CN117126906A

CN117126906A - 大豆分离蛋白的改性方法、改性大豆分离蛋白及其应用

Info

Publication number: CN117126906A
Application number: CN202310865441.7A
Authority: CN
Inventors: 刘军; 张文静; 张伟; 程永强
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2023-07-13
Filing date: 2023-07-13
Publication date: 2023-11-28

Abstract

本申请涉及一种大豆分离蛋白的改性方法、改性大豆分离蛋白及其应用。本申请提供的大豆分离蛋白的改性方法包括将活化后的食用菌菌丝体接种于含有大豆分离蛋白的液体培养基中，使大豆分离蛋白进行液态发酵。本申请通过食用菌液态发酵的方法对大豆分离蛋白进行处理，在提高SPI功能特性的基础上，使得其风味特征得到了进一步的改善。

Description

大豆分离蛋白的改性方法、改性大豆分离蛋白及其应用

技术领域

本申请涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种大豆分离蛋白的改性方法、改性大豆分离蛋白及其应用。

背景技术

大豆分离蛋白(soy protein isolate，SPI)中蛋白质含量超过90％，氨基酸平衡性好，不含胆固醇，是一种理想的植物蛋白来源。大豆蛋白的功能性质指的是除了蛋白本身具有的营养价值外，仍具有的可以改善食品特性的物理化学性质(如大豆蛋白的溶解性、乳化性、起泡性、凝胶性等)，使其在食品加工领域有着广泛的应用，如利用大豆蛋白较高的营养价值和较好的溶解性加工生产植物蛋白饮料，利用大豆蛋白乳化性在肉制品制作过程中起到乳化作用。除此之外，大豆蛋白还广泛应用于乳剂乳制品、速食方便食品、冷冻及速冻食品等众多食品产业。蛋白质改性处理能够改变蛋白质的理化性质，进而赋予蛋白质最佳的专项功能或同时兼具多种加工功能特性。蛋白质改性处理主要是通过物理或者生化的方法改变蛋白质的结构，使氨基酸的残基与多肽链的排列次序发生变化，从而达到改善蛋白质功能特性的目的。

目前针对大豆蛋白改性的研究方法仍然集中于物理方法、化学方法和酶法改性，如热处理、超声波处理、高压均质处理、接枝改性、交联改性和糖基化等，然而物理改性不会改变蛋白质的以及结构，因此改善功能特性的效果并不突出；化学改性则存在化学试剂残留、反应副产物多等安全因素，而酶法改性蛋白的各项技术还未发展成熟。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本申请提供了一种大豆分离蛋白的生物发酵改性方法。本申请通过食用菌液态发酵的方法对大豆分离蛋白进行处理，在提高SPI功能特性的基础上，使得其风味特征得到了进一步的改善。

第一方面，本申请提供了一种大豆分离蛋白的改性方法，其包括将活化后的食用菌菌丝体接种于含有大豆分离蛋白的液体培养基中，使大豆分离蛋白进行液态发酵。

本申请通过采用食用菌菌丝液态发酵技术对大豆分离蛋白进行改性，一方面过发酵过程中产生的酶水解作用，部分降解大豆分离蛋白改善了其功能特性(溶解性、起泡性以及乳化性)，另一方面，与固态发酵相比，食用菌菌丝体液态发酵后得到的大豆分离蛋白产物降解水平均一，在菌丝体均匀降解与次级代谢产物共同作用的基础上，能够有效改善其风味特征，提高了其感官接受度。

在一些实施方式中，所述食用菌选自食用真菌中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述食用菌选自羊肚菌、香菇、猴菇、栗蘑和白蘑中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述液体培养基包括大豆分离蛋白、葡萄糖和水。

在一些实施方式中，所述液体培养基中，大豆分离蛋白的质量浓度为2％-8％，例如为2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％或它们之间的任意值。在一些实施方式中，所述液体培养基中，大豆分离蛋白的质量浓度为3％-7％。

在一些实施方式中，所述液体培养基中，葡萄糖的质量浓度为0.5％-5％，例如为1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或它们之间的任意值。在一些实施方式中，所述液体培养基中，葡萄糖的质量浓度为1％-3％。

