CN111265502B

CN111265502B - 香紫苏醇和香紫苏内酯在抗丝状病毒感染中的应用

Info

Publication number: CN111265502B
Application number: CN201811482083.7A
Authority: CN
Inventors: 郭颖; 陈勍; 唐克
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2018-12-05
Filing date: 2018-12-05
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2038-12-05
Also published as: CN111265502A

Abstract

本发明公开了香紫苏醇和香紫苏内酯的在抗丝状病毒感染方面的应用。本发明包含香紫苏醇或/和香紫苏内酯对丝状病毒感染的预防或治疗中的应用或与其他抗病毒药物的联合应用。

Description

香紫苏醇和香紫苏内酯在抗丝状病毒感染中的应用

技术领域

本发明是关于香紫苏醇和香紫苏内酯抗丝状病毒感染方面的应用，属于医药技术领域。本发明包含香紫苏醇和香紫苏内酯在预防或治疗丝状病毒感染中的单独或联合应用。

背景技术

丝状病毒(Filovirus)属于丝状病毒科(Filoviridae)，又称纤丝病毒，该科病毒分为三个属，即埃博拉病毒属(Ebolavirus)、马尔堡病毒属(Marburgvirus)和奎瓦病毒属(Cuevavirus)。埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD)由埃博拉病毒引起，是严重危害公共安全和人类健康的重大烈性传染病，致死率高达25％-90％[Sanchez,A.；Geisbert,TW.；Feldmann,H.Filoviridae:Marburg and Ebola viruses.In:Knipe,DM.；Howley,PM.,editors.Fields virology.Philadelphia:Lippincott Williams&Wilkins；2006.1409-1448.]。马尔堡病毒也会致人死亡，致死率为50-80％[Nonfatal cases wereunderreported due to an uncooperative community；thus,the mortality valueseems overestimated(WHO update),August 24,2005]。奎瓦病毒是新发现的丝状病毒，在蝙蝠中发现，是否可感染人类尚无报道[Negredo A,Palacios G,Vázquez-Morón S,González F,Dopazo H,Molero F,Juste J,Quetglas J,Savji N,de la Cruz Martínez M,Herrera JE,Pizarro M,Hutchison SK,Echevarría JE,Lipkin WI,Tenorio A.Discoveryof an ebolavirus-like filovirus in europe.PLoS Pathog.2011；7(10):e1002304.]。丝状病毒为管制病毒，需要生物安全4级(P-4)实验室条件[Centers for Disease Controland Prevention/National Institutes of Health.Biosafety in Microbiological andBiomedical Laboratories.4th ed.Washington,DC:U.S.Department of Health andHuman Services,U.S.Government Printing Office；1999.DHHS Publication CDC 93-8395.]。丝状病毒是单链负链RNA病毒，有囊膜，表面有糖蛋白GP，是唯一负责病毒进入宿主的病毒蛋白，病毒中心为螺旋状核衣壳，包括基因组RNA及其他6种病毒蛋白[Feldmann,H.；Geisbert,TW.；Jahrling,PB.,et al.Filoviridae.In:Fauquet,C.；Mayo,MA.；Maniloff,J.；Desselberger,U.；Ball,LA.,editors.Virus taxonomy:VIIIth report of theinternational committee ontaxonomy of viruses.2004.645-653.]。丝状病毒基因进化树如图7所示，其中埃博拉病毒属目前已确定5种亚型，分别为扎伊尔型(Zaireebolavirus,代表病毒Ebola virus,简称EBOV)、苏丹型(Sudan ebolavirus,代表病毒Sudan virus,简称SUDV)、本迪布焦型(Bundibugyo ebolavirus,代表病毒Bundibugyovirus,简称BDBV)、泰森林型(

