MX2012004755A - Agentes dirigidos a gadd45beta. - Google Patents

Abstract

Compuestos basados alrededor de porciones de tetrapéptido, tripéptido y dipéptido y porciones peptiodes correspondientes; métodos relacionados y composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento de cáncer, enfermedades inflamatorias y otros trastornos.

Description

AGENTES DIRIGIDOS A GADD45BETA El trabajo que llevó a esta invención fue apoyado en parte por las subvenciones R01 CA84040 y CA098583 del National Institutes of Health.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al cáncer y otras enfermedades y - trastornos, por ejemplo enfermedades y trastornos inflamatorios, y a la modulación terapéutica de los mismos. En particular, la invención se refiere a compuestos basados en péptidos cortos capaces de modular la muerte celular programada (MCP) y la proliferación de células cancerosas y células proinflamatorias/autoinmunes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Durante mucho tiempo se ha considerado la inducción de apoptosis como un método de tratamiento de células cancerosas y también de células proinflamatorias, autoinmunes, y otras células enfermas. Existen varias rutas celulares implicadas en la activación de la muerte celular, que incluyen la ruta de la cinasa c-Jun N-terminal, JNK. Las JNKs son sensibles a . las citocinas y los estímulos de estrés, tales como radiación ultravioleta, choque de calor y choque osmótico. También la ruta de NF- ? es activada en respuesta a citocinas y estrés celular. La ruta NF-?? puede inhibir la ruta JNK por interferencia mediada por Gadd45 y la cinasa JNK, cinasa de la cinasa de proteína 7 activada por mitógeno (MKK7/J KK2). La actividad de la MKK7 es inhibida por Gadd45 , un miembro de la familia Gadd45 de factores inducibles y un objetivo de transcripción directo de NF-??. Esto significa que Gadd45P media la supresión de NF- ? de la señalización de JNK, uniéndose a MKK7 e inhibiendo su actividad: Papa, et al. 2004, Nature Cell Biology 6(2): 1462153.

Se ha propuesto el uso de inhibidores de NF-?? para el tratamiento del cáncer y enfermedades inflamatorias. Sin embargo, como NF-KB tiene varias actividades que incluyen funciones en la MCP, inmunidad, inflamación y desarrollo de tejido, es preferible inhibir funciones específicas de NF-??, más que el NF-?? mismo.

La presente invención se refiere a la inhibición de Gadd45 , que se sabe que es regulado positivamente en varios tipos de cáncer y también en trastornos inflamatorios crónicos y hereditarios.

El mieloma múltiple (MM), conocido también como mieloma de célula plasmática o enfermedad de Kahler, es un cáncer de las células del plasma. Actualmente el mieloma múltiple es incurable, aunque se pueden inducir remisiones temporales usando esteroides, quimioterapia, talidomida, inhibidores de proteosoma (Pls), por ejemplo bortezomib, melfalan, y trasplantes de células madres. De acuerdo con la Sociedad Americana para el Cáncer, existen aproximadamente 45,000 personas en los Estados Unidos que viven con mieloma múltiple, siendo diagnosticados aproximadamente 15,000 casos nuevos cada año en los Estados Unidos. El tiempo de supervivencia promedio a partir del diagnóstico es de aproximadamente 3 años. El mieloma múltiple es el segundo cáncer de sangre más generalizado después del linfoma no Hodgkin, y representa aproximadamente 1 % de todo el cáncer y aproximadamente 2% de todas las muertes por cáncer. La incidencia del mieloma múltiple parece ser creciente y también existe alguna evidencia de que la edad de inicio de la enfermedad está descendiendo. De esta manera, existe una clara necesidad de mejores tratamientos para el mieloma múltiple.

Casi todos los tumores primarios de mieloma múltiple y las líneas celulares de mieloma múltiple exhiben actividad constitutiva de NF-??. El bloqueo de la actividad de NF-?? causa la muerte de las células de mieloma múltiple. Una barrera mayor para obtener resultados en el tratamiento del cáncer a largo plazo con estrategias dirigidas a NF- ?, es la falta de especificidad y por lo tanto una deficiente tolerancia del tratamiento. Esto se debe a las funciones pleiotrópicas de NF- ? y del proteosoma. Existe la necesidad de un enfoque terapéutico radicalmente nuevo que sea más específico, más seguro y por lo tanto más eficaz.

Una de las funciones claves de NF-?? en el mieloma múltiple es promover la supervivencia. Se ha mostrado (De Smaele, et al. (2001 ) Nature 414:306-313) que NF- ? produce citoprotección suprimiendo la cascada de MAPK de JNK por medio de Gadd45p, un miembro de la familia Gadd45 de factores inducibles. El Gadd45 es regulado positivamente por NF- ? en • respuesta a varios estímulos y promueve la supervivencia haciendo blanco directamente en la cinasa JNK MKK7 (Papa, et al. 2004, Nature Cell Biology 6:146-153; Papa, et al. 2007, J. Biol. Chem. 282:19029-19041 ; Papa, et al. (2008), J. Clin. Invest. 1 18:191-1923).

Los inhibidores de proteosoma (Pls) y los inhibidores directos de NF-?? destruyen múltiples células de mieloma activando la ruta JNK, pero son inadecuados para la terapia curativa del mieloma múltiple debido a sus efectos indiscriminados sobre NF-??, y/o efectos indiscriminados sobre el proteosoma, lo que impide que sean utilizados a las dosis curativas completamente inhibitorias.

Además del mieloma múltiple, el Gadd45 es expresado en alto grado en otros tumores que incluyen linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, leucemia promonocítica y otras leucemias, así como . también algunos tumores sólidos que incluyen carcinoma hepatocelular, cáncer de la vejiga, cáncer del cerebro y del sistema nervioso central, cáncer de la mama, cáncer de la cabeza y cuello, cáncer del pulmón y cáncer de la próstata. Por lo tanto, la inhibición de Gadd45p en estos tumores puede inducir la muerte de la célula cancerosa y así tener efectos terapéuticos benéficos. También se sabe que muchas malignidades hematológicas (que incluyen mieloma múltiple, linfoma de células del manto, linfoma MALT, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Hodgkin, síndrome mielodisplásico, leucemia de células T del adulto (HTLV-1), leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia mielogénica aguda y leucemia linfocítica aguda), y tumores sólidos (que incluyen cáncer de la mama, cáncer cervical, cáncer renal, cáncer del pulmón, cáncer del colon, cáncer del hígado, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer laríngeo, cáncer tiroideo, cáncer paratiroideo, cáncer de la vejiga, cáncer del ovario, cáncer de la próstata, cáncer del páncreas y otros tipos de cáncer), exhiben activación constitutiva de NF- ? suministrando señales promotoras de supervivencia a las células a expensas de la MCP que de otra manera produciría un aumento de la muerte de las células de tumor (V. Baud y M. Karin 2009, Nat. Rev. Drug Disc. 8: 33-40). La actividad constitutiva de NF- ? también se encuentra en melanoma, cilindroma, carcinoma de células escamosas (piel y cabeza y cuello), carcinoma oral, carcinoma endometrial, retinoblastoma, astrocitoma y glioblastoma (V. Baud y M. Karin 2009, Nat. Rev. Drug Disc. 8: 33-40). La inhibición de Gadd45 en estos tumores que presentan una actividad constitutiva de NF-?? altamente aberrante también podría producir efectos terapéuticos benéficos, induciendo muerte celular programada en las células cancerosas. La presente invención se basa en la comprensión de que haciendo blanco en distintas funciones promotoras de supervivencia celular de NF-?? por medio de Gadd45p se obtiene una terapia más segura y más eficaz, que no está dirigida directamente a NF-??, para una gama de enfermedades y trastornos que incluyen el cáncer y también otras enfermedades caracterizadas por supervivencia celular aberrante, o enfermedades que se pueden tratar mediante la inducción de MCP (tales como enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades degenerativas y enfermedades isquémicas y vasculares).

Una amplia gama de enfermedades y trastornos dependen de la actividad de NF-??. En realidad, ahora se considera que la patogénesis de virtualmente cualquier enfermedad o trastorno humano conocido depende de la inflamación, y por lo tanto implica NF-??. Este funciona como un interruptor maestro de la respuesta inflamatoria, coordinando la expresión de un conjunto de más de 200 genes que codifican citocinas, receptores, factores de transcripción, quimocinas, enzimas proinflamatorias y otros factores que incluyen factores promotores de supervivencia, que inician y sostienen la inflamación. Los compuestos de la invención inhiben la distinta actividad promotora de supervivencia de NF-?? en la inflamación. Por lo tanto, las enfermedades y trastornos susceptibles de tratamiento con estos compuestos incluyen, aparte de las enfermedades inflamatorias crónicas convencionales (tales como enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide y psoriasis), otras enfermedades y trastornos que dependen de un componente inflamatorio significativo. Los ejemplos de tales enfermedades y trastornos, que son tratados con agentes antiinflamatorios o agentes inhibidores de NF- B, O que se ha propuesto que son susceptibles de tratamiento con inhibidores de NF-?? y también se podrían tratar con un compuesto de la invención, incluyen: 1. Aparato respiratorio: enfermedades obstructivas de las vías aéreas que incluyen: asma, que incluye asma bronquial, alérgico, intrínseco, extrínseco, inducido por ejercicio, inducido por fármaco (que incluye inducido por aspirina y AINE) y asma inducido por polvo, tanto intermitente como persistente y de toda severidad, y otras causas de hipersensibilidad de las vías aéreas; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); bronquitis que incluye bronquitis infecciosa y eosinofílica; enfisema; bronquiectasia; fibrosis quística, sarcoidosis; pulmón del granjero y enfermedades relacionadas; neumonitis por hipersensibilidad; fibrosis pulmonar que incluye alveolitis fibrosante criptogénica, neumonías intersticiales idiopáticas, terapia antineoplásica con complicación fibrótica e infección crónica que incluye tuberculosis y aspergilosis y otras infecciones fúngicas; complicaciones del trasplante de pulmón; trastornos vasculíticos y trombóticos de la vasculatura pulmonar e hipertensión pulmonar; actividad antitusiva que incluye el tratamiento de la tos crónica asociada con condiciones inflamatorias y secretorias de las vías aéreas y tos iatrogénica; rinitis aguda y crónica que incluye rinitis medicamentosa y rinitis vasomotora; rinitis alérgica perene y estacional que incluye rinitis nerviosa (fiebre del heno); poliposis nasal; infección viral aguda que incluye el resfriado común e infección causada por el virus sincitial respiratorio, influenza, coronavirus (que incluye SARS) o adenovirus; o esofagitis eosinofílica. 2. Hueso y articulaciones: artritis asociadas con, o que incluyen, osteoartritis/osteoartrosis, tanto primaria como secundaria, por ejemplo displasia congénita de la cadera; espondilitis cervical y lumbar, y lumbalgia y dolor del cuello; osteoporosis; artritis reumatoide y enfermedad de Still; espondiloartropatías seronegativas que incluyen espondilitis anquilosante, artritis psoriática, artritis reactiva y espondoartropatía no diferenciada; artritis séptica y otras artropatías relacionadas con infección y trastornos del hueso como tuberculosis, que incluyen la enfermedad de Potts y el síndrome de Poncet; sinovitis aguda y crónica inducida por cristal, que incluye gota por urato, enfermedad de depósito de pirofosfato de calcio, e inflamación de tendón, bursal y sinovial relacionada con apatita de calcio; enfermedad de Behcet; síndrome de Sjogren primario y secundario; esclerosis sistémica y esclerodermia limitada; lupus eritematoso sistémico, enfermedad de tejido conectivo mixto, y enfermedad de tejido conectivo no diferenciada; miopatías inflamatorias que incluyen dermatomiositis y polimiositis; polimialgia reumática; artritis juvenil que incluye artritis inflamatoria idiopática de cualquier distribución de articulación y síndromes asociados y fiebre reumática y sus complicaciones sistémicas; vasculitis que incluyen arteritis de células gigantes, arteritis de Takayasu, síndrome de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, poliarteritis microscópica y vasculitis asociada con infección viral, reacciones de hipersensibilidad, crioglobulinas y paraproteínas; lumbalgia; fiebre familiar del Mediterráneo, síndrome de Muckle-Wells, y fiebre hiberniana familiar, enfermedad de Kikuchi; artralgias inducidas por fármaco, tendonitis, y miopatías. 3. Dolor y remodelación del tejido conectivo de trastornos musculoesqueléticos por lesión [por ejemplo lesiones deportivas] o enfermedad: artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, osteoartritis, gota o artropatía de cristal), otra enfermedad de articulaciones (tal como degeneración de disco intervertebral o degeneración de articulación temporomandibular), enfermedad de remodelación de hueso (tal como osteoporosis, enfermedad de Paget u osteonecrosis), policondritis, esclerodermia, trastorno mixto del tejido conectivo, espondiloartropatías o enfermedad periodontal (tal como periodontitis). 4. Piel: psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis de contacto u otras dermatosis eczematosas, y reacciones de hipersensibilidad de tipo tardío; fito- y fotodermatitis; dermatitis seborreica, dermatitis herpetiforme, liquen plano, liquen escleroso y atrófico, pioderma gangrenoso, sarcoide de la piel, lupus eritematoso discoide, pénfigo, penfigoide, epidermólisis bulosa, urticaria, angioedema, vasculitis, eritemas tóxicos, eosinofilias cutáneas, alopecia areata, calvicie de patrón masculino, síndrome de Sweet, síndrome de Weber-Christian, eritema multiforme; celulitis tanto infecciosa como no infecciosa, paniculitis; linfomas cutáneos, cáncer de piel no melanoma y otras lesiones displásicas; trastornos inducidos por fármaco que incluyen erupciones fijas por fármaco. 5. Ojos: blefaritis; conjuntivitis que incluye conjuntivitis perene y alérgica vernal; iritis; uveítis anterior y posterior; coroiditis; trastornos inflamatorios, autoinmunes o degenerativos que afectan la retina; oftalmitis que incluyen oftalmitis simpática; sarcoidosis; infecciones que incluyen virales, fúngicas y bacterianas. 6. Aparato gastrointestinal: glositis, gingivitis, periodontitis; • esofagitis que incluye reflujo; gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis, enfermedad de Crohn, colitis que incluye colitis ulcerosa, proctitis, prurito anal; enfermedad celiaca, síndrome del intestino irritable, y alergias relacionadas con alimentos que pueden tener efectos distantes del intestino (por ejemplo, migraña, rinitis o eczema). 7. Región abdominal: hepatitis que incluye autoinmune, alcohólica y viral, fibrosis y cirrosis del hígado; colecistitis; pancreatitis tanto aguda como crónica. 8. Aparato genitourinario: nefritis que incluye intersticial y glomerulonefritis; síndrome nefrótico; cistitis que incluye cistitis aguda y crónica (intersticial) y úlcera de Hunner; uretritis aguda y crónica, prostatitis, epididimitis, ooforitis y salpinguitis; vulvovaginitis, enfermedad de Peyronie; disfunción eréctil (tanto masculina como femenina). 9. Rechazo de aloinjerto: agudo y crónico subsiguiente, por ejemplo, a trasplante de riñon, corazón, hígado, pulmón, médula ósea, piel o córnea, o subsiguiente a transfusión sanguínea; o enfermedad crónica de injerto contra hospedero. 10. SNC: enfermedad de Alzheimer y otros trastornos de demencia que incluyen CJD y nvCJD; amiloidosis; esclerosis múltiple y otros síndromes desmielinizantes; aterosclerosis y vasculitis cerebral; arteritis temporal; miastenia grave; dolor agudo y crónico (agudo, intermitente o persistente, de origen central o periférico) incluso dolor visceral, cefalea, migraña, neuralgia trigeminal, dolor facial atípico, dolor de articulación y hueso, dolor que se origina por cáncer e invasión de tumor, síndromes de dolor neuropático que incluyen neuropatía diabética, postherpética y asociada con VIH; neurosarcoidosis; complicaciones del sistema nerviosos central y periférico de procesos malignos, infecciosos o autoinmunes. 11. Otros trastornos autoinmunes y alérgicos que incluyen tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison, diabetes mellitus, púrpura trombocitopénica idiopática, fascitis eosinofílica, síndrome de hiper-lgE, síndrome antifosfolípido. 12. Otros trastornos con un componente inflamatorio o inmunológico, incluso síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), lepra, síndrome de Sezary, y síndromes paraneoplásicos. 13. Aparato cardiovascular: ateroesclerosis que afecta la circulación coronaria y periférica; pericarditis; miocarditis, cardiomiopatías inflamatorias y autoinmunes que incluyen sarcoide miocárdico; lesiones isquémicas de reperfusión, endocarditis, valvulitis y aortitis que incluyen la infecciosa (por ejemplo sifilítica); vasculitis; trastornos de las venas proximales y periféricas incluso flebitis y trombosis, que incluye trombosis venosa profunda y complicaciones de venas varicosas. 14. Aparato gastrointestinal: enfermedad celiaca, proctitis, gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis intermitente, trastorno de intestino irritable, síndrome de intestino irritable, diarrea no inflamatoria, alergias relacionadas con alimentos que tiene efectos distantes del intestino, por ejemplo migraña, rinitis y eczema.

La presente invención se refiere a inhibidores novedosos del complejo Gadd45p/MKK7 y/o señalización de ese complejo, que se pueden usar para inhibir la función promotora de supervivencia de NF-?? en el cáncer, inflamación, trastornos autoinmunes y degenerativos, isquémicos y vasculares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se provee un compuesto de fórmula I: I: X A-X2 en donde: A es A"", o A"-[M-A'-]n M-A'"; A"" es A", A'", o ?^?-??-?^, en donde Y2-Y3 es una porción de oligopéptido o una porción de oligopeptoide que tiene los residuos Y2-Y3, y Z-i está unido al nitrógeno N-terminal de Y2-Y3, y Z4 está unido al carbono C-terminal de Y2-Y3; A" es A', o Y1-Y2-Y3-Z4, en donde Y1-Y2-Y3 es una porción de oligopeptoide o una porción oligopeptoide que comprende los residuos: Y1-Y2-Y3, y Z4 está unido al carbono C-terminal de Y1-Y2-Y3; A'" es A', o Z1-Y2-Y3-Y4, en donde Y2-Y3-Y4 es una porción de oligopeptoide o una porción oligopeptoide que comprende los residuos Y2-Y3- Y4, y ?? está unido al nitrógeno N-terminal de Y2-Y3-Y4; cada ocurrencia de A' es independientemente una porción de oligopéptido o una porción de oligopeptoide que comprende los residuos Yr Y2-Y3-Y4; n es un entero de 0 a 18; Yi y Y4 son independientemente residuos de aminoácido o residuos de derivados de aminoácido que tienen cadenas laterales aromáticas; Y2 es un residuo de aminoácido o un residuo de un derivado de aminoácido, o está ausente; Y3 es un residuo de aminoácido o un residuo de un derivado de aminoácido, o está ausente; Zi es un grupo de la fórmula II: que está enlazado al nitrógeno N-terminal de Y2; W está ausente o es un oxígeno o un nitrógeno, o un grupo alquileno de uno a tres carbonos, dicho grupo alquileno de uno a tres carbonos está sustituido opcionalmente con al menos un sustituyente seleccionado de alquilo de uno a cuatro carbonos, o un grupo aromático carbocíclico o heterocíclico de 5-10 miembros; J es un grupo aromático carbocíclico o heterocíclico de 5-10 miembros, dicho grupo aromático está sustituido opcionalmente con al menos un sustituyente seleccionado de hidroxilo, halógeno, alquilo de uno a cuatro carbonos, o alcoxi de uno a cuatro átomos de carbono; Z4 representa un grupo de la fórmula III: que está enlazado al carbono C-terminal de Y3; R es hidrogeno o alquilo de uno a cuatro carbonos; W está ausente o es un grupo alquileno de uno a tres carbonos, dicho grupo alquileno de uno a tres carbonos está sustituido opcionalmente con al menos un sustituyente seleccionado de alquilo de uno a cuatro carbonos, o un grupo aromático carbocíclico o heterocíclico de 5-10 miembros; J' es un grupo carbocíclico alifático de 3-10 miembros o un grupo aromático carbocíclico o heterocíclico de 5-10 miembros, dicho grupo alifático o aromático está sustituido opcionalmente con al menos un sustituyente seleccionado de hidroxilo, halógeno, alquilo de uno a cuatro carbonos, o alcoxi de uno a cuatro átomos de carbono; M es un enlace peptídico entre la porción precedente de oligopéptido u oligopeptoide (?', A" o A'") y la porción subsiguiente de oligopéptido u oligopéptido (?', A" o A'"), o una porción enlazadora unida por medio de un enlace de amida, un enlace de éster, un enlace de éter, o un enlace de tioéter, al grupo carboxílico terminal de la porción precedente de oligopéptido u oligopeptoide (?', A" o A'"), y por medio de un enlace de amida, un enlace de éster, un enlace de éter, o un enlace de tioéter al grupo amino terminal de la porción subsiguiente de oligopeptoide (?', A" o A'"); Xi está ausente o es una porción añadida al extremo amino de A para bloquear el grupo amino libre; X2 está ausente o es una porción añadida al extremo carboxilo de A para bloquear el grupo carboxilo libre; con la condición de que está ausente si A comprende Z-i, y X2 está ausente si A comprende ¾; o derivados de los mismos, dichos derivados seleccionados del grupo que consiste en: a) oligómeros o multímeros de moléculas del compuesto de fórmula I, dichos oligómeros y multímeros comprendiendo dos o más moléculas del compuesto de fórmula I, cada una enlazada a una porción de armazón común por medio de un enlace de amida formado entre un grupo amino o ácido carboxílico presente en las moléculas del compuesto de fórmula I, y un grupo amino o ácido carboxílico opuesto sobre una porción de armazón, dicha porción de armazón participando en por lo menos dos enlaces de amida; b) derivados que comprenden una molécula del compuesto de fórmula I, o un oligómero o multímero del mismo como se define arriba en el inciso a), conjugado por medio de un enlace de amida, un enlace de éster, un enlace de éter o un enlace de tioéter con: PEG, compuestos basados den PEG, péptidos penetradores de célula, colorantes fluorescentes, biotina u otra porción de cola, ácidos grasos, nanopartículas de tamaño discreto, o ligandos quelantes en complejo con iones metálicos o radioactivos; c) derivados que comprenden una molécula del compuesto de fórmula I o un oligómero o multímero del mismo como se define en el inciso a), que ha sido modificada por amidación, glicosilación, carbamilación, acilación, sulfonilación, fosforilación, ciclización, lipidación, pegilación o enlace con un péptido o socio de fusión peptoide, para hacer un péptido de fusión o peptoide de fusión; y d) sales y solvatos de una molécula del compuesto de fórmula I o de un derivado del mismo como se define en los incisos a) o b) anteriores.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se provee una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con el primer aspecto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se provee un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizado por un incremento de la actividad y/o de expresión de NF-??, y/o un incremento de la actividad y/o expresión de Gadd45 , que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con el primer aspecto de la invención, o una composición farmacéutica de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, a un sujeto en necesidad del mismo.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se provee un compuesto de acuerdo con el primer aspecto de la invención, o una composición de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, para usarse como un medicamento.

De acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se provee el uso de un compuesto de acuerdo con el primer aspecto de la invención, o una composición farmacéutica de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizado por un aumento de la actividad y/o expresión de NF- B, y/o un incremento de la actividad y/o expresión de Gadd45p.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Representación esquemática de la interferencia protectora entre las rutas NF- ? y JNK en el contexto de la señalización de TNF-R1. Se puede observar que Gadd45 media la interferencia entre la ruta de supervivencia inducida por NF- ? y la ruta de muerte inducida por MKK7 y JNK. La inhibición de esta interferencia bloqueando Gadd453 permite que MKK7 active JNK, activando así una ruta de muerte en las células de tumor.

Figura 2. Modelo del complejo Gadd45 -MKK7. El modelo se construyó como se reporta en la referencia de Papa S. et al. 2007, J Biol Chem 282: 19029-19041. El modelo se refino adicionalmente usando la estructura cristalográfica de Gadd453 y una estructura de MKK7 (pdb:2DYL) modelada sobre la estructura cristalográfica de Gadd45y (pdb: 3FFM). La estructura de Gadd45 está en azul (listones), mientras que la estructura de MKK7 está en amarillo (listones con la superficie de Van der Waals también representada). Se destacan los lazos ácidos inhibitorios 60-71 y 104-118 de Gadd45p (Papa S. et al. 2007, J Biol Chem 282: 9029-19041 ).

Figura 3A. Examen de ELISA usado para aislar los D-' tetrapéptidos guía (DTP) 1 y 2. Se seleccionaron antagonistas de la interacción Gadd45p/MKK7 examinando una colección combinatoria simplificada de péptidos de fórmula general Fmoc-(pAla)2-Xi-X2-X3-X4-CONH2 (véase la referencia de Marasco et al. 2008, Curr. Protein Pept. Sci. 9:447-67), preparada usando uno de los 12 aminoácidos en cada posición de Xi a X4. Esta colección, que contiene un total de 124=20,736 péptidos diferentes, fue desenrollada iterativamente en 4 pasos por medio de pruebas de competencia de ELISA, usando en cada paso MKK7 (42 nM), (h)Gadd45p humano marcado con biotina soluble (21 nM), y cada una de las 12 subcolecciones a la concentración nominal de 42 nM (no mostrado). Figura 3B: El péptido más activo de la primera generación se usó entonces para la síntesis de una colección de segunda generación. El examen de esta colección suministró 2 péptidos altamente activos (marcados como 1 y 8 en la figura 3B). Figura 3C: Después, los péptidos optimizados se liberaron de Fmoc-( Ala)2-cola y se sintetizaron como los D-¡sómeros, produciendo DTP1 y DTP2, que interrumpen la interacción de Gadd45 /MKK7 con una CI50 de 0.22 nM y 0.19 nM, respectivamente. También se puede ver que los L-isómeros de estos péptidos (es decir, LTP1 y LTP2) exhibieron Cl50 similares a los DTPs en las pruebas de competencia de ELISA, mientras que los péptidos de control negativo, LNC y DNC, no exhibieron efecto inhibitorio detectable sobre la inhibición del complejo Gadd45p/MKK7. LNC, control negativo de L-isómero; LTP1, L-isómero del tetrapéptido 1 ; LTP2, L-isómero de tetrapéptido 2; DNC, control negativo del D-isómero.

Figura 4. Estabilidad de Z-DTPs en fluidos biológicos. Las pruebas de competencia de ELISA muestran que los DTPs Z-protegidos (Z-DTP1 , Z-DTP2) retienen actividad inhibitoria completa después de 48 horas de incubación con suero humano a 37°C (CI50 = 0.19 nM, Z-DTP1; CI50 = 0.18 nM, Z-DTP2), mientras que los LTPs Z-protegidos (Z-LTP1 , Z-LTP2) son desactivados casi completamente después de este tratamiento (valores de Cl50 > 10µ?). Las pruebas se hicieron como en la figura 3C, usando biotina soluble-hGadd45 cubierto con MKK7, y las concentraciones indicadas de los tetrapéptidos Z-LNC y Z-DNC, controles negativos del L- y D-isómero, respectivamente.

Figura 5. Pruebas de co-inmunoprecipitación (co-IP) que muestran la interrupción efectiva y específica de la interacción Gadd45 /MKK7 por los D-tetrapéptidos 1 y 2 (DTP1 y DTP2), pero no por los D-tetrapéptidos de control negativo (NC) (NC1 , NC2, NC3 y NC4). Se hizo Co-IP usando el anticuerpo anti-FLAG (MKK7) y se desarrollaron Western blots usando anticuerpos anti-HA (que detectan HA-Gadd45 ) (arriba) o anti-MKK7 (abajo), como se indica.

Figura 6. Pruebas de la cinasa MKK7 que muestran la interrupción efectiva y específica de la interacción Gadd45 /MKK7 y la restauración de la actividad catalítica de MKK7 por los D-tetrapéptidos 1 y 2 (DTP1 y DTP2), pero no por los D-tetrapéptidos de control negativo (NC) (NC1, NC2, NC3 y NC4). La MKK7 activa se inmunoprecipitó con un anticuerpo anti-FLAG de células HEK-293T tratadas con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)/ionomicina (P/l), y se incubaron con los D-tetrapéptidos en presencia (panel superior) o ausencia (panel inferior) de (h)Gadd45 humano recombinante, como se indica. Como se muestra, ningún D-tetrapéptido guía activo, ni los tetrapéptidos NC de control, inhibieron la actividad catalítica de MKK7 cuando se incubaron con la cinasa en ausencia de Gadd45 (panel inferior).

Figuras 7A, 7B, 7C. Pruebas de incorporación de [3H]timidina que muestran que los derivados Z-protegidos de DTP2 (Z-DTP2), pero no los derivados acetilo de DTP2 (Ac-DTP2) ni los derivados Z-protegidos de los L-isómeros de DTP2 (Z-LTP2), tienen actividad tumoricida significativa en líneas de células de tumor. Los datos se expresan como porcentaje de supervivencia/proliferación de células de tumor después del tratamiento con 10 µ? de Z-DTP2 (Figura 7A), Ac-DTP2 (Figura 7B) o Z-LTP2 (Figura 7C) (columnas en negrita), o con Z-DNC (Figura 7A), Ac-DNC (Figura 7B) y Z-LNC (Figura 7C) (columnas en blanco), con respecto a la supervivencia/proliferación de células no tratadas. Se indican los puntos de ' tiempo. Se muestran 3 de las 8 líneas celulares de mieloma múltiple susceptibles probadas (es decir, U266, KMS-1 1 , NCI-H929), y las líneas de células de linfoma de Burkitt (BJAB) y leucemia promonocítica (U937). Estos datos establecen la alta actividad citotóxica de Z-DTP2 (Figura 7A) en comparación con la inactividad de Ac-DTP2 (Figura 7B) y la baja actividad de Z-LTP (Figura 7C) (véanse también las figuras 8A, 8B y 8C, y el cuadro IV; líneas de mieloma múltiple adicionales). Figura 7B: La ausencia de actividad tumoricida de los Ac-DTP2s en líneas celulares de mieloma múltiple se correlaciona con permeabilidad celular baja de este compuesto, según se estableció en pruebas de CaC02 (datos no mostrados). La viabilidad de líneas celulares de mieloma múltiple después de tratamiento con otros derivados de DTPs menos eficaces (diseñados también para mejorar la captación celular de los DTPs), que incluyen los que llevan un grupo metilo • (Me), acetilo (Ac), miristilo (Myr), 3-metoxi, 4-hidroxi-benzoilo, benzoilo, 6CI- benciloxicarbonilo (6CI-Z), y/o fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), no se muestra. Figura 7C: Aunque la potencia in vitro de los Z-LTPs y la captación celular fueron comparables a las de Z-DTPs (véase la figura 3C; datos tampoco mostrados), Z-LTP2 muestra actividad baja en células de mieloma múltiple, debido a estabilidad baja en los fluidos biológicos (véase la figura 4).

Figuras 8A-8C. La actividad pro-apoptótica de los Z-DTPs es selectiva para líneas de células de tumor con actividad constitutiva de NF-kB. Figuras 8A, 8B, 8C: Pruebas de incorporación de [3H]timidina realizadas como se describe en las figuras 7A-7C, que muestran la supervivencia celular en un panel de líneas de células de tumor después de tratamiento con 10 µ? de Z-DTPs o Z-DNC, durante los siguientes tiempos: 144 h (Figura 8A); 24 h, 72 h o 144 h (Figuras 8B, 8C), como se indica. Figura 8A: Se muestra la potente actividad tumoricida de Z-DTP2 en 8 de 9 líneas celulares de mieloma múltiple, 1 de 2 líneas celulares de linfomas difusos de células B grandes (DLBCL; LY3), 1 de 1 línea celular de leucemia promonocítica (U937), y 1 de 6 líneas celulares de linfoma de Burkit (BJAB) que fueron probadas (véase también la figura 9). De manera interesante, Z-DTP2 mostró actividad citotóxica solo en la línea celular DLBCL del subtipo similar a células B activadas (ABC) (es decir, LY3), y no en el subtipo similar a célula B de centro germinal (GCB) (es decir, SUDHL6), que no presenta activación constitutiva de NF-kB (Ngo VN, et al. Nature 441 (7089): 106- 10; véase también las figuras 12A-12B, grado de expresión de Gadd45p). También muestran actividad en líneas celulares de mieloma múltiple, virtualmente todas las cuales presentan activación constitutiva de NF-??. Actividad tumoricida de Z-DTP2 (Figura 8B) y Z-DTP1 (Figura 7C) en líneas celulares de mieloma múltiple DLBCL después de tratamiento con 10 µ? de Z-DTPI, Z-DTP2 y Z-DNC durante los tiempos indicados (es decir 24, 72 o 144 h, como se muestra). Los resultados se confirmaron en pruebas de exclusión de azul de trípano (datos no mostrados) y pruebas de yoduro de propidio (Pl) (véase la figura 10; datos tampoco mostrados).

Figura 9. Pruebas de incorporación de [3H]timidina que muestran la ausencia de citotoxicidad de Z-DTP2 en un panel de 22 líneas de células de tumor resistentes después de tratamiento con Z-DTP2 por 144 horas, aunque este compuesto se usó a concentraciones muy altas -esto es, 100 µ?. Z-DNC, control D-negativo Z-protegido. También se muestran las líneas de células sensibles BJAB (linfoma de Burkitt), KMS-11 y KMS-12 (mieloma múltiple). Particularmente, hubo una fuerte correlación en estas líneas de células entre la sensibilidad a la destrucción inducida por Z-DTP2 y los grados de expresión de Gadd45 endógeno (véanse las figuras 12A y 12B).

Figura 10. La destrucción inducida por Z-DTP2 en líneas celulares de mieloma múltiple se debe a la apoptosis. Las pruebas de tinción nuclear con yoduro de propidio (Pl) muestran la inducción de apoptosis (es decir, contenido de ADN sub-Gi; véase FL2-A) en las líneas celulares de mieloma múltiple representativas, NCI-H929, KMS-11 , ARH-77, JJN-3 y U266, después de tratamiento con 10 µ? de Z-DTP2 o Z-DNC1 , como se muestra, para 72 o 144 h. También se muestra el contenido de ADN de células no tratadas cultivadas bajo las mismas condiciones. Los porcentajes de células apoptóticas se representan en los histogramas.

Figura 11. El tratamiento con Z-DTP2 causa una fuerte activación de JNK en las líneas celulares de mieloma múltiple. Las células KMS1 1 y NCI-H929 se trataron con 10µ? de Z-DTP2 o Z-DNC, como se muestra, y la activación de JNK se monitoreó en los tiempos indicados por medio de Western blotting, usando un anticuerpo específico anti-fosfo (P)- JNK. Se observa un aumento de la fosforilación de JNK (que un marcador de la activación de JNK) solo después de tratamiento con Z-DTP2, pero no después de tratamiento con el péptido de control negativo Z-protegido (Z- DNC). Se usó la estimulación de TNFa (2,000 U/ml) como control positivo para la activación de JNK. Importantemente, se observaron efectos similares de Z-DTP2 sobre la activación de MKK7 (datos no mostrados). Además, como puede verse con la actividad biológica de Gadd45 (véanse las referencias: De Smaele, et al. (2001) Nature 414:306-313; Papa, S et al, • (2004) Nal Cell Biol. 6, 146-153; Papa, et al. 2007, J. Biol. Chem. 282: 19029- 19041 ; Papa, et al. (2008) J. Clin. Invest. 1 18: 191-1923), los efectos de Z- DTPs en las líneas celulares de mieloma múltiple fueron específicas para la ruta MKK7/JNK, ya que no se observaron efectos con estos compuestos sobre la activación de las rutas de IKK/NF-??, ERK y p38 en estas líneas de células (datos no mostrados).

Figuras 12A-12B. Hay una fuerte correlación en las líneas de células de tumor entre la sensibilidad de las células a la destrucción inducida por Z-DTP y el grado de expresión de Gadd45 . Figura 12A: El panel superior muestra la expresión de Gadd45 en un panel de 29 líneas de células de cáncer (qRT-PCR; columnas rojas); mientras que el panel inferior muestra el porcentaje de muerte celular en las mismas líneas de células después de tratamiento con 10 µ? de Z-DTP2 durante 144 h (incorporación de [3H]timidina; columnas negras). En la figura 12B se muestra la gráfica de correlación de la expresión de Gadd45p contra el porcentaje de supervivencia celular después de tratamiento con Z-DTP2 para el mismo experimento mostrado en la figura 12A. La significancia del coeficiente de correlación entre el dominio de los dos parámetros es muy alta (p<0.001 ) (correlación de Pearson, que cuantifica la asociación entre dos variables, calculada usando el software GraphPad). Estos datos confirman la alta especificidad de objetivo de los Z-DTP en las células. Los valores en la figura 12A (panel superior) se normalizaron para ß-actina.

Figuras 13A-13B. Estructuras químicas de los compuestos relevantes descritos en esta patente, y descripción de los posibles farmacóforos y estrategias para su evaluación. En la figura 13A se muestran las estructuras químicas del compuesto de origen Z-DTP2 (Z-D-Tyr-D-Glu-D-Arg-D-Phe-NH2) [SEQ ID NO: 1], y de los derivados de Z-DTP2, mDTP1 (ácido p-hidroxi-benzoico-D-Glu-D-Arg-fenetilamina), mDTP2 (Ac-D-Tyr-D-Glu-D-Phe-NH2), y mDTP3 (Ac-D-Tyr-D-Arg-D-Phe-NH2). Estos compuestos Z-DTP2 modificados (en adelante denominados mDTPs) se probaron para determinar su actividad tanto in vitro (ELISA) como en células (pruebas de destrucción). También se reportan los pesos moleculares (PM), CI5o in vitro y en las células, y la eficiencia de ligando de Z-DTP2 y de estos compuestos modificados representativos (véase también el cuadro V). En la figura 13B se esbozan los principales pasos de la estrategia lograda para identificar el posible farmacóforo de los compuestos bioactivos (Geeson MP. 2008, J Med Chem. 51 :817- 834). La mayoría de los cambios propuestos ya se ha explorado: grupos N-terminales (véase el cuadro III); intercambio de Tyr a ciclohexilalanina, Phe a ciclohexilalanina; eliminación de la Glu y/o Arg interna; intercambio de Glu a Asp; profármacos de éster sobre la cadena lateral de Asp (véase el cuadro V); permutación de Tyr a Phe; intercambio de Arg a His, Lys o Pro (véase el cuadro VI). Juntos, los datos muestran que el farmacóforo bioactivo puede ser descrito de la siguiente manera: una tirosina o un anillo aromático similar con donador/aceptores de enlace de H requeridos en la posición Y-i ; por lo menos un alfa-aminoácido requerido en la posición Y2 y/o Y3, preferiblemente con un grupo básico para mejorar la captación celular. También permiten la retención de bioactividad prolina, asparaginas o leucina en la posición Y2 con o sin arginina en la posición Y3. Una distancia mayor de aproximadamente 7 Angstrom entre los dos anillos aromáticos (es decir, una distancia mayor que la impuesta por un alfa-aminoácido) causa una reducción de la bioactividad; se requiere un anillo aromático en la posición Y4 con o sin grupos donadores/aceptores de enlace de H para retención de la bioactividad (cuadro VI).

