BR112012010272A2 - métodos de aumento da eficiência de fermentação de um micro-organismo, in vitro para aumento do crescimento de um ou mais micro-organismos probióticos, para aumento do crescimento de um micro-organismo em uma amostra de teste de diagnóstico e de inibição de atividade microbiana ex vivo, e uso de metilsulfonilmetano (msm) - Google Patents

métodos de aumento da eficiência de fermentação de um micro-organismo, in vitro para aumento do crescimento de um ou mais micro-organismos probióticos, para aumento do crescimento de um micro-organismo em uma amostra de teste de diagnóstico e de inibição de atividade microbiana ex vivo, e uso de metilsulfonilmetano (msm) Download PDF

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Abstract

uso de mentilsulfonilmetano (msm) para modular atividade microbiana. a presente invenção refere-se a métodos de uso de metilsulfonimetano (msm) para modular atividade microbiana, tal como aumentar ou inibir a atividade de micro-organismos, em um exemplo, msm (tal como cerca de 0,5% a 5% de msm) é usado para aumentar a eficiência de fermentação, tal como aumentar a eficiência de fermentação associada com a produção de cerveja, cidra, vinho, um biocombustível, produto laticínio ou qualquer combinação dos mesmos. são também descritos métodos in vitro para aumento do crescimento de um ou mais micro-organismos probióticos e métodos de aumento do crescimento de um micro-organismo e uma amostra de tesde diagnóstico. métodos de inibição de atividade microbiana são também descritos. em um exemplo, particular, um método de inibição de atividade microbiana inclui seleção de um meio que é suscetível á contaminação por vírus da gripe h1n1; e contato do meio com msm em uma concentração cerca de 10% a cerca de 16% de peso em volume, desta maneira inibindo atividade microbiana do vírus da gripe h1n1.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS DE AUMENTO DA EFICIÊNCIA DE FERMENTAÇÃO DE UM MICROORGANISMO, IN VITRO PARA AUMENTO DO CRESCIMENTO DE UM OU MAIS MICRO-ORGANISMOS PROBIÓTICOS, PARA AUMENTO DO CRESCIMENTO DE UM MICRO-ORGANISMO EM UMA AMOSTRA DE TESTE DE DIAGNÓSTICO E DE INIBIÇÃO DE ATIVIDADE MICROBIANA EX VIVO, E USO DE METILSULFONILMETANO (MSM).
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
O presente pedido reivindica prioridade dos Pedidos de Patente Provisórios U.S. No. 61//257,751 depositado em 3 de novembro de 2009, No. 61/259.098 depositado em 6 de novembro de 2009, No. 61/294.437 depositado em 12 de janeiro de 2010 e No. 61/256.935 depositado de 30 de outubro de 2009, cada um deles aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao campo de metilsulfonilmetano (MSM), especial mente a métodos de uso de MSM para modificar atividade biológica, tal como aumentar ou inibir atividade microbiana incluindo crescimento bacteriano.
ANTECEDENTES
Microorganismo (ou micróbios) são organismos microscópicos que incluem bactérias, fungos, arqueas, protistas, plantas (por exemplo, algas verdes), vírus, príons, parasitas e animais tais como amebas, plankton. Dependendo do contexto, os micro-organismos podem ser vistos ou como prejudiciais ou benéficos. Em alguns casos, os micro-organismos podem ser prejudiciais e levar a males e doença em plantas, animais ou humanos. Além disso, em adição a causar infecções ou doenças, crescimento microbiano indesejado pode também ocorrer em produtos de consumo, tal como contaminação de alimento. Em outros casos, crescimento de micro-organismo é benéfico e é rotineiramente explorado em biotecnologia, tecnologias de diagnóstico modernas, em processos químicos (por exemplo, fermentação), em preparação de alimento e bebida, em aplicações ambiental e industrial e na manutenção e/ou promoção de saúde humana.
SUMÁRIO
São descritos aqui métodos de modulação da atividade de micro-organismo com MSM. MSM é um composto organoenxofre com a fórmu2/247 la (CH3)2SO2. Em particular, é descrita aqui a surpreendente capacidade de MSM em aumentar ou inibir atividade de micro-organismo, tal como crescimento ou sobrevivência de micro-organismo, dependendo da concentração de MSM provida ao micro-organismo (por exemplo, no meio onde o orga5 nismo é criado). MSM em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 5% em peso de meio ou em peso de teor de umidade do meio aumenta a atividade microbiana enquanto MSM em uma concentração de cerca de 6% a cerca de 17% em peso de meio ou em peso de teor de umidade do meio inibe a atividade microbiana.
É descrita aqui a surpreendente constatação que MSM pode ambos inibir e aumentar a atividade microbiana, dependendo da concentração de MSM. Por exemplo, concentrações de MSM entre cerca de 6 e cerca de 17 por cento em peso de meio (ou de teor de umidade do meio) inibem a atividade microbiana através da redução ou de outra maneira impactando o , 15 crescimento, taxa de sobrevivência (por exemplo, causando ou promovendo a deterioração ou morte celular, tal como morte de célula programada), metabolismo, reprodução (por exemplo, expressão de gene, expressão de proteína, transdução de sinal, transcrição, tradução, dobra de proteína, etc), proliferação, vitalidade, robustez, ação e/ou função do micro-organismo. Em contraste, concentrações de MSM entre cerca de 0,04% a cerca de 5% em peso aumentam a atividade microbiana, incluindo aumento da eficiência de fermentação microbiana, crescimento microbiano e/ou eficiência de cultura.
Desta maneira, são descritos aqui métodos de uso de MSM para modular atividade microbiana, tal como aumentar ou inibir a atividade de mi25 crorganismos.
Em algumas modalidades, um método de aumento da eficiência de fermentação de um micro-organismo é descrito. Por exemplo, o método inclui contato do meio contendo um micro-organismo capaz de fermentação com MSM, onde o MSM é provido em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 5% em peso do meio ou em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 5% em peso do teor de umidade do meio, onde o MSM aumenta a eficiência de fermentação do micro-organismo comparado com a eficiência
3/247 de fermentação na ausência de MSM.
Em algumas modalidades, métodos in vitro para aumento do crescimento de um ou mais micro-organismos probióticos são descritos. Em alguns exemplos, o método compreende contato de um ou mais microorganismos probióticos com um meio capaz de apoiar crescimento de um ou mais microrganismos probióticos; e provisão de MSM ao meio em cerca de 0,4% a cerca de 5% em peso do meio ou em peso de um teor de umidade do meio desta maneira aumentando o crescimento dos um ou mais microorganismos in vitro comparado com o crescimento dos um ou mais microorganismos in vitro na ausência de MSM.
São também providos métodos para aumento do crescimento de um micro-organismo em uma amostra de teste de diagnóstico. Em alguns exemplos, o método compreende contato da amostra de teste de diagnóstico compreendendo um ou mais micro-organismos com um meio capaz de apoiar crescimento dos um ou mais micro-organismos; provisão de MSM ao meio em uma concentração de cerca de 0,4% a cerca de 5% em peso do meio ou em peso de um teor de umidade do meio, desta maneira aumentando o crescimento dos um ou mais micro-organismos na amostra de teste de diagnóstico comparado com crescimento de um ou mais micro-organismos na ausência de MSM.
São ainda descritos métodos de inibição da atividade microbiana. Em alguns exemplos, o método compreende seleção de um meio que é suscetível à contaminação por gripe H1N1; e contato do meio com MSM em uma concentração de cerca de 10% a cerca de 16% em peso em volume, desta maneira inibindo atividade microbiana da gripe H1N1.
O acima e outras características da invenção se tornarão mais aparentes a partir da descrição detalhada que segue de várias modalidades.
DESCRIÇÃO DETALHADA
I. Visão Geral de Várias Modalidades
É descrita aqui a surpreendente constatação que MSM pode ambos inibir e aumentar a atividade microbiana, dependendo da concentração de MSM. Por exemplo, concentrações de MSM entre cerca de 6 e cerca
4/247 de 17 por cento em peso de meio (ou de teor de umidade de meio) inibem a atividade microbiana através da redução ou de outra maneira impactando o crescimento, taxa de sobrevivência (por exemplo, causando ou promovendo deterioração ou morte celular, tal como morte celular programada), metabolismo, reprodução (por exemplo, expressão de gene, expressão de proteína, transdução de sinal, transcrição, tradução, dobra de proteína, etc), proliferação, vitalidade, robustez, ação e/ou função do micro-organismo. Em contraste, concentrações de MSM entre cerca de 0,04% a cerca de 5% em peso aumentam a atividade microbiana, incluindo aumento da eficiência de fermentação microbiana, crescimento microbiano e/ou eficiência de cultura.
Desta maneira, são descritos aqui métodos de uso de MSM para modular atividade microbiana, tal como aumentar ou inibir a atividade de micro-organismos.
Em algumas modalidades, um método de aumento da eficiência de fermentação de um micro-organismo é descrito. Por exemplo, o método inclui contado do meio contendo um micro-organismo capaz de fermentação com MSM, onde o MSM é provido em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 5% em peso do meio ou em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 5% em peso do teor de umidade do meio, onde o MSM aumenta a eficiência de fermentação do micro-organismo comparado com a eficiência de fermentação na ausência de MSM. Em alguns exemplos, aumento da eficiência de fermentação compreende um aumento de pelo menos 50% em produção de álcool, dióxido de carbono ou ácido na presença de MSM pelo micro-organismo comparado com produção de álcool ou ácido na ausência de MSM. Por exemplo, eficiência de fermentação alta compreende um aumento de pelo menos 50% em produção de etanol, metanol ou uma combinação dos mesmos comparado com produção de etanol, metanol ou uma combinação dos mesmos na ausência de MSM.
Em alguns exemplos, aumento da eficiência de fermentação compreende um aumento de pelo menos 50% em produção de dióxido de carbono na presença de MSM pelo micro-organismo comparado com produção de dióxido de carbono na ausência de MSM, o micro-organismo é leve
5/247 dura e o método de fermentação alta é para a produção de pão.
Em alguns exemplos, aumento de eficiência de fermentação compreende um aumento de pelo menos 50% em produção de ácido láctico na presença de MSM pelo micro-organismo comparado com a produção de ácido láctico na ausência de MSM e o método de aumento de fermentação é para a produção de um produto de laticínio.
Em algumas modalidades, o método de aumento de eficiência de fermentação é para a produção de cerveja, cidra, vinho, um biocombustível, pão, produto de laticínio ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos o micro-organismo é levedura e o método de aumento de fermentação é para a produção de cerveja. Em alguns exemplos, o microorganismo é alga e o método de aumento de fermentação é para a produção de biocombustível.
Em algumas modalidades, a concentração de MSM é cerca de 0,5%. Em alguns exemplos, o meio compreende uma concentração de cloreto de sódio de menos do que 5% de teor de umidade total.
São também descritos métodos in vitro para aumento do crescimento de um ou mais micro-organismos probióticos. Em algumas modalidades, o método compreende contato de um ou mais micro-organismos probióticos com um meio capaz de apoiar crescimento de um ou mais microorganismos probióticos; e provisão de MSM ao meio em cerca de 0,4% a cerca de 5% em peso do meio ou em peso de um teor de umidade do meio desta maneira aumentando o crescimento dos um ou mais micro-organismos in vitro comparado com crescimento dos um ou mais micro-organismos in vitro na ausência de MSM.
Em alguns exemplos, a concentração de MSM é cerca de 1% a cerca de 3% do peso do meio ou do teor de umidade do meio.
Em alguns exemplos, o um ou mais micro-organismos probióticos compreendem Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Bacillus coagulans, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacteruim bifidum ou qualquer combinação dos mesmos.
Em alguns exemplos, o meio compreende um produto contendo
6/247 probiótico, tal como leite, iogurte, iogurte de arroz, iogurte congelado, chocolate, queijo, cerveja, vinho, vinagre, chucrute ou qualquer combinação dos mesmos.
São também descritos métodos para aumento do crescimento de um micro-organismo em uma amostra de teste de diagnóstico. Em alguns exemplos, o método compreende contato da amostra de teste de diagnóstico compreendendo um ou mais micro-organismos com um meio capaz de apoiar crescimento do um ou mais micro-organismos; provisão de MSM ao meio em uma concentração de cerca de 0,4% a cerca de 5% em peso do meio ou em peso de um teor de umidade do meio, desta maneira aumentando o crescimento do um ou mais micro-organismos na amostra de teste de diagnóstico comparado com crescimento de um ou mais micro-organismos na ausência de MSM.
São ainda descritos métodos de inibição da atividade microbiana. Em alguns exemplos, o método compreende seleção de um meio que é suscetível à contaminação por gripe H1N1 e contato do meio com MSM em uma concentração de cerca de 10% a cerca de 16% de peso em volume, desta maneira inibindo a atividade microbiana da gripe H1N1. Em alguns exemplos, o meio compreende um fluido do corpo, um tecido do corpo ou uma superfície. Em alguns exemplos, contato do meio compreende pulverização ou esfregação do meio suscetível à contaminação microbiana com MSM. Em alguns exemplos, a superfície é uma superfície doméstica, leito, cobertas, equipamento ou superfície industrial, sangue, pele ou uma combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, MSM é provido em uma composição, onde a dita composição é livre de alvejante ou livre de álcool ou consiste essencialmente em água. Em alguns exemplos, o método compreende ainda esterilização do meio após adição do dito SMS. E alguns exemplos o meio é livre de conservantes. Em alguns exemplos o MSM inibe a atividade microbiana através da redução da taxa de crescimento de gripe H1N1 em pelo menos 50% comparado com a taxa de crescimento de gripe H1N1 na ausência de MSM.
II. Abreviações e Termos
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DMEM: Meio da Eagle modificado com da Dulbecco
DMSO: Sulfóxido de dimetila
DNA: Ácido desoxirribonucleico
ELISA: Ensaio imunoabsorvente ligado à enzima
IC50: Concentração inibidora 50
LAB: Bactérias do ácido láctico
MIC: Concentração inibidora mínima
MSM: Metilsulfonilmetano
PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida
PBS: Solução salina tamponada com fosfato
PDA: Ágar de dextrose de batata
SDS: Dodecil sulfato de sódio
TNTC: Muito grande para contar
TSB: Caldo de soja tríptico As explicações que seguem de termos e métodos são providas
para descrever melhor a presença invenção e orientar aqueles de habilidade comum na técnica na prática da presente invenção. As formas singulares um, uma e o, a referem-se a um ou mais de um, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Por exemplo, o termo compreendendo uma célula bacteriana inclui células bacterianas singulares ou plurais e é considerado equivalente à expressão compreendendo pelo menos uma célula bacteriana. O termo ou refere-se a um elemento único de elementos alternativos declarados ou uma combinação de dois ou mais elementos, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Conforme aqui usado, compreende significa inclui. Desta maneira, compreendendo A ou B significa incluindo A, B ou A e B, sem excluir elementos adicionais.
A menos que de outro modo explicado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que geralmente compreendido por um versado comum na técnica à qual a presente invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Os materiais, métodos e
8/247 exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser limitantes. Por exemplo, métodos convencionais bem conhecidos na técnica à qual a presente invenção pertence são descritos em várias referências gerais e mais específicas, incluindo, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (e Suplementos para 2000); Ausubel e outros, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4a ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; e Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; Loudon, Organic Chemistry, Quarta Edição, New York: Oxford University Press, 2002, pp. 360-361, 1084-1085; Smith e March, March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Quinta Edição, Wiley-lnterscience, 2001; ou Vogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Quarta Edição, New York: Longman, 1978.
Termos adicionais geralmente usados em genética molecular podem ser encontrados em Benjamin Lewin, Genes V publicado pela Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew e outros (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Termos adicionais geralmente usados em química podem ser encontrados em Loudon, Organic Chemistry, Quarta Edição, New York: Oxford University Press, 2002, pp. 360-361, 1084-1085; Smith e March, March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Quinta Ed., Wiley-lnterscience, 2001; ou Vogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Quarta Edição, New York: Longman, 1978.
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Administração: Prover ou dar um composto a um indivíduo, tal como MSM, através de qualquer via eficaz. Vias de administração exemplares incluem, mas não estão limitadas a, vias por injeção (tais como subcutânea, intramuscular, intradermal, intraperitoneal e intravenosa), oral, sublingual, retal, transdermal (tal como tópica), intranasal, vaginal e inalação. Um tipo particular de administração é tópica.
Patógeno bacteriano: Uma bactéria que causa doença (bactérias patogênicas). Exemplos de bactérias patogênicas para as quais MSM pode ser usado para modificar incluem sem limitação qualquer uma ou mais de (ou qualquer combinação de) Acinetobacter baumanii, Actinobacillus sp., Actinomycetes, Actinomyces sp. (tais como Actinomyces israelii e Actinomyces naeslundii), Aeromonas sp. (tais como Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sóbria (Aeromonas sóbria) e Aeromonas caviae), Anaplasma phagocytophilum, Alcaligenes xylosoxidans, Acinetobacter baumanii, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacillus sp. (tais como Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensise Bacillus stearothermophilus), Bacteroides sp. (tal como Bacteroides fragilis), Bartonella sp. (tais como Bartonella bacilliformis e Bartonella henselae), Bifidobacterium sp., Bordetella sp. (tais como Bordetella pertussis, Bordetella parapertussise Bordetella bronchiseptica), Borrelia sp. (tais como Borrelia recurrentise e Borrelia burgdorferi), Brucella sp. (tais como Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melintensis e Brucella suis), Burkholderia sp. (tais como Burkholderia pseudomallei e Burkholderia cepacia), Campylobacter sp. (tais como Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari e Campylobacter fetus), Capnocytophaga sp., Cardiobacterium hominis, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Citrobacter sp. Coxiella burnetii, Corynebacterium sp. (tais como Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium jeikeum e Corynebacterium), Clostridium sp. (tais como Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium botulinum e Clostridium tetani), Eikenella corrodens, Enterobacter sp. (tais como Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae e Escherichia coli, incluindo Escherichia coli oportunística, tais como E. coli ente
10/247 roxigênica, E. coli enteroinvasiva, E. coli enteropatogênica, E. coli entereohemorrágica, E. coli enteroagregativa e E. coli uropatogênica), Enterococcus sp. (tais como Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium), Ehrlichia sp. (tais como Ehrlichia chafeensia e Ehrlichia canis), Erysipelothrix rhusiopathiae, Eubacterium sp., Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Gardnerella vaginalis, Gemella morbillorum, Haemophilus sp. (tais como Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Haemophilus aegyptius, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus haemolyticus e Haemophilus parahaemolyticus, Helicobacter sp. (tais como Helicobacter pylori, Helicobacter cinaedi e Helicobacter fennelliae), Kingella kingii, Klebsiella sp. (tais como Klebsiella pneumoniae, Klebsiella granulomatis e Klebsiella oxytoca), Lactobacillus sp., Listeria monocytogenes, Leptospira interrogans, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Peptostreptococcus sp., Moraxella catarrhalis, Morganella sp., Mobiluncus sp., Micrococcus sp., Mycobacterium sp. (tais como Mycobacterium leprae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovise Mycobacterium marinum), Mycoplasm sp. (tais como Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominise Mycoplasma genitalium), Nocardia sp. (tais como Nocardia asteroides, Nocardia cyriacigeorgica e Nocardia brasiliensis), Neisseria sp. (tais como Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis), Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides. Prevotella sp., Porphyromonas sp., Prevotella melaninogenica, Proteus sp. (tais como Proteus vulgaris e Proteus mirabilis), Providencia sp. (tais como Providencia alcalifaciens, Providencia rettgeri e Providencia stuartii), Pseudomonas aeruginosa, Propionibacterium acnes, Rhodococcus equi, Rickettsia sp. (tais como Rickettsia rickettsii, Rickettsia akari e Rickettsia prowazekii), Orientia tsutsugamushi (antes: Rickettsia tsutsugamushi) e Rickettsia typhi), Rhodococcus sp., Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, Salmonella sp. (tais como Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella enteritidis, Salmonella cholerasuis e Salmonella typhimurium), Serratia sp. (tais como Serratia marcesans e Serratia liquifaciens), Shigella sp. (tais como Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii e Shigella sonnet), Staphylococcus sp. (tais como Staphylococcus au
11/247 reus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hemolyticus, Staphylococcus saprophyticus), Streptococcus sp. (tais como Streptococcus pneumoniae (por exemplo, Streptococcus pneumoniae sorotipo 4 resistente a cloranfenicol, Streptococcus pneumoniae sorotipo 6B resistente à espectinomicina, Streptococcus pneumoniae sorotipo 9V resistente à estreptomicina, Streptococcus pneumoniae sorotipo 14 resistente à eritromicina, Streptococcus pneumoniae sorotipo 14 resistente à optoquina, Streptococcus pneumoniae sorotipo 18C resistente à rifampicina, Streptococcus pneumoniae sorotipo 19F resistente à tetraciclina,Streptococcus pneumoniae sorotipo 19F resistente à penicilina, Streptococcus pneumoniae sorotipo 23F resistente a trimetoprim, Streptococcus pneumoniae sorotipo 4 resistente a cloranfenicol, Streptococcus pneumoniae sorotipo 6B resistente à espectinomicina, Streptococcus pneumoniae sorotipo 9V resistente à estreptomicina, Streptococcus pneumoniae sorotipo 14 resistente à optoquina, Streptococcus pneumoniae sorotipo 18C resistente à rifampicina, Streptococcus pneumoniae sorotipo 19F resistente à penicilina ou Streptococcus pneumoniae sorotipo 23F resistente a trimetoprim), Streptococcus agalactiae, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, Grupo de streptococcus, Streptococcus pyogenes, Grupo B de streptococcus, Streptococcus agalactiae, Grupo C de streptococcus, Streptococcus anginosus, Streptococcus equismilis, Grupo D de streptococcus, Streptococcus bovis, Grupo F de streptococcus, e Streptococcus anginosus, Grupo G de streptococcus, Spirillum minus, Streptobacillus moniliformi, Treponema sp. (tais como Treponema carateum, Treponema petenue, Treponema pallidum e Treponema endemicum, Tropheryma whippelii, Ureaplasma urealyticum, Veillonella sp., Vibrio sp. (tais como Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Vibrio mimicus, Vibrio hollisae, Vibrio fluvialis, Vibrio metchnikovii, Vibrio damsela e Vibrio furnisii), Yersinia sp. (tais como Yersinia enterocoliticae e Yersinia pestis) e Xanthomonas maltophilia dentre outros.
Em algumas modalidades, MSM é usado para modificar, tal como aumentar ou diminuir, a atividade biológica de um ou mais dos organis12/247 mos listados acima.
Antibióticos beta-lactama: Uma Classe de agentes antibióticos contendo um núcleo de β-lactama em sua estrutura molecular. Exemplos incluem as famílias de antibióticos penicilina, cefalosporina, monobactama e carbapenema. Meticilina e Oxacilina são antibióticos Beta-lactama.
Atividade biológica: Uma expressão descrevendo os efeitos benéficos ou adversos de uma substância sobre matéria viva. Quando o agente é uma mistura química complexa, sua atividade é exercida pelo ingrediente ativo da substância ou farmacóforo, mas pode ser modificada por outros constituintes. Atividade é geralmente dependente da dosagem e não é incomum ter efeitos variando de benéficos a adversos para uma substância quando indo de doses baixas para altas. Em um exemplo, MSM altera, tal como aumenta ou diminui, a atividade biológica de um micro-organismo, tais como bactérias.
Biocombustível: Um combustível derivado de um produto metabólico de um organismo vivo. Ele é uma fonte de energia renovável, diferente de outros recursos naturais tais como petróleo, carvão e combustíveis nucleares. Um combustível biodiesel é um combustível processado equivalente a diesel derivado de fontes biológicas que pode ser usado em veículos de motor a diesel sem modificação. Biodieseis são atraentes para combustíveis, e alguns outros usos, porque eles têm uma pressão de vapor baixa, são não tóxicos, estáveis e não deterioram ou detonam quando sob aquecimento leve. Quimicamente, os biodieseis são geralmente definidos como mono alquil ésteres de ácidos graxos de cadeia longa derivados de fontes de lipídeo renováveis.
Alvejante: Uma solução de aproximadamente 3-6% de hipoclorito de sódio (NaCIO), e alvejante oxigênio, que contém peróxido de hidrogênio ou um composto de liberação de peróxido tal como perborato de sódio, percarbonato de sódio, persulfato de sódio, pirofosfato de tetrassódio ou peróxido de ureia junto com catalisadores e ativadores, por exemplo, tetraacetiletilenodiamina e/ou nonanoiloxibenzenossulfonato de sódio. Pó alvejante é hipoclorito de cálcio. Muitos alvejantes têm propriedades bactericidas fortes
13/247 e são usados para desinfecção e esterilização.
Condições que permitem produção: Quaisquer condições de fermentação ou cultura que permitam que o microrganismo cresça e/ou produza um produto desejado, tais como álcoois e dióxido de carbono ou ácidos orgânicos. Tais condições geralmente incluem faixas de temperatura, níveis de aeração e seleção de meio que, quando combinadas, permitem que o micro-organismo cresça. Meios exemplares incluem caldos ou géis. Para determinar se condições de cultura permitem produção de produto, o microorganismo pode ser culturado por 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48 ou 72 horas e uma amostra pode ser obtida e analisada. Por exemplo, as células na amostra ou no meio onde as células foram cultivadas podem ser testadas quanto à presença do produto desejado. Quando testando quanto à presença de um produto, ensaios podem ser usados, tais como aqueles providos aqui, incluindo aqueles apresentados nos Exemplos abaixo.
Contato: Colocação em associação física direta; incluindo em formas sólida, líquida e de gás. Contato inclui contato entre uma molécula e outra molécula. Contato pode ocorrer in vitro com células isoladas, tecido ou uma superfície sólida (tal como um artigo para casa ou superfície industrial) ou in vivo através da administração a um indivíduo.
Controle: Amostras que são acreditadas ser normais (por exemplo, atividade ou função representativa na ausência da variável sendo testada) bem como valores de laboratório, embora possivelmente arbitrariamente ajustados, tendo em mente que tais valores podem variar de laboratório para laboratório. Um grupo controle é praticamente idêntico ao grupo de tratamento, exceto pela variável única de interesse cujo efeito está sendo testado, que é apenas aplicada ao grupo de tratamento.
Cultura: Manutenção de uma célula em um meio que permite que o organismo continue a viver. Por exemplo, cultura inclui incubação de um micro-organismo em um meio de fermentação, tal como um caldo de fermentação ou gel de fermentação. Um versado comum na técnica vai compreender que o tempo, temperatura e outras condições físicas associadas com cultura vão depender do organismo sendo culturado e do resultado
14/247 desejado da cultura. Por exemplo, um micro-organismo que é culturado para produzir etanol pode ser posto em um caldo de fermentação contendo uma fonte de carboidrato, vários minerais e elementos em quantidades traço, bem como MSM e compostos úteis para indução da produção, incluindo menos do que 5% de NaCI.
Diminuição: Reduzir a qualidade, quantidade e resistência de alguma coisa. Em um exemplo, administração de MSM diminui ou reduz uma ou mais atividades biológicas, tais como crescimento, reprodução, proliferação, taxa de sobrevivência, metabolismo, vitalidade, robustez, ação e/ou função de micro-organismos em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 50% ou até mesmo 90%, incluindo entre 10% a 95%, 20% a 80%, 30% a 70%, 40% a 50%, tal como 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%. Por exemplo, administração de MSM diminui ou inibe crescimento bacteriano, por exemplo, em pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 4 vezes, comparado com um controle (tal como crescimento bacteriano na ausência de MSM ou um valor de referência conhecido ser representativo de crescimento bacteriano em um indivíduo afligido com uma infecção bacteriana). Tais diminuições podem ser medidas usando os métodos descritos aqui, bem como aqueles conhecidos de um versado comum na técnica. Em algumas modalidades, MSM é usado para inibir crescimento de micro-organismos específicos. Em outras modalidades, MSM é usado para inibir crescimento de uma ampla faixa de micro-organismos em certos meios ou produtos. Em algumas modalidades, reduções em escala log são realizadas após as primeiras 24 horas.
Sulfóxido de dimetila (DMSO): Sulfóxido de dimetila (DMSO), também conhecido como metilsulfinilmetano ou sulfóxido de metila, é um composto organoenxofre com a fórmula (CH3)SO. Este líquido incolor é um solvente aprótico polar que dissolve ambos os compostos polares e não polares e é miscível em uma ampla faixa de solventes orgânicos bem como água. Ele tem uma propriedade distinta de penetração na pele muito rapidamente, de maneira que uma pessoa pode senti-lo logo após ele ter entrado em contato com a pele. DMSO é também bem conhecido como um su
15/247 plemento nutricional e como um agente farmacêutico. Um versado na técnica relevante será familiar com seus usos. Vários graus de DMSO estão comercialmente disponíveis (por exemplo, produto No. 472301 da Sigma Aldrich, Corp., St. Louis, MO) e um versado na técnica será familiar com uma fonte de DMSO.
Realce ou aumento: Aumentar a qualidade, qualidade ou resistência de alguma coisa. Em um exemplo, MSM aumenta ou realça a atividade de um micro-organismo, por exemplo, com relação à atividade na ausência de MSM. Em um exemplo particular, MSM aumenta a atividade de um micro-organismo, tal como aumentando a taxa de crescimento, reprodução, proliferação, metabolismo, vitalidade, robustez, ação e/ou função de um micro-organismo em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 50%, ou até mesmo 90%, incluindo entre 10% a 95%, 20% a 80%, 30% a 70%, 40% a 50%, tal como 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 100%. Os termos atividade e crescimento são usados intercomutavelmente em alguns contextos. Em alguns exemplos, MSM é usado para aumentar o crescimento de micro-organismos específicos. Em outro exemplo, MSM é usado para aumentar o crescimento de uma ampla faixa de micro-organismos em certos meios ou produtos. Em alguns exemplos, aumento da atividade microbiana inclui aumento de produtos microbianos e metabolitos microbianos. Por exemplo, MSM aumenta ou realça a eficiência de fermentação ou eficiência de cultura tal como em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 50%, ou até mesmo em pelo menos 90%, incluindo entre 10% a 95%, 20% a 80%, 30% a 70%, 40% a 50%, tal como 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 100%. Tais aumentos podem ser medidos usando os métodos descritos aqui.
Fermentação: Um processo de derivação de energia a partir da oxidação de compostos orgânicos, tais como carboidratos, e uso de um aceitador de elétron endógeno, que é geralmente um composto orgânico. Durante a fermentação, piruvato é metabolizado para vários compostos diferentes. Fermentação homolática é a produção de ácido láctico a partir de piruvato; fermentação alcoólica é a conversão de piruvato em etanol e dióxido de car
16/247 bono; e fermentação heterolática é a produção de ácido láctico, bem como outros ácidos e álcoois. A fermentação não tem que ser necessariamente realizada em um ambiente anaeróbico. Por exemplo, mesmo na presença de oxigênio abundante, células de levedura preferem fermentação à fosforilação oxidativa, contanto que açúcares estejam prontamente disponíveis para consumo. Açúcares são um substrato comum de fermentação e exemplos típicos de produtos de fermentação são etanol, ácido láctico e hidrogênio. No entanto, compostos mais exóticos podem ser produzidos através de fermentação, tais como ácido butírico e acetona. Levedura realiza fermentação na produção de etanol em cervejas, vinhos e outras bebidas alcoólicas, junto com a produção de quantidades grandes de dióxido de carbono.
Caldo de fermentação: Qualquer meio que apoie a vida de micro-organismos (por exemplo, um micro-organismo que está ativamente metabolizando carbono). Um meio de fermentação geralmente contém uma fonte de carbono. A fonte de carbono pode ser qualquer coisa que possa ser utilizada, com ou sem enzimas adicionais, pelo micro-organismo para energia.
Eficiência de fermentação: Uma expressão de quanto produto de fermentação, tal como álcool, ácido láctico, micro-organismos ou outro produto de fermentação desejado, foi produzido com relação a um controle (tal como na ausência de MSM) ou a uma quantidade que poderia ser teoricamente produzida.
Meios de fermentação: Qualquer substância usada para culturar células, tais como células de mamífero e micro-organismos. Meios de fermentação incluem qualquer meio de crescimento (por exemplo, caldo ou gel) que apoie a vida de micro-organismo (por exemplo, um micro-organismo que está metabolizando carbono ativamente). Um meio de fermentação geralmente contém uma fonte de carbono, tais como glicose, xilose, material celulósico e similar. A fonte de carbono pode ser qualquer coisa que possa ser utilizada, com ou sem enzimas adicionais, pelo micro-organismo para energia.
Patógeno fúngico: Um fungo que causa doença. Exemplos de
17/247 patógenos fúngicos para os quais MSM pode ser usado para modificar incluem sem limitação qualquer um ou mais de (ou qualquer combinação de) Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, Pityrosporum orbiculare (Malassezia furfur), Candida sp. (tai como Candida albicans), Aspergillus sp. (tal como Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, Aspergillus versicolor e Aspergillus clavatus), Cryptococcus sp. (tais como Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Cryptococcus laurentii e Cryptococcus albidus), Coccidioides sp., Histoplasma sp. (tai como Histoplasma capsulatum), Pneumocystis sp. (tai como Pneumocystis jirovecii), Stachybotrys sp. (tai como Stachybotrys chartarum), Paracoccidioides, Blastomyce, Fusarium, Sporothrix, Trichosporon, Rhizopus, Pseudallescheria, Paecilomyces, Alternaria, Curvularia, Exophiala, Wangiella, Penicillium e Cephalosphorium. Em algumas modalidades, MSM é administrado para inibir ou prevenir uma infecção ou distúrbio associado com um ou mais dos patógenos fúngicos mencionados acima.
Incubação: Um termo que inclui uma quantidade suficiente de tempo para um agente, tal como MSM, interagir com uma célula ou tecido.
Dispositivo inalante: Um dispositivo capaz de aplicar uma composição a um indivíduo, por exemplo, ao tecido pulmonar de um indivíduo. Por exemplo, um dispositivo inalante pode ser um inalador, um nebulizador ou um ventilador. Dispositivos inalantes descritos aqui são construídos a partir de um material adaptado para contato de DMSO e/ou MSM. Em algumas modalidades, um dispositivo inalante é descartável ou substituível. Dispositivos inalantes descritos aqui são configurados para aplicar uma composição contendo DMSO ou MSM para contatar diretamente patógenos bacterianos no tecido pulmonar de um indivíduo. Dispositivos inalantes são configurados para gerar partículas de uma composição que variam em tamanho. Em algumas modalidades, um dispositivo inalante é configurado para gerar partículas de uma composição que varia em tamanho de a partir de cerca de 0,1 pm a cerca de 10 pm ou de a partir de cerca de 0,5 pm a cerca de 5 pm.
Inibição de atividade microbiana ou Inibição de uma Infecção ou
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Doença: A expressão inibição de atividade microbiana refere-se à redução da taxa de crescimento, reprodução, proliferação, sobrevivência, metabolismo, vitalidade, robustez, ação e/ou função de micro-organismos. A expressão inibição ou tratamento de uma infecção, doença ou condição refere-se à prevenção ou redução do desenvolvimento integral de uma infecção, doença ou condição, por exemplo, em um indivíduo que está sob risco de desenvolver uma infecção, tal como uma infecção bacteriana. Tratamento refere-se a uma intervenção terapêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica após ela ter começado a se desenvolver. Conforme aqui usado, o termo melhora, com referência a uma doença, condição patológica ou sintoma, refere-se a qualquer efeito benéfico observável do tratamento. O efeito benéfico pode ser evidenciado, por exemplo, por um início retardado de sintomas clínicos da infecção/doença em um indivíduo suscetível, uma redução em severidade de alguns ou todos os sintomas clínicos da infecção/doença, uma progressão mais lenta da infecção/doença, uma redução no número de relapsos da infecção/doença, uma melhora na saúde geral ou bem-estar do indivíduo ou por outros parâmetros bem conhecidos na técnica que são específicos para a infecção/doença particular, tal como uma infecção bacteriana particular.
Meio ou meios: Um ambiente contendo ou adequado para apoiar micro-organismos incluindo, mas não limitado a, caldos, ágar, culturas, alimentos, bebidas, suspensões celulares, tecido biológico, fluidos biológicos, superfícies inorgânicas, superfícies orgânicas, substratos, células vivas, células hospedeiro, ensaios de diagnóstico e outros ambientes sólidos, líquidos, de matriz, gelatinosos ou gasosos.
Metilsulfonilmetano (MSM): Um composto organoenxofre com a fórmula (CH3)2SO2. MSM tem sido largamente comercializado e vendido como um suplemento alimentar. MSM é também conhecido como DMSO2, Dimetil sulfona ou metil sulfona.
MSM é estruturalmente relacionado a sulfóxido de dimetila (DMSO), mas o comportamento desses dois é diferente. DMSO é um solvente altamente polar e um excelente ligante, com propriedades de dissolução tipo
19/247 água enquanto MSM é menos polar e menos reativo. MSM é também um metabolito de DMSO. MSM tem a estrutura química que segue:
o
Microorganismo: Um membro da espécie microbiana procariótica ou eucariótica dos domínios Archae, Bacteria e Eucarya, a última incluindo levedura e fungos filamentosos, protozoários, algas ou Protista superior. Os termos célula microbiana e micróbios são usados intercomutavelmente com o termo micro-organismo. Micróbios podem incluir organismos do tipo selvagem, geneticamente engenheirados ou modificados. Os microorganismos incluem vírus, príons, parasitas, fungos, mofo, levedura e bactérias.
Em algumas modalidades, MSM é usado para aumentar a atividade de um amplo espectro de micro-organismos incluindo, mas não limitado a, vírus, príons, parasitas, fungos, mofo, levedura, algas e bactérias. Em outras modalidades, MSM é usado para inibir a atividade de microorganismos incluindo, mas não limitado a, fungos, mofo, levedura, bactérias e vírus.
Modular ou modulação: Ajustar, alterar, regular uma atividade, um grau ou taxa tal como incluindo um aumento ou uma diminuição em atividade biológica de uma molécula. Em um exemplo, MSM é administrado para modular, ou aumentar ou diminuir a atividade microbiana, tal como crescimento bacteriano.
Parasita: Um organismo que vive dentro de humanos e outros organismos agindo como hospedeiros (para o parasita). Os parasitas são dependentes de seus hospedeiros por pelo menos parte de seu ciclo de vida. Os parasitas são prejudiciais a humanos porque eles consomem alimento necessário, comem tecidos e células do corpo e eliminam refugo tóxico, que torna a pessoa doente. Exemplos de patógenos fúngicos para uso de
20/247 acordo com os métodos e composições descritos incluem, sem limitação, qualquer um ou mais de (ou qualquer combinação de) Malária (Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae), Esquistossomas, Tripanossomas, Leishmania, nematoides Filariais, Tricomoníase, Sarcosporidíase, Tênia (T. saginata, T. solium), Leishmania, Toxoplasma gondii, Triquinelose (Trichinella spiralis) ou Cocidiose (Eimeria species). MSM pode ser usado para inibir ou prevenir atividade de um ou mais dos organismos listados acima.
Composição farmacêutica: Um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico ou profilático desejado quando apropriadamente administrado a um indivíduo. Uma composição farmacêutica pode incluir um agente terapêutico, um agente de diagnóstico ou um agente farmacêutico. Um agente terapêutico ou farmacêutico é um que sozinho ou junto com um composto adicional induz a resposta desejada (tal como indução de um efeito terapêutico ou profilático quando administrado a um indivíduo). Em um exemplo particular, um agente farmacêutico é um agente que reduz significantemente um ou mais sintomas associados com uma infecção, tal como uma infecção bacteriana ou viral. Em algumas modalidades, um agente terapêutico é um agente antibiótico, tal como meticilina ou oxacilina.
Carreadores ou Veículos Farmaceuticamente Aceitáveis: Os carteadores farmaceuticamente aceitáveis (veículos) úteis na presente invenção são convencionais. Remington’s Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19a Edição (1995), descreve composições e composições adequadas para aplicação farmacêutica de um ou mais compostos terapêuticos ou moléculas, tais como um ou mais peptídeos providos aqui. Em geral, a natureza do carteador vai depender do modo de administração particular sendo empregado. Por exemplo, a composição parenteral geralmente compreende fluidos injetáveis que incluem fluidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis tais como água, solução salina fisiológica, soluções salinas equilibradas, dextrose aquosa, glicerol ou similar como um veículo. Em uma modalidade particular o carteador é um que permite que o composto terapêutico cruze a barreira sangue-cérebro.
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Para composições sólidas (por exemplo, para formas de pó, pílula, comprimido ou cápsula), carreadores sólidos não tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Em adição a carreadores biologicamente neutros, as composições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidades pequenas de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes e agentes de tamponamento de pH e similar, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato sorbitano.
Prebiótico: Um ingrediente alimentício não digerível que estimula crescimento e/ou atividade de bactérias no trato digestivo que são benéficas para a saúde do corpo. Tipicamente, os prebióticos são carboidratos (tais como oligossacarídeos); no entanto, não carboidratos são também fontes de tais ingredientes. Prebióticos podem ser prebióticos de cadeia curta, cadeia longa e/ou espectro amplo. Prebióticos de cadeia curta (tal como oligofrutose) contêm 2-8 ligações por molécula de sacarídeo, são tipicamente fermentados mais rapidamente no lado direito do colo provendo alimento para as bactérias nesta área. Prebióticos de cadeia longa (tal como inulina) contêm 9-64 ligações por molécula de sacarídeo e tendem a ser fermentados mais lentamente, alimentando bactérias predominantemente no lado esquerdo do colo. Prebióticos de amplo espectro proveem uma faixa ampla de comprimentos de ligação molecular de 2-64 ligações por molécula e alimentam bactérias em todo o colo (tal como inulina enriquecida em oligofrutose, OEI). Em alguns exemplos, um prebiótico aumenta o número e/ou atividade de bifidobactérias e bactérias do ácido láctico. Bifidobactérias e bactérias do ácido láctico (lactobacillus ou LABs) são bactérias que melhoram a digestão (incluindo aumento da absorção mineral) e a eficácia e a resistência intrínseca do sistema imune. Um produto que estimula bifidobactéria, tal como MSM, é considerado um fator bifidogênico. Fontes de dieta tradicionais de prebióticos incluem sojas, fontes de inulina (tais como alcachofra Jerusalem, jicama e raiz de chicória), aveias selvagens, trigo não refinado, cevada não refinada, alho, alho-poró, cebola, aspargo, banana e yacon. Oligossacarídeos prebióticos são cada vez mais adicionados a alimentos pelos seus be
22/247 nefícios à saúde. Alguns oligossacarídeos que são usados desta maneira são frutooligossacarídeos (FOS), xilooligossacarídeos (XOS), polidextrose e galactooligossacarídeos (GOS). Alguns monossacarídeos tal como tagatose são também usados algumas vezes como probióticos. Conforme aqui usado, MSM é um prebiótico.
Probiótico: Um micro-organismo que confere um benefício de saúde ao hospedeiro incluindo, mas não limitado a, conferir proteção de ou tratamento de doença ou efeitos indesejados. Probióticos podem conferir benefícios de saúde a um produto, tal como aumentando a qualidade nutricional de produtos comestíveis. Probióticos incluem bactérias benéficas, tais como bactérias do ácido láctico (tais como Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei e Lactobacillus johnsonii) e bifidobactérias (tal como Lactobacillus bifidus) que são o tipo mais comum de micróbios usados como probióticos; mas certas leveduras e bacilos podem ser também probióticos. Probióticos são geralmente consumidos como parte de alimentos fermentados; tal como em iogurte, produtos de soja ou como suplementos de dieta. Culturas probióticas vivas estão disponíveis em produtos laticínios fermentados e alimentos fortificados com probióticos. No entanto, comprimidos, cápsulas, pós e sachês contendo as bactérias em forma seca por congelamento estão também disponíveis. Linhagens de probióticos exemplares incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus coagulans GBI-30, 6086 (Ganeden Biotech), Bifidobacterium LAFTI® B94 (Institut-RosellLallemand), Lactobacillus acidophilus LAFTI® L10 (Institut-Rosell-Lallemand), Lactobacillus casei LAFTI® L26 (Institut-Rosell-Lallemand), Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12, Bifidobacterium breve (Yakult), Bifidobacterium infantis 35624 (Procter & Gamble), Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 (Danisco), Bifidobacterium longum BB536 (Morinaga Milk Industry), Lactobacillus acidophilus DDS-1 (Nebraska Cultures), Lactobacillus acidophilus LA-5, Lactobacillus acidophilus NCFM (Danisco), Lactobacillus casei DN114-001 (Danone), Lactobacillus casei 431, Lactobacillus casei F19 (Aria Foods), Lactobacillus casei (Yakult), Lactobacillus paracasei St11 (or NCC2461, Nestlé), Lactobacillus johnsonii La1 (Lactobacillus LC1, Lactoba
23/247 cillus johnsonii NCC533, Nestlé), Lactococcus lactis L1A (Norrmejerier), Lactobacillus plantarum 299v (Probi), Lactobacillus reuteri ATTC 55730 (Lactobacillus reuteri SD2112, BioGaia Biologies), Lactobacillus rhamnosus ATCC 53013 (Valio), Lactobacillus rhamnosus LB21 (Norrmejerier), Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus gasseri PA16/8, Bifidobacterium bifidum MF20/5, Bifidobacterium longum SP07/3, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium longum Rosell-175, Lactococcus lactis Rosell-1058, Bifidobacterium breve Rosell-70, Lactobacillus rhamnosus Rosell-11, Lactobacillus acidophilus Rosel 1-52, Bifidobacterium bifidum rosell-71, Bacillus subtilis var natto, Lactobacillus paracasei, Enterococcus faecium, Bifidobacterium animalis, Lactobacillus delbrueckii eSaccharomyces cerevisiae.
Quantificação: Determinação ou medição da quantidade (tal como uma quantidade relativa) de uma molécula ou da atividade de uma molécula, tal como a quantidade de analito presente em uma amostra.
Célula-tronco: Uma célula que tem a habilidade de autorreplicação indefinidamente e que, sob as condições certas, ou dados os sinais certos, pode diferenciar em alguns ou todos os tipos de célula diferentes que formam um organismo. Células-tronco têm o potencial de se desenvolver em células diferenciadas, maduras, tais como células cardíacas, células de pele ou células nervosas. O ovo fertilizado é uma célula-tronco porque ele tem o potencial de gerar todas as células e tecidos e formar um embrião e que apoia seu desenvolvimento no útero. Mamíferos adultos incluem mais de 200 tipos de células, por exemplo, neurônios, miócitos, células epiteliais, eritrócitos, monócitos, linfócitos, osteócitos e condrócitos. Outras células que são essenciais para desenvolvimento embriônico, mas que não são incorporadas ao corpo do embrião, incluem tecidos extraembriônicos, placenta e cordão umbilical. Todas essas células são geradas a partir de um único ovo fertilizado.
Células pluripotentes podem dar origem a células derivadas de todas as três camadas de germe embriônicas - mesoderma, endoderma e ectoderma. Desta maneira, células pluripotentes têm o potencial de dar origem a qualquer tipo de célula. Células-tronco onipotentes são capazes de
24/247 diferenciar junto com apenas uma linhagem. Células-tronco embriônicas são células pluripotentes derivadas do blastócito. Células-tronco adultas são células não diferenciadas encontradas em um tecido diferenciado que podem replicar e se tornar especializadas para render todos os tipos de célula especializados do tecido do qual ela é originada. Células-tronco adultas são capazes de autorrenovação durante o tempo de vida do organismo. Fontes de células-tronco adultas foram encontradas em medula óssea, corrente sanguínea, córnea, retina, polpa dental, fígado, pele, trato gastrintestinal e pâncreas. MSM é usado aqui para aumentar a eficiência de cultura, estabilidade e/ou viabilidade de células-tronco.
Esterilização: Um processo que elimina (remove) ou mata todas as formas de vida, incluindo agentes transmissíveis (tais como fungos, bactérias, vírus, formas de esporo, etc) presentes em uma superfície, contidos em um fluido, em medicação ou em um composto tal como meios de cultura biológica. A esterilização pode também ser conseguida através de métodos conhecidos de um versado comum na técnica, incluindo através da aplicação das combinações apropriadas de calor, agentes químicos, irradiação, pressão alta e filtragem.
Indivíduo: Organismos vertebrados multicelulares vivos, uma categoria que inclui mamíferos humanos e não humanos.
Sintoma e sinal: Qualquer evidência subjetiva de doença ou da condição de um indivíduo, por exemplo, tal evidência conforme percebido pelo indivíduo; uma mudança notável na condição de um indivíduo indicativa de algum estado corporal ou mental. Um sinal é qualquer anormalidade indicativa de doença, passível de ser descoberta com exame ou avaliação de um indivíduo. Um sinal é geralmente uma indicação objetiva de doença. Sinais incluem, mas não estão limitados a, quaisquer parâmetros mensuráveis tais como testes para detecção de um distúrbio ou doença, tal como uma infecção bacteriana ou viral. Em um exemplo, redução ou inibição de um ou mais sintomas ou sinais associados com uma infecção bacteriana ou viraJ inclui redução ou inibição de crescimento bacteriano ou infecção viral em uma quantidade desejada, por exemplo, em pelo menos 20%, pelo me
25/247 nos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou até mesmo pelo menos 100%, comparado com o crescimento bacteriano ou infectividade viral na ausência de MSM.
Quantidade ou concentração terapeuticamente eficaz: Uma quantidade de uma composição que sozinha, ou junto com um agente(s) terapêutico(s) adicional(ais), é suficiente para obter um efeito desejado em um indivíduo, ou em uma célula, sendo tratado com o agente. A quantidade eficaz do agente será dependente de vários fatores incluindo o, mas não limitado ao, indivíduo ou células sendo tratados, e a maneira de administração da composição terapêutica. Em um exemplo, uma quantidade ou concentração terapeuticamente eficaz é uma que é suficiente para prevenir avanço, retardar progressão ou causar regressão de uma doença ou que é capaz de reduzir sintomas causados por uma condição ou doença.
Em um exemplo, um efeito desejado é reduzir ou inibir um ou mais sintomas associados com a doença. Os um ou mais sintomas não têm que ser completamente eliminados para composição ser eficaz. Por exemplo, uma composição pode diminuir o sinal ou sintoma em uma quantidade desejada, por exemplo, em pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou até mesmo pelo menos 100%, comparado com o sinal ou sintoma na ausência de MSM. Em um exemplo particular, uma resposta desejada é reduzir ou inibir atividade de micro-organismo (tal como crescimento bacteriano) em uma quantidade desejada, por exemplo, em pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou até mesmo pelo menos 100%, comparado com a atividade do micro-organismo na ausência de MSM.
Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica descrita pode ser administrada em uma dose única, ou em várias doses, por exemplo, diariamente, durante o curso do tratamento. No entanto, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode depender do indivíduo sendo tratado, da severidade e do tipo da condição sendo tratada, e da ma
26/247 neira de administração. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de urn agente pode ser medida como a concentração (moles por litro ou molar-M) do agente em sangue (in vivo) ou um tampão (in vitro) que produz o(s) efeito(s) desejado(s). Alternativamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente pode ser medida como a quantidade administrada a um indivíduo por peso do corpo do indivíduo, por exemplo, mg de agente/kg de peso do corpo.
Célula não tratada: Uma célula que não foi contatada com um agente desejado, tal como MSM. Em um exemplo, uma célula não tratada é uma célula que recebe o veículo onde MSM foi aplicado.
Vírus: Um organismo infeccioso microscópico que se reproduz dentro de células vivas. Um vírus consiste essencialmente em um núcleo de ácido nucleico circundado por um revestimento de proteína e tem a habilidade em replicar apenas dentro de uma célula viva. Replicação viral” é a produção de vírus adicional através da ocorrência de pelo menos um ciclo de vida viral. Um vírus pode subverter as funções normais da célula hospedeiro, fazendo com que a célula se comporte de uma maneira determinada pelo vírus. Por exemplo, uma infecção viral pode resultar em uma produção celular de uma citocina, ou respondendo a uma citocina, quando a célula não infectada não o faz normalmente. Em alguns exemplos, um vírus é um patógeno.
Exemplos específicos de patógenos virais que podem ser tratados de acordo com os métodos e composições descritos incluem, sem limitação, qualquer um ou mais de (ou qualquer combinação de): Arenavirus (tais como vírus Guanarito, vírus de Lassa, vírus Junin, vírus Machupo e Sabia), Arterivírus, Ronivírus, Astrovírus, Buniavírus (tais como vírus da febre hemorrágica de Crimean-Congo e Hantavirus), Barnavírus, Birnavírus, Bornavírus (tal como o vírus da doença de Borna), Bromovírus, Calicivírus, Crisovírus, Coronavirus (tais como Coronavirus e SARS), Cistovírus, Closterovírus, Comovírus, Dicistrovírus, Flavírus (tais como Vírus da febre amarela, Vírus do Oeste do Nilo, vírus da Hepatite C vírus da Dengue), Filovírus (tais como vírus Ebola e vírus Marburg), Flexivírus, Hepevírus (tal como vírus da
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Hepatitis E), adenovirus humano (tal como adenovirus A-F humano), astrovirus humano, poliomavírus BK humano, bocavírus humano, coronavirus humano (tai como urn coronavirus humano HKU1, NL63 e OC43), enterovirus humano (tai como enterovirus A-D humano), eritrovírus V9 humano, virus espumoso humano, herpesvirus humano (tais como herpesvirus 1 humano (virus herpes simplex tipo 1), herpesvirus 2 humano (virus herpes simplex tipo 2), herpesvirus humano 3 (virus Varicella zoster), herpesvirus humano 4 tipo 1 (virus Epstein-Barr tipo 1), herpesvirus humano 4 tipo 2 (vírus EpsteinBarr tipo 2), herpesvirus humano 5 linhagem AD169, herpesvirus humano 5 linhagem Merlin Strain, herpesvirus humano 6A, herpesvirus humano 6B, herpesvirus humano 7, herpesvirus humano 8 tipo M, herpesvirus humano 8 tipo P e Citomegalovírus Humano), vírus da imunodeficiência humana (HIV) (tais como HIV 1 e HIV 2), metapneumovírus humano, papilomavírus humano (tais como papillomavírus-1 humano, papillomavírus-18 humano, papillomavírus-2 humano, papillomavírus-54 humano, papillomavírus-61 humano, papillomavírus-cand90 humano, papilomavírus humano RTRX7, humano papilomavírus tipo 10, papilomavírus humano tipo 101, papilomavírus humano tipo 103, papilomavírus humano tipo 107, papilomavírus humano tipo 16, papilomavírus humano tipo 24, papilomavírus humano tipo 26, papilomavírus humano tipo 32, papilomavírus humano tipo 34, papilomavírus humano tipo 4, papilomavírus humano tipo 41, papilomavírus humano tipo 48, papilomavírus humano tipo 49, papilomavírus humano tipo 5, papilomavírus humano tipo 50, papilomavírus humano tipo 53, papilomavírus humano tipo 60, papilomavírus humano tipo 63, papilomavírus humano tipo 6b, papilomavírus humano tipo 7, papilomavírus humano tipo 71, papilomavírus humano tipo 9, papilomavírus humano tipo 92 e papilomavírus humano tipo 96), vírus da parainfluenza humano (tal como vírus da parainfluenza humano 1-3), parechovírus humano, parvovirus humano (tal como parvovirus humano 4 e parvovirus humano B19), vírus sincicial respiratório humano, rinovírus humano (tais como rinovírus A humano e rinovírus B humano), espumarretrovírus humano, vírus humano T-linfotrópico (tais como vírus T-linfotrópico humano 1 e vírus T-linfotrópico 2 humano), Polioma vírus humano, Hipovírus, Leviví
28/247 rus, Luteovírus, Vírus da coriomeningite linfocítica C (LCM), Marnavírus, Narnavírus, Nidovirales, Nodavírus, Ortomixovírus (tal como vírus Influenza), Partitivírus, Paramixovírus (tais como vírus do Sarampo e vírus da Cachumba), Picornavírus (tal como Poliovirus, o vírus do resfriado comum e vírus da Hepatite A), Potivírus, Poxivírus (tais como Varíola e Varíola bovina), Sequivírus, Reovírus (tal como Rotavirus), Rabdovírus (tal como vírus da Raiva), Rabdovírus (tal como vírus da Estomatite vesicular, Tetravírus, Togavírus (tais como vírus da Rubéola e vírus do Rio Ross), Tombusvírus, Totivírus, Timovírus e Norovirus dentre outros.
Em algumas modalidades, MSM é usado para inibir uma atividade biológica de um ou mais dos vírus listados acima.
Levedura: Um micro-organismo eucariótico classificado no Reino Fungi, com cerca de 1,500 espécies descritas. A maioria se reproduz assexuadamente através de brotamento, embora alguns se reproduzam através de fissão binária. As leveduras são geralmente unicelulares, embora algumas espécies possam se tornar multicelulares através da formação de um cordão de células de brotamento conectadas conhecidas com pseudohyphae, ou hyphae falsa. Leveduras exemplares que podem ser usadas nos métodos e composições descritos incluem, mas não estão limitadas a, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe, Pichia, Cryptococcus, Zygosaccharomyces, Torulopsis, Hansenula e Debaryomyces.
III. Composições de MSM
São descritas aqui composições de MSM para uso em modulação de atividade microbiana, tal como aumento ou diminuição de atividade microbiana. Em algumas modalidades, uma composição de MSM para uso no aumento da atividade microbiana inclui cerca de 0,02% a cerca de 5% de MSM em peso do meio (tal como meio de cultura) ou em peso do teor de umidade do meio (tal como meio de cultura), tal como cerca de 0,04% a cerca de 4%, cerca de 1% a cerca de 3%, incluindo cerca de 0,02%, cerca de 0,03%, cerca de 0,04%, cerca de 0,05%, cerca de 0,06%, cerca de 0,07%, cerca de 0,08%, cerca de 0,09%, cerca de 0,1%, cerca de 3%, cerca de
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0,5%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 2,5%, cerca de 3%, cerca de 4% ou cerca de 5% do peso do meio ou do teor de umidade do meio. Em alguns exemplos, as porcentagens de MSM providas aqui são calculadas a partir da quantidade de um solvente polar, por exemplo, água em um produto. A título de exemplo, uma composição com MSM 5% em peso do meio conteria 5 gramas de MSM por 100 gramas ou meio ou uma composição de MSM 5% em peso do teor de umidade do meio conteria 5 gramas de MSM por 100 gramas ou o solvente polar no meio, excluindo sólidos.
Em algumas modalidades, a composição descrita inclui um meio capaz de apoiar crescimento de um micro-organismo, um micro-organismo e MSM. Em alguns exemplos, um meio inclui um ou mais dos que seguem: produtos contendo probióticos, produtos laticínios, leite, iogurte, iogurte de arroz, iogurte congelado, chocolate, queijo, bebidas fermentadas (tais como cerveja, cidra, vinho) e água. Em alguns exemplos, o meio também inclui outros produtos, comestíveis ou não, que se beneficiam da atividade microbiana aumentada.