Forest ebolavirus,代表病毒

Forest virus,简称TAFV)和莱斯顿型(Reston ebolavirus,代表病毒Reston virus,简称RESTV)，其中扎伊尔型恶性程度最强，死亡率高达90％，是引起2014年西非埃博拉疫情的病毒亚型。马尔堡病毒属目前确定1种亚型，即马尔堡型(Marburg marburgvirus,代表病毒Marburg virus,简称MARV)。奎瓦病毒属目前确定1种亚型，即Lloviu型(Lloviu cuevavirus,代表病毒Lloviuvirus,简称LLOV)。

埃博拉病毒病和马尔堡病毒病是人畜共患病，人类和灵长类动物普遍易感，主要爆发于非洲地区，美国、英国、瑞士和中东曾报道有输入病例。临床症状是突然高烧、头痛、肌痛、恶心呕吐、腹泻等，最终病人死于多器官出血衰竭、组织坏死[Streether LA.Ebolavirus.Br J Biomed Sci.1999；56(4):280-284.]。

目前全球唯一获批的埃博拉疫苗是由我国研发的人5型腺病毒载体-2014基因型埃博拉疫苗(Ad5-EBOV)[Zhu FC,Wurie AH,Hou LH,Liang Q,Li YH,Russell JB,Wu SP,LiJX,Hu YM,Guo Q,Xu WB,Wurie AR,Wang WJ,Zhang Z,Yin WJ,Ghazzawi M,Zhang X,DuanL,Wang JZ,Chen W.Safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5vector-based Ebola vaccine in healthy adults in Sierra Leone:a single-centre,randomised,double-blind,placebo-controlled,phase 2trial.Lancet.2017；389(10069):621-628.]，于2017年获CFDA批准。目前尚无FDA批准的针对丝状病毒的有效治疗疫苗和药物。2018年5月在非洲爆发了新一轮埃博拉疫情，WHO分别于2018年5月和6月批准了1种实验性疫苗(rVSVΔG-ZEBOV)和5种实验性药物(ZMapp,REGN3470-3471-3479,mAb114,Remdesivir和Favipiravir)作为同情性治疗使用[WHO supports Ebolavaccination of high risk populations in the Democratic Republic of theCongo.21May 2018.Ebola treatments approved for compassionate use in currentoutbreak.6June 2018.]，但根据2018年10月26日的病例总结看，此次埃博拉疫情已造成168人死亡，死亡率63％[WHO.Ebola situation reports:Democratic Republic of theCongo.Latest numbers as of 26October 2018.]。

现有数据表明病人的生存率与病毒量密切相关，当病毒量低于10^4.5pfu/ml血液的病人存活率大大提高[Geisbert TW,Hensley LE,Larsen T,et al.Pathogenesis ofEbola haemorrhagic fever incynomolgus macaques:evidence that dendritic cellsare early and sustained targets of infection.Am J Pathol.2003；163:2347-2370.]。因此，尽量降低病毒复制速度，让宿主的先天和后天免疫应答来克服感染是抗丝状病毒药物研发的重要策略，阻断丝状病毒进入的抑制剂研发有重大意义。

以宿主为靶点进行抗病毒药物筛选是当前病毒学研究领域的热点。病毒进入宿主细胞需要依靠病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用。丝状病毒表面糖蛋白(Glycoprotein,GP)是唯一负责病毒进入宿主的病毒蛋白。针对丝状病毒进入宿主的过程，在2005年和2011年分别发现细胞内含体/溶酶体中的组织蛋白酶B(Cathepsin B)和NPC1蛋白(Niemann PickC1)是宿主应答丝状病毒侵入的关键因子。另外，2014年报道细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸受体AXL也是EBOV进入过程相关的重要宿主因子[Kartik Chandran et al.EndosomalProteolysis of the Ebola Virus Glycoprotein Is Necessary forInfection.Science.2005；308:1643-1645.Carette JE,Raaben M,Wong AC,Herbert AS,Obernosterer G,Mulherkar N,Kuehne AI,Kranzusch PJ,Griffin AM,Ruthel G,Dal CinP,Dye JM,Whelan SP,Chandran K,Brummelkamp TR.Ebola virus entry requires thecholesterol transporter Niemann–Pick C1.Nature.2011；477(7364):340-343.Morizono K,Chen IS.Role of phosphatidylserine receptors in envelopedvirus infection.J Virol.2014；88(8):4275-4290.]。