在一些实施方式中，所述食用菌菌丝体的接种量为2g/L-16g/L，例如为3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L或它们之间的任意值。在一些实施方式中，所述食用菌菌丝体的接种量为5g/L-10g/L。

在一些实施方式中，所述活化后的食用菌选自在PDA固体培养基中活化和扩培的食用菌菌丝体。在一些实施方式中，所述活化和扩培的温度为23℃-26℃，例如为24℃或25℃。在一些实施方式中，活化的时间为3天-7天，例如5天。在一些实施方式中，扩培的时间为7天-12天，例如10天。

在一些实施方式中，PDA固体培养基的制备包括1.5g/L MgSO₄，1.5g/L KH₂PO₄，30mg/L维生素B1，20g/L琼脂，于121℃灭菌15min后倒平板静置冷却。

在一些实施方式中，所述液态发酵的温度为23℃-26℃，例如为24℃或25℃。在一些实施方式中，所述液态发酵的时间为2天-15天，例如为3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。

本申请中，若无特别说明，所述活化、扩培和发酵时采用的培养基均时灭菌处理后的培养基。

在一些实施方式中，所述改性方法还包括将液态发酵后的产物进行干燥处理和粉碎处理。

在一些实施方式中，所述大豆分离蛋白的改性方法包括以下具体步骤：

S1：食用菌活化与培养：将食用菌的菌丝体于PDA培养基(1.5g/L MgSO4，1.5g/LKH2PO4，30mg/L维生素B1，20g/L琼脂，于121℃灭菌15min后倒平板静置冷却)中进行活化。

S2：菌丝体液态发酵SPI：将大豆分离蛋白与去离子水混合均匀，自然pH下，灭菌冷却后于超净工作台中混合葡萄糖溶液，使最终培养基中的SPI浓度例如为5％，葡萄糖浓度例如为2％。灭菌冷却后的培养基每份接入活化后的菌块例如接入4个直径7.8mm活化培养10d的。接种完毕后的液态培养基于摇床中培养。

S3：发酵至2天、3天、4天和6天时取样并冻存于例如-40℃冻存，待全部取样完成后进行干燥处理例如-50℃冻干处理。

第二方面，本申请提供了第一方面所述的改性方法得到的改性大豆分离蛋白。

第三方面，本申请提供了第二方面所述的改性大豆分离蛋白在食品添加剂中的应用。

本申请的有益效果是：

本申请通过食用菌液态发酵的方法对大豆分离蛋白进行处理，在提高SPI功能特性(溶解性、乳化性、乳化稳定性、起泡性、起泡稳定性)的基础上，使得其风味特征(游离氨基酸、呈味核苷酸、电子鼻、电子舌、挥发性风味物质等)得到了进一步的改善。