Em algumas modalidades, aumento da atividade microbiana inclui aumento da fermentação de um micro-organismo. Desta maneira em alguns exemplos particulares, uma composição inclui um meio capaz de apoiar crescimento de micro-organismos de fermentação, um microorganismo de fermentação e MSM. Em alguns exemplos, MSM é provido em uma concentração de cerca de 0,04% a cerca de 5%, tal como cerca de 0,1% a cerca de 4%, 0,5% a cerca de 3%, cerca de 1% a cerca de 2%, incluindo cerca de 0,04% a cerca de 0,05%, cerca de 0,06% a cerca de 0,07%, cerca de 0,08%, cerca de 0,09%, cerca de 0,1%, cerca de 0,3%, cerca de 0,5%, cerca de 0,7%, cerca de 1%, cerca de 1,5%, cerca de 2,0%, cerca de 2,5%, cerca de 3,0%, cerca de 4% ou cerca de 4,5% de MSM em peso de meio ou em peso do teor de umidade do meio, onde a concentração de MSM é eficaz para aumento da fermentação dos micro-organismos. Em algumas modalidades, as composições descritas são usadas para produzir uma bebida fermentada, tal como cerveja, cidra e/ou vinho. Em algumas modalidades, uma composição para aumento da eficiência de fermentação
30/247 inclui MSM adicionado a embalagens de levedura para gerar levedura de ativação rápida ou instantânea para uso doméstico ou comercial.
Em algumas modalidades, aumento da atividade microbiana inclui aumento do crescimento de probióticos. Desta maneira, em alguns exemplos, uma composição para aumento do crescimento de probióticos inclui um meio capaz de apoiar crescimento de probióticos e MSM em uma concentração de cerca de 0,04% a cerca de 5% em peso do meio ou em peso do teor de umidade do meio, onde a concentração de MSM é eficaz para aumento da atividade (por exemplo, crescimento) dos probióticos. Ainda, uma composição para aumento do crescimento dos probióticos inclui cerca de 0,04% a cerca de 5% de MSM, tal como cerca de 0,1% a cerca de 4%, 09,5 a cerca de 3%, cerca de 1% a cerca de 2%, incluindo cerca de 0,04% a cerca de 0,05%, cerca de 0,06% a cerca de 0,07%, cerca de 0,08%, cerca de 0,09%, cerca de 0,1%, cerca de 0,3%, cerca de 0,5%, cerca de 0,7%, cerca de 1%, cerca de 1,5%, cerca de 2,0%, cerca de 2,5%, cerca de 3,0%, cerca de 4% ou cerca de 4,5% de MSM em peso de meio ou em peso do teor de umidade do meio.
Em algumas modalidades, aumento da atividade microbiana inclui produção microbiana aumentada de biocombustível. Desta maneira, em alguns exemplos, uma composição para aumento da produção microbiana de biocombustível inclui um meio capaz de apoiar o crescimento de alga, alga capaz de produzir um biocombustível e MSM em uma concentração de cerca de 0,04% a cerca de 5%, tal como cerca de 0,1% a cerca de 4%, 0,5% a cerca de 3%, cerca de 1% a cerca de 2%, incluindo cerca de 0,04% a cerca de 0,05%, cerca de 0,06% a cerca de 0,07%, cerca de 0,08%, cerca de 0,09%, cerca de 0,1%, cerca de 0,3%, cerca de 0,5%, cerca de 0,7%, cerca de 1%, cerca de 1,5%, cerca de 2,0%, cerca de 2,5%, cerca de 3,0%, cerca de 4% ou cerca de 4,5% de MSM em peso de meio ou em peso do teor de umidade do meio, onde a concentração de MSM é eficaz para aumento da produção do biocombustível a partir da alga. Em outros exemplos, uma composição inclui alga e MSM e opcionalmente outros ingredientes para aumento do crescimento de alga. Em várias modalidades, a composição é
31/247 útil para aumento da atividade de alga para biocombustível, fazenda de alga, aquacultura, medicamentos, etc. Em uma modalidade, o método compreende exposição de alga a MSM em, por exemplo, uma composição de cerca de 0,04% a cerca de 5% em peso de meio ou em peso do teor de umidade do meio.
As composições de MSM para inibição da atividade microbiana são descritas. Em algumas modalidades, uma composição de MSM para inibição de atividade microbiana inclui cerca de 6% a cerca de 17%, tal como cerca de 7% a cerca de 15%, cerca de 10% a cerca de 12%, tal como cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca e 13%, cerca de 14%, cerca de 15% ou cerca de 16% de MSM em peso de meio ou em peso do teor de umidade do meio, onde a concentração de MSM é eficaz para inibição de atividade microbiana incluindo, mas não limitado a, crescimento microbiano, taxa de infecção ou uma combinação dos mesmos.
É compreendido que qualquer uma das composições descritas incluindo MSM para modular atividade microbiana tem uma concentração de cloreto de sódio de menos do que 5% de teor de umidade total do meio, tal como cerca de 1% a cerca de 3% de cloreto de sódio, incluindo 0%, 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 2,5%, 3% ou 4%. Em alguns exemplos, uma composição descrita de MSM é livre de conservante. Por exemplo, MSM é adicionado a um produto alimentício, cosmético ou bebida que requer ou deseja uma lista de ingredientes todos naturais. Em algumas modalidades, uma composição de MSM consiste ou consiste essencialmente em MSM e ingredientes não tóxicos todos naturais. Em outros exemplos, uma composição de MSM descrita inclui um ou mais conservantes adicionais. Conservantes incluem, mas não estão limitados a, um ou uma combinação do que segue: sorbato de potássio, metilparabeno, metilcloroisotiazolinona, ftalatos, cocamidopropil betaína, parabenos, decil poliglicose, poliaminopropil biguanida, fenoxietanol, lauril éter sulfato de sódio, EDTA tetrassódico, decil glicosídeo, polietileno glicol e propileno glicol.
Em várias modalidades, MSM é usado para prolongar a vida de
32/247 prateleira de produtos e é capaz de reduzir a atividade microbiana em pelo menos 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 1000 vezes comparado com produtos sem nenhum MSM ou comparado com produtos com agentes antimicrobianos menos eficazes. Em outras modalidades, MSM é capaz de obter níveis comparáveis de atividade antimicrobiana comparado com agentes que produzem efeitos colaterais indesejados. Desta maneira, em uma modalidade, MSM pode ser usado ao invés de um conservante indesejado. Em várias modalidades, as composições incluem formulações livres de conservantes ou com conservante reduzido compreendendo MSM.
Em várias modalidades, MSM é usado em produtos (por exemplo, cosméticos) que têm um pH ácido, básico ou neutro. Devido ao fato de MSM poder inibir atividade microbiana, cosméticos e outros produtos podem ter mais flexibilidade em seleção de pH. Desta maneira, um pH que é ótimo para o produto pode ser selecionado. Em várias modalidades, produtos compreendendo MSM não requerem refrigeração e podem ser armazenados em temperatura ambiente. Em outras modalidades, produtos compreendendo MSM não requerem esterilização, incluindo, mas não limitado a, esterilização através de agentes químicos, aquecimento, radiação, filtragem ou luz ultravioleta.
Em várias modalidades, as composições descritas incluem MSM em adição a um ou mais agentes de espessamento, emolientes e/ou agentes aromáticos. Em algumas modalidades, um produto ou outro meio é suplementado com adições contínuas ou periódicas de MSM para, por exemplo, prolongar as ações inibidoras ou estimuladoras de MSM.
Em certas modalidades, a adição de MSM é um agente antimicrobiano eficaz. Por exemplo, em uma modalidade, uma composição compreendendo MSM tem o mesmo efeito antimicrobiano ou um aumentado comparado com uma formulação sem nenhum MSM. Em outras modalidades, MSM serve como um agente antibacteriano. Em certas modalidades, MSM é usado como um substituto para um conservante alimentício químico. Em ainda outras modalidades, MSM pode ser usado em combinação com um conservante. Em certas tais modalidades, o uso de MSM reduz a quanti
33/247 dade de, ou substitui ao todo, conservantes tradicionais. Em algumas modalidades, MSM pode aumentar a vida de prateleira de um produto, incluindo produtos que tradicionalmente não teriam um conservante. Em ainda outras modalidades, MSM serve como um virucida, fungicida e/ou bacteriocida. Em modalidades adicionais, MSM é bacteriostático. Em algumas modalidades, MSM é um inibidor de espectro amplo de atividade microbiana. Em outras modalidades, MSM mata seletivamente um certo reino, gênero ou espécie. Em algumas modalidades, MSM inibe seletivamente bactérias aeróbicas. Em outras modalidades, MSM inibe seletivamente bactérias anaeróbicas. Em algumas modalidades, MSM inibe seletivamente bactérias gram-positivas. Em outras modalidades, MSM inibe seletivamente bactérias gram-negativas.
Em várias modalidades, MSM é usado para inibir o crescimento de micro-organismos, incluindo aqueles encontrados em cosméticos, auxiliares da saúde e beleza, produtos parenterais, topicamente usados e produtos orais. Em várias modalidades preferidas, MSM é usado para inibir o crescimento de micro-organismos em produtos embalados em recipientes de dose única ou múltipla. Formulações de MSM de acordo com várias das modalidades descritas aqui estão em qualquer forma adequada, incluindo, mas não limitado a, forma em pó, creme, líquido, pasta, sólido ou gel.
Em várias modalidades, MSM é adicionado a produtos cosméticos suscetíveis à contaminação microbiana. Cosméticos podem incluir, mas não estão limitados a, batom, brilho labial, delineador labial, preenchedor labial, bálsamo labial, condicionador labial e reforçadores labiais, base, pó, rouge, blush, bronzeador, máscara, delineador para os olhos, sombra para os olhos, brilho para o olho, lápis para olho com brilho, lápis para sobrancelha, esmalte de unha, corretivos, produtos de cuidado da pele, cremes, loções, soros, hidratante, protetor solar, produtos de reparo da pele (por exemplo, para acne, queimadura solar, rugas, olheiras) e protetor solar.
Em várias modalidades, MSM é adicionado a uma matriz de creme cosmético suscetível à contaminação microbiana. Em algumas modalidades do tipo, o creme inclui jojoba, aloe vera, manteiga de cacau, manteiga de karité, óleo de coco ou combinações dos mesmos.
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Em várias modalidades, MSM é adicionado a produtos de cuidado pessoal suscetíveis à contaminação microbiana. Tais produtos incluem produtos usados para necessidades hidratantes diárias, produtos para tratar psoríase ou eczema, produtos para tratar pele seca ou com coceira, produtos para tratar queimadura do sol ou vento, produtos pré- e pós-barbear, óleos ou creme de massagem, lubrificantes pessoais, produtos de tratamento para acne e esfoliantes ou emolientes. De acordo com outras modalidades, MSM é adicionado a produtos para amaciar a pele das mãos ou pés (tais como calos), produtos de cuidado da pele após natação, removedor de maquiagem, loção de pele para criança e creme para assadura. Em algumas modalidades, MSM inibe contaminação enquanto simultaneamente conferindo um efeito cosmético benéfico ou benefício para saúde.
Em várias modalidades, MSM é adicionado a produtos ou equipamentos médicos suscetíveis à contaminação microbiana. Produtos medicinais incluem, mas não estão limitados a, preventivos e tratamento para resfriado ou gripe, preventivos e tratamento para alergia, irrigantes nasais, gotas medicinais, colírio, inalantes, tratamentos para pé de atleta, herpes e medicação para úlceras, cremes para queimadura, unguentos para cortes e infecções e sprays ou loções bactericidas, fungicidas ou virucidas. Em algumas modalidades, MSM é usado para inibir atividade microbiana em inaladores, nebulizadores, ventiladores, cateteres, seringas, tubos de intubação, equipamento de quarto de hospital, mobília e superfícies, equipamento de diagnóstico, tecido, leito e cobertas de paciente. Em várias modalidades, MSM é usado para desinfetar tecidos e fluidos do corpo. Por exemplo, MSM pode ser usado como parte de um sistema de diálise para inibir atividade microbiana em sangue, que pode ser particularmente útil para pacientes com sepse. Em outra modalidade, MSM é injetado em um paciente para inibir atividade microbiana localmente ou sistemicamente. Em outras modalidades, uma composição incluindo MSM é topicamente aplicada a uma infecção microbiana presente em uma superfície dermal.
Em algumas modalidades, produtos de MSM são usados nasalmente. Em outras modalidades, tais produtos são usados oralmente e/ou
35/247 como um vapor. Em ainda outras modalidades, o produto é um colírio de uso repetido ou outro produto medicinal ocular.
Em várias modalidades, MSM é adicionado a produtos medicinais usados para prevenir ou tratar infecções fúngicas. Em algumas tais modalidades, o produto é usado para prevenir ou tratar pé de atleta. Em algumas modalidades, o produto é usado topicamente. Em algumas modalidades, o produto é um creme, unguento, spray, gel ou pó. Em outras modalidades, o produto é usado oralmente.
Em várias modalidades, MSM inibe a atividade de micotoxinas, metabolitos tóxicos produzidos por um organismo do reino fungo, incluindo cogumelos, mofos e leveduras. Produtos compreendendo MSM são também úteis para descontaminação de superfícies e equipamento que são suscetíveis à contaminação por tais organismos e/ou metabolitos. Em algumas modalidades, MSM inibe a atividade de organismos do reino fungo (por exemplo, cogumelos, mofos e leveduras). Em ainda outras modalidades, MSM inibe as toxinas de micróbios diretamente e/ou indiretamente através da inibição da atividade dos micróbios. Em uma modalidade, MSM inibe a formação e/ou liberação de metabolitos microbianos.
Em várias modalidades, MSM é adicionado a produtos usados para prevenir ou tratar infecções virais. Sprays nasais antivirais compreendendo MSM são providos em uma modalidade. Produtos compreendendo MSM são também úteis para descontaminação de superfícies e equipamento que são suscetíveis à contaminação viral. Em uma modalidade, MSM é usado para inibir o vírus da gripe, incluindo H1N1, ou em um tecido biológico ou em uma superfície externa. Em algumas modalidades, MSM é usado para inibir o vírus da imunodeficiência humana, vírus herpes simplex, vírus papiloma, vírus da parainfluenza, gripe, hepatite e outros vírus.
Em algumas modalidades, MSM inibe alga. Em uma modalidade, MSM inibe crescimento de alga. Em algumas modalidades, MSM inibe atividade de fitoplancton indesejada. Em outras modalidades, MSM inibe espécie macroalga. Em outra modalidade, MSM inibe dinoflagelatos dos gêneros Alexandrium e Karenia. Em várias modalidades, MSM inibe os meta36/247 bolitos tóxicos (incluindo subprodutos) de alga.
Em algumas modalidades, MSM é adicionado a produtos médicos usados para tratar uma queimadura, corte ou ferida. Feridas podem incluir, mas não estão limitadas a, lacerações, lacerações com separação, estiramento excessivo, compressão com trituração, lacerações por corte, rasgamento, incisões, feridas com incisão, abrasões, feridas por puncionamento, feridas por penetração. Em algumas modalidades, MSM é incorporado a uma bandagem usada para cobrir uma ferida. Em outras modalidades, MSM é adicionado a um creme ou unguento. Em tais modalidades, o produto formulado com MSM age como um antisséptico.
A microflora da pele (bactérias, fungos, vírus, fago, arquea) desempenha um papel significante em condições dermatológicas comuns, tal como dermatite atópica (uma forma comum de eczema). Tipicamente, um micróbio específico coloniza a pele para romper o equilíbrio da microflora comensal ou micróbios liberam substâncias tóxicas ou invadem as células para induzir uma resposta inflamatória diretamente. Desta maneira, em algumas modalidades, MSM é incorporado a um produto tópico que inibe crescimento de tal microflora. Administração subcutânea de MMS é provida em outras modalidades.
Em outras modalidades, MSM é adicionado a produtos ópticos suscetíveis à contaminação microbiana e/ou a produtos ópticos para aumentar sua atividade antimicrobiana. Produtos ópticos podem incluir soluções para limpeza ou desinfecção de lentes de contato. Em algumas tais modalidades, MSM é incorporado a vários produtos aplicados a lentes de contato tal como uma solução de armazenamento de lente de contato. Em algumas modalidades, MSM é adicionado a colírios usados em conjunto com lentes de contato. Em outras modalidades, MSM é adicionado a soluções químicas usadas em procedimentos de diagnóstico ocular, tal como solução de dilatação pupilar multiuso.
Em várias modalidades, MSM é adicionado a produtos orais suscetíveis à contaminação microbiana e/ou a produtos orais para aumentar sua atividade antimicrobiana. Em algumas modalidades, tais produtos são
37/247 usados para limpeza dos dentes. Em algumas modalidades, MSM é incorporado à pasta de dente ou gel dental. Em algumas modalidades, MSM é incorporado a ou revestido sobre as cerdas de uma escova de dente. Em outras modalidades, formulações de MSM são incorporadas a ou usadas para revestir fio dental. Em outras modalidades, o produto é usado para limpeza da língua. Em outras modalidades, o produto é um produto para lavagem buca, enxaguatório bucal ou irrigante bucal para uso dental em casa ou profissional. Em ainda outras modalidades, o produto é um chiclete ou doce. Em algumas modalidades, MSM é adicionado a soluções de armazenamento ou limpeza para implantes dentais, dentaduras e similar.
Em algumas modalidades, MSM é adicionado a alimentos contendo organismos probióticos, tais como leite, iogurte, iogurte de arroz, iogurte congelado, kefir, suco, vegetais em conserva, repolho fermentado, pasta de feijão fermentada, azeitonas em salmoura, chocolate, queijo e outros produtos laticínios e certos cereais. Em algumas modalidades, MSM é adicionado a produtos que são suplementos alimentares incluindo, mas não limitado a, pílulas probióticas, cápsulas e líquidos. Em algumas tais modalidades, MSM é adicionado a um suplemento para ingestão humana. Em outras modalidades, MSM é adicionado a um suplemento para animais. Em algumas modalidades, MSM é adicionado a um produto que é formulado como uma cápsula ou comprimido. Em algumas modalidades, MSM é adicionado a um produto que é formulado como um sólido ou líquido. Em outras modalidades, MSM é adicionado a um gênero alimentício durante o processo de produção, enquanto em ainda outras modalidades, MSM é adicionado a produtos alimentícios acabados.
Em várias modalidades, MSM é adicionado a um produto alimentício que é suscetível à infecção microbiana. Em algumas modalidades, MSM pode ser misturado, ad-mixed, composto ou de outra maneira incorporado ao produto alimentício. Em outras modalidades, MSM é aplicado à superfície de um produto alimentício. Por exemplo, em algumas modalidades, MSM pode ser pulverizado sobre um produto alimentício. Tais produtos alimentícios podem incluir, mas não estão limitados a, frutas, vegetais, peixe e
38/247 produtos de carne. Em algumas modalidades, MSM é usado em instalações de processamento ou embalagem para prolongar a vida de prateleira de produtos alimentícios. Em várias modalidades, a adição de MSM (por exemplo, cerca de 5% a cerca de 25%) aumenta o tempo para degradação de produtos ingeríveis. Por exemplo, MSM pode ser assado em ou adicionado a pães, massas ou biscoitos para aumentar a vida de prateleira dos produtos comestíveis em cerca de 10% a 100% (por exemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 150%, 200% ou mais). Por exemplo, em uma modalidade, se a vida de prateleira de um produto comestível for de 10 dias, a adição de MSM vai aumentar a vida de prateleira para pelo menos 11 dias em algumas modalidades (por exemplo, 11 dias, 14 dias, 15 dias, 20 dias ou 25 dias). Como um exemplo adiciona, em outra modalidade, se um produto comestível tiver uma vida de prateleira de 14 dias em temperatura ambiente e/ou 30 dias no refrigerador e/ou 3 meses no freezer, a adição de MSM vai aumentar a vida de prateleira para 30 dias em temperatura ambiente e/ou 60 dias no refrigerador e/ou 6 meses no freezer. Em modalidades adicionais, o uso de MSM vai permitir o transporte e/ou armazenamento de um produto comestível em temperatura ambiente, onde o produto teria de outra maneira que ser transportado e/ou armazenado em temperaturas mais frias. Em ainda outras modalidades, o uso de MSM vai obviar a necessidade de esterilização de produtos comestíveis.
Em alguns exemplos, qualquer uma das composições descritas de MSM consiste essencialmente em água. Por exemplo, MSM é particularmente eficaz quando combinado com água ou outros componentes líquidos. Em alguns exemplos, uma composição descrita de MSM é livre de alvejante, livre de álcool ou uma combinação dos mesmos. Em várias modalidades, uma composição para modulação de atividade microbiana inclui um composto relacionado com MSM ao invés de ou em adição a MSM. Compostos relacionados incluem, mas não estão limitados a, DMSO e dimetilsulfeto (DMS).
MMS usado de acordo com qualquer uma das modalidades providas aqui pode ser isolado, purificado ou processado. MMS que é chamado GRAS (Generally Recognized As Safe (Geralmente Reconhecido como Se
39/247 guro)) é usado para várias modalidades descritas aqui. Formulações para consumo por humanos, animais domésticos e animais de fazenda são providas de acordo com várias modalidades aqui.
Em algumas modalidades, MSM é combinado com um ou mais dos ingredientes que seguem (ou derivados, metabolitos, precursores, óleos, extratos, ésteres, ácidos, sais e compostos relacionados dos mesmos): ácido abiético, acácia, goma acácia do Senegal, extrato de acácia, ácido acético, acetona, acetil glicosamina, extrato de acmella oleracea, adenophora strícta, alaria marginata (vegetais marinhos), albumina, álcool, aldenina, alfafa, extrato de alga, alquil guanina transferase, alquiloamidas, alantoína, hidróxido de alumínio, amêndoa, aloe vera, ácido alfa lipoico, benzoato de alumínio, cloreto de alumínio, amino ácidos, ácido aminopropano sulfônico 3, glicolato de amônioe, lauril sulfato de amônio, extrato da raiz anemarrhenae asphodeloides, óleo de aniz, antioxidantes, apigenina, abricó, semente de abricó, ácido araquidônico, arbutian, óleo de argan, extrato da folha de argania spinosa, arginina, argirelina, extrato de arnica, óleo de artemisia dracunculus (tarragon), ácido ascórbico, palmitato de ascorbila, tetraisopalmitato de ascorbila, fermento de aspergillus, aspidosperma quebracho, astaxantina, atelocolágeno, extrato de semente de avena sativa (aveia), avobenzona, ácido azélico, feijões azuki, extrato de folha de melissa, bálsamo-do-Peru, extrato de caule de bambu, extrato de cevada (hordeum vulgare), sulfato de bário, cevada, alfavaca, pólen de abelha, cera de abelha, bentonita, peróxido de benzoíla, extrato da raiz de beta vulgaris (beterraba), betacaroteno, mirtilo, biotina, oxicloreto de bismuto, extrato de alga castanha, óleo de borragem, ácido bórico, óxido bórico, líquido de placenta bovina, levedura de produção de cerveja, bronopol, acetato de butila, estearato de butila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, butileno glicol, butilparabeno, karité, ácido triglicerídeo C18-36, cafeína, calamina, cálcio, extrato de calêndula, cera de carnaúba, extrato da folha de camellia oleifera, extrato da folha de camellia sinenis, cânfora, óleo da flor de canaga odorata (ylang ylang) flower oil, cera de candelilla, esteróis de canola, ácido caprílico, triglicerídeo carpílico/cáprico, caprilil glicol, oleorresina de capsicum, caramelo, carmim, caro
40/247 tenóides, carragenana, óleo de cenoura, óleo de semente de cenoura, óleo de semente de carthamus tinctorius (açafrão), óleo de rícino, celulose, centella asiática, calendula officinalis, cera de alba, cera de carnaúba, ceramida, cerebrosídeos, ferrocianida de amônio férrica, cetearete-3, álcool de cetearila, cetearil glicosídeo, cetearil olivato, álcool de cetila, lactato de cetila, óleo de camomila, extrato de flor de chamomilla recutita (matricaria), castanha, extrato de castanha, cloroxilenol, clorfenesia, colesterol, colina, chondrus crispus (musgo Irlandês), verde de hidróxido de cromo, verdes de óxido de cromo, álcool de cinamila, ácido cítrico, citronelol, citrus, óleo de citrus nobilis (mandarina verde), pó de trevo, extrato de flor de trevo, cliceril coconato, cocamidopropil betaína, cacau, manteiga de cacau, caprilato/caprato, óleo de coco, cerca de coco, óleo de fígado de bacalhau, coenzima q10, colágeno, extrato de confrey, extrato de equinácea, cera de copernica cerifera (carnaúba) cera, cobre, coentro, óleo de coriandrum sativum (cilantro), amido de milho, extrato de flor de milho, creatina, extrato de crithmum maritimum, pepino, ciclometicona, ciclopentassiloxana, dantoína 685, decil glicosídeo, água deionizada, diazolidinil ureia, desidrato de fosfato de cálcio, carbonato de dicaprilila, dietanolamina, dilaurato, dimeticona, dimetilaminoetanol, extrato de raiz de dioscorea villosa (ihame selvagem), glicirrizinato de dipotássio, distirilbifenil dissulfonato dissódico, edta dissódico, hidantoína dmdm, extrato de echinacea angustifolia (equinácea), edta, rosa eijitsu, elaeis oleifera, elastina, sabugueiro, emolientes, enzimas, extrato de epiloblum fleischeri (gravei willow),, extrato de folha de equisetum hiemale (cavalinha), erucato, ácidos graxos essenciais, óleos essenciais, etanol, etoxidiglicol, acetato de etila, copolímero de etileno/ácido acrílico, palmitato de etilexila, etilexilglicerina, etilparabeno, extrato de eucalipto, eucarion, extrato de fruta de euterpe oleracea, óleo de prímula da manhã, esfoliantes, ácidos graxos, álcoois graxos, óleo de fennel, óxido férrico, flavonoides, flavonolignana, óleos de peixe, linho, floralozona, fluor, formaldeído, ácidos de fruta, extrato de fruta, extratos de fruta, gaba, ácido gama linolênico, gelatina, geraniol, óleo de gerânio, gigartina papillata (alga selvagem), gengibre, óleo de gengibre, óleo de ginko biloba, ginseng, glicosamina, glicose oxidase, açúcar de glicose, glicerete,
41/247 glicerete-26, glicerina, glicerol, stearato de glicerol, rosinato hidrogenado de glicerila, oleato de glicerila, estearato de glicerila, glicol diestearato, ácido glicólico, ouro, extrato de hidraste, semente de uva, óleo de semente de uva, toronja, óleo de toronja, extrato de semente de toronja, chá verde, gomas, óleo de avelã, polímero reticulado de hdi/trimetilol hexillactona, óleo de semente de cânhamo, hexamidina, hexileno glicol, homosalato, mel, extrato de hordeum distichum, ácido hordiidroguaiarético, hormônios, hidratantes, extrato de humulus lupulus, ácido hialurônico, extrato de hidrastis canadensis (hidraste), hidrocortisona, extrato de hidrocotila, laurato de óleo de rícino hidrogenado, poliisobuteno hidrogenado, poliisobuleno hidrogenado, proteína animal hidrolisada, queratina hidrolisada, goma rizobiana hidrolisada, proteína de soja hidrolisada, proteína do trigo hidrolisada, hidroxiácidos, hidroxietilcelulose, hidroxietil-celulose, hidroxiisoexil 3-cicloexano, carboxaldeído, hidroxipropil-celulose, mel hidroxipropiltrimônio, hidroquinona, hidroxiestearato, extrato de hipericum, idebenona, imidazolidinil ureia, iodo, musgo Irlandês, óxidos de ferro, isobutilparabeno, isododecano, isoexadecano, isononil isononanoato, isopentildiol, álcool isopropílico, lanolato de isopropila, linoleate de isopropila, miristato de isopropila, isoestearato, ácido isoesteárico, extrato de hera, óleo de jasmim, manteiga de jojoba, óleo de jojoba, extrato de junípero, óleo de junípero, caulim, queratina, cetonas, kinerase, kinetina, ácido kójico, óleo de noz de kukui, ácido láctico, lactoperoxidase, extrato de folha de manta de dama, extrato de laminaria digitata (alga kelp), lanolina, extrato de madeira larix sibirica, lauramida, laurato, laurete, álcool de laurila, lauril glicosídeo, lavanda, óleo de lavanda, lecitina, óleo de limão, alcaçuz, óleo de lima, limoneno, extrato de tília, ácido linoleico, ácido linolênico, lipossomas, feijão alfarroba, extrato de fruta de lycium barbarum, extrato de fruta de lycium barbarum (baga goji), licopeno, óleo de noz de macadâmia, matcha, silicate de magnésio alumínio, fosfato de ascorbil magnésio, miristato de magnésio, estearato de magnésio, sulfato de magnésio (sais epsom), extrato de fruta malpighia punicifolia (acerola), violeta manganês, manteiga de manga, calêndula, extrato de marshmallow, pó de chá matcha, óleo de matricaria, mea, rainha do prado, óleo de melaleuca, extrato de melão, extra
42/247 to de mentha piperita (hortelã pimenta orgânica), mentol, acetato de metila, metil etil cetona, metildiidrojasmonato, metilparabeno, mica, compostos de microdermoabrasão, proteína do leite, minerais, óleo mineral, mipa, monoetanolamina, monoestearato, montmorilonita (argila verde), extrato de artemísia (artemisia vulgaris), amora, extrato da raiz de amora (morus nigra), murumuru, cogumelos, miristato, miristato, ácido mirístico miristato de miristila, óleo de myrtus communis (murta verde), n-acetil glicosamina, pó de nefrita, óleo de néroli, ofolha de urtiga, neuropeptídios, niacina, nitrosaminas, nonil nonoxinol-150, ácidos nucleicos, pó de noz moscada, nozes, aveia, farinha de aveia, aveias, óleo de ocimum basilicum linanol (basil linalol), octinoxato, octasalato, oleato, ácido oleico, álcool de oleíla, oligopeptídeos, oligossacarídeos, extrato de fruta de oliva, óleo de oliva, ômega-3, óleo de casca de laranja, ácido ortobórico, oxibenzona, ozoquerita, extrato de padina pavonica thallus, óleo de palma, palmitato, ácido palmítico, palmitoíla, pantetina, pantenol, ácido para-aminobenzoico, parabeno, parafina, extrato da fruta passiflora incarnata, maracujá, patchouli, caroço de pêssego, extrato de turfa, pectina, peg, óleo de hortelã-pimenta, peptídeos, geleia de petróleo, extrato de casca de phellodendron amurense, fenoxietanol, fenil trimeticona, feniletil resorcinol, ácido fosfórico, fitoquímicos, derivado de extrato de pinheiro, extrato de abacaxi, extrato de folha de plantago lanceolata, extrato de folha de tanchagem, extrato de pólen, extrato de raiz de polygonum cuspidatum, polipeptídeos, polissacarídeos, polissilicone, polisorbato, polivinilpirrolidona, progesterona, propileno glicol, propileptil caprilato, propilparabeno, extrato de semente de abóbora, extrato de punica granatum (romã), extrato de punica granatum/punica granatum, picnogenol, quatérnio-15, extrato da casca de quillaja saponária (sabão), extrato de quillia, reserveratol, ácido retinoico, retinoides, retinol, palmato de retinila, extrato de fruta ribes rubrum, arroz, cera de farelo de arroz, ricinoleato, óleo de rosa, rosehips, Rosemary, óleo de Rosemary, água de rosa, geleia real, extrato de fruta rubus villosus, saccharum officinarum (cana-de-açúcar), ácido salicílico, sálvia, óleo de madeira de sândalo, saponinas, sassafrás, saw palmetto, extrato de saxifraga sarmentose, esclareolídeo, extrato de scutellaria baicalensis, alga, extrato de
43/247 semente de cereal secale (centeio), extrato de selaginella tamariscina (musgo para aquário), selênio, óleo de sésamo, sesquioleato, erva cavalinha, manteiga de karité, silibinina, silica, silicone, sirtuinas, alginato de sódio, ascorbato de sódio, bissulfato de sódio, borato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, deidroacetato de sódio, etilparabeno de sódio, glicirretinato de sódio, hialuronato de sódio, lactobionato de sódio, lauril sulfato de sódio, metilparabeno de sódio, poliestireno sulfonato de sódio, propilparabeno de sódio, estearato de sódio, tioglicolato de sódio, acrilodimetil taurato de sódio, isoestearato sorbitano, olivato sorbitano, sesquioleato sorbitano, estearato sorbitano, sorbitol, sorbitol, soja, cera de soja, óleo de soja, óleo de hortelã, esqualano, erva de São Paulo/São João, estearato, células-tronco, estarato de sacarose, extrato de cana-de-açúcar, sulfato, óleo de semente de girassol, óleo de amêndoa doce, extrato de folha de symphytum officinale (confrey), extrato de folha de Symphytum officinale, fluorfolopita sintética, extrato de semente de tamarindos indica, óleo de árvore de chá, extrato de timo, óxido de estanho, dióxido de titânio, dióxido de titânio, tocoferol, acetato de tocoferila, tolueno, tomate, tragacanto, tretinoína, tribeenina, triclosano, trimelitato de tridecila, trietanolamina, tnidroxiestearina, citrato de triisoestearila, triisoestearato de trimetilolpropano, tirmetilsiloxissilicato, trimiristato, tripeptídeo, turmérico, tirosina, ubiquinona, ultramarino, undecilenoil fenilalanina, uréia, uridina, extrato de fruta vaccinium macrocarpon, glicerina vegetal, óleo de vetiver, vitamina A, vitaminas B1-B12, vitamina C, éster de vitamina C, vitamina D, vitamina E, vitamina K, vitaminas, pó de casca de noz, água, óleo de germe de trigo, proteína do soro do leite, (lactis proteinum), extrato de casca de bétula branca, casca de sabugueiro, óleo de Wintergreen, óleo de olmo escocês, goma xantana, goma xantana, extrato de yarrow, levedura, yerba mate, yucca, óxido de zinco, estearato de zinco.
Em algumas modalidades, a composição compreende, consiste ou consiste essencialmente em MSM em combinação com um, dois, três, quatro, cinco ou mais dos ingredientes mencionados acima. Em várias modalidades, MSM inibe atividade microbiana na formulação. Em outras modalidades, MSM oferece o mesmo efeito microbiano ou melhor quando usado
44/247 para substituir um conservante na formulação (alguns dos quais são identificados acima). Em certas modalidades, MSM oferece o mesmo efeito antimicrobiano ou melhor quando usado com uma quantidade reduzida de conservante. Em ainda outras modalidades, a adição de MSM a uma formulação tendo um conservante aumenta os efeitos do conservante. Os ingredientes identificados aqui podem ser usados com MSM em uma formulação cosmética (por exemplo, oral, injetável ou tópica) ou em outros tipos de formulações (por exemplo, formulações médicas orais, injetáveis ou tópicas).
Em algumas modalidades, a composição inclui MSM, mas é livre de um ou mais dos compostos que seguem: sulfatos, GMOs, fragrâncias sintéticas, corantes sintéticos, formaldeído, sorbato de potássio, metilparabeno, metilcloroisotiazolinona, cocamidopropil betaína, parabenos, decil poliglicose, poliaminopropil biguanida, fenoxietanol, lauril etil sulfato de sódio, EDTA tetrassódico, decil glicosídeo, polietileno glicol, propileno glicol, ftalatos e triclosana. Em algumas modalidades, o uso de MSM permite a fabricação de uma formulação que é livre de qualquer ingrediente sintético. Em ainda outras modalidades, o uso de MSM permite a fabricação de uma formulação que é livre de qualquer ingrediente causador de alergia, imunossupressor e/ou inflamatório.
Em várias modalidades, as propriedades antimicrobianas de MSM reduzem ou eliminam a necessidade de esterilização, temperaturas menores, ambientes estéreis, fechamentos especiais e/ou embalagem especial, etc. MSM tem uma função dupla ou multipropósito de acordo com algumas modalidades. Por exemplo, o MSM não apenas inibe o crescimento de micro-organismos indesejados, o MSM também afeta beneficamente o produto ao qual ele é adicionado em várias modalidades (por exemplo, MSM serve como um antioxidante, composto regenerador, composto antirruga, hidratante, agente de brilho da pele, amaciante, estimulante da circulação, neutralizante, reparador, reforçador do cabelo/unha, catalisador de cicatrização, agente de formação de nova superfície, etc, ou combinações de dois ou mais dos mesmos). Em várias modalidades, as propriedades antimicrobianas de MSM aumentam a vida de prateleira, meia-vida, eficácia e/ou estabi
45/247 lidade da formulação (ou ingrediente específico identificado aqui). O uso de MSM pode também ser particularmente benéfico em algumas modalidades para cosmético ou outros tipos de formulações que são compartilhadas por mais de uma pessoa (por exemplo, cosméticos usados por artistas de maquiagem ou em encontros de cosmética).
Cosméticos podem incluir, mas não estão limitados a, batom, brilho para os lábios, delineador para os lábios, preenchedor para os lábios, bálsamo para os lábios, condicionador para os lábios e reforçadores para os lábios, base, pó, rouge, blush, bronzeador, máscara, delineador para os oIhos, sombra para os olhos, brilho para os olhos, lápis para os olhos com brilho, lápis para sobrancelha, esmalte de unha, corretivo, produtos de cuidado da pele (por exemplo, produtos de microdermoabrasão, géis suavizantes), cremes, loções, soros, hidratante, protetor solar, produtos de reparo da pele (por exemplo, para acne, queimadura solar, rugas, olheiras) e atritos. Formulações para a face, cabelo e corpo (por exemplo, xampu, sabões, condicionadores, sprays, géis, soros, tratamentos restauradores, desodorantes, etc) são providas em várias modalidades. Cosméticos, tais como produtos cosmecêuticos e nutracêuticos, são providos em várias modalidades da invenção. Cargas dermais e outros produtos dermatológicos (tais como ácido hialurônico, waglerina 1, acetil hexapeptídeo-8, palmitoil tetrapeptídeo-7, oligopeptídeo de palmitoíla, lipossomas, colágeno, hidroxil-apatita de cálcio, ácido poli-láctico e toxina botulínica) são providos em várias modalidades. Formulações antirruga, antiacne, antienvelhecimento, esfoliantes, hidratantes e antiestrias, fragrâncias, maquiagem mineral e primers são providas em várias modalidades. Géis dermais, para usos cosmético e médico (por exemplo, inibição ou prevenção de infecção microbiana e/ou cicatrização de ferida), são providos em algumas modalidades.
Em várias modalidades, produtos contendo MSM podem ser transportados e/ou armazenados em condições de temperatura alta e umidade alta que de outra maneira seriam favoráveis para atividade microbiana.
Em algumas modalidades, produtos incluindo MSM são embalados em recipientes adaptados para aplicações de uso múltiplo e exposição a
46/247 micro-organismos externos, tal como do ar ou contato com uma parte do corpo (por exemplo, dedos). O uso de MSM é particularmente benéfico em várias modalidades porque ele aumenta a vida de prateleira de tais produtos. Em algumas modalidades, produtos compreendendo MSM são também embalados em recipientes vedados de uso único. Em uma modalidade, um produto de uso único (tal como uma embalagem de condimento, embalagem de tempero, um pacote de cosmético para viagem, etc) terá uma vida de prateleira mais longa e/ou não vai mais precisar de refrigeração se MSM for usado em conjunto com o produto e/ou embalagem.
Em algumas modalidades, MSM é incorporado diretamente ao material de embalagem para, por exemplo, aumentar a vida de prateleira. Por exemplo, MSM pode ser incorporado a bolsas de armazenamento de alimento para inibir crescimento microbiano. Em outras modalidades, MSM pode ser incorporado a recipientes e/ou tampas para aumentar a vida de prateleira de alimentos, cosméticos e outros produtos através da inibição de crescimento microbiano indesejado. Em ainda outras modalidades, MSM pode ser incorporado a produtos de revestimento tais como plástico e filme.
Em várias modalidades, uma composição para inibição de atividade microbiana em um creme ou unguento tópico inclui MSM, onde o MSM é configurado para afetar a contaminação microbiana através da inibição da atividade microbiana. MSM é provido em uma concentração de pelo menos 5% de acordo com uma modalidade (por exemplo, 5-10%, 10-16%, 16-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-75% ou mais e faixas de sobreposição das mesmas). Em alguns exemplos, a composição é um creme livre de conservante. Em uma modalidade, MSM inibe atividade microbiana em pelo menos 50% no creme em temperatura ambiente.
Em algumas modalidades, composições farmacêuticas incluem MSM, DMSO e/ou agentes antimicrobianos, ou suas combinações, que são formulados para uso em medicina humana ou veterinária.
Por exemplo, as composições farmacêuticas providas incluem cerca de 0,01% de MSM em peso a cerca de 20% de MSM em peso. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica contém entre cerca de
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0,01% a cerca de 5% de MSM em peso. Outras modalidades contêm entre cerca de 5% a cerca de 10% de MSM, cerca de 10% a cerca de 15% de MSM ou cerca de 15% a cerca de 20% de MSM, tal como cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19% ou cerca de 20% de SMS. Algumas modalidades incluem cerca de 10-16% de MSM, cerca de 10-14% de MSM ou cerca de 10-12% de MSM.
Agentes antimicrobianos adicionais exemplares que podem ser incluídos em uma composição descrita incluem, mas não estão limitados a, derivados de penicilina, cefalosporinas, penemas, monobactamas, carbapenemas, inibidores de beta-lactamase e suas combinações. Exemplos de derivados de penicilina incuem, mas não estão limitados a, aminopenicilinas (por exemplo, amoxacilina, ampicilina e epicilina); carboxipenicilinas (por exemplo, carbenicilina, ticarcilina e temocilina); ureidopenicilinas (por exemplo, azlocilina, piperacinila e mezlocilina); mecilinama, sulbenicilina, penicilina benzatina, penicilina G (benzilpenicilina), penicilina V (fenoximetilpenicilina), penicilina O (alilmercaptometilpenicilínico), penicilina procaína, oxacilina, meticilina, nafcilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, pivampicilina, hetacilina, becampicilina, metampicilina, talampicilina, co-amoxiclave (amoxacilina mais ácido clavulânico) e piperaciliona. Exemplos de cefalosporinas incluem, mas não estão limitados a, cefalexina, cefalotina, cefazolina, cefaclor, cefuroxima, cefamandol, cefotetano, cefoxitina, ceforanida, ceftriaxona, cefotaxima, proxetil cefpodoxima, ceftazidima, cefepima, cefoperazona, ceftizoxima, cefixima e cefpiroma. Exemplos de penemas incluem, sem limitação, faropenema. Exemplos de monobactamas incluem, sem limitação, aztreonama e tigemonana. Exemplos de carbapenemas incluem, mas não estão limitados a, biapenenvdoripenema, ertapenema, -imipenema, meropenema e -panipenema. Exemplos de inibidores de beta-lactamase incluem, mas não estão limitados a, tazobactama sal de 4,4-dióxido de sódio do ácido ([2S- (2alfa,3beta,5alfa)]-3-Metil-7-oxo-3-(1H-1,2,3-triazol-1-ilmetil)4-tia-1-azabiciclo[3,2,0]heptano-2-carboxílico), sulbactama 4,4-dióxido de
48/247 sódio de do ácido (2S,5R)- 3,3-dimetil-7-oxo-4-tia-1-azabiciclo[3,2,0]heptano2-carboxílico) ácido clavulânico ácido ((2R,5R,Z)-3-(2-hidroxietilideno)-7-oxo-
4- oxa-1-aza-bicoclo[3,2,0]heptano-2-carboxílico) ou outro antibiótico Betalactama.
Muitos antibióticos têm uma concentração inibidora mínima estabelecida (MIC) na qual eles são eficazes na redução ou morte de certas bactérias. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica descrita inclui uma quantidade de antibiótico Beta-lactama igual a cerca de 0,001 a 100 MIC para os patógenos bacterianos particulares descritos aqui. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende cerca de 1-5,
5- 10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90 ou cerca de 90100 MIC de um antibiótico Beta-lactama.
As composições farmacêuticas providas aqui também incluem combinações de MSM e composto antimicrobiano, por exemplo, uma combinação de MSM e um antibiótico Beta-lactama. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas providas aqui incluem MSM 10-16% e uma quantidade de um antibiótico Beta-lactama igual a 1 MIC para um patógeno bacteriano que a composição vai contatar.
Um versado na técnica conhecerá a MIC de um antibiótico para um patógeno bacteriano particular ou o versado na técnica vai saber como determinar a MIC de um antibiótico para um patógeno bacteriano particular. Métodos de determinação de uma MIC de um antibiótico particular para um patógeno bacteriano particular são descritos aqui, por exemplo, uso do sistema de teste de antibiótico Etest® (bioMérieux, Durham, NC).
A forma de dosagem da composição farmacêutica será influenciada pelo modo de administração escolhido. Por exemplo, em adição a fluidos injetáveis, formulações para inalação, tópicas, oftálmicas, peritoneais e orais podem ser empregadas. Preparações para inalação podem incluir aerossóis, partículas e similar. Em geral, o objetivo para tamanho de partícula para inalação é cerca de 1 pm ou menos a fim que a composição farmacêutica atinja a região alveolar do pulmão para absorção.
As composições farmacêuticas que incluem MSM, DMSO, um
49/247 agente antimicrobiano ou composto terapêutico conforme descrito aqui tal como um ingrediente ativo, ou que incluem uma mistura de dois ou mais dos mesmos, com ou sem agente(s) adicional(ais) como ingredientes ativos, podem ser formuladas com um carreador sólido ou líquido apropriado, dependendo do modo de administração particular escolhido. Formulações orais podem ser líquidas (por exemplo, xaropes, soluções ou suspensões) ou sólidas (por exemplo, pós, pílulas, comprimidos ou cápsulas). Para composições sólidas, carreadores sólidos não tóxicos convencionais podem incluir graus farmacêuticos de manitol, lactose, amino ou estearato de magnésio. Métodos reais de preparação de tais formas de dosagem são conhecidos ou se tornarão aparentes àqueles de habilidade comum na técnica.
Para administração oral, as composições farmacêuticas podem tomar a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparados através de meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); cargas (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogeno fosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou silica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou amido glicolato de sódio); ou agentes hidratantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos através de métodos bem conhecidos na técnica. Preparações líquidas para administração oral podem tomar a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões ou elas podem ser apresentadas como um produto seco para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas podem ser preparadas através de meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras comestíveis hidrogenadas); agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool de etila ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações podem também conter sais de tampão, saborizantes, agentes de coloração e agen50/247 tes adoçantes conforme apropriado.
Para administração através de inalação, os compostos para uso de acordo com a presente invenção são convenientemente aplicados na forma de uma apresentação em spray aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de um propelente adequado, por exemplo, diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada através de provisão de uma válvula para aplicar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos para uso em um inalante ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.
Para administração tópica, os compostos podem ser, por exemplo, misturados com um agente de aplicação líquido para administrar localmente. Os agentes usados terapeuticamente (tais como DMSO, MSM e/ou outros compostos terapêuticos conforme descrito aqui) são prontamente solúveis ou podem ser suspensos em água, e dessa maneira isto seria útil para aplicação uma vez que água não causa efeitos adversos a tecido biológico. Isto permite que doses suficientemente altas sejam administradas localmente ou sistemicamente, sem toxidez secundária a partir do veículo de aplicação.
Composições farmacêuticas que incluem uma quantidade terapêutica de MSM conforme descrito aqui como um ingrediente ativo serão normalmente formuladas com um carreador sólido ou líquido apropriado, dependendo do modo de administração particular escolhido. Os carreadores e excipientes farmaceuticamente aceitáveis úteis na presente invenção são convencionais. Por exemplo, formulações parenterais geralmente compreendem fluidos injetáveis que são veículos fluidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis tais como água, solução salina fisiológica, outras soluções salinas equilibradas, dextrose aquosa, glicerol ou similar. Excipientes que podem ser incluídos são, por exemplo, proteínas, tais como preparações de albumina de soro humano ou plasma. Se desejado, a composição farma
51/247 cêutica a ser administrada pode também conter quantidades pequenas de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes hidratantes ou emulsificantes, conservantes e agentes de tamponamento de pH e similar, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato sorbitano. Métodos reais de preparação de tais formas de dosagem são conhecidos, ou se tornarão aparentes, daqueles versados na técnica.
As composições farmacêuticas que incluem uma quantidade eficaz terapêutica de MSM, em algumas modalidades, serão formadas em forma de dosagem unitária, adequada para administração individual de dosagens precisas. A quantidade de MSM administrada vai depender do indivíduo sendo tratado, da severidade da aflição e da maneira de administração e é deixada para julgamento do médico prescrevente. Dentro desses limites, a formulação a ser administrada vai conter uma quantidade do(s) componente^) ativo(s) em quantidades eficazes para obter o efeito desejado no indivíduo sendo tratado.
Preparações para administração podem ser adequadamente formuladas para fornecer liberação controlada do(s) agente(s) terapêutico(s) (por exemplo, DMSO, MSM, antibiótico Beta-lactama e assim por diante). Por exemplo, as composições farmacêuticas podem estar na forma de partículas compreendendo um polímero biodegradável e/ou um polímero de geleificação de polissacarídeo e/ou bioadesivo, um polímero anfifílico, um agente modificando as propriedades de interface das partículas e uma substância farmacologicamente ativa. Essas composições exibem certas características de biocompatibilidade que permitem uma liberação controlada da substância ativa. Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.700.486,
Polímeros podem ser usados para liberação controlada. Várias matrizes poliméricas degradáveis e não degradáveis para uso em aplicação de fármaco controlada são conhecidas na técnica (Langer, Accounts Chem. Res. 26:537, 1993). Por exemplo, o copolímero em bloco, poloxâmero 407, existe como um líquido viscoso, porém móvel, em temperaturas baixas, mas forma um gel semissólido na temperatura corporal. Ele foi mostrado ser um veículo eficaz para formulação e aplicação sustentada de interleucina-2 e
52/247 urease recombinantes (Johnston e outros, Pharm. Res. 9:425, 1992; Pec, J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58, 1990). Alternativamente, hidroxiapatita tem sido usada como um microcarreador para liberação controlada de proteínas (Ijntema e outros, Int. J. Pharm. 112:215, 1994). Em outro aspecto, os lipossomas são usados para liberação controlada bem como direcionamento a alvo de compostos encapsulados em lipídeo (Betageri e outros, Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, 1993). Vários sistemas adicionais para aplicação controlada de proteínas terapêuticas são conhecidos (por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.055.303; Patente U.S. No. 5.188.837; Patente U.S. No. 4.235.871; Patente U.S. No. 4.501.728; Patente U.S. No. 4.837.028; Patente U.S. No. 4.957.735; e Patente U.S. No. 5.019.369; Patente U.S. No. 5.055.303; Patente U.S. No. 5.514.670; Patente U.S. No. 5.413.797; Patente U.S. No. 5.268.164; Patente U.S. No. 5.004.697; Patente U.S. No. 4.902.505; Patente U.S. No. 5.506.206; Patente U.S. No. 5.271.961; Patente U.S. No. 5.254.342; e Patente U.S. No. 5.534.496).
Em várias modalidades, composições farmacêuticas incluem DMSO e/ou MSM e um agente terapêutico para tratar uma doença infecciosa, tal como H1N1, vírus herpes simplex ou HIV. Em algumas modalidades, as composições incluindo DMSO e/ou MSM são providas como um inalante para tratar uma doença infecciosa. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas para tratamento de uma doença infecciosa incluem DMSO e/ou MSM formulado como sólidos, enquanto em várias outras modalidades, composições incluindo DMSO e MSM são formuladas como líquidos. Em algumas modalidades, as composições são consumidas oralmente para tratar a doença infecciosa, enquanto em algumas outras modalidades as composições são aplicadas topicamente. Em uma modalidade particular, as composições são aplicadas em um dispositivo inalante que é configurado para gerar partículas da formulação que variam em tamanho de a partir de cerca de 0,5 um a cerca de 5 um.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas incluindo DMSO e/ou MSM permitem que antibióticos (ou outros agentes tera
53/247 pêuticos) penetrem o tecido pulmonar infectado com uma doença infecciosa. Em uma modalidade, tais composições incluindo DMSO e/ou MSM: (i) permitem que antibióticos atinjam níveis mais profundos de tecido infeccioso; (ii) permitem contato direto de tecido infectado; (iii) prolongam o tempo de exposição dos antibióticos ao tecido infectado; e/ou (iv) diminuem o tempo para obter o efeito antibiótico desejado. Em uma modalidade, DMSO e/ou MSM obtém um ou mais desses efeitos desejados através do uso como um inalante, onde o inalante compreende ainda um ou mais antibióticos ou outros agentes terapêuticos.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas incluindo formulações de DMSO e/ou MSM incluem ainda agentes antiparasíticos que são eficazes no tratamento de infecções causadas por parasitas, tais como nematoides, cestoides, trematoides, protozoários ou amebas.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas incluindo formulações de DMSO e/ou MSM incluem ainda agentes antifúngicos que são eficazes no tratamento de infecções fúngicas, tais como aquelas causadas por verme em anel, candidíase e Cryptococcus (meningite cryptococcal, por exemplo).
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas incluindo formulações de DMSO e/ou MSM incluem ainda agentes antivirais que são eficazes no tratamento de infecções virais. Em algumas modalidades, classes específicas de agentes antivirais são usadas para tratar infecções causadas por um tipo de vírus particular. Em algumas modalidades, agentes que se direcionam a HIV, vírus do herpes, vírus da hepatite B ou C e vírus da gripe, tal como H1N1, são usados.
Em várias modalidades, as composições de DMSO e/ou MSM incluem antibióticos que são eficazes no tratamento de infecções bacterianas através de, por exemplo, inibição de crescimento bacteriano, metabolismo, proliferação, atividade e/ou função. Em algumas modalidades, antibióticos bacteriostáticos são usados, enquanto em outras modalidades, antibióticos bactericidas são usados. Em ainda outras modalidades, ambos os antibióticos bacteriostáticos e bacterianos são incorporados a uma formulação
54/247 única compreendendo DMSO e/ou MSM. Em algumas modalidades, antibióticos de uma ou mais classes são incorporados a uma composição incluindo DMSO e/ou MSM. Em certas modalidades, uma composição inclui um ou mais de um: aminoglicosídeo, ansamicina, carbacepem, carbanepem, cefalosporina (1a, 2a, 3a, 4a ou 5a geração), glicopeptídeos, macrolídeo, monobactam, penicilina, polipeptídeo, quinolona, sulfonamida, tetracilina e similar.
Em algumas modalidades, doenças específicas são direcionadas através da incorporação de antibióticos específicos a uma composição descrita incluindo DMSO e/ou MSM. Por exemplo, macrólidos, tal como azitromicina ou eritromicina, são incorporados a formulações usadas para tratar infecções do trato respiratório ou micoplasmais. Da mesma maneira, penicilinas, tal como amoxicilina ou oxaciclina, são incorporadas a formulações usadas para tratar uma ampla faixa de infecções streptococais.
Em ainda outras modalidades, micro-organismos causadores de doença específicos são direcionados pelos antibióticos específicos incorporados a uma formulação compreendendo DMSO e/ou MSM. Por exemplo, aminoglicosídeos, tal como neomicina, são incorporados a formulações usadas para tratar infecções por Escherichia coli. Em várias modalidades, antibióticos tipicamente usados para combater infecções microbianas são usados. Em certas modalidades, antibióticos incluindo, mas não limitado a, isoniazida, rifampicina, pirazinamida e etambutol são incorporados a formulações compreendendo um ou mais de DMSO e MEM, e são usados para tratar uma doença infecciosa, incluindo uma doença infecciosa resistente a fármaco.
Em várias modalidades, composições incluem DMSO, MSM e um ou mais dos agentes terapêuticos que seguem: rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol são providos. Em outras modalidades, composições incluindo DMSO e pelo menos um de rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol são providas. Em modalidades adicionais, composições incluindo MSM e pelo menos um de rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol são providas. Em várias modalidades, as composições incluindo DMSO e/ou MSM em combinação com rifampicina, isoniazida, pirazinamida
55/247 e etambutol são providas para tratar uma doença infecciosa, incluindo uma doença infecciosa resistente a fármaco.
Em algumas modalidades, rifampicina é provida em uma dose diária total variando de a partir de cerca de 400 mg a cerca de 800 mg por dia. Em algumas modalidades, rifampicina é provida em uma dose diária total variando de a partir de cerca de 500 mg a cerca de 700 mg por dia, enquanto em ainda outras modalidades, ela é provida em uma dose diária total variando de a partir de cerca de 550 a cerca de 650 mg por dia, incluindo 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630 e 640 mg por dia.
Em algumas modalidades, isoniazida é provida em uma dose diária total variando de a partir de cerca de 100 mg a cerca de 500 mg por dia. Em algumas modalidades, isoniazida é provida em uma dose diária total variando de a partir de cerca de 200 mg a cerca de 400 mg por dia, enquanto em ainda outras modalidades, ela é provida em uma dose diária total variando de a partir de cerca de 250 mg a cerca de 350 mg por dia, incluindo 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330 e 340 mg por dia.
Em algumas modalidades, pirazinamida é provida em uma dose diária total variando de a partir de cerca de 1,0 a cerca de 4,0 por dia. Em algumas modalidades, pirazinamida é provida em uma dose diária total variando de a partir de cerca de 2,0 a cerca de 3,0 por dia, enquanto em ainda outras modalidades, ela é provida em uma dose diária total variando de a partir de cerca de 2,0 a 2,5 g por dia, incluindo 2,1, 2,2, 2,3 e 2,4 g.
Em algumas modalidades, etambutamol é provido em uma dose diária total variando de a partir de cerca de 0,5 a cerca de 2,5 g por dia. Em algumas modalidades, etambutamol é provido em uma dose diária total variando de a partir de cerca de 1,0 a 2,0 g por dia, enquanto em ainda outras modalidades, ele é provido em uma dose diária total variando de a partir de cerca de 1,0 a cerca de 1,5 g por dia, incluindo 1,1, 1,2, 1,3 e 1,4 g.
Em algumas modalidades, composições farmacêuticas incluindo DMSO e/ou MSM são usadas para pré-tratar um paciente sofrendo de uma doença infecciosa, tal como H1N1. Em algumas modalidades, a dose de DMSO e/ou MSM usada para pré-tratar pacientes varia de a partir de cerca
56/247 de 10% a 50% peso para volume. Em algumas modalidades, a dose de DMSO e/ou MSM de pré-tratamento varia de a partir de cerca de 20% a cerca de 40%, de a partir de cerca de 25% a 35%, incluindo 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34%. Em algumas modalidades, cerca de 50% a cerca de 100% de DMSO e/ou MSM são usados. Em várias modalidades, pré-tratamento com DMSO e/ou MSM aumenta a habilidade de um antibiótico em inibir atividade bacteriana e/ou sensibilizar uma linhagem resistente a fármaco a um fármaco que era anteriormente ineficaz.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é preparada, onde antimicrobianos são dissolvidos em DMSO e/ou MSM antes da administração. Isto é particularmente vantajoso em certas modalidades porque o antimicrobiano e o DMSO (e opcionalmente MSM) podem ser administrados a um indivíduo através de inalação. Inalantes, de acordo com algumas modalidades, proveem acesso direto do DMSO e/ou MSM a tecido pulmonar infectado para sensibilizar células bacterianas ao antibiótico.