Figuras 14A-14E. Actividad citotóxica de los Z-DTPs en células de mieloma múltiple primarias aisladas de 5 pacientes representativos. Cada panel representa los datos obtenidos con células de un paciente diferente -esto es paciente 1 (Figura 14A), paciente 2 (Figura 14B), paciente 3 (Figura 14C), paciente 4 (Figura 14D) y paciente 5 (Figura 14E). Figuras 14A-14E: Los tratamientos con Z-DTP2, Z-DTP1 y Z-DNC fueron a las concentraciones indicadas durante 48 h. También se muestran las células no tratadas de cada paciente (-). Las pruebas se hicieron usando exclusión de azul de trípano y conteo de células. Los valores representan el porcentaje de células vivas " observado después del tratamiento con Z-DTP2, Z-DTP1 o Z-DNC, con respecto a la viabilidad de células de control no tratadas.

Figuras 15A-15B. Ausencia de actividad citotóxica de los Z-DTPs en células primarias no trasformadas de individuos libres de mieloma múltiple, que incluyen células estromales de médula ósea (BMSCs) (Figura 15A), células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) (Figura 15A), y células madre mesenquémicas (MSCs) (Figura 15B), o en linfocitos B y T primarios purificados de ratones (Figura 15B). Los tratamientos con Z-DTP2, Z-DTP1 y Z-DNC fueron a las concentraciones indicadas para: 48 h (BMSCs, PBMNCs) (Figura 15A), 72 h (células B y T murinas) (Figura 15B), o 144 h MSCs (Figura 15B). Las pruebas se hicieron usando exclusión de azul de trípano y conteo de células (Figura 15A) o incorporación de [3H]timidina (Figura 15B).

Figuras 16A-16C. Inducción de muerte celular en líneas celulares • de mieloma múltiple representativas después de silenciamiento, mediado por sh-RNA, de la expresión de Gadd45p. Figuras 16A-16C) Las líneas celulares de mieloma múltiple sensibles a Z-DTP, ARH-77 (Figura 16A) y NCI-H929 (Figura 16B), y la línea celular de mieloma múltiple resistente a Z-DTP, RPMI- 8226 (Figura 16C) se infectaron con lentivirus que expresan sh-RNAs específicos de Gadd45P (es decir, sh-Gadd45 -1 , sh-Gadd453-2, o sh- Gadc^-3), sh-RNAs específicos de MKK7 (es decir, sh-MKK7-1 o sh-MKK7-2), o sh-RNAs no específicos (es decir, sh-NS-1 o sh-NS-2), y la viabilidad de las células infectadas se monitoreó durante un periodo de 8 días usando citometría de flujo -que revela las células que tienen un incremento en la expresión de la proteína fluorescente verde (eGFP), esto es células infectadas- y conteo de células. Se muestra el porcentaje de supervivencia de las células de mieloma múltiples eGFP+ (esto es, infectadas) en los tiempos indicados con respecto a la viabilidad de las células de mieloma múltiple eGFP+ en el mismo cultivo el día 0. (Figuras 16A-16C) Las células se infectaron con lentivirus pLentiLox.3.7 que expresa los sh-RNAs indicados así como también eGFP, usando los métodos estándares (como se reportan en la referencia de Yang H et al., Proc Nati Acad Sci U S A, 5 de julio de 2006; 103(27): 10397-402). Cinco días después, las células eGFP+ se clasificaron usando un clasificador de células BD FACSAria™ II; después se dejaron reposar durante 2 días antes de empezar los análisis de viabilidad celular. Este tiempo (esto es, el inicio de los análisis de viabilidad) se denota en las gráficas como día 0). Los datos muestran que la inhibición de la expresión de Gadd45 causa una muerte celular rápida de las líneas celulares de mieloma múltiple que son sensibles a toxicidad inducida por Z-DTP (esto es, las líneas de células ARH-77, NCI-H929) (figuras 16A-16B), pero no en la línea celular de mieloma múltiple RPMI-8226 (figura 16C), que es resistente a esta toxicidad. Estos datos establecen adicionalmente la especificidad de objetivo de los Z-DTPs para el complejo Gadd45 /MKK7 en las células de mieloma múltiple (véanse también las figuras 7A-7C, 8A-8C, 9 y 12A-12B; pruebas de destrucción y qRT-PCR). También muestran la función esencial que desempeña Gadd45 en la supervivencia de las células de mieloma múltiple, validando así adicionalmente a Gadd45p como objetivo terapéutico en el mieloma múltiple.

Figuras 17A-17B. Pruebas de incorporación de [3H]-timidina que muestran que el silenciamiento mediado por sh-RNA de Gadd45 , pero no de MKK7, tiene actividad tumoricida potente en líneas celulares de mieloma múltiple que son susceptibles de destrucción inducida por Z-DTPs (esto es, las líneas celulares ARH-77 y NCI-H929; véanse también las figuras 7A, 7B, 7C y 8, sensibilidad a la destrucción inducida por Z-DTP). La viabilidad de la línea celular de mieloma múltiple resistente a Z-DTP, RPMI-8226, más bien no es afectada por inhibición de Gadd45 mediada por sh-RNA. Figura 17A: Se muestra la viabilidad de las tres líneas celulares de mieloma múltiple representativas, RPMI-8226, NCI-H929 y ARH-77, después de silenciar Gadd45 o MKK7. Figura 17B: Se muestra la viabilidad de la línea celular de mieloma múltiple, ARH-77, después de silenciar Gadd45ß o MKK7 usando tres sh-RNAs diferentes específicos de Gadd45p (es decir, sh-Gadd45 -1 , sh-Gadd45p-2, o sh-Gadd45 -3), dos sh-RNAs diferentes específicos de MKK7 (es decir, sh-MKK7-1 o sh-MKK7-2), y dos sh-RNAs diferentes no específicos (es decir, sh-NS-1 o sh-NS-2). (Figuras 17A y 17B): Líneas celulares de mieloma múltiple se infectaron con el lentivirus indicado, pLentiLox.3.7, que expresa sh-RNA; luego las células de mieloma múltiple eGFP+ (esto es, las células infectadas con el lentivirus) se clasificaron usando un clasificador de células BD FACSAria™ II como se indica en las figuras 16A-16C. Se hicieron pruebas de incorporación de [3H]-timidina 10 días después de la clasificación celular, que corresponden al día 8 en las figuras 16A-16C. Se muestra el porcentaje de incorporación de [3H]-timidina (esto es, c.p.m.), una medida de la proliferación celular, el día 8 (esto es, 10 días después de la clasificación celular), con respecto a la incorporación de [3H]-timidina que ocurre en las mismas células el día 0 (esto es, 2 días después de la clasificación celular). Estos datos establecen adicionalmente la especificidad de objetivo de los Z- DTPs para el complejo Gadd45p/MKK7 en células de mieloma múltiple • (véanse también las figuras 7A-7C, 8A-8C, 9 y 12A-12B, destrucción inducida por Z-DTP y expresión de Gadd45 ; figuras 16A-16C, silenciamiento de los genes Gadd45 y MKK7), y confirman la función esencial que desempeña Gadd45 en la supervivencia de las células de mieloma múltiple. Juntos, también validan a Gadd45p como objetivo terapéutico en el mieloma múltiple.

Figuras 18A-18C. Pruebas de tinción nuclear de Pl que muestran que el silenciamiento mediado por sh-RNA de Gadd45 induce apoptosis en las líneas celulares de mieloma múltiple sensibles a Z-DTP, ARH-77 (Figura 18A) y NCI-H929 (Figura 18B), pero no en la línea celular de mieloma múltiple resistente a Z-DTP, RPMI-8226 (Figura 18C) (véanse también las figuras 16A- 16C y 17A-17B, silenciamiento mediado por sh-RNA; figuras 7A-7C, 8A-8C y 12A-12B, sensibilidad de las líneas celulares de mieloma múltiple a la destrucción inducida por Z-DTP y expresión de Gadd45 ). (Figuras 18A-18C): No se observó inducción significativa de apoptosis en las mismas líneas celulares de mieloma múltiple en ausencia de infección lentiviral (no infectadas) o después de la expresión de sh-RNAs específicos de MKK7 (es decir, sh-MKK7-1 y sh-MKK7-2) o sh-RNAs no específicos (es decir, sh-NS-1 y sh-NS-2). Las líneas celulares de mieloma múltiple se infectaron con lentivirus pLentiLox.3.7 que expresan sh-RNA, y las células de mieloma múltiple eGFP+ (esto es, las células infectadas con lentivirus) se clasificaron usando un clasificador de células BD FACSAria™ II como en las figuras 16A-16C. Se hicieron pruebas de tinción nuclear de Pl 10 días después de la clasificación celular, que corresponden al día 8 en las figuras 16A-16C. Los porcentajes de células apoptóticas (esto es, las células que muestran contenido de ADN sub-d) se representan en los histogramas. (Figura 18A): De manera importante, el grado de apoptosis inducido por los diferentes sh-RNAs específicos de Gadd45p (esto es, sh-Gadd45 -1 , sh-Gadd45P-2 y sh-Gadd45p-3) se correlaciona con el grado de regulación negativa de Gadd45 inducida por cada uno de estos sh-RNAs específicos de Gadd45 (datos no mostrados). (Figuras 18A-18C): Estos datos establecen adicionalmente la especificidad de objetivo de los Z-DTPs para el complejo Gadd45p/MKK7 en las células de mieloma múltiple (véanse también las figuras 7A-7C, 8A-8C y 9, pruebas de destrucción con Z-DTPs; figuras 12A-12B, correlación estadísticamente significativa entre la expresión de Gadd45P y la sensibilidad de las células de cáncer a la destrucción inducida por Z-DTP; figuras 16A-16C y 17A-17B, inducción de destrucción de células de mieloma múltiple por la regulación negativa de Gadd45 , pero no de MKK7), y confirma la función esencial que desempeña Gadd45 en la supervivencia de las células de mieloma múltiple. Juntos, validan adicionalmente a Gadd45 como objetivo terapéutico en el mieloma múltiple.

Figuras 19A-19C. Pruebas de tinción nuclear de Pl que muestran que el silenciamiento mediado por sh-RNA de MKK7 o Gadd45 no afecta la distribución del ciclo celular en líneas celulares de mieloma múltiple. Las líneas celulares de mieloma múltiple representativas infectadas por lentivirus que se muestran -esto es, ARH-77 (Figura 19A), NCI-H929 (Figura 19B) y RPMI-8226 (Figura 19C)- son del mismo experimento mostrado en las figuras 18A-18C. Diferentemente de los datos mostrados en las figuras 18A-18C (en donde los perfiles de tinción de Pl están representados en una escala logarítmica que destaca la apoptosis), la tinción de Pl (esto es, FL2-A) en esta figura está representada en una escala lineal que destaca la distribución del ciclo celular. Los porcentajes de células de mieloma múltiple en las diferentes fases del ciclo celular (esto es, G-i , S y G2 M) están representados en los histogramas. (Figuras 19A-19B): No se pudieron hacer análisis del ciclo celular con sh-RNAs específicos de Gadd45 en las líneas celulares de mieloma múltiple ARH-77 (Figura 19A) y NCI-H929 (Figura 19B), debido a la inducción de apoptosis masiva en estas células (véanse las figuras 18A y 18B).

Figuras 20A-20C. El silenciamiento mediado por sh-RNA de MKK7 hace a la línea celular sensible a Z-DTO representativa, ARH-77, resistente a la destrucción inducida por Z-/mDTP. Las pruebas de incorporación de [3H]-timidina muestran los valores de CI5o del D-isómero de tetrapéptido de control negativo (Z-DNC) (Figuras 20A-20C), Z-DTP1 (Figura • 20A), Z-DTP2 (Figura 20B), o mDTP3 (Figura 20C), en células de mieloma múltiple ARH-77 que expresan sh-RNAs específicos de MKK7 (sh-MKK7) o no específicos (sh-NS). El tratamiento de las células ARH-77 con Z-DNC, Z- DTP1 , Z-DTP2, o mDTP3 fue durante 3 días. Puede observarse que las células ARH-77 que expresan sh-NS son altamente sensibles a la destrucción inducida por Z-/mDTP -mostrado por los valores de Cl50 de 1.4 µ? (Z-DTP1 ; figura 20A), 302 nM (Z-DTP2; figura 20B) y 303 nM (mDTP3; figura 20C)-, de forma similar a lo que se observa en las células ARH-77 progenitoras no infectadas (véase el cuadro IV). (Figuras 20A-20C): En contraste, las células ARH-77 que expresan sh-MKK7 se hicieron completamente resistentes a la destrucción inducida por Z-/mDTP -mostrado por los valores de CI5o > 10 µ?- de forma similar a lo que se observa en las células ARH-77 tratadas con Z- DNC. Los valores de CI50 se calcularon como se describe en la sección de ¦ ejemplos, usando concentraciones crecientes de Z-DNC (Figuras 20A-20C), Z-DTP1 (Figura 20A), Z-DTP2 (Figura 20B), y mDTP3 (figura 20C), que varían de 0.01 µ? a 10 µ?. En las gráficas se reportan los porcentajes de las cuentas por minuto (c.p.m.), una medida de la proliferación celular, obtenidos con células tratadas con péptidos, con respecto a los valores de c.p.m. obtenidos con células no tratadas. Se obtuvieron datos similares con líneas celulares de mieloma múltiple sensibles a Z-/mDTP adicionales, que incluyen las líneas celulares U266, KMS-1 1 y KMS-12 (datos no mostrados). (Figuras 20A-20C): Estos datos demuestran la especificidad de objetivo muy alta de Z-/mDTPs para el complejo Gadd45 /MKK7 en las células de mieloma múltiple (véase también las figuras 12A-12B, correlación entre la expresión de Gadd45 y la sensibilidad de las células de cáncer a la destrucción inducida por Z-DTP).

Figuras 21A-21 D. Los compuestos de la invención no se unen a Gadd45p o a MKK7 en aislamiento; más bien, para la unión requieren la formación del complejo Gadd45 /MKK7, determinada en pruebas de Biacore. Figura 21 A: Se muestra la unión de Gadd45p al dominio de cinasa de MKK7 (MKK7KD) inmovilizado sobre un chip. Se inyectaron diferentes concentraciones de Gadd45ß (que varían de 20 nM a 200 nM) sobre el chip en donde se había inmovilizado previamente MKK7KD. Se registró la unión dependiente de la dosis de Gadd45 a MKK7KD y se hicieron las curvas de disociación del complejo Gadd45 /MKK7KD¡ se determinó un valor de la constante de disociación al equilibrio (KD) de 4.0 ±0.7 nM promediando los valores determinados por los parámetros cinéticos de cada curva individual. Brevemente, el parámetro termodinámico de la constante de disociación al equilibrio (KD) se calculó considerando las fases de asociación (ka) y disociación ( d) que corresponden a un aumento o disminución de la señal de SPR (expresado como unidades de respuesta, UR), respectivamente. Figura 21 B: Unión de MKK7KD a Gadd45p, cuando Gadd45p se inmovilizó sobre el chip. Aquí, los valores de KD se determinaron inyectando MKK7«D a diferentes concentraciones (que varían de 1 nM a 25 nM) sobre un chip con Gadd453 inmovilizado. Como en la figura 21 A, las curvas dosis-respuesta se registraron a todas las concentraciones probadas de MKK7«D- De estos análisis se obtuvo un valor de KD de 3.4 ±0.6 nM -que es muy similar al valor de D obtenido en la figura 21 A. Figura 21 C: Se muestra la inyección de mDTP3 sobre un chip que contenía Gadd45 o MKK7KD. Para determinar si mDTP3 se une a Gadd45p y/o a MKK7«D, una solución que contenía mDTP3 a una concentración que varía de 1 nM a 10 µ? se inyectó sobre un chip modificado con una o la otra proteína. Como puede verse, no se registró unión de mDTP3 a Gadd45P ni a MKK7, incluso a la concentración más alta usada de mDTP3 (es decir, 10 µ?). Figura 21 D: Se muestra la unión de mDTP3 a un complejo Gadd45 /MKK7 preformado. Una concentración de 100 nM de Gadd45 se inyectó sobre el chip modificado con MKK7KD (60 µ?, tiempo de contacto de 3 min). Las proteínas Gadd45 se dejaron disociar durante aproximadamente 10 min, y cuando todavía estaba unido aproximadamente 50% de Gadd45 a MKK7«D, se inyectó mDTP3 a la concentración de 10 nM, 100 nM, o 1 µ?. Como puede verse, cuando se usó mDTP3 a una concentración equivalente o menor de 100 nM, indujo una disociación rápida del complejo Gadd45p/MKK7«D- Como también puede verse, la formación del complejo Gadd45 /MKK7KD se recuperó rápidamente después de quitar el mDTP3. Sin embargo, a concentraciones más altas (por ejemplo, 1 µ?), mDTP3 produjo curvas de dosis-respuesta de unión y disociación, indicando que se estuvo uniendo a Gadd45 y/o a MKK7KD o a un complejo de las dos proteínas. Estos datos apoyan el punto de vista de que los DTPs no se unen a las proteínas Gadd45 o MKK7 en aislamiento; más bien, se unen a una y/o la otra proteína, o a un complejo de las dos proteínas, solo cuando las dos proteínas hacen contacto una con la otra.

Nota sobre la nomenclatura usada en la presente En varias partes de esta especificación se hace referencia a compuestos por medio de un código significativo tal como LTP, DTP, LNC, DTP1 , etc. Los códigos que contienen "NC" describen compuestos que son · controles negativos no abarcados dentro del alcance de la invención. Los códigos que contienen "TP" (que es una abreviatura de tetra o tri- péptido/peptoides, aunque se debe notar que algunos de los compuestos se basan en motivos de dipéptido/peptoide) están dentro del alcance de la invención. El prefijo "L" o "D" denota los residuos en la configuración óptica L o D. Un subíndice numérico denota un compuesto específico numerado detallado en cualquier parte. El prefijo "Z" como en "Z-DTP" denota un grupo benciloxicarbonilo N-terminal. El prefijo "m" como en "mDTP" denota cualquier modificación de un DTP dirigida a mejorar la captación celular, actividad celular, y/o perfil PK, tal como la eliminación del extremo N y/o C (por ejemplo como en mDTP1), la eliminación del grupo Z y de los residuos de Arg o Glu de Z-DTP2, como en mDTP2 y mDTP3, respectivamente (se dan ejemplos adicionales en las figuras 13A-13B).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La estrategia fundamental de la presente invención surge de una comprensión de que la interferencia de NF-kB-JNK también controla la supervivencia contra la muerte programada de células que incluyen células de cáncer, que de otra manera morirían. Significativamente, Gadd45 está regulada positivamente en las células cancerosas en respuesta a la activación de NF-??, y se expresa constitutivamente en alto grado en las células de mieloma múltiple y otros tumores que incluyen linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, leucemia promonocítica y otras leucemias, así como también en algunos tumores sólidos que incluyen carcinoma hepatocelular, cáncer de la vejiga, cáncer del cerebro y el sistema nervioso central, cáncer de la mama, cáncer de la cabeza y cuello, cáncer del pulmón y cáncer de la próstata. La presente invención se basa en la estrategia de promover la muerte celular programada suministrando compuestos dirigidos a Gadd45 /MKK7 que previenen la interferencia NF-KB-JNK, incrementado así la señalización citotóxica de JNK en las células. Los productos y métodos de la presente invención pueden ser especialmente relevantes para el tratamiento de trastornos caracterizados por regulación positiva aberrante de Gadd453. También son relevantes para enfermedades y trastornos en donde no necesariamente Gadd45p puede estar regulada positivamente de manera aberrante, sino en donde NF-?? es regulada positivamente o activada de manera aberrante y donde un inductor de muerte celular programada por medio de señalización Gadd45 /MKK7 puede proveer un tratamiento.

Los ejemplos de estas enfermedades que presentan regulación positiva o activación aberrante de NF-?? y en donde un inductor de muerte celular programada por medio de señalización Gadd45 -MKK7 puede proveer un tratamiento, incluyen: malignidades hematológicas (tal como mieloma múltiple, linfoma de células del manto, linfoma MALT, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Hodgkin, síndrome mielodisplásico, leucemia de células T del adulto (HTLV-1), leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia mielogénica aguda y leucemia linfocítica aguda), tumores sólidos (tales como cáncer de la mama, cáncer cervical, cáncer renal, cáncer pulmonar, cáncer del colon, cáncer del hígado, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer laríngeo, cáncer de la tiroides, cáncer de la paratiroides, cáncer de la vejiga, cáncer del ovario, cáncer de la próstata, cáncer del páncreas y muchos otros tipos de cáncer), otros tipos de cáncer tales como melanoma, cilindroma, carcinoma de células escamosas [piel y cabeza y cuello], carcinoma oral, carcinoma endometrial, retinoblastoma, astrocitoma y glioblastoma), y otras enfermedades y trastornos tales como enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades degenerativas, enfermedades isquémicas y enfermedades vasculares.

Una amplia gama de enfermedades y trastornos dependen de la actividad de NF- ?. En realidad, la patogénesis de virtualmente toda enfermedad o trastorno humano conocido ahora se considera dependiente de la inflamación y por lo tanto implica a NF-??. Este funciona como un interruptor maestro de la respuesta inflamatoria, coordinando la expresión de una variedad de más de 200 genes que codifican citocinas, receptores, • factores de transcripción, quimocinas, enzimas proinflamatorias y otros factores que incluyen factores pro-supervivencia, que inician y sostienen la inflamación. Los compuestos de la invención inhiben la actividad pro- supervivencia distinta de NF-?? en la inflamación. Por lo tanto, las enfermedades y trastornos susceptibles de tratamiento con estos compuestos incluyen, aparte de las enfermedades inflamatorias crónicas convencionales (tales como enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide y psoriasis), otras enfermedades y trastornos que dependen de un componente inflamatorio significativo. Ejemplos de tales enfermedades y trastornos que se tratan con agentes antiinflamatorios o agentes inhibidores de NF-??, O que se ha propuesto que pueden ser tratados adecuadamente con inhibidores de NF- KB y también se podrían tratar con un compuesto de la invención, incluyen: 1. Aparato respiratorio: enfermedades obstructivas de las vías • aéreas que incluyen: asma, que incluye asma bronquial, alérgico, intrínseco, extrínseco, inducido por ejercicio, inducido por fármaco (que incluye inducido por aspirina y AINE) y asma inducido por polvo, tanto intermitente como persistente y de toda severidad, y otras causas de hipersensibilidad de las vías aéreas; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); bronquitis que incluye bronquitis infecciosa y eosinofílica; enfisema; bronquiectasia; fibrosis quística, sarcoidosis; pulmón del granjero y enfermedades relacionadas; neumonitis por hipersensibilidad; fibrosis pulmonar que incluye alveolitis fibrosante criptogénica, neumonías intersticiales idiopáticas, terapia antineoplásica con complicación fibrótica e infección crónica que incluye tuberculosis y aspergilosis y otras infecciones fúngicas; complicaciones del trasplante de pulmón; trastornos vasculíticos y trombóticos de la vasculatura pulmonar e hipertensión pulmonar; actividad antitusiva que incluye el tratamiento de la tos crónica asociada con condiciones inflamatorias y secretorias de las vías aéreas y tos iatrogénica; rinitis aguda y crónica que incluye rinitis medicamentosa y rinitis vasomotora; rinitis alérgica perene y estacional que incluye rinitis nerviosa (fiebre del heno); poliposis nasal; infección viral aguda que incluye el resfriado común e infección causada por el virus sincitial respiratorio, influenza, coronavirus (que incluye SARS) o adenovirus; o esofagitis eosinofílica. 2. Hueso y articulaciones: artritis asociadas con, o que incluyen, osteoartritis/osteoartrosis, tanto primaria como secundaria, por ejemplo displasia congénita de la cadera; espondilitis cervical y lumbar, y lumbalgia y dolor del cuello; osteoporosis; artritis reumatoide y enfermedad de Still; espondiloartropatías seronegativas que incluyen espondilitis anquilosante, artritis psoriática, artritis reactiva y espondoartropatía no diferenciada; artritis séptica y otras artropatías relacionadas con infección y trastornos del hueso como tuberculosis, que incluyen la enfermedad de Potts y el síndrome de Poncet; sinovitis aguda y crónica inducida por cristal, que incluye gota por urato, enfermedad de depósito de pirofosfato de calcio, e inflamación de tendón, bursal y sinovial relacionada con apatita de calcio; enfermedad de Behcet; síndrome de Sjogren primario y secundario; esclerosis sistémica y esclerodermia limitada; lupus eritematoso sistémico, enfermedad de tejido conectivo mixto, y enfermedad de tejido conectivo no diferenciada; miopatías inflamatorias que incluyen dermatomiositis y polimiositis; polimialgia reumática; artritis juvenil que incluye artritis inflamatoria idiopática de cualquier distribución de articulación y síndromes asociados y fiebre reumática y sus complicaciones sistémicas; vasculitis que incluyen arteritis de células gigantes, arteritis de Takayasu, síndrome de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, poliarteritis microscópica y vasculitis asociada con infección viral, reacciones de hipersensibilidad, crioglobulinas y paraproteínas; lumbalgia; fiebre familiar del Mediterráneo, síndrome de Muckle-Wells, y fiebre hiberniana familiar, enfermedad de Kikuchi; artralgias inducidas por fármaco, tendonitis, y miopatías. 3. Dolor y remodelación del tejido conectivo de trastornos musculoesqueléticos por lesión [por ejemplo lesiones deportivas] o enfermedad: artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, osteoartritis, gota o artropatía de cristal), otra enfermedad de articulaciones (tal como degeneración de disco intervertebral o degeneración de articulación temporomandibular), enfermedad de remodelación de hueso (tal como osteoporosis, enfermedad de Paget u osteonecrosis), policondritis, esclerodermia, trastorno mixto del tejido conectivo, espondiloartropatías o enfermedad periodontal (tal como periodontitis). 4. Piel: psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis de contacto u otras dermatosis eczematosas, y reacciones de hipersensibilidad de tipo tardío; fito- y fotodermatitis; dermatitis seborreica, dermatitis herpetiforme, liquen plano, liquen escleroso y atrófico, pioderma gangrenoso, sarcoide de la piel, lupus eritematoso discoide, pénfigo, penfigoide, epidermólisis bulosa, urticaria, angioedema, vasculitis, eritemas tóxicos, eosinofilias cutáneas, alopecia areata, calvicie de patrón masculino, síndrome de Sweet, síndrome de Weber-Christian, eritema multiforme; celulitis tanto infecciosa como no infecciosa, paniculitis; linfomas cutáneos, cáncer de piel no melanoma y otras lesiones displásicas; trastornos inducidos por fármaco que incluyen erupciones fijas por fármaco. 5. Ojos: blefaritis; conjuntivitis que incluye conjuntivitis perene y alérgica vernal; iritis; uveítis anterior y posterior; coroiditis; trastornos inflamatorios, autoinmunes o degenerativos que afectan la retina; oftalmitis que incluyen oftalmitis simpática; sarcoidosis; infecciones que incluyen virales, fúngicas y bacterianas. 6. Aparato gastrointestinal: glositis, gingivitis, periodontitis; esofagitis que incluye reflujo; gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis, enfermedad de Crohn, colitis que incluye colitis ulcerosa, proctitis, prurito anal; enfermedad celiaca, síndrome del intestino irritable, y alergias relacionadas con alimentos que pueden tener efectos distantes del intestino (por ejemplo, migraña, rinitis o eczema). 7. Región abdominal: hepatitis que incluye autoinmune, alcohólica y viral, fibrosis y cirrosis del hígado; colecistitis; pancreatitis tanto aguda como crónica. 8. Aparato genitourinario: nefritis que incluye intersticial y glomerulonefritis; síndrome nefrótico; cistitis que incluye cistitis aguda y crónica (intersticial) y úlcera de Hunner; uretritis aguda y crónica, prostatitis, epididimitis, ooforitis y salpinguitis; vulvovaginitis, enfermedad de Peyronie; disfunción eréctil (tanto masculina como femenina). 9. Rechazo de aloinjerto: agudo y crónico subsiguiente, por ejemplo, a trasplante de riñon, corazón, hígado, pulmón, médula ósea, piel o córnea, o subsiguiente a transfusión sanguínea; o enfermedad crónica de injerto contra hospedero. 10. SNC: enfermedad de Alzheimer y otros trastornos de demencia que incluyen CJD y nvCJD; amiloidosis; esclerosis múltiple y otros síndromes desmielinizantes; aterosclerosis y vasculitis cerebral; arteritis temporal; miastenia grave; dolor agudo y crónico (agudo, intermitente o persistente, de origen central o periférico) incluso dolor visceral, cefalea, migraña, neuralgia trigeminal, dolor facial atípico, dolor de articulación y hueso, dolor que se origina por cáncer e invasión de tumor, síndromes de dolor neuropático que incluyen neuropatía diabética, postherpética y asociada con VIH; neurosarcoidosis; complicaciones del sistema nerviosos central y periférico de procesos malignos, infecciosos o autoinmunes. 11. Otros trastornos autoinmunes y alérgicos que incluyen tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison, diabetes mellitus, púrpura trombocitopénica idiopática, fascitis eosinofílica, síndrome de hiper-lgE, síndrome antifosfolípido. 12. Otros trastornos con un componente inflamatorio o inmunológico, incluso síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), lepra, síndrome de Sezary, y síndromes paraneoplásicos. 13. Aparato cardiovascular: ateroesclerosis que afecta la circulación coronaria y periférica; pericarditis; miocarditis, cardiomiopatías inflamatorias y autoinmunes que incluyen sarcoide miocárdico; lesiones isquémicas de reperfusión, endocarditis, valvulitis y aortitis que incluyen la infecciosa (por ejemplo sifilítica); vasculitis; trastornos de las venas proximales y periféricas incluso flebitis y trombosis, que incluye trombosis venosa profunda y complicaciones de venas varicosas. 14. Aparato gastrointestinal: enfermedad celiaca, proctitis, gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis intermitente, trastorno de intestino irritable, síndrome de intestino irritable, diarrea no inflamatoria, alergias relacionadas con alimentos que tiene efectos distantes del intestino, por ejemplo migraña, rinitis y eczema.

Para este fin, los inventores han desarrollado varias moléculas sintéticas basadas en D-enantiómeros de tetrapéptidos, tripéptidos, dipéptidos y peptidomiméticos similares que incluyen porciones peptoides que interrumpen la interacción Gadd45p/MKK7. De manera importante, estos compuestos muestran actividad inhibitoria de Gadd45 sin suprimir la función de la cinasa MKK7. Esto es importante porque confirma que los compuestos de la invención pueden inducir señalización citotóxica de JNK mediante la • inhibición de los complejos Gadd45p/MKK7.

Las moléculas sintéticas no se unen a Gadd45 ni a MKK7 en aislamiento, sino que se unen a una u otra proteína cuando las proteínas están en contacto entre sí en estado enlazado o no enlazado, presumiblemente reconociendo una superficie que se hace disponible sobre Gadd45 , MKK7, y/o un complejo de las dos proteínas solo cuando Gadd45 y MKK7 hacen contacto uno con otro, y consecuentemente induciendo una modificación conformacional en una de las dos proteínas o en el complejo entero, que activa la disociación del complejo. Esta propiedad es de interés particular puesto que asegura que los compuestos tengan una especificidad muy alta por el objetivo (es decir, el complejo Gadd45p/MKK7), y reduce la probabilidad de que los compuestos de la invención puedan interaccionar y así afectar proteínas que tienen una estructura similar a la de Gadd45 o . MKK7. Esta propiedad -que establece que el objetivo terapéutico de los compuestos de la invención es la interfaz entre dos proteínas (es decir, Gadd45p y MKK7)- también asegura que los compuestos de la invención no bloqueen las actividades biológicas globales de Gadd45 o MKK7 ¡n vivo, sino que en su lugar alteren selectivamente las funciones biológicas que tienen Gadd45p o MKK7 como parte del complejo Gadd45p/MKK7.

Notablemente, se ha mostrado que los compuestos de la invención inducen apoptosis en líneas celulares de mieloma múltiple y células de tumor primarias, y otras líneas de células de tumor, que incluyen líneas de células de linfoma difuso de células B grandes y linfoma de Burkitt, así como también otros tipos de cáncer como leucemia promonocítica, con valores de CI5o en la escala nanomolar baja, pero no tienen actividad sobre líneas de células T de tumor o sobre células normales tales como fibroblastos no transformados, células estromales de medula ósea (BMSCs), células mononucleares de sangre periférica, y células madre mesenquémicas (MSCs), o en linfocitos B y T primarios purificados de ratones, aunque se usen a concentraciones muy altas (esto es, 100 µ?). Esta es evidencia de que tienen especificidad en su actividad citotóxica para células con NF-KB constitutivo anormalmente activo. De manera importante, los compuestos de la invención son resistentes a la proteólisis, solubles y estables en los fluidos biológicos, reteniendo su actividad inhibitoria completa después de incubación prolongada con suero humano, y por lo tanto parecen buenos candidatos para uso sistémico.

Los compuestos de la invención muestran alta especificidad de objetivo por el complejo Gadd45p/MMK7 en las células. Esto se muestra por los hallazgos de que: 1) en un panel grande de líneas de células de tumor hay una correlación estadística altamente significativa entre el grado de expresión de Gadd45ß y la sensibilidad de la célula cancerosa a la destrucción inducida por Z-/mDTP; 2) la regulación negativa mediada por sh-RNA de Gadd453 induce apoptosis en líneas de células de cáncer sensibles a Z-/mDTP, pero no en las resistentes a Z-/mDTP, y la cinética de inducción de apoptosis por sh-RNAs específicos de Gadd45p en estas líneas de células es similar a la observada con Z-/mDTPs; 3) la regulación negativa mediada por sh-RNA de MKK7 hace a las líneas de células de cáncer Z-/mDTPs completamente resistentes a destrucción inducida por Z-/mDTP; 4) el objetivo terapéutico de la invención es la interfaz entre dos proteínas, Gadd45 y MKK7, lo que provee el potencial de alta selectividad de objetivo, una ventaja clave de la solución de los presentes autores sobre las terapias existentes. Estos datos, junto con la toxicidad baja de los Z-/mDTPs para las células normales, y los hallazgos de que la anulación knock-out de Gadd45 es bien tolerada en los ratones, indican que haciendo blanco en las distintas funciones pro-supervivencia de NF-?? en la supervivencia celular por medio de inhibición mediada por Z-/mDTP de Gadd45p/MKK7, puede proveer una terapia que es más específica, menos tóxica y por lo tanto más eficaz que las terapias que hacen blanco en la ruta de NF-?? y/o el proteosoma.

Además, los compuestos de la invención no tienen toxicidad para las células normales, y la inhibición de Gadd45 parece tener poco o nada de efectos secundarios porque los ratones Gadd45p knock-out son viables y aparentemente sanos, indicando que la desactivación completa de Gadd45 es bien tolerada in vivo. Los compuestos de la invención también son estables, solubles, tienen permeabilidad celular, y por lo tanto son adecuados para el tratamiento del mieloma múltiple, linfoma difuso de células B grandes y otros tipos de cáncer que dependen para su supervivencia de NF-KB. También son útiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas y autoinmunes, especialmente las mediadas por NF-??. Los compuestos de la invención también tienen perfiles PK que son atractivos para uso terapéutico.

La invención también se refiere al desarrollo de pruebas químicamente útiles para predecir la respuesta a la terapia de Z-/mDTP en los pacientes. Los datos con un panel grande de líneas de células de tumor muestran que la sensibilidad a la destrucción inducida por Z-/mDTP se correlaciona, con un alto grado de significancia, con el grado de expresión de Gadd45 (p<0.01), estableciendo así la alta especificidad de la acción citotóxica de los Z-/mDTPs para Gadd45 . Además, la destrucción knock-out de Gadd45 induce apoptosis en células de mieloma múltiple, mientras que la destrucción knock-out de MKK7 hace a estas células completamente resistentes a la destrucción inducida por Z-/mDTP. Juntos, estos datos indican que, si la terapia Z-/mDTP entrara a la clínica, será posible predecir poblaciones respondedoras de pacientes mediante análisis simples y económicos de qRT-PCR.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se provee un compuesto de la fórmula I: I: X1-A-X2 en donde: A es A"" o A"-[M-A'-]n M-A"'; A"" es A", A'" o Z Y2-Y3- 4, en donde Y2-Y3 es una porción de oligopéptido o una porción de oligopeptoide que tiene los residuos Y2-Y3, y Z1 está unido al nitrógeno N- terminal de Y2-Y3, y ZA está unido al carbono C-terminal de Y2-Y3; A" es A' o Y1-Y2-Y3-Z4, en donde Y1-Y2-Y3 es una porción de oligopeptoide o una porción de oligopeptoide que comprende los residuos: Y Y2-Y3 y Z4 está unido al carbono C-terminal de Y1-Y2-Y3; A"' es A' o Z1-Y2-Y3-Y4, en donde Y2-Y3-Y4 es una porción oligopeptoide o una porción oligopeptoide que comprende los residuos Y2-Y3-Y4 y Zi está unido al nitrógeno N-terminal de Y2-Y3-Y4; cada ocurrencia de A' es independientemente una porción de oligopéptido o una porción de oligopeptoide que comprende los residuos Y-i-Y2-Y3-Y4; n es un entero de 0 a 18; Yi y Y4 son independientemente residuos de aminoácido o residuos de derivados de aminoácido que tienen cadenas laterales aromáticas; de acuerdo con algunas modalidades, cada cadena lateral comprende un grupo alquileno de uno a tres carbonos que está sustituido una o dos veces con un grupo aromático carbocíclico o heterocíclico de 5 a 10 miembros, y opcionalmente sustituido con alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; dicho grupo aromático está sustituido opcionalmente con al menos un sustituyente seleccionado de hidroxilo, halógeno o alquilo de C1 a C4 o alcoxi de C1 a C4; Y2 está ausente o es un residuo de aminoácido o un residuo de un derivado de aminoácido, preferiblemente cualquiera de los 20 aminoácidos naturales en la configuración L o D, y/o preferiblemente un residuo de aminoácido o un residuo de un derivado de aminoácido que tiene una cadena lateral que lleva preferiblemente una carga negativa en una solución acuosa a pH 7; Y3 es un residuo de aminoácido o un residuo de un derivado de aminoácido, preferiblemente cualquiera de los 20 aminoácidos naturales en la configuración L o D, y/o preferiblemente un residuo de aminoácido o un residuo de un derivado de aminoácido que tiene una cadena lateral que lleva preferiblemente una carga positiva en una solución acuosa a pH 7.

Cuando está presente tanto Y2 como Y3 en algunas modalidades, preferiblemente son tales que puede formarse un puente de sal entre las cargas positivas y negativas respectivas de las cadenas laterales, y/o son tales que la distancia entre los centros aromáticos sobre Y-i y Y4, o sobre Xi y X4, o sobre X1 y Y4, o sobre Y1 y X4, no es mayor de 10 o 20 Ángstrom, y no es menor de 3 Ángstrom. Preferiblemente, las cadenas laterales de Y2 y Y3 consisten en no más de 30 átomos. Y2 y Y3 pueden ser aminoácidos naturales o N-metil-aminoácidos en la configuración L o D.