附图说明

图1示出了实施例1-4的改性SPI与对比例1的SPI呈味核苷酸的含量；

图2示出了实施例1-4的改性SPI与对比例1的SPI的电子鼻数据雷达指纹图谱；

图3示出了实施例1-4的改性SPI与对比例1的SPI的电子舌数据雷达指纹图谱；

图4示出了实施例1-4的改性SPI与对比例1的SPI的溶解度；

图5示出了实施例1-4的改性SPI与对比例1的SPI的乳化性(ECI)及乳化稳定性(ESI)测试结果；

图6示出了实施例1-4的改性SPI与对比例1的SPI的起泡性(FC)及起泡稳定性(FS)测试结果；

图7为对比例2的固态发酵后的SPI样品图，其中，从左到右分别为白蘑发酵，羊肚菌发酵，香菇发酵，猴菇发酵；

图中：

SPI代表对比例1的未做任何处理的SPI；

香菇-2d代表实施例1的发酵2天的改性SPI；

香菇-4d代表实施例1的发酵4天的改性SPI；

羊肚-2d代表实施例2的发酵2天的改性SPI；

羊肚-4d代表实施例2的发酵4天的改性SPI；

白蘑-2d代表实施例3的发酵2天的改性SPI；

白蘑-4d代表实施例3的发酵4天的改性SPI；

猴菇-2d代表实施例4的发酵2天的改性SPI；

猴菇-4d代表实施例4的发酵4天的改性SPI；

图2和图3中，0-9分别表示：0代表对比例1未处理的SPI；1表示实施例4的猴菇发酵2d的SPI；2表示实施例1的香菇发酵2d的SPI；3表示实施例4的猴菇发酵4d的SPI；4表示实施例1的香菇发酵4d的SPI；5表示实施例2的羊肚菌发酵2d的SPI；6＝表示实施例2的羊肚菌发酵4d的SPI；7表示实施例3的白蘑发酵2d的SPI；8表示实施例3的白蘑发酵4d的SPI；9表示实施例3的白蘑发酵6d的SPI。

图中，不同字母表示Tukey的HSD测试有显著性差异(p＜0.05)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。

实施例1.使用香菇菌丝体发酵制备改性大豆分离蛋白

取-4℃下保存的香菇斜面(Lentinus edodes，天津市农业科学院提供)恢复至室温，挑取一定量的菌丝体使用PDA平板(1.5g/L MgSO₄，1.5g/L KH₂PO₄，30mg/L维生素B1，20g/L琼脂)活化(23～26℃，5d)并扩培(23-26℃，10d)香菇菌丝体。

称取一定量大豆分离蛋白与去离子水混合均匀，自然pH下，121℃灭菌15min，冷却后于超净工作台中混合一定浓度的葡萄糖溶液，得到灭菌后的大豆分离蛋白培养基(培养基中SPI 5％，葡萄糖2％)。每份冷却后的培养基接入活化培养10d的菌丝体块，其中菌丝接种量为10g/L。

接种完毕后的液态培养基于25℃，120rpm摇床中培养4～6d，发酵完毕后干燥粉碎后过筛即可获得香菇菌丝体发酵改性后的大豆分离蛋白。

实施例2.使用羊肚菌菌丝体发酵制备改性大豆分离蛋白

取-4℃下保存的羊肚菌斜面(Morchella esculenta，由天津市农业科学院提供)恢复至室温，挑取一定量的菌丝体使用PDA平板(1.5g/L MgSO₄，1.5g/L KH₂PO₄，30mg/L维生素B1，20g/L琼脂)活化(23～26℃，5d)并扩培(23-26℃，10d)羊肚菌菌丝体。

称取一定量大豆分离蛋白与去离子水混合均匀，自然pH下，121℃灭菌15min，冷却后于超净工作台中混合一定浓度的葡萄糖溶液，得到灭菌大豆分离蛋白培养基(培养基中SPI 5％，葡萄糖2％)，每份冷却后的培养基接入活化培养10d的菌丝体块，菌丝接种量为10g/L。

接种完毕后的液态培养基于25℃，120rpm摇床中培养4～6d，发酵完毕干燥粉碎后过筛即可获得羊肚菌菌丝体发酵改性后的大豆分离蛋白。

实施例3.使用白蘑菌丝体发酵制备改性大豆分离蛋白

取-4℃下保存的白蘑斜面(Tricholoma mongolicum Imai，由天津市农业科学院提供)恢复至室温，挑取一定量的菌丝体使用PDA平板(1.5g/L MgSO₄，1.5g/L KH₂PO₄，30mg/L维生素B1，20g/L琼脂)活化(23～26℃，5d)并扩培(23-26℃，10d)白蘑菌丝体。

称取一定量大豆分离蛋白与去离子水混合均匀，自然pH下，121℃灭菌15min，冷却后于超净工作台中混合一定浓度的葡萄糖溶液，得到灭菌大豆分离蛋白培养基(培养基中SPI 5％，葡萄糖2％)，每份冷却后的培养基接入活化培养10d的菌丝体块，其中菌丝接种量为10g/L。

接种完毕后的液态培养基于25℃，120rpm摇床中培养4～6d，发酵完毕后干燥即可获得白蘑菌丝体发酵改性后的大豆分离蛋白。

实施例4.使用猴菇菌丝体发酵制备改性大豆分离蛋白

取-4℃下保存的猴菇斜面(Hericium erinaceus，由天津市农业科学院提供)恢复至室温，挑取一定量的菌丝体使用PDA平板(1.5g/L MgSO₄，1.5g/L KH₂PO₄，30mg/L维生素B1，20g/L琼脂)活化(23～26℃，5d)并扩培(23-26℃，10d)猴菇菌丝体。

