aromático sendo opcionalmente substituído por pelo menos um substituinte selecionado a partir de hidroxila, halogênio, alquila de um a quatro carbonos ou alcóxi de um a quatro átomos de carbono;

M é uma ligação peptídica entre o oligopeptídeo ou porção oli- gopeptoide precedente (A1, A" ou A"') e o oligopeptídeo ou porção oligopep- toide seguinte (A, A" ou A"') ou um grupo ligante unido mediante ligação a- mida, ligação éster, ligação éter ou ligação tio éter ao grupo carboxílico terminal do oligopeptídeo ou porção oligopeptoide precedente (A', A" ou A'") e mediante ligação amida, ligação éster, ligação éter ou ligação tio éter ao grupo amino terminal do porção oligopeptoide seguinte (A, A" ou A");

XT está ausente ou é uma porção adicionada ao amino terminal de A a fim de bloquear o grupo amino livre; X2 está ausente ou é uma porção adicionada à carboxila terminal de A a fim de bloquear o grupo carboxila livre; sob a condição de que Xi está ausente se A compreender Zi e de que X2 está ausente se A compreender Z4; ou derivados destes, os referidos derivados sendo selecionados a partir do grupo constituído por: a) oligômeros ou multímeros de moléculas do composto da Fórmula I, os referidos oligômeros e multímeros contendo duas ou mais moléculas do composto da Fórmula I, cada uma estando ligada a um grupo de es- queleto (scaffold) em comum mediante ligação amida formada entre um grupo amino ou de ácido carboxílico presente em moléculas do composto da Fórmula I e um grupo oposto amino ou de ácido carboxílico no grupo de esqueleto, o referido grupo de esqueleto participando em pelo menos 2 ligações amida, b) derivados contendo uma molécula do composto da Fórmula I ou um oligômero ou multímero deste, conforme definido acima na parte a), conjugada mediante ligação amida, ligação éster, ligação éter ou ligação tio éter a: PEG, compostos à base de PEG, peptídeos de penetração celular, corantes fluorescentes, biotina ou outro grupo de etiqueta (tag), ácidos gra- xos, nanopartículas de tamanho distinto ou ligantes quelantes complexados com íons de metal ou radioativos. c) derivados contendo uma molécula do composto da Fórmula I ou um oligômero ou multímero deste, conforme definido na parte a), que tenha sido modificada por amidação, glicosilação, carbamilação, acilação, sul- fatação, fosforilação, ciclização, lipidação, peguilação ou ligação a um peptí- deo ou parceiro de fusão peptoide para formar um peptídeo de fusão ou pep- toide de fusão. e d) sais e solvatos de uma molécula do composto da Fórmula I ou de um derivado deste, conforme definido na parte a) ou b) acima.

De acordo com um segundo aspecto da invenção, é provida uma composição farmacêutica contendo um composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é provido um método para tratar uma doença ou distúrbio caracterizado por atividade e/ou expressão aumentadas de NF-KB e/ou atividade e/ou expressão aumentadas de Gadd45β, compreendendo administrar a quantidade terapeuticamen- te eficaz de um composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou de uma composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção a um indivíduo com necessidade deste tratamento.

De acordo com um quarto aspecto da invenção, é provido um composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou uma composição de acordo com o segundo aspecto da invenção para uso como medicamento.

De acordo com um quinto aspecto da invenção, é provido o uso de um composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou de uma composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizado por atividade e/ou expressão aumentadas de NF-KB e/ou atividade e/ou expressão aumentadas de Gadd45β.

Breve Explicação dos Desenhos

Figura 1. Representação esquemática do crosstalk entre as vias de NF-KB e de JNK no contexto da sinalização de TNF-R1. Pode ser visto que o crosstalk entre a via da sobrevida, induzida por NF-βB e a via da morte, induzida por MKK7 e JNK, é mediado por Gadd45β. A inibição deste crosstalk pelo bloqueio de Gadd45β possibilita que MKK7 ative JNK, assim desencadeando uma via de morte em células tumorais.

Figura 2. Modelo do complexo Gadd45β-MKK7. O modelo foi construído como relatado na referência por Papa S. et al. 2007, J Biol Chem 282: 19029-19041. O modelo foi aperfeiçoado utilizando a estrutura cristalo- gráfica de MKK7 (pdb: 2DYL) e uma estrutura de Gadd45β modelada sobre a estrutura cristalográfica de Gadd45y (pdb: 3FFM). A estrutura de Gadd45β está em azul (Fitas), ao passo que a estrutura de MKK7 está em amarelo (fitas com a Superfície de Van der Waals também representada). As alças ácidas inibidoras 60-71 e 104-118 de Gadd45β (Papa S. et al. 2007, J Biol Chem 282: 19029-19041) estão realçadas.

Figura 3. (A) O rastreamento por ELISA utilizado para isolar os principais D-tetrapeptídeos (DTPs) 1 e 2. Antagonistas da interação Gadd45β/MKK7 foram selecionados rastreando uma biblioteca combinatória simplificada de peptídeos da fórmula geral Fmoc-(βAla)2-X1-X2-X3-X4-CONH2 (consultar a referência por Marasco et al. 2008, Curr. Protein Pept. Sei. 9:447-67), preparada com um dos 12 aminoácidos em cada posição de Xj a X4. Esta biblioteca, contendo no total 124 = 20.736 diferentes peptídeos, foi deconvoluída iterativamente em quatro etapas por ensaios ELISA de competição, utilizando em cada etapa MKK7 humana revestida (42 nM), (h)Gadd45β humana solúvel marcada com biotina (21 nM) e cada uma das 12 sub-bibliotecas à concentração nominal de 42 nM (não mostrado). (B) O peptídeo mais ativo da primeira geração foi então utilizado para a síntese de uma biblioteca de segunda geração. O rastreamento desta biblioteca forneceu dois peptídeos altamente ativos (indicados na Figura 3B como 1 e 8). (C) Peptídeos otimizados foram estão libertados da etiqueta Fmoc-(βAla)2 e sintetizados em forma de D-isômeros, rendendo DTP1 e DTP2, os quais romperam a interação Gadd45β/MKK7 com IC5o de 0,22 nM e 0,19 nM, respectivamente. Pode ser visto também que os L-isômeros destes peptídeos (ou seja, LTP1 e LTP2) exibiram IC50s semelhantes àqueles de DTPs nos ensaios ELISA de competição, ao passo que os peptídeos de controle negativo, LNC e DNC, não exibiram efeito inibitório detectável sobre a formação do complexo Gadd45β?MKK7. LNC, controle negativo de L-isômero; LTP1, tetrapeptídeo L-isômero 1; LTP2, tetrapeptídeo L-isômero 2; DNC, controle negativo de D-isômero.

Figura 4. Estabilidade de Z-DTPs em líquidos biológicos. Ensaios ELISA de competição mostrando que os DTPs protegidos por Z (Z-DTP1, Z-DTP2) retêm atividade inibitória total depois de 48 horas de incubação com soro humano a 37°C (IC5o = 0,19 nM, Z-DTP1; IC50 = 0,18 nM, Z-DTP2), ao passo que LTPs protegidos por Z (Z-LTP1, Z-LTP2) estão quase que completamente inativados depois desse tratamento (IC50s > I0 μM). Os ensaios foram realizados como na Figura 3C, utilizando MKK7 revestida, bioti- na-hGadd45β solúvel e as concentrações indicadas dos tetrapeptídeos. Z- LNC e Z-DNC, controles negativos de L e D-isômeros, respectivamente.

Figura 5. Ensaios de co-imunoprecipitação (co-IP) mostrando a interrupção eficaz e específica da interação Gadd45β/MMK7 pelos D- tetrapeptídeos 1 e 2 (DTP1 e DTP2), mas não pelos D-tetrapeptídeos de controle negativo (NC) (NCI, NC2, NC3 e NC4). A Co-IP foi realizada utilizando o anticorpo anti-FLAG (MKK7), e western blots foram desenvolvidos utilizando os anticorpos anti-HA (detectando HA-Gadd45β) (acima) ou anti- MKK7 (abaixo), como indicado.

Figura 6. Ensaios de MKK7 quinase mostrando a interrupção eficaz e específica da ruptura da interação Gadd45β/MMK7 e a restauração da atividade catalítica de MKK7 pelos D-tetrapeptídeos 1 e 2 (DTP1 e DTP2), mas não pelos D-tetrapeptídeos de controle negativo (NO) (NCI, NC2, NC3 e NC4). MKK7 ativa foi imunoprecipitada com o anticorpo anti-FLAG de células HEK-293T tratadas com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Zionomicina (P/l) e incubadas com os D-tetrapeptídeos na presença (painel superior) ou ausência (painel inferior) (h)Gadd45β humana recombinante, conforme indicado. Como mostrado, nem os D-tetrapeptídeos ativos líderes, nem os tetra- peptídeos NC de controle inibiram a atividade catalítica de MKK7 quando incubados com a quinase na ausência de Gadd45β (painel inferior).

Figura 7. (A, B, C) Ensaios de incorporação de [3H]timidina mostrando que derivados protegidos por Z de DTP2 (Z-DTP2), mas não os derivados de acetila de DTP2 (Ac-DTP2) ou os derivados protegidos por Z dos L-isômeros de DTP2 (Z-LTP2) apresentam atividade tumoricida significativa em linhagens de células tumorais. Os dados são expressos em percentual de sobrevida/proliferação de células tumorais após tratamento com 10 μM de Z-DTP2 (A), Ac-DTP2 (B) ou Z-LTP2 (C) (colunas preenchidas) ou com Z-DNC (A), Ac-DNC (B) e Z-LNC (C) (colunas vazias) em relação à sobrevi-da/proliferação de células não tratadas. Os momentos estão indicados. São mostradas 3 das 8 linhagens celulares suscetíveis de mieloma múltiplo que foram testadas (ou seja, U266, KMS-11, NCI-H929) e linhagens celulares de linfoma de Burkitt (BJAB) e de leucemia pró-monocítica (U937). Esses dados estabelecem a alta atividade citotóxica de Z-DTP2 (A), quando comparado à inatividade de Ac-DTP2 (B) e a baixa atividade de Z-LTP2 (C) (consultar também as Figuras 8 A, 8B e 8C e a Tabela IV; linhagens adicionais de mie-loma múltiplo). (B) A ausência de atividade tumoricida de Ac-DTP2 em linhagens celulares de mieloma múltiplo correlacionou-se com a baixa permeabilidade celular deste composto, conforme estabelecida em ensaios de CaCO2 (dados não mostrados). A viabilidade de linhagens celulares de mieloma múltiplo depois do tratamento com outros derivados de DTP menos eficazes (criados também para melhorar a captação celular de DTP), incluindo aqueles contendo grupo metila (Me), acetila (Ac), miristila (Myr), 3-metóxi,4- hidróxi-benzoíla, benzoíla, 6CI-benziloxicarbonila (6CI-Z) e/ou fluorenil- metiloxi-carbonila (Fmoc), não é mostrada. (C) Embora a potência in vitro e a captação celular de Z-LTPs sejam comparáveis àquelas de Z-DTPs (consultar a Figura 3C; dados também não mostrados), Z-LTP2 mostra baixa ativi-dade em células de mieloma múltiplo, por sua baixa estabilidade em líquidos biológicos (consultar a Figura 4).

Figura 8. A atividade pro-apoptótica de Z-DTPs é seletiva para linhagens de células tumorais com atividade constitutiva do NF-KB. (A, B, C) Ensaios de incorporação de [3H]timidina, realizados conforme descrito na Figura 7, mostrando a sobrevida celular em um painel de linhagens de células tumorais depois do tratamento com Z-DTPs ou Z-DNC 10 pM durante os seguintes tempos: 144 horas (A); 24 horas, 72 horas ou 144 horas (B, C), como indicado. (A) É mostrada a potente atividade tumoricida de Z-DTP2 em 8 de 9 linhagens celulares de mieloma múltiplo, 1 de 2 linhagens celulares de linfoma difuso de grandes células B (DLBCL; LY3), 1 de 1 linhagem celular de leucemia pró-monocítica (U937) e 1 de 6 linhagens celulares de linfoma de Burkitt (BJAB) que foram testadas (consultar também a Figura 9). Curiosamente, Z-DTP2 mostrou atividade citotóxica somente na linhagem celular de DLBCL do subtipo semelhante ao de células B ativadas (ABC) (ou seja, LY3) e não naquela do subtipo semelhante a células B do centro germina- tivo (GCB) (ou seja, SUDHL6), que não apresentam ativação de NF-KB constitutivo (Ngo VN, et al. Nature 441(7089): 106-10; consultar também a Figura 12, níveis de expressão de Gadd45β). Adicionalmente, mostraram também atividade em linhagens celulares de mieloma múltiplo, virtualmente em todas nas quais a ativação de NF-KB constitutivo está presente. A atividade tumoricida de Z-DTP2 (B) e Z-DTP1 (C) em linhagens celulares de mieloma múltiplo e de DLBCL após o tratamento com 10 μM de Z-DTP1, Z- DTP2 e Z-DNC durante os tempos indicados (ou seja, 24, 72 ou 144 horas, como mostrado). Os resultados foram confirmados em ensaios de exclusão com azul de Trypan (dados não mostrados) e ensaios com iodeto de propí- dio (PI) (consultara Figura 10; dados também não mostrados).

Figura 9. Ensaios de incorporação de [3H]timidina mostrando ausência de citotoxicidade de Z-DTP2 em um painel de 22 linhagens de células tumorais resistentes após o tratamento com Z-DTP2 durante 144 horas, mesmo quando este composto foi utilizado a concentrações muito altas - ou seja, 100 μM. Z-DNC, controle negativo de D protegido por Z. São mostradas também as linhagens de células sensíveis BJAB (Linfoma de Burkitt), KMS-11 e KMS-12 (mieloma múltiplo). Notavelmente, houve forte correlação nestas linhagens celulares entre sensibilidade à morte induzida por Z-DTP2 e níveis de expressão endógena de Gadd45β (consultar Figuras 12A e 12B).

Figura 10. A morte induzida por Z-DTP2 em linhagens celulares de mieloma múltiplo é decorrente de apoptose. Ensaios de coloração nuclear com iodeto de propídio (PI) mostrando a indução de apoptose (ou seja, teor do DNA de sub-Gi; consultar FL2-A) nas linhagens celulares representativas de mieloma múltiplo, NCI-H929, KMS-11, ARH-77, JJN-3 e U266, depois do tratamento com 10 pM de Z-DTP2 ou Z-DNC1, como mostrado, durante 72 ou 144 horas. É mostrado também o conteúdo de DNA de células não tratadas nas mesmas condições. Os percentuais de células apoptóticas estão retratados nos histogramas.

Figura 11.0 tratamento com Z-DTP2 causa forte ativação de JNK em linhagens celulares de mieloma múltiplo. Células KMS11 e NCI- H929 foram tratadas com 10 pM de Z-DTP2 ou Z-DNC, como mostrado, e a ativação de JNK foi monitorada nos tempos indicados por Western Blotting, utilizando um anticorpo anti-fosfo (P) específico para JNK. A fosforilação aumentada de JNK (marcador da ativação de JNK) é vista somente depois do tratamento com Z-DTP2, mas não depois do tratamento com o peptídeo de controle negativo protegido por Z (Z-DNC). A estimulação de TNFa (2.000 U/mL) foi utilizada como controle positivo para ativação de JNK. De modo importante, efeitos semelhantes de Z-DTP2 foram observados sobre a ativação de MKK7 (dados não mostrados). Além do mais, tal como visto com a atividade biológica de Gadd45β (consultar as referências: De Smaele, et al. (2001) Nature 414:306-313; Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6,146- 153; Papa, et al. 2007 J. Biol. Chem. 282:19029-19041; Papa, et al. (2008) J. Clin. Invest. 118:191-1923), os efeitos de Z-DTPs em linhagens celulares de mieloma múltiplo foram específicos para a via MKK7/JNK, uma vez que não foram observados efeitos com estes compostos sobre a ativação das vias IKK/NF-KB, ERK e p38 nestas linhagens celulares (dados não mostrados).

Figura 12. Forte correlação em linhagens de células tumorais entre sensibilidade celular à morte induzida por Z-DTP e níveis de expressão de Gadd45β. (A) O painel superior mostra a expressão de Gadd45β em um conjunto de 29 linhagens de células cancerosas (qRT-PCR; colunas vermelhas); enquanto que o painel inferior mostra o percentual de morte celular nas mesmas linhagens celulares com 10 μM de Z-DTP2 durante 144 horas (Incorporação de [3H]timidina; colunas pretas). (B) É mostrado o gráfico de correlação de expressão de Gadd45β contra o percentual de sobrevida celular depois do tratamento com Z-DTP2 para o mesmo experimento mostrado em (A). A significância do coeficiente de correlação entre o domínio dos 2 parâmetros é muito alta (p <0,01) (Correlação de Pearson que quantifica a associação entre duas variáveis, calculada utilizando o software GraphPad). Esses dados confirmam a alta especificidade do alvo de Z-DTPs em células. Os valores em (A) (painel superior) foram normalizados para β-actina.

Figura 13. Estruturas químicas de compostos relevantes descritos nesta patente, e a descrição de possível farmacóforos e estratégias para sua avaliação. (A) São mostradas as estruturas químicas do composto precursor Z-DTP2 (Z-D-Tyr-D-Glu-D-Arg-D-Phe-NH2) [SEQ ID NO.: 1] e dos derivados de Z-DTP2, mDTP1 (ácido p-hidróxi-benzoico-D-Glu-D-Arg- fenetilamina), mDTP2 (Ac-D-Tyr-D-Glu-D-Phe-NH2) e mDTP3 (Ac-D-Tyr-D- Arg-D-Phe-NH2). Estes compostos modificados de Z-DTP2 (a seguir deno-minados mDTPs) foram testados quanto à atividade tanto in vitro (ELISA) como em células (ensaios de morte). Os pesos moleculares (MW), IC50S in vitro e em células e a eficiência do ligante de Z-DPT2 e destes compostos modificados representativos são também relatados (consultar também a Tabela V). (B) Estão descritas as principais etapas da estratégia realizada para identificar o possível farmacóforo dos compostos bioativos (Geeson MP. 2008 J Med Chem. 51:817-834). A maioria das alterações propostas já foi explorada: grupos em N-terminal (consultar a Tabela III); Tyr para ciclo- hexilalanina, Phe para troca de ciclo-hexilalanina, retirada da Glu e/ou Arg interna, troca de Glu para Asp, pro-fármacos de éster na cadeia lateral de Asp (consultar a Tabela V); Tyr para troca por Phe, trocar de Arg para His, Lys ou Pro (consultar a Tabela VI). Em conjunto, os dados mostram que o farmacóforo bioativo pode ser descrito como segue: tirosina ou um anel a- romático semelhante com doador/aceitadores de ligação com H necessários na posição Yi; pelo menos um alfa-aminoácido na posição Y2 e/ou Y3, de preferência com um grupo básico para melhorar a captação celular. Prolina, asparaginas ou leucina na posição Y2 com ou sem arginina na posição Y3 permitem também reter a bioatividade. Uma distância maior do que em torno de 7 Angstrom entre os dois anéis aromáticos (ou seja, distância maior do que a imposta por um alfa-aminoácido) provoca redução na bioatividade; é necessário um anel aromático na posição Y4, com ou sem grupos doado- res/aceitadores de ligação H para retenção da bioatividade (Tabela VI).

Figura 14. (A, B, C, D, E) Atividade citotóxica de Z-DTPs em células primárias de mieloma múltiplo, isoladas de 5 pacientes representativos. Cada painel retrata os dados obtidos com células de um diferente paciente - ou seja, paciente 1 (A), paciente 2 (B), paciente 3 (C), paciente 4 (D) e paciente 5 (E). (A, B, C, D, E) Os tratamentos com Z-DTP2, Z-DTP1 e Z-DNC foram às concentrações indicadas, durante 48 horas. São mostradas também as células não tratadas de cada paciente (-). Os ensaios foram realiza-dos utilizando exclusão por azul de Trypan e contagem de células. Os valores representam o percentual de células vivas observado após o tratamento com Z-DTP2, Z-DTP1 ou Z-DNC em relação à viabilidade de células não tratadas de controle.

Figura 15. Ausência de atividade citotóxica de Z-DTPs em células primárias não transformadas de indivíduos sem mieloma múltiplo, incluindo células estromais da medula óssea (BMSCs) (A), células mononuclea- res do sangue periférico (PBMNCs) (A) e células-tronco mesenquimais (MSCs) (B), ou linfócitos B e T primários purificados de camundongos (B). Os tratamentos com Z-DTP2, Z-DTP1 e Z-DNC foram às concentrações indicadas, durante: 48 horas (BMSCs, PBMNCs) (A), 72 horas (células B e T murinas) (B) ou 144 horas (MSCs) (B). Os ensaios foram realizados utilizando exclusão por azul de Trypan e contagem de células (A) ou incorporação de [3H]timidina (B).

Figura 16. Indução de morte celular em linhagens celulares representativas de mieloma múltiplo após o silenciamento da expressão de Gadd45β mediado por sh-RNA. (A, B, C) As linhagens celulares de mieloma múltiplo sensíveis ao Z-DTP, ARH-77 (A) e NCI-H929 (B), e a linhagem celular de mieloma múltiplo resistente ao Z-DTP, RPMI-8226 (C), foram infectadas com lentivírus expressando sh-RNAs específicos para Gadd45β (ou seja, sh-Gadd45β-1, sh-Gadd45β-2 ou sh-Gadd45β-3), sh-RNAs específicos para MKK7 (ou seja, sh-MKK7-1 ou sh-MKK7-2) ou sh-RNAs não específicos (ou seja, sh-NS-1 ou sh-NS-2), e a viabilidade de células infectadas foi monitorada sobre um período de 8 dias com citometria de fluxo - revelando células com expressão intensificada de proteína verde fluorescente (eGFP), ou seja, células infectadas - e contagem de células. É mostrado o percentual de sobrevida de células eGFP+ (ou seja, infectadas) de mieloma múltiplo nos tempos indicados, em relação à viabilidade de células eGFP+ de mieloma múltiplo na mesma cultura no Dia 0. (A, B, C) As células foram infectadas com lentivírus pLentiLox.3.7 expressando os sh-RNAs indicados, bem como eGFP, utilizando métodos padrão (conforme relatado na referência por Yang H et al., Proc Natl Acad Sei USA. 2006 Jul 5; 103(27): 10397-402). Cinco dias depois, as células eGFP+ foram separadas utilizando separador de células BD FACSAria™ II, em seguidas deixadas em repouso por 2 dias antes que fossem iniciadas as análises de viabilidade celular. Esse tempo (ou seja, o início até o início das análises de viabilidade) está indicado nos gráficos como o Dia 0. Os dados revelam que a inibição da expressão de Gadd45β causa rápida morte celular em linhagens celulares de mieloma múltiplo que são sensíveis à toxicidade induzida por Z-DTP (ou seja, as linhagens celulares ARH-77, NCI-H929) (A, B), mas não na linhagem celular RPMI-8226 de mieloma múltiplo (C), a qual é resistente a esta toxicidade. Estes dados es tabelecem ainda o alvo da especificidade de Z-DTPs para o complexo Gadd45β/MKK7 em células de mieloma múltiplo (consultar também as Figuras 7, 8, 9 e 12; ensaios de morte e de qRT-PCR). Os dados mostram também o papel essencial que Gadd45β desempenha na sobrevida de células de mieloma múltiplo, dessa forma validando adicionalmente Gadd45β como alvo terapêutico no mieloma múltiplo.

Figura 17. (A, B) Ensaios de incorporação de [3H]timidina mostrando que o silenciamento de Gadd45β mediado por sh-RNA, mas não o de MKK7, possui potente atividade tumoricida em linhagens celulares de mieloma múltiplo que são suscetíveis à morte induzida por Z-DTPs (ou seja, as linhagens celulares ARH-77 e NCI-H929; consultar também as Figuras 7A, 7B, 7C e 8, sensibilidade à morte induzida por Z-DTP). A viabilidade da linhagem celular de mieloma múltiplo resistente ao Z-DTP, RPMI-8226, ao contrário não é afetada pela inibição de Gadd4β mediada por sh-RNA. (A) É mostrada a viabilidade das três linhagens celulares representativas de mieloma múltiplo, RPMI-8226, NCI-H929 e ARH-77, após o silenciamento de Gadd45β ou de MKK7. (B) É mostrada a viabilidade da linhagem celular de mieloma múltiplo, ARH-77, depois do silenciamento de Gadd45β ou de MKK7, utilizando três diferentes sh-RNAs específicos para Gadd45β (ou seja, sh-Gadd45β-1, sh-Gadd45β-2 ou sh-Gadd45β-3), dois diferentes sh- RNAs específicos para MKK7 (ou seja, sh-MKK7-1 ou sh-MKK7-2) e dois diferentes sh-RNAs não específicos (ou seja, sh-NS-1 ou sh-NS-2). (A, B) As linhagens celulares de mieloma múltiplo foram infectadas com o lentivírus pLentiLox.3.7 que expressa os sh-RNAs, em seguida, células eGFP+ de mie-loma múltiplo (ou seja, células infectadas com lentivírus) foram separadas utilizando separador celular BD FACSAria™ II como na Figura 16. Os ensaios de incorporação de [3H]timidina foram realizados 10 dias da separação celular, correspondente ao Dia 8 na Figura 16. É mostrado o percentual de incorporação de [3H]timidina (ou seja, c.p.m.), uma medida de proliferação celular, no Dia 8 (ou seja, 10 dias a separação de células) em relação à incorporação de [3H]timidina ocorrida nas mesmas células no Dia 0 (ou seja, 2 dias depois da separação das células). Esses dados estabelecem ainda mais a especificidade do alvo de Z-DTPs para o complexo Gadd45β/MKK7 em células de mieloma múltiplo (consultar também as Figuras 7, 8, 9 e 12, morte induzida por Z-DTP e expressão de Gadd45β; Figura 16, silenciamen- to gênico de Gadd45β e de MKK7), e confirmam o papel essencial que Gadd45β desempenha na sobrevida de células do mieloma múltiplo. Em conjunto, os dados validam ainda também Gadd45β como agente terapêutico no mieloma múltiplo.

Figura 18. (A, B, C) Ensaios de coloração nuclear por PI mostrando que o silenciamento de Gadd45β mediado por sh-RNA induz apopto- se nas linhagens celulares de mieloma múltiplo sensíveis ao Z-DTP, ARH-77 (A) e NCI-H929 (B), mas não na linhagem celular de mieloma múltiplo resistente ao Z-DTP, RPMI-8226 (C) (consultar também as Figuras 16 e 17, Silenciamento mediado por sh-RNA; Figuras 7, 8 e 12, sensibilidade de linhagem celular de mieloma múltiplo à morte induzida por Z-DTP e expressão de Gadd45β). (A, B, C) Não foi observada indução significativa de apoptose nas mesmas linhagens celulares de mieloma múltiplo na ausência de infecção pelo lentivírus (não infectadas) ou após a expressão de sh-RNAs específicos para MKK7 (ou seja, sh-MKK7-1 e sh-MKK7-2) ou de sh-RNAs não específicos (ou seja, sh-NS-1 e sh-NS-2). As linhagens celulares de mieloma múltiplo foram infectadas com lentivírus pLentiLox.3.7 expressando sh-RNAs, e as células eGFP+ de mieloma múltiplo (ou seja, células infectadas com lentivírus) foram separadas utilizando separador celular BD FACSAria™ II como na Figura 16. Ensaios de coloração nuclear por PI foram realizados 10 dias depois da separação das células, correspondente ao Dia 8 na Figura 16. Os percentuais de células apoptóticas (ou seja, células exibindo conteúdo de DNA sub-G1) estão retratados nos histogramas. (A) De modo importante, os níveis de apoptose induzidos pelos diferentes sh-RNAs específicos para Gadd45β (ou seja, sh-Gadd45β-1, sh-Gadd45β-2 e sh-Gadd45β-3) correla- cionam-se com os níveis de regulação negativa de Gadd45β induzidos por cada um destes sh-RNAs específicos para Gadd45β (dados não mostrados). (A, B, C) Esses dados estabelecem ainda mais a especificidade do alvo de Z-DTPs para o complexo Gadd45β/MKK7 em células de mieloma múltiplo (consultar também as Figuras 7, 8 e 9, ensaios de morte com Z-DTPs; Figura 12, correlação estatisticamente significativa entre expressão de Gadd45β e sensibilidade de células cancerosas à morte induzida por Z-DTP; Figuras 16 e 17, Indução de morte de células de mieloma múltiplo pela regulação negativa de Gadd45β, mas não de MKK7), e confirmam o papel essencial que Gadd45β desempenha na sobrevida de células de mieloma múltiplo. Em conjunto, os dados validam adicionalmente Gadd45β como alvo terapêutico no mieloma múltiplo.

Figura 19. (A, B, C) Ensaios de coloração nuclear por PI mostrando que o silenciamento mediado por sh-RNA de MKK7 ou de Gadd45β não afeta a distribuição do ciclo celular em linhagens celulares de mieloma múltiplo. As linhagens celulares mostradas representativas de mieloma múltiplo infectadas com lentivírus - ou seja, ARH-77 (A), NCI-H929 (B) e RPMI- 8226 (C) - são do mesmo experimento exibido na Figura 18. Diferentemente dos dados mostrados na Figura 18 (na qual os perfis de coloração por PI são representados em escala logarítmica, que realça apoptose), a coloração por PI (ou seja, FL2-A) nesta figura está representada em escala linear, que realça a distribuição do ciclo celular. Os percentuais de células de mieloma múltiplo nas diferentes fases do ciclo celular (ou seja, Gi, Se G2/M) estão retratados nos histogramas. (A, B) As análises do ciclo celular não puderam ser realizadas com sh-RNAs específicos para Gadd45β nas linhagens celulares de mieloma múltiplo ARH-77 (A) e NCI-H929 (B) devido à indução de apoptose maciça nestas células (consultar as Figuras 18A e 18B).

Figura 20. (A, B, C) O silenciamento de MKK7 mediado por sh- RNA torna a linhagem celular representativa sensível ao Z-DTP, ARH-77, resistente à morte induzida por Z-/mDTP. Ensaios de incorporação de [3H]timidina mostrando que a IC50s dos tetrapeptídeos D-isômeros de controle negativo (Z-DNC) (A, B, C), Z-DTP1 (A), Z-DTP2 (B), ou mDTP3 (C) em células ARH-77 de mieloma múltiplo expressando sh-RNAs específicos para MKK7 (sh-MKK7) ou sh-RNAs não específicos (sh-NS). Os tratamentos de células ARH-77 com Z-DNC, Z-DTP1, Z-DTP2 ou mDTP3 foram por 3 dias. Pode ser visto que células ARH-77 expressando sh-NS são altamente sen síveis à morte induzida por Z-/mDTP - mostrado pelos valores de IC5o de 1,4 pM (Z-DTP1; A), 302 nM (Z-DTP2; B), and 303 nM (mDTP3; C) - semelhante ao visto nas células ARH-77 precursoras não infectadas (consultar a Tabela IV). (A, B, C) Por outro lado, células ARH-77 expressando sh-MKK7 tornaram-se completamente resistentes à morte induzida por Z-/mDTP - mostrado pelos valores de IC50 > 10 pM - semelhante ao visto em células ARH-77 tratadas com Z-DNC. Os valores de IC50 foram calculados conforme descrito nos Exemplos, utilizando concentrações crescentes de Z-DNC (A, B, C), Z-DTP1 (A), Z-DTP2 (B) e mDTP3 (C), variando de 0,01 a 10 pM. Os gráficos relatam os percentuais das contagens por minuto (c.p.m.), uma medida de proliferação celular, obtidos com células tratadas com o peptídeo, em relação aos valores de c.p.m. obtidos com células não tratadas. Dados semelhantes foram obtidos com linhagens celulares adicionais de mieloma múltiplo sensíveis ao Z-/mDTP, incluindo as linhagens celulares U266, KMS- 11 e KMS-12 (dados não mostrados). (A, B, C) Estes dados demonstram a especificidade muito alta do alvo de Z-/mDTPs para o complexo Gadd45β/MKK7 em células de mieloma múltiplo (consultar também a Figura 12, correlação entre expressão de Gadd45β e sensibilidade de células cancerosas à morte induzida por Z-DTP).