香紫苏醇(结构式I)是一种芳香化合物，属于双环二萜醇，来源于唇形科植物香紫苏(Salvia Sclare L.)的花序及茎叶，是香紫苏油和香紫苏浸膏中的重要成分，是合成龙涎香等名贵香料的原料，主要用于香紫苏内酯(结构式II)及降龙涎醚等天然龙涎香代用品的合成，香气细腻且气味持久，可作为添加剂用于香精、香水、香料、香烟、化妆品、葡萄酒、保健食品等的调配。香紫苏醇还具有抗真菌活性[van den

S,Müller A,Fleming AJ,Smart CC.The ABC transporter SpTUR2confers resistance to the antifungalditerpene sclareol.Plant J.2002；30(6):649-662.]，抗细菌活性[Ouyang P,Sun M,HeX,Wang K,Yin Z,Fu H,Li Y,Geng Y,Shu G,He C,Liang X,Lai W,Li L,Zou Y,Song X,Yin L.Sclareol protects Staphylococcus aureus-induced lung cell injury viainhibiting alpha-hemolysin expression.J.Microbiol.Biotechnol.2017；27(1),19-25.]，抗肿瘤活性[Sashidhara KV,Rosaiah JN,Kumar A,Bid HK,Konwar R,Chattopadhyay N.Cell growth inhibitory action of an unusual labdanediterpene,13-epi-sclareol in breast and uterine cancers in vitro.PhytotherRes.2007；21(11):1105-1108.]，抗炎活性[Huang GJ,Pan CH,Wu CH.Sclareol exhibitsanti-inflammatory activity in both lipopolysaccharide-stimulated macrophagesand theλ-carrageenan-induced paw edema model.J Nat Prod.2012；75(1):54-59.]，抗光老化活性[Lee S,Shin S,Jung E,Park D.Cell-based assay system for high-throughput screening of anti-photo-aging agents in fibroblast transfectants.Cytotechnology.2016；68(4):1633-1640.]。香紫苏内酯(结构式II)也是一种芳香化合物，广泛用于食品工业，尤其作为烟草增香矫味剂、甜味食品调味剂、咖啡增味剂等广泛使用。已有报道香紫苏内酯具有抗肿瘤活性[Duca G,Aricu A,Kuchkova K,Secara E,Barba A,Dragalin I,Ungur N,Spengler G.Sclareolide enhances gemcitabine induced celldeath through mediating the NICD and Gli1pathways in gemcitabine resistanthuman pancreatic cancer.Mol Med Rep.2017；15(4):1461-1470.]。

虽然已报道香紫苏醇和香紫苏内酯具有多种抗真菌抗肿瘤等作用，但经文献检索未见有对其抗病毒活性的报道(包括丝状病毒和其他种类病毒)。

本发明是基于应用埃博拉病毒感染模型对350个天然产物进行普筛，发现香紫苏醇和香紫苏内酯可阻断埃博拉病毒感染宿主细胞。我们又应用马尔堡病毒感染模型和奎瓦病毒感染模型评价了香紫苏醇和香紫苏内酯，发现香紫苏醇和香紫苏内酯也可有效抑制马尔堡病毒和奎瓦病毒的感染。我们判断香紫苏醇和香紫苏内酯具有可阻断丝状病毒感染的作用。

发明内容

本发明解决的技术问题是，提供香紫苏醇和香紫苏内酯在制备预防或治疗丝状病毒感染的药物中的应用。

所述的丝状病毒包括但不限定于埃博拉病毒。

所述的丝状病毒包括但不限定于马尔堡病毒。

所述的丝状病毒包括但不限定于奎瓦病毒。

所述的埃博拉病毒包括扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型、泰森林型和莱斯顿型。

具体而言，为解决本发明的技术问题，采用如下技术方案：

本发明提供了如结构式(I)所示的香紫苏醇及其药学上可接受的盐和如结构式(II)所示的香紫苏内酯及其药学上可接受的盐在预防或治疗丝状病毒感染的药物中的应用

进一步的，所述的丝状病毒包括埃博拉病毒、马尔堡病毒、奎瓦病毒。所述的埃博拉病毒包括扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型、泰森林型和莱斯顿型。