称取一定量大豆分离蛋白与去离子水混合均匀，自然pH下，121℃灭菌15min，冷却后于超净工作台中混合一定浓度的葡萄糖溶液，得到灭菌大豆分离蛋白培养基(培养基中SPI 5％，葡萄糖2％)。每份冷却后的培养基接入活化培养10d的菌丝体块，其中菌丝接种量为10g/L。

接种完毕后的液态培养基于25℃，120rpm摇床中培养4～6d，发酵完毕后干燥粉碎后过筛即可获得猴菇菌丝体发酵改性后的大豆分离蛋白。

实施例5

实施例5与实施例1的区别在于接种的菌丝接种量不同，具体的：实施例5中培养基接入活化培养10d的菌丝体块，其中菌丝接种量为2g/L。

实施例6

实施例6与实施例2的区别在于接种的菌丝接种量不同，具体的：实施例6中培养基接入活化培养10d的菌丝体块，其中，菌丝接种量为4g/L。

实施例7

实施例7与实施例3的区别在于接种的菌丝接种量不同，具体的：实施例7中培养基接入活化培养10d的菌丝体块，其中菌丝接种量为12g/L。

实施例8

实施例8与实施例4的区别在于接种的菌丝接种量不同，具体的：实施例8中培养基接入活化培养10d的菌丝体块，其中菌丝接种量为16g/L。

对比例1

未做任何处理的大豆分离蛋白。

对比例2

固态发酵实验操作：

一、实验材料

菌种：香菇、羊肚菌、白蘑、猴菇菌(与实施例1-4中的菌种相同)；

发酵原料：国产大豆分离蛋白；

种子培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉1％，MgSO₄·7H₂O 0.075％，KH₂PO₄0.12％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，自然pH，121℃灭菌20min。

固态发酵培养基：大豆蛋白粉15g，葡萄糖4％(配制浓度为6％的葡萄糖溶液，灭菌后每15g蛋白粉中加10mL)，蛋白粉与种子液比为1:1。

二、大豆分离蛋白固态发酵

1.种子液培养

从活化好的PDA平板培养基(1.5g/L MgSO₄，1.5g/L KH₂PO₄，30mg/L维生素B1，20g/L琼脂)中取出3块直径7.8mm的圆形菌体接入到装有30mL液体种子培养基的100mL三角瓶中，于27℃，160rpm恒温摇床培养7d制得发酵种子液备用。

2.四种食用菌固态发酵大豆分离蛋白

将10mL灭菌后的6％葡萄糖溶液与25g大豆蛋白粉混合并搅拌均匀，加入发酵后的种子液5mL，使用玻璃棒搅拌均匀后，于25℃培养箱中恒温静置发酵10d，期间观察菌丝体长势及大豆蛋白粉的变化。

3.固态发酵后蛋白样品制备

取发酵后的大豆蛋白粉平铺于玻璃平皿上，置于60℃烘箱中烘干至恒重，烘干后的发酵大豆蛋白样品研磨成粉。

性能测试

一、风味特征

1、游离氨基酸测定

称取50.0mg冻干粉加入1.5mL的去离子水中，在25℃超声提取30min；后，12000×g离心10min后，将0.65mL上清与0.65mL磺基水杨酸(8％，w/v)混合均匀，于25℃黑暗条件下孵育30min；12000×g离心10min，上清过0.22μm滤膜，使用氨基酸分析仪测定游离氨基酸组成及含量。

2、呈味核苷酸测定

将样品(2.500g)和10mL预冷的10％高氯酸加入单独的50mL离心管中，随后均质化，超声处理5分钟，并在4℃下以10614 ×g离心15分钟。收集上清液，用5％高氯酸5mL沉淀，再次离心，重新收集上清液。最后合并两种上清液样品，用6mol/L KOH调节pH至6.5。将溶液在4℃下静置0.5小时，使用超纯水将整个上清液体积调节至50mL，摇匀，并通过0.22μm滤膜过滤。