Figura 21. (A, B, C, D) Os compostos da invenção não se ligam a Gadd45β ou MKK7 isoladamente; ao invés, sua ligação requer a formação de um complexo Gadd45β/MKK7, conforme determinado em ensaios Biaco- re. (A) É mostrada a ligação de Gadd45β ao domínio quinase de MKK7 (MKK7kD) imobilizado sobre um chip. Diferentes concentrações de Gadd45β (variando de 20 a 200 nM) foram injetadas no chip onde MKK7kd havia sido previamente imobilizado. A ligação dependente da dose de Gadd45β a MKK7kD e as curvas de dissociação do complexo Gadd45β/MKK7kD foi registrada, e um valor de constante de dissociação no equilíbrio (KD) de 4,0 ± 0,7 nM foi determinada calculando a média dos valores determinados pelos parâmetros cinéticos individuais de cada curva. Resumidamente, o parâmetro termodinâmico da constante de dissociação no equilíbrio (KD) foi calculado considerando as fases de associação (ka) e de dissociação (kd) correspon- dentes a aumento ou diminuição no sinal SPR (expresso em unidades de resposta, RU) respectivamente. (B) Ligação de MKK7kD a Gadd45β, quando Gadd45β estava imobilizada sobre o chip. Aqui, os valores foram determinados injetando MKK7kD a diferentes concentrações (variando de 1 a 25 nM) sobre um chip com Gadd45β imobilizada. Tal como em (A), as curvas de dose-resposta foram registradas em todas as concentrações testadas de MKK7kD. A partir destas análises, foi obtido valor de KD de 3,4 ± 0,6 nM - o qual é muito semelhante ao valor de KD obtido em (A). (C) A injeção de mDTP3 sobre um chip contendo Gadd45β ou MKK7kD é mostrada. A fim de determinar se mDTP3 se liga a Gadd45β e/ou a MKK7kD, uma solução contendo mDTP3 a uma concentração variando de 1 nM e 10 μM foi injetada sobre um chip derivatizado com qualquer uma ou a outra proteína. Como pode ser visto, não foi registrada ligação de mDTP3 a Gadd45β ou a MKK7 mesmo a mais alta concentração utilizada de mDTP3 (ou seja, 10 μM). (D) É mostrada a ligação de mDTP3 a um complexo Gadd45β/MKK7 pré-formado. Gadd45β a uma concentração de 100 nM foi injetada sobre o chip derivatizado com MKK7kD (60 pL; tempo de contato de 3 minutos). Foi permitido às proteínas Gadd45β que se dissociassem por em torno de 10 minutos e quando aproximadamente 50% da Gadd45β estava ainda ligado a MKK7kD, mDTP3 foi injetado à concentração de 10 nM, 100 nM ou de 1 pM. Como pode ser visto, quando foi utilizada uma concentração equivalente ou abaixo de 100 nM, mDTP3 induziu rápida dissociação do complexo Gadd45β/MKK7kD- Como pode ser visto também, a formação do complexo Gadd45β/MKK7kD foi rapidamente recuperada depois que mDTP3 foi retirado por lavagem. Em concentrações mais altas (por exemplo, 1 pM), contudo, mDTP3 deu origem a curvas de ligação dose-resposta e de dissociação, in-dicando que estava ligado a Gadd45β e/ou a MKK7kD ou a complexo das duas proteínas. Esses dados reforçam a visão de que DTPs não se ligam às proteínas Gadd45β ou MKK7 isoladamente, mas sim que se ligam a uma ou à outra proteína ou a um complexo das duas proteínas somente quando as duas proteínas entram em contato uma com a outra.

Observação sobre a nomenclatura utilizada neste relatório des-critivo:

Em várias partes deste relatório descritivo, os compostos são designados por um código de significação, tal como LTP, DTP, LNC, DTP1, etc. Códigos contendo "NC" descrevem compostos que são controles negativos não abrangidos pelo âmbito da invenção. Códigos contendo "TP" (que é uma abreviação para tetra ou tripeptídeos/peptoides, embora deva ser notado que alguns dos compostos sejam à base de motivos dipeptídi- cos/peptoides) são abrangidos pelo âmbito da invenção. O prefixo "L" ou "D" indica resíduos na configuração óptica L ou D. Um sufixo numérico indica um composto específico numerado detalhado em outro lugar. O prefixo "Z", como em "Z-DTP", indica um grupo benziloxicarbonila no N-terminal. O prefixo "m", como em "mDTP", indica qualquer modificação de um DTP que visou melhorar a captação celular, a atividade celular e/ou o perfil PK, tal como a remoção do terminal N e/ou C (por exemplo, como em mDTP1), a remoção do grupo Z e dos resíduos Arg ou Glu de Z-DTP2, como em mDTP2 e mDTP3, respectivamente (exemplos adicionais são fornecidos na Figura 13).

Descrição Detalhada da Invenção

A estratégia salientada da presente invenção advém de um entendimento de que o crosstalk (interferência cruzada) de NF-KB-JNK controla também a sobrevida contra a morte programada de células, incluindo células cancerosas, que de outra forma morreriam. Significativamente, Gadd45β é regulada positivamente em células cancerosas em resposta à ativação de NF-KB e é expressa constitutivamente em altos níveis em células de mieloma múltiplo e de outros tumores, inclusive de linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, leucemia pró-monocítica e outras leucemias, bem como em alguns tumores sólidos, incluindo carcinoma hepatocelular, câncer de bexiga, câncer cerebral e do sistema nervoso central, câncer de mama, câncer da cabeça e pescoço, câncer de pulmão e câncer de próstata. A presente invenção é fundamentada na estratégia de promover a morte celular programada pela liberação de compostos direcionados a Gadd45β/MKK7 que impedem o crosstalk de NF-KB-JNK, intensificando com isso a sinalização citotóxica de JNK nas células. Produtos e métodos da presente invenção podem ser especialmente pertinentes ao tratamento de distúrbios caracterizados pela regulação positiva anormal de Gadd45β. Além disso, são pertinentes também a doenças e distúrbios nos quais Gadd45β pode não estar necessariamente regulada positivamente de modo anormal, mas nos quais NF-KB está regulado positivamente ou ativado de modo anormal e em que um indutor de morte celular programada, por intermédio da sinalização de Gadd45β-MKK7, pode proporcionar um tratamento.

Exemplos destas doenças apresentando regulação positiva ou ativação anormal de NF-KB e em que um indutor de morte celular programada, por intermédio da sinalização de Gadd45β-MKK7, pode proporcionar um tratamento incluem: neoplasias malignas hematológicas (tais como mieloma múltiplo, linfoma de células do manto, linfoma MALT, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Hodgkin, síndrome mielodisplásica, leucemia de células T do adulto (HTLV-1), leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, leucemia mielogênica aguda e leucemia linfocítica aguda), tumores sólidos (tais como câncer de mama, câncer cervical, câncer renal, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de laringe, câncer de tireoide, câncer de paratireoide, câncer de bexiga, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas e muitos outros tipos de câncer), outros tipos de câncer (tais como melanoma, cilin- droma, carcinoma de células escamosas [da pele e da cabeça e pescoço], carcinoma oral, carcinoma de endométrio, retinoblastoma, astrocitoma e glioblastoma) e outras doenças e distúrbios tais como doenças autoimunes, doenças inflamatórias crônicas, doenças degenerativas, doenças isquêmicas e doenças vasculares.

Uma ampla gama de doenças e distúrbios depende da atividade de NF-KB. De fato, é considerado atualmente que a patogênese de virtualmente toda doença ou distúrbio humano conhecido depende de inflamação e, portanto, envolve o NF-KB. O NF-KB atua como chave-mestre da resposta inflamatória, coordenando a expressão de um conjunto de mais de 200 genes codificadores de citocinas, receptores, fatores de transcrição, quimioci- nas, enzimas pró-inflamatórias, fatores, quimiocinas e outros fatores, incluin- do fatores pró-sobrevida que iniciam e sustentam a inflamação. Os compostos da invenção inibem a atividade distinta pró-sobrevida do NF-KB na inflamação. Por conseguinte, doenças e distúrbios passíveis de tratamento com estes compostos incluem, à parte doenças inflamatórias crônicas convencionais (tais como doença intestinal inflamatória, artrite reumatoide e psoríase), outras doenças e distúrbios que dependem de componente inflamatório significativo. Exemplos destas doenças e distúrbios, as quais estão sendo tra-tados com agentes anti-inflamatórios ou agentes inibidores de NF-KB-OU para os quais foi proposto ser adequados para o tratamento com inibidores de NF-KB e que poderiam também ser tratados com um composto da invenção, incluem:

1. trato respiratório: doenças obstrutivas das vias aéreas incluindo: asma, inclusive asma brônquica, alérgica, intrínseca, induzida por exercício, induzida por fármaco (incluindo induzida por aspirina e por NSAID) e induzida por poeira, tanto intermitente como persistente e de todas as gravidades, e outras causas de hiperresponsividade das vias aéreas; doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD); bronquite, incluindo bronquite infecciosa e eosinofílica; enfisema; bronquiectasia; fibrose cística; sarcoidose; doenças do pulmão do fazendeiro e correlatas; pneumonite por hipersensibilida- de; fibrose pulmonar, incluindo alveolite fibrosante criptogenética, pneumonias intersticiais idiopáticas, fibrose complicada por terapia antineoplásica e infecção crônica, inclusive tuberculose e aspergilose e outras infecções por fungos; complicações de transplante pulmonar; distúrbios vasculíticos e trombóticos da vasculatura pulmonar e hipertensão pulmonar; atividade anti- tussígena, incluindo o tratamento de tosse crônica associada a condições inflamatórias e secretórias das vias aéreas e tosse iatrogênica, rinite aguda e crônica, incluindo rinite medicamentosa e rinite vasomotora; rinite alérgica perene e sazonal, incluindo rinite nervosa (febre do feno); polipose nasal; infecção viral aguda incluindo o resfriado comum e infecção causada pelo vírus sincicial respiratório, Influenza, coronavirus (inclusive SARS) ou adenovirus; ou esofagite eosinofílica;

2. osso e articulações: artrites associadas ou incluindo osteoar- trite/osteoartrose, tanto primárias como secundárias a, por exemplo, displasia congênita do quadril; espondilite cervical e lombar e dor lombar e dor do pescoço; osteoporose; artrite reumatoide e doença de Still; espondiloartropa- tias soronegativas, incluindo espondilite anquilosante, artrite psoriática, artrite reativa e espondartropatia indiferenciada; artrite séptica e outras artropati- as e distúrbios ósseos relacionados à infecção tais como tuberculose, incluindo doença de Potts e síndrome de Poncet; sinovite aguda e crônica induzida por depósito de cristais, incluindo gota úrica, doença do depósito de piro- fosfato de cálcio e inflamação sinovial, bursal e de tendões relacionada à apatita de cálcio; doença de Behcet; síndrome de Sjogren primária e secundária; esclerose sistêmica e esclerodermia limitada; lúpus sistêmico eritema- toso, doença mista do tecido conjuntivo e doença do tecido conjuntivo indife-renciada; miopatias inflamatórias incluindo dermatomiosite e polimiosite; po- limialgia reumática; artrite juvenil incluindo artrites inflamatórias idiopáticas de qualquer distribuição articular e síndromes associadas; e febre reumática e suas complicações sistêmicas; vasculites incluindo arterite de células gigantes, arterite de Takayasu, síndrome de Churg-Strauss, poliarterite nodosa, poliarterite microscópica e vasculites associadas com infecção virai, reações de hipersensibilidade, crioglobulinas e paraproteínas; dor lombar; febre familiar do Mediterrâneo, síndrome de Muckle-Wells e febre familiar da Hi- bérnia, doença de Kikuchi; artralgias, tendinites e miopatias induzidas por fármacos;

3. dor e remodelamento do tecido conjuntivo de distúrbios mus- culoesqueléticos decorrentes de lesão [por exemplo, lesão esportiva] ou doença: artrites (por exemplo, artrite reumatoide, osteoartrite, gota ou artropatia por depósito de cristais), outra doença articular (tal como degeneração do disco intervertebral ou degeneração da articulação temporomandibular), doença do remodelamento ósseo (tal como osteoporose, doença de Paget ou osteonecrose), policondrite, esclerodermia, doença mista do tecido conjuntivo, espondiloartropatias ou doença periodontal (tal como periodontite):

4. pele: psoríase, dermatite atópica, dermatite de contato ou outras dermatoses eczematosas e reações de hipersensibilidade do tipo tardio; fito e fotodermatite; dermatite seborreica, dermatite herpetiforme, líquen plano, líquen esclerose e atrófico, piodermia gangrenosa, sarcoide cutâneo, lúpus eritematoso discoide, pênfigo, penfigoide, epidermólise bolhosa, urticá- ria, angioedema, vasculites, eritemas tóxicos, eosinofilias cutâneas, alopecia areata, calvície de padrão masculino, síndrome de Sweet, síndrome de We- ber-Christian, eritema multiforme; celulite, infecciosa e não infecciosa; pani- culite; linfomas cutâneos, câncer de pele não melanoma e outras lesões dis- plásicas; distúrbios induzidos por fármaco incluindo erupções fixas medicamentosas;

5. olhos: blefarite; conjuntivite, incluindo conjuntivite alérgica perene e vernal; irite; uveíte anterior e posterior; coroidite; distúrbios autoimunes, degenerativos ou inflamatórios afetando a retina; oftalmite incluindo of- talmite simpática; sarcoidose; infecções incluindo virais, fúngicas e bacteria- nas;

6. trato gastrointestinal: glossite, gengivite, periodontite; esofagi- te, incluindo de refluxo; gastroenterite eosinofílica, mastocitose, doença de Crohn, colite incluindo colite ulcerativa, proctite, prurido anal; doença celíaca, síndrome do intestino irritável e alergias alimentares cujos efeitos podem ser distantes do intestino (por exemplo, enxaqueca, rinite ou eczema);

7. abdominal: hepatite, incluindo autoimune, alcoólica e viral; fibrose e cirrose hepática; colecistite; pancreatite, tanto aguda como crônica;

8. genitourinário: nefrite incluindo intersticial e glomerulonefrite; síndrome nefrótica; cistite incluindo cistite aguda e crônica (intersticial) e úlcera de Hunner; uretrite, prostatite, epididimite, ooforite e salpingite agudas e crônicas; vulvovaginite; doença de Peyronie; disfunção erétil (tanto masculina como feminina);

9. rejeição ao aloenxerto: aguda e crônica após, por exemplo, o transplante de rim, coração, fígado, pulmão, medula óssea, pele ou córnea ou após transfusão de sangue; ou doença do enxerto contra hospedeiro crônica;

10. sistema nervoso central: doença de Alzheimer e outras doenças que levam à demência incluindo CJD e nvCJD; amiloidose; esclerose múltipla e outras síndromes desmielinizantes; aterosclerose cerebral e vas- culite; arterite temporal; miastenia grave; dor aguda e crônica (aguda, intermitente ou persistente, seja de origem central ou de periférica) incluindo dor visceral, cefaleia, enxaqueca, neuralgia do trigêmeo, dor facial atípica, dor articular ou óssea, dor decorrente do câncer e da invasão tumoral, síndromes da dor neuropática incluindo neuropatias diabéticas, pós-herpéticas e associadas ao HIV; neurosarcoidose; complicações do sistema nervoso central e periférico de processos malignos, infecciosos ou autoimunes;

11. outros distúrbios autoimunes e alérgicos, incluindo tiroidite de Hashimoto, doença de Graves, doença de Addison, diabetes mellitus, púrpura trombocitopênica idiopática, fascite eosinofílica, síndrome de hiper- IgE, síndrome antifosfolipídica;

12. outros distúrbios com componente inflamatório ou imunológi- co; incluindo síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), hanseníase, síndrome de Sezary e síndromes paraneoplásicas;

13. cardiovascular: aterosclerose, afetando a circulação corona- riana e a periférica; pericardite; miocardite, cardiomiopatias inflamatórias e autoimunes incluindo sarcoide miocárdico; lesões de isquemia e reperfusão; endocardite, valvulite, and aortite incluindo de origem infecciosa (por exemplo sifilítica); vasculites; distúrbios das veias proximais e periféricas incluindo flebite e trombose, inclusive trombose venosa profunda e complicações de veias varicosas;

14. trato gastrointestinal: doença celíaca, proctite, gastroenterite eosinofílica, mastocitose, doença de Crohn, colite ulcerativa, colite microscópica, colite indeterminada, doença intestinal inflamatória, síndrome do intestino irritável, diarreia não inflamatória, alergias alimentares cujos efeitos são distantes do intestino, por exemplo, enxaqueca, rinite e eczema. Para essa finalidade, os inventores desenvolveram algumas moléculas sintéticas à base de D-enantiômeros de tetrapeptídeos, tripeptídeos, dipeptídeos e miméticos peptídicos semelhantes, incluindo grupos peptoides que rompem a interação Gadd45β/MKK7. De modo importante, estes compostos exibem atividade inibidora de Gadd45β sem suprimir a função da MKK7 quinase. Isso é importante porque confirma que os compostos da invenção conseguem induzir a sinalização citotóxica de JNK por intermédio da inibição de complexos Gadd45β/MKK7.

As moléculas sintéticas não se ligam a Gadd45β nem a MKK7 isoladas, mas se ligam a uma ou a outra proteína quando as proteínas estão em contato entre si no estado ligado ou não ligado, supostamente por reconhecerem uma superfície que se torna disponível em Gadd45β, MKK7 e/ou um complexo das duas proteínas somente quando Gadd45β e MKK7 entram em contato entre si e, consequentemente, por induzirem uma modificação conformacional em uma das duas proteínas ou no complexo como um todo que desencadeia a dissociação do complexo. Essa propriedade é de particular interesse, uma vez que assegura a alta especificidade dos compostos para o alvo (ou seja, o complexo Gadd45β/MKK7) e reduz a probabilidade de que os compostos da invenção possam interagir e assim afetar proteínas com estrutura semelhantes à de Gadd45β ou MKK7. Esta propriedade - que estabelece que o alvo terapêutico dos compostos da invenção é a interface entre as duas proteínas (ou seja, Gadd45β e MKK7) - assegura também que os compostos da invenção não bloquearão as atividades biológicas globais de Gadd45β ou de MKK7 in vivo, mas antes interferirão seletivamente com as atividades biológicas exercidas por Gadd45β ou por MKK7 como parte do complexo Gadd45β/MKK7.

Notavelmente, os compostos da invenção demonstraram induzir apoptose em linhagens celulares de mieloma múltiplo e em células de tumor primário e em outras linhagens de células B tumorais, incluindo linhagens celulares de linfoma difuso de grandes células B e de linfoma de Burkitt, bem como de outros tipos de câncer como leucemia pró-monocítica, com IC50s no baixo intervalo nanomolar, porém não exercem atividade sobre linhagens de células T tumorais ou sobre células normais, tais como fibroblastos não transformados, células estromais da medula óssea (BMSCs), células mono- nucleares do sangue periférico (PBMNCs) e células-tronco mesenquimais (MSCs), ou em linfócitos B e T primários purificados de camundongos, mesmo quando utilizados a concentrações muito altas (ou seja, 100 μM).

Isso evidencia terem especificidade na sua atividade citotóxica para células com NF-KB constitutivamente ativo de modo anormal. De modo importante, os compostos da invenção são resistentes à proteólise, são solúveis e estáveis em líquidos biológicos retendo a atividade inibitória total após a incubação prolongada com soro humano e, portanto, parecem ser candidatos adequados para o uso sistêmico.

Os compostos da invenção mostram alta especificidade de alvo para o complexo Gadd45β/MKK7 em células. Isso é demonstrado pelos a- chados de que: 1) em um grande painel de linhagens de células tumorais, há correlação estatística altamente significativa entre os níveis de expressão de Gadd45β e a sensibilidade de células cancerosas à morte induzida por Z- ZmDTP; 2) a regulação negativa de Gadd45β mediada por sh-RNA induz a- poptose em linhagens de células cancerosas sensíveis ao Z-/mDTP, mas não em resistentes ao Z-/mDTP, e a cinética da indução de apoptose por sh- RNAs específicos para Gadd45β é semelhante à observada com Z-/mDTPs; 3) a regulação negativa de MKK7 mediada por sh-RNA torna linhagens de células cancerosas sensíveis ao Z-mDTP completamente resistentes à morte induzida por Z-/mDTP; 4) o alvo terapêutico da invenção é a interface entre as duas proteínas, Gadd45β e MKK7 - o que proporciona mais ainda o potencial para alta seletividade de alvo, uma vantagem fundamental da solução dos inventores sobre as terapias existentes. Esses dados, juntamente com a baixa toxicidade de Z-/mDTPs contra células normais e os achados de que a ablação por knockout de Gadd45β é bem tolerada em camundongos indicam que o direcionamento às funções distintas pró-sobrevida do NF- KB em sobrevida celular por intermédio da inibição mediada por Z-/mDTP de Gadd45K/MKK7 pode proporcionar uma terapia mais específica, menos tóxica e, portanto, mais eficaz do que as terapias direcionadas à via do NF-KB e/ou o proteassoma.

Além disso, os compostos da invenção não possuem toxicidade contra células normais e a inibição de Gadd45β parece não ter ou ter poucos efeitos colaterais, uma vez que camundongos desabilitados (knockout) para Gadd45β são viáveis e aparentemente saudáveis, indicando que a inativa- ção completa de Gadd45β é bem tolerada in vivo. Os compostos da invenção são também estáveis, solúveis, permeáveis à célula e, portanto, adequados para o tratamento de mieloma múltiplo, linfoma difuso de grandes células B e outros tipos de câncer que dependem do NF-KB para sua sobre- vida. Os compostos são úteis também para o tratamento de doenças crônicas inflamatórias e autoimunes, especialmente aquelas mediadas por NF- KB. Os compostos da invenção possuem também perfis PK atraentes para uso terapêutico.

A invenção refere-se também ao desenvolvimento de ensaios clinicamente úteis para predizer a resposta à terapia com Z-/mDTP em pacientes. Os dados com um grande painel de linhagens de células tumorais mostram que a sensibilidade à morte induzida por Z-/mDTP correlaciona-se em alto grau de significância com os níveis de expressão de Gadd45β (p <0,01), estabelecendo, dessa forma, a alta especificidade da ação citotóxica de Z-/mDTPs para Gadd45β. Além do mais, a redução da expressão (knocking down) de Gadd45β induz apoptose em células de mieloma múltiplo, enquanto que reduzir a expressão de MKK7 torna estas células completamente resistentes à morte induzida por Z-/mDTP. Em conjunto, estes dados indicam que, caso a terapia com Z-/mDTP seja introduzida na clínica, será possível predizer populações de pacientes com resposta à terapia mediante a- nálise simples e de custo compensador por qRT-PCR.

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é provido um composto da Fórmula I: I: X1-A-X2 em que, A é A"" ou A'HM-A'-JnM-A’"; A"" é A", A'" ou Z1-Y2-Y3-Z4, em que Y2-Y3 é uma porção oligo- peptídica ou uma porção oligopeptoide tendo os resíduos Y2-Y3 e Zi está ligado ao nitrogênio do N-terminal de Y2-Y3 e Z4 está ligado ao carbono do C- terminal de Y2-Y3; A" é A' ou YÍ-Y2-Y3-Z4, em que Y1-Y2-Y3 é uma porção oligopeptoide ou uma porção oligopeptoide compreendendo os resíduos Y1-Y2-Y3 e Z4 está ligado ao carbono do C-terminal de YI-Y2-Y3;

A'" é A' ou ZrY2-Y3-Y4, em que Y2-Y3-Y4 é uma porção oligopeptoide ou uma porção oligopeptoide compreendendo os resíduos Y2-Y3-Y4 e Zi está ligado ao nitrogênio do N-terminal de Y2-Y3-Y4; toda ocorrência de A' é independentemente uma porção oligo- peptídica ou uma porção oligopeptoide compreendendo os resíduos YI-Y2- Y3-Y4; n é um número inteiro de 0 a 18,

Yi e Y4 são independentemente resíduos de aminoácidos ou resíduos de derivados de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas; de acordo com certas concretizações, cada cadeia lateral compreende um grupo alquileno contendo de um a três carbonos que estão substituídos uma ou duas vezes com um grupo aromático carbocíclico ou heterocíclico de 5 a 10 membros e, opcionalmente, substituídos ainda por alquila de 1 a 4 átomos de carbono; o referido grupo aromático está opcionalmente substituído por pelo menos um substituinte selecionado a partir de hidroxila, halogênio ou C1 a 04 alquila ou C1 a C4 alcóxi.

Y2 está ausente ou é um resíduo de aminoácido ou derivado de resíduo de aminoácido, de preferência qualquer um dos 20 aminoácidos naturais na configuração L ou D e/ou de preferência um resíduo de aminoácido ou resíduo de derivado de aminoácido tendo cadeia lateral de preferência com carga negativa em solução aquosa em pH 7;

Y3 é um resíduo de aminoácido ou resíduo de um derivado de aminoácido, de preferência qualquer um dos 20 aminoácidos naturais na configuração L ou D e/ou de preferência um resíduo de aminoácido ou resíduo de derivado de aminoácido tendo cadeia lateral de preferência com carga positiva em solução aquosa em pH 7;

Quando ambos estiverem presentes em certas concretizações, Y2 e Y3 são de preferência tais que uma ponte de sal possa ser formada entre as respectivas cargas positiva e negativa das cadeias laterais e/ou tais que a distância entre os centros aromáticos em Yi e Y4, em Xi e X4, em Xi e Y4 OU em Yi e X4 não seja maior do que 10 ou 20 Angstroms, nem menor do que 3 Angstroms. De preferência, as cadeias laterais de Y2 e Y3 são formadas por no máximo 30 átomos. Y2 e Y3 podem ser aminoácidos naturais ou N-metil-aminoácidos na configuração L ou D. é um grupo da Fórmula II:

o qual está ligado ao nitrogênio do N-terminal de Y2,

W está ausente ou é oxigênio, nitrogênio ou um grupo alquileno contendo de um a três carbonos, este grupo alquileno de um a três carbonos sendo opcionalmente substituído por pelo menos um substituinte selecionado a partir de alquila de um a quatro carbonos ou grupo aromático carbocí- 10 clico ou heterocíclico de 5 a 10 membros;

J é um grupo aromático carbocíclico ou heterocíclico de 5 a 10 membros, este grupo aromático sendo opcionalmente substituído por pelo menos um substituinte selecionado a partir de hidroxila, halogênio, alquila de um a quatro carbonos ou alcóxi de um a quatro átomos de carbono; Z4 representa um grupo da Fórmula III:

o qual está ligado ao carbono do C-terminal de Y3,

R é hidrogênio ou alquila de um a quarto carbonos; W está ausente ou é um grupo alquileno de um a três carbonos, este grupo alquileno de um a três carbonos sendo opcionalmente substituído 20 por pelo menos um substituinte selecionado a partir de alquila de um a quatro carbonos ou grupo aromático carboxílico ou heterocíclico de 5 a 10 membros;

J' é um grupo carbocíclico alifático de 3 a 10 membros ou grupo aromático carbocíclico ou heterocíclico de 5 a 10 membros, este grupo alifá- 25 tico ou aromático sendo opcionalmente substituído por pelo menos um subs- tituinte selecionado a partir de hidroxila, halogênio, alquila de um a quatro carbonos ou alcóxi de um a quatro átomos de carbono;

M é uma ligação peptídica entre o oligopeptídeo ou porção oligopeptoide precedente (A', A" ou A'") e o oligopeptídeo ou porção oligopeptoide seguinte (A', A" ou A'") ou um grupo ligante unido mediante ligação a- mida, ligação éster, ligação éter ou ligação tio éter ao grupo carboxílico terminal do oligopeptídeo ou porção oligopeptoide precedente (A1, A" ou A"') e mediante ligação amida, ligação éster, ligação éter ou ligação tio éter ao grupo amino terminal do porção oligopeptoide seguinte (A1, A" ou A"'); X-i está ausente ou é uma porção adicionada ao amino terminal de A a fim de bloquear o grupo amino livre; X2 está ausente ou é uma porção adicionada à carboxila terminal de A a fim de bloquear o grupo carboxila livre; De acordo com certas concretizações, W está ausente ou é um alquileno de 1 a 3 carbonos.

De preferência, Xi e X2 são grupos de no máximo 30 (ou mais preferivelmente de 20 ou 10) átomos, com a condição de que X1 esteja ausente se A compreender Z4 (ou seja, se não houver grupos amino ou carboxila livres nos terminais da molécula, Xi e X2 não são necessários); ou seus derivados, os referidos derivados sendo selecionados a partir do grupo constituído por: a) oligômeros ou multímeros de moléculas do composto da Fórmula I, os referidos oligômeros e multímeros contendo duas ou mais moléculas do composto da Fórmula I, cada uma estando ligada a um grupo de esqueleto (scaffold) em comum mediante ligação amida formada entre um grupo amino ou de ácido carboxílico presente em moléculas do composto da Fórmula I e um grupo oposto amino ou de ácido carboxílico no grupo de esqueleto, 0 referido grupo de esqueleto participando em pelo menos duas li-gações amida, b) derivados contendo uma molécula do composto da Fórmula l ou um oligômero ou multímero deste, conforme definido acima na parte a), conjugada mediante ligação amida, ligação éster, ligação éter ou ligação tio éter a: PEG, compostos à base de PEG, peptídeos de penetração celular, corantes fluorescentes, biotina ou outro grupo de etiqueta (tag), ácidos gra- xos, nanopartículas de tamanho distinto ou ligantes quelantes complexados com íons de metal ou radioativos. c) derivados contendo uma molécula do composto da Fórmula I ou um oligômero ou multímero deste, conforme definido na parte a), que tenha sido modificada por amidação, glicosilação, carbamilação, acilação, sul- fatação, fosforilação, ciclização, lipidação, peguilação ou ligação a um peptí- deo ou parceiro de fusão peptoide para formar um peptídeo de fusão ou pep- toide de fusão. d) sais e solvatos de uma molécula do composto da Fórmula I ou de um derivado deste, conforme definido na parte a) ou b) acima.

De acordo com certas concretizações: Yi é D-triptofano, L-triptofano, D-tirosina, L-tirosina, D-3,3-difenil- alanina, L-3,3-difenil-alanina, D-H-3-(4-piridil) alanina, L-H-3-(4-piridil) alani- na, D-H-3-(3-piridil) alanina, L-H-3-(3-píridil) alanina, D-H-3-(2-piridil) alanina, L-H-3-(2-piridil) alanina, ácido D-2-amino-4-fenil-butírico, ácido L-2-amino-4- fenil-butírico, D-H-4-hidróxi-fenil-glicina, L-H-4-hidróxi-fenil-glicina, D-3-(2- furil)-alanina, L-3-(2-furil)-alanina, L-homofenilalanina, D-homofenilalanina, D-3-(4-quinolil)-alanina, L-3-(4-quinolil)-alanina; D-naftil-alanina, L-naftil- alanina, ácido p-hidróxi-benzoico, ácido p-hidróxi-fenil-acético, ácido 3-(p- hidróxi-fenil)-propiônico ou derivados N-metila em configuração L ou D de qualquer um acima. Alternativamente, Yi pode ser: D-fenilalanina, L-fenilalanina, D- triptofano, L-triptofano, D-tirosina, L-tirosina, D-3,3-difenil-alanina, L-3,3 - difenil-alanina, D-H-3-(4-piridil) alanina, L-H-3-(4-piridil) alanina, D-H-3-(3- piridil) alanina, L-H-3-(3-piridil) alanina, D-H-3-(2-piridil) alanina, L-H-3-(2- piridil) alanina, ácido D-2-amino-4-fenil-butírico, ácido L-2-amino-4-fenil- butírico, D-fenil-glicina, L-fenil-glicina, D-H-4-hidróxi-fenil-glicina, L-H-4- hidróxi-fenil-glicina, D-3-(2-furil)-alanina, L-3-(2-furil)-alanina, L-ciclo- hexilalanina, D-ciclo-hexilalanina, L-homofenilalanina, D-homofenilalanina, D-3-(4-quinolil)-alanina, L-3 -(4-quinolil)-alanina; D-naftil-alanina ou L-naftil- alanina.

De acordo com certas concretizações: Y2 está ausente ou é ácido D-glutâmico, ácido L-glutâmico, ácido D-aspártico, ácido L-aspártico, L- leucina, D-leucina L-glutamina, D-glutamina, L-metionina, D-metionina, ácido D-2-amino-heptanodioico, ácido L-2-amino-heptanodioico, éster metílico ou etílico de qualquer um destes, L-homoserina, D-homoserina; ou derivados N- metila in Configuração L ou D de qualquer um dos acima.

Alternativamente, Y2 pode ser: ácido D-glutâmico, ácido L- glutâmico, ácido D-aspártico, ácido L-aspártico, ácido D-2-amino- heptanodioico, ácido L-2-amino-heptanodioico, éster metílico ou etílico de qualquer um destes, L-homoserina ou D-homoserina;

De acordo com certas concretizações: Y3 é D-arginina, L- arginina, L-prolina D-prolina D-histidina, L-histidina, D-lisina, ácido D-α,β- diaminopropiônico (D-Dap), ácido L-a,B-diaminopropiônico (L-Dap), ácido L- α,δ-diaminobutirico (L-Dab), ácido L-α,δ-diaminobutirico (L-Dab), L-ornitina, D-ornitina, L-lisina; ou derivados N-metila em configuração L ou D de qualquer um dos acima.