Em uma modalidade, um inalante é provido para se direcionar ao sítio de infecção (por exemplo, pulmões) de várias doenças infecciosas. Em algumas tais modalidades, o dispositivo de inalação compreende um nebulizador. Em outras modalidades, um inalador é usado. Em algumas modalidades, um inalador de dose medida é usado, e a formulação é inalada em forma de aerossol líquido. Em outras modalidades, inaladores de pó seco são usados, e a formulação é inalada em uma forma de aerossol em pó. Em várias modalidades, administração oral, intravenosa, intramuscular ou subcutânea é usada em adição a ou ao invés de terapia inalante.
A habilidade em administrar agentes antimicrobianos como um inalante (por exemplo, em uma forma de aerossol em pó) com DMSO e/ou MSM é especialmente vantajosa em algumas modalidades porque ela permite estabilidade em prateleira maior e dosagens pré-embaladas. Isto é particularmente útil para indivíduos em nações subdesenvolvidas ou em desenvolvimento que não têm acesso regular a instalações de cuidado da saúde. Cursos de tratamento inteiros podem ser providos a um indivíduo afetado em uma visita única a um praticante de cuidado da saúde sem a necessidade de
57/247 uma internação hospitalar ou visitas repetidas. Em várias modalidades, as formulações descritas aqui são adequadas para autoadministração (por exemplo, através de dispositivos de inalação) e são então especialmente apropriadas para pacientes com acesso limitado a cuidado de saúde.
Em certas modalidades, o volume total de DMSO e/ou MSM inalado é cerca de 2-8 mL. Em algumas modalidades, o volume total de DMS e/ou MSM inalado é cerca de 2 mL a cerca de 4 mL. Em algumas modalidades, o volume total de DMSO e/ou SMS inalado é cerca de 6 mL a cerca de 8 mL. Em ainda outras modalidades, o volume total de DMSO e/ou MSM inalado é cerca de 3 mL a cerca de 7 mL, incluindo 4, 5, e 6 mL. Desta maneira, em algumas modalidades, a concentração de DMSO administrado através de inalação varia de a partir de cerca de 65% a cerca de 95%, incluindo 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 e 94%.
Em várias modalidades, MSM está incluído com o DMSO e compostos antimicrobianos inalados. Em certas modalidades, a quantidade de MSM inalado varia de a partir de cerca de 0,01% em peso a cerca de 70% em peso do inalante. Em outras modalidades, a formulação inalante contém entre cerca de 0,01% e 10% de MSM em peso. Outras modalidades contêm entre cerca de 10% e 20% de MSM, cerca de 20-30% de MSM, cerca de 30-40% de MSM, cerca de 40-50% de MSM, cerca de 50-60% de MSM ou cerca de 60-70% de MSM incluindo 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 e 70% de MSM. Ainda outras modalidades compreendem uma formulação contendo cerca de 7 e 15% de MSM, cerca de 15-25% de MSM, cerca de 25-35% de MSM, cerca de 35-45% de MSM, cerca de 55-60% de MSM, cerca de 60-65% de MSM ou cerca de 65-70% de MSM. Desta maneira, em algumas modalidades da formulação de inalação contendo MSM, a concentração de DMSO administrado varia de a partir de cerca de 50% a cerca de 95%, incluindo 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 e 94%.
Em várias modalidades, o uso de MSM reduz a quantidade de DMSO necessária para obter um efeito comparável e/ou aumentar a eficácia de DMSO em pelo menos 10%, 25%, 50%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 ve
58/247 zes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes. Em outras modalidades, o uso de MSM reduz a quantidade de um agente terapêutico necessária para obter um efeito comparável e/ou aumenta a eficácia do agente terapêutico em pelo menos 10%, 25%, 50%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes. Em modalidades adicionais, o uso de DMSO reduz a quantidade de um agente terapêutico necessária para obter um efeito comparável e/ou aumenta a eficácia do agente terapêutico em pelo menos 10%, 25%, 50%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes. Em ainda outras modalidades, o uso de DMSO e MSM reduz a quantidade de um agente terapêutico necessária para obter um efeito comparável e/ou aumenta a eficácia do agente terapêutico em pelo menos 10%, 25%, 50%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes comparado com DMSO ou MSM sozinho e/ou o agente terapêutico sozinho.
Em várias modalidades, uma formulação de pré-tratamento incluindo DMSO, sozinho ou em combinação com MSM, é administrada a um indivíduo intravenosamente, intramuscularmente, topicamente ou oralmente para aumentar os efeitos de uma terapia inalante compreendendo DMSO e/ou MSM com agentes terapêuticos, tais como antibióticos. O prétratamento com DMSO, sozinho ou em combinação com MSM, aumenta os efeitos terapêuticos do inalante em pelo menos 10%, 25%, 50%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes.
Em várias modalidades, indivíduos tendo uma doença infecciosa são tratados com uma formulação compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente em DMSO, sozinho ou em combinação com MSM, e um ou mais agentes terapêuticos, tais como antibióticos. Em algumas modalidades, a formulação inclui ainda outros agentes terapêuticos, carreadores ou excipientes. Em uma modalidade, a formulação inclui ainda arginina, vitamina D, antioxidantes, macrolídeos, linezolida, tioacetazona, tioridazina ou combinações dos mesmos.
DMSO prontamente rompe a integridade de muitos materiais (particularmente plástico e polímeros usados na fabricação de equipamento médico descartável). Desta maneira, várias modalidades da invenção com
59/247 preendem dispositivos que facilitam o armazenamento e a administração de DMSO. Em algumas modalidades, DMSO é armazenado em garrafas de vidro e administrado através de tubulação não reativa. Em outras modalidades, dispositivos inalantes são especialmente projetados para serem resistentes a DMSO. Em algumas modalidades, porções dos dispositivos inalantes são descartáveis ou substituíveis. De acordo com várias modalidades, formulações compreendendo DMSO são fabricadas, armazenadas e/ou administradas usando materiais e dispositivos descritos no Pedido de Patente U.S. No. 12/066.480, que é o registro da Fase Nacional do Pedido de Patente Internacional No. PCT/US06/35499, depositado em 11 de setembro de 2006, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
Em certas modalidades, o dispositivo de aplicação aplica gotículas ou partículas da formulação inalada de um tamanho capaz de atingir os bronquíolos dos pulmões do paciente. Em algumas modalidades, o dispositivo de aplicação é sincronizado com o ritmo respiratório de um paciente para levar a formulação para os bronquíolos. Terapia inalante de acordo com uma modalidade permite administração mais direta da formulação inalada a tecidos alvo pulmonares infectados. Direcionamento direto é vantajoso em algumas modalidades porque ele permite redução da quantidade de compostos antimicrobianos incorporados à formulação enquanto mantendo ou melhorando a eficácia da formulação contra micro-organismos infecciosos. Em outras modalidades, administração direta aumenta a eficácia de um dado regime antimicrobiano contra uma ou mais linhagens de micro-organismos resistentes a fármaco. Direcionamento direto, de acordo com outras modalidades, minimiza os efeitos colaterais através da minimização do contato com tecido não alvo.
O tamanho de gotícula ou partícula pequeno que é provido de acordo com algumas modalidades reduz o volume de DMSO e/ou MSM que é administrado comparado com terapia de ventilador tradicional. Por exemplo, em uma modalidade, o uso de um dispositivo inalante (pro exemplo, nebulizador) será eficaz com cerca de 6 mg a cerca de 25 mg de DMSO e/ou MSM diariamente, comparado com 50-100 mg diariamente quando adminis
60/247 trado através de certos outros cursos. Redução de DMSO é benéfica em algumas modalidades porque ela reduz efeitos colaterais indesejados e odor. Em outras modalidades, quantidades maiores de DMS são usadas e toleradas.
Em várias modalidades, a adição de MSM reduz inesperadamente o odor desagradável normalmente sentido com uso de DMSO. Por exemplo, em certas modalidades, formulações de DMSO e MSM não produzem nenhum odor perceptível após uso. Em algumas outras modalidades tendo concentrações de DMS se aproximando de ou excedendo 50%, a combinação com MSM na formulação reduz ou elimina o odor baseado em DMSO. Tal resultado é inesperado, dado o fato que uso de DMSO é normalmente associado com um odor desagradável forte.
Em algumas modalidades, o uso de DMSO e/ou MSM com agentes terapêuticos (tal como antibióticos) permite a fabricação e/ou administração de tamanhos de gotículas ou partícula pequenos, desta maneira reduzindo a irritação da mucosa da boca e da garganta, uma vez que gotículas ou partículas viajam mais profundamente para os pulmões do paciente. Em algumas modalidades, a profundidade da viagem das gotículas ou partículas aumenta a concentração dos antibióticos dissolvidos nos pulmões do paciente.
Em várias modalidades, as composições de DMSO e/ou MSM são combinadas com agentes terapêuticos (tais como antibióticos) e providas como um aerossol para aplicar fármacos localmente ativos ao sistema respiratório para tratar uma doença respiratória. Em uma modalidade, as vias aéreas inferiores são contatadas (ou contatadas exclusivamente) com a composição. Em outras modalidades, a composição é usada para tratar sistemicamente doenças. Para fármacos sistemicamente ativos, as partículas de aerossol são dimensionadas para atingir a superfície alveolar em áreas periféricas do pulmão.
Em algumas modalidades, o uso de composições de DMSO e/ou MSM compreendendo um agente terapêutico (tal como um antibiótico) é particularmente vantajoso porque ele provê início de ação rápido. Em uma mo
61/247 dalidade, aplicação por inalação provê uma área de absorção grande do pulmão. Para fármacos de ação localmente, o início de ação é imediato em algumas modalidades. Formulações inaladas sistemicamente ativas, de acordo com algumas modalidades, atingem a corrente sanguínea rapidamente. Terapia de inalação provê um efeito terapêutico dentro de cerca de 1-90 minutos em algumas modalidades. Em uma modalidade, DMSO e/ou MSM aumentam a biodisponibilidade do agente terapêutico. Em uma modalidade adicional, DMSO e/ou MSM reduz a degradação do agente terapêutico. Em outra modalidade, formulações aerossol descritas aqui reduzem os efeitos colaterais gastrintestinais ou irritação da pele que podem ocorrer com tratamento oral ou tópico.
Em várias modalidades, partículas inalantes são dimensionadas para minimizar o depósito dessas partículas por impacto de inércia nas vias áreas superiores sem atingir o sítio de ação. Em várias modalidades, as partículas são dimensionadas para minimizar depósito na boca e garganta, desta maneira minimizando o engolimento e efeitos colaterais locais ou sistêmicos indesejados. Em várias modalidades, as partículas são menores do que 2, 5 ou 10 pm. Em uma modalidade, as partículas são de cerca de 3-5 pm e são transportadas para as bifurcações e vias aéreas menores dos bronquíolos. Em outra modalidade, as partículas são de menos do que 3 pm e seguem o fluxo de ar para os alvéolos. Em várias modalidades, o uso de DMSO e/ou MSM permite otimização do tamanho de partícula do agente terapêutico. Desta maneira, doenças tal como uma doença infecciosa podem ser mais eficazmente tratadas. Além disso, em várias modalidades, o uso de DMSO e/ou MSM sensibiliza micro-organismos resistentes a fármaco para antibióticos.
Em várias modalidades, DMSO e/ou MSM formam uma solução, mistura, emulsão, suspensão ou outra combinação adequada com o agente terapêutico. Em uma modalidade, homogeneização, sonificação, processamento de fluido de cisalhamento alto ou outros métodos mecânicos são usados para combinar o agente terapêutico com o DMSO e/ou MSM. Em outras modalidades, o agente terapêutico dissolve prontamente em DMSO. Diferen
62/247 te dos outros solventes fortes, DMSO não é prejudicial para tecido pulmonar. Desta maneira, DMSO é especialmente vantajoso em algumas modalidades porque ele pode ambos dissolver o agente terapêutico e aplicar o dito agente sem danificar tecido pulmonar. Em algumas modalidades, DMSO dissolve pelo menos 50%, 75%, 90%, 95% ou 99% do agente terapêutico e, em uma modalidade, é capaz de prevenir precipitação indesejada do agente terapêutico.
Em algumas modalidades, sprays, géis ou lenços compreendendo DMSO, sozinho ou em combinação com MSM, e agentes bacterianos são providos para sanitização de equipamento médico, superfícies e corpo para minimizar o espalhamento de doença infecciosa.
Em várias modalidades, uma composição farmacêutica compreendendo DMSO e/ou MSM e agentes antimicrobianos são usados como um tratamento para uma doença infecciosa.
Em certas modalidades, as composições descritas aqui são eficazes para tratar várias doenças infecciosas incluindo, mas não limitado a, infecção por acinetobacter, actinomicose, infecção por Adenovirus, doença do sono Africana (tripanossomíase Africana), AIDS, amebíase, anaplasmose, Anthrax, infecção por Arcanobacterium haemolyticum, febre hemorrágica Argentina, ascaríase, aspergilose, infecção por astrovírus, babesiose, infecção por Bacillus cereus, pneumonia bacteriana, vaginose bacteriana (BV), infecção por Bacteróides, balantidíase, infecção por Baylisascaris, infecção pelo vírus BK, piedra preta, infecção por Blastocystis hominis, blastomicose, febre hemorrágica Boliviana, infecção por Borrelia, botulismo, febre hemorrágica Brasileira, brucelose, infecção por Burkholderia, infecção por Calicivírus, campilobacteriose, candidíase(moniliase; infecção oral), doença da arranhadura do gato, celulite, doença de Chagas, cancroide, varicela, clamídia, infecção por Chlamydophila pneumoniae, cólera, cromoblastomicose, clonorquíase, infecção por Clostridium difficile, coccidioidomicose, febre do carrapato do Colorado, resfriado comum, doença de creutzfeldt-Jacob, febre hemorrágica de Crimean-Congo, criptococose, criptosporidiose, larva cutânea migratória (CLM), ciclosporíase, cisticercose, infecção por citomegaloví
63/247 rus, febre da dengue, dientamebíase, difteria, difilobotriase, dracunculiase, febre hemorrágica do ebola, equinocose, erliquiose, enterobiase (infecção por lombriga), infecção por Enterococcus, infecção por enterovirus, tifo epidêmico, eritema infeccioso, exantema súbito, fasciolopsíase, fasciolose, insônia familiar fatal (fatal familial insomnia) (FFI), filaríase, envenenamento alimentar, infecção por ameba de vida livre, infecção por Fusobacterium, gangrena gas (mionecrose Clostridial), geotricose, síndrome de GerstmannStrãussler-Scheinker (GSS), giardíase, muermo, gnatostomíase, gonorréia, granuloma inguinal (Donovanose), Infecção estreptococcal Grupo A, Infecção estreptococcal Grupo B, infecção por Haemophilus influenzae, doença da mão, pé e boca (hand, foot and mouth disease (HFMD)), Hantavirus, infecção por Helicobacter pylori, (síndrome hemolítica-urêmica (hemolyticuremic syndrome (HUS)), febre hemorrágica com síndrome renal (hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS)), Hepatite A, B, C, D ou E, virus herpes simplex, histoplasmose, infecção por tênia, infecção por bocavírus humano, erliquiose por ewingii humana, anaplasmose granulocítica humana (human granulocytic anaplasmosis (HGA)), infeçcão por metapneumovírus humano, erliquiose monocítica humana, infecção por papilomavírus humano (HPV), infecção por vírus da parainfluenza humano e himenolepíase.
Em certas modalidades, as formulações descritas aqui são também eficazes no tratamento de uma ou mais das doenças infecciosas que seguem Mononucleose Infecciosa pelo Vírus Epstein-Barr (Mono), Influenza (gripe), Isosporíase, doença de Kawasaki, queratite, infecção por Kingella kingae, Kuru, febre de Lassa, Legioneose, Leishmaníase, Leprosia, Leptospirose, Listeriose, doença de Lyme, Filaríase linfática, Coriomeningite Linfocítica, Malária, febre hemorrágia de Marburg (Marburg hemorrhagic fever (MHF)), Sarampo, Melioidose (doença de Whitmore), Meningites, Doença meningocócica, Metagonimiase, Microsporidiose, Microsporidia, Molluscum contagiosum (MC), Caxumba, Tifo murino, Pneumonia por micoplasma, Micetoma, Miiase, Conjuntivite Neonatal, Oncocercose (Cegueira do rio), Paracocidioidomicose (blastomicose Sulamericana), Paragonimiase, Pasteurelose, Pediculosis capitis (Piolho da cabeça), Pediculosis corporis (Piolho do
64/247 corpo), Pediculosis pubis (Piolho pubiano, Piolho-caranguejo), Doença inflamatória pélvica (Pelvic inflammatory disease (PID)), Coqueluche, Praga, infecção Pneumococcal, Pneumonia pneumocistica (Pneumocystis pneumonia (PCP)), Pneumonia, Poliomielite, Poliovirus, Meningoencefalite amébica primária (Primary amoebic meningoencephalitis (PAM)), Leucoencefalopatia multifocal progressiva, Psitacose, febre Q, Raivas, Febre da mordida do rato, Vírus sincicial respiratório, Rinosporidiose, infecção por Rinovírus, infecção Rickettsial, Rickettsialpox, febre do Vale Rift (Rift Valley fever (RVF)), Febre maculosa das montanhas rochosas (Rocky mountain spotted fever (RMSF)), infecção por Rotavirus, Rubéola, Salmonelose, Síndrome Respiratória Aguda Severa SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome), Sarna, Esquistossomiase, Sepse, Shigelose, Herpes (Herpes zoster), Smallpox, Esporotricose, envenenamento de alimento Staphylococcal, Estrongiloidíase, Sífilis, Tênia, Tétano (tetania), Tinea barbae (Coceira do barbeiro), Tinea capitis (Dermatomicose do Couro cabeludo), Tinea corporis (Dermatomicose do Corpo), Tinea cruris (Coceira na Virilha), Tinea manuum (Dermatomicose da Mão), Tinea nigra, Tinea pedis (Pé de Atleta), Tinea unguium (Onicomicose), Tinea versicolor (Pitiriase versicolor), Toxocaríase (Larvas Migratórias Oculares (OLM)), Toxocaríase (Larva Migratória Visceral (VLM)), Toxoplasmose, Triquinelose, Tricomoníase, Trichuríase (Infecção por gusano), Tularemia, infecção por Ureaplasma urealyticum , Encefalite equina Venezuelana, Febre hemorrágica Venezuelana, Pneumonia Viral, Febre do Nilo do Oeste, Piedra Branca, Yersiniose, Febra amarela e Zigomicose.
Em várias modalidades, as composições descritas aqui são particularmente eficazes no tratamento de uma ou mais doenças infecciosas que são resistentes a terapias de fármaco. Em adição a essas doenças infecciosas listadas acima, que podem já ser ou podem se tornar resistentes a fármaco no futuro, certas modalidades são eficazes no tratamento, dentre outras, doenças resistentes a fármaco: sarampo, tétano, malária, infecções respiratórias dos tratos superior e inferior, hepatite, febre tifoide, infecção por Staphylococcus aureus intermediária vancomicina/glicopeptídeo, enterococci resistente à vancomicina, Staphylococcus aureus resistente à meticilina
65/247 (MRSA) e Streptococcus pneumoniae.
Em algumas modalidades, tratamento de uma doença infecciosa compreende o pré-tratamento de um paciente com DMSO, seguido pela administração de uma composição farmacêutica compreendendo DMSO e agentes antimicrobianos. Em outras modalidades, tratamento de uma doença infecciosa compreende o pré-tratamento de um paciente com DMSO, seguido pela administração de uma formulação compreendendo DMSO, MSM e agentes antimicrobianos. Em algumas modalidades, pré-tratamento com DMSO é administrado intravenosamente através de um cateter IV de gotejamento. Em outras modalidades, o DMSO é dado em uma injeção de bolo IV. Em ainda outras modalidades, pré-tratamento com DMSO não é realizado. Composições de pré-tratamento incuem ainda MSM, um agente terapêutico ou uma combinação dos mesmos em algumas modalidades.
Em várias modalidades, composições incluindo DMSO e agentes antimicrobianos ou DMSO, MSM e agentes antimicrobianos são administradas oralmente, intravenosamente, intramuscularmente ou subcutaneamente. No entanto, como o sítio de infecção de várias doenças infecciosas são os pulmões, em algumas modalidades, formulações são administradas através de inalação. Em tais modalidades, o dispositivo inalante compreende um nebulizador. Em outras modalidades, um inalador é usado.
Em várias modalidades, os indivíduos são pré-tratados com DMSO usando DMSO intravenoso através de gotejameto dentro de, por exemplo, um período de dez minutos. Em uma modalidade, DMSO será provido em garrafas de vidro com tubulação não reativa da proprietária. Os indivíduos vão então receber antibióticos dissolvidos em DMSO em doses de 3 mL através de um inalante ou spray bucal três vezes por dia com refeições. Em uma modalidade, pré-tratamento com DMSO é provido na faixa de cerca de 25 mg a cerca de 75 mg (por exemplo, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg) em 200 mL de dextrose 5% e água. Em uma modalidade, 56 mg de DMSO em 200 mL de dextrose 5% e água são providos. Em uma modalidade, os antibióticos que seguem são providos: rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol. Em uma modalidade, cerca de 600 mg de rifampicina,
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300 mg de isoniazida, 2,4 g de pirazinamida e 1,2 g etambutol são administrados por dia, através de um inalador/nebulizador ou spray bucal aplicado em dosagens de 3 mL, três vezes por dia. Em uma modalidade, os antibióticos são combinados com DMSO para aplicação através de inalação, com ou sem o pré-tratamento com DMSO. Pré-tratamento com MSM é também provido em várias modalidades. Pré-tratamento intravenoso de DMS, MSM ou a combinação dos dois é provido em algumas modalidades. Em alguns exemplos, formulações de pré-tratamento incluem agentes terapêuticos.
Em várias modalidades, efeitos terapêuticos são obtidos dentro de duas semanas de tratamento, dentro de dois meses de tratamento e/ou dentro de seis meses de tratamento. Outras janelas terapêuticas são também providas.
Em algumas modalidades, pacientes pré-tratados com DMSO mostram melhor aperfeiçoamento do que aqueles tratados com DMSO inalante e antibióticos sem pré-tratamento com DMSO intravenoso. Em algumas modalidades, pacientes tratados com DMSO com DMSO inalante e antibióticos mostram melhor progresso do que aqueles tratados com antibiótico sozinho. Em várias modalidades, a adição de MSM à formulação aumenta os efeitos terapêuticos ou reduz os efeitos colaterais. Em uma modalidade, MSM é usado sozinho como um pré-tratamento.
Em várias modalidades, as composições descritas aqui são usadas não apenas para tratar sintomas e doenças indesejados, mas podem também agir como um agente de prevenção. Por exemplo, a formulação pode ser tomada em uma base regular para prevenir o início de doença. Em uma modaidde, os indivíduos sob risco (por exemplo, membros da família ou indivíduos que estão expostos a pacientes tendo uma doença infeccisoa) são administrados com doses menores de DMSO e/ou MSM e antibióticos para prevenir o início de infecção.
IV. Método de Uso de MSM
São descritos aqui métodos de uso de qualquer uma das composições de MSM descritas (conforme descrito na Seção III) para modular a atividade microbiana, tal como aumentar ou inibir a atividade de micro
67/247 organismos. Por exemplo, métodos de aumento da atividade microbiana são descritos, os quais incluem métodos de aumento do crescimento microbiano, eficiência de fermentação, eficiência de cultura, sobrevivência microbiana ou qualquer combinação dos mesmos. Métodos de inibição de atividade microbiana são também descritos, os quais incluem métodos de inibição de crescimento microbiano (tal como crescimento bacteriano) ou infecção. Em algumas modalidades, MSM seletivamente aumenta a atividade (por exemplo, crescimento) de micro-organismos (tal como um micro-organismo probiótico) e inibe a atividade de micróbios indesejados (tal como uma atividade bacteriana ou fúngica indesejada).
A. Métodos de Aumento da Atividade Microbiana
Métodos de aumento de atividade microbiana são descritos. Em uma modalidade, um método para aumento da atividade de um microorganismo inclui provisão de micro-organismos, um meio capaz de apoiar crescimento dos micro-organismos e MSM em uma quantidade suficiente para aumentar a atividade (por exemplo, eficiência de fermentação, crescimento, eficiência de cultura e/ou sobrevivência microbiana) dos microorganismos e contato do MSM com o meio, desta maneira aumentando o crescimento dos micro-organismos no meio. É compreendido que o MSM pode ser adicionado ao meio antes do, concomitante com ou após o meio ser contatado com os micro-organismos. Em uma modalidade particular, MSM é provido em uma concentração de cerca de 0,04% a cerca de 5% em peos do meio ou em peso do teor de umidade do meio. Desta maneira, em tais exemplos, MSM (tal como uma composição incluindo cerca de 0,5% a cerca 5% de MSM) é usado para aumentar o crescimento microbiano. Por exemplo, MSM é usado para aumentar a eficiência de fermentação, tal como aumentar a eficiência de fermentação associada com a produção de cerveja, cidra, vinho, um biocombustível, produto laticínio ou qualquer combinação dos mesmos. Em vários exemplos, MSM aumenta a produção de certos processos de fabricação de alimento ou bebida que se baseiam em microorganismos, tal como processo de produção de cerveja, produção de vinho, assado, produção de conserva, produção de produto laticínio e similar. Em
68/247 exemplos adicionais, MSM é usado para aumentar o crescimento de um ou mais micro-organismos probióticos ou um micro-organismo em uma amostra de teste de diagnóstico. Em exemplos adicionais, MSM é usado para aumentar a eficiência de cultura e/ou sobrevivência de micro-organismos.
/. Métodos para Aumentar a Eficiência de Fermentação de Microorganismos com MSM
Em várias modalidades, MSM é usado para facilitar produção de energia. Desta maneira, são descritos aqui métodos de aumento da produção de energia, incluindo métodos de aumento da eficiência de fermentação de micro-organismos. Por exemplo, micro-organismos podem ser usados em um processo de fermentação para produzir etanol e em reatores de biogás para produzir metano. Fermentação é um processo de fornecimento de energia onde moléculas orgânicas ou sintéticas são degradadas através de metabolismo por micro-organismos. Algumas formas de micro-organismos, tal como bactéria ou levedura, podem ser usadas para converter várias formas de refugos agricultural e urbano em combustíveis úteis. Microorganismos podem ser usados como células de combustível microbianas vivas. Em algumas modalidades, MSM aumenta crescimento e metabolismo microbianos. Em algumas modalidades, MSM aumenta produção de energia bacteriana. Em algumas modalidades, MSM aumenta crescimento e metabolismo de levedura. Em algumas modalidades, MSM aumenta produção de energia de levedura.
Em várias modalidades, MSM é usado para ativar ou aumentar um ou mais do que segue: (i) fermentação de etanol ou outra respiração anaeróbica usada principalmente por levedura quando oxigênio não está presente em quantidade suficiente para respiração celular normal; (ii) produção de hidrogênio fermentativa; (iii) fermentação industrial ou outro rompimento e remontagem de agentes bioquímicos para indústria; (iv) a conversão de carboidratos em álcoois ou ácidos sob condições anaeróbicas usadas para preparação de alimento (por exemplo, pães, laticínio, feijões, vinho, chucrute, kimchee, peixe e tofu); (v) fermentação para fabricação de brandy, whiskey, vodka, cerveja, vinho ou cidra, (vi) fermentação para fabricação de glicosa
69/247 mina; e (vii) fermentação para o tratamento aeróbico de folhas de chá para romper agentes químicos indesejados e desenvolver outros que impactam, por exemplo, o sabor e/ou nutrientes de chá.
Em uma modalidade, um método de aumento de eficiência de fermentação de um micro-organismo inclui contato do meio contendo um micro-organismo capaz de fermentação com MSM, onde o MSM é provido em uma concentração de cerca de 0,04% a cerca de 5% em peso do meio ou em uma concentração de cerca de 0,04% a cerca de 5% em peso do teor de umidade do meio, onde a concentração de MSM aumenta a eficiência de fermentação do micro-organismo comparado com a eficiência de fermentação na ausência de MSM.
Em uma modalidade, eficiência de fermentação aumentada é indicada por um aumento de pelo menos 10%, tal como cerca de 20% a 80%, um aumento de cerca de 30% a 50%, incluindo um aumento de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 300% em produção de álcool, dióxido de carbono ou ácido na presença de MSM pelo micro-orgnismo comparado com produção de álcool, dióxido de carbono ou ácido na ausência de MSM. Por exemplo, o método de aumento da eficiência de fermentação é pará a produção de cerveja, cidra, vinho, um biocombustível, pão, produto laticínio ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, aumento da eficiência de fermentação inclui um aumento de pelo menos 10%, tal como cerca de 20% a 80%, um aumento de cerca de 30% a 50%, incluindo um aumento de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 300% em produção de etanol, metanol ou uma combinação dos mesmos comparado com a produção de etanol, metanol ou uma combinação dos mesmos na ausência de MSM. Em um exemplo particular, o micro-organismo é levedura e o método de aumento de fermentação é para a produção de cerveja. Em outro exemplo, o micro-organismo é alga e o método de aumento de fermentação é para a
70/247 produção de biocombustível.
Em algumas modalidades, aumento de eficiência de fermentação inclui um aumento de pelo menos 10%, tal como cerca de 20% a 80%, um aumento de cerca de 30% a 50%, incluindo um aumento de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 300% em produção de dióxido de carbono na presença de MSM pelo micro-organismo comparado com produção de dióxido de carbono na ausência de MSM. Em um exemplo particular, o micro-organismo é levedura e o método de aumento de fermentação é para a produção de pão.
Em modalidades adicionais, MSM é usado para controlar o processo de fermentação na produção de produtos laticínios culturados tais como iogurte, leite, queijo e similar. Por exemplo, métodos de aumento da eficiência de fermentação incluem um aumento de pelo menos 10%, tal como cerca de 20% a 80%, aumento de cerca de 30% a 50%, incluindo um aumento de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 96%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 300% em produção de ácido láctico na presença de MSM pelo micro-organismo comparado com produção de ácido láctico na ausência de MSM.
Em algumas modalidades, a concentração de MSM eficaz para aumentar a eficiência de fermentação é cerca de 0,04% a cerca de 5%, tal como cerca de 0,1% a cerca de 4%, 0,5% a cerca de 3%, cerca de 1% a cerca de 2%, incluindo cerca de 0,04% a cerca de 0,05%, cerca de 0,06%, cerca de 0,07%, cerca de 0,08%, cerca de 0,09%, cerca de 0,1%, cerca de 0,3%, cerca de 0,5%, cerca de 0,7%, cerca de 1%, cerca de 1,5%, cerca de 2,0%, cerca de 2,5%, cerca de 3%, cerca de 4% ou cerca de 4,5% em peso de meio ou pelo teor de umidade do meio. Em algumas modalidades, MSM é adicionado aos pacotes de levedura para gerar levedura de ativação rápida ou instantânea para uso doméstico ou comercial.
Em alguns exemplos, o meio para o método de aumento de efi
71/247 ciência de um micro-organismo inclui uma concentração de cloreto de sódio de menos do que 5% de teor de umidade total do meio, tal como cerca de 1% a cerca de 3% de cloreto de sódio, incluindo 0%, 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 2,5%, 3% ou 4%.
Em certas modalidades, MSM é usado para fabricação de cerveja. Culturas de levedura estão envolvidas na produção de cerveja durante o processo de fermentação para produzir etanol e dióxido de carbono. Em alguns exemplos, MSM é usado para acelerar ou facilitar ativação da cultura de levedura, aumentar a fermentação, reduzir contaminação ambiental potencial (tal como de micro-organismos de origem no ar indesejáveis) ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, um aumento na eficiência para ativar a levedura (tal como um aumento na eficiência do processo de partida), um aumento na eficiência do processo de fermentação ou combinação dos mesmos é indicado por um aumento de pelo menos 10%, tal como cerca de 20% a 80%, aumento de cerca de 30% a 50%, incluindo um aumento de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 300% comparado com um controle (tal como eficiência desses processos na ausência de MSM).
Em várias modalidades, MSM é usado para aumento da atividade de alga, incluindo o processo de fermentação associado com geração de biocombustível a partir do uso de alga. Em uma modalidade, isto é particularmente benéfico para algacultura (fazenda de alga) para fabricação de óleo vegetal, biodiesel, bioetanol, biogasolina, biometanol, biobutanol e/ou outros biocombustíveis. Em uma modalidade, a adição de MSM aumenta a taxa de crescimento de alga em cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 100%, cerca de 200%, cerca de 300%, cerca de 400%, cerca de 500% ou mais. MSM pode ser particularmente vantajoso porque, através do aumento da atividade de alga (tal como crescimento de alga), a produção de biocombustíveis pode ser tornar escalável, economicamente competitiva e/ou comercialmente viável. Em uma modalidade, MSM realça o processo através do qual o produto de alga é coletado e convertido em bio
72/247 combustível. Em outras modalidades, MSM realça o processo através do qual o teor de carboidrato da alga é fermentado em bioetanol ou biobutanol. Em algumas modalidades, MSM realça o processo de alga através de (i) aumento do rendimento de alga, (ii) formação de colônias de alga mais robustas, (iii) encurtamento do tempo para coleta, (iv) encurtamento do tempo de fermentação, (v) aumento da fermentação e/ou então apoio ou aumento do crescimento, reprodução, proliferação, taxa de sobrevivência, metabolismo, vitalidade, robustez, ação e/ou função da alga. Algas incluindo, mas não limitado a, Botryococcus braunii, Chlorella, Dunaliella tertiolecta, Gracilaria, Pleurochrysis carterae e Sargassum são aumentadas por MSM de acordo com várias modalidades.
ii. Métodos para Aumentar o Crescimento Microbiano com MSM
Em algumas modalidades, a adição de MSM é particularmente vantajosa porque MSM promove o crescimento de certos organismos (por exemplo, probióticos). Em algumas modalidades, micro-organismos cultivados com uma composição de meio compreendendo MSM têm uma curva de taxa de crescimento maior comparado com uma composição comparável sem MSM. Em algumas modalidades, micro-organismos cultivados com uma composição compreendendo MSM têm uma densidade de população geral aumentada comparado com uma composição comparável sem MSM. Em certas modalidades, MSM aumenta significantemente o crescimento simultâneo de um ou mais micro-organismos. Em algumas modalidades, meio suplementado com uma composição de MSM para aumento da atividade microbiana (tal como uma faixa de concentração de cerca de 0,4% a cerca de 5% ou qualquer uma das composições de MSM para aumento do crescimento microbiano provido na Seção III) aumenta o crescimento de microorganismos.
Alguns micro-organismos são organismos anaeróbicos (anaeróbios). Anaeróbios não requerem oxigênio para crescimento. Anaeróbios podem ser usados para fermentação e/ou cultura. Em algumas modalidades, MSM tem um impacto positivo sobre anaeróbios, tal como Bifidobacterium, dentre outros. Em tais modalidades, MSM tem um impacto positivo maior
73/247 sobre crescimento de anaeróbios do que outros micro-organismos. Em outras modalidades, MSM tem um impacto positivo maior sobre crescimento de bactérias aeróbicas comparado com outros micro-organismos. Em ainda outras modalidades, aeróbios e anaeróbios são ambos positivamente impactados pela presença de MSM.
As bactérias podem geralmente ser classificadas como grampositivas ou gram-negativas, dependendo da estrutura de sua parede celular. Bactérias gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Escherichia coli, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, bactérias do ácido acético, Legionella, alfa-proteobactérias, cianobactérias, espiroquetas, bactérias de enxofre verde e não enxofre verde. Entéricos são bactérias Gram-negativas de fromato de haste; a maioria ocorre normalmente ou patogenicamente nos intestinos de humanos e outros animais. Em algumas modalidades, MSM tem um impacto positivo sobre o crescimento de bactérias gram-positivas. Em outras modalidades, MSM tem um impacto positivo sobre o crescimento de bactérias gram-negativas. Em tais modalidades, MSM tem um impacto positivo maior sobre bactérias gram-negativas do que bactérias gram-positivas. Em outras modalidades, MSM tem um impacto positivo maior sobre bactérias gram-positivas do que bactérias gram-negativas. Em ainda outras modalidades, MSM tem um impacto positivo sobre ambas as bactérias gram-negativas e gram-positivas.
Probióticos incluem micro-organismos vivos pensados ser saudáveis para o organismo hospedeiro. Bactérias do ácido láctico (LAB) (Lactic acid bacteria) e bifidobactérias são tipos comuns de micróbios usados como probióticos. Certas leveduras e bacilos são também usados. Em várias modalidades, MSM é usado para aumentar a sobrevivência ou crescimento de pelo menos um probiótico. Efeito sobre sobrevivência de organismos probióticos pode ser medido em três pontos de acordo com algumas modalidades: capacidade de sobrevivência, colonização e produção de ácido láctico. Para serem eficazes na manutenção da saúde do trato gastrintestinal, bactérias probióticas devem ser capazes de sobreviver. Bactérias que são mortas
74/247 quando chegam, na maioria dos caoss, não proveem nenhum benefício. Desta maneira, em algumas modalidades, MSM afeta positivamente sobrevivência de probiótico. Em certas modalidades, MSM melhora a sobrevivência inicial quando da exposição de bactérias a um novo ambiente. Desta maneira, em tais modalidades, um produto compreendendo um probiótico e MSM estabelece uma população maior ou mais saudável (ou ambas) de bactérias probióticas no intestino comparado com produtos probióticos sozinhos. Em certas modalidades, MSM melhroa a sobrevivência a longo prazo de probióticos. Desta maneira, em tais modalidades, um produto compreendendo um probiótico e MSM estabelece uma duração mais longa e, com base em crescimento, uma população maior de bactérias probióticas no intestino comparado com produtos probióticos sozinhos. Dessas bactérias probióticas que chegam no intestino vivas, aquelas que colonizam (multiplicam no) o intestino geralmente proveem benefício. Desta maneira, em várias modalidades, MSM melhora a velocidade e a frequência de multiplicação de probiótico. Em ainda outras modalidades, MSM aumenta a produção de ácido láctico.
Em algumas modalidades, MSM tem um impacto positivo sobre crescimento de probiótico. Em algumas modalidades, MSM tem um impacto positivo sobre a flora microbiana do trato gastrintestinal. Em tais modalidades, MSM tem um impacto positivo sobre a saúde intestinal. Em algumas modalidades, alimentos contendo probióticos são suplementados com MSM, e os níveis de probiótico resultantes obtidos no trato intestinal são maiores do que após ingestão do alimento contendo probiótico sozinho. Em algumas tais modalidades, a adição de MSM resulta em nível maior de organismo probiótico em uma estrutura de tempo mais curta do que com ingestão de alimento contendo probiótico sozinho. Em algumas modalidades, probióticos que requerem 24 a 48 horas antes dos efeitos serem observados são tornados mais eficazes porque MSM aumenta seu tempo de vida.
O crescimento bacteriano tipicamente tem uma fase lag inicial onde as bactérias se ajustam ao ambiente, antes de irem para a fase log, onde as células duplicam. Após a fase log há uma fase estacionária. Durante
75/247 a fase estacionária, a taxa de crescimento diminui como um resultado de depleção de nutriente e acúmulo de subprodutos metabólicos. Esta fase é atingida uma vez que os micróbios começam a exaurir os recursos que estão disponíveis para eles. Esta fase é de um valor relativamente constante uma vez que a taxa de crescimento microbiano é igual à taxa de morte microbiana. Na fase de morte, as bactérias tipicamente exaurem nutrientes e os números da população caem.
Em algumas modalidades, MSM impacta a fase log, fase lag, fase estacionária, fase de morte ou qualquer combinação das mesmas. Em certas modalidades, MSM encurta a fase lag, de maneira que as bactérias, tais como bactérias probióticas, começam a fase log mais cedo. Em várias modalidades, MSM prolonga a fase estacionária. Em certas modalidades, a taxa de morte é diminuída na presença de MSM. Certas modalidades da invenção conforme aqui descrito afetam positivamente uma ou mais e, em certas modalidades todas, fases de crescimento de bactérias probióticas.
Em algumas modalidades, MSM impacta o metabolismo de micróbios (por exemplo, probióticos), na fase lag. Durante a fase lag, os micróbios estão amadurecendo (crescendo em tamanho) e não são capazes ainda de se dividir (então não crescendo em número). Durante a fase lag do ciclo de crescimento microbiano, síntese de RNA, enzimas e outras moléculas ocorre. Em algumas modalidades, MSM diminui a duração da fase log através da aceleração da maturação (e adaptação de micro-organismos aos estressores ambientais) dos micro-organismos, desta maneira permitindo divisão microbiana mais cedo do que em meios sem MSM.
Em algumas modalidades, suplementação com MSM rsulta em um aumento na fase log de crescimento de micróbios (por exemplo, probióticos). A fase exponencial (algumas vezes chamada a fase log) de crescimento é um período caracterizado por duplicação celular. O número de micróbios novos que aparece por tempo unitário é proporcional à presente população. Se crescimento não for limitado, duplicação vai continuar em uma taxa constante então o número de células e a taxa de população aumentam duas vezes com cada período de tempo consecutivo. Crescimento exponencial não
76/247 pode continuar indefinidamente, no entanto, porque o meio é logo depletado de nutrientes e enriquecido com refugos. Em algumas modalidades, MSM aumenta a duração geral da fase exponencial. Em outras modalidades, a presença de MSM no meio de crescimento promove entrada microbiana na fase exponencial mais rapidamente do que micro-organismos em meio livre de MSM. O ambiente de crescimento inicial com meios suplementados com MSM pode ser condutor para multiplicação e sobrevivência celulares.
Em várias modalidades, MSM afeta a fase estacionária de crescimento microbiano (por exemplo, probiótico). Em um exemplo, suplementação de meios com MSM prolonga a fase estacionária para micróbios comparado com meio livre de MSM.
Em algumas modalidades, MSM aumenta o crescimento probiótico, que por sua vez se desloca e pega nutrientes de micróbios indesejados. Em outras modalidades, MSM aumenta a atividade probiótica, que por sua vez aumenta a produção de ácidos láctico e acético para diminuir o pH ambiental e inibir a atividade de bactérias indesejáveis. Em modalidades adicionais, MSM aumenta a atividade probiótica, que por sua vez estimula a produção de agentes de imunomodulação (por exemplo, citocinas), desta maneira aumentando a resposta imune. Em certas modalidades, MSM aumenta a atividade probiótica, que por sua vez aumenta a atividade bactericida com relação à contaminação microbiana indesejada. Em uma modalidade, MSM aumenta o crescimento probiótico em uma taxa mais rápida do que os micróbios indesejados, desta maneira permitindo que os probióticos colonizem preferivelmente um ambiente (por exemplo, produtos comestíveis, trato intestinal).
Sem desejar ser limitado por uma teoria particular, MSM tem um efeito bioquímico sobre metabolismo microbiano. Por exemplo, em algumas modalidades, a adição de MSM tem um efeito positivo sobre metabolismo de certos micro-organismos de maneira que certos micro-organismos são capazes de melhor se adaptar e/ou recuperar de mudanças ambientais. Em algumas modalidades, MSM serve como um substrato ou co-fator para metabolismo microbiano e/ou cursos bioquímicos anapleuróticos. Em algumas
77/247 modalidades, MSM impacta positivamente a fase lag de crescimento. Em algumas modalidades, MSM aumenta a fase log de crescimento microbiano. Em modalidades adicionais, MSM aumenta a duração da fase estacionária de crescimento microbiano. Em algumas modalidades, MSM diminui a taxa de declínio da população de certos micróbios. Em certas modalidades, MSM provê um ambiente de crescimento seletivo ou semi-seletivo, de maneira que certas espécies microbianas crescem mais rapidamente (ou atingem tamanho de população maior, ou ambos) comparado com outras espécies microbianas. Em certas modalidades, MSM impacta a atividade metabólica de micro-organismos, enquanto em outras modalidades MSM cria um ambiente mais condutor para crescimento microbiano.
Desta maneira, métodos de aumento de crescimento microbiano são providos. Em algumas modalidades, métodos de aumento do crescimento microbiano incluem métodos in vivo para aumento do crescimento de um ou mais micro-organismos. Em um exemplo, métodos in vitro para aumento do crescimento de um ou mais micro-organismos incluem contato de um ou mais micro-organismos com um meio capaz de apoiar crescimento de um ou mais micro-organismos; e provisão de MSM ao meio em cerca de 0,4% a 5% em peso do meio ou em peso do teor de umidade do meio desta maneira aumentando o crescimento de um ou mais micro-organismos in vitro comparado com o crescimento de um ou mais micro-organismos in vitro na ausência de MSM. É compreendido que métodos similares podem ser usados para aumento da crescimento de micro-organismos desejados (tais como probióticos) in vivo. Por exemplo, um aumento em crescimento microbiano é indicado por um aumento em peso do micro-organismo ou número de célula tal como um aumento de 10%, tal como cerca de 20% a 80%, um aumento de cerca de 30% a 50%, incluindo um aumento de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150, cerca de 200%, cerca de 300% comparado com um controle (tal como peso do microorganismo ou número de célula na ausência de MSM). Aumentos em crescimento de micro-organismo podem ser detectados através de métodos co
78/247 nhecidos daqueles de habilidade na técnica incluindo aqueles descritos nos Exemplos.
a. Métodos para Aumento de Crescimento de um Microorganismo Probiótico
Métodos para aumento da crescimento de um ou mais microorganismos probióticos são descritos. Por exemplo, métodos de aumento do crescimento de um ou mais micro-organismos probióticos incluem contato de um ou mais micro-organismos probióticos com um meio capaz de apoiar crescimento de um ou mais micro-organismos probióticos; e provisão de MSM ao meio em cerca de 0,4% a cerca de 5% em peso do meio ou em peso do teor de umidade do meio desta maneira aumentando o crescimento de um ou mais micro-organismos comparado com o crescimento dos um ou mais micro-organismos na ausência de MSM. Em um exemplo, a concentração de MSM é cerca de 1 % a cerca de 3% do peso do meio ou em peso do teor de umidade do meio. Um aumento em crescimento probiótico é indicado por um aumento de pelo menos 10%, tal como cerca de 20% a 80%, aumento de cerca de 30% a 50%, aumento de cerca de 30% a 50%, incluindo um aumento de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 300% no crescimento celular comparado com um controle (tal como crescimento celular na ausência de MSM).
Em alguns exemplos, o meio para aumento do crescimento microbiano, tal como crescimento probiótico, inclui um produto contendo probiótico, tal como leite, iogurte, iogurte de arroz, iogurte congelado, chocolate, queijo, cerveja, vinho, vinagre, chucrute ou qualquer combinação dos mesmos.
É compreendido que o método pode ser usado para aumentar crescimento de qualquer micro-organismo probiótico incluindo, mas não limitado a, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Bacillus coagulans, Lactobacillus rhamno-sus, Bifidobacteruim bifidum ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, os métodos descritos são usados
79/247 para aumentar a atividade da bactéria Lactobacillus rhamnosus. Em outras modalidades, os métodos descritos são usados para aumentar a atividade de espécies dentro do gênero Lactobacillus. Por exemplo, um método de aumento da atividade (por exemplo, crescimento) de Lactobacillus acidophilus inclui contato de Lactobacillus acidophilus com um meio capaz de apoiar o crescimento de Lactobacillus acidophilus; e provisão de MSM ao meio em cerca de menos do que 1% (tal como cerca de 0,04%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,75, 0,8% ou 0,9%) em peso do meio ou em peso de um teor de umidade do meio desta maneira aumentando o crescimento de Lactobacillus acidophilus comparado com crescimento de Lactobacillus acidophilus na ausência de MSM.
Em outras modalidades, os métodos descritos são usados para aumentar a atividade de Bifidobacterium bifidum. Por exemplo, um método de aumento da atividade (por exemplo, crescimento) de Bifidobacterium bifidum inclui contato de Bifidobacterium bifidum com um meio capaz de apoiar crescimento de Bifidobacterium bifidum; e provisão de MSM ao meio em cerca de menos do que 1% (tal como cerca de 0,04%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,75, 0,8% ou 0,9%) de peso do meio ou um teor de umidade do meio desta maneira aumentando o crescimento de Bifidobacterium bifidum comprado com crescimento de Bifidobacterium bifidum na ausência de MSM.
Um aumento em crescimento probiótico é indicado por um aumento em peso do micro-organismo probiótico ou número de célula de tal, incluindo um aumento de pelo menos 10%, tal como um de 20% a 80%, um aumento de cerca de 30% a 50%, incluindo um aumento de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 300% comparado com um controle (tal como peso do micro-organismo probiótico ou número de célula na ausência de MSM). Aumentos em crescimento de micro-organismo probiótico podem ser detectados através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica incluindo aqueles descritos nos Exemplos.
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b. Métodos para Aumento do Crescimento de um Microorganismo em uma Amostra de Teste de Diagnóstico ou Amostra de Teste Industrial
Métodos para aumento do crescimento de um micro-organismo em uma amostra de teste de diagnóstico ou amostra de teste industrial são descritos. Em uma modalidade, um método para aumento do crescimento de um micro-organismo em uma amostra de teste de diagnóstico é provido. Em um exemplo, o método inclui contato de uma amostra de teste de diagnóstico (por exemplo, sangue, tecido, raspagens, fluidos do corpo e produtos metabólicos e similar) compreendendo um ou mais micro-organismos com um meio capaz de apoiar o crescimento de um ou mais micro-organismos; e provisão de MSM ao meio em uma concentração suficiente para aumentar o crescimento microbiano, desta maneira aumentando o crescimento de um ou mais micro-organismos na amostra de teste de diagnóstico comparado com o crescimento de um ou mais micro-organismos na ausência de MSM.
Em algumas modalidades, um método para aumento de crescimento de um micro-organismo em uma amostra de teste industrial é provido. Em um exemplo, o método inclui contato de uma amostra de teste industrial (por exemplo, amostra de água, amostra de mofo ou bactérias domésticas e outras amostras similares) compreendendo um ou mais micro-organismos com um meio capaz de apoiar o crescimento de um ou mais microorganismos; e provisão de MSM ao meio em uma concentração suficiente para aumentar o crescimento microbiano, desta maneira aumentando o crescimento de um ou mais micro-organismos na amostra de teste industrial comparado com crescimento do um ou mais micro-organismos na ausência de MSM.
Em várias modalidades, MSM é provido em uma composição para facilitação de ensaios de diagnóstico ou ensaios de amostra de teste industrial, tal como em uma concentração de cerca de 0,04% a cerca de 5% em peso da amostra ou em peso do teor de umidade da amostra. Em algumas modalidades, MSM é provido em uma composição para facilitação de ensaios de diagnóstico ou ensaios de amostra de teste industriais tal como qualquer uma das composições de MSM capazes de aumento da atividade
81/247 microbiana que são descritas na Seção III. Em certas modalidades, MSM é adicionado diretamente à amostra de teste de diagnóstico ou industrial compreendendo micro-organismos.
De acordo com várias modalidades descritas aqui, MSM pode encurtar o tempo de detecção e/ou análise em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%. De acordo com várias modalidades descritas aqui. MSM pode aumentar a atividade microbiana (tal como crescimento) em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 5 vezes, 100 vezes, 500 vezes ou 1000 vezes. Por exemplo, um aumento em crescimento microbiano é indicado por um aumento em peso do microorganismo ou número celular de tal, incluindo um aumento de pelo menos 10%, tal como cerca de 20% a 80%, um aumento de cerca de 30% a 50%, incluindo um aumento de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 300% comparado com um controle (tal como peso do micro-organismo ou número celular na ausência de MSM). Aumentos em crescimento de microorganismo podem ser detectados através de métodos conhecidos daqueles de habilidade na técnica incluindo aqueles descritos nos Exemplos.
Em várias modalidades, MSM é usado em conjunto com testes de avaliação médica e teste de diagnóstico rápido, tal como em amostras de urina ou sangue. Em muitos casos, testes de diagnóstico são realizados para identificar possíveis infecções microbianas. Vários grupos de microorganismos, incluindo bactérias, vírus, mofo e levedura, podem causar infecções. Se um micro-organismo for encontrado, mais teste é feito para determinar quais antibióticos podem ser eficazes no tratamento da infecção. A fim de diagnosticar tais infecções o mais cedo possível, em algumas modalidades MSM é usado para suplementar o meio de crescimento usado em testes de diagnóstico para aumentar a taxa de crescimento de micro-organismos na amostra do paciente, desta maneira melhorando o tempo de detecção do teste. Em algumas modalidades, MSM pode aumentar a sensibilidade de detecção de um teste de diagnóstico. Em algumas modalidades, o teste de
82/247 diagnóstico é um teste de urina. Em algumas modalidades, o teste de diagnóstico é um teste de sangue. Em outras modalidades, outras amostras de paciente podem ser cultivadas para propósitos de diagnóstico, tal como esputo, saliva, raspagens de pele, trocas dentais, esfregaços vaginais ou cervicais e similar. Em uma modalidade, MSM é usado para prover um teste de estrep rápido. Por exemplo, uma amostra de fluido corporal (a amostra de teste de diagnóstico) é adicionada a um tubo de teste ou placa de cultura (o meio). O meio apoia a cultura de quaisquer micróbios que possam existir no fluido corporal. Ao prover um meio que é pré-dosado com MSM ou através da adição de MSM antes de ou após adição de fluido corporal ao tubo de teste ou placa de cultura, micróbios no fluido corporal (ou seus produtos que podem ser ensaiados ou metabolitos) aumentariam, e seria mais fácil de ensaiar. Desta maneira, diagnóstico é facilitado.
Em várias modalidades, o uso de MSM facilita diagnóstico médico de infecções virais através do apoio do crescimento de vírus para ensaio de diagnóstico. Vírus incluem, mas não estão limitados a, vírus da imunodeficiência humana, vírus herpes simplex, papiloma vírus, vírus parainfluenza, gripe, hepatite e outros vírus. Da mesma maneira, diagnóstico médico de outras infecções, tais como aquelas causadas por bactérias, fungos, levedura e parasitas, é também facilitado por MSM de acordo com várias modalidades. O uso de MSM facilita o desenvolvimento de vacina em uma modalidade.
Em várias modalidades, MSM é usado para aumentar a detecção de micróbios em um teste comercial ou industrial. Microorganismos são um contaminante comum de água. Muitos estojos de teste de segurança de água avaliam a qualidade de água potável através de métodos de teste da Environmental Protection Agency (EPA) ao testar, dentre outros, a presença de bactérias. Mofo encontrado em ambientes doméstico, de escritório e escola foi ligado a distúrbios pulmonares e sintomas alérgicos. No entanto, alguns testes usados para detectar bactérias ou mofo podem consumir tempo para análise enquanto alguns teste ainda detectam apenas organismos viáveis (vivos). Desta maneira, em várias modalidades, MSM é usado para su
83/247 plementar meios de crescimento suplementados usados em testes de detecção comercial. Em algumas modalidades, meios suplementados com MSM melhoram o tempo de detecção de testes. Em algumas modalidades, meios suplementados com MSM melhoram a sensibilidade de detecção de tais testes. Em certas modalidades, MSM restaura bactérias ambientalmente estressadas que eram anteriormente não viáveis. Em modalidades adicionais, estojos de teste de diagnóstico compreendendo meios suplementos com MSM específicos de micro-organismo são usados para aumentar o tempo de detecção ou sensibilidade de um teste direcionado à detecção de um microorganismo particular. Em outras modalidades, MSM é usado para suplementar um meio de crescimento de espectro amplo, de maneira que uma variedade de micro-organismos é detectada mais rapidamente ou com sensibilidade grande.
/77. Métodos para Aumento de Capacidade de Sobrevivência de Microorganismos e Células com MSM
Métodos para aumento da capacidade de sobrevivência de micro-organismos (incluindo, mas não limitado a, micro-organismos probióticos) ou células (tais como células-tronco ou células recombinantes) são descritos. Por exemplo, métodos de aumento da capacidade de sobrevivência de micro-organismos ou células, tais como células em cultura, incluem contato de um ou mais micro-organismos ou células selecionadas com MSM em cerca de 0,4% a cerca de 5% em peso do meio ou em peso de um teor de umidade do meio desta maneira aumentando a capacidade de sobrevivência dos um ou mais micro-organismos ou coleção de células comparado com a capacidade de sobrevivência dos um ou mais micro-organismos ou coleção de células na ausência de MSM. Em um exemplo, a concentração de MSM é cerca de 1% a cerca de 3% do peso do meio ou do teor de umidade do meio. Um aumento em capacidade de sobrevivência é indicado por um aumento de pelo menos 10%, tal como cerca de 20% a 80%, um aumento de cerca de 30% a 50%, incluindo um aumento de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de
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200%, cerca de 300% em número de colônia ou célula comparado com um controle (tal como número de colônia ou célula na ausência de MSM).
De acordo com várias modalidades, MSM melhora a sobrevivência inicial dos micro-organismos (incluindo, mas não limitado a, microorganismos probióticos). Em uma modalidade, MSM melhora a sobrevivência a longo prazo dos micro-organismos. Em uma modalidade, MSM prolonga a fase estacionária de uma curva de crescimento dos micro-organismos.
Em várias modalidades, MSM prolonga a meia-vida de um produto através da extensão do tempo de vida de bactérias benéficas comparado com produtos sem MSM. Por exemplo, um produto contendo probiótico pode ter uma meia-vida de várias semanas, após o que os organismos probióticos começam a declinar em saúde e/ou população. No entanto, em algumas modalidades, a adição de MSM a um produto contendo probiótico aumenta a duração de tempo a partir do empacotamento do produto até o declínio de saúde e/ou população do probiótico. Em tais modalidades, o produto probiótico é funcional (em termos de aplicação de uma população de probióticos para a saúde e ativos ao trato Gl do consumidor) por um período de tempo mais longo após empacotamento.
Em várias modalidades, a adição de MSM aumenta o tempo para deterioração de produtos ingeríveis através do apoio ou aumento da atividade de micróbios benéficos, com uma diminuição resultante na atividade de micróbios indesejados. Por exemplo, MSM pode aumentar a vida de prateleira de produtos comestíveis, tal como um produto probiótico, em cerca de 10% a 100% (por exemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 150%, 200% ou mais). Por exemplo, em uma modalidade, se a vida de prateleira de um produto comestível for de 10 dias, a adição de MSM vai aumentar a vida de prateleira para pelo menos 11 dias em algumas modalidades (por exemplo, 11 dias, 14 dias, 15 dias, 20 dias ou 25 dias). Como um exemplo adicional, em outra modalidade, se um produto comestível tiver uma vida de prateleira de 14 dias em temperatura ambiente e/ou 30 dias no refrigerador e/ou 3 meses no freezer, a adição de MSM vai aumentar a vida de prateleira para 30 dias em temperatura ambiente e/ou 60 dias no refrigerador e/ou 6 meses no free
85/247 zer. Em algumas modalidades, o uso de MSM aumenta inesperadamente a atividade de micróbios benéficos e inibe (ou diretamente ou indiretamente) a atividade de bactérias indesejadas, desta maneira reduzindo ou eliminando a necessidade para esterilização (por exemplo, através de irradiação, filtragem, calor, agentes químicos, etc).