使用惰性ODS-3C18(4.6mm×250mm，5μm，GL Sciences Inc.，日本东京)色谱柱通过高效液相色谱(HPLC)分析样品。设置以下测试参数：流动相A，甲醇溶液；流动相B，0.02mol/L磷酸二氢钾和磷酸氢二钾溶液，用磷酸调节pH至6.5；等度洗脱；流速，1毫升/分钟；柱温，28℃；进样体积，10μL；检测波长，254nm。

3、电子舌分析

使用电子舌(TS-5000Z，Intelligent Sensor Tech-nologies，Inc.，Kanagawa-Pref.，Japan)检测发酵羊肚菌发酵SPI的味道特征，将发酵后的冻干粉配制成1mg/mL的蛋白溶液，使用标准滤纸过滤后，置于电子仪器的采样托盘中，用于数据采集。

4、电子鼻分析

每个样品测量一式三份，将1mL发酵后的产物，置于10mL玻璃小瓶中，在顶空加热至60℃，10min，采集时间为120s，使用基于不同材料制成的气体传感器的电子鼻系统(AIRSENSE-PEN3，德国)表征发酵产物的挥发性气味，使用清洁空气作为载气，通过连接到针头的特氟龙管，以100mL/min的恒定速率将来自小瓶顶部空间的样品气体泵入传感器室。

5、FSPI风味评价

人的嗅觉对不同挥发性有机化合物的感知阈值不同，因此对大豆蛋白的挥发性风味评价需要人类的感官评价进行综合判定，感官评价方法如下：

风味：称取1g样品放在25mL的干净玻璃罐中，盖上盖子，试验小组成员通过3次轻叩玻璃罐以振动产品，使蛋白粉在罐内轻微扬起，然后打开盖子，细嗅3次，打分。

感官小组由9名拥有SGS感官评价资质的人员组成，豆腥味参照物为灭菌处理后的大豆分离蛋白。评价后，除去最高值和最低值，计算平均值进行分析。评价表如表1所示。

表1感官评价表

6、可溶性糖测定

精确称取50mg样品，加入5mL80％乙醇，充分混匀，室温振荡45min，过滤。残渣再用2.5mL 80％乙醇洗涤5次，合并上清液，减压旋转燕发(40℃)浓缩，去离子水定容至10mL。样品稀释至适宜浓度，以不同浓度的甘露醇、海藻糖和阿糖醇标准品做外标，过0.22μm微孔滤膜上机测试。

采用阴离子色谱法，色谱条件：Dionex ICS2500系统，包括：四元梯度泵、ED50A电化学检测器(金电极)、LC30柱温箱；进样量25μL；Chromeleon 6.0色谱工作站；CarboPacPA-20阴离子交换分析(150mmx3mm):0.45L/in的流速，柱温30℃；流动相为纯水和0.25MNaOH。

二、功能特性

7、溶解度的测定

将发酵后的大豆分离蛋白20mg溶解于10ml去离子水中，配制成终浓度为0.2％(w/v)的蛋白样品溶液，室温下搅拌1h充分水合；10000g离心10min，将上清稀释至合适倍数后，采用BCA法测定上清中蛋白质浓度。蛋白质的溶解度表示为上清液蛋白含量占总蛋白含量的百分比(％)。

8、乳化性及乳化稳定性测定

使用0.2mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)配制浓度为0.5％(m/v)的大豆分离蛋白溶液12mL，加入4mL大豆色拉油，混合后，用高速分散机在10000rpm转速下乳化2min，乳化过程中样品始终处于冰水浴。

乳状液制备结束后立即从底部吸取乳状液50μL加入5mL 1.0g/L的SDS溶液中，混匀后在500nm下测定溶液吸光度，记为A₀，均质后静置60min，从溶液底部吸取50μL加入5mL1.0g/L的SDS溶液中，混匀后在500nm下测定溶液吸光度，记为A₆₀，按下式计算乳化性(ECI)和乳化稳定性(ESI)：

其中：

T＝2.303；

N：稀释倍数100；

C：乳化液形成前蛋白质浓度(g/mL)