Zi es un grupo de la fórmula II: que está enlazado al nitrógeno N-terminal de Y2; W está ausente o es un oxígeno o un nitrógeno, o un grupo alquileno de uno a tres carbonos, dicho grupo alquileno de uno a tres carbonos está sustituido opcionalmente con al menos un sustituyente seleccionado de alquilo de uno a cuatro carbonos, o un grupo aromático carbocíclico o heterocíclico de 5-10 miembros; J es un grupo aromático carbocíclico o heterocíclico de 5-10 miembros, dicho grupo aromático está sustituido opcionalmente con al menos un sustituyente seleccionado de hidroxilo, halógeno, alquilo de uno a cuatro carbonos, o alcoxi de uno a cuatro átomos de carbono; Z4 representa un grupo de la fórmula III: que está enlazado al carbono C-terminal de Y3; R es hidrógeno o alquilo de uno a cuatro carbonos; W está ausente o es un grupo alquileno de uno a tres carbonos, dicho grupo alquileno de uno a tres carbonos está sustituido opcionalmente con al menos un sustituyente seleccionado de alquilo de uno a cuatro carbonos, o un grupo aromático carbocíclico o heterocíclico de 5-10 miembros; J' es un grupo carbocíclico alifático de 3-10 miembros, o un grupo aromático carbocíclico o heterocíclico de 5-10 miembros, dicho grupo alifático o aromático está sustituido opcionalmente con al menos un sustituyente seleccionado de hidroxilo, halógeno, alquilo de uno a cuatro carbonos, o alcoxi de uno a cuatro átomos de carbono; M es un enlace peptídico entre la porción precedente de oligopéptido u oligopeptoide (?', A" o A"') y la porción subsiguiente de oligopéptido u oligopeptoide (?', A" o A'"), o una porción enlazadora, unida por medio de un enlace de amida, un enlace de éster, un enlace de éter, o un enlace de tioéter, al grupo carboxílico terminal de la porción precedente de oligopéptido u oligopeptoide (?', A" o A'"), y por medio de un enlace de amida, un enlace de éster, un enlace de éter, o un enlace de tioéter, al grupo amino terminal de la porción subsiguiente de oligopeptoide (?', A" o A'"); Xi está ausente o es una porción añadida al extremo amino de A para bloquear el grupo amino libre; X2 está ausente o es una porción añadida al extremo carboxilo de A para bloquear el grupo carboxílico libre; De acuerdo con algunas modalidades, W está ausente o es un alquileno de 1 a 3 carbonos.

Preferiblemente, X y X2 son porciones de no más de 30 átomos (o muy preferiblemente 20 o 10); con la condición de que Xi está ausente si A comprende y X2 está ausente si A comprende Z4 (es decir, si no hay grupos amino o carboxilo libres en los extremos de la molécula, no se requieren X1 y X2); o derivados de los mismos, dichos derivados siendo seleccionados del grupo que consiste en: a) oligómeros o multímeros de moléculas del compuesto de fórmula I, dichos oligómeros y multímeros comprendiendo dos o más moléculas del compuesto de fórmula I, cada una enlazada a una porción de armazón común por medio de un enlace de amida formado entre un grupo amino o ácido carboxílico presente en las moléculas del compuesto de fórmula I, y un grupo amino o ácido carboxílico opuesto sobre una porción de armazón, dicha porción de armazón participando en por lo menos 2 enlaces de amida; b) derivados que comprenden una molécula del compuesto de fórmula I, o un oligómero o multímero del mismo como se define arriba en el inciso a), conjugados por medio de un enlace de amida, un enlace de éster, un enlace de éter o un enlace de tioéter con: PEG, compuestos basados en PEG, péptidos penetradores de célula, colorantes fluorescentes, biotina u otra porción de cola, ácidos grasos, nanopartículas de tamaño discreto, o ligandos quelantes en complejo con iones metálicos o radioactivos; c) derivados que comprenden una molécula del compuesto de fórmula I o un oligómero o multímero del mismo como se define en el inciso a), que han sido modificados por amidación, glicosilación, carbamilación, acilación, sulfonilación, fosforilación, ciclización, lipidación, pegilación o enlace con un socio de fusión péptido o peptoide para hacer un péptido de fusión peptoide de fusión; y d) sales y solvatos de una molécula del compuesto de fórmula I de un derivado del mismo como se define en los incisos a) o b) anteriores.

De acuerdo con algunas modalidades: Yi es: D-triptófano, L-triptófano, D-tirosina, L-tirosina, D-3,3-difenil-alanina, L-3,3-difenil-alanina, D-H-3-(4-piridil)alanina, L-H-3-(4-pihdil)alanina, D-H-3-(3-pir¡dil)alan¡na, L-H-3-(3-piridil)alanina, D-H-3-(2-piridil)alanina, L-H-3-(2-piridil)alanina, ácido D-2-amino-4-fenil-butírico, ácido L-2-amino-4-fenil-butírico, D-H-4-hidroxi-fenil-glicina, L-H-4-hidroxi-fenil-glicina, D-3-(2-furil)-alanina, L-3-(2-fur¡l)-alan¡na, L-homo-fenilalanina, D-homo-fenilalanina, D-3-(4-quinolil)-alanina, L-3-(4-quinolil)-alanina, D-naftil-alanina, L-naftil-alanina, ácido p-hidroxi-benzoico, ácido p-hidroxi-fenil-acético, ácido 3-(p-hidroxi-fenil)-propión¡co, o derivados N-metilo en la configuración L o D de cualquiera de los anteriores.

Alternativamente, Yi puede ser: D-fenilalanina, L-fenilalanina, D-triptófano, L-triptófano, D-tirosina, L-tirosina, D-3,3-difenil-alanina, L-3,3 -difenil-alanina, D-H-3-(4-piridil)alanina, L-H-3-(4-piridil)alanina, D-H-3-(3-piridil)alan¡na, L-H-3-(3-piridil)alanina, D-H-3-(2-piridil)alanina, L-H-3-(2-piridil)alanina, ácido D-2-amino-4-fenil-butírico, ácido L-2-amino-4-fenil-butírico, D-fenil-glicina, L-fenil-glicina, D-H-4-hidroxi-fenil-glicina, L-H-4-hidroxi-fenil-glicina, D-3-(2-furil)-alanina, L-3-(2-furil)-alanina, L-ciclohexilalanina, D-ciclohexilalanina, L-homo-fenilalanina, D-homo-fen¡lalanina, D-3-(4-quinolil)-alanina, L-3-(4-quinolil)-alanina, D-naftil-alanina, o L-naftil-alanina.

De acuerdo con algunas modalidades: Y2 está ausente o es: ácido D-glutámico, ácido L-glutámico. ácido D-aspártico, ácido L-aspártico, L-Leucina D-Leucina L-glutamina D-glutamina L-Metionina D-Metionina ácido D-2-amino-heptanodioico, ácido L-2-amino-heptanodioico, un éster metílico o etílico de los mismos, L-homoserina, D-homoserina, o derivados N-metilo en la configuración L o D de cualquiera de los anteriores.

Alternativamente, Y2 puede ser: ácido D-glutámico, ácido L-glutámico, ácido D-aspártico, ácido L-aspártico, ácido D-2-amino-heptanodioico, ácido L-2-amino-heptanodioico, un éster metílico o etílico de cualquiera de los mismos, L-homoserina, o D-homoserina.

De acuerdo con algunas modalidades: Y3 es: D-arginina, L-arginina, L-Prolina D-Prolina D-histidina, L-histidina, D-lisina, ácido D-a, -diaminoprop¡ónico (D-Dap), ácido L-a, -diaminopropiónico (L-Dap), ácido L-a,5-diaminobutírico (L-Dab), ácido L-a,5-diaminobutírico (L-Dab), L-ornitina, D-ornitina, L-lisina; o derivados N-metilo en la configuración L o D de cualquiera de los anteriores.

Alternativamente, Y3 puede ser: D-arginina, L-arginina, D-histidina, L-histidina, D-lisina, ácido D-a, -diaminopropónico (D-Dap), ácido L-a, -diaminopropiónico (L-Dap), ácido L-a,5-diaminobutírico (L-Dab), ácido L-a,5-diaminobutírico (L-Dab), L-ornitina, D-ornitina, o L-lisina.

De acuerdo con algunas modalidades: Y4 es: D-fenilalanina, L-fenilalanina, D-triptófano, L-triptófano, D-tirosina, L-tirosina, D-3,3-difenil-alanina, L-3,3-difenil-alanina, D-H-3-(4-piridil)alanina, L-H-3-(4-piridil)alanina, D-H-3-(3-piridil)alanina, L-H-3-(3-piridil)alanina, D-H-3-(2-piridil)alanina, L-H-3-(2-piridil)alanina, ácido D-2-amino-4-fenil-butírico, ácido L-2-amino-4-fenil-butírico, D-fenil-glicina, L-fenil-glicina, D-H-4-hidroxi-fenil-glicina, L-H-4-hidroxi-fenil-glicina, D-3-(2-furil)-alanina, L-3-(2-furil)-alanina, L-homo-fenilalanina, D-homo-fenilalanina, D-3-(4-quinolil)-alanina, L-3-(4-quinol¡l)-alanina, D-naftil-alanina, L-naftil-alanina, sus derivados N-metilo en la configuración L o D, anilina, bencilamina, o 2-fenil-etil-amina.

Alternativamente, Y4 puede ser: D-fenilalanina, L-fenilalanina, D-triptófano, L-triptófano, D-tirosina, L-tirosina, D-3,3-difenil-alanina, L-3,3-difenil-alanina, D-H-3-(4-piridil)alanina, L-H-3-(4-piridil)alanina, D-H-3-(3-piridil)alanina, L-H-3-(3-piridil)alanina, D-H-3-(2-piridil)alanina, L-H-3-(2-piridil)alanina, ácido D-2-amino-4-fenil-butírico, ácido L-2-amino-4-fenil-butírico, D-fenil-glicina, L-fenil-glicina, D-H-4-hidroxi-fenil-glicina, L-H-4-hidroxi-fenil-glicina, D-3-(2-furil)-alanina, L-3-(2-furil)-alanina, L-ciclohexilalan¡na, D-ciclohexilalanina, L-homo-fenilalanina, D-homo-fenilalanina, D-3-(4-quinolil)-alanina, L-3-(4-quinolil)-alanina; D-naftil-alanina, o L-naftil-alanina.

De acuerdo con algunas modalidades preferidas, Y-i , Y2, Y3 y Y son todas como se describe arriba. De acuerdo con algunas modalidades, Y^ Y2, Y3 y Y4 son todas las que se describen arriba con la condición de que Y2 sea: ácido D-glutámico, ácido L-glutámico, ácido D-aspártico, ácido L-aspártico, ácido D-2-amino-heptanodioico, ácido L-2-amino-heptanodioico, un éster metílico o etílico de cualquiera de los mismos, L-homoserina, L-Leucina, D-Leucina L-glutamina D-glutamina L-Metionina D-Metionina D-homoserina, o derivados N-metilo en la configuración L o D de cualquiera de los anteriores, y Y3 es: D-arginina, L-arginina, D-histidina, L-histidina, D-lisina, L-lisina; L-Prolina D-Prolina ácido D-a,P-diaminoprop¡ónico (D-Dap), ácido L-a,p-diaminopropiónico (L-Dap), ácido D-a,5-diaminobutírico (D-Dab), ácido L-a,6-diaminobutírico (L-Dab), D-ornitina, L-ornitina, o derivados N-metilo en la configuración L o D de cualquiera de los anteriores.

De acuerdo con algunas modalidades, Yi y Y2 son ambos como se describe arriba pero uno de los dos, Y2 o ?3, o ambos, están ausentes. De acuerdo con algunas modalidades, M es un enlace peptídico.

De acuerdo con algunas modalidades X1 es un hidrógeno, o X1 es uno de los siguientes grupos, añadido en el extremo amino de la secuencia de oligopéptido a fin de formar un enlace de amida: acetilo, benciloxicarbonilo, 2- cloro-benciloxicarbonilo, 3- metoxi-4-hidroxi-benzoílo, 3-hidroxi-4-metoxi-benzoílo, benzoílo, o fluorenilmetoxicarbonilo; X2 es un grupo hidroxilo, o es uno de los siguientes grupos añadido en el extremo de ácido carboxílico de la secuencia de oligopéptido a fin de formar un enlace de amida: amina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, D-triptófano, L-triptófano, D-tirosina, L-tirosina D-3,3-difenil-alanina, L-3,3-d¡fenil-alanina, D-H-3-(4-pirid¡l)-alanina, L-H-3-(4-pirid¡l)-alanina, D-H-3-(3-pirid¡l)-alanina, L-H-3-(3-p¡r¡dil)-alanina, D-H-3-(2-piridil)-alanina, L-H-3-(2-piridil)-alanina, ácido D-2-amino-4-fenil-butírico, ácido L-2-amino-4-fenil-butírico, D-fenil-glicina, L-fenil-glicina, D-H-4-hidroxi-fenil-glicina, L-H-4-hidroxi-fenil-glicina, D-3-(2-fur¡l)-alanina, L-3-(2-furil)-alanina, L-ciclohexilalanina, D-ciclohexilalanina, L-homo-fenilalanina, D-homo-fenilalanina, D-3-(4-quinolil)-alanina, L-3-(4-quinolil)-alanina; D-naftil-alanina, L-naftil-alanina, o derivados N-metilo en la configuración L o D de cualquiera de los anteriores.

De acuerdo con algunas modalidades: Zi es: 4-hidroxi-benzoílo, (4-hidroxi-fenil)-acetilo, 3-(4-hidroxi-fenil)-propionilo, benzoílo, benciloxicarbonilo, 2- fenil-acetilo, 3- fenil-propionilo, 3,3-difenil-propionilo, 3-(1 H-indol-3il)-propionilo, (1 H-indol-3-il)-acetilo, furan-2-il-acetilo, furan-3-il-acetilo, 3-piridin-4-il-propionilo, 3-piridin-3-il-propionilo, 3-piridin-2-il-propionilo, 3-pirimidin-4-¡l-propionilo 3-piridazin-4-il-propionilo, 3-[1 ,3,5]-triazin-2-il-propionilo, 2-p i rid in-4-i l-aceti lo, 2-piridin-3-il-acetilo, 2-piridin-2-il-acetilo, 2-pirimidin-4-il-acetilo, 2-piridazin-4-il-acetilo, 2-[1 ,3,5]-triazin-2-il-acetilo, naftalen-1-il-acetilo, naftalen-2-il-acetilo, 2-naftalen-1-il-propionilo, o 2-naftalen-2-il-propionilo; Y2 es: ácido D-glutámico, ácido L-glutámico, ácido D-aspártico, ácido L-aspártico, L-leucina, D-leucina, L-glutamina, D-glutamina, L-metionina, D-metionina, ácido D-2-amino-heptanodioico, ácido L-2-amino-heptanodioico, un éster metílico o etílico de cualquiera de los mismos, L-homoserina, D-homoserina; o derivados N-metilo en la configuración L o D de cualquiera de los anteriores.

Y3 es: D-arginina, L-arginina, D-histidina, L-histidina, L-prolina, D-prolina, D-lisina, L-lisina; ácido D-a,3-diaminopropiónico (D-Dap), ácido L-a,3-diaminopropiónico (L-Dap), ácido D-a,5-diaminobutírico (D-Dab), ácido L-a,5-diaminobutírico (L-Dab), D-ornitina, L-ornitina, o derivados N-metilo en la configuración L o D de cualquiera de los anteriores; ?4 es: fenilamina, bencilamina, fenetilamina, ciclohexilamina, 2- ciclohexil-etilamina, 3- ciclohexil-propilamina, 4- (2-amino-etil)-fenol, 4-amino-fenol, 4-aminometil-fenol, 1 H-indol-3-il-amina, 2-(1 H-indol-3-il)-etilamina, C-(1 H-indol-3-il)-metilamina, 2,2-difenil-etilamina, 2,2-dipiridin-4-il-etilamina 2-piridin-4-il-etilamina, 2-piridin-3-il-etilamina, 2-piridin-2-il-etilamina, 2-pirimidin-4-il-etilamina, 2-[1 ,3,5]-triazin-2-il-etilamina, C-furan-2-il-metilamina, C-furan-3-il-metilamina, o C-naftalen-2-il-metilamina.

De acuerdo con la costumbre, todos los péptidos y peptoides y las regiones de los mismos se describen del extremo N al extremo C.

El valor de n puede ser 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18. De acuerdo con algunas modalidades preferidas, n = 0.

De acuerdo con algunas modalidades preferidas A es A'. En tales modalidades, por lo tanto, el compuesto es esencialmente un tetrapéptido, un tripéptido o un dipéptido (o un peptoide correspondiente) con grupos bloqueadores opcionales Xi y X2 en uno más de los extremos.

Oligopéptidos Los oligopéptidos son polímeros cortos formados por la condensación de a-aminoácidos (denominados aquí simplemente "aminoácidos"). El enlace entre un residuo de un aminoácido y el siguiente se conoce como un enlace peptídico o un enlace de amida.

Aminoácidos Como se usa aquí, el término "aminoácido" incluye los 20 aminoácidos normales (isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspártico, metionina, cisteína, fenilalanina, ácido glutámico, treonina, glutamina, triptófano, glicina, valina, prolina, serina, tirosina, arginina e histidina) en sus configuraciones ópticas tanto D como L. También incluye a-aminoácidos sintéticos en formas tanto D como L. De acuerdo con algunas modalidades se prefiere la configuración D.

Derivados de aminoácido Como se usa aquí, este término incluye glicinas /V-sustituidas que difieren de los a-aminoácidos en que sus cadenas laterales están unidas a átomos de nitrógeno a lo largo del esqueleto de la molécula, en lugar de hacerlo a los a-carbonos (como están en los aminoácidos). También se incluyen en el término los ésteres de metilo y etilo de los a-aminoácidos, ß- aminoácidos, y los a-aminoácidos N-metilados.

Oligopeptoides Hablando estrictamente, el término "oligopéptido" se refiere a los • oligómeros de a-aminoácidos solamente. Un oligómero análogo que incorpora (en algunas o todas las posiciones de residuos) un derivado de aminoácido (por ejemplo una glicina /V-sustituida), se conoce como un oligopeptoide.

Derivados Preferiblemente, los derivados del compuesto del primer aspecto de la invención son derivados funcionales. El término "derivado funcional" se usa aquí para denotar un derivado químico de un compuesto de fórmula (I) que tiene la misma función fisiológica (que los compuestos no modificados correspondientes de fórmula (I)), o alternativamente que tiene la misma función ¡n vitro en una prueba funcional (por ejemplo, en una de las pruebas descritas en uno de los ejemplos de la presente).

Los derivados del compuesto de la invención pueden comprender la estructura de la fórmula (I) modificada mediante procesos muy conocidos, que incluyen amidación, glicosilación, carbamilación, acilación, por ejemplo acetilación, sulfonilación, fosforilación, ciclización, lipidación y pegilación. La estructura de la fórmula (I) se puede modificar en posiciones aleatorias dentro de la molécula o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula, y puede incluir 1 , 2, 3 o más porciones químicas añadidas. Los derivados incluyen compuestos en los cuales el grupo NH2 N-terminal es reemplazado con otro grupo, por ejemplo un grupo metoxi. Un compuesto de la invención puede ser una proteína de fusión, con lo cual la estructura de fórmula (I) se fusiona con otra proteína o polipéptido (el socio de fusión) usando los métodos conocidos. Se puede usar cualquier péptido o proteína adecuada como el socio de fusión (por ejemplo albúmina de suero, anhidrasa carbónica, glutatión-S-transferasa o tiorredoxina, etc.). Los socios de fusión preferidos no tendrán una actividad biológica adversa in vivo. Tales proteínas de fusión se pueden hacer enlazando el extremo carboxi del socio de fusión con el extremo amino de la estructura de fórmula (I), o viceversa. Opcionalmente se puede usar un enlazador separable para enlazar la estructura de fórmula (I) al socio de fusión. Una proteína de fusión separable resultante se puede cortar in vivo de tal manera que libere una forma activa de un compuesto de la invención. Los ejemplos de dichos enlazadores separables incluyen, sin limitación, los enlazadores D- D-D-D-Y [SEQ ID NO: 227], G-P-R, A-G-G y H-P-F-H-L [SEQ ID NO: 228], que pueden ser cortados por enterocinasa, trombina, enzima de corte de ubiquitina y renina, respectivamente; véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 6,410,707.

El compuesto de la invención puede ser un derivado fisiológicamente funcional de la estructura de fórmula (I). El término "derivado fisiológicamente funcional" se usa aquí para denotar un derivado químico de un compuesto de fórmula (I) que tiene la misma función fisiológica que el compuesto no modificado correspondiente de fórmula (I). Por ejemplo, un derivado fisiológicamente funcional puede ser convertible en el cuerpo en un compuesto de fórmula (I). De acuerdo con la presente invención, los ejemplos de compuestos fisiológicamente funcionales incluyen ésteres, amidas y carbamatos; preferiblemente ésteres y amidas.

Los ésteres y amidas farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención pueden comprender un éster o amida de alquil(Ci-2o)-, alquenil(C2-2o)-, aril(C5- 0)-, alquil(C5-io)- o alquil(Ci.2o)-aminoácido unido en un sitio apropiado, por ejemplo en un grupo ácido. Los ejemplos de porciones adecuadas son sustituyentes hidrofóbicos con 4 a 26 átomos de carbono, preferiblemente de 5 a 19 átomos de carbono. Los grupos de lípidos adecuados incluyen, sin limitación los siguientes: lauroilo (C12H23), palmitilo (C15H31), oleilo (Ci5H29), estearilo (C17H35), colato; y desoxicolato.

Los métodos para la lipidación de compuestos que contienen sulfhidrilo con derivados de ácido graso se describen en la patente de EE. UU. No. 5,936,092; patente de EE. UU. No. 6,093,692; y patente de EE. UU. No. 6,225,445. Los derivados de ácido graso de un compuesto de la invención que comprenden un compuesto de la invención enlazado a un ácido graso mediante un enlace disulfuro se pueden usar para suministrar un compuesto de la invención a células y tejidos neuronales. La lipidación aumenta • notablemente la absorción de los compuestos con respecto a la velocidad de absorción de los compuestos no lipidados correspondientes, y también prolonga la retención de los compuestos en la sangre y tejidos. Además, el enlace disulfuro en el derivado lipidado es relativamente lábil en las células y por lo tanto facilita la liberación intracelular de la molécula desde las porciones de ácido graso. Las porciones adecuadas que contienen lípido son sustituyentes hidrofóbicos con 4 a 26 átomos de carbono, preferiblemente de 5 a 19 átomos de carbono. Los grupos de lípido adecuados incluyen, sin limitación, los siguientes: palmitilo (C15H31), oleilo (C15H29), estearilo (C17H35), colato; y desoxicolato.

Los métodos de ciclización incluyen ciclización por medio de formación de un puente de disulfuro y ciclización de cabeza a cola usando una resina de ciclización. Los péptidos cíclicos pueden tener mayor estabilidad, • que incluye mayor resistencia a la degradación enzimática, como resultado de sus restricciones conformacionales. En particular, la ciclización puede ser conveniente cuando el péptido no cíclico incluye un grupo de cisteína N- terminal. Los péptidos cíclicos adecuados incluyen estructuras cíclicas de cabeza a cola monoméricas y dimérícas. Los péptidos cíclicos pueden incluir uno o más residuos adicionales, especialmente una cisteína adicional incorporada con la finalidad de formar un enlace disulfuro, o una cadena lateral incorporada para ciclización basada en resina.

Un compuesto de la invención puede ser una estructura pegilada de fórmula (I). Los compuestos pegilados de la invención pueden proveer ventajas adicionales tales como mayor solubilidad, estabilidad y tiempo de circulación del polipéptido, o inmunogenicidad reducida (véase la patente de EE. UU. No. 4,179,337).

Las porciones químicas para la modificación de un compuesto de la invención también se pueden seleccionar de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, etc. La porción de polímero para modificar un compuesto de la invención puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificada o no ramificada. Se pueden usar polímeros de otros pesos moleculares dependiendo del perfil terapéutico deseado, por ejemplo la duración deseada de la liberación sostenida, los efectos, si los hubiere, sobre la actividad biológica, la facilidad de manejo, el grado o ausencia de antigenicidad, y otros efectos conocidos del polietilenglicol para una proteína o análogo terapéutico. Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular de aproximadamente 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11 ,000, 11 ,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000, o 100,000 kDa.

Las sales y solvatos de los compuestos de la invención, que son adecuados para usarse en un medicamento, son aquellos en donde el contraion o disolvente asociado es farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, las sales o solvatos que tienen contraiones o disolventes asociados que no son farmacéuticamente aceptables están dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo para usarse como intermediarios en la preparación de los compuestos de fórmula (I) y sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables.

Las sales adecuadas de acuerdo con la invención incluyen las formadas con ácidos o bases orgánicas e inorgánicas. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, cítrico, tartárico, acético, fosfórico, láctico, pirúvico, acético, tricloroacético, succínico, perclórico, fumárico, maleico, glicólico, láctico, salicílico, oxalacético, metanosulfónico, etanosulfónico, p-toluenosulfónico, fórmico, benzoico, malónico, naftalen-2-sulfónico, bencenosulfónico e isetiónico. Otros ácidos, como el ácido oxálico, aunque por sí solos no son farmacéuticamente aceptables, pueden ser útiles como intermediarios para obtener los compuestos de la invención y sus sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables con bases incluyen las sales de amonio, sales de metal alcalino, por ejemplo las sales de potasio y sodio, sales de metal alcalinotérreo, por ejemplo las sales de calcio y magnesio, y las sales con bases orgánicas, por ejemplo diciclohexilamina y N-metil-D-glucamina.

Los expertos en química orgánica apreciarán que muchos compuestos orgánicos pueden formar complejos con disolventes en los que reaccionan o de los que se precipitan o cristalizan. Tales complejos son conocidos como "solvatos". Por ejemplo, un complejo con agua es conocido como "hidrato". La presente invención provee solvatos de los compuestos de la invención.

De acuerdo con algunas modalidades preferidas, el compuesto tiene una vida media en la circulación humana de por lo menos 0.1 , 0.2, 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , o preferiblemente por lo menos 12 horas.

Preferiblemente, el compuesto retiene por lo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o preferiblemente 99% de su capacidad para unirse a Gadd45 y/o MKK7 (y/o una asociación de ambos), evaluada en una prueba de unión in vitro, o por lo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o preferiblemente 99% de su capacidad para bloquear la interacción de Gadd453 con MKK7, evaluada en una prueba de unión competitiva in vitro después de incubación en suero humano normal durante 24 horas a 37 grados Celsius.

Alternativa o adicionalmente, el compuesto tiene por lo menos una de las siguientes actividades: a) La capacidad de inhibir por lo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o preferiblemente 99% de las interacciones de MKK7 con Gadd45 , bajo las condiciones de prueba descritas en los ejemplos. b) La capacidad de destruir in vitro por lo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, preferiblemente 99% de las células de un cultivo de una línea celular de mieloma humano, seleccionada del grupo que consiste en U266, KMS-1 1 , NCI-H929, ARH-77, JJN-3, KMS-12, KMS-18 y KMS-27, o de un cultivo de la línea celular DLBCL, LY-3, o de un cultivo de la línea de células promonocíticas U937, o de un cultivo de células de linfoma de Burkitt BJAB, o de un cultivo de células de tumor primarias (por ejemplo, células primarias de tumor de mieloma múltiple), bajo condiciones en las cuales por lo menos 90% de la línea de células T JURKAT no es destruido.

De acuerdo con algunas modalidades preferidas, la porción de núcleo de oligopéptido del compuesto, identificada como A en la fórmula (I), tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 2] (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Arg)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 3] (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-His)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 4] (L-Trp)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 5] (L-Trp)-(L-Glu)-(L-His)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 6] (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Arg)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 7] (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 8] (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 9] (L-Trp)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 10] (L-Trp)-(L-Glu)-(L-Arg)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 11] (L-Trp)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 12] (L-Trp)-(L-Asp)-(L-Arg)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 13] (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 14] (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-H¡s)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 15] (L-Trp)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 16] (L-Trp)-(L-Glu)-(L-H¡s)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 17] (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Arg)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 18] (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 19] (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 20] (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Arg)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 21] (L-Trp)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 22] (L-Trp)-(L-Glu)-(L-Arg)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 23] (L-Trp)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 24] (L-Trp)-(L-Asp)-(L-Arg)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 25] (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-H¡s)-(L-Tyr) [SEQ ID NO: 26] (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 27] (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-H¡s)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 28] (D-Trp)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 29] (D-Trp)-(D-Asp)-(D-H¡s)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 30] (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Arg)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 31] (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Tyr) [SEQ ID NO: 32] (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Tyr) [SEQ ID NO: 33] (D-Trp)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Typ) [SEQ ID NO: 34] (D-Trp)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Typ) [SEQ ID NO: 35] [D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 36] (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-His)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 208] ;D-Tyr)-(D-Asp)-(D-I_ys)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 209] ;D-Trp)-(D-Glu)-(D-His)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 210] ;D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Lys)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 211] ;D-Trp)-(D-Glu)-(D-Lys)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 212] ;D-Trp)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 213] ;D-Tyr)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 214] ;D-Tyr)-(D-Glu)-(D-H¡s)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 215] ;D-Trp)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 216] O-Trp)-(D-Glu)-(D-His)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 217] O-Tyr)-(D-Asp)-(D-Arg)-(D-Trp) [SEQ ID NO:218] O-Tyr)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 219] ;D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Lys)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 220] O-Tyr)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 221] O-Trp)-(D-Glu)-(D-Lys)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 222] O-Trp)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 223] D-Trp)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 224] D-Trp)-(D-Gln)-(D-Arg)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 225] D-Trp)-(D-Asn)-(D-Lys)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 226] L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Phe), D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Phe), L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Phe), (L-Tyr)-(L-Arg)-(L-Phe), (D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Phe), (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Phe), (D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Phe) (D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Phe), (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Pro)-(D-Phe), (D-Phe)-(D-Leu)-(D-Phe), (D-Phe)-(D-Arg)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Glu)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Asp)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Pro)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Leu)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-GluMD-Trp), (D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-LeuMD-Trp), (D-Phe)-(D-Pro)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Leu)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Arg)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Glu)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Asp)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Pro)-(D-Trp) y (D-Phe)-(D-Leu)-(D-Trp).

En otras modalidades, la porción A se selecciona del grupo que consiste en: ácido p-¦hidroxibenzoico- (L-Glu)- L-Arg)-anilina ácido p-¦hidroxibenzoico- (D-Glu)- (L-Arg)-anilina ácido p-¦hidroxibenzoico- (L-Glu)- D-Arg)-anilina ácido p-¦hidroxibenzoico- (D-Glu)- (D-Arg)-anilina ácido p-•hidroxibenzoico- (L-Glu)- L-Arg)-bencilamina ácido p-¦hidroxibenzoico- (D-Glu)- (L-Arg)-bencilamina ácido p-•hidroxibenzoico- (L-Glu)- (D-Arg)-bencilamina ácido p-¦hidroxibenzoico- (D-Glu)- (D-Arg)-bencilamina ácido p-¦hidroxibenzoico- (L-Glu)- L-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido p- -hidroxibenzoico- (D-Glu)- (L-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido p- -hidroxibenzoico- (L-Glu)- (D-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido p-¦hidroxibenzoico- (D-Glu)- (D-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido 2-¦(4-hidroxi-fenil)acético-(L-Glu)-(L-Arg)-anilina ácido 2- (4-hidroxi-fenil )acético-(D-Glu)-(L-Arg)-anilina ácido 2- (4-hidroxi-fenil )acético-(L-Glu)-(D-Arg)-anilina ácido 2- (4-hidroxi-fenil )acético-(D-Glu)-(D-Arg)-anilina ácido 2- (4-hidroxi-fenil )acético-(L-Glu)-(L-Arg)-bencilamina ácido 2- (4-hidroxi-fenil )acético-(D-Glu)-(L-Arg)-bencilamina ácido 2- (4-hidroxi-fenil )acético-(L-Glu)-(D-Arg)-bencilamina ácido 2- (4-hidroxi-fenil )acético-(D-Glu)-(D-Arg)- bencilamina ácido 2- (4-hidroxi-fenil )acético-(L-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido 2- (4-hidroxi-fenil )acético-(D-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido 2- (4-hidroxi-fenil )acético-(L-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido 2- (4-hidroxi-fenil )acético-(D-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido 3- (4-hidroxi-fenil )propiónico-(L-Glu)-(L-Arg)-anilina ácido 3- (4-hidroxi-fenil )propiónico-(D-Glu)-(L-Arg)-anilina ácido 3- (4-hidroxi-fenil )propiónico-(L-Glu)-(D-Arg)-anilina ácido 3- (4-hidroxi-fenil )propiónico-(D-Glu)-(D-Arg)-anilina ácido 3- (4-hidroxi-fenil )propiónico-(L-Glu)-(L-Arg)-bencilamina ácido 3- (4-hidroxi-fenil )propiónico-(D-Glu)-(L-Arg)-bencilamina ácido 3- (4-hidroxi-fenil )propiónico-(L-Glu)-(D-Arg)-bencilamina ácido 3- (4-hidroxi-fenil )propiónico-(D-Glu)-(D-Arg)-bencilamina ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(L-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etil ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(D-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido 3-(4-h¡droxi-fenil)propiónico-(L-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-et¡l-amina ácido 3-(4-hidroxi-fen¡l)propiónico-(D-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido p-hidroxibenzoico- L-Arg)-anilina ácido p-hidroxibenzoico- D-Arg)-anilina ácido p-hidroxibenzoico- L-Glu)-anilina ácido p-hidroxibenzoico D-Glu)-anilina ácido p-hidroxibenzoico- L-Arg)-bencilamina ácido p-hidroxibenzoico- D-Arg)-bencilamina ácido p-hidroxibenzoico L-Glu)-bencilamina ácido p-hidroxibenzoico D-Glu)-bencilamina ácido p-hidroxibenzoico L-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido p-hidroxibenzoico D-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido p-hidroxibenzoico D-Glu)-2-fenil-etil-amina ácido p-hidroxibenzoico- L-Glu)-2-fenil-etil-amina ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(L-Arg)-anilina ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Arg)-anilina ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(L-Glu)-anilina ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Glu)-anilina ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Arg)-bencilamina ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(L-Arg)-bencilamina ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Glu)-bencilamina ácido 2- (4-¦hidroxi-fenil )acético-(L-Glu)-bencilamina ácido 2- (4-•hidroxi-fenil )acético-(L-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido 2- (4-¦hidroxi-fenil )acético-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido 2- (4-¦hidroxi-fenil )acético-(L-Glu)-2-fenil-etil-amina ácido 2- (4-¦hidroxi-fenil )acético-(D-Glu)-2-fenil-etil-amina ácido 3- (4-¦hidroxi-fenil )propiónico-(L-Arg)-anilina ácido 3- (4-¦hidroxi-fenil )propiónico-(D-Arg)-anilina ácido 3- (4-¦hidroxi-fenil )propiónico-(L-Glu)-anilina ácido 3- (4-¦hidroxi-fenil )propiónico-(D-Glu)-anilina ácido 3- (4-¦hidroxi-fenil )propiónico-(L-Arg)-bencilamina ácido 3- (4-¦hidroxi-fenil )propiónico-(D-Arg)-bencilamina ácido 3- (4- -hidroxi-fenil )propiónico-(L-Glu)-bencilamina ácido 3- (4- -hidroxi-fenil )propiónico-(D-Glu)-bencilamina ácido 3- (4- -hidroxi-fenil )propiónico-(L-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido 3- (4- -hidroxi-fenil )propiónico-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina ácido 3- (4- -hidroxi-fenil )propiónico-(L-Glu)-2-fenil-etil-amina ácido 3- (4- -hidroxi-fenil )propiónico-(D-Glu)-2-fenil-etil-amina.

Alternativamente, la porción marcada como A' en la fórmula I puede ser un oligopéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo listado directamente arriba.

De acuerdo con algunas modalidades, la porción A' es una porción de péptido o peptoide que tiene los residuos: Xaai - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4, en donde: Xaai es L-Tyr, D-Tyr, N-metil-L-Tyr, N-metil-D-Tyr, ácido p-hidroxibenzoico, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico o acetilo; Xaa2 es L-Glu, D-Glu, L-Asp o D-Asp, N-metil-L-Glu, N-metil-D-Glu, N-metil-L-Asp, N-metil-D-Asp, L-Pro, D-Pro, N-metil-L-Pro, N-metil-D-Pro, L-Leu, D-Leu, N-metil-L-Leu, N-metil-D-Leu, o está ausente; Xaa3 es L-Arg, D-Arg, L-His o D-His, L-Lys, D-Lys, N-metil-L-Arg, N-metil-D-Arg, N-metil-L-His, N-metil-D-His, N-metil-L-Lys, N-metil-D-Lys, o está ausente; y Xaa es anilina, bencilamina, 2-fenil-etil-amina, L-Phe o D-Phe, N-metil-L-Phe, N-metil-D-Phe, L-Trp, D-Trp, N-metil-L-Trp, N-metil-D-Trp.

De acuerdo con algunas modalidades, Xaa2 o Xaa3 está ausente, pero no ambos Xaa2 y Xaa3. De acuerdo con otras modalidades, tanto Xaa2 como Xaa3 están ausentes.

M puede ser simplemente un enlace de amida entre porciones adyacentes de péptido o peptoide. Alternativamente, puede ser una porción molecular introducida como un espaciador y unida a las porciones adyacentes de péptido o peptoide por medio de enlaces de amida.

M puede ser un aminoácido adicional. Preferiblemente es un aminoácido adicional con una cadena lateral no voluminosa, por ejemplo glicina, alamina o serina o derivados de cualquiera de los mismos. Alternativamente, M puede ser una porción diferente de aminoácido, por ejemplo ácido e-aminocaproico, ácido 3-amino-propiónico, ácido 4-amino- butírico. Otras porciones pueden ser metil-amina, etil-amina, propil-amina, butil-amina, metileno, di-metileno, tri-metileno o tetra-metileno. En todos los casos M debe ser tal que su presencia no altere materialmente la unión entre la porción A' y Gadd45 y/o MKK7. La magnitud de la interferencia potencial se puede evaluar usando un ensayo de unión in vitro como se describe en la presente.

Oliqómeros y multímeros El primer aspecto de la invención abarca oligómeros o multímeros de moléculas del compuesto de fórmula (I), dichos oligómeros o multímeros comprendiendo dos o más moléculas del compuesto de fórmula (I), cada una enlazada a una porción de armazón común mediante un enlace de amida formado entre un grupo amíno o ácido carboxílico presente en las moléculas del compuesto de fórmula (I), y un grupo amino o ácido carboxílico opuesto en una porción de armazón, dicha porción armazón participando por lo menos en 2 enlaces de amida.

De acuerdo con algunas modalidades, el armazón común puede ser el aminoácido lisina. La lisina es un aminoácido trifuncional que tiene, además de los grupos funcionales que la definen como un aminoácido, un grupo amino sobre su cadena lateral. Esta naturaleza trifuncional le permite formar tres enlaces de amida con péptidos, peptoides o moléculas similares. Otros aminoácidos trifuncionales que se pueden usar como un armazón común incluyen el ácido D-a,p-diaminopropiónico (D-Dap), ácido L-a,ß- diaminopropiónico (L-Dap), ácido L-a,5-diaminobutírico (L-Dab), ácido L-a,d-diaminobutírico (L-Dab), y L-ornitina, D-ornitina. También se pueden usar otros aminoácidos trifuncionales no estándares de acuerdo con la invención. El armazón común también puede comprender péptidos, peptoides o moléculas similares ramificadas que incorporan aminoácidos trifuncionales dentro de su secuencia y tienen por lo menos tres grupos terminales funcionalmente activos para formar enlaces de amida.

Péptidos penetradores de célula De acuerdo con algunas modalidades, los compuestos de fórmula (I) se conjugan con un péptido penetrador de célula (CPP).

Tales péptidos se pueden unir a un compuesto de fórmula (I) mediante uno o más enlaces covalentes o mediante asociaciones no covalentes.