Em algumas modalidades, MSM é provido para aumentar a atividade de vetores genéticos, tais como vetores virais recombinantes em células recombinantes. Isto pode ser benéfico para uso de diagnóstico bem como terapêutico, tal como terapia de gene. Em algumas modalidades, MSM é usado para aumentar a atividade (por exemplo, crescimento, cutlura ou viabilidade) de um ou mais vetores de plasmídeo, vetores binários, vetores de clonagem, vetores de expressão, vetor móvel e vetores virais. Desta maneira, métodos para aumento da terapia de gene são descritos, onde um ou mais processos associados com terapia de gene são realçados ou aumentados através de tratamento da célula ou micro-organismo recombinante com uma concentração de MSM (tal como uma concentração de cerca de 0,04% a cerca de 5% de MSM) capaz de realçar um ou mais processos de terapia de gene (talcomo a expressão, crescimento ou capacidade de sobrevivência de células ou micro-organismos recombinantes), desta maneira aumentando a eficácia da terapia de gene.
iv. Métodos de Realce da Eficiência de Cultura com MSM
Métodos de aumento da eficiência de cultura com MSM são descritos aqui. Em uma modalidade, métodos para aumento de vários tipos de Culturas são providos incluindo, mas não limitado a, aumento da eficiência de cultura de antibiótico, esteroide, célula (por exemplo, recombinante e tipo selvagem), micro-organismo e fertilizante. Por exemplo, em várias modalidades, MSM é usado para suplementar meios de cutura usados para o crescimento ou propagação de organismos microbianos. Em várias modalidades, meios suplementados com MSM aumentam a eficiência de cultura ao aumentar o crescimento das células.
Em algumas modalidades, métodos de aumento da eficiência de cultura incluem aumento/promoção da atividade microbiana em campos am
86/247 biental e industrial. Os micro-organismos participam em ciclos de elemento tal como o ciclo de carbono e o ciclo de nitrogênio, bem como realizando outros papéis vitais em virtualmente todos os ecossistemas, tal como reciclagem dos produtos de refugo e/ou restos de outros organismos através de decomposição. Desta maneira, em algumas modalidades, o uso de MSM pode aumentar a decomposição de refugo e tratamento de refugo. Muitos processos de oxidação biológicos para tratamento de águas de refugo industriais têm em comum o uso de oxigênio (ou ar) e ação microbiana. Micróbios especialmente culturados são usados no tratamento biológico de esgoto e efluente de refugo industrial, um processo conhecido como bioaumento. Bioaumento é usado para assegurar que os micro-organismos in situ possam degradar contaminantes. Em algumas modalidades, MSM aumenta a degradação de contaminantes de certos micro-organismos. Em algumas modalidades, MSM é adicionado a produtos de jarginagem, tal como solo, fertilizantse e latas de composto, para aumentar a atividade de micro-organismos benéficos. Desta maneira, MSM é usado para aumentar a eficiência de fertilizantes e reações de composto.
Em uma modalidade, um método de aumento da eficiência de um fertilizante inclui aplicação de MSM ao meio em uma quantidade suficiente aumentar a atividade de um fertilizante, desta maneira aumentando a atividade do fertilizante. Em uma modalidade particular, MSM é dissolvido em uma solução para uma concentração final de cerca de 0,04% a cerca de 5%. Esta solução é então pulverizada sobre uma superfície de planta ou antes, seguindo ou simultaneamente ao fertilizante. Um aumento em eficiência de fertilizante é indicado por um aumento de pelo menos 10%, tal como cerca de 20% a 80%, um aumento de cerca de 30% a 50%, incluindo um aumento de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 300% em crescimento de planta comparado com um controle (tal como crescimento de planta na ausência de MSM).
Em outra modalidade, um método para aumento da eficiência de
87/247 composição é descrito. Este método inclui aplicação de MSM ao composto em quantidade suficiente para aumentar a atividade de um ou mais microorganismos ou substâncias presentes no composto. Em uma modalidade particular, MSM é dissolvido em uma solução para uma concentração final de cerca de 0,04% a cerca de 5%. Esta solução é então aplicada ao composto (tal como despejando ou pulverizando a solução) e deixada tempo suficiente para aumentar a eficiência da composição. Um aumento em eficiência do composto é indicado por um aumento de pelo menos 10%, tal como cerca de 20% a 80%, um aumento de cerca de 30% a 50%, incluindo um aumento de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 300% em níveis de nitrato comparado com um controle (tais como níveis de nitrato na ausência de MSM). Em outros exemplos, um aumento em eficiência de composto é indicado por um aumento de pelo menos 10%, tal como um aumento cerca de 20% a 80%, um aumento de 30% a 50%, incluindo um aumento de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 300% de diminuição na quantidade de tempo que a decomposição de matéria orgânica ocorre comparado com um controle (tal como taxa de decomposição na ausência de MSM).
B. Métodos de Inibição da Atividade Microbiana
Métodos de inbição da atividade microbiana são descritos. Em uma modalidade, um método para inibição da atividade microbiana inclui seleção de um meio que é suscetível à contaminação; e contato do meio com MSM em uma concentração de cerca de 6% a cerca de 16% de peso em volume, desta maneira inibindo a atividade microbiana comparado com atividade microbiana em um controle (tal como atividade microbiana na ausência de MSM). Em uma diminuição de pelo menos 10%, tal como uma diminuição de cerca de 20% a 80%, diminuição de cerca de 30% a 50%, incluindo diminuição de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de
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90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 300% comparado com um controle (tal como atividade microbiana na ausência de MSM).
Em algumas modalidades, um método para inibição de atividade microbiana inclui seleção de um meio que é susctivel à contaminação bacteriana; e contato do meio com MSM em uma concentração de cerca de 6% a cerca de 16% de peso em volume, desta maneira inibindo atividade bacteriana. Em algumas modalidades, um método para inibição de atividade microbiana inclui seleção de um meio que é suscetível à contaminação viral (tal como contaminação pelo vírus da imunodeficiência humana, H1N1, vírus herpes simplex, papiloma vírus, vírus parainfluenza, gripe, hepatite ou outros vírus similares); e contato do meio com MSM em uma concentração de cerca de 6% a cerca de 16% de peso em volume, desta maneira inibindo atividade viral.
Em um exemplo particular, um método de inibição de atividade microbiana inclui seleção de um meio que é suscetível à contaminação por gripe H1N1; e contato do meio com MSM em uma concentração de cerca de 10% a cerca de 16% de peso em volume, desta maneira inibindo atividade microbiana de gripe H1N1. Em algumas modalidades, MSM inibe a atividade microbiana através da redução da taxa de crescimento de gripe H1N1 em pelo menos 10%, tal como em cerca de 20%, uma diminuição de cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 300% em crescimento ou infectividade de gripe H1N1 comparado com um controle (tal como atividade ou infectividade de gripe H1N1 na ausência de MSM).
Em várias modalidades, os métodos incluem MSM em cerca de 8% (em peso) ou mais, do peso total ou teor de umidade do produto. Em certas modalidades, MSM é um agente antimicrobiano eficaz quando usado em concentrações entre cerca de 5% e cerca de 16%. Em certas modalidades, MSM é um agente antimicrobiano eficaz quando usado em concentrações (com base no peso total ou teor de umidade de um produto) entre cer
89/247 ca de 9% e cerca de 16%, entre cerca de 10% e cerca de 16%, entre cerca de 12% e cerca de 16%, entre cerca de 9% e cerca de 13% e entre cerca de 10% e cerca de 12%. Em certas modalidades, MSM é um agente antimicrobiano eficaz quando usado em concentrações entre cerca de 5% e cerca de 16%, incluindo 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% e 15%. Em várias modalidades descritas aqui, as porcentagens de MSM são baseadas no teor de umidade de um produto. Em algumas modalidades, MSM é particularmente eficaz quando combinado com água ou outros componentes líquidos. Em várias modalidades, as porcentagens de MSM providas aqui são baseadas na quantidade de um solvente polar em um produto ou outro meio.
Em algumas modalidades, os métodos descritos de inibição de atividade microbiana incluem inibição de crescimento de micro-organismos específicos. Em alguns exemplos, os métodos incluem inibição de crescimento de uma ampla faixa de micro-organismos em certos meios ou produtos. Em algumas modalidades, reduções de escala log são feitas após as primeiras 24 horas. Em algumas outras modalidades, reduções de escala log significantes são evidentes dentro de 24-48 horas. Em algumas modalidades, os métodos descritos incluem formulações de MSM que rendem redução em níveis microbianos (por exemplo, bacteriano) variando de a partir de cerca de 0,5 log a cerca de 5 log ou mais dentro de duas semanas. Em algumas modalidades, os métodos descritos de inibição de atividade microbiana resultam em uma redução log de redução entre cerca de 1 log e redução de cerca de 3 log ou mais. Em outras modalidades, os métodos descritos de inibição de atividade microbiana inibem letalmente o crescimento de certos micro-organismos. Em uma modalidade, um método usando uma formulação de MSM entre cerca de 12% e cerca de 16% mata letalmente certos micróbios (por exemplo, bactérias) dentro de cerca de 48 horas. Em outra modalidade, uma formulação compreendendo MSM entre cerca de 8% e cerca de 12% mata letalmente certos micróbios (por exemplo, bactérias) dentro de cerca de três a sete dias. Em outras modalidades, o método emprega uma formulação de MSM entre cerca de 5% e cerca de 8%, combinado com uma quantidade reduzida de conservante convencional, que mata
90/247 letamente certos micróbios (por exemplo, bactérias) dentro de cerca de 48 horas. Com concentrações de conservante maiores, os níveis de MSM podem ser reduzidos mais.
Em algumas modalidades, os métodos descritos de inibição de atividade microbiana com MSM (tal como com cerca de 6% a cerca de 16% de MSM) impactam o metabolismo de micróbios na fase lag. Por exemplo, o método descrito aumenta a duração da fase lag. Uma alteração, tal como um aumento na fase lag, pode ser detectada através de métodos daqueles versados na técnica incluindo aqueles descritos nos Exemplos.
Em algumas modalidades, suplementação com MSM resulta em uma diminuição na fase log de crescimento de micróbios. A fase exponencial (algumas vezes chamada a fase log) de crescimento é um período caracterizado por duplicação celular. O número de micróbios novos que aparecem por tempo unitário é proporcional à presente população. Se crescimento não for limitado, duplicação vai continuar em uma taxa constante de maneira que ambos o número de células e a taxa de aumento da população duplicam com cada período de tempo consecutivo. Crescimento exponencial não pode continuar indefinidamente, no entanto, porque o meio é logo depletado de nutrientes e enriquecido com refugos. Em algumas modalidades, MSM diminui a duração geral da fase exponencial. Em outras modalidades, a presença de MSM no meio de crescimento inibe entrada microbiana na fase exponencial.
Em várias modalidades, os métodos descritos de inibição de atividade microbiana incluem modulação da fase estacionária de crescimento microbiano. Durante a fase estacionária, a taxa de crescimento diminui como um resultado de depleção de nutriente e acúmulo de subprodutos metabólicos. Esta fase é atingida conforme os micróbios começam a exaurir os recursos que estão dispniveis para eles. Esta fase é um valor relativamente constante uma vez que a taxa de crescimento microbiano é igual à taxa de morte microbiana. Suplementação com MSM de meios em certas concentrações encurta a fase estacionária para micróbios em uma modalidade.
É compreendido que um meio inclui qualquer meio ou ambiente
91/247 contendo ou adequado para apoio de contaminação incluindo, mas não limitado a, cosméticos, caldos, ágar, culturas, alimentos, bebidas, suspensões celulares, tecido biológico, fluidos biológicos, superfícies inorgânicas, superfícies orgânicas, substratos, células vivas, células hospedeiro, ensaios de diagnóstico e outros ambientes sóldios, líquidos, de matriz, gelatinosos ou gasosos. Em alguns exemplos, o meio é um fluido corporal, um tecido corporal ou uma superfície.
Em algumas modalidades, contato com o meio inclui administração tópica, oral, intravenosa, intramuscular ou subcutânea de MSM ao meio suscetível à contaminação microbiana. Em outras modalidades, contato com o meio inclui pulverização ou esfregação do meio suscetível à contaminação microbiana com uma composição/formulação de MSM descrita. Por exemplo, uma superfície pode incluir qualquer superfície suscetível à contaminação incluindo, mas não limitado a, uma superfície doméstica, uma superfície industrial (tais como superfícies em banheiros públicos, maçanetas de porta, pisos, paredes, corre-mãos, carrinhos de compras e similar), leito, cobertas, equipamento ou superfície industrial, sangue, pele ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, uma superfície doméstica pode incluir uma maçaneta de porta, maçaneta de porta arredondada, uma lata de lixo, um balcão de pia, piso, assento de banheiro ou qualquer superfície que seja geralmente tocada ou exposta a possíveis contaminantes.
Crescimento microbiano não intencional pode ocorrer em muitos auxiliares cosméticos, de saúde e beleza, produtos tópicos e produtos orais. Uso agudo ou continuado de produtos com contaminação microbiana pode levar a efeitos adversos à saúde para o usuário. Contaminação pode ocorrer, por exemplo, durante fabricação, empacotamento ou uso repetitivo por um consumidor que inclui abertura e fechamento repetido de recipientes, contato com as mãos, pele ou membranas da mucosa ou retirada/administração contínua de doses individuais. Na ausência de propriedades antimicrobianas, esses produtos podem permitir o crescimento não intencional de muitos micro-organismos diferentes, e potencialmente prejudiciais.
92/247
Conservantes antimicrobianos podem ser adicionados a produtos para protegê-los de crescimento microbiano. Conservantes antimicrobianos de uso geral comuns incluem propionato de cálcio, nitrato de sódio, sulfitos (dióxido de enxofre, bissulfito de sódio, hidrogeno sulfito de potássio, etc) e EDTA dissódico. Conservantes cosméticos incluem formaldeído, sorbato de potássio, metilparabeno e metilcloroisotiazolinona.
Em muitos casos, conservantes devem ser adicionados em uma concentração eficaz mínima, uma vez que reações adversas podem ocorrer em certas concentrações ou doses. Desta maneira, embora conservantes possam inibir crescimento microbiano, eles também têm o potencial de causar queimaduras químicas e/ou irritar a pele e membranas da mucosa. Alguns conservantes sintéticos modernos se tornaram controversos poque eles foram mostrados causar problemas respiratórios ou outros de saúde. Adição de certos conservantes a produtos comerciais pode apresentar complicações únicas com solubilidade, limites de pH, desativação por alguns compostos de polietileno glicol (PEG) e uma mudança na cor, consistência ou fragrância de um produto. Alguns conservantes têm atividade apenas limitada contra classes de micro-organismos particulares.
Métodos de inibição de atividade microbiana em um produto para o consumidor são também descritos. Em uma modalidade, o método inclui seleção de um meio que é suscetível à contaminação microbiana, tal como um produto para o consumidor, e adição de MSM ao meio para afetar a contaminação microbiana através da inibição da atividade microbiana. MSM é provido em uma concentração de pelo menos 10% de acordo com uma modalidade (por exemplo, 10-16%, 16-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-75% ou mais e faixas sobrepondo as mesmas). O meio é livre de conservantes em algumas modalidades.
Em algumas modalidades, métodos de inibição da atividade microbiana em um creme cosmético em temperatura ambiente são providos. Em uma modalidade, o método inclui seleção de um meio que é suscetível à contaminação microbiana; e adição de MSM ao meio para afetar a contaminação microbiana através da inibição da atividade microbiana. MSM é adi
93/247 cionado em uma concentração de pelo menos 5% de acordo com uma modalidade (5-10%, 10-16%, 16-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-75% ou mais e suas faixas de sobreposição). O meio é livre de conservantes em algumas modalidades. O meio inclui um creme cosmético em algumas modalidades. Em um exemplo, MSM inibe a atividade microbiana em pelo menos 50% no creme cosmético em temperatura ambiente.
Em alguns exemplos, o meio inclui um ou mais do que segue: cosméticos, caldos, ágar, culturas, alimentos, bebidas, suspensões celulares, tecido biológico, fluidos biológicos, superfícies inorgânicas, superfícies orgânicas, substratos, células vivas, células hospedeiro, ensaios de diagnóstico e outros ambientes sólidos, líquidos, de matriz, gelatinosos ou gasosos. Por exemplo, em uma modalidade, o meio inclui um produto óptico ou um produto para higiene ou saúde oral. O meio pode também incluir um fluido ou tecido corporal, tal como sangue. Em um exemplo, o meio é esterilizado antes da adição de MSM e/ou após adição de MSM. Em outros exemplos, nenhuma esterilização é necessária. Em alguns exemplos, as propriedades antimicrobianas de MSM reduzem ou eliminam a necessidade de esterilização.
Em alguns exemplos, contaminação microbiana é causada por bactérias, tais como bactérias gram positivas e/ou bactérias gram negativas, fungos, parasita, levedura, mofo, vírus ou suas combinações (por exemplo, bactérias e mofo ou outras combinações). Em várias modalidades, contaminação microbiana é causada por um ou mais dos gêneros que seguem: Candida, Aspergillus, Escherichia, Pseudomonas, Staphylococcus e Streptococcus ou combinações dos mesmos. Em outra modalidade, contaminação microbiana é causada por uma doença infecciosa incluindo qualquer uma das doenças infecciosas descritas aqui.
Em várias modalidades, métodos para tratamento de uma doença infecciosa são descritos incluindo, mas não limitados a, H1N1, vírus do herpes simplex ou HIV. Em uma modalidade, o método inclui administração de uma quantidade terapêutica eficaz de um agente terapêutico e DMSO sozinho, MSM sozinho ou em combinação com DMS e MSM. A concentra
94/247 ção de DMSO e/ou MSM varia de a partir de cerca de 6% a cerca de 17% em uma composição.
Em uma modalidade, MSM inibe atividade microbiana através da redução da taxa de crescimento de um ou mais micróbios em mais de 50%, o que por sua vez aumenta a vida de prateleira do meio. É compreendido que MSM pode conferir um benefício terapêutico e/ou estético. Em algumas modalidades, o benefício terapêutico ou estético não está relacionado com a inibição microbiana.
Em algumas modalidades, os métodos descritos de inibição de atividade microbiana inibem atividade microbiana em temperaturas condutores da atividade microbiana, incluindo 20-25°C, 25-30°C, 30-40°C, 40-50°C e mais altas (e suas faixas de sobreposição). Em algumas modalidades, MSM inibe a atividade microbiana em níveis de umidade favoráveis para atividade microbiana, incluindo 50%-60%, 60-70%, 70-80%, 80-95% e mais altas (e suas faixas de sobreposição).
MMS é particularmente vantajoso em várias modalidades porque ele pode ser usado em concentrações mais altas do que outros conservantes, que quando usados mesmos em concentrações baixas podem causar efeitos adversos. Por exemplo, conservantes têm estado implicados em dermatite atópica, brotoejas, vermelhidão, dor abdominal, náusea, asma, rinite, dores musculares, dores na junta, fadiga, enfraquecimento, enxaqueca, distúrbio de déficit de atenção e hiperatividade, palpitações e arritmias. Em contraste, MSM não é conhecido causar tais efeitos em concentrações providas de acordo com as presentes modalidades preferidas. Além disso, MSM tem uma função dupla de acordo com algumas modalidades. MSM não apenas inibe o crescimento de micro-organismos indesejados, MSM também afeta beneficamente o produto ao qual ele é adicionado em várias modalidades.
Em algumas modalidades, os métodos descritos de inibição da atividade microbiana não apenas inibem atividade microbiana, mas proveem um ou mais efeitos benéficos incluindo, mas não limitado a, redução de espasmos musculares, irritação da pele, redução de dor, lubrificação das jun
95/247 tas, redução de inflamação, tratamento de artrite reumatoide e osteoartrite, melhoras cardiovasculares, lubrificação da pele, cicatrização de ferida melhor e couro cabeludo, cabelo, cutícula e unhas melhores.
Em algumas modalidades, os métodos descritos de inibição da atividade microbiana são usados para prevenir ou minimizar a formação de novos micróbios. Em outras modalidades, os métodos são usados para matar ou reduzir micróbios existentes. Em uma modalidade, MSM pode converter um produto contaminado inútil em um produto útil.
De acordo com várias modalidades, os métodos inibem atividade microbiana instantaneamente. Em outras modalidades, os métodos inibem atividade microbiana em e até 1 dias, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 7 dias, 10 dias, 14 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos e mais.
Em várias modalidades, MSM é adicionado a agentes de limpeza para aumentar a atividade antimicrobiana (por exemplo, para inibir atividade de micro-organismo). Em algumas modalidades, MSM é adicionado a uma formulação de sabão. Em algumas modalidades, o produto é um sabão em pó, enquanto em outras modalidades o produto é um sabão líquido. Em algumas modalidades, MSM é adicionado a uma formulação em gel para fornecer um sanitizador. Por exemplo, métodos de inibição de atividade microbiana incluem métodos de sanitização de uma superfície, tal como o corpo, equipamento, pisos, materiais, paredes, etc. Em certas modalidades, o sanitizador resultante é um sanitizador instantâneo. Em outras modalidades, o sanitizador age não instantaneamente (por exemplo, é eficaz com o tempo). Em algumas modalidades, o sanitizador é aplicado ao corpo. Em ainda outras modalidades, o produto é aplicado a uma superfície. Superfícies incluem, mas não estão limitadas a, superfícies comerciais, dispositivos médicos, superfícies médicas, equipamento de produção, pisos de produção e superfícies de preparação de alimento. Superfícies podem incluir, mas não estão limitadas a, superfícies domésticas, veículos, computadores, roupas e brinquedos.
Em algumas modalidades adicionais, métodos de inibição de ati
96/247 vidade microbiana incluem pulverização ou incorporação de MSM (por exemplo, cerca de 5% a cerca de 50%) em máscaras para o rosto ou filtros. Filtros podem incluir, mas não estão limitados a, filtros de ar condicionado, filtros de ar e filtros de água. Ambientes com ar reciclado, tais como aviões, podem se beneficiar especialmente de sistemas de filtragem de MSM. Plantas de tratamento de refugo e filtragem de água podem também incorporar MSM para inibir atividade microbiana. Em algumas modalidades, MSM é provido para reduzir contaminação microbiana em arranjos de flores e produtos de jardinagem (tais como fertilizantes e solos).
Em algumas modalidades, métodos de inibição da atividade microbiana incluem inibição da atividade microbiana de um micro-organismo presente em uma ração de animal ou para prevenir crescimento microbiano durante armazenamento ou processamento da ração. Tipos de ração para animal incluem, mas não estão limitados a, ração composta ou forragem. Ração animal pode consistir em matérias-primas e/ou aditivos. Matériaprima pode ser provida como feno ou grãos. Alternativamente, matéria-prima pode ser fabricada e provida como uma farinha, peletes ou farelos. Em algumas modalidades, MSM é aplicado à ração animal para reduzir crescimento de mofo. Em outras modalidades, MSM é aplicado à ração animal para reduzir crescimento de fungo. Em algumas modalidades, MSM é aplicado a matérias-primas de ração e então incorporado a produto de ração acabado. Em modalidades adicionais, o produto é aplicado à ração durante ou após a fabricação. Em algumas modalidades, o produto é aplicado à ração para armazenamento a longo prazo.
V. Métodos de Fabricação de Produtos Incluindo MSM
Métodos de fabricação de produtos incluindo MSM são descritos aqui. Em algumas modalidades, MSM é incorporado em um estágio que vai reduzir cristalização de MSM. Em uma modalidade, MSM é incorporado a um produto antes da emulsificação do dito produto. Em outra modalidade, MSM é encapsulado (por exemplo, em um lipídeo, polímero ou outro material) antes da adição a um produto. MSM microencapsulado, de acordo com algumas modalidades, pode ser projetado para MSM de liberação com o
97/247 tempo ou dose. Em ainda outras modalidades, MSM é combinado com a porção aquosa de um produto antes da mistura dos ingredientes úmidos e secos. Em uma modalidade, MSM em forma de pó seco é misturado com um líquido aquoso ou polar para ativar o MSM.
Em ainda outra modalidade, MSM é adicionado a um produto em uma temperatura elevada (por exemplo, maior do que 25°C, 30°C, 40°C, 50°C, 75°C ou mais). Em algumas modalidades, MSM é materialmente não afetado por calor e pode ser adicionado antes do aquecimento. Soluções que têm uma temperatura maior do que cerca de 35°C apoiam concentrações de MSM maiores do que 50% em algumas modalidades. Em várias modalidades, MSM não impacta substancialmente o pH do produto ao qual ele é adicionado. Em uma modalidade, produtos sólidos higroscópicos e outros produtos com teor de umidade baixo compreendem MSM na faixa de cerca de 15% ou mais.
Métodos para fabricação de um produto tendo uma concentração de conservante reduzida são também descritos aqui. Em uma modalidade, o método inclui provisão de um meio que é suscetível à contaminação microbiana, onde o meio compreende um conservante e adição de MSM ao meio, onde o MSM afeta a contaminação microbiana através da inibição do crescimento microbiano. MSM é adicionado em uma concentração de pelo menos 5% a cerca de 20% de acordo com uma modalidade (por exemplo, 58%, 8-12%, 12-15%, 15-20%, ou mais, e suas faixas de sobreposição. Em uma modalidade, MSM e o conservante inibem crescimento microbiano em pelo menos 50% no meio em temperatura ambiente e MSM suplementa ou aumenta a habilidade do conservante em inibir crescimento microbiano, desta maneira reduzindo a concentração de conservante necessária para inibir crescimento microbiano. Em uma modalidade, o meio é emulsificado ou então misturado. Em uma modalidade, MSM é adicionado ao meio antes da emulsificação (ou outra mistura).
Os exemplos que seguem são providos para ilustrar certas características e/ou modalidades particulares. Esses exemplos não devem ser considerados limitar a invenção às características ou modalidades partícula98/247 res descritas.
EXEMPLOS Exemplo 1 Modulação de Ativide Microbiana baseada em MSM
Este exemplo descreve modulação de atividade microbiana baseada em MSM, tal como aumento ou inibição do crescimento microbiano dependendo da concentração de MSM.
Estudos de crescimento microbiano lado-a-lado foram conduzidos em meios suplementados com MSM em uma concentração de 0,1% a 10% e uma amostra controle contendo 0% de MSM. Os micro-organismos avaliados foram Aspergillus niger, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Salmonella cholerasuis. Todos os micro-organismos foram cultivados em caldo de soja tríptico (TSB) (Tryptic Soy Broth) e com exceção de Candida e Aspergillus, todos foram sucessivamente transferidos para meios frescos cada dia por 4 dias consecutivos antes da inoculação para manter organismos em uma fase de crescimento exponencial. Candida e Aspergillus tiveram 48-58 horas de crescimento em TBS antes da inoculação nos meios de teste. Aspergillus foi também cultivado em placas de ágar de dextrose de batata múltiplas (PDA) (Potato Dextrose Agar) por 48-58 horas. O inóculo de Aspergillus foi preparado soltando um enxágue de superfície com TSB das placas de PDS com uma camada de Aspergillus, e então adicionado à cultura de 45-58 horas até turbidez. Para cada microroganismo de teste, alíquotas de 90 mM de TBS foram preparadas ou com 10% ou 0% de MSM. Uma vez cada conjunto de meio de teste tendo sido plaqueado quanto à esterilidade, eles foram inoculados em um nível de 5 pl de inóculo por 10 mL de caldo (diluição do inóculo 1:2000) com cada respectivo micro-organismo. Os organismos bacterianos foram incubados a 30°C ± 2°C e organismos fúngicos foram incubados a 25°C ± 2°C.
Os organismos fúngicos foram plaqueados diariamente em PDA nos Dias 0 ao 7 a cada 24 horas. Preparação e plaqueamento foram realizados em temperatura ambiente. As placas fúngicas foram incubadas a 25°C ± 2°C por pelo menos 3 dias. Amostras de teste foram plaqueadas em triplica
99/247 ta em cada data de teste e as médias são registradas. Os dados são expressos como unidades de formação de colônia recuperadas por mililitro (cfu/mL).
Os efeitos de MSM sobre crescimento de Aspergillus niger e crescimento de Candida albicans são mostrados nas Tabelas 1-1(a) e 11(b), respectivamente. MSM a dez por cento inibiu crescimento de Aspergillus niger por volta do dia 4 de tratamento representado por uma redução drástica em formação de colônia em tal data. Uma redução em crescimento foi também observada em amostras tratadas com MSM de Candida albicans' no entanto, a redução não foi tao drástica comparado com a Aspergillus niger. Por exemplo, meio suplementado com MSM 10% resultou em viabilidade de levedura reduzida comparado com concentrações menores de MSM logo nos 2 primeiros dias (plaqueamento dia 2 para Candida). O crescimento de Candida foi reduzido logo no início do estudo, com reduções substanciais em população fúngica no Dia 4. Após esses pontos de tempo, a divergência em curvas de crescimento continuaram durante o estudo para Candida. Esses dados indicam que uma concentração de MSM 10% provê um efeito negativo significante sobre o crescimento de vários organismos fúngicos com o tempo.
Tabela 1-(1a). Efeito de MSM sobre Crescimento de Aspergillus niger
Aspergillus niger MSM 0% MSM 0,1% MSM 0,5% MSM 1,0% MSM 10%
Dia 0 1,0x 103 9,1 x 102 7,6 x 102 8,9 x 102 1,2x 103
Dia 1 1,3x 103 2,3 x103 2,7 x 103 2,0 x 103 7,0 x 102
Dia 2 4,3 x 103 3,0 x 102 4,0 x 103 2,0 x 103 1,6 x 102
Dia 3 2,0 x 103 7,5 x 102 1,3x 103 1,0x 103 4,6 x 102
Dia 4 1,4 x 104 5,0 x 103 3,7 x 103 3,3 x 103 20
Dia 5 1,3x 104 4,3 x 103 9,7 x 103 6,0 x 103 10
Dia 6 4,4 x 104 1,1 x 104 7,0 x 103 4,7 x 103 3
Dia 7 4,1 x 104 1,3 x 104 7,0 x 103 5,7 x 103 3
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Tabela 1-1 (b). Efeito de MSM sobre Crescimento de Candida albicans
Candida albicans MSM 0% MSM 0,1% MSM 0,5% MSM 1,0% MSM 10%
Dia 0 2,2 x 104 2,1 x 104 1,8 x 104 2,5 x 104 2,6 x 104
Dia 1 1,0 x 105 4,7 x 106 4,9 x 106 5,0 x106 <1,0 x 105
Dia 2 1,0 x 107 9,8 x 106 1,1 x 107 9,8 x 106 4,0 x 103
Dia 3 1,3x 107 1,2 x 107 1,3 x 107 1,2 x 107 <1,0x 105
Dia 4 1,9x 107 1,3x 107 1,4 x 107 1,2 x107 7,0 x 104
Dia 5 1,6 x 107 1,3 x 107 1,4 x 107 1,3 x107 1,7 x 104
Dia 6 8,8 x 106 1,3 x 107 1,4 x 107 1,6 x 107 2,8 x 103
Dia 7 1,7 x 107 1,4 x 107 1,6 x 107 1,7 x 107 3,3 x 103
O efeito de MSM sobre crescimento de Staphylococcus aureus é ilustrado na Tabela 1-2, Uma diferença em viabilidade na presença de concentrações mais altas de MSM foi observada. Em particular, MSM 10% pa5 receu ambos diminuir a taxa de crescimento e o tamanho de população máximo de Staphylococcus aureus.
Tabela 1-2. Efeito de MSM sobre Crescimento de Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus MSM 0% MSM 0,1% MSM 0,5% MSM 1,0% MSM 10%
Dia 0 2,4 x 105 2,4 x 105 2,5 x 105 2,3 x 105 2,5 x 105
Dia 1 3,6 x 108 4,6 x 108 4,1 x 108 6,0 x 108 5,3 x 107
Dia 2 7,5 x 108 8,5 x 108 7,8 x 108 8,2 x 108 3,0 x 108
Dia 3 9,6 x 108 9,1 x 108 8,4 x 108 9,6x108 5,1 x 108
Dia 4 6,4 x 108 7,9 x 108 4,7 x 108 4,5x108 3,7 x 108
Dia 7 2,6 x 108 1,8 x 108 1,7 x 108 3,3 x 108 9,0 x 107
O efeito de MSM sobre crescimento de Pseudomonas aeruginosa é ilustrado na Tabela 1-3. Suplementação de meio com MSM a dez por cento resultou em divergência substancial em viabilidade de Pseudomonas aeruginosa com o tempo. Por exemplo, meios suplementados com MSM 10% renderam uma redução na população que durou os primeiros 4 dias de estudo, mas não persistiu depois deste tempo.
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Tabela 1-3. Efeito de MSM 10% sobre crescimento de Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa MSM 0% MSM 0,1% MSM 0,5% MSM 1,0% MSM 10%
Dia 0 4,0 x 105 4,8 x 105 4,8 x 105 4,2 x 105 4,0 x 105
Dia 1 4,4 x 108 5,1 x 108 5,4 x 108 5,8 x 108 1,0x 105
Dia 2 1,1 x 109 6,0 x 108 9,2x108 5,7 x 108 5,8x103
Dia 3 1,6 x 109 1,4 x 109 1,2 x 109 1,0 x 109 5,3x103
Dia 4 1,6 x 109 2,0 x 109 1,4 x109 1,9x 109 3,7 x 106
Dia 7 1,4 x 109 2,1 x 109 1,6x 109 1,2 x 109 6,0x106
O efeito de MSM sobre o crescimento de Pseudomonas aeruginosa é ilustrado na Tabela 1-4. Suplementação de meio com MSM a dez por 5 cento resultou em substancialmente menos crescimento de E. coli com o tempo.
Tabela 1-4. Efeito de MSM 10% sobre o Crescimento de Escherichia coli
Escherichia coli MSM 0% MSM 0,1% MSM 0,5% MSM 1,0% MSM 10%
Dia 0 6,9 x 105 6,4 x 105 7,0 x 105 6,7 x 105 6,8x105
Dia 1 9,2 x 108 1,0 x 109 1,4 x 109 1,2 x 109 3,0 x 104
Dia 2 1,3 x 109 1,4 x 109 1,6x10® 3,2 x 109 1,2 x 105
Dia 3 1,6 x 109 2,0 x 109 1,9x 10s 1,8 x 109 3,9x107
Dia 4 1,4 x 109 1,4 x 109 1,4x10s 1,4 x 109 1,2 x108
Dia 7 1,3x 109 1,2 x 109 2,8 x 10s 1,5 x 109 7,0 x 107
O efeito de MSM sobre crescimento de Salmonella cholerasuis é ilustrado na Tabela 1-5. Meios suplementados com MSM 10% reduziram o 10 crescimento de Salmonella cholerasuis para a maioria dos pontos de tempo do estudo.
Tabela 1-5. Efeito de MSM 10% sobre Crescimento de Salmonella cholerasuis
Salmonella cholerasuis MSM 0% MSM 0,1% MSM 0,5% MSM 1,0% MSM 10%
Dia 0 6,8 x 105 8,7 x 105 5,9 x 105 5,5 x 105 7,6x105
Dia 1 9,6 x 108 1,2 x 109 9,7 x 108 1,1 x 109 1,7 x 106
Dia 2 1,3 x 109 1,0x 109 1,2 x 109 1,3x 109 7,7 x 107
102/247
Salmonella cholerasuis MSM 0% MSM 0,1% MSM 0,5% MSM 1,0% MSM 10%
Dia 3 1,2 x 109 1,2 x 109 1,5 x 109 1,5 x 109 3,2 x 108
Dia 4 7,8 x 108 6,0 x 108 7,1 x 108 8,0 x 108 1,9x 108
Dia 7 3,0 x 108 3,.4 x 108 3,6 x 108 9,2 x 108 2,3 x 108
Esses estudos indicam que certas concentrações de MSM inibem crescimento, incluindo crescimento de Aspergillus niger, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e E. coli.
Exemplo 2
Teste de Eficácia Antimicrobiana de Meios Suplementados com MSM
Este exemplo descreve os resultados de teste de eficácia antimicrobiana de meios suplementados com MSM.
Os compostos ou produtos formulados tendo atividade antimicrobiana podem ser avaliados com o United States Pharmacopeia (USP) 10 Antimicrobial Effectiveness (AET). Ο AET envolve a adição de microorganismos específicos (Candida albicans, Aspergillus niger, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus) diretamente a urn produto de teste em concentrações relativamente altas para estimular contaminação. O produto é mantido por um mês, com análise semanal quanto a - 15 níveis de micro-organismo. Dependendo da via de administração de um produto, satisfação do AET geralmente requer uma redução de 1 a 3 log em bactérias dos níveis iniciais, o que deve ocorrer em uma a duas semanas, sem nenhum aumento em bactérias após duas semanas. Para levedura e mofo, nenhum aumento a partir do nível de inóculo inicial é permitido. Satis20 fação com sucesso dos critérios do AET demonstra que um produto, opcionalmente suplementado com um composto antimicrobiano sob avaliação, pode suportar uma inoculação de até um milhão de micro-organismos por grama de produto sem ficar contaminado. O AET demonstra a eficácia de um sistema de preservação em um produto e/ou pode ser usado como parte 25 de um estudo de estabilidade para determinar se um sistema de preservação vai afetar a vida de prateleira de um produto.
O AET foi realizado através da adição dos micro-organismos especificados diretamente aos meios de teste suplementados com MSM em
103/247 concentrações simulando contaminação microbiana. Culturas ativas, frescas, padronizadas para uma concentração entre 100.000 a 1.000.000 células por ml_ do produto de teste, foram adicionadas aos meios suplementados com MSM. As inoculações foram feitas usando Candida albicans, Aspergillus ni5 ger, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus.
Caldo de soja tríptico (TSB) foi usado como os meios de cultura. MSM foi diluído 1/1, 1/5, 1/10, 1/100 e 1/1000 e cada um usado para suplementar o meio. O meio inoculado foi mantido por um mês, tempo durante o qual os micro-organismos adicionados foram enumerados semanalmente para de10 terminar se eles estavam crescendo, morrendo ou permanecendo próximo do nível de inoculação inicial. Os pontos de dados foram medidos em triplicada em 48 horas, 3, 5, 14, 20, 28 e 30 dias. Os resultados desses estudos são mostrados nas Tabelas 2-1 a 2-8. Os critérios de aceitação para eficácia antimicrobiana são descritos em detalhes na USP, aqui incorporada a título 15 de referência.
Tabela 2-1. Resultados de teste de AET para diluição de MSM 1:1
Organismo de Teste Inóculo Inicial 48 h 3 dias 5 dias 14 dias 20 dias 28 dias 30 dias
Aspergillus niger 3x105 3,5 x 105 3,2 x 105 3,1 x 105 2,3 x 103 <10 <10 <10
Candida Albicans 2,5 x 105 2,8 x 105 2,6 x 105 2,4 x 105 1,2 x 103 <10 <10 <10
Escherichia coli 1,3x105 1,3x105 1,2 x 105 1,1 x 105 1,8x103 <10 <10 <10
Pseudomonas aeruginosa 1,5 x 105 1,8 x 105 1,9 x 105 1,6 x 105 4,0 x 103 <10 <10 <10
Staphylococcus aureus 5,5 x 105 5,4 x 105 5,6 x 105 5,2 x 105 3,7 x 103 <10 <10 <10
Salmonella typhimurium 4,6 x 105 4,9 x 105 5,1 x 105 4,7 x 105 2,5 x 103 <10 <10 <10
104/247
Tabela 2-2. Redução Log a partir de Inóculo de Microorganismo Inicial com diluição de MSM 1:1
Organismo de Teste 14 Dias 28 Dias
Aspergillus niger 3,4 4,5
Candida Albicans 3,0 4,4
Escherichia coli 3,3 4,1
Pseudomonas aeruginosa 3,6 4,2
Staphylococcus aureus 3,6 4,7
Salmonella typhimurium 3,4 4,7
Tabela 2-3. Resultados de Teste de AET para diluição de MSM 1:5
Organismo de Teste Inóculo Inicial 48 h 3 dias 5 dias 14 dias 20 dias 28 dias 30 dias
Aspergillus niger 3X105 4,0 x 105 4,2 x 105 3,8 x 105 3x103 <10 <10 <10
Candida Albicans 2,5 x 105 2,9 x 105 3,1 x 105 3,2 x 105 2x10s <10 <10 <10
Escherichia coli 1,3x105 1,4x105 1,7x105 2x105 IxlO3 <10 <10 <10
Pseudomonas aeruginosa 1,5x105 1,6x105 2,0 x 105 2,2 x 105 1,2x103 <10 <10 <10
Staphylococcus aureus 5,5 x 105 5,7 x 105 6,0 x 105 5,9 x 105 2,3 x 103 <10 <10 <10
Salmonella typhimurium 4,6 x 105 5,0 x 105 5,2 x 105 5,4 x 105 3,2 x 103 <10 <10 <10
Tabela 2-4. Redução Log a partir de Inóculo de Microorganismo Inicial com
Diluição de MSM 1:5
Organismo de Teste 14 Dias 28 Dias
Aspergillus niger 3,5 4,5
Candida Albicans 3,3 4,4
Escherichia coli 3,0 4,1
Pseudomonas aeruginosa 3,2 4,2
Staphylococcus aureus 3,4 4,7
Salmonella typhimurium 3,5 4,7
105/247
Tabela 2-5. Resultados de Teste AET para Diluição de MSM 1:10
Organismo de Teste Inóculo Inicial 48 h 3 dias 5 dias 14 dias 20 dias 28 dias 30 dias
Aspergillus niger 3X105 5x105 5,2 x 105 5,4x105 2x1o4 <10 <10 <10
Candida Albicans 2,5x105 3x105 3,4 x 105 4x10s 1,5x104 <10 <10 <10
Escherichia coli 1,3x105 2x10s 2,3 x 105 3,2 x 105 2,5 x 103 <10 <10 <10
Pseudomonas aeruginosa 1,5x105 1,9x105 2,2 x 105 2,9 x 105 4x10s <10 <10 <10
Staphylococcus aureus 5,5 x 105 5,9 x 105 6,1 x 105 6,3 x 105 2,9 x 104 <10 <10 <10
Salmonella typhimurium 4,6 x 105 5,0 x 105 5,2 x 105 5,5 x 105 3,2 x 103 <10 <10 <10
Tabela 2-6. Redução Log a partir do Inóculo de Microorganismo Inicial com
Diluição de MSM 1:10
Organismo de Teste 14 Dias 28 Dias
Aspergillus niger 4,3 4,5
Candida Albicans 4,2 4,4
Escherichia coli 3,4 4,1
Pseudomonas aeruginosa 3,6 4,2
Staphylococcus aureus 4,5 4,7
Salmonella typhimurium 3,5 4,7
Tabela 2-7. Resultados de Teste de AET para Diluição de MSM 1:10
Organismo de Teste Inóculo Inicial 48 h
Aspergillus niger 3x105 TNTC*
Candida Albicans 2,5 x 105 TNTC
Escherichia coli 1,3x 105 TNTC
Pseudomonas aeruginosa 1,5 x 105 TNTC
Staphylococcus aureus 5,5 x 105 TNTC
Salmonella typhimurium 4,6 x 105 TNTC
* - Colônias muito numerosas para contar (TNTC)
106/247
Tabela 2-8. Resultados de Teste de AET para Diluição de MSM 1:1000
Organismo de Teste Inóculo Inicial 48 h
Aspergillus niger 3x 105 TNTC*
Candida Albicans 2,5 x 105 TNTC
Escherichia coli 1,3 xΊΟ5 TNTC
Pseudomonas aeruginosa 1,5 x 105 TNTC
Staphylococcus aureus 5,5 x 105 TNTC
Salmonella typhimurium 4,6 x 105 TNTC
As diluições de 1:1, 1:5 e 1:10 de MSM (Tabelas 2-1 a 2-6, acima) indicam que essas concentrações de MSM nos meios mataram microorganismos e não têm simplesmente um efeito estático sobre crescimento. Com base nas populações de cultura no dia 5, efeitos bacterianos foram inesperados, uma vez que as populações de cultura eram estáveis ou mostraram sinais de crescimento grande. No entanto, por volta de 14 dias, redução em níveis de inoculação iniciais foram observados, e por volta de 20 dias, uma morte total de micro-organismos foi observada usando MSM pelo menos 10%. Esses resultados foram confirmados salpicando uma amostra vazia de TSB de 90 mL com 10 mL da mistura de diluição testada (por exemplo, os meios acreditados não conter mais quaisquer micro-organismos vivos). Nenhum dos micro-organismos pôde ser culturado e contaminação não foi observada. Esses resultados demonstram que MSM, em certas concentrações, é bactericida para esses organismos.
Exemplo 3
Efeitos Bactericidas de MSM Estéril e Não Estéril sobre Escherichia coli
Este exemplo descreve os efeitos bactericidas de MSM estéril e não estéril sobre crescimento de E. coli.
A metodologia do teste AET USP <51 > conforme descrito no Exemplo 2 foi usada como a base para avaliar a letalidade para Escherichia coli (ATCC linhagem 8739) de várias concentrações de MSM variando de 5 a 16% em TSB ou solução salina. O AET USP <51 > é um método de teste de eficácia antimicrobiana (United States Pharmacopoeia) para determinação de se um conservante é eficaz com base em uma metodologia verificada
107/247 e validada. Os parâmetros do AET são descritos acima. Neste estudo, após o período de incubação designado, as culturas foram avaliadas visualmente e foram então riscadas e cultivadas em ágar MacConkey seletivo para análise qualitativa dos efeitos das várias concentrações de MSM. Este estudo também avaliou o efeito de pré-esterilização de MSM (por autoclave a vapor a 121°C por 15 minutos) antes da preparação dos meios. Os meios de teste foram preparados pesando uma quantidade apropriada de MSM e adicionando-o a 25 mL de meios TSB ou solução salina. As composições do meio foram codificadas conforme provido na Tabela 3-1.
Tabela 3-1. Composições de meio testadas contra E. coli
Códido do Meio Preparação
NS Solução salina estéril adicionada a MSM não estéril
NSA Solução salina + MSM, então esterilizado
TSB TSB estéril adicionado a MSM não estéril
TSBA TSB + MSM, então esterilizado
TSBC TSB sem MSM, salpicado com E. coli
(-) TSBC Controle negativo (sem E. coli)
NSC Solução salina sem MSM, salpicada com E. coli
(-) NSC Controle negativo (sem E. coli)
Todos os tubos exceto controles negativos foram salpicados com 250 pl de uma cultura de 1,2x108, o que rendeu uma densidade de população inicial de E. coli de 1,2x106/mL. Os tubos foram incubados a 25°C.
Em 24 horas, sinais visíveis, de crescimento foram observados no MSM 5-9% em meios de TSB/TSBA (vide Tabela 3-2 abaixo). Em contraste, quaisquer sinais de crescimento foram vistos nos tubos com MSM 1016% em meios de TSB/TSBA (vide Tabela 3-2 abaixo). Tubos de solução salina não mostraram quaisquer sinais de crescimento. Quando riscados em meios MacConkey, crescimento pesado resultou em todos os meios contendo MSM 5-9%, enquanto menos colônias foram detectadas nas placas riscadas do MSM 10% em meios de TSB/TSBA. Pouco ou nenhum crescimento resultou do riscamento do MSM 11-16% em meios de TSB/TSBA. Crescimento foi detectado no controle para TSB e positivo para solução salina
108/247 (TSB ou solução salina sem MSM, salpicado com E. coli), enquanto nenhum crescimento foi detectado nas placas riscadas dos meios não salpicados.
Tabela 3-2. Perfil de crescimento de E. coli em meios contendo MSM após 24 horas
Concentração de MSM TSB TSBA NS NSA
5% Pesado Pesado Pesado Pesado
6% Pesado Pesado Pesado Pesado
7% Pesado Pesado Pesado Pesado
8% Pesado Pesado Pesado Pesado
9% Pesado Pesado Pesado Pesado
10% Moderado Moderado Pesado Pesado
11% Pouco Pouco Pesado Pesado
12% Pouco Pouco Moderado Moderado
13% Pouco Pouco Moderado Moderado
14% Pouco Pouco Moderado Moderado
15% Pouco Pouco Moderado Moderado
16% Pouco Pouco Moderado Moderado
Conforme mostrado na Tabela 3-3, em 48 horas sinais de crescimento pesado foram observados em MSM 5-10% nos tubos de cultura de TSB/TSBA. Crescimento aparente foi observado no MSM 11% nos tubos de cultura de TSB/TSBA. Similar ao ponto de tempo de 24 horas, poucos a quaisquer sinais observáveis de crescimento foram observados no MSM 1210 15% em tubos de cultura de TSB/TSBA. Após riscamento, crescimento bacteriano pesado ocorreu em todos os meios contendo MSM 5-10%. MSM 11% em TSB/TSBA permitiu crescimento moderado, enquanto a mesma concentração de MSM adicionada à solução salina permitiu crescimento pesado. Nas concentrações de MSM 12-16% em TSB/TSBA, pouco ou ne15 nhum crescimento foi detectado nas placas. Crescimento moderado foi observado a partir de concentrações similares de MSM em meios de solução salina.
109/247
Tabela 3-3. Perfil de crescimento de E. coli em meios contendo MSM após horas
Concentração de MSM TSB TSBA NS NSA
5% Pesado Pesado Pesado Pesado
6% Pesado Pesado Pesado Pesado
7% Pesado Pesado Pesado Pesado
8% Pesado Pesado Pesado Pesado
9% Pesado Pesado Pesado Pesado
10% Pesado Pesado Pesado Pesado
11% Moderado Moderado Pesado Pesado
12% Pouco Pouco Moderado Moderado
13% Pouco Pouco Moderado Moderado
14% Pouco Pouco Moderado Moderado
15% Pouco Pouco Moderado Moderado
16% Pouco Pouco Moderado Moderado
Após 72 horas de cultura, sinais de crescimento pesado foram observados no MSM 5-10% em tubos de cultura de TSB/TSBA (Tabela 3-4).
Crescimento aparente foi observado no MSM 11% em tubos de cultura de TSB/TSBA. Similar ao ponto de tempo de 24 horas, poucos ou quaisquer sinais de crescimento foram observados no MSM 12-15% em tubos de cultura de TBS/TSBA. Após riscamento, crescimento bacteriano pesado ocorreu em todos os meios contendo MSM 5-10%. MSM 11% em TSB/TSBA permi10 tiu crescimento moderado, enquanto a mesma concentração de MSM adicionada à solução salina permitiu crescimento pesado. Na concentração de MSM 12-16% em TSB/TSBA, pouco ou nenhum crescimento foi detectado nas placas. Crescimento moderado foi observado a partir de concentrações similares de MSM em meios com solução salina.
110/247
Tabela 3-4. Pérfil de crescimento de E. coli em meios contendo MSM após
12. horas .
Concentração de MSM TSB TSBA NS NSA
5% Pesado Pesado Pesado Pesado
6% Pesado Pesado Pesado Pesado
7% Pesado Pesado Pesado Pesado
8% Pesado Pesado Pesado Pesado
9% Pesado Pesado Pesado Pesado
10% Pesado Pesado Pesado Pesado
11% Moderado Moderado Pesado Pesado
12% Pouco Pouco Moderado Moderado
13% Pouco Pouco Moderado Moderado
14% Pouco Pouco Moderado Moderado
15% Pouco Pouco Moderado Moderado
16% Pouco Pouco Moderado Moderado
Esses resultados mostram que concentrações de MSM de a partir de 10-16% são eficazes em matar bactérias em certos pontos de tempo.
Em 24 horas, MSM 10% reduziu a população bacteriana viável, enquanto em 48-72 horas concentrações mais altas eram mais eficazes em matar a maioria da população bacteriana. As concentrações de 10-16% de MSM em TSB/TSBA eram mais eficazes do que a mesma concentração em um meio baseado em solução salina. Os dados sugerem ainda que a esterilização 10 com vapor não impacta inerentemente a eficácia de MSM.
Exemplo 4
Comparação de Eficácia Bactericida de MSM em Meios Baseados em Solução Salina ou Caldo de Soja Tríptico (TSB)
Este exemplo compara eficácia bactericida de MSM em meios baseados em solução salina e TSB.
Conforme apresentado nos Exemplos 2 e 3, a metodologia de teste AET USP <51 > foi usada como a base para avaliar a letalidade para E.
coli de várias concentrações de MSM (em flocos ou microprill) variando de a
111/247 partir de 5 a 16% em TSB ou solução salina. Cada composição de meio foi inoculada com 1,25 x 106/ml_ de E. coli e então culturada por sete dias a 35°C. No final do período de incubação, as culturas foram avaliadas visualmente e foram então cultivadas em ágar de soja tríptico em concentrações 5 serialmente diluídas para assegurar crescimento bacteriano (se algum) em uma densidade que era capaz de ser quantificada. As culturas plaqueadas foram cultivadas por 24 horas a 35°C antes da análise. As composições de meio foram codificadas conforme mostrado na Tabela 4-1 e os resultados desses estudos são providos na Tabela 4-2.
Tabela 4-1. Composições de meio
Código do Meio Preparação
PS Microprill de MSM adicionado à solução salina
FS MSM em flocos adicionado à solução salina
PTSB Microprill de MSM adicionado a TSB
FTSB MSM em flocos adicionado a TSB
TSBC TSB sem MSM, salpicado com E. coli
(-) TSBC Controle negativo (sem E. coli)
NSC Solução salina sem MSM, salpicado com E. coli
(-) NSC Controle negativo (sem E. coli)
Tabela 4-2. Crescimento Log de E. coli em meios diferentes com várias concentrações de MSM
Concentração de MSM FTSB FS PTSB PS
16% 1 4,5 1 4,8
15% 2,6 4,8 2,3 5,1
14% 2,9 4,9 2,1 5,6
13% 2,6 5,5 3 5,6
12% 2,7 5,1 3 5,8
11% 3,6 5,4 3,3 5,9
10% 6 5,5 6 5,8
9% 6 5,6 6 5,9
8% 6 5,7 6 6
112/247
Concentração de MSM FTSB FS PTSB PS
7% 6 5,9 6 6
6% 6 5,9 6 6,2
5% 6 5,7 6 6,4
Concentrações na faixa de MSM de a partir de 11-16% têm um efeito negativo sobre o crescimento de E. coli em cultura por 7 dias. Como a concentração de MSM aumentou acima de 10% ou no meio FTSB ou PTSB, crescimento de E. coli foi reduzido. Ambas as formas de MSM mostraram eficácia em inibição de crescimento bacteriano.
Exemplo 5
Efeito de Meios Livres de Cloreto de Sódio Sobre Efeito Bactericida de MSM
Este exemplo mostra o efeito de meios livres de cloreto de sódio sobre efeitos bactericidas de MSM.
Um estudo empregando meio de caldo Müller-Hinton, que não contém NaCI, foi realizado. Meio Müller-Hinton padrão foi comparado com meio Müller-Hinton suplementado com NaCI para o mesmo nível que o meio baseado em solução salina do Exemplo 4. MSM foi adicionado a cada meio em concentrações variando de 5-16%. Após inoculação de cada tipo de meio contendo MSM com 1,9 x 107cfu/mL de E. coli, as culturas foram incubadas a 35°C por sete dias. Alíquotas de cada cultura foram então obtidas em 24 e 48 horas, bem como 7 dias. As alíquotas foram cultivadas em ágar de soja tríptico em concentrações serialmente diluídas para assegurar crescimento bacteriano (se algum) em uma densidade que era capaz de ser quantificada. As culturas plaqueadas foram cultivadas por 24 horas a 35°C antes da análise. As composições do meio foram codificadas conforme provido na Tabela 5-1. Os resultados desses estudos são providos nas Tabelas 5-2 a 5-4.
113/247
Tabela 5-1. Composições do meio
Código do Meio Preparação
PMHS Microprill de MSM adicionado a meio Müller-Hinton mais NaCI
FMHS MSM em flocos adicionado a meio de Müller-Hinton mais NaCI
PMH Microprill de MSM adicionado a meio Müller-Hinton
FMH MSM em flocos adicionado a meio Müller-Hinton
MHC Meio Müller-Hinton sem MSM, salpicado com E. coli
(-) MHC Controle negativo (sem E. coli)
MHNSC Meio Müller-Hinton mais NaCI sem MSM, salpicado com E. coli
(-) MHNSC Controle negativo (sem E. coli)
Após 24 horas em cultura, uma redução de aproximadamente 1 log a partir do inóculo inicial foi detectada em todos os meios tendo concentrações de MSM maiores do que 13% (Tabela 5-2). Ainda, em MSM 12%, 5 todas as composições do meio reduziram o crescimento de E. coli, exceto a composição de PMHS. Em MSM 11%, apenas o meio FMH reduziu o crescimento de E. coli.
Tabela 5-2. Crescimento Log de E. coli em meio Müller-Hinton ou MüllerHinton (mais NaCI) suplementado com MSM após 24 horas
Concentração de MSM PMHS FMHS PMH FMH
16% 6,2 6,1 6,1 6,2
15% 6,0 6,1 6,0 6,2
14% 6,0 6,0 5,9 6,3
13% 6,3 6,2 5,8 5,9
12% 7,2 5,7 5,8 5,9
11% 7,9 7,8 7,4 5,9
10% 8,7 8,2 7,9 7,8
9% 8,3 8,3 8,3 8,2
8% 8,2 8,4 8,4 8,4
7% 8,3 8,4 8,4 8,5
114/247
Concentração de MSM PMHS FMHS PMH FMH
6% 8,1 8,4 8,5 8,5
5% 8,2 8,4 8,6 8,6
Depois de 48 horas em cultura, composições do meio com concentrações de MSM maiores do que 13% reduziram crescimento de E. coli em 1-2 log. Certas concentrações de MSM são eficazes na redução de crescimento bacteriano, o que é surpreendente porque outras concentrações de 5 MSM são eficazes em apoiar atividade bacteriana aumentada.
Tabela 5-3. Crescimento Log de E. coli em meio Müller-Hinton ou MüllerHinton (mais NaCI) suplementado com MSM após 24 horas
Concentração de MSM PMHS FMHS PMH FMH
16% 6,0 5,9 6,0 5,9
15% 6,0 5,9 5,8 4,6
14% 5,7 5,9 5,4 5,3
13% 5,9 5,9 5,4 5,2
12% 6,7 6,9 5,6 5,3
11% 7,8 7,8 7,2 7,1
10% 7,9 8,0 7,9 8,2
9% 8,2 8,1 8,1 8,2
8% 8,1 8,1 8,2 8,3
7% 8,2 8,2 8,0 8,4
6% 8,1 8,2 8,4 8,4
5% 8,4 8,3 8,3 8,4
Depois de 7 dias em cultura, composições de meio contendo MSM tão baixo quanto 12% substancialmente inibiram o crescimento de E.
coli (Tabela 5-4). Meio FMHS foi o mais eficaz em MSM 12%, rendendo uma redução 3 log em E. coli.