U：乳化液中油的体积分数0.25。

9、起泡性及稳定性测定

称取一定质量的冻干SPI样品配制成浓度为1％(w/v)的溶液，取20mL该浓度的SPI溶液倒入100mL的烧杯中，在转速为10000rpm的条件下用高速均质机不间断的搅打2mim搅打结束后立即用量筒测量此时的泡沫高度记为V₁，后再次测定其泡沫高度记为V₂。

起泡能力(Foaming capacity)公式如下：

FC(％)＝(V₁-20)/20×100％

泡沫稳定性(Foaming stability)公式如下：

FS(％)＝(V₂-20)/(V₁-20)×100％

测试结果

1、发酵后风味评分

表2

2、发酵后可溶性糖的变化

表3

注：数据单位：mg/g；-代表未检出

表3中，实施例1-实施例4的测试的样品为发酵6d的大豆分离蛋白。

从表3结果中可知，不同菌丝体发酵处理对可溶性糖的存在种类和含量均有影响，大豆分离蛋白使用香菇、羊肚、白蘑和猴菇发酵后，可溶性糖含量均有所增加，种类也有所不同。可溶性糖是产生甜味的重要成分，不同的菌丝体在生长过程中产生不同类型的可溶性糖，对于大豆分离蛋白的风味特征具有良好的改善效果

3、发酵后游离氨基酸的变化

表4

注：*必需氨基酸(essential amino acid，EAA)，**半必需氨基酸(emi-essentialamino acid，HEAA)，***总氨基酸(total amino acid，AA)。单位：μg/mL

游离氨基酸是食材中的主要呈味物质之一，食材的风味与口感与其呈味氨基酸的含量的比例密切相关。由上表可知菌丝体发酵处理大度分离蛋白显著增加了呈鲜味、呈甜味的游离氨基酸含量，其中猴菇发酵的样品中总鲜味氨基酸的含量达到了8.16±0.87μg/mL，羊肚菌发酵的样品中甜味氨基酸含量达到了34.07±3.16μg/mL，较高浓度的甜味氨基酸不仅能够掩盖苦涩味，同时能够与鲜味氨基酸一同发挥协同作用，起到增香增鲜的效果，进而达到改善大豆分离蛋白整体风味特征的效果。

4、发酵后呈味核苷酸(I+G)的变化

5’-肌苷酸(I)和5’-鸟苷酸(G)是食用菌生长代谢过程中最主要的鲜味核苷酸，结果表明，菌丝体发酵可以显著提高大豆分离蛋白中呈味核苷酸的含量(结果见图1)，与未发酵的大豆蛋白样品相比，菌丝体生长代谢产生一系列鲜味物质，有利于提高大豆分离蛋白的风味特征，研究结果为植物蛋白相关风味产品的开发提供了有力的理论基础和实践依据。

5、发酵后主要挥发性成分的变化

表5

注-代表未检出

从上表可以看出：未做任何处理的样品中，1-辛烯-3醇、1-己醇、酯和醛是主要成分，1-辛烯-3-醇的相对含量为30.17％，主要由脂肪氧化产生，具有令人不愉快的油腻味道，由于具有较低的气味阈值，是大豆分离蛋白中不良风味的主要贡献成分。

发酵后的大豆分离蛋白样品的3-己醇、2-己醇、1-戊醇、1-己醇、3，5-辛二烯-2-醇、1-辛烯-3-醇、1-庚醇、1-癸烯-4-醇的相对含量不同程度地降低。其中发酵处理后的大豆主要气味成分1-辛烯-3-醇的相对含量从30.17％显著降低至13.10％，表明大豆中的不良风味显著减少。食用菌具有丰富的挥发性呈味物质，主要为酸类、呋喃和吡嗪等杂环和芳香族类物质，不同类型的蘑菇菌丝体发酵大豆分离蛋白具有蘑菇特征的的挥发性风味化合物，如发酵后的大豆分离蛋白样品中1-辛烯-3-醇的含量显著增加，其具有标志性的蘑菇、泥土和玫瑰味道，发酵产物中检测到苯乙醇、壬醛和芳樟醇等呈现花香的风味物质。总之，用蘑菇菌丝体发酵可以改善大豆分离蛋白以豆腥味为主的不良气味，同时产生蘑菇、花香等易于接受的风味特征，对于改善大豆分离蛋白的风味特征具有良好的应用前景。