Alternativamente, Y3 pode ser D-arginina, L-arginina, D-histidina, L-histidina, D-lisina, ácido D-α,β-diaminopropionico (D-Dap), ácido L-α,β- diaminopropiônico (L-Dap), ácido L-α,δ-diaminobutirico (L-Dab), ácido L-α,δ- diaminobutírico (L-Dab), L-ornitina, D-ornitina ou L-lisina.

De acordo com certas concretizações: Y4 é D-fenilalanina, L- fenilalanina, D-triptofano, L-triptofano, D-tirosina, L-tirosina, D-3,3-difenil- alanina, L-3,3 -difenil-alanina, D-H-3-(4-piridil) alanina, L-H-3-(4-piridil) alanina, D-H-3-(3-piridil) alanina, L-H-3-(3-piridil) alanina, D-H-3-(2-piridil) alanina, L-H-3-(2-piridil) alanina, ácido D-2-amino-4-fenil-butírico, ácido L-2-amino-4- fenil-butírico, D-fenil-glicina, L-fenil-glicina, D-H-4-hidróxi-fenil-glicina, L-H-4- hidróxi-fenil-glicina, D-3-(2-furil)-alanina, L-3-(2-furil)-alanina, L- homofenilalanina, D-homofenilalanina, D-3-(4-quinolil)-alanina, L-3-(4- quinolil)-alanina; D-naftil-alanina, L-naftil-alanina, seus derivados N-metila em configuração L ou D, anilina, benzilamina ou 2-fenil-etilamina.

Alternativamente, Y4 pode ser: D-fenilalanina, L-fenilalanina, D- triptofano, L-triptofano, D-tirosina, L-tirosina, D-3,3-difenil-alanina, L-3,3- difenil-alanina, D-H-3-(4-piridil) alanina, L-H-3-(4-piridil) alanina, D-H-3-(3- piridil) alanina, L-H-3-(3-piridil) alanina, D-H-3-(2-piridil) alanina, L-H-3-(2- piridil) alanina, ácido D-2-amino-4-fenil-butírico, ácido L-2-amino-4-fenil- butirico, D-fenil-glicina, L-fenil-glicina, D-H-4-hidróxi-fenil-glicina, L-H-4- hidróxi-fenil-glicina, D-3-(2-furil)-alanina, L-3-(2-furil)-alanina, L-ciclo- hexilalanina, D-ciclo-hexilalanina, L-homofenilalanina, D-homofenilalanina, D-3-(4-quinolil)-alanina, L-3-(4-quinolil)-alanina; D-naftil-alanina ou L-naftil- alanina.

De acordo com certas concretizações preferidas, Yi, Y2, Y3 e Y4 são todos como descritos acima. De acordo com certas concretizações, Y1t Y2, Y3 e Y4 são todos como descritos acima, com a condição de Y2 ser ácido D-glutâmico, ácido L-glutâmico, ácido D-aspártico, ácido L-aspártico, ácido D-2-amino-heptanodioico, ácido L-2-amino-heptanodioico, éster metílico ou etílico de qualquer um destes; L-homoserina, L-leucina, D-leucina, L- glutamina, D-glutamina, L-metionina, D-metionina, D-homoserina ou derivados N-metila em configuração L ou D de qualquer um dos acima, e Y3 ser D- arginina, L-arginina, D-histidina, L-histidina, D-lisina, L-lisina; L-prolina, D- prolina, ácido D-a,B-diaminopropiônico (D-Dap), ácido L-α,β- diaminopropiônico (L-Dap), ácido D-α,δ-diaminobutirico (D-Dab), ácido L- α,δ-diaminobutirico (L-Dab), D-ornitina, L-ornitina ou derivados N-metila em configuração L ou D de qualquer um dos acima.

De acordo com certas concretizações, Yi e Y2 são ambos como descritos acima, mas um ou ambos de Y2 e Y3 estão ausentes. De acordo com certas concretizações, M é uma ligação peptídica.

De acordo com certas concretizações: X-i é hidrogênio ou Xi é um dos seguintes grupos adicionado ao amino terminal da sequência oligopeptídica de modo a formar uma ligação amida: acetila, benziloxicarbonila, 2-cloro-benziloxicarbonila, 3-metóxi,4- hidróxi-benzoíla, 3-hidróxi,4-metóxi-benzoíla, benzoíla ou fluorenil-metóxi- carbonila; X2 é um grupo hidroxila ou é um dos seguintes grupos adiciona- do ao terminal ácido do grupo carbonila da sequência oligopeptídica de modo a formar uma ligação amida: amina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, D- triptofano, L-triptofano, D-tirosina, L-tirosina, D-3,3-difenil-alanina, L-3,3- difenil-alanina, D-H-3-(4-piridil)-alanina, L-H-3-(4-piridil)-alanina, D-H-3-(3- piridil)-alanina, L-H-3-(3-piridil)-alanina, D-H-3-(2-piridil)-alanina, L-H-3-(2- piridil)-alanina, ácido D-2-amino-4-fenil-butírico, ácido L-2-amino-4-fenil- butírico, D-fenil-glicina, L-fenil-glicina, D-H-4-hidróxi-fenil-glicina, L-H-4- hidróxi-fenil-glicina, D-3-(2-furil)-alanina, L-3-(2-furil)-alanina, L-ciclo- hexilalanina, D-ciclo-hexilalanina, L-homofenilalanina, D-homofenilalanina, D-3-(4-quinolil)-alanina, L-3-(4-quinolil)-alanina, D-naftil-alanina, L-naftil- alanina ou derivados N-metila em configuração L ou D de qualquer um dos acima.

De acordo com certas concretizações: Z-i é 4-hidróxi-benzoíla, (4-hidróxi-fenil)-acetila, 3-(4-hidróxi-fenil)- propionila, benzoíla, benziloxicarbonila, 2-fenil-acetila, 3-fenil-propionila, 3,3- difenil-propionial, 3-(1H-indol-3-il)-propionila, (1 H-indol-3-il)-acetila, furan-2-il- acetila, furan-3-il-acetila, 3-piridin-4-il-propionila, 3-piridin-3-il-propionila, 3- piridin-2-il-propionila, 3-pirimidin-4-il-propionila, 3-piridazin-4-il-propionila, 3- [1,3,5]triazin-2-il-propionila, 2-piridin-4-il-acetila, 2-piridin-3-il-acetila, 2-piridin- 2-il-acetila, 2-pirimidin-4-il-acetila, 2-piridazin-4-il-acetila, 2-[1,3,5]triazin-2-il- acetila, naftalen-1-il-acetila, naftalen-2-il-acetila, 2-naftalen-1-il-propionila ou 2-naftalen-2-il-propionila; Y2 é ácido D-glutâmico, ácido L-glutâmico, ácido D-aspártico, á- cido L-aspártico, L-leucina, D-leucina, L-glutamina, D-glutamina, L-metionina, D-metionina, ácido D-2-amino-heptanodioico, ácido L-2-amino- heptanodioico, éster metílico ou etílico de qualquer um destes, L- homoserina, D-homoserina, ou derivados N-metila em configuração L ou D de qualquer um dos acima; Y3 é D-arginina, L-arginina, D-histidina, L-histidina, L-prolina, D- prolina, D-lisina, L-lisina; ácido D-α,β-diaminopropionico (D-Dap), ácido L- a,B-diaminopropiônico (L-Dap), ácido D-α,δ-diaminobutirico (D-Dab), ácido L-α,δ-diaminobutirico (L-Dab), D-ornitina, L-ornitina ou derivados N-metila em configuração L ou D de qualquer um dos acima; Z4 é fenilamina, benzilamina, fenetilamina, ciclo-hexilamina, 2- ciclo-hexil-etilamina, 3-ciclo-hexil-propilamina, 4-(2-amino-etil)-fenol, 4- amino-fenol, 4-aminometil-fenol, 1H-indol-3-il-amina, 2-(1 H-indol-3-il)- etilamina, C-(1H-indol-3-il)-metilamina, 2,2-difenil-etilamina, 2,2-dipiridin-4-il- etilamina, 2-piridin-4-il-etilamina, 2-piridin-3-il-etilamina, 2-piridin-2-il- etilamina, 2-pirimidin-4-il-etilamina, 2-[1,3,5]triazin-2-il-etilamina, C-furan-2-il- metilamina, C-furan-3-il-metilamina ou C-naftalen-2-il-metilamina.

De acordo com a convenção, todos os peptídeos e peptoides e suas regiões são descritos a partir do N-terminal para o C-terminal. n pode ser 0, 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8,9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18. De acordo com certas concretizações preferidas, n = 0.

De acordo com certas concretizações preferidas, A é A'. Em tais concretizações, o composto é, portanto, essencialmente, tetrapeptídeo, tri- peptídeo ou dipeptídeo (ou peptoide correspondente) com grupos opcionais de bloqueio Xi e X2 em um ou mais dos terminais. Qliqopeptídeos Oligopeptídeos são polímeros curtos formados pela condensação de a-aminoácidos (designados neste relatório descritivo simplesmente "aminoácidos"). O vincula entre um resíduo de aminoácido e o seguinte é conhecido como ligação peptídica ou ligação amida. Aminoácidos

Neste relatório descritivo, o termo "aminoácido" inclui os 20 aminoácidos padrão (Isoleucina, Alanina, Leucina, Asparagina, Lisina, Ácido Aspártico, Metionina, Cisteína, Fenilalanina, Ácido Glutâmico, Treonina, Glu- tamina, Triptofano, Glicina, Valina, Prolina, Serina, Tirosina, Arginina e Histi- dina) em ambas as suas configurações ópticas, D e L. Inclui também a- aminoácidos sintéticos nas formas D e L. De acordo com certas concretizações, a configuração D é preferida.

Derivados de aminoácidos

Neste relatório descritivo, este termo inclui glicinas N- substituídas que diferem de a-aminoácidos pelo fato de suas cadeias laterais estarem anexadas a átomos de nitrogênio ao longo da cadeia principal da molécula, em vez de os a-carbonos (como o estão em aminoácidos). No termo, estão incluídos também ésteres metílicos e etílicos de a-aminoácidos, P-aminoácidos e a-aminoácidos N-metilados.

Oliqopeptoides

Em rigor, o termo "oligopeptídeo" refere-se a oligômeros somente de a-aminoácidos. Um oligômero análogo incorporando (em todas ou em algumas posições de resíduos) um derivado de aminoácido (por exemplo, glicina A/-substituída) é conhecido como oligopeptoide. Derivados

De preferência, os derivados do composto do primeiro aspecto da invenção são derivados funcionais, o termo "derivado funcional" é utilizado neste relatório descritivo para indicar um derivado químico de um composto da Fórmula (I) tendo a mesma função fisiológica que os compostos correspondentes não modificados da Fórmula (I) ou, alternativamente, tendo a mesma função in vitro em um ensaio funcional (por exemplo, em um dos ensaios descritos em um dos exemplos apresentados neste relatório descritivo).

Os derivados do composto da invenção pode compreender a estrutura da Fórmula (I) modificada por processos bem conhecidos incluindo amidação, glicosilação, carbamilação, acilação, por exemplo, acetilação, sul- fatação, fosforilação, ciclização, lipidização e peguilação. A estrutura da Fórmula (I) pode ser modificada em posições aleatórias dentro da molécula ou em posições predeterminadas dentro da molécula, e pode incluir um, dois, três ou mais grupos químicos acoplados. Os derivados incluem compostos nos quais o grupo NH2 do N-terminal é substituído por outro grupo, por exemplo, grupo metóxi. Um composto da invenção pode ser uma proteína de fusão, pelo qual a estrutura da Fórmula (I) é fundida a outra proteína ou polipeptídeo (o parceiro de fusão), utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Qualquer peptídeo ou proteína adequada pode ser utilizado como o parceiro de fusão (por exemplo, albumina sérica, anidrase carbônica, glutationa-S-transferase ou tioredoxina, etc.). Parceiros preferidos de fusão não terão atividade biológica adversa in vivo. Estas proteínas de fusão podem ser produzidas unindo a terminação carbóxi do parceiro de fusão à terminação amino da estrutura da Fórmula (I) ou vice-versa. Opcionalmente, um ligante clivável pode ser utilizado para unir a estrutura da Fórmula (I) ao parceiro de fusão. Uma proteína clivável resultante de fusão pode ser clivada in vivo de tal modo que uma forma ativa de um composto da invenção seja liberada. Exemplos destes ligantes cliváveis incluem, entre outros, os ligan- tes D-D-D-D-Y [SEQ ID NO.: 227], G-P-R, A-G- G e H-P-F-H-L [SEQ ID NO.: 228], os quais podem ser clivados pela enteroquinase, trombina, enzima que cliva ubiquitina e renina, respectivamente. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N2 6 410 707.

Um composto da invenção pode ser um derivado fisiologicamen- te funcional da estrutura da Fórmula (I). O termo "derivado fisiologicamente funcional" é utilizado neste relatório descritivo para indicar um derivado químico de um composto da Fórmula (I) tendo a mesma função fisiológica que o composto correspondente não modificado da Fórmula (I). Por exemplo, um derivado fisiologicamente funcional pode ser convertido no corpo para um composto da Fórmula (I). De acordo com a presente invenção, exemplos de derivados fisiologicamente funcionais incluem ésteres, amidas e carbamatos; de preferência ésteres e amidas.

Ésteres e amidas farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção pode compreender éster ou amida de C1.20 alquila, C2-20 alque- nila, C5.10 arila, C5-10 ou C1.20 alquila ou aminoácido, unido em um sítio apropriado, por exemplo, a um grupo ácido. Exemplos de grupos adequados são substituintes hidrofóbicos com 4 a 26 átomos de carbono, de preferência de 5 a 19 átomos de carbono. Grupos lipídicos adequados incluem, entre outros, os seguintes: lauroíla (CÍ2H23), palmitila (C15H31), oleíla (C15H29), esteari- la (C17H35), colato e desoxicolato.

Métodos para lipidização de compostos contendo sulfidrila com derivados de ácidos graxos estão descritos na Patente U.S. N2 5 936 092, Patente U.S. N2 6 093 692 e U Patente U.S. N2 6 225 445. Derivados de ácidos graxos de um composto da invenção, compreendendo um composto da invenção unido ao ácido graxo mediante uma ligação dissulfeto, podem ser utilizados para liberação de um composto da invenção a células neuronais e a tecidos. A lipidização aumenta acentuadamente a absorção dos compostos em relação à taxa de absorção dos compostos correspondentes não lipi- dizados, bem como prolonga a retenção no sangue e tecidos dos compostos. Além do mais, a ligação dissulfeto em derivado lipidizado é relativamente lábil nas células e, dessa forma, facilita a liberação intracelular da molécula dos grupos de ácidos graxos. Grupos adequados contendo lipídios são substituintes hidrofóbicos com 4 a 26 átomos de carbono, de preferência de 5 a 19 átomos de carbono. Grupos lipídicos adequados incluem, entre outros, os seguintes: palmitila (C15H31), oleíla (CI5H29), estearila (C17H35), colato e desoxicolato.

Métodos de ciclização incluem ciclização através da formação de uma ponte dissulfeto e ciclização "head-to-tail" (cabeça-cauda), utilizando uma resina de ciclização. Peptídeos ciclizados podem exibir estabilidade reforçada, incluindo maior resistência à degradação enzimática, como resultado de suas restrições conformacionais. A ciclização pode ser especialmente rápida quando o peptídeo não ciclizado inclui um grupo cisteína no N- terminal. Peptídeos ciclizados adequados incluem estruturas monoméricas e diméricas ciclizadas head-to-tail. Os peptídeos ciclizados podem incluir um ou mais resíduos adicionais, especialmente uma cisteína adicional incorporada para que seja formada uma ligação dissulfeto ou uma cadeia lateral para fins de ciclização à base de resina.

Um composto da invenção pode ser uma estrutura peguilhada da Fórmula (I). Compostos peguilados da invenção podem oferecer vantagens adicionais, tais como maior solubilidade, estabilidade e tempo circulante do polieptídeo, ou menor imunogenicidade (consultar a Patente U.S. N° 4 179 337).

Porções químicas para derivatização de um composto da invenção podem ser selecionados também a partir de polímeros solúveis em á- gua, tais como polietilenoglicol, copolímeros etilenoglicol/propilenoglicol, car- boximetilcelulose, dextrana, álcool polivinílico e os semelhantes. Um grupo polimérico para derivatização de um composto da invenção pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não. Polímeros de outros pesos moleculares podem ser utilizados, dependendo do perfil terapêutico desejado, por exemplo, a duração da liberação sustentada desejada, os efeitos, se presentes, sobre a atividade biológica, a facilidade de manuseio, o grau ou a ausência de antigenicidade e outros efeitos conhecidos do polieti- lenoglicol a uma proteína terapêutica ou análoga. Por exemplo, o polietileno- glicol pode ter massa molar media em torno de 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90,000, 95.000 ou de 100.000 kDa.

Sais e solvatos de compostos da invenção que são adequados para uso em um medicamento são aqueles em que um contraíon ou solvente associado é farmaceuticamente aceitável. Contudo, sais e solvatos tendo contraíons ou solventes associados não farmaceuticamente aceitáveis são abrangidos pelo âmbito da presente invenção, por exemplo, para uso como intermediários no preparo dos compostos da Fórmula (I) e de seus sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis.

Sais adequados de acordo com a invenção incluem os formados com ácidos ou bases orgânicas ou inorgânicas. Sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis incluem os formados com ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, cítrico, tartárico, acético, fosfórico, láctico, pirú- vico, trifluoracético, succínico, perclórico, fumárico, maleico, glicólico, salicíli- co, oxaloacético, metano sulfônico, etano sulfônico, p-tolueno sulfônico, fór- mico, benzoico, malônico, naftaleno-2-sulfônico, benzeno sulfônico e isetiô- nico. Outros ácidos como oxálico, embora não sejam em si farmaceuticamente aceitáveis, podem ser úteis como intermediários em obter os compostos da invenção e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Os sais farmaceuticamente aceitáveis com bases incluem sais de amónio, sais de metal alcalino, por exemplo, sais de potássio e de sódio, sais de metal alcalino terroso, por exemplo, sais de cálcio e de magnésio, e sais com bases orgânicas, por exemplo, diciclo-hexilamina e N-metil-D-glucosamina.

Aqueles versados no estado da técnica da química orgânica reconhecerão que muitos compostos orgânicos podem formar complexos com solventes nos quais são reagidos ou dos quais são precipitados ou cristalizados. Tais complexos são conhecidos como "solvatos". Por exemplo, um complexo com água é conhecido como "hidrato". A presente invenção provê solvatos de compostos da invenção.

De acordo com certas concretizações preferidas, o composto possui meia-vida na circulação humana de pelo menos 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11 ou o mais preferível de pelo menos 12 horas.

De preferência, o composto retém pelo menos 20, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90 ou o mais preferível 99% de sua capacidade de se ligar a Gadd45β e/ou a MKK7 (e/ou uma associação de ambas) conforme avaliada em ensaio de ligação in vitro, ou pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou o mais preferível 99% de sua capacidade de bloquear a interação de Gadd45β com MKK7 conforme avaliada em ensaio competitivo in vitro após a incubação em soro humano normal por 24 horas a 37 graus Celsius.

Alternativa ou adicionalmente, o composto possui pelo menos uma das seguintes atividades: a) A habilidade para inibir pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou o mais preferível 99% das interações de MKK7 com Gadd45β sob as condições de ensaio descritas nos exemplos. b) A habilidade in vitro para eliminar pelo menos 20, 30, 40, 50 , 60, 70, 80, 90 ou o mais preferível 99% das células em cultura de linhagem celular de mieloma humano, selecionada a partir do grupo constituído por U266, KMS-11, NCI-H929, ARH-77, JJN-3, KMS-12, KMS-18 e KMS-27, ou de cultura da linhagem de células LY-3 de DLBCL ou de cultura da linhagem de células pró-monocíticas U937 ou de cultura da linhagem de células BJAB de linfoma de Burkitt ou cultura de células tumorais primárias (por exemplo, células tumorais primárias de mieloma múltiplo) em condições nas quais pe lo menos 90% das células da linhagem JURKAT de células T não sejam mortas. De acordo com certas concretizações preferidas, o grupo central do oligopeptídeo do composto, identificado como A na Formula I possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído por: (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Phe), [SEQ ID NO.: 2] (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Arg)-(L-Phe), [SEQ ID NO.: 3] (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-His)-(L-Phe), [SEQ ID NO.: 4] (L-Trp)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Phe), [SEQ ID NO.: 5] (L-Trp)-(L-Glu)-(L-His)-(L-Phe), [SEQ ID NO.: 6] (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Arg)-(L-Phe), [SEQ ID NO.: 7] (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Phe), [SEQ ID NO.: 8] (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Phe), [SEQ ID NO.: 9] (L-Trp)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Phe), [SEQ ID NO.: 10] (L-Trp)-(L-Glu)-(L-Arg)-(L-Phe), [SEQ ID NO.: 11] (L-Trp)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Phe), [SEQ ID NO.: 12] (L-Trp)-(L-Asp)-(L-Arg)-(L-Phe), [SEQ ID NO.: 13] (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Trp), [SEQ ID NO.: 14] (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-His)-(L-Trp), [SEQ ID NO.: 15] (L-Trp)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Trp), [SEQ ID NO.: 16] (L-Trp)-(L-Glu)-(L-His)-(L-Trp),[SEQ ID NO.: 17] (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Arg)-(L-Trp), [SEQ ID NO.: 18] (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Trp), [SEQ ID NO.: 19] (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Trp), [SEQ ID NO.: 20] (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Arg)-(L-Trp), [SEQ ID NO.: 21] (L-Trp)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Trp), [SEQ ID NO.: 22] (L-Trp)-(L-Glu)-(L-Arg)-(L-Trp), [SEQ ID NO.: 23] (L-Trp)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Trp), [SEQ ID NO.: 24] (L-Trp)-(L-Asp)-(L-Arg)-(L-Trp), [SEQ ID NO.: 25] (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Tyr), [SEQ ID NO.: 26] [D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Phe), [SEQ ID NO.: 27] [D-Tyr)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Phe), [SEQ ID NO.: 28] (D-Trp)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Phe), [SEQ ID NO.: 29] (D-Trp)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Phe), [SEQ ID NO.: 30] (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Arg)-(D-Phe), [SEQ ID NO.: 31] (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Tyr); [SEQ ID NO.: 32] (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Tyr), [SEQ ID NO.: 33] (D-Trp)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Typ), [SEQ ID NO.: 34] (D-Trp)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Typ), [SEQ ID NO.: 35] (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Phe), [SEQ ID NO.: 36] (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-His)-(D-Phe), [SEQ ID NO.: 208] (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Phe), [SEQ ID NO.: 209] (D-Trp)-(D-Glu)-(D-His)-(D-Phe), [SEQ ID NO.: 210] (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Lys)-(D-Phe), [SEQ ID NO.: 211] (D-Trp)-(D-Glu)-(D-Lys)-(D-Phe), [SEQ ID NO.: 212] (D-Trp)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Phe), [SEQ ID NO.: 213] (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Trp),[SEQ ID NO.: 214] (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-His)-(D-Trp), [SEQ ID NO.: 215] (D-Trp)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Trp), [SEQ ID NO.: 216] (D-Trp)-(D-Glu)-(D-His)-(D-Trp), [SEQ ID NO.: 217] (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Arg)-(D-Trp), [SEQ ID NO.:218] (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Trp), [SEQ ID NO.: 219] (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Lys)-(D-Trp), [SEQ ID NO.: 220] (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Trp), [SEQ ID NO.: 221] (D-Trp)-(D-Glu)-(D-Lys)-(D-Trp), [SEQ ID NO.: 222] (D-Trp)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Trp), [SEQ ID NO.: 223] (D-Trp)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Trp), [SEQ ID NO.: 224] (D-Trp)-(D-Gln)-(D-Arg)-(D-Trp), [SEQ ID NO.: 225] (D-Trp)-(D-Asn)-(D-Lys)-(D-Trp), [SEQ ID NO.: 226] (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Phe), (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Phe), (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Phe), (L-Tyr)-(L-Arg)-(L-Phe), (D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Phe), (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Phe), (D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Phe), (D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Phe), (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Tyr), (D-Tyij-(D-Pro)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Pro)-(D-Phe), (D-Phe)-(D-Leu)-(D-Phe), (D-Phe)-(D-Arg)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Glu)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Asp)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Pro)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Leu)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Pro)-(D-Trp) (D-Phe)-(D-Leu)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Arg).(D-Trp) (D-Phe)-(D-Glu)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Asp)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Pro)-(D-Trp) e (D-Phe)-(D-Leu)-(D-Trp).

Em outras concretizações, o grupo A é selecionado a partir do grupo constituído por: Ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-(L-Arg)-anilina Ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-(L-Arg)-anilina Ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-(D-Arg)-anilina Ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-(D-Arg)-anilina Ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-(L-Arg)-benzilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-(L-Arg)-benzilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-(D-Arg)-benzilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-(D-Arg)-benzilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(L-Glu)-(L-Arg)-anilina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(D-Glu)-(L-Arg)-anilina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(L-Glu)-(D-Arg)-anilina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(D-Glu)-(D-Arg)-anilina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(L-Glu)-(L-Arg)-benzilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(D-Glu)-(L-Arg)- benzilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(L-Glu)-(D-Arg)-benzilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(D-Glu)-(D-Arg)-benzilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(L-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(D-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(L-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(D-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(L-Glu)-(L-Arg)-anilina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(D-Glu)-(L-Arg)-anilina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(L-Glu)-(D-Arg)-anilina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(D-Glu)-(D-Arg)-anilina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(L-Glu)-(L-Arg)-benzilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(D-Glu)-(L-Arg)-benzilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(L-Glu)-(D-Arg)-benzilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(D-Glu)-(D-Arg)-benzilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(L-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(D-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(L-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(D-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(L-Arg)-anilina Ácido p-hidroxibenzoico-(D-Arg)-anilina Ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-anilina Ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-anilina Ácido p-hidroxibenzoico-(L-Arg)-benzilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(D-Arg)-benzilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-benzilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-benzilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(L-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(D-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-2-fenil-etilamina Ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-2-fenil-etilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(L-Arg)-anilina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(D-Arg)-anilina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(L-Glu)-anilina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(D-Glu)-anilina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(D-Arg)-benzilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(L-Arg)-benzilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(D-Glu)-benzilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(L-Glu)-benzilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(L-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(D-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(L-Glu)-2-fenil-etilamina Ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético-(D-Glu)-2-fenil-etilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(L-Arg)-anilina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(D-Arg)-anilina ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(L-Glu)-anilina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(D-Glu)-anilina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(L-Arg)-benzilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(D-Arg)-benzilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(L-Glu)-benzilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(D-Glu)-benzilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(L-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(D-Arg)-2-fenil-etilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(L-Glu)-2-fenil-etilamina Ácido 3-(4-hidróxi-fenil) propiônico-(D-Glu)-2-fenil-etilamina.

Alternativamente, o grupo identificado como A' na Fórmula I pode ser um oligopeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo listado diretamente acima.

De acordo com certas concretizações, o grupo A é um peptídeo ou grupo peptoide tendo os resíduos Xaai - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4, em que: Xaai é L-Tyr, D-Tyr, N-metil-L-Tyr, N-metil-D-Tyr, ácido p- hidroxibenzoico, ácido 2-(4-hidróxi-fenil) acético, ácido 3-(4-hidróxi-fenil) pro- piônico ou acetila; Xaa2 é L-Glu, D-Glu, L-Asp ou D-Asp, N-metil-L-Glu, N-metil-D- Glu, N-metil-L-Asp, N-metil-D-Asp, L-Pro, D-Pro, N-metil-L-Pro, N-metil-D- Pro, L-Leu, D-Leu, N-metil-L-Leu, N-metil-D-Leu ou está ausente; Xaa3 é L-Arg, D-Arg, L-His ou D-His, L-Lys, D-Lys, N-metil-L-Arg, N-metil-D-Arg, N-metil-L-His, N-metil-D-His, N-metil-L-Lys, N-metil-D-Lys ou está ausente; e Xaa4 é anilina, benzilamina, 2-fenil-etilamina, L-Phe ou D-Phe, N-metil-L-Phe, N-metil-D-Phe, L-Trp, D-Trp, N-metil-L-Trp, N-metil-D-Trp.

De acordo com certas concretizações qualquer um de Xaa2 ou Xaa3 está ausente, mas não ambos, Xaa2 e Xaa3. De acordo com outras concretizações, Xaa2 e Xaa3 estão os dois presentes.

M pode ser simplesmente uma ligação amida entre grupos pep- tídicos ou peptoides adjacentes. Alternativamente, pode ser um grupo molecular introduzido como espaçador e unido aos grupos peptídicos ou peptoides adjacentes por ligações amida.

M pode ser um aminoácido adicional. De preferência, é um ami- noácido adicional com cadeia lateral não volumosa, por exemplo, glicina, alanina ou serina ou derivados de qualquer uma destas. Alternativamente, M pode ser um grupo não de aminoácido, por exemplo, ácido ε-aminocaproico, ácido 3-amino-propiônico, ácido 4-amino-butírico. Outros grupos podem ser metilamina, etilamina, propilamina, butilamina, metileno, di-metileno, tri- metileno ou tetra-metileno. Em todos os casos, M deve ser tal que sua presença não interfira substancialmente com a ligação entre o grupo A' e Gadd45β e/ou MKK7. A extensão da possível interferência pode ser avaliada utilizando um ensaio de ligação in vitro conforme descrito neste pedido de patente.

Oligômeros e multímeros

O primeiro aspecto da invenção abrange oligômeros ou multímeros de moléculas do composto da Fórmula I, os referidos oligômeros e multímeros compreendendo duas ou mais moléculas do oligômero composto da Fórmula I, unida cada a um grupo do esqueleto (scaffold) em comum mediante ligação amida entre um grupo amina ou carboxílico presente em molécula do composto da Fórmula I e um grupo amino ou carboxílico oposto em um grupo de esqueleto, o referido grupo de esqueleto participando em pelo menos duas ligações amida.

De acordo com certas concretizações, o esqueleto em comum pode ser o aminoácido lisina. Lisina é um aminoácido trifuncional, contendo, adicionalmente aos grupos funcionais que a define como aminoácido, um grupo amino em sua cadeia lateral. Esta natureza trifuncional permite-lhe formar três ligações amida com peptídeos, peptoides ou moléculas semelhantes. Outros aminoácidos trifuncionais que podem ser utilizados como esqueleto em comum incluem ácido D-α,β-diaminopropi0nico (D-Dap), ácido L-α,β-diaminopropi0nico (L-Dap), ácido L-α,δ-diaminobutirico (L-Dab), ácido L-α,δ-diaminobutirico (L-Dab), L-ornitina e D-ornitina. Outros aminoácidos trifuncionais não padrão podem ser utilizados também de acordo com a invenção. O esqueleto em comum pode compreender também peptídeos e peptoides ramificados ou moléculas semelhantes que incorporam aminoácidos trifuncionais dentro de sua sequência e com pelo menos três grupos terminais funcionalmente ativos capazes de formar ligações amida. Peptídeos penetradores de células De acordo com certas concretizações, os compostos da Fórmula I estão conjugados a um peptídeo penetrador de células (CPP).

Tais peptídeos podem ser acoplados a um composto da Fórmula I quer por uma ou mais ligações covalentes ou por associações não covalen- tes. CPPs podem penetrar diretamente no plasmalema, por exemplo, o CPP pode ser Tat ou derivado, peptídeo derivado da sequência de Anten- napedia ou etiqueta (tag) poli-arginina, peptídeo PTD-4 ou peptídeo permeável à célula funcionalmente equivalente (Ho A, Schwarze SR, Mermelstein SJ, Waksman G, Dowdy SF 2001 Synthetic protein transduction domains: enhanced transduction potential in vitro and in vivo. Cancer Res 61A74-477).

Alternativamente, o CPP pode entrar na célula por mediação da endocitose ou através de mediação da formação de estruturas transitórias abrangendo a membrana. Para uma discussão sobre peptídeos penetradores de células, remete-se o leitor para a leitura de Wagstaff et al. (2006). Curr. Med. Chem. 13:171-1387 e referências contidas nesse texto. De acordo com certas concretizações, os compostos da invenção podem ser conjugados a nanopartículas (por exemplo, nanopartículas de ouro) visando promover a captação celular.

Corantes fluorescentes, grupos de etiqueta (taci) e derivados li- pidizados

Os compostos da Fórmula I podem ser conjugados a corantes fluorescentes de modo que sua penetração em tecidos ou células-alvo possa ser monitorada. Corantes fluorescentes podem ser obtidos com grupos amino (ou seja, succinimidas, isotiocianatos, hidrazinas), grupos carboxila (ou seja, carbodiimidas), grupos tiol (ou seja, maleimidas e brometos de acetila) e grupos azida, os quais podem ser utilizados para reagirem seletivamente com os grupos peptídicos dos compostos da Fórmula I. Exemplos de coran-tes fluorescentes incluem fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados.