本发明还提供了一种药物组合物在制备抗丝状病毒药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物是以结构式(I)所示的香紫苏醇或其药学上可接受的盐或以结构式(II)所示的香紫苏内酯或其药学上可接受的盐作为有效成分的药物组合物

进一步的，所述的药物组合物还含有其他的抗病毒药。

所述的丝状病毒包括埃博拉病毒、马尔堡病毒、奎瓦病毒。所述的埃博拉病毒包括扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型、泰森林型和莱斯顿型。

该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其他添加剂。

本发明的发明人发现香紫苏醇和香紫苏内酯可特异性地阻断丝状病毒感染宿主细胞。还可以和其他的抗病毒药物进行联合用药。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/kg体重，优选为0.1-100mg/kg体重，更优选为1-60mg/kg体重，最优选为2-30mg/kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其他治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

有益技术效果

香紫苏醇和香紫苏内酯是常用于香精、香水、香料、香烟、化妆品、葡萄酒、保健食品的添加剂，其安全性、毒副作用等均已明确。本发明发现香紫苏醇和香紫苏内酯具有抗丝状病毒的新用途将可快速使其应用于高危病毒感染，缓解疫情。

附图说明

图1.扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、泰森林型埃博拉病毒、马尔堡病毒和奎瓦病毒感染模型。

图2.香紫苏醇、香紫苏内酯阻断扎伊尔型埃博拉病毒感染活性。

图3.香紫苏醇、香紫苏内酯阻断苏丹型埃博拉病毒感染活性。

图4.香紫苏醇、香紫苏内酯阻断泰森林型埃博拉病毒感染活性。

图5.香紫苏醇、香紫苏内酯阻断马尔堡病毒感染活性。

图6.香紫苏醇、香紫苏内酯阻断奎瓦病毒感染活性。

图7.丝状病毒糖蛋白GP基因进化树。

具体实施方式

实施例1.筛选模型的原理

丝状病毒进入宿主细胞是病毒感染的第一步，抑制病毒的进入就可有效阻断病毒感染。丝状病毒包膜表面的糖蛋白(Glycoprotein，GP)是丝状病毒进入过程的关键蛋白。

我们合成了扎伊尔型埃博拉病毒的包膜GP基因(EBOV-GP，Gene AccessionNo.L11365)、苏丹型埃博拉病毒包膜GP基因(SUDV-GP,Gene Accession No.FJ968794.1)、泰森林型埃博拉病毒包膜GP基因(TAFV-GP,Gene Accession No.FJ217162.1)、马尔堡病毒包膜GP基因(Marburg-GP,Gene Accession No.NC_001608.3)和奎瓦病毒包膜GP基因(Cueva-GP,Gene Accession No.JF828358)。通过共转染表达GP蛋白质粒和pNL4-3-Luc-R^-E^-，可获得丝状病毒GP为外壳包裹HIV核心的丝状重组病毒HIV/Filovirus-GP[Chen Q,Tang K,Zhang X,Chen P,Guo Y.Establishment of pseudovirus infection mousemodels for in vivo pharmacodynamics evaluation of filovirus entryinhibitors.Acta Pharm Sin B.2018；8(2):200-208.]。该病毒颗粒具有以下特点：1)病毒对宿主细胞的选择性取决于GP的特性；2)由于HIV载体上env、nef和vpr基因缺失，因此该病毒只能一次性进入宿主细胞并且不能复制，所以该病毒是安全的；3)该HIV载体上带有一个荧光素酶报告基因，因此被感染的细胞会表达荧光素酶，通过检测荧光素酶活性就可标示细胞被病毒感染的程度。模型构建结果见图1。