Los CPPs pueden penetrar directamente el plasmalema, por ejemplo el CPP puede ser Tat o un derivado, un péptido derivado de la secuencia Antennapedia, o una cola de poli-arginina, un péptido PTD-4, o un péptido permeable a célula funcionalmente equivalente (Ho A, Schwarze SR, Mermelstein SJ, Waksman G, Dowdy SF 2001 , "Synthetic protein transduction domains: enhanced transduction potential in vitro and in vivo". Cáncer Res 61 :474-477).

Alternativamente, el CPP puede entrar a la célula mediando endocitosis o mediando la formación de estructuras transitorias que atraviesan la membrana. Para una discusión de los péptidos penetradores de célula el lector puede consultar Wagstaff et al. (2006) Curr. Med. Chem. 13: 171-1387, y las referencias ahí citadas.

De acuerdo con algunas modalidades, los compuestos de la invención se pueden conjugar con nanopartículas (por ejemplo, nano-oro) para promover la captación celular.

Marcas fluorescentes, porciones de cola y derivados lipidados Los compuestos de fórmula I se pueden conjugar con colorantes fluorescentes para poder monitorear su penetración a los tejidos o células objetivo. Los colorantes fluorescentes se pueden obtener con grupos amino (es decir, succinimidas, isotiocianatos, hidrazinas), grupos carboxilo (es decir, carbodiimidas), grupos tiol (es decir, maleimidas y bromuros de acetilo) y grupos de azida que se pueden usar para que reaccionen selectivamente con las porciones de péptido de los compuestos de fórmula I. Los ejemplos de colorantes fluorescentes incluyen, fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados.

Los compuestos de fórmula I se pueden conjugar con nanopartículas de tamaño discreto, tales como los que describe Chithrani DB, Mol Membr Biol., 7 de octubre de 2010 (publicada electrónicamente antes de su impresión), con un tamaño discreto de hasta 100 nm, con lo cual los péptidos con sus derivados se pueden unir por medio de un puente de disulfuro para permitir una liberación específica dentro del medio reductor del citosol. Para el mismo propósito también se pueden usar péptido-nanopartículas conjugadas mediante enlaces de amida, éter, éster, tioéter, dada la baja toxicidad de estos compuestos. Las nanopartículas favorecerán la captación celular y también proveerán un medio para visualizar y cuantificar la captación celular mediante técnicas de fluorescencia (Schrand AM, Lin JB, Hens SC, Hussain SM., Nanoscale, 27 de septiembre de 2010, publicada electrónicamente antes de su impresión).

Las porciones de cola se pueden añadir por medios similares, y similarmente permiten monitorear el desempeño del direccionamiento a tejidos y células.

Se pueden usar derivados de ácido graso de un compuesto de la invención que comprenden un compuesto de fórmula I enlazado a un ácido graso mediante un enlace disulfuro para el suministro de un compuesto de la invención a las células y tejidos. La lipidación aumenta notablemente la absorción de los compuestos con respecto a la velocidad de absorción de los compuestos no lipidados correspondientes, y también prolonga la retención de los compuestos en la sangre y tejidos. Además, el enlace de disulfuro en el derivado lipidado es relativamente lábil en las células y así facilita la liberación intracelular de la molécula de las porciones de ácido graso. Las porciones adecuadas que contienen lípido son sustituyentes hidrofóbicos con 4 a 26 átomos de carbono, preferiblemente de 5 a 19 átomos de carbono. Los grupos de lípido adecuados incluyen, sin limitación, los siguientes: palmitilo (C15H31), oleilo (C15H29), estearilo (C17H35), colato; linolato y desoxicolato.

Conjugados iónicos La invención también abarca compuestos de fórmula (I) unidos funcionalmente a iones metálicos o radioactivos. Esta unión típicamente se obtiene por la conjugación de un agente quelante de iones (por ejemplo EDTA) que forma quelatos con el ion. Mediante tales medios se pueden suministrar iones radioactivos (por ejemplo 99mTc, 11 ln, ^Cu, 67Cu, 89Sr, 90Y, i i7mSn i53Sm i86Re i88Re Q i77|_uj a [as cé as objetivo como radioterapia.

Se pueden usar iones metálicos no radioactivos (por ejemplo iones de gadolinio) como marcadores detectables de RMN.

Sales y solvatos Las sales y solvatos de los compuestos de la invención que son adecuados para usarse en un medicamento son aquellos en donde un contraion o disolvente asociado es farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, sales y solvatos que tienen contraiones o disolventes asociados que no son farmacéuticamente aceptables están dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo para usarse como intermediarios en la preparación de los compuestos de fórmula (I) y sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables.

Las sales adecuadas de acuerdo con la invención incluyen las ' formadas con ácidos o bases orgánicas o inorgánicas. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con el ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, cítrico, tartárico, acético, fosfórico, láctico, pirúvico, acético, tricloroacético, succínico, perclórico, fumárico, maleico, glicólico, láctico, salicílico, oxalacético, metanosulfónico, etanosulfónico, p-toluenosulfónico, fórmico, benzoico, malónico, naftalen-2-sulfónico, bencenosulfónico e isetiónico. Otros ácidos, como el ácido oxálico, aunque por sí solos no son farmacéuticamente aceptables, pueden ser útiles como intermediarios para obtener los compuestos de la invención y sus sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables con bases incluyen las sales de amonio, sales de metal alcalino, por ejemplo las sales de potasio y sodio, sales de metal alcalinotérreo, por ejemplo las sales de calcio y magnesio, y las sales con bases orgánicas, por ejemplo diciclohexilamina y N-metil-D-glucamina.

Los expertos en química orgánica apreciarán que muchos compuestos orgánicos pueden formar complejos con disolventes en los que reaccionan o de los que se precipitan o cristalizan. Tales complejos son conocidos como "solvatos". Por ejemplo, un complejo con agua es conocido como "hidrato". La presente invención provee solvatos de los compuestos de la invención.

A continuación se dan ejemplos de las moléculas de fórmula I. Cuando no se especifica la configuración L/D de un residuo de aminoácido, se contemplan las dos configuraciones: Acetil-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 37] ácido para-hidroxibenzoico-Glu-Arg-anilina ácido para-hidroxibenzoico-Glu-Arg-bencilamina ácido para-hidroxibenzoico-Glu-Arg-2-fenil-etil-amina ácido 2-(4-h¡droxifenil)acético-Glu-Arg-anilina ácido 2-(4-hidroxifenil)acético-Glu-Arg-bencilamina ácido 2-(4-hidroxifenil)acético-Glu-Arg-2-fenil-etil-amina ácido 3-(4-hidroxifenil)acético-Glu-Arg-3-anilina ácido 3-(4-hidroxifenil)acético-Glu-Arg-bencilamina ácido 3-(4-hidroxifenil)acético-Glu-Arg-2-fenil-etil-amina acetil-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 38] ácido para-hidroxibenzoico-Asp-His-anilina ácido para-hidroxibenzoico-Asp-His-bencilamina ácido para-hidroxibenzoico-Asp-His-3-fenil-propil-amina ácido 2-(4-hidroxifenil)acético-Asp-His-anilina ácido 2-(4-hidroxifenil)acético-Asp-His-bencilamina ácido 2-(4-hidroxifenil)acético-Asp-His-2-fenil-etil-amina ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico-Asp-His-anilina ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico-Asp-His-bencilamina ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico-Asp-His-2-fenil-etil-amina acetil-Tyr-Asp-Lys-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 39] acetil-Tyr-Glu-Lys-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 40] acetil-Tyr-Glu-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 41] acetil-Tyr-Asp-Arg-Phe-NH2l [SEQ ID NO: 42] acetil-Trp-Glu-His-Phe-NH2, [SEQ ID NO: 43] acetil-Trp-Glu-Lys-Phe-NH2, [SEQ ID NO: 44] acetil-Trp-Asp-His-Phe-NH2, [SEQ ID NO: 45] acet¡l-Trp-Asp-Lys-Phe-NH2, [SEQ ID NO: 46] acet¡l-Tyr-Glu-Arg-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 47] acetil-Tyr-Asp-Lys-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 48] acetil-Tyr-Glu-Lys-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 49] acetil-Tyr-Glu-His-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 50] acetil-Tyr-Asp-Arg-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 51] acetil-Trp-Glu-His-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 52] acetil-Trp-Glu-Lys-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 53] acet¡l-Trp-Asp-H¡s-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 54] acetil-Trp-Asp-Lys-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 55] lactama interna de acetil-Tyr-Glu-Lys-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 56] acetil-Tyr-Gln-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 57] acetil-Tyr-Met-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 58] acetil-Tyr-Leu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 59] acetil-Tyr-Arg-Phe-NH2l acetil-Tyr-Arg-Tyr-N H2, acetil-Tyr-Glu-Phe-NH2, acetil-Tyr-Glu-Tyr-NH2, acetil-Tyr-Asp-Phe-NH2, acetil-Tyr-Asp-Tyr-NH2l acetil-Tyr-Pro-Phe-NH2) acetil-Tyr-Lys-Phe-NH2, acetil-Tyr-H¡s-Phe-NH2, H-Tyr-Arg-Phe-NH2, H-Tyr-Arg-Tyr-NH2, H-Tyr-Glu-Phe-NH2, H-Tyr-Glu-Tyr-NH2, H-Tyr-Asp-Phe-NH2, H-Tyr-Asp-Tyr-NH2, H-Tyr-Pro-Phe-NH2, H-Tyr-Lys-Phe-NH2, H-Tyr-H¡s-Phe-NH2, benc¡loxicarbon¡l-Tyr-Arg-Phe-NH2) bencilox¡carbon¡l-Tyr-Arg-Tyr-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Glu-Phe-NH2) benc¡lox¡carbon¡l-Tyr-Glu-Tyr-NH2, benc¡loxicarbon¡l-Tyr-Asp-Phe-NH2, benciloxicarbon¡l-Tyr-Asp-Tyr-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Pro-Phe-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Lys-Phe-NH2, benc¡lox¡carbonil-Tyr-H¡s-Phe-NH2) benc¡lox¡carbon¡l-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 60] benciloxicarbonil-Tyr-Asp-H¡s-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 61] bencilox¡carbonil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 62] benciloxicarbonil-Tyr-Arg-Phe-NH2, bencilox¡carbon¡l-Tyr-Glu-Phe-NH2, benciloxicarbonil-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, benciloxicarbonil-(N-met¡l)Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, benciloxicarbonil-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-Phe-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-(N-metil)Glu-Phe-NH2l benciloxicarbonil-(N-metil)Tyr-Glu-Phe-NH2, acetil-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, acetil-(N-metil)Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, acetil-Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2l acetil-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-Phe-NH2, acetil-Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, acetil-Tyr-(N-metil)Glu-Phe-NH2, acetil-(N-metil)Tyr-Glu-Phe-NH2, H-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, H-(N-metil)Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, H-Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, H-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-Phe-NH2, H-Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2) H-Tyr-(N-metil)Glu-Phe-NH2, H-(N-metil)Tyr-Glu-Phe-NH2, acetil-Tyr-Glu-(p-homo)Phe-NH2, acet¡l-Tyr-( -homo)Glu-Phe-NH2, acetil-( -homo)Tyr-Glu-Phe-NH2, acetil-Tyr-Phe-NH2> acetil-Phe-Tyr-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Phe-NH2, benciloxicarbonil-Phe-Tyr-NH2, H-Tyr-Phe-NH2, H-Phe-Tyr-NH2, (3-metox¡-4-h¡droxi-benzoil)-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 63] (3-metoxi-4-hidroxi-benzoil)-Tyr-Asp-H¡s-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 64] (3-metoxi-4-hidroxi-benzo¡l)-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 65] (3-metoxi-4-hidroxi-benzoil)-Tyr-Arg-Phe-NH2, (3-metoxi-4-hidrox¡-benzo¡l)-Tyr-Glu-Phe-NH2, fluorenilmetiloxicarbon¡l-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 66] fluoren¡lmetiloxicarbonil-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 67] fluorenilmetiloxicarbonil-Tyr-Asp(OMe)-H¡s-Phe-NH2 [SEQ ID ¦ NO: 68] fluorenilmetilox¡carbon¡l-Tyr-Asp(OMe)-H¡s-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 69] fluorenilmet¡loxicarbon¡l-Tyr-Arg-Phe-NH2, fluorenilmetiloxicarbonil-Tyr-Glu-Phe-NH2, miristil-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 70] m¡r¡st¡l-Tyr-Asp-H¡s-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 71] mir¡stil-Tyr-Arg-Phe-NH2, mir¡stil-Tyr-Glu-Phe-NH2, miristil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 72] acetil-Tyr-Glu-Arg-Phe-Gly-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 73] acet¡l-Tyr-Asp-His-Phe-Gly-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 74] acetil-Tyr-Arg-Phe-Gly-Tyr-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 75] acet¡l-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-Gly-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 76] bencilox¡carbon¡l-Tyr-Glu-Arg-Phe-Gly-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 77] benc¡loxicarbonil-Tyr-Asp-His-Phe-Gly-Tyr-Asp-H¡s-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 78] benc¡loxicarbonil-Tyr-Arg-Phe-Gly-Tyr-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 79] bencilox¡carbonil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-Gly-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 80].

Ejemplos adicionales de los compuestos de la invención incluyen: Compuesto A1 Ac-Tyr-Phe-NH2 Compuesto A3 Ac-Tyr-bAla-Phe-NH2 Compuesto A6 Ac-Tyr-(ácido 6-amino-caproico)-Phe-NH2 Compuesto A7 Ac-Tyr-Tyr-NH2 Compuesto A8 Ac-Phe-Tyr-NH2 Compuesto A9 Ac-Phe-Arg-Phe-NH2 Compuesto B2 Ac-Tyr-Lys-Phe-NH2 Compuesto B13 Ac-Tyr-Pro-Phe-NH2 Compuesto B 16 Ac-Tyr-His-Phe-NH2 Compuesto H1 L-3,3-difen¡l-alanina Compuesto H2 L-H-3(4-p¡ridil)alan¡na Compuesto H3 L-H-4-hidrox¡-fenil-gl¡c¡na Compuesto H4 ácido L-2-amino-4-fen¡l-butírico Compuesto H5 L-fenil-glicina Compuesto H6 L-H-4-hidroxi-fenil-glicina Compuesto H7 L-homo-fenilalanina Compuesto H8 L-3-(2-furil)-alanina Compuesto H9 L-3-(4-quinolil)-alanina Compuesto H10 L-naftil-alanina Compuesto 11 Ac-Tyr-Arg-(N-Me)Phe Compuesto I2 Ac-Tyr-(N-Me)Arg-Phe-N H2 Compuesto 13 Ac-(N-Me)Tyr-Arg-Phe-NH2 Compuesto I4 Ac-(N-Me)Tyr-(N-Me)Arg-(N-Me)Phe Compuesto 15 Ac-(N-Me)Tyr-Arg-(N-Me)Phe-NH2 Compuesto 01 Ac-Phe-Arg-Tyr-NH2 Compuesto 02 Ac-Phe-Arg-Phe-NH2 Compuesto 03 Ac-Tyr-Arg-Tyr-NH2 Compuesto 05 H-Phe-His-Tyr-NH2 Compuesto 07 H-Phe-His-Phe-NH2 Compuesto 08 H-Phe-Arg-Tyr-NH2 Compuesto 09 H-Phe-Arg-Phe-NH2 Compuesto 0 0 H-Tyr-Arg-Tyr-NH2 Compuesto P1 -(hidrox¡l)-fenil-ác¡do acético-Arg-3-fenil-etilamina Compuesto P2 -(hidroxil)-fenil-ácido acético-His-3-fenil-etil-amina Compuesto P3 -(hidroxil)-fenil-ácido acético-Glu-3-fenil-etilamina Compuesto G1 Ciclo(Tyr-Arg-Phe) Compuesto G2 Ciclo(Phe-Arg-Tyr) Compuesto G3 Ciclo(Tyr-Phe) Compuesto N1 Nano-oro-Tyr-Arg-Phe-NH2 De acuerdo con algunas modalidades, los compuestos descritos aquí específicamente, incluso en los ejemplos, son los compuestos preferidos o son las modalidades preferidas de la porción A' de la fórmula I. La presente invención contempla las versiones multiméricas o los compuestos específicos descritos explícitamente. Por ejemplo, la presente invención contempla porciones de péptido o peptoide de 3 o 4 residuos de los compuestos específicos descritos en la presente que corresponden a la porción A, A', A", A'" o A"" de los compuestos de fórmula I.

Composiciones farmacéuticas De acuerdo con un segundo aspecto de la invención se provee una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con el primer aspecto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Aunque es posible administrar solo el ingrediente activo, es preferible que esté presente en una formulación o composición farmacéutica. Por consiguiente, la invención provee una formulación farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), o un derivado del mismo, o una sal o solvato del mismo, como se define arriba, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener la forma de una formulación farmacéutica como se describe más abajo.

Las formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la invención incluyen las adecuadas para administración oral, parenteral (que incluye subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa e intraarticular), inhalación (que incluye polvos o nieblas de partículas finas que se pueden generar por medio de varios tipos de aerosoles presurizados dosificadores, nebulizadores o ¡nsufladores), rectal y tópica (que incluye dérmica, transdérmica, transmucosal, bucal, sublingual e intraocular), aunque la vía más adecuada puede depender por ejemplo de la afección y trastorno del receptor.

Convenientemente, las formulaciones se pueden presentar en forma de dosis unitarias y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos conocidos en las ciencias farmacéuticas. Todos los métodos · incluyen el paso de asociar el ingrediente activo con el vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y después, si es necesario, dando forma al producto en la formulación deseada.

Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral se pueden presentar como unidades discretas tales como cápsulas, obleas o tabletas, cada una conteniendo una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como un polvo o granulado; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. El ingrediente activo también se puede presentar como un bolo, electuario o pasta. Varios vehículos farmacéuticamente aceptables y su . formulación se describen en los tratados de formulación estándares, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin; véase también Wang, Y. J. y Hanson, M. A., Journal of Parenteral Science and Technology, Informe Técnico No. 10, Sup. 42:2S, 1988.

Una tableta se puede hacer por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingrediente auxiliares. Las tabletas comprimidas se pueden preparar comprimiendo el ingrediente activo en una forma de libre flujo, tal como un polvo o granulado, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluente inerte, agente tensoactivo o dispersante, en una máquina adecuada. Las tabletas moldeadas se pueden hacer moldeando una mezcla del preparado pulverizado humedecido con un diluente líquido inerte, en una máquina adecuada. Opcionalmente las tabletas se pueden recubrir o ranurar y se pueden formular a fin de proveer liberación lenta o controlada del ingrediente activo. Los presentes compuestos, por ejemplo, se pueden administrar en una forma adecuada para liberación inmediata o liberación prolongada. La liberación inmediata o prolongada se pueden lograr usando composiciones farmacéuticas adecuadas que comprenden los presentes compuestos, o particularmente en el caso de la liberación prolongada, usando dispositivos tales como implantes subcutáneos o bombas osmóticas. Los presentes compuestos también se pueden administrar por vía liposómica.

Preferiblemente, las composiciones de acuerdo con la invención son adecuadas para administración subcutánea, por ejemplo por inyección.

Las composiciones ejemplares para la administración oral incluyen suspensiones que pueden contener, por ejemplo, celulosa microcristalina para impartir volumen, ácido algínico o alginato de sodio como agente de suspensión, metilcelulosa como incrementador de viscosidad, y agentes edulcorantes o saborizantes como los que se conocen en la técnica; y tabletas de liberación inmediata que pueden contener, por ejemplo, celulosa microcristalina, fosfato dicálcico, almidón, estearato de magnesio y/o lactosa y/o otros excipientes, aglutinantes, extensores, desintegradores, diluentes y lubricantes como los que se conocen en la técnica. Los compuestos de fórmula (I) o las variantes, derivados, sales o solvatos de los mismos, también pueden ser suministrados a través de la cavidad oral por medio de administración sublingual y/o bucal. Las tabletas moldeadas, tabletas comprimidas o tabletas secadas por congelación son formas ejemplares que se pueden usar. Las composiciones ejemplares incluyen aquellas que formulan los presentes compuestos con diluentes de disolución rápida tales como manitol, lactosa, sacarosa y/o ciclodextrinas. En tales formulaciones también se incluyen excipientes de peso molecular alto, tales como celulosas (Avicel) o polietilenglicoles (PEG). Tales formulaciones pueden incluir también un excipiente para ayudar a la adhesión mucosal, tales como hidroxipropilcelulosa (HPC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), carboximetilcelulosa de sodio (SCMC), copolímero de anhídrido maleico (por ejemplo Gantrez), y agentes para controlar la liberación tales como copolímero poliacrílico (por ejemplo Carbopol 934). También se pueden agregar lubricantes, deslizantes, saborizantes, agentes colorantes y estabilizadores para facilitar la fabricación y uso.

Las formulaciones para administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del receptor deseado; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitarias o dosis múltiples, por ejemplo ampolletas y frascos sellados, - y se pueden guardar en una condición secada por congelación (liofilizada) que solo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo solución salina o agua para inyección, inmediatamente antes de usarse. Se pueden preparar soluciones y suspensiones inyectables extemporáneas a partir de polvos, granulados y tabletas estériles del tipo previamente descrito. Las composiciones ejemplares para administración parenteral incluyen soluciones o suspensiones inyectables que pueden contener, por ejemplo, diluentes o disolventes inocuos aceptables para uso parenteral, tales como manitol, 1 ,3- butanodiol, agua, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio, u otros agentes adecuados de dispersión, mojado y suspensión, que incluyen mono- o diglicéridos, y ácidos grasos que incluyen ácido oleico o Cremaphor. Un vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, una solución isotónica amortiguadora a un pH de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 8.0, . preferiblemente a un pH de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 7.4, por ejemplo de 3.5 a 6.0, por ejemplo de 3.5 a aproximadamente 5.0. Los amortiguadores útiles incluyen los amortiguadores de citrato de sodio-ácido cítrico, fosfato de sodio-ácido fosfórico y acetato de sodio/ácido acético. Preferiblemente, la composición no incluye agentes oxidantes ni otros compuestos conocidos que son nocivos para el compuesto de fórmula I y moléculas relacionadas. Los excipientes que se pueden incluir son, por ejemplo, otras proteínas como albúmina de suero humano o preparados de plasma. Si se desea, la composición farmacéutica también puede contener cantidades menores de sustancia auxiliares inocuas tales como agentes mojantes o emulsionantes, conservadores y amortiguadores de pH, etc., por ejemplo acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

Las composiciones ejemplares para administración por aerosol nasal o inhalación incluyen soluciones en solución salina que pueden contener por ejemplo alcohol bencílico u otros conservadores adecuados, promotores de absorción para aumentar la biodisponibilidad, y/o otros agentes solubilizantes o dispersantes como los que se conocen en la técnica. Convenientemente, en composiciones para administración por aerosol nasal o inhalación, el compuesto de la invención se suministra en forma de un preparado de espray de aerosol desde un empaque presurizado o nebulizador, utilizando un propulsor adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria puede ser determinada suministrando una válvula para liberar una cantidad medida. Para usarse en un inhalador o insuflador se pueden formular cápsulas y cartuchos, por ejemplo de gelatina, que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, por ejemplo lactosa o almidón. En un ejemplo específico no limitativo, un compuesto de la invención se administra como un aerosol desde una válvula dosificadora a través de un adaptador de aerosol, conocido también como accionador. Opcionalmente también se incluye un estabilizador, y/o se incluyen partículas porosas para liberación pulmonar profunda (véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 6,447,743).

Las formulaciones para administración rectal se pueden presentar como un enema de retención o un supositorio con los vehículos usuales, tales como manteca de cacao, ésteres de glicéridos sintéticos o polietilenglicol. Normalmente tales vehículos son sólidos a las temperaturas ordinarias, pero se licúan y/o se disuelven en la cavidad rectal para liberar el fármaco.

Las formulaciones para administración tópica en la boca, por ejemplo bucalmente o sublingualmente, incluyen pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base saborizada tal como sacarosa y acacia o tragacanto, y pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia. Las composiciones ejemplares para administración tópica incluyen un vehículo tópico tal como Plastibase (aceite mineral gelificado con polietileno).

Las formulaciones de dosis unitarias preferidas son las que contienen una dosis eficaz del ingrediente activo como se cita aquí anteriormente, o una fracción apropiada de la misma.

Se debe entender que, además de los ingredientes arriba mencionados particularmente, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales tomando en cuenta el tipo de formulación en cuestión; por ejemplo, los adecuados para administración oral pueden incluir agentes saborizantes.

Los compuestos de la invención también se administran • convenientemente como sistemas de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de sistemas de liberación sostenida de la invención incluyen materiales poliméricos adecuados, por ejemplo matrices de polímeros semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo películas, o microcápsulas; materiales hidrofóbicos adecuados, por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable; o resinas de intercambio iónico; y derivados escasamente solubles del compuesto de la invención, por ejemplo una sal escasamente soluble. Los sistemas de liberación sostenida se pueden administrar por vía oral; rectal; parenteral; intravaginal; intraperitoneal; tópica, por ejemplo como un polvo, ungüento, gel, gotas o parches transdérnnicos; por vía bucal; o como un espray oral o nasal.

Los preparados para su administración se pueden formular convenientemente para obtener la liberación controlada de los compuestos de . la invención. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de partículas que comprenden uno o más polímeros biodegradables, polímeros gelificantes y/o bioadhesivos de polisacárido, polímeros anfifílicos, agentes capaces de modificar las propiedades de interfaz de las partículas del compuesto de fórmula (I). Estas composiciones presentan ciertas características de biocompatibilidad que permiten la liberación controlada de la sustancia activa; véase la patente de EE. UU. No. 5,700,486.

Un compuesto de la invención puede ser suministrado por medio de una bomba (véasa Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Reí. Biomed. Eng. 14:201 , 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321 :574, 1989), o por medio de infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo usando una minibomba. También se puede usar una solución intravenosa de bolsa. Otros sistemas de liberación controlada se exponen en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533, 1990). En otro aspecto de la descripción, los compuestos de la invención se suministran por medio de una bomba implantada, que se describe por ejemplo en la patente de EE. UU. No. 6,436,091 ; patente de EE. UU. No. 5,939,380; patente de EE. UU. No. 5,993,414.

Se utilizan dispositivos implantables de infusión de fármaco para proveer a los pacientes de una dosis o infusión constante y a largo plazo de un fármaco o cualquier otro agente terapéutico. Esencialmente, tal dispositivo se puede clasificar como activo o pasivo. Un compuesto de la presente invención se puede formular como un preparado de depósito. Tal formulación de depósito de acción duradera se puede administrar por implantación, por ejemplo por vía subcutánea o intramuscular; o por inyección intramuscular. De esta manera, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados, por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable; o resinas de intercambio iónico; o como derivados escasamente solubles, por ejemplo como una sal escasamente soluble.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención se puede administrar como una dosis de un solo impulso, como una dosis de bolo, o como dosis de impulso administradas en el tiempo. De esta manera, en las dosis de impulso se provee una administración de bolo de un compuesto de la invención, seguido por un periodo en donde no se le administra al sujeto el compuesto de la invención, seguido por una segunda administración de bolo. En ejemplos específicos no limitativos, las dosis de impulso de un compuesto de la invención se administran durante el transcurso de un día, durante el transcurso de una semana, o durante el transcurso de un mes.

En una modalidad, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención se administra con una cantidad terapéuticamente eficaz de otro agente, por ejemplo un agente quimioterapéutico antineoplásico adicional (por ejemplo, talidomida, dexametasona, bortezomib, lenalidomida, melfalan, cisplatino, doxorrubicina, 5-FU, etc.), o un agente para tratar la anemia (por ejemplo eritropoyetina) o un agente para prevenir las fracturas de hueso (por ejemplo un bisfosfonato como pamidronato o ácido zoledrónico).

La cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención dependerá de la molécula utilizada, el sujeto tratado, la severidad y tipo de afección, y la manera y vía de administración.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención se provee un método de tratamiento de un trastorno o enfermedad, que comprende administrar un compuesto de acuerdo con el primer y segundo aspecto de la invención, o una composición farmacéutica de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con el primer aspecto de la invención o una composición farmacéutica de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, a un sujeto en necesidad del mismo.

Trastornos y enfermedades Los compuestos, composiciones y métodos de la invención son adecuados para el tratamiento o prevención de enfermedades y trastornos que están caracterizados por un aumento aberrante de la expresión o actividad de Gadd45p, o que están caracterizados por una activación aberrante de la ruta de NF-?? y son susceptibles de tratamiento por inducción de la muerte celular programada mediante la inhibición de la actividad de Gadd45 .

Las enfermedades adecuadas para el tratamiento o prevención incluyen el cáncer. Preferiblemente el cáncer es un cáncer que expresa niveles elevados de Gadd45 con respecto a las células o tejidos sanos normales correspondientes. Los tipos de cáncer que se sabe expresan niveles altos aberrantes de Gadd45p, y por lo tanto susceptibles de tratamiento con los compuestos de la invención, incluyen: mieloma múltiple, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, leucemia promonocítica y otras leucemias, así como también tumores sólidos tales como carcinoma hepatocelular, cáncer de la vejiga, cáncer del cerebro y sistema nervioso central, cáncer de la mama, cáncer de la cabeza y el cuello, cáncer del pulmón y cáncer de la próstata. De acuerdo con algunas modalidades, el cáncer es un cáncer que depende para su supervivencia de NF-??. El cáncer específico de este tipo que depende de NF-?? para su supervivencia y por lo tanto es susceptible de tratamiento o prevención, incluye: mieloma múltiple, linfoma de células del manto, linfoma MALT, linfoma de Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, leucemia promonocítica, síndrome mielodisplásico, leucemia de células T del adulto (HTLV-1), leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda, cáncer asociado con colitis, cáncer del colon, cáncer del hígado (por ejemplo carcinoma hepatocelular), cáncer cervical, cáncer renal, cáncer del pulmón, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer laríngeo, cáncer de la próstata, cáncer pancreático, cáncer de la tiroides, cáncer de la paratiroides, cáncer de la vejiga, cáncer del ovario, cáncer de la mama, melanoma, cilindroma, carcinoma de células escamosas (piel, y cabeza y cuello), carcinoma oral, carcinoma endometrial, retinoblastoma, astrocitoma y glioblastoma. De acuerdo con algunas modalidades preferidas el cáncer es el mieloma múltiple. De acuerdo con algunas modalidades, se pueden analizar las células tomadas del sujeto (por ejemplo, biopsia del cáncer de un sujeto o extraídas de la sangre u otro fluido corporal del sujeto en el cual pudieron ser liberadas por el cáncer) para determinar la activación de NF- ? y/o el aumento de la actividad de Gadd453 para determinar la conveniencia de tratamiento del cáncer mediante los métodos, compuestos y composiciones de la invención.

Otras enfermedades y trastornos susceptibles de tratamiento o prevención incluyen enfermedad autoinmune (por ejemplo esclerosis múltiple, lupus, diabetes de tipo I), enfermedad alérgica (por ejemplo asma), enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, psoriasis, colitis ulcerosa), enfermedad genética (por ejemplo incontinencia pigmentaria, displasia ectodérmica anhidrótica con inmunodeficiencia y cilindromatosis), enfermedad isquémica y vascular (por ejemplo ateroesclerosis, angina de pecho, ataque cerebral, infarto de miocardio), y enfermedad degenerativa (por ejemplo enfermedad de Alzheimer y Parkinson), enfermedades del hígado tales como fibrosis hepática y cirrosis hepática.

Una amplia gama de enfermedades y trastornos dependen de la actividad de NF-??. En realidad, ahora se considera que la patogénesis de virtualmente cualquier enfermedad o trastorno humano conocido depende de la inflamación, y por lo tanto implica NF-??. Este funciona como un interruptor maestro de la respuesta inflamatoria, coordinando la expresión de un conjunto de más de 200 genes que codifican citocinas, receptores, factores de transcripción, quimocinas, enzimas proinflamatorias y otros factores que incluyen factores promotores de supervivencia, que inician y sostienen la inflamación. Los compuestos de la invención inhiben la distinta actividad promotora de supervivencia de NF-?? en la inflamación. Por lo tanto, las enfermedades y trastornos susceptibles de tratamiento con estos compuestos incluyen, aparte de las enfermedades inflamatorias crónicas convencionales (tales como enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide y psoriasis), otras enfermedades y trastornos que dependen de un componente inflamatorio significativo. Los ejemplos de tales enfermedades y trastornos, que son tratados con agentes antiinflamatorios o agentes inhibidores de NF-??, o que se ha propuesto que son susceptibles de tratamiento con inhibidores de NF-?? y también se podrían tratar con un compuesto de la invención, incluyen: 1. Aparato respiratorio: enfermedades obstructivas de las vías aéreas que incluyen: asma, que incluye asma bronquial, alérgico, intrínseco, extrínseco, inducido por ejercicio, inducido por fármaco (que incluye inducido por aspirina y AINE) y asma inducido por polvo, tanto intermitente como persistente y de toda severidad, y otras causas de hipersensibilidad de las vías aéreas; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); bronquitis que incluye bronquitis infecciosa y eosinofílica; enfisema; bronquiectasia; fibrosis quística, sarcoidosis; pulmón del granjero y enfermedades relacionadas; neumonitis por hipersensibilidad; fibrosis pulmonar que incluye alveolitis fibrosante criptogénica, neumonías intersticiales idiopáticas, terapia antineoplásica con complicación fibrótica e infección crónica que incluye tuberculosis y aspergilosis y otras infecciones fúngicas; complicaciones del trasplante de pulmón; trastornos vasculíticos y trombóticos de la vasculatura pulmonar e hipertensión pulmonar; actividad antitusiva que incluye el tratamiento de la tos crónica asociada con condiciones inflamatorias y secretorias de las vías aéreas y tos iatrogénica; rinitis aguda y crónica que incluye rinitis medicamentosa y rinitis vasomotora; rinitis alérgica perene y estacional que incluye rinitis nerviosa (fiebre del heno); poliposis nasal; infección viral aguda que incluye el resfriado común e infección causada por el virus sincitial respiratorio, influenza, coronavirus (que incluye SARS) o adenovirus; o esofagitis eosinofílica. 2. Hueso y articulaciones: artritis asociadas con, o que incluyen, osteoartritis/osteoartrosis, tanto primaria como secundaria, por ejemplo displasia congénita de la cadera; espondilitis cervical y lumbar, y lumbalgia y dolor del cuello; osteoporosis; artritis reumatoide y enfermedad de Still; espondiloartropatías seronegativas que incluyen espondilitis anquilosante, artritis psoriática, artritis reactiva y espondoartropatía no diferenciada; artritis séptica y otras artropatías relacionadas con infección y trastornos del hueso como tuberculosis, que incluyen la enfermedad de Potts y el síndrome de Poncet; sinovitis aguda y crónica inducida por cristal, que incluye gota por urato, enfermedad de depósito de pirofosfato de calcio, e inflamación de tendón, bursal y sinovial relacionada con apatita de calcio; enfermedad de Behcet; síndrome de Sjogren primario y secundario; esclerosis sistémica y esclerodermia limitada; lupus eritematoso sistémico, enfermedad de tejido conectivo mixto, y enfermedad de tejido conectivo no diferenciada; miopatías inflamatorias que incluyen dermatomiositis y polimiositis; polimialgia reumática; artritis juvenil que incluye artritis inflamatoria idiopática de cualquier distribución de articulación y síndromes asociados y fiebre reumática y sus complicaciones sistémicas; vasculitis que incluyen arteritis de células gigantes, arteritis de Takayasu, síndrome de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, poliarteritis microscópica y vasculitis asociada con infección viral, reacciones de hipersensibilidad, crioglobulinas y paraproteínas; lumbalgia; fiebre familiar del Mediterráneo, síndrome de Muckle-Wells y fiebre hiberniana familiar, enfermedad de Kikuchi; artralgias inducidas por fármaco, tendonitis, y miopatías. 3. Dolor y remodelación del tejido conectivo de trastornos musculoesqueléticos por lesión [por ejemplo lesiones deportivas] o enfermedad: artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, osteoartritis, gota o artropatía de cristal), otra enfermedad de articulaciones (tal como degeneración de disco intervertebral o degeneración de articulación temporomandibular), enfermedad de remodelación de hueso (tal como osteoporosis, enfermedad de Paget u osteonecrosis), policondritis, esclerodermia, trastorno mixto del tejido conectivo, espondiloartropatías o enfermedad periodontal (tal como periodontitis). 4. Piel: psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis de contacto u otras dermatosis eczematosas, y reacciones de hipersensibilidad de tipo tardío; fito- y fotodermatitis; dermatitis seborreica, dermatitis herpetiforme, liquen plano, liquen escleroso y atrófico, pioderma gangrenoso, sarcoide de la piel, lupus eritematoso discoide, pénfigo, penfigoide, epidermólisis bulosa, urticaria, angioedema, vasculitis, eritemas tóxicos, eosinofilias cutáneas, alopecia areata, calvicie de patrón masculino, síndrome de Sweet, síndrome de Weber-Christian, eritema multiforme; celulitis tanto infecciosa como no infecciosa, paniculitis; linfomas cutáneos, cáncer de piel no melanoma y otras lesiones displásicas; trastornos inducidos por fármaco que incluyen erupciones fijas por fármaco. 5. Ojos: blefaritis; conjuntivitis que incluye conjuntivitis perene y alérgica vernal; iritis; uveítis anterior y posterior; coroiditis; trastornos inflamatorios, autoinmunes o degenerativos que afectan la retina; oftalmitis que incluyen oftalmitis simpática; sarcoidosis; infecciones que incluyen virales, fúngicas y bacterianas. 6. Aparato gastrointestinal: glositis, gingivitis, periodontitis; esofagitis que incluye reflujo; gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis, enfermedad de Crohn, colitis que incluye colitis ulcerosa, proctitis, prurito anal; enfermedad celiaca, síndrome del intestino irritable, y alergias relacionadas con alimentos que pueden tener efectos distantes del intestino (por ejemplo, migraña, rinitis o eczema). 7. Región abdominal: hepatitis que incluye autoinmune, alcohólica y viral, fibrosis y cirrosis del hígado; colecistitis; pancreatitis tanto aguda como crónica. 8. Aparato genitourinario: nefritis que incluye intersticial y glomerulonefritis; síndrome nefrótico; cistitis que incluye cistitis aguda y crónica (intersticial) y úlcera de Hunner; uretritis aguda y crónica, prostatitis, epididimitis, ooforitis y salpinguitis; vulvovaginitis, enfermedad de Peyronie; disfunción eréctil (tanto masculina como femenina). 9. Rechazo de aloinjerto: agudo y crónico subsiguiente, por ejemplo, a trasplante de riñon, corazón, hígado, pulmón, médula ósea, piel o córnea, o subsiguiente a transfusión sanguínea; o enfermedad crónica de injerto contra hospedero. 10. SNC: enfermedad de Alzheimer y otros trastornos de demencia que incluyen CJD y nvCJD; amiloidosis; esclerosis múltiple y otros síndromes desmielinizantes; aterosclerosis y vasculitis cerebral; arteritis temporal; miastenia grave; dolor agudo y crónico (agudo, intermitente o persistente, de origen central o periférico) incluso dolor visceral, cefalea, migraña, neuralgia trigeminal, dolor facial atípico, dolor de articulación y hueso, dolor que se origina por cáncer e invasión de tumor, síndromes de dolor neuropático que incluyen neuropatía diabética, postherpética y asociada con VIH; neurosarcoidosis; complicaciones del sistema nerviosos central y periférico de procesos malignos, infecciosos o autoinmunes. 11. Otros trastornos autoinmunes y alérgicos que incluyen tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison, diabetes mellitus, púrpura trombocitopénica idiopática, fascitis eosinofílica, síndrome de hiper-lgE, síndrome antifosfolípido. 12. Otros trastornos con un componente inflamatorio o inmunológico, incluso síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), lepra, síndrome de Sezary, y síndromes paraneoplásicos. 13. Aparato cardiovascular: ateroesclerosis que afecta la circulación coronaria y periférica; pericarditis; miocarditis, cardiomiopatías inflamatorias y autoinmunes que incluyen sarcoide miocárdico; lesiones isquémicas de reperfusión, endocarditis, valvulitis y aortitis que incluyen la infecciosa (por ejemplo sifilítica); vasculitis; trastornos de las venas proximales y periféricas incluso flebitis y trombosis, que incluye trombosis venosa profunda y complicaciones de venas varicosas. 14. Aparato gastrointestinal: enfermedad celiaca, proctitis, gastroenteritis eosinofílíca, mastocitosis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis intermitente, trastorno de intestino irritable, síndrome de intestino irritable, diarrea no inflamatoria, alergias relacionadas con alimentos que tiene efectos distantes del intestino, por ejemplo migraña, rinitis y eczema.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención se provee un compuesto de acuerdo con el primer aspecto de la invención, o una composición de acuerdo con el segundo aspecto d la invención, para usarse como un medicamento.

De acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se provee el uso de un compuesto de acuerdo con el primer aspecto de la invención, o una composición farmacéutica de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno. Dicha enfermedad o trastorno y sujeto siendo definidos en las modalidades preferidas que se describen arriba con respecto al tercer aspecto de la invención.

Preferiblemente, los productos, métodos de la invención son para el tratamiento de enfermedades y trastornos de los humanos.

Aspectos teranósticos de la invención La invención abarca, en varias modalidades, métodos de tratamiento, uso de los compuestos o composiciones de la invención para la fabricación de un medicamento, y compuestos o composiciones de la invención para uso terapéutico.

De acuerdo con algunas modalidades, la invención también puede abarcar: a) Métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno como se indica arriba en donde la enfermedad o trastorno es un cáncer en un sujeto individual, y el cáncer sospechoso en ese sujeto ha sido muestreado previamente (por ejemplo tomando una biopsia de tejido o fluido corporal tal como sangre o esputo) y se determina que muestra expresión elevada de Gadd45 , y/o expresión y/o actividad elevada de NF-kB. b) Compuestos o composiciones de la invención para usarse como un medicamento para el tratamiento de los tejidos de un individuo al que previamente se le determinó expresión y/o actividad elevada de Gadd45 , y/o expresión y/o actividad elevada de NF-kB. c) Uso de los compuestos o composiciones de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno que está caracterizado por expresión y/o actividad elevada aberrante de Gadd45 , o que está caracterizado por activación aberrante de la ruta de NF-kB, y es susceptible de tratamiento por inducción de muerte celular programada mediante la inhibición de la actividad de Gadd45 , en donde la enfermedad o trastorno es un cáncer, en donde se ha determinado previamente que dichas células cancerosas muestran expresión y/o actividad elevada de Gadd45 .

La expresión y/o actividad "elevada" puede significar una elevación de por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 50%, por lo menos 75%, por lo menos 100%, por lo menos 200%, por lo menos 300%, por lo menos 400%, por lo menos 500%, por lo menos 600%, por lo menos 700%, por lo menos 800%, por lo menos 900%, o por lo menos 1 ,000%, en comparación con la expresión y/o actividad en el tejido sano de control del mismo origen, y opcionalmente obtenido del mismo sujeto o de un sujeto sano. El grado de expresión y actividad se pueden determinar mediante cualquier método conocido que incluye RT-PCR, Southern blotting, Northern blotting, Western blotting, ELISA, radioinmunoensayo, prueba de cinasa y otras pruebas de unión, funcionales y/o de expresión.

Este aspecto teranóstico de la invención se ilustra principalmente por los resultados presentados en las figuras 12A y 12B. Los resultados mostrados aquí demuestran que, en un panel de 29 líneas de células cancerosas de tejidos de diferente origen, la sensibilidad de la célula cancerosa a la destrucción inducida por Z-DTP se correlaciona en un grado muy alto de significancia estadística con el grado de expresión endógena de Gadd45 , evaluada mediante pruebas qRT-PCR. En realidad, la gráfica de correlación de la expresión de Gadd45p contra el porcentaje de supervivencia/proliferación celular después de tratamiento con Z-DTP2, muestra que la significancia del coeficiente de correlación entre el dominio de los dos parámetros es muy alto (p<0.01) (correlación de Pearson). Sorprendentemente, la única línea celular de mieloma múltiple (de un total de 9 líneas celulares probadas de mieloma múltiple) que es refractaria a la destrucción inducida por Z-/mDTP, y también a la muerte celular inducida por el silenciamiento mediado por sh-RNA de Gadd45p (figuras 16A-16C, 17A-17B y 18A-18C), es la línea celular RPMI-8226 que expresa los niveles más bajos -casi indetectables- de Gadd45 (figura 12A). Estos datos indican que si la terapia basada en DTP entrara a la clínica, será posible predecir poblaciones respondedoras de pacientes mediante un análisis simple y económico de qRT-PCR. Por ejemplo, se pueden analizar células primarias de pacientes de mieloma múltiple para determinar el grado de expresión de Gadd45 , y se puede considerar que los pacientes con expresión elevada recibirán el mayor beneficio del tratamiento con los compuestos de la invención. Por lo tanto, un aspecto importante de la invención es un aspecto teranóstico -esto es, la aplicación de una prueba clínicamente útil para predecir la respuesta a la terapia de DTPs en los pacientes.

Este aspecto teranóstico de la invención también es apoyado por la especificidad de objetivo muy alta de los compuestos de invención en las células para el complejo Gadd45 /MKK7. Esto indica que a mayor grado de expresión del objetivo (es decir, Gadd45P) en las células, será mayor la probabilidad de que tales células dependan de Gadd45 para su supervivencia, por lo tanto será mayor la probabilidad de que tales células sean sensibles a la destrucción inducida por Z-/mDTP. Esta alta especificidad de Z-/mDTP es demostrada por los hallazgos de que: (1) en un panel grande de líneas celulares de tumor hay una correlación estadística altamente significativa entre el grado de expresión de Gadd45 y la sensibilidad de la célula cancerosa a la destrucción inducida por Z-/mDTP (figura 12A-12B); (2) la regulación negativa mediada por sh-RNA de Gadd453 induce rápidamente apoptosis en líneas de células de cáncer sensibles a Z-/mDTP, pero no en las resistentes a Z-/mDTP (figuras 16A-16C, 17A-17B, 18A-18C), y la cinética de inducción de apoptosis por sh-RNAs específicos de Gadd45p en estas líneas celulares es similar a la observada con Z-/mDTP (figuras 7A, 8B y 8C); (3) la regulación negativa mediada por sh-RNA de MKK7 hace a las líneas de células de cáncer sensibles a Z-/mDTP completamente resistentes a la destrucción inducida por Z-/mDTP (figuras 20A, 20B, y 20C); (4) el objetivo terapéutico de la invención es la interfaz entre dos proteínas, Gadd45 y MKK7 (figuras 21 A, 21 B, 21 C y 21 D) -lo que provee adicionalmente el potencial para una alta selectividad de objetivo, una ventaja clave de la solución de los presentes autores sobre las terapias existentes. Estos datos, junto con la baja toxicidad de Z-/mDTP para las células normales, y los hallazgos de que la anulación knock-out de Gadd45 es bien tolerada en los ratones (véase la referencia Papa, et al. (2008) J. Clin Invest. 118:191-1923), indican que haciendo blanco en las distintas funciones pro-supervivencia de NF-kB en la supervivencia celular, por medio de inhibición mediada por Z-/mDTP de Gadd45 /MKK7, se puede proveer una terapia que es más específica, menos tóxica y por lo tanto más eficaz que las terapias dirigidas a la ruta de NF-kB y/o el proteosoma.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran la invención.

EJEMPLO 1 Síntesis de Z-DTP2 A manera de ejemplo, se reporta la síntesis de Z-DTP2. El Z-DTP2 comprende un núcleo de tetrapéptido formado de D-tirosina, D-glutamina, D-arginina, D-fenilalanina, con benciloxicarbonilo (esto es, un grupo Z) enlazado al extremo N por medio de un enlace de amida y un grupo amino enlazado al extremo C por medio de un enlace de amida.

Materiales y métodos El Z-DTP2 se preparó manualmente siguiendo el método de fase sólida de Fmoc/tBu (Fields G.B. y Noble R.L. 1990, Int J Pept Protein Res; 35: 161-214; Bodansky, M. y Bodansky A. (1995), "The practice of peptide synthesis", 2a ed., Springer Verlag, Berlín) y empezando desde 500 pmoles (1000 mg) de resina de amida de poliestireno de Rink (resina Fmoc-RINK-AM, GL Biochem, Shangai, China, Cat. 49001), que tiene una sustitución de 0.50 mmoles/g. La resina se puso en un vaso de polipropileno de 30 mi dotado con un tapón de teflón de 20 µ?t?, una tapa superior de polipropileno y una tapa inferior de polipropileno de cierre Luer. La resina se hinchó con 10.0 mi de una mezcla de diclorometano (DCM) : dimetilformamida (DMF) 50:50 (ambos de LabScan, Stillorgan, Irlanda; DCM cat. No. H6508L; DMF cat. No. H33H1 1X) durante 20 minutos. Después de que el disolvente se eliminó al vacío, el grupo Fmoc se separó por tratamiento con 5.0 mi de una mezcla DMF-piperidina 8:2 (piperidina, Pip, cat. No. 80641 ; Sigma-Aldrich, Milán, Italia) durante 20 minutos a temperatura ambiente (ta.). El reactivo se eliminó al vacío y la resina se lavó 3 veces con 5.0 mi de DMF. Después se disolvieron 2.5 mmoles, 0.97 g, de Fmoc-D-Phe-OH (GL Biochem, Shangai, Cat. No. 35702) en 5.0 mi de DMF (concentración final de 0.5M), y se activó con 5.0 mi de una solución 0.5 M de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (PyBOP, Novabiochem, cat. No. 01-62-0016) en DCM, y 0.90 mi de di-iso-propil-etilamina (5.0 mmoles; DIEA, Sigma-Aldrich, cat. No. D-3887). La solución del aminoácido activado se vació sobre la resina y se dejó bajo agitación vigorosa durante 30 minutos. La solución se drenó al vacío y la resina se lavó 3 veces con 5.0 mi de DMF. El grupo Fmoc de a-??^ se eliminó como se describe anteriormente usando una solución DMF-Pip 8:2 (5.0 mi) durante 20 minutos y lavado extensivo con 0.5 mi de DMF (3 veces). Una solución de Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH (2.5 mmoles, 1.6 g en 5.0 mi de DMF; GL Biochem, Shangai, Cat. No. 36404) se activó como se describe usando 2.5 mmoles de PyBOP y 5.0 mmoles de DIEA puro. La solución se transfirió a la resina y se dejó bajo agitación durante 30 minutos. Después de separar los grupos Fmoc con 5.0 mi de una solución de DMF-Pip 8:2 y lavado con DMF (tres veces, 5.0 mi), se le agregó a la resina una solución de Fmoc-(D)-Glu(tBu)-OH 0.50 M en DMF (2.5 mmoles, 1.1 g en 5.0 mi de DMF; GL Biochem, Shangai, Cat. No. 36605) preactivada con PyBOP y DIEA como se describe arriba, y la reacción se dejó proceder durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de drenar el aminoácido, el grupo Fmoc se eliminó como se describe arriba (20 minutos de tratamiento con DMFPip 8:2, 5.0 mi), y la resina se lavó 3 veces con 5.0 mi de DMF. Se disolvieron 2.5 mmoles de Fmoc-(D)-Tyr(tBu)-OH (1.2 g, GL Biochem, Shangai, Cat. No. 36906) en 5.0 mi de DMF y se preactivaron con PyBOP y DIEA como se reporta arriba; se transfirieron a la resina y se dejó bajo agitación durante 45 minutos. La solución de aminoácido se removió por drenado al vacío, después la resina se lavó 5 veces con 5.0 mi de DMF. Se disolvieron 5 mmoles de Z-OSu (benciloxicarbonil-N-hidroxi-succinimida, GL Biochem, Shangai, Cat. No. 10502) en 10 mi de DMF y se agregaron a la resina. Se le agregaron 2.4 mi de DIEA y la reacción se dejó agitando durante la noche. ' Después de drenar la solución, la resina se lavó extensivamente con DMF, DCM, alcohol metílico (MeOH, LabScan, Cat. No. C2517), y éter etílico (Et20, LabScan, Cat. No. A3509E), se secó al vacío y se pesó. El peso fue de 1.1 g. Para separar el péptido, la resina se trató con 10.0 mi de una mezcla compuesta de TFA-H20-TIS 90:5:5 (v/v/v) (TFA, ácido trifluoroacético, Sigma- Aldrich, Italia, Cat. No. 91700; TIS, tri-iso-propilsilano, Sigma-Aldrich, cat. No. 23,378-1) durante 3 horas a t.a. La resina se removió por filtración y después a la solución de ácido trifluoroacético se le agregaron 20 mi de ET20 frío, llevando a la formación de un precipitado blanco. Después de eliminación de los disolventes por centrifugación, el precipitado se lavó con 10.0 mi de Et20 frío, se disolvió en 10.0 mi de H20/CH3CN 50:50 (v/v), y se liofilizó. El péptido se caracterizó por LC-MS usando una columna C 8 de calibre estrecho de 50x2 mm ID ONYX (Phenomenex, Torrance, CA, EE. UU.), equilibrada a 600 · µ?/min con 5% de CH3CN, 0.05% de TFA. El análisis se efectuó aplicando un gradiente de CH3CN, TFA al 0.05% de 5% a 70% durante 3 minutos. El péptido se purificó por RP-HPLC semipreparativa usando una columna C18 10x1 cm ONYX (Phenomenex, Torrance, CA, EE. UU.), equilibrada a 20 ml/min, inyectando 20 mg en cada corrida. Para eluir el péptido se aplicó un gradiente de 5% a 65% durante 8 minutos. Las fracciones puras se reunieron y se caracterizaron por LC-MS. El PM determinado del péptido A fue de 746.8 amu (teórico: 746.83 amu), y el producto era más de 95% puro (HPLC). Se obtuvo un rendimiento de alrededor de 60% después de purificación de todo el producto crudo.

EJEMPLO 2 Inhibición dependiente de la dosis de la interacción entre Gadd45B y MKK7 con una selección de los compuestos de la fórmula general (I) Para evaluar las propiedades inhibitorias de los péptidos se hicieron pruebas basadas en ELISA. En estas pruebas una proteina de fusión de glutatión S-transferasa (GST) y la cinasa de la cinasa de proteína 7 activada por mitógeno (MKK7) se depositaron sobre los pocilios de una placa de 96 pocilios, mientras que se usó hGadd45p biotinilado en solución. El hGadd45 se biotiniló usando un kit EZ Link NHS-LC-biotin (Pierce, Rockford, IL), de acuerdo con Tornatore et al. (Tornatore L. et al. (2008), J. Mol. Biol; 378:97-11 1 ).

Materiales y métodos En primer lugar se investigó la asociación entre Gadd45ß y MKK7 por medio de pruebas ELISA, también como lo describen Tornatore et al. (Tornatore L. et al. (2008), J. Mol. Biol; 378:97-11 1). La cinasa de longitud completa fusionada con GST se depositó sobre pocilios de una placa de microtitulación de 96 pocilios y se dejó durante 16 h a 4 °C, a una concentración de 42 nM en el amortiguador A (Tris 25 mM, pH 7.5, NaCI 150 mM, DTT 1 mM y EDTA 1 mM). Algunos pocilios se llenaron con amortiguador solo y se usaron como blancos.

Después de incubación por 16 h a 4°C, las soluciones se eliminaron y los pozos se llenaron con 350 µ?_ de un 1% (p/v) de solución de NFDM (Leche en polvo descremada) en PBS (solución salina regulada con fosfato). La placa se incubó durante 1 h a 37°C en la oscuridad. Después de lavar con T-PBS de regulador de pH (PBS con 0.004% (v/v) detergente Tween), los pozos se llenados con 100 pL de hGadd45 biotinilado en concentraciones que varían de 8.4 nM a 168 nM. Cada función de datos se llevó a cabo por triplicado. Después de la incubación durante 1 hr en la oscuridad a 37°C, las soluciones se eliminaron y los pozos nuevamente se lavaron con T- PBS. Después, se agregaron 100 pL de una dilución 1 :10,000 de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante disuelto en regulador de pH a cada pozo y la placa se incubó durante 1 hr a 37°C en la oscuridad. Después de la eliminación de la solución enzimática y del lavado, se agregaron 100 pL de o-fenilendiamina de sustrato cromogénico (0.4 mg/mL en 50 mM de regulador de pH de citrato de fosfato de sodio, que contiene 0.4 mg/mL de urea en peróxido de hidrógeno) y se dejó que el color se desenvolviera en la oscuridad durante 5 min. La reacción se interrumpió al agregar 50 pL de 2.5 M H2SO4. La absorbancia a 490 nm se midió en todos los pozos y los valores se promediaron después de sustraer los vacíos correspondientes. La proteína unida después se detectó como se describió anteriormente. La concentración molar de hGadd45p biotinilada en la cual se detecta la señal de ELISA media máxima corresponde a la constante de disociación (KD) (Friguet B, Chaffotte AF, Djavadi-Ohaniance L, Goldberg ME.J Immunol Methods. 1985 Mar 18;77(2):305-19). Los ensayos de competencia de unión se llevaron a cabo al revestir GST-MLL7 a 42 nM como se describió, una concentración dehGadd45p biotinilada de 21 nM (condiciones de saturación previa 1 :0.5 mol/relación molar) y, en una primera prueba usando competidores a 21 nM. La unión de hGadd453 biotinilada con GST-MKK7 se analizó en la presencia de cantidades en aumento del péptido competidor (concentraciones que varían de 0.01 nM a 100 nM) y los valores obtenidos con el competidor se expresaron como el porcentaje de la unión detectada en la ausencia del competidor. Los datos de actividad, expresados como porcentaje de la capacidad inhibidora a 21 nM bajo las condiciones del ensayo, se reportaron en el siguiente Cuadro 1 para un juego seleccionado de compuestos de acuerdo con la invención. Según la convención adoptada en el Cuadro "L-Xaa" y "D-Xaa" se refieren a las formas L y D de Xaa de aminoácido.

Los datos de IC50 de los compuestos seleccionados (es decir, la dosis del compuesto requerida para lograr un 50% de reducción de unión de Gadd45p con MKK7) se reportaron en la Figura 3C.

EJEMPLO 3 Aislamiento de los tetrapéptidos guía Materiales y Métodos Se utilizó una detección de ELISA para identificar los D- tetrapéptidos guía a partir de los cuales pueden derivarse los compuestos preferidos de la invención. Una biblioteca peptidica de combinación simplificada (Marasco et Al. 2008, Curr. Protein Pept. Sci. 9:447-67) se detectó para antagonistas de interacción Gadd45 /MKK7. Esta biblioteca contiene un total de 124=20,736 tetrapéptidos diferentes por medio de las combinaciones de los siguientes residuos de aminoácidos Gln (Q), Ser (S), Arg (R), Ala (A), Tyr (Y), Pro (P), Met (M), Cys (C), Phe (F), Leu (L), His (H), Asp (D), y fue iterativamente destorcido en cuatro pasos mediante las pruebas de competencia de ELISA usando en cada paso MKK7 revestido (42 nM), hGadd45 soluble en biotina (21 nM) y cada una de las 12 subbibliotecas (42 nM). Los resultados de esta detección se muestran en el Cuadro I anterior (en donde se utilizan los códigos de residuos de aminoácidos de una sola letra estándar X2l X3 y X representan mezclas de los 12 residuos dados anteriormente) (ver también la Figura 3A). El péptido más activo resultante descrito en el Cuadro I (es decir, Fmoc-(pAla)-YDHF-NH2, también referido como Fmoc- LTP1) después de sometió a varias rondas de optimización y eliminación de la etiqueta de Fmoc-(pA1a)2-tag, dando rendimiento de Ac-LTP 1 y Ac-LTP2 (ver Cuadro II). Estos tetrapéptidos se resintetizaron utilizando D-isómeros de los mismos aminoácidos, al final dando como rendimiento el tetrapéptido guía 1 y 2 (DTP1 y DTP2), los cuales interrumpieron la interacción de Gadd45 /MKK7 con IC50S de 0.22 nM y 0.19 nM, respectivamente (Figura 3C).

Secuencia de DTPI: Acetil-(D-Tyr)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Phe)-NH2 [SEQ ID NO.: [38] Secuencia de DTP2: Acetil-(D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Phe)-NH2 [SEQ ID NO.: [37] También las siguientes secuencias se seleccionaron como controles negativos (NC) : Secuencia de NC1 : Acetil-(D-Tyr)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Gln)-NH2 [SEQ ID NO.: [81] Secuencia de NC2: Acetil-(L-Tyr)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Ala)-NH2 [SEQ ID NO.: [82] Secuencia de NC3: Acetil-(L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Trp)-NH2 [SEQ ID NO.: [83] Secuencia de NC4: Acetil-(L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Trp)-NH2 [SEQ ID NO.: [84] Las Figuras 3A, 3B y 3C muestran las pruebas de unión de competencia de ELISA. El porcentaje de inhibición de péptidos acetilados y/o péptidos modificados (es decir, péptidos conjugados con acetilo u otros grupos) se muestran respectivamente en los Cuadros II y III (los cuales utilizan códigos de residuo de aminoácido de una sola letra estándar).

EJEMPLO 4 Pruebas de inmunoprecipitación Materiales y Métodos El riñon embrionario humano (HEK-293) se cultivó en un medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero fetal de becerro (FCS), 100 unidades/ml de penicilina, 100 de mg/mL de estreptomicina y 1% de glutamina. Las células HEK-293 (2.2x106) se sembraron en placas de cultivo tisular de 10 cm2 , y al siguiente día, se transfectaron con plásmidos pcDNA-FLAG-MKK7 y pcDNA-HA-Gadd45p , usando una técnica de precipitación de Ca3(P04)2 (Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se lavaron una vez con PBS, después se suspendieron nuevamente y se incubaron durante 30 min a 4°C en regulador de lisis (20 mM HEPES, 350 mM NaCI2, 20% de glicerol, 1 mM de MgCI2) 0.2 mM de EGTA, 1 mM de DTT, 1 mM de a3 V0 ) y 50 mM de NaF) complementado con inhibidores de proteasa (1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 µ? quimostatina, 2 µ/ml aprotinina, y 2 µ/ml de leupeptina) con agitación ligera ocasional. Se recolectaron las células lisadas y después se centrifugaron a45,000xg durante 40 min. Los lisados celulares despejados resultantes se utilizaron para un análisis adicional.

Los tetrapéptidos guía DTP1 y DTP2 aislados en el Ejemplo 3, junto con los tetrapéptidos control negativo (NC1 , NC2, NC3 y NC4), se co- incubaron con Gadd45p/MKK7 para demostrar que los D-tetrapéptidos activos, pero no los tetrapéptidos control negativo interrumpieron la interacción de Gadd45 /MKK7. Las inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo utilizando esencialmente las mismas condiciones descritas en Papa, S et a!., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153 y las referencias en la misma, y un anticuerpo anti-FLAG que precipitó MKK7 etiquetada con FLAG. Los Western blots se desarrollaron utilizando anticuerpos anti-MKK7 o anticuerpos anti-HA (uniéndose a HA-hGadd45p), como se indicó en la Figura 5 (paneles inferior y superior, respectivamente).

Resultados Los resultados se muestran en la Figura 5. Se puede observar a partir de los Western blots presentados en la Figura 5 que hubo una fuerte interacción entre Gadd45 y MKK7 cuando se llevó a cabo la co-inmunoprecipitación con lisados de células HEK-293 que expresan transitoriamente HA-Gadd45 y FLAG-MKK7 y un anticuerpo anti-FLAG (específicamente uniéndose a MKK7 etiquetado con FLAG). Este resultado se obtuvo cuando las co-inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo en la presencia de tetrapéptidos o en la presencia de D-tetrapéptidos control negativo (NC) NC1 , NC2, NC2 o NC4. Cuando se llevaron a cabo co-inmunoprecipitaciones en la presencia de 1 ó 5 nM de DTP 1 o DTP2; sin embargo, el complejo precipitado sin o con poco Gadd45 , indicando que la interacción entre MKK7 y Gadd45p se interrumpió mediante los compuestos de DTP activos, con lo cual se conduce a una reducción de Gadd45p en los co-inmunoprecipitados. Estos datos confirman y extienden el resultado observado en las pruebas de competencia de ELISA mostrado en las Figuras 3A, 3B y 3C y la Figura 4.

EJEMPLO 5 Estabilidad de DTP en suero humano Materiales y Métodos En la Figura 4, se llevaron a cabo las pruebas de competencia de ELISA de unión a Gadd45ß/MKK7 para determinar la estabilidad de los D-tetrapéptidos conjugados con Z en suero humano. Para este propósito, las actividades de los antagonistas Gadd45piMKK7 más activos seleccionados de la detección de biblioteca de combinación descrita en el ejemplo 3 (es decir, Z-LTP1 , Z-LTP2, Z-DTP1 , y Z-DTP2), así como de un L-tetrapéptido control negativo (es decir, Z-LNC) y el D-enantiómero correspondiente (es decir, Z-DNC), se compararon antes y después de una preincubaciónd e 48 horas con suero humano a 37°C en las pruebas de competencia de ELISA. ELISA se llevaron a cabo como se describió en la Figura 3C. Brevemente, 100 µ? de 42 nM de GST- MKK7 recombinante en regulador de ELISA (25mM Tris pH 7.5, 150 mM de NaCI, 1 mM de DTT, 1 mM de EDTA) se revistieron en placas de 96 pozos mediante incubación durante la noche a 4°C. Después del bloqueo con 2% de NFDM durante 1 hr a 37°C, las placas se lavaron con TPBS, y después se agregaron 21 nM de (h)Gadd45p humana biotinilada recombinante a los pozos junto con concentraciones crecientes de tetrapéptidos que se sometieron o no a la preincubacion con suero humano, como se indicó. Para una discusión adicional de las condiciones utilizadas para las pruebas de competencia de ELISA, el lector se dirige a Tomatore et Al 2008 JMB, 378: 97-1 11 y sus referencias.

Resultados La Figura 3C muestra que las actividades de DTP1 y DTP2 son comparables con aquéllas de sus L-enantiómeros correspondientes (es decir, LTPI y LTP2, respectivamente) al inhibir la formación del complejo Gadd45p/MMK7, como se muestra mediante una comparación del Cl50 de los DTP y LTP en las pruebas de competencia de ELISA. La Figura 4 muestra que no sucede ninguna pérdida de actividad después de una incubación de 48 horas de Z-DTP1 o Z-DTP2 con suero humano a 37°C. De hecho, los datos muestran que después de esta preincubacion, los Z-DTP, pero no los Z-LTP retienen completamente su habilidad de interrumpir la interacción de Gadd45p-MKK7 en la pruebas de competencia de ELISA. Al compara los Cl50 de los tetrapéptidos después de la preincubacion con suero y después de ninguna preincubacion sin suero, se puede observar que los Z-DTP1 y Z-DTP2 son completamente estables después de la preincubacion con suero (Cl50 = 0.19 nM para Z-DTP1 , y Cl50 = 0.18 nM para Z-DTP2 mientras que Z-LTP I y Z-LTP2 no lo son, ya que los últimos tetrapéptidos muestran una pérdida importante de actividad después de la preincubación con suero (ver su Cl5oS> 10µ?). En todas las concentraciones probadas, las actividades inhibidoras de los D-tetrapéptidos se han preincubado con suero donde se pueda distinguir en estas pruebas de aquéllas de los D-tetrapéptidos que no se han sometido a esta preincubación (Figuras 3C y 4).

La comparación de los patrones dependientes de la dosis mostrada en las Figuras 3C y 4 indica que Z-DTP1 y Z-DTP2 son estables en suero humano a 37°C y por lo tanto, son adecuados para uso sistémico, mientras que Z-LTP1 y Z-LTP2 no lo son. También se puede ver que los tetrapéptidos control negativo (por ejemplo Z-DNC y Z-LNC) no tienen ninguna actividad en las pruebas de competencia de ELISA antes mencionadas, a pesar de que sin se han preincubado o no con suero humano (Figuras 3C y 4). Los datos representados en las Figuras 3C y 4 también muestran que la adición de N-terminal de un grupo benciloxicarbonilo (Z) (en lugar del grupo acetilo) no comprende la habilidad de DTP 1 y DTP2 o de LTP 1 y LTP2 para inhibir la formación del complejo Gdd45p/MKK7 — sin embargo, la adición de un grupo Z aumenta notablemente la captación celular de los DTP (no se muestran los datos), por lo tanto, aumenta de manera notable la actividad celular de los DTP en pruebas de eliminación de tumores (ver Figuras 7A y 7B).

EJEMPLO 6 Determinación de los CI50 de Z-DTP en un panel de líneas celulares de mieloma múltiple Materiales v Métodos Para examinar adicionalmente los efectos del tratamiento con D-tetrapéptidos en la supervivencia/proliferación de líneas celulares de mieloma múltiple, las células de 8 líneas celulares de mieloma (de 9 líneas celulares de mieloma probadas) que fueron sensibles a la eliminación inducida por Z-DTP (es decir, células U266, KMS-.11 , NC1-F1929, ARH-77, JJN-3, KMS-I2, KMS-18, KMS-27; ver también las Figs. 8A, 8B, 8C, y 12A-12B) se trataron con concentraciones crecientes (que varía de 0.01 a 10µ?) de Z-DTP1 o Z-DTP2 durante 24, 72 o 144 horas, como se muestra en el Cuadro IV. Los cultivos de líneas celulares de mieloma múltiple y los tratamiento con Z-DTP se llevaron a cabo como se describe en el ejemplo 8 (ver a continuación). Se evaluaron los efectos de los Z-DTP en supervivencia/proliferación de múltiples líneas celulares mediante el uso de pruebas de incorporación de [3H]timidina) llevadas a cabo como se describió en el ejemplo 8. La cantidad de proliferación celular medida con cada una de las concentraciones de Z-DTP utilizadas y con los cultivos no tratados (es decir, los cultivos incubados con un solo medio), se expresó como conteos por minuto (c.p.m.). - que tiene correlación directa con el grado de proliferación celular. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Se determinaron las concentraciones promedio de Z-DTP1 y Z-DTP2, así como sus derivados (por ejemplo, mDTP3), que resultaron en un 50% de inhibición de proliferación celular (es decir, CI5o) con relación a la proliferación celular registrada con los cultivos no tratados. Los CI5o de Z-DTP1 y Z-DTP2 calculado para las 8 líneas de mieloma sensibles probadas en los tiempos mostrados (es decir, días 1 , 3 y 6) se reportan en el Cuadro IV. Los Cl50 de estos dos compuestos, así como los de los 31 compuestos adicionales (incluyendo los de los derivados de Z-DTP2 como mDTP3), calculados en las múltiples células de mieloma KMS-I I y/o KMS-12 en los días 1 , 3 y 6 se reportaron en el Cuadro V.

Como se puede ver en el Cuadro IV, Z-DTP 1 y Z-DTP2 disminuyeron de manera notable la captación de [3H]-TdR en las múltiples líneas celulares probadas en una manera que depende de la dosis (excepto aquélla en la línea celular RPMI-8226, que muestra niveles muy bajos de Gadd45 ; a continuación mencionado adicionalmente; ver las Figuras 12A-12B) (también ver las figures 8A, 8B, 8C, y 12A-12B). Se obtuvieron resultados similares en estas líneas celulares de mieloma múltiple cuando se calcularon los Cl50 de Z-DTPI y ZD- TP2 usando pruebas de exclusión por azul de tripano (midiendo la viabilidad celular) (no se muestran los datos).

Resultados Como se muestra en el Cuadro IV, todas las líneas celulares de mieloma múltiple probadas mostrados alta sensibilidad de la inhibición alcanzada con Z-DTP de la supervivencia/proliferación celular (ver también las Figuras 8A, 8B, 8C, y 12A-12B). No obstante, como también se puede ver en el Cuadro IV, estas líneas celulares mostraron sensibilidad variable a Z-DTP1 y Z-DTP2. De hecho, algunas líneas celulares ya eran altamente sensibles a la inhibición alcanzada por Z-DTP de supervivencia/proliferación celular después de un tratamiento de 24 horas con estos compustos (por ejemplo, ver el CI5o=1 3 µ? de células KMS-12, y el CI5o = 2.88 µ? de Z-DTP2 de células KMS-1 1 en 24 horas), y todas fueron altamente sensibles tanto Z-DTP1 como Z-DTP2 después del tratamiento durante 144 horas, con CI50 que varían de 10.1 nM a 4.9 µ? para Z-DTP 1 , y de 10 nM a 4.5 µ? para Z-DTP2, en este momento (Cuadro IV). Debe observarse, el derivado Z-DTP2, mDTP3 (compuesto 17), se probó en las líneas celulares KMS-1 1 y KMS-12, y mostró una actividad celular mejorada en las líneas celulares comparada con Z-DTP1 y Z-DTP2, con Cl50 de 16 nM y 25 nM, respectivamente, en el día 6, comparada con los Cl50 de Z-DTP1 (es decir, 316 nM y 10.1 nM, respectivamente) y Z-DTP2 (es decir, 66 nM y 10 nM, respectivamente) (ver Cuadro V) (también ver las Figuras 20A, 20B, y 20C). Por lo tanto, los DTP activos, pero no los Z-DNC control negativo, tienen fuerte actividad citotóxicos en la mayoría de las líneas celulares de mieloma múltiple. Además, nuestros más recientes derivados (por ejemplo, mDTP3) retienen alta potencia in vitro, pero muestran actividad celular mejorada en células de mieloma múltiple, con MW sustancialmente reducido (-500 contra >700), por lo tanto eficiencias de ligando mejoradas (ver Cuadro V) (también ver las Figuras 13A- 3B).

EJEMPLO 7 Restauración de actividad catalítica de MKK7 inhibida con Gadd45[3por tetrapéptidos Materiales y Métodos En la Figura 6, la transfección transitoria de pcDNA-FLAG-MKK7 en las células HEK-293 se llevó a cabo utilizando el método de precipitación de Ca3(P04)2, esencialmente como se describe en Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153 y las referencias en el mismo. 36 horas después de la transfección, las células se trataron con 100 ng/nil de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y 1 µ? ionomicina durante 30 min a 37°C. Los extractos celulares se prepararon como se describe en el ejemplo 4 y se utilizaron para la inmunoprecipitación con anticuerpos anti-FLAG (uniendo a FLAG-MKK7) como se describe en Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153 y las referencias en el mismo. Brevemente, se incubaron 50 µg de de lisado celular de células HEK-293 tratadas o no tratadas con PMA-ionomicina (P1 1) que expresan transitoriamente FLAG-MKK7 con 10 µ? de gel de afinidad anti-FLAG M2 (SIGMA) durante 4 horas a 4°C durante la rotación. Los inmunoprecipitados se lavaron 3 veces en regulador de lisis y dos veces más en regulador de cinasa (10 mM FIEPES, 5 mM MgCI2, 1 mM MnC12,12.5 mM ß-glicerofosfato, 2 mM DTT, 4 mM NaF y 0.1 mM Na3 VC ). La actividad catalítica de MKK7 finalmente se midió en pruebas de cinasa al incubar los ¡nmunoprecipitados de FLAG-MKK7 a 30°C durante 20 min con 20 µ? de regulador de cinasa con 2 µ? de GST-JNK1 recombinante y 5 µ?? de [?-32?]???) (reacción de cinasa), como se describe en Papa, S et a., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153 y las referencias en el mismo.

En algunas reacciones, para probar la habilidad de los antagonistas de D-tetrapéptido a interrumpir la interacción de Gadd45 - MKK7 y así liberar la actividad catalítica de MKK7 de la inhibición alcanzada por Gadd45 , los ¡nmunoprecipitados de FLAG-MKK7 1) primero se preincubaron durante 10 min a 30°C con 1 nM o 5 nM de DTP1 , DTP2 o D-tetrapeptides control negativo (NC), NC1 , NC2, NC3 y NC4, y 2) después se incubaron por otros 10 min a 30°C con o sin 5 µ? de proteína de fusión de GST de (h)Gadd45p (GST- hGadd45phumano recombinante; purificado de lisados bacterianos como se describe en Papa, S., (2007) J. BioL Chem. 282, 19029-19041 ), antes de utilizarlos para la reacción de cinasa descrita anteriormente, como se indica en la Figura 6.

En todos los casos, las reacciones de cinasa se terminaron mediante la adición de regulador de muestras de Laemmli. Las proteínas después de resolvieron por 10% de SDS-PAGE, y la actividad de cinasa de MKK7 mostrada por la autoradiografía. Para una discusión adicional de las condiciones de prueba de cinasa de MKK7, el lector se dirige a Papa, S et al., (2007) J Biol. Chem. 282, 19029-1904 1 y Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153 y las referencias en el mismo.

Resultados Los resultados se muestran en la Figura 6 en donde la intensidad de una banda corresponde al grado de actividad de cinasa de MKK7 medida, ya que esta intensidad es proporcional a la cantidad de [?-3 -?]???) incorporada por MKK7 en su sustrato, GST-JNK1. Como puede ser visto de Figuras 3C, 4, y 5, la incubación con DTP1 o DTP2 interrumpió específicamente y efectivamente la interacción Gadd45p con MKK7 y como resultado, como puede ser visto de la Figura 6, recuperó totalmente la actividad catalítica de MKK7, mientras que incubación con tetrapéptidos control negativo (NC) NC1 , NC2, NC3 o NC4 no lo hicieron (Figura 6, paneles superiores). También puede ser visto de la Figura 6 que ni los tetrapéptidos control, NC1 , NC2, NC3 y NC4, ni los tetrapéptidos activos, DTP1 y DTP2, proporcionaron ninguna inhibición de la actividad catalítica de KK7 cuando se incubó con MKK7 en ausencia de GST- hGadd45 recombinante (Figura 6, paneles inferiores). Estos resultados son consistentes con aquéllos mostrados en las Figuras 3C, 4, y 5, donde sólo DTP1 y DTP2, pero no NC1 , NC2, NC3 ni NC4 fueron capaces de interrumpir la interacción de MKK7-Gadd45p ya sea en pruebas de ELISA o de co-inmunoprecipitación.