Os compostos da Fórmula I podem ser conjugados a nanopartí- cuias de tamanho distinto, tais como as descritas em Chithrani DB, Mol Membr Biol. 2010 Oct 7, (Epub ahead of print) com tamanho distinto de até 100 nm, pelo qual os peptídeos ou seus derivados podem ser acoplados por ponte dissulfeto para permitir a liberação específica dentro do meio redutor do citosol. Adicionalmente, nanopartículas de peptídeos, conjugadas mediante ligação amida, éter, éster, tio éter podem ser utilizadas para a mesma finalidade dado a baixa toxicidade destes compostos. As nanopartículas fa-vorecerão a captação celular, bem como oferecerão um meio para visualizar e quantificar a captação celular por técnicas de fluorescência (Schrand AM, Lin JB, Hens SC, Hussain SM., Nanoscale. 2010 Sep 27, Epub ahead of print).

Porções tag podem ser anexadas por meios semelhantes e i- gualmente permitir monitorar o sucesso do direcionamento a tecidos e células.

Derivados de ácidos graxos de um composto da invenção, compreendendo um composto da Fórmula I unido a um ácido graxo mediante uma ligação dissulfeto, podem ser utilizados para a liberação de um composto da invenção a células e a tecidos. A lipidização aumenta a absorção dos compostos em relação à taxa de absorção dos compostos correspondentes não lipidizados, bem como prolonga a retenção no sangue e em tecidos dos compostos. Além do mais, a ligação dissulfeto em um derivado lipidizado é relativamente lábil nas células e facilita, dessa forma, a liberação intracelular da molécula os grupos de ácidos graxos. Grupos adequados contendo lipídios são substituintes hidrofóbicos com 4 a 26 átomos de carbono, de preferência de 5 a 19 átomos de carbono. Grupos lipídicos adequados incluem, entre outros, os seguintes: palmitila (C15H31,), oleíla (C-15H29), estearila (C17H35), colato; linolato e desoxicolato.

Conjugados iônicos

A invenção abrange também compostos da Fórmula I unidos funcionalmente a íons metabólicos ou radiativo. A conjugação de um agente quelante de íon (por exemplo, EDTA) é tipicamente empregada para unir o composto ao íon por quelação. Por tais meios, íons radioativos (por exem- pio, "mTc, 111ln, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 90Y, 117mSn, 153Sm, 186Re, 188Re ou 177l_u) podem ser liberados a células-alvo como radioterapia. íons metálicos não radioativos (por exemplo, íons de gadolínio) podem ser utilizados como marcador detectável por RMN.

Sais e solvatos

Sais e solvatos de compostos da invenção que são adequados para uso em um medicamento são aqueles em que um contraíon ou solvente associado é farmaceuticamente aceitável. Contudo, sais e solvatos com contraíon ou solventes associados não aceitáveis farmaceuticamente são abrangidos pelo âmbito da presente invenção, por exemplo, para uso como intermediários no preparo dos compostos da Fórmula (I) e de seus sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis.

Sais adequados de acordo com a invenção incluem os formados com ácidos ou bases orgânicas ou inorgânicas. Sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis incluem os formados com ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, cítrico, tartárico, acético, fosfórico, láctico, pirú- vico, trifluoracético, succínico, perclórico, fumárico, maleico, glicólico, salicíli- co, oxaloacético, metano sulfônico, etano sulfônico, p-tolueno sulfônico, fór- mico, benzoico, malônico, naftaleno-2-sulfônico, benzeno sulfônico e isetiô- nico. Outros ácidos como oxálico, embora não sejam em si farmaceuticamente aceitáveis, podem ser úteis como intermediários em obter os compostos da invenção e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Os sais farmaceuticamente aceitáveis com bases incluem sais de amónio, sais de metal alcalino, por exemplo, sais de potássio e de sódio, sais de metal alcalino terroso, por exemplo, sais de cálcio e de magnésio, e sais com bases orgâni-cas, por exemplo, diciclo-hexilamina e N-metil-D-glucosamina.

Aqueles versados no estado da técnica da química orgânica reconhecerão que muitos compostos orgânicos podem formar complexos com solventes nos quais são reagidos ou dos quais são precipitados ou cristalizados. Tais complexos são conhecidos como "solvatos". Por exemplo, um complexo com água é conhecido como "hidrato". A presente invenção provê solvatos de compostos da invenção.

Exemplos de moléculas preferidas da Fórmula I são fornecidos abaixo. Quando a configuração L/D de um resíduo de aminoácido não está especificada, as duas configurações são englobadas.

Acetil-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 37], Ácido para-hidroxibenzoico-Glu-Arg-anilina, Ácido para-hidroxibenzoico-Glu-Arg-benzilamina, Ácido para-hidroxibenzoico-Glu-Arg-2-fenil-etilamina, Ácido 2-(4-hidroxifenil) aoético-Glu-Arg-anilina, Ácido 2-(4-hidroxifenil) acético-Glu-Arg-benzilamina, Ácido 2-(4-hidroxifenil) acético-Glu-Arg-2-fenil-etilamina, Ácido 3-(4-hidroxifenil) acético-Glu-Arg-3-anilina, Ácido 3-(4-hidroxifenil) acético-Glu-Arg-benzilamina, Ácido 3-(4-hidroxifenil) acético-Glu-Arg-2-fenil-etilamina, Acetil-Tyr-Asp-His-Prie-NH2 [SEQ ID NO.: 38], Ácido para-hidroxibenzoico-Asp-His-anilina, Ácido para-hidroxibenzoico-Asp-His-benzilamina, Ácido para-hidroxibenzoico-Asp-His-3-fenil-propilamina, Ácido 2-(4-hidroxifenil) acético-Asp-His-anilina, Ácido 2-(4-hidroxifenil) acético-Asp-His-benzilamina, Ácido 2-(4-hidroxifenil) acético-Asp-His-2-fenil-etilamina, Ácido 3-(4-hidroxifenil) propiônico-Asp-His-anilina, Ácido 3-(4-hidroxifenil) propiônico-Asp-His-benzilamina, Ácido 3-(4-hidroxifenil) propiônico-Asp-His-2-fenil-etilamina, Acetil-Tyr-Asp-Lys-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 39], Acetil-Tyr-Glu-Lys-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 40], Acetil-Tyr-Glu-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 41], Acetil-Tyr-Asp-Arg-Phe-NH2) [SEQ ID NO.: 42], Acetil-Trp-Glu-His-Phe-NH2, [SEQ ID NO.: 43], Acetil-Trp-Glu-Lys-Phe-NH2, [SEQ ID NO.: 44], Acetil-Trp-Asp-His-Phe-NH2, [SEQ ID NO.: 45], Acetil-Trp-Asp-Lys-Phe-NH2, [SEQ ID NO.: 46], Acetil-Tyr-Glu-Arg-Tyr-NH2 [SEQ ID NO.: 47], Acetil-Tyr-Asp-Lys-Tyr-NH2 [SEQ ID NO.: 48], Acetil-Tyr-Glu-Lys-Tyr-NH2 [SEQ ID NO.: 49], Acetil-Tyr-Glu-His-Tyr-NH2 [SEQ ID NO.: 50], Acetil-Tyr-Asp-Arg-Tyr-NH2, [SEQ ID NO.: 51], Acetil-Trp-Glu-His-Tyr-NH2, [SEQ ID NO.: 52], Acetil-Trp-Glu-Lys-Tyr-NH2, [SEQ ID NO.: 53], Acetil-Trp-Asp-His-Tyr-NH2) [SEQ ID NO.: 54], Acetil-Trp-Asp-Lys-Tyr-NH2, [SEQ ID NO.: 55], Lactama interna de acetil-Tyr-Glu-l_ys-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: Acetil-Tyr-Gln-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 57], Acetil-Tyr-Met-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 58], Acetil-Tyr-Leu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 59], Acetil-Tyr-Arg-Phe-NH2, Acetil-T yr-Arg-T yr-N H2, Acetil-Tyr-Glu-Phe-NH2, Aceti l-Ty r-G I u-Tyr-N H2, Acetil-Tyr-Asp-Phe-NH2, Acetil-Tyr-Asp-Tyr-NH2, Acetil-Tyr-Pro-Phe-NH2, Acetil-T yr-Lys-Phe-N H2, Acetil-Tyr-His-Phe-NH2, H-Tyr-Arg-Phe-NH2, H-Tyr-Arg-Tyr-NH2, H-Tyr-Glu-Phe-NH2, H-Tyr-Glu-Tyr-NH2, H-Tyr-Asp-Phe-NH2, H-Tyr-Asp-Tyr-NH2, H-Tyr-Pro-Phe-NH2, H-Tyr-Lys-Phe-NH2, H-Tyr-His-Phe-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-Arg-Phe-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-Arg-Tyr-NH21 Benziloxicarbonil-Tyr-Glu-Phe-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-Glu-Tyr-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-Asp-Phe-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-Asp-Tyr-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-Pro-Phe-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-Lys-Phe-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-His-Phe-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 60]. Benziloxicarbonil-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 61], Benziloxicarbonil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 62], Benziloxicarbonil-Tyr-Arg-Phe-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-Glu-Phe-NH2, Benziloxicarbonil-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, Benziloxicarbonil-(N-metil)Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, Benziloxicarbonil-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-Phe-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-(N-metil)Glu-Phe-NH2, Benziloxicarbonil-(N-metil)Tyr-Glu-Phe-NH2, Acetil-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-(N-rnetil)Phe-NH2, Acetil-(N-metil)Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, Acetil-Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, Acetil-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-Phe-NH2, Acetil-Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, Acetil-Tyr-(N-metil)Glu-Phe-NH2, Acetil-(N-metil)Tyr-Glu-Phe-NH2, H-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, H-(N-metil)Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, H-Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, H-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-Phe-NH2, H-Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, H-Tyr-(N-metil)Glu-Phe-NH2, H-(N-metil)Tyr-Glu-Phe-NH2, Acetil-Tyr-Glu-(β-homo)Phe-NH2, Acetil-Tyr-(β-homo)Glu-Phe-NH2, Acetil-(β-homo)Tyr-Glu-Phe-NH2, Acetil-Tyr-Phe-NH2, Acetil-Phe-Tyr-NH2, Benziloxicarbonil-Tyr-Phe-NH2, Benziloxicarbonil-Phe-Tyr-NH2, H-Tyr-Phe-NH2, H-Phe-Tyr-NH2, (3-metóxi,4-hidróxi-benzoil)-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 63], (3-metóxi,4-hidróxi-benzoil)-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 64], (3-metóxi,4-hidróxi-benzoil)-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 65], (3-metóxi,4-hidróxi-benzoil)-Tyr-Arg-Phe-NH2, (3-metóxi,4-hidróxi-benzoil)-Tyr-Glu-Phe-NH2, Fluorenil-metóxi-carbonil-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 66], Fluorenil-metóxi-carbonil-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 67], Fluorenil-metóxi-carbonil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 68] , Fluorenil-metóxi-carbonil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 69], Fluorenil-metóxi-carbonil -Tyr-Arg-Phe-NH2, Fluorenil-metóxi-carbonil -Tyr-Glu-Phe-NH2, Miristil-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 70], Miristil-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 71], Miristil-Tyr-Arg-Phe-NH2,

Miristil-Tyr-Glu-Phe-NH2, Miristil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 72], Acetil-Tyr-Glu-Arg-Phe-Gly-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 73], Acetil-Tyr-Asp-His-Phe-Gly-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 74], Acetil-Tyr-Arg-Phe-Gly-Tyr-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 75], Acetil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-Gly-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 76], benziloxicarbonil-Tyr-Glu-Arg-Phe-Gly-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 77], benziloxicarbonil-Tyr-Asp-His-Phe-Gly-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 78], benziloxicarbonil-Tyr-Arg-Phe-Gly-Tyr-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 79], benziloxicarbonil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-Gly-Tyr-Asp(OMe)-His- Phe-NH2 [SEQ ID NO.: 80]

Exemplos adicionais de compostos da invenção incluem:

Composto A6 Ac-Tyr-(ácido 6-amino-caproico)-Phe-NH2 Composto A7 Ac-Tyr-Tyr-NH2 Composto A8 Ac-Phe-Tyr-NH2 Composto A9 Ac-Phe-Arg-Phe-NH2

Composto B16 Ac-Tyr-His-Phe-NH2 Composto H1 L-3,3-difenil-alanina Composto H2 L-H-3(4-piridil) alanina Composto H3 L-H-4-hidróxi-fenil-glicina Composto H4 Ácido L-2-amino-4-fenil-butírico Composto H5 L-fenil-glicina Composto H6 L-H-4-hidróxi-feniI-glicina Composto H7 L-homofenilalanina Composto H8 L-3-(2-furil)-alanina Composto H9 L-3-(4-quinolil)-alanina Composto H10 L-naftil-alanina

Composto 07 H-Phe-His-Phe-NH2 Composto 08 H-Phe-Arg-Tyr-NH2 Composto 09 H-Phe-Arg-Phe-NH2 Composto 010 H-Tyr-Arg-Tyr-NH2 Composto P1 Ácido 4-(hidroxil)-fenil-acético-Arg-3-fenil-etilamina Composto P2 Ácido 4-(hidroxil)-fenil-acético-His-3-fenil-etilanima Composto P3 Ácido 4-(hidroxil)-fenil-acético-Glu-3-fenil-etilamina

Composto G1 Ciclo(Tyr-Arg-Phe) Composto G2 Ciclo(Phe-Arg-Tyr)

Composto G3 Ciclo(Tyr-Phe) e Partículas de nano-ouro-Tyr-Arg-Phe-NH2

De acordo com certas concretizações, os compostos especificamente descritos neste pedido de patente, incluindo nos exemplos, são compostos preferidos ou são concretizações preferidas do grupo A' da Fórmula I. A presente invenção contempla as versões multímeras ou os compostos específicos explicitamente descritos neste pedido de patente. Por exemplo, a presente invenção contempla os grupos peptídicos ou peptoides de 3 ou 4 resíduos dos compostos específicos descritos neste pedido de patente, como correspondentes para o grupo A, A', A", A" ou A"" de compostos da Fórmula I.

Composições farmacêuticas

De acordo com um segundo aspecto da invenção, é provida uma composição farmacêutica contendo um composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Embora seja possível que o ingrediente ativo seja administrado isoladamente, é preferível que este esteja presente em uma formulação ou composição farmacêutica. Dessa forma, a invenção provê uma formulação farmacêutica contendo um composto da Fórmula (I), ou seu derivado, sal ou solvato, conforme definido acima, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Composições farmacêuticas da invenção podem assumir a forma de uma formulação farmacêutica conforme descrita abaixo.

As formulações farmacêuticas de acordo com a invenção incluem as adequadas para administração oral, parenteral (incluindo subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa e intra-articular), inalação (incluindo partículas finas de pó ou névoas, as quais podem ser geradas por meio de vários tipos de aerossóis pressurizados dosimetrados, nebulizadores ou in- sufladores), retal e tópica (incluindo dérmica, transdérmica, transmucosa, bucal, sublingual e intraocular), embora a via mais adequada possa depender, por exemplo, da condição e do distúrbio do destinatário.

As formulações podem ser apresentadas convencionalmente em forma de dose unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos no estado da técnica da farmácia. Todos os métodos incluem a etapa de levar o ingrediente ativo a se associar com o veículo, o qual constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas levando o ingrediente ativo a se associar uniforme e intimamente com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos, ou ambos, e depois, se necessário, moldar o produto na formulação desejada.

As formulações da presente invenção adequadas para administração podem ser apresentadas em unidades distintas, tais como cápsulas, cachês ou comprimidos, cada um contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo; em pó ou grânulos; em solução ou suspensão em líquido aquoso ou não aquoso; ou em emulsão óleo em água ou água em óleo. O ingrediente ativo pode ser apresentado também em forma de bolus, eletu- ário ou pasta. Vários veículos farmaceuticamente aceitáveis e sua formulação estão descritos em tratados padrão sobre formulações, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin. Consultar também Wang, Y. J. and Hanson, M. A., Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S, 1988.

Um comprimido pode ser feito por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Comprimidos prensados podem ser preparados prensando o ingrediente ativo em máquina adequada em forma bem fluida, tal como pó ou grânulos, opcionalmente misturado com agregante, lubrificante, diluente inerte, agente ativo de superfície ou dispersante. Comprimidos moldados podem ser feitos pela moldagem em máquina adequada da mistura do composto em pó umedecida com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem ser opcionalmente revestidos ou marcados e podem ser formulados de modo a proporcionarem libe ração lenta ou controlada do ingrediente ativo incluso. Os presentes compostos podem, por exemplo, ser administrados em uma forma adequada para liberação imediata ou liberação prolongada. A liberação imediata ou prolongada pode ser conseguida pelo uso de composições farmacêuticas adequadas, contendo os presentes compostos ou, especialmente no caso de liberação prolongada, pelo uso de dispositivos tais como implantes subcutâneos ou bombas osmóticas. Os presentes compostos podem ser admi-nistrados também por lipossoma. De preferência, as composições de acordo com a invenção são adequadas para administração subcutânea, por exemplo, por injeção.

Composições exemplares para administração oral incluem suspensões que podem conter, por exemplo, celulose microcristalina para conferir volume, ácido algínico ou alginato de sódio como agente de suspensão, metilcelulose como promotor da viscosidade e adoçantes ou agentes de sabor tais como os conhecidos no estado da técnica; e comprimidos de liberação imediata que podem conter, por exemplo, celulose microcristalina, fosfato dicálcico, amido, estearato de magnésio e/ou lactose e/ou outros excipien- tes, agregantes, extensores, desintegrantes, diluentes e lubrificantes, tais como os conhecidos no estado da técnica. Os compostos da Fórmula (I) ou variante, derivado, sal ou solvato destes podem ser liberados também através da cavidade oral por administração sublingual e/ou bucal. Comprimidos moldados, comprimidos prensados ou comprimidos liofilizados são formas exemplares que podem ser utilizadas. Composições exemplares incluem aquelas nas quais o único ou mais presentes compostos são formulados com diluentes de rápida dissolução como manitol, lactose, sacarose e/ou ciclodextrinas. Adicionalmente, podem ser incluídos em tais formulações ex- cipientes de alto peso molecular como celuloses (avicel) ou polietilenoglicóis (PEG). Tais formulações podem incluir também um excipiente para auxiliar a adesão à mucosa tal como hidroxipropilcelulose (HPC), hidroxipropilmetilce- lulose (HPMC), carboximetilcelulose sódica (SCMC), copolímero de anidrido maleico (por exemplo, Gantrez), além de agentes para controlar a liberação tanto como copolímero poliacrílico (por exemplo, Carbopol 934). Lubrifican tes, deslizantes, sabores, agentes corantes e estabilizantes podem ser adicionados também para facilitar a fabricação e o uso.

Formulações para administração parenteral incluem soluções aquosas e não aquosas injetáveis que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornem a solução isotônica com o sangue do destinatário pretendido; e suspensões aquosas e não aquosas estéreis que podem incluir agentes de suspensão ou de espessamento. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de múltiplas doses, por exemplo, ampolas e frascos lacrados, e podem ser armazenadas em condição liofilizada, exigindo somente a adição do veículo líquido estéril, por exemplo, solução salina ou água para injetáveis, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões injetáveis extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo previamente descrito. Composições exemplares para administração parenteral incluem soluções ou suspensões injetáveis que podem conter, por exemplo, diluen- tes ou solventes não tóxicos aceitáveis para via parenteral, como manitol, 1,3-butanodiol, água, solução de Ringer, solução isotônica de cloreto de sódio, ou outros agentes dispersantes ou umectantes adequados, incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos e ácidos graxos, incluindo ácido oleico, ou Cremaphor. Um veículo aquoso pode ser, por exemplo, solução tampão isotônica em pH em torno de 3,0 a em torno de 8,0, de preferência em pH em torno de 3,5 a em torno de 7,4, por exemplo, de 3,5 a 6,0, por exemplo, de 3,5 a em torno de 5,0. Tampões úteis incluem tampões de citrato de sódio- ácido cítrico, fosfato de sódio-ácido fosfórico e acetato de sódio/ácido acético. A composição não inclui de preferência agentes oxidantes e outros compostos conhecidos por serem nocivos ao composto da Fórmula I e moléculas relacionadas. Excipientes que podem ser incluídos são, por exemplo, outras proteínas, como albumina sérica ou os preparados plasmáticos. Se desejado, a composição farmacêutica pode conter também quantidades mínimas de substâncias auxiliares não tóxicas, como agentes umectantes ou emulsi- onantes, conservantes e agentes de tamponamento do pH e os semelhantes, por exemplo, acetato de sódio ou monolaureato de sorbitano.

Composições exemplares para administração por aerossol nasal ou inalação incluem soluções em salina, as quais podem conter, por exemplo, álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para incrementar a biodisponibilidade e/ou outros agentes solubili- zantes ou dispersantes, tais como aqueles conhecidos no estado da técnica. Convenientemente em composições para administração por aerossol nasal ou inalação, o composto da invenção é liberado na forma de apresentação em spray nasal pulverizado a partir de embalagem pressurizada ou nebuli- zador, com o uso de um propelente adequado, por exemplo, diclorodifluor- metano, triclorofluormetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de aerossol pressurizado, a dose unitária pode ser determinada por uma válvula inserida para liberar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de gelatina, por exemplo, para uso em inalante ou insuflador podem ser formulados para conter uma mistura em pó do composto e uma base de pó adequada, por exemplo, lactose ou amido. Em um exemplo específico não limitante, um composto da invenção é administrado em aerossol, a partir de uma válvula dosimetrada, através de um adaptador de aerossol conhecido também como acionador. Opcionalmente, é incluindo também um estabili- zante, e/ou partículas porosas para liberação pulmonar profunda são incluídas (por exemplo, consultar a Patente U.S. N- 6 447 743).

Formulações para administração retal podem ser apresentadas em forma de enema de retenção ou supositório com os veículos habituais, como manteiga de cacau, ésteres sintéticos de glicerídeos ou polietilenogli- col. Estes veículos estão tipicamente na forma sólida a temperaturas comuns, mas se liquefazem e/ou dissolvem na cavidade retal para liberação do fármaco.

Formulações para administração tópica na boca, por exemplo, por via bucal ou sublingual, incluem losangos contendo o ingrediente ativo em base com sabor, tal como sacarose e acácia ou tragacanta, e pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia. Composições exemplares para administração tópica incluem um veículo tópico tal como Plastibase (óleo mineral gelificado com polietileno).

Formulações preferidas de dose unitária são aquelas contendo uma dose eficaz, conforme enunciado previamente neste relatório descritivo, ou uma fração desta, do ingrediente ativo.

Deve ser entendido que, adicionalmente aos ingredientes especialmente citados acima, as formulações desta invenção podem incluir outros agentes convencionais no estado da técnica que digam respeito ao tipo da formulação em questão, por exemplo, aqueles adequados para administração oral podem incluir agentes de sabor.

Os compostos da invenção são também adequadamente administrados como sistemas de liberação sustentada. Exemplos adequados de sistemas de liberação sustentada da invenção incluem materiais poliméricos adequados, por exemplo, matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de itens moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas, materiais hidrofó- bicos adequados, por exemplo, em emulsão em óleo aceitável; ou resinas de troca iônica; e derivados fracamente solúveis do composto da invenção, por exemplo, sal fracamente solúvel. Os sistemas de liberação sustentada po-dem ser administrados por via oral, retal, parenteral, intravaginal, intraperitoneal, tópica, por exemplo, em forma de pó, pomada, gel, gotas ou adesivo transdérmico, por via bucal ou em forma de aerossol oral ou nasal.

Os preparados para administração podem ser adequadamente formulados para proporcionarem liberação controlada de compostos da invenção. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem estar na forma de partículas contendo um ou mais de polímeros biodegradáveis, polissaca- rídeo gelificante e/ou polímeros bioadesivos, polímeros anfifílicos, agentes capazes de modificar as propriedades da interface das partículas do composto da Fórmula (I). Estas composições exibem certas características de biocompatibilidade que permitem liberação controlada da substância ativa. Consultar a Patente U.S. Ns 5 700 486.

Um composto da invenção pode ser liberado por meio de bomba (consultar Langer, supra; Sefton, CRC Crít. Ref. Biomed. Eng. 14:201, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989) ou por infusões subcutâneas contínuas, por exemplo, com o uso de minibomba. Uma solução em bolsa intravenosa pode ser também empregada. Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer (Science 249:1527-1533,1990). Em outro aspecto da invenção, os compostos da invenção são liberados por meio de uma bomba implantada, descrita, por exemplo, na Patente U.S. N- 6 436 091; Patente U.S. N-. 5 939 380; Patente U.S. N2 5 993 414.

Dispositivos implantáveis para infusão de fármaco são utilizados para fornecer uma dose constante e prolongada ou infusão de um fármaco ou de qualquer outro agente terapêutico a pacientes. Essencialmente, tal dispositivo pode ser classificado em ativo ou passivo. Um composto da presente invenção pode ser formulado em preparado de depósito. Tal formulação em depósito de ação prolongada pode ser administrada por implante, por exemplo, subcutâneo ou intramuscular ou injeção intramuscular. Dessa forma, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais po- liméricos ou hidrofóbicos adequados, por exemplo, em forma de emulsão em óleo aceitável; ou resinas de troca iônica; ou em derivados fracamente solúveis, por exemplo, em forma de sal fracamente solúvel.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção pode ser administrada em dose de pulso único, em dose de bolus ou pulsos de dose administrado ao longo do tempo. Portanto, em pulsos de doses, é fornecida a administração em bolus de um composto da invenção, seguido por um período de tempo em que nenhum composto da invenção é administrado ao indivíduo, seguido por uma segunda administração em bolus. Em exemplos específicos não limitantes, doses em pulso de um composto da invenção são administradas durante o ciclo de um dia, durante o ciclo de uma semana ou durante o ciclo de um mês.

Em uma concretização, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção é administrada com uma quantidade terapeuticamente eficaz de outro agente, por exemplo, um agente quimioterápico an- tineoplásico adicional (por exemplo, talidomida, dexametasona, bortezomib, lenalidomida, melfalano, cisplatina, doxorrubicina, 5-FU, etc.), um agente para tratar anemia (por exemplo, eritropoietina) ou um agente para prevenir fraturas ósseas (por exemplo, bifosfonato tal como pamidronato ou ácido zolendrônico).

A quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção dependerá da molécula utilizada, do indivíduo em tratamento, da gravidade e do tipo do acometimento e da maneira e da via de administração.

De acordo com o terceiro aspecto da invenção, é provido um método para tratar um distúrbio ou doença, compreendendo administrar um composto de acordo com o primeiro e o segundo aspecto da invenção ou uma composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção, administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou de uma composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção a um indivíduo com necessidade desse tratamento.

Distúrbios e doenças

Os compostos, as composições e os métodos da invenção são adequados para o tratamento ou a prevenção de doenças e distúrbios que são caracterizados por expressão ou atividade anormal ou aumentada de Gadd45β ou que são caracterizados por ativação anormal da via NF-KB e são passíveis de tratamento pela indução da Morte Celular Programada pela inibição da atividade de Gadd45β.

Doenças adequadas para tratamento ou prevenção incluem o câncer. De preferência, o câncer é do tipo que expressa níveis elevados de Gadd45β em relação a células ou tecidos normais saudáveis correspondentes. Tipos de câncer conhecidos por expressarem níveis anormalmente altos de Gadd45β e, portanto, adequados para o tratamento com os compostos da invenção incluem: mieloma múltiplo, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, leucemia pró-monocítica e outras leucemias, bem como tumores sólidos tais como carcinoma hepatocelular, câncer de bexiga, câncer cerebral e do sistema nervoso central, câncer de mama, câncer da cabeça e pescoço, câncer de pulmão e câncer de próstata. De acordo com certas concretizações, o câncer pode ser do tipo que depende do NF-KB para sua sobrevida. Tais tipos específicos de câncer que dependem do NF-KB para sobrevida e, portanto, adequados para o tratamento ou a prevenção incluem: mieloma múltiplo, linfoma de células do manto, linfoma MALT, linfoma de Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, leucemia pró-monocítica, síndrome mielodisplásica, leucemia de células T do adulto (HTLV-1), leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogênica crônica, leucemia mielogênica aguda, leucemia linfoblástica aguda, câncer associado à colite, câncer de cólon, câncer de fígado (por exemplo, carcinoma hepatoce- lular), câncer cervical, câncer renal, câncer de pulmão, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de laringe, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de tireoide, câncer de paratireoide, câncer de bexiga, câncer de ovário, câncer de mama, melanoma, cilindroma, carcinoma de células escamo-sas (da pele e da cabeça e pescoço), carcinoma oral, carcinoma de endomé- trio, retinoblastoma, astrocitoma e glioblastoma. De acordo com certas concretizações preferidas, o câncer é mieloma múltiplo. De acordo com certas concretizações, células coletadas do indivíduo (por exemplo, obtidas por biopsia do câncer de um indivíduo ou extraídas do sangue ou de outro líquido corporal do indivíduo no qual possam ter sido liberadas pelo câncer) podem ser testadas quanto à ativação de NF-KB e/ou elevação do nível de atividade de Gadd45β a fim de determinar a adequação do câncer ao tratamento pelos métodos, compostos e as composições da invenção.

Outras doenças e distúrbios adequados para o tratamento ou a prevenção incluem doença autoimune (por exemplo, esclerose múltipla, lúpus, diabetes tipo I), doença alérgica (por exemplo, asma), doença inflamatória crônica (por exemplo, doença intestinal inflamatória, artrite reumatoide, psoríase, colite ulcerativa), doença genética (por exemplo, incontinência pigmentar, displasia ectodérmica anidrótica com imunodeficiência e cilindro- matose), doença isquêmica e vascular (por exemplo, aterosclerose, angina pectoris, acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio) e doença degenerativa (por exemplo, doença de Alzheimer e de Parkinson), doenças hepáticas tais como fibrose hepática e cirrose hepática.