115/247
Tabela 5-4. Crescimento Log de E. coli em meio Müller-Hinton ou MüllerHinton (mais NaCI) suplementado com MSM após 7 dias
Concentração de MSM PMHS FMHS PMH FMH
16% 4,4 4,7 3,9 7,8
15% 4,7 4,7 3,8 7,9
14% 4,9 4,7 3,3 7,6
13% 3,9 4,4 3,2 7,2
12% 6,0 4,1 6,0 6,5
11% 6,8 6,2 6,6 7,0
10% 6,8 6,9 7,0 7,0
9% 6,9 7,0 7,0 6,5
8% 7,2 7,0 7,8 7,2
7% 7,5 6,8 6,7 7,6
6% 8,0 8,0 7,5 7,6
5% 8,0 8,1 8,0 7,8
Exemplo 6
Efeito Bactericida de MSM em Meio com Teor de Proteína Baixo e Livre de
Cloreto de Sódio
Este exemplo mostra o efeito bactericida de MSM em meio com baixo teor de proteína e livre de cloreto de sódio.
Caldo de lactose, livre de ambos NaCI e de proteínas, foi usado como o meio neste experimento. MSM foi adicionado ao caldo de lactose em 10 concentrações variado de 5-16%. Um conjunto em duplicata de meios contendo MSM foi suplementado com DMSO para uma concentração final de 1%. Cada composição de meio foi inicialmente inoculada com 6,75 x 106 cfu/mL de E. coli. As culturas foram incubadas a 25°C por sete dias. Alíquotas de cada cultura fotam obtidas após 24 horas de cultura e no final de sete 15 dias de cultura. As alíquotas foram serialmente diluídas (com diluente Letheen Modificado) e plaqueadas em placas de ágar de soja tríptico. As culturas de placa foram cultivadas por 24 horas a 35°C e então analisadas. As composições dos meios foram codificadas conforme mostrado na Tabela 6-1. Os
116/247 resultados desses estudos são mostrados nas Tabelas 6-2 e 6-3.
Tabela 6-1. Composições do Meio
Código do Meio Preparação
LBM MSM adicionado a caldo de lactose
LBMD MSM adicionado a caldo de lactose suplementado com DMSO 1%
LB Caldo de lactose com MSM, salpicado com E. coli
(-)LB Controle negativo (nenhum E. coli)
Caldo de lactose contendo MSM de a partir de 11-16% reduziu crescimento bacteriano de a partir de cerca de 1 log (MSM 16%) para um máximo de cerca de 2,2 log (MSM 11%) conforme mostrado na Tabela 16-2.
Inibição de crescimento bacteriano foi reduzida em 1 log ou mais de MSM 916%.
Tabela 6-2. Log de crescimento de E. coli de 24 horas em MSM-caldo de lactose com ou sem DMSO
Concentração de MSM LBM LBMD
16% 5,8 5,3
15% 5,6 5,5
14% 5,5 5,3
13% 5,1 5
12% 5,5 4,9
11% 4,6 5,6
10% 7 4,8
9% 7,1 5,7
8% 8 7,8
7% 8 9,2
6% 8,1 8,4
5% 8,4 8,8
Após 7 dias de cultura, um padrão mais definido de inibição de crescimento bacteriano era evidente (Tabela 6-3). MSM 10% em caldo de lactose manteve a população de E. coli aproximadamente equivalente ao
117/247 inóculo inicial.
Tabela 6-3. Log de crescimento de E. coli de 7 dias em MSM-caldo de lactose com ou sem DMSO
Concentração de MSM LBM LBMD
16% 4 4
15% 3,9 3,6
14% 4 3,6
13% 3,3 3,2
12% 3,4 2,9
11% 2,5 3,1
10% 6,9 4,2
9% 7,9 7,9
8% 8,2 8,4
7% 8,4 8,6
6% 8,4 8,6
5% 8,5 8,6
Exemplo 7
Avaliação do Efeito Bactericida de MSM em Cosméticos
Este exemplo mostra o efeito bactericida de MSM em cosméticos.
Uma avaliação inicial do efeito bactericida de MSM em uma matriz cosmética foi realizada. A matriz cosmética era uma base de creme (jojoba) que é usada em muitos produtos cosméticos. MSM foi incorporado ao 10 creme em várias concentrações variando de a partir de MSM 5-16%. Cada uma dessas concentrações foi então salpicada com E. coli em um nível de 4,6 x 105 cfu/mL e incubada a 25°C por 48 horas. Após 48 horas, as alíquotas de cada cultura foram diluídas e plaqueadas em ágar de soja tríptico, que foi então incubado a 35°C por 24 horas antes da contagem. Os resultados 15 desses estudos são mostrados na Tabela 7-1,
118/247
Tabela 7-1. Log de crescimento de E. coli de 48 horas em matriz cosmética contendo MSM
Concentração de MSM Creme
16% 1
15% 1
14% 1
13% 1
12% 1
11% 0,78
10% 1,5
9% 1,9
8% 1,8
7% 2,5
6% 2
5% 3,16
Esses dados indicam que crescimento bacteriano em um creme cosmético é particularmente sensível a MSM. Surpreendentemente, concen5 trações menores de MSM (por exemplo, a faixa de concentração de 5-9%) substancialmente inibiram crescimento bacteriano neste estudo. Desta maneira, em várias modalidades, MSM em concentrações maiores do que 5% é usado para inibir atividade microbiana.
Exemplo 8
Avaliação da Atividade Bactericida de MSM 10% em Base Cosmética Com ou Sem Preservativo Durante 28 Dias
Este exemplo mostra a atividade bactericida de MSM 10% em uma base cosmética com ou sem conservante durante um período de 28 dias.
Para avaliar a habilidade de MSM em funcionar como um antimicrobiano a longo prazo em uma base cosmética, MSM 10% foi incorporado a uma matriz de creme cosmético salpicada com E. coli, que foi avaliada por um período de tempo de 28 dias usando o protocolo AET USP <51 >. A matriz de creme cosmético onde o MSM foi incorporado era livre de conservan119/247 te. Um creme adicional, com um conservante, foi também salpicado com E. coli e avaliado. Os resultados desses estudos são mostrados nas Tabelas 81 a 8-4.
Tabela 8-1. Efeito de MSM 10% sobre Crescimento Microbiano em um Cre5 me Cosmético sem Preservativo
Organismo de Teste Inóculo Inicial 48 h 7 dias 14 dias 28 dias
Aspergillus niger 1,1 x 105 8x 103 8x 103 6x 103 5x 102
Candida Albicans 2,1 x 105 <10 <10 <10 <10
Escherichia coli 4,8 x 106 <10 <10 <10 <10
Pseudomonas aeruginosa 1,89 x 106 <10 <10 <10 <10
Staphylococcus aureus 4,0 x 106 <10 <10 <10 <10
Tabela 8-2. Redução Log a partir do Inóculo de Microorganismo Inicial com
MSM 10% em diluição de MSM em Creme Cosmético de Jojoba livre de
Preservativo
Organismo de Teste 14 Dias 28 Dias
Aspergillus niger 1,2 2,3
Candida Albicans 4,3 4,3
Escherichia coli 5,7 5,7
Pseudomonas aeruginosa 5,3 5,3
Staphylococcus aureus 5,6 5,6
Tabela 8-3. Crescimento microbiano em um Creme Cosmético Contendo um
Conservante
Organismo de Teste Inóculo Inicial 48 h 7 dias 14 dias 28 dias
Aspergillus niger 1,1 x 105 2x 106 1,6 x 102 18x 101 3x 101
Candida Albicans 2,1 x 105 <10 <10 <10 <10
120/247
Organismo de Teste Inóculo Inicial 48 h 7 dias 14 dias 28 dias
Escherichia coli 4,8 x 106 <10 <10 <10 <10
Pseudomonas aeruginosa 1,89 x 106 <10 <10 <10 <10
Staphylococcus aureus 4,0 x 106 3x 104 1,6x 104 <10 <10
Tabela 8-4. Redução Log a partir de Inóculo de Microorganismo Inicial em
Creme Cosmético de Jojoba Contendo um Conservante
Organismo de Teste 14 Dias 28 Dias
Aspergillus niger 2,7 3,5
Candida Albicans 4,3 4,3
Escherichia coli 5,7 5,7
Pseudomonas aeruginosa 5,3 5,3
Staphylococcus aureus 5,6 5,6
Esses estudos mostram que uma base de creme cosmético contendo MSM é eficaz em inibir substancialmente crescimento microbiano du5 rante um período de 28 dias. Ainda, esses estudos ilustram que sob algumas condições MSM é um agente antimicrobiano mais eficiente do que um conservante cosmético padrão. Por exemplo, MSM 10% reduziu a carga microbiana para um grau maior em 48 horas comparado com creme contendo conservante. Além disso, S. aureus foi reduzida para níveis quase indetectá10 veis em 48 horas no creme contendo MSM. Em contraste, o creme contendo conservante mostrou uma população bacteriana modesta de 3 x 104 bactérias após 48 horas. Apesar de uma fase inicial menos robusta, carga bacteriana de creme contendo conservante foi reduzida para o mesmo grau perto do final do estudo comparado com o creme contendo conservante.
Exemplo 9
Avaliação da Atividade Antimicrobiana de MSM em Duas Composições
Cosméticas Livres de Preservativo
Este exemplo descreve atividade antimicrobiana de MSM em duas composições cosméticas livres de conservante.
121/247
Conforme descrito no Exemplo 8, acima, MSM 10% foi incorporado às matrizes cosméticas, que foram salpicadas com várias inoculações iniciais de micróbios. De acordo com o teste AET USP <51 >, essas culturas de micróbio salpicadas foram incubadas por 28 dias, com amostras removi5 das em 48 horas, 7 dias, 14 dias e 28 dias para plaqueamento e subsequente contagem de colônia. Os resultados desses estudos são mostrados nas Tabelas 9-1 a 9-4 abaixo.
Tabela 9-1. Efeito de MSM 10% sobre Crescimento Microbiano em Composição Cosmética Livre de Preservativo No. 1
Organismo de Teste Inóculo Inicial 48 h 7 dias 14 dias 28 dias
Aspergillus niger 8,0 x 105 9,0 x 103 4,0 x 103 5,0 x 101 <10
Candida Albicans 2,0 x 106 2,1 x 103 <10 <10 <10
Escherichia coli 5,8 x 10® 5,4 x 104 <10 <10 <10
Pseudomonas aeruginosa 5,7 x 10® 7,3 x 103 <10 <10 <10
Staphylococcus aureus 5,3 x 106 1,9x 104 <10 <10 <10
Tabela 9-2. Redução Log a partir do Inóculo de Microorganismo Inicial com
Composição Cosmética Livre de Preservativo com MSM 10% No. 1
Organismo de Teste 14 Dias 28 Dias
Aspergillus niger 4,2 4,9
Candida Albicans 5,3 5,3
Escherichia coli 5,8 5,8
Pseudomonas aeruginosa 5,8 5,8
Staphylococcus aureus 5,7 5,7
Tabela 9-3. Efeito de MSM 10% sobre Crescimento Microbiano em Composição Cosmética Livre de Preservativo No. 2
Organismo de Teste Inóculo Inicial 48 h 7 dias 14 dias 28 dias
Aspergillus niger 8,0 x 105 9,0 x 103 3,0 x 103 1,3x 103 6,0 x 101
Candida Albicans 2,0 x 10® 9,0 x 102 <10 <10 <10
Escherichia coli 5,8 x 10® 1,7 x 105 <10 <10 <10
Pseudomonas aeruginosa 5,7 x 10® 2,1 x 103 <10 <10 <10
122/247
Organismo de Teste Inóculo Inicial 48 h 7 dias 14 dias 28 dias
Staphylococcus aureus 5,3 x106 1,5 x 105 <10 <10 <10
Tabela 9-4. Redução Log a partir do Inóculo de Microorganismo Inicial com
Composição Cosmética Livre de Preservativo com MSM 10% No. 2
Organismo de Teste 14 Dias 28 Dias
Aspergillus niger 2,8 5,1
Candida Albicans 5,3 5,3
Escherichia coli 5,8 5,8
Pseudomonas aeruginosa 5,8 5,8
Staphylococcus aureus 5,7 5,7
Esses estudos mostram que MSM exibiu propriedades antimicrobianas eficazes na ausência de um conservante.
Exemplo 10
Concentrações Selecionadas de MSM Apoiam Atividade Microbiana
Este exemplo mostra que concentrações selecionadas de MSM apoiam a atividade microbiana.
Estudos de crescimento lado-a-lado em meios fortificados com MSM em uma concentração de 0, 0,04, 0,1, 0,2, 0,4 e 1% de MSM foram comparados à curva de crescimento de vários micro-organismos com uma amostra controle de concentração de MSM 0%. Cada organismo (Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium bifidum) foi cultivado em meio de crescimento bacteriano MRS (caldo) e plaqueado em ágar MRS em intervalos de tempo diferentes. Os resultados são expressos em unidades de formação de colônia por mililitro (cfu/mL).
Para cada organismo de teste, alíquotas de 100 mL de caldo MRS foram preparadas com a concentração respectiva de MSM conforme mostrado. Inicialmente, uma solução de teste de 1%, 0,4% e 0,2% de MSM (+/- 0,01%) foi preparada adicionando 1 g ou 0,45 g de MSM a 110 g de caldo MRS e 0,20 g de MSM em 100 g, respectivamente. As concentrações de teste de 0,1% e 0,04% foram preparadas fazendo uma diluição 1:10 das soluções de teste de 1% e 0,4%. Uma vez cada conjunto de meio de teste ten
123/247 do sido plaqueado quanto à esterilidade, eles foram inoculados em um nível de 100 pl de inóculo por 100 g ou mL de caldo de teste (diluições de inóculo de 1:1000) com cada respectivo micro-organismo. Todos os organismos bacterianos foram incubados a 35°C +/- 2°C por toda a duração do estudo.
Todas as amostras foram plaqueadas em ágar de MRS nos tempos 0, 12, 36, 48, 60 e 72 horas (+/- 45 minutos). Todas as preparações e plaqueamento foram conduzidos em temperatura ambiente. Todos os eventos de plaqueamento foram incubados a 35°C +/- 2°C por pelo menos 2 dias ou 3 dias para Bifidobacterium. Amostras de teste foram plaqueadas em triplicata em cada data de teste e as médias são registradas. Os resultados desses estudos são providos nas Tabelas 10-1 a 10-3.
Para amostras de Lactobacilus rhamnosus (Tabela 10-1), dentro das primeiras 12 horas, todas as amostras de MSM tinham recuperado pelo menos 12% ou mais do que o controle de 0%. As concentrações de 0,2% e 1% foram 41% e 47% maiores respectivamente dentro das primeiras 12 horas. Todos os valores de teste estavam em linha em 24 horas antes do nivelamento, as culturas eram altamente turvas sugerindo que o organismo foi conduzido para a fase estacionária. No entanto, após nivelamento levemente em 36 e 48 horas, as contagens nas amostras com MSM continuaram a aumentar enquanto o controle de 0% começou a cair.
Tabela 10-1. Crescimento de Lactobacillus rhamnosus
Tempo (horas) MSM 0% MSM 0,04% MSM 0,1% MSM 0,2% MSM 0,4% MSM 1%
0 1,4 x 106 1,7 X 106 1,7 x 106 1,9x 106 2,2 x 106 1,5 x 106
12 1,7 x 107 2,1 x 107 1,9x 107 2,4x107 2,2 x 107 2,5 x 107
24 1,4 x 109 1,5 X 109 1,3 x 109 1,4 x 109 1,4 x 109 1,4 x 109
36 2,0 x 109 1,8 x 109 1,8 x109 2,0 x109 2,1 x 109 2,7 x 109
48 2,0 x 109 2,1 x 109 2,3x109 2,3 x 109 2,1 x 109 2,4 x 109
60 3,0 x 109 2,6 x 109 3,0 x 109 2,3 x 109 2,8 x 109 2,6 x 109
72 2,7 x 109 2,6 x 109 3,0 x 109 3,2 x 109 3,0 x 109 3,8 x 109
Esses estudos sugerem que concentrações de MSM de cerca de 0,1% a cerca de 1% aumentam o crescimento/função de Lactobacillus rhamnosus, com os níveis microbianos variando de a partir de 11% a 41%
124/247 mais altos mais ou menos no final de 72 horas.
Para amostras de Lactobacillus acidophilus (Tabela 10-2), as concentrações de MSM de 0,04% e 0,1% foram as primeiras a render crescimento, seguido por MSM 0,2% e 0,4% em 36 horas e a amostra de MSM 1% em 48 horas. Nenhum crescimento foi recuperado a partir do controle 9%, sugerindo que MSM tinha um impacto positivo sobre a recuperação. Concentrações de MSM menores revelaram um tempo de recuperação mais curto do que as concentrações maiores de MSM. As amostras de MSM de 0,04% e 0,4% resultaram em níveis altos de crescimento de Lactobacillus acidophilus. Esses estudos ilustram que MSM afeta o metabolismo microbiano de uma maneira que promove adaptabilidade e recuperação microbianas.
Tabela 10-2. Crescimento de Lactobacillus acidophilus
Tempo (horas) MSM 0% MSM 0,04% MSM 0,1% MSM 0,2% MSM 0,4% MSM 1%
0 1,0 x 103 1,0 x 103 1,0x103 1,0 x 103 1,0x 103 1,0 x103
12 1,0 x 103 1,0 x 103 1,0 x103 1,0 x 103 1,0x 103 1,0 x103
24 1,0x 103 1,5 x 104 1,2 x104 1,0 x105 1,0 x 105 1,0 x 105
36 1,0 x 103 8,7 x 107 3,4 x 107 7,3 x105 1,6 x 10® 1,0x 103
48 1,0 x 103 2,2 x 108 2,1 x 108 7,4x106 2,2 x 108 4,7 x 104
60 1,0x 105 3,4 x 108 1,7 x108 1,7 x107 3,1 x 108 2,8x107
72 1,0 x 105 4,7 x 108 2,7 x 108 8,9 x106 3,6 x 10® 1,6x10®
Bifidobacterium bifidum, um micróbio comum usado em probióticos, foi também testado. Todas as amostras de Bifidobacterium foram incubadas sob condições anaeróbicas. Indicadores de oxigênio foram usados para verificar condições anaeróbicas entre intervalos de plaqueamento para as amostras de teste de Bifidobacterium e eventos de plaqueamento.
Em 48 horas, as amostras de MSM de 0,04% e 0,2% foram 1 log maior do que o controle de MSM 0%. A amostra de MSM 0,2% tinha o nível mais alto de crescimento para Bifidobacterium bifidum, seguido pela amostra de MSM 0,04%.
Conforem observado com o Lactobacillus rhamnosus (Tabela 10-2), as amostras de MSM de 0,1% e 1% continuaram a crescer enquanto
125/247 o controle foi levado para uma fase de crescimento de fase estacionária (Tabela 10-3). Aumentos de um e 2 log de Bifidobacterium foram observados com as concentrações de MSM de 0,04% e 0,2%, respectivamente (Tabela 10-3).
Tabela 10-3. Crescimento de Bifidobacterium bifidum
Tempo (horas) MSM 0% MSM 0,04% MSM 0,1% MSM 0,2% MSM 0,4% MSM 1%
0 8,7 x 104 6,6 x 104 7,0 x 104 7,0 x 104 1,1 x 105 6,8 x 104
12 2,0 x 103 3,5 x 103 4,4 x 104 3,1 x 104 2,0 x 103 2,3x104
24 1,4 x 105 1,2 x 105 1,3 x105 1,3x 105 1,0 x 105 2,0x105
36 2,4 x 105 2,3 x 105 2,0 x 105 2,3 x 105 2,3 x 105 4,0 x 105
48 2,6 x 105 5,2 x 106 2,3 x 105 5,8 x 106 4,0 x 105 3,1 x 105
60 3,3 x 105 3,4 x 107 4,7 x 105 4,8 x 107 8,7 x 105 3,7 x 105
72 1,6 x 106 8,0 x 107 5,3 x 105 1,2x 108 1,2x 106 5,7 x 105
Também foram testadas através de observação as características de crescimento geral de organismos probióticos em meios suplementado com MSM e livre de MSM. Os tamanhos de colônia de crescimento de Bacillus coagulans em meios de 0% e meios contendo MSM 5% foram comparados (vide Exemplo 13 para descrição detalhada).
Exemplo 11
Avaliação da Influência de MSM sobre Vida de Prateleira
Este exemplo descreve efeito de MSM sobre a vida de prateleira de leite.
MSM como aditivo foi mostrado aumentar o crescimento e a recuperação de micro-organismos benéficos em um produto. Este exemplo examinou se MSM modificou os micro-organismos que afetam a estabilidade da vida de prateleira de um produto baseado em contagem microbiana. Leite que tem uma vida de prateleira relativamente curta foi usado como o produto para avaliar neste estudo. Leite com concentrações de gordura foi analisado para estudar os efeitos de como a concentração de sólido no produto pode afetar o MSM. A vida de prateleira padrão para leite é 18 a 21 dias, o estudo foi realizado 28 dias. Estudo de vida de prateleira em produtos de leite fortificados com MSM em 0%, 0,5%, 1,0%, 2,5%, 5,0% e 10% foi conduzido. Os
126/247 intervalos de tempo para plaqueamento de soluções em dias foram nos dias 0, 7, 14, 21, 24 e 28. As influências dos sólidos percentuais sobre concentrações de MSM nas porcentagens que seguem foram avaliadas: 0,0%, 1,0%, 2%, 10,5% e 40%. As curvas de crescimento de unidades de formação de colônia recuperadas por mililitro (cfu/mL) de micro-organismos foram comparadas entre as concentrações de MSM, com a concentração de MSM 0% com um controle de amostra. O pó de estoque de MSM foi fornecido pela Bergstrom Nutrition com certificado de análise. O pó era a fórmula de microprill, No. do lote 0806809, data de validade 31/10/13. Todos os meios, água e pó de MSM de estoque foram checados quanto à esterilidade antes do estudo. As concentrações de MSM de trabalho foram preparadas a partir de uma solução de MSM 10% única e foram diluídas então com leite engarrafado para obter a concentração final desejada de MSM. O produto foi fornecido por uma planta de processamento de leite local. As amostras foram coletadas e o estudo começou no dia do processamento. O produto incluía duas garrafas de cada tipo de produto para cada concentração de MSM para cada dia de análise. As garrafas totais para um tipo de produto foram 72 para todo o experimento. Todas as garrafas do mesmo tipo de produto vieram de um lote de produção.
Os micro-organismos analisados foram a flora normal encontrada no produto após processamento. As amostras de produto foram mantidas a 4°C durante o estudo. Toda prep. e todo plaqueamento foram conduzidos em temperatura ambiente. Cada concentração de MSM foi realizada em duplicata. Cada diluição foi plaqueada em duplicata para cada intervalo de tempo amostrado. Para capturar as colônias apropridas por mililitro, cada organismo em cada intervalo de tempo foi plaqueado em três diluições. Todas as placas foram incubadas a 37°C ± 0,5°C por 48 horas antes do exame. A placa de diluição apropriada foi usada para enumeração e tirada a média para registro. A placa apropriada para enumeração continha entre 25 e 250 cfu/mL.
A amostra de estoque de MSM e todos os meios preparados com MSM foram testados quanto a níveis de base de micro-organismos em
127/247 ágar de Soja Tríptico. O estoque de MSM foi <10 cfu/g e todos os meios de teste foram negativos em todos os casos antes da inoculação. Todos os intervalos de tempo para plaqueamento incluíam placas de controle negativo durante despejamento para propósitos de controle de qualidade. Todas as 5 placas de controle negativo estavam ausentes para crescimento de microorganismo. Os resultados desses estudos são mostrados nas Tabelas 11.1 15.1 abaixo.
Tabela 11.1. Crescimento Log de Leite Desnatado
Cone. Tempo (Dias)
de MSM 0 7 14 21 24 28
0% 1,50 2,05 0,94 4,40 1,44 2,20
0,5% 0,00 1,00 0,70 4,41 4,68 3,79
1% 0,74 0,70 0,00 4,56 1,28 2,02
2,5% 0,74 0,70 1,65 4,37 3,69 0,00
5% 0,00 0,70 0,00 1,15 3,20 0,00
10% 0,92 0,70 0,59 0,00 0,00 0,00
Tabela 12.1 . Crescimento Log de Leite Integral 1%
Cone. Tempo (Dias)
de MSM 0 7 14 21 24 28
0,0% 0,35 1,36 0,00 4,44 4,44 5,74
0,5% 1,05 0,50 0,70 4,37 3,27 6,09
1,0% 0,35 1,23 0,70 4,37 5,27 5,36
2,5% 0,00 0,00 0,00 4,28 4,28 2,53
5,0% 0,00 2,55 0,59 0,59 1,28 0,00
10,0% 0,70 0,00 0,50 0,85 0,50 0,00
Tabela 13.1 . Crescimento Log de Leite Integral 2%
Cone. Tempo (Dias)
de MSM 0 7 14 21 24 28
0,0% 1,90 1,60 2,44 4,45 4,44 4,93
0,5% 1,26 1,59 2,09 4,43 3,27 5,48
1,0% 1,04 3,21 0,00 4,07 5,27 6,56
2,5% 1,06 0,00 0,70 2,96 4,28 5,81
128/247
Cone. Tempo (Dias)
5,0% 1,39 0,35 0,00 3,97 1,28 0,59
10,0% 0,35 0,50 0,70 1,97 0,50 1,66
Tabela 14.1. Crescimento Log de Leite Integral 10,5%
Cone, de Tempo (Dias)
MSM 0 7 14 21 24 28
0,0% 0,35 0,42 1,98 4,43 2,94 4,7
0,5% 0,00 1,09 0,00 4,36 2,73 3,84
1,0% 0,50 0,00 0,94 3,30 2,24 3,91
2,5% 0,35 0,35 0,00 2,34 3,14 1,84
5,0% 0,00 0,85 0,00 0,35 1,99 0,00
10,0% 1,00 0,85 0,35 2,14 0,35 0,00
Tabela 15.1. Crescimento Log de Leite Integral 40%
Cone, de Tempo (Dias)
MSM 0 7 14 21 24 28
0,0% 0,00 1,89 2,08 4,47 4,23 4,75
0,5% 0,00 0,35 2,32 4,46 4,02 1,95
1,0% 0,74 0,00 2,37 4,35 3,33 3,86
2,5% 0,00 0,00 0,00 2,16 3,79 0,95
5,0% 0,00 0,80 0,50 1,25 1,03 0,35
10,0% 0,00 0,00 1,95 4,45 0,85 0,35
Quando avaliando todo o leite sem o MSM, houve um pico nas contagens no dia 21. Este é um pico padrão típico com produtos de leite. O aumento na flora normal atinge um ponto de log 2 e há um início na degradação do produto. Em 4 log a vida de prateleira do produto é questionável e os fatores sensoriais tornam o produto indesejável.
O estudo de avaliação leva em consideração a natureza do pro10 duto sendo testado. O produto foi obtido de um dia de produção de lote.
Contagens microbianas para um lote único de produtos de leite podem variar em 0,5 a 1,5 log. Observando o crescimento do dia 0, as faixas para cada produto estão dentro de 1,05 log uma da outra.
129/247
O Dia 7 mostra que para o controle e as concentrações de MSM houve um leve aumento nas contagens microbianas. Houve uma contagem microbiana que era maior do que a outra para cada amostra, exceto pelo produto de leite integral a 10,5%. As contagens microbianas de produto a 10,5% estavam todas dentro de 0,75 log uma da outra (controle e concentrações de MSM). Os produtos de leite a 40% e desnatado tiveram um aumento na amostra controle. Enquanto o produto de leite a 1 % teve um pico na amostra de MSM de 5% o produto de leite a 2% teve um pico na amostra de MSM a 1%.
No Dia 14, os produtos mostram contagens microbianas e taxas de crescimento normais. Nenhum crescimento anormal é visto nos produtos. Os produtos de leite desnatado estão dentro das variabilidades de carga microbiana esperadas, quando comparando a amostra vazia com as concentrações de MSM. Produto de leite a 40% demonstrou uma contagem microbiana menor para as concentrações de MSM de 5,00% e 2,50%, enquanto a amostra vazia e as outras concentrações de MSM estão dentro de 0,40 log em contagens microbianas. Produto de leite a 10,5% demonstra a amostra vazia ser 1 log maior do que as concentrações de MSM, com MSM 1,00% e 10,0% sendo apenas dois com uma contagem microbiana.
No Dia 21, as contagens microbianas dos produtos se separaram com relação às amostras vazias e concentrações de MSM. Os produtos com leite a 1% e desnatado indicaram que MSM nas concentrações maiores (5,0% e 10,0%) deixaram mais lento o crescimento de flora normal. Enquanto as contagens microbianas do controle e das concentrações de MSM menores aumentaram 4 log. No produto de leite a 2%, a concentração de MSM a 10,0% e a concentração de MSM a 2,5% deixaram mais lenta a taxa de crescimento de flõra normal. As contagens microbianas de MSM 0,50%, 1,00%, 5,00% e do controle vazio estavam em 4 log. O produto de leite a 10,5% mostrou MSM 5,0% em 0,35 log, deixando mais lenta a taxa de crescimento comparado com controle, que estava a 4,43 log. A concentração de MSM 0,5% estava em 4,36 log, MSM 1,0% estava em 3,30 log, MSM 2,50% estava em 2,34 log e MSM 10,0% estava em 2,14 log. Com o aumento em
130/247 concentrações de MSM as contagens microbianas diminuíram, com a exceção do MSM 5,00%. A carga microbiana de produto de leite 40% foi relativamente igual em contagem para o controle, MSM 0,5%, 1,0% e 10%. A concentração de MSM 2,5% foi dois log menor do que o controle em 2,16 log, enquanto MSM 5,0% foi menor em 3,22 log.
No Dia 24, o controle e o MSM 1,0% para o produto de leite desnatado caíram para em torno de 1,3 log, enquanto o MSM 0,50% manteve contagens microbianas. As contagens microbianas de MSM 2,50% caíram, enquanto as de MSM 5,0% aumentaram. Não houve nenhum crescimento observado no MSM 10,0%. O produto de leite a 1% teve uma contagem microbiana diminuída no MSM 0,50%, aumentada no MSM 1,00%, e nenhuma alteração nos controle e MSM 2,5%. O MSM 5,0% aumentou e o MSM 10,0% diminuiu. Essas duas concentrações de MSM maiores mantiveram uma contagem microbiana baixa. Para o produto de leite a 2% todas as concentrações de MSM e controle continuaram a aumentar na carga microbiana. O MSM 10% continuou a ficar para trás na contagem microbiana. O produto de leite a 10,5% demonstrou uma diminuição no controle e nas concentrações de MSM; 0,5%, 1,0% e 10,0%. O MSM 2,5% e o MSM 0,5% continuaram a aumentar. O produto de leite a 40% mostrou uma leve diminuição em crescimento para o controle; MSM 5,0% e as concentrações de MSM menores; contagens microbianas de MSM 2,5% aumentaram em 24 horas, enquanto o MSM 10% teve uma diminuição significante em crescimento microbiano. MSM 5,0% e MSM 10,0% estavam na contagem próximos às cargas microbianas do dia 0 iniciais.
No Dia 28, produtos de leite desnatado eram de mais de 2 log em carga microbiana. A concentração de MSM 0,5% foi de 3,79 log. As concentrações mais altas de MSM, 2,50%, 5,0% e 10,0%, estavam em nenhum crescimento para o dia 28. O produto de leite a 1% mostra um aumento para o controle, MSM 0,5% e 1,0%. A amostra de MSM 2,5% teve um aumento em carga microbiana, enquanto o MSM 5,00% e 10,0% estava em nenhum crescimento. O produto de leite a 2% teve um aumento para MSM 1,0%, uma leve diminuição para controle, MSM 0,50% e 2,5%. O MSM 5,0% e
131/247
MSM 10,0% diminuíram para 0,50 log e 1,66 log, respectivamente. Os produtos de leite integral superiores, 10,5 e 40%, mostram o controle continuando a crescer em contagens microbianas. Ambos os produtos têm o MSM
1,0% aumentando, enquanto o produto de 10,5% também teve o aumento 5 de MSM 0,5% em contagens microbianas, o produto a 40% teve a diminuição de MSM 0,5%. O MSM 2,5% diminuiu em carga microbiana para ambos os produtos. 5,0% e 10% para o produto de leite não tiveram nenhum crescimento. O produto 40% teve uma contagem microbiana de 0,35 log para as concentrações de MSM de 5,0% e 10,0%.
Esses estudos indicam que o uso de MSM como um aditivo para o leite não afeta de modo adverso a vida de prateleira do leite. Em particular, no dia 21 não havia nenhuma concentração de MSM que tivesse uma contagem microbiana maior do que o controle. Além disso, esses estudos indicam que em certos produtos de leite, uma concentração de MSM 0,5% ou
MSM 10,0% na verdade manteve a carga microbiana significantemente menor do que o controle. Esses estudos sugerem que MSM em tais concentraf - ções pode ser usado para aumentar a vida de prateleira de um produto, tal como leite.
Exemplo 12
Leite com Acidophilus e Crescimento de Bacillus coagulans com
Ácido Gástrico Simulado suplementado com MSM
Este exemplo descreve leite com acidophilus e crescimento de Bacillus coagulans em ácido gástrico simulado suplementado com MSM.
Analisar os efeitos de metilsulfonilmetano (MSM) sobre o cres25 cimento de micro-organismos probióticos fortificados com MSM em um fluido de estômago simulado. Estudos anteriores mostraram que a adição de MSM a meios de crescimento auxilia na taxa de crescimento de micro-organismos. O estudo vai medir o efeito de crescimento de probiótico fortificado com MSM em um fluido de ácido gástrico simulado.
Estudos de crescimento microbiano foram realizados na presença de 0%, 0,25%, 2,0% e 5%. Intervalos de tempo para plaqueamento foram estendidos a cada 3 horas para 15 horas, então em 24 e 48 horas. As curvas
132/247 de crescimento de unidades de formação de colônia por mililitro (cfu/mL) recuperadas dos micro-organismos foram comparadas entre as concentrações de MSM com a concentração de MSM 0% como um controle de amostra para cada micro-organismo. O pó de estoque de MSM foi fornecido pela Bergstrom Nutrition com certificado de análise. O pó era a fórmula de microprill, No. do lote 0806809, data de validade 31/10/13, Todos os meios e pó de MSM de estoque foram checados quanto à esterilidade antes do estudo. O estudo foi realizado em dois organismos durante um período de duas semanas. Os micro-organismos analisados incluíam leite com Lactobacillus acidophilus e Bacillus coagulans (15BB No. do Lote 90BC004A1MZ fornecido pela Ganeden).
Para o leite com Lactobacillus acidophilus, 11 mL de leite com uma contagem de 81.000 cfu/mL foiram adicionados a 99 mL de ácido gástrico simulado. Para o Bacillus coagulans, 1 grama de pó foi adicionado a 99 mL de Caldo de Soja Tríptico (TSB) para obter uma contagem de 108.000 cfu por mL de Bacillus coagulans. Onze mililitros do TSB de Bacillus coagulans foram adicionados a 99 mL de ácido gástrico simulado. As concentrações de MSM de trabalho foram preparadas a partir de uma solução de MSM 5,0% única e foram diluídas então com leite ou TSB para obter a concentração final de MSM. Todas as soluções foram verificadas quanto à esterilidade antes de prosseguir com o estudo. O ácido gástrico simulado de trabalho foi incubado a 35,0 ± 0,2°C durante o estudo. O pH do ácido gástrico simulado estava em 1,2,
Leite com Lactobacillus acidophilus foi inoculado em ágar de MRS nos momentos listados anteriormente. Bacillus coagulans foi inoculado em Ágar de Soja Tríptico (TSA) nos momentos listados anteriormente. Todas as prep. e plaqueamentos foram realizados em temperatura ambiente. Cada concentração de MSM no ácido gástrico simulado foi realizada em duplicata. Cada diluição para cada organismo foi plaqueada em triplicata para cada intervalo de tempo amostrado. Para capturar as colônias apropriadas por mililitro, cada organismo em cada intervalo de tempo foi plaqueado em seis diluições diferentes. Todas as placas foram incubadas a 35°C ± 0,5°C por 72
133/247 horas para todos os organismos, exceto para Bacillus que foi incubado por 48 horas, antes do exame. A placa de diluição apropriada foi usada para enumeração e tirada a média para registro. A placa apropriada para enumeração contém entre 25 e 250 cfu/mL.
A amostra de estoque de MSM e todos os meios preparados com MSM foram testados quanto a níveis de base de micro-organismos em ágar de MRS e TSA. O estoque de MSM foi <10 cfu/g e todos os meios de teste foram <1 cfu/mL em todos os casos antes da inoculação (vide Tabela abaixo). Todos os intervalos de tempo para plaqueamento incluíam placas de controle negativo durante despejamento para propósitos de controle de qualidade. Todas as placas de controle negativo foram limpas para crescimento de micro-organismo. Os resultados desses estudos são providos nas Tabelas 16.1 a 18.2 abaixo.
Tabela 16.1. Controle de Números de Cultura de Estoque antes da Inoculação da Amostra de Teste
Lactobacillus acidophilus Milk Bacillus coagulans
Inóculo de cfu/mL 8,1 x 104 1,08 x 105
Cfu adicionado a 99 mL 8,1 x 105 1,08 x 106
Cfu/mL no meio no tempo 0 8,1-x 103 1,08 x 104
O controle de números é derivado de crescimento de organismo específico em meios apropriados. Os líquidos de inoculação foram plaqueados para enumeração nos meios apropriados. Para capturar as colônias apropriadas por mililitro, cada líquido foi plaqueado em triplicata em quatro diluições diferentes. A placa de diluição apropriada foi usada para enumeração e média tirada para registro. A placa apropriada para enumeração contém entre 25 e 250 cfu/mL.
134/247
Tabela 17.1. Crescimento Log de L. acidophilus em leite em duplicata
Concentração de MSM em percentagem
Tempo em (horas) 0 0 0,25 0,25 2,5 2,5 5 5
0 0 0 0 0 0 0 0 0,82
3 0 0 0 0 1,3 1 0 0,82
6 0 0 0,52 0,52 0 0 0,82 1
9 0 0 0,82 0 0,82 0 0,52 0,52
12 0 1,00 1,00 0 1,22 0,82 0,82 1,37
15 0,52 1,43 1,56 1,3 1,3 1,37 1,43 1,43
24 0,52 0,82 1,37 1,27 1,67 1,6 1,67 1,64
48 0 0 0 0 1,3 1,22 1,22 1,43
Tabela 17.2. Crescimento Log de L. acidophilus bebida de leite
Concentração de MSM em porcentagem
CD O _J
O c (D
L_ O
Tempo em (Horas) 0 0,25 2,5 5
0 0 0 0 0,41
3 0 0 1,15 0,41
6 0 0,52 0 0,91
9 0 0,41 0,41 0,52
12 0,5 0,5 1,02 1,10
15 0,98 1,43 1,34 1,43
24 0,67 1,32 1,64 1,66
48 0 0 1,26 1,33
Leite com Acidophilus posto em ácido gástrico simulado foi auxiliado por MSM na recuperação do Lactobacillus acidophilus. Recuperação 5 inicial foi menos do que o limite de detecção do método. MSM a 5,0% tinha uma recuperação log inicial de 0,41, A hora 3 mostrou um pico na recuperação para o MSM 2,5%, enquanto mantendo o crescimento log para MSM 5,0%. Na hora 6, o MSM 0,25% teve uma recuperação de 0,52 log, MSM 5,0% mostrou uma recuperação de 0,91 log. O MSM 2,5% teve uma diminu ição em crescimento para não detectável. Na hora 9, houve uma detecção significante para todas as concentrações de MSM. O controle 0% é deixado continuar abaixo do limite detectável. Na hroa 12, o controle aumentou 0,5
135/247 log igualando ao MSM 0,25%. As amostras de MSM 2,5% e 5,0% tinham taxas de crescimento em 1,02 e 1,10 log, respectivamente. A hora 15 demonstrou crescimento contínuo com as concentrações de MSM em 1,43,
1,34 e 1,43 log. O controle MSM 0% aumentou em 0,48 log para 0,98 log. O
MSM 0% e MSM 0,25% em 24 horas diminuíram em crescimento em 0,31 log e 0,11 log, respectivamente. O MSM 0,25% aumentou em 0,30 log e
MSM 5,0% aumentou em 0,23 log. Na Hora 48, o MSM 0,25% e o MSM 0% controle diminuíram para abaixo dos limites detectáveis. O MSM 2,5% diminuiu 0,38 log e o MSM 5,0% diminuiu em 0,33 log.
Tabela 18.1. Crescimento Log de Bacillus coagulans em duplicata
Concentração de MSM em porcentagem
Tempo (Horas) 0 0 0,25 0,25 2,5 2,5 5 5
0 0 0,52 0,52 0 0 0 0,52 0
3 0 0 0,52 0 0 0 0 0
6 0 0 0,52 0,52 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0 0 0 0
12 0 0 1,12 0,52 0 0 0 0
15 0 0 0 0 0 0 0,52 0
24 0 0 0 0 0 0 0 0
48 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabela 18.2. Crescimento Log de Bacillus coagulans médio
Concentração de MSM em porcentagem φ
E o ω
Φ
Tempo (Horas) 0 0,25 2,5 5
0 0 0,26 0 0,26
3 0 0,26 0 0
6 0 0,52 0 0
9 0 0 0 0
12 0 0,82 0 0
15 0 0 0 0,26
24 0 0 0 0
48 0 0 0 0
A recuperação inicial de Bacillus coagulans indicou nenhuma re136/247 cuperação. As amostras de MSM 0,25% e 5,0% tinham uma média de 0,26 log, no entanto. Uma recuperação baixa foi vista em todo o estudo para MSM 0,25% e na hora 15 para MSM 5,0%. A recuperação foi muito baixa para chegar a uma conclusão sobre o estudo de Ácido Gástrico para Bacillus coagulans. É possível que a exposição de 3 horas inicial tenha matado o organismo.
Esses estudos revelam que com relação ao leite com Acidophilus há um impacto positivo sobre crescimento bacteriano com o leite contendo MSM. Nas primeiras 3 a 6 horas há um ligeiro aumento no crescimento de fase log de cada L. acidophilus nas concentrações de MSM 0,25%, 2,5% e 5,0%. Na hora 9, há uma recuperação significante de L. acidophilus do leite nas concentrações de MSM versus o controle. A Hora 12 é quando houve a primeira indicação de recuperação do L. acidophilus no leite controle em 0,5 log, igualando ao MSM 0,25%. Concentrações de MSM de 2,5% e 5,0% estão em uma taxa de crescimento de recuperação de 1 log. Na Hora 15 o controle maximiza seu crescimento em 0,98 log. A concentração de MSM 0,25% maximiza em 1,43 log. MSM 2,5% e 5,0% maximiza na hora 24 em 1,64 e 1,66 log, respectivamente. A Hora 24 mostra uma eliminação para o controle e MSM 0,25%. Na hora 48 o controle e MSM 0,25% caem abaixo do limite detectável para o método e o MSM 2,5% e 5,0% estão ainda acima de 1 log de organismo. MSM parece estar auxiliando este processo através da aceleração da adaptação e permite que os micro-organismos se adaptem mais rápido aos estressores ambientais.
Amostras tratadas com MSM mostraram um aumento em fase log de crescimento. Este aumento da fase log é visto mais fácil na concentração de MSM 5,0%. O MSM 5,0% é 0,45 log maior do que o controle na hora 15, que é a recuperação de crescimento máxima para o controle. O MSM 5,0% atingiu um máximo de 1,66 log ou 0,68 log maior do que o controle. Isto indica uma taxa de sobrevivência de célula filha em uma porcentagem maior do que a amostra controle 0%. Desta maneira, sugerindo que o ambiente com MSM é condutor para multiplicação e sobrevivência celulares.
MSM também afetou a fase estacionária e a fase de eliminação.
137/247
A fase estacionária do controle foi mais curta do que a fase estacionária do MSM 2,5% e 5,0%. Da Hora 15 até a 24, as amostras não apenas mantiveram a taxa de crescimento, mas continuaram a aumentar em log por um mínimo de 0,24 log. Esses resultados indicam que um aditivo permitiu que L. acidophilus se desenvolvesse por mais tempo; permitindo que o organismo se estabelecesse para um melhor benefício para a saúde. O controle era não detectável na Hora 48. O crescimento de MSM 2,5% e 5,0% estava ainda acima de 1 log. Isto indica a capacidade de sobrevivência do L. acidophilus em leite era maior com o aditivo MSM.
O estudo com Bacillus coagulans indicou nenhuma recuperação. Isto foi possivelmente devido ao tempo de exposição no fluido gástrico. Um tempo de exposição mais curto seria benéfico para a capacidade de sobrevivência do Bacillus coagulans. A diferença entre o estudo de Lactobacillus acidophilus e o de Bacillus coagulans era a matriz. Leite proveu o suficiente de um tampão para permitir a sobrevivência do L. acidophilus no fluido gástrico.
Exemplo 13
Medida de Viabilidade de Bacillus coagulans Suplementado com MSM
Este exemplo descreve o efeito de MSM sobre viabilidade de Bacillus coagulans e formação de colônia.
Estudos de formação de colônia robustas microbianas foram conduzidos na presença de MSM 0%, 1,0%, 2,0% e 5%. Os microorganismos foram cultivados por 72 horas em 30 mililitros de caldo de soja tríptico. No final das 72 horas, o caldo foi medido quanto à formação de colônia, com documentação fotográfica de formação de colônia em caldo de soja tríptico. A transmitância percentual foi também medida em uma área de 25 mm x 25 mm do ágar de soja tríptico posto entre duas lâminas de microscópio em um espectrômetro.
As curvas de crescimento de unidades de formação de colônia por mililitro (cfu/mL) recuperadas dos micro-organismos foram comparadas entre as concentrações de MSM e a concentração de MSM 0% como um controle de amostra para cada micro-organismo. O pó de estoque de MSM
138/247 foi fornecido pela Bergstrom Nutrition com certificado de análise. O pó era a fórmula de microprill, No. do lote 0806809, data de validade 31/10/13. Todos os meios e pó de MSM de estoque foram checados quanto à esterilidade antes do estudo. Os micro-organismos analisados incluíam Bacillus coagulans 9BB No. do Lote 0109E002 fornecido pela Ganeden.
Para o Bacillus coagulans, o organismo foi isolado e cultivado por 24 horas antes da coleta. O micro-organismo coletado foi posto em uma garrafa de 100 mL estéril chamada diluição A. A diluição A foi diluída mais em uma solução de trabalho, com uma contagem de 210 Bacillus coagulans por 1 mL, chamada diluição B. Um mililitro de Diluição B foi usado para inocular os 30 mL de concentrações de TSB declaradas acima. As concentrações de MSM de trabalho foram preparadas a partir de uma solução única de MSM 5,0% e foram diluídas então com TSB para obter a concentração final de MSM. Todas as soluções foram verificadas quanto à esterilidade antes de prosseguir o estudo.
Bacillus coagulans foi inoculado em Ágar de Soja Tríptico (TSA) a 35°C ± 0,5°C por 72 horas para verificação de colônia e densidade de população. Toda prep. e todo plaqueamento foram conduzidos em temperatura ambiente. Cada concentração de MSM no estudo foi realizada em duplicata. Cada diluição para o micro-organismo foi plaqueada em triplicate para cada amostra. Para capturar as colônias apropriadas por mililitro, o microorganismo foi plaqueado em seis diluições diferentes. Todas as placas foram incubadas a 35°C ± 0,5°C por 48 horas para o micro-organismo. A placa de diluição apropriada foi usada para enumeração e média tirada para registro. A placa apropriada para enumeração continha entre 25 e 250 cfu/mL.
A amostra de estoque de MSM e todos os meios preparados com MSM foram testados quanto a níveis de base de micro-organismos em ágar de MRS e TSA. O estoque de MSM foi <10 cfu/g e todo o meio de teste foi <1 cfu/mL em todos os casos antes da inoculação. Todos os intervalos de tempo para plaqueamento incluíam placas de controle negativo durante despejamento para propósitos de controle de qualidade. Todas as placas de controle negativo foram limpas para crescimento de micro-organismo. Os
139/247 resultados desses estudos são providos abaixo.
Tabela 19.1. Controle de Números de Cultura de Estoque antes de Inoculação da Amostra de Teste
Bacillus coagulans
cfu/mL de inóculo 2,1 x 104
Cfu adicionado a 99 mL 2,1 x 104
Cfu/mL em média no tempo 0 2,1 x 102
O controle de números é derivado de crescimento de organis mos específicos em meios apropriados. Os líquidos de inoculação foram polaqueados para enumeração nos meios apropriados. Para capturar as colônias apropriadas por mililitro, cada líquido foi plaqueado em triplicata em quatro diluições diferentes. A placa de diluição apropriada foi usada para enumeração e média feita para registro. A placa apropriada para enumera10 ção contém entre 25 e 250 cfu/mL.
Tabela 20.1. Tabela da População de Bacillus coagulans
Concentração de MSM em Porcentagem Média de Contagem de População
0 4,3 x 1O10
1,0 1,01 x 1011
2,5 3,3 x 1011
5,0 2,8 x 1011
A contagem de população foi baseada na diluição do caldo <
soja tríptico após 72 horas e inoculação em placas de ágar de soja tríptico.
As placas foram incubadas por 48 horas e enumeradas.
Tabela 21.1. Peso de Bacillus coagulans
Concentração de MSM . _. , _ . _ em Porcentagem Medla de Pes0 da PoPula?a°
0 0,0586
1,0 2,5 5,0 0,1363 0,9828 0,1260
O caldo de soja tríptico após 72 horas foi centrifugado para baixo
140/247 em um frasco cônico. O sobrenadante foi retirado e o pelete foi lavado. A centrifugação e a lavagem foram repetidas três vezes. No final da terceira lavagem, os frascos com pelete foram pesados. Cada frasco foi pesado vazio e registrado. O peso do frasco correspondente foi então subtraído do peso final do pelete e do frasco, para dar o peso da população de Bacillus coagulans. Uma seção de 25 x 25 mm de ágar foi cortada de cada placa no final do período de 72 horas e posta entre duas lâminas de microscópio. As lâminas foram vedadas para prevenir que o ágar escapasse. O comprimento de onda foi ajustado em 546 nm e duas lâminas vazias foram usadas como uma amostra vazia. Quando examinando as placas, uma colônia de Bacillus coagulans foi observada ser maior e mais robusta olhando com o MSM 5,0% comparado com o controle de MSM 0%. Os pesos indicaram um crescimento mais pesado ou uma colônia que era maior em tamanho agregando ao peso da biomassa.
Tabela 22.1. Transmitância percentual de Bacillus coagulans
Concentração de MSM ± Transmitancia Percentual em Porcentagem
Agar 0,0 1,0 2,5 61,1% 52,3% 51,5% 49,8%
5,0 45,6%
A transmitância percentual foi usada para indicar o tamanho de colônia de Bacillus coagulans onde uma diminuição em transmitância indica um aumento em tamanho de colônia uma vez que a colônia inibiu a luz de passar pelo ágar. A adição de MSM 1 a 5% pareceu causar uma diminuição na transmitância percentual. Foi observado que o resultado da transmitância percentual pode ser influenciado pelo tamanho da amostra, localização da amostra e variáveis de ágar.
A partir de observação visual, foi notado que as colônias eram maiores em tamanho seguindo tratamento com MSM comparado com o controle vazio. As colônias também resultaram em um total de peso maior
141/247 quando medindo a biomassa das amostras tratadas com MSM comparado com o controle vazio. Esses dois resultados combinados com a transmitância percentual medida indicam que MSM como um aditivo (em certas concentrações) influencia positivamente a viabilidade, saúde e tamanho de Bacillus coagulans.
Exemplo 14
Efeito de MSM sobre Crescimento de Lactobacillus acidophilus e Recuperação em um Ambiente de Trato Intestinal Simulado
Este exemplo descreve o efeito de MSM sobre crescimento de Lactobacillus acidophilus e recuperação em um ambiente de trato intestinal simulado.
Estudos de crescimento microbiano fortificado com MSM foram conduzidos nas concentrações que seguem: 0%, 0,25%, 2,0% e 5%. Os intervalos de tempo para plaqueamento de soluções em horas foram 0, 3, 8, 24, 30, 36, 48, 54, 60 e 72 horas. As curvas de crescimento de unidades de formação de colônia por mililitro (cfu/mL) recuperadas dos micro-organismos foram comparadas entre as concentrações de MSM com a concentração de MSM 0% como um controle de amostra para cada micro-organismo. O pó de estoque de MSM foi fornecido pela Bergstrom Nutrition com certificado de análise. O pó era a fórmula de microprill, No. do lote 0806809, data de validade 31/10/13. Todos os meios, água e pó de MSM de estoque foram checados quanto à esterilidade antes do estudo. O pH do ácido gástrico simulado estava em 1,2. O pH do fluido intestinal simulado era 6,8. Os microorganismos analisados incluíam Lactobacillus acidophilus ATCC No. 4356,
Para o Lactobacillus acidophilus, leite engarrafado foi usado como o produto. Um mililitro de uma solução 9 log de organismo foi posto em 99 mL de leite engarrafado e misturado com agitação à mão. Isto foi repetido para cada concentração de MSM. A suspensão foi enumerada para cada concentração de MSM e é referida como o inóculo de partida. Dez mililitros de cada concentração de MSM e leite com Lactobacillus acidophilus foram postos em 90 mL de ácido gástrico simulado por 20 minutos. O ácido gástrico foi preaquecido para 35°C e mantido a 35°C por todos os 20 minutos. No
142/247 final do periodo de 20 minutos, 10 mL da mistura de ácido gástrico simulado, Lactobacillus acidophilus e leite foram plaqueados em 90 mL de fluido intestinal simulado. O fluido intestinal simulado foi preaquecido para 35°C e mantido a 35°C durante todo o estudo. As concentrações de MSM de trabalho foram preparadas a partir de uma solução de MSM 5,0% única e foram diluídas então com leite engarrafado para obter a concentração de MSM final. Todas as soluções foram verificadas quanto à esterilidade antes de prosseguir o estudo.
Solução intestinal de Lactobacillus acidophilus foi inoculada em ágar de MRS nos momentos listados anteriormente. Toda prep. e plaqueamento foram realizados em temperatura ambiente. Cada concentração de MSM foi realizada em duplicata. Cada diluição para cada organismo foi plaqueada em triplicata para cada intervalo de tempo amostrado. Para capturar as colônias apropriadas por mililitro, cada organismo em cada intervalo de tempo foi plaqueado em quatro diluições. Todas as placas foram incubadas a 37°C ± 0,5°C por 72 horas em um ambiente de CO2, antes do exame. A placa de diluição apropriada foi usada para enumeração e feita média para relatório. A placa apropriada para enumeração continha entre 25 e 250 cfu/mL.
A amostra de estoque de MSM e todos os meios preparados com MSM foram testados quanto aos níveis de base de micro-organismos em ágar de MRS e ágar de Soja Tríptico. O estoque de MSM foi <10 cfu/g e todos os meios de teste foram negativos em todos os casos antes da inoculação. Todos os intervalos de tempo para plaqueamento incluíam placas de controle negativo durante despejamento para propósitos de controle de qualidade. Todas as placas de controle negativo eram ausentes de crescimento de micro-organismo. Os resultados desses estudos são providos nas Tabelas abaixo.
Tabela 23.1. Crescimento Log de Lactobacillus acidophilus
Concentração de MSM
Tempo MSM 0% MSM 0,25% MSM 2,5% MSM 5,0%
Inóculo de 6,83 6,86 6,86 7,02
143/247
Concentração de MSM
Tempo MSM 0% MSM 0,25% MSM 2,5% MSM 5,0%
partida
20 min Gástrico <1,00 <1,00 <1,00 <1,00
Hora 3 1,33 1,30 1,46 1,62
Hora 8 2,22 2,18 2,30 2,33
Hora 24 4,47 4,40 5,94 6,39
Hora 30 4,10 4,66 5,39 6,63
Hora 36 4,00 4,38 5,32 8,65
Hora 48 4,59 8,03 11,17 10,17
Hora 54 8,97 8,02 13,23 13,33
Hora 60 9,23 9,14 11,27 12,76
Hora 72 9,21 9,34 12,87 12,78
Com a revisão dos dados há um benefício com a adição de MSM ao produto no crescimento e na recuperação de Lactobacillus acidophilus. Comparando o controle MSM 0% versus o MSM 5,0% há um aumento significante na fase log de crescimento com Lactobacillus acidophilus.
Dentro das primeiras 24 horas o MSM 5,0% foi 1,81 log maior do que o controle. Durante as 12 horas seguintes, o controle, o de 0,25% e 2,5%, diminuiu. O MSM 5,0% continuou a aumentar durante o mesmo período de tempo.
No final da estrutura de tempo o MSM 5,0% estava em 8,65 log, 4,65 log maior do que o controle. Da hora 36 até a hora 48 a concentração de MSM 10 cresceu em uma taxa maior do que o controle vazio. MSM 0,25% aumentou em 3,65 log e MSM 2,5% aumento em 5,85 log comparado com 0,59 log para o MSM 0%. A tendência mudou nas próximas 8 horas com o controle aumentando em 4,38 log. O MSM 0,25% diminuiu, enquanto o MSM 2,5% e 5,0% não aumentou tão significantemente quanto o controle, houve um au15 mento de 2,07 e 3,16 log. Da hora 60 até a hora 72 o controle vazio caiu enquanto as concentrações de MSM aumentaram.
Analisando os dados, outro período de 24 horas de teste teria ajudado a prever melhor um estágio de desaparecimento. Em 72 horas, o gráfico indica o Lactobacillus acidophilus atingindo a fase estacionária. Sem
144/247 nenhuma indicação de um estágio de desaparecimento, é difícil prever se a concentração de MSM prolongaria a vida da população mais do que o controle. O que é visto é um aumento de taxa de crescimento, com uma população maior atingida com o MSM 2,5% e 5,0%. MSM como um aditivo para os produtos de Lactobacillus acidophilus aumentaria a probabilidade de que o organismo se estabelecesse no trato intestinal. Mais organismos mais rápido aumentaria o benefício de consumir um probiótico.