EJEMPLO 8 Eliminación específica de líneas celulares tumorales que representan la actividad de NF-KB constitutiva y/o niveles elevados de la expresión Gadd45 mediante tetrapéptidos Materiales y Métodos Este ejemplo investiga el uso de tetrapéptidos control (es decir, Z-DNC, Z-LNC, y Ac-DNC) y tetrapéptidos guía boactivos in vitro (es decir, Z-DTP1 , Z-DTP2, Z-LTP2 y Ac-DTP2) para la eliminación de un panel grande de líneas celulares tumorales de humano y murino de varios tejidos de origen. Las líneas celulares tumorales incluyen: líneas celulares de mieloma múltiple U266, KMS-I 1 , NC1-H929, ARH-77, JJN-3, KIVIS-12, KMS-18, KMS-27, RPMI-8226; las líneas celulares de linfoma difuso de células B grandes LY-3 y SUDHL6; las líneas celulares de linfoma de Burkitt BJAB, ST486, RAJI, RAMOS, Namalwa, y HS-SULTAN; la línea celular de leucemia promonocítica U937; las lineas celulares de linfoma y leucemia de células T JURKAT, HUT-78, MT-2, MT-4, MOLT4, MT2-HTLV-I, y CEM; las líneas celulares de cáncer de mama MCF7, MD-MDA-23 1 , y MD-MDA-486; las líneas celulares de linfoma de células B previas NALM-6 (humano) y 70Z/3 (ratón); la línea celular de leucemia mielogénica crónica K652; las líneas celulares de linfoma de células B KARPAS (humano) y A20 (ratón); la línea celular de riñon embrionario humano HEK-293T. La líneas celulares tumorales se cultivaron como se describió previamente (Zazzeroni et al. 2003, Blood 102. 3270-3279) en RPMI-1640 (líneas celulares de mieloma múltiple, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, leucemia promonocítica, leucemia y linfoma de células T, linfoma de células B previas, leucemia mielogénica crónica y de linfoma de células B) o el medio DMEM (líneas celulares de cáncer de mama y de riñon embrionario) complementado con10% de suero bovino fetal (FBS), 1 % de glutamina, 100 U/mL de penicillina, y 100 u/mL de estreptomicina en una atmósfera de 5% de C02 a 37°C.

Para las pruebas de inhibición de proliferación (Figuras 7A-7C, 8A-8C y 9) y las pruebas de muerte celular (Figura 10), se sembraron células en pozos de placas de 96 pozos a una concentración de 1 .0x 14 células/ml (pruebas de proliferación) o en pozos en placas de 24 pozos a una concentración de 4x 105 células/ml (pruebas de apoptosis) y se cultivaron hasta 6 días. Durante esta vez, las células fueron cultivadas en el medio solo (los cultivos sin tratamiento) o en el medio complementado con tetrapéptidos control (por ejemplo, Z-DNC) o activos (por ejemplo, Z-DTP2) (cultivos tratados) para lograr un concentratidn final de los tetrapéptidos en los cultivos de 10 µ? ó 100 µ?, como se indica. Para las pruebas de inhibición de proliferación dirigidas a valorar los efectos de los tetrapéptidos en supervivencia/proliferación de células tumorales, los cultivos se analizaron diariamente por exclusión con azul tripano (discriminando entre las células vivas y muertas) y el conteo celular (no se muestran los datos) o pruebas de incorporación de [3Hitimidina (Figuras 7A-7C, 8A-8C y 9), como se indica. En estas últimas pruebas, los efectos de Z-DTP, Ac-DTP y Z-LTP sobre la supervivencia/proliferación de las líneas celulares tumorales se investigó al medir la síntesis de ADN usando timidina tritiada estándar ([3H)timidina; pruebas de captación de [3H]-TdR). En los análisis mostrados, las células se incubaron durante 24, 72, 120 ó 144 horas a 37°C en la presencia o ausencia de los tetrapéptidos control o bioactivos, como se indicó, después se sometieron a incubación durante18 horas con [3H]-TdR (0.037 MBq/pozo, equivalente a 0.5 µ??/????). Las células se cosecharon en tapetes de fibra de vidrio usando un cosechador de células automático de placa de 96 pozos, después de lo cual se agregó fluido de centelleo y incorporación de [3H]timidina medida por espectroscopia de centelleo en un contador beta. Los resultados se expresaron como los porcentajes de los conteos por minuto (c.p.m.) (directamente correlacionada con el grado de la proliferación celular) medidos con los cultivos tratados con tetrapéptidos relacionados con los cultivos correspondientes incubados con el medio solo (células no tratadas). Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Como se menciona a continuación, Z-DTP2, Z-LTP2 y Ac-DTP2 dieron resultados similares para ZD- TP1 , Z-LTP1 y Ac-DTP1 , respectivamente, en estas pruebas de supervivencial/proliferación, aunque Z-DTP2 mostró una actividad ligeramente mayor que Z-DTP1 (no se muestran los datos, ver también el Cuadro IV).

La apoptosis celular en cultivos se midió en los momentos indicados por el uso de tinción nuclear de yoduro de propidio (P1 ) y citometría de flujo (FC) llevado a cabo como se describió previamente (Ríccardi y Nicoletti (2006) Nature Protocols 1 , - 1458— 1461 ) para identificar las células con un contenido de sub-d DNA (es decir, células apoptóticas) (Figura 10). Para estas pruebas, las células (4x105 células/ml) se cultivaron en placas de 24 pozos durante 72 ó 144 horas como se indica en la Figura 10, después se lavaron dos veces en solución salina reguladora de fosfato IX (PBS) y se fijó con 70% de etanol congelado durante 16 horas a -20°C, tras lo cual se sometieron a centrifugación y susbsecuentemente se suspendieron nuevamente en 1X PBS que contiene 100 µg/mL de ARNasa A. Después de este paso, las células se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min y se sometierona centrifugación, después se volvieron a suspender en 50 µg/mL de P1 , y se incubaron por otros 45 min a 4°C en la oscuridad. La citometria de flujo (FC) finalmente se llevó a cabo con un sistema automatizado FACsCalibur y los datos fueron analizados utilizando el software FlowJo.

Para determinar la base de la diferente sensibilidad de líneas celulares tumorales con la eliminación inducida por Z-DTP, medimos los niveles de expresión de Gadd45p en un panel de 29 lineas celulares tumorales o diferentes tejidos de origen al usar reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCT) y se correlacionaron estos niveles con el grado de susceptibilidad de estas lineas celulares con la actividad citotóxica de Z-DTP. Para estos análisis que se muestran en las Figuras 12A-12B, las líneas celulares de cáncer de mama y de HEK-293T se cultivaron en matraces de 75 cm2 flasks (5x106 célulaas/matraz) en medio completo de DMEM, mientras que todas las demás lineas celulares se cultivaron en pazos de placas de 6 pozos a 5x 105 células/pozo en medio completo de RPMI-1640 como se describió arriba. El ARN total se extrajo con Trizol y se purificó usando el mini kit de ARN PureLike (Invitrogen). 1 µg de ARN se agregó como plantilla para las reacciones de transcriptasa inversa (RT) realizadas usando el kit GeneAmp RNA PCR Kit (Applied Biosystems). Se llevaron a cabo qRT-PCR con cADN resultantes por triplicado usando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), Los iniciadores específicos de Gadd4Spse mencionan en el Cuadro VII y una máquina PCR en tiempo real ABI 7900. Los valores Ct experimentales fueron normalizados a ß-actina, y la expresión relativa de ARNm calculada contra una muestra de referencia (es decir ARNm a partir de células de HEK-293T). La sensibilidad de las lineas celulares de cáncer a la eliminación inducida por Z-DTP se analizó como se describió anteriormente al llevar a cabo las pruebas de incorporación de [3H]timidina después del tratamiento de las células con 10 µ? de Z-DTP2 durante 144 horas. También se muestra en las Figuras 12A-12B la correlación del gráfico de la expresión mARN Gadd45 contra el porcentaje de supervivencia celular después del tratamiento con Z-DTP2. La importancia del coeficiente de correlación entre el dominio de los dos parámetros fue calculado mediante la correlación de Pearson, que cuantifica la asociación entre dos variables, calculada usando el software GraphPad.

Con el fin de determinar si la eliminación inducida por Z-DTP de líneas celulares de cáncer fue debido a la inducción de la señalización citotóxica de JNK, monitoreamos la activación de JNK después del tratamiento de dos líneas celulares de mieloma múltiple sensibles representativas (es decir, las líneas KMS11 y NCI-H929) con Z-DTP2 (Figura 1 1). Para ello, utilizamos análisis de Western blot para una evaluación de fosforilación de JNK - un indicador de activación de JNK. Las líneas celulares de mieloma múltiple de KMS11 y NCI-H929 se cultivaron en placas de 6 pozos a 5x105 células/ozo en medio completo de RPMI-1640 como se describió arriba y se trataron con 10µ? de Z-DTP2 o del tetratpéptido de control negativo, Z-DNC, por 3, 6, 12 ó 24 hrs (Figura 1 ). Después de tratamiento de tetrapéptido, los lisados celulares fueron preparados esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 4 y se realizaron Western blots utilizando un anticuerpo específico a antifosfo(P)-INK. La metodología utilizada para análisis de Western blot se describe en las referencias por De Smaele, et al. (2001) Nature 414:306-313; Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153; Papa, et al. 2007 J.Biol.Chem. 282:19029-19041 ; Papa, et al. (2008) J.CIindnvest. 1 18:191-1923. Los niveles de 13-actina fueron determinados utilizando un anticuerpo específico a ß-actina específico y sirvió como control de carga (Figura 1 1). La estimulación de TNFa (2,000 U/ml) de células KMS 11 y NCI-H929 fue llevada a cabo para 5, 10 o 30 y usada como control positivo para activación de INK (Figura 11 ). Estos análisis revelaron que la activación de INK sólo es causada por tratamiento con Z-DTP2, pero no por tratamiento con Z-DNC. Los efectos semejantes de Z-DTP2 fueron vistos en la activación de MKK7 (datos no mostrados). Importantemente, como fue visto con la actividad biológica de Gadd45 (ver referencias: De Smaele, et al. (2001) Nature 414:306-3 13; Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153; Papa, et at. 2007 J.Biol.Chem. 282:19029-19041 ; Papa, et al. (2008) J.CIin.Invest. 1 18:191-1923), los efectos de Z-DTP2 en células de mieloma múltiple fueron específicos para la ruta MKK7/JNK, ya que este compuesto no exhibió efecto en la activación de las rutas de IKKINF-??, ERK y p38 (datos no mostrados).

Resultados Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran que derivados Z-protegidos de DTP2 (Z-DTP2), pero no de derivados de acetilo (Ac-DTP2) ni de L-isómeros de Z-DTP2 (Z-LTP2), ni los tetrapéptidos de control negativo, Z-DNC, Ac-DNC y Z-LNC, inhiben notablemente la proliferación de tres líneas celulares de mieloma múltiple de las 8 líneas celulares de mieloma múltiple scuscptibles probadas (es decir U266, los KM-1 1 , y NCI-H929), de la línea celular del linfoma de Bürkitt, BJAB, y de la línea celular de leucemia promonocítica U937 (vea también Figuras 8A-8C y 12A-12B, y Cuadro IV; líneas adicionales de mieloma múltiple). Las células fueron cultivadas con 10 µ? de ya fuera Z-DTP2 o Z-DNC (Figura 7A), Ac-DTP2 o Ac-DNC (Figura 7B), y Z-LTP2 o Z-LNC (Figura 7C) como fue indicado. La incorporación de [3H]-tTdR (midiendo la síntesis de ADN) de las células tratadas fue medida y comparada con la de células cultivadas sólo con medio. Los datos son expresados como el porcentaje de c.p.m. observado con células tumorales después de tratamiento con Z-DTP2, Ac-DTP2 o Z-LTP2 (columnas llenadas), o con Z-DNC, Ac-DNC o Z-LNC (columnas vacías) con respeto a c.p.m. medido con células cultivadas con sólo medio (células sin tratamiento). Una inhibición marcada de proliferación celular fue observada en líneas celulares de mieloma múltiples y de otras líneas celulares tumorales tratadas con Z-DTP2, pero no en aquellas tratadas con Z-DNC. En la Figura 7B, la ausencia de actividad tumoricida de Ac-DTP2 en líneas celulares de mieloma múltiple tuvo correlación con la baja permeabilidad celular de este compuesto, como fue establecido en los ensayos con CaC02 (datos no mostrados). La viabilidad de líneas celulares de mieloma múltiple después de tratamiento con otros derivados de DTP menos eficaces (diseñados también para mejorar la captación celular de DTP), incluyendo los que portan un grupo metilo (Me), acetilo (Ac), miristilo (Myr), 3-metoxi, 4-hidroxi-benzoilo, benzoilo, 6CI-benciloxicarbonilo (6C1-Z), y/o fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), no se muestra. Aunque la potencia y captación celular in vivo de Z-LTP fueron comparables a las de Z-DTPs (vea Figura 3C; también datos no mostrados), Z-LTP2 mostró actividad baja en células de mieloma múltiple (Figura 7C), debido a la baja estabilidad en fluidos biológicos (vea Figura 4). Una inhibición semejante de proliferación celular fue observada en las líneas celulares tumorales tratadas con Z-DTP lo, pero no en aquellas tratadas con Ac-DTP1 ni Z-LTP1 (datos no mostrados) a pesar de que (como también fue visto con derivados de DTP2) estos dos últimos compuestos exhibieron potencia comparable con Z-DTP1 in vitro (ver Figuras 3C y 4). Juntos, estos datos establecen la actividad citotóxica elevada de Z-DTP (Figura 7A y datos no mostrados) comparados con la inactividad de Ac-DTP (Figura 7B y datos no mostrados) y la baja actividad de Z-LTP (Figura 7C y datos no mostrados).

En las Figuras 8A 8B y 8C, nosotros examinamos los efectos de tratamiento de D-tetrapéptido en la proliferación de un panel más grande de líneas celulares de mieloma múltiple (es decir U266, KMS-1 1 , JJN-3, NCI-H929, ARH-77, KMS-27, KMS-18, KMS-12, y RPMI-8226). Otras líneas celulares tumorales probadas incluyen las líneas celulares de linfoma de célula B grandes difusas, LY-3 y SUDHL6, las líneas celulares de linfoma de Burkitt, BJAB, ST486 y RAJI, y la línea celular de leucemia promonocitica, U937. Las células fueron tratadas con 10 µ? de ya fuera Z-DTP2, Z-DTP1 o Z-DNC, como se muestra, por los tiempos indicados (es decir 24, 72 o 144 Horas). La incorporación de [3H]timidina de células tratadas fue medido como en las Figuras 7A-7C y comparada con la de células cultivadas con sólo medio. Los datos son expresados como el porcentaje de c.p.m. observado con células tumorales tratadas con Z-DTP2 o Z-DTP1 (columnas llenadas), o con Z-DNC (columnas vacías) con respeto a c.p.m. medido con células sin tratamiento. La Figura 8A muestra que Z-DTP2, pero no Z-DNC, inhibe notablemente la supervivencia/proliferación de 8 de 9 lineas celulares de mieloma múltiple probadas (es decir U266, KMS-1 1 , JJN-3 y ARH NCI-H929, ARH-77, KMS-27, KMS-18, KMS-12), de la línea celular de linfoma de Burkitt, BJAB, de la línea celular de linfoma de célula B grande difuso (DLBCL), LY-3, y de la línea celular de leucemia de promonocitica, U937 (vea también Figuras 12A-12B). En particular, Z-DTP2 mostró actividad citotóxica sólo en la línea celular de DLBCL del subtipo similar a célula B activada (ABC) (es decir LY3), que depende de NF- ? para la supervivencia, y no del subtipo similar a célula B central germinal (GCB) (es decir SUDHL6), que no cuenta con la activación constitutiva de NF-?? (Ong VN, et al. Nature 441 (7089): 106-10; ver también Figuras 12A-12B). También mostró actividad citotóxica potente de Z-DTP en la inmensa mayoría de las múltiples líneas celulares probadas— todas las cuales dependen de NF-?? para la supervivencia. Como es mostrado en las Figuras 8B y 8C, los efectos inhibitorios de Z-DPT1 y Z-DTP2 en la proliferación de célula tumoral aumentaron con el tiempo— inhibición máxima de proliferación fue observada después de tratamiento de tetrapéptido por 144 horas, aunque estos efectos fueran ya aparentes después de tratamiento por 24 horas. Estos datos son de acuerdo con aquellos obtenidos por conteo de células en ensayos de exclusión con azul de triptano (datos no mostrados) y en ensayos de tinción nuclear P1 para el contenido de ADN (vea Figura 10; también datos no mostrados). Juntos, estos y otros datos muestran que la actividad citotóxica de Z-DTPs es selectiva para células tumorales que exhiben actividad constitutiva de NF-?? (vea también Figuras 12A-12B; también datos no mostrados).

La especificidad de la actividad citotóxica de Z-DTP fue corroborada adicionalmente mediante los ensayos de proliferación de [3H]timidina mostrados en la Figura 9. Esta Figura muestra la ausencia de la citotoxicidad inducida por Z-DTP2 en n panel de 22 líneas celulares tumorales resistentes después de tratamiento por 144 horas, incluso cuando este compuesto fue usado a concentraciones muy elevadas— es decir 100 µ?. Los ensayos de proliferación de [3H]timidina mostrados en la Figura 9 fueron realizados como se describe en las Figuras 8A-8C.

Como puede verse en la Figura 9, Z-DTP2 no exhibió citotoxicidad en las líneas celulares de leucemia de célula T y de linfoma, JURKAT, HUT-78, MT-2, MT-4, MOLT4, MT2-HTLV-I, and CEM, las lineas celulares de linfoma de Burkitt BJAB, ST486, RAJI, RAMOS, Namaiwa y HS-SULTAN, las líneas celulares de cáncer de mama MCF7, MD-MDA-231 , y MD-MDA-486, las líneas celulares de linfoma de células B previas aNALM-6 y 70Z/3, las líneas celulares de linfoma de células B KARPAS y A20, la línea celular mielogénica crónica K652, la línea celular de riñon embriónico humano HEK-293T, y la línea celular de mieloma múltiple RPMI-8226 (ver también Figuras 12A-12B). También se muestran en la Figura 9 las líneas de células sensibles BJAB (linfoma de Burkitt), KMS-1 1 y KMS-12 (mieloma múltiple). En particular, hubo una correlación fuerte en estas líneas de células también entre sensibilidad a la eliminación inducida por Z-DTP2 y los niveles de expresión de Gadd45p (vea Figuras 12A-12B). De nota, la línea celular de RPMI-8226 - la única línea celular de mieloma múltiple probada que es resistente a la eliminación inducida por Z-/mDTP (Figuras 8A y 9)— mostró niveles muy bajos de Gadd45p (ver Figuras 12A-12B), confirmando adicionalmente que la actividad citotoxica de DTP en el cáncer depende de los niveles de expresión constitutiva de Gadd45p .

En la Figura 10, los paneles insertados muestran el porcentaje de células que exhiben tinción por yoduro de propidio (P1 ) que indica una cantidad menor a Gi de ADN (es decir células que ya están o muertas o muriendo por apoptosis), después de tratamiento por los tiempos indicados (es decir 72 o 144 hrs) con ya sea medio de cultivo solo (sin tratar) o medio de cultivo que suministra una concentración final de 10 µ? de ya sea Z-DTP2 o Z-NC1 . Los porcentajes de células apoptóticas se representan en los histogramas. Mostradas son las cinco líneas celulares de mieloma múltiple sensibles representativas NCI-H929, KMS-1 , ARH-77, JJN-3, y U266. Como puede ser visto, la eliminación inducida por Z-DTP2 se debe a la provocación de la apoptosis, y la porción de células apoptóticas vistas después de la exposición de las células a este compuesto aumenta con el tiempo de tratamiento.

La Figura 11 muestra que que el tratamiento con Z-DTP2 causa una fuerte activación de JNK en líneas celulares de mieloma múltiple. Las dos líneas celulares de mieloma múltiple sensibles representativas, KMS1 1 y NCI-H929, fueron tratadas con 10 µ? de Z-DTP2 o Z-DNC, como se muestra. La activación de INK fue vigilada en los tiempos indicados por western blotting utilizando un anticuerpo específico a anti-fosfo(P)-JNK. Puede verse que la fosforilación de INK (un marcador de la activación de JNK) sólo aumenta después de tratamiento con Z-DTP2, pero no después de tratamiento con péptido de control negativo Z-protegido (Z-DNC) Verdaderamente, Z-DTP2 causó una activación aún más fuerte de JNK que la estimulación con TNFa (2,000 U/ML) — nuestro control positivo. Efectos semejantes de Z-DTP2 fueron vistos en la activación de KK7 y utilizando los ensayos de quinasa para vigilar las actividades de INK y MKK7 (datos no mostrados). Notablemente, como fue visto con la actividad biológica de Gadd45 (ver referencias: De Smaele, et al. (2001) Nature 414:306-3 13; Papa, S et al. (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153; Papa, et al. (2007) J.Biol.Chem. 282:19029-19041 ; Papa, et al. (2008) J.CIin.Invest. 18:191-1923), los efectos de Z-DTP2, así como de Z-DTP1 y mDTP3 (datos no mostrados), en células de mieloma múltiple fueron específicos para la ruta de MKK7/JNK, ya que no se observaron efectos con estos compuestos en las rutas de IKK/NF- ??, ERK y p38 (datos no mostrados). De manera importante, el tratamiento con Z-DTPs no logró activar INK en la línea celular de mieloma múltiple, RPMI-8226, que es resistente a la eliminación inducida por Z-DTP (ver Figuras 8A y 9). Estos y otros datos (ver también Figuras 20A-20C) sustentan la visión de que Z-DTP inducen la apoptosis en líneas celulares tumorales al activar la señalización citotóxica de JNK.

Crucialmente, los datos presentados en las Figuras 12A y 12B muestran que la sensibilidad de las líneas celulares de cáncer a la eliminación inducida por Z-DTP se correlaciona con un nivel muy alto de importancia estadística con niveles de expresión de Gadd4S endógena (p<0.01). La expresión de ARNm de Gadd45 i fue valorada en un panel de 29 líneas celulares de cáncer utilizando ensayos de qRT-PCR (Figura 12A, panel superior, columnas rojas). Los valores se normalizaron para ß-actina. La viabilidad/proliferación en las mismas líneas celulares de cáncer se determinó al realizar la incorporación de [3H]timidina después del tratamiento con 0 µ? de Z-DTP2 por 144hrs. Estos resultados se muestran en el panel inferior de la Figura 12A (columnas negras). Estos valores informados aquí representan el porcentaje de c.p.m. medido con células tratadas con Z-DTP2 con respeto a c.p.m. medido con células no tratadas. La Figura 12B muestra la gráfica de correlación de expresión de Gadd45 contra el porcentaje de supervivencia/proliferación celular observado después de tratamiento con Z-DTP2 para el mismo experimento mostrado en la Figura 12A. Como puede observarse, la significancia del coeficiente de correlación entre el dominio de los dos parámetros es muy alta (p<0.1) (correlación de Pearson, que cuantifica la asociación entre dos variables, calculada usando el software GraphPad). Esto es un punto clave para el desarrollo de una terapia exitosa en el hombre. Estos datos demuestran la alta especificidad objetivo de los Z-DTP en las células para Gadd45 . En sustento adicional de esta conclusión, el silenciamiento mediado por ARN-sh de Gadd45p induce apoptosis en células de mieloma múltiple, mientras que el silenciamiento mediado por ARN-sh de MKK7 MKK7 hace a estas células completamente resistentes a la eliminación inducida por Z-DTP (ver Figuras 16A-16C, 17A-17B, 18A-18C, y 20A-20C). Estos datos en conjunto indican también que si la terapia basada en DTP entrara a la clínica, será posible predecir poblaciones respondedoras de pacientes mediante un análisis simple y económico de qRT-PCR. En consecuencia, se entiende que pueden analizarse células primarias de pacientes de mieloma múltiple para determinar el grado de expresión de Gadd45p , y se puede considerar que los pacientes con expresión elevada recibirán el mayor beneficio del tratamiento con los compuestos de la invención. Por lo tanto, un aspecto importante de la invención es un aspecto teranóstico -esto es, la aplicación de una prueba clínicamente útil para predecir la respuesta a la terapia de DTPs en los pacientes.

EJEMPLO 9 IC50 in vitro y en células de un panel de derivados de Z-DTP Hemos desarrollado un plan extenso de optimización delantera para ofrecer una nueva terapia segura y efectiva para tratar cáncer y otras enfermedades y trastornos, utilizando nuestros delanteros actuales como puntos de partida. Z-DTP2 ya muestra alta estabilidad, alta solubilidad, actividad in vitro inferior a nM y buena actividad en células de mieloma múltiple (líneas primarias y celulares) y otras células de cáncer, con la elevada especificidad de diana y nula toxicidad en células normales (ver Figuras 3C, 4, 8A-8C, 9, 12A-12B, 14A-14E y 15A-15B; vea también Cuadro IV; datos no mostrados). También exhibe excelentes perfiles de partida de DMPK y de seguridad in vivo (soltero dosis de bolo i.v. en ratones) (ver Cuadros VIII y IX). Hemos aplicado un diseño molecular racional para producir derivados de DTP con propiedades mejoradas de ADMET mientras se conserva una elevada bioactividad (Geeson MP. 2008 J Med Chem. 51 :817-834). En este enfoque, hemos modificado el tamaño (MW), lipofilicidad (LogP) y estado de ionización (carga molecular) - las propiedades voluminosas clave de moléculas que influyen sobre las propiedades de ADMET - utilizando nuestro farmacóforo modelo para preservar los elementos estructurales responsables de la bioactividad in vitro (ver Figuras 13A-13B). Como fue descrito en este Ejemplo, nuestros derivados más recientes (por ejemplo mDTP3 y mDTP4) retienen una alta potencia in vitro, pero mostró una mejor actividad de eliminación en células de mieloma múltiple, con MW sustancialmente reducido (-500 vs >700), de ahí aumentó las eficiencias del ligando (Figuras 13A-13B). Nosotros también hemos aplicado medios adicionales de mejorar la actividad celular de los péptidos y sus valores PK, inclusive ciclación, la adición de bloquear los grupos para interiorizar amidas vulnerable, y/o el reemplazo con eslabones no amídicos.

Materiales y Métodos 33 compuestos fueron diseñados con base en las secuencias de tetrapéptidos delanteros: Tyr-Glu-Arg-Phe y Tyr-Asp-His-Phe derivados de la filtración de genoteca (ver Figuras 3A-3C). Todos los compuestos menos compuestos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, y 16 (ver Cuadro V) - fueron preparados por un método de fase sólida siguiendo la química clásica siguiente de Fmoc/tBu (como descrito en la referencia por Fields GB, Noble RL. Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxy-carbonil amino acids. Int J Pept Protein Res 1990;35:161-214). Sólo aminoácidos en la conFiguración D fueron utilizados para armar los péptidos mostrados en el Cuadro V. La acetilación N-terminal fue llevada a cabo por tratamiento con 10% de anhídrido acético en dimetilformamida (DMF) conteniendo 5% DIEA (di-isopropil-etilamina). Donde fue necesario, el grupo Z fue introducido por tratamiento en resina con Z-OSu (benciloxicarbonil-N-hidroxisuccinimida) 0.5 M en DMF/5 % DIEA. Los compuestos fueron escindidos desde la resina utilizando tratamiento con TFA (ácido trifluoroacético) y depuradores, luego fueron purificados a homogeneidad por fase inversa preparativa (RP)-PLC. La síntesis de compuestos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, y 16 (Cuadro V) fue realizada fuera. La identidad y la pureza del compuesto fue evaluada utilizando análisis de LC-MS y NMR. Xi fue ácido benzoico, X2 fue ácido bencílico, Y1 fue anilina, Y2 fue bencilamina e Y3 fue fenetilamina. Los compuestos fueron todos disueltos en DMSO en la concentración de solución de partida de 5 mM, y las alícuotas fueron entonces diluidas en solución reguladora de pH para lograr las concentraciones indicadas para los ensayos de competición de ELISA. Las proteínas fueron preparadas como se reportó en Tornatore L, et al. (2008). J Mol Biol; 378:97-1 11.

Los ensayos de unión por competición de ELISA fueron realizados como se reportó en Tornatore L., et al. (2008). J Mol Biol; 378:97-J1 1 (ver también los métodos descritos en los ejemplos 2 y 3), usando péptidos en concentraciones cada vez mayores, en la escala de entre 0.01 nM y 10 nM. Brevemente, GST-MKK7 fue inmovilizado en 42 nM sobre pozos de placas de microtitulación de 96 pozos. Los compuestos en competencia fueron preincubados con biotina-hGadd45p (21 nM)y luego incubados con la quinasa recubierta. Para cada compuesto, el Cl50 in vitro fue calculado como la concentración que tiene como resultado una reducción de 50% en la unión de Gadd45p a MKK7 con respeto a la unión observada en ausencia de competidores.

Investigamos los efectos de cada compuesto en la viabilidad/proliferación de los derivados de DTP en las dos líneas celulares de mieloma múltiple sensibles representativas, KMS12 y KMS11. Los ensayos de incorporación de [3H]timidina en líneas celulares de mieloma múltiple de KMS1 1 y KMS12 fueron realizados como se describe para los ejemplos 6 y 8 (Figuras 7A, 7B, 7C, 8A, 8B y 8C y Cuadro IV. Brevemente, las células en la placa de 96 pozos fueron cultivadas y tratadas por separado con el compuesto indicado en pozos de placas de 96 pozos utilizando concentraciones crecientes del compuesto, en la escala de 0.1 nM y 10 µ?. Los cultivos celulares y los tratamientos de compuestos también se llevaron a cabo como se describe para las Figuras 7A, 7B, 7C, 8A, 8B y 8C, y el Cuadro IV. La captación de [3H]timidina, que mide la viabilidad/proliferación, fue determinada después del tratamiento con los compuestos para 1 , 3, ó 6 días comop se indique. En estos tiempos, los CI5o de cada compuesto fueron calculados como se describe en el ejemplo 6 al determinar la concentración que tiene como resultado una inhibición de 50% de supervivenia/proliferación con relación a la supervivencia/proliferación observada con células no tratadas.

Los CI50 in vitro (ELISA) y en células (células KMS-11 y KMS-12) de los 33 compuestos descritos en este ejemplo se reportan en el Cuadro V.

Resultados Mostrado en el Cuadro V son los valores de CI50 in vitro y en células de un panel de tetra- y tripéptidos diseñados con base en las sucesiones de consenso, Tyr-Glu-Arg-Phe y Tyr-As-His-Phe, derivadas de la filtración de genoteca y la química de optimización delantera.

Estos compuestos fueron filtrados in vitro utilizando un ensayo de competición de ELISA donde el desplazamiento de la unión de biotina-Gadd45p a GST-MKK7 recubierta fue determinado probando las actividades de los compuestos a concentraciones diferentes. CI50 in vivo para un grupo de compuestos seleccionados fueron determinados utilizando ensayos de incorporación de [3H]timidina en líneas celulares de mieloma KMS-11 y KMS-12 para evaluar las actividades tumoricidas de los compuestos. Los Cl50 de los compuestos indicados en células fueron determinados después de un tratamiento por 1 , 3 ó 6 días. Z denota un grupo benciloxicarbonilo. Como puede ser visto en el Cuadro V, los compuesto smás activos en las células fueron el compuesto 9, denotado como Z-DTP2 (CI50 10 nM en células KMS-11 ; Cl50 = 66 nM en KMS-12) y el compuesto 17, denotado como mDTP3 (Cl50 = 25 nM en células KMS-11 ; Cl50 = 16 nM en KMS-12).

Los 33 compuestos descritos en este Ejemplo fueron todos filtrados in vitro, en ensayos de competición de ELISA, por su capacidad de interrumpir la interacción de Gadd45p/MKK7 (Cuadro V). La mayor parte de estos compuestos - excepto los compuestos 18, 20, 21 , 22, 32, y 33 — también fueron filtrados en células, utilizando ensayos de incorporación de [3H]timidina en líneas celulares de mieloma múltiple de KMS-1 1 y/o KMS-12 y sus Cl50 en estas células determinados en el día 1 , 3 y 6.

Como puede verse en el Cuadro V, los compuestos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 15 y 17 se probaron en ambas líneas celulares. Los compuestos 15 y 19 sólo fueron probados en células KMS-12. Los compuestos 10, 1 1 , 12, 13, 14, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, y 31 sólo fueron probados en la línea celular de KMS-11. Los compuestos 18, 20, 21 , 22, 32, y 33 no fueron probados en células debido a su actividad relativamente baja ¡n vitro.

El Cuadro V muestra que los CI50 in vitro de los compuestos probados estuvieron entre 100 pM (ver compuesto 7, X2-Asp-His-Y3 compuesto 15, X2-Glu-Arg-Y3 y compuesto 19, ZTyr-Arg-Phe) y> 10 nM (ver compuestos 24, 27, 30, 31 , 32, y 33). Como puede ser visto, las actividades de los compuestos que estuvieron in vitro se reflejaron generalmente en sus actividades en las células, aunque algunos de los compuestos activos in vitro tuvieron actividad relativamente baja en las células, plausiblemente debido a su baja captación celular, por ejemplo comparar el compuesto 15 (mostrando un Cl50 in vitro = 100 pM, y un CI50 263 nM en células KMS-11 ) al compuesto 9 (Z-DTP2; mostrando un C oin vitro 190 pM y un 1C5o = 10 nM en células KMS-1 1). Los datos en las células muestran también que la presencia de un grupo Z en el grupo N-terminal y/o de cadenas laterales básicas dio lugar a una mayor actividad en las células, debido a una mayor captación celular. Para ejemplos de la relevancia de la cadena lateral básica, compare los Cl50 en las células del compuesto 19 (Z-Tyr-Arg-Phe-NH2 Cl50=81 nM en células KMS-12 en el día 3) con los del compuesto 8 (Z-Tyr-Asp-Phe-NH2 Cl50> 10 µ? en células KMS-11 en el día 3) (es decir intercambio de Arg a Asp), o con los del compuesto 16 (Z-Tyr-Glu-Phe-NH2 CI5o 3.0 µ? en células KMS-11 en el día 3) (es decir intercambio de Arg a Glu); también observe los Cl50comparables bajos in vitro de estos tres compuestos - todos los cuales están en la escla inferior a nM (Cuadro V). Para ejemplos de la relevancia del grupo Z, compare los Cl50 en células U266, KMS-1 1 y NCI-H929 de Z-DTP2 (Figura 7A) con los de Ac-DTP2 (Figura 7B); ver también los CI50 similares in vitro de estos dos compuestos (Figuras 3C y 4; datos no mostrados). Los datos también indican que los compuestos sin anillos aromáticos en ambos extremos (p. ej., compuestos 20 y 21) están inactivos tanto in vitro como en las células (Cuadro V), lo que indica que esos anillos aromáticos son absolutamente necesarios para la bioactividad. Curiosamente, la presencia de 2 tirosinas en la N-terminal también tuvo como resultado la pérdida de actividad (Cuadro V).

EJEMPLO 10 CI50 in vitro de un panel de derivados adicionales de Z-DTP Materiales y métodos Un grupo de 18 compuestos adicionales fue concebido con base en la secuencia de tripéptido guía, Tyr-Arg-Fen (es decir mDTP3), con el fin de investigar la pertinencia a bioactividad de: 1) La distancia entre los dos anillos aromáticos; 2) las propiedades del aminoácido en la posición central; 3) la ocurrencia del grupo acetilo en la N-terminal; (4) y la presencia de sustituyentes de los anillos aromáticos (véase el Cuadro VI). Todos los compuestos fueron preparados por un método de fase sólida siguiendo la química clásica siguiente de Fmoc/tBu (como descrito en la referencia por Fields GB, Noble RL. Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxy-carbonil amino acids. mt. I Pept. Protein Res. 1990;35:161-214. La acetilación N-terminal fue llevada a cabo por tratamiento con 10% de anhídrido acético en dimetilformamida (DMF) conteniendo 5% DIEA (di-isopropil-etilamina). Los compuestos fueron escindidos desde la resina utilizando tratamiento con TFA (ácido trifluoroacético) y depuradores, luego fueron purificados a homogeneidad por fase inversa preparativa (RP)-PLC. La identidad y la pureza del compuesto fue evaluada utilizando análisis de LC-MS y NMR. Los compuestos fueron purificados por RP-FIPLC, a continuación, todos fueron disueltos en DMSO a la concentración de solución de partida de 5 mM y se almacenaron hasta que fueron utilizados. Las alícuotas fueron entonces diluidas en serie en solución reguladora de pH para lograr las concentraciones indicadas para los ensayos de competición de ELISA. Los ensayos de unión de competición de ELISA se realizaron como se informó en la referencia de Tornatore L. , et al (2008). JM01 Biol; 378:97-111 (ver también los métodos en los ejemplos 2 y 3), usando péptidos en mayores concentraciones, en la escala de entre 0.01 nM y 10 nM. Brevemente, GST-MKK7 fue inmovilizado en 42 nM sobre pozos de placas de microtitulación de 96 pozos. Los compuestos en competencia fueron preincubados con biotina-hGadd45 (21 nM)y luego incubados con la quinasa recubierta. Para cada compuesto, el Cl50 in vitro fue calculado como la concentración que tiene como resultado una reducción de 50% en la unión de Gadd45 a MKK7 con respeto a la unión observada en ausencia de competidores.

Resultados El Cuadro VI muestra los valores de Cl50 de un panel de 18 tripéptidos y dipéptidos con base en mDTP3 (Ac-D-Tyr-D-Arg-D-Phe). Los compuestos fueron diseñados para investigar la influencia en la bioactividad de los siguientes parámetros: 1) La distancia entre los dos anillos aromáticos en la N- y C-terminal (véase compuestos A1 , A1 bis, A3, A6, A7, A8); 2) las propiedades del aminoácido en la posición central (ver compuestos B2, B13, B16, B16 bis, O5 y O5 bis); 3) la presencia o ausencia de un grupo hidroxilo en el anillo aromático de los residuos en las posiciones 1 y 3 (véase compuestos A9, O1 , 03, 05, 05 bis, 06, O7 y 08); la aparición de un grupo acetilo en la N-term¡nal (ver compuestos A9 y 07; B16 y B16 bis; 01 y 08; 03 y 06; 05 y 05 bis).

Los 18 compuestos adicionales fueron sometidas a pruebas de actividad in vitro mediante ensayos de competición de ELISA y crecientes concentraciones del compuesto, que van desde 0.01 nM a 100 nM. Como puede verse en el Cuadro VI, todas los dipéptidos fueron inactivos independientemente de la ocurrencia de un aminoácido Phe o Tyr en la N-terminal o la C-terminal (ver compuestos A1 , A1 bis, A7 y A8). La introducción de espaciadores más largos que el alfa-aminoácido en la posición central de los tripéptidos también resultó en pérdida de actividad in vitro (véase compuestos A3 y A6, que portan una [3-alanina y un ácido ácido s-caproico en la posición intermedia, respectivamente). Esto no fue cierto para los tetrapéptidos donde las posiciones Y2 y Y3 fueron ocupadas por Asp/Glu o His/Arg - compare los Cl50 in vitro del compuesto 9 (es decir Z-DTP2) con los del compuesto 16 (es decir), y los del compuesto 1 (es decir Z-DTP1) con los del compuesto 8 (es decir Z-Tyr-Asp-Phe-Nhb). Esto es así porque Z-DPT2 y Z-DTP1 , que contienen un aminoácido extra entre los dos grupos aromáticos activos, conservó su alta potencia in vitro (ver CI50 en el Cuadro V). Notablemente, como se muestra en el Cuadro VI, la remoción del grupo hidroxilo en la tirosina N-terminal también dio lugar a la pérdida completa de bioactividad in vitro (véase compuestos A9, 01 , 05, 05 bis, 07, 08) independientemente de la presencia de un grupo acetilo. Es significativo que esta observación pone de manifiesto un importante aporte del grupo hidroxilo a la interacción de los compuestos activos con las proteínas objetivo. De hecho, este grupo está probablemente implicado en la formación de un enlace H o una interacción polar. En contraste, la ocurrencia de un grupo hidroxilo en el anillo aromático en la C-terminal no afectó las actividades de los compuestos (véase compuestos A9, 01 , 03, 05, 05 bis, 06, 07 y 08). Del mismo modo, sustituyendo la arginina con otro aminoácido básico, como histidina o lisina, o con prolina no alteró la bioactividad in vitro (véase compuestos B2, B13, B16, B16 bis, 05 y 05 bis), lo que sugiere un papel menor en la cadena lateral de este residuo en la capacidad de los compuestos para interrumpir la interacción de Gadd45p/MKK7.