Uma ampla gama de doenças e distúrbios depende da atividade de NF-KB. De fato, é considerado atualmente que a patogênese de virtualmente toda doença ou distúrbio humano conhecido depende de inflamação e, portanto, envolve NF-KB. O NF-KB atua como chave-mestra da resposta inflamatória, coordenando a expressão de um conjunto de mais de 200 genes codificadores de citocinas, receptores, fatores de transcrição, quimioci- nas, enzimas pró-inflamatórias e outros fatores, incluindo fatores pró- sobrevida, os quais iniciam e sustentam a inflamação. Os compostos da invenção inibem a atividade distinta pró-sobrevida do NF-KB na inflamação. Por conseguinte, doenças e distúrbios passíveis de tratamento com estes compostos incluem, à parte doenças inflamatórias crônicas convencionais (tais como doença intestinal inflamatória, artrite reumatoide e psoríase), ou-tras doenças e distúrbios que dependem de componente inflamatório significativo. Exemplos destas doenças e distúrbios, as quais são tratadas com agentes anti-inflamatórios ou agentes inibidores de NF-KB OU para as quais foi proposto serem adequadas ao tratamento com inibidores de NF-KB e que poderiam também ser tratadas com um composto da invenção incluem:

1. trato respiratório: doenças obstrutivas das vias aéreas incluindo: asma, inclusive asma brônquica, alérgica, intrínseca, extrínseca, induzida por exercício, induzida por fármaco (incluindo induzida por aspirina e por NSAID) e induzida por poeira, tanto intermitente como persistente e de todas as gravidades, e outras causas de hiperresponsividade das vias aéreas; doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD); bronquite, incluindo bronquite infecciosa e eosinofílica; enfisema; bronquiectasia; fibrose cística; sarcoido- se; doença do pulmão do fazendeiro e relacionadas; pneumonite por hiper- sensibilidade; fibrose pulmonar, incluindo alveolite fibrosante criptogenética, pneumonias intersticiais idiopáticas, fibrose complicada por terapia antineo- plásica e infecção crônica, incluindo tuberculose e aspergilose e outras infecções por fungos; complicações de transplante pulmonar; distúrbios vascu- líticos e trombóticos da vasculatura pulmonar e hipertensão pulmonar; atividade antitussígena, incluindo o tratamento de tosse crônica associada a condições inflamatórias e secretórias das vias aéreas e tosse iatrogênica; rinite aguda e crônica incluindo rinite medicamentosa e rinite vasomotora; rinite alérgica perene e sazonal, incluindo rinite nervosa (febre do feno); poli- pose nasal; infecção virai aguda incluindo o resfriado comum e infecção causada pelo vírus sincicial respiratório, Influenza, coronavirus (inclusive SARS) ou adenovirus; ou esofagite eosinofílica;

2. osso e articulações: artrites associadas ou incluindo osteoar- trite/osteoartrose, tanto primárias como secundárias a, por exemplo, displasia congênita do quadril; espondilite cervical e lombar, e dor lombar e dor no pescoço; osteoporose; artrite reumatoide e doença de Still; espondiloartropa- tias soronegativas incluindo espondilite anquilosante, artrite psoriática, artrite reativa e espondartropatia indiferenciada; artrite séptica e outras artropatias e distúrbios ósseos relacionados à infecção, tais como tuberculose, incluindo doença de Potts e síndrome de Poncet; sinovite aguda e crônica induzida por depósito de cristais incluindo gota úrica, doença do depósito de pirofos- fato de cálcio e inflamação sinovial, bursal e de tendões relacionada à apati- ta de cálcio; doença de Behcet; síndrome de Sjogren primária e secundária; esclerose sistêmica e esclerodermia limitada; lúpus sistêmico eritematoso, doença mista do tecido conjuntivo e doença indiferenciada do tecido conjunto; miopatias inflamatórias incluindo dermatomiosite e polimiosite; polimialgia reumática; artrite juvenil incluindo artrites inflamatórias idiopáticas de qualquer distribuição articular e síndromes associadas e febre reumática e suas complicações sistêmicas; vasculites incluindo arterite de células gigantes, arterite de Takayasu, síndrome de Churg-Strauss, poliarterite nodosa, poliar- terite microscópica e vasculites associadas à infecção virai, reações de hi- persensibilidade, crioglobulinas e paraproteínas; dor lombar; febre familiar do Mediterrâneo, síndrome de Muckle-Wells e febre familiar da Hibérnia, doença de Kikuchi; artralgias, tendinites e miopatias induzidas por fármacos;

3. dor e remodelamento do tecido conjuntivo de distúrbios mus- culoesqueléticos decorrentes de lesão [por exemplo, lesão esportiva] ou doença: artrites (por exemplo, artrite reumatoide, osteoartrite, gota ou artropatia por depósito de cristais), outra doença articular (tal como degeneração do disco intervertebral ou degeneração da articulação temporomandibular), do ença do remodelamento ósseo (tal como osteoporose, doença de Paget ou osteonecrose), policondrite, esclerodermia, doença mista do tecido conjuntivo, espondiloartropatias ou doença periodontal (tal como periodontite);

4. pele: psoríase, dermatite atópica, dermatite de contato ou outras dermatoses eczematosas e reações de hipersensibilidade do tipo tardio; fito e fotodermatites; dermatite seborreica, dermatite herpetiforme, líquen plano, líquen esclerose e atrófico, piodermia gangrenosa, sarcoide cutâneo, lúpus eritematoso discoide, pênfigo, penfigoide, epidermólise bolhosa, urticá- ria, angioedema, vasculites, eritemas tóxicos, eosinofilias cutâneas, alopecia areata, calvície de padrão masculino, síndrome de Sweet, síndrome de We- ber-Christian, eritema multiforme; celulite, tanto infecciosa como não infecciosa; paniculite; linfomas cutâneos, câncer de pele não melanoma e outras lesões displásicas; distúrbios induzidos por fármaco incluindo erupções fixas medicamentosas;

5. olhos: blefarite; conjuntivite, incluindo conjuntivite alérgica perene e vernal; irite; uveíte anterior e posterior; coroidite; distúrbios autoimu- nes, degenerativos ou inflamatórios afetando a retina; oftalmite incluindo of- talmite simpática; sarcoidose; infecções incluindo virais, fúngicas e bacteria- nas;

6. trato gastrointestinal: glossite, gengivite, periodontite; esofagi- te, incluindo de refluxo; gastroenterite eosinofílica, mastocitose, doença de Crohn, colite incluindo colite ulcerativa, proctite, prurido anal; doença celíaca, síndrome do intestino irritável e alergias alimentares, cujos efeitos são distantes do intestino (por exemplo, enxaqueca, rinite ou eczema);

7. abdominais: hepatite, incluindo autoimune, alcoólica e viral; fibrose e cirrose hepática; colecistite; pancreatite, tanto aguda como crônica; 8. genitourinário: nefrite incluindo intersticial e glomerulonefrite; síndrome nefrótica; cistite incluindo cistite aguda e crônica (intersticial) e úlcera de Hunner; uretrite, prostatite, epididimite, ooforite e salpingite agudas e crônicas; vulvovaginite; doença de Peyronie; disfunção erétil (tanto masculina como feminina);

9. rejeição ao aloenxerto: aguda ou crônica após, por exemplo, o transplante de rim, coração, fígado, pulmão, medula óssea, pele ou córnea ou após transfusão de sangue; ou doença do enxerto contra hospedeiro crônica;

10. sistema nervoso central: doença de Alzheimer e outras doenças que levam à demência, incluindo CJD e nvCJD; amiloidose; esclerose múltipla e outras síndromes desmielinizantes; aterosclerose cerebral e vas- culite; arterite temporal; miastenia grave; dor aguda e crônica (aguda, intermitente ou persistente, seja de origem central ou de periférica) incluindo dor visceral, cefaleia, enxaqueca, neuralgia do trigêmeo, dor facial atípica, dor articular ou óssea, dor decorrente do câncer e da invasão tumoral, síndromes da dor neuropática incluindo neuropatias diabéticas, pós-herpéticas e associadas ao HIV; neurosarcoidose; complicações do sistema nervoso central e periférico de processos malignos, infecciosos ou autoimunes;

11. outros distúrbios autoimunes e alérgicos incluindo tiroidite de Hashimoto, doença de Graves, doença de Addison, diabetes mellitus, púrpura trombocitopênica idiopática, fascite eosinofílica, síndrome de hiper-lgE, síndrome antifosfolipídica;

12. outros distúrbios com componente inflamatório ou imunológi- co; incluindo síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), hanseníase, síndrome de Sezary e síndromes paraneoplásicas;

13. cardiovascular: aterosclerose, afetando a circulação corona- riana e a periférica; pericardite; miocardite, cardiomiopatias inflamatórias e autoimunes incluindo sarcoide miocárdico; lesões de isquemia e reperfusão; endocardite, valvulite e aortite incluindo de origem infecciosa (por exemplo sifilítica); vasculites; distúrbios das veias proximais e periféricas incluindo flebite e trombose, inclusive trombose venosa profunda e complicações de veias varicosas;

14. trato gastrointestinal: doença celíaca, proctite, gastroenterite eosinofílica, mastocitose, doença de Crohn, colite ulcerativa, colite microscópica, colite indeterminada, doença intestinal inflamatória, síndrome do intestino irritável, diarreia não inflamatória, alergias alimentares, cujos efeitos são distantes do intestino, por exemplo, enxaqueca, rinite e eczema.

De acordo com um quarto aspecto da invenção, é provido um composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou uma composição de acordo com o segundo aspecto da invenção para uso como medicamento.

De acordo com um quinto aspecto da invenção, é provido o uso de um composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou de uma composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento de uma doença ou distúrbio. A referida doença ou distúrbio e o indivíduo sendo definidos em certas concretizações preferidas conforme descritos acima em referência ao terceiro aspecto da invenção.

De preferência, os produtos, os métodos da invenção destinam- se ao tratamento de doenças e distúrbios em humanos.

Aspectos Teraqnósticos da Invenção

A invenção abrange, em várias concretizações, métodos de tratamento, uso de compostos ou de composições da invenção para a fabricação de um medicamento e compostos ou composições da invenção para uso terapêutico.

De acordo com certas concretizações, a invenção pode abranger também: a) Métodos para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio, conforme declarado acima, em que a doença ou o distúrbio é câncer em uma pessoa e em que uma amostra do câncer suspeito do indivíduo tenha sido previamente coletada (por exemplo, por biopsia de tecido ou líquido corporal, como sangue ou escarro) e determinada exibir níveis elevados de expressão e/ou atividade de Gadd45β e/ou níveis elevados de expressão e/ou atividade de NF-KB. b) Compostos ou composições da invenção para uso como medicamento para o tratamento de tecidos de um indivíduo de quem tenha sido previamente determinado exibir níveis elevados de expressão e/ou atividade de Gadd45β e/ou níveis elevados de expressão e/ou atividade de NF-KB. c) Uso de compostos ou composições da invenção para a fabri cação de um medicamento destinado ao tratamento de uma doença ou dis-túrbio que seja caracterizado pela expressão e/ou atividade aumentada a- normal de Gadd45β ou que seja caracterizado por ativação anormal da via do NF-KB e que sejam passíveis de tratamento pela indução de Morte Celular Programada pela inibição da atividade de Gadd45β, em que a doença ou distúrbio é câncer, em que as referidas células cancerosas tenham sido pre-viamente determinadas exibirem níveis elevados da expressão e/ou da ativi-dade de Gadd45β.

"Níveis elevados" podem significar elevados em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400%, pelo menos 500%, pelo menos 600%, pelo menos 700%, pelo menos 800%, pelo menos 900% ou pelo menos 1.000%, quando comparados aos níveis em tecido saudável de controle da mesma origem e, opcionalmente, obtido do mesmo indivíduo ou de um indivíduo saudável. Os níveis de ex-pressão e de atividade podem ser determinados por qualquer método conhecido no estado da técnica, incluindo RT-PCR, Southern blotting, Northern blotting, Western blotting, ELISA, radioimunoensaio, ensaio de quinases e outros ensaios de ligação, funcionais e/ou de expressão.

Este aspecto teragnóstico da invenção é primariamente ilustrado pelos resultados nas Figuras 12A e 12B. Os resultados mostrados neste relatório descritivo demonstram que, em um painel de 29 linhagens de células cancerosas de diferentes tecidos de origem, a sensibilidade das células cancerosas à morte induzida por Z-DTP correlaciona-se, em grau muito alto de significância estatística, com níveis de expressão de Gadd45β, conforme avaliados por ensaios de qRT-PCR. De fato, o gráfico de correlação de expressão de Gadd45β contra o percentual de sobrevida/proliferação celular após o tratamento com Z-DTP2 mostra que a significância da correlação entre o domínio dos 2 parâmetros é muito alta (p <0,01) (correlação de Pearson). Surpreendentemente, a única linhagem celular de mieloma múltiplo (do total de 9 linhagens celulares testadas de mieloma múltiplo) que é refratária à morte induzida por Z-/mDTP, bem como à morte celular induzida pelo si- lenciamento de Gadd45β mediado por sh-RNA (Figuras 16,17 e 18) é a linhagem de células RPMI-8226, que expressa os níveis mais baixos - quase indetectáveis - de Gadd45β (Figura 12A). Esses dados indicam que, caso a terapia à base de DTP seja introduzida na clínica, será possível predizer populações de pacientes que respondem à terapia mediante análise simples e de custo compensador por qRT-PCR. Por exemplo, uma célula primária de pacientes com mieloma múltiplo pode ser analisada quanto aos níveis de expressão de Gadd45β, e pacientes com altos níveis desta expressão podem ser considerados que se mais beneficiarão do tratamento com os compostos da invenção. Por conseguinte, um importante aspecto da invenção é o teragnóstico - ou seja, a aplicação de um ensaio clinicamente útil para predizer a resposta à terapia com DTPs em pacientes.

Este aspecto teragnóstico da invenção é reforçado também pela especificidade muito alta do alvo dos compostos da invenção em células para o complexo Gadd45β/MKK7. Isso indica que quanto mais altos os níveis de expressão do alvo (ou seja, Gadd45β) nas células, mais alta a probabilidade de que tais células dependerão de Gadd45β para sobrevida, consequentemente, quanto mais alta será a probabilidade de que tais células sejam sensíveis à morte induzida por Z-/mDTP. Esta alta especificidade de Z- ZmDTPs é demonstrada pelos achados de que: 1) em um grande painel de linhagens de células tumorais, há uma correlação estatística altamente significativa entre níveis de expressão de Gadd45β e sensibilidade das células cancerosas à morte induzida porZ-ZmDTP (Figura 12); 2) a regulação negativa mediada pelo sh-RNA-de Gadd45β induz rapidamente apoptose em linhagens de células cancerosas sensíveis ao Z-/mDTP, mas não em resistentes ao Z-/mDTP (Figuras 16,17,18), e a cinética da indução de apoptose pelos sh-RNAs específicos para Gadd45β nestas linhagens celulares é semelhante à observada com Z-/mDTPs (Figuras 7A, 8B e 8C); 3) a regulação negativa mediada por sh-RNA de MKK7 torna linhagens de células cancerosas sensíveis ao Z-/mDTP completamente resistentes à morte induzida por Z-/mDTP (Figuras 20A, 20B e 20C); 4) o alvo terapêutico da invenção é a interface entre as duas proteínas, Gadd45β e MKK7 (Figura 21 A, 21B, 21C e 21 D) - o que fornece ainda potencial para alta seletividade de alvo, uma vantagem fundamental da solução da invenção sobre as terapias existentes. Estes dados, juntamente com a baixa toxicidade de Z-/mDTPs contra células normais e os achados de que a ablação por knockout (desabilitação) de Gadd45β é bem tolerada em camundongos (consultar a referência por Papa, et al. (2008) J. Clin. Invest. 118:191-1923) indicam que o direcionamento a funções distintas pró-sobrevida de NF-KB em sobrevida celular por intermédio da inibição de Gadd45β/MKK7 mediada por Z-/mDTP pode proporcionar uma terapia mais específica, menos tóxica e, por conseguinte, mais eficaz do que terapia direcionadas à via do NF-KB e/ou o proteassoma.

Exemplos

Os exemplos não limitantes a seguir ilustram a invenção. Exemplo 1 - Síntese de Z-DTP2

A título de exemplo, a síntese de Z-DTP2 é relatada. Z-DTP2 compreende um núcleo tetrapeptídico formado por D-tirosina, D-glutamina, D-arginina, D-fenilalanina com benziloxicarbonila (ou seja, grupo Z) ligada ao N-terminal por meio de uma ligação amida, e um grupo amino ligado ao C- terminal por meio de uma ligação amida. Materiais e métodos

Z-DTP2 foi preparado manualmente seguindo o método de fase sólida Fmoc/tBu (Fields G.B. and Noble R.L. 1990 Int J Pept Protein Res; 35:161-214; Bodansky, M. andBodansky A. 1995. The practice of peptide synthesis, 2nd ed., Springer Verlag, Berlin) e partindo de 500 μmoles (1000 mg) de resina Rink amida poliestireno (Fmoc-RINK-AM-resin, GL Biochem, Shangai, China, n- de cat. 49001), com substituição de 0,50 mmoles/g. A resina foi colocada em um vaso de propileno de 30 ml_, equipado com septo de teflon de 20 μm, uma tampa superior de polipropileno e uma tampa inferior luer-lock de polipropileno. A resina foi expandida com 10,0 ml_ de uma mistura 50:50 de diclorometano (DCM):dimetil formamida (DMF) (ambos da LabScan, Stillorgan, Irlanda; DCM n2 de cat. H6508L; DMF n2 de cat. H33H1IX) durante 20 minutos. Em seguida, depois da retirada do solvente sob vácuo, o grupo Fmoc foi clivado por tratamento com 5,0 ml_ de uma mis- tura 8: de DMF-Piperidina (Piperidina, Pip, ne de cat. 80641; Sigma-Aldrich, Milão, Itália) durante 20 minutos à temperatura ambiente (RT). O reagente foi retirado sob vácuo, e a resina foi lavada 3 vezes com 5,0 ml_ de DMF. Depois, 2,5 mmoles, 0,97 g de Fmoc-D-Phe-OH (GL Biochem, Shangai, ref. de cat. 35702) foram dissolvidos em 5,0 ml_ de DMF (conc. Final: 0,55 M) e ativados com 5,0 ml_ de uma solução 0,5 M de hexafluorfosfato de benzotri- azol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfônio (PyBOP, Novabiochem, n2 de cat. 01-62- 0016) em DCM, e 0,90 mL de di-iso-propiletilamina (5,0 mmoles; DIEA, Sig- ma-Aldrich, n2 de cat. D-3887). A solução de aminoácido ativado foi despejada sobre a resina e deixada em agitação vigorosa por 30 minutos. A solução foi escoada sob vácuo, e a resina foi lavada 3 vezes com 5,0 mL de DMF. O grupo Fmoc no a-NH2 foi retirado, conforme descrito anteriormente, utilizando uma solução 8:2 de DMF-Pip (5,0 mL) por 20 minutos e lavagem intensa com 5,0 mL de DMF (3 vezes). Uma solução de Fmoc-D-Arg(Pbf)- OH (2,5 mmoles, 1,6 g em 5,0 mL DMF; GL Biochem, Shangai, n2 de cat. 36404) foi ativada, como descrito, utilizando 2,5 mmoles de PyBOP e 5,0 mmoles de DIEA puro. A solução foi transferida para a resina e deixada sob agitação por 30 minutos. Depois da divagem dos grupos Fmoc com 5,0 mL de uma solução 8:2 de DMF-Pip e lavagem com DMF (3 vezes, 5,0 mL), uma solução de Fmoc-(D)-Glu(tBu)-OH, 0,50 M, em DMF (2,5 mmoles, 1,1 g em 5,0 mL de DMF; GL Biochem, Shangai, n2 de cat. 36605), ativada previamente com PyBOP e DIEA como descrito acima, foi adicionada à resina e a reação foi permitida prosseguir por 30 minutos à temperatura ambiente. Depois de escoar o aminoácido, o grupo Fmoc foi retirado como descrito acima (tratamento de 20 minutos com 8:2 DMF:Pip, 5,0 mL) e a resina foi lavada 3 vezes com 5,0 mL de DMF. 2,5 mmoles de Fmoc-(D)-Tyr(tBu)-OH (1,2 g, GL Biochem, Shangai, n2 de cat. 36906), dissolvidos em 5,0 mL de DMF e ati-vados previamente com PyBOP e DIEA como relatado acima, foram transferidos para a resina e deixados sob agitação por 45 minutos. A solução de aminoácido foi retirada por escoamento a vácuo, em seguida, a resina foi lavada 5 vezes com 5,0 mL de DMF. 5 mmoles de Z-OSu (benziloxicarbonil- N-hidróxi-succinimida, GL Biochem, Shangai, n2de cat. 10502) foram dissol vidos em 10 mL de DMF e adicionados à resina. 2,4 ml_ de DIEA foram adicionados, e a reação foi deixada sob agitação durante a noite. Depois que a solução foi escorrida, a resina foi intensamente lavada com DMF, DCM, álcool metílico (MeOH, LabScan, n2 de cat. C2517) e éter etílico (Et2O, LabS- can, n2 de cat. A3509E) e seca sob vácuo e pesada. O peso foi de 1,1 g. A fim de clivar o peptídeo, a resina foi tratada com 10,0 mL de uma mistura composta por TFA-H2O-TIS 90:5:5 (v/v/v) (TFA, ácido trifluoracético, Sigma- Aldrich, Itália, n2 de cat. 91700; TIS, tri-iso-propilsilano, Sigma-Aldrich, n2 de cat. 23,378-1) por 3 horas à RT. A resina foi retirada por filtração, em seguida, 20 mL de Et2O frio foram adicionados à solução de ácido trifluoracético, levando à formação de um precipitado branco. Depois da retirada dos solventes por centrifugação, o precipitado foi lavado com 10,0 mL de Et2O frio, dissolvido em 10,0 mL de H2O/CH3CN 50:50 (v/v) e liofilizado. O peptídeo foi caracterizado por LC-MS, utilizando uma coluna C18 ONYX de orifício estreito com 50 x 2 mm ID (Phenomenex, Torrance, CA, EUA), equilibrada a 600 μl_/min com CH3CN 5%, TFA 0,05%. A análise foi realizada aplicando gradiente de CH3CN, TFA 0,05%, de 5% a 70% durante 3 minutos. O peptídeo foi purificado por RP-HPLC semipreparativa, utilizando coluna C18 ONIX de 10 x 1 cm (Phenomenex, Torrance, CA, EUA), equilibrada a 20 mL/min, injetando 20 mg em cada corrida. Um gradiente de 5% a 65% durante 8 minutos foi aplicado para eluir o peptídeo. Frações puras foram agrupadas e caracterizadas por LC-MS. O MW determinado do Peptídeo A foi 746,8 amu (teórico: 746,83 amu), e o produto era mais de 95% puro (HPLC). Foi obtido rendimento em torno de 60% após a purificação de todo produto bruto.

Exemplo 2 - Inibição dependente da dose da interação entre Gadd45β e MKK7 com uma seleção de compostos da Fórmula Geral (I)

A fim de avaliar as propriedades inibitórias de peptídeos, ensaios ELISA foram realizados. Nestes ensaios, uma proteína de fusão, formada por glutationa S-transferase (GST) e proteína quinase quinase 7 ativada por mitógeno (MKK7), foi revestida sobre cavidades de uma placa de 96 cavidades, enquanto hGadd45β biotinilada foi utilizada em solução. hGadd45β foi biotinilada usando um kit EZ Link NHS-LC-biotin (Pierce, Rockford, IL), de acordo com Tomatore et al. (Tornatore L., et at. (2008). J Mol B/ol;378:97-l 11).

Materiais e métodos

Primeiramente, a associação entre Gadd45β e MKK7 foi investigada por ensaios ELISA, também conforme relatado em Tornatore et al. (Tornatore L., et al. (2008). J Mol B/o/;378:97-l 11). A quinase complete fundida à GST foi revestida durante 16 h a 4°C e a uma concentração de 42 nM em tampão A (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCI 150 mM, DTT 1 mM e EDTA 1 mM) nas cavidades de uma placa de microtitulação de 96 cavidades. Algumas cavidades foram preenchidas somente com tampão e foram utilizadas como brancos. Depois da incubação por 16 h a 4°C, as soluções foram retiradas, e as cavidades foram preenchidas com 350 pL de solução de NFDM 1% (m/v) (Leite seco desnatado) em PBS (solução salina com tampão fosfato). A placa foi incubada por 1 hora a 37°C no escuro. Depois de lavagem com tampão T-PBS (PBS com detergente Tween 0,004% (v/v), as cavidades foram preenchidas com 100 μL de hGadd45β biotinilada a concentrações variando de 8,4 nM a 168 nM. Cada ponto de dados foi realizado em triplicata. Depois da incubação por 1 hora no escuro a 37°C, as soluções foram retiradas e as cavidades foram novamente lavadas com T-PBS. Depois, 100 pL de estrep- tavidina conjugada à peroxidase de rábano em diluição de 1:10.000 em tampão foram adicionados a cada cavidade e a placa foi incubada por 1 hora a 37°C no escuro. Depois da retirada da solução enzimática e lavagem, 100 pL do substrato cromogênico o-fenilenodiamina (0,4 mg/mL em tampão de fosfato de sódio-citrato 50 mM, contendo 0,4 mg/mL de ureia em peróxido de hidrogênio) foram adicionados, e foi permitido que a cor desenvolvesse no escuro por 5 min. A reação foi interrompida pela adição de 50 pL de H2SO4 2,5 M. A absorbância a 490 nm foi medida em todas as cavidades, e foi calculada a média dos valores depois de serem subtraídos os brancos correspondentes. Proteína ligada foi detectada como descrito acima. A concentra-ção molar de Gadd45β biotinilada à qual a metade do sinal máximo de ELISA é detectada corresponde à constante de dissociação (KD) (Friguet B, Chaffotte AF, Djavadi-Ohaniance L, Goldberg ME. J Immunol Methods. 1985 Mar 18;77(2):305-19). Ensaios de competição por ligação foram realizados revestindo GST-MKK7 a 42 nM como descrito, hGadd45β biotinilada a uma concentração de 21 nM (condições pré-saturação: razão 1:0,5 mol/mol) e, em um primeiro teste, utilizando competidores a 21 nM. A ligação de hGadd45β biotinilada a GST-MKK7 foi analisada na presença de quantidades crescentes de peptídeo competidor (concentrações variando de 0,01 nM a 100 nM), e os valores obtidos com o competidor foram expressos como o percentual da ligação detectado na ausência de competidor. Os dados de atividade, expressos em percentual de capacidade inibidora a 21 nM sob as condições do ensaio, são relatados na Tabela I abaixo para um conjunto selecionado de compostos de acordo com a invenção. De acordo com a convenção adotada na tabela, "L-Xaa" e "D-Xaa" referem-se às formas L e D do aminoácido Xaa. Dados de IC5o de compostos selecionados (ou seja, a dose do composto necessária para obter 50% de redução da ligação de Gadd45β a MKK7) são relatados na Figura 3C.

Exemplo 3 - Isolamento de tetrapeptídeos líderes Materiais e métodos

Rastreamento por ELISA foi utilizado para identificar D- tetrapeptídeos líderes, a partir dos quais compostos preferidos da invenção pudessem ser derivados. Uma biblioteca combinatória simplificada de peptídeos (Marasco et al. 2008, Curr. Protein Pept. Sei. 9:447-67) foi rastreada para antagonistas da interação Gadd45β/MKK7. Esta biblioteca continha no total 124 = 20.736 diferentes tetrapeptídeos formados por combinações dos seguintes resíduos de aminoácidos: Gin (Q), Ser (S), Arg (R), Ala (A), Tyr (Y), Pro (P), Met (M), Cys (C), Phe (F), Leu (L), His (H), Asp (D), e foi iterativamente deconvoluída em quatro etapas por ensaios ELISA de competição, utilizado em cada etapa MKK7 revestida (42 nM), hGadd45β-biotina solúvel (21 nM) e cada uma das 12 sub-bibliotecas (42 nM). Os resultados deste rastreamento são mostrados na Tabela I acima (em que códigos padrão de uma única letra de aminoácidos são utilizados e X2, X3 e X4 representam misturas dos 12 resíduos fornecidos acima) (consultar também a Figura 3A).

O peptídeo resultante mais ativo descrito na Tabela I (ou seja, Fmoc-(βAla)2- YDHF-NH2, designado também Fmoc-LTP1) foi então submetido a diversas rodadas de otimização e a retirada da etiqueta Fmoc-(βAla)2, produzindo Ac- LTP1 e Ac-LTP2 (consultar a Tabela II). Estes tetrapeptídeos foram então sintetizados novamente, utilizando D-isômeros dos mesmos aminoácidos, rendendo no final o tetrapeptídeo 1 e 2 líderes (DTP1 e DTP2), os quais rompem a interação Gadd45β/MKK7 com IC50s de 0,22 nM e 0,19 nM, res-pectivamente (Figura 3C). Sequência de DTP1: Acetil-(D-Tyr)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Phe)-NH2 [SEQ ID NO.: 38] Sequência de DTP2: Acetil-(D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Phe)-NH2 [SEQ ID NO.: 37] Além disso, as sequências seguintes foram selecionadas como controle negativo (NC): Sequência de NCI: Acetil-(D-Tyr)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Gln)- NH2[SEQ ID NO.: 81] Sequência de NC2: Acetil-(L-Tyr)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Ala)-NH2 [SEQ ID NO.: 82] Sequência de NC3: Acetil-(L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Trp)-NH2 [SEQ ID NO.: 83] Sequência de NC4: Acetil-(L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Trp)- NH2 [SEQ ID NO.: 84]

As Figuras 3A, 3B e 3C mostram os ensaios ELISA de competição. O percentual de inibição de peptídeos acetilados e/ou o de peptídeos modificados (ou seja, peptídeos conjugados a grupos acetila ou a outros) são mostrados respectivamente nas Tabelas II e III (as quais usam códigos de uma única letra de aminoácidos).

Exemplo 4 - Ensaios de imunossupressão Materiais e métodos

Células de rim embrionário humano (HEK-293) foi cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro bovino fetal 10% (FCS), penicilina 100 unidades/mL, estreptomicina 100 mg/mL e glutamina 1%. As células HEK-293 (2,2 x 106) foram semeadas sobre lâminas de cultura de tecido de 10 cm2 e, no dia seguinte, foram trans- fectadas com os plasmídeos pcDNA-FLAG-MKK7 e pcDNA-HA-Gadd45β, utilizando uma técnica padrão de precipitação com Ca3(P04)2 (Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153). Quarenta e oito horas depois da transfec- ção, as células foram lavadas uma vez com PBS e, então, ressuspensas e incubadas por 30 minutos a 4°C em tampão de lise (HEPES 20 mM, NaCI 350 mM, glicerol 20%, MgCI2 1 mM, EGTA 0,2 mM, DTT 1 mM, Na3V04 1 mM e NaF 50 mM), suplementado com inibidores da protease (fluoreto de fenil-metil-sulfonila 1 mM, quimostatina 10 μM, aprotinina 2 μg/mL e leupep- tina 2 pg/mL) com leve agitação ocasional. As células lisadas foram coletadas e depois centrifugadas a 45.000 x g por 40 minutos. As células lisadas liberadas resultantes foram utilizadas para análise posterior.

Os tetrapeptídeos DTP1 e DTP2 líderes, isolados no Exemplo 3, juntamente com os tetrapeptídeos de controle negativo (NCI, NC2, NC3 e NC4), foram incubados ao mesmo tempo com Gadd45β/MKK7 a fim de determinar que os D-tetrapeptídeos ativos, mas não os tetrapeptídeos de controle negativo, rompiam a interação de Gadd45β/MKK7. As imunoprecipita- ções foram realizadas utilizando essencialmente as mesmas condições descritas em Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153 e as e referências nele contidas, e um anticorpo anti-FLAG que precipitou MKK7 unido à etiqueta FLAG. Western blots foram desenvolvidos utilizando anticorpo anti- MKK7 ou anticorpo anti-HA (ligando-se a HA-hGadd45β), como indicado na Figura 5 (painel inferior e superior, respectivamente). Resultados

Os resultados são apresentados na Figura 5. Pode ser visto a partir das manchas de Western blotting apresentados na Figura 5 que havia forte interação entre Gadd45β e MKK7 quando a co-imunoprecipitação era realizada com lisados de células HEK-293 expressando transitoriamente HA- Gadd45β e FLAG-MKK7 e um anticorpo anti-FLAG (ligando-se especificamente a MKK7 unido à etiqueta FLAG). Este resultado foi obtido quando co- imunoprecipitações foram realizadas na ausência de tetrapeptídeos ou na presença dos D-tetrapeptídeos de controle negativo (NO) NCI, NC2, NC2 ou NC4. Quando as co-imunoprecipitações foram realizadas na presença de DTP 1 ou DTP2 a 1 ou 5 nM, contudo, o complexo não contendo ou contendo muito pouco Gadd45β precipitou, indicando que a interação entre MKK7 e Gadd45β havia sido rompida pelos compostos DTP ativos, levando com isso a uma redução de Gadd45β nos co-imunoprecipitados. Esses dados confirmam e ampliam o resultado observado nos ensaios ELISA de competição mostrados nas Figuras 3A, 3B e 3C e na Figura 4.

Exemplo 5 - Estabilidade de DTPs em soro humano Materiais e métodos

Na Figura 4, ensaios ELISA de competição da ligação Gadd45β/MKK7 foram realizados para determinar a estabilidade de D- tetrapeptídeos conjugados ao Z no soro humano. Para tanto, as atividades dos antagonistas mais ativos de Gadd45β/MKK7, selecionados a partir do rastreamento da biblioteca combinatória descrita no Exemplo 3 (ou seja, Z- LTP1, Z-LTP2, Z-DTP1 e Z-DTP2), bem como um L-tetrapapetídeo (ou seja, Z-LNC) de controle negativo e o D-enantiômero correspondente (ou seja, Z- DNC), foram comparadas antes e depois de incubação prévia de 48 horas com soro humano a 37°C em ensaios ELISA de competição. O ensaio ELISA foi realizado como descrito na Figura 3 C. Resumidamente, 100 μL de 42 nM de GST-MKK7 recombinante em tampão ELISA (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCI 150 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM) foram revestidas em cavidades de placas de 96 cavidades por incubação durante a noite a 4°C. Depois do bloqueio com NFDM 2% por 1 hora a 37°C, as placas foram lavadas com TPBS e, em seguida, 21 nM de (h)Gadd45β humana recombinante biotinilada foram adicionados às cavidades junto com concentrações crescentes dos tetrapeptídeos que haviam sido submetidos ou não à incubação prévia com soro humano, como indicado. Para discussão adicional sobre as condições utilizadas para o ensaio ELISA de competição, remete-se o leitor para o texto de Tornatore et al 2008 JMB, 378: 97-111 e as e referências nele contidas. Resultados A Figura 3C mostra que as atividades de DTP 1 e de DTP2 são comparáveis às de seus L-enantiômeros correspondentes (ou seja, LTP1 e LTP2, respectivamente) em inibir a formação do complexo Gadd45β/MMK7, como mostrado por comparação das IC50s de DTPs e de LTPs em ensaios ELISA de competição. A Figura 4 mostra que não ocorre perda da atividade após incubação por 48 horas de Z-DTP1 ou Z-DTP2 com soro humano a 37°C. De fato, os dados mostram que, após esta incubação prévia, Z-DTPs, mas não Z-LTPs retêm completamente sua habilidade para romper a interação Gadd45β-MKK7 em ensaios ELISA de competição. A comparação das IC50S dos tetrapeptídeos após incubação prévia com soro e depois de nenhuma incubação prévia com soro permite observar que Z-DTP1 e Z-DTP2 estão completamente estáveis após a incubação prévia com soro (IC50 = 0,19 nM, para Z-DTP1, e IC50 = 0,18 nM para Z-DTP2), enquanto que Z- LTP1 e Z-LTP2 não o estão, uma vez que os últimos tetrapeptídeos mostram perda significativa de atividade após a incubação prévia com soro (consultar suas IC50s >10 μM). Em todas as concentrações testadas, as atividades inibitórias D-tetrapeptídeos que haviam sido previamente incubados com soro eram indistinguíveis nestes ensaios daquelas dos D-tetrapeptídeos que não haviam sido submetidos a esta incubação prévia (Figuras 3C e 4).