Com a adição de MSM há um benefício em recuperação de Lactobacillus acidophilus após uma diminuição se a população crescer. Na hora 24 até a hora 36 há uma diminuição no crescimento para o MSM 0,25%, MSM 2,5% e MSM 0,0%. Embora o MSM 0,25% e o MSM 2,5% tenham se recuperado em doze horas com um aumento em taxa de crescimento significante, o MSM 0,0% levou mais doze horas para mostrar uma taxa de crescimento significante. Para o MSM 5,0% não houve nenhuma diminuição em recuperação para esta estrutura de tempo, apenas uma leve diminuição em taxa de crescimento. O MSM 5,0% levou apenas 6 horas para produzir uma taxa de crescimento substancial após a leve diminuição na taxa de crescimento na hora 24. Isto mostra como o MSM influencia o tempo de recuperação para Lactobacillus acidophilus. Aumento do tempo de recuperação para Lactobacillus acidophilus seria um benefício para ajuda-lo a estabelecer uma colônia intestina mais cedo, aumentando o benefício para a saúde.
O estudo precisa ser estendido para 96 horas e além para observar se MSM como um aditivo pode estender mais a população de Lactobacillus acidophilus. Uma população que pode se estabelecer por um período de tempo mais longo no trato intestinal seria benefício agregado a produtos probióticos e às pessoas que consomem os mesmos.
MSM como um suplemento com Lactobacillus acidophilus ajuda o organismo a se estabelecer mais rápido e atingindo uma população maior. Esses atributos beneficiariam pessoas que consomem Lactobacillus acidophilus como um probiótico.
Exemplo 15
Efeito de MSM sobre Crescimento de Grama e Valor Nutriente
145/247
Este exemplo descreve o efeito de MSM sobre crescimento de grama e valor nutriente de tal grama.
O efeito de MSM sobre crescimento de grama e valor nutriente foi avaliado através do monitoramento do crescimento da grama sob as condições que seguem: (1) fertilizante sozinho; (2) MSM sozinho (OptiMSM® GNC - No. do Lote 0922904, taxa de 1:500 ou 2 libras por 1.000 pés quadrados); e (3) fertilizante e MSM (MSM na taxa de 1:500 ou 2 libras por 1.000 pés quadrados na presença de fertilizante) aplicado ao mesmo campo, mas através de uma aplicação separada. O fertilizante testado era Urea (450-0) e o tipo de pasto incluía a mistura de gramas que segue (festuca-dosprados, azevém perene, grama-do-pomar, Timothy, trevo branco, trevo vermelh médio e azevém intermediário; sementes para tais formulações estão comercialmente disponíveis na Web no endereço oregroseeds.com/allnatdairy.html). O campo a ser testado foi medido e então marcado para denotar níveis diferentes de aplicação de MSM e controle. Usando um distribuir de difusão controlada, o MSM e/ou fertilizante foi aplicado. O campo foi irrigado como de costume (irrigado com sprinkler a cada quatro dias). A grama foi deixada crescer por sete semanas e três dias antes de ser cortada para teste. A grama amostrada foi cortada 2,54 cm do solo e posta em bolsas plásticas para secagem antes do transporte. Os resultados desses testes sobre o valor nutriente são mostrados na Tabela 23,2 abaixo. Tabela 23.2.
1:500
Resultados Relatados em uma Base Seca
Porcent. MSM/Fert Porcent. MSM Porcent. Fertilizante Método AOAC
Matéria Seca 43,26 39,57 44,62 934,02
Umidade 56,74 60,43 55,33 934,02
Proteína Bruta 20,03 24,36 22,26 2001,11
Fibra de Detergente Ácido 30,95 25,77 29,44 973,18
Fibra de Detergente Neutro 52,84 35,23 48,44 2002,04
Solúveis de Célula 47,16 64,71 51,56 Cale
Lignina 4,21 4,62 3,98 973,18
146/247
1:500
Resultados Relatados em uma Base Seca
Porcent. MSM/Fert Porcent. MSM Porcent. Fertilizante Método AOAC
Cinza 10,89 11,25 11,26 942,05
TDN/DDM Estimado 64,47 68,39 65,61 Calculation
Energ. Liq. da Lact. (Mcal/lb) 0,66 0,71 0,67 NFTA calc
Energ. Liq. Est. (Mcal/lb) 0,55 0,6 0,57 NFTA calc
Cálcio 0,47 0,96 0,55 968,08
Fósforo 0,46 0,43 0,42 964,06
Magnésio 0,16 0,28 0,17 968,08
Potássio 3,97 3,48 4,09 968,08
Sódio 0,03 0,3 0,05 983,04
Cobre 14,57 8,82 8,18 968,08
Ferro 94,51 157,77 128,15 968,08
Zinco 25,75 24,79 25,76 968,08
Manganês 40,23 33,08 33,73 968,08
Selênio 2,61 3,23 2,87 996,17
Nitrato Quantitativo 0,3 0,05 0,64 968,07
Valor de Alimentação Rei. 114,06 181,73 126,68 NFTA calc
RFV Est.-Corrigido para Cinza 191,08 132 Cálculo
Cloreto 0,94 0,62 0,34 915,01
Enxofre 0,32 0,25 0,36 923,01
Solubilidade da Proteína 46,48 59,52 52,56 923,04
Carbo Não estrutural 12,74 25,66 14,54 Calculation
Também, foi notado que embora todas as gramas avaliadas tenham crescido em taxas iguais, o azevém cresceu 5,08 a 7,62 cm (2 a 3) mais alta nas áreas tratadas com MSM. Ainda, foi notado que não houve nenhuma variação de cor visível entre a grama tratada com MMS e sem 5 MSM. Além disso, foi notado que os cavalos preferiam a grama de pasto tratada com MSM à grama tratada sem MSM.
Esses estudos indicam que MSM pode alterar o valor nutriente de grama (por exemplo, ele pode aumentar o valor alimentício relativo comparado com fertilizante sozinho), possivelmente o sabor da grama bem como
147/247 a altura da grama dependendo do tipo de grama.
Exemplo 16
Efeito de MSM 0,5% sobre a Eficiência de Fermentação com Relação à Produção de Cerveja (Scotch Ale)
Este exemplo descreve o efeito de MSM 0,5% sobre a eficiência de fermentação relacionada com a produção de cerveja, em particular Scoth Ale.
Foi demonstrado aqui que MSM em certas concentrações tem um efeito positivo sobre micro-organismos, incluindo crescimento de microorganismo. Este impacto positivo inclui organismos tais como fungos, levedura e bactérias. Culturas de levedura estão envolvidas na produção de cerveja durante o processo de fermentação para produzir etanol e dióxido de carbono. Este estudo determinou se MSM 0,5% em peso tinha um impacto positivo, tal como eficiência maior do processo de produção de cerveja. MSM foi adicionado ao Iniciador de Levedura (100 mL de H2O, 100 g de extrato de malte seco, 1 frasco de White labs Edinburgh Ale Yeast) e ao mosto. Mosto é o líquido extraído do processo de amassamento durante a produção de cerveja ou uísque. O mosto contém os açúcares que são fermentados pela levedura do processo de produção de cerveja para produzir álcool.
Primeiro, o Iniciador de Levedura foi preparado de acordo com métodos padrão conhecidos daqueles de habilidade na técnica exceto que MSM 0,5% foi adicionado a um grupo de tratamento e nenhum MSM adicionado a um grupo controle. Este procedimento é detalhado abaixo. Os materiais incluíam o que segue: 2 jarros de vidro de 1,81 kg (64 onças); funil; 2câmara a vácuo de produção de cerveja tipo padrão; 5,0 gramas de MSM; 2000 mL de Água; 200 gramas de Extrato de Malte Seco (DME); 2 frascos de extrato de levedura White Labs Edinburgh Ale WLPO28; e sanitizador de produção de cerveja (San Star).
A preparação da batelada Iniciadora de Tratamento incluía as etapas que seguem: (1) as jarras de vidro, as câmaras a vácuo e o funil foram completamente limpos e então enxaguados com sanitizador de cerveja; (2) 1000 mL de água foram fervidos, então 100 gramas de DME foram adi
148/247 cionados; (3) a amostra foi fervida por 10 minutos; (4) a amostra foi removida do calor e 5,0 gramas de MSM adicionados; e (5) a solução foi deixada esfriar para 22,22°C (72° F). A batelada de Iniciador de Tratamento foi então posta em um jarro de vidro de 1,81 kg (64 onças) sanitizado ao qual 1 frasco de levedura White Labs Edinburgh Ale foi adicionado. A câmara a vácuo foi aplicada e todo o recipiente foi posto em uma câmara escura em temperatura ambiente por 48 horas.
Preparação de Batelada Iniciadora Controle incluía as etapas que seguem: (1) os jarros de vidro, as câmaras a vácuo e o funil foram totalmente limpos e então enxaguados com sanitizador de cerveja; (2) 1000 mL de água foram fervidos, então 100 gramas de DMF foram adicionados; (3) a amostra foi fervida por 10 minutos; (4) a amostra foi removida do calor; e (5) a solução foi deixada esfriar para 22,22°C (72° F). A batelada Iniciadora de Tratamento foi então posta em um jarro de vidro de 1,81 kg (64 onças) sanitizado ao qual 1 frasco de levedura White Labs Edinburgh Ale foi adicionado. A câmara a vácuo foi aplicada e todo o recipiente foi posto em uma sala escura em temperatura ambiente por 48 horas.
O Iniciador de Tratamento com MSM mostrou sinais de atividade (borbulhamento através do coletor) em aproximadamente 2 horas após a levedura ter sido iniciada. O material de partida controle não mostrou nenhum sinal de atividade até aproximadamente 10 horas após a levedura ser sido iniciada.
No Dia da Produção da Cerveja (2 dias após o iniciador de levedura ter sido feito) o purê foi preparado. Os materiais para preparar o purê incluíam o que segue: 8,16 kg (18 libras) de grão de base American 2-Row; 1,36 kg (3 libras) de grão de especialidade Crystal Malt 40L; 453,59 g (1 libra) de grão de especialidade Cara-Pils Malt; e água. Um preparador de purê (um recipiente usado no processo de produção do purê para converter os amidos em grãos moídos em açúcares para fermentação) e caldeira do fermentador foram limpos com lavagem dos fermentadores empoeirados e totalmente enxaguados. O preparador de purê foi então sanitizado (Stan Star Brewing Sanitizer). Os grãos que seguem foram esmagados e moídos para
149/247 fabricação do purê: 8,16 kg (18 libras) de grão de base American 2-Row; 1,36 kg (3 libras) de grão de especialidade Crystal Malt 40L; e 453,59 g (1 libra) de grão de especialidade Cara-Pils Malt. 26,5 I (sete galões) de água foram aquecidos para 72,78°C (163° F) e então combinados com preparador de purê preaquecido. Os grãos esmagados foram então adicionados e a solução foi completamente misturada. A tampa foi posta e a solução deixada formar um purê por 60 minutos. Após 60 minutos, 16,08 I (4,25 galões) de trabalho foram drenados do preparador de purê para a caldeira do fermentador. A água de reserva foi preaquecida para 75,56°C (168° F), adicionada ao preparador de purê e completamente misturada com o grão. A mistura foi deixada incubar por 10 minutos. Este processo foi repetido mais duas vezes até que um volume de pré-ebulição total de 48,26 I (12,75) galões foi obtido na caldeira do fermentador.
Após a preparação do purê, o processo de produção de cerveja foi iniciado. Os materiais que seguem foram usados para o processo de produção de cerveja: 85,05 g (3,0 onças) de lúpulo Cascade; 2 colheres de chá de musgo Irlandês; 105 gramas de MSM; caldeira do fermentador contendo 48,26 I (12,75 galões) de mosto; esfriador de mosto; 2 recipientes de fermentação; refractrômetro; sanitizador de produção de cerveja; lavagem de fermentadores empoeirados (PBW); e um filtro de concreto celular. O equipamento foi limpo completamente com PBW. O resfriador de mosto e o filtro de concreto celular foram sanitizados com sanitizador de produção de cerveja (San Star Brewing Sanitizer). O mosto (48,26 I (12,75 galões)) foi trazido para fervura em uma caldeira do fermentador e uma primeira alíquota de lúpulo Cascade 42,52 g (1,5 onça) foi adicionada à solução. Com 30 minutos de fervura, uma segunda alíquota 14,17 g (0,5 onça) de lúpulo Cascade foi adicionada. Com 40 minutos de fervura, terceira alíquota de lúpulo Cascade foi adicionada, bem como 2 colheres de chá de musgo Irlandês. Com 50 minutos de fervura, uma quarta alíquota 14,17 g (0,5 onça) de lúpulo Cascade foi adicionada. O mosto foi decantado da caldeira do fermentador para o resfriador de mosto e esfriado para (74° F). O mosto foi então dividido em dois fermentadores (cada um de 21 litros de volume). MSM 0,5% (105 gramas)
150/247 foi adicionado ao fermentador de tratamento. Leitura de Brix de ambos os fermentadores foi feita e o ponto de base foi registrado (Fermentador de tratamento = 15 Brix; Fermentador controle = 14,75 Brix). Cada fermentador foi testado com Brix a cada 24 horas por 21 dias. Ambos os fermentadores fo5 ram aerados por 25 minutos com filtro de concreto celular sanitizado. Levedura infundida com MSM foi iniciada no recipiente do fermentador de tratamento enquanto levedura sem alteração foi iniciada no recipiente de fermentador controle. Tubos de sopro foram presos a ambos os fermentadores e fermentação foi deixada acontecer por 21 dias. Os resultados dos estudos 10 são providos na Tabela 23.3 abaixo.
Tabela 23.3
Dia F.G. MSM (Ajustado para Alc e Temp.) F.G. Controle (Ajustado para Alc e Temp)
1 1,026 1,028
2 1,018 1,020
3 1,016 1,018
4 1,016 1,017
5 1,015 1,017
6 1,015 1,015
7 1,015 1,015
8 1,015 1,015
9 1,015 1,015
10 1,015 1,015
11 1,015 1,015
12 1,015 1,015
13 1,015 1,015
14 1,015 1,015
15 1,015 1,015
16 1,015 1,015
17 1,015 1,015
18 1,015 1,015
151/247
Dia F.G. MSM (Ajustado para Alc e Temp.) F.G. Controle (Ajustado para Alc e Temp)
19 1,015 1,015
20 1,015 1,015
21 1,015 1,015
Quando da fabricação de um iniciador de levedura quanto mais rápida acontecer a cultura de levedura melhor para eficiência e para minimização da contaminação ambiental potencial de micro-organismos de origem no ar indesejáveis. A batelada de início tratada com MSM mostrou atividade 80% mais cedo do que o controle (2 horas comparado com 10 horas). O estudo também indicou que MSM auxiliou no processo de fermentação. Tal como o iniciador de levedura, quanto mais rápida a ativação do processo de fermentação de levedura melhor para a eficiência e para minimização de contaminação ambiental de micro-organismos de origem no ar indesejáveis. O fermentador tratado com MSM mostrou atividade 58% mais cedo do que o controle (3,5 horas comparado com 9 horas). A batelada de tratamento com MSM também atingiu fermentação máxima em 5 dias onde a batelada controle levou 6 dias (um tempo de término 17-25% mais cedo).
Esses resultados indicam que MSM é útil no processo de produção de cerveja.
Exemplo 17
Crescimento de Lactobacillus acidophilus em Leite com Acidophilus Suplementado com MSM
Este exemplo descreve crescimento de Lactobacillus acidophilus em leite com Acidophilus suplementado com MSM.
Estudos de crescimento microbiano foram conduzidos em leite com Acidophilus fortificado com MSM a 0%, 0,5%, 2,5% e 5%. Os intervalos de tempo para avaliação foram 8 e 16 horas para um total de 104 horas. Então as amostras foram avaliadas a cada 7 dias por um total de 28 dias. As curvas de crescimento de unidades de formação de colônia por mililitro (cfu/mL) recuperadas dos micro-organismos foram comparadas entre o leite
152/247 com Acidophilus com concentração de MSM e o leite com Acidophilus com concentração de MSM 0% como um controle de amostra. O pó de estoque de MSM foi fornecido pela Bergstrom Nutrition com certificado de análise. O pó era uma fórmula de microprill, lote No. 0806809, data de validade 31/10/13. Os leites foram comprados em uma loja local. O leite de Acidophilus tinha baixo teor de gordura (Darigold). O leite com Acidophilus mais Bifidus continha 2% de gordura do leite (Lucerne). Leite com Acidophilus mais de Bifidus foi administrado simultaneamente com uma concentração de MSM de 2,5% e 0% como um produto contendo dois microrganismos. As soluções de trabalho foram mantidas a 4°C durante o estudo. As soluções de trabalho de leite de MSM foram ativadas em duplicata.
Toda a preparação e todo o plaqueamento foram conduzidos em temperatura ambiente. Todas as diluições para todas as soluções foram plaqueadas em triplicata para todos os intervalos de tempo amostrados. Para capturar as colônias apropriadas por mililitro, todos os organismos em todos os intervalos de tempo foram plaqueados em três soluções diferentes. Todas as placas foram incubadas a 35°C ± 0,5°C em CO2 por 72 horas para todas as soluções. A placa de diluição apropriada foi usada para enumeração e a média tirada para relatório. A placa apropriada para enumeração contém entre 25 e 250 cfu/ml.
A amostra de estoque de MSM e todos os meios preparados com MSM foram testados quanto aos níveis de base de micro-organismos em ágar de MRS e TSA. O estoque de MSM foi <10 cfu/g e todos os meios de teste eram <1 cfu/mL em todos os casos antes da inoculação. Todos os intervalos de tempo para plaqueamento incluíam placas de controle negativo durante despejamento para propósitos de controle de qualidade. Todas as placas controle foram limpas para crescimento de micro-organismo. Em 72 horas, as concentrações de MSM e soluções de controle negativo foram verificadas negativas para contaminação. Os resultados desses estudos são providos na Tabela 24 abaixo.
153/247
Tabela 24. Crescimento Log de Lactobacillus acidophilus em Leite fortificado com MSM
Concentração de MSM em porcentagem em Leite com acidophilus
Tempo Leite Acid. A/B 0 A/B 2,5% 0,50% 0,50% 2,50% 2,50% 5% 5%
0 8,82 5,33 6,41 7,33 6,62 6,67 6,7 6,56 6,47
8 9,08 8,36 8,67 9,06 9,00 9,06 8,97 8,73 9,08
24 9,17 8,19 9,16 9,41 9,35 9,24 9,01 9,32 9,26
32 8,85 8,73 8,87 9,2 9,12 9,06 9,11 9,33 9,19
48 8,54 8,15 8,3 8,55 8,69 8,93 8,77 8,78 8,72
56 8,46 8,51 8,56 8,77 8,69 8,7 8,81 8,88 8,7
72 8,65 8,45 8,45 8,56 8,67 8,71 8,6 8,75 8,63
80 10,09 9,66 9,82 9,92 9,51 9,52 9,96 9,87 9,71
96 10,02 9,68 8,61 9,93 10,25 10,18 10,31 10,14 10,26
104 9,45 8,83 8,92 9,47 9,52 9,8 9,45 9,74 9,38
Dia 7 10,29 10,1 10,42 10,64 10,72 10,4 10,59 10,89 10,52
Dia 14 6,96 6,83 5,70 6,81 5,63 8,00 6,66 7,82 8,26
Dia 21 5,30 5,60 5,37 5,37 5,37 5,56 5,37 5,64 5,48
Dia 28 4,00 3,82 3,94 2,52 3,48 3,43 3,22 2,52 2,52
Na hora 0 havia crescimento pelo menos 1 log maior de Lactobacillus acidophilus no leite sem MSM comparado com leite fortificado com
MSM. A significância é, na hora 8, o leite fortificado com MSM mostrou um mínimo de um aumento 1,73 log em crescimento, enquanto o leite sem MSM mostrou um aumento de 0,26 na taxa de crescimento. O MSM dentro das primeiras 8 horas de crescimento rendeu um aumento significante comparado com o controle. O maior aumento em crescimento é MSM 5% com um aumento log médio de 2,39, enquanto o MSM 2,5% foi de um aumento médio de 2,33 log. A hora 24 mostra uma taxa de crescimento que era nivelada entre concentrações controle e de MSM. O controle tinha 0,32 log de diminuição em crescimento na hora 32. As concentrações de MSM de 2,5% e 5% tinham uma diminuição de 0,04 e 0,03 log em crescimento, enquanto a de
0,5% foi diminuída por um 0,22 log na hora 32. Na hora 48, o controle teve uma diminuição de 0,31 log, enquanto a diminuição de MSM é de 0,54 log para 0,5%, 0,24 log para 2,55 e 0,51 log para 5%. As concentrações de
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MSM mantiveram uma taxa de recuperação maior comparado com o controle. A concentração de MSM de 2,5% era em média 0,31 log maior e a de 5% era 0,21 log maior. A hora 56 não mostrou nenhuma mudança significante em aumento ou diminuição de crescimento. Na hora 72 o controle aumentou em 0,19 log, enquanto as concentrações de MSM eram estáveis. A hora 80 teve um aumento significante em crescimento. O controle mostrou um aumento de 1,44 log. As amostras tratadas com MSM mostraram um aumento de crescimento em 0,5% (1,1 log), 2,5% (1,09 log) e 5% (1,1 log). Na hora 96 o controle estabilizou. Todas as concentrações de MSM aumentaram em média (0,5%, 0,38 log; 2,5%, 0,51 log; e 5,0% 0,41 log) para a Hora 96. Na Hora 96, a concentração de MSM de 2,5% foi 0,23 log maior do que o controle. Na Hora 104, a diminuição em crescimento log era comparável entre as concentrações controle e MSM (diminuição de controle 0,57 log; MSM 0,5% diminuiu 0,60 log; MSM 2,5% diminuiu 0,62 log; e 5,0% de MSM diminuiu 0,64 log). Comparando recuperação de crescimento final entre concentrações controle e de MSM, o estudo mostrou o MSM 0,5 a 0,05 log maior do que controle, o MSM 2,5% em 0,18 log maior do que o controle e o MSM 5% em 0,11 log maior do que controle.
O Dia 7 mostrou um aumento de crescimento da hora 104 para todas as soluções de trabalho. O controle aumentou 0,84 log, MSM 0,5% aumentou 1,19 log, MSM 2,5% aumentou 0,87 log e MSM 5,0% aumentou 1,15 log. MSM 0,5% foi 0,39 log maior do que o controle, MSM 2,5% foi 0,21 log maior do que o controle e MSM 5,0% foi 0,42 log maior do que o controle. O Dia 14 mostrou uma diminuição significante em crescimento. A maior diminuição em crescimento foi MSM 0,5% em 4,46 log. O controle foi próximo com uma diminuição de 0,33 log, MSM 2,5% a 3,17 e MSM 5% a 2,67 log. MSM 0,5% foi 0,74 log menor do que o controle, enquanto o MSM 2,5% era 0,37 log maior. A amostra de MSM 0,5% era um log inteiro maior do que o controle em 1,08 log. O Dia 21 continuou a diminuição em crescimento. O controle era 1,66 log menor, MSM 0,5% era 0,85 log menor, 2,5% era 1,87 menor e MSM 5,0% era 2,48 log menor. MSM 0,5% e o controle foram iguais em crescimento log, com MSM 2,5% 0,17 log maior do que o controle e
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MSM 5,0% 0,26 log maior do que o controle. No Dia 28, um crescimento menor continuou com uma diminuição de 1,3 log para o controle, 2,37 log para MSM 0,5%, 2,14 log para MSM 2,5% e 3,04 log para MSM 5,0%. O crescimento para o controle negativo no Dia 28 foi 1,00 log maior do que 5 MSM 0,5%, 0,68 log maior do que MSM 2,5% e 1,48 log maior do que MSM 5,0%.
O leite com Aciduphilus mais Bifidus durante o curso do estudo demonstrou taxas de crescimento similares. Da Hora 0 até a Hora 8 ambos mostraram um aumento significante em crescimento. Na Hora 24, o controle 10 diminuiu 0,17 log, enquanto o MSM 2,5% aumentou 0,49 log, dando o MSM 2,5% uma contagem maior 0,97 log do que o controle. Na Hora 32, o MSM 2,5% diminuiu 0,29 log e o controle aumentou 0,54 log, com o MSM 2,5% tendo uma contagem 0,14 log maior do que o controle. Da Hora 48 até a Hora 72 houve um padrão contínuo de aumento e diminuição em crescimento, 15 com o MSM 2,5% tendo um crescimento alto de 0,15 e 0,5 log com relação ao controle. Na Hora 72 o crescimento foi igual entre o controle e MSM 2,5%. A Hora 80 mostrou um aumento de crescimento de 1,21 log para o controle e 1,37 log para o MSM 2,5%, com o MSM 2,5% tendo aumento de 0,16 log em crescimento. Na Hora 96, houve uma diminuição significante em 20 crescimento para o MSM 2,5% de 1,21 log. O controle não mostrou nenhuma diferença significante da Hora 80, resultando em um crescimento maior de 1,07 log para o controle comparado com MSM 2,5%. Na Hora 104, o crescimento do controle diminuiu em 0,85 log e a amostra de MSM 2,5% aumentou em 0,31 log. A Hora 104 mostrou as amostras de MMS 2,5% em 25 0,09 log maior do que o controle. O Dia 7 teve um aumento de 1,27 log para o leite e 1,5 log para o MSM 2,5%, com o MSM 2,5% sendo 0,32 log maior do que o leite. O Dia 14 mostrou uma diminuição em crescimento, 3,27 log para leite, 4,72 log para MSM 2,5%. O leite tinha um aumento de 1,13 em crescimento comparado com o MSM 2,5%. O Dia 21 diminuiu lentamente, o leite diminuiu em 1,23 log e MSM 2,5% em 0,33 log, com o leite sendo 0,23 log maior em crescimento do que MSM. O leite do Dia 28 diminuiu em 2,78 log e MMS 2,5% diminuiu em 1,43 log, com MSM sendo 0,12 log maior do
156/247 que o leite sem MSM. A Tabela 25 mostra os dados através da média das duplicatas.
Tabela 25. Crescimento de Lactobacillus acidophilus em Leite fortificado com média de MSM
Concentração de MSM em porcentagem em Leite com acidophilus
Tempo Leite Acid. A/B A/B 2,5% 0,50% 2,50% 5,00%
0 8,82 5,33 6,41 6,98 6,69 6,52
8 9,08 8,36 8,67 9,03 9,02 8,91
24 9,17 8,19 9,16 9,38 9,13 9,29
32 8,85 8,73 8,87 9,16 9,09 9,26
48 8,54 8,15 8,3 8,62 8,85 8,75
56 8,46 8,51 8,56 8,73 8,76 8,79
72 8,65 8,45 8,45 8,62 8,66 8,69
80 10,09 9,66 9,82 9,72 9,74 9,79
96 10,02 9,68 8,61 10,09 10,25 10,20
104 9,45 8,83 8,92 9,50 9,63 9,56
Dia 7 10,29 10,1 10,42 10,68 10,50 10,71
Dia 14 6,96 6,83 5,7 6,22 7,33 8,04
Dia 21 5,3 5,6 5,37 5,37 5,465 5,56
Dia 28 4,00 3,82 3,94 3,00 3,325 2,52
Tabela 26. Crescimento de micro-organismos não probióticos em Leite com
Acidophilus cfu por mL
Concentração de MSM em porcentagem
Dia Leite Acid. A/B 0 A/B 2,5% 0,50 % 0,50 % 2,50 % 2,50 % 5% 5%
0 10 300 370 20 30 10 10 10 20
3 20 830 480 10 10 30 10 10 10
7 10 1250 570 10 10 20 10 10 20
14 20 2500 1460 20 20 <10 <10 20 10
21 20 8000 3500 20 40 60 170 20 10
28 650 1200 00 1100 00 30 2250 2460 2700 10 10
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A Tabela 26 mostra os dados para contagens de placa padrão analisadas nas soluções de trabalho. Isto foi realizado para verificar em como MSM afetaria a flora normal encontrada nos leites. O Dia 0 foi o dia que as amostras foram ajustadas para iniciar o estudo. O Leite com Acidophilus mais Bifidus começou com uma contagem maior no Dia 0 do que era tipicamente esperado. Isto fez com que os valores finais fossem elevados. O produto de leite com Acidophilus no Dia 0 estava em valores esperados. O leite com Acidophilus manteve taxas de crescimento adequadas durante o estudo e eram equivalentes a taxas de crescimento típicas vistas em produtos de leite. O MSM 5,0% não permitiu nenhum crescimento significante durante o estudo.
MSM como um aditivo para este produto desempenhou um papel significante em aumento da população de probiótico, Lactobacillis acidophilus, em um produto. Dentro das primeiras oito horas de fortificação de um produto com MSM, houve uma influência significante em probiótico no produto. Houve um aumento significante na taxa de crescimento de probiótico. Leite com Acidophilus sem MSM teve um aumento de 0,26 log em crescimento dentro das primeiras 8 horas. Equanto o leite com Acidophilus com MSM teve um mínimo de 1,73 log de crescimento. Então a amostra de leite de MSM 2,5% teve um aumento de 227 e 2,39 log. A amostra de MSM 5,0% teve um aumento de 2,17 e 2,61 log.
Durante o estudo houve um aumento contínuo de crescimento quando comparando o controle de leite com Acidophilus com o leite com Acidophilus fortificado com MSM. A taxa de crescimento alta varia de 0,04 a 1,08 log com relação ao controle. Apenas em dois pontos de tempo houve dados que mostraram o crescimento de controle maior do que as soluções de MSM, Hora 80 e Dia 28. Quando analisando os dados, a razão para o crescimento maior na Hora 80 foi devido à curva de crescimento de pico. Leite com Acidophilus sem MSM atingiu o pico antes do leite com MSM. Desta maneira, o MSM estava ainda na fase de crescimento, enquanto o leite de Acidophilus tinha atingido o pico de seu crescimento. Com o aumento em crescimento devido ao MSM, houve uma taxa maior de desaparecí
158/247 mento no final do estudo. Desta maneira, o Dia 28 mostrou um crescimento menor para soluções de MSM do que o controle.
O crescimento de pico foi atingido com o leite com Acidophilus fortificado com MSM 0,5%, com um log de 10,89. O leite com Acidophilus atingiu um crescimento de pico de 10,29 log. Cada concentração de MSM excedeu o crescimento do leite com Acidophilus. MSM 2,5% teve um crescimento de pico de 10,59 log e MSM 0,5% teve uma taxa de crescimento de pico de 10,72 log. Isto estabeleceu mais a influência de MSM em um probiótico. O produto uma vez fortificado com MSM excedeu o crescimento do produto sem MSM. Com o crescimento de pico sendo maior, houve um crescimento alto visto no Dia 14, uma semana inteira passada a taxa de crescimento de pico. O crescimento do leite com Acidophilus foi 6,96 log; o leite fortificado com MSM foi 7,82 e 8,26 log, um aumento de 0,86 e 1,3 log respectivamente.
A eficácia do probiótico é baseada em três pontos: Capacidade de sobrevivência, Colonização e Produção de Ácido Láctico. MSM demonstra a habilidade em afetar a capacidade de sobrevivência e a colonização das bactérias probióticas. Dentro das primeiras oito horas a habilidade em colonizar foi vista com a taxa de crescimento alta. No Dia 14 a habilidade em sobreviver foi vista com crescimento log alto. A habilidade em aumentar a produção de Ácido Láctico foi o terceiro componente da eficácia de um probiótico que será estudado. Neste estudo, houve uma reação observada de produção de espuma aumentada nas soluções de MSM.
A declaração do MSM sendo um aditivo de suplemento alimentar benéfico é apoiada por este estudo. A flora microbiana do trato intestinal pode ser impactada de uma maneira positiva com a adição de MSM na dieta humana. Houve um aumento em crescimento de bactérias probióticas, com um aumento em capacidade de sobrevivência. Aumentando a probabilidade de que MSM quando usado em um produto probiótico aumentaria o benefício para o consumidor.
Exemplo 18
Recuperação de Lactobacillus acidophilus em Leite com Acidophilus Suple159/247 mentado com MSM
Este exemplo mostra recuperação de Lactobacillus acidophilus em leite com Acidophilus suplementado com MSM.
Para analisar os efeitos de MSM sobre a recuperação de Lactobacillus acidophilus em leite com Acidophilus, após um tempo de incubação especificado uma porção diluída das soluções de crescimento originais foi transferida para o caldo apropriado e amostrada em intervalos de tempo analisando as taxas de recuperação. Crescimento microbiano foi determinado em leite com Acidophilus fortificado com MSM em 0%, 0,5%, 2,5% e 5%. Nos Dias 7, 14, 21 e 28 as amostras de leite com Acidophilus fortificado com MSM foram diluídas e transferidas para os caldos apropriados sem MSM para o estudo de recuperação. Intervalos de tempo para plaqueamento foram estendidos a cada 24 horas durante um período de 72 horas. As curvas de crescimento de unidades de formação de colônia por mililitro (cfu/mL) recuperadas dos micro-organismos foram comparadas entre o leite com Acidophilus com concentrações de MSM com o leite com Acidophilus com concentração de MSM 0% como um controle de amostra. Todos os meios e pó de MSM de estoque foram checados quanto à esterilidade antes do estudo. O estudo foi realizado em quatro organismos durante um período de duas semanas. Os micro-organismos foram separados em duas rodadas, cada semana analisando dois micro-organismos por semana.
O leite com Acidophilus tinha teor de gordura baixo (Darigold). O Leite com Acidophilus mais Bifidus continha 2% de gordura do leite (Lucerne). O leite com Acidophilus e Bifidus foi ativado simultaneamente com uma concentração de MSM de 0,2% e 0% como um produto contendo dois microorganismos. As soluções de trabalho foram mantidas a 4°C durante o estudo. As soluções de trabalho de leite com MSM foram administradas em duplicata. Todas as preparações e todos os plaqueamento foram realizados em temperatura ambiente. Todas as diluições para todas as soluções foram plaqueadas em triplicata para todos os intervalos de tempo amostrados. Para capturar as colônias apropriadas por mililitro, todos os organismos em todos os intervalos de tempo foram plaqueados em três diluições diferentes. Todas
160/247 as placas foram incubadas a 35°C + 0,5°C em CO2 por 72 horas para todas as soluções. A placa de diluição apropriada foi usada para enumeração e tirada a média para relatório. A placa apropriada para enumeração contém entre 25 e 250 cfu/mL.
A amostra de estoque de MSM e todos os meios preparados com MSM foram testados quanto a nível de base de micro-organismos em ágar de MSM e TSA. O estoque de MSM era <10 cfu/g e todos os meios de teste eram <1 cfu/mL em todos os casos antes da inoculação. Todos os intervalos de tempo para plaqueamento incluíam placas de controle negativo durante despejamento para propósitos de controle de qualidade. Todas as placas controle foram limpas para crescimento de micro-organismo. Em 72 horas, as concentrações de MSM e soluções de controle negativo foram verificadas negativas para contaminação.
O estudo observa os efeitos de MSM sobre a recuperação de Lactobacillus acidophilus de leite com Acidophilus fortificado com MSM. O estudo de recuperação foi realizado paralelo com o estudo feito sobre os efeitos de MSM sobre crescimento de Lactobacillus acidophilus em leite com Acidophilus fortificado com MSM. A taxa de recuperação foi analisada no Dia 7, Dia 14, Dia 21 e Dia 28. Para a Tabela 27, o crescimento para Dia x sem nenhum tempo é calculado para o estudo de crescimento inicial com o fator de diluição para o crescimento log. O crescimento da Tabela 28 foi calculado a partir do Dia de crescimento log x sem nenhum tempo subtraído do crescimento log para dados analisados subsequentes, por exemplo, o Dia 28 tinha um resultado de 4,00 log, calculando a diluição o valor 0 do tempo Dia 28 é 2,00 log para a Tabela 27. A Tabela 28 considera o valor de 2,00 como o valor de partida. Dados subsequentes para as horas analisadas, pegar as contagens em log e subtrair o valor inicial de 2,00, por exemplo, Dia 28-24 é 11,20 log, subtraindo 2,00 log a taxa de crescimento alta é 9,29 log.
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Tabela 27. Recuperação Lag de Lactobacillus acidophilus em Leite Fortificado com MSM Dia 7
Dia -Hora 0% A/B 0% A/B 2,5% 0,50% 0,5% 2,50% 2,5% 5% 5%
Dia 7 -24 11,29 12,88 13,44 13,1 12,78 13,16 13,15 12,12 13,29
Dia 7 - 48 12,71 13,42 12,5 12,7 12,67 12,04 12,67 13,09 13,25
Dia 7 - 72 12,17 13,47 12,77 12,4 13,74 11,92 13,28 13,1 12,87
Tabela 28. Recuperação de Lactobacillus acidophilus em Leite Fortificado com MSM Dia 7 com recuperação média em porcentagem de MSM com dados de partida iniciais.
Concentração de MSM em porcentagem
Dia -Hora Leite Acidophilus Leite Ac/Bf MSM Ac/Bf 2,5% MSM 0,5% MSM 2,5% MSM 5,0%
Dia 7 8,29 8,1 8,42 8,68 8,50 8,71
Dia 7 -24 11,29 12,88 13,44 12,94 13,16 12,71
Dia 7 - 48 12,71 13,42 12,50 12,69 12,36 13,17
Dia 7 - 72 12,17 13,47 12,77 13,07 12,60 12,99
A recuperação do Dia 7 mostra que todas as concentrações de MSM dentro das primeiras 24 horas de crescimento têm um aumento maior do que 1 log com relação ao controle, MSM 0,5% 1,65, MSM 2,5% 1,87 e MSM 5,0% 1,42, Na Hora 48, o controle era ligeiramente maior em crescimento com o MSM 0,5% a 0,03 log e 0,36 log maior do que MSM 2,5%, mas 0,46 log menor do que MSM 5,0%. Na Hora 72, as concentrações de MSM excediam o crescimento do controle; MSM 0,5% a 0,9 log, MSM 2,5% a 0,43 log e 5,0% a 0,82 log.
Controle de Acidophilus mais bifidus nas primeiras 24 horas estava em 12,88 log para crescimento, enquanto Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5% estava em 13,44 log de crescimento. O leite com MSM 2,5% era 0,56 log maior do que o controle. Nos próximos dois períodos de 24 horas o controle de Acidophilus mais bifidus teve um crescimento em 13,42 log e 13,47 log. O Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5% teve um crescimento a 12,50 log e 12,77 log durante o mesmo período de tempo. O controle era 0,92 log maior do que MSM 2,5% no segundo período de 24 horas e era 0,7 log maior no terceiro período de 24 horas.
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Tabela 29. Recuperação de Lactobacillus acidophilus em Leite Fortificado com MSM Dia 7 em aumento de taxa de crescimento de recuperação log a partir do tempo de início de zero
Hora Leite Acidophilus Leite Ac/Bf Ac/Bf MSM 2,5% MSM 0,5% MSM 2,5% MSM 5,0%
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
24 3,00 4,78 5,02 4,26 4,66 4,00
48 1,42 0,54 -0,94 -0,26 -0,8 0,47
72 -0,54 0,05 0,27 0,39 0,25 -0,19
Analisando recuperação do Dia 7 com base na taxa de aumento de crescimento em log, houve um aumento significante dentro das primeiras 24 horas de crescimento. O controle aumentou em 3 log a partir da inoculação inicial, enquanto a concentração de MSM aumentou em 4,26 log para o MSM 0,5%, 4,55 log para o MSM 0,25% e 4,00 log para o MSM 0,5%. Nas segundas vinte e quatro horas houve uma diminuição no crescimento com relação a MSM 0,5% e MSM 2,5%. O crescimento controle aumentou em 1,42 log e o crescimento de MSM 5,0% aumentou em 0,47 log. O terceiro período de vinte e quatro horas, o crescimento controle diminuiu em 0,54 log e o crescimento de MSM 5,0% diminuiu em 0,19 log. O MSM 0,5% e o MSM 2,5% aumentaram em crescimento log, 0,39 e 0,25 log, respectivamente.
O controle leite com Acidophilus mais bifidus mostrou um aumento log de 4,78 nas primeiras 24 horas, comparado com um aumento de 5,02 para o leite com Acidophilus mais bifidus fortificado com MSM 2,5%. No segundo período de 24 horas o controle de Acidophilus mais bifidus aumentou em 0,54 log, enquanto o MSM 2,5% diminuiu em 0,94 log. No terceiro período de 24 horas, o controle de Acidophilus mais bifidus amentou em 0,05 log, enquanto o leite com MSM 2,5% aumentou em 0,27 log.
Tabela 30. Recuperação Lag de Lactobacillus acidophilus em Leite Fortificado com MSM Dia 14
Concentração de MSM em porcentagem
Dia-Hora 0% A/B 0% A/B 2,5% 0,5% 0,5% 2,50 % 2,50 % 5,0% 5,0%
Dia 14-24 10,62 13,38 13,35 10,19 10,10 10,00 9,73 9,6 9,6
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Dia-Hora 0% A/B 0% A/B 2,5% 0,5% 0,5% 2,50 % 2,50 % 5,0% 5,0%
Dia 14-48 12,37 13,52 13,47 12,95 12,72 12,43 12,2 12,99 13,04
Dia 14 - 72 12,43 13,31 13,43 13,02 12,70 12,51 12,63 12,65 12,21
Tabela 31. Recuperação de Lactobacillus acidophilus em Leite Fortificado com MSM Dia 14 com recuperação média em porcentagem de MSM com dados de partida iniciais
Concentração de MSM em porcentagem
Dia - Hora Leite Acidophilus Leite Ac/Bf Ac/Bf MSM 2,5% MSM 0,5% MSM 2,5% MSM 5,0%
Dia 14 - 0 4,96 4,83 3,70 4,22 5,33 6,04
Dia 14-24 10,62 13,38 13,35 10,15 9,87 9,60
Dia 14 -48 12,37 13,52 13,47 12,84 12,32 13,02
Dia 14-72 12,43 13,31 13,43 12,86 12,57 12,43
No Dia 14 o controle excedeu o crescimento das concentrações de MSM nas primeiras 24 horas. O controle era 0,48 log maior do que o MSM 0,5%, 0,75 log maior do que o MSM 0,25% e 1,02 log maior do que MSM 5,0%. Na Hora 48 a solução controle era 0,05 log maior do que o MSM 2,5%. MSM 0,5% era 0,47 log maior do que o controle e MSM 5,0% era 0,65 10 log maior do que o controle. Na Hora 72 o MSM 0,5% era 0,43 log maior,
MSM 2,5% era 0,14 maior do que o controle e MSM 5,0% era igual ao controle.
Acidophilus mais bifidus fortificado com MSM 2,5% era 0,03 log menor do que o controle de Acidophilus mais bifidus na Hora 24. Na Hora 48 15 o controle de Acidophilus mais bifidus era 0,05 log maior do que o Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5%. Na Hora 72, Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5% era 0,12 log maior do que o controle de Acidophilus mais bifidus.
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Tabela 32. Recuperação de Lactobacillus acidophilus em Leite Fortificado com MSM Dia 14 em aumento de taxa de crescimento de recuperação log do tempo partida de zero
Concentração de MSM em porcentagem
Hora Leite Acidophilus Leite Ac/Bf Ac/Bf MSM 2,5% MSM 0,5% MSM 2,5% MSM 5,0%
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
24 5,66 8,55 9,65 5,93 4,54 3,56
48 1,75 0,14 0,12 2,69 2,45 3,42
72 0,06 -0,21 -0,04 0,03 0,26 -0,59
Analisando a recuperação no Dia 14 com base na taxa de aumento de crescimento em log, o que segue foi observado; o controle aumentou em 5,66 log a partir da inoculação inicial, enquanto as concentrações de MSM aumentaram em 5,93 log para o MSM 0,5%, 4,54 log para o MSM 0,25% e 3,56 log para o MSM 5,0%. Nas segundas vinte e quatro horas, o crescimento controle aumentou em 1,75 log enquanto o MSM 0,5% aumentou em 2,69 log, o MSM 2,5% aumento em 2,45 log e o MSM 0,5% aumentou em 3,42 log. O terceiro período de vinte e quatro horas, o crescimento controle aumentou em 0,06 log e o crescimento de MSM 5,0% diminuiu em 0,59 log. O MSM 0,5% e MSM 2,5% aumentaram em crescimento log, 0,003 e 0,26 log, respectivamente.
O controle de leite com Acidophilus mais bifidus mostrou um aumento de 8,55 log nas primeiras 24 horas, comparado com aumento de 9,65 log para o leite com Acidophilus mais bifidus fortificado com MSM 2,5%. No segundo período de 24 horas o controle de Acidophilus mais bifidus aumentou em 0,14 log, enquanto o leite com MSM 2,5% diminuiu em 0,12 log. No terceiro período de 24 horas, o controle de Acidophilus mais bifidus diminuiu em 0,21 log, enquanto o leite com MSM 2,5% diminuiu em 0,04 log.
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Tabela 33. Recuperação Lag de Lactobacillus acidophilus em Leite Fortificado com MSM Dia 21
A Concentração de MSM em porcentagem
Dia - Hora 0% A/B 0% A/B 2,5% 0,50% 0,50% 2,50% 2,50% 5% 5,00%
Dia 21 - 24 12,94 12,43 13,08 12,89 12,93 10,62 10,95 9,52 9,85
Dia 21 -48 13,02 12,16 12,08 12,94 13,1 12,44 13,12 13,08 13,07
Dia 21 -72 10,32 10,86 12,33 12,29 10,31 13,14 13,05 13,26 13,04
Tabela 34. Recuperação de Lactobacillus acidophilus em Leite Fortificado com MSM Dia 21 com recuperação média em porcentagem de MSM com dados de partida iniciais
Concentração de MSM em porcentagem
Dia - Hora Leite Acidophilus Leite Ac/Bf Ac/Bf MSM 2,5% MSM 0,5% MSM 2,5% MSM 5,0%
Dia 21 3,30 3,60 3,37 3,37 3,47 3,56
Dia 21 -24 12,94 12,43 13,08 12,91 10,79 9,69
Dia 21 -48 13,02 12,16 12,08 13,02 12,78 13,08
Dia 21 - 72 10,32 10,86 12,33 11,30 13,10 13,15
No Dia 21 o controle de Acidophilus nas primeiras 24 horas teve um crescimento log de 12,94, MSM 0,5% o crescimento foi de 12,91 log, MSM 2,5% foi 10,79 log e MSM 5,0% foi 9,69. No período das próximas 24 horas o controle era igual em crescimento a leite com MSM 0,5%, 0,24 log maior do que o MSM 2,5% e 0,05 log menor do que MSM 5,0%. O período de 24 horas final mostrou um aumento significante nas concentrações de MSM comparado com o controle. MSM 0,5% era 0,98 log maior do que o controle, MSM 2,5% era 2,78 log maior do que o controle e o MSM 5,0% era 2,83 log maior do que o controle.
Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5% era 0,65 log maior do que controle de Acidophilus mais bifidus nas primeiras 24 horas. Na Hora 48 o controle de Acidophilus mais bifidus era 0,08 log maior. Nas 24 horas finais o Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5% passou o controle de Acidophilus mais bifidus em 1,47 log.
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Tabela 35. Recuperação de Lactobacillus acidophilus em Leite fortificado com MSM Dia 21 em aumento de taxa de crescimento de recuperação log a partir do tempo de partida zero
Concentração de MSM em porcentagem
Hora Leite Acidophilus Leite Ac/Bf Ac/Bf MSM 2,5% MSM 0,5% MSM 2,5% MSM 5,0%
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
24 9,64 8,83 9,71 9,54 7,32 6,13
48 0,08 -0,27 -1,00 0,11 2,00 3,39
72 -2,70 -1,30 0,25 -1,72 0,32 0,08
Revisando o aumento log para o Dia 21, nas primeiras 24 horas o controle de leite com Acidophilus teve um aumento de 9,64 log. MS 0,5% tinha um aumento de 9,54 log, MSM 2,5% teve um aumento de 7,32 log e MSM 5,0% teve um aumento de 6,13 log. Nas segundas 24 horas o controle aumentou em 0,08 log. MSM 0,5% aumentou em 0,11 log, MSM 2,5% aumentou em 2,00 e MSM 5,0% aumentou em 3,39 log. As 24 horas finais mostraram a diminuição do controle em 2,70 log. MSM 0,5% diminuiu em 1,72 log, MSM 2,5% aumentou em 0,32 log e MSM 5,0% aumentou em 0,08 log.
Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5% aumentou em 9,71 log e o controle de Acidophilus mais bifidus aumentou em 8,83 log. No final dos dois períodos de 24 horas, o controle de Acidophilus mais bifidus diminuiu 0,27 log e 1,30 log. O Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5% diminuiu 1,00 log no segundo período de 24 horas e aumento 0,25 log no período de 24 horas final.
Tabela 36, Recuperação Lag de Lactobacillus acidophilus em Leite fortificado com MSM Dia 28
Concentração de MSM em porcentagem
Dia -Hora 0% A/B0 A/B 2,5% 0,50% 0,50% 2,50% 2,50% 5,0% 5,0%
Dia 28 - 24 13,1 13,41 12,67 6,11 6,47 6,37 6,37 5,64 5,48
Dia 28 - 48 11,04 13,42 13,19 13,66 12,99 12,52 12,62 12,58 13,16
Dia 28 - 72 12,47 10,31 12,00 12,99 13,01 12,98 12,34 12,49 12,47
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Tabela 37. Recuperação de Lactobacillus acidophilus em Leite fortificado com MSM Dia 28 com recuperação média em porcentagem de MSM com dados de partida iniciais
Concentração de MSM em porcentagem
Dia - Hora Leite Acidophilus Leite Ac/Bf Ac/Bf MSM 2,5% MSM 0,5% MSM 2,5% MSM 5,0%
Dia 28 2,00 1,82 1,94 1,00 1,33 0,52
Dia 28 - 24 13,10 13,41 12,67 6,29 6,37 5,56
Dia 28 - 48 11,04 13,42 13,19 13,33 12,57 12,87
Dia 28 - 72 12,47 10,31 12,00 13,00 12,66 12,48
Os dados de recuperação do Dia 28 mostram no primeiro período de 24 horas que o controle de leite com Acidophilus teve um crescimento log de 13,10. As concentrações de MSM eram: 6,29 log para MSM 0,5%, 6,37 log para MSM 2,5% e 5,56 log para MSM 5,0%. Na Hora 48 o crescimento log de MSM 0,5% era 13,33, o MSM 2,5% era 12,57 e o MSM 5,0% era 12,87 log. O controle na Hora 48 era 12,71 log. O controle diminuiu para 12,17 log na Hora 72, MSM 0,5% diminuiu para 13,00 log e MSM 5,0% diminuiu para 12,48 log. MSM 2,5% melhorou para 12,66 log. Este foi um aumento de 0,53 log com relação ao controle.
O controle de Acidophilus mais bifidus foi 13,41 log na Hora 24, 0,74 log maior do que o Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5%. Na Hora 48, a diferença foi menos com o controle 0,23 log maior do que o Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5%. Na Hora 72, o Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5% foi 1,69 log maior do que o controle, que estava em 10,31 log. Tabela 38. Recuperação de Lactobacillus acidophilus em Leite fortificado com MSM Dia 28 em aumento de taxa de crescimento de recuperação log a partir do tempo de partida de zero
Concentração de MSM em porcentagem
Tempo Leite Acidophilus Leite Ac/Bf Ac/Bf MSM 2,5% MSM 0,5% MSM 2,5% MSM 5,0%
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
24 11,10 11,59 10,73 5,29 5,04 5,04
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Tempo Leite Acidophifus Leite Ac/Bf Ac/Bf MSM 2,5% MSM 0,5% MSM 2,5% MSM 5,0%
48 -2,06 0,01 0,52 7,04 6,20 7,31
72 1,43 -3,11 -1,19 -0,32 0,09 -0,39
No Dia 28, a taxa de crescimento aumentou onde o controle de leite com Acidophilus no primeiro periodo de 24 horas aumentou 11,10 log, MSM 0,5% aumentou 5,29 log, MSM 2,5% aumentou 5,04 log e MSM 5,0% aumentou 5,04 log. No segundo periodo de 24 horas, houve uma mudança para o controle diminuindo em 2,06 log, enquanto as concentrações de leite fortificado com MSM aumentaram 0,5% de MSM em 7,04 log, 2,5% em 6,20 log e 5,0% em 7,31 log. O período final de 24 horas mostrou que o controle aumentou em 1,43, o MSM 2,5% aumentou em 0,09 log, o MSM 0,5% diminuiu em 0,32 log e o MSM 5,0% diminuiu em 0,39 log.
Controle de leite com Acidophilus mais bifidus aumentou 11,59 log nas primeiras 24 horas e o Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5% aumentou 10,73 log. No segundo período de 24 horas, o controle de Acidophilus mais bifidus aumentou 0,01 log e o Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5% aumentou 0,52 log. No período final de 24 horas, o controle de Acidophilus mais bifidus diminuiu 3,11 log, enquanto o Acidophilus mais bifidus com MSM 2,5% diminuiu 1,19 log.
Esses estudos mostram que MSM como um aditivo para este produto desempenhou um papel significante na recuperação do probióticos, Lactobacillus acidophilus. Em cada caso de recuperação, houve um aumento na taxa de crescimento de Lactobacillus acidophilus com produto fortificado com MSM versus o produto sem MSM.
Os dados de recuperação do Dia 7 mostraram nas primeiras 24 horas que MSM tinha um aumento de 0,99 log a 1,66 log comparado com o controle. No segundo período de 24 horas para o Dia 7 mesmo que a taxa de crescimento de MSM fosse menor do que controle, os números de crescimento gerais eram maiores para o MSM 5,0%, 0,46 log maior. O terceiro período de 24 horas para o dia 7, a taxa de crescimento de MSM foi maior do que para o controle, em 0,36 log, 0,79 log e 0,93 log.
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No Dia 14, apenas o MSM 0,5% ultrapassou o controle em 0,27 log a taxa de crescimento nas primeiras 24 horas. As amostras de MSM 2,5% e MSM 5,0% foram 0,13 e 2,10 log, respectivamente, menores do que o controle. Este é onde o controle começou a ultrapassar as concentrações de MSM nas primeiras 24 horas. Nos Dias 21 e 28, o controle ultrapassou todas as concentrações de MSM nas primeiras 24 horas.
As segundas 24 horas para todos os pontos de dados que foram coletados após o Dia 27 mostraram que as concentrações de MSM tiveram desempenho melhor do que o controle. Os dados do segundo período no Dia 14 mostraram taxas de crescimento de MSM em 0,70, 0,94 e 1,67 log maiores do que o controle. Os dados do segundo período de tempo Dia 21 mostraram taxas de crescimento de MSM de 0,03, 1,92 e 3,31 log maiores do que o controle. Os dados do segundo período de tempo Dia 28 mostraram taxas de crescimento de MSM em 9,10, 8,26 e 9,37 log maiores do que o controle. Esta taxa de crescimento alta não se traduziu sempre em concentração maior de Lactobacillus acidophilus no caldo de recuperação. No Dia 14, as concentrações de MSM 0,5% e 5% eram maiores do que o controle, enquanto MSM 2,5% era menor. No Dia 21 apenas o MSM 5,0% foi maior. No Dia 28, todas as três concentrações de MSM foram significantemente maiores do que o controle, em 2,29, 1,53 e 1,83 log.
Os dados do terceiro período para o Dia 14 demonstraram que apenas a taxa de crescimento de concentração de MSM 2,5% era maior, em 0,20 log. Mesmo com as taxas de crescimento menores, um log maior de crescimento foi visto para as concentrações de MSM, exceto pelo MSM 5,0% que foi igual ao controle. No Dia 21, os dados do terceiro período mostraram a taxa de crescimento de concentrações de MSM excedendo o controle em 0,98, 3,02 e 2,78 log. Este aumento da taxa de crescimento realmente se traduziu em uma concentração maior de Lactobacillus acidophilus para as amostras fortificadas com MSM. As contagens de recuperação de crescimento foram 0,98, 2,78 e 2,83 log maior do que o controle. O controle excedeu as concentrações de MSM para a taxa de crescimento do Dia 28 no terceiro período. No entanto, as contagens de recuperação de crescimento
170/247 para a concentração de MSM de 0,5, 2,5 e 5% foram 0,53, 0,19 e 0,01 log, respectivamente, maiores do que o controle.
Com curvas de crescimento de bactérias há uma fase lag inicial onde as bactérias se ajustam ao ambiente, antes de irem para fase Expo5 nencial ou log, onde as células duplicam. Depois da fase log há uma fase estacionária onde taxa de crescimento diminui. Nesta fase picos e vales são vistos conforme crescimento diminui. Finalmente, há uma fase de morte onde as bactérias ficam sem nutrientes e morrem.
Este estudo provê indicadores de como MSM auxilia na fase lag, fase log, fase estacionária e fase de morte. MSM em estágios diferentes encurta a fase lag de maneira que as bactérias probióticas começam a fase log antes. A fase log foi prolongada além do controle neste estudo, de maneira que o produto com o aditivo de MSM tinha um valor de pico maior. A fase estacionária foi realizada pelo MSM uma vez que havia uma extensão de valores maiores por um período de tempo mais longo. A taxa de morte foi deixada mais lenta com MSM. Em pontos diferentes houve uma taxa mais lenta de declínio em crescimento. Essas observações diferentes mostram que MSM como um aditivo afeta positivamente bactérias probióticas. O benefício de ingestão de um produto probiótico fortificado com MSM seria um 20 tempo de resposta mais rápido com um efeito de duração mais longa. O consumidor obteria um produto que aumenta suas resposta do corpo aos benefícios agregados de bactérias probióticas.
MSM consistentemente auxiliou na recuperação e no crescimento de bactérias probióticas no produto estudado. Dentro das primeiras 24 25 horas de crescimento, houve um aumento em taxa de recuperação indicando que micro-organismos estressados respondiam a um novo ambiente melhor com MSM como um aditivo.
Exemplo 19
Crescimento de Bifidobacterium bifidum em Meios Fortificados com MSM
Este exemplo mostra os efeitos de MSM sobre o crescimento de
Bifidobacterium bifidum em meios de crescimento microbiano fortificados com MSM.
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Estudos de crescimento microbiano foram conduzidos em meios fortificados com MSM a 0%, 0,125%, 0,25%, 0,5%, 1,0%, 2,5% e 5%. Intervalos de tempo para plaqueamento foram estendidos a cada 8 horas por um total de 96 horas. As curvas de crescimento de unidades de formação de colônia recuperadas por mililitro (cfu/mL) dos micro-organismos foram comparadas entre as concentrações de MSM com a concentração de MSM 0% como um controle de amostra para cada micro-organismo. O pó de estoque de MSM foi fornecido pela Bergstrom Nutrition com certificado de análise. Ο pó era a fórmula microprill, lote No. 0806809, data de validade 31/10/13. Todos os meios e pó de MSM de estoque foram checados quanto à esterilidade antes do estudo. O micro-organismo analisado foi Bifidobacterium bifidum ATCC No. 29521.
Bifidobacterium bifidum (99 mL de caldo de MRS com adição de L-cisteína 0,05%) foi preparado com relação às concentrações de MSM. As concentrações de MSM de trabalho foram preparadas a partir de um MSM 5% único em solução de caldo de MRS e foram diluídas consequentemente com caldo de MRS para obter a concentração final desejada de MSM. As soluções foram verificadas quanto à esterilidade antes de prosseguir com o estudo.