6、电子鼻测试

电子鼻对样品的气味特征及其敏感，挥发性化合物成分的微小变化会导致不同传感器的相应，通过12个金属氧化物传感器对发酵前后的大豆分离蛋白样品进行了挥发性成分的强度差异分析，其中LY2/G对胺、醇、氨和酮敏感；LY2/GH对胺和氨敏感；LY2/gCTL对硫化氢敏感；PA/2对氮化合物敏感；T70/2对酒精蒸气敏感；T30/1对有机溶剂和轻极性分子敏感。具体的测试结果见图2。

由于食用菌菌丝体的生长速度较缓，四种食用菌发酵至3d的雷达指纹图与无座任何处理的样品几乎完全重叠，而PA/2、T70/2、T30/1传感器在白蘑、羊肚菌处理6d后的信号强度显著高于未处理以及猴菇和香菇发酵处理的样品(P<0.05)，表明在使用白蘑和羊肚菌发酵处理后，连续生成一定量的芳香化合物，这可能是由于在菌丝体生长代谢产生的酶水解过程中形成了新的挥发性化合物，如醇和酯类物质。

当使用白蘑发酵处理大豆分离蛋白9d时，会积累胺类、氨、硫化氢等导致难闻气味的化合物，这可能与发酵过程中的过度酶解有关。

7、电子舌测试

基于电子舌对于发酵样品的分析，分析中使用的检测传感器包括CTS(用于咸味)，NMS(用于鲜味)，AHS(用于酸味)，SCS(用于苦味)以及PKS和CPS(均用于通用)。如图3所示，发酵后大豆分离蛋白样品随着发酵时间的延长，发酵产物的苦味(SCS值)和鲜味增加，鲜味增加使由于发酵的进行，呈味核苷酸和鲜味氨基酸的含量增加，使得大豆分离蛋白的鲜味特征变得明显；随着发酵时间的进行，蛋白中的疏水氨基酸逐渐暴露，接触味蕾并产生苦味，随着水解的进行，越来越多的侧链暴露，导致苦味增加，合理控制发酵进程能够增加大豆分离蛋白鲜味的同时，减少苦味特征的产生，对于改善其风味组成具有一定的应用潜力。

8、溶解度测试结果

实施例1-4与对比例1的大豆分离蛋白的溶解度见图4。

从图4中可以看出：发酵后的SPI样品表现出高溶解度，以羊肚菌发酵为例，发酵至第六天时，溶解度较未处理的原料相比有显著的提升，约为未处理样品(RM)的2.43倍。

9、乳化性及乳化稳定性测试结果

实施例1-4与对比例1的大豆分离蛋白的乳化性(ECI)及乳化稳定性(ESI)的测定结果见附图5，五种食用菌发酵后的大豆分离蛋白样品的乳化性与发酵前样品相比均有显著提升，可能是通过发酵过程中的代谢作用，对氨基酸和多肽进行了移接、重排，肽分子数目的增加，相对增加了蛋白质的疏水部分，同时氨基、羧基等数目的增加使电荷数增加，进而提高了蛋白质的乳化性能。

10、起泡性及起泡稳定性测试结果

实施例1-4与对比例1的大豆分离蛋白的起泡性(FC)和起泡稳定性(FS)结果如图6所示，食用菌菌丝体发酵至6d时，起泡性均高于未经发酵的大豆分离蛋白。其中羊肚菌发酵的大豆分离蛋白样品具有最高的起泡性约16％，这可能是由于大豆蛋白的部分水解形成了低分子量的肽，因此肽能够以更快的速度转移到空气-水界面，并且蛋白质-蛋白质之间的相互作用提高了粘弹性内聚膜的强度，降低了表面张力。而起泡稳定性与原始大豆分离蛋白相比改变不明显，可能是由于发酵过程中蛋白质的降解导致电荷数量增加，当其增加到一定程度时，气液薄膜降低，泡沫易破裂，导致泡沫稳定性降低。