A comparação dos padrões dependentes da dose mostrada nas Figuras 3C e 4 indica que Z-DTP1 e Z-DTP2 estão estáveis em soro humano a 37°C e, desse modo, são adequados para uso sistêmico, enquanto que Z- LTP1 e Z-LTP2 não o são Pode ser visto também que tetrapeptídeos de controle negativo (por exemplo, Z-DNC e Z-LNC) carecem de qualquer atividade nos ensaios ELISA de competição, independentemente de terem sido ou não incubados previamente com soro humano (Figuras 3C e 4). Os dados retratados nas Figuras 3C e 4 mostram também que a adição no N-terminal de um grupo benziloxicarbonila (Z) (no lugar do grupo acetila) não compromete a habilidade de DTP1 e DTP2 ou de LTP1 e LTP2 de inibir a formação do complexo Gadd45β/MKK7 - embora a adição de um grupo Z aumente acentuadamente a captação celular de DTPs (dados não mostrados), portanto, aumente acentuadamente a atividade celular DTP em ensaios de morte de tumor (consultar as Figuras 7A e 7B).

Exemplo 6 - Determinação das ICgpS de Z-DTPs em um painel de linhagens celulares de mieloma múltiplo Materiais e métodos

A fim de examinar os efeitos do tratamento com D-tetrapetídeo sobre a sobrevida/proliferação de linhagens celulares de mieloma múltiplo, as células de 8 linhagens celulares de mieloma múltiplo (das 9 linhagens celulares testadas de mieloma múltiplo) que eram sensíveis à morte induzida por Z-DTP (ou seja, células U266, KMS-.11, NC1-H929, ARH-77, JJN-3, KMS-12, KMS-18, KMS-27; consultar também as Figuras 8A, 8B, 8C e 12) foram tratadas com concentrações crescentes (variando de 0,01 a 10 pM) de Z-DTP 1 ou Z-DTP2 durante 24, 72 ou 144 horas, como mostrado na Tabela IV. As culturas de células de mieloma múltiplo e os tratamentos com Z-DTPs foram realizados como descrito no Exemplo 8 (consultar abaixo). Os efeitos de Z-DTPs sobre a sobrevida/proliferação de células de mieloma foram avaliados pelo uso de ensaios de incorporação de [3H]timidina, realizados como descrito também no Exemplo 8. A taxa de proliferação celular, medida com cada uma das concentrações utilizadas de Z-DTPs e com as culturas não tratadas (ou seja, culturas incubadas apenas com o meio), foi expressa em contagens por minuto (c.p.m.) - as quais se correlacionam diretamente com a extensão da proliferação celular. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. As concentrações medias de Z-DTP1 e Z-DTP2, bem como de seus derivados (por exemplo, mDTP3), que resultaram em 50% de inibição da proliferação celular (ou seja, IC50) em relação à proliferação celular registrada com as culturas não tratadas foram então determinadas. As IC50s de Z- DTP1 e Z-DTP2 calculadas para as 8 linhagens de células sensíveis de mieloma múltiplo, testadas nos tempos mostrados (ou seja, Dia 1, 3 e 6) são relatadas na Tabela IV. As IC5oS destes dois compostos, bem como as de 31 compostos adicionais (inclusive as de derivados de Z-DTP2 como mDTP3), calculadas em células KMS-11 e/ou KMS-12 de mieloma múltiplo no Dia 1, 3 e 6 são relatadas na Tabela V.

Como pode ser visto na Tabela IV, Z-DTP1 e Z-DTP2 diminuíram acentuadamente a captação de [3H]-TdR em todas as linhagens célula- res testadas de mieloma múltiplo em maneira dose-dependente (exceto para a linhagem de células RPMI-8226, que exibiram níveis muito baixos de Gadd45β; discutido mais detalhadamente abaixo; consultar a Figura 12) (consultar também a Figuras 8A, 8B, 8C e 12). Resultados semelhantes foram obtidos nestas linhagens celulares de mieloma múltiplo quando as IC5oS de Z-DTP1 e Z-DTP2 foram calculadas utilizando ensaios de exclusão com azul de Trypan (medindo a viabilidade celular) (dados não mostrados). Resultados

Como mostrado na Tabela IV, todas as linhagens celulares testadas de mieloma múltiplo exibiram alta sensibilidade à inibição da sobrevi- da/proliferação celular produzida pelo Z-DTP (consultar também as Figuras 8A, 8B, 8C e 12). Como pode ser visto também na Tabela IV, contudo, estas linhagens celulares exibiram sensibilidade variável ao Z-DTP1 e Z-DTP2. De fato, algumas linhagens celulares já eram altamente sensíveis à inibição da sobrevida/proliferação celular produzida por Z-DTP depois de um tratamento de 24 horas com estes compostos (por exemplo, consultar a IC50 = 1,3 pM para células KMS-12 e a ICso = 2,88 μM para células KMS-11 de Z-DTP2 em 24 horas), e todas estas eram altamente sensíveis ao Z-DTP 1 e Z-DTP2 a- pós o tratamento por 144 horas, com IC50s variando de 10,1 nM a 4.9 pM, para Z-DTP1, e de 10 nM a 4,5 pM para Z-DTP2 neste momento (Tabela IV). De nota, o derivado de Z-DTP2, mDTP3 (composto 17), foi testado em linhagens de células KMS-11 e KMS-12 e mostrou melhor atividade celular nestas linhagens celulares, quando comparado ao Z-DTP1 e Z-DTP2, com IC50s de 16 nM e 25 nM, respectivamente, no Dia 6, em comparação às IC50s de Z-DTP1 (ou seja, 316 nM e 10,1 nM, respectivamente) e de Z-DTP2 (ou seja, 66 nM e 10 nM, respectivamente) (consultar a Tabela V) (consultar também as Figuras 20A, 20B e 20C). Por conseguinte, os DTPs ativos, mas não Z-DNCs de controle negative, possuem forte atividade citotóxica na maioria das linhagens celulares de mieloma múltiplo. Além do mais, os derivados mais recentes dos inventores (por exemplo, mDTP3) retêm alta potência in vitro, mas mostram atividade celular melhorada em células de mieloma múltiplo, com MW substancialmente reduzido (-500 versus >700), por tanto, eficiências aumentada de ligantes (consultar a Tabela V) (consultar também a Figura 13).

Exemplo 7 - Restauração por tetrapeptídeos da atividade catalítica de MKK7 inibida por Gadd45β

Materiais e métodos Na Figura 6, a transfecção transitória de pcDNA-FLAG-MKK7 em células HEK-293 foi realizada utilizando o método de precipitação com Ca3(P04)2, essencialmente como descrito em Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153 e referências nele contidas. 36 horas após a transfecção, as células foram tratadas com 100 ng/ml de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), 100 ng/ml, e ionomicina 1 μM durante 30 minutos a 37°C. Extratos das células foram preparados como descrito no Exemplo 4 e utilizados para imunoprecipitação com anticorpos anti-FLAG (ligando-se a FLAG-MKK7), como descrito em Papa, S et al, (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153 e referências nele contidas. Resumidamente, 50 μg de lisado celular obtido de células HEK-293 tratadas ou não com PMA-ionomicina (P/l), expressando transitoriamente FLAG-MKK7, foram incubados com 10 μL de anti-FLAG M2 Affinity Gel (SIGMA) por 4 horas a 4°C durante rotação. Os imunoprecipitados foram então lavados 3 vezes em tampão de lise e duas vezes mais em tampão quinase (HEPES 10 mM, MgCI2 5 mM, MnCI2 1 mM, β-glicerofosfato 12,5 M, DTT 2 mM, NaF 4 mM e Na3V04 0,1 mM). A atividade catalítica de MKK7 foi finalmente medida em ensaios de quinase, incubando imunoprecipitados de FLAG-MKK7 a 30°C por 20 minutos com 20 μL de tampão quinase, contendo 2 μM de GST-JNK1 recombinante e 5 μCi de [y-32P]ATP) (reação com quinase), como descrito em Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153 e referências nele contidas.

Em algumas reações, para testar a habilidade de antagonistas D-tetrapeptídicos para romper a interação Gadd45β-MKK7 e, desse modo, liberar a atividade catalítica de MKK7 da inibição produzida por Gadd45β, os imunoprecipitados de FLAG-MKK7 foram 1) primeiramente, incubados previamente por 10 minutos a 30°C com 1 nM ou 5 nM de DTP 1, DTP2 ou dos D-tetrapeptídeos de controle negativo (NO), NCI, NC2, NC3 e NC4, e 2) em seguida incubados por mais 10 minutos a 30°C com ou sem 5 μM de uma proteína de fusão de GST de (h)Gadd45β humana recombinante (GST- hGadd45β; purificada a partir de lisados bacterianos como descrito em Papa, S., (2007)7. Biol. Chem. 282,19029-19041), antes de serem usados para a reação com quinase descrita acima, como indicado na Figura 6.

Em todos os casos, as reações com quinase foram finalizadas pela adição de tampão de amostra Laemmli. As proteínas foram então resolvidas por SDS-PAGE 10%, e a atividade quinase de MKK7 revelada por au- torradiografia. Para discussão adicional sobre as condições de ensaios de quinase de MKK7, remete-se o leitor para o texto de Papa, S et al., (2007) J. Biol. Chem. 282, 19029-19041 e Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146- 153 e as referências neles contidas. Resultados

Os resultados são mostrados na Figura 6, em que a intensidade de uma banda corresponde ao grau medido de atividade quinase de MKK, uma vez que esta intensidade é proporcional à quantidade de (y-32P]ATP) incorporada por MKK7 em seu substrato, GST-JNK1. Como pode ser visto a partir das Figuras 3C, 4 e 5, a incubação com DTP1 ou DTP2 rompeu efetiva e especificamente a interação de Gadd45β com MKK7 e, como consequência, como pode ser visto a partir da Figura 6, restaurou totalmente a atividade catalítica de MKK7, ao passo que a incubação com os tetrapeptídeos de controle negativo (NC) NCI, NC2, NC3 ou NC4 não o fez (Figura 6, painéis superiores). Pode ser visto também a partir da Figura 6 que nem os tetrapeptídeos de controle, NCI, NC2, NC3 e NC4, nem os tetrapeptídeos ativos, DTP1 e DTP2, produziram inibição da atividade catalítica de MKK7 quando incubados com MKK7 na ausência de GST-hGadd45β recombinante (Figura 6, painéis inferiores). Estes resultados são compatíveis com os mostrados nas Figuras 3C, 4 e 5, em que somente DTP 1 e DTP2, mas não NCI, NC2, NC3 ou NC4, foi capaz de romper a interação MKK7-Gadd45β em ensaios ELISA ou de co-imunoprecipitação.

Exemplo 8 - Morte específica de linhagens de células tumorais apresentando atividade constitutiva de NF-KB e/ou altos níveis de expressão de Gadd45β por tetrapeptídeos Materiais e métodos

Este exemplo investiga o uso de tetrapeptídeos de controle (ou seja, Z-DNC, Z-LNC e Ac-DNC) e tetrapeptídeos bioativos líderes in vitro (ou seja, Z-DTP1, Z-DTP2, Z-LTP2 e Ac-DTP2) para a morte de um grande painel de linhagens de células tumorais humanas e murinas de vários tecidos de origem. As linhagens de células tumorais testadas incluíram: U266, KMS- 11, NC1-H929, ARH-77, JJN-3, KMS-12, KMS-18, KMS-27, RPMI-8226; as linhagens de células LY-3 e SUDHL6 de linfoma difuso de grandes células B; as linhagens de células BJAB, ST486, RAJI, RAMOS, Namalwa e HS- SULTAN de linfoma de Burkitt; a linhagem de células U937 de leucemia pró- monocítica; as linhagens de células JURKAT, HUT-78, MT-2, MT-4, MOLT4, MT2-HTLV-I e CEM de leucemias e linfomas de células T; as linhagens de células MCF7, MD-MDA-231 e MD-MDA-486 de câncer de mama; as linhagens de células NALM-6 (humana) e 70Z/3 (camundongo) de linfoma de pré-células B; a linhagem de células K652 de leucemia mielogênica crônica; as linhagens de células KARPAS (humana) e A20 (camundongo) de linfoma de células B; a linhagem de células HEK-293T de rim embrionário humano. As linhagens de células tumorais foram cultivas como descrito previamente (Zazzeroni et al. 2003, Blood 102: 3270-3279) em meio RPMI-1640 (linhagens celulares de mieloma múltiplo, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, leucemia pró-monocítica, leucemia e linfoma de células T, linfoma de pré-células B, leucemia mielogênica crônica e linfoma de células B) ou DMEM (linhagem celulares de câncer de mama e de rim embrionário humano) suplementado com soro fetal bovino 10% (FBS), glutamina 1%, penicilina 100 U/mL e estroptomicina 100 μg/mL em atmosfera umidificada de CO2 5% a 37°C.

Para ensaios de inibição da proliferação (Figuras 7, 8 e 9) e ensaios de morte celular (Figura 10), as células foram semeadas em cavidades de placas de 96 cavidades a uma concentração de 1,0 x 104 células/mL (ensaios de proliferação) ou em cavidades de placas de 24 cavidades a uma concentração de 4 x 105 células/ml_ (ensaios de apoptose) e cultivadas por até 6 dias. Durante esse período, as células foram cultivadas em apenas meio (culturas sem tratamento) ou cultivadas em meio suplementado com tetrapeptídeos de controle (por exemplo, Z-DNC) ou com ativos (por exemplo, Z-DTP2) (culturas tratadas) para concentração final atingida dos tetrapeptídeos nas culturas de 10 μM ou 100 μM, conforme indicado. Para os ensaios de inibição de proliferação que visavam avaliar os efeitos dos tetrapeptídeos sobre sobrevida/proliferação de células tumorais, as culturas foram analisadas diariamente por exclusão com azul de Trypan (discriminando células vivas de mortas) e contagem celular (dados não mostrados) ou por ensaios de incorporação de [3H]timidina (Figuras 7A, 7B, 7C, 8A, 8B, 8C e 9), conforme indicado. Nestes últimos ensaios, os efeitos de Z-DTPs, Ac- DTPs e Z-LTPs sobre a sobrevida/proliferação de linhagens de células tumorais fora investigados medindo a síntese de DNA com ensaios padrão de captação de timidina tritiada ([3H]timidina; [3H]-TdR). Nas análises mostradas, as células foram incubadas por 24, 72, 120 ou 144 horas a 37°C na presença ou ausência de tetrapeptídeos de controle ou bioativos, conforme indicado, e então submetidas a uma incubação adicional por 18 horas com [3H]-TdR (0,037 MBq/cavidade, equivalentes a 0,5 pCi/cavidade). As células foram então coletadas subsequentemente e transferidas para mantas de fibra de vidro, utilizando um coletor automático de células de placas de 96 cavidades, após o qual, líquido de cintilação foi adicionado, e a incorporação de [3H]timidina foi medida por espectroscopia de cintilação em líquido em contador beta. Os resultados são expressos como os percentuais das contagens por minute (c.p.m.) (correlacionando-se diretamente com a extensão da proliferação celular), medidos em culturas tratadas com tetrapeptídeos em relação à c.p.m. medida em culturas correspondentes incubadas apenas com meio (células não tratadas). Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Conforme discutido mais detalhadamente a seguir, Z-DTP2, Z- LTP2 e Ac-DTP2 produziram resultados semelhantes aos de Z-DTP1, Z- LTP1 e Ac-DTPI, respectivamente, nestes ensaios de sobrevida/proliferação, embora Z-DTP2 tivesse exibido atividade ligeiramente mais alta do que Z-DTP1 (dados não mostrados; consultar também a Tabela IV).

A apoptose celular foi medida em culturas nos tempos indicados pelo uso de coloração nuclear com iodeto de propídio (PI) e citometria de fluxo (FC), realizados essencialmente como descritas previamente (Riccardi and Nicoletti (2006) Nature Protocols 1, - 1458 - 1461), visando identificar células com conteúdo de DNA sub-G1 (ou seja, células apoptóticas) (Figura 10). Para estes ensaios, as células (4 x 105 células/mL) foram cultivadas em placas de 24 cavidades por 72 ou 144 horas, conforme indicado na Figura 10, em seguida, lavadas duas vezes em 1X solução salina com tampão fosfato (PBS) e fixadas com etanol 70% gelado por 16 horas a -20°C, após o qual, foram submetidas à centrifugação e subsequentemente resuspensas em 1X PBS contendo 100ng/ml_ de RNAase A. Depois dessa etapa, as células foram incubadas à temperatura ambiente por 30 minutos e submetidas à centrifugação, em seguida, ressuspenas em 50 μg/mL de PI e incubadas por mais 45 minutos a 4°C no escuro. A citometria de fluxo (FC) foi finalmente realizada com sistema automático FACsCalibur, e os dados foram analisados com o software FlowJo.

A fim de determinar a base para a diferente sensibilidade de linhagens de células tumorais à morte induzida por Z-DTP, os níveis de expressão de Gadd45β foram medidos em um painel de 29 linhagens de células tumorais de diferentes tecidos de origem, utilizando a reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo reação (qRT-PCT) e correlacionando estes níveis com o grau de suscetibilidade destas linhagens celulares à ati-vidade citotóxica de Z-DTPs. Para estas análises, as quais são mostradas na Figura 12, as linhagens celulares de câncer de mama e HEK-293T foram cultivas em frascos de 75 cm2 (5 x 106 células/frasco) em meio DMEM completo, ao passo que todas as outras linhagens celulares foram cultivadas em cavidades de placas de 6 cavidades a 5 x 105 células/cavidade em meio RPMI-1640 completo, como descrito acima. RNA total foi extraído com Trizol e purificado utilizando o mini-kit PureLike RNA (Invitrogen). 1 μg de RNA foi adicionado como modelo para reações da transcriptase reversa (RT) realizadas utilizando o kit GeneAmp RNA PCR (Applied Biosystems). As qRT- PCRs foram realizadas com os cDNAs resultantes, em triplicata, utilizando a mistura SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), os iniciadores (iniciadores) específicos para Gadd45β listados na Tabela VII e máquina ABI7900 de PCR em tempo real. Valores Ct experimentais foram normalizados para β-actina, e a expressão relativa de mRNA calculada contra uma amostra de referência (ou seja, mRNA de células HEK-293T). A sensibilidade de linhagens de células cancerosas à morte induzida por Z-DTP foi anali-sada como descrito acima, realizando ensaios de incorporação de [3H]timidina após o tratamento das células com 10 pM de Z-DTP2 por 144 horas. Na Figura 12 é mostrado o gráfico de correlação de expressão de mRNA de Gadd45β contra o percentual de sobrevida celular após o tratamento com Z-DTP2. A significância do coeficiente de correlação entre o domínio dos 2 parâmetros foi calculada por correlação de Pearson, que quantifica a associação entre duas variáveis utilizando o software GraphPad.

A fim de determinar se a morte induzida por Z-DTP era resultante da indução da sinalização citotóxica de JNK, a ativação de JNK após o tratamento de duas linhagens representativas de células sensíveis de mieloma múltiplo (ou seja, as linhagens de células KMS11 e NCI-H929) com Z- DTP2 foi monitorada (Figura 11). Para tanto, foram utilizadas análises por Western Blotting para avaliação da fosforilação de JNK - um indicador de ativação de JNK. As linhagens de células KMS11 e NCI-H929 de mieloma múltiplo foram cultivadas em placas de 6 cavidades a 5 x 105 célu- las/cavidade em meio RPMI-1640 completo, como descrito acima, e tratadas com 10 pM de Z-DTP2 ou com o tetrapeptídeo de controle negativo, Z-DNC, por 3, 6, 12 ou 24 horas (Figura 11). Depois do tratamento com os tetrapeptídeos, lisados celulares foram preparados essencialmente conforme descrito no Exemplo 4, e ensaios por Western Blotting foram realizados utilizando um anticorpo anti-fosfo(P) específico para JNK. A metodologia utilizada para as análises por Western Blotting está descrita nas referências por De Smae- le, et al. (2001) Nature 414:306-313; Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153; Papa, et al. 2007 J. Biol. Chem. 282:19029-19041; Papa, et al. (2008) J. Clin. Invest. 118:191-1923. Os níveis de β-actina foram determinados com anticorpo específico contra β-actina e serviu como controle de car- ga (Figura 11). A estimulação de TNFα (2.000 U/mL) de células KMS11 e de NCI-H929 foi realizada por 5, 10 ou 30 minutos e utilizada como controle positivo para ativação de JNK (Figura 11). Estas análises revelaram que a ativação de JNK é causada somente pelo tratamento com Z-DTP2, mas não pelo tratamento com Z-DNC. Efeitos semelhantes de Z-DTP2 foram vistos sobre a ativação de MKK7 (dados não mostrados). De modo importante, como visto com a atividade biológica de Gadd45β (consultar referências: De Smaele, et al. (2001) Nature 414:306-313; Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153; Papa, et al. 2007 J. Biol. Chem. 282:19029-19041; Papa, et al. (2008) J. CUn. Invest. 118:191-1923), os efeitos de Z-DTP2 em células de mieloma múltiplo foram específicos para a via MKK7/JNK, uma vez que este composto não exibiu efeito sobre a ativação das vias IKK/NF-kB, ERK e p38 (dados não mostrados). Resultados

As Figuras 7A, 7B e 7C mostram que derivados protegidos por Z de DTP2 (Z-DTP2), mas não os derivados de acetila (Ac-DTP2) ou L- isômeros de Z-DTP2 (Z-LTP2), nem os tetrapeptídeos de controle negativo, Z-DNC, Ac-DNC e Z-LNC, inibem acentuadamente a proliferação de três linhagens celulares representativas de mieloma múltiplo das 8 linhagens de células suscetíveis testadas de mieloma múltiplo (ou seja, U266, KMS-11 e NCI-H929), da linhagem celular de linfoma de Burkitt, BJAB, e da linhagem celular de leucemia pró-monocítica, U937 (consultar também as Figuras 8 e 12 e a Tabela IV; linhagens adicionais de mieloma múltiplo). As células foram cultivadas com 10 μM de Z-DTP2 ou de Z-DNC (Figura 7A), Ac-DTP2 ou Ac-DNC (Figura 7B) e Z-LTP2 ou Z-LNC (Figura 7C), conforme indicado. A incorporação de [3H]-tTdR (medindo a síntese de DNA) de células tratadas foi medida e comparada à de células cultivadas somente com os meios. Os dados estão expressos como o percentual de c.p.m. observado com células tumorais após o tratamento com Z-DTP2, Ac-DTP2 ou Z-LTP2 (colunas escuras), ou com Z-DNC, Ac-DNC ou Z-LNC (colunas claras) em relação à c.p.m. medida com células cultivadas somente com o meio (células não tratadas). Foi observada inibição acentuada da proliferação celular em linha- gens celulares de mieloma múltiplo e de outros tumores, tratadas com Z- DTP2, mas não nas tratadas com Z-DNC. Na Figura 7B, a ausência de atividade tumoricida de Ac-DTP2 em linhagens celulares de mieloma múltiplo correlacionou-se com a baixa permeabilidade celular deste composto, conforme estabelecida em ensaios com CaCO2 (dados não mostrados). A viabilidade de linhagens celulares de mieloma múltiplo após o tratamento com outros derivados menos eficazes de DTP (destinados também a melhorar a captação celular de DTP), incluindo aqueles contendo grupo metila (Me), acetila (Ac), miristila (Myr), 3-metóxi,4-hidróxi-benzoíla, benzoíla, 6CI- benziloxicarbonila (6CI-Z) e/ou fluorenil-metilóxi-carbonila (Fmoc), não é mostrada. Embora a potência e a captação celular in vitro de Z-LTPs fossem comparáveis às de Z-DTPs (consultar a Figura 3C; dados também não mos-trados), Z-LTP2 exibiu baixa atividade em células de mieloma múltiplo (Figura 7C), devido à baixa estabilidade em líquidos biológicos (consultar a Figura 4). Foi observada inibição semelhante da proliferação celular nas linhagens de células tumorais tratadas com Z-DTP 1, mas não nas tratadas com Ac- DTP1 ou Z-LTP1 (dados não mostrados) - apesar de estes dois últimos compostos (como visto também para derivados de DTP2) terem exibido potência comparável ao Z-DTP1 in vitro (consultar as Figuras 3C e 4). Em conjunto, estes dados estabelecem a alta atividade citotóxica de Z-DTPs (Figura 7A e dados não mostrados), quando comparada à inatividade de Ac-DTPs (Figura 7B e dados não mostrados) e a baixa atividade de Z-LTPs (Figura 7C e dados não mostrados).

Nas Figuras 8A, 8B e 8C, foram examinados os efeitos do tratamento com D-tetrapeptídeos sobre a proliferação de um painel maior de linhagens celulares de mieloma múltiplo (ou seja, U266, KMS-11, JJN-3, NCI- H929, ARH-77, KMS-27, KMS-18, KMS-12 e RPMI-8226). Outras linhagens de células tumorais testadas incluem as linhagens celulares de linfoma difuso de grandes células B, LY-3 e SUDHL6, as linhagens celulares de linfoma de Burkitt, BJAB, ST486 e RAJI, e a linhagem celular de leucemia pró- monocítica, U937. As células foram tratadas com 10 μM de Z-DTP2, Z-DTP1 ou de Z-DNC, conforme mostrado, pelos tempos indicados (ou seja, 24, 72 ou 144 horas). A incorporação de [3H]timidina de células tratadas foi medida conforme na Figura 7 e comparada à de células cultivadas somente com meio. Os dados são expressos como percentual de c.p.m. observado com células tumorais tratadas com Z-DTP2 ou Z-DTP1 (colunas escuras), ou com Z-DNC (colunas vazias) em relação à c.p.m. medida com células não tratadas. A Figura 8A mostra que Z-DTP2, mas não Z-DNC, inib acentuadamente a sobrevida/proliferação de 8 das 9 linhagens celulares de mieloma múltiplo testadas (ou seja, U266, KMS-11, JJN-3 e NC1-H929, ARH-77, KMS-27, KMS-18, KMS-12), da linhagem celular de linfoma de Burkitt, BJAB, da linhagem celular de linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), LY-3, e da linhagem celular de leucemia pró-monocítica, U937 (consultar também a Figura 12). Notavelmente, Z-DTP2 exibiu atividade citotóxica somente na linhagem de células DLBCL do subtipo semelhante à célula B ativada (ABC) (ou seja, LY3), que depende do NF-KB para sobrevida, e não no subtipo de semelhante à célula B do centro germinativo (GCB) (ou seja, SUDHL6), que não manifesta ativação de NF-KB constitutivo (Ngo VN, et al. Nature 441(7089): 106-10; consultar também a Figura 12). Foi mostrada também potente atividade citotóxica de Z-DTPs na vasta maioria das múltiplas linhagens celulares testadas - todas as quais dependentes do NF-KB para sobrevida. Como mostrado nas Figuras 8B e 8C, os efeitos inibitórios de Z-DPT1 e Z-DTP2 sobre a proliferação de células tumorais aumentou com o tempo - a inibição máxima da proliferação foi observada após o tratamento com tetra- peptídeo por 144 horas, embora estes efeitos já fossem evidentes após o tratamento por 24 horas. Estes dados concordam com os obtidos por contagem de células em ensaios de exclusão azul de Trypan (dados não mostrados) e nos ensaios de coloração nuclear por PI para conteúdo de DNA (con-sultar a Figura 10; dados também não mostrados). Em conjunto, estes e outros dados mostram que a atividade citotóxica de Z-DTPs é seletiva para células tumorais exibindo atividade constitutiva de NF-KB (consultar também a Figura 12; dados também não mostrados).

A especificidade da atividade citotóxica de Z-DTPs foi corroborada ainda mais pelos ensaios de proliferação com [3H]timidina mostrados na Figura 9. Esta figura mostra a ausência de citotoxicidade induzida por Z- DTP2 em um painel de 22 linhagens de células tumorais resistentes após o tratamento por 144 horas, mesmo quando este composto foi utilizado em concentrações muito altas - ou seja, 100 μM. Os ensaios de proliferação com [3H]timidina mostrados na Figura 9 foram realizados como descritos na Figura 8.

Como mostrado na Figura 9, Z-DTP2 não exibiu citotoxicidade nas linhagens de células JURKAT, HUT-78, MT-2, MT-4, MOLT4, MT2- HTLV-I e CEM de leucemia e de linfoma de células T, nas linhagens de células BJAB, ST486, RAJI, RAMOS, Namalwa e HS-SULTAN de linfoma de Burkitt, nas linhagens de células MCF7, MD-MDA-231 e MD-MDA-486 de câncer de mama, nas linhagens de células NALM-6 e 70Z/3 de linfoma de pré-células B, nas linhagens de células KARPAS e A20 de linfoma de células B, na linhagem de células K652 de leucemia mielogênica crônica, na linhagem de células HEK-293T de rim embrionário humano e na linhagem de células RPMI-8226 de mieloma múltiplo (consultar também a Figura 12). Na Figura 9, são mostradas também as linhagens celulares sensíveis BJAB (linfoma de Burkitt), KMS-11 e KMS-12 (mieloma múltiplo). Notavelmente, houve forte correlação nestas linhagens celulares também entre sensibilidade à morte induzida por Z-DTP2 e níveis de expressão de Gadd45β (consultar a Figura 12). De nota, a linhagem de células RPMI-8226 - a única linhagem celular testada de mieloma múltiplo que foi resistente à morte induzida por Z- ZmDTP (Figuras 8A e 9) - exibiu níveis muito baixos de Gadd45β (consultar a Figura 12), confirmando adicionalmente que a atividade citotóxica de DTPs no câncer depende dos níveis de expressão constitutiva de Gadd45β.

Na Figura 10, os painéis incorporados mostram o percentual de células exibindo coloração pelo iodeto de propídio (PI), indicativa de quantidade de DNA de sub-G1 (ou seja, células que estão mortas ou morrendo por apoptose), após o tratamento pelos tempos indicados (ou seja, 72 ou 144 horas) com meio de cultura somente (não tratadas) ou meio de cultura liberando concentração final de 10 μM de Z-DTP2 ou Z-NC1. Os percentuais de células apoptóticas estão retratados nos histogramas. São mostradas cinco linhagens de células sensíveis representativas de mieloma múltiplo, NCI- H929, KMS-11, ARH-77, JJN-3 e U266. Como pode ser visto, a morte induzida por Z-DTP2 de células de mieloma múltiplo é causada pelo desencadeamento de apoptose, e a parte de células apoptóticas vistas após a exposição celular a este composto aumenta com o tempo de tratamento.

A Figura 11 mostra que o tratamento com Z-DTP2 causa forte a- tivação de JNK em linhagens celulares de mieloma múltiplo. As duas linhagens de células sensíveis representativas de mieloma múltiplo, KMS11 e NCI-H929, foram tratadas com 10 μM de Z-DTP2 ou Z-DNC, conforme mostrado. A ativação de JNK foi monitorada nos tempos indicados por Western Blotting, utilizando um anticorpo anti-fosfo(P) específico para JNK. Pode ser visto que a fosforilação de JNK (um marcador de ativação de JNK) aumenta somente após o tratamento com Z-DTP2, mas não após o tratamento com o peptídeo de controle protegido por Z (Z-DNC). De fato, Z-DTP2 causou uma ativação ainda mais forte de JNK do que a estimulação de TNFa o fez (2.000 U/mL) - o controle positivo utilizado. Efeitos semelhantes de Z-DTP2 foram vistos sobre a ativação de MKK7 e usando ensaios com quinase para monitorar as atividades de JNK e de MKK7 (dados não mostrados). Notavelmente, tal como visto com a atividade biológica de Gadd45β (consultar as refe-rências: De Smaele, et al. (2001) Nature 414:306-313; Papa, S et al. (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153; Papa, et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:19029- 19041; Papa, et al. (2008) J. Clin. Invest. 118:191-1923), os efeitos de Z- DTP2, bem como de Z-DTP1 e mDTP3 (dados não mostrados), em células de mieloma múltiplo foram específicos para a via MKK7/JNK, uma vez que não foram observados efeitos com estes compostos sobre as vias IKK/NF- kB, ERK e p38 (dados não mostrados). De modo importante, o tratamento com Z-DTPs não conseguiu ativar JNK na linhagem de células RPMI-8226 de mieloma múltiplo, que é resistente à morte induzida por Z-DTP (consultar as Figuras 8A e 9). Estes e outros dados (consultar também a Figura 20) apoiam a visão de que Z-DTPs induzem apoptose em linhagens de células tumorais ao ativarem a sinalização citotóxica de JNK.