As soluções de trabalho foram inoculadas em um nível de 1,5 a 2 log de micro-organismo por 100 mL de caldo. Bifidobacterium bifidum foi incubado sob condições anaeróbicas a 35°C ± 0,5°C por 72 horas. Indicadores de oxigênio foram usados para verificar condições anaeróbicas entre intervalos de plaqueamento para as amostras de teste de Bifidobacterium.
Bifidobacterium foi inoculado em ágar de MRS suplementado com L-cisteína nos momentos listados anteriormente para diminuir o potencial de oxidação-redução de meio. Toda preparação e todo plaqueamento foram conduzidos em temperatura ambiente. Todas as diluições para todos os organismos foram plaqueadas em triplicata para todos os intervalos de tempo amostrados. Para capturar as colônias apropriadas por mililitro, todos os organismos em todos os intervalos de tempo foram plaqueados em seis diluições diferentes. Todas as placas foram incubadas a 35°C ± 0,5°C por 72
172/247 horas. A placa de diluição apropriada foi usada para enumeração e teve média tirada para relatório. A placa apropriada para enumeração contém entre 25 e 250 cfu/mL. A amostra de estoque de MSM e todas as médias preparadas com MSM foram testadas quanto a níveis de base de micro-organismos em ágar de MRS e TSA. Os estoques de MSM eram <10 cfu/g e todos os meios de teste foram <1 cfu/mL em todos os casos antes da inoculação. Todos os intervalos de tempo para plaqueamento incluíam placas controle negativo durante despejamento para propósitos de controle de qualidade. Todas as placas controle negativo foram limpas para crescimento de microorganismo. Em 72 horas, concentrações de MSM e soluções controle foram verificadas negativas para contaminação de linhagens e as linhagens foram verificadas para espécie original.
Tabela 39. Controle de Números de Cultura de Estoque antes da Inoculação da Amostra de Teste
Bifidobacterium bifidum
Inóculo de cfu/mL 1,48 x 104
Cfu adicionado a 100 mL 1,48 x 104
Cfu/mL em meio no tempo 0 1,48 x 102
O controle de números foi derivado de crescimento de organismos específicos em meios apropriados. Após incubação, as colônias foram retiradas do meio e capturadas em um frasco estéril. O frasco foi usado como a solução de partida para o controle de número (estoque). A solução de estoque foi então diluída para obter uma leitura apropriada no espectrômetro, usando comprimento de onda de 420 com transmissão de luz percentual. As concentrações bacterianas foram determinadas de acordo com o Método AOAC 960,09, Tabela 960,09A. A preparação de suspensão de cultura da cultura de estoque foi determinada através de leitura do espectrômetro ou comparação com padrão McFarland.
173/247
Tabela 40. Crescimento Log de Bifidobacterium bifidum em Meios Fortificados com MSM
Concentração de MSM em porcentagem
H 0 0,125 0,25 0,5 1 2,5 5
0 1,22 1,12 1,00 1,00 1,00 1,30 1,12
8 2,55 2,89 2,93 2,84 2,73 2,71 2,04
16 7,16 7,85 8,07 7,45 7,73 7,56 6,10
24 8,94 9,06 8,49 8,81 8,81 8,64 8,43
32 10,81 11,45 11,41 11,22 11,49 11,56 11,13
40 11,03 10,80 10,31 12,09 11,19 11,73 11,78
48 11,54 8,22 8,10 9,39 10,43 10,72 10,70
56 10,64 7,25 7,22 9,51 10,57 11,34 10,59
64 9,97 8,86 6,77 10,34 10,66 12,26 14,32
72 8,56 6,59 6,39 8,35 8,34 10,26 8,65
80 10,56 9,12 8,52 10,38 9,43 9,52 12,20
88 10,64 9,12 8,52 9,70 10,41 10,64 12,31
96 <6,00 <6,00 <6,00 8,82 <6,00 <6,00 9,60
O crescimento observado com Bifidobacterium bifidum mostra um aumento de 0,2 a 0,4 log em taxa de crescimento para as concentrações de MSM de 0,125% a 2,5% na hora 8. As concentrações de MSM de 0,125% a 2,5% na hora 16 aumentaram para 0,3 a 0,7 log. A Hora 24 mostrou as concentrações de MSM de 0,125% a 2,5% diminuindo para serem iguais a ou menores do que o controle. MSM em uma concentração de 5% mostrou 10 taxa de crescimento menor comparado com o controle para as primeiras 24 horas. A Hora 32 havia um aumento em taxa de crescimento variando de a partir de 0,3 a 0,75 log para todas as concentrações de MSM comparado com o controle. Na Hora 40 as concentrações de MSM de 0,125% e 0,25% mostraram um declínio uniforme em taxa de crescimento, até o ponto que 15 elas estavam abaixo do controle da hora 40 até a hora 96, MSM 0,5% na hora 48 até a hora 95 diminuiu na taxa de crescimento para onde ele era 2 a 3 log completos abaixo da taxa de controle de crescimento. MSM em uma concentração de 1% era compatível com a taxa de crescimento do cresci174/247 mento da Hora 40 até a Hora 96, exceto para Hora 48 e Hora 80 onde ele era um log integral menor. MSM 2,5% na hora 40 era 0,7 log maior na taxa de crescimento comparado com o controle. Da Hora 56 até a hora 72 MSM 2,5% teve uma taxa de crescimento que era 0,7 a 2,29 log maior do que o 5 controle. A Hora 80 mostrou uma taxa de crescimento menor 1 log para amostra de MSM 2,5% comparado com o controle e Horas 88 e 96 a taxa de crescimento era equivalente. MSM 5% na Hora 40 teve uma taxa de crescimento de 0,7 log maior do que o controle. Na Hora 48, isto caiu para 0,7 log menor do que o controle e na Hora 56 a taxa de crescimento era equivalente 10 ao controle. A Hora 64 mostra uma taxa de crescimento alta de 4,35 log para o MSM 5% com relação ao controle. A Hora 72 mostrou uma diminuição em taxa de crescimento, com um retorno para um aumento de 1,6 log em taxa de crescimento na Hora 80 e na Hora 88. A Hora 96 mostrou uma taxa de MSM 5% de crescimento que era aproximadamente 3,6 log maior do que o 15 controle.
Bifidobacterium bifidum mostrou um benefício significante em ter MSM como um aditivo para influenciar crescimento. Todas as concentrações de MSM aumentaram a taxa de crescimento para o ponto onde o Bifidobacterium bifidum atingiu máximo 16 horas antes do controle. O controle atingiu 20 um máximo de 11,54 log de crescimento na Hora 48. Este crescimento máximo foi atingido por todas as concentrações de MSM na Hora 32. As concentrações de MSM de 0,125% e 0,25% mostraram um declínio em crescimento da Hora 40 até a Hora 96, nunca atingindo o crescimento máximo novamente. MSM 0,5% aumentou o crescimento para 0,5 log maior do que o 25 máximo do controle. MSM 0,5% deixou mais lenta a diminuição de crescimento da Hora 48 até a Hora 96. O MSM 0,5% retardou o estágio de desaparecimento para o ponto que na hora 96 havia 8,82 log de crescimento, que era aproximadamente 2 log maior do que o controle. MSM 1 % não aumentou o crescimento das bactérias comparado com o controle, mas diminuiu o es30 tágio de desaparecimento. Da Hora 40 até a Hora 64, o MSM 1% não mostrou uma queda grande em crescimento, houve uma queda lenta de 0,5 log para Hora 48, mas não houve nenhuma diminuição para as Horas 56 e 64.
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Na Hora 72 houve uma queda de 2 log em crescimento, mas na Hora 80 houve um aumento de 1 log de crescimento e na Hora 88 há outro aumento de 1 log de crescimento. Na Hora 96 o crescimento estava fora da faixa contável e foi estimado em menos de 6 log de crescimento. Continuando por mais 8 horas, pode ter havido outro pico no crescimento para mais de 6 log. MSM 2,5% na hora 40 atingiu 11,73 log de crescimento, com uma queda de 1 log na Hora 48. Houve um aumento estável de crescimento na Hora 56 e na Hora 64, atingindo um máximo de 12,26 log, 0,72 log maior do que o controle. Na Hora 72 houve uma queda de 2 log, com uma queda de 0,7 log na Hora 80 para o MSM 2,5%. Na Hora 88, o MSM 2,5% aumentou o crescimento 1 log, antes de cair abaixo da faixa contável na Hora 96. MSM em uma concentração de 5% foi menor em aumento da taxa de crescimento comparado com outras concentrações de MSM. Na Hora 32, o crescimento estava em 11,13 log e na Hora 40 o crescimento foi 11,78 log. Na Hora 48, o crescimento caiu 1 log e na Hora 56 houve uma queda de 0,1 log. Na Hora 64, o crescimento atingiu o mais alto para todas as concentrações de 14,32 log para o MSM 5%. Houve uma queda de 6 log na Hora 72, mas na Hora 80 o crescimento aumentou 4 log para 12,20. Na Hora 88, um aumento de 0,1 log foi observado, antes da queda para 9,60 log de crescimento na Hora 96. O MSM 5% deixou mais lenta a taxa de morte consideravelmente, estendendo a fase estacionária para 40 horas. Uma vez a fase estacionária tendo sido atingida houve aumento e diminuição contínuos em crescimento, com movimento em direção a um padrão de crescimento menor. Esses estudos indicam que MSM está prosseguindo para a fase estacionária mais rápido para todas as concentrações, estendendo a fase estacionária para concentrações de mais de MSM 0,5% e aumentando o crescimento máximo para as concentrações de MSM 2,5% e 5%.
Exemplo 20
Efeitos de Púrpura de Bromocresol sobre E. coli quando MSM é adicionado à Matriz
Este exemplo mostra os efeitos de Púrpura de Bromocresol sobre E. coli quando MSM é adicionado à Matriz.
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Para investigar se MSM funciona como um carreador/transportador, a habilidade de MSM para transportar Bromocresol para E. colifoi avaliada. Púrpura de Bromocresol é um corante indicador que fica amarelo na presença de bactérias E. coli. Ela é não tóxica para o organismo. Para minimizar interferência iônica potencial Caldo de Lactose foi escolhido como o meio preferido para este estudo porque ele é livre de ambos NaCI e proteínas. Eficácia antimicrobiana USP <15> para teste foi usada como o molde para mostrar a LCwo (concentração letal). As concentrações de MSM entre 5%-16% em aumentos de 1% foram usadas. Todas as concentrações foram plaqueadas para 10‘7 diluições para determinar a redução log.
Os materiais incluíam o que segue: Número do lote 0604751 de OptiMSM Flake; Escherichia coli linhagem 8739 ATCC lote: 57762704; tubos de culturas de vidro de Borossilicato de 30 mL foram usados para todo material OptiMSM; Accumedia MacConkey Broth (MB) Lote: 100,974A; Diluente usado foi Alpha Biosciences Modified Letheen Broth (MLB) Lote: I08-09; Alpha Biosciences Trypto Soy Agar com Lecitina; e Tween 80 (TSA) Lote: F0842,
Flake OptiMSM foi pesado usando urn Mettler Toledo AG245 balance SN certificado: 1115210833 e separado em alíquotas para cada concentração. O material foi posto em tubos de cultura de vidro de borossilicato de 30 mL. O material foi calculado em urn volume de 10 mL. O material foi adicionado a cada tubo como segue: 5% (0,5g), 6% (0,6g), 7% (0,7g), 8% (0,8g), 9% (0,9g), 10% (1,0g), 11% (1,1g), 12% (1,2g), 13% (1,3g), 14% (1,4g), 15% (1,5g) e 16% (1,6g). MacConkey Broth foi separado em alíquotas em 10 mL para cada tubo, então esterilizado por 20 minutos a 121 °C. Os tubos foram coletados para temperatura ambiente que era aproximadamente 20°C. Todos os tubos foram então salpicados com a mesma diluição de Escherichia coli que deu um nível de unidades de formação de colônia a 6,0 x 106 /mL (6,8). Os tubos foram então incubados a 25°C. Observação diária para mudança de cor foi realizada durante os primeiros sete dias. Os tubos foram misturados periodicamente para assegurar que OptiMSM fosse bem equilibrado em todos os momentos. Um controle positivo e negativo foi de177/247 terminado.
Os resultados desses estudos são como segue:
(1) Dia um: mostrou a mudança de cor do caldo para amarelo para concentração de 5-7%; 8% mostrou clareamento leve de cor; e 9-16% não mostraram quaisquer sinais de mudança.
(2) Dia dois: mostrou os mesmos sinais que no dia um.
(3) Dia três: mostra uma mudança na concentração de 8% mudando para a cor amarela típica.
(4) Dia 4 até o dia 6: não mostrou quaisquer sinais de mudança significantes.
(5) Dia 7: Mostrou a mudança de 9% para uma cor amarela. Nenhuma mudança de cor de 10%-16%.
(6) Dia 14: Não mostrou quaisquer sinais para a faixa de concentração para 10%-16%.
Os tubos de concentração foram riscados em ágar MacConkey para ver se organismo poderia ser recuperado. Quaisquer organismos foram observados após a incubação de 72 horas. O Dia 30 não mostrou quaisquer sinais de mudança para a faixa de concentração para 10-16%. Controle positivo foi riscado para cada ponto de tempo riscado e mostrou sinais de organismo demonstrados por um risco de isolamento clássico.
Este teste qualitativo indica OptiMSM tendo algum tipo de efeito de carreador e reduzindo ou matando o organismo. Isto é demonstrado pela falta de cor amarela em concentrações de MSM menores do que o que foi demonstrado em estudos anteriores usando meio de crescimento. A cor mostrou redução em concentrações tão baixas quanto 8% versus 11% nos estudos de meio de crescimento.
Exemplo 21
Estudo Antimicrobiano de MSM e DMSO sobre Organismos Streptococcus
Este exemplo mostra os efeitos de MSM e DMSO sobre o crescimento de organismos Streptococcus.
Foi demonstrado aqui que concentrações específicas de MSM (tal como 10% a 16% de MSM) matam micro-organismos. Sulfóxido de dime
178/247 tila foi também observado matar micro-organismos em concentrações de 3050%. Este estudo avaliou as propriedades bactericidas de ambos os compostos, sozinhos e em combinação, bem como sua eficácia quando usados com um nível de penicilina baixo.
Streptococcus pyogenes (Lancefield grupo A) tem uma cápsula de ácido hialurônico e Strepotococcus pneumoniae (nenhum Grupo Lancefield identificado até agora) tem uma cápsula de polissacarídeo distinta. Esses dois organismos são responsáveis por muitos tipos de infecções streptococais humanas e apresentam dois tipos de encapsulação diferentes. Ambos esses organismos foram usados neste estudo in vitro. Em particular, este estudo determinou os efeitos antimicrobianos de MSM e DMSO, ambos individualmente e em combinação, sobre Streptococcus pyogenes e Streptococcus pneumoniae. Este estudo também determinou as concentrações mais eficazes para propriedades antimicrobianas para ambos os compostos e em combinação e se combinação de MSM e DMSO reduz as concentrações de qualquer composto necessário para obter redução microbiana. Ainda, a eficácia do uso de MSM, DMSO e a combinação dos dois em conjunto com um agente antibiótico foi avaliada.
Streptococcus pneumoniae (No. 1034®) e Streptococcus pyogenes (Lancefield grupo A, No. 10096®) foram compradas da ATCC. MSM (No. 41631) e DMSO (No. D8418) foram comprados da Sigma-Aldrich. Penicilina foi comprada da Henry Schein. Meio de cultura bacteriana foi comprado da Becton-Dickinson and company (No. 297963). O estojo de ensaio ATP quimioluminescente foi comprado da Promega (No. G8230). Streptococcus pyogenes foi culturado em caldo Brain Heart Infusion (BD 237500, cabine No. 44) da noite para o dia. Quantidades iguais de caldo contendo bactéria foram usadas para os estudos. Streptococcus pneumoniae foi também culturada em caldo Brain Heart Infusion.
Avaliação de viabilidade bacteriana:
O estojo de ensaio ATP bioluminescente foi usado para avaliar a viabilidade bacteriana, com base na reação que segue:
ATP+D-Luciferina +O2 Ofciluciferin +AMP +pirofosfato +CO2 +luz
179/247 (560nm).
ATP bacteriana pode ser medida através de lise direta das bactérias com um detergente adequado; a ATP liberada é então livre para reagir com a luciferina/luciferase e levando à emissão de luz. A intensidade da luz 5 emitida é proporcional à concentração de ATP. Medição da intensidade de luz usando um luminômetro permite quantificação direta de ATP, que é o indicador universal de viabilidade para micro-organismos vivos.
Ambas a S. pyogenes e a S. pneumoniae foram culturas sob várias condições para determinar condições ótimas para avaliar MSM, DMSO 10 e/ou Penicilina. MSM, DMSO e Penicilina foram diluídos em meio de cultura de acordo com a Tabela 45-1. A bactéria foi culturada por 7 horas para Streptococcus pneumoniae e 18 horas para Streptococcus pyogenes, respectivamente. Então a viabilidade bacteriana foi avaliada através do estojo de ensaio de ATP bioluminescente. O teste foi conduzido em triplicatas.
Tabela 41. Concentrações de MSM, DMSO e Penicilina avaliadas
MSM (%) DMSO (%) Penicilina(pgZL)
20 20 100
10 10 50
5 5 25
2,5 2,5 12,5
1,25 1,25 6,25
0,625 0,625 3,125
0,3125 0,3125 1,5625
0 0 0
O MSM e o DMSO foram diluídos em meio de cultura de acordo com a tabela 42 (para Streptococcus pneumonia, esquerda abaixo) e Tabela (Streptococcus pyogenes, direita abaixo).
180/247
Tabela 42
Tabela 43
DMSO (%) MSM (%)
0 0
5
10
20
5 0
5
10
20
10 0
5
10
20
20 0
5
10
20
DMSO (%) MSM (%)
0 0
2,5
5
10
2,5 0
2,5
5
10
5 0
2,5
5
10
8 0
2,5
5
10
Para determinação da eficácia do uso de MSM, DMSO em conjunto com Penicilina, o MSM, o DMSO e a Penicilina foram diluídos em meio de cultura de acordo com a Tabela 44-1 (S. pneumonia) e Tabela 44-2 (S.
pyogenes).
Tabela 44-1
Tabela 44-2
DMSO (%) MSM (%) Penicilina (pg/L)
5 5 25
10
20
DMSO(%) MSM (%) Penicilina (pg/L)
2,5 2,5 3,125
5
10
181/247
DMSO (%) MSM (%) Penicilina (pg/L)
10 5
10
20
20 5
10
20
DMSO (%) MSM (%) Penicilina (pg/L)
2,5 6,25
5
10
5 2,5 3,125
6,25
8 3,125
6,25
A IC5o de DMSO, MSM e Penicilina em Streptococcus pneumoniae foi 12,86%, 15,97% e 68,54 g/L, respectivamente. DMSO e MSM tinham efeito sinérgico dentro de doses de 5% a 20% (para ambos os fármacos) na inibição de crescimento de Streptococcus pneumoniae. DMSO e penicilina também tinham efeito sinérgico dentro de doses de 10% a 20% (para DMSO) e 25 pg/L (para Penicilina) na inibição de crescimento de Streptococcus pneumoniae. Ainda, MSM e Penicilina tinham um efeito sinérgico dentro de doses de 5% (para MSM) e 25 pg/L (para Penicilina) na inibição de crescimento de Streptococcus pneumoniae. Quando Penicilina, DMSO e MSM foram usados juntos, o efeito sinérgico mais alto resultou de DMSO + MSM apenas ao invés de Penicilina + DMSO + MSM.
A IC50 de DMS, MSM e Penicilina em Streptococcus pyogenes foi 9,07%, 10,26% e 15,25 pg/L, respectivamente. DMSO e MSM tinham um efeito sinérgico dentro de doses de 2,5% a 5% (para ambos os fármacos) na inibição de crescimento de Streptococcus pyogenes. DMSO e Penicilina tinham um efeito sinérgico dentro de doses de 5% (para DMSO) e 6,25 pg/L (para Penicilina) na inibição de crescimento de Streptococcus pyogenes. MSM e Penicilina tinham um efeito sinérgico dentro de doses de 2,5% a 5% (para MSM) e 3,125 a 6,25 pg/L (para Penicilina) em inibição de crescimento de Streptococcus pyogenes. Quando Penicilina, DMSO e MSM foram usados juntos, o efeito sinérgico resultou de DMSO + MSM apenas ao invés de Penicilina + DMSO + MSM.
182/247
Tabela 45-1. Viabilidade de S. pneumoniae após Exposição a DMSO
Concentração de DMSO Viabilidade de S. pneumonia (%)
5 75,45
10 40,18
20 27,19
Tabela 45-2. Viabilidade de S. pneumonia após exposição a MSM
Concentração de MSM Viabilidade de S. pneumonia (%)
5 95,34
10 48,57
20 39,08
Tabela 45-3. Viabilidade de S. pneumonia após Exposição a Várias Concentrações de MSM em DMSO 5%
DMSO (%) MSM (%) Viabilidade de S. pneumonia (%)
5 0 75,45
5 5 50,94 *
5 10 45,40
5 20 27,22
Tabela 45-4. Viabilidade de S. pneumonia Exposição a Várias Concentrações de MSM em DMSO 10%
DMSO (%) MSM (%) Viabilidade de S. pneumonia (%)
10 0 40,18
10 5 47,81
10 10 37,42
10 20 11,95
Tabela 45-5. Viabilidade de S. pneumonia Exposição a Várias Concentrações de MSM em DMSO 20%
DMSO (%) MSM (%) Viabilidade de S. pneumonia (%)
20 0 27,19
20 5 17,60*
20 10 7,76
20 20 5,15
183/247
Tabela 45-6. Viabilidade de S. pneumonia Exposição a Várias Concentrações de Penicilina
Penicilina (pg/L) Viabilidade de S. pneumonia (%)
25 79,82
50 42,70
100 40,93
Tabela 45-7. Viabilidade de S. pneumonia após Exposição a 25 pg/L de Penicilina com Várias Concentrações de DMSO
Penicilina (pg/L) DMSO (%) Viabilidade de S. pneumonia (%)
25 0 79,82
25 5 46,13
25 10 39,78
25 20 22,08
Tabela 45-8. Viabilidade de S. pneumonia após Exposição a 50 pg/L de Penicilina com Várias Concentrações de DMSO
Penicilina (pg/L) DMSO (%) Viabilidade de S. pneumonia (%)
50 0 42,70
50 5 46,27
50 10 37,09
50 20 19,14
Tabela 45-9. Viabilidade de S. pneumonia após Exposição a Várias Concentrações de DMSO
Penicilina (pg/L) DMSO (%) Viabilidade de S. pneumonia (%)
100 0 40,93
100 5 45,09
100 10 35,80
100 20 21,76
A combinação de MSM 5% com 25 pg/L de penicilina exibiu uma redução sinérgica na viabilidade de S. pneumoniae, levando a apenas 41% de viabilidade (vide Tabela 10). Sinergia comparado com os resultados esperados baseados em MSM sozinho e penicilina sozinha é indicada nas Ta
184/247 belas por um *. Em contraste, MSM 5% sozinho reduziu a viabilidade em apenas aproximadamente 5%, enquanto 25 pg/L de penicilina sozinha reduziram a viabilidade em aproximadamente 21%. Desta maneira, a combinação de MSM 5%/25 pg/L de penicilina foi inesperadamente mais eficaz do que esperado com base nos resultados obtidos com MSM ou penicilina sozinha.
Além disso, como com DMSO, certas concentrações de MSM permitiram que concentrações menores de penicilina reduzissem a viabilidade bacteriana quase tão eficazmente quanto concentrações maiores. Por exemplo, MSM 20% com 100 pg/L de penicilina reduziu a viabilidade de S. pneumoniae para 21,37%, MSM 20% com 50 pg/L de penicilina reduziu a viabilidade de S. pneumoniae para 20,75%. Desta maneira, com o uso de MSM 20%, a concentração requerida de penicilina é reduzida pela metade. Continuando esta tendência é a combinação de MSM 20% com 25 pg/L de penicilina que reduziu a viabilidade de S. pneumoniae para aproximadamente 25%. Similarmente, embora com uma redução menos robusta em viabilidade bacteriana, MSM 5% permitiu que 25 pg/L de penicilina tivesse desempenho quase tão identicamente quanto 100 pg/L de penicilina (comparar as Tabelas 45-10 até 45-12 para 25 pg/L de penicilina).
Tabela 45-10. Viabilidade de S. pneumoniae Após Exposição a 25 pg/L de
Penicilina com Várias Concentrações de MSM
Penicilina (pg/L) MSM (%) Viabilidade de S. pneumonia (%)
25 0 79,82
25 5 41,23*
25 10 41,83
25 20 25,36
Tabela 45-11. Viabilidade de S. pneumonia Após Exposição a 50 pg/L de
Penicilina com Várias Concentrações de MSM
Penicilina (pg/L) MSM (%) Viabilidade de S. pneumonia (%)
50 0 42,70
50 5 41,23
50 10 47,47
185/247
Penicilina (pg/L) MSM (%) Viabilidade de S. pneumonia (%)
50 20 20,75
Tabela 45-12. Viabilidade de S. pneumonia após Exposição a 100 pg/L de
Penicilina com Várias Concentrações de MSM
Penicilina (pg/L) MSM (%) Viabilidade de S. pneumonia
100 0 40,93
100 5 41,75
100 10 36,67
100 20 21,37
Com base nos resultados sinérgicos vistos em certas combinações de MSM ou DMSO com penicilina, o presente estudo foi realizado a fim de identificar as várias combinações de MSM, DMSO e penicilina que renderam reduções sinérgicas em viabilidade bacteriana comparado com combinação dos efeitos de combinação de DMSO, MSM e penicilina sobre viabilidade bacteriana. Este estudo foi também planejado para identificar combinações dos três compostos que permitem vantajosamente que um ou mais dos compostos sejam reduzidos, ainda eficazmente reduzindo viabilidade bacteriana.
DMSO a 5, 10 e 20% foi combinado individualmente com MSM sozinho em um de 5, 10 ou 20% e penicilina em um de 25, 50 ou 100 pg/L. A viabilidade foi avaliada conforme descrito acima. Dados de viabilidade são apresentados na Tabela 45-13, O símbolo * representa resultados sinérgicos comparado com a combinação correspondente de DMSO e penicilina. O símbolo ψ representa resultados sinérgicos comparado com a combinação correspondente de MSM e penicilina. Os valores para a redução em viabilidade bacteriana foram adicionados para determinar a redução limiar para sinergia. Por exemplo, DMSO 5% reduz a viabilidade em aproximadamente 25% e 25 pg/mL de penicilina reduziram a viabilidade em aproximadamente 21%, para uma redução combinada total esperada de aproximadamente 46%. Isto representa 64% de viabilidade. Desta maneira, se a combinação de MSM 5%, DMSO 5% e 25 pg/L de penicilina resulta em menos de 64% de viabilidade, sinergia entre os compostos foi identificada.
186/247
Várias combinações de MSM, DMSO e penicilina renderam aperfeiçoamento sinérgicos em redução bacteriana. Por exemplo, a combinação de DMSO 5%, MSM 5% e 25 pg/L de penicilina reduziu a viabilidade bacteriana para aproximadamente 52% (vide Tabela 45-13). Cinco por cento de DMSO em combinação com 25 25 pg/L de penicilina reduziram a viabilidade bacteriana para aproximadamente 64% (por exemplo, uma redução de cerca de 46%, com base na redução individual vista com DMSO 5%, vide Tabela 45-1, e a redução individual vista com 25 pg/L de penicilina). Desta maneira, a combinação de todos os três compostos reduziu a viabilidade bacteriana em cerca de mais 12%. Similarmente, a combinação de MSM 5% com 25 pg/L de penicilina resultou em viabilidade bacteriana de cerca de 74%, enquanto que a combinação de todos os três compostos reduziu a viabilidade em quase mais 22%.
Em algumas combinações, resultados sinérgicos foram detectados com relação a ambos o DMSO e a penicilina bem como MSM mais penicilina. Por exemplo, DMSO 10% em combinação com MSM 20% e 25 pg/L de penicilina rendeu uma sinergia com atividade antimicrobiana aperfeiçoada comparado com ambas as combinações de referência. Em outras combinações, sinergia foi detectada apenas com relação a ou DMS mais penicilina ou MSM mais penicilina. Por exemplo, a combinação de MSM 5% com DMSO 10% e 25 pg/L de penicilina era sinérgica com relação a MEM mais penicilina, mas não com relação a DMSO mais penicilina.
Em adição aos efeitos sinérgicos discutidos acima, há vários casos onde certas combinações de DMSO, SMS e penicilina permitem uma redução na concentração eficaz de penicilina. Por exemplo, conforme mostrado na Tabela 45-13, a combinação de DMSO 5% com MSM 20% rendeu viabilidade bacteriana geral muito similar na faixa de concentrações de penicilina testadas (de a partir de -25% de viabilidade com 25 pg/L de penicilina até -18% de viabilidade com 100 pg/L de penicilina). Ainda, DMSO 10% com MSM 20% resultou em viabilidades bacterianas quase idênticas em toda a faixa de concentração de penicilina.
Resultados similares são vistos com DMSO 20% em combina187/247 ção com 5, 10 ou 20% de MSM e qualquer concentração de penicilina. Esses resultados revelaram uma faixa ligeiramente mais ampla de viabilidade bacteriana em todas as concentrações de penicilina diferentes, no entanto, dado o fato que a redução em todos os casos chega a aproximadamente 90 5 a 95%, essas combinações são todas ainda eficazes.
Tabela 45-13. Viabilidade de S. pneumoniae Após Exposição a Várias Combinações de DMSO, MSM e Penicilina
DMSO (%) MSM (%) Penicilina (pg/L) Viabilidade de S. pneumonia (%)
5 5 25 52,11 *, ψ
5 5 50 43,36
5 5 100 53,03
5 10 25 51,82 *
5 10 50 44,52
5 10 100 31,33
5 20 25 24,91 *
5 20 50 19,20
5 20 100 18,12
10 5 25 44,41 ψ
10 5 50 38,24
10 5 100 36,19
10 10 25 39,38
10 10 50 33,73
10 10 100 25,98
10 20 25 11,87*, ψ
10 20 50 11,03
10 20 100 10,96
20 5 25 12,74 *, ψ
20 5 50 13,39 ψ
20 5 100 9,28 ψ
20 10 25 7,69 *, ψ
20 10 50 7,74
20 10 100 5,58
188/247
DMSO (%) MSM (%) Penicilina (pg/L) Viabilidade de S. pneumonia (%)
20 20 25 4,93 *, ψ
20 20 50 5,60
20 20 100 1,80
Conforme acima discutido, a estrutura de S. pyogenes difere daquela de S. pneumoniae, e então experimentos adicionais foram realizados para avaliar os efeitos sinérgicos de várias concentrações de DMSO e MSM, bem como combinações de DMSO, MSM e penicilina.
DMSO foi adicionado a culturas de S. pyogenes para concentrações finais de 0,31, 0,63, 1,25, 2,50, 5,00, 10,0 ou 20,0. Nessas concentrações, DMSO resultou em reduções em viabilidade bacteriana de uma maneira dependente da dose. Vide Tabela 45-14. MSM sozinho foi adicionado a culturas de S. pyogenes para concentrações finais de 0,31, 0,63, 1,25, 2,50, 10 5,00, 10,0 ou 20,0, Nessas concentrações, MSM também resultou em reduções em viabilidade bacteriana de uma maneira dependente da dose. Vide Tabela 45-15,
Tabela 45-14. Viabilidade de S. pyogenes após Exposição a DMSO
Concentração de DMSO Viabilidade de S. pyogenes (%)
0,31 100
0,63 100
1,25 100
2,50 100
5,00 96,66
10,0 14,50
20,0 5,14
Tabela 45-15. Viabilidade de S. pyogenes após Exposição a MSM
Concentração de MSM Viabilidade de S. pyogenes (%)
0,31 100
0,63 100
1,25 100
2,50 100
189/247
Concentração de MSM Viabilidade de S. pyogenes (%)
5,00 95,88
10,0 23,94
20,0 15,18
MSM e DMSO em combinação foram avaliados quanto aos seus efeitos antibacterianos sobre S. pyogenes. DMSO a 2,5%, 5% e 8% foi combinado com MSM a 0% (DMSO apenas controle), 2,5%, 5% e 10%. Conforme mostrado nas Tabelas 16, 17 e 18 certas combinações de MSM com DMSO são sinérgicas comparado com os efeitos de DMS ou SMS sozinho. Resultados sinérgicos comparados com DMS ou MSM sozinho são indicados por um Por exemplo, adição de MSM 2,5% a DMSO 2,5% reduziu a viabilidade bacteriana para aproximadamente 65% (vide Tabela 16), embora o não efeito dessas concentrações de MSM e DMSO fosse esperado, como individualmente, nenhum composto reduziu a viabilidade bacteriana. O efeito sinérgico é também visto com DMSO 2,5% e MSM 5%, onde a viabilidade bacteriana é reduzida em quase 83% (comparado com uma redução de 4% esperada com base nos efeitos do composto sozinho). Sinergia é também vista com DMSO 5% em combinação com qualquer concentração de MSM. Desta maneira, em algumas modalidades, DMSO a 5% induz redução sinérgica em viabilidade bacteriana em combinação com qualquer concentração de MSM entre 2,5% e 10%. Em algumas modalidades, DMSO a 2,5% e MSM em concentrações entre 2,5% e 5% são vantajosamente e inesperadamente sinérgicos em reduzir viabilidade bacteriana.
Tabela 45-16. Viabilidade de S. pyogenes após Exposição a Várias Concentrações de MSM em DMSO 2,5
DMSO (%) MSM (%) Viabilidade de S. pyogenes (%)
2,5 0 100
2,5 2,5 65,06 *
2,5 5,0 17,71 *
2,5 10,0 16,37
190/247
Tabela 45-17. Viabilidade de S. pyogenes após Exposição a Várias Concentrações de MSM em DMSO 5
DMSO(%) MSM (%) Viabilidade de S. pyogenes (%)
5,0 0 96,66
5,0 2,5 36,21 *
5,0 5,0 7,87*
5,0 10,0 7,64*
Tabela 45-18. Viabilidade de S. pyogenes após Exposição a Várias Concentrações de MSM em DMSO 8
DMSO(%) MSM (%) Viabilidade de S. pyogenes (%)
8,0 0 9,96
8,0 2,5 14,37
8,0 5,0 5,97
8,0 10,0 5,60
Várias concentrações de penicilina sozinha foram avaliadas quanto à sua habilidade em reduzir viabilidade de S. pyogenes. Conforme mostrado na Tabela 45-19, penicilina diminuiu a viabilidade bacteriana de uma maneira dependente da dose.
Tabela 45-19. Viabilidade de S pyogenes após Exposição a Várias Concen10 trações de Penicilina
Penicilina (pg/L) Viabilidade de S. pyogenes (%)
1,56 100
3,13 100
6,25 100
12,5 13,16
25,0 9,07
50 9,57
100 9,40
Devido à natureza altamente eficaz de concentrações de penicilina em ou acima de 25 pg/L, DMSO foi combinado com concentrações de penicilina que eram menos eficazes (variando de 3,125 a 12,5 pg/L). Desta
191/247 maneira, identificação de sinergismo entre DMSO e penicilina seria menos provável de ser matematicamente obscuro.
Conforme mostrado nas Tabelas 45-20, 45-21 e 45-22 (identificadas por um *) várias combinações de DMSO e penicilina resultaram em 5 resultados sinérgicos. Por exemplo, DMSO 5% em combinação com 3,125 pg/L de penicilina, com base na eficácia dos dois componentes sozinhos, seria apenas esperado reduzir viabilidade bacteriana em cerca de 4%. No entanto, quando combinados, a redução real era aproximadamente 10 vezes maior (viabilidade reduzida para -61%, vide Tabela 45-20). Efeitos sinérgi10 cos similares foram vistos quando DMSO 5% foi combinado com 6,25 pg/L ou 12,5 pg/L de penicilina (vide Tabela 45-21 e 45,22, respectivamente).
Tabela 45-20. Viabilidade de S pyogenes após Exposição a 3,13 pg/L de
Penicilina com Várias Concentrações de DMSO
Penicilina (pg/L) DMSO (%) Viabilidade de S. pyogenes (%)
3,13 0 100
3,13 2,5 100
3,13 5,0 60,85 *
3,13 8,0 12,90
Tabela 45-21. Viabilidade de S pyogenes após Exposição a 6,25 pg/L de
Penicilina com Várias Concentrações de DMSO
Penicilina (pg/L) DMSO (%) Viabilidade de S. pyogenes (%)
6,25 0 100
6,25 2,5 100
6,25 5,0 60,23 *
6,25 8,0 6,91 *
Tabela 45-22. Viabilidade de S pyogenes após Exposição a 12,5 pg/L de
Penicilina com Várias Concentrações de DMSO
Penicilina (pg/L) DMSO (%) Viabilidade de S. pyogenes (%)
12,5 0 13,16
12,5 2,5 19,63
12,5 5,0 14,77 *
192/247
Penicilina (pg/L) DMSO (%) Viabilidade de S. pyogenes (%)
12,5 8,0 6,43
Estudos similares àqueles usando DMSO foram realizados combinando MSM com penicilina variando de 3,125 a 12,5 pg/L. Os resultados são mostrados nas Tabelas 45-23, 45-24 e 45-25, Sinergia é indicada por um *. Como com DMSO, concentrações anteriormente ineficazes de MSM 5 e penicilina foram eficazes em combinação na redução de viabilidade bacteriana. Quando tomados sozinhos, nenhum efeito seria esperado de 3,13 pg/L de penicilina com MSM 2,5%, no entanto, uma redução de 8% em viabilidade é detectada (vide Tabela 45-23). Esses efeitos são mais pronunciados com a combinação de 6,25 pg/L de penicilina com MSM. Por exemplo, 10 MSM 5% com 6,25 pg/L de penicilina seria esperado para dar uma população bacteriana viável de 96% (vide Tabela 45-24). No entanto, dados indicam que viabilidade foi reduzida para cerca de 17%, quase 80% de redução a partir dos resultados esperados. Sinergia não foi detectada quando 12,5 pg/L de penicilina foram usados, devido à eficácia daquela concentração de 15 penicilina sozinha.
Tabela 45-23. Viabilidade de S. pyogenes após Exposição a 3,13 pg/L de
Penicilina com Várias Concentrações de MSM
Penicilina (pg/L) MSM (%) Viabilidade de S. pyogenes (%)
3,13 0 100
3,13 2,5 92,89 *
3,13 5,0 78,31 *
3,13 8,0 9,91*
Tabela 45-24. Viabilidade de S pyogenes após Exposição a 6,25 pg/L de
Penicilina com Várias Concentrações de MSM
Penicilina (pg/L) MSM (%) Viabilidade de S. pyogenes (%)
6,25 0 100
6,25 2,5 90,11 *
6,25 5,0 17,42*
6,25 8,0 10,77*
Tabela 45-25. Viabilidade de S pyogenes após Exposição a 12,5 pg/L de
193/247
Penicilina com Várias Concentrações de MSM
Penicilina (pg/L) MSM (%) Viabilidade de S. pyogenes (%)
12,5 0 13,16
12,5 2,5 16,33
12,5 5,0 12,85
12,5 8,0 16,02
Como com S. pneumoniae, combinações de várias concentrações de DMS, MSM e penicilina foram avaliadas quanto aos seus efeitos sobre viabilidade bacteriana e possível atividade sinérgica comparado com MSM com penicilina ou DMSO com penicilina. Os resultados são mostrados na Tabela 45-26. Sinergia conforme comparado com DMS e penicilina é indicada por um enquanto sinergia comparado com MSM e penicilina é indicada por um ψ. Como pode ser visto pelos dados na Tabela 45-26, sinergia substancial foi determinada através das várias concentrações de compostos. A maioria das combinações de DMSO e MSM exibiu uma curva de dose-resposta com base na concentração de penicilina usada. Com base na eficácia de 12,5 pg/L sozinha, não é esperado que combinações desta concentração de penicilina com DMSO e MSM devam ser mais eficazes. De interesse, as concentrações anteriormente ineficazes de penicilina são tornadas eficazes de uma maneira dependente da dose através da combinação com DMSO e MSM. Por exemplo, DMSO 2,5% com MSM 5% e 3,125 pg/mL de penicilina seria esperado reduzir viabilidade bacteriana para entre 100% e 96% (quando comparado com DMSO+penicilina e MSM+penicilina, respectivamente). No entanto, a combinação de todos os três reduziu a viabilidade bacteriana para cerca de 19%. Os resultados esperados são similares para combinações com 6,25 pg/L de penicilina, mas a combinação real reduziu a viabilidade bacteriana ainda mais, para cerca de 13%. Concentrações altas dos vários compostos não resulta em reduções maiores em viabilidade bacteriana. Por exemplo, a combinação de DMSO 8% com MSM 2,5% e 3,125 pg/L de penicilina parece ser mais eficaz do que DMSO 8% com MSM 2,5% e 12,5 pg/L de penicilina.
194/247
Tabela 45-26. Viabilidade de S. pneumoniae após Exposição a Várias Combinações de DMSO, MSM e Penicilina
DMSO (%) MSM (%) Penicilina (pg/L) Viabilidade de S. pyogenes (%)
2,5 2,5 3,125 91,74 *, ψ
2,5 2,5 6,25 60,55 *, ψ
2,5 2,5 12,5 8,08 *, ψ
2,5 5 3,125 18,72 *, ψ
2,5 5 6,25 13,38 *, ψ
2,5 5 12,5 9,41 *
2,5 10 3,125 16,05 *, ψ
2,5 10 6,25 11,78 *, ψ
2,5 10 12,5 11,77*
5 2,5 3,125 14,60 *, ψ
5 2,5 6,25 10,44 *, ψ
5 2,5 12,5 9,55*, ψ
8 2,5 3,125 9,55 *, ψ
8 2,5 6,25 10,28 ψ
8 2,5 12,5 15,55 ψ
Esses estudos indicam que em certas concentrações MSM,
DMSO ou uma combinação dos mesmos pode inibir Streptococcus pyoge5 nes e Streptococcus pneumoniae apoiando um uso possível de tais substâncias para prevenir ou inibir crescimento de Streptococcus pyogenes e Streptococcus pneumoniae.
Exemplo 22
Crescimento de Probiótico em Meios Suplementados com MSM
Este exemplo descreve crescimento de probiótico em meios suplementados com MSM.
Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus delbrueckii e Bacillus coagulans, meios de crescimento foram suplementados com MSM a 0, 0,125, 0,25, 0,5, 1,0, 2,5 e 5%. Um estoque de MSM 5% único de caldo de MRS foi preparado e usado para fazer cada composição
195/247 de meio. Meios para os organismos de lactobacillus foram preparados adicionando a quantidade apropriada de MSM a 99 ml_ de caldo de MRS. Para Bifidobacterium bifidus, 99 mL de caldo de MRS foram preparados com as respectivas concentrações de MSM e L-cisteína 0,05%. Para Bacillus coagulans, 99 mL de caldo de soja tríptico foi suplementado com a quantidade apropriada de MSM.
Essas soluções de meio foram inoculadas com cada organismo probiótico e incubadas a 35°C ± 0,5°C em CO2 para um total de 72 horas para todas as soluções, exceto por Bifidobacterium bifidum, que foi cultivado em condições anaeróbicas. Amostras de cada meio foram coletadas a 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 e 72 horas. Amostras de lactobacilos foram plaqueadas em ágar de MRS. Amostras de Bifidobacterium bifidum foram plaqueadas em MRS + ágar de L-cisteína e amostras de Bacillus coagulans foram plaqueadas em ágar de soja tríptico. As placas foram incubadas a 35°C ± 0,5°C em CO2 para um total de 72 horas para todas as soluções, exceto Bacillus coagulans, que foi cultivada por 48 horas. As placas foram então contadas. Controles negativos (meios de estoque e controles de plaqueamento) eram livres de crescimento microbiano. Os dados foram apresentados em Cfu/mL. Os resultados desses estudos são apresentados nas Tabelas abaixo.
Tabela 46. Crescimento de Lactobacillus acidophilus em Meios Fortificados com MSM
Tempo MSM 0 % MSM 0,125% MSM 0,2% MSM 0,50% MSM 1% MSM 2,5% MSM 5%
0 1,48 1,37 1,37 1,30 1,48 1,48 1,52
8 1,48 2,19 1,43 2,01 2,25 2,20 1,37
16 4,87 4,83 5,74 3,82 3,79 4,24 2,69
24 6,97 7,14 8,19 6,47 6,77 5,78 5,36
32 9,47 9,15 9,85 9,15 9,05 9,16 8,91
40 7,08 9,53 9,50 9,58 9,49 9,35 9,25
196/247
Tempo MSM 0 % MSM 0,125% MSM 0,2% MSM 0,50% MSM 1% MSM 2,5% MSM 5%
48 7,27 9,59 9,32 10,45 10,98 10,16 10,88
56 7,20 10,16 9,26 9,33 10,90 11,10 10,01
64 7,29 9,40 9,37 9,53 10,34 11,58 8,95
72 7,19 8,56 8,36 8,57 8,68 8,44 6,66
Tabela 47. Crescimento de Lactobacillus bulgaricus em Meios Fortificados com MSM
Tempo MSM0 % MSM 0,125% MSM 0,2% MSM 0,50% MSM 1% MSM 2,5% MSM I 5% I
0 2,22 2,29 2,25 2,23 2,29 2,26 2,19
8 3,56 4,15 4,08 4,42 4,83 4,57 3,28
16 8,09 8,22 8,34 8,28 8,36 8,09 7,39
24 8,71 9,04 9,10 9,05 9,03 9,01 8,50
32 9,29 8,55 9,60 9,54 9,31 9,15 9,29
40 9,32 9,29 9,11 9,40 9,34 9,27 9,37
48 10,81 10,94 11,07 10,82 11,23 11,37 10,92
56 7,69 8,00 8,79 9,14 8,11 8,23 10,07
64 8,78 8,59 8,79 8,80 6,50 8,75 10,96
72 6,56 6,74 6,72 6,72 6,45 6,51 8,62
Tabela 48. Crescimento de Bacillus coagulans em Meios Fortificados com
MSM
Tempo MSM 0% MSM 0,125% MSM 0,2% MSM 0,50% MSM 1% MSM 2,5% MSM 5%
0 1,43 1,52 1,67 1,48 1,30 1,43 1,56
8 5,05 4,81 4,94 4,42 4,98 5,13 4,61
197/247
Tempo MSM 0% MSM 0,125% MSM 0,2% MSM 0,50% MSM 1% MSM 2,5% MSM 5%
16 6,75 6,95 7,19 6,94 7,29 7,05 7,56
24 10,34 9,87 10,34 10,29 10,30 10,22 10,48
32 10,70 11,06 11,25 11,05 11,42 11,70 11,55
40 10,70 11,72 11,34 10,25 11,02 10,55 10,85
48 11,07 11,56 9,94 10,40 10,38 10,88 10,22
56 11,35 9,60 11,45 10,76 10,86 10,86 11,1
64 11,01 12,13 11,37 10,45 10,40 10,97 10,75
72 10,92 10,14 10,94 10,86 10,70 11,05 11,81
Tabela 49. Crescimento de Bifidobacteruim bifidum em Meios Fortificados com MSM
Tempo MSM 0% MSM 0,125% MSM 0,2% MSM 0,50% MSM 1% MSM 2,5% MSM 5%
0 1,67 1,64 1,82 1,85 1,48 1,64 1,00
8 2,30 1,73 2,08 1,99 1,70 1,60 2,29
16 5,33 6,55 5,22 6,53 6,81 6,21 6,71
24 5,86 2,70 6,15 3,14 2,75 2,52 5,72
32 8,80 3,37 5,03 3,52 3,37 3,37 10,32
40 9,71 4,19 8,14 4,62 3,48 3,52 12,02
48 10,60 6,41 8,55 4,51 3,90 3,95 10,54
56 10,42 9,97 9,00 6,05 8,32 8,35 10,92
64 10,65 11,34 10,19 9,55 8,02 8,30 12,04
72 11,21 10,00 9,10 7,52 9,52 10,12 12,43
Esses estudos indicam que MSM pode aumentar o crescimento de organismos probióticos dependendo da concentração de MSM emprega198/247 da.
Exemplo 23 Efeito de MSM sobre Vírus de H1N1 e Herpes Simplex
Este exemplo mostra a habilidade de MSM em aumentar ou reduzir a infectividade de linhagem do vírus da Gripe A H1N1 tipo Suíno/California/04/2009 (CDC ID No.2009712047), Rinovírus tipo 12 (ATCC No. VR-284) e Vírus Herpes Simplex tipo 1 (ATCC No. VR-260). O estudo foi realizado como um Teste de pré-tratamento de oito concentrações de MSM. Teste de redução/aumento de rendimento de vírus e subsequente titulação de vírus foi conduzido em três réplicas. As concentrações inibidoras de MSM (IC5o ou IC90 - a concentração na qual crescimento ou atividade é inibido em 50% ou 90%) foram também determinadas neste estudo.
Citotoxidez de MSM foi determinada antes do teste. Oito concentrações de MSM (16%, 14%, 12%, 10%, 8,0%, 6,0%, 1,0% e 0,5%) foram testadas em células MDCK (No. ATCC CCL-34). As concentrações de MSM 16% a 8% eram citotóxicas para células MDCK e destruíram completamente monocamadas de célula. As concentrações 6% a 0,5% não produziram nenhum efeito citotóxico visível. TC50 (concentração na qual 0 composto, sozinho, mata 50% de células não infectadas) foi determinada ser aproximadamente 7%. Desta maneira, esta concentração foi a primeira diluição não citotóxica mais baixa usada em teste.
Um total de oito concentrações de MSM foi incluído no teste: 7% (-74,365 mM); 6% (-63,742 mM); 5% (-53,118 mM); 4% (-42,494 mM); 3% (-31,871 mM); 2% (-21,247 mM); 1% (-10,624 mM); e 0,5% (-5,312 mM). Uma descrição detalhada do material e dos métodos é provida abaixo.
Células Hospedeiro. Células Madin Darby Canis Kidney (MDCK [ATCC No. CCL-34]), MRC-5 (fibroblastos pulmonares humanos; [ATCC No. CCL-171]) e células Vero (rim de macaco verde Africano [ATCC No. CCL-81] foram mantidas como monocamadas em vidraria de cultura de célula descartável e foram usadas para 0 Teste Antiviral de Pré-tratamento de linhagem do vírus da Gripe A H1N1 tipo Suíno A/California/04/2009, Rinovírus tipo 14 (ATCC No. VR-284) e HSV-1 (ATCC No. VR-260), respectivamente. Antes
199/247 do teste, as culturas de célula hospedeiro foram semeadas nas placas de cultura de célula apropriadas. Monocamadas de célula eram 80 a 90% confluentes em menos de 48 horas de vida antes da inoculação com o vírus. O meio de crescimento (GM) (Growth Medium) e o meio de manutenção (MM) (Maintenance Medium) eram EM EM 1X e/ou MEM Avançado com suplementos apropriados.
Determinação de citotoxidez do produto de teste. A concentração não citotóxica mais alta do produto de teste foi determinada antes do teste. Cultura de célula MDCK foi lavada com Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) e incubada com as diluições que seguem de um produto: 16%, 14%, 12%, 10%, 8,0%, 6,0%, 1,0% e 0,5%. A incubação foi 1 hora a 37°C ± 2°C em uma incubadora de CO2. Após incubação, as células tratadas foram cobertas com MM. As placas foram incubadas em uma incubadora de CO2 por 3 dias a 37°C ± 2°C. A toxidez foi monitorada usando um Inverted Compound Microscope. Um teste de citotoxidez realizado conforme mostrado no Protocolo de Estudo mostrou que as concentrações de produção de 16% a 8% eram tóxicas para células MDCK e destruíram completamente monocamadas de célula. Concentrações de produto de 6% a 0,5% não produziram nenhum efeito citotóxico visível. TC50 (concentração na qual o composto, sozinho, mata 50% de células não infectadas) foi determinada ser aproximadamente 7%.
A. Teste de Pré-tratamento. Solução de estoque de Produto de Teste foi preparada como segue: 35,0 gramas de produto foram diluídos em 100 mL de PBS e aquecidos a 40°C até serem dissolvidos. A solução a 35% foi mantida a 40°C até que diluições mais altas foram preparadas (vide Project Notes [Forma No. 95-G-001] no Adendo VI deste Relatório Final). Culturas de célula MDCK, MRC-5 e Vero foram lavadas com PBS e incubadas com as diluições de produto que seguem: 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% e 0,5%. A incubação foi de 1 hora a 37°C ± 2°C em incubadora de CO2. Após a incubação ter sido terminada aproximadamente 300-1000 UI (unidades de infecção) de cada um dos vírus de teste foram adicionados às células tratadas apropriadas. O teste foi realizado em três réplicas. As placas foram incuba
200/247 das em uma incubadora de CO2 por 6 dias na temperatura apropriada para cada vírus. CPE foi monitorado usando um Inverted Compound Microscope. Todos os dados resultantes do teste estão incluídos no Adendo IV deste Relatório Final (Formas Nos. 95-G-001, 91-L-002 e 07-L-002).
B. Controle de toxidez para Teste de Pré-tratamento. Culturas de célula MDCK, MRC-5 e Vero foram lavadas com PBS e incubadas com as diluições de produto 7% a 0,5%. A incubação foi 1 hora a 37°C ± 2°C em uma incubadora de CO2. Após incubação, as células tratadas foram cobertas com MM. As placas foram incubadas em uma incubadora de CO2 por 6 dias na temperatura apropriada para cada vírus. A toxidez foi monitorada usando um Inverted Compound Microscope. Os resultados dos testes de citotoxidez são apresentados na Tabela 50.
C. Controle de Vírus. Culturas de célula MDCK, MRC-5 e Vero foram lavadas com PBS e incubadas com MM. A incubação foi 1 hora a 37°C ± 2°C em uma incubadora de CO2. Após a incubação ter sido terminada aproximadamente 300-1000 UI (unidades de infecção) de cada um dos vírus de teste foram adicionadas às células. Essas réplicas de Controle de Vírus foram feitas. As placas foram incubadas em uma incubadora de CO2 por 6 dias na temperatura apropriada para cada vírus. CPE foi monitorado usando um Inverted Compound Microscope.
D. Controle Negativo. Monocamadas de cultura de célula infectada serviram como o controle negativo. O GM foi substituído com MM em todas as cavidades controle Negativas.
E. Determinação da redução e/ou aumento de rendimento de vírus. Após controle de vírus ter atingido o efeito citopático máximo (destruição completa da monocamada), amostras das cavidades de teste e cavidades de controle de vírus foram obtidas para titulação. Diluições de dez vezes foram feitas em MM e plaqueadas em células suscetíveis em quatro réplicas. Os resultados dos testes de redução/aumento de rendimento de vírus são apresentados nas Tabelas 51 a 91.
Análise de Dados. O título da população de vírus em culturas celulares foi expresso como -log10 do ponto final de titulação 50% para infecti
201/247 vidade. Para calcular o título viral, um cálculo de dose infecciosa de cultura de tecido 50% (TCID50) -- o teste Quantal (Spearman-Kãrber Method) - foi
aplicado. log TCID50 = 1 - d (s - 0,5)
onde: I = -logw da diluição mais baixa;
d = diferença entre etapas de diluição;
s = soma de proporções de cavidades positivas.
1.1 A concentração de composto mais alta que produz um
efeito citotóxico foi determinada como 50% da concentração de composto tóxico (TC5o).
1.2 A redução percentual foi calculada como segue: Teste de TCID50 % Redução 1= 1-----------. xlOO . Controle de vírus TCIDso
1.3 TCID50 de popuiaçao ae virus recuperada do teste e
controle de vírus foi usada para calcular a redução ou aumento da infectividade do vírus. IC50 foi determinada usando GraphPad Prism 5, Inc. Software. IC90 foi determinada experimentalmente quando presente.
Critérios de Aceitação de Teste. Um teste válido requer que: 1) células nas cavidades de controle negativo sejam viáveis e presas ao fundo da cavidade; 2) 0 meio seja livre de contaminação em todas as cavidades da placa; e 3) o Controle de Vírus mostre a presença de CPE específico de vírus.
Reduções de populações de vírus foram observadas para todos os três vírus de teste. MSM em concentração de 7% produziu as reduções médias que seguem: redução 1,16 log10 (redução de 93,08%) de Vírus da Gripe A H1N1 tipo Suína; redução de 2,50 log10 (redução de 99,68%) de Vírus Herpes Simplex tipo 1 (HSV-1); redução de 1,25 logw (redução de 94,38%) de Rinovírus tipo 14, MSM em uma concentração de 6% produziu as reduções médias que seguem: redução de 1,00 log10 (redução de 90,00%) de vírus da Gripe A H1N1 tipo Suína; redução de 1,00 log 10 (redução de 90,00%) de HSV-1; redução de 0,67 logw (redução de 78,62%) de
202/247
Rinovírus tipo 14,
MSM em concentração de 5% produziu as reduções médias que seguem: redução de 0,4 log10 (redução de 61,10%) de vírus da Gripe A H1N1 tipo Suína; redução de 1,34 log10 (redução de 95,43%) de HSV-1; redução de 0,09 log10 (redução de 18,72%) de Rinovírus tipo 14, MSM em concentração de 4% produziu as reduções médias que seguem: redução de 0,16 log10 (redução de 30,82%) de vírus da Gripe A H1N1 tipo Suína; redução de 1,59 logw (redução de 97,43%) de HSV-1; redução de 0,28 logw (redução de 47,52%) de Rinovírus tipo 14, MSM em concentração de 3% produziu as reduções médias que seguem: redução de 0,0 log10 (redução de 00,00%) de vírus da Gripe A H1N1 tipo Suína; redução de 1,00 logw (redução de 90,00%) de HSV-1; redução de 0,11 logw (redução de 22,38%) de Rinovírus tipo 14, MSM a 2% de concentração produziu as reduções médias que seguem: redução de 0,41 logw (redução de 61,10%) de vírus da Gripe A H1N1 tipo Suína; redução de 0,84 logw (redução de 85,55%) de HSV-1; redução de 0,42 logw (redução de 61,98%) de Rinovírus tipo 14, MSM em concentração de 1% produziu as reduções médias que seguem: redução de 0,25 log10 (redução de 43,77%) de vírus da Gripe A H1N1 tipo Suína; redução de 0,67 logw (redução de 78,62%) de HSV-1; redução de 0,14 logw (redução de 27,56%) de Rinovírus tipo 14, MSM em concentração de 0,5% produziu as reduções médias que seguem: redução de 0,66 logw (redução de 78,12%) de vírus da Gripe A H1N1 tipo Suína; redução de 0,25 logw (redução de 43,77%) de HSV-1; redução de 0,40 logw (redução de 60,19%) de Rinovírus tipo 14,
Aumento/estimulação da infectividade de vírus foi observado para vírus da Gripe A H1N1 tipo Suína tratado com MSM 3%. O aumento médio da população de vírus foi 0,17 logw (32,39%). Um total três concentrações de MSM aumentou a infectividade de Rinovírus tipo 14, MSM em concentração de 5% produziu uma média de 0,053 logw de aumento (11,49%). MSM a três por cento produziu uma média de aumento de 0,11 logw (22,38%); e MSM 1% produziu uma média de aumento de 0,11 logw (22,38%). Todos os aumentos/estimulações de infectividade de vírus deter
203/247 minados neste estudo estavam situados na faixa de variação normal para população de vírus e não foram significantes. Uma concentração inibidora de MSM onde crescimento ou atividade é inibido em 50% (IC50) foi computada usando Dose-Resposta de regressão não linear (GrapPad Prism 5, software). Os valores de CI50 de MSM best-fit e ΙΟ50 com intervalos de segurança de 95% foram calculados para cada vírus de teste. Para vírus da Gripe A H1N1 tipo Suína, o valor best-fit de IC5o de MSM foi 5,114 mM. IC50 com intervalo de 95% de segurança estava variando de 0,008038 mM a 3253 mM. Para HSV-1, o valor best-fit de IC50 de MSM foi determinado ser 10,13 mM com um IC50 com intervalo de 95% de segurança estava variando de 7,144 mM a 14,37 mM. Para Rinovírus tipo 14, o valor best-fit de IC50 de MSM foi 38,16 mM. IC50 com intervalo de 95% de segurança estava variando de 13,07 mM a 111,4 mM. IC90 (redução de 1,0 log10) foi determinada experimentalmente para HSV-1 e H1N1 de Gripe A tipo Suína. No entanto, devido à intercepção de concentrações de MSM múltiplas com o eixo de redução 90%, valores experimentais de IC90 não podem ser considerados precisos.