11、发酵后颜色变化

由图7可见，对比例2中羊肚、香菇发酵的大豆分离蛋白在发酵进行至10d时出现变色、发黏的现象，这可能有是由于豆粕中的大分子蛋白质的降解引起小分子蛋白质和肽含量的升高，而小分子蛋白质和肽易溶于水进而造成蛋白粉发黏。发酵后的大豆蛋白粘度超过临界值后，会使颜色加深，且由于固态发酵接种有氨臭味，不均一的固态发酵对于大豆蛋白质品质的一种损坏。

应用例

应用例1.使用发酵后的大豆分离蛋白制作冰激凌

发酵大豆蛋白冰淇淋配方：发酵4d后的大豆蛋白1％～9％、白砂糖12％、奶粉8％、奶油3％、羧甲基纤维素(CMC)0.1％～0.5％、单甘脂0.05％-0.25％。制作工艺：原料融化→配制→巴氏杀菌(65～75℃，30～35min)→均质(50～55℃，20-25MPa)→冷却→老化(4℃，8h)→凝冻→成型→硬化(-18～-20℃)→成品冷藏。

使用发酵改性后的大豆蛋白制作的冰激凌，可以有效提高产品的膨胀率，同时降低其融化率。经过发酵处理后的大豆蛋白，乳化能力和起泡能力有明显提高，所以提高了冰激凌产品的膨胀率、降低了其融化率，较未做处理的大豆分离蛋白，发酵改性后的大豆蛋白可以形成形态完整，不易变形、软塌、无冰晶的冰激凌成品，可以替代部分乳化剂、稳定剂和奶粉。应用例2.使用发酵后的大豆分离蛋白制作蛋糕

10％发酵4d大豆蛋白溶液以30％的添加量(大豆蛋白溶液占总蛋白量的百分比)与蛋清混合得到300g蛋白溶液，加入3g塔塔粉中速搅打至出现大的蛋白泡沫。加入120g白砂糖，快速连续搅打至出现细腻泡沫，将剩余糖120g、盐2g加入，搅打至泡沫拉出下垂尖端但不滴落的角。将过筛两次的低筋粉加入上述蛋白泡沫中，上下低速翻滚成糊状，倒入烤盘中，用抹刀抹平震荡出气泡，放入预热烤箱中(面火180℃，底火160℃，30分钟)。焙烤结束取出蛋糕，倒扣在晾网上30min冷却，脱模既得成品。与未添加大豆蛋白的蛋糕产品相比，改性后的蛋白蛋糕硬度、热量均低于全蛋清蛋白，且蛋糕品质更好。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种大豆分离蛋白的改性方法，其包括：将活化后的食用菌菌丝体接种于含有大豆分离蛋白的液体培养基中，使大豆分离蛋白进行液态发酵。

2.根据权利要求1所述的改性方法，其特征在于，所述食用菌选自食用真菌中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的改性方法，其特征在于，所述食用菌选自羊肚菌、香菇、猴菇、栗蘑和白蘑中的一种或多种。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的改性方法，其特征在于，所述液体培养基包括大豆分离蛋白、葡萄糖和水，

优选地，所述液体培养基中，大豆分离蛋白的质量浓度为2％-8％，优选为3％-7％；和/或

所述液体培养基中，葡萄糖的质量浓度为0.5％-5％，优选为1％-3％。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的改性方法，其特征在于，所述食用菌菌丝体的接种量为2g/L-16g/L，优选为5g/L-10g/L。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的改性方法，其特征在于，所述活化后的食用菌菌丝体选自在PDA固体培养基中活化和扩培的食用菌菌丝体，优选地，所述活化和扩培的温度为23℃-26℃。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的改性方法，其特征在于，所述液态发酵的温度为23℃-26℃，所述液态发酵的时间为2天-15天。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的改性方法，其特征在于，所述改性方法还包括将液态发酵后的产物进行干燥处理和粉碎处理。

9.一种根据权利要求1-8中任一项所述的改性方法得到的改性大豆分离蛋白。

10.根据权利要求9所述的改性大豆分离蛋白在食品添加剂中的应用。