De modo decisivo, os dados apresentados nas Figuras 12A e 12B mostram que a sensibilidade de linhagens de células cancerosas à morte induzida por Z-DTP correlaciona-se em grau muito alto de significância estatística com níveis de expressão endógena de Gadd45β (p <0,01). A expressão do mRNA de Gadd45β foi avaliada em um painel de 29 linhagens de células cancerosas, utilizando ensaios de qRT-PCR (Figura 12A, painel superior, colunas vermelhas). Os valores foram normalizados para β-actina. A viabilidade/proliferação nas mesmas linhagens de células cancerosas foi determinada por ensaios de incorporação de [3H]timidina realizados após o tratamento com 10 μM de Z-DTP2 por 144 horas. Estes resultados são mostrados no painel inferior da Figura 12 A (colunas escuras). Os valores relatados representam o percentual de c.p.m., medida com células tratadas com Z-DTP2 em relação à c.p.m. medida com células sem tratamento. A Figura 12B mostra o gráfico de correlação da expressão de Gadd45β contra o percentual de sobrevida/proliferação celular observado após o tratamento com Z-DTP2 do mesmo experimento mostrado na Figura 12A. Como pode ser visto, a significância do coeficiente de correlação entre o domínio dos 2 parâmetros é muito alta (p <0,01) (correlação de Pearson, que quantifica a associação entre duas variáveis, calculada com o software GraphPad). Esta é uma questão fundamental para o desenvolvimento de uma terapia bem sucedida no homem. Estes dados demonstram a alta especificidade do alvo celular dos Z-DTPs para Gadd45β. Em apoio adicional a esta conclusão, o silenciamento de Gadd45β, mediado por sh-RNA, induz apoptose em células de mieloma múltiplo, a passo que o silenciamento de MKK7 MKK7, mediado por sh-RNA, torna estas células completamente resistentes à morte induzida por Z-DTP (consultar as Figuras 16,17,18 e 20). Em conjunto, estes dados mostram também que, caso a terapia à base de DTP seja introduzida na clínica, será possível predizer populações de pacientes com resposta à terapia mediante análise simples e de custo compensador por qRT-PCR. Dessa forma, segue-se que células primárias de pacientes com mieloma múltiplo podem ser analisadas quanto a níveis de expressão de Gadd45β, e pacientes com altos níveis desta expressão podem ser considerados aqueles que se beneficiarão mais do tratamento com os compostos da invenção. Por conseguinte, um importante aspecto da invenção é um aspecto teragnóstico - ou seja, a aplicação de um ensaio clinicamente útil para predizer a resposta à terapia com DTPs em pacientes.

Exemplo 9 - ICgpS in vitro e em células de um painel de derivados de Z-DTPs

Os inventores desenvolveram um plano intensivo de otimização visando obter uma nova terapia segura para tratar o câncer e outras doenças e distúrbios, utilizando os líderes atuais como pontos de partida. Z-DTP2 já demonstra alta estabilidade, alta solubilidade, atividade em intervalo sub- nM in vitro e boa atividade em células de mieloma múltiplo (linhagens primárias e celulares) e em outras células cancerosas, com alta especificidade do sem toxicidade em células normais (consultar as Figuras 3C, 4, 8, 9,12,14 e 15; consultar também a Tabela IV; dados não mostrados). Este composto exib também excelentes perfis iniciais DMPK e de segurança in vivo (dose única i.v. em bolus em camundongos) (consultar as Tabelas VIII e IX). Os presentes inventores aplicaram o desenho molecular racional para produzir derivados de DTP com propriedades ADMET melhoradas, ao mesmo tempo em que retendo alta bioatividade (Geeson MP. 2008 J Med Chem. 51:817- 834). Nessa abordagem, os presentes inventores modificaram o tamanho (MW), a lipofilicidade (LogP) e o estado de ionização (carga molecular) - as principais propriedades de volume de moléculas que influenciam as propriedades ADMET - utilizando o modelo de farmacóforos dos presentes inventores para preservar elementos estruturais responsáveis pela bioatividade in vitro (consultar a Figura 13). Como descrito neste Exemplo, os derivados mais recentes (por exemplo, mDTP3 e mDTP4) retêm alta potência in vitro, mas mostram atividade melhorada de morte em células de mieloma múltiplo, com MW substancialmente reduzido (~500 versus >700), portanto, com eficiências aumentadas de ligantes (Figura 13). Foram aplicados também meios para melhorar a atividade celular dos peptídeos e os valores PK, incluindo ciclização, adição de grupos de bloqueio para internalizar amidas vulneráveis e/ou substituição com ligações diferentes de amida. Materiais e métodos 33 compostos foram desenhados com base nas sequências dos tetrapeptídeos líderes: Tyr-Glu-Arg-Phe e Tyr-Asp-His-Phe, derivados a partir do rastreamento da biblioteca (consultar a Figura 3). Todos os compostos - exceto os compostos 2, 3, 4, 5, 6, 7,10, 11, 12, 13, 14, 15 e 16 (consultar a Tabela V) - foram preparados por um método em fase sólida seguindo a química clássica de Fmoc/tBu (como descrito na referência por Fields GB, Noble RL. Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenilmetoxi-carbonil amino acids. Int J Pept Protein Res 1990;35:161-214). Somente aminoácidos na configuração D foram utilizados para montar os peptídeos mostrados na Tabela V. A acetilação em N-terminal foi realizada por tratamento com ani- drido acético 10% em dimetilformamida (DMF), contendo DIE A 5% (di- isopropil-etilamina). Quando necessário, o grupo Z foi introduzido por tratamento em resina com Z-OSu (Benziloxicarbonil-N-hidróxi-succinimida) 0,5 M em DMF/DIEA 5%. Os compostos foram clivados da resina com TFA (ácido trifluoracético) e tratamento com scavengers, em seguida, foram purificados até homogeneidade por (RP)-PLC preparativa em fase reversa. A síntese dos compostos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e 16 (Tabela V) foi terceirizada. A identidade e a pureza do composto foram avaliadas utilizando análises por LC-MS e RMN. X-i era ácido benzoico, X2 era ácido benzílico, Yi era anilina, Y2 era benzilamina e Y3 era fenetilamina. Os compostos foram todos dissolvidos em DMSO na concentração de estoque de 5 mM, e alíquotas foram então diluídas em série em tampão para obter as concentrações indicadas para os ensaios ELISA de competição. As proteínas foram preparadas como relatado em Tornatore L., et al. (2008). J Mol Biol; 378:97-111.

Os ensaios ELISA de competição por ligação foram realizados como relatado na referência por Tornatore L., et al. (2008). J Mol Biol; 378:97-111 (consultar também os Métodos descritos nos Exemplos 2 e 3), utilizando peptídeos em concentrações crescentes, variando entre 0,01 nM e 10 nM. Resumidamente, GST-MKK7 foi imobilizada a 42 nM em cavidades de placas de microtitulação de 96 cavidades. Compostos competindo foram incubados previamente com biotina-hGadd45β (21 nM) e então incubados com a quinase revestida. Para cada composto, a IC50 in vitro foi calculada como a concentração resultando em 50% de redução da ligação de Gadd45β a MKK7, em relação à ligação observada na ausência de competidores.

Os presentes inventores investigaram os efeitos de cada composto sobre a viabilidade/proliferação dos derivados de DTP nas duas linhagens de células sensíveis representativas de mieloma múltiplo, KMS12 e KMS-11. Ensaios de incorporação de [3H]timidina em linhagens de células KMS11 e KMS12 de mieloma múltiplo foram realizados como descrito nos Exemplos 6 e 8 (Figuras 7A, 7B, 7C, 8A, 8B e 8C e Tabela IV). Resumidamente, células em placas de 96 cavidades foram cultivadas e tratadas sepa-radamente com o composto indicado em cavidades das placas de 96 cavidades, utilizando concentrações crescentes do composto, variando entre 0,1 nM e 10 μM. Culturas celulares e tratamentos com os compostos foram também realizados conforme descrito nas Figuras 7A, 7B, 7C, 8A, 8B e 8C e Tabela TV. A captação de [3H]timidina, que mede a viabilidade/proliferação celular, foi determinada após o tratamento com os compostos por 1, 3 ou 6 dias como indicado. Nestes tempos, as IC50S de cada composto foram calculadas como descrito no Exemplo 6, determinando a concentração que resulta em 50% de inibição de sobrevida/proliferação celular, em relação à sobrevida/proliferação observada com células sem tratamento.

As IC50s in vitro (ELISA) e em células (células KMS-11 e KMS- 12) dos 33 compostos descritos neste Exemplo estão relatadas na Tabela V. Resultados A Tabela V mostra os valores de IC50 in vitro e em células de um painel de tetra e tripeptídeos desenhados com base nas sequências de consenso, Tyr-Glu-Arg-Phe e Tyr-Asp-His-Phe, derivadas a partir do rastrea- mento da biblioteca e química levando à otimização.

Estes compostos foram rastreados in vitro utilizando um ensaio ELISA de competição, em que o deslocamento da ligação de biotina- Gadd45β para GST-MKK7 foi determinado por testes das atividades dos compostos a diferentes concentrações. IC50s in vivo para um grupo de compostos selecionados foram determinadas utilizando ensaios de incorporação de [3H]timidina em células KMS-11 e KMS-12 de mieloma para avaliar as atividades tumoricidas dos compostos. IC50s dos compostos indicados em células foram determinadas após o tratamento por 1, 3 ou 6 dias. Z indica um grupo Z benziloxicarbonila. Como pode ser visto na Tabela V, os compostos mais ativos em células foram o composto 9, indicado como Z-DTP2 (IC50 = 10 nM em células KMS-11; IC50 = 66 nM em KMS-12) e o composto 17, indicado como mDTP3 (IC50 = 25 nM em células KMS-11; ICso = 16 nM em KMS-12).

Os 33 compostos descritos neste Exemplo foram todos rastrea- dos in vitro, em ensaios ELISA de competição, quanto à habilidade exibida para romper a interação Gadd45β/MKK7 (Tabela V). A maioria destes compostos - exceto os compostos 18, 20, 21, 22, 32 e 33 - foi rastreada também em células, utilizando ensaios de incorporação de [3H]timidina em linhagens de células KMS-11 e/ou KMS-12 de mieloma múltiplo, e suas IC50s nestas células determinas no Dia 1, 3 e 6. Conforme pode ser visto na Tabela V, os compostos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 15 e 17 foram testados nas duas linhagens celulares. Os compostos 15 e 19 foram somente testados em células KMS-12. Os compostos 10, 11, 12, 13, 14, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 e 31 foram somente testados na linhagem de células KMS-11. Os compostos 18, 20, 21, 22, 32 e 33 não foram testados em células pela atividade relativamente baixa exibida in vitro.

A Tabela V mostra que as IC50S in vitro dos compostos testados variaram entre 100 pM (consultar o composto 7, X2-Asp-His-Y3; o composto 15, X2-GIu-Arg-Y1; e o composto 19, Z-Tyr-Arg-Phe) e > 10 nM (consultar os compostos 24, 27, 30, 31, 32 e 33). Conforme pode ser visto, as atividades dos compostos existentes in vitro se refletiram frequentemente nas suas atividades em células, embora alguns dos compostos ativos in vitro apresentassem atividade relativamente baixa em células, possivelmente em decor-rência da sua pouca captação celular, por exemplo, comparar o composto 15 (com IC50 in vitro = 100 pM e IC50 = 263 nM em células KMS-11) ao composto 9 (Z-DTP2; com IC50 in vitro = 190 pM e IC50 = 10 nM em células KMS- 11). Os dados em células mostram também que a presença de um grupo Z no N-terminal e/ou de cadeias laterais básicas resultou em atividade mais alta em células, graças à captação celular aumentada. Para exemplo da importância da cadeia lateral básica, comparar a IC50 em células do composto 19 (Z-Tyr-Arg-Phe-NH2; IC50 = 81 nM em células KMS-12 no Dia 3) à do composto 8 (Z-Tyr-Asp-Phe-NH2; IC50 > 10 μM em células KMS-11 no Dia 3) (ou seja, troca de Arg para Asp), ou à do composto 16 (Z-Tyr-Glu-Phe-NH2; IC50 = 3,0 μM em células KMS-11 no Dia 3) (ou seja, troca de Arg para Glu); notar também as baixas IC50s comparáveis in vitro destes três compostos - todas as quais no intervalo sub-nM range (Tabela V). Para exemplo da importância do grupo Z, comparar as IC50s em células U266, KMS-11 e NCI- H929 de Z-DTP2 (Figura 7A) às de Ac-DTP2 (Figura 7B); consultar também as IC50s semelhantes in vitro destes dois compostos (Figuras 3C e 4; dados não mostrados). Os dados mostram também que compostos sem anéis a- romáticos nas duas extremidades (por exemplo, os compostos 20 e 21) são inativos in vitro e em células (Tabela V), indicando que tais anéis aromáticos são altamente necessários para a bioatividade. Curiosamente, a presença de 2 tirosinas no N-terminal resultou também na perda de atividade (Tabela V).

Exemplo 10 - ICsoS in vitro de um painel de derivados adicionais de Z-DTPs

Material e métodos Um painel de 18 compostos adicionais foi desenhado com base na sequência tripeptídica líder, Tyr-Arg-Phe (ou seja, mDTP3), visando investigar a importância para a bioatividade de: 1) a distância entre os dois anéis aromáticos; 2) as propriedades do aminoácido na posição central; 3) a ocorrência do grupo acetila no N-terminal; 4) e a presença de substituintes dos anéis aromáticos (consultar a Tabela VI). Todos os compostos foram preparados por um método em fase sólida seguindo a química clássica de Fmoc/tBu (como descrito na referência por Fields GB, Noble RL. Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenilmetoxi-carbonil amino acids. Int J Pept Protein Res 1990;35:161-214). A acetilação em N-terminal foi realizada por tratamento com anidrido acético 10% em dimetilformamida (DMF), contendo DIEA 5% (di-isopropil-etilamina). Os compostos foram clivados da resina com TFA (ácido trifluoracético) e tratamento com scavengers, em seguida foram purificados até a homogeneidade por (RP)-PLC preparativa em fase reversa. A identidade e a pureza do compostos foram avaliadas por análises 5 de LC-MS e RMN. Os compostos foram purificados utilizando RP-HPLC, em seguida todos foram dissolvidos em DMSO à concentração de estoque de 5 mM e armazenados até que fossem utilizados. Alíquotas foram então diluídas em série em tampão para obter as concentrações indicadas nos ensaios ELISA de competição. Os ensaios ELISA de competição por ligação foram 10 realizados como relatado na referência por Tornatore L., et al. (2008). J Mol Biol; 378:97-111 (consultar também os Métodos nos Exemplos 2 e 3), utilizando os peptídeos em concentrações crescentes, variando entre 0,01 nM e 10 nM. Resumidamente, GST-MKK7 foi imobilizada a 42 nM em cavidades de placas de microtitulação de 96 cavidades. Compostos competindo foram 15 incubados previamente com biotina-hGadd45β (21 nM) e então incubados com a quinase revestida. Para cada composto, a IC50 in vitro foi calculada com a concentração que resulta em 50% de redução de ligação de Gadd45β a MKK7, em relação à ligação observada na ausência de competidores. Resultados

A Tabela VI mostra os valores de IC50 de um painel de 18 tripep- tídeos e dipeptídeos desenhados com base em mDTP3 (Ac-D-Tyr-D-Arg-D- Phe). Os compostos foram desenhados para investigar a influência sobre a bioatividade dos seguintes parâmetros: 1) a distância entre os dois anéis aromáticos no N e no C-terminal (consultar os compostos Al, Al bis, A3, A6, A7 e A8); 2) as propriedades do aminoácido na posição central (consultar os compostos B2, B13, B16, B16 bis, 05 e 05 bis); 3) a presença ou ausência de um grupo hidroxila no anel aromático dos resíduos nas posições 1 e 3 (consultar os compostos A9, 01, 03, 05, 05 bis, 06, 07 e 08); a ocorrência de um grupo acetila no N-terminal (consultar os compostos A9 e 07; B16 e B16 bis; 01 e 08; 03 e 06; 05 e 05 bis).

Os 18 compostos adicionais foram testados quanto à atividade in vitro com ensaios ELISA de competição e concentrações crescentes dos compostos, variando de 0,01 nM a 100 nM. Como pode ser visto na Tabela VI, Todos os dipeptídeos testados eram inativos, independentemente da o- corrência de um aminoácido Phe ou Tyr no N-terminal ou no C-terminal (consultar os compostos A1, A1 bis, A7 e A8). A introdução de espaçadores 5 maiores do que um alfa-aminoácido na posição central dos tripeptídeos re sultou também em perda de atividade in vitro (consultar os compostos A3 e A6, contendo β-alanina e ácido ε-caproico na posição do meio, respectivamente). Isso não foi verdadeiro para tetrapeptídeos nos quais as posições Y2 e Y3 epam ocupadas por Asp/Glu ou His/Arg - comparar as IC5oS in vitro do 10 composto 9 (ou seja, Z-DTP2) às do composto 16 (ou seja, mDTP2) e às do composto 1 (ou seja, Z-DTP1) às do composto 8 (ou seja, Z-Tyr-Asp-Phe- NH2). ISSO porque Z-DPT2 e Z-DTP1, os quais contêm um aminoácido extra entre os dois grupos aromáticos ativos, retiveram alta potência in vitro (con- sultar as IC50s na Tabela V). Notavelmente, como mostrado na Tabela VI, a 15 retirada do grupo hidroxila na tirosina do N-terminal resultou também na per da completa da bioatividade in vitro (consultar os compostos A9, 01, 05, 05 bis, 07 e 08), independentemente da presença de um grupo acetila. Significativamente, essa observação aponta para uma importante contribuição do grupo hidroxila para a interação dos compostos ativos com as proteínas al- vo.

De fato, este grupo está possivelmente envolvido na formação de uma ligação com H ou interação polar. Por outro lado, a ocorrência de um grupo hidroxila no anel aromático no C-terminal não afetou a atividade dos compostos (consultar os compostos A9, 01, 03, 05, 05 bis, 06, 07 e 08). Do mesmo modo, substituir arginina por outro aminoácido básico, como histidina ou lisina, ou por prolina não alterou a bioatividade in vitro (consultar os compostos B2, B13, B16, B16 bis, 05 e 05 bis), sugerindo função mínima para a cadeia lateral deste resíduo na habilidade dos compostos para romper a interação Gadd45β/MKK7.

Exemplo 11 - Infecções por lentivírus estabelecendo a função 30 essencial de Gadd45β na sobrevida de células de mieloma múltiplo Material e métodos

A fim de determinar a função de Gadd45β e de MKK7 na sobre- vida de linhagens celulares de mieloma múltiplo, os presentes inventores investigaram os efeitos da regulação negativa da expressão de Gadd45β ou de MKK7 nestas células (consultar as Figuras 16A, 16B, 16C, 17A, 17B, 18A, 18B, 18C, 19A, 19B e 19C). Para tanto, foi efetuada a infecção com lentivírus expressando sh-RNAs direcionados a Gadd45β e MKK7, o que resultou no silenciamento dos genes de Gadd45β e de MKK7, respectivamente. As sequências de DNA codificadoras do small hairpin (sh)-RNAs direcionados estão listadas na Tabela VII. As sequências dos sh-RNA direcionados (ou seja, sh-Gadd45β-1, sh-Gadd45β-2, sh-Gadd45β-3, sh-MKK7-1 e sh-MKK7-2) e as sequências específicas de controle, sh-NS-1 e sh-NS-2, foram introduzidas entre os sítios de restrição BamHI e Hpal do vetor lentivi- ral, LentiLox3.7 (consultar a referência por Yang et al., 2006 PNAS 103, 10397-10402). O preparado lentiviral de alto título em células HEK-293T foi produzido utilizando essencialmente as mesmas condições descritas nas referências por Pham et al. 2004 Cell 116, 529-542 e por Yang et al. 2006 PNAS 103, 10397-10402. Para a introdução das sequências de sh-RNAs direcionadas a Gadd45β e MKK7 e das sequências de sh-RNAs não específicos de controle, as cinco linhagens celulares de mieloma múltiplo, sensíveis ao Z-DTP, ARH-77, NCI-H929, U266, KMS11 e KMS12, e a linhagem celular de mieloma múltiplo resistente ao Z-DTP, RPMI-8226, foram infectadas com os lentivírus LentiLox3.7, como relatado em protocolos publicados essencialmente como descrito na referência por Yang et al. 2006 PNAS 103, 10397- 10402. 5 dias depois da infecção, células de mieloma múltiplo eGFPD foram separadas utilizando um separador celular BD FACSAria™ II, então deixadas em repouso por 2 dias antes que fossem iniciadas as análises de sobre- vida e de proliferação celular. A viabilidade das células infectadas de mieloma múltiplo foi monitorada durante um período de 8 dias por citometria de fluxo - medindo a expressão de proteínas verde fluorescente intensificada (eGFP) (marcando células infectadas) - e contagem de células (Figuras 16A, 16B, 16C, 17A, 17B). Apoptose (Figuras 18A, 18B e 18C) e distribuição do ciclo celular (Figuras 19A, 19B e 19C) foram medidas por ensaios de coloração nuclear por PI que foram realizados como descrito em Riccardi C. and Nicoletti I 2006 Nature Protocols 1, 1458 -1461 (consultar também os Métodos descritos no Exemplo 8). Resultados

As Figuras 16A, 16B e 16C mostram que o silenciamento da expressão de Gadd45β mediado por sh-RNA resulta na rápida indução de morte celular, levando à proliferação reduzida, nas linhagens celulares de mieloma múltiplo, representativas de sensíveis ao Z-DTP, ARH-77 (Figuras 16A) e NCI-H929 (Figuras 16B), mas não na linhagem celular de mieloma múltiplo resistente ao Z-DTP, RPMI-8226 (Figuras 16C). No experimento mostrado nas Figuras 16A, 16B e 16C, linhagens celulares de mieloma múltiplo foram infectadas com lentivírus expressando sh-RNAs específicos para Gadd45β (sh-Gadd45β-1, sh-Gadd45β-2 ou sh-Gadd45β-3), sh-RNAs específicos para MKK7 (sh-MKK7-1 ou sh-MKK7-2) ou sh-RNAs não específicos (sh-NS-1 ou sh-NS-2), e a viabilidade das células infectadas foi monitorada durante um período de 8 dias por citometria de fluxo - revelando células expressando proteína verde fluorescente intensificada (eGFP), ou seja, células infectadas - e contagem celular. É mostrado o percentual de sobrevida de células eGFP+ (ou seja, infectadas por lentivírus) de mieloma múltiplo nos tempos indicados, em relação à viabilidade de células eGFP+de mieloma múltiplo na mesma cultura no Dia 0. As células foram infectadas com lentivírus pLenti- Lox.3.7 expressando os sh-RNAs e eGFP indicados, utilizando métodos padrão (como relatados em Yang H et al., Proc Natl Acad Sei USA. 2006 Jul 5; 103(27): 10397-402). 5 dias mais tarde, as células eGFP+ foram separadas com separador celular BD FACSAria™ II, em seguida, deixadas em repouso por 2 dias antes que as análises de viabilidade celular iniciassem. Este momento (ou seja, o início das análises de viabilidade) é indicado nas Figuras 16A, 16B e 16C como Dia 0. Os dados mostram que a inibição da expressão de Gadd45β, mas não a inibição da expressão de MKK7, causa rapidamente morte celular em linhagens celulares de mieloma múltiplo que são sensíveis à toxicidade induzida por Z-DTP (ou seja, as linhagens de células ARH-77 e NCI-H929) (Figuras 16A e 16B, respectivamente), mas não a linhagem de células RPMI-8226 de mieloma múltiplo (Figuras 16C), que é resistente a esta toxicidade. Estes dados estabelecem adicionalmente a especificidade de alvo de Z-DTPs para o complexo Gadd45β/MKK7 em células de mieloma múltiplo (consultar também as Figuras 7, 8, 9 e 12; ensaios de morte e de qRT-PCR). De fato, concordando ainda com essa conclusão, a cinética da inibição da proliferação de células de mieloma múltiplo observada depois do silenciamento de Gadd45β foi muito semelhante à observada depois do tratamento destas células com Z-DTPs (consultar as Figuras 7A, 8B e 80). Os dados demonstram também a função essencial que Gadd45β desempenha na sobrevida de células de mieloma múltiplo, validando, dessa forma, ainda mais a Gadd45β como alvo terapêutico no mieloma múltiplo.

As Figuras 17A e 17B mostram que o silenciamento de Gadd45β, mediado por sh-RNA, mas não o de MKK7, somente possui atividade inibitória potente sobre a sobrevida/proliferação de linhagens celulares de mieloma múltiplo que são sensíveis à morte induzida por Z-DTPs (por exemplo, as linhagens de células ARH-77 e NCI-H929; consultar também as Figuras 7 e 8, sensibilidade à morte induzida por Z-DTP). Em contraste marcante, a viabilidade da linhagem celular de mieloma múltiplo resistente ao Z- DTP, RPMI-8226, foi completamente não afetada pela inibição de Gadd45β mediada por sh-RNA. A proliferação/sobrevida celular nas Figuras 17A e 17B foram determinadas pelo uso de ensaios de incorporação de [3H]timidina, realizados como descritos nos Exemplos 6 e 8. A Figura 17A mostra a viabilidade de três linhagens celulares representativas de mieloma múltiplo, RPMI-8226, NCI-H929 e ARH-77, depois do silenciamento de Gadd45β ou MKK7. A Figura 17B mostra a viabilidade/proliferação da linhagem celular de mieloma múltiplo, ARH-77, depois do silenciamento de Gadd45β ou MKK7 utilizando três diferentes sh-RNA específicos para Gadd45β (sh-Gadd45β-1, sh-Gadd45β-2 ou sh-Gadd45β-3), dois diferentes sh-RNA específicos para MKK7 (sh-MKK7-1 ou sh-MKK7-2) e dois diferentes sh-RNAs não específicos (sh-NS-1 ou sh-NS-2). Linhagens celulares de mieloma múltiplo foram infectadas com os lentivírus pLentiLox.3.7 indicados expressando os sh-RNAs, depois células eGFP+ de mieloma múltiplo (ou seja, células infectadas com lentivírus) foram separadas com um separador celular BD FACSAria™ II como na Figura 16. Os ensaios de incorporação de [3H]timidina retratados nas Figuras 17A e 17B foram realizados 10 dias depois da separação das células, correspondendo ao Dia 8 na Figura 16. É mostrado o percentual de incorporação de [3H]timidina (ou seja, c.p.m.), uma medida de proliferação celular, no Dia 8 (ou seja, 10 dias depois da separação das células) em relação à incorporação de [3H]timidina ocorrida nas mesmas células no Dia 0 (ou seja, 2 dias depois da separação das células). Estes dados estabelecem ainda mais a especificidade de alvo de Z-DTPs para o complexo Gadd45β/MKK7 em células de mieloma múltiplo (consultar também as Figuras 7,8, 9,12 e 16) e confirmam a função essencial que Gadd45β desempenha na sobrevida de células de mieloma múltiplo. Em conjunto, validam ainda a Gadd45β como alvo terapêutico no mieloma múltiplo.

As Figuras 18A, 18B e 18C mostram que o silenciamento de Gadd45β mediado por sh-RNA induz efetivamente apoptose nas linhagens celulares de mieloma múltiplo sensíveis ao Z-DTP, ARH-77 (Figura 18A) e NCI-H929 (Figura 18B), mas não na linhagem celular de mieloma múltiplo resistente ao Z-DTP, RPMI-8226 (Figura 18C) (consultar também as Figuras 16 e 17, sh-silenciamento mediado por RNA; Figuras 7, 8 e 12, sensibilidade de linhagem celular de mieloma múltiplo à morte induzida por Z-DTP e níveis de expressão de Gadd45β). A indução de apoptose nas Figuras 18A, 18B e 18C foi determinada pelo uso de ensaios de coloração nuclear por PI, realizados como descrito no Exemplo 8. Estes dados demonstram que a inibição da sobrevida/proliferação de células de mieloma múltiplo, causada pela regulação negativa da expressão de Gadd45β observada nas Figuras 16 e 17 deveu-se à indução da morte celular programada mediada pela via de apop-tose. Notavelmente, não foi observada indução significativa nas mesmas linhagens celulares de mieloma múltiplo na ausência de infecção pelos lentivírus (não afetadas) ou depois da expressão de sh-RNAs específicos para MKK7 (sh-MKK7-1 e sh-MKK7-2) ou de sh-RNAs não específicos (sh-NS-1 e sh-NS-2) (Figuras 18A, 18B e 18C). Linhagens celulares de mieloma múltiplo foram infectadas com lentivírus pLentiLox.3.7 expressando sh-RNAs, e célu- las eGFP+ de mieloma múltiplo (ou seja, células infectadas com lentivírus) foram separadas com um separador celular BD FACSAria™ II como na Figura 16. Ensaios de coloração nuclear por PI foram realizados 10 depois da separação das células, correspondendo ao Dia 8 na Figura 16. Os percentu- ais de células apoptóticas (ou seja, células exibindo conteúdo de DNA sub- G1) são retratados nos histogramas. De modo importante, os níveis de a- poptose induzidos pelos diferentes sh-RNAs específicos para Gadd45β (ou seja, sh-Gadd45β-1, sh-Gadd45β-2 e sh-Gadd45β-3) correlacionaram-se com os níveis de regulação negativa de Gadd45β induzida por cada um des- tes sh-RNAs específicos para Gadd45β (Figuras 18A; dados também não mostrados). Os dados nas Figuras 18A, 18B e 18C estabelecem adicionalmente a especificidade de alvo de Z-DTPs para o complexo Gadd45β/MKK7 em células de mieloma múltiplo (consultar também as Figuras 7, 8 e 9, ensaios de morte com Z-DTPs; Figura 12, correlação estatisticamente significa- tiva entre expressão de Gadd45β e sensibilidade de células cancerosas à morte induzida por Z-DTP; Figuras 16 e 17, indução de morte de linhagem celular de mieloma múltiplo pela regulação negativa de Gadd45β, mas não de MKK7), e confirmam a função essencial que Gadd45β desempenha na sobrevida de células de mieloma múltiplo. Em conjunto, validam ainda a

Gadd45β como alvo terapêutico no mieloma múltiplo.

As Figuras 19A, 19B e 19C mostram que o silenciamento de MKK7 ou de Gadd45β, mediado por sh-RNA, não afeta a distribuição do ciclo celular em linhagens celulares de mieloma múltiplo. As linhagens celulares mostradas de mieloma múltiplo, representativas de infectadas por lentiví- rus - ou seja, ARH-77 (Figura 19A), NCI-H929 (Figura 19B) e RPMI-8226 (Figura 19C) - são do mesmo experimento exibido na Figura 18. As análises de ciclo celular mostradas nas Figuras 19A, 19B e 19C foram realizadas pelo uso de ensaios de coloração nuclear por PI, conduzidos como descritos no Exemplo 8 (consultar também a Figura 18). Diferentemente dos dados mos- trados na Figura 18 (na qual perfis de coloração por PI estão representados em escala logarítmica, que realça apoptose), a coloração por PI (ou seja, FL2-A) nestas Figuras é representada em escala linear, que realça a distri- buição do ciclo celular. Os percentuais de células de mieloma múltiplo nas diferentes fases do ciclo celular (ou seja, Gi, Se G2/M) estão retratados nos histogramas. Análises do ciclo celular não puderam ser realizadas com sh- RNAs específicos para Gadd45β no caso das linhagens de células ARH-77 (Figura 19A) e NCI-H929 (Figura 19B) de mieloma múltiplo devido à indução de apoptose maciça depois da expressão destes sh-RNAs (consultar as Figuras 18A e 18B). Não obstante, pode ser visto na Figura 19A que a regulação negativa de Gadd45β não afetou a distribuição do ciclo celular na linhagem celular resistente ao Z-DTP, RPMI-8229.