EJEMPLO 11 Infecciones lentivirales que establecen el papel esencial de Gadd45B en la supervivencia celular del mieloma múltiple Materiales y métodos Para determinar el papel de Gadd45p y MXK7 en la supervivencia de las líneas celulares de mieloma múltiple, se investigaron los efectos de disminuir la expresión de Gadd45p o MKK7 en estas células (véanse las Figuras 16A, 16B, 16C, 17A, 17B, 18A, 18B, 18C, 19A, 19B y 19C). Con esta finalidad, se realizó la infección con lentivirus que expresan los ARN-sh de direccionamiento a MKK7 y Gadd45, que tiene como resultado el silenciamiento de los genes Gadd45p y MKK7, respectivamente. Las secuencias de ADN que codifican los ARN de horquilla pequeña (ARN-sh) de direccionamiento están listadas en el Cuadro VII. Las secuencias de ARN-sh de direccionamiento (es decir a Gadd45p-1-sh, Gadd45p-2-sh, Gadd45p-3-sh, MKK7-1-sh y MKK7-2-sh) y las secuencias de control no específicas NS-1-sh y NS-2-sh fueron introducidas entre los sitios de restricción de BamHI y Hpal del vector lentiviral, LentiLox3.7 (véase la referencia de Yang et al. 2006 PNAS 103, 10397-10402). La producción de la preparación de lentiviral de alta titulación en células de HEK 293T fue realizada utilizando en esencia las mismas condiciones descritas en las referencias de Pham et al. 2004 Cell 116, 529-542 y de Yang et al. 2006 PNAS 103, 10397-10402. Para la introducción de las secuencias de ARN-sh de direccionamiento a Gadd45py MKK7 y las secuencias de ARN-sh de control no específicas, las cinco líneas celulares de mieloma múltiple, sensibles a ZD-TP, representativas ARH-77, NCI-H929, U266, KMS 11 y KMS12, y la línea celular de mieloma múltiple, resistente a Z-DTP, RPMI-8226, fueron infectadas con lentivirus LentiLox3.7, según se informa en protocolos publicados como se describe en esencia en la referencia de Yang et al. 2006 PNAS 103, 10397-10402. Cinco días después de la infección, se separaron células de mieloma múltiple eGFP+ usando un separador de células BD FACSAria TM II; después se dejaron reposar durante 2 días antes de empezar los análisis de supervivencia y proliferación celulares. Se monitoreó la viabilidad de las células de mieloma de múltiple infectadas durante un período de 8 días realizando la citometría de flujo— midiendo la expresión de la proteína fluorescente verde y realzada (eGFP) (marcando las células infectadas)— y el conteo de células (Figuras 16A, 16B, 16C, 17A, 17B). La apoptosis (Figuras 18A, 18B y 18C) y la distribución del ciclo celular (Figuras 19A, 19B y 19C) fueron medidas realizando ensayos de tinción nuclear con P1 , como se describe en Riccardi C. y Nicoletti I 2006 Nature Protocols 1 , 1458— 1461 (véanse también los métodos descritos en el ejemplo 8).

Resultados Las Figuras 16A, 16B y 16C muestran que el silenciamiento mediado por ARN-sh de la expresión de Gadd45p tiene como resultado la rápida incución de la muerte celular, llevando a proliferación reducida, en las líneas celulares de mieloma múltiple, sensibles a Z-DTP, representativas ARH-77 (Figura 16A) y NCJ-H929 (Figura 16B), pero no en la línea celular de mieloma múltiple, resistente a Z-DTP, RPMI-8226 (Figura 16C). En el experimento mostrado en Figuras 16A, 16B y 16C, se infectaron líneas celulares de mieloma múltiple con lentivirus que expresa ARN-sh específicos de Gadd45 (Gadd45 -1-sh, Gadd45 -2-sh o Gadd45 -3-sh), ARN-sh específicos de MKK7 (MKK7-1-sh o MKK7-2-sh) o ARN-sh no específicos (NS-1-sh o NS-2-sh) y se monitoreó la viabilidad de células infectadas durante un período de 8 días utilizando citometría de flujo - revelando células que expresan proteína fluorescente verde realzada (eGFP), esto es células infectadas - y conteo de células. Se muestra el porcentaje de supervivencia de las células de mieloma múltiple eGFP4 (esto es infectadas por lentivirus) en los tiempos indicados con respecto a la viabilidad de las células de mieloma múltiple eGFP en el mismo cultivo el día 0. Las células se infectaron con lentivirus pLentiLox.3.7 que expresa los sh-RNAs indicados y eGFP, usando los métodos estándares (como se reportan en Yang H et al., Proc Nati Acad Sci U S A, 5 de julio de 2006; 103(27): 10397-402). Cinco días después, las células eGFP+ se clasificaron usando un clasificador de células BD FACSAria TM; después se dejaron reposar durante 2 días antes de empezar los análisis de viabilidad celular. Este tiempo (esto es, el inicio de los análisis de viabilidad) se denota en las Figuras 16A, 16B y 16C como día 0). Los datos muestran que la inhibición de la expresión Gadd45 pero no la inhibición de la expresión de MKK7, causa rápidamente la muerte celular en las líneas celulares de mieloma múltiple que son sensibles a la toxicidad inducida por Z-DTP (esto es las líneas celulares ARH-77 y NCI-H929) (Figuras 16A y 16B, respectivamente), pero no en la línea celular de mieloma múltiple RPMI-8226 (Figura 16C), que es resistente a esta toxicidad. Estos datos establecen además la especificidad de objetivo de Z-DTP para el complejo Gadd45 /MKK7 en células de mieloma de múltiple (véanse también las Figuras 7A-7C, 8A-8C, 9 y 12A-12B; eliminación y ensayos de qRT-PCR). Verdaderamente, en el acuerdo adicional con esta conclusión, la cinética de la inhibición de la proliferación de células de mieloma múltiple que se observó después del silenciamiento de Gadd45 fue muy semejante a la que se observó después del tratamiento de estas células con los Z-DTPs (véanse las Figuras 7A, 8B y 8C). Los datos demuestran también el papel esencial que Gadd45p juega en la supervivencia de las células de mieloma múltiple, validando así además Gadd45 como un objetivo terapéutico en el mieloma múltiple.

Las Figuras 17A y 17B que muestran que el silenciamiento mediado por ARN-sh de Gadd453p, pero no el de MKK7, tiene actividad inhibitoria potente en la supervivencia/proliferación sólo de líneas celulares de mieloma múltiple que son susceptibles a la eliminación inducida por Z-DTP (por ejemplo las líneas celulares AltH-77 y NCI-H929; véanse también las Figuras 7A-7C y 8A-8C, sensibilidad a la eliminación inducida por Z-DTP). En contraste impresionante, la viabilidad de la línea celular de mieloma múltiple resistente a Z-DTP, RPMI-8226, más bien no fue afectada por completo por inhibición de Gadd45p mediada por sh-ARN. Se determinaron la proliferación/supervivencia celular en las Figuras 7A y 17B mediante el uso de los ensayos de incorporación de [3H]Timidina, llevados a cabo como se describe en los ejemplos 6 y 8. Se muestra en la Figura 17A la viabilidad de las tres líneas celulares de mieloma múltiple representativas, RPMI-8226, NCI-H929 y ARH-77, después de silenciar Gadd45p o MKK7. La Figura 17B muestra la viabilidad/proliferación de la línea celular de mieloma múltiple, ARH-77, después del silenciamiento de Gadd45p o MKK7 utilizando tres diferentes ARN-sh específicos de Gadd45 (Gadd45 -1-sh, Gadd45p-2-sh o Gadd45 -3-sh), dos diferentes ARN-sh específicos de MKK7 (MKK7-1-sh o MKK7-2-sh), y dos diferentes ARN-sh no específicos (NS-1-sh o NS-2-sh). Líneas celulares de mieloma múltiple se infectaron con el lentivirus indicado, pLentiLox.3.7, que expresa ARN-sh; luego las células de mieloma múltiple eGFP+ (esto es, las células infectadas con el lentivirus) se separaron usando un separador de células BD FACSAria™ II como se indica en las Figuras 16A-16C. Los ensayos de incorporación de [3H]timidina mostrados en las Figuras 17A y 17B se llevaron a cabo 10 días después de la selección celular, correspondiente al día 8 en las Figuras 16A-16C. Se muestra el porcentaje de incorporación de [3H]-timidina (esto es, c.p.m.), una medida de la proliferación celular, el día 8 (esto es, 10 días después de la separación celular), con respecto a la incorporación de [3H]-timidina que ocurre en las mismas células el día 0 (esto es, 2 días después de la separación celular). Estos datos establecen además la especificidad de objetivo de Z-DTP para el complejo Gadd45p/MKK7 en células de mieloma de múltiple (véanse también las Figuras 7A-7C, 8A-8C, 9, 12A-12B y 16A-16C) y confirman el papel esencial que Gadd45 juega en la supervivencia de célula de mieloma múltiple. Juntos, también validan Gadd45 como objetivo terapéutico en el mieloma múltiple.

Las Figuras 18A, 18B y 18C muestran que el silenciamiento de ARN-sh-mediado por Gadd45 induce efectivamente la apoptosis en las líneas celulares de mieloma múltiple sensibles a Z-DTP, ARH-77 (Figura 18A) y NCI-H929 (Figura 18B), pero no en la línea celular de mieloma múltiple resistente a Z-DTP, RPMI-8226 (Figura 18C) (véanse también las Figuras 16A-16C y 17A-17B, silenciamiento mediado por ARN-sh; Figuras 7A-7C, 8A-8C y 12A-12B, sensibilidad de línea celular de mieloma múltiple a la eliminación inducida por Z-DTPy niveles de expresión de Gadd45 ). Se determinó la inducción de la apoptosis en Figuras 18A, 18B y 18C mediante el uso de ensayos de tinción nuclear con P1 , realizados como se describe en el ejemplo 8. Estos datos demuestran que la inhibición de la supervivencia/prolifeation de células de mieloma múltiple causada por la disminución de la expresión de Gadd45p observada en las Figuras 16A-16C y 17A-17B se debió a la inducción de la muerte celular programada, mediada por la ruta de apoptosis. Notablemente, no se observó inducción significativa de apoptosis en las mismas líneas celulares de mieloma múltiple en ausencia de infección lentiviral (no infectadas) o después de la expresión de ARN-sh específicos de MKK7 ( KK7-1-sh y MKK7-2-sh) o ARN-sh no específicos (NS-1-sh y NS-2-sh) (Figuras 8A, 18B y 18C). Líneas celulares de mieloma múltiple se infectaron con lentivirus pLentiLox.3.7 que expresan ARN-sh y las células de mieloma múltiple eGFP+ (esto es, las células infectadas con lentivirus) se separaron usando un separador de células BD FACSAria™ II como se indica en las Figuras 16A-16C. Se realizaron ensayos de tinción nuclear con P1 , 10 días después de la separación de las células, correspondientes al día 8 en las Figuras 16A-16C. Los porcentajes de células apoptóticas (esto es, las células que exhiben contenido de ADN sub-G1) están representados en los histogramas. De manera importante, los niveles de apoptosis inducida por los diferentes sh-ARN específicos de Gadd45p(es decir, sh-Gadd45f3-l, sh-Gadd45p-2, y sh-Gadd45p-3) correlacionados con los niveles de la desregulación de Gadd453 inducida por cada uno de estos sh-ARN específicos de Gadd45p (Figuras 18A; tampoco se muestran los datos). Los datos de las Figuras 18A, 18B y 18C establecen además la especificidad de objetivo de los Z-DTP para el complejo Gadd45 /MKK7 en células de mieloma múltiple (véanse también las Figuras 7A-7C, 8A-8C y 9, ensayos de eliminación con Z-DTPs; Figuras 12A-12B, correlación estadísticamente significativa entre la expresión de Gadd453, y sensibilidad de las célula cancerosas a la eliminación inducida por Z-DTP; Figuras 16A-16C y 17A-17B, inducción de eliminación de líneas celulares de mieloma múltiple mediante la disminución de Gadd45 , pero no de MKK7), y confirman el papel esencial que Gadd45p juega en la supervivencia de células de mieloma múltiple. Juntos, validan además Gadd45p como objetivo terapéutico en el mieloma múltiple.

Las Figuras 19A, 19B y 19C muestran que el silenciamiento mediado por RNA-sh de MKK7 o de Gadd45p no afecta ka distribución del ciclo celular en las líneas celulares de mieloma múltiple. Las líneas celulares de mieloma múltiple representativas infectadas por lentivirus que se muestran -esto es, ARH-77 (Figura 19A), NCI-H929 (Figura 19B) y RPMI-8226 (Figura 19C)- son del mismo experimento mostrado en las Figuras 18A-18C. Los análisis del ciclo celular mostrados en las Figuras 19A, 19B y 19C se realizaron mediante el uso de ensayos de tinción nuclear con P1 , llevados a cabo como se describe en el ejemplo 8 (véase también las Figuras 8A-18C). A diferencia de los datos mostrados en las Figuras 18A-18C (en los cuales los perfiles de tinción con P1 están representados en una escala logarítmica que destaca la apoptosis), la tinción con P1 (esto es, FL2-A) en estas Figuras está representada en una escala lineal que destaca la distribución del ciclo celular. Los porcentajes de células de mieloma múltiple en las diferentes fases del ciclo celular (esto es, G1 , S y G2/M) están representados en los histogramas. Los análisis del ciclo celular no podría realizarse con ARN-sh específicos de Gadd45 en el caso de las líneas celulares de mieloma múltiple ARI-1-77 (Figura 19A) y NCI-H929 (Figura 19B), debido a la inducción de la apoptosis masiva después de la expresión de estos ARN-sh (véanse las Figuras 18A y 18B). No obstante, como se puede ver eii la Figura 19A, la disminución de Gadd45p no tuvo efecto en la distribución del ciclo celular en la línea celular resistente a Z-DTP, RPMI-8229.

EJEMPLO 12 La disminución de la expresión de MKK7 hace que las líneas celulares de mieloma múltiple normalmente sensibles sean completamente refractarias a la eliminación inducida por Z-DTP Materiales y Métodos Para valorar la especificidad de objetivo de los Z-/mDTP para el complejo Gadd45 /MKK7, se investigaron los efectos de la disminución de la expresión de MKK7 en la sensibilidad de líneas celulares susceptibles de mieloma múltiple a la eliminación inducida por Z-/mDTP (Figuras 20A 20B y 20C). Con esta finalidad, se infectó la línea celular representativa de mieloma múltiple, ARFI-77, con lentivirus que expresan ARN-sh específicos de MKK7, que tiene como resultado el silenciamiento del gen MKK7, o de los ARN-sh de control no específicos. Las secuencias de ADN que codifican los ARN de horquilla pequeña (ARN-sh) están listadas en el Cuadro VII. Las secuencias de ARN-sh con direccionamiento a MKK7 y las secuencias de control no específicas se introdujeron entre los sitios de restricción BamH1 y Hpal del vector de lentiviral, LentiLox3.7, como se describe en el ejemplo 1 (véase la referencia de Yang et al. 2006 PNAS 103, 10397-10402. La producción de la preparación de lentiviral de alta titulación en células de HEK 293T fue realizada utilizando en esencia las mismas condiciones descritas en la referencia de Yang et al. 2006 PNAS 103, 10397-10402. Para la introducción de las secuencias de ARN-sh de direccionamiento a MKK7 y las de control no específicas, la línea celular representativa de mieloma múltiple sensible a Z-DTP, ARH-77, se infectó con lentivirus LentiLox3.7 que expresa ARN-sh específicos de MKK7 (MKK7-sh) o ARN-sh no específicos (NS-sh), según se informa en protocolos publicados en esencia como se describe en la referencia de Yang et al. 2006 PNAS 103, 10397-10402. Cinco días después de la infección, se separaron células eGFP°ARH-77 utilizando un separador de células BD FACSAria™ II. Entonces, 10 días después de la separación de células, las células ARH-77 de mieloma múltiple infectadas por lentivirus se trataron con Z-DTP1 , Z-DTP2, mDTP3 o Z-NC durante 72 horas a 37°C, o se cultivaron bajo las mismas condiciones en ausencia del tratamiento con péptido, como se describe en el ejemplo 8. Los tratamientos con Z-DTP1 , Z-DTP2, mDTP3 y Z-NC se llevaron a cabo con las siguientes concentraciones finales de péptidos: 0.01 µ?, 0.03 µ?, 0.1 µ?, 0.3 .µ?, 1 µ?, 3 µ? y 10 µ?. Después de estos tratamientos, se determinó la supervivencia/proliferación de ARH-77 al llevar a cabo los ensayos de incorporación de [3H]tinidina como se describió en los ejemplos 6 y 8. Los resultados del estos experimentos fueron expresados como los porcentajes de supervivencia/proliferación (es decir c.p.m.) observados en células de mieloma múltiple, infectadas por lentivirus y tratadas con Z-DTP1 , Z-DTP2, mDTP3 o Z-NC con respeto al supervivencia/proliferación de las respectivas células infectadas por lentivirus en ausencia del tratamiento con péptidos. Las concentraciones medias de Z-DTP1 , Z-DTP2, mDTP3 y Z-DNC que tienen como resultado el 50% (Cl50) de inhibición de la supervivencia/proliferación de las células se determinaron realizando ensayos de incorporación de [3H]timidina y se calcularon como se describe en el ejemplo 6. Los resultados de estos experimentos se muestran en las Figuras 20A, 20B y 20C.

Resultados Las Figuras 20A, 20B y 20C muestran que el silenciamiento mediado por sh-RNA de MKK7 hace a la línea celular sensible a Z-JmDTP representativa, ARH-77, resistente a la eliminación inducida por Z/-mDTP. Los ensayos de incorporación de [3Htiinidina mostrados en estas Figuras muestran el CI50S del tetrapéptido control negativo de D-isómero (Z-DNC) (Figuras 20A, 20B y 20C), Z-DTP1 (Figura 20A), Z-DTP2 (Figura 20B) y mDTP3 (Figura 20C) en células de mieloma múltiple de ARH-77 que expresan sh-ARN específicos de MKK7 (sh-MKK7) o no específicos (sb-NS). Los tratamientos de las células ARH-77 se llevaron a cabo con diferentes concentraciones de estos péptidos y se analizó la viabilidad/proliferación celular mediante los ensayos de incorporación de [3H]timidina después de 3 días. Se puede observar que la célula ARH-77 que expresa sh-NS es altamente sensible a la eliminación inducida por Z-/mDTP— mostrada por los valores de CI50 de 1.4 µ? (Z-DTP1 ; Figura 20A), 302 nM (Z-DTP2; Figura 20B) y 303 nM (mDTP3; Figura 20C)— similar a lo que se observa en las células ARH-77 parentales no infectadas (ver Cuadro IV). En el contraste impresionante sin embargo, las células ARH-7 que expresan MKK7-sh se hicieron completamente resistentes a la eliminación inducida por Z-mDTP— mostrado por los valores de Cl50 > 10 µ? de Z-DTP 1 , Z-DTP2 y mDTP3— semejante a lo que se ve en células ARH tratadas con ZDNC-77 (Figuras 20A, 20B y 20C). Cl50se calcularon como se describió en el ejemplo 6, usando las concentraciones crecientes de Z-DNC (Figuras 20A, 20B y 20C), ZD- TPI (Figura 20A), Z-DTP2 (Figura 20B), y mDTP3 (Figura 20C), que varían de 0.01 a 1 µ.?. En las gráficas se reportan los porcentajes de las cuentas por minuto (c.p.m.), una medida de la supervivencia/proliferación celular, obtenidos con células tratadas con péptidos, con respecto a los valores de c.p.m. obtenidos con células no tratadas. Se obtuvieron datos similares con líneas celulares de mieloma múltiple sensibles a Z-/mDTP adicionales, que incluyen las líneas celulares U266, KMS-1 1 y KMS-12 (datos no mostrados). Estos datos (es decir la pérdida de la sensibilidad de Z-/mDTP en células de mieloma múltiple susceptibles, por el silenciamiento de MKK7), junto con los datos mostrados en las Figuras 12A-12B (es decir la notable correlación entre la expresión de Gadd45 y la sensibilidad de las células de cáncer a la eliminación inducida por Z-DTP), demuestra conclusivamente la especificidad muy alta de objetivo de los Z-/mDTP para el complejo Gadd45p/MKK7 en células de mieloma múltiple.

EJEMPLO 13 Los Z-DTP retienen la fuerte actividad citotóxica y especifica en células primarias de mieloma múltiple de los pacientes Materiales y Métodos Para confirmar que los Z-/mDTP retienen la actividad citotóxica en células primarias de mieloma múltiple, se examinaron los efectos de Z-DTP1 y Z-DTP2 en la supervivencia de las células de mieloma múltiple, aisladas de pacientes con un diagnóstico clínico de mieloma múltiple. Con esta finalidad, se purificaron células de mieloma múltiple de porciones aspiradas de médula ósea (BM) de pacientes con mieloma múltiple por selección negativa, utilizando esterillas magnéticas conjugadas con CD138, en esencia como se describe en la referencia de Hideshima T. et al. 2006, Blood 107: 4053-4062. La pureza de células de mieloma múltiple fue confirmada por citometría de flujo, utilizando y CD 138 y 45 anti-CD anticuerpos, también en esencia de acuerdo con el procedimiento descrito en la referencia de Hideshima T. et al. 2006, Blood 107: 4053-4062. Se cultivaron las células CDI38+ BM purificadas a una concentración de 4x105 células/mi en pozos de placas de 96 pozos y se trataron con 1 µ? o10 µ? de Z-DTP1 , Z-DTP2 o Z-DNC durante 48 horas. La viabilidad celular se midió mediante el conteo celular usando ensayos de exclusión por azul tripano (Figuras 14A, 14B, 14C, 14D y 14E). Para determinar el índice terapéutico in vitro de los Z-/mDTP, se realizaron también ensayos de viabilidad y proliferación con células primarias no transformadas de origen tanto humano como de ratón, después del tratamiento con 10 pM o 100 pM de Z-DTP1 , Z-DTP2 y Z-DNC. Con esta finalidad, se purificaron células estromales de médula ósea (BMSC), células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) y células germinales mesenquimales (MSC) de individuos sanos después de separación de densidad de Ficoll-Hypaque, de acuerdo con los protocolos informados en la referencia de Piva R. et al. 2008 Blood 1 11 : 2765-2775). Se trataron entonces células BMSC, PBMNC y MSC durante los tiempos indicados y con las concentraciones peptídicas especificadas en las Figuras 15A y 15B. Para establecer con mayor precisión la especificidad de la actividad citotóxica de los Z-/niDTP por las células de cáncer, se utilizaron también linfocitos B y T primarios purificados del bazo y nodos linfáticos de ratones, respectivamente, en esencia como se describe en la referencia de Shirakawa et al. 2010 Cell Mol inimunology 1-12. Se activaron entonces células B y T por simulación con 1 ng/mL de LPS durante 16 horas y se trataron subsiguientemente con 100 pM de Z-DTP1 , Z-DTP2 o Z-DNC durante 72 horas como se muestra en la Figura 15B.

Resultados Las Figuras 14A, 14B, 14C, 14D y 14E muestran que Z-DTP1 y Z-DTP2, pero no Z-DNC, exhiben una fuerte actividad citotóxica en células primarias de mieloma múltiple aisladas de 5 pacientes representativos. Cada panel representa los datos obtenidos de células de mieloma múltiple de un paciente diferente -esto es paciente 1 (Figura 14A), paciente 2 (Figura 14B), paciente 3 (Figura 14C), paciente 4 (Figura 14D) y paciente 5 (Figura 14E). Los tratamientos con Z-DTPI Z-DTP2 y Z-DNC tenían las concentraciones indicadas (es decir 1 µ? o 10 µ?), durante 48 horas. Los ensayos se realizaron utilizando exclusión por triptano azul. Los valores representan el porcentaje de células vivas después del tratamiento con Z-DTP2, Z-DTP1 o Z-DNC, con respecto a la viabilidad de células de control no tratadas. La fuerte actividad citotóxica— comparable con la de ZD- TP2 y Z-DTP 1— también se observó en células primarias de mieloma de pacientes con mDTP3, bajo condiciones experimentales semejantes (datos no mostrados). Estas conclusiones demuestran que los Z-/mDTP retienen la actividad en células primarias de mieloma múltiple e indica que la terapia con Z-/mDTP se puede utilizar en pacientes para tratar el mieloma múltiple.

Las Figuras 15A y 15B muestran que Z-DTP1 y Z-DTP2 no exhiben toxicidad a las células primarias normales de origen humano o de ratón, aun cuando se utilicen en concentraciones muy altas— esto es, 100 µ?. Las células primarias sometidas a prueba incluyeron células estromales normales de médula ósea (BMSC) (Figura 15A), células mononucleares de sangre periféricas (PBMNC) (Figura 15A), y células germinales mesenquimales (MSC) (Figura 15B), aisladas de individuos sin mieloma múltiple, y linfocitos B y T primarios purificados, aislados de ratones (Figura 15B). Los tratamientos con Z-DTP2, Z-DTP 1 y Z-DNC fueron a las concentraciones indicadas durante: 48 h (BMSC, PBMNC) (Figura 15A), 72 h (células B y T murinas) (Figura 15B), o 144 h MSC (Figura 15B). Los ensayos se realizaron utilizando exclusión por tripatano azul (Figura 15A) o incorporación de [3H]timidina (Figura 15B). Los datos presentados en las Figuras 14A-14E y 15A-15B indican que los Z-DTP tienen altos índices terapéuticos in vitro (es decir carecen de toxicidad en células normales contra una alta toxicidad en células de cáncer). Verdaderamente, Z-DTP1 y Z-DTP2, pero no Z-DNC, muestran una fuerte actividad tumoricida en las células de mieloma múltiple de los pacientes (Figuras 14A-14E), pero no exhiben toxicidad en las células normales primarias de individuos sanos o ratones (Figura 15A), aun cuando se utilicen en concentraciones muy altas, tales como 100µ? (véase la Figura 15B). Estos datos demuestran que los Z-DTP no tienen efectos citotóxicos indiscriminados en las células— más bien sus efectos citotóxicos son específicos para las células de cáncer y/o de células se caracterizan por sus niveles altos de expresión de Gadd45 o actividad y/o expresión o actividad altas constitutivas de NF-??. La actividad alta de los Z-/mDTP en células de mieloma múltiple y otras de cáncer, combinada con su falta de la toxicidad en células normales primarias, inclusive BMSC, MSC, PBMNC humanas primarias y linfocitos B y T de ratón, aun cuando se utilicen en concentraciones altas (es decir 100 µ?), demuestra que los compuestos de la invención tienen excelentes índices terapéuticos in vitro (véase la Figura 9, carecen de toxicidad en líneas celulares que no dependen de NF-BKpara su supervivencia; Figuras 12A-12B, correlación entre la expresión de Gadd45p y la sensibilidad de células de cáncer a los Z-DTP; Figuras 14A-14E y 15A-15B, ensayos de eliminación en células primarias) — ventaja esencial de la invención sobre las terapias existentes. Los compuestos de la invención carecen también de toxicidad en líneas celulares de tumores, tales como leucemia de células T, linfoma de Burkitt y muchos otros, que no dependen de NF-BKpara la supervivencia (aun cuando se utilicen a razón de 100 µ?; véase la Figura 9), mostrando que su actividad tiene la especificidad inherente para células con NFK-? constitutivamente activas. Además, en un panel grande de líneas celulares de tumor de diferentes tejidos de origen, hay una correlación significativa en el aspecto altamente estadístico entre los niveles de expresión de Gadd45p y la sensibilidad a la eliminación inducida por Z-/mDTP (P<0.01 ; Figuras 12A-12B), estableciendo así la alta especificidad de la acción citotóxica de los Z-/mDTP para Gadd45p. Crucialmente, la disminución mediada por ARN-sh de Gadd45p causa la apoptosis en las líneas celulares de mieloma múltiple (por ejemplo ARH-77 y NC1 H929), sensibles a Z-/mDTP, con cinética semejante a la observada con los Z-/mDTP, pero no en líneas celulares de mieloma múltiple resistentes a Z-/mDTP (por ejemplo RPMI-8226), y la disminución mediada mediada por ARN-sh de MKK7 causa resultados con una pérdida de la sensibilidad a la eliminación inducida por Z-/mDTP en líneas celulares susceptibles de mieloma múltiple (por ejemplo ARH-77) (véase las Figuras 20A-20C). Juntos, estos datos muestran que la actividad citotóxica de los Z-/mDTP está restringida a células de tumor que se caracterizan por NFKB constitutivamente activo y/o niveles altos de expresión o actividad de Gadd45p— los Z-/mDTP exhiben citotoxidad en niveles en nM en líneas celulares sensibles de mieloma múltiple, pero no tienen toxicidad en lineas resistentes de tumor que no dependen de NF-?? para la supervivencia o que exhiben bajos niveles de expresión de Gadd45p , aun cuando se utilicen a razón de 100 µ?. Además, en contraste con ratones que carecen de componentes de núcleo de la ruta de IKKINF-??, los ratones con gadd45p_ " mice are viable and seemingly healthy (Papa et al. 2008 J Clin Invest 1 18, 191 1-1923), indicando que (a diferencia del bloqueo de proteasoma/NFi B) la desactivación completa de Gadd45p es tolerado adecuadamente in vivo (Papa et all 2008 J Clin Invest 1 18, 1911-1923). Juntas, estas conclusiones indican que terapia con Z-/mDTP será segura y específica (véanse las Figuras 9 y 15A-15B, falta de toxicidad en las líneas celulares de tumores independientes de NF- ? y células primarias normales; Figuras 12A-12B, correlación entre la expresión de Gadd45 y la sensibilidad de células de cáncer a la eliminación inducida por Z-/mDTP; Figuras 14-14E, eliminación inducida por Z-/mDTP de células primarias de mieloma múltiple). Los inhibidores de proteasoma (Pl), tales como bortezomib, y otras terapias de mieloma múltiple destruyen también las células de mieloma múltiple activando INK (Chauhan et al. 2008 Blood 1 1 1 , 1654-1664), pero no puede curar debido a los bajos índices terapéuticos (Lauback et al 2009 Leukemia 23, 2222-2232; Ludwing et al 2010 Oncologist 15, 6-25 y www.cancecare.on.caf). Direccionar las funciones discretas de NF-icB en la supervivencia de mieloma múltiple por medio de Gadd45ß hará posible disasociar las funciones de NF-?? en inmunidad, inflamación y supervivencia, para proporcionar una terapia más específica y más segura que pueda tolerarse en dosis requeridas para la curación. Los Zl-mDTP definen una clase enteramente nueva de agentes terapéuticos que se dirigen en una ruta novedosa en el mieloma múltiple, y potencialmente otros cánceres y enfermedades o trastorno que dependen de NF-BKpara la supervivencia.

EJEMPLO 14 Las propiedades de unión de mDTP3 a las proteínas Gadd45P y MKK7 aisladas y como parte de un complejo Gadd45B/MKK7 A manera de ejemplo, se realizaron experimentos de unión con mDTP3 a Gadd45 , el dominio de cinasa de MKK7 (MKK7) y al complejo Gadd45/MKK7 utilizando la técnica de resonancia de plasmón de superficie.

Materiales y Métodos Para determinar cómo los DTP se unen al complejo Gadd45 /MKK7, SE realizaron experimentos con un instrumento Biacore3 000 SPR (GE Healthcare, Milán, Italia), utilizando chips sensores CM5 (GE Healthcare, Milán, Italia). Se preparó Gadd45 humano de longitud completa y se purificó como se describe en la referencia de Tornatore L., et al. (2008). J Mol Biol; 378:97— 11 1. El dominio constitutivamente activo de cinasa de MKK7, que se extendía de los residuos 101 a 405, y que contenía las mutaciones S287D y T291 D (MKK7KD), se expresó en E.Coli como proteína de fusión de His6. Se purificó la proteína hasta homogeneizar mediante dos pasos subsiguientes de cromatografía de afinidad (soporte de Ni-NTA) y filtración de gel (Superdex G75), y se caracterizó entonces por SDS-PAGE, la LC-MS para verificar identidad y pureza, y mediante dicroismo circular para valorar el plegado.

Se inmovilizó MKK7«D en el chip sensor de Biacore por medio de química clásica de acoplamiento de EDC/NHS con pH 5 (proteína pl, ~9) con un caudal de 5 uL/min. Se logró un nivel de inmovilización de aproximadamente 8000 unidades de respuesta. El Gadd45p, que es una proteína intrínsecamente ácida con un pl de aproximadamente 4.5, se inmovilizó con pH 3.5 (6000 niveles de inmovilización RU) en un canal separado. Los grupos reactivos residuales tanto en el Gadd45 como el MKJ (7 canales fueron desactivados finalmente por tratamiento con etanolamina. En otro canal se realizó el mismo procedimiento de activación con EDC/NHS y desactivación con etanolamina. Este canal se utilizó como referencia y la señal que deriva de él se consideró como blanco, y los valores se sustrayeron de los canales experimentales que detectan las proteínas Gadd45 o MKK7KD para eliminar la unión no especifica a la superficie de chip. Para determinar si se inmovilizaron efectivamente las dos proteínas, se realizaron inyecciones repetidas de Gadd45 (20-200 nM) y MKK7 (1-25 nM) en concentraciones crecientes de proteína (3 mm de tiempo de contacto; 60 µ?_). Se logró la regeneración usando las inyecciones de 1 M de NaC1 (1 mm, canal derivado de lvlKK7KD) o 20 mM de NaOH (30 seg, canal derivado de Gadd45 ).

ILas concentraciones crecientes del tripéptido mDTP3 (Ac-D-Tyr-D-Arg-D-Phe-NH2) finalmente se inyectaron sobre el chip a concentraciones que varían entre 1 nM y 10 µ?. En un experimento separado, se inyectó mDTP3 durante la fase de disociación de Gadd4 de MKK7 inmovilizado o de MKK7iu de Gadd45ßinmovilizado. Los resultados de estos análisis están indicados en las Figuras 21 A, 21 B, 21 C y 21 D.

Resultados Como se puede observar en la Figura 21A, la unión de Gadd45 a MKK7KD inmovilizado fue muy efectiva. Se observaron las curvas de asociación y disociación de dosis-respuesta y curvas en toda la concentración utilizada. Se estimó la constante de disociación KD de la interacción Gadd45P/JVIKK7KD promediando los valores calculados en cada una de las diferentes curvas y se determinó que era de 4.0±0.7 nM (véase la Figura 21 A). De manera similar, las inyecciones repetidas de MKK7KD en el canal de Gadd45p proporcionaron las curvas de asociación de respuesta por dosis y disociación (Figura 21 B) de las cuales se derivó KD de 3.4±0.6 nM.

Para determinar si mDTP3 se une a MKK7KD y/o a Gadd45p, las muestras del péptido (es decir, mDTP3) se inyectaron sobre los canales derivados de 0add45p y MXK7KD- Sorprendentemente, como se puede ver en la Figura 21 C, los datos muetran que este péptido no se une a Gadd45p o MKK7KD a aislamiento. Sin embargo, sorprendentemente, cuando se inyectó mDTP3 durante la fase de disociación de Gadd45p de MICK7«D, (Figura 21 D) o la fase de disociación de MKK7KD de Gadd45 (no se muestran los datos), se observó la unión y se pudieron registrar las curvas de asociación y disociación de repuesta por dosis. La Figura 21 D muestra que cuando se inyectó mDTP3 en bajas concentraciones de 10 nM o 100 nM, este péptido indujo una rápida disociación del complejo Gadd45p/MICK7KD- Como se puede observar también, se recuperó rápidamente la formación del complejo Gadd45/MKK7KD después de que se eliminara por lavado el péptido. Las Figuras 21A-21 D también muestra que cuando se inyectó mDTP3 en altas concentraciones (por ejemplo, 1 µ?), se registraron las curvas de unión y disociación de respuesta por dosis, indicando que mDTP3 se estaba uniendo a Gadd45 3 y/o a MKK7 o a un complejo de las dos proteínas. Juntos, estos datos demuestran que mDTP3 no puede unirse a Gadd45p o MKK7KD aislados, aun cuando se utilicen en concentraciones altas, más bien su unión a Gadd45p, MKK7KD O una superficie creada por interacción de las dos proteínas requiere la formación de un complejo Gadd45 /MKK7. Estos datos son importantes, ya que muestran que el objetivo terapéutico es la interfaz entre dos proteínas (es decir Gadd45 y MKK7)— que provee potencial para la alta selectividad de objetivo en las células, una ventaja esencial de esta invención en las terapias existentes.

EJEMPLO 15 Perfiles farmacocinéticos (DMPK in vivo de Z-DTP2 y mDTP3 Para valorar la idoneidad de Z-DTP2 y mDTP3 para el uso terapéutico in vivo, se realizaron análisis farmacocinéticos en ratones.

Materiales y Métodos Estudio de farmacocinética en ratones: Sumario del protocolo: Se administró Z-DTP2 y Z-mDTP3 intravenosamente a ratones. Se reunieron muestras de la sangre hasta 7 puntos de tiempo después de inyección intravenosa (i.v.) de los compuestos durante 8 horas y se analizó el plasma por LC-MS/MS para determinar la concentración de los compuestos en cada punto de tiempo.

Procedimiento experimental: Tres ratones CD 1 machos, de 25-30 gramos cada uno, fueron medicados por cada ruta de administración por cada punto de tiempo, por cada compuesto. El compuesto de prueba fue administrado intravenosamente (en un nivel típico de dosis de 10 mg de compuesto por kg de peso corporal). Se les dio a los animales acceso libre al alimento durante todo el estudio.

En los siguientes puntos de tiempo, se anestesiaron los animales, se reunió sangre en tubos heparinizados y se sacrificaron los animales: dosificación i.v.: 0.08, 0.25, 0.5, 1 , 2, 4 y 8 horas después de la dosificación Preparación de la muestra: Se centrifugaron las muestras de la sangre para obtener el plasma, que se transfirieron luego a un recipiente marcado separado. Se analizado por separado las alícuotas de los puntos de tiempo individuales para los tres animales. Se precipitaron las proteínas agregando tres volúmenes de metanol y centrifugando durante 30 min a 4°C. Se diluyeron alícuotas de 100 µ?_ de los sobrenadantes resultantes con 200 µ?_ de agua de calidad por HPLC en pozos de un plato de 96 pozos.

Análisis cuantitativo: Se prepararon curvas estándar en matrices de plasma en blanco y se trataron de manera idéntica a las muestras. Se cuantificaron las muestras de plasma por LC-MS/MS y se indicó la concentración de cada compuesto en el plasma en µg/mL.

Análisis elemental: Los parámetros farmacocinéticos se calcularon empleando un análisis de modelo nocompartimental, como se describe en el sitio de Internet http://www.pharsight.com/main.php Bioanálisis: Sumario del protocolo Se midió la concentración del compuesto de prueba en el plasma por medio de LC-MS/MS. Los datos fueron cuantificados usando una curva estándar de cinco puntos sobre un rango de 3-3000 ng/mh Procedimiento experimental: Las proteínas fueron precipitadas desde aliquotas de 501 µ?_ de las muestras individuales de plasma agregando 150 µ? de metanol. Después de la precipitación de proteínas, las muestras de plasma fueron sometidas a centrifugado por 30 mm a 4 °C. Se diluyeron aliquotas de 100 µ!_ del sobrenadante resultante con 200 µ?_ de agua de grado HPLC en una placa con 96 pozos. Entonces el compuesto de prueba fue cuantificado por LC-MS/MS a partir de una curva estándar de cinco puntos preparada por adición de plasma con concentraciones variadas del compuesto de prueba disuelto en DMSO sobre una escala de concentración final de 3-3000 ng/ml (concentración final de DMSO de 1%) y fue tratado en una manera idéntica a las muestras de prueba como se describió antes.