MSM testado em oito concentrações diferentes contra HSV-1, H1N1 Gripe A tipo Suína e Rinovírus produziu curvas de dose-resposta de formato em U. Por exemplo: MSM 4% (redução Iog10 de 1,00) foi mais eficaz contra HSV-1 do que MSM 6% (redução 1,50 log10); MSM 0,5% (redução 0,66 log10) era mais ou igualmente eficaz contra H1N1 de Gripe A tipo Suína do que MSM 5% (redução de 0,4 log10); as concentrações de 4% a 0,5% eram mais ou igualmente eficazes contra Rinovírus do que MSM 5%. É possível, se confirmado em pesquisa adicional, que efeitos de MSM de formato em U representem um evento estável.
Este estudo indica que MSM pode ser usado como um produto antiviral. Concentrações não citotóxicas de 7% e 6% reduziram populações de vírus envelope tais como HSV-1 e H1N1 Gripe A tipo Suína em mais de 1,0 log-io. As Tabelas 50 a 91 incluem os resultados para os estudos mencionados acima.
A Tabela 50 representa Teste Citotóxico para oito concentrações de produto realizado em paralelo com o Teste de pré-tratamento usando cul204/247 turas de célula MDCK, MRC-5 e Vero.
TABELA 50
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, No. do lote 0902951
Designação da Cultura Celular Citotoxidez do Produto de Teste
7% 6% 5% 4% 3% 2% 1% 0,5%
Vero 00 00 00 00 00 00 00 00
MDCK ++ ++ 00 00 00 00 00 00
MRC-5 ++ 00 00 00 00 00 00 00
+ = CPE Presente
0 = CPE não testada
As Tabelas 2 a 9 apresentam a infecitividade do Controle de Virus (TCID50), a infectividade média (TCID50) e as reduções log-10 e percentuais observadas no teste de Pré-tratamento do Produto de Teste, Metilsulfonilmetano (Número do Lote 0902951) e Linhagem A do Virus da Gripe A 10 H1N1 tipo Suína/California/04/2009 (CDC ID No. 2009712047).
TABELA 51 Redução de Infectividade
Produto de teste: Metilsulfonilmetano, 7% (No. do lote 0902951)
Vírus: Linhagem A de H1N1 Virus da Gripe A tipo Suina/California/04/2009 CDC ID No. 2009712047
Linhagem da Célula Hospedeiro: MDCK Linhagem da Célula Hospedeiro ATCC NO. CCL-34
Diluições (-logio) Controle do Virus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ z
-4 ++++ ++++ ++++ 00+0 0000 0+00
-5 00+0 +000 +0+0 0000 0000 0000
-6 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
205/247
Diluições (-logw) Controle do Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
TCID50 4,75log10 4,75 logw 5,00 logw 3,75 logw 3,50logw 3,75 logw -
TCID50 Média 4,83 logio 3,67 logio
Redução Log* 1,08 logw 1,33 logw 1,08 logw
Redução Log Média 1,16 logw
Redução Percentual , .. 91,68% 95,32% 91,68%
Redução Percentual Média** 93,08%
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução Iog10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
206/247
TABELA 52 Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 6% (lote No. 0902951)
Vírus: Linhagem A de H1N1 Vírus da Gripe A tipo Suína/California/04/2009
CDC ID No. 2009712047
Linhagem da Célula Hospedeiro: MDCK Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-34
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
1 :í: , ....... ' 0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +4-++
-4 ++++ ++++ ++++ 0+00 000+ +00+
-5 00+0 +000 +0+0 0000 0000 0000
-6 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCID50 4,75log10 4,75 log-io 5,00 logw 3,75 logw 3,75log10 4,00 logw
TCID50 Média 4,83 log10 3,67 logio
Redução Log* 1,08 logw 1,08 logw 0,83 logw
Redução Log Média 1,00 log10
Redução Percentual 91,68% 91,68% 85,21%
Redução Percentual Média** 90,00%
+ = CPE Presente 0 = CPE não detectada
NT = Não testado Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste ** - Redução % Média(calculada a partir da redução log 10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
TABELA 53
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 5% (lote No. 0902951)
207/247
Vírus: Linhagem A de H1N1 Vírus da Gripe A tipo Suína/California/04/2009 CDC ID No. 2009712047
Linhagem da Célula Hospedeiro: MDCK Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-34
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ 0+++ +++0
-5 00+0 +000 +0+0 0000 +000 0000
-6 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCID50 4,75lo gio 4,75 logio 5,00 logio 4,50log-i 0 4,50lo gw 4,25logw
TCID50 Média 4,83 log! 0 4,42 log10 . ..
Redução Log* 0,33 logw 0,33 logw 0,58 log10
Redução Log Média 0,41 log10
Redução Percentual 53,23% 53,23 % 73,70%
Redução Percentual Média** 61,10%
5 + = CPE Presente
0 = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica
* - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução Iog10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*1OO
TABELA 54
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 4% (lote No. 0902951)
208/247
Vírus: Linhagem A de H1N1 Vírus da Gripe A tipo Suína/California/04/2009
CDC ID No. 2009712047
Linhagem da Célula Hospedeiro: MDCK Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-34
Diluições (-logio) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ 0+++ ++++
-5 00+0 +000 +0+0 00+0 000+ 000+
-6 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCID50 4,75log10 4,75 log10 5,00 log10 4,75log10 4,50log 10 4,75100! 0
TCID50 Média 4,83 log10 4,67 log10
Redução Log* 0,08 log 10 0,33 log-10 0,08 log 10
Redução Log Média 0,16 log10
Redução Percentual 16,82 % 53,23% 16,82%
Redução Percentual Média** 30,82%
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução Iog10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
TABELA 55
209/247
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 3% (lote No. 0902951)
Vírus: Linhagem A de H1N1 Vírus da Gripe A tipo Suína/California/04/2009
CDC ID No. 2009712047
Linhagem da Célula Hospedeiro: MDCK Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-34
Diluições (Tog10) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
--- 0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ TO000· ?
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-5 00+0 +000 +0+0 00++ +00+ 0++0
-6 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
tcid50 4,75logio 4,75 5,00 5,OOIog10 5,00logw 5,00logio
log10 logw
TCID50 4,83 log10 5,00 log10
Média
Redução 0,00 0,00 log10 0,00 logw
Log logio
Redução 0,00 logw
Log Média :·/
Redução 00,00% 00,00% 00,00%
Percentual
Redução 00,00%
Percentual ··. ' ' ; . .
Média I
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de Teste ** - Redução % Média( calculada a partir da redução Iog10 média) = 100-(1/ Redução TCID50)*100
TABELA 56
210/247
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 2% (lote No. 0902951)
Vírus: Linhagem A de H1N1 Vírus da Gripe A tipo Suína/California/04/2009
CDC ID No. 2009712047
Linhagem da Célula Hospedeiro: MDCK Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-34
Diluições (-log! o) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +000
-5 00+0 +000 +0+0 0000 000+ 0+00
-6 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCID50 4,75logw 4,75 log10 5,00 log-fo 4,50log10 4,75log10 4,00log10
TCID50 Média 4,83 log10 4,42 log10
Redução Log* 0,33 log io 0,08 log-io 0,83 log10
Redução Log Média 0,41 log10
Redução Percentual 53,23 % 16,82% 85,21%
Redução Percentual Média** 61,10%
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução Iog10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
211/247
TABELA 57
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 1% (lote No. 0902951)
Vírus: Linhagem A de H1N1 Vírus da Gripe A tipo Suína/California/04/2009 5 CDC ID No. 2009712047
Linhagem da Célula Hospedeiro: MDCK Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-34
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++0+ ++++ ++++
-5 00+0 +000 +0+0 00+0 000+ 0000
-6 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
tcid50 4,75log10 4,75 logw 5,00 logw 4,50log10 4,75logw 4,50logw
TCID50 Média 4,83 log10 4,58log10
Redução Log* * , 1 1 μ t V. 1 _ 1 1 1 I ,1 . _ 0,33 log10 0,08 logw 0,33 logw
Redução Log Média 0,25 logw
Redução Percentual 53,23% 16,82% 53,23%
Redução Percentual Média** 43,77%
+ = CPE Presente
0 = CPE não detectada
10 NT = Não testado
Rep = Réplica
* - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução Iog10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
212/247
TABELA 58
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 0,5% (lote No. 0902951)
Vírus: Linhagem A de H1N1 Vírus da Gripe A tipo Suína/Calífornia/04/2009 5 CDC ID No. 2009712047
Linhagem da Célula Hospedeiro: MDCK Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-34
Diluições (-logio) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ +000 ++++ +++0
-5 00+0 +000 +0+0 0000 0000 0000
-6 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCID50 4,75log10 4,75 logio 5,00 logio 3,75log10 4,50log10 4,25log10
TCID50 Média 4,83 log10 4,17 log10
Redução Log* 1 ,08 log10 0,33 log10 0,58 logio
Redução Log Média 0,66 logio
Redução Percentual 91,68% 53,23% 73,70%
Redução Percentual Média** >|||1| as II 78,12%
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste
213/247 ** - Redução % Média (calculada a partir da redução Iog10 média) = 100-(1/ Redução TCID50)*100
As Tabelas 59 a 67 apresentam a infectividade Controle do Vírus (TCID50), a infectividade média (TCID50) e as reduções percentuais log-ιο ob5 servadas no teste de Pré-tratamento do Produto de Teste, Metilsulfonilmetano (Número do Lote 0902951) e Vírus Herpes Simplex tipo 1 (ATCC No. VR260).
TABELA 59
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 7% (lote No. 0902951)
Vírus: Vírus Herpes Simplex linhagem HF ATCC NO. VR-260
Linhagem da Célula Hospedeiro: Vero Linhagem da Célula Hospedeiro ATCC NO. CCL-81
Diluições (-iogio) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-1 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 NT NT NT ++++ +000 0+0+
-4 ++++ ++++ ++++ 0000 00+0 0000
-5 ++++ +++0 ++++ 0000 0000 0000
-6 0000 00+0 +0+0 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 NT NT NT
-8 0000 0000 0000 NT NT NT
TCID50 5,50log10 5,50log10 6,OOIog10 3,50log10 3,OOIog10 3,OOIog10
TCID50 Média 5,67log10 3,17 logw
Redução Log* -' : - κ/ύί7 - 2,1 7 log10 2,67 log-io 2,67 logw
Redução Log Média 2,50 log10
Redução Percentual 99,32% 99,79% 99,79 %
Redução Percentual Média** 99,68%
214/247 + = CPE Presente Ο = CPE não detectada
NT = Não testado Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução Iog10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
TABELA 60
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 6% (lote No. 0902951)
Vírus: Vírus Herpes Simplex linhagem HF ATCC NO. VR-260
Linhagem da Célula Hospedeiro: Vero Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-81
Diluições (-logio) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
Kill W' 0000
-3 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++0
-5 ++++ +++0 ++++ 000+ 0+00 +000
-6 0000 00+0 +0+0 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-8 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCID50 5,50log10 5,50log10 6,00logio 4,75log10 4,75log10 4,50log 10
TCID50 Média 5,67)og10 4,67 log10
Redução Log* 0,92 logio 0,92 logio 1,17 logio
Redução Log Média 1,00 log10
Redução Percentual 87,98% 87,98% 93,24 %
Redução Percentual Média** 90,00% • . .
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
215/247
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste ** - Redução % Média(calculada a partir da redução Iog10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
TABELA 61
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 5% (lote No. 0902951)
Vírus: Vírus Herpes Simplex linhagem HF ATCC NO. VR-260
Linhagem da Célula Hospedeiro: Vero Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-81
Diluições (-logio) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-3 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++0+ ++++ 000+ ti®®''®-’·'®'
-5 ++++ +++0 ++++ 0+00 0000 0000 EB
-6 0000 00+0 +0+0 000+ 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-8 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCID50 5,50log10 5,50log10 6,OOIog10 4,75log10 4,50log10 3,75log10
TCID50 Média 5,67log10 4,33 log-io
Redução Log* 0,92 logw 1,17 logio 1,92 logio
Redução Log Média 1,34 log10
Redução Percentual 87,98% 93,24% 98,80
Redução Percentual Média** 95,43%
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica
216/247 * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste ** - Redução % Média(calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
TABELA 62 Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 4% (lote No. 0902951)
Virus: Vírus Herpes Simplex linhagem HF ATCC NO. VR-260
Linhagem da Célula Hospedeiro: Vero Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-81
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
/V ÍS/í /)7:-/4/ i://lÍzlitlHÍH
-3 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ 00+0 +0+0 +0+0
-5 ++++ +++0 ++++ 0000 +00+ 0000
-6 0000 00+0 +0+0 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-8 0000 0000 0000 0000 0000 0000
tcid50 5,50log10 5,50log10 6,OOIog10 3,75log10 4,50log10 4,00log10
TCID50 5,67log10 4,08 log10
Média
Redução 1,92 1,17 1,67
Log* log io i°g io logw
Redução ®118ΐι··Ι 1,59 log10
Log Média 11111111
Redução BiSM 98,80% 93,24% 97,86%
Percentual
Redução lliülll 97,43%
Percentual
Média**
0000
Controle de Célula
1Q + = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste
217/247 ** - Redução % Média (calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
TABELA 63
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 3% (lote No. 0902951)
Vírus: Vírus Herpes Simplex linhagem HF ATCC NO. VR-260
Linhagem da Célula Hospedeiro: Vero Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-81
Diluições (-logio) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-3 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ 00++ ++++ ++++
-5 ++++ +++0 ++++ 00+0 0000 00++
-6 0000 00+0 +0+0 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 000+
-8 0000 0000 0000 0000 0000 0000
tcid50 5,50log10 5,50log10 6,OOIog10 4,25log10 4,50log10 5,25logio
TCID50 Média 5,67log10 4,67 log10
Redução Log* MiO 1,42 log10 1,17 Ιθ9ιο 0,42 log10
Redução Log Média 1,00 log10
Redução Percentual 96,20% 93,24% 61,98%
Redução Percentual Média** 90,00%
+ = CPE Presente
10 0 = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica
* - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste ** - Redução % Média(calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/
218/247
Redução TCID50)*1OO
TABELA 64
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 2% (lote No. 0902951)
Vírus: Vírus Herpes Simplex linhagem HF ATCC NO. VR-260
Linhagem da Célula Hospedeiro: Vero Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-81
Diluições (-logic) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-3 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-5 ++++ +++0 ++++ 0+++ 0000 00+0
-6 0000 00+0 +0+0 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-8 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCID50 5,50logio 5,50log10 6,OOIog10 5,25log10 4,50log10 4,75109! 0
TCID50 Média 5,67log10 4,83 log10
Redução Log 0,42 logic 1,17 logw 0,92 logw
Redução Log Média 0,84 log10
Redução Percentual 61,98% 93,24% 87,98%
Redução Percentual Média - ··.. 85,55%
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/
219/247
Redução TCID50)*100
TABELA 65
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 1% (lote No. 0902951)
Vírus: Vírus Herpes Simplex linhagem HF ATCC NO. VR-260
Linhagem da Célula Hospedeiro: Vero Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-81
Diluições (-logio) Controle de Vírus Produto de Teste Controlede Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-3 NT NT NT ++++ ++++ ++++ OSWIE--·/·..
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-5 ++++ +++0 ++++ 00++ 00++ 00++
-6 0000 00+0 +0+0 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-8 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCID5o 5,50log10 5,50log10 6,OOIog10 5,OOIog10 5,OOIog10 5,OObgio
TCID50 Média 5,67log10 5,00 log10
Redução Log 0,67 logio 0,67 logio 0,67 logio
Redução Log Média glfflllBIlBl/://-; 0,67 log10
Redução Percentual . ' '7 7 78,62% 78,62% 78,62 % 7 ·7---/-/
Redução Percentual Média 78,62% ®8HÍ8|Í··
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
220/247
TABELA 66
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 0,5% (lote No. 0902951)
Vírus: Vírus Herpes Simplex linhagem HF ATCC NO. VR-260
Linhagem da Célula Hospedeiro: Vero Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-81
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-3 NT NT NT ++++ ++++ ++++ 7' /W:
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-5 ++++ +++0 ++++ ++++ ++0+ ++0+
-6 0000 00+0 +0+0 0000 0000 000+
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-8 0000 0000 0000 0000 0000 0000
tcid50 5,50logw 5,50logw 6,00logw 5,50logw 5,25logw õ.õOlogio
TCID50 Média 5,67logw 5,42 logw
Redução Log 0,17 logw 0,42 logw 0,17 logw
Redução Log Média 0,25 logw
Redução Percentual 32,39% 61,98% 32,39%
Redução Percentual Média 43,77%
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
221/247
TABELA 67
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 7% (lote No. 0902951)
Vírus: Rinovírus tipo 14 linhagem 1059 ATCC NO. VR-284
Linhagem da Célula Hospedeiro: MRC-5 Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-171
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++0+ ++++ ++++
-5 ++++ ++++ ++++ 0000 0000 0000 '
-6 0000 0000 0+0+ 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCID5o 5,50logw 5,50logw 6,00logw 4,25log10 4,50logw 4,50109! 0
TC1D50 Média 5,67 logw 4,42 logw
Redução Log 1,42 logw 1,17 logw 1,17 logw
Redução Log Média 1,25 logw
Redução Percentual 96,20% 93,24% 93,24%
Redução Percentual Média 94,38%
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
222/247
As Tabelas 68 a 74 apresentam a infectividade Controle do Virus (TCID50), a infectividade média (TCID50) e as reduções logw e percentual observadas em teste de pré-tratamento do Produto de Teste, Metilsulfonilmetano (Número do Lote 0902951) e Rinovírus tipo 14 (ATCC No. VR-284).
TABELA 68
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 6% (lote No. 0902951)
Vírus: Rinovírus tipo 14 linhagem 1059 ATCC NO. VR-284 Linhagem da Célula Hospedeiro: MRC-5 Linhagem da Célula Hospedeiro 10 ATCC NO. CCL-171
Diluições (-logio) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-5 ++++ ++++ ++++ +000 +0+0 +0++
-6 0000 0000 0+0+ 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCID50 5,50log10 5,50log10 6,OOIog10 4,75log10 5,00logw 5,25logio
TCID50 Média 5,67 log10 5,00 log10
Redução Log 0,92 logio 0,67 logw 0,42 logio
Redução Log Média 0,67 log10
Redução Percentual ife 8 Í-' 87,98% 78,62% 61,98%
Redução Percentual Média 78,62%
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
223/247
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
TABELA 69
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 5% (lote No. 0902951)
Vírus: Rinovírus tipo 14 linhagem 1059 ATCC NO. VR-284
Linhagem da Célula Hospedeiro: MRC-5 Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-171
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-5 ++++ ++++ ++++ 0+++ ++++ ++++
-6 0000 0000 0+0+ 0000 0000 +00+
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCIDso 5,50log10 5,50log10 6,OOIog10 5,25log-|0 5,50log10 6,OOIog10
TCID50 Média 5,67 log10 5,58 log-io
Redução Log 0,09 logw 0,17 log io 0,00 logio
Redução Log Média ιιβ /7 £· 7: 0,09 log10
Redução Percentual J||^ 18,72% 32,39% 00,00%
Redução Percentual Média 18,72%
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste
224/247 ** - Redução % Média (calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
TABELA 70
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 4% (lote No. 0902951)
Vírus: Rinovírus tipo 14 linhagem 1059 ATCC NO. VR-284
Linhagem da Célula Hospedeiro: MRC-5 Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-171
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
BB / WABB-B':./·. 0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++ ./:grBB.:r
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ lllllll ; B1:
-5 ++++ ++++ ++++ 00++ ++++ ++++ BB??:'' '
-6 0000 0000 0+0+ 0000 0000 0+00 /BB*/:/··
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
tcid50 5,50log10 5,50log10 6,OOIog10 5,OOIog10 5,50log10 5,75109! 0 ^BABB': ' B·
TCID50 Média 5,67 log10 5,42 log10
Redução Log - 0,67 logw 0,17 logw 0,00 logw
Redução Log Média .. 0,28 log10
Redução Percentual • \b·'· 1 78,62% 32,39% 00,00%
Redução Percentual Média 47,52%
+ = CPE Presente
0 = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
Teste
225/247 ** - Redução % Média (calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
TABELA 71
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 3% (lote No. 0902951)
Vírus: Rinovírus tipo 14 linhagem 1059 ATCC NO. VR-284
Linhagem da Célula Hospedeiro: MRC-5 Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-171
Diluições (-logio) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-5 ++++ ++++ ++++ ++0+ ++++ ++++
-6 0000 0000 0+0+ 000+ 0000 000+
-7 0000 0000 0000 0000 0000 +000
TCID50 5,50logio 5,50logio 6,00logio 5,50log10 5,50log10 6,00log1 0
TCID50 Média 5,67 logio 5,67 logio
Redução Log 0,17 logio 0,17 logio 0,00 logw
Redução Log Média 0,11 logio
Redução Percentual 32,39% 32,39% 00,00%
Redução Percentual Média ,,.:.,' j,;: ·.; Ϊ/// / / . / ·ϊ: / 22,38%
+ = CPE Presente
0 = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
226/247
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
TABELA 72
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 2% (lote No. 0902951)
Vírus: Rinovírus tipo 14 linhagem 1059 ATCC NO. VR-284
Linhagem da Célula Hospedeiro: MRC-5 Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-171
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++ ΙΙίΙφ'νόΐΦτίΙ
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ Τ' Á
-5 ++++ ++++ ++++ ++++ 0+++ 0000 yy .y
-6 0000 0000 0+0+ 0000 00+0 00+0 SM/· : ·:Τ;: .·
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
tcid50 5,50logw 5,50logw 6,00logw 5,50logw 5,50logw 4,75log-i 0
TCID50 Média 5,67 logw 5,25 logw
Redução Log 0,17 logw 0,17 logw 0,92 logw
Redução Log Média ÍSÍ/MB YÍSWi·:!·?· ÍT' 0,42 logw
Redução Percentual 32,39% 32,39% 87,98%
Redução Percentual Média 61,98%
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
227/247
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
TABELA 73
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 1% (lote No. 0902951)
Vírus: Rinovírus tipo 14 linhagem 1059 ATCC NO. VR-284
Linhagem da Célula Hospedeiro: MRC-5 Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-171
Diluições (-logio) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-5 ++++ ++++ ++++ ++++ ++0+ ++++ .
-6 0000 0000 0+0+ +0+0 0000 000+
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000 1 '
tcid50 5,50logio 5,50log10 6,00logio 6,OOIog10 5,25logio 5,75100-, 0
TCID50 Média 5,67 log-io 5,67 log10
Redução Log 0,00 logio 0,42 logio 0,00 logio eiillllligi
Redução Log Média IÍÍIÍ 0,14 log10 - h ,n
Redução Percentual 00,00% 61,98% 00,00%
Redução Percentual Média 27,56%
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
228/247
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/
Redução TCID50)*100
TABELA 74
Redução de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 0,5% (lote No. 0902951)
Vírus: Rinovírus tipo 14 linhagem 1059 ATCC NO. VR-284
Linhagem da Célula Hospedeiro: MRC-5_Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-171
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ i ·
-5 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 0000 .··
-6 0000 0000 0+0+ 0000 +000 0000 -Μ
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCID50 5,50log10 5,50logw 6,OOIog10 5,50log10 5,75log10 4,50100! 0 1Y.//:I1///://;/·.·./.·//;
TCID50 Média 5,67 log10 5,25 log10
Redução Log 0,17 logw 0,00 logw 1,17 logw :/:////:
Redução Log Média 0,40 log10
Redução Percentual .‘Τ'/' ';ΐ· ::/-:/:///1/:/://:::- 32,39% 00,00% 93,24%
Redução Percentual Média 60,19%
+ = CPE Presente = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Redução Log= TCID50 Média do Vírus Controle - TCID50 da Réplica de
229/247
Teste ** - Redução % Média (calculada a partir da redução log10 média) = 100-(1/ Redução TCID50)*100
A tabela 75 apresenta a infectividade Controle de Vírus (TCID50), a infectividade média (TCID5o) e os aumentos logw θ percentual observados no Teste de pré-tratamento do Produto de Teste Metilsulfonilmetano (Número do lote 0902951) e linhagem A do vírus da Gripe A H1N1 tipo Suína/California/04/2009 (CDC ID No. 2009712047).
TABELA 75
Aumento de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 3% (lote No. 0902951)
Vírus: Linhagem A de Vírus da Gripe A H1N1 tipo Suína/Calífornia/04/2009 CDC ID No. 2009712047
Linhagem da Célula Hospedeiro: MDCK Linhagem da Célula Hospedeiro
ATCC NO. CCL-34
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-5 00+0 +000 +0+0 00++ +00+ 0++0
-6 0000 0000 0000 0000 0000 0000
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
tcid50 4,75logio 4,75 logw 5,00 logw 5,00logw 5,00logw 5,00logw
TCID50 Média 4,83 logio 5,00 logw
Estimulação Log 0,17 logw 0,17 logio 0,17 logw
Estimulação Log Média 11.1/.-/ 0,17 logw
Estimulação Percentual llillllll'l 32,39% 32,39% 32,39%
Estimulação Percentual Média 1111111^^^^ 32,39%
230/247
+ = CPE Presente
0 = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica
* - Estimulação Log = TCID50 Média de Teste - TCID50 de Réplica do
Controle de Vírus ** - Estimulação % média (calculada a partir da estimulação de log10 média) = 100-(1/ Estimulação de TCID50)*100
As Tabelas 76 a 78 mostram a infectividade Controle do Vírus (TCID50) e os aumentos logic θ percentual observados no Teste de prétratamento do Produto de Teste, Metilsulfonilmetano (Número do Lote 0902951) e Rinovírus tipo 14 (ATCC NO. VR-284).
TABELA 76
Aumento de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 5% (lote No. 0902951)
Vírus: Rinovírus tipo 14 linhagem 1059 ATCC NO. VR-284
Linhagem da Célula Hospedeiro: MRC-5 Linhagem da Célula Hospedeiro ATCC NO. CCL-171
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ -_z_ _
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-5 ++++ ++++ ++++ 0+++ ++++ ++++
-6 0000 0000 0+0+ 0000 0000 +00+
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
tcid50 5,50log10 5,50log10 6,OOIog10 5,25log10 5,50log10 6,00log-i 0
TCID50 5,67 log10 5,58 Iog-10
Média ΙΒΟΟΖ-'Α/α./
Estimula- 0,08 0,08 0,00 . 7 ....... :
ção Log A1· T +4 7’,O log10 logio logw
Estimula- < ·7777//τ7™/Β 0,053 log1c
ção Log k+4-:7 41k^B:iÃ7;7'7'-7/
Média
231/247
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
Estimulação Percentual 16,82% 16,82% 00,00%
Estimulação Percentual Média 11,49%
+ = CPE Presente
Ο = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Estimulação Log = TCID50 Média de Teste - TCID50 de Réplica do Controle de Vírus ** - Estimulação % Média (calculada a partir da estimulação log10 média) = 100-(1/ Estimulação de TCID50)*100
TABELA 77
Aumento de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 3% (lote No. 0902951)
Vírus: Rinovírus tipo 14 linhagem 1059 ATCC NO. VR-284
Linhagem da Célula Hospedeiro: MRC-5 Linhagem da Célula Hospedeiro ATCC NO. CCL-171
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-5 ++++ ++++ ++++ ++0+ ++++ ++++
-6 0000 0000 0+0+ 000+ 0000 000+
-7 0000 0000 0000 0000 0000 +000
TCID5o 5,50logw 5,50logw 6,00logw 5,50log1 0 5,50log1 0 6,00log 10
TCID50 Média 5,67 logw 5,67 logw
Estimula- 0,17 logw 0,17 logw 0,00
232/247
Diluições (-logio) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
ção Log .....7; 7 7 logio
Estimulação Log Média 0,11 logio ' 8
Estimulação Percentual 32,39% 32,39% 00,00%
Estimulação Per- 77¾ 22,38%
centual
Média á '7
+ = CPE Presente
Ο = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica * - Estimulação Log = TCID50 Média de Teste - TCID50 de Réplica do Controle de Vírus ** - Estimulação % Média (calculada a partir da estimulação log10 média) = 100-(1/ Estimulação de TCID50)*100
TABELA 78
Aumento de Infectividade
Produto de Teste: Metilsulfonilmetano, 1% (lote No. 0902951)
Vírus: Rinovírus tipo 14 linhagem 1059 ATCC NO. VR-284
Linhagem da Célula Hospedeiro: MRC-5 Linhagem da Célula Hospedeiro ATCC NO. CCL-171
Diluições (-logio) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0000
-2 NT NT NT ++++ ++++ ++++
-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
-5 ++++ ++++ ++++ ++++ ++0+ ++++
-6 0000 0000 0+0+ +0+0 0000 000+
-7 0000 0000 0000 0000 0000 0000
TCID50 5,50logio 5,50logio 6,00logio 6,00logio 5,25logw 5,75logi
233/247
Diluições (-logw) Controle de Vírus Produto de Teste Controle de Célula
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
0
TCID50 Média 5,67 logw 5,67 logw
Estimulação Log -Ξ A A 0,17 logw 0,17 logw 0,00 logw
Estimulação Log Média a XIIIX' jn 0,11 logw
Estimulação Percentual 32,39% 32,39% 00,00%
Estimulação Percentual Média A Ι'ΧΟΧ 22,38%
+ = CPE Presente
0 = CPE não detectada
NT = Não testado
Rep = Réplica
* - Estimulação Log = TCID50 Média de Teste - TCID50 of Réplica do Controle de Vírus ** - Estimulação % Média (calculada a partir da estimulação log10 média) = 100-(1/ Estimulação de TCID50)*100
Regressão Não linear, Dose versus Resposta:
Análises de Dose-Resposta (Inibição) foram realizadas para as concentrações de produto de teste convertidas em nM (peso molecular do produto de teste = 94,13). As análises de regressão não linear foram como segue: log (inibidor) vs. resposta normalizada - Inclinação variável. As concentrações são apresentadas na Tabela 79.
TABELA 79
Concentração, % Concentração, mM
7% 74,365
6% 63,742
5% 53,118
4% 42,494
234/247
Concentração, % Concentração, mM
3% 31,871
2% 21,247
1% 10,624
0,5% 5,312
A Tabela 80 apresenta os dados registrados para Vírus Herpes
Simplex.
TABELA 80
Dose, mM Response, redução %
74,365 99,320 99,790 99,790
63,742 87,980 87,980 93,240
53,118 87,980 93,240 98,800
42,494 98,800 93,240 97,860
31,871 96,200 93,240 61,980
21,247 61,980 93,240 87,980
10,624 78,620 78,620 78,620
5,312 32,390 61,980 32,390
A Tabela 81 apresenta transformação (log de dose =X=Log(X)) de dados para Vírus Herpes Simplex.
TABELA 81
Dose, mM Response, redução %
1,871369 99,320 99,790 99,790
1,804426 87,980 87,980 93,240
1,725242 87,980 93,240 98,800
1,628328 98,800 93,240 97,860
1,503396 96,200 93,240 61,980
1,327298 61,980 93,240 87,980
1,026288 78,620 78,620 78,620
0,7252581 32,390 61,980 32,390
A Tabela 82 apresenta transformação para normalização de dados para Vírus Herpes Simplex. A Redução Percentual foi normalizada como
235/247 segue: 32,39% se torna 0% para todos os conjuntos de teste; 99,79% se torna 100% para todos os conjuntos de teste.
TABELA 82
Dose, mM Response, redução %
1,871369 99,30267 100,000 100,000
1,804426 82,47775 82,47775 90,2819
1,725242 82,47775 90,2819 98,53116
1,628328 98,53116 90,2819 97,1365
1,503396 94,67358 90,2819 43,90208
1,327298 43,90208 90,2819 82,47775
1,026288 68,59051 68,59051 68,59051
0,7252581 0,000 43,90208 0,000
Computação para IC50 para Vírus Herpes Simplex é apresentada na Tabela 83. O valor best-fit para IC50 do Vírus Herpes Simplex foi determinado 10,13 mM. No entanto, devido a uma variação significante em redução de vírus, valores de IC50 variando de 7,144 mM a 14,37 MM podem ser considerados uma aproximação mais plausível.
TABELA 83
log(inibidor) vs. resposta normalizada - Inclinação variável
Valores Best-fit
LoglC50 1,006
Inclinação 1,523
IC50 10,13
Erro padrão
LoglC50 0,07314
Inclinação 0,3281
Intervalos de confiança de 95%
LoglC50 0,8539 a 1,157
Inclinação 0,8428 a 2,204
IC50 7,144 a 14,37
Qualidade de Ajuste
236/247
log(inibidor) vs. resposta normalizada - Inclinação variável
Graus de Liberdade 22
Quadrado R 0,6761
Soma Absoluta de Quadrados 6312
Sy.x 16,94
Número de Pontos
Analisado 24
A Tabela 84 apresenta os registros de dados para vírus A H1N1 de Gripe tipo Suína
TABELA 84
Dose, mM Resposta, % de redução
74,365 91,680 91,680 85,210
63,742 91,680 91,680 85,210
53,118 53,230 53,230 73,700
42,494 16,820 53,230 16,820
31,871 0,000 0,000 0,000
21,247 53,230 16,820 85,210
10,624 53,230 16,820 53,230
5,312 91,680 53,230 73,700
A Tabela 85 apresenta transformação [log de dose =X=Log(X)] de dados para vírus A H1N1 de gripe tipo Suína.
TABELA 85
Dose, mM Resposta, % de redução
1,871369 91,680 91,680 85,210
1,804426 91,680 91,680 85,210
1,725242 53,230 53,230 73,700
1,628328 16,820 53,230 16,820
1,503396 0,000 0,000 0,000
1,327298 53,230 16,820 85,210
1,026288 53,230 16,820 53,230
0,7252581 91,680 53,230 73,700
237/247
A Tabela 86 apresenta transformação para normalização de dados para vírus A H1N1 da Gripe tipo Suína. A Redução Percentual foi normalizada como segue: 0% se torna 0% para todos os conjuntos de dados; 91,68% se torna 100% para todos os conjuntos de dados.
TABELA 86
Dose, mM Resposta, % de redução
1,871369 100,000 100,000 92,94284
1,804426 100,000 100,000 92,94284
1,725242 58,06065 58,06065 80,38831
1,628328 18,34642 58,06065 18,34642
1,503396 0,000 0,000 0,000
1,327298 58,06065 18,34642 92,94284
1,026288 58,06065 18,34642 58,06065
0,7252581 100,000 58,06065 80,38831
Computação de IC50 para virus da Gripe A H1N1 tipo Suína é apresentada na Tabela 87. O valor de IC50 best-fit para vírus H1N1 da Gripe A tipo Suína foi determinado 5,114 mM. Valores de IC50 com intervalos de segurança de 95% variaram de 0,008038mM a 3253 mM. Em vista de incon10 sequência de redução de vírus (curva de formato em U) IC50s de MSM foram determinadas com uma aproximação significante. Valores de IC90 não podem ser concluídos a partir desse conjunto de dados.
TABELA 87
log(inibidor) vs. resposta normalizada - Inclinação variável
Valores Best-fit
LoglC50 0,7087
Inclinação 0,2135
IC50 5,114
Erro Padrão
LoglC50 1,352
Inclinação 0,3534
Intervalos de Confiança 95%
238/247
log(inibidor) vs. resposta normalizada - Inclinação variável
LoglC50 -2,095 a 3,512
Inclinação -0,5194 a 0,9464
IC50 0,008038 a 3253
Qualidade de Ajuste
Graus de Liberdade 22
Quadrado R 0,01810
Soma Absoluta de Quadrados 29296
Sy.x 36,49
Número de Pontos
Analisado 24
A Tabela 88 apresenta os registros de dados para Rinovírus tipo
14.
TABELA 88
Dose, mM Resposta, % de redução
74,365 96,200 93,240 93,240
63,742 87,980 78,620 61,980
53,118 18,720 32,390 0,000
42,494 78,620 32,390 0,000
31,871 32,390 32,390 0,000
21,247 32,390 32,390 87,980
10,624 0,000 61,980 0,000
5,312 32,390 0,000 93,240
A Tabela 89 apresenta transformação [log de dose =X=Log(X)] de dados para Rinovírus tipo 14.
TABELA 89
Dose, mM Resposta, % de redução
1,871369 96,200 93,240 93,240
1,804426 87,980 78,620 61,980
1,725242 18,720 32,390 0,000
1,628328 78,620 32,390 0,000
239/247
Dose, mM Resposta, % de redução
1,503396 32,390 32,390 0,000
1,327298 32,390 32,390 87,980
1,026288 0,000 61,980 0,000
0,7252581 32,390 0,000 93,240
A Tabela 90 apresenta transformação para normalização de dados para Rinovírus tipo 14. A Redução Percentual foi normalizada como segue: 0% se torna 0% para todos os conjuntos d edados; 96,20% se torna 100% para todos os conjuntos de dados.
TABELA 90
Dose, mM Resposta, % de redução
1,871369 100,000 96,92308 96,92308
1,804426 91,45531 81,72558 64,42828
1,725242 19,45946 33,66944 0,000
1,628328 81,72558 33,66944 0,000
1,503396 33,66944 33,66944 0,000
1,327298 33,66944 33,66944 91,45531
1,026288 0,000 64,42828 0,000
0,7252581 33,66944 0,000 96,92308
Computação de IC50 para Rinovírus tipo 14 é apresentada na
Tabela 91. O valor IC50 best-fit para Rinovírus tipo 14 foi determinado 38,16 mM. Valores de IC50 com intervalos de segurança de 95% variaram de 13,07mM a 111,4 mM. Em vista de inconsequência de redução de vírus 10 (curva de formato em U) IC50s de MSM foram determinadas com uma aproximação significante. Valores de IC90 não podem ser concluídos a partir desses conjuntos de dados.
TABELA 91
log(inibidor) vs. resposta normalizada - Inclinação variável
Valores Best-fit
LoglC50 1,582
Inclinação 0,6280
240/247
log(inibidor) vs. resposta normalizada - Inclinação variável
IC50 38,16
Erro Padrão
LogICõO 0,2244
Inclinação 0,4179
Intervalos de Segurança 95%
LogICõO 1,116 to 2,047
Inclinação -0,2387 to 1,495
IC50 13,07 to 111,4
Qualidade de Ajuste
Graus de Liberdade 22
Quadrado R 0,1044
Soma de Quadrados Absoluta 29118
Sy.x 36,38
Número de Pontos
Analisado 24
Exemplo 24
Efeito de MSM sobre Alga
Este exemplo mostra efeitos de MSM sobre atividade de alga.
Duas espécies de Chlorella foram examinadas quanto a cresci5 mento - Chlorella sorokiniana uma espécie de água doce e Chlorella minutissima uma espécie marinha. O estudo mediu o efeito de crescimento de alga em um ambiente de água doce e água salgada com a adição de MSM onde MSM foi adicionado nas concentrações que seguem: 0%, 0,25%, 2%, 5%, 10% e 20%. O crescimento foi medido nos dias 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10. As curvas de crescimento de transmitância percentual das algas foram comparadas entre as concentrações de MSM com a concentração de MSM
0% como um controle de amostra para cada micro-organismo. O pó de estoque de MSM foi fornecido pela Bergstrom Nutrition com certificado de análise. O pó era a fórmula de microprill, No. do lote 0806809. Todos os meios, água e pó de MSM de estoque foram checados quanto à esterilidade antes do estudo. Os meios que seguem foram comprados da UTEX Culture Collec241/247 tion of Algae: Enriched Salt Water Medium e Volvox Dextrose Medium.
As algas foram cultivadas por 48 horas no meio apropriado. A suspensão inicial foi enumerada para cada alga e é referida como os inóculos de partida. Chlorella sorokiniana estava a 381 milhões de células por mililitro e Chlorella minutissima estava a 19 milhões de células por mililitro. Um mililitro da solução de alga foi posto em 9 ml de meio e misturado através de vórtex. Isto foi repetido para cada concentração de misturador de meio de MSM. O tubo de alga e MSM foram incubados em temperatura ambiente com exposição à luz do sol. As concentrações de MSM de trabalho foram preparadas a partir de uma única solução de MSM 20,0% e foram diluídas desta maneira com meio para dar a concentração final desejada de MSM. Todas as soluções foram verificadas quanto à esterilidade antes de prosseguir com o estudo. Cada diluição de MSM para cada organismo foi ajustada em e analisada em triplicata para cada intervalo de tempo medido. As amostras foram medidas através de transmitância percentual em um espectrômetro de UV/VIS em comprimento de onda de 750 nm. O estoque do meio foi testado quando à transmitância percentual níveis de base a cada intervalo de tempo foram medidos. Os resultados desses estudos são providos nas Tabelas 92 e 93 abaixo. A transmitância percentual menor indicou um fator de crescimento maior. Esses estudos demonstram que tratamento com MSM pode aumentar o crescimento de alga.
Tabela 92. Crescimento de Chlorella sorokiniana
Concentrações de MSM
0 0,5 1 2,5 5 10 20 Meio
0 80,3 47,3 48,7 40,6 35,6 31,2 19,3 30,2
1 50,6 41,8 42,5 43,1 31,2 31,3 21,9 40,3
2 24,5 29,3 37,5 44,9 27,4 29,7 24,1 82,4
3 29,9 29,6 37,5 43,8 21,4 28,4 28,1 91,2
4 25,4 19,0 17,3 26,1 18,2 29,0 31,4 94,5
5 10,6 12,4 13,5 10,3 15,7 28,7 33,6 93,3
6 10,5 12,5 13,0 10,9 15,9 27,1 36,8 97,8
7 10,0 11,9 12,5 11,0 16,3 27,6 40,6 34,3
8 10,0 12,2 12,4 11,2 17,0 27,1 40,8 32,2
242/247
Concentrações de MSM
Tabe 9 8,5 7,5 7,8 8,4 13,7 76,4 84,8 30,4
10 7,4 6,4 6,6 6,0 12,8 93,8 96,7 18,8
Ia 93 - Crescimento de Chlorella minutissima Porcentagem de MSM
0,0 0,5 1,0 2,5 5,0 10,0 20,0 Meio
ro ω o E ro Ό ω Q 0 72,4 93,5 91,1 82,8 68,9 49,6 30,0 105,1
1 74,6 70,1 80,5 75,1 87,4 49,2 33,8 105,1
2 51,5 45,4 40,0 59,5 76,5 50,8 51,1 105,1
3 33,4 32,1 31,0 45,4 62,0 51,9 54,8 105,1
4 28,2 27,6 27,9 33,6 52,9 52,0 57,3 105,1
5 26,4 26,6 26,5 32,4 52,2 51,9 57,5 105,1
6 25,6 25,1 25,4 30,0 50,7 54,9 57,4 105,1
7 24,3 23,6 24,4 28,6 51,0 56,1 57,1 106,4
8 24,1 22,8 23,7 27,7 51,9 58,6 55,8 107,0
9 18,0 20,4 21,0 23,3 47,1 41,4 45,1 109,3
10 14,9 18,9 19,4 21,1 44,1 36,7 30,2 112,0
Exemplo 25
Absorção de MSM em Formulações Tópicas está Dentro de Níveis de Segurança Reconhecidos
Este exemplo mostra que absorção de MSM em formulações tópicas está dentro de níveis de segurança reconhecidos.
Coelhos Brancos Neozelandeses, que são um modelo de animal aceito para estudos de absorção dermal, foram usados para avaliar a absorção e níveis de sangue resultantes de MSM. Os coelhos foram obtidos da 10 Charles River Canada (Saint-Constant, Quebec). Cinco coelhos machos, idades de 12-13 semanas e variando em peso de 2,6 kg a 2,7 kg, foram usados para os estudos de absorção dermal. Os coelhos foram usados por causa de sua maior permeabilidade na pele comparado com ratos, porcos ou humanos. Desta maneira, teste em coelhos é uma abordagem mais con15 servativa para segurança de produtos tópicos para uso humano. O tamanho do coelho era baseado na restrição ética de coleta de mais de 6 mL/kg de peso do corpo de sangue dentro de um período de duas semanas. O volume total de sangue a ser removido durante este estudo foi 10 mL em um único
243/247 dia. Um animal por grupo foi usado para minimizar o número de animais requerido. Os animais foram alojados individualmente em gaiolas de aço inoxidável com ciclos de luz/escuro de 12 horas. O ambiente da sala do animal foi monitorado diariamente (faixas direcionadas: 18-26°C e umidade relativa 5 25-50%). Ar fresco foi fornecido à sala em taxa suficiente para prover aproximadamente 15 a 17 mudanças de ar da sala por hora. Observações clínicas foram conduzidas para todos os animais para assegurar que os animais estivessem em boa saúde antes da dosagem. Observações de morbidez e mortalidade foram também conduzidas durante o período de estudo.
Grupos de tratamento foram como mostrado na Tabela 94,
Tabela 94: Projeto do Estudo 1
Grupo Artigo de Teste Área de Superfície Exposta Volume Aplicado Número de Animais Tempos de Coleta de Sangue (min)
A MSM 10% + água 90% 6cm2 0,5mL 1 0 (pré-dose), 10, 30, 120,480 minutos
B DMSO 50% + água 50% 6cm2 0,5mL 1 0 (pré-dose), 10, 30, 120,480 minutos
C DMSO 70% + água 30% Water 6cm2 0,5mL 1 0 (pré-dose), 10, 30, 120, 480 minutos
D MSM 10% + DMSO 50% + Água 40% 6cm2 0,5mL 1 0 (pré-dose), 10, 30, 120,480 minutos
E MSM 10% + DMSO 70%+ Água 20% 6cm2 0,5mL 1 0 (pré-dose), 10, 30, 120,480 minutos
Um dia antes do estudo, o traseiro de cada coelho foi pregado firmemente usando grampos de cabelo. Uma área de 6 cm2 foi medida e marcada para assegurar equivalência na aplicação das várias composições.
Cada produto foi aplicado através de pipetagem de 0,5 ml_ de cada composição no centro da área de teste e espalhado para cobrir toda a área de tes244/247 te. Após o período de exposição de 5 minutos, as composições foram removidas através de esfregação, enxague e secagem da área de teste.
Antes da coleta do sangue, os animais foram tranquilizados com Acepromazina (1 mg/kg) através de injeção intramuscular no músculo da perna traseira direita, após o que creme EMLA (lidocaína/prilocaína) foi aplicado a ambas as orelhas ao longo da artéria da orelha. Sangue foi coletado através da inserção de Agulha de 21G (conector removido) na artéria da orelha. Aproximadamente 2 mL de sangue integral foram coletados em tubos vacuutainer de 4 mL (Becton Dickinson, Mississauga, ON) contendo K2EDTA. Os tubos foram invertidos para misturar com o anticoagulante e armazenados refrigerados até que plasma foi separado através de centrifugação. Plasma foi separado do sangue integral através de centrifugação a 3000 x g por 10 minutos. Plasma foi coletado, transferido e armazenado em um criofrasco a -70°C até processamento adicional para análise de MSM.
Seguindo o período de exposição de 5 minutos aos vários produtos de teste (vide Tabela 1) sangue foi coletado após 10 minutos, 30 minutos, 2 horas e 8 horas. Antes das coletas de sangue de 2 e 8 horas, creme de EMLA foi aplicado às orelhas (aproximadamente 30 minutos antes de cada uma dessas coletas de sangue) uma vez que os efeitos anestésicos do creme de EMLA duram aproximadamente 1 a 2 horas. Ambos o creme de EMLA e Acepromazina foram usados devido a considerações éticas e proveem o bem estar dos animais usados neste estudo.
As concentrações de MSM em plasma foram quantificadas através de cromatografia de gás-espectrometria de gás (GC/MS) com base em métodos estabelecidos. Em suma, 450 pL de amostra de plasma foram misturados com 50 pL de solução salina fisiológica e vortexados por 30 segundos. Seguindo isso 1 mL de Acetonitrila (Fisher, grau HPLC) foi adicionado à mistura. A solução foi vortexada vigorosamente por 60 segundos e centrifugada a 2000 rpm por 5 minutos. Um microlitro do sobrenadante transparente foi introduzido no sistema GC/MS (GC/MS QP20108 El, Shimadzu, Kyoto, Japão). A análise foi realizada em uma coluna Shimadzu SHR5XLB (ID 0,25 mm X comprimento 30 m, película de 0,25 um, Kyoto, Japão). O tempo de
245/247 retenção de MSM foi 6,1-6,3 minutos. MSM foi detectado com MS e m/z 79 (M+-15) foi usado para monitoramento de perfis de SIM de íon de MSM. Gás hélio foi usado como o gás carreador, a pressão de cabeçote foi 0,25 kg/cm2, gás de formação foi 30 mL/min, a temperatura da coluna fio 80°C, temperatura do injetor 120°C, temperatura do separador 200°C e temperatura de fonte de íon 250°C). A energia de ionização foi 70 eV. Um gráfico padrão externo foi preparado com MSM dissolvido em acetonitrila nas concentrações que seguem: 62,5 pg/ml, 31,3 pg/ml, 15,6 pg/ml, 7,8 pg/ml, 3,9 pg/ml, 1,9 pg/ml, 0,98 pg/ml e 0,49 pg/ml. A concentração de MSM em amostras de plasma foi calculada a partir da inclinação da curva padrão. O gráfico best-fitted era linear com um valor R2 de 0,998,
Todos os animais foram observados antes do início do estudo e todos demonstraram boa saúde. Durante o curso do estudo e subsequente ao estudo, todos os animais demonstraram boa saúde. Morbidez, mortalidade e lesão foram avaliadas duas vezes por dia. Quaisquer animais demonstraram qualquer morbidez, mortalidade ou lesão.
Os resultados do estudo de absorção são sumarizados na Tabela 95, Concentrações no plasma de linha de base de MSM (antes da exposição aos artigos de teste) variaram entre 4,2 pg/mL e 104,2 pg/mL. A variação em linha de base está dentro da faixa normal de variação de concentrações de MSM natural que foram estabelecidas em estudos anteriores. Seguindo exposição aos vários artigos de teste, as concentrações de plasma mais altas de MSM medidas foram menores que ou iguais a aproximadamente 140 pg/mL. Esta concentração de pico resulta da exposição a MSM 10% + DMSO 70% + água 20%. Quando corrigida para variação natural em concentrações de MSM de linha de base, a mudança maior em MSM do plasma foi detectada no grupo de DMSO 70% + água 30%. Esses dados sugerem que variações em MSM, ou devido à absorção ou devido a metabolismo de DMSO, estão dentro da faixa natural de concentrações de MSM.
246/247
Tabela 95: Concentração de MSM em Plasma Após Exposição a MSM e
DMSO
T ratamento Ponto de Tempo (minuto) MSM Concentração (pg/mL)
MSM 10%+ água 90% 0 25,6
10 17,6
30 16,3
120 14,0
480 15,4
DMSO 50% + água 50% 0 4,2
10 6,9
30 6,9
120 7,4
480 12,6
DMSO 70% + água 30% 0 56,7
10 89,0
30 98,9
120 128,7
480 120,2
MSM 10% + DMSO 50%+ água 40% 0 104,2
10 116,5
30 127,9
120 128,4
480 140,4
MSM 10% + DMSO 70%+ água 20% 0 26,8
10 37,3
30 30,9
120 33,9
480 44,4
Em vista das muitas modalidades possíveis às quais os princípios da presente invenção podem ser aplicados, deve ser reconhecido que as modalidades ilustradas são apenas exemplos preferidos da invenção e
247/247 não devem ser tomados como limitantes do escopo da invenção. Pelo contrário, o escopo da invenção é definido pelas reivindicações que seguem. A requerente então reivindica como sua invenção tudo o que estiver dentro do escopo e espírito dessas reivindicações.

Claims (27)

1. Método de aumento da eficiência de fermentação de um micro-organismo, caracterizado pelo fato de que compreende:
contato do meio contendo um micro-organismo capaz de fermentação com metilsulfonilmetano (MSM), em que o MSM é provido em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 5% em peso do meio ou em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 5% em peso do teor de umidade do meio, em que o MSM aumenta a eficiência de fermentação do micro-organismo comparado com a eficiência de fermentação na ausência de MSM.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aumento da eficiência de fermentação compreende um aumento de pelo menos 50% em produção de álcool, dióxido de carbono ou ácido na presença de MSM pelo micro-organismo comparado com produção de álcool, dióxido de carbono ou ácido na ausência de MSM.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o método de aumento da eficiência de fermentação é para a produção de cerveja, cidra, vinho, um biocombustível, pão, um produto de laticínio ou qualquer combinação dos mesmos.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é levedura e o método de aumento da fermentação é para a produção de cerveja, ou em que o micro-organismo é alga e o método de aumento de fermentação é para a produção de biocombustível.
5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o aumento da eficiência de fermentação compreende um aumento de pelo menos 50% em produção de dióxido de carbono na presença de MSM pelo micro-organismo comparado com produção de dióxido de carbono na ausência de MSM, o micro-organismo é levedura e o método de aumento de fermentação é para a produção de pão.
6. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o aumento da eficiência de fermentação compreende um aumen
2/4 to de pelo menos 50% em produção de ácido láctico na presença de MSM pelo micro-organismos comparado com produção de ácido láctico na ausência de MSM e o método de aumento da fermentação é para produção de um produto de laticínio.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
6, caracterizado pelo fato de que a concentração de MSM é cerca de 0,5%.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
7, caracterizado pelo fato de que o meio compreende uma concentração de cloreto de sódio de menos de 5% de teor de umidade total.
9. Método in vitro para aumento do crescimento de um ou mais micro-organismos probióticos, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
contato de um ou mais micro-organismos probióticos com um meio capaz de apoiar crescimento de um ou mais micro-organismos probióticos; e provisão de metilsulfonilmetano (MSM) ao meio em cerca de 0,4% a cerca de 5% em peso do meio ou em peso de um teor de umidade do meio desta maneira aumentando crescimento de um ou mais microorganismos in vitro comparado com crescimento de um ou mais microorganismos in vitro na ausência de MSM.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a concentração de MSM é cerca de 1 % a cerca de 3% do peso do meio ou do teor de umidade do meio.
11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que os um ou mais micro-organismos probióticos compreendem Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Bacillus coagulans, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacteruim bifidum ou qualquer combinação dos mesmos.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o meio compreende um produto contendo probiótico tal como leite, iogurte, iogurte de arroz, iogurte congelado, chocolate, queijo, cerveja, vinho, vinagre, chucrute ou qualquer combinação dos meios.
3/4
13. Método para aumento do crescimento de um microorganismo em uma amostra de teste de diagnóstico, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
contato da amostra de teste de diagnóstico compreendendo um ou mais micro-organismos com um meio capaz de apoiar crescimento do um ou mais micro-organismos;
provisão de MSM (metilsulfonilmetano) ao meio em uma concentração de cerca de 0,4% a cerca de 5% em peso do meio ou em peso de um teor de umidade do meio, desta maneira aumentando o crescimento dos um ou mais micro-organismos na amostra de teste de diagnóstico comparado com crescimento do um ou mais micro-organismos na ausência de MSM.
14. Método de inibição de atividade microbiana ex vivo, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
seleção de um meio que é suscetível à contaminação por gripe H1N1; e contato do meio com metilsulfonilmetano (MSM) em uma concentração de cerca de 10% a cerca de 16% de peso em volume, desta maneira inibindo a atividade microbiana da gripe H1N1.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o meio compreende um fluido de corpo, um tecido do corpo ou uma superfície.
16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o contato do meio compreende pulverização ou esfregação do meio suscetível à contaminação microbiana com MSM.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a superfície é uma superfície doméstica, leito, cobertas, equipamento industrial ou superfície, sangue, pele ou uma combinação dos mesmos.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que MSM é provido em uma composição, em que a dita composição é livre de alvejante, ou livre de álcool, ou consiste essencial mente em água.
4/4
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda esterilização do meio após adição do dito MSM.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 19, caracterizado pelo fato de que o dito meio é livre de conservantes.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, caracterizado pelo fato de que o MSM inibe a atividade microbiana através de redução da taxa de crescimento de vírus da gripe H1N1 em pelo menos 50% quando comparado com a taxa de crescimento do vírus da gripe H1N1 na ausência de MSM.
22. Uso de metilsulfonilmetano (MSM) em uma concentração de cerca de 10% a cerca de 16% de peso em volume, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para a inibição de atividade microbiana em um meio compreendendo fluido de corpo, tecido do corpo; ou superfície do corpo; o meio sendo suscetível à contaminação da gripe H1N1.
23. Uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o meio é contatado por pulverização ou esfregação do meio suscetível à contaminação microbiana com MSM.
24. Uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o meio é sangue, pele ou uma combinação dos mesmos.
25. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a
24, caracterizado pelo fato de que a composição é livre de alvejante, ou livre de álcool, ou consiste essencialmente em água.
26. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a
25, caracterizado pelo fato de que o MSM inibe a atividade microbiana através da redução da taxa do crescimento de vírus da gripe H1N1 em pelo menos 50% quando comparado com a taxa de crescimento do vírus da gripe H1N1 na ausência de MSM.
27. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto, ou de processo, ou uso, englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada, ou ilustrada no pedido de patente.
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