Exemplo 12 - A regulação negativa da expressão de MKK7 torna linhagens celulares normalmente sensíveis de mieloma múltiplo em completamente refratárias à morte induzida por Z-DTP

Materiais e métodos A fim de avaliar a especificidade do alvo de Z-/mDTPs para o complexo Gadd45β/MKK7, foram investigados os efeitos da regulação negativa da expressão de MKK7 sobre a sensibilidade de linhagens celulares de mieloma múltiplo que eram suscetíveis à morte induzida por Z-/mDTP (Figuras 20A, 20B e 20C). Para tanto, a linhagem celular de mieloma múltiplo representativa, ARH-77, foi infectada com lentivírus expressando sh-RNAs específicos para MKK7, o que resultou no silenciamento do gene de MKK7, ou expressando sh-RNAs não específicos de controle. As sequências de DNA codificadoras dos small hairpin (sh)-RNAs direcionados estão listadas na Tabela VII. As sequências de sh-RNAs direcionadas a MKK7 e as sequências não específicas de controle foram introduzidas entre os sítios de restrição BamHI e Hpal do vetor lentiviral, LentiLox3.7, como descrito no E- xemplo 11 (consultar a referência por Yang et al. 2006 PNAS 103, 10397- 10402). O preparado lentiviral de alto título em células HEK-293T foi produzido utilizando essencialmente as mesmas condições descritas na referência por Yang et al. 2006 PNAS 103, 10397-10402. Para a introdução das sequências de sh-RNAs direcionadas a MKK7 e as não específicas de controle, a linhagem celular de mieloma múltiplo, representativa de sensível ao Z- DTP, ARH-77, foi infectada com lentivírus LentiLox3.7 expressando sh-RNAs específicos para MKK7 (sh-MKK7) ou sh-RNAs não específicos (sh-NS), conforme relatado em protocolos publicados essencialmente como descrito na referência por Yang et al. 2006 PNAS 103, 10397-10402. 5 dias depois da infecção, células ARH-77 eGFPD foram separadas com um separador celular BD FACSAria™ II. Em seguida, 10 dias depois da separação das células, células ARH-77 de mieloma múltiplo, infectadas por lentivírus, foram tratadas com Z-DTP1, Z-DTP2, mDTP3 ou Z-NC por 72 horas a 37°C, ou foram cultivadas sob as mesmas condições na ausência de tratamento com os peptídeos, como descrito no Exemplo 8. Os tratamentos com Z-DTP1, Z- DTP2, mDTP3 and Z-NC foram conduzidos nas seguintes concentrações finais dos peptídeos: 0,01 μM, 0,03 μM, 0,1 pM, 0,3 pM, 1 pM, 3 pM e 10 pM. Depois destes tratamentos, a sobrevida/proliferação de células ARH-77 foi determinada por ensaios de incorporação de [3H]timidina, realizados como descrito nos Exemplos 6 e 8. Os resultados destes experimentos foram expressos como os percentuais de sobrevida/proliferação (ou seja, c.p.m.) observada em células de mieloma múltiplo infectadas por lentivírus tratadas com Z-DTP1, Z-DTP2, mDTP3 ou Z-NC, em relação à sobrevida/proliferação das respectivas células infectadas por lentivírus na ausência de tratamento com peptídeos. As concentrações medias de Z-DTP1, Z-DTP2, mDTP3 e Z- DNC resultando em 50% (IC50) de inibição da sobrevida/proliferação celular foram determinadas por ensaios de incorporação de [3H]timidina, e foram calculadas como descrito no Exemplo 6. Os resultados destes experimentos são mostrados nas Figuras 20A, 20B e 20C. Resultados

As Figuras 20A, 20B e 20C mostram que o silenciamento de MKK7 mediado por sh-RNA torna a linhagem celular representativa sensível ao Z-/mDTP, ARH-77, completamente resistente à morte induzida por Z- /mDTP. Os ensaios de incorporação de [3H]timidina, retratados nestas Figuras, mostra as IC5oS do tetrapeptídeo D-isômero de controle negativo (Z- DNC) (Figuras 20A, 20B e 20C), Z-DTP1 (Figura 20A), Z-DTP2 (Figura 20B) e mDTP3 (Figura 20C) em células ARH-77 de mieloma múltiplo expressando sh-RNAs específicos de MKK7 (sh-MKK7) ou sh-RNAs não específicos (sh- NS). Os tratamentos de células ARH-77 foram conduzidos com diferentes concentrações destes peptídeos, e a viabilidade/proliferação celular foi analisada por ensaios de incorporação de [3H]timidina depois de 3 dias. Pode ser visto que células ARH-77 expressando sh-NS são altamente sensíveis à morte induzida por Z-/mDTP - mostrado por valores de IC50 de 1,4 μM (Z- DTP1; Figura 20A), 302 nM (Z-DTP2; Figura 20B) e de 303 nM (mDTP3; Figura 20C) - semelhante ao que é visto nas células ARH-77 precursoras não afetadas (consultar a Tabela IV). Em contraste marcante, contudo, células ARH-77 expressando sh-MKK7 tornaram-se completamente resistentes à morte por Z-/mDTP - mostrado pelos valores de IC50 > 10 pM de Z-DTP1, Z- DTP2 e mDTP3 - semelhante ao que é visto em células ARH-77 tratadas com Z-DNC (Figuras 20A, 20B e 20C). As IC50s foram calculadas como descrito no Exemplo 6, utilizando concentrações crescentes de Z-DNC (Figuras 20A, 20B e 20C), Z-DTP1 (Figura 20A), Z-DTP2 (Figura 20B) e de mDTP3 (Figura 20C), variando de 0,01 a 10 pM. Nos gráficos são relatados os percentuais das contagens por minuto (c.p.m.), uma medida de sobrevida/proliferação celular, obtida com células tratadas em relação aos valores de c.p.m. obtidos com células não tratadas. Dados semelhantes foram obtidos com linhagens celulares adicionais de mieloma múltiplo que são sensíveis ao Z-/mDTP, incluindo linhagens de células U266, KMS-11 e KMS-12 (dados não mostrados). Estes dados (ou seja, a perda de sensibilidade ao Z- /mDTP em células suscetíveis de mieloma múltiplo pelo silenciamento de MKK7), em conjunto com os dados mostrados na Figura 12 (ou seja, a forte correlação entre expressão de Gadd45β e sensibilidade de células cancerosas à morte induzida por Z-DTP), demonstra conclusivamente a especificidade muito alta do alvo de Z-/mDTPs pelo complexo Gadd45β/MKK7 em células de mieloma múltiplo.

Exemplo 13 - Z-DTPs retêm forte atividade citotóxica específica em células primárias de mieloma múltiplo de pacientes Materiais e métodos

A fim de confirmar se Z-/mDTPs retêm atividade citotóxica em células primárias de mieloma múltiplo, foram examinados os efeitos de Z- DTP1 e Z-DTP2 sobre a sobrevida de células de mieloma múltiplo isoladas de pacientes com diagnóstico clínico de mieloma múltiplo. Para tanto, células de mieloma múltiplo foram purificadas de aspirados da medula óssea (BM) de pacientes com mieloma múltiplo por seleção negativa, utilizando esferas magnéticas conjugadas, essencialmente como descrito na referência por Hideshima T. et al. 2006, Blood 107: 4053-4062. A pureza das células de mieloma múltiplo foi confirmadas por citometria de fluxo, utilizando anticorpos anti-CD138 e anti-CD45, também essencialmente de acordo com o procedimento descrito na referência por Hideshima T. et al. 2006, Blood 107: 4053-4062. Células da medula óssea CD138+ foram então cultivadas a uma concentração de 4 x 105 células/mL em cavidades de placas de 96 cavidades e tratadas com 1 pM ou 10 pM de Z-DTP1, Z-DTP2 ou Z-DNC por 48 horas. A viabilidade celular foi medida por contagem de células utilizando ensaios de exclusão por azul de Trypan (Figuras 14A, 14B, 14C, 14D e 14E).

A fim de determinar o índice terapêutico in vitro de Z-/mDTPs, ensaios de viabilidade e de proliferação foram realizados também com células primárias não transformadas de origem humana e de camundongo, depois do tratamento com 10 pM ou 100 pM de Z-DTP1, Z-DTP2 e Z-DNC. Para tanto, células estromais da medula óssea (BMSCs), células mononu- cleares do sangue periférico (PBMNCs) e células-tronco mesenquimais (MSCs) foram purificadas de indivíduos saudáveis depois de separação por densidade com Ficoll-Hypaque, de acordo com os protocolos relatados na referência por Piva R . et al. 2008 Blood 111: 2765-2775). Células BMSCs, PBMNCs e MSCs foram então tratadas durante os tempos indicados e com as concentrações de peptídeos especificados nas Figuras 15A e 15B. A fim de estabelecer a especificidade da atividade citotóxica de Z-/mDTPs por células cancerosas, foram utilizadas também linfócitos B e T primários, purificados do baço e de linfonodos de camundongos, respectivamente, essencialmente como descrito na referência por Shirakawa et al. 2010 Cell Mol immunology 1-12. Células B e T foram ativadas em seguida por simulação com 1 ng/mL de LPS por 16 horas e subsequentemente tratadas com 100 pM de Z-DTP1, Z-DTP2 ou Z-DNC por 72 horas como mostrado na Figura 15B. Resultados

As Figuras 14A, 14B, 14C, 14D e 14E mostram que Z-DTP1 e Z- DTP2, mas não Z-DNC, exibem forte atividade citotóxica em células primárias de mieloma múltiplo, isoladas de 5 pacientes representativos. Cada painel retrata os dados obtidos com células de mieloma múltiplo de um diferente paciente - ou seja, paciente 1 (Figura 14A), paciente 2 (Figura 14B), paciente 3 (Figura 14C), paciente 4 (Figura 14D) e paciente 5 (Figura 14E). Os tratamentos com Z-DTP2, Z-DTP1 e Z-DNC foram nas concentrações indicadas (ou seja, 1 pM ou 10 μM), por 48 horas. Foram realizados ensaios utilizando exclusão com azul de Trypan. Os valores representam o percentual de células vivas após o tratamento com Z-DTP2, Z-DTP1 ou Z-DNC em relação à viabilidade de células de controle sem tratamento. Forte atividade citotóxica - comparável à de Z-DTP2 e Z-DTP1 - foi observada também em células primárias de mieloma múltiplo de pacientes com mDTP3, sob condições experimentais semelhantes (dados não mostrados). Esses achados demonstram que Z-/mDTPs retém atividade em células primárias de mieloma múltiplo e indicam que uma terapia à base de Z-/mDTP pode ser utilizada em pacientes para tratar o mieloma múltiplo.

As Figuras 15A e 15B mostram que Z-DTP1 e Z-DTP2 não exibem toxicidade contra células primárias normais de origem de camundongo ou humana, mesmo quando utilizado em concentrações muito altas - ou seja, 100 pM. As células primárias testadas incluíram células estromais normais da medula óssea (BMSCs) (Figura 15A), células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) (Figura 15A) e células-tronco mesenquimais (MSCs) (Figura 15B), isoladas de indivíduos sem mieloma múltiplo, e linfóci- tos B e T primários purificados isolados de camundongos (Figura 15B). Os tratamentos com Z-DTP2, Z-DTP1 e Z-DNC foram às concentrações indicadas por: 48 horas (BMSCs, PBMNCs) (Figura 15A), 72 horas (células B e T murinas) (Figura 15B) ou 144 horas (MSCs) (Figura 15B). Os ensaios foram realizados por exclusão com azul de Trypan (Figura 15A) ou de incorporação de [3H]timidina (Figura 15B). Os dados apresentados nas Figuras 14 e 15 indicam que Z-DTPs possuem altos índices terapêuticos in vitro (ou seja, ausência de toxicidade em célula normal contra alta toxicidade em células cancerosas). De fato, Z-DTP1 e Z-DTP2, mas não Z-DNC, mostram forte atividade tumoricida em células de mieloma múltiplo de pacientes (Figura 14), mas não exibem toxicidade em células primárias normais de indivíduos saudáveis ou de camundongos (Figura 15A), mesmo quando utilizados em concentrações muito altas como 100 pM (consultar a Figura 15B). Esses dados demonstram que Z-DTPs não discriminou efeitos citotóxicos em células - mas antes, seus efeitos citotóxicos são específicos para células cancerosas e/ou células que apresentam altos níveis de expressão ou atividade de Gadd45β e/ou alta expressão ou atividade constitutiva de NF-KB.

A alta atividade de Z-/mDTPs em células de mieloma múltiplo e de outros tipos de câncer, associada à sua ausência de toxicidade em células primárias normais, incluindo BMSCs, MSCs, PBMNCs primárias humanas e linfócitos B e T de camundongos, mesmo quando utilizados a altas concentrações (ou seja, 100 μM), demonstra que os compostos da invenção possuem excelentes índices terapêuticos in vitro (consultar a Figura 9, ausência de toxicidade em linhagens celulares que não dependem do NF-KB para sobrevida; Figura 12, correlação entre expressão de Gadd45β e sensibilidade de células cancerosas aos Z-DTPs; Figuras 14 e 15, ensaios de morte em células primárias) - uma vantagem fundamental da presente invenção sobre as terapias existentes. Os compostos da invenção não possuem também toxicidade em linhagens de células tumorais tais como linhagens celulares de leucemia de células T, linfoma de Burkitt e muitos outros, os quais não dependem do NF-KB para sobrevida (mesmo quando utilizados a 100 pM; consultar a Figura 9), mostrando que sua atividade possui especificidade inerente para células com NF-KB constitutivamente ativo. Além disso, em um grande painel de linhagens de células tumorais de diferentes tecidos de origem, há uma correlação de alta significância estatística entre níveis de expressão de Gadd45β e sensibilidade à morte induzida por Z- /mDTP (p <0,01; Figura 12), estabelecendo com isso a alta especificidade da ação citotóxica dos Z-/mDTPs para Gadd45β. Fundamentalmente, a regula- ção negativa de Gadd45β, mediada por sh-RNA, causa apoptose em linhagens celulares de mieloma múltiplo que são sensíveis ao Z-/mDTP (por e- xemplo ARH-77 e NCIH929) com cinética semelhante à vista com Z- ZmDTPs, mas não em linhagens celulares de mieloma múltiplo que são resistentes ao Z-/mDTP (por exemplo, RPMI-8226), e a regulação negativa de MKK7, mediada por sh-RNA, resulta em perda de sensibilidade à morte induzida por Z-/mDTP em linhagens celulares sensíveis de mieloma múltiplo (por exemplo, ARH-77) (consultar a Figura 20). Em conjunto, os dados dos presentes inventores mostram que a atividade citotóxica de Z-/mDTPs está restrita a células tumorais apresentando NF-KB constitutivamente ativo e/ou níveis elevados de expressão ou atividade de Gadd45β - Z-/mDTPs exibem citotoxicidade em níveis nM em linhagens celulares sensíveis de mieloma múltiplo, porém não têm toxicidade em linhagens de células tumorais que não dependem do NF-KB para sobrevida ou que exibem baixos níveis de expressão de Gadd45β, mesmo quando utilizados a 100 μM. Além do mais, ao contrário de camundongos desprovidos dos componentes centrais da via IKK/NF-kB, camundongos gadd45β-~ são viáveis e aparentemente saudáveis (Papa et al. 2008 J Clin Invest 118, 1911-1923), indicando que a inati- vação completa de Gadd45β (diferentemente do bloqueio completo do pro- teassoma/NF-KB) é bem tolerada in vivo (Papa et al. 2008 J Clin Invest 118, 1911-1923). Em conjunto, esses achados indicam que a terapia à base de Z- /mDTP será segura e específica (consultar as Figuras 9 e 15, ausência de toxicidade em linhagens de células tumorais independentes de NF-βB e células primárias normais; Figura 12, correlação entre expressão de Gadd45β e sensibilidade de células cancerosas à morte induzida por Z-/mDTP; Figura 14, ,morte induzida por Z-/mDTP de células primárias de mieloma múltiplo).

Inibidores do proteassoma (Pis), como bortezomib, e outras terapias para o mieloma múltiplo também eliminam também as células do mieloma múltiplo ao ativarem JNK (Chauhan et al 2008 Blood 111, 1654-1664), mas não conseguem curar dado a seus baixos índices terapêuticos (Lau- back et al 2009 Leukemia 23, 2222-2232; Ludwing et al 2010 Oncologist 15, 6-25 e www.cancecare.on.ca/). O direcionamento às funções distintas do

NF-KB na sobrevida de mieloma múltiplo mediante a Gadd45β possibilitará dissociar as funções doe NF-kB voltadas para imunidade, inflamação e sobrevida, de modo a proporcionar uma terapia mais segura, mais específica que possa ser tolerada nas doses necessárias para a cura. Os Z-/mDTPs definem uma classe inteiramente nova de agentes terapêuticos direcionados a uma nova via em mieloma múltiplo e potencialmente a outras tipos de câncer e doenças ou distúrbios que dependem do NF-KB para a sobrevida.

Exemplo 14 - Propriedades de ligação de mDTP3 às proteínas Gadd45β e MKK7 isoladas e como parte do complexo Gadd45β/MKK7

A título de exemplo, experimentos de ligação foram realizados com mDTP3 à Gadd45β, ao domínio quinase de MKK7 (MKK7kD) e ao complexo Gadd45β/MKK7 pela técnica de Ressonância Plasmônica de Superfície. Materiais e métodos

A fim de determinar o modo como DTPs se ligam ao complexo Gadd45β/MKK7, foram realizados experimentos com equipamento Biaco- re3000 SPR (GE Healthcare, Milão, Itália), utilizando 4 canais de chips sensores CM5 (GE Healthcare, Milão, Itália). Gadd45β humana completa foi preparada e purificada como descrito na referência por Tornatore L, et al. (2008). J Mol Biol; 378:97-1 11.0 domínio quinase constitutivamente ativo de MKK7, abrangendo os resíduos 101 a 405, e exibindo as mutações S287D e T291D (MKK7kD), foi expresso em E.Coli em forma de proteína de fusão de His6. A proteína foi purificada até a homogeneidade por duas etapas subsequentes de cromatografia por afinidade (suporte de Ni-NTA) e filtração em gel (Superdex G75) e, então, caracterizada por SDS-PAGE, LC-MS visando verificar a identidade e a pureza, e por Dicroísmo Circular para avaliar o do- bramento. MKK7kD foi imobilizada no chip sensor Biacore mediante acoplamento químico clássico de EDC/NHS em pH 5 (pl da proteína, ~9) em vazão de 5 pL/min. Foi alcançado nível de imobilização de aproximadamente 8000 Unidades de Resposta. Gadd45β, intrinsicamente uma proteína ácida com pl de aproximadamente 4,5, foi imobilizada em pH 3,5 (Níveis de imobi- lização: 6000 RU) em um canal separado. Os grupos reativos residuais nos canais de Gadd45β e de MKK7kD foram finalmente inativados por tratamento com etanolamina. Em outro canal, o mesmo procedimento de ativação com EDC/NHS e inativação com etanolamina foi realizado. Este canal foi utilizado como referência e o sinal que derivava foi considerado o branco, e valores foram subtraídos de acordo dos canais experimentais que detectavam as proteínas Gadd45β ou MKK7kD para retirar a ligação não específica à superfície do chip. A fim de determinar se as duas proteínas estavam efetivamente imobilizadas, foram realizadas injeções repetidas de Gadd45β (20-200 nM) e MKK7kD (1-25 nM) a concentrações crescentes (tempo de contato: 3 minutos; 60 μL). A regeneração foi alcançada com injeções de NaCI 1 M (1 min, canal derivado de MKK7kD) ou de NaOH 20 mM (30 segundos, canal derivado de Gadd45βl).

Concentrações crescentes do tripeptídeo mDTP3 (Ac-D-Tyr-D- Arg-D-Phe-NH2) foram finalmente injetadas sobre o chip a concentrações variando entre 1 nM e 10 μM. Em um experimento separado, mDTP3 foi injetado durante a fase de dissociação de Gadd45β de MKK7kD imobilizada ou de MKK7kD de Gadd45β imobilizada. Os resultados destas analises estão relatados nas Figuras 21 A, 21B, 21C e 21 D. Resultados

Como pode ser visto na Figura 21A, a ligação de Gadd45β à MKK7kD imobilizada foi muito eficaz. Curvas dose-resposta da associação e dissociação foram observadas em todas as concentrações testadas. A constante de dissociação KD da interação Gadd45β/MKK7KD foi estimada pela média dos valores calculada sobre cada uma das diferentes curvas e determinada em 4,0 ± 0,7 nM (consultar a Figura 21A). Do mesmo modo, injeções repetidas de MKK7kD sobre o canal de Gadd45β forneceram as curvas dose- resposta de associação e dissociação (Figura 21B) a partir das quais foi derivada KD de 3,4 ± 0,6 nM foi derivada.

A fim de determinar se mDTP3 liga-se à MKK7kD e/ou à Gadd45β, amostras do peptídeo (ou seja, mDTP3) foram injetadas sobre canais derivados de Gadd45β e de MKK7kD. Surpreendentemente, como ode ser visto na Figura 21C, os dados mostram que este peptídeo não se liga à Gadd45β ou à MKK7kD isoladas. Extraordinariamente, contudo, quando mDTP3 foi injetado durante a fase de dissociação de Gadd45β de MKK7kD (Figura 21 D) ou a fase de dissociação de MKK7kD de Gadd45β (dados não mostrados), a ligação era observada e curvas dose-resposta de associação e dissociação puderam ser registradas. A Figura 21D mostra que quando mDTP3 foi injetado às baixas concentrações de 10 nM ou 100 nM, este peptídeo induziu rápida dissociação do complexo Gadd45β/MKK7KD- Conforme pode também ser visto, a formação do complexo Gadd45β/MKK7KD foi rapidamente recuperada depois que o peptídeo foi lavado embora. A Figura 21D mostra também que quando mDTP3 foi injetado a concentrações mais altas (por exemplo 1 μM), curvas dose-resposta de ligação e dissociação eram registradas, indicando que mDTP3 estava ligado à Gadd45β e/ou a MKK7kD ou a um complexo das duas proteínas. Em conjunto, estes dados demons-tram que mDTP3 não consegue se ligar à Gadd45β ou à MKK7kD isoladas, mesmo quando utilizado a altas concentrações, mas antes sua ligação à Gadd45β, a MKK7kD ou a uma superfície criada pela interação das duas proteínas requer a formação de um complexo Gadd45β/MKK7. Estes dados são importantes por mostrarem que o alvo terapêutico da invenção é a interface entre as duas proteínas (ou seja, Gadd45β e MKK7) - o que oferece potencial para alta seletividade de alvo nas células, uma vantagem importante da presente invenção sobre as terapias existentes.

Exemplo 15 - Perfis farmacocinéticos in vivo (DMPK) de Z-DTP2 e mPTP3

A fim de avaliar a adequação de Z-DTP2 e mDTP3 para uso terapêutico in vivo, foram realizadas análises farmacocinéticas em camundongos. Materiais e métodos

Estudo de farmacocinética no camundongo: Sumário do protocolo: Z-DTP2 e Z-mDTP3 foram administrados por via intravenosa a camundongos. Amostras de sangue foram coletadas em até 7 momentos depois da injeção intravenosa (i.v.) dos compostos sobre 8 horas, e o pias- ma foi analisado por LC-MS/MS para determinar a concentração dos compostos em cada momento. Procedimento experimental:

Três machos de camundongo CD1, todos com 25 - 30 gramas receberam uma dose por via de administração por momento por composto. O composto em teste foi administrado por via intravenosa (em nível típico de dose de 10 mg de composto por kg de peso corporal). Foi concedido aos animais acesso livre a alimentos por todo o estudo. Nos momentos abaixo, os animais foram anestesiados, sangue foi coletado em tubos heparinizados e os animais foram sacrificados: • administração iv: 0,08; 0,25; 0,5; 1; 2; 4 e 8 após a administração i.v.

Preparo de amostras: As amostras de sangue foram centrifugadas para obter o plasma, o qual foi então transferido para um recipiente separado marcado. Alíquotas de cada momento dos três animais foram analisadas isoladamente. As proteínas foram precipitadas adicionado 3 volumes de metanol e centrifugando por 30 minutos a 4°C. Alíquotas de 100 μl dos sobrenadantes resultantes foram diluídas com 200 μl de água grau HPLC em cavidades de uma placa de 96 cavidades.

Análise quantitativa: Curvas padrão foram preparadas em matrizes de plasma para branco e tratadas em maneira idêntica às amostras. As amostras de plasma foram quantificadas por LC-MS/MS, e a concentração de cada composto no plasma foi registrada em μg/mL.

Análise farmacocinética: Parâmetros farmacocinéticos foram calculados empregando análise de modelo não compartimentai, como descrito no site da Internet: http://www.pharsiqht.com/main.php Bioanálise:

Sumário do protocolo: A concentração do composto em teste em amostras de plasma foi medida por LC-MS/MS. Os dados foram quantificados utilizando uma curva padrão de cinco pontos sobre uma variação de 3-3000 ng/mL.

Procedimento experimental: Proteínas foram precipitadas de alíquotas de 50 μL das amostras individuais de plasma, adicionando 150 μL de metanol. Depois da precipitação de proteínas, as amostras de plasma foram centrifugadas por 30 minutos a 4°C. Alíquotas de 100 pL do sobrenadante resultante foram diluídas com 200 pL de água grau HPLC em placa de 96 cavidades. O composto em teste foi então quantificado por LC-MS/MS a partir de uma curva padrão de cinco pontos, preparada pela adição de concentrações variadas (spiking) ao plasma do composto em teste, dissolvido em DMSO, sobre um intervalo de concentração final variando de 3 - 3000 ng/mL (concentração final de DMSO: 1%) e tratado em maneira idêntica às amostras em teste como descrito acima. Resultados Estudos farmacocínéticos em macho de camundongos CD1 mostram que Z-DTP2 e mDTP3 possuem perfis DMPK in vivo adequados para a administração por infusão intravenosa (i.v.) (consultar as Tabelas VIII, IX [A] e IX [B]), na ausência de toxicidade aguda em camundongos. A Tabela VIII relata os valores dos parâmetros farmacocínéticos in vivo mais importantes obtidos com Z-DTP2 e mDTP3, incluindo meia-vida plasmática (TI/2), volumes de distribuição no estado de equilíbrio (Vss) e terminal (Vβ) e clearance (depuração) total (CLtot), área sob a curva de concentração plasmática versus tempo (AUC) e concentração no momento 0 (Co). Os valores foram calculados a partir dos dados das curvas de concentração plasmática versus tempo, com base nos métodos de análise não compartimentai e compartimentai (Groulx A. 2006 ScianNew 9: 1-5 and DiStefano 3rd 1982 Am J Phy-siol Regul Integr Comp Physiol 243: 1-6) (dados não mostrados). Cada parâmetro mostrado representa a média de valores experimentais obtidos de 3 diferentes agrupamentos de machos de camundongos CD1 após uma injeção intravenosa (i.v.) única dos compostos a uma dose de 10 mg por kg de peso corporal. Três machos de camundongo CD1 (25 - 30 g de peso corpo ral) receberam a administração i.v. de Z-DTP2 ou mDTP3. Amostras de sangue foram coletadas em 7 momentos como mostrado (ou seja, em 0,08; 0,25; 0,5; 1; 2; 4 e 8 horas após a injeção), e o plasma foi analisado por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS) para determinar as concentrações sanguíneas dos dois compostos em cada momento. Os gráficos do perfil de concentração plasmática versus tempo foram extrapolados para Z-DTP2 e mDTP3. Os resultados mostram que Z-DTP2 e mDTP3 seguem os dois uma disposição multifásica após injeção intravenosa (dados não mostrados). De fato, as curvas de concentração versus tempo dos compostos administrados por via intravenosa exibem um perfil distinto biexponencial com fase inicial rápida e íngreme de distribuição e Tv2 terminal longa (dados não mostrados).

Os principais parâmetros farmacocinéticos extrapolados a partir dos dados de curvas de concentração plasmática-tempo (ou seja, Co, AUC até o último momento, T1/2, VP, Vss e CL) são fundamentais para calcular os níveis de dose e o esquema de administração, necessários para atingir as concentrações sistêmicas desejadas no estado de equilíbrio de um fármaco (ou seja, as concentrações sistêmicas terapêuticas). Como pode ser visto na Tabela VIII, Z-DTP2 e mDTP3 exibem meias-vidas in vivo de aproximadamente 2 horas e de aproximadamente 1 hora e 20 minutos, respectivamente.

Curiosamente, Z-DTP2 e mDTP3 mostram os dois uma meia- vida inicial de distribuição de aproximadamente 5 minutos, o que poderia sugerir rápida captação tecidual/celular, mas que alternativamente poderia sugeria ligação a proteínas plasmáticas. De modo mais importante, os dois compostos exibem eliminação muito lenta dos tecidos, o que é refletido por meia-vida terminal de aproximadamente 8 horas (Tabela VIII e dados não mostrados) (http://www.pharsiqht.com/main.php e http://www.meds.com/leucemia/idamvcin/adriamycin.html e Kupperman et al 2010 Cancer Res 70 1970-1980). Os dados mostram também que Z-DTP2 e mDTP3 seguem ambos um sistema farmacocinético em geral linear (Bere- zhkovskiy (2007) J Pharm Sei. 96, 1638-52), como indicado pelo achado de que seus valores de distribuição do volume total são mais altos do que os de distribuição do volume no estado de equilíbrio (ou seja, Vβ > Vss).

Tanto a distribuição do volume terminal como a no estado de equilíbrio, bem como as meias-vidas terminais dos dois compostos contribuem de modo sinérgico para estabelecer a quantidade de fármaco necessária no corpo para taxa constante de infusão.

De modo importante, Z-DTP2 e mDTP3 mostram valores de clearance total no intervalo de 66 a 90 rnLZ min/kg e de 22 a 27 ml_Z min/kg, respectivamente, sugerindo taxas metabólicas lentas e de excreção biliar (Tabela VIII e dados não mostrados).

As Tabelas IX [A] e IX [B] mostram a dose prevista para administração in vivo de Z-DTP2 e mDTP3, respectivamente, necessária para atingir concentrações sistêmicas terapêuticas dos dois compostos. O valores relatam a dose expressa em mg/h, necessária para obter as concentrações plasmáticas desejadas no estado de equilíbrio de 1, 5 ou 10 μM para Z-DTP (Tabela IX [A]) ou mDTP3 (Tabela IX [B]). Significativamente, apesar de terem uma meia-vida comparável, bem como meia-vida terminal comparável à de Z-DTP2, mDTP3 exib valor de clearance total 3 vezes mais baixo do que o de Z-DTP2 (Tabela VIII e dados não mostrados). De nota, mesma uma pequena diferença neste parâmetro farmacocinético fundamental pode afetar significativamente o tamanho da dose e o esquema de administração, ne-cessários para atingir a concentração plasmática desejada no estado de e- quilíbrio de um composto, tal como visto com a diferença nas doses previstas para Z-DTP2 e mDTP3 (Tabelas IX [A] e IX [B], respectivamente). De fato, as Tabelas IX [A] e IX [B] (analises de modelamento) mostram que para atingir uma concentração plasmática no estado de equilíbrio de 1, 5 ou 10 μM, a dose necessária para mDTP3 é significativamente mais baixa do que a necessária para Z-DTP2. Por conseguinte, com base nestes resultados farmacocinéticos e nos valores de IC5o determinados para os dois compostos em linhagens celulares de mieloma múltiplo (consultar a Tabela IV) para que uma concentração plasmática no estado de equilíbrio de até 10 μM possa ser atingida, será necessário administrar Z-DTP2 e mDTP3 por infusão i.v. contínua a uma taxa de 0,976 mg/h e de 0,218 mg/h, respectivamente (Tabelas IX [A] e IX [B]). De nota, a síntese de Z-/mDTP é concisa e direta, portanto, de custo compensador mesmo para uso crônico. Portanto, mesmo com T1/2 baixa, a terapia com X-/mDTP por infusão será aceitável em pacientes hospita- 5 lizados já em quimioterapia. Os compostos da invenção são também altamente solúveis e possuem alta especificidade e bons perfis de segurança, de modo que podem ser liberados em altas doses, em baixos volumes para minimizar os efeitos terapêuticos, como explorado com êxito pelas terapias existentes com peptídeos. 10 Tabelas Tabela I

Claims (7)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula I: Acetyl-D-Tyr-D-Arg-D-Phe-NH2 ou um sal ou solvato do mesmo.

2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto, como definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente quimioterápico antineoplásico, tal como, talidomida, dexametasona, bortezomibe e lenalidomida; ou um agente para tratar anemia, tal como, eritropoietina; ou um agente para prevenir fraturas ósseas, tal como, um bifosfonato, tal como, pamidronato ou ácido zoledrônico.

4. Composição de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de ser para uso como um medicamento.

5. Uso de um composto, como definido na reivindicação 1, ou de uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar um câncer que exiba elevação previamente determinada dos níveis de expressão e/ou de atividade de Gadd45β ou para tratar uma doença inflamatória em um indivíduo, cujo tecido do referido indivíduo exiba elevação previamente determinada dos níveis de expressão e/ou de atividade de Gadd45β.

6. Uso de um composto, como definido na reivindicação 1, ou de uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou transtorno em um indivíduo que seja definido pela expressão e/ou a atividade anormal aumentada de Gadd45β e/ou que seja definido pela ativação anormal da via de NF-KB e seja passível de tratamento pela indução de Morte Celular Programada pela inibição da atividade de Gadd45β.

7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a doença ou transtorno é mieloma múltiplo, linfoma de Burkitt, leucemia pró-monocítica ou linfoma difuso de grandes células B.

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