Resultados Los estudios farmacocinéticos en ratones CD1 macho demuestran que tanto Z-DTP2 como mDTP3 tienen perfiles de DMPK in vivo adecuados para la administración por infusión intravenosa (i.v.) (ver Cuadros VIII, IX IA], y IX IBI), en la ausencia de toxicidad aguda en ratones. El Cuadro VIII reporta los valores de los parámetros farmacocinéticos in vivo más importantes obtenidos con Z-DTP2 y mDTP3, incluyendo la vida media en plasma (T112), volúmenes de distribución en estado estable (Vss) y terminal (Vu), y eliminación total (tot CL), área bajo la concentración de plasma contra curva de tiempo (AUC), y concentración en el punto de tiempo 0 (CO). Los valores fueron calculados a partir de los datos de la concentración de plasma contra curvas de tiempo, basándose en los métodos de análisis compartimental y no compartimental (Groulx A.2006 ScianNew 9: 1-5 y DiStefano 3er 1982 Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 243: 1-6) (datos no mostrados). Cada parámetro mostrado representa el promedio de los valores experimentales obtenidos de tres diferentes grupos de ratones CD 1 macho seguido de una sola inyección intravenosa (i.v.) de los compuestos a una dosis de10 mg por kg de peso corporal. Tres ratones CDI macho (25-30 gr de peso corporal) fueron dosificados por administración iv. de cualquiera de Z-DTP2 o mDTP3. Se recogieron muestras de sangre en 7 puntos en el tiempo como se muestra (es decir, a 0.08, 0.25, 0.5, 1 , 2, 4 y 8 hrs. después de la inyección) y el plasma fue analizado por espectrometría de masas de cromatografía líquida (LC-MS) para determinar las concentraciones en la sangre de los dos compuestos en cada punto en el tiempo. Las gráficas de la concentración de plasma contra el perfil de tiempo fueron extrapoladas tanto para Z-DTP2 como para mDTP3. Los resultados demuestran que Z-DTP2 y mDTP3 siguen ambos una disposición multifásica después de la inyección intravenosa (no se muestran datos). De hecho, las curvas de concentración-contra-tiempo de los compuestos administrados por vía intravenosa despliegan un perfil bio-exponencial diferente con una fase de distribución inicial empinada y una larga T½ terminal (no se muestran datos).

Los parámetros farmacocinéticos principales extrapolados de los datos de las curvas de concentración el plasma-tiempo (es decir, Co, AUC al último, T½, \/ß, Vss y CL) son cruciales en el cálculo de los niveles de dosificación y el régimen de administración, que se requieren para lograr las deseadas concentraciones sistémicas en estado estable de un fármaco (es decir, las concentraciones sistémicas terapéuticas). Como se puede ver en el Cuadro VIII, Z-DTP2 y mDTP3 exhiben vidas medias in vivo de aproximadamente 2 hrs. y de aproximadamente 1 hr. y 20 mm, respectivamente.

Es interesante notar que tanto Z-DTP2 como mDTP3 ambos presentan una vida media distributiva inicial de aproximadamente 5 mm, lo que podría sugerir una rápida captación de tejido/celular, pero alternativamente podría sugerir la unión a proteínas de plasma. Lo que es más importante, ambos compuestos exhiben una eliminación muy lenta de los tejidos, lo que se refleja en una vida media terminal de aproximadamente 8 hrs. (Cuadro VIII y datos no mostrados) (http://www.pharsight.comlrnain.pbp y http://www.meds.comlleukemialidamycinladriamycin.html y Kupperman et al 2010 Cáncer Res 70 1970-1980). Los datos también demuestran que ambos Z-DTP2 y mDTP3 siguen un sistema farmacocinético lineal general (Berezhkovskiy (2007) J Pharm Sci. 96, 163 8-52), como lo indica el descubrimiento de que sus valores de distribución de volumen total son más altos que los de la distribución de volumen en estado estable (i.e. ?ß> Vss).

Ambas distribuciones de volumen terminal y en estado estable, así como las vidas medias terminales de los dos compuestos contribuyen en forma sinergística a establecer la cantidad de fármaco que se requiere en el cuerpo para una relación de infusión constante.

Es importante señalar que Z-DTP2 y mDTP3 presentan valores de eliminación total en la escala de 66 a 90 ml/min/kg y de 22 a 27 ml/min/kg, respectivamente, lo que sugiere lentas velocidades de excreción metabólica y biliar para ambos compuestos (Cuadro VIII y datos no mostrados).

Los Cuadros IX [A] y IX [B] presentan la dosificación prescrita para la administración in vivo de ZD- TP2 y mDTP3, respectivamente, requerida para lograr concentraciones terapéuticas sistémicas de los dos compuestos. Los valores reportan la dosificación expresada en mg/hr requerida para obtener las concentraciones deseadas en el plasma en estado estable de 1 , 5 o 10 µ? tanto para Z-DTP (Cuadro IX [A]) como para mDTP3 (Cuadro IX [B]). Es importante notar que, a pesar de tener una vida media comparable así como una vida media terminal comparable para Z-DTP2, mDTP3 exhibe un valor de desaparición total que es 3 veces inferior que el de Z-DTP2 (Cuadro VIII y datos no mostrados). Es de resaltar que incluso una pequeña diferencia en este crucial parámetro farmacocinético puede afectar significativamente el tamaño de dosificación y el régimen requerido para lograr la concentración deseada en el plasma en estado estable de un compuesto, como se puede ver con la diferencia en las dosificaciones prescritas para Z-DTP2 y mDTP3 (Cuadros IX [A] y IX [B], respectivamente). De hecho, los Cuadros IX [A] y IX [B] (análisis de modelación) demuestran que, para lograr una concentración del plasma en estado estable de 1 , 5, o 10 µ?, la dosificación requerida para mDTP3 es significativamente inferior que la requerida para Z-DTP2. Así, basándose en estos resultados farmacocinéticos y en los valores de IC50 determinados para los dos compuestos en líneas celulares de mieloma múltiple (ver el Cuadro IV) para lograr una concentración de plasma en estado estable de hasta 0 µ? será necesario administrar Z-DTP2 y inDTP3 por infusión intravenosa continua a una velocidad de 0.976 mg/hr y 0.2 8 mg/hr, respectivamente (Cuadros IX [A] y IX [B]).

Nótese que la síntesis de Z-/mDTP es concisa y directa, y por lo tanto efectiva en costos incluso para el uso crónico. Así, incluso con un T1 bajo, 2, la terapia de Z-/mDTP por infusión será aceptable en pacientes hospitalizados que ya reciben quimioterapia. Los compuestos de la invención también son altamente solubles y tienen una alta especificidad y buenos perfiles de seguridad, por lo que pueden ser administrados en dosis altas, en volúmenes bajos para maximizar los efectos terapéuticos, como son explotados exitosamente por las existentes terapias peptídicas.

CUADROS CUADRO I Examen inicial de Elisa CUADRO II Péptidos puros modificados CUADRO III Péptidos modificados CUADRO IV CUADRO V CUADRO VI Compuestos 5 20 CUADRO VII CUADRO VIII CUADRO IX (A) CUADRO IX (B)

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto de fórmula I: Xi-A-X2 en donde, A es A"", o A"-[M-A'-]n -A"'; A"" es A", A'", o Z1-Y2-Y3-Z4, en donde Y2-Y3 es una porción de oligopéptido o una porción de oligopeptoide que tiene los residuos Y2-Y3 y Z1 está unido al nitrógeno N-terminal de Y2-Y3 y Z4 está unido al carbono C-terminal de Y2-Y3; A" es A', o Y1-Y2-Y3-Z4, en donde Y1-Y2-Y3 es una porción de oligopeptoide que comprende los residuos: Y1-Y2-Y3 y 4 está unido al carbono C-terminal de Y1-Y2-Y3; A'" es A' o Z Y2-Y3-Y4, en donde Y2-Y3-Y4 es una porción de oligopeptoide o una porción de oligopeptoide que comprende los residuos Y2-Y3-Y y está unido al nitrógeno N-terminal de Y2-Y3-Y4; cada ocurrencia de ' es independientemente una porción de oligopéptido o una porción de oligopeptoide que comprende los residuos Y1-Y2-Y3-Y4; n es un entero de 0 a 18 Y y Y4 son independientemente residuos de aminoácido o residuos de derivados de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas Y2 es un residuo de aminoácido o un residuo de un derivado de aminoácido o está ausente; Y3 es un residuo de aminoácido o un residuo de un derivado de aminoácido o está ausente; Z1 es un grupo de la fórmula II: que está enlazado al nitrógeno N-terminal de Y2, W está ausente, o un oxígeno, o un nitrógeno, o un grupo alquileno de uno a tres carbonos, dicho grupo alquileno de uno a tres carbonos se sustituye opcionalmente con por lo menos un sustituyente seleccionado de alquilo de uno a cuatro carbonos, o un grupo aromático, carbocíclico o heterocíclico de 5-10 miembros; J es un grupo aromático carbocíclico o heterocíclico de 5-10 miembros, dicho grupo aromático se sustituye opcionalmente con por lo menos un sustituyente seleccionado de hidroxilo, halógeno, alquilo de uno a cuatro carbonos, o alcoxi de uno a cuatro átomos de carbono; Z4 representa un grupo de la fórmula III: que está enlazado al carbono C-terminal de Y3, R es hidrógeno o alquilo de uno a cuatro carbonos; W está ausente o es un grupo alquileno de uno a tres carbonos, dicho grupo alquileno de uno a tres carbonos está sustituido opcionalmente con por lo menos un sustituyente seleccionado de alquilo de uno a cuatro carbonos, o un grupo aromático carbocíclico o heterocíclico de 5-10 miembros; J' es un grupo carbocíclico alifático de 3-10 miembros o un grupo aromático carbocíclico o heterocíclico de 5-10 miembros, dicho grupo alifático o aromático se sustituye opcionalmente con por lo menos un sustituyante seleccionado de hidroxilo, halógeno, alquilo de uno a cuatro carbonos, o alcoxi de uno a cuatro átomos de carbono; M es una unión de péptidos entre el oligopéptido precedente o porción de oligopeptoide (?', A" o A'") y el siguiente oligopéptido o porción de oligopéptido (?',?" o A'") o una porción enlazadora unida a través de un enlace de amida, un enlace de éster, un enlace de éter, o un enlace de tioéter con el grupo carboxílico terminal o el oligopéptido precedente o porción de oligopeptoide (?', A" o A'") y através de un enlace de amida, un enlace de éster, un enlace de éter o un enlace de tioéter con el grupo amino terminal de la siguiente porción de oligopeptoide (?', A" o A'"); Xi está ausente, o es una porción agregada al amino terminal de A para bloquear el grupo amino libre; X? está ausente o es una porción agregada al carboxilo terminal de A para bloquear el grupo carboxilo libre; con la condición de que ^ esté ausente si A comprende ? y X2 está ausente si A comprende Z4 o derivados del mismo, dichos derivados siendo seleccionados del grupo que consiste en: a) oligómeros o multímeros de moléculas del compuesto de la fórmula I, dichos oligómeros y multímeros comprenden dos o más moléculas del compuesto de la fórmula I, cada uno enlazado a una porción de armazón común a través de un enlace de amida formado entre un grupo amino o ácido carboxílico presente en moléculas del compuesto de la fórmula I, y un grupo amino o ácido carboxílico opuesto en una porción de andamiaje, dicha porción de armazón participa en por lo menos 2 enlaces de amida, b) derivados que comprenden una molécula del compuesto de la fórmula I o un oligómero o multímero del mismo, como se definió antes en la parte a) conjugado a través de un enlace de amida, un enlace de éster, un enlace de éter o un enlace de tioéter a: PEG, compuestos basados en PEG, péptidos penetradores de célula, colorantes fluorescentes, biotina u otra porción de cola, ácidos grasos, nanopartículas de tamaño discreto o ligandos quelantes en complejo con iones metálicos o radioactivos; y c) derivados que comprenden una molécula del compuesto de fórmula I o un oligómero o multimero de la misma como se define en el inciso a), que ha sido modificada por amidación, glicosilación, carbamilación, acilación, sulfatación, fosforilación, ciclización, lipidación, pegilación o enlace con un péptido o socio de fusión peptoide, para hacer un péptido de fusión o peptoide de fusión; d) sales y solvatos de una molécula del compuesto de la fórmula I o de un derivado del mismo, como se define en el inciso a) o b) anteriores.

2 - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque Y2 es un residuo de aminoácido o un residuo de un derivado de aminoácido que tiene una cadena lateral que porta una carga negativa en solución acuosa, a pH7, y en donde Y3 es un residuo de aminoácido o un residuo de un derivado de aminoácido que tiene una cadena lateral que porta una carga positiva en solución acuosa a pH7 y en donde Y3 y Y4 son tales que se puede formar un puente de sal entre las respectivas cargas positiva y negativa de las cadenas laterales.

3.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado además porque: Yi es: D-triptófano, L-triptófano, D-tirosina, L-tirosina, D-3,3-difenil-alanina, L-3,3-difenil-alanina, D- H-3-(4-pir¡dil)alanina, L-H-3-(4-piridil)alanina, D-H-3-(3-piridil)alan¡na, L-H-3-(3-pirid¡l)alanina, D-H-3-(2-pirid¡l)alanina, L-H-3-(2-pirid¡l)alan¡na, ácido D-2-amino-4-fenil-butírico, ácido L-2-amino-4-fenil-butírico, D-H-4-hidroxi-fenil-glicina, L-H-4-hidroxi-fenil-glicina, D-3-(2-furil)-alanina, L-3-(2-furil)-alanina, L-homo-fenilalanina, D-homo-fenilalanina, D-3-(4-quinolil)-alanina, L-3-(4-quinolil)-alanina, D-naftil-alanina, L-naftil-alanina, ácido p-hidroxi-benzoico, ácido p-hidroxi-fenil-acético, ácido 3-(p-hidroxi-fenil)-propiónico, o derivados N-metilo en la configuración L o D de cualquiera de los anteriores; Y2 está ausente o es: ácido D-glutámico, ácido L-glutámico. ácido D-aspártico, ácido L-aspártico, L-Leucina, D-Leucina, L-glutamina, D-glutamina, L-Metionina, D-Metionina, ácido D-2-amino-heptanodioico, ácido L-2-amino-heptanodioico, un éster metílico o etílico de los mismos, L-homoserina, D-homoserina; on derivados N-metilo en la configuración L o D de cualquiera de los anteriores; Y3 es: D-argin¡na, L-arginina, L-Prolina, D-Prolina, D-histidina, L-histidina, D-lisina, ácido D-a, -diaminopropiónico (D-Dap), ácido L-a,p-diaminopropiónico (L-Dap), ácido L-a.ó-diaminobutírico (L-Dab), ácido L-a.ó-diaminobutirico (L-Dab), L-ornitina, D-omitina, L-lisina; o derivados N-metilo en la configuración L o D de cualquiera de los anteriores; Y es: D-fenilalanina, L-fenilalanina, D-triptófano, L-triptófano, D-tirosina, L-tirosina, D-3,3-difenil-alanina, L-3,3-difenil-alanina, D-H-3-(4-pir¡dil)alanina, L-H-3-(4-piridil)alanina, D-H-3-(3-piridil)alanina, L-H-3-(3-piridil)alan¡na, D-H-3-(2-piridil)alanina, L-H-3-(2-piridil)alanina, ácido D-2-amino-4-fenil-butírico, ácido L-2-amino-4-fenil-butírico, D-fenil-glicina, L-fenil-glicina, D-H-4-hidroxi-fenil-glicina, L-H-4-hidroxi- fenil-glicina, D-3-(2-furil)-alanina, L-3-(2-furil)-alanina, L-homo-fenilalanina, D-homo-fenilalanina, D-3-(4-quinolil)-alanina, L-3-(4-quinolil)-alanina, D-naftil-alanina, L-naft¡l-alan¡na, sus derivados N-metilo en la configuración L o D, anilina, bencilamina, o 2-fenil-etil-amina; Z\ es: 4-hidroxi-benzoílo, (4-hidroxi-fenil)-acetilo, 3-(4-hidroxi-fenil)-propionilo, benzoilo, benciloxicarbonilo, 2-fenil-acetilo, 3-fenil-propionilo, 3,3-difenil-propionilo, 3-(1 H-indol-3il)-propionilo, (1 H-indol-3-il)-acetilo, furan-2-il-acetilo, furan-3-il-acetilo, 3-piridin-4-il-propionilo, 3-piridin-3-il-propionilo, 3-pir¡din-2-il-propionilo, 3-pirimidin-4-il-propionilo, 3-piridazin-4-il-propionilo, 3-[1 ,3,5]-triazin-2-il-propionilo, 2-piridin-4-il-acetilo, 2-piridin-3-il-acetilo, 2-piridin-2-il-acetilo, 2-pirimidin-4-il-acetilo, 2-piridazin-4-¡l-acetilo, 2-[1 ,3,5]-triazin-2-il-acetilo, naftalen-1-il-acetilo, naftalen-2-il-acetilo, 2-naftalen-1 -il-propionilo, o 2-naftalen-2-il-propionilo; y Z4 es: fenilamina, bencilamina, fenetilamina, ciclohexilamina, 2-ciclohexil-etilamina, 3-ciclohexil-propilamina, 4-(2-amino-etil)-fenol, 4-amino-fenol, 4-aminometil-fenol, 1 H-indol-3-il-amina, 2-(1 H-indol-3-il)-etilamina, C-(1 H-indol-3-il)-metilamina, 2,2-difenil-etilamina, 2,2-dipiridin-4-il-et¡lamina, 2-pirid¡n-4-il-etilamina, 2-piridin-3-il-etilamina, 2-piridin-2-il-etilamina, 2-pirim¡din-4-il-et¡lamina, 2-[1 ,3,5]-triazin-2-il-etilamina, C-furan-2-il-metilamina, C-furan-3-il-metilamina, o C-naftalen-2-il-metilamina.

4.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , 2 ó 3, caracterizado además porque M es un enlace peptídico.

5.- El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque ^ es un hidrógeno o Xi es uno de los siguientes grupos agregado al amino terminal de la secuencia de oligopéptido o de oligopeptoide, para formar un enlace de amida: acetilo, benciloxicarbonilo, 2-cloro-benciloxicarbonilo, 3-metoxi-4-hidroxi-benzoilo, 3-hidroxi-4-metoxi-benzoílo, o fluorenilmetoxicarbonilo;

6.- El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque X? es un grupo hidroxilo o es uno de los siguientes grupos agregados al ácido carbonilo terminal de la secuencia de oligopéptido u oligopeptoide, para formar un enlace de amida: Amina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, D-triptófano, L-triptófano, D-tirosina, L-tirosina, D-3,3-difenil-alanina, L-3,3 -difenil-alanina, D-H-3-(4-pirid¡l)alanina, L-H-3-(4-piridil)alanina, D-H-3-(3-piridil)alanina, L-H-3-(3-piridil)alanina, D-H-3-(2-piridil)alanina, L-H-3-(2-piridil)alan¡na, ácido D-2-amino-4-fenil-butirico, ácido L-2-amino-4-fenil-butírico, D-fenil-glicina, L-fenil-glicina, D-H-4-hidrox¡-fenil-glicina, L-H-4-hidroxi-fenil-glicina, D-3-(2-furil)-alanina, L-3-(2-furil)-alanina, L-ciclohexilalanina, D-ciclohexilalanina, L-homo-fenilalanina, D-homo-fenilalanina, D-3-(4-quinolil)-alanina, L-3-(4-quinolil)-alanina, D-naftil-alanina, L-naftil-alanina, derivados N-metilo en la configuración L o D de cualquiera de los anteriores.

7. - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque n=0.

8. - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7, caracterizado además porque dicho compuesto tiene una vida media en la circulación humana de por lo menos 15 minutos.

9. - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque dicho compuesto retiene por lo menos 20% de su capacidad de unirse a Gadd45p y/o MKK7 según fue estimado en un ensayo de unión, in vitro , o por lo menos 20% de su capacidad para bloquear la interacción de Gadd45p con MKK7 según lo estimado en un ensayo de unión in vitro , o en donde dicho compuesto tiene la capacidad de restaurar por lo menos 20% de la actividad catalítica inhibida por Gadd45 de MMK7 según lo estimado bajo condiciones que no inhiben la actividad de MIKK7, por ejemplo las condiciones proporcionadas en el ejemplo 7.

10. - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque dicho compuesto tiene por lo menos una de las siguientes actividades: a) la capacidad de inhibir por lo menos el 20% de las interacciones de MKK7 con Gadd45p bajo las condiciones de ensayo que se describen en el ejemplo 1 , 2, 3, 4, ó 7, de preferencia dichas condiciones de ensayo son tales que no inhiben la actividad de MKK7; b) la capacidad de matar in vitro por lo menos 20% de las células en un cultivo de línea celular de mieloma humano seleccionado del grupo que consiste en las células U266, KMS-1 I, NCI-H929, ARH-77, JJN-3, KMS- 2, KMS-18, y KMS-27; bajo condiciones en las que no muere el 80% de la línea de células T JURKAT.

1. - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque A es un oligopéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 2], (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Arg)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 3], (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-H¡s)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 4], (L-Trp)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 5], (l_-Trp)-(L-Glu)-(L-His)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 6], (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Arg)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 7], (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 8], (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 9], (L-Trp)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 10], (L-Trp)-(L-Glu)-(L-Arg)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 1 1], (L-Trp)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 12], (L-Trp)-(L-Asp)-(L-Arg)-(L-Phe) [SEQ ID NO: 13], (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 14], (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-His)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 15], (L-Trp)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 16], (L-Trp)-(L-Glu)-(L-His)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 17], (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Arg)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 18], (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 19], (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 20], (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Arg)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 21], (L-Trp)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 22], (L-Trp)-(L-Glu)-(L-Arg)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 23], (L-Trp)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 24], (L-Trp)-(L-Asp)-(L-Arg)-(L-Trp) [SEQ ID NO: 25], (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Tyr) [SEQ ID NO: 26], (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 27], (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 28], (D-Trp)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 29], (D-Trp)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 30], (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Arg)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 31], (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Tyr) [SEQ ID NO: 32], (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Tyr) [SEQ ID NO: 33], (D-Trp)-(D-Asp)-(D- His)-(D-Typ) [SEQ ID NO: 34], (D-Trp)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Typ) [SEQ ID NO: 35], (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 36], (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-His)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 208], (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 209], (D-Trp)-(D-Glu)-(D-His)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 210], (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Lys)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 211], (D-Trp)-(D-Glu)-(D-Lys)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 212], (D-Trp)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Phe) [SEQ ID NO: 213], (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-H¡s)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 214], (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-H¡s)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 215], (D-Trp)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 216], (D-Trp)-(D-Glu)-(D-His)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 217], (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Arg)-(D-Trp) [SEQ ID NO:218], (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 219], (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Lys)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 220], (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 221], (D-Trp)-(D-Glu)-(D-Lys)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 222], (D-Trp)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 223], (D-Trp)-(D-Asp)-(D-Lys)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 224], (D-Trp)-(D-Gln)-(D-Arg)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 225], (D-Trp)-(D-Asn)-(D-Lys)-(D-Trp) [SEQ ID NO: 226], (L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Phe), (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Phe), (L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Phe), (L-Tyr)-(L-Arg)-(L-Phe), (D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Phe), (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Phe), (D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Phe), (D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Phe), (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Pro)-(D-Phe), (D-Phe)-(D-Leu)-(D-Phe), (D-Phe)-(D-Arg)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Glu)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Asp)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Pro)-(D-Tyr), (D-Phe)-(D-Leu)-(D-Tyr), (D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Arg)-(D- Trp), (D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Trp), (D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Pro)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Leu)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Arg)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Glu)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Asp)-(D-Trp), (D-Phe)-(D-Pro)-(D-Trp), y (D-Phe)-(D-Leu)-(D-Trp), ácido p-h¡droxibenzoico-(L-Glu)-(L-Arg)-anilina, ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-(L-Arg)-anilina, ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-(D-Arg)-anilina, ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-(D-Arg)-anilina, ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-(L-Arg)-bencilamina, ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-(L-Arg)-benc¡lamina, ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-(D-Arg)-bencilamina, ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-(D-Arg)-bencilamina, ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(L-Glu)-(L-Arg)-anilina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Glu)-(L-Arg)-anilina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(L-Glu)-(D-Arg)-anilina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Glu)-(D-Arg)-anilina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(L-Glu)-(L-Arg)-bencilamina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Glu)-(L-Arg)-bencilamina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(L-Glu)-(D-Arg)-bencilamina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Glu)-(D-Arg)-bencilamina, ácido 2-(4- idroxi-fenil)acético-(L-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(L-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(L-Glu)-(L-Arg)-anilina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(D- Glu)-(L-Arg)-anilina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(L-Glu)-(D-Arg)-anilina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(D-Glu)-(D-Arg)-anilina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(L-Glu)-(L-Arg)-bencilamin ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(D-Glu)-(L-Arg)-bencilamina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(L-Glu)-(D-Arg)-bencilamina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(D-Glu)-(D-Arg)-bencilamina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(L-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(D-Glu)-(L-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(L-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(D-Glu)-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido p-hidroxibenzoico-(L-Arg)-anilina, ácido p-hidroxibenzoico-(D-Arg)-anilina, ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-anilina, ácido p-h¡droxibenzoico-(D-Glu)-anilina, ácido p-hidroxibenzoico-(L-Arg)-bencilamina, ácido p-hidroxibenzoico-(D-Arg)-bencilamina, ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-bencilamina, ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-bencilamina, ácido p-hidroxibenzoico-(L-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido p-hidroxibenzoico-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido p-hidroxibenzoico-(D-Glu)-2-fenil-etil-amina, ácido p-hidroxibenzoico-(L-Glu)-2-fenil-etil-amina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(L-Arg)-anilina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Arg)-anilina, ácido 2-(4-hidrox¡-fenil)acético-(L-Glu)-anilina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Glu)-anilina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Arg)-bencilamina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(L-Arg)-bencilamina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Glu)-bencilamina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(L-Glu)-bencilamina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(L- Arg)-2-fenil-et¡l-amina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(L-Glu)-2-fenil-etil-amina, ácido 2-(4-hidroxi-fenil)acético-(D-Glu)-2-fenil-etil-amina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(L-Arg)-anilina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(D-Arg)-anilina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(L-Glu)-anilina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(D-Glu)-anilina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(L-Arg)-bencilamina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(D-Arg)-bencilamina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(L-Glu)-bencilam¡na, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(D-Glu)-bencilamina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(L-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(D-Arg)-2-fenil-etil-amina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(L-Glu)-2-fenil-etil-amina, ácido 3-(4-hidroxi-fenil)propiónico-(D-Glu)-2-fenil-etil-amina, Acetil-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 56], ácido para-hidroxibenzoico-Glu-Arg-anilina, ácido para-hidroxibenzoico-Glu-Arg-bencilamina, ácido para-hidroxibenzoico-Glu-Arg-2-fenil-etil-amina, ácido 2-(4-hidroxifenil)acético-Glu-Arg-anilina, ácido 2-(4-hidroxifenil)acético-Glu-Arg-bencilamina, ácido 2-(4-hidroxifenil)acético-Glu-Arg-2-fenil-etil-amina, ácido 3-(4-hidroxifenil)acético-Glu-Arg-3-anilina, ácido 3-(4-hidroxifenil)acético-Glu-Arg-bencilamina, ácido 3-(4-hidroxifenil)acético-Glu-Arg-2-fenil-etil-amina, acetil-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 57], ácido para-hidroxibenzoico-Asp-His-anilina, ácido para-hidroxibenzoico-Asp-His-bencilamina, ácido para-hidroxibenzoico-Asp-His-3-fenil-propil-amina, ácido 2-(4-hidroxifenil)acético-Asp-His-anilina, ácido 2-(4-hidroxifenil)acético-Asp-His-bencilamina, ácido 2-(4-hidroxifenil)acético-Asp- His-2-fenil-etil-amina, ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico-Asp-His-anilina, ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico-Asp-His-bencilamina, ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico-Asp-His-2-fenil-etil-amina, acetil-Tyr-Asp-Lys-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 39], acetil-Tyr-Glu-Lys-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 40], acetil-Tyr-Glu-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 41], acetil-Tyr-Asp-Arg-Phe-NH2, [SEQ ID NO: 42], acetil-Trp-Glu-His-Phe-NH2, [SEQ ID NO: 43], acetil-Trp-Glu-Lys-Phe-NH2) [SEQ ID NO: 44], acetil-Trp-Asp-His-Phe-NH2, [SEQ ID NO: 45], acetil-Trp-Asp-Lys-Phe-NH2, [SEQ ID NO: 46], acetil-Tyr-Glu-Arg-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 47], acetil-Tyr-Asp-Lys-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 48], acetil-Tyr-Glu-Lys-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 49], acetil-Tyr-Glu-His-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 50], acetil-Tyr-Asp-Arg-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 51], acetil-Trp-Glu-His-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 52], acetil-Trp-Glu-Lys-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 53], acetil-Trp-Asp-His-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 54], acetil-Trp-Asp-Lys-Tyr-NH2 [SEQ ID NO: 55], lactama interna de acetil-Tyr-Glu-Lys-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 56], acetil-Tyr-GIn-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 57], acetil-Tyr-Met-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 58], acetil-Tyr-Leu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 59], acetil-Tyr-Arg-Phe-NH2, acetil-Tyr-Arg-Tyr-NH2, acetil-Tyr-Glu-Phe-NH2, acetil-Tyr-Glu-Tyr-NH2, acetil-Tyr-Asp-Phe-NH2, acetil-Tyr-Asp-Tyr-NH2, acetil-Tyr-Pro-Phe-NH2, acetil-Tyr-Lys-Phe-NH2, acetil-Tyr-His-Phe-NH2, H-Tyr-Arg-Phe-NH2, H-Tyr-Arg-Tyr-NH2, H-Tyr-Glu-Phe-NH2, H-Tyr-Glu-Tyr-NH2, H-Tyr-Asp-Phe-NH2, H-Tyr-Asp-Tyr-NH2, H-Tyr-Pro-Phe-NH2, H-Tyr-Lys-Phe-NH2, H-Tyr-His-Phe-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Arg-Phe-NH2> benciloxicarbonil-Tyr-Arg-Tyr-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Glu-Phe-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Glu-Tyr-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Asp-Phe-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Asp-Tyr-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Pro-Phe-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Lys-Phe-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-His-Phe-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 60], bencilox¡carbonil-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 61], bencilox¡carbonil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 62], benciloxicarbonil-Tyr-Arg-Phe-NH2 benciloxicarbonil-Tyr-Glu-Phe-NH2, benciloxicarbonil-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, benciloxicarbonil-(N-metil)Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, benciloxicarbonil-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-Phe-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-(N-metil)Glu-Phe-NH2, benciloxicarbonil-(N-metil)Tyr-Glu-Phe-NH2, acetil-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, acetil-(N-metil)Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, acetil-Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, acetil-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-Phe-NH2, acetil-Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, acetil-Tyr-(N-metil)Glu-Phe-NH2, acetil-(N-metil)Tyr-Glu-Phe-NH2, H-(N-metil)Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, H-(N-metil)Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, H-Tyr-(N-metil)Arg-(N-metil)Phe-NH2, H-(N-me1il)Tyr-(N-metil)Arg-Phe-NH2, H-Tyr-Glu-(N-metil)Phe-NH2, H-Tyr-(N-metil)Glu-Phe-NH2, H-(N-metil)Tyr-Glu-Phe-NH2, acetil-Tyr-Glu-(p-homo)Phe-NH2, acetil-Tyr-( -homo)Glu-Phe-NH2, acetil-(P-homo)Tyr-Glu-Phe-NH2, acetil-Tyr-Phe-NH2, acetil-Phe-Tyr-NH2, benciloxicarbonil-Tyr-Phe-NH2, benciloxicarbonil-Phe-Tyr-NH2, H-Tyr-Phe-NH2, H-Phe-Tyr-NH2, (3-metoxi-4-hidroxi-benzoil)-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 63], (3-metoxi-4-hidroxi-benzoil)-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 64], (3-metoxi-4-hidroxi- benzoil)-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 65], (3-metoxi-4-hidrox¡-benzoil)-Tyr-Arg-Phe-NH2, (3-metoxi-4-hidrox¡-benzoil)-Tyr-Glu-Phe-NH2, fluorenilmetilox¡carbon¡l-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 66], fluorenilmet¡lox¡carbon¡l-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 67], fluoren¡lmet¡lox¡carbon¡l-Tyr-Asp(OMe)-H¡s-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 68], fluoren¡lmetiloxicarbonil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 69], fluorenilmet¡lox¡carbon¡l-Tyr-Arg-Phe-NH2, fluorenilmetiloxicarbonil-Tyr-Glu-Phe-NH2, m¡r¡st¡l-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 70], miristil-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 71], m¡r¡st¡l-Tyr-Arg-Phe-NH2l miristil-Tyr-Glu-Phe-NH2, miristil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 72], acetil-Tyr-Glu-Arg-Phe-Gly-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 73], acetil-Tyr-Asp-His-Phe-Gly-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 74], acetil-Tyr-Arg-Phe-Gly-Tyr-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 75], acetil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-Gly-Tyr-Asp(OMe)-H¡s-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 76], benciloxicarbonil-Tyr-Glu-Arg-Phe-Gly-Tyr-Glu-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 77], benciloxicarbonil-Tyr-Asp-His-Phe-Gly-Tyr-Asp-His-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 78], benciloxicarbonil-Tyr-Arg-Phe-Gly-Tyr-Arg-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 79], benciloxicarbonil-Tyr-Asp(OMe)-His-Phe-Gly-Tyr-Asp(OMe)-H¡s-Phe-NH2 [SEQ ID NO: 80]. Compuesto A3 Ac-Tyr-bAla-Phe-NH2 Compuesto A6 Tyr-(ácido 6-am¡no-caproico)-Phe-NH2 Compuesto A7 Ac-Tyr-Tyr-NH2 Compuesto A8 Ac-Phe-Tyr-NH2 Compuesto A9 Ac-Phe-Arg-Phe-NH2 Compuesto B2 Ac-Tyr-Lys-Phe-NH2 Compuesto B13 Ac-Tyr-Pro-Phe-NH2 Compuesto B 6 Ac-Tyr-H¡s-Phe-NH2 Compuesto Hl L-3,3-difenil-alan¡na Compuesto H2 L-H-3-(4-pirid¡l)alan¡na Compuesto H3 L-H-4-h¡droxi-fen¡l-gl¡c¡na Compuesto H4 ácido L-2-amino-4-fenil-butírico Compuesto H5 L-fenil-glicina Compuesto H6 L-T-l-4-hidroxi-fenil-glicina Compuesto H7 L-homo-fenilalanina Compuesto H8 L-3-(2-furil)-alanina Compuesto H9 L-3-(4-quinol¡l)-alanina Compuesto H10 L-naftil-alanina Compuesto 1 1 Ac-Tyr-Arg-(N.-Me)Phe-NH2 Compuesto 12 Ac-Tyr-(N-Me)Arg-Phe-NH2 Compuesto 13 Ac-(N-Me)Tyr-Arg-Phe-NH2 Compuesto 14 Ac-(N-Me)Tyr-(N-Me)Arg-(N-Me)Phe Compuesto 15 Ac-(N-Me)Tyr-Arg-(N-Me)Phe Compuesto 01 Ac-Phe-Arg-Tyr-NH2 Compuesto 02 Ac-Phe-Arg-Phe-NH2 Compuesto 03 Ac-Tyr-Arg-Tyr-NH2 Compuesto 05 H-Phe-His-Tyr-NH2 Compuesto 07 H-Phe-H¡s-Phe-NH2 Compuesto 08 H-Phe-Arg-Tyr-NH2 Compuesto 09 H-Phe-Arg-Phe-NH2 Compuesto 010 H-Tyr-Arg-Tyr-NH2 Compuesto P1 Ácido 4-(hidroxil)-fenil-acético-Arg-3-fenil-etilamina Compuesto P2 Ácido 4-(hidroxil)-fenil-acético-His-3-fenil-etil-amina Compuesto P3 Ácido 4-(hidroxil)-fenil-acético-Glu-3 -fenil-etilamina Compuesto G1 Ciclo(Tyr-Arg-Phe) Compuesto G2 Ciclo(Phe-Arg-Tyr) Compuesto G3 Ciclo(Tyr-Phe) y Compuesto NI Nano-oros-Tyr-Arg-Phe-NH2

12. - Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un portador farmacéuticamente aceptable.

13. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque también comprende otro agente terapéutico o combinación de otros agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente quimioterapéutico antineoplásico, por ejemplo, talidomida, dexametasona, bortezomib, y lenalidomida, o un agente para tratar la anemia, por ejemplo eritropoyetina, o un agente para prevenir las fracturas de hueso, por ejemplo un bisfosfonato como pamidronato o ácido zoledrónico.

14. - El uso de un compuesto como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , o una composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 12 o en la reivindicación 13, en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un sujeto que necesite del mismo.

15. - El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde dicha enfermedad o trastorno es un cáncer en seres humanos que depende de NF-?? y/o Gadd45p para su sobrevivencia y/o crecimiento.

16. - El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde dicha enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno inflamatorio en un ser humano que depende de NF-?? y/o Gadd45p.

17. - El uso como se reclama en la reivindicación 14 o la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable después de medir la expresión y/o nivel de actividad de Gadd45p en células que se sospechan cancerosas o en células proinflamatorias en un sujeto.

18. - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , o la composición de conformidad con la reivindicación 12 o la reivindicación 3, para usarlos como un medicamento.

19. - El compuesto o composición de conformidad con la reivindicación 18, para usarlos en el tratamiento de un cáncer del cual se ha determinado previamente que exhibe niveles evaluados de expresión y/o actividad de Gadd45 o una enfermedad inflamatoria en un sujeto, tejido de dicho sujeto del que se ha determinado previamente que exhibe niveles evaluados de expresión y/o actividad de Gadd45p .

20.- El uso de un compuesto como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , o una composición como la que se reclama en en la reivindicación 12 o reivindicación 13 para la producción de un medicameno para el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto, el cual está caracterizado la atípica expresión y/o actividad de Gadd45p aumentada y/o caracterizado por la activación atípica de la ruta de NF-?? y que es susceptible de ser tratado por la inducción de muerte celular programada por la inhibición de la actividad de Gadd45 ß.

21.- El uso como se reclama en la reivindicación 20, en donde dicha enfermedad o trastorno es mieloma múltiple.

22. - El uso como se reclama en la reivindicación 20, en donde dicha enfermedad o trastono es linfoma de Burkitt.

23. - El uso como se reclama en la reivindicación 20, en donde dicha enfermedad o trastrono es leucemia promonocítica.

24. - El uso como se reclama en la reivindicación 20, en donde dicha enfermedad o trastorno es linfoma de célula B grandes difusas.

25. - El uso como se reclama en la reivindicación 20, 21 , 22, 23 o 24, en donde se determinó previamente que dicho sujeto padece un cáner que exhibe niveles elevados de actividad y/o expresión de Gad45p.