实施例2.香紫苏醇和香紫苏内酯对丝状重组病毒感染的抑制作用

在本发明中应用了扎伊尔型埃博拉病毒(EBOV,Gene Accession No.L11365)、苏丹型埃博拉病毒(SUDV,Gene Accession No.FJ968794.1)、泰森林型埃博拉病毒(TAFV,Gene Accession No.FJ217162.1)、马尔堡病毒(Gene Accession No.NC_001608.3)和奎瓦病毒(Gene Accession No.JF828358)对香紫苏醇和香紫苏内酯的抗丝状病毒感染作用进行药理活性评价：

重组病毒制备[Chen Q,Tang K,Zhang X,Chen P,Guo Y.Establishment ofpseudovirus infection mouse models for in vivo pharmacodynamics evaluation offilovirus entry inhibitors.Acta Pharm Sin B.2018；8(2):200-208.]：共转染2μgpcDNA3.1/EBOV-GP质粒(或2μg pcDNA3.1/SUDV-GP质粒或2μg pcDNA3.1/TAFV-GP质粒或2μg pcDNA3.1/Marburg-GP质粒或2μg pcDNA3.1/Cueva-GP质粒)和2μg pNL4-3-Luc-R^-E^-质粒至293T细胞，转染后48h收集上清，上清液经0.45μm滤膜过滤，该上清中含有扎伊尔型埃博拉病毒颗粒(HIV/EBOV-GP)或苏丹型埃博拉病毒颗粒(HIV/SUDV-GP)或泰森林型埃博拉病毒颗粒(HIV/TAFV-GP)或马尔堡病毒颗粒(HIV/Marburg-GP)或奎瓦病毒颗粒(HIV/Cueva-GP)，重组病毒可用于感染。

感染[Chen Q,Tang K,Zhang X,Chen P,Guo Y.Establishment of pseudovirusinfection mouse models for in vivo pharmacodynamics evaluation of filovirusentry inhibitors.Acta Pharm Sin B.2018；8(2):200-208.]：感染前一天，按每孔6×10⁴个细胞的密度将293T细胞接种到24孔板上。用DMSO溶解阳性对照化合物或待筛选化合物，感染前15分钟加入细胞培养液中，以DMSO溶剂作空白对照。加入适宜稀释度的病毒液感染细胞。感染48小时后，弃去上清，然后向被感染的细胞每孔加入50μl细胞裂解液(Promega)裂解细胞，将30μl荧光素酶底物(Promega)与20μl细胞裂解液混合后用FB15荧光检测器(Sirius)仪器测定细胞荧光素酶的相对活性，其活性的强弱反映了病毒的感染的水平。结果显示，香紫苏醇和香紫苏内酯可有效抑制丝状病毒对宿主细胞的感染，结果见表1，量效曲线见图2-6。

表1香紫苏醇和香紫苏内酯对丝状重组病毒感染的抑制作用

Claims

1.如结构式(I)所示的香紫苏醇及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗埃博拉病毒、马尔堡病毒或奎瓦病毒感染的药物中的应用

2.一种药物组合物在制备抗埃博拉病毒、马尔堡病毒或奎瓦病毒药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物是以结构式(I)所示的香紫苏醇或其药学上可接受的盐作为有效成分的药物组合物

3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述的药物组合物还含有其他的抗病毒药。

4.根据权利要求1-3任一项的应用，其特征在于，所述的埃博拉病毒选自扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型、泰森林型和莱斯顿型。

5.如结构式(II)所示的香紫苏内酯及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗埃博拉病毒、马尔堡病毒或奎瓦病毒感染的药物中的应用

6.一种药物组合物在制备抗埃博拉病毒、马尔堡病毒或奎瓦病毒药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物是以结构式(II)所示的香紫苏内酯或其药学上可接受的盐作为有效成分的药物组合物

7.根据权利要求6的应用，其特征在于，所述的药物组合物还含有其他的抗病毒药。

8.根据权利要求5-7任一项的应用，其特征在于，所述的埃博拉病毒选自扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型、泰森林型和莱斯顿型。